EA 028344B1 20171130

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000028344b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение формулы (Ia1) или его свободная кислота, свободное основание или фармацевтически приемлемая соль, в которой R ₁ обозначает гетероциклил, выбранный из азетидинила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила, гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aS)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, октагидро-5H-пирроло[3,2-с]пиридинила, октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aR,7aR)октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aS,7aS)октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (7R,8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aS)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aR)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(2H)-она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила, (1R,5S)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, (1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила, (1R,5S)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, (1S,4S)-2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, (1R,5S)-3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6-диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7-диазаспиро[4.4]нонила или 6,9-диазаспиро[4.5]децила; причем гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R ₃ и одним дополнительным возможным заместителем R ₄ ; и причем, альтернативно, каждый гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя тремя или четырьмя заместителями R ₃ ; R ₂ фенил или гетероарил; причем каждый фенил и гетероарил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R ₆ и одним возможным дополнительным заместителем R ₇ ; R _a обозначает водород; R _b обозначает водород; R ₃ , в каждом случае, независимо выбран из циано, галогена, гидрокси, оксо, С _1-8 алкила, галоген-С _1-8 алкила, С _1-8 алкилкарбонила, С _1-8 алкокси, галоген-С _1-8 алкокси, С _1-8 алкокси-С _1-8 алкила, С _1-8 алкоксикарбонила, амино, С _1-8 алкиламино, (C _1-8 алкил) ₂ -амино, амино-С _1-8 алкила, С _1-8 алкиламино-С _1-8 алкила, (C _1-8 алкил) ₂ -амино-С _1-8 алкила, амино-С _1-8 алкиламино, С _1-8 алкиламино-С _1-8 алкиламино, (С _1-8 алкиламино-С _1-8 алкил) ₂ -амино, (С _1-8 алкил) ₂ -амино-С _1-8 алкиламино, [(С _1-8 алкил) ₂ -амино-С _1-8 алкил] ₂ -амино, (C _1-8 алкиламино-С _1-8 алкил)(С _1-8 алкил)амино, [(C _1-8 алкил) ₂ -амино-С _1-8 алкил](С _1-8 алкил)амино, С _1-8 алкокси-С _1-8 алкиламино, (С _1-8 алкокси-С _1-8 алкил) ₂ -амино, (С _1-8 алкокси-С _1-8 алкил)(C _1-8 алкил)амино, C _1-8 алкилкарбониламино, С _1-8 алкоксикарбониламино, гидрокси-C _1-8 алкила, гидрокси-С _1-8 алкокси-С _1-8 алкила, гидрокси-С _1-8 алкиламино, (гидрокси-С _1-8 алкил) ₂ -амино или (гидрокси-С _1-8 алкил)(C _1-8 алкил)амино; R ₄ обозначает С _3-14 циклоалкил, С _3-14 циклоалкил-С _1-8 алкил, С _3-14 циклоалкиламино, фенил-С _1-8 алкил, фенил-С _1-8 алкоксикарбонил, фенилсульфонилокси-С _1-8 алкил, гетероциклил или гетероциклил-C _1-8 алкил; причем каждый случай C _3-14 циклоалкила, фенила и гетероциклила в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R ₅ ; R ₅ , в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С _1-8 алкила, галоген-С _1-8 алкила, C _1-8 алкокси, галоген-С _1-8 алкокси, амино, С _1-8 алкиламино, (C _1-8 алкил) ₂ -амино или C _1-8 алкил-тио; R ₆ , в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С _1-8 алкила, С _2-8 алкенила, галоген-C _1-8 алкила, гидрокси-С _1-8 алкила, С _1-8 алкокси, галоген-С _1-8 алкокси, С _1-8 алкокси-С _1-8 алкила, амино, С _1-8 алкиламино, (С _1-8 алкил) ₂ -амино или С _1-8 алкил-тио; и R ₇ обозначает С _3-14 циклоалкил, С _3-14 циклоалкилокси, фенил, гетероциклил или гетероарил, причем гетероциклил, отличный от R ₁ , в каждом случае выбран из оксиранила, оксетанила, азетидинила, тетрагидрофуранила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, пиранила, дигидро-2Н-пиранила, тиопиранила, 1,3-диоксанила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила, 1,3-бензодиоксолила бензо[d][1,3]диоксолила, 1,4-бензодиоксанила, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинила 2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксинила, гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aS)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, октагидро-5Н-пирроло[3,2-c]пиридинила, октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aR,7aR)октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aS,7aS)октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (7R,8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8aS)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aR)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(2H)-она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила, (1R,5S)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, [1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила, (1R,5S)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, (1S,4S)-2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, [1R,5S)-3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6-диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7-диазаспиро[4.4]нонила, 6,9-диазаспиро[4.5]децила; причем гетероарил в каждом случае выбран из фуранила, тиенила, пирролила, 2Н-пирролила, 3H-пирролила, пиразолила, 1Н-пиразолила, имидазолила, 1Н-имидазолила, изоксазолила, изотиазолила, оксазолила, 1,3-тиазолила, оксадиазолила, 1,2,4-оксадиазолила, 1,3,4-оксадиазолила, тиадиазолила, 1Н-тетразолила, 2Н-тетразолила, пиридинила, пиримидинила, пиразинила, пиридазинила, триазинила, индолила, 1Н-индолила, индазолила, 1Н-индазолила, 2Н-индазолила, индолизинила, изоиндолила, бензофуранила, бензотиенила, бензотиофенила, бензоимидазолила, 1Н-бензоимидазолила, 1,3-бензоксазолила, 1,3-бензооксазолила, 9Н-пуринила, хинолинила, изохинолинила, хиназолинила, хиноксалинила, 1,3-диазинила, 1,2-диазинила, 1,2-диазолила, 1,4-диазанафталинила, акридинила, фуро[3,2-b]пиридинила, фуро[3,2-c]пиридинила, фуро[2,3-c]пиридинила, 6Н-тиено[2,3-b]пирролила, тиено[3,2-с]пиридинила, тиено[2,3-d]пиримидинила, 1Н-пирроло[2,3-b]пиридинила, 1Н-пирроло[2,3-с]пиридинила, 1Н-пирроло[3,2-b]пиридинила, пирроло[1,2-а]пиразинила, пирроло[1,2-b]пиридазинила, пиразоло[1,5-а]пиридинила, пиразоло[1,5-а]пиразинила, 3H-имидазо[4,5-b]пиридинила, имидазо[1,2-а]пиримидинила, имидазо[1,2-с]пиримидинила, имидазо[1,2-b]пиридазинила, имидазо[1,2-а]пиразинила, имидазо[2,1-b][1,3]тиазолила, имидазо[2,1-b][1,3,4]тиадиазолила,[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридинила или[1,2,4]триазоло[4,3-а]пиридинила.

2. Соединение по п.1, причем фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид, гидрохлорид, дигидрохлорид, гидробромид, ацетат или трифторацетат.

3. Соединение, выбранное из следующих соединений: 7-(пиперазин-1-ил)-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-(пиперазин-1-ил)-3-(тиофен-3-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,4-диметоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(1,4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,5-дифторфенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,4-диметоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,4-диметоксифенил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3-метоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(3-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(3-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он; 7-(1,4-диазепан-1-ил)-3-(3-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(2-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(4-метоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(4-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(имидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(имидазо[2,1-b][1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(4-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,4-диметоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(имидазо[2,1-b][1,3]тиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,4-дигидроксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(4-этоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3-фтор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3-гидроксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-фтор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3-хлор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(4-фтор-3-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(5-фтор-2-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,5-дифтор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2,4-диметоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(4-этоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1-бензофуран-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-[3-(дифторметокси)фенил]-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-[4-(дифторметокси)фенил]-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(имидазо[2,1-b][1,3]тиазол-6-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(3,4-диметоксифенил)-7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-пропилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-(4-трет-бутилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-(4-циклопропилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метилпропил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-(4-циклобутилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(пропан-2-ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(2-метоксиэтил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-(1-циклопропил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-(1-циклобутил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(оксетан-3-ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(пропан-2-ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-(1-циклобутилпиперидин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(оксетан-3-ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3S)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[4-(диметиламино)пиперидин-1-ил]-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-4-(2-гидроксиэтил)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-4-циклобутил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он;7-[(3R)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3S)-4-циклобутил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метил-4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метил-4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R)-4-циклобутил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метил-4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-(2-метоксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-(2-метоксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он или 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; или его фармацевтически приемлемая соль.

4. Фармацевтическая композиция для применения в лечении спинальной мышечной атрофии, включающая эффективное количество соединения по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.

5. Способ усиления включения экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.

6. Способ увеличения количества белка Smn, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.

7. Способ по п.5 или 6, в котором клетка человека представляет собой клетку человека от пациента, страдающего спинальной мышечной атрофией.

8. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, включающий введение пациенту эффективного количества соединения по п.1.

9. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.4.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

6. Способ увеличения количества белка Smn, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.

Евразийское 028344 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201491412
(22) Дата подачи заявки 2013.01.25
(51) Int. Cl.
A61K31/44 (2006.01) A01N43/42 (2006.01)
(54) СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ
(31) 61/591,102
(32) 2012.01.26
(33) US
(43) 2014.12.30
(86) PCT/US2013/023067
(87) WO 2013/112788 2013.08.01
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ПиТиСи ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Чэнь Гуанмин, Дакка Амал, Карп Гари Митчелл, Ли Чуньши, Нарасимхан Яна, Нарышкин Николай, Виталл Марла Л., Уэлч Эллен, Чжао Синь (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-5089633
WO-A1-2003104216
GAULTON A. et al. ChEMBL: A Large-Scale Bioactivity Database For Drug Discovery. Nucleic Acids Research, 23 September 2011, Vol. 40, DOI: 10.1093/nar/gkr777
MAIYALAGAN T. et al. 3-(4-Methoxyphenyl)-1H-isochromen-1-one. Acta Cryst, 2009, Vol. E65, o128, DOI: 10.1107/
S1600536808042074
HEYNEKAMP J.J. et al. Uncharged Isocoumarin-Based Inhibitors Of Urokinase-Type Plasminogen Activator. BMC Chemical Biology,
2006, Vol. 6, No. 1, p. 1-11, DOI: 10.1186/1472-6769-6-1
Изобретение относится к соединениям формулы (Ia1), их композициям и их применениям для лечения спинальной мышечной атрофии
Технология, описанная здесь, не была создана при поддержке правительства США.
Перекрестная ссылка
По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США 61/591102, поданной 26 января 2012 г., которая полностью и во всех целях включена в настоящее описание путем ссылки. Заявление по соглашению по исследованию суставов
Раскрытый объект был разработан, и заявленное изобретение было осуществлено одной или более сторон, или от ее имени, соглашения по исследованию суставов, которое в действительности было осуществлено на дату или до даты подачи заявки на заявленное изобретение;
заявленное изобретение было осуществлено в результате деятельности, предпринятой в рамках соглашения по исследованию суставов; и
заявка на патент на заявленное изобретение раскрывает или уточнена так, чтобы раскрывать названия сторон соглашения по исследованию суставов.
Введение
Изобретение относится к соединениям, их композициям и их применению для лечения спинальной мышечной атрофии.
Уровень техники
Спинальная мышечная атрофия (SMA) в своем самом широком смысле описывает совокупность наследственных и приобретенных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), характеризующихся прогрессивной потерей мотонейронов в спинном мозге и стволовой области головного мозга, вызывающей слабость мышц и атрофию мышц. Самая распространенная форма SMA вызывается мутациями в гене выживания мотонейронов (SMN) и проявляется в широком диапазоне серьезности, передаваясь от взрослых детям (Crawford and Pardo, Neurobiol. Dis., 1996, 3:97).
Инфантильная SMA является самой тяжелой формой этого нейродегенеративного нарушения. Симптомы включают слабость мышц, недостаточный мышечный тонус, слабый крик, вялость или тенденцию к падению, трудности с сосанием или глотанием, накопление секреций в легких или горле, трудности с кормлением и увеличенную восприимчивость к инфекциям дыхательных путей. Ноги имеют тенденцию быть более слабыми, чем руки, и вехи развития, такие как держание головы или сидение, не могут быть достигнуты. В общем, чем ранее симптомы появляются, тем короче продолжительность жизни. Когда клетки мотонейронов разрушаются, симптомы появляются через короткое время. Тяжелые формы заболевания являются летальными, и все формы не имеют никакого известного лечения. Течение SMA непосредственно связано со скоростью разрушения клеток мотонейронов и серьезностью развивающейся в результате слабости. Младенцы с тяжелой формой SMA часто умирают от респираторного заболевания вследствие слабости мышц, поддерживающих дыхание. Дети с более умеренными формами SMA живут намного дольше, хотя они, возможно, нуждаются в обширной медицинской поддержке, особенно те, которые находятся на более тяжелом конце спектра. Клинический спектр нарушений SMA был разделен на следующие пять групп.
(a) Тип 0 SMA (In Utero SMA) является самой тяжелой формой заболевания и начинается до рождения. Обычно первый симптом типа 0 SMA проявляется в сниженной двигательной активности плода, что может впервые наблюдаться между 30 и 36 неделями беременности. После рождения эти новорожденные имеют низкую двигательную активность и имеют трудности с глотанием и дыханием.
(b) Тип 1 SMA (инфантильная SMA, или болезнь Верднига-Хоффмана) обычно представляет симптомы между 0 и 6 месяцами. Эта форма SMA также является очень тяжелой. Пациенты никогда не достигают способности сидеть, и смерть обычно наступает в течение первых 2 лет при отсутствии искусственного дыхания.
(c) Тип 2 SMA (промежуточная SMA) имеет возраст начала в 7-18 месяцев. Пациенты достигают способности сидеть без посторонней поддержки, но не могут без посторонней помощи стоять или ходить. Прогноз в этой группе в значительной степени зависит от степени респираторной поддержки.
(d) Тип 3 SMA (ювенильная SMA, или болезнь Кугельберга-Веландера) обычно диагностируется после 18 месяцев. Пациенты с типом 3 SMA в состоянии идти независимо в некоторый момент в ходе развития заболевания, но часто попадают в инвалидное кресло в течение молодости или во взрослом возрасте.
(e) Тип 4 SMA (SMA взрослых). Слабость обычно начинается в позднем пубертатном периоде в языке, руках или стопах, затем распространяется на другие области тела. Течение SMA взрослых намного медленнее и оказывает небольшое воздействие или никакого воздействия на ожидаемую продолжительность жизни.
Ген SMN был картирован с помощью анализа сцепления сложной области в хромосоме 5q. У человека эта область содержит инвертированную дупликацию размером приблизительно 500 тысяч пар оснований (п.о.), приводящую к двум почти идентичным копиям гена SMN. SMA вызывается инактивирую-щей мутацией или делецией копии теломерного гена (SMN1) в обеих хромосомах, приводя к потере генетической функции SMN1. Однако все пациенты сохраняют центромерную копию гена (SMN2), и число копий гена SMN2 у пациентов с SMA в целом коррелирует обратно пропорционально с серьезностью заболевания; то есть, пациенты с менее тяжелой SMA имеют больше копий SMN2. Однако SMN2 неспо
собен полностью компенсировать потерю функции SMN1 вследствие альтернативного сплайсинга экзона 7, вызванного трансляционно молчаливой мутации С в Т в экзоне 7. В результате большинство транс-криптов, произведенных от SMN2, не имеют экзона 7 (SMN2 Д7) и кодируют обрезанный белок Smn, который имеет ослабленную функцию и быстро разлагается.
Белок Smn, как считается, играет роль в процессинге РНК и метаболизме, имея хорошо охарактеризованную функцию посредничества в сборке специфического класса комплексов РНК-белок, называемых snRNP. Smn может иметь другие функции в мотонейронах, однако его роль в предотвращении селективной дегенерации мотонейронов четко не установлена.
В большинстве случаев SMA диагностируют на основании клинических симптомов и отсутствия всех копий экзона 7 в гене SMN1, что определяется генетическим тестом. Однако приблизительно в 5% случаев SMA вызывается мутациями, отличными от делеции всего гена SMN1 или делеции всего экзона 7 в гене SMN1, некоторые из которых известны, а другие еще не определены. В таких случаях, когда генетический тест SMN1 невыполним или генная последовательность SMN1 не показывает никакой аномалии, могут быть показаны другие тесты, такие как электромиография (ЭМГ) или биопсия мышц.
Медицинский уход в отношении пациентов SMA в настоящее время ограничен поддерживающей терапией, включая респираторную, пищевую и восстановительную поддержку; нет никакого известного лекарственного средства, направленного на основную причину заболевания. Текущее лечение для SMA состоит из профилактики и контроля вторичных эффектов хронической потери моторных единиц. Главной проблемой контроля при типе 1 SMA является профилактика и раннее лечение легочных проблем, которые являются первичной причиной смерти в большинстве случаев. Хотя некоторые младенцы, пораженные SMA, доживают до взрослого возраста, те, у которых выявлен тип 1 SMA, имеют ожидаемую продолжительность жизни менее двух лет.
Были разработаны несколько мышиных моделей SMA. В частности, модель SM№i7 (Le et al., Hum. Mol. Genet., 2005, 14:845) несет и ген SMN2, и несколько копий кДНК SMN2Д7 и резюмирует многие из фенотипических особенностей типа 1 SMA. Модель SMNД7 может использоваться как для исследований экспрессии SMN2, так и для оценки моторной функции и выживания. Модель мыши С/С-аллель (Jackson Laboratory линия No.: 008714) обеспечивает модель менее тяжелой SMA на мышах, имеющих уменьшенные уровни обоих полноразмерной мРНК SMN2 (SMN2 FL) и белка Smn. Фенотип мыши С/С-аллель имеет ген SMN2 и гибрид mSmn1-SMN2 ген, который подвергается альтернативному сплайсингу, но не имеет явной слабости мышц. Модель мышей С/С-аллель используется для исследований экспрессии
SMN2.
В результате улучшенного понимания генетического основания и патофизиологии SMA были исследованы несколько стратегий лечения, но ни одна все же не продемонстрировала успех в клинике.
Замена гена SMN1 с использованием вирусных векторов доставки и замена клеток с использованием дифференцированных стволовых клеток SMN1++ продемонстрировали эффективность на животных моделях SMA. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить безопасность и иммунный ответ и выполнить требование инициации лечения на неонатальной стадии, прежде чем эти подходы могут быть использованы на людях.
Коррекция альтернативного сплайсинга SMN2 в культивируемых клетках была также достигнута с использованием синтетических нуклеиновых кислот в качестве терапевтических средств: (i) антисмысловых олигонуклеотидов, которые нацеливаются на элементы последовательности в пре-мРНК SMN2 и изменяют результат реакции сплайсинга на генерацию полноразмерной мРНК SMN2 (Passini et al., Sci. Transl. Med., 2011, 3:72ra18; and Hua et al., Nature, 2011, 478:123) и (ii) транс-сплайсинговых молекул РНК, которые обеспечивают полностью функциональную последовательность РНК, которые заменяют фрагмент мутанта в течение сплайсинга и производят полноразмерную мРНК SMN1 (Coady and Lorson, J. Neurosci., 2010, 30:126).
Другие подходы при исследовании включают поиск лекарственных средств, которые увеличивают уровни Smn, усиливают остаточную функцию Smn или компенсируют потерю Smn. Было показано, что аминогликозиды усиливают экспрессию стабилизированного белка Smn, продуцируемого из SMN2 Д7 мРНК, промотируя трансляционный пропуск аберрантного терминирующего кодона, но имеют недостаточное проникновение в центральную нервную систему и являются токсичными после повторного введения. Было показано, что химиотерапевтические средства, такие как акларубицин, увеличивают белок Smn в клеточной культуре; однако профиль токсичности этих лекарственных средств исключает их долговременное использование в пациентах SMA. Некоторые лекарственные средства, находящиеся на стадии клинических исследований, для лечения SMA включают активаторы транскрипции, такие как ингибиторы гистон деацетилазы ("HDAC") (например, бутираты, вальпроевая кислота и гидроксимочевина), и стабилизаторы мРНК (ингибитор декэпирования мРНК RG3039 от Repligen), предназначенные для увеличения количества полной РНК, транскрибированной от гена SMN2. Однако использование ингибиторов HDAC или стабилизаторов мРНК не затрагивает основную причину SMA и может привести к общему увеличению транскрипции и экспрессии генов с потенциальными проблемами безопасности у людей.
В дополнительном варианте нейропротективные средства, такие как олезоксим, были выбраны для исследования. Такие стратегии не направлены на увеличение продукции функционального Smn для лечения SMA, а исследуются в отношении возможности защитить Smn-дефицитные мотонейроны от ней-родегенерации.
Система, предназначенная для идентификации соединений, которые увеличивают включение экзо-на 7 SMN в РНК, транскрибированную от гена SMN2, и некоторые бензоксазольные и бензизоксазоль-ные соединения, идентифицированная таким образом, были описаны в международной заявке PCT/US2009/003238, поданной 27 мая 2009 г. (опубликована как международная публикация WO 2009/151546 и публикация США US 2011/0086833). Система, предназначенная для идентификации соединений, которые производят стабильный белок Smn от SMN2 Д7 мРНК, и некоторые изоиндолиновые соединения, идентифицированные таким образом, были описаны в международной заявке PCT/US2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация WO 2010/019236 и публикация США US 2011/0172284). Каждый из указанных документов включен в настоящее описание полностью и во всех целях.
Все другие документы, упомянутые здесь, включены путем ссылки в настоящую заявку, как если бы были полностью описаны здесь.
Несмотря на успехи, достигнутые в понимании генетического основания и патофизиологии SMA, остается потребность в идентификации соединений, которые меняли бы течение спинальной мышечной атрофии, одного из самых разрушительных неврологических заболеваний у детей.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение относится к соединениям формулы (la 1)
(Ial)
или их свободной кислоте, свободному основанию или фармацевтически приемлемой соли, в которой R1, R2, Ra и Rb имеют определенные здесь значения. В одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (Ia1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
SMA вызывается делецией или мутацией гена SMN1, приводя к селективной дегенерации Smn-дефицитных мотонейронов. Хотя у человека сохраняются несколько копий гена SMN2, небольшое количество функционального белка Smn, экспрессируемого от SMN2, полностью не компенсирует потерю Smn, который экспрессировался бы от гена SMN1. Соединения, их композиции и применения, описанные здесь, основаны частично на открытии, что соединение формулы (Ia1) увеличивает включение экзо-на 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от минигена SMN2. Этот миниген репродуцирует альтернативную реакцию сплайсинга экзона 7 SMN2, что приводит к пропуску экзона 7 в большинстве транс-криптов SMN2. Таким образом, соединения формулы (Ia1) или ее формы могут использоваться для модуляции включения экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2. Заявитель также обнаружил, что соединение формулы (Ia1) увеличивает включение экзона 7 SMN1 в мРНК, которая транскрибируется от минигена SMN1. Таким образом, соединения формулы (Ia1) или ее формы могут использоваться для модуляции включения экзона 7 SMN1 в мРНК, которая транскрибируется от гена
SMN1.
В частном варианте осуществления изобретение относится к соединениям формулы (Ia1) или ее формы, которые могут использоваться для модуляции включения экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения SMA у пациента-человека, включающему введение пациенту эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы. Соединение формулы (Ia1) или ее формы предпочтительно вводят пациенту-человеку в фармацевтической композиции. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (Ia1) для лечения SMA, причем соединение усиливает включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2. Не будучи ограниченным теорией, соединения формулы (Ia1) усиливают включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2, и увеличивают уровни белка Smn, продуцируемого от гена SMN2, и таким образом могут использоваться для лечения SMA у пациента-человека.
В другом аспекте изобретение относится к праймерам и/или зондам, описанным ниже в биологических примерах (например, праймеры SMN, такие как SEQ ID NO. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или SEQ ID NO. 2, 9
или 12, и/или зонды SMN, такие как SEQ ID NO. 3 или 10), и к применению этих праймеров и/или зондов. В частном варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, включающей SEQ ID NO. 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, состоящей, по существу, из SEQ ID NO. 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO. 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13.
В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2 и не включает экзон 7 из SMN2, может использоваться как биомаркер для SMA, такого как раскрытый здесь. В других вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2 и включает экзон 7 из SMN2, может использоваться как биомаркер для лечения пациента соединением, таким как раскрытое здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с SMA. В другом частном варианте осуществления пациент не является пациентом с SMA.
В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2 и включает экзон 7 из SMN2, а также количества мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2 и не включает экзон 7 из SMN2, может использоваться как биомаркеры для лечения пациента соединением, таким как раскрытое здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с SMA. В другом частном варианте осуществления пациент не является пациентом с SMA.
В соответствии с этими вариантами осуществления праймер(ы) SMN и/или зонд SMN, описанные ниже, могут использоваться в тестах, таких как PCR (например, qPCR), амплификация по типу катящегося кольца и RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), чтобы оценить и/или количественно определить количество мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2 и включает или не включает экзон 7 из SMN2.
В частном варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные ниже в биологических примерах (например, праймеры SMN, такие как SEQ ID NO. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или SEQ ID NO. 2, 9 или 12, и/или зонды SMN, такие как SEQ ID NO. 3 или 10), используют в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, такой тест, как описанный ниже в биологических примерах), для того чтобы определить, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы) включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные ниже в биологических примерах (например, праймеры SMN, такие как SEQ ID NO. 7, 11 или 13 и/или SEQ ID NO. 9 или 12, и/или зонды SMN, такие как SEQ ID NO. 3 или 10), используют в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, такой тест, как описанный ниже в биологических примерах), для того чтобы контролировать количество мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2 и включает экзон 7 из SMN2, в пробе пациента. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с SMA. В другом частном варианте осуществления пациент не является пациентом с SMA.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанные ниже в биологических примерах (например, праймеры SMN, такие как SEQ ID NO. 7, 8, 11 или 13 и/или SEQ ID NO. 9 или 12, и/или зонды SMN, такие как SEQ ID NO. 3 или 10), используют в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, такой тест, как описанный ниже в биологических примерах), для того чтобы контролировать реакцию пациента на соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы). В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с SMA. В другом частном зарианте осуществления пациент не является пациентом с SMA.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (Ia1), раскрытой здесь) включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2, включающему (а) контактирование мРНК, которая транскрибируется от минигена SMN2, описанного здесь или в международной заявке PCT/US2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация WO 2010/019236) или публикация США US 2011/0172284, в присутствии соединения (например, соединения формулы (Ia1), раскрытой здесь) с праймером(ами), описанным(и) здесь (например, SEQ ID NO. 1 и/или 2), наряду с компонентами, применимыми для, например, RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификации по типу катящегося кольца; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от ми-нигена и включает экзон 7 из SMN2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в отсутствие соединения, указывает, что соединение усиливает включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в отсутствие соединения указывает, что
соединение не усиливает включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (Ia1), раскрытой здесь) включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2, включающему (а) контактирование мРНК, которая транскрибируется от минигена SMN2, описанного здесь или в международной заявке PCT/US2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация WO 2010/019236) или публикация США US 2011/0172284 в присутствии соединения (например, соединение формулы (Ia1), раскрытой здесь) с зондом, описанным здесь (например, SEQ ID NO. 3 или 10), наряду с компонентами, применимыми для, например, RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификации по типу катящегося кольца и если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в отсутствие соединения, указывает, что соединение усиливает включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в отсутствие соединения указывает, что соединение не усиливает включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу определения, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (Ia1), раскрытой здесь) включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2, включающему (а) контактирование мРНК, которая транскрибируется от минигена SMN2, описанного здесь или в международной заявке PCT/US2009/004625, поданной 13 августа 2009 г. (опубликована как международная публикация WO 2010/019236) или публикация США US 2011/0172284 в присутствии соединения (например, соединения формулы (Ia1), раскрытой здесь) с праймером(ами) (например, SEQ ID NO. 1 или 2) и/или зондом, описанными здесь (например, SEQ ID NO. 3 или 10), наряду с компонентами, применимыми для, например, RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификации по типу катящегося кольца и если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в отсутствие соединения, указывает, что соединение усиливает включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от ми-нигена и включает экзон 7 из SMN2, в присутствии соединения относительно количества мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из SMN2, в отсутствие соединения указывает, что соединение не усиливает включение экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2.
В другом аспекте изобретение относится к наборам, включающим праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры SMN, такие как SEQ ID NO. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или SEQ ID NO. 2, 9 или 12 и/или зонды SMN, такие как SEQ ID NO. 3 или 10), и к их применению.
Краткое описание фигур
Фиг. 1, на которую имеется ссылка в биологическом примере 1, является схематическим рисунком конструкции минигена SMN2-A, которая продуцирует два подвергшихся альтернативному сплайсингу транскрипта мРНК: полноразмерная мРНК, которая содержит экзон 7, и Д7 мРНК, которая не содержит экзон 7. Нуклеотид аденин, вставленный в экзон 7 из SMN2-A после нуклеинового остатка 48, представлен буквой "А". Альтернативно, нуклеотид может также быть выбран из цитозина или тимина. Вследствие вставки одного нуклеотида (А, С или Т) после нуклеинового остатка 48, полноразмерная мРНК не содержит терминирующий кодон в открытой рамке считывания SMN, тогда как Д7 мРНК имеют терминирующий кодон в экзоне 8, который обозначен словом "Stop";
фиг. 2, на которую имеется ссылка в биологическом примере 1, показывает последовательность ДНК минигена от конструкции минигена SMN2-A SEQ ID NO. 21 (фиг. 2а). Как показано на фиг. 2b, могут быть найдены следующие подпоследовательности:
1-70: 5'UTR (deg);
71-79: экзон 6: старт-кодон и сайт BamHI (atgggatcc); 80-190: экзон 6;
191-5959: интрон 6;
5960-6014: экзон 7 со вставкой нуклеотида аденина "А" (положение 6008);
6015-6458: интрон 7;
6459-6481: часть экзона 8;
6482-8146: сайт BamHI (последовательность на 5' конце), последовательность, кодирующая люци-феразу, начинающаяся с кодона 2 (без инициирующего кодона), сайт NotI (последовательность на 3' кон-
це), терминирующий кодон ТАА; и 8147-8266: 3'UTR (deg);
фиг. 3, на которую имеется ссылка в биологическом примере 2, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга минигена SMN2 в клетках, обработанных возрастающими концентрациями Соединения 65 (фиг. 3a) и соединения 69 (фиг. 3b) за период 24 ч. Уровни полноразмерной мРНК минигена SMN2 определяли количественно, используя количественную PCR с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Уровень полноразмерной мРНК минигена SMN2 в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 4, на которую имеется ссылка в биологическом примере 3, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2 в фибробластах пациента с типом 1 SMA, обработанных возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 4а) и соединения 69 (фиг. 4b) за период 24 ч. Уровни полноразмерной и Д7 мРНК SMN2 определяли количественно, используя RT-qPCR. Уровни полноразмерной и Д7 мРНК SMN2 в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 5, на которую имеется ссылка в биологическом примере 4, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2 в фибробластах пациента с типом 1 SMA, обработанных возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 5а) и соединения 69 (фиг. 5b) за период 24 ч. Полноразмерную и Д7 мРНК SMN2 амплифицировали, используя обратную транскрипцию по окончании PCR (RT-PCR), и продукты PCR разделяли, используя электрофорез на агарозном геле. Верхние и нижние диапазоны соответствуют полноразмерной и Д7 мРНК SMN2, соответственно. Интенсивность каждого диапазона пропорциональна количеству РНК, присутствующей в образце;
фиг. 6, на которую имеется ссылка в биологическом примере 5, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2 (как в гене SMN2, так и в гибридном гене Smn1-SMN2 мыши) в тканях мозга и мышц в модели SMA на мышах С/С-аллель в результате обработки в течение 10 дней, дважды в сутки (BID) с 10 мг/кг соединения 65 (фиг. 6а) и соединения 69 (фиг. 6b). Уровни полноразмерной и Д7 мРНК SMN2 определяли количественно, используя RT-qPCR, объединенное количество полноразмерной и Д7 мРНК SMN2 собирали в момент 1 и вычисляли фракционные количества полноразмерной и Д7 SMN2;
фиг. 7, на которую имеется ссылка в биологическом примере 6, показывает коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2 (как в гене SMN2, так и в гибридном гене Smn1-SMN2 мыши) в тканях мозга и мышц в модели SMA на мышах С/С-аллель в результате обработки в течение 10 дней, дважды в сутки с 10 мг/кг соединения 65 (фиг. 7). Полноразмерную и Д7 мРНК SMN2 амплифицировали, используя RT-PCR. Продукты PCR разделяли, используя электрофорез на агарозном геле. Верхние и нижние диапазоны соответствуют полноразмерной и Д7 мРНК SMN2 соответственно. Интенсивность каждого диапазона пропорциональна количеству РНК, присутствующей в образце;
фиг. 8, на которую имеется ссылка в биологическом примере 7, показывает дозозависимое увеличение экспрессии белка Smn в человеческих фибробластах при типе 1 SMA, обработанных за период 48 ч соединением 65 (фиг. 8а) и соединением 69 (фиг. 8b);
фиг. 9, на которую имеется ссылка в биологическом-примере 8, показывает увеличение в единицах ядерного спекла (gems) в фибробластах пациента с типом 1 SMA, обработанных соединением 65 (фиг. 9а) и соединением 69 (фиг. 9b) за период 48 ч. Спеклы подсчитывали, используя флюоресцентную микроскопию. Число спеклов в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к числу в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 10, на которую имеется ссылка в биологическом примере 9, показывает увеличение экспрессии белка Smn (черные круги) в мотонейронах, полученных из клеток iPS, полученных из фибробластов пациента с типом 1 SMA, обработанных соединением 65 (фиг. 10а) и соединением 69 (фиг. 10b) за период 72 часа. Уровень белка Smn определяли количественно, используя иммунное окрашивание Smn и софо-кусную флюоресцентную микроскопию. Уровень белка Smn в обработанных соединением образцах подвергали нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивали как функцию концентрации соединения;
фиг. 11, на которую имеется ссылка в биологическом примере 11, показывает увеличенную экспрессию белка Smn в тканях головного мозга, спинного мозга, мышц и печени в модели SMA на мышах С/С-аллель вследствие обработки дважды в сутки в течение 10 дней с 10 мг/кг соединения 65 (фиг. 11а, n=5) и соединения 69 (фиг. 11b, n=4), где три звезды (***) на каждой фигуре обозначают р <0,001 ANO-VA;
фиг. 12, на которую имеется ссылка в биологическом примере 12, показывает дозозависимое увеличение экспрессии белка Smn в тканях (головной мозг, фиг. 12а; спиннсй мозг, фигура 12b; и мышца, фигура 12с) в мышиных моделях неонатальной Д7 SMA в результате обработки в течение 7 дней один раз в сутки (QD) обозначенными дозами соединения 65, где три звезды (***) на каждой фигуре обозначают
р <0,001 ANOVA;
фиг. 13, на которую имеется ссылка в биологическом примере 13, показывает различия в массе тела
в мышиных моделях неонатальной Д7 SMA в результате обработки вплоть до Послеродового Дня (PND) 140 соединением 65 (фиг. 13а) и до PND 79 соединением 69 (фиг. 13b);
фиг. 14, на которую имеется ссылка в биологическом примере 14, показывает улучшенный выпрямительный рефлекс в мышиных моделях неонатальной Д7 SMA в результате обработки соединением 65 (фиг. 14а) и соединением 69 (фиг. 14b);
фиг. 15, на которую имеется ссылка в биологическом примере 15, показывает улучшенное выживание в мышиных моделях неонатальной Д7 SMA в результате обработки соединением 65 (фиг. 15а) и соединением 69 (фиг. 15b);
фиг. 16, на которую имеется ссылка в биологическом примере 15, показывает увеличенную экспрессию белка Smn в тканях мозга и мышц в мышиных моделях Д7 SMA в результате обработки соединением 65 до PND 144 (фиг. 16а) и соединением 69 до PND 80 и PND 83 относительно обработанных носителем и подобранных в соответствии с возрастом гетерозиготных мышей соответственно;
фиг. 17, на которую имеется ссылка в биологическом примере 16, показывает дозозависимое увеличение FL мРНК минигена SMN1 и дозозависимое уменьшение Д7 мРНК минигена SMN1 в человеческих фибробластах при типе SMA 1, обработанных за период 7 ч соединением 65 (фиг. 17а) и соединением 69 (фиг. 17b). Полноразмерную и Д7 мРНК минигена SMN1 амплифицировали, используя RT-PCR, и полученные продукты PCR разделяли, используя электрофорез на агарозном геле. Верхние и нижние диапазоны соответствуют полноразмерной и Д7 мРНК минигена SMN1 соответственно. Интенсивность каждого диапазона пропорциональна количеству РНК, присутствующей в образце.
Подробное описание
Изобретение относится к соединениям формулы (Ial)
(Ial)
или их свободной кислоте, свободному основанию или фармацевтически приемлемой соли, в которой
R1 обозначает гетероциклил, выбранный из азетидинила, пирролинила, пирролидинила, пиразоли-
нила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазо-
линила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила,
триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразоли-
нила, тетразолидинила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-тетрагидропиридинила, пиперидинила,
пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила, гексагидропирролоРД-^пиррол-
(1 Ц)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-( 1 Ц)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-
(Ш)ила, гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила,
(3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(Ш)ила,
(3 aR,6aS)гексагидропирроло[3,4-с] пиррол-( 1 H)mra, (3 aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-с] пиррол-( 1 Ц)ила,
октагидро-5H-пирроло[3,2-с]пиридинила, октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aR,7aR)-
октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aS,7aS)-октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, гексагид-
ропирроло [1,2-а] пиразин-( 1 Ц)ила, (7R,8aS)гексагидропирроло [1,2-а] пиразин-( 1 H)mra,
(8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aS)-
октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(Ш)ила, (8aR)-октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, гексагидро-
пирроло^Д-а^иразин-^И^она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила,
(Ж^)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, (Ш^)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8-
азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила,
(1R,5S)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, (1S,4S)-2,5-
диазабицикло[2.2.1]гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, (1R,5S)-3,8-
диазабицикло[3.2.1]октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6-
диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7-
диазаспиро[4.4]нонила или 6,9-диазаспиро[4.5]децила;
причем гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R3 и одним дополнительным возможным заместителем R4; и
причем, альтернативно, каждый гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя тремя или четырьмя заместителями R3;
R2 фенил или гетероарил;
причем каждый фенил и гетероарил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R6 и одним возможным дополнительным заместителем R7; Ra обозначает водород; Rb обозначает водород;
R3, в каждом случае, независимо выбран из циано, галогена, гидрокси, оксо, ^^алсшла, галоген-Cb 8алкила, C1-8алкилкарбонила, ^^жокси, галоген-C1-8алкокси, C1-8алкокси-С1-8алкила, C1-8алкокси-карбонила, амино, C1-8алкиламино, (C1-8алкил)2-амино, амино-C1-8алкила, C1-8алкиламино-C1-8алкила, (C1-8алкил)2-амино-C1-8алкила, амино-C1-8алкиламино, C1-8алкиламино-C1-8алкиламино, (C1-8алкиламино-C1-8алкил)2-амино, (C1-8алкил)2-амино-C1-8алкиламино, [(C1-8алкил)2-амино-C1-8алкил]2-амино, (C1-8алкиламино-C1-8алкил) (C1-8алкил)амино, [(C1-8алкил)2-амино-C1-8алкил](C1-8алкил)амино, C1-8алкокси-C1-8алкиламино, (C1-8алкокси-C1-8алкил)2-амино, (C1-8алкокси-C1-8алкил)(C1-8алкил)амино, C^^CCM-карбонил-амино, C1-8алкоксикарбониламино, гидрокси-C1-8алкила, гидрокси-C1-8алкокси-C1-8алкила, гид-рокси-C1-8алкиламино, (гидрокси-C1-8алкил)2-амино или (гидрокси-C1-8алкил)(C1-8алкил)амино;
R4 обозначает C3-14циклоалкил, C3-14циклоалкил-C1-8алкил, О^мциклоалкиламино, фенил-C1-8алкил, фенил-C1-8алкоксикарбонил, фенилсульфонилокси-C1-8алкил, гетероциклил или гетероциклил-C1-8алкил; причем каждый случай C3-14циклоалкила, фенила и гетероциклила в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R5;
R5, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, ^^жила, галоген-C1-8алкила, C1-8алкокси, галоген-C1-8алкокси, амино, C1-8алкиламино, (C1-8алкил)2-амино или C^^CCM-тио;
R6, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, C1-8алкила, C1-8алкенила, галоген-C1-8алкила, гидрокси-C1-8алкила, C1-8алкокси, галоген-C1-8алкокси, C1-8алкокси-C1-8алкила, амино, C1-8алкиламино, (C1-8алкил)2-амино или C1-8алкил-тио; и
R7 обозначает C3-14циклоалкил, C3-1^muK^cauK)KOT, фенил, гетероциклил или гетероарил,
причем гетероциклил, отличный от R1, в каждом случае выбран из оксиранила, оксетанила, азети-
динила, тетрагидрофуранила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазоли-
нила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазо-
линила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила,
оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, пиранила, ди-
гидро-2Н-пиранила, тиопиранила, 1,3-диоксанила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-
тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила,
1,3-бензодиоксолила бензо[d][1,3]диоксолила, 1,4-бензодиоксанила, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинила
2,3-дигидробензо [b] [ 1,4]диоксинила, гексагидропирроло [3,4-b]пиррол-(1H)ила,
(3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила,
гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила,
(3 aR,6aR)гексагидропирроло [3,4-b] пиррол-(2H)ила, гексагидропирроло [3,4-с] пиррол-(Ш)ила,
(3aR,6aS)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)-гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила,
октагидро-5Н-пирроло [3,2-с]пиридинила, октагидро-6Н-пирроло [3,4-b]пиридинила, (4aR,7aR)-
октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aS,7aS)октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, гексагид-
ропирроло [ 1,2-а]пиразин-(Ш)ила, (7R,8aS)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ила,
(8aS)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8aR)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ила,
(8aS)октагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aR)октагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1H)ила, гексагид-
ропирроло[1,2-а]пиразин-(2Н)-она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила,
(1R,5S)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, (Ж^)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8-
азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила,
(Ж^)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, (1S,4S)-2,5-
диазабицикло[2.2.1]гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, (1R,5S)-3,8-
диазабицикло[3.2.1]октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6-
диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7-
диазаспиро[4.4]нонила, 6,9-диазаспиро[4.5]децила;
причем гетероарил в каждом случае выбран из фуранила, тиенила, пирролила, 2Н-пирролила, 3H-
пирролила, пиразолила, 1Н-пиразолила, имидазолила, 1Н-имидазолила, изоксазолила, изотиазолила, ок-
сазолила, 1,3-тиазолила, оксадиазолила, 1,2,4-оксадиазолила, 1,3,4-оксадиазолила, тиадиазолила, 1Н-
тетразолила, 2Н-тетразолила, пиридинила, пиримидинила, пиразинила, пиридазинила, триазинила, индо-
лила, 1Н-индолила, индазолила, 1Н-индазолила, 2Н-индазолила, индолизинила, изоиндолила, бензофу-
ранила, бензотиенила, бензотиофенила, бензоимидазолила, 1Н-бензоимидазолила, 1,3-бензоксазолила,
1,3-бензооксазолила, 9Н-пуринила, хинолинила, изохинолинила, хиназолинила, хиноксалинила, 1,3-
диазинила, 1,2-диазинила, 1,2-диазолила, 1,4-диазанафталинила, акридинила, фуро[3,2-b]пиридинила,
фуро[3,2-с]пиридинила, фуро[2,3-c]пиридинила,6Н-тиено[2,3-b]пирролила, тиено[3,2-с]пиридинила, тие-
но[2,3-d]пиримидинила, 1Н-пирроло[2,3-b]пиридинила, 1Н-пирроло[2,3-с]пиридинила, 1Н-пирроло[3,2-
ЭДпиридинила, пирроло[1,2-а]пиразинила, пирроло[1,2-b]пиридазинила, пиразоло[1,5-а]пиридинила, пи-
разоло[1,5-а]пиразинила, 3H-имидазо[4,5-b]пиридинила, имидазо[1,2-а]пиримидинила, имидазо[1,2-
с]пиримидинила, имидазо^Д-^пиридазинила, имидазо[1,2-а]пиразинила, имидазо[2,1-b][1,3]тиазолила,
имидазо[2,1-b][1,3,4]тиадиазолила, [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридинила или[1,2,4]триазоло[4,3-
а]пиридинила.
или ее формы.
Терминология
Химические термины, используемые выше и по всему описанию, если специально не указано иное, должны пониматься специалистом как имеющие следующие указанные значения.
В рамках изобретения термин "С1-8алкил" вообще относится к насыщенным углеводородным радикалам, имеющим от одного до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи, включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, н-пропил (также называемый пропилом или пропани-лом), изопропил, н-бутил (также называемый бутилом или бутанилом), изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил (также называемый пентилом или пентанилом), н-гексил (также называемый гексилом или гек
санилом), н-гептил (также называемый гептилом или гептанилом), н-октил и т.п. В некоторых вариантах осуществления С1-8алкил включает, но не ограничен ими, С1-6алкил, С1-4алкил и т.п. С1-8алкил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "С2-8алкенил" вообще относится к частично ненасыщенным углеводородным радикалам, имеющим от двух до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи и одну или более углерод-углеродных двойных связей, включая, но не ограничиваясь ими, этенил (также называемый винилом), аллил, пропенил и т.п. В некоторых вариантах осуществления С2-8алкенил включает, но не ограничен ими, С2-6алкенил, С2-4алкенил и т.п. С2-8алкенил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "С2-8алкинил" вообще относится к частично ненасыщенным углеводородным радикалам, имеющим от двух до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи и одну или более углерод-углеродных тройных связей, включая, но не ограничиваясь ими, этинил, пропинил, бутинил и т.п. В некоторых вариантах осуществления С2-8алкинил включает, но не ограничен ими, С2-6алкинил, С2-4алкинил и т.п. С2-8алкинил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "С1-8алкокси" вообще относится к насыщенным углеводородным радикалам, имеющим от одного до восьми атомов углерода в конфигурации прямой или разветвленной цепи формулы: -0-С1-8алкил, включая, но не ограничиваясь ими, метокси, этокси, н-пропокси, изопро-покси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, н-пентокси, н-гексокси и т.п. В некоторых вариантах осуществления С1-8алкокси включает, но не ограничен ими, С1-6алкокси, С1-4алкокси и т.п. С1-8алкокси может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "С3-14циклоалкил" вообще относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому, бициклическому или полицикллческому углеводородному радикалу, включая, но не ограничиваясь ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогек-сенил, циклогептил, циклооктил, 1Н-инданил, инденил, тетрагидро-нафталинил и т.п. В некоторых вариантах осуществления С3-14циклоалкил включает, но не ограничен ими, С3-8циклоалкил, С5-8циклоалкил, С3-10циклоалкил и т.п. С3-14циклоалкил может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "арил" вообще относится к моноциклическому, бициклическому или полициклическому радикалу с кольцевой структурой атома углерода ароматического соединения, включая, но не ограничиваясь ими, фенил, нафтил, антраценил, флуоренил, азуленил, фенантренил и т.п. Арильный радикал может быть в случае необходимости замещен различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "гетероарил" вообще относится к моноциклическому, бициклическо-му или полициклическому радикалу с кольцевой структурой атома углерода ароматического соединения, в котором один или более членов атомов углерода, являющихся членами кольца, были заменены, где это позволяет стабильность структуры, одним или более гетероатомами, такими как атом О, S или N, включая, но не ограничиваясь ими, фуранил (также называемый фурилом), тиенил (также называемый тиофе-нилом), пирролил, 2Н-пирролил, 3Н-пирролил, пиразолил, 1Н-пиразолил, имидазолил, 1Н-имидазолил, изоксазолил, изотиазолил, оксазолил, 1,3-тиазолил, триазолил (такой как 1Н-1,2,3-триазолил и т.п.), ок-садиазолил (такой как 1,2,4-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил и т.п.), тиадиазолил, тетразолил (такой как 1Н-тетразолил, 2Н-тетразолил и т.п.), пиридинил (также называемый пиридилом), пиримидинил, пира-зинил, пиридазинил, триазинил, индолил, 1Н-индолил, индазолил, 1Н-индазолил, 2Н-индазолил, индоли-зинил, изоиндолил, бензофуранил, бензотиенил (также называемый бензотиофенилом), бензоимидазо-лил, 1Н-бензоимидазолил, 1,3-бензотиазолил, 1,3-бензоксазолил (также называемый 1,3-бензооксазолилом), пуринил, 9Н-пуринил, хинолинил, изохинолинил, хиназолинил, хиноксалинил, 1,3-диазинил, 1,2-диазинил, 1,2-диазолил, 1,4-диазанафталинил, акридинил, фуро[3,2-Ь]пиридинил, фуро[3,2-
c] пиридинил, фуро[2,3-с]пиридинил, 6Н-тиено[2,3-Ь]пирролил, тиено[3,2-с]пиридинил, тиено[2,3-
d] пиримидинил, 1Н-пирроло[2,3-Ь]пиридинил, 1Н-пирроло[2,3-с]пиридинил, 1Н-пирроло[3,2-Ь]пиридинил, пирроло[1,2-а]пиразинил, пирроло[1,2-Ь]пиридазинил, пиразоло[1,5-а]пиридинил, пиразо-ло[1,5-а]пиразинил, имидазо[1,2-а]пиридинил, 3Н-имидазо[4,5-Ь]пиридинил, имидазо[1,2-а]пиримидинил, имидазо[1,2-с]пиримидинил, имидазо[1,2-Ь]пиридазинил, имидазо[1,2-а]пиразинил, имидазо [2,1 -b] [ 1,3]тиазолил, имидазо [2,1 -b] [ 1,3,4]тиадиазолил, [ 1,2,4]триазоло [ 1,5-а]пиридинил, [1,2,4]триазоло[4,3-а]пиридинил и т.п. Гетероарильный радикал может быть в случае необходимости замещен на кольцевом атоме углерода или азота различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "гетероциклил" вообще относится к насыщенному или частично ненасыщенному моноциклическому, бициклическому или полициклическому углеродному радикалу с кольцевой структурой, в котором один или более членов атомов углерода, являющихся членами кольца,
были заменены, где это позволяет стабильность структуры, одним или более гетероатомами, такими как
атом О, S или N, включая, но не ограничиваясь ими, оксиранил, оксетанил, азетидинил, тетрагидрофура-
нил, пирролинил, пирролидинил, пиразолинил, пиразолидинил, имидазолинил, имидазолидинил, изокса-
золинил, изоксазолидинил, изотиазолинил, изотиазолидинил, оксазолинил, оксазолидинил, тиазолинил,
тиазолидинил, триазолинил, триазолидинил, оксадиазолинил, оксадиазолидинил, тиадиазолинил, тиадиа-
золидинил, тетразолинил, тетразолидинил, пиранил, дигидро-2Н-пиранил, тиопиранил, 1,3-диоксанил,
1,2,5,6-тетрагидропиридинил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, пиперидинил, пиперазинил, морфолинил,
тиоморфолинил, 1,4-диазепанил, 1,3-бензодиоксолил (также называемый бензо[d][1,3]диоксолил), 1,4-
бензодиоксанил, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинил (также называемый 2,3-
дигидробензо[Ь] [ 1,4]диоксинил), гексагидропирроло [3,4-Ь]пиррол-(1Н)ил,
(3а8,6а8)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(1Н)ил, (3аК,6аЯ)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(1Н)ил,
гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)-ил, (3а8,6а8)гексагидропирроло[3,4-Ь]пиррол-(2Н)ил,
(3аЯ,6аК)гексагидропирроло [3,4-Ь]пиррол-(2Н)ил, гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1Н)ил,
(3аЕ1,6а8)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1Н)ил, (3аК,6а!1)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1Н)ил, октагидро-5Н-пирроло[3,2-с]пиридинил, октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинил, (4аЯ,7аК)октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинил, (4а8,7а8)октагидро-6Н-пирроло[3,4-Ь]пиридинил, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ил, (7Я,8а8)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ил, (8а8)гексагидропирроло [1,2-а]пиразин-(1Н)ил, (8аЯ)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ил, (8а8)октагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ил, (8аЯ)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1Н)ил, гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(2Н)он, окта-гидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинил, 3-азабицикло[3.1.0]гексил, (1Я,58)-3-азабицикло[3.1.0]гексил, 8-азабицикло[3.2.1]октил, (1Я,58)-8-азабицикло[3.2.1]октил, 8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енил, (1R,58)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енил, 9-азабицикло[3.3.1]нонил, (1Я,58)-9-азабицикло[3.3.1]нонил, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептил, (18,48)-2,5-диазабицикло[2.2.1]гептил, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октил, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октил, (1Я,58)-3,8-диазабицикло[3.2.1]октил, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонил, азаспи-ро[3.3]гептил, 2,6-диазаспиро[3.3]гептил, 2,7-диазаспиро[3.5]нонил, 5,8-диазаспиро[3.5]нонил, 2,7-диазаспиро[4.4]нонил, 6,9-диазаспиро[4.5]децил и т.п. Гетероциклил может быть в случае необходимости замещен на кольцевом атоме углерода или азота различными заместителями как описано здесь, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "С1-8алкокси-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-О-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "С1-8алкокси-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С^ 8алкил-О-С1 -8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил-О-С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин "С1-8алкокси-С1-8алкиламино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -О-С1 -8алкил-МН-С1 -8алкил-О-С1 -8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-М(С1-8алкил-О-С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -0-С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкил-О-С1-8алкил).
В рамках изобретения термин "С1-8алкокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1 -8алкил-МН-С1 -8алкил-О-С1 -8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1 -8алкил-М(С1 -8алкил-О-С1 -8алкил)2.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М (С1-8алкил) (С1-8алкил-0-С1-8алкил).
В рамках изобретения термин "С1-8алкоксикарбонил" относится к радикалу формулы -С(О)-0-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "С1-8алкоксикарбонил-С2-8алкенил" относится к радикалу формулы -С1 -8алкенил-С(О)-0-С1 -8алкил.
В рамках изобретения термин "С1-8алкоксикарбониламино" относится к радикалу формулы -МН-С(О)-0-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкил. В рамках изобретения термин "(С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)2. В рамках изобретения термин "С1-8алкиламино-С1-8алкенил" относится к радикалу формулы -С2-8алкенил-МН-С1 -8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкил)2-амино-С2-8алкенил" относится к радикалу формулы -С2-8алкенил-М(С1 -8алкил)2.
В рамках изобретения термин "С1-8алкиламино-С1-8алкокси" относится к радикалу формул^1 -О-С1-8алкил-МН-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -О-С1 -8алкил-М(С1 -8алкил)2.
В рамках изобретения термин ''С1-8алкиламино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин "С1-8алкиламино-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкил-МН-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1 -8алкил-М(С1 -8алкил)2.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкиламино-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил-МН-С1-8алкил)2.
В рамках изобретения термин "[(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил]2-амино" относится к радикалу формул^! -М[С1-8алкил-М(С1-8алкил)2]2.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкиламино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -N(Q -8алкил)(С1 -8алкил-МН-С1 -8алкил).
В рамках изобретения термин "[(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)[С1-8алкил-М(С1-8алкил)2].
В рамках изобретения термин "С1-8алкиламино-С2-8алкинил" относится к радикалу формулы -С2-8алкинил-МН-С1 -8алкил.
В рамках изобретения термин "(С1-8алкил)2-амино-С2-8алкинил" относится к радикалу формулы -С2-8алкинил-М(С1 -8алкил)2.
В рамках изобретения термин "С1-8алкилкарбонил" относится к радикалу формулы -С(О)-С1-8алкил. В рамках изобретения термин "С1-8алкилкарбониламино" относится к радикалу формулы -МН-С(О)-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "С1-8алкилтио" относится к радикалу формулы -8-С1-8алкил.
В рамках изобретения термин "амино-С2-8алкенил" относится к радикалу формулы -С2-8алкенил-
МН2.
В рамках изобретения термин "амино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-
М1Н2.
В рамках изобретения термин "амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН2. В рамках изобретения термин "амино-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкил-МН2.
В рамках изобретения термин "(амино-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил-МН2)2.
В рамках изобретения термин "(амино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -N(Q -8алкил)(С1 -8алкил-МН2).
В рамках изобретения термин "амино-С2-8алкинил" относится к радикалу формулы -С2-8алкинил-
МН2.
В рамках изобретения термин "арил-С1-8алкоксикарбонил" относится к радикалу формулы -С(О)-0-С1-8алкил-арил.
В рамках изобретения термин "арил-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкиларил. В рамках изобретения термин "арил-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкиларил.
В рамках изобретения термин "(арил-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил-арил)2.
В рамках изобретения термин "(арил-С1-8алкил) (С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -N(Q -8алкил)(С1 -8алкиларил).
В рамках изобретения термин "арил-С1-8алкиламино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН-С1-8алкиларил.
В рамках изобретения термин "(арил-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкиларил)2.
В рамках изобретения термин "(арил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1 -8алкил-М(С1 -8алкил)(С1 -8алкиларил).
В рамках изобретения термин "ариламино" относится к радикалу формулы -МН-арил.
В рамках изобретения термин "ариламинокарбонил" относится к радикалу формулы -С(О)-МН-
арил.
В рамках изобретения термин "арилсульфонилокси-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-О-802-арил.
В рамках изобретения термин "бензоксикарбонил" относится к радикалу формулы -С(О)О-СН2-фенил.
В рамках изобретения термин "С3-14циклоалкил-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-С3-14циклоалкил.
В рамках изобретения термин "С3-14циклоалкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С3
14циклоалкил.
В рамках изобретения термин "С3-14циклоалкилокси" относится к радикалу формулы -0-С3-14циклоалкил.
В рамках изобретения термин "галоген" вообще относится к атому галогена, включая фтор, хлор, бром и йод.
В рамках изобретения термин "галоген-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -0-С1-8алкилгалоген, в котором С1-8алкил частично или полностью замещен одним или более атомами галогена, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "галоген-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкилгалоген, в котором С1-8алкил частично или полностью замещен одним или более атомами галогена, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "галоген-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-Сь 8алкилгалоген.
В рамках изобретения термин "(галоген-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -N(Q -8алкил)(С1 -8алкилгалоген).
В рамках изобретения термин "(галоген-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкилгалоген)2.
В рамках изобретения термин "гетероарил-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -О-С1-8алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин "гетероарил-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин "гетероарил-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-Сь 8алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин "(гетероарил-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1 -8алкилгетероарил)2.
В рамках изобретения термин "(гетероарил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1 -8алкил)(С1 -8алкилгетероарил).
В рамках изобретения термин "гетероарил-С1-8алкиламино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН-С1-8алкилгетероарил.
В рамках изобретения термин "(гетероарил-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкилгетероарил)2.
В рамках изобретения термин "(гетероарил-С1-8алкил(С1-8алкил)амино-С1-8алкил"
,,,, относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкилгетероарил).
В рамках изобретения термин "гетероариламино" относится к радикалу формулы -МН-гетероарил.
В рамках изобретения термин "гетероциклил-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -О-С1-8алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин "гетероциклил-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин "гетероциклил-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1 -8алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин "(гетероциклил-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1 -8алкилгетероциклил)2.
В рамках изобретения термин "(гетероциклил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1 -8алкил)(С1 -8алкилгетероциклил).
В рамках изобретения термин "гетероциклил-С1-8алкиламино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1 -8алкил-МН-С1 -8алкилгетероциклил.
В рамках изобретения термин "(гетероциклил-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкилгетероциклил)2.
В рамках изобретения термин "(гетероциклил-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкилгетероциклил).
В рамках изобретения "гетероциклиламино" термин относится к радикалу формулы -МН-гетероциклил.
В рамках изобретения термин "(гетероциклил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)(гетероциклил).
В рамках изобретения термин "гетероциклиламино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН-гетероциклил.
В рамках изобретения термин "гетероциклилкарбонил" относится к радикалу формулы -С(О)-гетероциклил.
В рамках изобретения термин "гетероциклилкарбонилокси" относится к радикалу формулы -0-С(О)гетероциклил.
В рамках изобретения термин "гетероциклилокси" относится к радикалу формулы -О-гетероциклил. В рамках изобретения термин "гидрокси" относится к радикалу формулы -ОН.
В рамках изобретения термин "гидрокси-С1-8алкокси-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-О-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин "гидрокси-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-ОН, в котором С1-8алкил частично или полностью замещен одним или более радикалами гидрокси, если это позволяют доступные валентности.
В рамках изобретения термин "гидрокси-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил-0Н)2.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин "гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-МН-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил" относится к радикалу формулы -С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин "гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -0-С1-8алкил-МН-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -О-С1-8алкил-М(С1-8алкил-0Н)2.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкокси" относится к радикалу формулы -0-С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин "гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкил-МН-С1-8алкил-ОН.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил)2-амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил-МН-С1-8алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкил-М(С1-8алкил-ОН)2.
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкиламино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)(С1-8ажил-МН-С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин "[(гидрокси-С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)[С1-8алкил-М(С1-8алкил-ОН)2].
В рамках изобретения термин "(гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкиламино" относится к радикалу формулы -МН-С1-8алкил-М(С1-8алкил, С1-8алкил-ОН).
В рамках изобретения термин "[(гидрокси-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино" относится к радикалу формулы -М(С1-8алкил)[С1-8алкил-М(С1-8алкил)(С1-8алкил-ОН)].
В рамках изобретения термин "заместитель" означает позиционные переменные на атомах основной молекулы, которые присоединены в определяемом положении атома, заменяя один или более атомов водорода на определяемом атоме, при условии, что присоединяемый атом не превышает доступную валентность или общие валентности, так, что замещение приводит к стабильному соединению. Соответственно, комбинации заместителей и/или переменных допустимы, только если такие комбинации приводят к стабильным соединениям. Следует также отметить, что любой углерод, а также гетероатом с уровнем валентности, который представляется ненасыщенным, как описано или показано здесь, как предполагается, имеет достаточное число атома(ов) водорода, чтобы насытить описанные или показанные валентности.
В целях этого описания, где один или более заместителей для соединения формулы (1а1) охватывают функциональные группы, включенные в соединение формулы (1а1), каждая функциональная группа, находящаяся в любом местоположении в пределах раскрытого соединения, может быть независимо выбрана и быть независимо и/или в случае необходимости замещена.
В рамках изобретения термины "независимо выбранный" или "каждый выбранный" относятся к функциональным переменным в списке заместителей, которые могут быть присоединены более одного раза к структуре основной молекулы, причем структура замещения в каждом случае независима от структуры в любом другом случае. Далее, использование родового заместителя на основной структуре для приведенного здесь соединения, как следует понимать, включает замену родового заместителя специфическими заместителями, которые включены в рамки специфического рода, например, арил может быть независимо заменен фенилом или нафталинилом (также называемым нафтилом) и т.п., так, чтобы конечное соединение было включено в рамки соединений, описанных здесь.
В рамках изобретения термин "каждый случай", когда он используется во фразе, такой как "...арил, арил-С1-8алкил, гетероциклил и гетероциклил-С1-8алкил, причем каждый случай арила и гетероциклила может быть в случае необходимости замещен одним или двумя заместителями..." включает дополнительное независимое замещение на каждом арильном и гетероциклильном кольцах и на арильной и гете
роциклильной частях арил-С1-8алкила и гетероциклил-С1-8алкила.
В рамках изобретения термин "в случае необходимости замещенные" означает, что указанные заместители, группы, радикалы или части представляют диапазон рода и могут быть независимо выбраны, чтобы заменить один или более атомов водорода на определяемом атоме, присоединенном к основной молекуле.
В рамках изобретения термины "стабильное соединение" или "стабильная структура" означают соединение, которое является достаточно крепким для выделения с полезной степенью чистоты из реакционной смеси и его составления в эффективное терапевтическое средство.
Приведенные здесь названия соединений получали, используя программное обеспечение ЛСБ ЬаЪБ Index Мате, поставляемое ЛСБ ЬаЪБ, и/или программное обеспечение СпетЕ)га\у Ultra, поставляемое CambridgeSoft(r). Когда название соединения, раскрытого здесь, находится в противоречии с изображенной структурой, показанная структура имеет преимущество перед названием для определения этого соединения. Номенклатура для радикалов-заместителей, определенных здесь, может немного отличаться от химического названия, из которого они получены; специалисту понятно, что определение радикала заместителя включает радикал, как обнаруживается на химическом названии.
Термин "8М№', если иначе не определено, относится к человеческому гену 8МПМ2, ДНК или РНК. В частном варианте осуществления термин "8МШ" относится к человеческому гену 8МШ, термин "8ММ2" относится к человеческому гену 8МШ, ДНК или РНК.
Последовательности нуклеиновой кислоты для человеческих генов 8МШ и 8ММ известны в данной области техники. В отношении последовательностей нуклеиновой кислоты человеческого 8МШ, см., например, вепБапк Accession №os. DQ894095, ММ-000344, ММ-022874, и ВС062723. В отношении последовательностей нуклеиновой кислоты человеческого 8ММ2, см., например, ММ-022875, ММ-022876, ММ-022877, ММ-017411, DQ894734 (Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen), Карлсбад, Калифорния), ВС000908, ВС070242, СЯ595484, СЯ598529, СЯ609539, U21914 и ВС015308.
Ген 8ММ1 может быть найден последовательно по цепи человеческой хромосомы 5 от приблизительно нуклеотида 70220768 до приблизительно нуклеотида 70249769. Приблизительные местоположения экзонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8МШ на человеческой хромосоме 5 являются следующими:
70241893-70242003 экзон 6;
70242004-70247767 интрон 6; 70247768-70247821 экзон 7; 70247822-70248265 интрон 7 и
70248266-70248839 экзонов 8.
Ген 8ММ2 может быть найден последовательно по цепи человеческой хромосомы 5 от приблизительно нуклеотида 69345350 до приблизительно нуклеотида 69374349.
Приблизительные местоположения экзонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8ММ2 на человеческой хромосоме 5 являются следующими:
69366468-69366578 экзон 6;
69366579-69372347 интрон 6;
69372348-69372401 экзон 7;
69372402-69372845 интрон 7 и
69372846-69373419 экзон 8.
В частных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, показанные выше для эк-зонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8ММ1, используются в минигенных конструкциях нуклеиновой кислоты 8МШ, описанных здесь. В других частных вариантах осуществления нуклеотидные последовательности экзонов 6, 7 и 8 и интронов 6 и 7 8ММ2 в приведенных здесь примерах используются в минигенных конструкциях нуклеиновой кислоты 8ММ2, описанных здесь.
Термин "8mn" или "белок 8mn", если иначе не определено, относится к человеческому белку человека 8mn, который содержит аминокислотные остатки, кодируемые экзонами 1-7 гена 8ММ2. В частном варианте осуществления белок 8mn стабилен и функционален in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту. В другом частном варианте осуществления белок 8mn представляет собой полноразмерный белок, кодируемый человеческим геном 8МШ и/или геном 8ММ2. В другом частном варианте осуществления белок 8mn имеет аминокислотную последовательность, которую можно найти в GenBank под номером доступа ММЮ0335, ЛЛС50473.1, ААА66242.1 или №> _059107.
В рамках изобретения термин "усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2" и аналогичные термины, если иначе не определено, относится к включению полной, интактной, необрезанной последовательности экзона 7 8ММ2 в зрелую мРНК, которая транскрибируется от гена 8МПМ2 (т.е. приводя к продукции полноразмерной мРНК 8МШ) in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту, так чтобы повышенные уровни белка 8mn продуцировались от гена 8ММ2 in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы усиленная экспрессия стабильного и функционального белка 8mn продуцировалась от гена 8ММ2 in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специали
сту; или так, чтобы экспрессия слитого белка, кодируемого минигеном, усиливалась in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы экспрессия белка 8mn, продуцированного от гена 8ММ2, у пациента (например, животная модель для 8МЛ или человек-субъект с 8МЛ), усиливалась.
В рамках изобретения термин "усиливает включение экзона 7 8МШ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ1" и аналогичные термины, если иначе не определено, относится к включению полной, интактной, необрезанной последовательности экзона 7 8ММ1 в зрелую мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ (т.е. приводя к продукции полноразмерной мРНК 8МШ) in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту, так, чтобы повышенные уровни белка 8mn продуцировались от гена 8ММ1 in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы усиленная экспрессия стабильного и функционального белка 8mn продуцировалась от гена 8ММ1 in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы экспрессия слитого белка, кодируемого минигеном, усиливалась in vitro и/или in vivo, что может быть оценено способами, известными специалисту; или так, чтобы экспрессия белка 8mn, продуцированного от гена 8ММ1 у пациента (например, животная модель для 8МЛ или пациент-человек), усиливалась.
В рамках изобретения термин "существенное изменение" в контексте количества мРНК означает, что количество мРНК не изменяется статистически значительным количеством, например, значение р меньше чем значение, выбранное из 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 или 0,00001.
В рамках изобретения термины "субъект" и "пациент" используются взаимозаменяемо и относятся к животному или любому живому организму, имеющему чувствительность и способность к самостоятельному движению и который требует для своего существования кислорода и органической пищи. Неограничивающие примеры включают виды: человека, лошадей, свиней, крупного рогатого скота, крыс, мышей, собак и кошек. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой млекопитающее или теплокровное позвоночное животное. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой животное, не являющееся человеком. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой человека. В одном частном варианте осуществления пациентом является пациент с 8МЛ, являющийся человеком.
В рамках изобретения термин "пожилой человек" относится к человеку возрастом 65 лет или старше.
В рамках изобретения термин "взрослый человек" относится к человеку, имеющему возраст 18 лет или старше.
В рамках изобретения термин "ребенок" относится к человеку, имеющему возраст от 1 года до 18
лет.
В рамках изобретения термин "младенец" относится к новорожденному до 1 года. В рамках изобретения термин "малыш" относится к человеку, имеющему возраст от 1 года до 3 лет.
Формы соединения
В некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, соединение формулы (1а1) или ее формы выделяют для использования, причем форма выбрана из ее свободной кислоты, свободного основания или фармацевтически приемлемой соли.
В рамках изобретения термин "выделенный" означает физическое состояние соединения формулы (1а1) или ее формы после выделения и/или очистки в способе синтеза (например, из реакционной смеси) или из естественного источника или их комбинации согласно способу выделения или очистки, или способам, описанным здесь, или которые являются известными специалисту (например, хроматография, перекристаллизация и т.п.) с чистотой, достаточной для охарактеризовывания стандартными аналитическими методиками, описанными здесь или известными специалисту.
В рамках изобретения термин "защищенный" означает, что функциональная группа на соединении формулы (1а1) находится в форме, модифицированной таким образом, чтобы предотвратить нежелательные побочные реакции на защищенном участке, когда соединение подвергают реакции. Подходящие защитные группы известны специалисту, а также описаны в стандартных руководствах, таких как, например, T.W. Greene et а1., Protective Groups in 0^аг1к 8ynthesis (1991), Wiley, №w York.
Соединения формулы (1а1) могут образовывать соли, которые включены в рамки этого описания. Ссылка на соединение формулы (1а1) включает ссылку на его соли, если не указано иное. Термин "соль(и)" в рамках изобретения обозначает соли с кислотой, образованные с неорганическими и/или органическими кислотами, а также соли с основанием, образованные с неорганическими и/или органическими основаниями. Кроме того, когда соединение формулы (1а1) содержит как основную группу, такую как, но не ограничиваясь ими, пиридин или имидазол, и кислотную группу, такую как, но не ограничиваясь ей, карбоновая кислота, можно сформировать цвиттерионы ("внутренние соли"), которые включены в рамки термина "соль(и)", как он используется здесь.
Термин "фармацевтически приемлемая соль(и)" в рамках изобретения обозначает такие соли соединений, описанных здесь, которые являются безопасными и эффективными (т.е. нетоксичными, физиологически приемлемыми) для использования на млекопитающих, и которые обладают биологической ак
тивностью, хотя другие соли также могут быть использованы. Соли соединений формулы (1а1) можно образовать, например, вводя соединение формулы (1а1) в реакцию с количеством кислоты или основания, таким как эквивалентное или стехиометрическое количество, в такой среде, как среда, в которой соль осаждается, или в водной среде, с последующей лиофилизацией.
Фармацевтически приемлемые соли включают одну или более солей кислых или основных групп, прсутствующих в соединениях, описанных здесь. Варианты солей присоединения с кислотой включают, но не ограничены ими, ацетат, кислый фосфат, аскорбат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, битар-трат, борат, бутират, хлорид, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, этансульфонат, формиат, фумарат, гентизинат, глюконат, глюкуронат, глутамат, гидробромид, гидрохлорид, дигидрохлорид, гидройодид, изоникотинат, лактат, малеат, метансульфонат, нафталинсульфонат, нитрат, оксалат, памоат, пантотенат, фосфат, пропионат, сахарат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат (также известный как тозилат), трифторацетат и т.п. Один или более вариантов солей присоединения с кислотой включают хлорид, гидрохлорид, дигидрохлорид, тригидрохлорид, гидробромид, ацетат, диацетат или трифторацетат. Более конкретные варианты осуществления включают хлорид, гидрохлорид, дигидро-хлорид, гидробромид или трифторацетат.
Дополнительно, кислоты, которые вообще считают подходящими для образования фармацевтически пригодных солей из основных фармацевтических соединений, обсуждаются, например, P. 8tah1 et а1., Cami11e G. (eds.) №ndbook of Pharmaceutica1 8alts. Properties, 8e1ection and Use. (2002) Zurich: Wiley-УСН; 8. Berge et al., Journal of Pharmaceutical 8ciences (1977) 66(1) 1-19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33, 201-217; Лnderson et al., The Practice of Medicina1 ОЮПШГГУ (1996), Лcademic Press, №w York; и в The 0range Book (see, website for Food & Drug Administration, Washington, D.C). Эти раскрытия включены в настоящее описание путем ссылки.
Подходящие основные соли включают, но не ограничены ими, соли алюминия, аммония, кальция, лития, магния, калия, натрия, цинка и диэтаноламина. Некоторые соединения, описанные здесь, могут также образовывать фармацевтически приемлемые соли с органическими основаниями (например, органическими аминами), такими как, но не ограничиваясь ими, дициклогексиламины, трет-бутиламины и т.п., и с различными аминокислотами, такими как, но не ограничиваясь ими, аргинин, лизин и т.п. Основные азотсодержащие группы могут быть кватернизованы такими агентами как низшие галогеналкилы (например, метил-, этил- и бутил-хлориды, бромиды и йодиды), диалкилсульфаты (например, диметил-, диэтил- и дибутил-сульфаты), длинноцепочечные галогениды (например, децил-, лаурил- и стеарил-хлориды, бромиды и йодиды), аралкил галогениды (например, бензил- и фенетил-бромиды) и другие.
Все такие соли с кислотой и соли с основанием могут быть фармацевтически приемлемыми солями в рамках описания, приведенного здесь, и все такие соли с кислотой и основанием считаются эквивалентными свободным формам соответствующих соединений в целях, описанных здесь.
В рамках изобретения термин "в основном чистый" относится к соединениям, состоящим в основном из единственного изомера в количестве, больше или равном 90%, в количестве, больше или равном 92%, в количестве, больше или равном 95%, в количестве, больше или равном 98%, в количестве, больше или равном 99%, или в количестве, равном 100% единственного изомера.
Полиморфные кристаллические и аморфные формы соединений формулы (Ia1) и соли, сольваты, сложные эфиры и пролекарства соединений формулы (Ia1) также включены в понятие соединений, описанных здесь.
Применения соединений
Здесь описаны соединения формулы (Ia1) или ее формы, которые усиливают включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2. Было показано с использованием тестов, описанных здесь (см. раздел биологических примеров, ниже), что такие соединения формулы (Ia1) или ее формы усиливают включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2. Соответственно, соединения формулы (Ia1) или ее формы могут быть использованы в качестве усилителей включения экзона 7 8МШ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8МШ.
В одном аспекте изобретение относится к способам модуляции включения экзона 7 8ММ2 в РНК, транскрибируемую от гена 8ММ2, включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способам модуляции включения экзона 7 8ММ2 в РНК, транскрибируемую от гена 8ММ2, включающим контактирование человеческой клетки с соединением формулы (Ia1) или ее формы, которая модулирует экспрессию минигена 8ММ2, описанного здесь или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы (Ia1) или ее формы in vitro и/или in vivo, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с 8МЛ или находит
ся в организме человека-пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы (Ia1) или ее формы. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы (Ia1) или ее формы, которая усиливает экспрессию минигена 8ММ2, описанного здесь или в Международной Публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы (Ia1) или ее формы in vitro и/или in vivo, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с 8МЛ или находится в организме человека-пациента с 8МЛ. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с 8МЛ или находится в организме человека-пациента с 8МЛ, причем 8МЛ вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене 8ММ1 на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8МШ. В другом варианте осуществления человеческая клетка представляет собой человеческую клетку от пациента с 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления человеческая клетка происходит от линии клеток, такой как GM03813, GM00232, GM09677 и/или GM23240 (доступна от Corie11 Institute). В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам усиления включения эк-зона 7 8ММ1 и 8ММ2 в РНК, транскрибируемую от генов 8ММ1 и 8ММ2, включающим контактирование человеческой клетки с соединением формулы (Ia1) или ее формы. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы (Ia1) или ее формы in vitro и/или in vivo, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с 8МЛ или находится в организме человека-пациента с 8МЛ. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способу модуляции включения экзона 7 8ММ2 в РНК, транскрибируемую от гена 8ММ2, включающему введение животной модели для 8МЛ соединения формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу модуляции включения экзона 7 8ММ в РНК, транскрибируемую от гена 8ММ2, включающему введение животной модели для 8МЛ соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое модулирует экспрессию минигена 8ММ2, описанного здесь или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом зарианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, включающему введение животной модели для 8МЛ соединения формулы (Ia1) или ее формы. Б другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, включающему введение животной модели для 8МЛ соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое усиливает экспрессию минигена 8ММ2, описанного здесь или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В одном варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в примерах международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом варианте осуществления миниген представляет собой миниген, описанный в биологическом примере 1, ниже. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзо-на 7 8ММ2 в РНК, транскрибируемую от гена 8ММ2, включающему введение животной модели для 8МЛ соединения формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способу увеличения количества белка 8mn, включающему контактирование человеческой клетки с соединением формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу увеличения количества белка 8mn, включающе
му контактирование человеческой клетки с соединением формулы (Ia1), которое усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2. Человеческую клетку можно ввести в контакт с соединением формулы (Ia1) или ее формы in vitro и/или in vivo, например, в организме животного или человека. В частном варианте осуществления человеческая клетка получена от человека или находится в организме человека. В другом частном варианте осуществления человеческая клетка получена от пациента с 8МЛ или находится в организме человека-пациента с 8МЛ. В другом варианте осуществления человеческая клетка представляет собой человеческую клетку от пациента с 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления человеческая клетка происходит от линии клеток, такой как GM03813, GM00232, GM09677 и/или GM23240 (доступна от G)riell Institute). В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способу увеличения количества белка 8mn, включающему введение животной модели для 8МЛ соединения формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу увеличения количества белка 8mn, включающему введение животной модели для 8МЛ соединения формулы (Ia1), которое усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2 в, например, клеточном или бесклеточном тесте, таком как описанный в биологических примерах, ниже.
В одном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) усиливает экспрессию минигена, описанного здесь или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) усиливает экспрессию минигена, описанного в Примерах международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833. В другом частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) усиливает экспрессию минигена, описанного в биологическом примере 1, ниже. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В одном варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (Ia1) или ее формы для получения лекарственного средства, которое усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2. В другом варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (Ia1) или ее формы для получения лекарственного средства, которое усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, таким образом увеличивая экспрессию белка 8mn у пациента-человека. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2 в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способам усиления включения экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, у пациента-человека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления включения экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, у пациента-человека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы вводят пациенту-человеку в фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ. В другом частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ, причем 8МЛ вызвана инактивирую-щей мутацией или делецией в гене 3ММ1 на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8МШ. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способам усиления экспрессии белка 8mn у пациента-человека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу усиления экспрессии белка 8mn у пациента-человека, включающим введение человеку эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы вводят пациенту-человеку в фармацевтической композиции, включающей фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2 в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже), или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, Примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание
путем ссылки.
В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ. В другом частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ, причем 8МЛ вызвана инактивирующей мутацией или делецией в теломерной копии гена 8ММ1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8МШ. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (Ia1) или ее формы для получения лекарственного средства, которое усиливает экспрессию белка 8mn у пациента-человека. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже), или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом аспекте изобретение относится к способам лечения спинальной мышечной атрофии (8МЛ), включающему введение пациенту эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8МЛ у пациента-человека, включающему введение пациенту эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8МЛ у пациента-человека, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, включающей эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В одном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8МЛ у пациента-человека, включающему зведение пациенту эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ММ в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2. В частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8МЛ у пациента-человека, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, включающей эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения 8МЛ у пациента-человека, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, включающая эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое усиливает включение экзона 7 8ММ1 и/или 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ1 и/или 8ММ2, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2 в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже) или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, Примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В другом варианте осуществления изобретение относится к применению соединения формулы (Ia1) или ее формы в получении лекарственного средства для лечения 8МЛ у пациента-человека. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже). В другом варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы усиливает включение экзона 7 8ММ2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8ММ2, как определено в тесте, описанном здесь (см., например, биологические примеры, ниже), или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (см., например, Примеры в этих публикациях), каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В частном варианте осуществления соединение представляет собой соединение формулы (Ia1) или ее формы.
В варианте способа по изобретению соединения формулы (Ia1) или ее формы используются в комбинации с одним или более дополнительными средствами. Соединение(я) формулы (Ia1) или ее формы может вводиться пациенту или контактировать с клеткой до, одновременно с или после введения пациенту или контактирования клетки с дополнительным средством(ами). Соединение(я) формулы (Ia1) или ее формы и дополнительное средство(а) может вводиться пациенту или контактировать с клеткой в
единственной композиции или разных композициях. В некоторых вариантах осуществления соединение^) формулы (Ia1) или ее формы используется в комбинации с заменой гена 8MN1 (с использованием, например, вирусных векторов доставки). В других частных вариантах осуществления соединение(я) формулы (Ia1) или ее формы используется в комбинации с заменой клетки с использованием дифференцированных стволовых клеток 8МШ+Л и/или 8MN2+A В других частных вариантах осуществления со-единение(я) формулы (Ia1) или ее формы используются в комбинации с заменой клетки с использованием дифференцированных стволовых клеток 8MN1+/+. В других частных вариантах осуществления соеди-нение(я) формулы (Ia1) или ее формы используются в комбинации с заменой клетки с использованием дифференцированных стволовых клеток 8MN2+/+. В другом частном варианте осуществления соедине-ние(я) формулы (Ia1) или ее формы используется в комбинации с акларубицином. В другом частном варианте осуществления соединение(я) формулы (Ia1) или ее формы используется в комбинации с активатором транскрипции, таким как ингибитор гистон деацетилазы ("HDAC") (например, бутираты, вальп-роевая кислота и гидроксимочевина) и стабилизаторами мРНК (например, мРНК декэпирующий ингибитор RG3039 от Repligen).
В некоторых вариантах осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) имеет терапевтический эффект и/или благоприятный эффект. В частном варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) производит один, два или более из следующих эффектов: (i) уменьшает или облегчает серьезность 8МЛ; (ii) задерживает начало 8МЛ; (iii) ингибирует прогрессию 8МЛ; (iv) уменьшает частоту госпитализации пациента; (v) уменьшает продолжительность госпитализации для пациента; (vi) увеличивает выживаемость пациента; (vii) улучшает качество жизни пациента; (viii) уменьшает количество симптомов, связанных с 8МЛ; (ix) уменьшает или облегчает серьезность симптома(ов), связанного с 8МЛ; (х) уменьшает продолжительность симптома, связанного с 8МЛ; (xi) предотвращает рецидив симптома, связанного с 8МЛ; (xii) инги-бирует развитие или начало симптома 8МЛ; и/или (xiii) ингибирует прогрессию симптома, связанного с 8МЛ.
Симптомы 8МЛ включают слабость мышц, недостаточный мышечный тонус, слабый крик, слабый кашель, вялость или тенденцию к падению, затруднение всасывания или глотания, затруднение дыхания, накопление секреций в легких или верхних дыхательных путях, сжимание кулака потной рукой, дрожь/вибрацию языка, голову, часто наклоняемую к одной стороне даже в положении лежа, ноги, которые имеют тенденцию быть более слабыми, чем руки, ноги, часто принимающие положение "лягушачьих лапок", трудности с кормлением, повышенную восприимчивость к инфекциям дыхательных путей, слабость кишечника/мочевого пузыря, массу тела ниже нормы, неспособность сидеть без поддержки, невозможность ходить, невозможность ползать и гипотонию, арефлексию и множественные врожденные контрактуры (артрогрипоз), связанные с потерей клеток переднего рога.
В частном варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) производит один, два или более следующих эффектов: (i) сокращение потери силы мышц; (ii) увеличение силы мышцы; (iii) сокращение атрофии мышцы; (iv) сокращение потери моторной функции; (v) увеличение количества мотонейронов; (vii) сокращение потери мотонейронов; (viii) защита 8MN дефицитных мотонейронов от дегенерации; (ix) увеличение моторной функции; (х) увеличение легочной функции; и/или (xi) сокращение потери легочной функции.
В другом варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность ребенка или младенца к сидению. В другом варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца, ребенка младшего возраста, ребенка или взрослого вставать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца, ребенка младшего возраста, ребенка или взрослого ходить без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца, ребенка младшего возраста, ребенка или взрослого бегать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца, ребенка младшего возраста, ребенка или взрослого дышать без посторонней помощи. В другом варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца, ребенка младшего возраста, ребенка или взрослого поворачиваться во сне без посторонней
помощи. В другом варианте осуществления лечение 8МЛ соединением формулы (Ia1) или ее формы (индивидуально или в комбинации с дополнительным средством) приводит к функциональной способности или помогает сохранять функциональную способность младенца, ребенка младшего возраста, ребенка или взрослого глотать без посторонней помощи.
В некоторых вариантах осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8MN, такие как 8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или 8EQ ID N0. 2, 9 или 12, и зонды 8MN, такие как 8EQ ID N0. 3 или 10), используется в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот, для определения того, усиливает ли соединение формулы (Ia1) или ее формы включение экзона 7 8MN1 и/или 8MN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN1 и/или 8MN2. В некоторых вариантах осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8MN, такие как 8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 или 13 и/или 8EQ ID N0. 2, 9 или 12, и зонды 8MN, такие как 8EQ ID N0. 3 или 10), используется в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот или Саузерн-блот, или фармацевтическом продукте или наборе для теста, таких как описанные ниже, для контроля ответов пациента на соединение формулы (Ia1) или ее формы.
Популяция пациентов
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, страдающему 8МЛ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы вводят пациенту, предрасположенному или склонному к 8МЛ. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту-человеку, причем пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ, причем 8МЛ вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене 8MN1 в обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8MN1. В некоторых вариантах осуществления пациента-человека гено-типируют до введения соединения формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтической композиции, чтобы определить, имеет ли пациент инактивирующую мутацию или делецию в теломерной копии гена 8MN1 в обеих хромосомах, которая приводит к потере функции гена 8MN1. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 0 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 1 8МЛ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 2 8МЛ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы, или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 3 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту с типом 4 8МЛ.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенного включения экзона 7 8MN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенной экспрессии белка 8mn.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят человеку, который имеет возраст в диапазоне от приблизительно О месяцев до приблизительно 6 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 12 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 18 месяцев, от приблизительно 18 до приблизительно 36 месяцев, от приблизительно 1 до приблизительно 5 лет, от приблизительно 5 до приблизительно 10 лет, от приблизительно 10 до приблизительно 15 лет, от приблизительно 15 до приблизительно 20 лет, от приблизительно 20 до приблизительно 25 лет, от приблизительно 25 до приблизительно 30 лет, от приблизительно 30 до приблизительно 35 лет, от приблизительно 35 до приблизительно 40 лет, от приблизительно 40 до приблизительно 45 лет, от приблизительно 45 до приблизительно 50 лет, от приблизительно 50 до приблизительно 55 лет, от приблизительно 55 до приблизительно 60 лет, от приблизительно 60 до приблизительно 65 лет, от приблизительно 65 до приблизительно 70 лет, от приблизительно 70 до приблизительно 75 лет, от приблизительно 75 до приблизительно 80 лет, от приблизительно 80 до приблизительно 85 лет, от приблизительно 85 до приблизительно 90 лет, от приблизительно 90 до приблизительно 95 лет или от приблизительно 95 до приблизительно 100 лет.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят младенцу. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят ребенку младшего возраста. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят взрослому человеку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пожилому человеку.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы, или его фармацевтической композиции вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы, или его фармацевтической композиции вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтическую композицию вводят пациенту 8МЛ для лечения или облегчения 8МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту 8МЛ для лечения или облегчения 8МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту 8МЛ, чтобы предотвратить прогрессию 8МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его фармацевтической композиции вводят пациенту 8МЛ для лечения или облегчения 8МЛ.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы, или его лекарственного средства вводят пациенту, страдающему 8МЛ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы вводят пациенту, предрасположенному или склонному к 8МЛ. В частном варианте осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту-человеку, причем пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ, причем 8МЛ вызвана инактивирующей мутацией или делецией в гене 8MN1 на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8MN1. В некоторых вариантах осуществления пациента-человека генотипируют до введения соединения формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственного средства, чтобы определить, имеет ли пациент инактивирующую мутацию или делецию в теломерной копии гена 8MN1 в обеих хромосомах, которая приводит к потере функции гена 8MN1. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 0 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 1 8МЛ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 2 8МЛ. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 3 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту с типом 4 8МЛ.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенного включения экзона 7 8MN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2. В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту, который получит или может получить пользу от увеличенной экспрессии белка 8mn.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят человеку, который имеет возраст в диапазоне от приблизительно 0 месяцев до приблизительно 6 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 12 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 18 месяцев, от приблизительно 18 до приблизительно 36 месяцев, от приблизительно 1 до приблизительно 5 лет, от приблизительно 5 до приблизительно 10 лет, от приблизительно 10 до приблизительно 15 лет, от приблизительно 15 до приблизительно 20 лет, от приблизительно 20 до приблизительно 25 лет, от приблизительно 25 до приблизительно 30 лет, от приблизительно 30 до приблизительно 35 лет, от приблизительно 35 до приблизительно 40 лет, от приблизительно 40 до приблизительно 45 лет, от приблизительно 45 до приблизительно 50 лет, от приблизительно 50 до приблизительно 55 лет, от приблизительно 55 до приблизительно 60 лет, от приблизительно 60 до приблизительно 65 лет, от приблизительно 65 до приблизительно 70 лет, от приблизительно 70 до приблизительно 75 лет, от приблизительно 75 до приблизительно 80 лет, от приблизительно 80 до приблизительно 85 лет, от приблизительно 85 до приблизительно 90 лет, от приблизительно 90 до приблизительно 95 лет или от приблизительно 95 до приблизительно 100 лет.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят младенцу. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят ребенку младшего возраста. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят ребенку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят взрослому человеку. В других вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пожилому человеку.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту, чтобы предотвратить начало 8МЛ у пациента, для которого существует риск проявления 8МЛ.
В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственное средство вводят пациенту 8МЛ для лечения или облегчения 8МЛ. В других вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту 8МЛ для лечения или облегчения 8МЛ. В других вариантах осуществления профилактически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту 8МЛ, чтобы предотвратить прогрессию 8МЛ. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы или его лекарственного средства вводят пациенту 8МЛ для лечения или облегчения 8МЛ.
Способ введения
При введении пациенту соединение формулы (Ia1) или ее формы предпочтительно вводят как компонент композиции, которая в случае необходимости включает фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. Композиция может вводиться перорально или любым другим удобным путем, например, инфузией или болюсным вливанием, абсорбцией через эпителиальные или кожно-слизистые покровы (например, слизистую оболочку полости рта, прямой кишки и кишечника) и может вводиться вместе с другим биологически активным средством. Введение может быть системным или местным. Известны различные системы доставки, например, инкапсуляция в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, капсулах, и они могут использоваться для введения соединения.
Способы введения включают, но не ограничены ими, парентеральный, кожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, внутриносовой, эпидуральный, пероральный, подъязычный, внутриносовой, внутрицеребральный, внутривлагалищный, чрескожный, ректальный, ингаляцией или топический, особенно в уши, нос, глаза или кожу. Способ введения оставлен на усмотрение практикующего врача. В большинстве случаев введение приводит к высвобождению соединения в кровоток. В частном варианте осуществления соединение вводят перорально.
Дозировка и лекарственные формы
Количество соединения формулы (Ia1) или ее формы, которое будет эффективно в лечении 8МЛ, зависит, например, от пути введения, типа 8МЛ, общего состояния здоровья пациента, этнической принадлежности, возраста, массы тела и пола пациента, диеты, времени и серьезности 8МЛ, и должно быть определено согласно суждению практикующего врача и обстоятельств каждого пациента или лица.
В некоторых вариантах осуществления "эффективное количество", "профилактически эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" в контексте введения соединения формулы (Ia1) или ее формы, или его композиции или лекарственного средства, относится к количеству соединения формулы (Ia1), которое оказывает терапевтический эффект и/или благоприятное воздействие. В некоторых частных вариантах осуществления "эффективное количество", "профилактически эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" в контексте введения соединения формулы (Ia1) или ее формы, или его композиции или лекарственного средства, приводит к одному, двум или более из следующих эффектов: (i) уменьшает или облегчает серьезность 8МЛ; (ii) задерживает начало 8МЛ; (iii) ингибирует прогрессию 8МЛ; (iv) уменьшает частоту госпитализации пациента; (v) уменьшает продолжительность госпитализации для пациента; (vi) увеличивает выживаемость пациентов; (vii) улучшает качество жизни пациента; (viii) уменьшает количество симптомов, связанных с 8МЛ; (ix) уменьшает или облегчает серьезность симптома(ов), связанного с 8МЛ; (х) уменьшает продолжительность симптома, связанного с 8МЛ; (xi) предотвращает рецидив симптома, связанного с 8МЛ; (xii) ингибирует развитие или начало симптома 8МЛ; и/или (xiii) ингибирует прогрессию симптома, связанного с 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы представляет собой количество, эффективное для усиления включения экзона 7 8MN2 в мРНК 8MN2, которая транскрибируется от гена 8MN2, и увеличения уровней белка 8mn, продуцируемого от гена 8MN2, и, таким образом, создания желательного благоприятного воздействия у пациента. В некоторых случаях желаемый эффект может быть определен путем анализа или количественного определения: (1) включения экзона 7 8MN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2; или (2) уровней белка 8mn, продуцируемого от гена 8MN2. Неограничивающие примеры эффективных количеств соединения формулы (Ia1) или ее формы описаны здесь.
Например, эффективное количество может быть количеством, требуемым для лечения 8МЛ у пациента-человека, или количеством, требуемым для усиления включения экзона 7 8MN2 в мРНК, которая
транскрибируется от гена 8MN2, у пациента-человека, или количеством, требуемым для увеличения уровней белка 8mn, продуцируемого от гена 8MN2 у пациента-человека. В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ.
В общем, эффективное количество будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,001 мг/кг/сутки до приблизительно 500 мг/кг/сутки для пациента или субъекта, имеющего массу тела в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 200 кг. Типичный взрослый пациент, как ожидают, будет иметь в среднем массу тела в диапазоне от приблизительно 70 до приблизительно 100 кг.
В рамках настоящего описания "эффективное количество" соединения формулы (Ia1) или ее формы для применения в получении лекарственного средства, получении фармацевтического набора или в способе лечения 8МЛ у пациента-человека включает количество в диапазоне от приблизительно 0,001 до приблизительно 35000 мг. В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ.
Композиции, описанные здесь, составляют для введения пациенту через любой путь доставки лекарственного средства, известный в данной области техники. Неограничивающие примеры включают пероральный, глазной, ректальный, щечный, топический, носовой, офтальмический, подкожный, внутримышечный, внутривенный (болюс и инфузия), внутрицеребральный, чрескожный и легочный пути введения.
Фармацевтические композиции
Варианты осуществления, описанные здесь, включают использование соединения формулы (Ia1) или ее формы в фармацевтической композиции. В частном варианте осуществления описано применение соединения формулы (Ia1) или ее формы в фармацевтической композиции для лечения 8МЛ у пациента-человека, включающее введение эффективного количества соединения формулы (Ia1) или ее формы в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом. В частном варианте осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ.
Соединение формулы (Ia1) или ее формы может в случае необходимости быть в форме композиции, включающей соединение или его форму и дополнительный носитель, эксципиент или разбавитель. Другие варианты осуществления включают фармацевтические композиции, включающие эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В частном варианте осуществления фармацевтические композиции являются подходящими для введения животному и/или человеку. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть в любой форме, которая позволяет вводить композицию пациенту.
В частном варианте осуществления и в этом контексте термин "фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель" означает носитель, эксципиент или разбавитель, апробированный регулирующим агентством федеральной власти или власти штата или указанный в Фармакопее США или другой в целом признанной фармакопее для использования на животных, и более конкретно, у человека. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному)), эксципиенту или носителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая таковые нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода представляет собой специфический носитель для внутривенно вводимых фармацевтических композиций. Физиологические растворы и водный раствор декстрозы и растворы глицерина могут также использоваться как жидкие носители, особенно для инъецируемых растворов.
Типичные композиции и лекарственные формы включают один или более эксципиентов. Подходящие эксципиенты известны специалисту в области фармации, и неограничивающие примеры подходящих эксципиентов включает крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, сили-кагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Является ли специфический эксципиент подходящим для включения в фармацевтическую композицию или лекарственную форму, зависит от различных факторов, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, путь, которым лекарственную форму вводят пациенту, и конкретные активные ингредиенты в лекарственной форме. Изобретение также относится к безводным фармацевтическим композициям и лекарственным формам, включающим одно или более соединений формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. Композиции и лекарственные формы могут принимать форму растворов или сиропов (в случае необходимости с ароматизатором), суспензий (в случае необходимости с ароматизатором), эмульсий, таблеток (например, жевательных таблеток), пилюль, капсул, гранул, порошка (в случае необходимости для восстановления), составов с замаскированным вкусом или замедленного высвобождения и т.п.
Фармацевтические композиции по изобретению, которые являются подходящими для перорального введения, могут быть представлены как отдельные лекарственные формы, такие как, но не ограничиваясь ими, таблетки, каплеты, капсулы, гранулы, порошок и жидкости. Такие лекарственные формы содержат предопределенные количества активных ингредиентов, и могут быть получены способами, известными специалисту в области фармации.
Примеры эксципиентов, которые могут использоваться в пероральной лекарственной форме по изобретению, включают, но не ограничены ими, связующие, наполнители, разрыхлители и лубриканты.
Биомаркеры
В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, используется как биомаркер для 8МЛ. В некоторых вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, используется как биомаркер для 8МЛ. В других вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, используется как биомаркер для пациента с 8МЛ, получающего лечение соединением, таким как раскрытое здесь. В других вариантах осуществления количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, используется как биомаркер для пациента с 8МЛ, получающего лечение соединением, таким как раскрытое здесь. В некоторых вариантах осуществления изменение в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2 и соответствующее изменение в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, представляет собой биомаркер для пациента, получающего лечение соединением, таким как раскрытое здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и соответствующее уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2 после введения соединения (например, соединения формулы (Ia1), раскрытого здесь) указывает, что соединение может быть эффективным для лечения 8МЛ. В другом частном варианте осуществления уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и соответствующее увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2 после введения соединения (например, соединения формулы (Ia1), раскрытого здесь) указывает, что соединение не будет эффективно лечить 8МЛ. В соответствии с этими вариантами осуществления, праймер(ы) 8MN и/или зонд 8MN, описанные ниже, могут использоваться в тестах, таких как PCR (например, qPCR) и RT-PCR (например, RT-qPCR или RT по окончании PCR), для оценки и/или количественного определения количества мРНК, которая транскрибируется от гена гена 8MN2 и включает или не включает экзон 7 из 8MN2.
В одном варианте осуществления изобретение относится к праймерам 8MN и/или зондам 8MN (например, прямой лраймер, имеющий нуклеотидную последовательность 8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 или 13; и/или обратный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность 8EQ ID N0. 9 или 12; и/или зонд 8MN, такой как 8EQ ID N0. 3 или 10) для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8MN2. Эти праймеры могут использоваться как праймеры в, например, RT-PCR (такой как RT-PCR, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR, как описано здесь или как известно специалисту), PCR (такой как qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, и как зонды в тестах гибридизации, таких как Нозерн-блот и/или Саузерн-блот. В биологических примерах, описанных здесь, RT по окончании PCR представляет собой полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, которую осуществляют для определенного числа циклов амплификации (или до исчерпания исходных материалов) с последующим количественным анализом каждого продукта ДНК, с использованием, например, гель-электрофоретического разделения, окрашивания флуоресцентным красителем, количественного анализа флюоресценции и т.п.
8EQ ID N0. 1 гибридизуется с ДНК или РНК, включающей нуклеотиды, соответствующие нуклео-тидам 22-40 из экзона 7 8MN2, 8EQ ID N0. 2 гибридизуется с ДНК или РНК, включающей нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 4-26 из последовательности, кодирующей люциферазу светлячка; 8EQ ID N0. 7 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 32-54 из экзона 7 8MN2 и нуклеотидам 1-4 из экзона 8 из 8MN2, 8EQ ID N0. 8 гибридизуется с последовательностям нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 87-111 из экзона 7 8MN2 и нуклеотидам 1-3 из экзона 8 из 8MN2, 8EQ ID N0. 9 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, антисмысловая цепь ДНК или РНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 39-62 из экзона 8 из 8MN2, 8EQ ID N0. 11 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 43-63 из экзона 6 из 8MN2, 8EQ ID N0. 12 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, антисмысловая цепь ДНК или РНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 51-73 из экзона 8 из 8MN2, и 8EQ ID N0. 13 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 22-46 из экзона 6 из 8MN2.
Соответственно, олигонуклеотид, соответствующий 8EQ ID N0. 9, 11, 12 и/или 13, может использоваться в реакции амплификации для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8MN2, не содержащим экзон 7 из человеческих 8MN2, и нуклеиновой кислоты, кодирующей или кодируемой человеческим 8MN2 и включающей экзон 7 из человеческих 8MN2. Напротив, олигонуклеотид, соответствующий 8EQ ID N0. 8, в сочетании с обратным даунстрим-праймером (на
пример, 8EQ ID N0. 9 или 12) может использоваться для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8MN2, не содержащим экзон 7 из человеческих 8MN2, и олигонук-леотида, соответствующего 8EQ ID N0. 1 и 7, в сочетании с обратным даунстрим-праймером (например, 8EQ ID N0. 9 или 12) может использоваться для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих или кодируемых человеческим 8MN1 и/или 8MN2 и включающих экзон 7 из 8MN2.
8EQ ID N0. 3 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 50-54 из экзона 7 из человеческих 8MN2 и нуклеотидам 1-21 из экзона 8 из человеческих 8MN2, и 8EQ ID N0. 10 гибридизуется с последовательностями нуклеиновой кислоты (например, смысловая цепь ДНК), включающими нуклео-тиды, соответствующие нуклеотидам 7-36 из экзона 8 из человеческих 8MN2. 8EQ ID N0. 3 может быть использована как зонд для детекции мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает экзон 7 из 8MN2, описанного здесь или описанного в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833 (каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки), и детекции мРНК, которая транскрибируется от человеческого 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2. Кроме того, 8EQ ID N0. 10 может быть использована как зонд для детекции мРНК, которая транскрибируется от минигена и включает или не включает экзон 7 из 8MN2, и детекции мРНК, которая транскрибируется от человеческого 8MN1 и/или 8MN2, описанного здесь, или как описано в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки.
В частном варианте осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8MN, такие как 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13 и/или 8EQ ID N0. 2, 9 или 12, и/или зонды 8MN, такие как 8EQ ID N0. 3 или 10), используется в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, тест, такой как описанный ниже в биологических примерах), для определения того, усиливает ли соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы) включение эк-зона 7 8MN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8MN, такие как 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13 и/или 8EQ ID N0. 9 или 12, и/или зонды 8MN, такие как 8EQ ID N0. 3 или 10), используется в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, тест, такой как описанный ниже в биологических примерах), для контроля количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В другом варианте осуществления праймер и/или зонд, описанный ниже в биологических примерах (например, праймеры 8MN, такие как 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13 и/или 8EQ ID N0. 9 или 12, и/или зонды 8MN, такие как 8EQ ID N0. 3 или 10), используется в тесте, таком как RT-PCR, RT-qPCR, RT по окончании PCR, PCR, qPCR, амплификация по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блот или Саузерн-блот (например, тест, такой как описанный ниже в биологических примерах), для контроля ответа пациента на соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы). В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
Образец (например, проба крови, образец РВМС или образец ткани, такой как образец ткани кожи или мышцы) от пациента может быть получен с использованием методик, известных специалисту, и праймеры и/или зонды, описанные ниже в биологических примерах, могут использоваться в тестах (например, PCR, RT-PCR, RT-qPCR, qPCR, RT по окончании PCR, амплификация по типу катящегося кольца, Нозерн-блот и Саузерн-блот) для определения количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 (например, количества мРНК, которая включает экзон 7 из 8MN2, транскрибированных от гена 8MN2). Образец, полученный от пациента, относится к образцу, который обрабатывают и/или манипулируют после получения от пациента, используя методики, известные специалисту. Например, образец от пациента может быть обработан, например, для экстракции РНК, с использованием методик, известных специалисту. Образец от пациента может быть обработан, например, для экстракции РНК, и РНК обратно транскрибируют, чтобы получить кДНК. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соедине
ние формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
Количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена 8MN2, которая включает экзон 7 из 8MN2, и количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, может быть дифференцировано друг от друга, например, размером фрагмента РНК или ДНК, генерируемого от мРНК 8MN2, которая включает экзон 7 из 8MN2, и от мРНК 8MN2, которая не включает экзон 7 из 8MN2.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами, например, для RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR), амплификации по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR), амплификации по типу катящегося кольца и, если применимо, Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (b) детекцию количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2.
Количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена 8MN2, которая включает экзон 7 из 8MN2, и количество мРНК, которая транскрибируется от человеческого гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, может быть дифференцировано друг от друга, например, размером фрагмента РНК или ДНК, генерируемого от мРНК 8MN2, которая включает экзон 7 из 8MN2, и от мРНК 8MN2, которая не включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN1 и/или 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми
компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR), амплификации по типу катящегося кольца, или Нозерн-блота или Саузерн-блота; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от генов 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, если применимо; и (b) детекции количества мРНК, которая транскрибируется от генов 8MN2. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
Количество мРНК, которая транскрибируется от человеческих генов 8MN2, которая включает экзон 7 из 8MN2, и количество мРНК, которая транскрибируется от человеческих генов 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, может быть дифференцировано друг от друга, например, размером фрагмента РНК или ДНК, генерируемого от мРНК 8MN2, которая включает экзон 7 из 8MN2, и от мРНК 8MN2, которая не включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу детекции количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, включающему: (а) контактирование образца пациента (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение, такое как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В частном варианте осуществления пациент представляет собой пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение, описанное здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть полезным или является полезным
и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным: здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и
включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR)
или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем
(1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из
8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не
включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от
пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение мо-
жет быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие
изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и
не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибиру-
ется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого
типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соедине-
ние и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В
некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7,
14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение фор-
мулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным: здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и
(2) (i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибирует-
ся от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая
транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же
самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) отсутствие изменения или сущест-
венного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7
из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и
не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количествы мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) (i) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев
или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR) или PCR (например, qPCR), причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу оценки ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование
образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) (i) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца, ткани) от пациента до введения соединения указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента оценивают через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего
от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50, или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы как описано здесь); и (b) детекцию количествы мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12,
16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как из формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 11 или 13), и/или
обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или
обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля чувствительности пациента с 8МЛ к соединению, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 8, 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (на
пример, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты указывает, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после зведения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает эк-зон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12,
16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после вве
16,
дения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) (i) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным
и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 510, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с зондом 8MN (например, 8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1)(i) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2) (i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) контактирование образца пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани) или образца, полученного от пациента с 8МЛ (например, пробы крови или образца ткани, который был обработан для экстракции РНК), с прямым праймером 8MN, описанным ниже
(например, 8EQ IE N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, причем образец представляет собой образец от пациента или полученный от пациента с 8МЛ, которому ввели соединение (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь); и (b) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2 и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) (i) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В другом частном варианте осуществления изобретение относится к способу контроля ответа пациента с 8МЛ на соединение, включающему: (а) введение соединения пациенту 8МЛ; (b) контактирование образца (например, пробы крови или образца ткани), полученного или происходящего от пациента, с прямым праймером 8MN, описанным ниже (например, 8EQ ID N0. 11 или 13), и/или обратным праймером 8MN, описанным здесь (например, 8EQ ID N0. 9 или 12), и/или зондом 8MN (8EQ ID N0. 10), наряду с применимыми компонентами для, например, RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца; и (с) детекцию количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, причем (1) (i) увеличение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) уменьшение количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, от того же самого типа образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывает, что пациент отвечает на соединение и что соединение может быть или является полезным и/или имеет терапевтическое значение для пациента; и (2)(i) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, и (ii) отсутствие изменения или существенного изменения в количестве мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в пробе пациента относительно количества
мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, в аналогичном образце (например, тот же самый тип образца ткани) от пациента до введения соединения или определенного количества доз соединения, или определенной более ранней даты, указывают, что пациент не отвечает на соединение и что соединение не является полезным и/или не имеет терапевтического значения для пациента. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют через 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 ч, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 дней, 1, 2, 3, 6, 9, 12 месяцев или больше после введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после того, как пациент получил 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или больше доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют после введения 1-5, 510, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-100 доз соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления ответ пациента проверяют в течение дней, недель, месяцев или лет в течение или после непрерывного введения соединения, такого как соединение формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь.
В частных вариантах осуществления 8МЛ у пациента вызвана инактивирующей мутацией или де-лецией в гене 8MN1 на обеих хромосомах, приводящей к потере функции гена 8MN1.
Наборы
В одном аспекте изобретение относится к фармацевтическим или тестовым наборам, включающим праймер 8MN или зонд, описанный здесь, в одном или более контейнерах, и инструкции по использованию. В одном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает, в контейнере, один или более обратных праймеров 8MN (например, 8EQ ID N0. 2, 9 и/или 12) и/или один или более прямых праймеров 8MN (8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 и/или 13), и инструкции по использованию. В другом варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает, в одном контейнере, обратный праймер 8MN (например, 8EQ ID N0. 2, 9 или 12), прямой праймер 8MN (8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 или 13) и инструкции по использованию.
В одном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает, в отдельных контейнерах, один обратный праймер 8MN (например, 8EQ ID N0. 2, 9 или 12) в одном контейнере, другой прямой праймер 8MN (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 или 13) в другом контейнере, и инструкции по использованию.
В некоторых вариантах осуществления применимые компоненты, необходимые для PCR (например, qPCR), RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинуклеозид трифосфаты, и т.д., включены в такие наборы. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для гибридизации, включены в такие наборы. Фармацевтический или тестовый набор, содержащий такие праймеры, может использоваться в PCR и RT-PCR для, например: (i) оценки того, усиливает ли терапевтическое средство (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы) включение экзона 7 8MN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2, (ii) контроля количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7 из 8MN2, и количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, и/или (iii) контроля ответа пациента на терапевтическое средство (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы). В других вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В других вариантах осуществления человек является пациентом-человеком. В некоторых других вариантах осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 1, в одном контейнере, и обратный праймер с последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 2, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых человеческим минигеном 8MN1 или человеческим минигеном 8MN2, такими как описанные здесь, или в международной публикации W0 2009/151546 или публикации заявки на патент США 2011/0086833, каждая из которых полностью включена в настоящее описание путем ссылки. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 7, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В другом частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 8, в одном контейнере, и
обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенным человеческим геном 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 7, в одном контейнере, прямой праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 8, в другом контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 11, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 11, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти лраймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 13, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 13, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 1, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 9, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридизации, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В частном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает прямой прай-мер с нуклеотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 1, в одном контейнере, и обратный праймер с нуклзотидной последовательностью, найденной в 8EQ ID N0. 12, в другом контейнере. В некоторых вариантах осуществления эти праймеры используются в RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR), PCR (например, qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодируемых эндогенными человеческими генами 8MN2. В других вариантах осуществления эти праймеры используются как зонды в, например, тестах гибридиза
ции, таких как Саузерн-блот или Нозерн-блот.
В другом варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает зонд 8MN, описанный здесь (например, 8EQ ID N0. 3 или 10), в одном контейнере. В других вариантах осуществления зонд используется в, например, тесте гибридизации, таком как Саузерн-блот или Нозерн-блот. В частном варианте осуществления зонд используется в RT-qPCR или qPCR. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для PCR (например, qPCR), RT-PCR (например, RT по окончании PCR и/или RT-qPCR) или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинук-леозид трифосфаты, праймеры, и т.д., включены в такие наборы. В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для гибридизации, включены в такие наборы.
В одном варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает обратный прай-мер 8MN (например, 8EQ ID N0. 2, 9 или 12) в одном контейнере, прямой праймер 8MN (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 или 13) в другом контейнере, и зонд 8MN (например, 8EQ ID N0. 3 или 10) в другом контейнере, и инструкции по использованию. В другом варианте осуществления фармацевтический или тестовый набор включает один или более обратных праймеров 8MN (например, 8EQ ID N0. 2, 9 и/или
12) в одном контейнере, один или более прямых праймеров 8MN (например, 8EQ ID N0. 1, 7, 8, 11 и/или
13) в другом контейнере, и один или более зондов 8MN (например, 8EQ ID N0. 3 и/или 10) в другом контейнере, и инструкции по использованию.
В некоторых вариантах осуществления компоненты, необходимые для проведения PCR, RT-PCR или амплификации по типу катящегося кольца, такие как полимераза, дезоксинуклеозид трифосфаты и т.д., включены в такие наборы. Фармацевтический или тестовый набор, содержащий такие зонды и/или праймеры, может использоваться в PCR и RT-PCR для, например: (i) оценки того, усиливает ли терапевтическое средство (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы) включение экзона 7 8MN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2, (ii) контроля количества мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и включает экзон 7, и количество мРНК, которая транскрибируется от гена 8MN2 и не включает экзон 7 из 8MN2, и/или (iii) контроля ответа пациента на терапевтическое средство (например, соединение формулы (Ia1) или ее формы). В других вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В других вариантах осуществления человек является пациентом-человеком. В некоторых других вариантах осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическому набору, включающему соединение формулы (Ia1) или ее формы, в контейнере, и инструкции по использованию соединения или его формы. В частном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтическому набору, включающему фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы (Ia1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель и инструкции по использованию. В другом частном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтическому набору, включающему фармацевтическую композицию, включающую эффективное количество соединения формулы (Ia1) или ее формы и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель и инструкции по использованию. В одном варианте осуществления инструкции по использованию объясняют одно, два или более из следующего: доза, путь введения, частота введения и побочные эффекты введения соединения формулы (Ia1) или ее формы пациенту. В других вариантах осуществления субъект представляет собой человека. В других вариантах осуществления человек является пациентом-человеком. В некоторых других вариантах осуществления пациент-человек представляет собой пациента с 8МЛ.
Общие способы синтеза Как раскрыто здесь, общие способы получения соединений формулы (Ia1) или ее формы, как описано здесь, доступны через стандартную, известную методологию синтеза. Многие из исходных материалов коммерчески доступны или, если не доступны, могут быть получены с использованием путей, описанных ниже, с использованием методик, известных специалисту. Приведенные здесь схемы синтеза включают множественные стадии реакции, каждая из которых является самостоятельной и может быть осуществлена с или без любой предшествующей или последующей стадии(й). Другими словами, каждая из индивидуальных стадий реакций схем синтеза, приведенных здесь, рассматривается изолированно. Схема А.
Соединения формулы (Ia1), в которой R2 обозначает моноциклический или бициклический арил, ге-тероциклил или гетероарильную кольцевую систему, могут быть получены как описано ниже на схеме А
Соединение А1 (где X обозначает различные реактивные группы, которые могут использоваться для получения множества заместителей функциональной группы R1, вводя в реакцию подходящие исходные материалы с соединением А1, соединением Л3 или соединением А4, используя методики, известные специалисту, и где L обозначает уходящую группу, такую как галоген или трифторметилсуль
фонилокси и т.п.) вводят в реакцию с соединением А2 в присутствии подходящего металлического катализатора или комбинации двух разных подходящих металлических катализаторов (таких как бис(трифенилфосфин)палладий (II) хлорид и йодид меди (I) и т.п.), по меньшей мере с одним эквивалентом основания, неорганического или органического (такого как триэтиламин и т.п.), в органическом растворителе (таком как ацетонитрил и т.п.), подвергают сочетанию 8onogashira, получая соединение Л3. Реакция может быть осуществлена при комнатной или повышенной температуре. В случае необходимости, реакция может также быть осуществлена с использованием микроволнового облучения при повышенной температуре. Соединение Л3 вводят в реакцию с кислотой Льюиса (такой как трифторуксусная кислота или п-толуолсульфоновая кислота и т.п.) с или без органического растворителя (такого как толуол или этанол и т.п.) при комнатной или повышенной температуре с осуществлением циклизации с получением соединения А4. Схема В.
Соединения формулы (Ia1), в которой R2 обозначает моноциклический или бициклический арил, ге-тероциклил или гетероарильную кольцевую систему, могут также быть получены как описано ниже на схеме В
RR О RR о
A3 А4
Соединение А1 вводят в реакцию с триметилсилилацетиленом в присутствии подходящего металлического катализатора или комбинации двух разных подходящих металлических катализаторов (таких как бис(трифенилфосфин)палладий (II) хлорид и йодид меди (I) и т.п.), по меньшей мере с одним эквивалентом основания, неорганического или органического (такого как триэтиламин и т.п.), в органическом растворителе (таком как ацетонитрил и т.п.), подвергая сочетанию 8onogashira. Реакция может быть осуществлена при комнатной или повышенной температуре. В случае необходимости реакция может также быть осуществлена с использованием микроволнового облучения при повышенной температуре. Полученное промежуточное соединение триметилсилилацетилен обрабатывают неорганическим основанием (таким как карбонат калия и т.п.) в метаноле, получая соединение В1. Соединение В1 вводят в реакцию с соединением В2, используя условия, описанные на схеме А, осуществляя сочетание 8onogashira, получая соединение Л3, которое может затем быть превращено в соединение А4 путем обработки кислотой, как описано на схеме А. Схема С.
Соединения формулы (Ia1), в которой R2 обозначает моноциклический или бициклический гетеро-циклил или гетероарильную кольцевую систему, могут быть получены как описано ниже на схеме С
Соединение С1 (где X обозначает различные реактивные группы, которые могут использоваться для получения множества заместителей функциональной группы R1 путем введения в реакцию подходящих исходных материалов с соединением С1, соединением С2, соединением С3, соединением С4 или соединением С6 с использованием методик, известных специалисту, и где L обозначает уходящую группу, такую как галоген или трифторметилсульфонилокси и т.п.) вводят в реакцию с бут-3-ин-2-олом и в присутствии подходящего катализатора на основе палладия (такого как тетра
кис(трифенилфосфин)палладий (0) и т.п.), подходящего металлического сокатализатора (такого как хлорид цинка и т.п.) и органического основания (такого как триэтиламин и т.п.) в органическом растворителе (таком как NjN-диметилформамид и т.п.), при повышенной температуре в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 150°С, осуществляя сочетание 8onogashira с последующей циклизацией, получая соединение С2. Соединение С2 вводят в реакцию с подходящим окислителем (таким как диоксид марганца и т.п.) в подходящем растворителе (таком как дихлорметан и т.п.) при комнатной или повышенной температуре, получая соединение С3. а-метильную группу соединения С3 вводят в реакцию с подходящим селективным бромирующим реагентом (таким как Br2 или NB8 и т.п.), получая соединение С4. Соединение С4 вводят в реакцию с соединением С5 (причем термин "Het" относится к в случае необходимости замещенному гетероциклилу или гетероарильной кольцевой системе, содержащей подобную амидину группу, такую как, но не ограничиваясь ими, 2-аминопиридин, 2-аминопиримидин, 2-аминопиразин, 3-аминопиридазин, 2-аминотиазол, 4-аминотиазол, 4-аминопиримидин и т.п.), получая соединение С6. Схема D.
Соединения формулы (Ia1), в которой R2 обозначает моноциклический или бициклический гетероциклил или гетероарильную кольцевую систему, могут быть получены как описано ниже на схеме D
Соединение С4 (где X обозначает различные реактивные группы, которые могут использоваться для получения множества заместителей функциональной группы R1 путем введения в реакцию подходящих исходных материалов с соединением С4 или соединением D2 с использованием методик, известных специалисту), полученное как описано на схеме С, вводят в реакцию с соединением D1 (причем термин "Het" относится к в случае необходимости замещенному гетероциклилу или гетероарильной кольцевой системе, содержащей подобную кетимину группу, такую как, но не ограничиваясь ими, 2-метилпиридин, 2-метилпиримидин, 2-метилпиразин, 3-метилпиридазин, 2-метилтиазол, 4-метилтиазол, 4-метилпиримидин и т.п.) в присутствии органического основания (такого как триэтиламин и т.п.) в подходящем растворителе (таком как ацетонитрил и т.п.), осуществляя тандемную алкилирующую дегидра-тивную циклизацию, получая соединение D2.
Частные синтетические примеры
Для более подробного описания и помощи в понимании предлагаются следующие неограничивающие примеры, полно иллюстрирующие спектр соединений, описанных здесь, и которые не должны рассматриваться как специфически ограничивающие объем изобретения. Такие вариации соединений, описанных здесь, которые могут уже быть известны или разработаны позже и которые находятся в рамках компетенции специалиста, считаются входящими в рамки соединений, как описано здесь и заявлено далее. Эти примеры иллюстрируют получение некоторых соединений. Специалисту понятно, что методики, описанные в этих примерах, представляют собой методики, описанные в данной области техники, которые хорошо функционируют в практике синтеза и также составляют предпочтительные способы для практики этого изобретения. Однако следует понимать, что специалисту в свете настоящего раскрытия будет понятно, что множество изменений могут быть сделаны в частных способах, которые раскрыты, с получением подобного или похожего результата без отступления от духа и объема настоящего описания.
Кроме приведенных в следующих примерах вариантов соединений, если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции, экспериментальные данные и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, должны быть поняты как модифицируемые термином "приблизительно". Соответственно, все такие числа представляют собой приближения, которые могут варьировать в зависимости от желательных свойств, которые требуется получить в результате реакции или в результате варьирующих экспериментальных условий. Поэтому в рамках ожидаемого диапазона экспериментальной воспроизводимости термин "приблизительно" в контексте полученных данных относится к диапазону для данных при условии, что может варьировать согласно стандартному отклонению от среднего значения. Также для приводимых экспериментальных результатов, полученные данные могут быть округлены до большего или меньшего значения для представления данных без потери значимых чисел. По меньшей мере, и не как попытка ограничить заявку доктриной эквивалентов до объема формулы изобретения, каждый числовой параметр должен рассматриваться в свете числа значащих цифр и методик округления, используемых специалистом.
Хотя числовые диапазоны и параметры, формулирующие широкий объем настоящего описания, представляют собой приближения, числовые обозначения, представленные в примерах, приведенных ниже, даны настолько точно, насколько возможно. Любое числовое обозначение, однако, неотъемлемо содержит определенные ошибки, являющиеся обязательным следствием стандартного отклонения, обна
руживаемого в их соответствующих измерениях в тесте.
Примеры соединений
Как используется выше и во всем настоящем описании, следующие сокращения, если не указано иное, имеют следующие значения:
Аббревиатура
Значение
нагревание (химия) или делеция (биология)
АсОН или НОАс
Уксусная кислота
Ас20
Уксусный ангидрид
аргон
ACN
ацетонитрил
BINAP
2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафталин
B(OiPr)3
триизопропил борат
Вое
трет-бутокси-карбонил
Вос20
ди-трет-бутил дикарбонат
ВиОН
н-бутанол
градусы Цельсия
CDI
1,1-карбонилдиимидазол или N,N'-карбонилдиимидазол
(СНО)п ИЛИ (НСНО)"
параформальдегид
Соед
соединение
д/ч/час/мин/с
день(д)/час(ч или час)/минута(мин)/секунда(с)
DavePhos
2-дициклогексилфосфино-2'-(N, N-диметиламино)бифенил
DCE
1,2-дихлорэтан
DCM
дихлорметан (CH2CI2)
DIAD
диизопропил азодикарбоксилат
DIEA или DIPEA
N, N- диизопропилэтиламин
DMA
диметилацетамид
DMAP
4-(диметиламйно)пиридин
DME
1,2 -диметоксиэтан
DMF
диметилформамид
DMSO
диметилсульфоксид
EDC или EDCI
N- (3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид
EtOAc
этил ацетат
EtOH
этанол
Et20
простой диэтиловый эфир
HCOH
формальдегид
iPrl
йодпропан
JohnPhos
(2-бифенил)-ди-трет-бутилфосфин
KOAc
ацетат калия
LAH
литий алюминий гидрид
LC/MS, LCMS или LC-MS
жидкостная хроматография с масс-спектроскопией
LDA
литий диизопропиламин
LiHMDS или LHMDS
литий бис(триметилсилил)амид
MeOH
метанол
Mel
йодметан
Me-THF
2-метилтетрагидрофуран
Me2Zn
диметилцинк
Mn02
диоксид марганца
масс-спектроскопия
NaH
гидрид натрия
NaHS
гидросульфид натрия
NaHMDS
натрий бис(триметилсилил)амид или натрий гексаметилдисалазид
Nal
йодид натрия
NaOAc
ацетат натрия
NaOMe
метоксид натрия
NBS
N- бромсукцинимид
NMP
Л/-метилпирролидон
NMR
ядерный магнитный резонанс
o/n
В течение ночи
палладий
Pd/C
палладий на угле
Pd(dba)2
бис(дибензилиденацетон)палладий
Pd2 (dba) з или Pd2dba3
трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0)
PdCl2(PhCN)2
транс-бис(бензонитрил)дихлорпалладий(II)
PdCl2(dppf), PdCl2dppf или Pd(dppf)Cl2
[1,1'-
бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(II)
Pd(OAc)2
ацетат палладия (II)
Pd(PPh3)4 или Pd(Ph3P) 4
тетракис(трифенилфосфин)палладий(0)
Pd(PPh3)2Cl2, PdCl2 (PPh3) 2 или
PdCl2(Ph3P)2
бис(трифенилфосфин)палладий(II) дихлорид
PHBu3BF4 или tBu3PHBF4
три-трет-бутилфосфоний тетрафторборат
Phi
йодбензол
Phi(OTFA)2
[бис(трифторацетокси)йод]бензол
PhMe
толуол
POCl3
фосфорил хлорид
PPh3
трифенилфосфин
PPA
полифосфорная кислота
PPTs
пиридиний гг-толуолсульфонат
psi
Давление в фунтах на квадратный дюйм
PyBOP
(бензотриазол-1-иолкси)трипирролидинофосфоний гексафторфосфат
комнатная температура
S-Phos, SPhos или Sphos
2 -дициклогексилфосфино-2',6'-диметоксибифенил
T3P
пропилфосфоновый ангидрид
TEA, Et3N или NEt3
триэтиламин
Tf20
трифторметансульфоновый ангидрид
TFA
трифторуксусная кислота
THF
тетрагидрофуран
TLC
тонкослойная хроматография
TMS
триметилсилан
TMSC1
триметилхлорсилан или триметилсилил хлорид
TMSOK
триметилсиланолат калия
t-Bu
трет-бутил
TsOH, p-TsOH или pTSA
тозиловая кислота или п-толуолсулфоновая кислота
xantphos
4,5-бис(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен
Стадия А. К раствору коммерчески доступного 4-(3-(этоксикарбонил)-фенил)пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилата (13,4 г, 40,0 ммоль) в дихлорметане (200 мл) при комнатной температуре при мягком перемешивании частями добавляли N-бромсукцинимид (8,5 г, 48 ммоль). После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 0,5 ч. Анализ LC/MS аликвоты показал полное исчезновение исходного материала. Смесь обрабатывали насыщенным раствором Na2CO3 (100 мл) и перемешивали в течение 15 мин. Органический слой отделяли и высушивали над Na2SO4. После удаления растворителя остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, используя градиент 0-50% этилацетата в гексанах. Промежуточный бромид получали в форме бесцветного масла (14,2 г, 86%). MS m/z 412,4[М+Н]+, 414,4 [М+2Н]+.
Стадия В. В круглодонную колбу на 250 мл загружали PdCl2(PhCN)2 (0,51 г, 1,33 ммоль), PBu3HBF4 (0,77 г, 2,66 ммоль) и CuI (0,20 г, 1,06 ммоль) и продували три раза аргоном с последующим добавлением диоксана (30 мл) и диизопропиламина (5,6 мл, 4,03 г, 40,0 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим добавлением промежуточного бромида (11,0 г, 26,6 ммоль), полученного на стадии А, и TMS-ацетилена (4,51 мл, 3,13 г, 32,0 ммоль). Реакционную смесь затем перемешивали при комнатной температуре в течение 6 дней. Анализ LC/MS аликвоты показал > 95% превращения. Осадок удаляли фильтрацией и промывали этилацетатом. Фильтраты объединяли и летучие компоненты удаляли на роторном испарителе. Остаток хроматографировали (силикагель, 0-70% этил-ацетата в гексанах), получая промежуточный алкин TMS в форме коричневого масла (8,73 г, 76%). MS m/z 431,4 [М+Н]+.
Стадия С. Смесь промежуточного алкина TMS, полученного на стадии В (3,10 г, 7,21 ммоль), K2CO3 (1,49 г, 10,8 ммоль) и МеОН (40 мл) перемешивали в ванне с водой со льдом. LC/MS показала, что полное превращение было достигнуто в течение 2 ч. Затем добавляли насыщенный раствор NH4Cl (20 мл) и этилацетат (200 мл), и органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали этилацетатом (3x30 мл) и объединенные органические фракции упаривали досуха на роторном испарителе. Остаток хроматографировали (силикагель, 0-10% этилацетата в гексанах), получая промежуточный алкин в форме коричневого масла (1,65 г, 64%). MS m/z 359,3[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, CDCl3-d) 8 м.д. 7,51 (1Н, д, J=8,51 Гц), 7,44 (1Н, д, J=2,84 Гц), 6,97-7,03 (1Н, м), 4,41 (2Н, кв., J=7,15 Гц), 3,57-3,64 (4Н, м), 3,21-3,27 (5Н, м), 1,49 (9Н, с), 1,41 (3Н, т, J=7,09 Гц).
Стадия D. К смеси промежуточного алкина, полученного на стадии С (1,10 г, 3,1 ммоль), 2-йодпиридина (0,69 г, 3,38 ммоль), PdCl2(Ph3P)2 (0,11 г, 0,15 ммоль) и CuI (0,03 г, 0,15 ммоль), под аргоном, добавляли ацетонитрил (6,0 мл) и триэтиламин (0,62 г, 6,14 ммоль). Смесь перемешивали при 50°С в течение 4 ч. Летучие компоненты удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (си-ликагель, этилацетат в гексанах 0-70%), получая продукт сочетания, 4-(3-(этоксикарбонил)-4-(пиридин-2-илэтинил)фенил)пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилат в форме коричневого масла (1,2 г, 87%). MS m/z 4 3 6,4 [М+Н]+.
Стадия Е. Смесь соединения, полученного на стадии D (0,59 г, 1,4 ммоль), и п-толуолсульфоновой кислоты (0,05 г, 0,27 ммоль) в этаноле (6,0 мл) облучали в микроволновом реакторе при 180°С в течение 3 ч. Смесь затем разбавляли водой (20 мл) и подщелачивали до рН 8 с использованием Na2CO3. Осадок собирали, промывали водой и высушивали. Твердое вещество растворяли в дихлорметане (10 мл), обрабатывали TFA (2 мл) в течение 0,5 ч при комнатной температуре, затем подщелачивали с использованием Na2CO3 до рН 8-9. Слой дихлорметана отделяли и водный слой экстрагировали дополнительным количеством дихлорметана (3x5 мл). Объединенный раствор дихлорметана высушивали над Na2SO4 и хро-матографировали (силикагель, МеОН в дихлорметане, 0-30%), получая целевое соединение в форме
твердого вещества желтого цвета (0,071 г, 17%). Температура плавления 179-181 °С; MS m/z 308,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,64-8,69 (1Н, м), 7,95 (1Н, тд, J=7,80, 1,73 Гц), 7,85 (1Н, дт, J=7,96, 1,06 Гц), 7,68-7,74 (2Н, м), 7,57 (1Н, дд, J=8,83, 2,84 Гц), 7,51 (1Н, д, J=2,52 Гц), 7,42 (1Н, ддд, J=7,57, 4,73, 1,26 Гц), 3,21-3,26 (4Н, м), 2,84-2,89 (4Н, м). Пример 2.
Получение соединения 2
Стадия А. Смесь 4-(4-бром-3-(этоксикарбонил)фенил)пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилата, полученного как показано в примере 1, стадия А (22,63 г, 54,8 ммоль), CuI (0,52 г, 2,75 ммоль), NaI (16,44 г, 109,6 ммоль) и N1, ^-диметилциклогексан-1,2-диамина (0,87 мл, 5,5 ммоль) в диоксане (100 мл) перемешивали при 110°С под аргоном в течение 18 ч. Твердое вещество удаляли фильтрацией и фильтрат концентрировали досуха на роторном испарителе. Остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-30%), получая промежуточный йодид в форме коричневого масла (26,2 г, 102%). MS m/z 461,2 [М+Н]+.
Стадия В. 4-(3-(Этоксикарбонил)-4-(тиофен-3-илэтинил)фенил)-пиперазин-1-трет-бутилкарбокси-лат получали, используя процедуру сочетания Sonagashira, показанную в примере 1, стадия D, из йодида, полученного на стадии А, описанной выше и 3-этинил-тиофена (87%). MS m/z 441,2 [М+Н]+.
Стадия С. Соединение, полученное на стадии В (192 мг, 0,44 ммоль), перемешивали с TFA (1,0 мл) при 100°С в течение 6 ч. После охлаждения смесь разбавляли водой (5 мл) и нейтрализовали Na2CO3. Осадок собирали и промывали водой, дихлорметаном и ацетоном, получая целевое соединение в форме коричневого порошка (47 мг, 34%). Температура плавления 240°С (разложение); MS m/z 313,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 7,95 (1Н, дд, J=2,99, 1,42 Гц), 7,71 (1Н, дд, J=5,04, 2,84 Гц), 7,54-7,65
(4Н, м), 7,27 (1Н, с), 3,45-3,53 (4Н, м), 3,20-3,28 (4Н, м).
Пример 3.
Получение соединения 3
Стадия А. Смесь 4-(3-(этоксикарбонил)-4-этинилфенил)-пиперазин-1-трет-бутилкарбоксилата, полученного с использованием химии, показанной в примере 1, стадия С (3,58 г, 10,0 ммоль), 3,4-диметоксибромбензола (2,60 г, 12,0 ммоль), CuI (0,095 г, 0,5 ммоль), PdCl2(Ph3P)2 (0,35 г, 0,5 ммоль), Et3N (2,8 мл, 2,02 г, 20,0 ммоль) и ацетонитрила (10,0 мл) облучали в микроволновом реакторе под аргоном при 120°С в течение 0,5 ч. Смесь затем охлаждали и хроматографировали (силикагель, этилацетат в гек-санах, 0-70%), получая промежуточный алкин в форме коричневого масла, который затем хроматогра-фировали снова (силикагель, этилацетат в дихлорметане, 0-10%), получая бесцветное масло, гомогенное в анализе LC/MS. MS m/z 495,2 [М+Н]+.
Стадия В. Промежуточный алкин, полученный на стадии А, обрабатывали трифторуксусной кислотой (10,0 мл) при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор разбавляли водой (50 мл) и нейтрализовали с использованием NaHCO3 до рН 8-9. Желтый осадок собирали и промывали водой и высушивали, получая целевое соединение (1,26 г, 34% в целом, 2 стадии). Температура плавления: 142-143°С; MS m/z 367,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 7,52-7,59 (2Н, м), 7,46 (1Н, д, J=1,58 Гц), 7,42 (1Н, дд, J=8,51, 2,21 Гц), 7,38 (1Н, д, J=2,21 Гц), 7,32 (1Н, с), 7,08 (1Н, д, J=8,83 Гц), 3,86 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,153,22 (4Н, м), 2,82-2,89 (4Н, м).
Стадия А. Смесь 2-бром-5-фторметилбензоата (699 мг, 3,0 ммоль), 1-этинил-4-метоксибензола (475 мг, 3,6 ммоль), CuI (28,5 мг, 0,15 ммоль), PdCl2(Ph3P)2 (105 мг, 0,15 ммоль), Et3N (0,83 мл, 606 мг, 6,0 ммоль) и ацетонитрила (3,0 мл) облучали в микроволновом реакторе под аргоном при 120°С в течение 0,5 ч. Смесь затем охлаждали и хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-10%), получая промежуточный алкин в форме коричневого масла, используемый непосредственно на следующей стадии. MS m/z 285,1 [М+Н]+.
Стадия В. Промежуточный алкин, полученный на стадии А, обрабатывали трифторуксусной кислотой (6,0 мл) при 100°С в течение 1 ч. Летучие компоненты удаляли под вакуумом и остаток обрабатывали водой и нейтрализовали Na2CO3. Осадок собирали и хроматографировали (силикагель, дихлорметан), получая промежуточный изокумарин (581 мг, 72%, 2 стадии). MS m/z 271,1 [М+Н]+.
Стадия С. Смесь соединения, полученного на стадии В (108 мг, 0,4 ммоль), и (S)-2-метилпиперазина (12 0 мг, 1,2 ммоль) в NMP (1,0 мл) перемешивали при 180°С в течение 24 ч. После охлаждения смесь загружали на колонку с силикагелем и хроматографировали (МеОН в дихлорметане, 0-20%), получая целевое соединение в форме желтого порошка (24 мг, 17%). Температура плавления: 129-131°С; MS m/z 351,3[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 7,80 (2Н, д, J=9,14 Гц), 7,51-7,59 (2Н, м), 7,46 (1Н, д, J=2,21 Гц), 7,26 (1Н, с), 7,06 (2Н, д, J=8,83 Гц), 3,82 (3Н, с), 3,64-3,73 (2Н, м), 2,973,03 (1Н, м), 2,76-2,85 (2Н, м), 2,61-2,70 (1Н, м), 2,31 (1Н, т, J=11,03 Гц), 1,06 (3Н, д, J=6,31 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 4 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 5.
Получение соединения 30
Стадия А. Смесь 5-бром-2-йодметилбензоата (18,4 г, 54,0 ммоль), ацетилена TMS (8,5 мл, 5,88 г, 60,0 ммоль), CuI (0,51 г, 2,7 ммоль), PdCl2(Ph3P)2 (1,9 г, 2,7 ммоль), Et3N (15,0 мл, 10,9 г, 108,0 ммоль) и ацетонитрила (100 мл) перемешивали под аргоном при комнатной температуре в течение 4 ч. После удаления летучих компонентов в вакууме, остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах,
0-20%), получая промежуточный алкин TMS в форме бесцветного масла (15,7 г, 94%).
Стадия В. Промежуточный алкин, полученный на стадии А (9,33 г, 30,0 ммоль), смешивали с (S)-2-метилпиперазином (3,60 г, 36,0 ммоль), Pd2dba3 (0,27 г, 0,6 ммоль), JohnPhos (0,18 г, 0,6 ммоль) и Cs2CO3 (13,7 г, 42,0 ммоль). Реакционную систему продували три раза аргоном и добавляли растворитель, DME (60 мл). Суспензию затем перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Анализ LC/MS аликвоты реакционной смеси показал полный расход исходного бромида. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане 0-50%), получая (S)-5-(3-метилпиперазин-1-ил)-2-((триметилсилил)этинил)метилбензоат в форме коричневого масла (7,56 г, 79%). MS m/z 331,1 [М+Н]+.
Стадия С. Соединение, полученное на стадии В (7,56 г, 22,9 ммоль), обрабатывали ди-трет-бутил бикарбонатом (7,5 г, 34,4 ммоль) и несколькими кристаллами DMAP в дихлорметане (100 мл). После перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре, анализ LC/MS аликвоты реакционной смеси показал полное исчезновение исходного материала. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане, 0-10%), получая (S)-4-(3-(метоксикарбонил)-4-((триметилсилил)этинил)фенил)-2-метилпиперазин-1-трет-бутилкарбоксилат в форме бесцветного масла (6,49 г, 66%). MS m/z 431,1 [М+Н]+.
Стадия D. Соединение, полученное на стадии С (6,49 г, 15,1 ммоль), обрабатывали K2CO3 (карбонат калия)(3,12 г, 22,6 ммоль) в МеОН (40 мл) на ванне с водой со льдом в течение 2 ч. Летучие компоненты удаляли на роторном испарителе и остаток обрабатывали насыщенным раствором ]N-[4Cl (100 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x150 мл). Объединенные экстракты затем концентрировали досуха и хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах 0-80%), получая ^)-4-(4-этинил-3-(метоксикарбонил)фенил)-2-метилпиперазин-1-трет-бутилкарбоксилат в форме светло-коричневого масла (5,39 г, 100%). MS m/z 359,3 [М+Н]+.
Стадия Е. Смесь промежуточного соединения, полученного на стадии D, ^)-4-(4-этинил-3-(метоксикарбонил)фенил)-2-метилпиперазйн-1-трет-бутилкарбоксилата (716 мг, 2,0 ммоль), 4-йод-1,2-диметоксибензола (634 мг, 2,4 ммоль), CuI (19,0 мг, 0,1 ммоль), PdCl2(Ph3P)2 (70 мг, 0,1 ммоль), Et3N (0,56 мл, 202 мг, 4,0 ммоль) и ацетонитрила (2,0 мл) облучали в микроволновом реакторе под аргоном при 120°С в течение 20 мин. Смесь затем охлаждали и хроматографировали дважды (силикагель, этил-ацетат в гексанах, 0-50%, затем этилацетат в дихлорметане, 7,5%), получая промежуточный алкин в форме желтого масла (3 67 мг, 37%). MS m/z 495,3 [М+Н]+.
Стадия F. Соединение, полученное на стадии Е (367 мг, 0,74 ммоль), обрабатывали TFA (5,0 мл) при комнатной температуре в течение 2 ч. Анализ LC/MS аликвоты реакционной смеси показал полное превращение. Смесь разбавляли водой (40 мл), нейтрализовали Na2CO3 и экстрагировали дихлорметаном (3x20 мл). Объединенные экстракты высушивали и упаривали досуха. Желтый остаток растирали с простым диэтиловым эфиром и высушивали. Целевое соединение получали в форме желтого порошка (228 мг, 81%). Температура плавления: 155-157°С; MS m/z 381,5 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6): 8 м.д. 7,51-7,58 (2Н, м), 7,46 (1Н, д, J=2,52 Гц), 7,42 (1Н, дд, J=8,51, 1,89 Гц), 7,38 (1Н, д, J=1,89 Гц), 7,32 (1Н, с), 7,07 (1Н, д, J=8,83 Гц), 3,86 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,64-3,71 (2Н, м), 2,96-3,02 (1Н, м), 2,75-2,84 (2Н, м), 2,65 (1Н, м, J=3,15 Гц), 2,30 (1Н, дд, J=11,35, 10,40 Гц), 1,05 (3Н, д, J=6,31 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 5 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 6.
Стадия А. Смесь 5-фтор-2-йодбензойной кислоты (9,04 г, 34,0 ммоль), бут-3-ин-2-ола (5,7 мл, 5,46 г, 78,0 ммоль), ZnCl2 (4,62 г, 34,0 ммоль), Pd(Ph3P)4 (1,96 г, 1,7 ммоль), Et3N (14,2 мл, 10,3 г, 102,0 ммоль) и DMF (50 мл) перемешивали под аргоном при 100°С в течение 2 ч. После удаления летучих компонентов
Получение соединения 65
под вакуумом остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-50%), получая промежуточное соединение 7-фтор-3-(1-гидроксиэтил)-1Н-изохромен-1-он в форме коричневого масла (5,93 г, 84%). MS m/z 209,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, CDCl3-d): 8 м.д. 7,91-7,96 (1Н, м), 7,43-7,47 (2Н, м), 6,556,59 (1Н, м), 4,67 (1Н, кв., J=6,52 Гц), 1,57 (3Н, д, J=6,62 Гц).
Стадия В. Промежуточное соединение, полученное на стадии А (5,93 г, 28,5 ммоль), растворяли в дихлорметане (50 мл) и обрабатывали MnO2 (24,8 г, 285 ммоль) в течение 48 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток суспендировали в дихлорметане (500 мл) и перемешивали в течение 0,5 ч. Смесь фильтровали и твердое вещество промывали дихлорметаном (4x100 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха на роторном испарителе и хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане 0-20%), получая промежуточный кетон в форме белых игольчатых кристаллов (3,88 г, 66%). MS m/z 207,1 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, CDCl3-d): 8 м.д. 8,01-8,06 (1Н, м), 7,68 (1Н, дд, J=8,51, 5,04 Гц), 7,51-7,57 (1Н, м), 7,40 (1Н, д, J=0,63 Гц), 2,59 (3Н, с).
Стадия С. Промежуточный кетон, полученный на стадии В (2,63 г, 12,8 ммоль), растворяли в хлороформе (30 мл) и обрабатывали бромом (0,72 мл, 2,25 г, 14,0 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч с последующим добавлением гексанов (150 мл) и смесь перемешивали в течение 15 мин. Осадок собирали фильтрацией и промывали гексанами, водой и высушивали. Фильтрат промывали Na2CO3 и концентрировали. Остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлор-метане, 0-5%), получая дополнительное промежуточное соединение бромкетон (полные 3,48 г, 96%). MS m/z 283,0 [М-Н]-, 285,0 [М-Н]-; 1Н-ЯМР (500 МГц, CDCl3-d): 8 м.д. 8,05 (1Н, дд, J=8,20, 2,84 Гц), 7,72 (1Н, дд, J=8,51, 5,04 Гц), 7,54-7,60 (1Н, м), 7,52 (1Н, с), 4,47 (2Н, с).
Стадия D. Промежуточное соединение бромкетон, полученное на стадии С (1,43 г, 5,0 ммоль), смешивали с 3,5-диметилпиразин-2-амином (0,67 г, 5,5 ммоль) и ацетонитрилом (10,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 100°С в течение ночи и охлаждали до комнатной температуры. Добав-
ляли этилацетат (20 мл) и осадок собирали, промывали этилацетатом и затем высушивали, получая 3-
(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-он гидробромид (1,81 г, 93%). MS m/z 310,3 [М+Н]+.
Стадия Е. Смесь соединения, полученного на стадии D (390 мг, 1,0 ммоль), N-метилпиперазина (300 мг, 3,0 ммоль) в NMP (2,0 мл) перемешивали при 180°С в течение 24 ч под аргоном. После охлаждения до комнатной температуры смесь загружали на колонку с силикагелем. Флэш-хроматографию (си-ликагель) осуществляли, используя МеОН в дихлорметане (0-30%), получая целевое соединение в форме желтого порошка (223 мг, 57%). Температура плавления: 240-241°С; MS m/z 390,1 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,34 (1Н, с), 8,24-8,27 (1Н, м), 7,70 (1Н, д, J=8,83 Гц), 7,57 (1Н, дд, J=8,83, 2,52 Гц), 7,50 (1Н, д, J=2,52 Гц), 7,42 (1Н, с), 3,26-3,31 (4Н, м), 2,74 (3Н, с), 2,45-2,49 (4Н, м), 2,38 (3Н, д, J=0,95 Гц), 2,24 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 6 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Стадия А. Промежуточное соединение бромкетон, полученное на стадии С, пример 6 (285 мг, 1,0 ммоль), смешивали с 2-аминотиазолом (110 мг, 1,1 ммоль) и ацетонитрилом (4,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 100°С в течение 0,5 ч и охлаждали до комнатной температуры. Добавляли этилацетат (10 мл) и осадок собирали фильтрацией. Осадок промывали этилацетатом и высушивали, получая промежуточное соединение, 2-амино-3-(2-(7-фтор-1-оксо-1Н-изохромен-3-ил)-2-оксоэтил)тиазол-3-ий бромид (355 мг, 92%), гомогенный в анализе LC/MS. MS m/z 305,0 М+.
Стадия В. Смесь соединения, полученного на стадии А (193 мг, 0,5 ммоль), в NMP (1,0 мл) перемешивали при 180°С в течение 1 ч, пока анализ LC/MS аликвоты реакционной смеси не показал, что весь исходный материал был превращен в промежуточное соединение циклизации. MS m/z 287,0[М+Н]+. Смесь охлаждали до комнатной температуры и N-метилпиперазин (150 мг, 1,5 ммоль) добавляли под аргоном. Полученную смесь затем перемешивали при 180°С в течение 24 ч. После охлаждения смесь загружали на колонку с силикагелем и целевое соединение элюировали МеОН в дихлорметане (0-30%) в
форме желтого порошка (32 мг, 17%). Температура плавления: 236-238°С; MS m/z 367,2[М+Н]+; 1Н-ЯМР
(500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,12 (1Н, с), 7,93 (1Н, д, J=4,41 Гц), 7,52-7,63 (2Н, м), 7,48 (1Н, с), 7,32 (1Н, д, J=4,41 Гц), 7,17 (1Н, с), 3,23-3,30 (4Н, м), 2,43-2,49 (4Н, м), 2,23 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 7 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 8.
Получение соединения 61
Стадия А. Следуя процедуре, описанной в примере 6, стадия D, промежуточное соединение, 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-он гидробромид (244 мг, 62%), получали из коммерчески доступного 3-хлор-2-аминопиридина. MS m/z 315, 1 [М+Н]+.
Стадия В. Следуя процедуре, описанной в примере 6, стадия E, из 3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-он гидробромида (99 мг, 0,25 ммоль) и N-метилпиперазина (86 мг, 0,75 ммоль) целевое соединение получали в форме желтого порошка (19 мг, 19%). Температура плавления: 240°С (разложение); MS m/z 395,0 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,57 (1Н, дд, J=6,94, 0,95 Гц), 8,46 (1Н, с), 7,72 (1Н, д, J=8,83 Гц), 7,58 (1Н, с), 7,52 (1Н, дд, J=7,25, 0,95 Гц), 7,51 (1Н, д, J=2,52 Гц), 7,44 (1Н, с), 6,95 (1Н, дд, J=7,41, 6,78 Гц), 3,28-3,31 (4Н, м), 2,47 (4Н, м), 2,24 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 8 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 9.
Получение соединения 66
(S)-3-(6,8-Диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(3-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он (78 мг, 0,2 ммоль), полученный согласно процедуре из примера 6, суспендировали в дихлорэтане (1,0 мл) с последующим добавлением формальдегида (0,4 мл, 37%, 4,9 ммоль) и №ВН(ОАс)3 (85 мг, 0,4 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем разбавляли дихлорметаном (5,0 мл) и нейтрализовали Na2CO3. Слой дихлорметана отделяли и водный слой экстрагировали дихлормета-ном (3x2,0 мл). Экстракты объединяли и высушивали над Na2SO4 и хроматографировали (силикагель, МеОН в дихлорметане 0-20%), получая целевое соединение в форме светло-желтого порошка (55 мг, 68%). Температура плавления: 255-256°С; MS m/z 404,1 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,33 (1Н, с), 8,23-8,26 (1Н, м), 7,68 (1Н, д, J=8,83 Гц), 7,56 (1Н, дд, J=8,83, 2,52 Гц), 7,48 (1Н, д, J=2,52 Гц), 7,40 (1Н, с), 3,65-3,76 (2Н, м), 2,82-2,91 (2Н, м), 2,73 (3Н, с), 2,37 (3Н, д, J=0,95 Гц), 2,21-2,28 (4Н, м), 2,09-2,19 (1Н, м), 1,08 (3Н, д, J=6,31 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 9 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 10.
Получение соединения 76
Промежуточное соединение бромкетон, полученное на стадии С, пример 6 (855 мг, 3,0 ммоль), смешивали с 2,3,5-триметилпиразином (402 мг, 3,3 ммоль) и ацетонитрилом (10,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 80°С в течение 4 ч и охлаждали до комнатной температуры с последующим добавлением триэтиламина (1,3 мл, 9,0 ммоль). После перемешивания в течение 0,5 ч при комнатной температуре смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. Растворитель удаляли на роторном испарителе и остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в дихлорметане 30%), получая промежуточное соединение, 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-он (782 мг, 85%). MS m/z 309,3 [М+Н]+.
Стадия В. Следуя процедуре, описанной в примере 6, стадия Е, из 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-фтор-1Н-изохромен-1-она (77 мг, 0,25 ммоль) и N-метилпиперазина (75 мг, 0,75 ммоль) целевое соединение получали в форме желтого порошка (44 мг, 45%). Температура плавления: 219-221°С; MS m/z 389,5 [М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,03 (1Н, д, J=1,58 Гц), 7,97 (1Н, д, J=0,63 Гц), 7,56 (1Н, д, J=2,84 Гц), 7,47-7,53 (2Н, м), 7,22 (1Н, с), 7,16-7,19 (1Н, м), 3,24-3,30 (4Н, м), 2,57 (3Н, с), 2,45-2,49 (4Н, м), 2,28 (3Н, д, J=0,95 Гц), 2,24 (3Н, с).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 10 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 11.
Получение соединения 85
Соединение 65, полученное в примере 6 (188 мг, 0,5 ммоль), смешивали с 1-бром-2-этоксиэтаном (104 мг, 0,75 ммоль), K2CO3 (172 мг, 1,25 ммоль) и DMF (1,0 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 60°С в течение ночи, охлаждали до комнатной температуры и хроматографировали на силика-геле (метанол в дихлорметане, 0-20%), получая целевое соединение в форме желтого порошка (100 мг, 46%). Температура плавления: 192-194°С; MS m/z 434,3[М+Н]+; 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,36 (1Н, с), 8,25-8,29 (1Н, м), 7,71 (1Н, д, J=8,83 Гц), 7,57 (1Н, дд, J=8,83, 2,52 Гц), 7,50 (1Н, д, J=2,52 Гц), 7,43 (1Н, с), 3,48 (2Н, т, J=5,83 Гц), 3,27-3,31 (4Н, м), 3,26 (3Н, с), 2,74 (3Н, с), 2,56-2,62 (4Н, м), 2,54 (2Н, т, J=5,83 Гц), 2,38 (3Н, д, J=0,95 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 11 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции.
Пример 12.
Получение соединения 88
-N^ S02CI2 / DMF
Часть 1, стадия А. К охлажденному раствору 2,6-диметилпиразина (108 г, 1,0 моль) в DMF (260 мл) на ванне лед/Н^ при энергичном перемешивании добавляли сульфурилхлорид (270 мл, 3,3 моль). Скорость добавления устанавливали такой, чтобы поддерживать температуру реакции 40-60°С в течение приблизительно 2 ч. После добавления охлаждающую ванну удаляли и смесь перемешивали в течение дополнительных 0,5 ч. Анализ LC/MS аликвоты показал, что осталось <5% исходного материала. Реакционную смесь затем охлаждали на ванне лед/вода и, поддерживая температуру ниже 35°С, тщательно гасили с помощью 10М NaOH (1 л) с последующим добавлением Na2CO3 (твердого) до рН 6. После добавления воды (800 мл) смесь перегоняли. Дистиллят собирали и органические фракции отделяли. Водный слой экстрагировали простым диэтиловым эфиром (100 мл x3) и эфирные экстракты объединяли с органическими фракциями, отделенными предварительно. Объединенные экстракты промывали водой
(30 мл x3), затем солевым раствором и высушивали над Na2SO4. После того как экстракты были сконцентрированы, остаток перегоняли и продукт собирали в форме бесцветной жидкости, приблизительная точка кипения: 127°С при 154 мм рт.ст. (99,1 г, 69%). 1Н-ЯМР (500 МГц, хлороформ-d) 8 м.д. 8,05 (1Н, с), 2,61 (3Н, д, J=0,63 Гц), 2,50 (3Н, с).
Часть 1, стадия В. Смесь 2-хлор-3,5-диметилпиразин (28,5 г, 0,2 моль), полученного выше, CuO (0,8 г, 0,01 моль) и концентрированного водного раствора NH3 (28~30%, 150 мл) перемешивали в закрытом
сосуде под давлением при 150°С в течение 3 дней. После охлаждения смесь концентрировали досуха и
остаток обрабатывали этилацетатом (500 мл), затем перемешивали в течение 15 мин и фильтровали. Осадок промывали дополнительным количеством этилацетата (приблизительно 1,5 л) до тех пор, пока исходный материал более не обнаруживался в фильтрате. Фильтраты объединяли и концентрировали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем (MeOH/CH2Cl2, 0-10%), получая твердое вещество желтого/коричневатого цвета (20,7 г, 84%). 1Н-ЯМР (500 МГц, хлороформ-d) 8 м.д. 7,68 (1Н, с), 2,46 (3Н, с), 2,42 (ЗН, д, J=0,63 Гц)
Часть 2, стадия А. Смесь 5-бром-2-йодбензойной кислоты (12,6 г, 38,5 ммоль), бут-3-ин-2-ола (3,1 мл, 2,96 г, 42,4 ммоль), ZnCl2 (5,2 г, 38,5 ммоль), Pd(Ph3P)4 (2,23 г, 1,9 ммоль), Et3N (16,0 мл, 11,7 г, 115,5 ммоль) и DMF (80 мл) перемешивали под аргоном при 80°С в течение 2 ч. После удаления летучих компонентов под вакуумом, остаток хроматографировали (силикагель, этилацетат в гексанах, 0-100%), получая промежуточное соединение 7-бром-3-(1-гидроксиэтил)-1Н-изохромен-1-он в форме коричневого масла (7,5 г, 72%). 1Н-ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) 8 м.д. 8,38-8,45 (1Н, м), 7,81 (1Н, дд, J=8,35, 2,05 Гц), 7,32 (1Н, д, J=8,51 Гц), 6,52-6,59 (1Н, м), 4,66 (1Н, кв. д, J=6,52, 0,95 Гц), 1,54-1,60 (3Н, м).
Часть 2, стадия В. Промежуточное соединение, полученное в части 2, стадия А (7,5 г, 27,7 ммоль), растворяли в дихлорметане (100 мл) и обрабатывали MnO2 (48,0 г, 554 ммоль) в течение 20 ч при комнатной температуре. Твердое вещество отфильтровывали и промывали дихлорметаном (4x203 мл). Объединенные фильтраты упаривали досуха на роторном испарителе и хроматографировали (силикагель, этилацетат/CH^b, 0-20%), получая продукт в форме белых игольчатых кристаллов (4,5 г, 61%). 1Н-ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) 8 м.д. 8,51 (1Н, дд, J=2,84, 0,63 Гц), 7,92 (1Н, дд, J=8,35, 2,05 Гц), 7,53 (1Н, д, J=8,51 Гц), 7,36 (1Н, с), 2,59 (3Н, с).
Часть 2, стадия С. Промежуточное соединение, полученное в части 2, стадия В (23,0 г, 86,0 ммоль), растворяли в хлороформе (400 мл) и обрабатывали бромом (4,64 мл, 14,5 г, 90,3 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч с последующим добавлением гексанов (1000 мл) и полученную смесь перемешивали в течение 15 мин. Осадок собирали фильтрацией и промывали гексанами, затем водой и высушивали. Фильтрат промывали Na2CO3 и концентрировали. Остаток хроматографиро-вали (силикагель, этилацетат/CH^l^ 0-5%), получая дополнительное промежуточное соединение (общее количество 27,0 г, 91%). 1Н-ЯМР (500 МГц, ХЛОРОФОРМ-d) 8 м.д. 8,48-8,56 (1Н, м), 7,94 (1Н, дд, J=8,35, 2,05 Гц), 7,56 (1Н, д, J=8,20 Гц), 7,48 (1Н, с), 4,46 (2Н, с).
Часть 2, стадия D. Промежуточное соединение, полученное в части 2, стадия С (4,84 г, 14,0 ммоль), смешивали с 3,5-диметилпиразин-2-амином (1,81 г, 14,7 ммоль), полученным в части 1 и ацетонитрилом (30 мл) в закрытой пробирке. Смесь перемешивали при 100°С в течение ночи и охлаждали до комнатной температуры. Добавляли этилацетат (60 мл) и осадок собирали, затем промывали этилацетатом и высушивали, получая 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-бром-1Н-изохромен-1-он гидробромид (5,04 г, 80%). MS m/z 370,2, 372,2[М+Н]+. 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,50-8,54 (1Н, м), 8,34 (1Н,
с), 8,21 (1Н, д, J=1,89 Гц), 8,02 (1Н, дд, J=8,35, 2,05 Гц), 7,80 (1Н, д, J=8,51 Гц), 7,51-7,57 (1Н, м), 2,79 (3Н, с), 2,41 (3Н, д, J=0,95 Гц).
Часть 2, стадия Е. 3-(6,8-Диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-бром-1Н-изохромен-1-он гидробромид, полученный в части 2, стадия D (1,13 г, 2,5 ммоль), смешивали с 4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-5,6-дигидропиридин-1(2Н) -трет-бутилкарбоксилатом (1,55 г, 5,0 ммоль), Pd2dba3 (0,12 г, 0,013 ммоль), KF (0,87 г, 15,0 ммоль), t-Bu3PHBF4 (0,087 г, 0,3 ммоль) и THF (10,0 мл). Под покрытием аргона реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. После охлаждения смесь разбавляли CH2Cl2 (10 мл) и фильтровали. Осадок промывали CH2Cl2 и фильтраты объединяли и упаривали. Остаток обрабатывали 10%-ным TFA в CH2Cl2 (55 мл) в течение 2 ч при комнатной температуре. Летучие компоненты удаляли и остаток нейтрализовали Na2CO3. После упаривания досуха остаток суспендировали в 10% МеОН в CH2Cl2 и фильтровали. Фильтрат хроматографировали (силикагель, Ме-0-20%), получая целевое соединение в форме белого порошка (0,92 г, 99%). Температура плавления: 266°С (разложение); MS m/z 373,2[М+Н]+. 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,45 (1Н, с), 8,27-8,30 (1Н, м), 8,18 (1Н, д, J=1,00 Гц), 8,04 (1Н, дд, J=1,00 Гц), 7,88 (1Н, д, J=8,51 Гц), 7,56 (1Н, с), 6,41-6,49 (1Н, м), 3,80-3,87 (2Н, м), 3,38 (2Н, т, J=6,15 Гц), 2,76-2,81 (2Н, м), 2,75 (3Н, с), 2,39 (3Н, д,
J=0,95 Гц).
Как показано ниже в табл. 1, дополнительные соединения, раскрытые здесь, могут быть получены согласно примеру 12 с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции. Пример 13.
Получение соединения 96
Соединение 88, полученное в примере 12 (37,2 мг, 0,1 ммоль), смешивали с 10%-ным Pd/C (8,0 мг) и EtOH (1,0 мл) и гидрировали при комнатной температуре в течение ночи, используя баллон с водородом. Смесь разбавляли CH2Cl2 (2,0 мл) и фильтровали через Целит. Фильтрат собирали и хроматографировали (силикагель, 0-20% МеОН в CH2Cl2), получая целевое соединение в форме белого порошка (21,0 мг, 56%). Температура плавления: 218-220°С; MS m/z 375,2[М+Н]+. 1Н-ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) 8 м.д. 8,43 (1Н, с), 8,29 (1Н, д, J=0,63 Гц), 8,02 (1Н, д, J=1,58 Гц), 7,85 (1Н, д, J=8,20 Гц), 7,76 (1Н, дд, J=8,20, 1,89 Гц), 7,54 (1Н, с), 3,38-3,47 (2Н, м), 2,96-3,10 (3Н, м), 2,76 (3Н, с), 2,40 (3Н, д, J=0,95 Гц), 1,97-2,08 (2Н, м), 1,76-1,92 (2Н, м).
В табл. 1 приведены выделенные соединения в форме свободного основания соединения формулы (Ia1), которые могут быть получены согласно процедурам приведенных примеров с заменой подходящих исходных материалов, реагентов и условий реакции. Получение любой соли, изотополога, стереоизоме-ра, рацемата, энантиомера, диастереомера или таутомера из формы свободного основания соединения формулы (Ia1) также рассматривается и включено в рамки описания. Если форма свободного основания соединения не была отделена от формы соли, специалист может осуществить необходимые реакции для получения и выделения формы свободного основания соединения.
Термин "Соед." обозначает номер соединения, термин "Прим." обозначает "Номер приме-ра"(причем * указывает, что соответствующий пример для соединения приведен выше), термин "Т.пл." обозначает "Температуру плавления (°С)", термин "MS" обозначает "Пик(и) Масс-спектроскопии m/z M+, [М+Н]+, [М+2Н]+, [М-Н]- или [М-2Н]-", термин "D" обозначает "Разложение/Расщепление", термин "DR" обозначает "Скорость разложения," термин "S" обозначает "Размягчение", термин "ND" указывает, что значение "не было определено" и термин "NI" указывает, что соединение "не было выделено".
3-(имидазо[2,1-b][1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
224-226
353,3
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(4-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он
109-110
365, 3
3-(3,4-диметоксифенил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
155-157
381,3
3-(4-метоксифенил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
129-131
351, 3
3-(2-метоксифенил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
143-146
351, 3
3-(имидазо[2,1-Ь][1,3]тиазол-б-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
236-238
367, 2
7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
343-345
322, 1
3 -(2 , 3 -дигидро-1,4-бензодиоксин-б-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
175-177
379,2
3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7- [ (3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
236-238
378, 2
3-(2,З-дигидро-1,4-бензодиоксин-б-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
175-177
379,2
3-(2,З-дигидро-1,4-бензодиоксин-б-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
163-165
379,2
3-(2,З-дигидро-1,4-бензодиоксин-б-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
218-220
393 , 3
3-(1, З-бензодиоксол-5-ил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
248-250
365,3
3-(3,4-дигидроксифенил)-7- [ (3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
220-222
353,2
3-(4-этоксифенил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
239-240
365, 3
3-(3-фтор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
209-211
369,1
3-(3-гидроксифенил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он
256-258
337,2
3-(2-фтор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
167-168
369,2
3-(3-хлор-4-метоксифенил)-7- [ (3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
187-189
385,2
3-(4-фтор-3-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
118-120
369,2
3-(5-фтор-2-метоксифенил)-7- [ (3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
115-117
369,2
3-(3,5-дифтор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
170-173
387, 2
3 -(2,4-диметоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
231 (D)
381,6
3-(4-этоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
245 (D)
351, 8
3-(2-метил-1-бензофуран-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
206-208
361, 7
3-[3-(дифторметокси)фенил]-7- [ (3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
132-134
387, 0
3-[4-(дифторметокси)фенил]-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
121-123
387,0
3-(имидазо[2,1-Ь] [1,3]тиазол-б-ил)-7 - [ (3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
340-342
367, 0
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
225-227
362 , 0
3 -(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
242-244
376, 1
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
279-281
390, 1
3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
343-345
381,0
3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3S)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
314-316
3 95 , 0
3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
240 (D)
395, 0
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил) -1Н-изохромен-1-он
> 330
376, 2
3-(б,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
325-327
390,2
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
244-246
404 , 3
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)- 7 -(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
240-241
390, 1
3 -(б,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
255-256
404, 1
3-(3,4-диметоксифенил)-7- [ (3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
138-140
395, 1
7-[(8aR)-гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
255-257
402, 5
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8aS)-гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он
282-285
416, 5
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8aR)-гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он
282-285
416, 5
3 -(б,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R) -3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
331-333
390 , 5
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
252-254
404, 1
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
238-240
404, 6
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
260-262
418, 5
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
248-250
420, 5
10*
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
219-221
389,5
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
202-204
403, 5
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
213-215
417, 5
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
240-242
419, 6
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8aS)-гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он
220-222
415, 1
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8aR)-гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил]-1Н-изохромен-1-он
218-220
415, 1
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)- 7 -(4-пропилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он, и
244-246
418,2
7-(4-трет-бутилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он;
300-302
432,3
7-(4-циклопропилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
260 (D)
416, 3
11*
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
192-194
434, 3
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метилпропил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
243-245
432,3
7-(4-циклобутилпиперазин-1-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
279-281
430,3
12*
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
266 (D)
373,2
3-(6,8-диметилимидазо [1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
240-242
387,3
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
227-229
401,3
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(пропан-2-ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он
259-261
415,3
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- [1-(2-метоксиэтил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он
174-176
431,2
7-(1-циклопропил-1,2,3,6 -тетрагидропиридин-4-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
230-232
413,3
7-(1-циклобутил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
252-254
427, 3
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
226-228
415, 3
13*
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 -(пиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
218-220
375,2
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
294-296
432, 3
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(оксетан-3-ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он
253-255
429, 3
3-(б-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
221-226
396, 3
100
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
291-296
410, 3
101
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
286-291
438, 3
102
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
229-234
424,3
103
3-(2-метил-1,З-бензотиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
271-276
378, 3
104
3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
231-236
392,3
105
3 -(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7 - [4 - (пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
222-228
420, 3
106
3-(2-метил-1,З-бензотиазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
229-235
378,2
107
3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
222-228
434,4
108
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
251-258
410,2
109
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
251-258
410,2
110
3 -(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
261-266
424, 2
111
3-(б-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
271-276
424, 2
112
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
270-275
424,2
113
3 -(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
269-273
393,2
114
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
248-250
389,4
115
3-(6 , 8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- (1-этилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
215-217
403,4
116
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
204-206
417,5
117
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(пропан-2-ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он
227-229
417,5
118
7-(1-циклобутилпиперидин-4-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
429, 5
119
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(оксетан-3-ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он
225-227
431, 5
120
7-[(3S)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
255-260
404,2
121
7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
250-255
390, 2
122
3-(б-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил) -1Н-изохромен-1-он
279-285
376,2
123
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- (4-гидроксипиперидин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
290-292
391,3
124
7-[4 -(диметиламино)пиперидин-1-ил]-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
274-276
418, 3
125
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
219-225
376,2
126
7-[(3R)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
238-241
404,2
127
7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
243-248
390, 3
128
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил) -7- [4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
231-236
404, 3
129
7-[(3R,5S)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
233-238
418, 2
130
7-[(3R,5S)-4-(2-гидроксиэтил)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
241-245
434,2
131
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
279-284
404, 3
132
7-[(3R,5S)-4-циклобутил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
444, 3
133
7-[(3R)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
420,2
134
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-(2-гидроксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
434,2
135
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-этил-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
238-243
418,2
136
7-[(3S)-4-циклобутил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
277-282
444,2
137
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-З-метил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
249-254
432,3
138
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (3S)-3-метил-4 -(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
266-271
432 , 2
139
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- [ (3S)-З-метил-4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
251-256
446, 3
140
3-(б,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- [ (3R)-4-этил-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
243-246
418,2
141
3-(б,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- [ (3R)-З-метил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
251-256
432, 3
142
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-(2-гидроксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
256-261
434,2
143
7-[(3R)-4-циклобутил-3-метилпиперазин-1-ил]-3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
281-285
444, 3
144
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7- [ (3R)-З-метил-4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
262-267
432,2
145
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-(2-метоксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
205-210
448,2
146
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7 - [ (3S)-4-(2-метоксиэтил)-З-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
221-226
448, 2
147
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-4-этил-3 , 5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
253-258
432,2
148
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
259-263
446, 3
149
3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
261-266
418,2
150
3 -(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
390,2
151
3 -(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
229-234
404, 3
152
3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S) - 3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
206-211
404, 3
153
3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
208-213
404, 3
154
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
239-244
418, 2
155
7 -[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3 -(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он
233-238
418 , 2
156
3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
268-270
361, 3
157
3-(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он
239-240
375, 3
158
3 -(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он
235-238
432 , 2
159
3 -(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он
239-241
387, 3
или их соль, изотополог, стереоизомер, рацемат, энантиомер, диастереомер или таутомер.
Биологические примеры
Чтобы описать более подробно и помочь в понимании настоящего описания, предлагаются следующие неограничивающие биологические примеры, более полно иллюстрирующие объем описания и которые не должны рассматриваться как специфически ограничивающие его объем. Такие вариации настоящего описания, которые могут уже быть известны или разработаны позже и которые находятся в рамках компетенции специалиста, считаются входящими в рамки соединений, как описано здесь и заявлено далее. Эти примеры иллюстрируют тестирование некоторых соединений, описанных здесь, in vitro и/или in vivo и демонстрируют пригодность этих соединений для лечения SMA, усиления включения экзона 7 SMN2 в мРНК, транскрибируемую от гена SMN2. Соединения формулы (Ia1) усиливают включение экзона 7 SMN2 в мРНК, транскрибируемую от гена SMN2 и увеличивают уровни белка Smn, продуцируемого от гена SMN2, и, таким образом, могут использоваться для лечения SMA у пациента-человека.
Пример 1.
Конструкция минигена SMN2. Получение конструкций минигена.
ДНК, соответствующую области гена SMN2, начинающейся с 5' конца экзона 6 (ATAATTCCCCC)(SEQ ID NO. 14) и заканчивающейся на остатке нуклеиновой кислоты 23 экзона 8 (CAGCAC)(SEQ ID NO. 15), амплифицировали с помощью PCR с использованием следующих праймеров:
Прямой праймер: 5'-CGCGGATCCATAATTCCCCCACCACCTC-3' (SEQ ID NO. 16).
Обратный праймер: 5'-CGCGGATCCGTGCTGCTCTATGCCAGCA-3' (SEQ ID NO. 17).
5' конец каждого праймера был сконструирован с добавлением сайта распознавания эндонуклеазы рестрикции BamHI на 5' конце экзона 6 (GGATCC)(SEQ ID NO. 18) и 3' конце после 23-го нуклеотида экзона 8. Используя сайты распознавания эндонуклеазы рестрикции BamHI, фрагмент PCR клонировали в производное оригинального вектора рсДНК 3.1/Hygro, который был модифицирован как раскрыто в публикации заявки на патент US 2005/0048549.
Новые UTR добавляли к модифицированному вектору, используя сайт HindIII и сайты рестрикции
BamHI, включающие 5'DEG UTR: 5'-
TAGCTTCTTACCCGTACTCCACCGTTGGCAGCACGATCGCACGTCCCACGTGAACCATTGGTA
AACCCTG-3' (SEQ ID NO. 19), клонированный в модифицированный вектор pcDNA3.1/Hygro вместе со стартовым кодоном выше сайта рестрикции BamHI и;
3'DEG UTR: 5'-
ATCGAAAGTACAGGACTAGCCTTCCTAGCAACCGCGGGCTGGGAGTCTGAGACATCACTCAAG ATATATGCTCGGTAACGTATGCTCTAGCCATCTAACTATTCCCTATGTCTTATAGGG-3' (SEQ ID NO.
20), клонированный в модифицированный вектор pcDNA3.1/Hygro с использованием сайта распознавания рестрикционной эндонуклеазы NotI и сайта распознавания рестрикционной эндонуклеазы XhoI с терминирующим кодоном непосредственно после сайта рестрикции NotI. Кроме того, ген люциферазы светлячка с отсутствующим стартовым кодоном клонировали в вектор, используя BamHI и сайты рестрикции NotI.
Полученный миниген включает, в порядке от 5' к 3' : 5'-DEG UTR, стартовый кодон, шесть дополнительных нуклеотидов, формирующих сайт рестрикции BamHI, остатки нуклеиновой кислоты экзона 6, остатки нуклеиновой кислоты интрона 6 SMN2, остатки нуклеиновой кислоты экзона 7 SMN2, остатки нуклеиновой кислоты интрона 7 SMN2 и первые 23 остатка нуклеиновой кислоты экзона 8 SMN2, дополнительные шесть нуклеотидов, формирующих сайт рестрикции BamHI и ген люциферазы светлячка с отсутствующим стартовым кодоном.
Единственный остаток аденина был вставлен после нуклеотида 48 экзона 7 SMN2 сайт-направленным мутагенезом. Эта конструкция минигена упоминается как SMN2-A.
Транскрипты SMN2, полученные из минигенов, содержащих экзон 6-8 и промежуточные интроны, демонстрируют сплайсинг их эндогенной пре-мРНК (Lorson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1999, 96 (11), 6307). Получали SMN2-альтернативную конструкцию репортера сплайсинга, которая содержит эк-зоны 6-8 и промежуточные интроны, сопровождаемые репортерным геном люциферазы. Существенными признаками этой конструкции является отсутствие стартового кодона в гене люциферазы, инактивация стоп-кодона (в открытой рамке считывания, которая кодирует белок SMN) экзона 7 вставкой нуклеотида после нуклеиновой кислоты 48 экзона 7 и добавление стартового кодона (ATG) непосредственно выше экзона 6. Единственный аденин (SMN2-A) был вставлен после нуклеинового остатка 48 экзона 7.
Миниген SMN2 был сконструирован так, чтобы репортерный ген люциферазы находился в рамке со стартовым кодоком ATG непосредственно выше экзона 6, когда экзон 7 присутствует в мРНК и репор-терный ген люциферазы находился вне рамки со стартовым кодоном ATG непосредственно выше экзона 6, если экзон 7 SMN2 удален в ходе сплайсинга пре-мРНК. Кроме того, в отсутствие экзона 7, открытая рамка считывания, которая начинается со стартового кодона ATG непосредственно выше экзона 6, содержит стоп-кодон во фрагменте экзона 8 SMN. Таким образом, в присутствии соединений, которые увеличивают включение экзона 7 SMN2 в мРНК, транскрибируемую от гена SMN2, продуцируется больше транскриптов, содержащих экзон 7 и более функциональный репортер. Схематическая иллюстрация этого описания может быть найдена на фиг. 1.
Последовательность ДНК минигена из конструкции SMN2-A SEQ ID NO. 21 приведена на фиг. 2а. Изображение минигена субпоследовательности SMN2-A представлено на фиг. 2b.
Пример 2.
Тест RT-qPCR сплайсинга мРНК минигена SMN2 в культивируемых клетках.
Основанный на количественной PCR с обратной транскрипцией (RT-qPCR) тест используют, чтобы определить количественно уровень полноразмерной мРНК минигена SMN2, содержащей экзон 7 SMN2, на линии клеток ?0X293^ стабильно трансфицированной указанным минигеном и обработанной тестируемым соединением.
Материал
Источник
Клетки НЕК2 93Н
АТСС Catalog No.: CRL-1573
Cells-To-Ct
лизирующий буфер
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4399002
DMEM
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11960-044
96-луночные
плоскодонные
планшеты
Becton Dickinson Catalog No.: 353072
Смесь ферментов RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Part No. : 4388520 (также включенный в AgPath-ID kit Catalog No.: 4387391)
Буфер RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Part No.: 4388519 (также включенный в AgPath-ID kit Catalog No.: 4387391)
Набор AgPath-ID One-Step RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4387391
Термоциклер
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) 7900HT
Протокол. Клетки HEK2 93Н, стабильно трансфицированные минигенной конструкцией SMN2-A, описанной выше (10000 клеток/лунка), высевали в 200 мкл среды для культуры клеток (DMEM плюс 10%-ный FBS, с 200 мкг/мл гигромицина) в плоскодонные планшеты с 96 лунками и планшет немедленно взбалтывали, чтобы гарантировать правильное диспергирование клеток, образующее монослой клеток. Клеткам дают прикрепиться в течение по меньшей мере 4-6 ч. Тестируемые соединения последовательно разбавляют 3,16-кратно в 100%-ном ДМСО, чтобы произвести кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200х в ДМСО) добавляют в каждую содержащую клетки лунку и планшет инкубируют в течение 24 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% СО2, 100%-ная относительная влажность). 2 экземпляра получают для каждой тестируемой концентрации соединения. Клетки затем лизируют в лизирующем буфере Cells-To-Ct и лизат сохраняют при -80°С.
Полноразмерную мРНК минигена SMN2-A и GAPDH определяют количественно, используя следующие праймеры и зонды, приведенные в табл. 3. Праймер SMN Прямой A (SEQ ID NO. 1) гибридизу-ется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 7 (от нуклеотида 22 к нуклеотиду 40), праймер SMN Обратный A (SEQ ID NO. 2) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в последовательности, кодирующей люциферазу светлячка, зонд A SMN (SEQ ID NO. 3) гибридизуется с нуклеотид-ными последовательностями в экзоне 7 (от нуклеотида 50 к нуклеотиду 54) и экзоне 8 (от нуклеотида 1 к нуклеотиду 21). Комбинация этих трех олигонуклеотидов обнаруживает только минигены SMN1 или SMN2 (RT-qPCR) и не будет обнаруживать эндогенные гены SMN1 или SMN2.
1 Праймеры и зонды, разработанные РТС Therapeutics, Inc.
2 Коммерчески доступные от Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen).
Прямой и обратный праймеры SMN используются в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд SMN используется в конечной концентрации 0,15 мкМ. Праймеры GAPDH используются в конечных концентрациях 0,2 мкМ и зонды - в концентрации 0,15 мкМ.
Смесь SMN2-миниген GAPDH (15 мкл полный объем) получают, объединяя 7,5 мл 2х буфера RT-PCR, 0,4 мл 25х смеси ферментов RT-PCR, 0,75 мл 20х смеси праймер-зонд GAPDH, 4,0075 мл воды, 2 мл 10-кратно разбавленного лизата клеток, 0,06 мл 100 мМ прямого праймера SMN, 0,06 мл 100 мМ обратного праймера SMN и 0,225 мл 100 мМ зонда SMN.
PCR осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяют стадии 3 и 4 для в общей сложности 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит как миниген SMN2-A, так и наборы праймеров/зондов GAPDH (мультиплексный проект), обеспечивая одновременное измерение уровней двух транскриптов.
Два продукта сплайсинга SMN получают от минигека SMN2. Первый продукт сплайсинга, содержащий экзон 7, соответствующий полноразмерной мРНК SMN2, упомянут здесь с использованием термина "FL миниген SMN2." Второй продукт сплайсинга с отсутствующим экзоном 7 упомянут здесь с использованием термина "А7 миниген SMN2".
Увеличение FL минигена SMN2 мРНК относительно его содержания в клетках, обработанных контрольным носителем, определяют на основании данных PCR в реальном времени, используя модифицированный способ AACt (как описано в Livak and Schmittgen, Methods, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) вычисляют по наклону кривой амплификации для FL минигена SMN2 и GAPDH индивидуально. Изобилие FL минигена SMN2 и GAPDH затем вычисляют как (1+E)-Ct, где Ct представляет собой пороговое значение для каждого ампликона. Изобилие FL минигена SMN2 подвергают нормализации к изобилию GAPDH. Изобилие подвергнутого нормализации FL минигена SMN2 от обработанных тестируемым соединением образцов затем делят на изобилие подвергнутого нормализации FL минигена SMN2 от обработанных носителем клеток, чтобы определить уровень SMN2 FL мРНК относительно контроля, обработанного носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 3, клетки, обработанные соединением 65 (фиг. 3a) и соединением 69 (фиг. 3b), увеличили мРНК FL минигена SMN2 в низких концентрациях. Оба тестируемых соединения полностью восстановили включение экзона 7 относительно необработанных клеток.
Для соединений формулы (Ia1) или ее формы, раскрытой здесь, табл. 4 представляет EC15x для продукции полноразмерной мРНК SMN2, которая была получена от данных концентрации с 7 точками, произведенных для каждого тестируемого соединения согласно процедуре биологического примера 2. Термин "EC15x для продукции полноразмерной мРНК SMN2" определяют как концентрацию тестируемого соединения, которая является эффективной для увеличения количества полноразмерной мРНК SMN2 до уровня в 1,5 раза больше относительно уровня в обработанных носителем клетках. EC15x для продукции полноразмерной мРНК SMN2 от > 3 мкМ до <30 мкМ обозначены одной звездой (*), EC15x от > 1 мкМ до <3 мкМ обозначены двумя звездами (**), EC15x от > 0,3 мкМ до <1 мкМ обозначены тремя звездами (***), EC15x от > 0,1 мкМ до <0,3 мкМ обозначены четырьмя звездами (****) и EC15x <0,1 мкМ обозначены пятью звездами (*****).
Таблица 4
Соед.
ECl,5x
* *
* * *
*****
* *
* *
* *
Соед.
ECi,5x
* * *
* * * *
*****
*****
*****
* *
* * *
* *
*****
Соед.
ECi,5x
107
* * *
108
*****
109
*****
110
* * *
111
* * * *
112
* *
113
*****
114
*****
115
*****
* *
* * *
* * *
* *
* *
* * *
* * *
* * *
* *
* *
* * * *
* *
* *
* * *
* * *
*****
*****
* * *
* *
* * *
* * *
* *
* *
* * *
* * *
* * * *
*****
* * * *
* * * *
* * *
*****
* *
* * * *
* * *
*****
*****
*****
*****
* * *
*****
*****
* * * *
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
* * * *
* * * *
* * * *
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
*****
* *
*****
*****
100
*****
101
* * * *
102
* * * *
103
*****
104
* * * *
105
* * * *
106
* *
116
*****
117
*****
118
*****
119
* * * *
120
*****
121
*****
122
*****
123
* *
124
*****
125
*****
126
*****
127
*****
128
*****
129
*****
130
*****
131
*****
132
*****
133
*****
134
*****
135
*****
136
*****
137
*****
138
* * * *
139
* * *
140
*****
141
*****
142
*****
143
*****
144
*****
145
*****
146
* * * *
147
*****
148
*****
149
*****
150
*****
151
*****
152
*****
153
*****
154
*****
155
*****
156
*****
157
*****
158
*****
159
*****
Пример 3.
Тест RT-qPCR сплайсинга эндогенной мРНК SMN2 в культивируемых клетках.
Основанный на количественной PCR с обратной транскрипцией (RT-qPCR) тест используют, чтобы определить количественно уровни полноразмерной и А7 мРНК SMN2 в первичных клетках и линиях клеток, содержащих ген SMN2, обработанных тестируемым соединением.
Материал
Источник
Клетки SMA Типа 1 человека
GM03813 (Coriell Institute)
Лизирующий буфер Cells-To-Ct
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4399002
DMEM
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11960-044
96-луночные
плоскодонные
планшеты
Becton Dickinson Catalog No.: 353072
Смесь ферментов RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Part No.: 4388520 (также включенный в AgPath-ID kit Catalog No.: 4387391)
Буфер RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Part No. : 4388519 (также включенный в AgPath-ID kit Catalog No. : 4387391)
Набор AgPath-ID One-Step RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4387391
Термоциклер
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) 7900HT
Протокол. Клетки GM03813 пациента с SMA (5000 клеток/лунка) высевали в 200 мкл среды для культуры клеток (DMEM плюс 10%-ный FBS) в плоскодонные планшеты с 96 лунками и планшет немедленно взбалтывали, чтобы гарантировать правильное диспергирование клеток, образующее монослой клеток. Клеткам дают прикрепиться в течение по меньшей мере 4-6 ч. Тестируемые соединения последовательно разбавляют 3,16-кратно в 100%-ном ДМСО, чтобы произвести кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200 х в ДМСО) добавляют в каждую тестовую лунку и 1 мкл ДМСО добавляют в каждую контрольную лунку. Планшет инкубируют в течение 24 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% СО2, 100%-ная относительная влажность). Клетки затем лизируют в лизирующем буфере Cells-To-Ct и лизат сохраняют при -80°С.
SMN2-специфичные продукты сплайсинга и мРНК GAPDH идентифицируют, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 5. Праймер SMN FL Forward В (SEQ ID NO. 7) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 7 (от нуклеотида 32 к нуклеотиду 54) и экзоне 8 (от нуклеотида 1 к нуклеотиду 4), праймер SMN А7 Forward В (SEQ ID NO. 8) гибридизуется с нуклео-тидными последовательностями в экзоне 6 (от нуклеотида 87 к нуклеотиду 111) и экзоне 8 (от нуклеоти-да 1 к нуклеотиду 3), праймер SMN Reverse В (SEQ ID NO. 9) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8 (от нуклеотида 39 к нуклеотиду 62), зонд SMN Probe В (SEQ ID NO. 10) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8 (от нуклеотида 7 к нуклеотиду 36). Эти праймеры и зонд гибридизуются с нуклеотидными последовательностями, общими для мРНК SMN2 человека. Так как клетки пациента с SMA, используемые в примере 3, содержат только ген SMN2, RT-qPCR может определить количественно только полноразмерную SMN2 и А7 мРНК.
1 Праймеры и зонды, разработанные РТС Therapeutics, Inc.
2 Коммерчески доступные от Life Technologies, Inc (ранее Invitrogen).
Прямой и обратный праймеры SMN используются в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд SMN используется в конечной концентрации 0,15 мкМ. Праймеры GAPDH используются в конечных концентрациях 0,1 мкМ и зонд - в концентрации 0,075 мкМ. Набор одностадийной RT-PCR использовался как смесь PCR в реальном времени.
Смесь SMN-GAPDH (10 мкл полный объем) получают, объединяя 5 мкл 2х буфера RT-PCR, 0,4 мкл 25х смеси ферментов RT-PCR, 0,25 мкл 20х смеси праймер-зонд GAPDH, 1,755 мкл воды, 2,5 мкл лизата клеток, 0,04 мкл 100 мМ прямых праймеров SMN FL или SMN А7, 0,04 мкл 100 мкМ обратного праймера SMN и 0,015 мкл 100 мкМ зонда.
PCR осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяют стадии 3 и 4 для в общей сложности 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит либо SMN2 FL и GAPDH, либо SMN2 А7 и наборы прайме-ры/зонд GAPDH (мультиплексный проект), обеспечивая одновременное измерение уровней двух транс-криптов.
Эндогенный ген SMN2 дает начало двум прошедшим альтернативный сплайсинг мРНК. Полноразмерная мРНК SMN2, которая содержит экзон 7, упомянута здесь с использованием термина "SMN2 FL" . Усеченная мРНК, которая не содержит экзон 7, упомянута здесь с использованием термина "SMN2 А7".
Увеличение SMN2 FL и уменьшения SMN2 А7 мРНК относительно их уровней в клетках, обработанных контрольным носителем, определяют на основании данных PCR в реальном времени, используя модифицированный способ ААО: (как описано в Livak and Schmittgen, Methods, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) вычисляют по наклону кривой амплификации для SMN2 FL, SMN2 А7 и GAPDH индивидуально. Изобилие SMN2 FL, SMN2 А7 и GAPDH затем вычисляют как (1+E)-Ct, где Ct представляет собой пороговое значение для каждого ампликона. Изобилие SMN2 FL и SMN2 А7 подвергают нормализации к изобилию GAPDH. Подвергнутые нормализации изобилия SMN2 FL и SMN2 А7 от обработанных тестируемым соединением образцов затем делят на изобилие подвергнутых нормализации SMN2 FL и SMN2 А7, соответственно, от обработанных носителем клеток, чтобы определить уровни SMN2 FL и SMN2 А7 мРНК относительно контроля, обработанного носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 4, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 4а) и соединения 69 (фиг. 4b), содержат прогрессивно больше SMN2 FL мРНК и меньше SMN2 А7 мРНК, чем те, которые обработаны носителем, показывая коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2.
Пример 4.
Полуколичественный тест RT по окончании PCR сплайсинга эндогенной мРНК SMN2 в культивируемых клетках.
Тест сплайсинга с обратной транскрипцией по окончании PCR используется для визуализации и количественного определения уровней полноразмерной и А7 мРНК SMN2 в первичных клетках и линии клеток, содержащих ген SMN2, обработанных тестируемым соединением.
Материал
Источник
Клетки SMA Типа 1 человека
GM03813 (Coriell Institute)
Cells-To-Ct лизирующий буфер
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4399002
DMEM
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11960-044
96-луночные
плоскодонные
планшеты
Becton Dickinson Catalog No.: 353072
Platinum Taq HiFi DNA Polymerase Super Mix
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11304-016
iScript RT ферментный набор
BioRad: Catalog No.: 170-8890
Этидий бромид 2% гели агарозы Е 48-лунок Double Comb
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: G8008-02
Gel Documentation System
UVP Gel Doc It 310 Imaging system
Протокол. Клетки GM03813 пациента с SMA (5000 клеток/лунка) высевали в 200 мкл среды для культуры клеток (DMEM плюс 10%-ный FBS) в плоскодонные планшеты с 96 лунками и планшет немедленно взбалтывали, чтобы гарантировать правильное диспергирование клеток, образующее монослой клеток. Клеткам дают прикрепиться в течение по меньшей мере 4-6 ч.
Тестируемые соединения последовательно разбавляют 3,16-кратно в 100%-ном ДМСО, чтобы произвести кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200х в ДМСО) добавляют в каждую тестовую лунку и 1 мкл ДМСО добавляют в каждую контрольную лунку. Планшет инкубируют в течение 24 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% CO2, 100%-ная относительная влажность). Клетки затем лизируют в лизирующем буфере Cells-To-Ct и лизат сохраняют
при -80°С.
SMN FL и А7 мРНК идентифицируют, используя следующие праймеры в табл. 6. Эти праймеры ги-бридизуются с нуклеотидными последовательностями в экзоне 6 (SMN Прямой С, SEQ ID NO. 11)(от нуклеотида 43 к нуклеотиду 63) и экзоне 8 (SMN Обратный С, SEQ ID NO. 12)(от нуклеотида 51 к нук-леотиду 73), общими для человеческой мРНК SMN2. Так как клетки пациента с SMA, используемые в примере 4, содержат только ген SMN2, RT-PCR может визуализировать и определить количественно только полноразмерную мРНК SMN2 и А7 мРНК SMN2.
1 Праймер, разработанный РТС Therapeutics, Inc.
Чтобы синтезировать кДНК, 5 мкл лизата, 4 мкл 5х реакционной смеси iScript, 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды объединяли и инкубировали 5 мин при 25°С, затем 30 мин при 42°С, затем 5 мин при 85°С. Раствор кДНК сохраняли при -20°С.
Чтобы осуществить PCR, 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразной суперсмеси объединяли в 96-луночных полуокаймленных планшетах для PCR. PCR осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяют стадии 2-4 для в общей сложности 33 циклов, затем поддерживают при 4°С.
10 мкл каждого образца PCR разделяли электрофорезом на 2%-ном агарозном Е-геле в течение 14 минут, окрашивали окрашивающим реагентом для двухцепочечной ДНК ^ДНК)(например, этидий бромидом) и визуализировали с использованием геля для формирования изображений.
Результаты. Как видно на фиг. 5, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 5а) и соединения 69 (фиг. 5b) содержат прогрессивно больше FL мРНК SMN2 и меньше А7 мРНК SMN2, что показывает коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2.
Пример 5.
Тест RT-qPCR сплайсинга мРНК SMN2 в тканях животных.
Основанный на количественной PCR с обратной транскрипцией (RT-qPCR) тест используется для количественного определения уровней полноразмерной и А7 мРНК SMN2 в тканях мышей, обработанных тестируемым соединением.
Материалы
Материал
Источник
Ткани от мышей С/С-аллеля SMA
The Jackson Laboratory, штамм No.: 008714
(В 6 . 12 9 - SmП 1tm5 (Smnl/SMN2)Mrph J J)
Ткани от мышей А7 SMA
The Jackson Laboratory, штамм No. : 0 0502 5 (FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg (SMN2) 8 9Ahmb Smn 1 tmiMsd/ j)
Смесь ферментов RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Part No. : 4388520 (также включен в набор AgPath-ID kit Catalog No.: 4387391)
Буфер RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Part No.: 4388519 (также включен в набор AgPath-ID kit Catalog No.: 4387391)
Набор AgPath-ID One-Step RT-PCR
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4387391
Мышиные GAPDH праймеры и зонды
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4352339E
Лизирующий реагент QIAzol
Qiagen Catalog No.: 79306
RNeasy Lipid Tissue Mini Kit
Qiagen Catalog No.: 74804
5 мм шарики из нержавеющей стали
Qiagen Catalog No.: 69989
TissueLyzer II
Qiagen Catalog No.: 85300
Термоциклер
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) 7900HT
Протокол. Мышей С/С-аллель SMA обрабатывали пероральным скармливанием два раза в сутки (BID) в течение 10 дней тестируемых соединений, повторно суспендированных в 0,5% НРМС и 0,1% Tween-80. Образцы тканей собирали и быстро замораживали для очистки РНК.
Образцы тканей (20-40 мг) гомогенизировали в лизирующем реагенте QIAzol в течение 2 мин при 20 Гц в TissueLyser II, используя один шарик из нержавеющей стали. После добавления хлороформа го-могенат разделяли на водную и органическую фазы центрифугированием. РНК отделялась наверх, водную фазу экстрагировали и добавляли этанол, чтобы обеспечить подходящие условия связывания. Образец затем наносили на колонку RNeasy из RNeasy Mini Kit, где полное количество РНК связывается с мембраной. РНК элюировали в воде без РНК-азы, затем сохраняли при -20°С и впоследствии анализировали с использованием TaqMan RT-qPCR на 7900НТ термоциклере. Полную РНК разбавляли в десять раз и 2,5 мкл разбавленного образца добавляли к смеси TaqMan RT-qPCR.
Продукты сплайсинга SMN2 идентифицировали, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 7. Праймер SMN FL Прямой В (SEQ ID NO. 7) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзонах 7 и 8, праймер SMN А7 Прямой В (SEQ ID NO. 8) гибридизуются с нуклеотидными последовательностями в экзонах 6 и 8, праймер SMN Обратный В (SEQ ID NO. 9) гибри-диэуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8, зонд SMN Зонд В (SEQ ID NO. 10) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 8. Эти праймеры и зонд гибридизуются с последовательностями нуклеотида, общими для человеческой мРНК SMN2. Так как клетки пациента с SMA, используемые в примере 5, содержат только ген SMN2, RT-qPCR может определить количественно только полноразмерную мРНК и А7 мРНК SMN2.
1 Праймеры и зонды, разработанные РТС Therapeutics, Inc.
Прямые и обратные праймеры SMN используются в конечных концентрациях 0,4 мкМ. Зонд SMN используется в конечной концентрации 0,15 мкМ. Смесь SMN-GAPDH (полный объем 10 мкл) получают, объединяя 5 мкл 2х буфера RT-PCR, 0,4 мкл 25х смеси ферментов RT-PCR, 0,5 мкл 20х смеси прай-мер-зонд GAPDH, 1,505 мкл воды, 2,5 мкл раствора РНК, 0,04 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,04 мкл 100 мкМ обратного праймера и 0,015 мкл 100 мкМ зонда SMN.
Каждый цикл PCR осуществляли при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 с); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяют стадии 3 и 4 для в общей сложности 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит наборы праймеры/зонд (мультиплексный проект) либо SMN2 FL и mGAPDH, либо SMN2 А7 и mGAPDH, обеспечивая одновременное измерение уровней двух транс-криптов.
Увеличение SMN2 FL и уменьшение SMN2 А7 мРНК относительно их уровней в тканях животных, обработанных контрольным носителем, определяют на основании данных PCR в реальном времени, используя модифицированный способ ААО: (как описано в Livak and Schmittgen, Methods, 2001, 25:402-8). Эффективность амплификации (Е) вычисляют по наклону кривой амплификации для SMN2 FL, SMN2 А7 и GAPDH индивидуально. Изобилие SMN2 FL, SMN2 А7 и GAPDH затем вычисляют как (1+E)-Ct, где Ct представляет собой пороговое значение для каждого ампликона. Изобилие SMN2 FL и SMN2 А7 подвергают нормализации к изобилию GAPDH. Изобилие подвергнутых нормализации SMN2 FL и SMN2 А7 от обработанных тестируемым соединением образцов затем делят на изобилие подвергнутых нормализации SMN2 FL и SMN2 А7, соответственно, от обработанных носителем клеток, чтобы определить уровни SMN2 FL и SMN2 А7 мРНК относительно контроля, обработанного носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 6, ткани животных, обработанных соединением 65 (фиг. 6а) и соединением 69 (фиг. 6b), содержат существенно больше FL мРНК SMN2 и меньше А7 мРНК SMN2, чем обработанные носителем, что показывает коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2.
Пример 6.
Тест сплайсинга эндогенной мРНК SMN2 с помощью полуколичественной RT по окончании PCR в тканях животных.
Тест сплайсинга с помощью обратной транскрипции по окончании PCR (RT-PCR) использовали, чтобы определить количественно уровни полноразмерной и А7 мРНК SMN2 в тканях мышей, обработанных тестируемым соединением.
Материал
Источник
Ткани от мышей С/С-аллель SMA
The Jackson Laboratory, партия No.: 0 08714 (B6 .129-Smn ltm5(Smnl/SMN2)MrPh/J)
Ткани от мышей АЕхоп7 SMA
The Jackson Laboratory, партия No.: 005025 (FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg (SMN2 ) 89Ahmb SmnltmlMsd/J)
Липидный набор Qiagen RNeasy
Qiagen Catalog No.: 74804
Набор ферментов Platinum Taq HiFi DNA Polymerase Super Mix
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11304-016
iScript RT
BioRad Catalog No.: 170-8890
Twin.tec 96-луночные полуокаймленные планшеты для PCR
Eppendorf Catalog No.: 951020389
Этидий бромид 2% агарозные Е гели 48-Well Double Comb
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: G8008-02
Gel Documentation System
Система построения изображений UVP Gel Doc It 310 Imaging system
Протокол. Мышей С/С-аллель SMA обрабатывали пероральным скармливанием два раза в сутки в течение 10 дней тестируемых соединений в 0,5% НРМС и 0,1% Tween-80. Образцы ткани собирали и быстро замораживали для очистки РНК.
Образцы ткани (20-40 мг) гомогенизировали в лизирующем реагенте QIАзол в течение 2 мин при 20 Гц в TissueLyser II, используя один шарик из нержавеющей стали. После добавления хлороформа гомо-генат разделяли на водную и органическую фазы центрифугированием. РНК отделялась наверх, водную фазу экстрагировали и добавляли этанол, чтобы обеспечить подходящие условия связывания. Образец затем наносили на колонку RNeasy из RNeasy Mini Kit, где полное количество РНК связывается с мембраной. РНК элюировали в воде без РНК-азы, затем сохраняли при -20°С.
Продукты сплайсинга SMN2 идентифицировали, используя следующие праймеры и зонды, представленные в табл. 8. Эти праймеры гибридизуются с нуклеотидными последовательностями в экзоне 6 (SMN Прямой D, SEQ ID NO. 13)(от нуклеотица 22 к нуклеотиду 46) и экзоне 8 (SMN Обратный С, SEQ ID NO. 12), общими для человеческой мРНК SMN2.
1 Праймер, разработанный РТС Therapeutics, Inc.
Чтобы синтезировать кДНК, комбинируют 1 мкл раствора РНК (25-50 нг), 4 мкл 5х реакционной смеси iScript, 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды и инкубируют при 25°С в течение 5 мин, затем при 42°С в течение 30 мин, затем 85°С в течение 5 мин. Раствор кДНК сохраняют при -20°С.
Для осуществления PCR 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразной суперсмеси объединяют в 96-луночных полуокаймленных планшетах для PCR. PCR осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяют стадии 2-4 для в общей сложности 33 циклов, затем поддерживают при 4°С.
10 мкл каждого образца PCR разделяли электрофорезом на 2%-ном агарозном Е-геле в течение 14 мин, окрашивали окрашивающим реагентом для dsДНК (например, этидий бромидом) и визуализировали с использованием геля для формирования изображений.
Результаты. Как видно на фиг. 7, ткани от мышей, обработанных возрастающими концентрациями соединения 65, содержат прогрессивно больше FL мРНК SMN2 и меньше А7 мРНК SMN2, что показывает коррекцию альтернативного сплайсинга SMN2. Пример 7.
Тест белка Smn в культивируемых клетках.
Тест HTRF (гомогенная флюоресценция с временным разрешением) SMN используют, чтобы определить количественно уровень белка Smn в фибробластах пациента с SMA, обработанных тестируемыми соединениями. Результаты теста показаны в табл. 9.
Материалы
Материал
Источник
Клетки человека SMA Тип 1
GM03813 (Coriell Institute)
Коктейль
ингибитора
протеазы
Roche Applied Science Catalog No.: 11836145001
Анти-SMN d2
Blue cap Cisbio Catalog No.: 63IDC002-SMN
Анти-SMN криптат
Red cap Cisbio Catalog No.: 63IDC002-SMN
Буфер
восстановления SMN
Cisbio Catalog No.: 63IDC002-SMN-Buffer
DMEM
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11960-044
Лизирующий буфер RIPA
20 MM Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% NP-40, 1% натрий деоксихолат
Буфер для разбавления
20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl
Считыватель планшетов Envision Plate Reader
Perkin Elmer Model No.: 2103
Протокол. Клетки оттаивают и культивируют в DMEM-10% FBS в течение 72 ч. Клетки обрабатывают трипсином, подсчитывают и повторно суспендируют в концентрации 25000 клеток/мл в DMEM-10% FBS. Суспензии клетки высевают в плотности 5000 клеток на лунку в 96-луночный планшет для микротитрования и инкубируют в течение 3-5 ч. Для получения контрольного сигнала три (3) лунки в 96-луночном планшете не получают клетки и, таким образом, служат чистыми контрольными лунками. Тестируемые соединения последовательно разбавляют в 3,16 раз в 100% ДМСО, чтобы получить кривую изменения концентрации с 7 точками. 1 мкл раствора тестируемого соединения переносят в содержащие клетки лунки и клетки инкубируют в течение 48 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% CO2, 100%-ная относительная влажность). Получают тройные образцы для каждой тестируемой концентрации соединения. Через 48 ч супернатант удаляют из лунки и 25 мкл лизирующего буфера RIPA, содержащего ингибиторы протеазы, добавляют к лунке и инкубируют при взбалтывании при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляют 25 мкл разбавителя и затем 35 мкл полученного лизата перекосят на планшет с 384 лунками, где каждая лунка содержит 5 мкл раствора антитела (разбавление 1:100 анти-SMN d2 и ан-ти-SMN криптат в буфере восстановления SMN). Планшет центрифугируют в течение 1 мин, чтобы вызвать растворение основания лунки, затем инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Флюоресценцию для каждой лунки планшета при 665 и 620 нм измеряют на спектрофотометре для считывания Envision multilabel (Perkin-Elmer).
Нормализованный сигнал флюоресценции вычисляют для каждого образца, чистого контроля и контрольной лунки с носителем, деля сигнал при 665 нм на сигнал при 620 нм. Нормализация сигнала объясняет возможное затухание флюоресценции вследствие матричного эффекта лизата. Значение AF (измерение изобилия белка Smn как значение в процентах) для каждой лунки с образцами вычисляют, вычитая подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок из подвергнутой нормализации флюоресценции для каждой лунки с образцами, затем деля эту разницу на подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок и умножая полученное значение на 100. Значение AF для каждой лунки с образцами представляет изобилие белка Smn в тестируемых образцах, обработанных соединением. Значение AF для каждой лунки с образцами делят на значение AF для контрольных лунок с носителем, чтобы вычислить кратность увеличения изобилия белка Smn относительно контроля с носителем.
Результаты. Как видно на фиг. 8, фибробластная клетка пациента с SMA тип 1, обработанная соединением 65 (фиг. 8а) и соединением 69 (фиг. 8b), демонстрирует дозозависимое увеличение экспрессии белка Smn при измерении в тесте HTRF SMN.
Для соединений формулы (Ia1) или ее формы, раскрытой здесь, в табл. 9 показана EC15x для экс
прессии белка Smn, которая была получена от данных концентрации с 7 пунктами, произведенных для каждого тестируемого соединения согласно процедуре биологического примера 7. Термин "EC15x для экспрессии белка Smn" определяют как концентрацию тестируемого соединения, которая является эффективной для продуцирования в 1,5 раза большего количества белка Smn в фибробласте пациента с SMA по сравнению с количеством, продуцированным в контроле с носителем, ДМСО. EC15x для экспрессии белка Smn от > 3 мкМ до <10 мкМ обозначена одной звездой (*), EC15x от > 1 мкМ до <3 мкМ обозначена двумя звездами (**), EC15x от > 0,3 мкМ до <1 мкМ обозначена тремя звездами (***) и EC15x <0,3 мкМ обозначена четырьмя звездами (****).
Таблица 9
Соед.
ECl,5x
* * *
* * * *
* *
* * * *
* * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * *
* * * *
* * * *
* * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * *
Соед.
ECl,5x
* * *
* * * *
? * * *
****
****
* * *
****
* * * *
***
* * * *
* * * *
***
***
100
***
101
***
103
****
108
* * * *
109
***
110
* * *
111
***
112
113
* *
114
****
115
* * * *
116
***
117
* * *
118
****
119
***
120
****
121
* * * *
122
* * * *
124
* * * *
125
* * * *
126
* * * *
Соед.
ECi,5x
127
* * * *
128
129
130
* * * *
131
* * * *
132
133
* * * *
134
* * * *
135
* * * *
136
137
* * * *
138
139
* *
140
* * * *
141
* * * *
142
* * * *
143
* * * *
144
* * * *
145
146
* * * *
147
* * *
148
149
+ * * *
150
151
¦к * * *
152
153
¦к * * *
154
* * * *
155
* * * *
156
* * * *
157
* * * *
158
* * * *
159
* * * *
Для соединений формулы (Ia1) или ее формы, раскрытой здесь, в табл. 10 приведена максимальная кратность (Кратность) увеличения белка Smn, которая была получена от данных концентрации с 7 пунктами, произведенных для каждого тестируемого соединения согласно процедуре биологического примера 7. Максимальная кратность увеличения <1,2 обозначена одной звездой (*), кратность увеличения от > 1,2 до <1,35 обозначена двумя звездами (**), кратность увеличения от > 1,35 до <1,5 обозначена тремя звездами (***), кратность увеличения от > 1,5 до <1,65 обозначена четырьмя звездами (****) и кратность увеличения > 1,65 обозначена пятью звездами (*****).
Соед.
Кратность
* *
* *
* * * *
* *
? *
* * *
* * *
* * *
* * *
* * * *
* * * *
* *
* * *
* * *
* *
* * *
* *
* * *
* * * *
* * *
? * *
* *
Соед.
Кратность
107
* * *
108
*****
109
*****
110
* * * *
111
*****
112
*****
113
* * * *
114
*****
115
*****
116
* * * *
117
*****
118
* * * *
119
* * * * *
120
*****
121
*****
122
*****
123
124
* * * *
125
*****
126
* * * *
127
*****
128
*****
129
*****
130
* * * *
131
*****
132
*****
133
*****
134
*****
135
*****
136
*****
137
*****
138
* * * *
139
*****
140
*****
141
*****
142
*****
143
*****
144
*****
145
*****
146
*****
147
*****
148
* * * *
149
*****
150
*****
151
*****
152
*****
153
*****
154
*****
155
*****
156
*****
157
* * * *
158
*****
159
*****
Пример 8.
Тест подсчета гемов (Smn-зависимый подсчет ядерного спекла).
Уровень белка Smn непосредственно коррелирует с количеством ядерных фокусов, также известных как гемы, полученных после окрашивания клетки флуоресцентно меченным анти-Smn антителом (Liu and Dreyfuss, EMBO J., 1996, 15:3555). Гемы представляют собой мультибелковые комплексы, формирование которых обусловлено белком Smn и тест подсчета гемов используется для оценки уровня белка Smn в клетке. Как описано здесь, тест подсчета гемов используется для количественного определения уровня белка Smn в фибробластных клетках пациента с SMA, обработанных тестируемым соединением.
Материалы
Материал
Источник
Клетки человека SMA тип 1
GM03813 (Coriell Institute)
Первичное антитело мыши анти-SMN клон 2В1
Sigma Catalog No.: S2944
Вторичное антитело-анти-мышь Alexa Fluor 555
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: A21422
Бычий сывороточный альбумин (BSA)
Sigma Catalog No.: A3294
4% параформальдегид
Electron Microscopy Sciences Catalog No.: 15710
Бортезомиб
LC Labs, Catalog No.: B-1408
0,05% Triton Х-100
Sigma Catalog No.: 93443-100 мл
Гистологическая среда-ProLong Gold Antifade Reagent с DAPI
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog Nos.: P7481 и P36935
22x22 No.: 1 стерильные покровные стекла
Fisher Catalog No.: 12-548-B
DMEM
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11960-044
PBS
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 10010-031
Прозрачный лак для ногтей
Revlon brand Catalog No.: 1271-76
Флуоресцентный микроскоп Zeiss Axovert 135
Zeiss
Протокол. Клетки оттаивают и культивируют в DMEM-10% FBS в течение 72 ч, затем обрабатывают трипсином, подсчитывают и повторно суспендируют в концентрации 100000 клеток/мл в DMEM-10% FBS, 2 мл суспензии клеток высевают в 6-луночный планшет для клеточной культуры со стерильным покровным стеклом и инкубируют в течение 3-5 ч. Тестируемые соединения последовательно разбавляют в 3,16 раз в 100% ДМСО, чтобы получить кривую изменения концентрации с 7 точками. 10 мкл раствора тестируемого соединения переносят в каждую содержащую клетки лунку и инкубируют в течение 48 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% CO2, 100%-ная относительная влажность). Для каждой тестируемой концентрации соединения получают два образца. Клетки, содержащие ДМСО в конечной концентрации 0,5%, используют в качестве контроля.
Среду для культуры клеток отсасывают из лунок, содержащих покровные стекла и мягко промывают три раза холодным PBS. Клетки фиксируют инкубацией в течение 20 мин при комнатной температуре в параформальдегиде. Клетки затем промывают два раза холодным PBS, затем осуществляют инкубацию в течение 5 мин при комнатной температуре с 0,05% Triton Х-100 в PBS для пермеабилизации клеток. После того как фиксированные клетки были промыты три раза холодным PBS, их блокируют 10%-ным FBS в течение 1 ч. Добавляют 60 мкл первичного антитела, разбавленного 1:1000 в блокирующем буфере и смесь инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Клетки промывают три раза PBS и добавляют 60 мкл вторичного антитела, разбавленного 1: 5000 в блокирующем буфере, затем смесь ин
кубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Покровные стекла монтируют на предметные стекла при помощи заливочной среды и дают высохнуть в течение ночи. Лак для ногтей наносят на края покровного стекла и стекла хранят в темноте. Zeiss Axovert 135 с объективом 63х Plan-Apochromat, NA=1,4 используют для детекции и подсчета иммунофлюоресценции. Подсчитывают число гемов на > 150 ядер и % активации вычисляют, используя ДМСО и 10 нМ бортезомиба в качестве контролей. Для каждого тестируемого соединения клетки исследуют при всех длинах волны, чтобы идентифицировать тестируемые соединения с присущей флюоресценцией.
Результаты. Как видно на фиг. 9, клетки пациента с SMA типа 1, обработанные соединением 65 (фиг. 9а) и соединением 69 (фиг. 9b), содержат прогрессивно больше гемов относительно клеток, обработанных ДМСО.
Пример 9 Тестирование белка Smn в человеческих мотонейронах.
Иммунофлуоресцентную софокусную микроскопию Smn используют, чтобы количественно определить уровень белка Smn в человеческих мотонейронах, обработанных тестируемыми соединениями.
Протокол. Человеческие мотонейроны, полученные из клеток SMA iPS (Ebert et al., Nature, 2009, 457:2770; и Rubin et al., BMC Biology, 2011, 9:42), обрабаывают тестируемым соединением в различных концентрациях в течение 72 ч. Уровень белка Smn в ядре клетки определяют количественно, используя иммунное окрашивание Smn и софокусную флюоресцентную микроскопию, по существу, как описано в Makhortova et al., Nature Chemical Biology, 2011, 7:544. Уровень белка Smn в обработанных соединением образцах подвергают нормализации к уровню в обработанных носителем образцах и выстраивают как функцию концентрации соединения.
Результаты. Как видно на фиг. 10, человеческие мотонейроны, обработанные в течение 72 ч увеличивающимися концентрациями соединения 65 (фиг. 10а) и соединения 69 (фиг. 10b), содержат прогрессивно больше белка Smn в ядре.
Пример 10.
Тестирование белка Smn в тканях животных.
В этом тесте белка Smn сравнивают ткани от обработанных тестируемым соединением мышей с тканями от мышей, обработанных носителем, ДМСО, чтобы определить увеличение уровней белка Smn, продуцируемого от человеческого гена SMN2.
Материалы
Материал
Источник
Ткани мышей С/С-аллель SMA
The Jackson Laboratory, партия No.: 0 08714 (Вб . l29-Smnltm5(Smnl/SMN2> MrPh/J)
Ткани мышей Д7 SMA
The Jackson Laboratory, партия No.: 005025 (FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg (SMN2 ) 8 9Ahmb Smnl tmiMsd/ j)
Коктейль ингибиторов протеазы
Roche Applied Science Catalog No.: 11836145001
Анти-SMN d2
Blue cap Cisbio Catalog No.: 63IDC002-SMN
Анти-SMN криптат
Red cap Cisbio Catalog No.: 63IDC002-SMN
Буфер восстановления SMN
Cisbio Catalog No. : 63IDC002-SMN-Buf f er
Лизирующий буфер RIPA
20 MM Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1% NP-40, 1% натрий деоксихолат
Буфер для разбавления
20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl
Набор для тести белка ВСА
Pierce Catalog No.: 23225
Белый планшет с 3 84 лунками
Nunc Catalog No.: 351190
Планшет из полипропилена с V-образным дном
Falcon Catalog No.: 165195
Прозрачный планшет из полистирола с 96 лунками
Nunc Catalog No.: 4424 04
5 мм шарики из нержавеющей стали
Qiagen Catalog No.: 69989
Закупоривающиеся пробирки 2, 0 мл
Eppendorf Catalog No.: 022363352
Полуокаймленный 96-луночный планшет для PCR Twin.tec
Eppendorf Catalog No.: 951020389
TissueLyzer II
Qiagen Catalog No.: 85300
Считыватель планшетов Envision Plate Reader
Perkin Elmer Model No.: 2103
Протокол. Образцы ткани в закупоривающихся пробирках взвешивали и добавляли объем буфера RIPA, содержащего коктейль ингибиторов протеазы, на основании отношения масса-объем для каждого типа ткани: мозг (50 мг/мл), мышца (50 мг/мл) и спинной мозг (25 мг/мл).
Ткани гомогенизировали, используя TissueLyzer с размалыванием с помощью шариков. Шарики из нержавеющей стали диаметром 5 мм добавляли к образцу и энергично встряхивали в течение 5 мин при 30 Гц в TissueLyzer. Образцы затем центрифугировали в течение 20 мин при 14000xg в микроцентрифуге и гомогенаты переносили на планшет для PCR. Гомогенаты разбавляли в буфере RIPA приблизительно до 1 мг/мл для HTRF и приблизительно 0,5 мг/мл для полного измерения белка, используя тест белка ВСА. Для теста HTRF SMN 35 мкл гомогената ткани переносили на планшет с 384 лунками, содержащий 5 мкл раствора антитела (1:100 разведение каждого из анти-SMNd2 и анти-SMN криптата в буфере для восстановления). Чтобы получить контрольный сигнал, три (3) лунки в планшете содержат только лизи-рующий буфер RIPA и, таким образом, служат чистыми контрольными лунками. Планшет центрифугируют в течение 1 мин, чтобы вызвать растворение основания лунки, затем инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Флюоресценцию для каждой лунки планшета при 665 и 620 нм измеряют на спектрофотометре для считывания Envision multilabel (Perkin-Elmer). Полный белок в гомогенате ткани измеряют, используя тест ВСА согласно протоколу изготовителя.
Нормализованный сигнал флюоресценции вычисляют для каждого образца, чистого контроля и контрольной лунки с носителем, деля сигнал при 665 нм на сигнал при 620 нм. Нормализация сигнала объясняет возможное затухание флюоресценции вследствие матричного эффекта гомогената ткани. Значение AF (измерение изобилия белка Smn как значение в процентах) для каждой лунки с образцами вычисляют, вычитая подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок из подвергнутой нормализации флюоресценции для каждой лунки с образцами, затем деля эту разницу на подвергнутую нормализации среднюю флюоресценцию для чистых контрольных лунок и умножая полученное значение на 100. Значение AF для каждой лунки с образцами делят на полное количество белка (определенное с использованием теста ВСА) для этого образца ткани. Изменение изобилия белка Smn для каждого образца ткани относительно контроля с носителем вычисляют как процентное различие в значении AF образца ткани в присутствии тестируемого соединения и усредненного значения AF контрольного сигнала с носителем, разделенное на усредненное значение AF контрольного сигнала с носи
телем.
Пример 11.
Тестирование белка Smn в тканях взрослых мышей С/С-аллеля с SMA.
Ткани для использования в тесте белка Smn на взрослых мышах С/С-аллеля с SMA получали как описано в примере 10. В этом тесте оценивали, увеличивает ли лечение мышей С/С-аллеля с SMA тестируемым соединением в течение 10 дней уровни белка Smn, продуцируемого от гена SMN2.
Материалы
Материал
Источник
Ткани от мышей С/С-аллеля с SMA
The Jackson Laboratory, партия No. :
008714 (Вб . 12 9 - Smnltm5 (Smnl/SMN2)Mrph i'J)
Протокол. Мышам С/С-аллеля с SMA вводили два раза в сутки перорально (в 0,5% гидроксипро-пилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Tween 80) тестируемое соединение или носитель в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней. Подобранным по возрасту гетерозиготным мышам вводили носитель для использования в качестве контроля. Ткани собирали для анализа содержания белка согласно примеру 10.
Результаты. Как видно на фиг. 11, подвергнутый нормализации уровень полного белка Smn был увеличен в тканях головного мозга, спинного мозга, мышц и печени взрослых мышей С/С-аллеля с SMA, обработанных два раза в сутки в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней соединением 65 (фиг. 11а) и соединением 69 (фиг. 11b), относительно группы носителя.
Пример 12.
Белок Smn в тканях новорожденных A7 мышей с SMA.
Тест белка Smn в тканях новорожденных мышей с SMA используют, чтобы определить, увеличива-
ет ли лечение тестируемым соединением содержания белка Smn, продуцированного от гена SMN2.
Материалы
Материал
Источник
Ткани от Д7 мышей с SMA
The Jackson Laboratory, партия No. : 00502 5 (FVB.Cg-Tg(SMN2 * de11 a 7)42 9 9Ahmb Tg (SMN2 ) 89Ahmb SmnlMMsd/J)
Протокол. SMA A7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (IP) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) с послеродового дня (PND) 3 до PND 9. Ткани собирали для анализа содержания белка согласно примеру 10.
Результаты. Как видно на фиг. 12, подвергнутый нормализации уровень полного белка Smn был до-зозависимо увеличен в тканях головного мозга (фиг. 12а), спинного мозга (фиг. 12b) и мышц (фиг. 12с) новорожденных SMA A7 гомозиготных мышей с нокаутом, которых лечат в течение 7 дней один раз в сутки указанными дозами соединения 65.
Пример 13.
Масса тела новорожденных A7 мышей с SMA.
Изменение в массе тела новорожденных мышей с SMA используют, чтобы определить, улучшает ли лечение тестируемым соединением показатели массы тела.
Материаль!
Материал
Источник
Ткани от АЭкзон7 мышей с SMA
The Jackson Laboratory, партия No. : 005025 (FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg (SMN2 ) 89Ahmb SmnltmlMsd/ J)
Протокол. SMA A7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (IP) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) от PND 3 до момента, когда режим зведения переключали на пероральное введение два раза в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Tween 80 в дозе, в 3,16 раз превышающей дозу, используемую для IP. Массу тела SMA A7 мышей, обрабатываемых тестируемым соединением или носителем и подобранных по соответствующему возрасту гетерозиготных мышей регистрировали каждый день.
Результаты. Как видно на фиг. 13, масса тела новорожденных SMA A7 гомозиготных мышей с нокаутом, обработанных соединением 65 (фиг. 13 а) и соединением 69 (фиг. 13b) IP один раз в сутки от PND 3 до PND 23, затем перорально два раза в сутки от PND 24 до конца исследования, улучшалась по сравнению с мышами, обработанными носителем.
Пример 14.
Рефлекс выпрямления у новорожденных A7 мышей с SMA.
Функциональное изменение в рефлексе выпрямления новорожденных мышей с SMA используют, чтобы определить, улучшает ли лечение тестируемым соединением рефлекс выпрямления.
Материал
Источник
Ткани от АЭкзон7 мышей с SMA
The Jackson Laboratory, партия No.: 005025 (FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg(SMN2)89Ahmb
SmnltmlMsd/J)
Протокол. SMA A7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (IP) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) от PND 3 до момента, когда режим введения переключали на пероральное введение два раза в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Tween 80 в дозе, в 3,16 раз превышающей дозу, используемую для IP. Время рефлекса выпрямления измеряют как время, затраченное мышью, чтобы перевернуться на ноги из положения лежа на спине. Рефлекс выпрямления измеряли пять раз для каждой мыши (давая максимальное время 30 с для каждой попытки) с перерывом в 5 мин между каждым измерением. Время рефлекса выпрямления для SMA A7 гомозиготных мышей с нокаутом, обрабатываемых тестируемым соединением или носителем и подобранных по соответствующему возрасту гетерозиготных мышей измеряли в PND 10, 14 и 18 и выстраивали на графике.
Результаты. Как видно на фиг14, рефлекс выпрямления новорожденных SMA A7 гомозиготных мышей с нокаутом, обработанных соединением 65 (фиг. 15а) и соединением 69 (фиг. 15b) IP один раз в сутки от PND 3, улучшался по сравнению с мышами, обработанными носителем. Время, затраченное на переворачивание, новорожденных SMA A7 гомозиготных мышей с нокаутом было подобно таковому для подобранных по возрасту гетерозиготных мышей в PND 18.
Пример 15.
Выживание новорожденных A7 мышей с SMA.
Изменение в числе выживших мышей в течение времени используют, чтобы определить, улучшает ли лечение тестируемым соединением выживание.
Материаль!
Материал
Источник
Ткани от А7 мышей с SMA
The Jackson Laboratory, партия No.: 005025 (FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg (SMN2) 89Ahmb SmnltmlMsd/J)
Протокол. SMA A7 гомозиготным мышам с нокаутом вводили один раз в сутки внутрибрюшинно (IP) тестируемое соединение или носитель (100% ДМСО) от PND 3 до момента, когда режим введения переключали на пероральное введение два раза в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Tween 80 в дозе, в 3,16 раз превышающей дозу, используемую для IP и затем переключали на пероральное введение один раз в сутки в 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (НРМС) с 0,1% Tween 80 в дозе, в 6,32 раз превышающей дозу, используемую для IP. Число выживших мышей в каждой группе регистрировали каждый день и выстраивали как процент от общего числа мышей. Ткани SMA A7 и подобранных по возрасту гетерозиготных мышей собирали для измерения содержания белка Smn и обрабатывали, как детально описано в примере 10. Подвергнутые нормализации содержания полного белка Smn, измеренные в тканях, выстраивали как процент содержания в тканях у подобранных по возрасту гетерозиготных мышей, причем уровень Smn у гетерозиготных мышей принимали равным 100%. Уровень белка Smn в ткани мышей, обработанных тестируемым соединением, относительно уровня в ткани гетерозиготных мышей обозначен как значение в процентах над каждой риской на графике.
Результаты. Как видно на фиг. 15, выживание новорожденных SMA A7 гомозиготных мышей с нокаутом, обработанных соединением 65 (фиг. 15а) и соединением 69 (фиг. 15b) IP один раз в сутки от PND 3 до PND 23, затем перорально два раза в сутки от PND 24 до конца исследования, улучшалось по сравнению с мышами, обработанными носителем. Как видно на фиг. 16, содержание белка Smn в тканях головного мозга и мышц SMA A7 гомозиготных мышей с нокаутом после лечения соединением 65 (фиг. 16а) до PND 144 и соединением 69 (фиг. 16b) от PND 3 до PND 80 и 83, было измерено и выстроено относительно обработанных носителем и подобранных по возрасту гетерозиготных мышей.
Пример 16.
Тест сплайсинга человеческой мРНК минигена SMN1 с помощью полуколичественной RT по окончании PCR в культивируемых клетках.
Тест RT-PCR используют, чтобы визуализировать и количественно определить уровни человеческой полноразмерной и A7 мРНК минигена SMN1 в первичных клетках и линиях клеток, экспрессирую-щих конструкцию минигена SMN1 человека, обработанных тестируемым соединением.
Материал
Источник
Клетки НЕК2 93Н
ATCC Catalog No.: CRL-1573
Cells-To-Ct лизирующий буфер
Life Technologies, Inc. (ранее Applied Biosystems) Catalog No.: 4399002
FuGENE-б липидный
трансфицирующий
реагент
Roche Applied Science, Catalog No. : 11 814 443 001
DMEM
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11960-044
96-луночные
плоскодонные
планшеты
Becton Dickinson Catalog No.: 353072
Platinum Taq HiFi Супермикс ДНК-полимеразы
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: 11304-016
Набор ферментов iScript RT
BioRad Catalog No.: 170-8890
Этидий бромид 2% агарозные Е гели 48-Well Double Comb
Life Technologies, Inc. (ранее Invitrogen) Catalog No.: G8008-02
Gel Documentation System
UVP Gel Doc It 310 Imaging system
Конструкция минигена SMN1. Получение конструкций минигена.
Используя процедуру для получения конструкции минигена SMN2, описанную в биологическом примере 1, версию SMN1 минигена получали, заменяя шестой нуклеотид экзона 7 (остаток тимина) конструкции минигена SMN2-A на цитозин с использованием сайт-направленного мутагенеза. Таким образом, подобно конструкции минигена SMN2-A, конструкция минигена SMN1 имеет единственный остаток аденина, вставленный после нуклеинового остатка 48 экзона 7. Конструкция минигена SMN1 упоминается как SMN1-A.
Протокол. Клетки HEK293Н (10000 клеток/лунка/199 мкл) трансфицировали, используя реактив FuGENE-6, в планшете с 96 лунками с 15 нг минигенной плазмиды репортера SMN1-A на лунку. Клетки инкубировали в течение 24 ч после трансфекции. Тестируемые соединения последовательно разбавляли в 3,16 раз в 100% ДМСО, чтобы получить кривую изменения концентрации с 7 точками. Раствор тестируемого соединения (1 мкл, 200 х в ДМСО) добавляли к каждой тестовой лунке. 1 мкл ДМСО добавляли к каждой контрольной лунке. Планшет инкубировали в течение 7 ч в термостате для клеточной культуры (37°С, 5% CO2, 100%-ная относительная влажность). Клетки затем лизировали в лизирующем буфере Cells-To-Ct и лизаты сохраняли при -80°С.
Два продукта сплайсинга мРНК SMN получают от минигена SMN1. Термин "миниген SMN1 FL" относится к первому продукту сплайсинга, содержащему экзон 7, соответствующему полноразмерной мРНК SMN1. Термин "миниген SMN1 A7" относится ко второму продукту без экзона 7.
FL и A7 мРНК минигена SMN амплифицировали, используя праймеры, представленные в табл. 11. Праймер SMN Прямой С (SEQ ID NO. 11) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в экзоне 6 (от нуклеотида 43 к нуклеотиду 63), праймер SMN Обратный A (SEQ ID NO. 2) гибридизуется с нуклеотидными последовательностями в последовательности, кодирующей люциферазу светлячка. Комбинация этих двух олигонуклеотидов обнаруживает только минигены SMN1 или SMN2 (RT-PCR) и не будет обнаруживать эндогенные гены SMN1 или SMN2. Так как клетки пациента с SMA, используемые в примере 16, были трансфицированы только человеческим минигеном SMN1, RT-PCR может визуализировать и количественно определять только полноразмерную мРНК минигена SMN1 и A7 мРНК минигена SMN1.
1 Праймер, разработанный РТС Therapeutics, Inc.
Чтобы синтезировать кДНК, 5 мкл лизата, 4 мкл 5х реакционной смеси iScript, 1 мкл обратной транскриптазы и 10 мкл воды объединяли и инкубировали 5 мин при 25°С, затем 30 мин при 42°С, затем 5 мин при 85°С. Раствор кДНК сохраняли при -20°С.
Чтобы осуществить PCR, 5 мкл кДНК, 0,2 мкл 100 мкМ прямого праймера, 0,2 мкл 100 мкМ обратного праймера и 22,5 мкл полимеразного супермикса объединяют в 96-луночном полуокаймленном планшете для PCR. PCR осуществляют при следующих температурах в течение обозначенного времени: стадия 1: 94°С (2 мин), стадия 2: 94°С (30 с), стадия 3: 55°С (30 с), стадия 4: 68°С (1 мин), затем повторяют стадии 2-4 для в общей сложности 33 циклов, затем поддерживают при 4°С.
10 мкл каждого образца PCR разделяют электрофорезом на 2%-ном агарозном Е-геле в течение 14 мин, окрашивали окрашивающим реагентом для dsДНК (например, этидий бромидом) и визуализировали с использованием геля для формирования изображений.
Результаты. Как видно на фиг. 17, клетки, обработанные возрастающими концентрациями соединения 65 (фиг. 17а) и соединения 69 (фиг. 17b), содержат прогрессивно больше мРНК FL минигена SMN1 и меньше A7 мРНК минигена SMN1, указывая на коррекцию альтернативного сплайсинга SMN1.
Безотносительно того, был ли документ, процитированный здесь, специфично и индивидуально указан как включенный путем ссылки, все документы, упомянутые здесь, включены путем ссылки в настоящую заявку для любой и всех целей в той же степени, как если бы каждая индивидуальная ссылка была полностью сформулирована здесь.
Хотя некоторые варианты осуществления были описаны подробно выше, специалисту будет понятно, что многие модификации возможны в вариантах осуществления без отхода от раскрытия изобретения. Все такие модификации входят в рамки представленной формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение формулы (Ial)
(Ial)
или его свободная кислота, свободное основание или фармацевтически приемлемая соль, в которой
R1 обозначает гетероциклил, выбранный из азетидинила, пирролинила, пирролидинила, пиразоли-
нила, пиразолидинила, имидазолинила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазо-
линила, изотиазолидинила, оксазолинила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила,
триазолидинила, оксадиазолинила, оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразоли-
нила, тетразолидинила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-тетрагидропиридинила, пиперидинила,
пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила, гексагидропирролоРД-ЭДпиррол-
(1Н)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-
(1Н)ила, гексагидропирролоР^-Цпиррол-^Щила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила,
(3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(Ш)ила,
(3aR,6aS)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-с]пиррол-(1H)ила,
октагидро-5H-пирроло[3,2-с]пиридинила, октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aR,7aR)октагидро-
6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aS,7aS)октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, гексагидропирро-
ло[1,2-а]пиразин-(Ш)ила, (7R,8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила,
(8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила,
(8aS)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, (8aR)октагидропирроло[1,2-а]пиразин-(1H)ила, гексагид-
ропирроло[1,2-а]пиразин-(2H)-она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила,
(1R,5S)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, (1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8-
азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила,
(1R,5S)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, (1S,4S)-2,5-
диазабицикло[2.2.1]гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, (1R,5S)-3,8-
диазабицикло[3.2.1]октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6-
диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7-
диазаспиро[4.4]нонила или 6,9-диазаспиро[4.5]децила;
причем гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R3 и одним дополнительным возможным заместителем R4; и
причем, альтернативно, каждый гетероциклил в случае необходимости замещен одним, двумя тремя или четырьмя заместителями R3;
R2 фенил или гетероарил;
причем каждый фенил и гетероарил в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R6 и одним возможным дополнительным заместителем R7; Ra обозначает водород; Rb обозначает водород;
R3, в каждом случае, независимо выбран из циано, галогена, гидрокси, оксо, С1-8алкила, галоген-С1-8алкила, С1-8алкилкарбонила, С1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, С1-8алкокси-С1-8алкила, С1-8алкоксикарбонила, амино, С1-8алкиламино, (C1-8алкил)2-амино, амино-С1-8алкила, С1-8алкиламино-С1-8алкила, (C1-8алкил)2-амино-С1-8алкила, амино-С1-8алкиламино, С1-8алкиламино-С1-8алкиламино, (С1-8алкиламино-С1-8алкил)2-амино, (С1-8алкил)2-амино-С1-8алкиламино, [(С1-8алкил)2-амино-С1-8алкил]2-амино, (C1-8алкиламино-С1-8алкил)(С1-8алкил)амино, [(C1-8алкил)2-амино-С1-8алкил](С1-8алкил)амино, С1-8алкокси-С1-8алкиламино, (С1-8алкокси-С1-8алкил)2-амино, (С1-8алкокси-С1-8алкил)(C1-8алкил)амино, C1-8алкилкарбониламино, С1-8алкоксикарбониламино, гидрокси-C1-8алкила, гидрокси-С1-8алкокси-С1-8алкила, гидрокси-С1-8алкиламино, (гидрокси-С1-8алкил)2-амино или (гидрокси-С1-8алкил)(C1-8алкил)амино;
R4 обозначает С3-14циклоалкил, С3-14циклоалкил-С1-8алкил, С3-14циклоалкиламино, фенил-С1-8алкил, фенил-С1-8алкоксикарбонил, фенилсульфонилокси-С1-8алкил, гетероциклил или гетероциклил-C1-8алкил; причем каждый случай C3-14циклоалкила, фенила и гетероциклила в случае необходимости замещен одним, двумя или тремя заместителями R5;
R5, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С1-8алкила, галоген-С1-8алкила, C1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, амино, С1-8алкиламино, (C1-8алкил)2-амино или C1-8алкил-тио;
R6, в каждом случае, независимо выбран из галогена, гидрокси, циано, нитро, С1-8алкила, С2-8алкенила, галоген-C1-8алкила, гидрокси-С1-8алкила, С1-8алкокси, галоген-С1-8алкокси, С1-8алкокси-С1-8алкила, амино, С1-8алкиламино, (С1-8алкил)2-амино или С1-8алкил-тио; и
R7 обозначает С3-14циклоалкил, С3-14циклоалкилокси, фенил, гетероциклил или гетероарил,
причем гетероциклил, отличный от R1, в каждом случае выбран из оксиранила, оксетанила, азети-
динила, тетрагидрофуранила, пирролинила, пирролидинила, пиразолинила, пиразолидинила, имидазоли-
нила, имидазолидинила, изоксазолинила, изоксазолидинила, изотиазолинила, изотиазолидинила, оксазо-
линила, оксазолидинила, тиазолинила, тиазолидинила, триазолинила, триазолидинила, оксадиазолинила,
оксадиазолидинила, тиадиазолинила, тиадиазолидинила, тетразолинила, тетразолидинила, пиранила, ди-
гидро-2Н-пиранила, тиопиранила, 1,3-диоксанила, 1,2,5,6-тетрагидропиридинила, 1,2,3,6-
тетрагидропиридинила, пиперидинила, пиперазинила, морфолинила, тиоморфолинила, 1,4-диазепанила,
1,3-бензодиоксолила бензо[d][1,3]диоксолила, 1,4-бензодиоксанила, 2,3-дигидро-1,4-бензодиоксинила
2,3-дигидробензо [b] [ 1,4]диоксинила, гексагидропирроло [3,4-b]пиррол-(1H)ила,
(3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(1H)ила,
гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила, (3aS,6aS)гексагидропирроло[3,4-b]пиррол-(2H)ила,
(3 aR,6aR)гексагидропирроло [3,4-b] пиррол-(2H)ила, гексагидропирроло [3,4-с] пиррол-(1H)ила,
(3aR,6aS)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1H)ила, (3aR,6aR)гексагидропирроло [3,4-с]пиррол-(1H)ила,
октагидро-5Н-пирроло[3,2-с]пиридинила, октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aR,7aR)октагидро-
6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, (4aS,7aS)октагидро-6H-пирроло[3,4-b]пиридинила, гексагидропирро-
ло [ 1,2-а]пиразин-(Ш)ила, (7R,8aS)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ила,
(8aS)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ила, (8aR)гексагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1Н)ила,
(8aS)октагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(Ш)ила, (8aR)октагидропирроло [ 1,2-а]пиразин-(1H)ила, гексагид-
ропирроло[1,2-а]пиразин-(2H)-она, октагидро-2Н-пиридо[1,2-а]пиразинила, 3-азабицикло[3.1.0]гексила,
(1R,5S)-3-азабицикло[3.1.0]гексила, 8-азабицикло[3.2.1]октила, [1R,5S)-8-азабицикло[3.2.1]октила, 8-
азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, (Ж^)-8-азабицикло[3.2.1]окт-2-енила, 9-азабицикло[3.3.1]нонила,
(1R,5S)-9-азабицикло[3.3.1]нонила, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептила, (1S,4S)-2,5-
диазабицикло[2.2.1]гептила, 2,5-диазабицикло[2.2.2]октила, 3,8-диазабицикло[3.2.1]октила, [1R,5S)-3,8-
диазабицикло[3.2.1]октила, 1,4-диазабицикло[3.2.2]нонила, азаспиро[3.3]гептила, 2,6-
диазаспиро[3.3]гептила, 2,7-диазаспиро[3.5]нонила, 5,8-диазаспиро[3.5]нонила, 2,7-
диазаспиро [4.4] нонила, 6,9-диазаспиро [4.5]децила;
причем гетероарил в каждом случае выбран из фуранила, тиенила, пирролила, 2Н-пирролила, 3H-пирролила, пиразолила, 1Н-пиразолила, имидазолила, 1Н-имидазолила, изоксазолила, изотиазолила, ок-сазолила, 1,3-тиазолила, оксадиазолила, 1,2,4-оксадиазолила, 1,3,4-оксадиазолила, тиадиазолила, 1Н-тетразолила, 2Н-тетразолила, пиридинила, пиримидинила, пиразинила, пиридазинила, триазинила, индо-лила, 1Н-индолила, индазолила, 1Н-индазолила, 2Н-индазолила, индолизинила, изоиндолила, бензофу-ранила, бензотиенила, бензотиофенила, бензоимидазолила, 1Н-бензоимидазолила, 1,3-бензоксазолила, 1,3-бензооксазолила, 9Н-пуринила, хинолинила, изохинолинила, хиназолинила, хиноксалинила, 1,3-диазинила, 1,2-диазинила, 1,2-диазолила, 1,4-диазанафталинила, акридинила, фуроРД-^пиридинила, фуро[3,2-с]пиридинила, фуро[2,3-с]пиридинила, 6Н-тиено[2,3-b]пирролила, тиено[3,2-с]пиридинила, тиено[2,3чЦпиримидинила, 1Н-пирроло[2,3-b]пиридинила, 1Н-пирроло[2,3-с]пиридинила, 1Н-пирроло[3,2-b]пиридинила, пирроло[1,2-а]пиразинила, пирроло[1,2-b]пиридазинила, пиразоло[1,5-
a] пиридинила, пиразоло[1,5-а]пиразинила, 3H-имидазо[4,5-b]пиридинила, имидазо[1,2-а]пиримидинила, имидазо[1,2-с]пиримидинила, имидазо^^-^пиридазинила, имидазо[1,2-а]пиразинила, имидазо[2,1-
b] [1,3]тиазолила, имидазо[2,1-b][1,3,4]тиадиазолила,[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиридинила или[1,2,4]триазоло [4,3-а]пиридинила.
2. Соединение по п.1, причем фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлорид, гид-
рохлорид, дигидрохлорид, гидробромид, ацетат или трифторацетат.
3. Соединение, выбранное из следующих соединений:
7-(пиперазин-1-ил)-3 -(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
7-(пиперазин-1-ил)-3 -(тиофен-3 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3 -(3,4-диметоксифенил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
7-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он;
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(2,2-дифтор- 1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-( 1,4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-(4-метил-1,4-диазепан-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(3,5-дифторфенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(1,3 -бензодиоксол-5 -ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил) -1Н-изохромен- 1-он;
3 -(3,4-диметоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3 -(3,4-диметоксифенил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он;
3-(3 -метоксифенил)-7-(пиперазин-1 -ил) -1Н-изохромен- 1-он;
3 -(3 -метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(3-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он;
7-( 1,4-диазепан-1-ил)-3 -(3 -метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(2-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(2-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(4-метоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(4-метоксифенил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(имидазо [1,2-а] пиридин-2 -ил) -7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3 -(имидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(имидазо[2,1-b][1,3]тиазол-6-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(4-метоксифенил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(3,4-диметоксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(4-метоксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(2-метоксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-(имидазо[2,1-b][1,3]тиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил] -3 -(пиридин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(1,3-бензотиазол-2-ил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1 -он;
3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-6-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(1,3-бензодиоксол-5-ил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он;
3 -(3,4-дигидроксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен-1-он;
3 -(4-этоксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он;
3-(3 -фтор-4 -метоксифенил) -7-[(3S)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен- 1-он;
3 -(3 -гидроксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он;
3-(2-фтор-4-метоксифенил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(3 -хлор-4-метоксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он;
3 -(4-фтор-3 -метоксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-(5 -фтор-2 -метоксифенил) -7-[(3S)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен- 1-он;
3-(3,5 -дифтор-4-метоксифенил) -7-[(3S)-3 -метилпиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен- 1-он;
3 -(2,4-диметоксифенил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
3 -(4-этоксифенил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(2-метил-1-бензофуран-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-[3 -(дифторметокси)фенил] -7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-[4-(дифторметокси)фенил] -7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-(имидазо[2,1-b][1,3]тиазол-6-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(8-хлоримидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3 -(8-хлоримидазо [ 1,2-а]пиридин-2-ил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1 -он;
3-(8-хлоримидазо[1,2-а]пиридин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-
1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-
он;
3 -(3,4-диметоксифенил)-7-[(3 S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он; 7-[(8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он; 3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -
он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-
он;
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3 -(1,3-диметилпирроло [ 1,2-а]пиразин-7-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-
он;
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8aS)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(1,3-диметилпирроло[1,2-а]пиразин-7-ил)-7-[(8aR)гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-пропилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-(4-трет-бутилпиперазин-1-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-(4-циклопропилпиперазин-1-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метоксиэтил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-
он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(2-метилпропил)пиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен-1-
он;
7-(4-циклобутилпиперазин-1 -ил)-3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1 -(пропан-2-ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил] -1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(2-метоксиэтил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]-1Н-изохромен-1-он;
7-(1-циклопропил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
7-(1-циклобутил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-пропил-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(оксетан-3-ил)-1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил]
1Н-изохромен-1-он;
3 -(6-хлор-8-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3 -(6-хлор-8-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он;
3 -(6-хлор-8-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен-1 -
он;
3 -(6-хлор-8-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-этилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3 -(2-метил-1, 3 -бензотиазол-6-ил)-7 -(пиперазин-1 -ил) -1Н-изохромен- 1-он; 3 -(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3 -(2-метил-1, 3 -бензотиазол-5 -ил)-7 -(пиперазин-1 -ил) -1Н-изохромен- 1-он; 3-(2-метил-1,3-бензотиазол-6-ил)-7-[4-(оксетан-3-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3 -(6-хлор-8-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3 -(6-хлор-8-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-
1-он;
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-
1-он;
3-(6-хлор-8-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-
1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-метилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(1-этилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-( 1 -пропилпиперидин-4-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1 -(пропан-2-ил)пиперидин-4-ил] -1Н-изохромен-1 -он;
7-(1-циклобутилпиперидин-4-ил)-3 -(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[1-(оксетан-3-ил)пиперидин-4-ил]-1Н-изохромен-1-
он;
7-[(3S)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3 S)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил] -3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-гидроксипиперидин-1-ил)-1Н-изохромен-1-он; 7-[4-(диметиламино)пиперидин-1-ил] -3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -
он;
3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он; 7-[(3R)-4-этил-3 -метилпиперазин-1 -ил] -3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 7-[(3R)-3,4-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-1-он; 3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-4-этил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
7-[(3R,5S)-4-(2 -гидрокс иэтил) -3,5 -диметилпиперазин-1 -ил] -3-(6 -метилимидазо [1,2-а] пиразин-2 -ил) -1Н-изохромен-1 -он;
3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-
он;
7-[(3R,5S)-4-циклобутил-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-3-(6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
7-[(3R)-4-(2-гидроксиэтил)-3 -метилпиперазин-1-ил] -3 -(6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-
1-он;
7-[(3 S)-4-циклобутил-3 -метилпиперазин-1 -ил] -3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 S)-3 -метил-4-пропилпиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен- 1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 S)-3 -метил-4-(пропан-2-ил)пиперазин-1 -ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 S)-3 -метил-4-(оксетан-3 -ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-этил-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-
1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-(2-гидроксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
7-[(3R)-4-циклобутил-3 -метилпиперазин-1-ил] -3 -(6,8-диметилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метил-4-(пропан-2-ил)пиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-4-(2-метоксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3S)-4-(2-метоксиэтил)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8 -диметилимидазо [1,2-а] пиразин-2 -ил) -7-[(3R,5S)-4 -этил-3, 5 -диметилпиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,5-диметил-4-пропилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен- 1-он;
3-(6,8 -диметилимидазо [1,2-а] пиразин-2 -ил) -7-[(3R,5S)-3,4,5 -триметилпиперазин-1 -ил] -1Н-изохромен- 1-он;
3 -(8-этил-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(пиперазин-1 -ил)-1Н-изохромен-1-он; 3 -(8-этил-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3 -(8-этил-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3 S)-3 -метилпиперазин-1-ил] -1Н-изохромен-1 -он; 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он; 7-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил] -3 -(8-этил-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен- 1-он;
7-[(3 S)-3,4-диметилпиперазин-1 -ил] -3 -(8-этил-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-1Н-изохромен-
1-он;
3 -(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(пиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3 -(2-метил-2Н-индазол-5-ил)-7-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-изохромен-1 -он; 3-(8-этил-6-метилимидазо[1,2-а]пиразин-2-ил)-7-[(3R,5S)-3,4,5-триметилпиперазин-1-ил]-1Н-изохромен-1-он или
3 -(8-этил-6-метилимидазо [ 1,2-а]пиразин-2-ил)-7-( 1,2,3,6-тетрагидропиридин-4-ил)-1Н-изохромен-1 -
он;
или его фармацевтически приемлемая соль.
4. Фармацевтическая композиция для применения в лечении спинальной мышечной атрофии, включающая эффективное количество соединения по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, экс-ципиент или разбавитель.
5. Способ усиления включения экзона 7 SMN2 в мРНК, которая транскрибируется от гена SMN2, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.
6. Способ увеличения количества белка Smn, включающий контактирование клетки человека с соединением по п.1.
7. Способ по п.5 или 6, в котором клетка человека представляет собой клетку человека от пациента, страдающего спинальной мышечной атрофией.
8. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, включающий введение пациенту эффективного количества соединения по п.1.
9. Способ лечения спинальной мышечной атрофии у пациента-человека, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по п.4.
4.
tagcttcttacccgtactccaccgttggcagcacgatcgcacgtcccacgtgaaccattggtaaaccctgatgggatccataattcccccaccacctccc
atatgtccagattctcttgatgatgctgatgctttgggaagtatgttaatttcatggtacatgagtggctatcatactggctattatatggtaagtaatcac
tcagcatcttttcctgacaatttttttgtagttatgtgactttgttttgtaaatttataaaatactacttgcttctctctttatattactaaaaaataaaaataa
aaaaatacaactgtctgaggcttaaattactcttgcattgtccctaagtataattttagttaattttaaaaagctttcatgctattgttagattattttgat^
atacacttttgaattgaaattatactttttctaaataatgttttaatctctgatttgaaattgattgtagggaatggaaaagatgggataatttttcataaa
tgaaaaatgaaattcttttttttttttttttttttttgagacggagtcttgctctgttgcccaggctggagtgcaatggcgtgatcttggctcacagcaagct
ctgcctcctggattcacgccatlctcctgcctcagcctcagaggtagctgggactacaggtgcctgccaccacgcctgtctaattttttgtatttttttgtaa
agacagggtttcactgtgttagccaggatggtctcaatctcctgaccccgtgatccacccgcctcggccttccaagagaaatgaaatttttttaatgcac
aaagatctggggtaatgtgtaccacattgaaccttggggagtatggcttcaaacttgtcactttatacgttagtctcctacggacatgttctattgtatttt
agtcagaacatttaaaattattttattttattttattttttttttttttttgagacggagtctcgctctgtcacccaggctggagtacagtggcgcagtctcgg
ctcactgcaagctccgcctcccgggttcacgccattctcctgcctcagcctctccgagtagctgggactacaggcgcccgccaccacgcccggctaattt
ttttttatttttagtagagacggggtttcaccgtggtctcgatctcctgacctcgtgatccacccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaagcgtg
agccaccgcgcccggcctaaaattatttttaaaagtaagctcttgtgccctgctaaaattatgatgtgatattgtaggcacttgtatttttagtaaattaat
atagaagaaacaactgacttaaaggtgtatgtttttaaatgtatcatctgtgtgtgcccccattaatattcttatttaaaagttaaggccagacatggtgg
cttacaactgtaatcccaacagtttgtgaggccgaggcaggcagatcacttgaggtcaggagtttgagaccagcctggccaacatgatgaaaccttgt
ctctactaaaaataccaaaaaaaatttagccaggcatggtggcacatgcctgtaatccgagctacttgggaggctgtggcaggaaaattgctttaatct
gg§aggca§aggtt6cagtgagttgagattgtgccactgcactccacccttggtgacagagtgagattccatctcaaaaaaagaaaaaggcctggca
cggtggctcacacctataatcccagtactttgggaggtagaggcaggtggatcacttgaggttaggagttcaggaccagcctggccaacatggtgact
actccatttctactaaatacacaaaacttagcccagtggcgggcagttgtaatcccagctacttgagaggttgaggcaggagaatcacttgaacctgg
gaggcagaggttgcagtgagccgagatcacaccgctgcactctagcctggccaacagagtgagaatttgcggagggaaaaaaaagtcacgcttcag
ttgttgtagtataaccttggtatattgtatgtatcatgaattcctcattttaatgaccaaaaagtaataaatcaacagcttgtaatttgttttgagatcagtt
atctgactgtaacactgtaggcttttgtgttttttaaattatgaaatatttgaaaaaaatacataatgtatatataaagtattggtataatttatgttctaa
ataactttcttgagaaataattcacatggtgtgcagtttacctttgaaagtatacaagttggctgggcacaatggctcacgcctgtaatcccagcacttt
gggaggccagggeaggtggatcacgaggtcaggagatcgagaecatcctggctaacatggtgaa^^
tagccgggcatgttggcgggcaccttttgtcccagctgctcgggaggctgaggcaggagagtggcgtgaacccaggaggtggagcttgcagtgagcc
gagattgtgccagtgcactccagcctgggcgacagagcgagactctgtctcaaaaaataaaataaaaaagaaagtatacaagtcagtggttttggttt
tcagttatgcaaccatcactacaatttaagaacattttcatcaccccaaaaagaaaccctgttaccttcattttccccagccctaggcagtcagtacactt
tctgtctctatgaatttgtctattttagatattatatataaacggaattatacgatatgtggtcttttgtgtctggcttctttcacttagcatgctattttcaag
attcatccatgctgtagaatgcaccagtactgcattcettcttattgctgaatattctgttgtttggttatatcacattttatccattcatcagttcatggaca
tttaggttgtttttatttttgggctataatgaataatgttgctatgaacattcgtttgtgttctttttgtttttttggttttttgggttttttttgttttgtttttgtttt
tgagacagtcttgctctgtctcctaagctggagtgcagtggcatgatcttggcttactgcaagctctgcctcccgggttcacaccattctcctgcctcagc
ccgacaagtagctgggactacaggcgtgtgccaccatgcacggctaattttttgtatttttagtagagatggggtttcaccgtgttagccaggatggtct
cgatctcctgacctcgtgatctgcctgcctaggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgcacctggccttaagtgtttttaatacgtcat
tgccttaagctaacaattcttaacctttgttctactgaagccacgtggttgagataggctctgagtctagcttttaacctctatctttttgtcttagaaatct
aagcagaatgcaaatgactaagaataatgttgttgaaataacataaaataggttataactttgatactcattagtaacaaatctttcaatacatcttac
ggtctgttaggtgtagattagtaatgaagtgggaagccactgcaagctagtatacatgtagggaaagatagaaagcattgaagccagaagagagac
agaggacatttgggctagatctgacaagaaaaacaaatgttttagtattaatttttgactttaaattttttttttatttagtgaatactggtgtttaatggtc
tcattttaataagtatgacacaggtagtttaaggtcatatattttatttgatgaaaataaggtataggccgggcacggtggctcacacctgtaatcccag
cactttgggaggccgaggcaggcggatcacctgaggtcgggagttagagactagcctcaacatggagaaaccccgtctctactaaaaaaaatacaa
aattaggcgggcgtggt
ggtgcatgcctgtaatcccagctactcaggaggctgaggcaggagaattgcttgaacctgggaggtggaggttgcggtgagccgagatcacctcattg cactccagcctgggcaacaagagcaaaactccatctcaaaaaaaaaaaaataaggtataagcgggctcaggaacatcattggacatactgaaaga agaaaaatcagctgggcgcagtggctcacgccggtaatcccaacactttgggaggccaaggcaggcgaatcacctgaagtcgggagttccagatca gectgaccaacatggagaaaccctgtctctac^
gcaggagaattgcttgaaccgagaaggcggaggttgcggtgagccaagattgcaccattgcactccagcctgggcaacaagagcgaaactccgtctc aaaaaaaaaaggaagaaaaatatttttttaaattaattagtttam
atctcggctcactgcaacctccgcctcctgggttcaagtgattctcctgcctcagcttcccgagtagctgtgattacagccatatgccaccacgcccagc
cagttttgtgUttgttttgttttttgttttttttttttgagagggtgtcttgctctgtcccccaagctggagtgcagcggcgcga
ctgcctcccaggttcacaccattctcttgcctcagcctcccgagtagctgggactacaggtgcccgccaccacacccggctaattmttgtgtttttagta
gagatggggtttcactgtgttagccaggatggtctcgatctcctgaccttttgatccacccgcctcagcctccccaagtgctgggattataggcgtgagc
cactgtgcccggcctagtcttgtatttttagtagagtcgggatttctccatgttggtcaggctgttctccaaatccgacctcaggtgatccgcccgccttgg
cctccaaaagtgeaaggcaaggcattacaggcatgagccactgtgac^
tcactctattgctcaggctggagtgcaagggcacattcacagctcactgcagccttgacctccagggctcaagcagtcctctcacctcagtttcccgagt
agctgggactacagtgataatgccactgcacctggctaatttttatttttatttatttatttttttttgagacagagtcttgctctgtcacccaggctggagt
gcagtggtgtaaatctcagctcactgcagcctccgcctcctgggttcaagtgattctcctgcctcaacctcccaagtagctgggattagaggtccccacc
accatgcctggctaattttttgtactttcagtagaaacggggttttgccatgttggccaggctgttctcgaactcctgagctcaggtgatccaactgtctcg
gcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgtgcctagcctgagccaccacgccggcctaatttttaaattttttgtagagacagggtctcat
tatgttgcccagggtggtgtcaagctccaggtctcaagtgatccccctacctccgcctcccaaagttgtgggattgtaggcatgagccactgcaagaaa
accttaactgcagcctaataattgttttctttgggataacttttaaagtacattaaaagactatcaacttaatttctgatcatattttgttgaataaaataa
gtaaaatgtcttgtgaaaeaaaatgetttttaacatcea^
ccttacagggttttagacaaaatcaaaaagaaggaaggtgctcacattccttaaatataaggagtaagtctgccagcattatgaaagtgaatcttactt
ttgtaaaactttatggtttgtggaaaacaaatgtttttgaacatttaaaaagttcagatgttagaaagttgaaaggttaatgtaaaacaatcaatattaa
agaattttgatgccaaaactattagataaaaggttaatctacatccctactagaattctcatacttaactggttggttgtgtggaagaaacatactttcac
aataaagagctttaggatatgatgccattttatatcactagtaggcagaccagcagacttttttttattgtgatatgggataacctaggcatactgcact
gtacactctgacatatgaagtgctctagtcaagtttaactggtgtccacagaggacatggtttaactggaattcgtcaagcctctggttctaatttctcat
ttgcaggaaatgctggcatagagcagcacggatccgaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccg
ctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcg
gaatacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttca
attctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacattt
cgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggatt
ctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgat
cgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgcctgcgtcagattctcgc
atgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggat
atttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattcaaagtgcgttgctagta
ccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactrt^
agtcggggaagcggrrgcaaaacgcttccatctt^
gggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcagaga
ggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattct
ggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtctttaattaaatacaaaggatatcaggtggcc
cccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgcc
gttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggagga
gttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaag
tccaaattgcgcggccgctaaatcgaaagtacaggactagccttcctagcaaccgcgggctgggagtctgagacatcactcaagatatatgctcggta
acgtatgctctagccatctaactattccctatgtcttataggg
SEQ ID NO, 21 Фиг. 2а
Экзон 6
Добавление к экзону 6 ' 5' UTR (град.)
Фиг. 2b
Клетки, содержащие миниген SMN2, обработанные Соединением 65
Концентрация (мкМ) Фиг. 3а
Послеродовой день Фиг. 15а
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028344
028344
- 1 -
- 1 -
(19)
028344
028344
- 1 -
- 1 -
(19)
028344
028344
- 4 -
- 3 -
(19)
028344
028344
- 9 -
- 9 -
028344
028344
- 10 -
- 10 -
028344
028344
- 16 -
- 16 -
028344
028344
- 56 -
- 56 -
028344
028344
- 58 -
- 58 -
028344
Материалы
028344
- 75 -
- 74 -
028344
Материалы
028344
- 75 -
- 76 -
028344
028344
Материалы
- 77 -
- 78 -
028344
028344
Материалы
- 77 -
- 78 -
028344
Материалы
028344
- 83 -
- 82 -
028344
028344
- 85 -
- 85 -
028344
028344
- 85 -
- 85 -
028344
028344
- 85 -
- 85 -
028344
028344
- 86 -
- 86 -
028344
028344
- 87 -
- 87 -
028344
Материалы
028344
Материалы
- 91 -
- 91 -
028344
028344
- 93 -
- 93 -
028344
028344
- 100 -
- 100 -
028344
028344
- 101 -
- 101 -
028344
028344
- 102 -
- 102 -
028344
028344
- 103 -
- 103 -