|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Применение композиции, содержащей высушенные распылением клетки лактобактерий для лечения и профилактики инфекций, вызываемых Helicobacter pylori у людей и животных. 2. Применение по п.1, в котором высушенные распылением клетки лактобактерий находятся в мономерной и/или димерной формах. 3. Применение по пп.1 и 2, в котором а) клетки лактобактерий высушены распылением и б) полученные высушенные распылением клетки лактобактерий добавлены в физиологически совместимый носитель. 4. Применение по п.3, в котором размеры коагрегатов не меньше чем 50 мкм и, в частности, больше чем 500 мкм. 5. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором клетки лактобактерий отобраны из группы, состоящей из Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus и Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens, DSM 17646, DSM 17647, DSM 17648, DSM 17649, DSM 17650, DSM 17651, DSM 17652, DSM 17653, предпочтительно Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri и Lactobacillus pentosus. 6. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором указанная композиция находится, в частности, в составе пищевых продуктов, и/или кормах для домашних животных и/или сельскохозяйственных животных, и/или диетических добавок и необязательно содержит адьюванты и добавочные вещества. 7. Применение по любому из предыдущих пунктов для эрадикационной терапии Helicobacter pylori в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики. 8. Способ получения композиции, лекарственного средства или диетической добавки, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий, в котором клетки лактобактерий ферментируют и высушивают распылением и полученные клетки лактобактерий смешивают с физиологически совместимым носителем. 9. Способ по п.8, в котором клетки лактобактерий предварительно инокулируют и обогащают. 10. Применение высушенных распылением клеток лактобактерий для получения фармацевтической и/или диетической композиции для профилактики и/или лечения болезней, вызванных инфицированием Helicobacter pylori. 11. Применение по п.10, где болезни, вызванные инфицированием Helicobacter pylori, выбирают из следующих: болезни желудочно-кишечного тракта, такие как гастрит, язва желудка и рак желудка, дискомфорт в животе, в частности дискомфорт в верхней части живота, тяжесть в желудке, желудочные спазмы, боль в животе, боль или давление в верхней части живота, ощущение жжения в верхней части живота, хронически повторяющиеся расстройства желудка, постоянное ощущение наполненности, снижение аппетита, боль в пустом желудке, вздутие живота, изжога, диарея, нерегулярный стул, недомогание, тошнота и рвота, пищевая непереносимость, нарушение всасывания, несварение желудка (функциональная диспепсия), гастрит, повреждения слизистой оболочки или гастродуоденальная язва. 12. Применение высушенных распылением клеток лактобактерий для эрадикационной терапии Helicobacter pylori. 13. Применение по п.12, в котором высушенные распылением клетки лактобактерий применяют в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики. 14. Применение лекарственного средства или диетической добавки, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий, для профилактики или лечения заболеваний, вызванных инфицированием Helicobacter pylori. 15. Применение по п.14, в котором заболевания, вызванные инфицированием Helicobacter pylori, представляют собой следующие: заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как гастрит, язва желудка и рак желудка, дискомфорт в животе, дискомфорт в верхней части живота, тяжесть в желудке, желудочные спазмы, боль в животе, боль или давление в верхней части живота, ощущение жжения в верхней части живота, хронически повторяющиеся расстройства желудка, постоянное ощущения наполненности, снижение аппетита, боль в пустом желудке, вздутие живота, изжога, диарея, нерегулярный стул, недомогание, тошнота и рвота, пищевая непереносимость, нарушение всасывания, несварение желудка (функциональная диспепсия), гастрит, повреждения слизистой оболочки или гастродуоденальная язва. 16. Применение по п.14 или 15, в котором лекарственное средство применяют при эрадикационной терапии Helicobacter pylori в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Применение композиции, содержащей высушенные распылением клетки лактобактерий для лечения и профилактики инфекций, вызываемых Helicobacter pylori у людей и животных. 2. Применение по п.1, в котором высушенные распылением клетки лактобактерий находятся в мономерной и/или димерной формах. 3. Применение по пп.1 и 2, в котором а) клетки лактобактерий высушены распылением и б) полученные высушенные распылением клетки лактобактерий добавлены в физиологически совместимый носитель. 4. Применение по п.3, в котором размеры коагрегатов не меньше чем 50 мкм и, в частности, больше чем 500 мкм. 5. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором клетки лактобактерий отобраны из группы, состоящей из Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus и Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens, DSM 17646, DSM 17647, DSM 17648, DSM 17649, DSM 17650, DSM 17651, DSM 17652, DSM 17653, предпочтительно Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri и Lactobacillus pentosus. 6. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором указанная композиция находится, в частности, в составе пищевых продуктов, и/или кормах для домашних животных и/или сельскохозяйственных животных, и/или диетических добавок и необязательно содержит адьюванты и добавочные вещества. 7. Применение по любому из предыдущих пунктов для эрадикационной терапии Helicobacter pylori в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики. 8. Способ получения композиции, лекарственного средства или диетической добавки, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий, в котором клетки лактобактерий ферментируют и высушивают распылением и полученные клетки лактобактерий смешивают с физиологически совместимым носителем. 9. Способ по п.8, в котором клетки лактобактерий предварительно инокулируют и обогащают. 10. Применение высушенных распылением клеток лактобактерий для получения фармацевтической и/или диетической композиции для профилактики и/или лечения болезней, вызванных инфицированием Helicobacter pylori. 11. Применение по п.10, где болезни, вызванные инфицированием Helicobacter pylori, выбирают из следующих: болезни желудочно-кишечного тракта, такие как гастрит, язва желудка и рак желудка, дискомфорт в животе, в частности дискомфорт в верхней части живота, тяжесть в желудке, желудочные спазмы, боль в животе, боль или давление в верхней части живота, ощущение жжения в верхней части живота, хронически повторяющиеся расстройства желудка, постоянное ощущение наполненности, снижение аппетита, боль в пустом желудке, вздутие живота, изжога, диарея, нерегулярный стул, недомогание, тошнота и рвота, пищевая непереносимость, нарушение всасывания, несварение желудка (функциональная диспепсия), гастрит, повреждения слизистой оболочки или гастродуоденальная язва. 12. Применение высушенных распылением клеток лактобактерий для эрадикационной терапии Helicobacter pylori. 13. Применение по п.12, в котором высушенные распылением клетки лактобактерий применяют в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики. 14. Применение лекарственного средства или диетической добавки, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий, для профилактики или лечения заболеваний, вызванных инфицированием Helicobacter pylori. 15. Применение по п.14, в котором заболевания, вызванные инфицированием Helicobacter pylori, представляют собой следующие: заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как гастрит, язва желудка и рак желудка, дискомфорт в животе, дискомфорт в верхней части живота, тяжесть в желудке, желудочные спазмы, боль в животе, боль или давление в верхней части живота, ощущение жжения в верхней части живота, хронически повторяющиеся расстройства желудка, постоянное ощущения наполненности, снижение аппетита, боль в пустом желудке, вздутие живота, изжога, диарея, нерегулярный стул, недомогание, тошнота и рвота, пищевая непереносимость, нарушение всасывания, несварение желудка (функциональная диспепсия), гастрит, повреждения слизистой оболочки или гастродуоденальная язва. 16. Применение по п.14 или 15, в котором лекарственное средство применяют при эрадикационной терапии Helicobacter pylori в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики.
Евразийское
патентное
ведомство
028340
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201391823
(22) Дата подачи заявки 2012.06.08
(51) Int. Cl.
A61K35/74 (2006.01) A61P31/04 (2006.01)
(54) ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ HELICOBACTER
PYLORI У ЛЮДЕЙ И ЖИВОТНЫХ, С ПОМОЩЬЮ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ВЫСУШЕННЫЕ РАСПЫЛЕНИЕМ КЛЕТКИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ
(31) 11169137.4; 11185851.0
(32) 2011.06.08; 2011.10.19
(33) EP
(43) 2014.04.30
(86) PCT/EP2012/060948
(87) WO 2012/168468 2012.12.13
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
НОВОЗИМС А/С (DK)
(72) Изобретатель:
Ариа Штефани, Геллинг Детлеф, Хольц Катерина, Ланг Кристиане
(DE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) ТО B.C.S. ET AL.: "SPRAY
DRYING, FREEZE DRYING, OR FREEZING OF THREE DIFFERENT LACTIC ACID BACTERIA SPECIES", JOURNAL OF FOOD SCIENCE, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING, INC, US, vol. 62, no. 3, 1 January 1997 (1997-01-01), pages 576-578, 585, XP002038914, ISSN: 0022-1147, DOI:10.1111/ JЛ365-262L1997.TB04434.Х the whole document
EP-A1-1112692 WO-A1-2008060198 WO-A1-2007073709 WO-A1-2008039531
SERVIN A.L.: "Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens", FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 28, no.
4, 1 October 2004 (2004-10-01), pages 405-440,
XP004564881, ISSN: 0168-6445 page 412, right-hand column, paragraph 4.2.2
NAOMI LJEMURA ET AL.: "Helicobacter
pylori Infection and the Development of
Gastric Cancer" NEW ENGLAND JOURNAL OF
MEDICINE, vol. 345, no. 11, 13 September 2001 (2001-09-13), pages 784-789, XP55037354, ISSN: 0028-4793, DOI: 10.1056/NEJMoa001999 the whole document
SOBALA G.M. ET AL.: "Acute Helicobacter
pylori infection: clinical features, local and systemic immune response, gastric mucosal histology, and gastric juice ascorbic acid concentrations.", GUT NOV 1991 LNKD- PUBMED:1752479, vol. 32, no. 11, November 1991 (1991-11), pages 1415-1418, XP002682923, ISSN: 0017-5749 the whole document
LORCA GRACIELA L. ET AL.:
"Lactobacillus acidophilus autolysins inhibit helicobacter pylori in vitro", CURRENT
MICROBIOLOGY, SPRINGER, NEW YORK, NY,
US, vol. 42, 1 January 2001 (2001-01-01), pages
39-44, XP002970548, ISSN: 0343-8651, DOI:
10.1007/S002840010175 the whole document
(57) Изобретение относится к лечению и профилактике инфекций, вызываемых Helicobacter pylori у людей и животных, с помощью композиции, содержащей высушенные распылением клетки лактобактерий.
Данное изобретение относится к высушенным распылением штаммам лактобактерий и/или клеток лактобактерий и их применению, в частности, в фармацевтических и/или диетических композициях для того, чтобы включить лекарственное средство или диетические добавки в лечение и профилактику инфекций, вызываемых Helicobacter pylori у людей и животных.
Пробиотические микроорганизмы включают клетки, которые оказывают благоприятный эффект на организм человека либо животного. Эти микроорганизмы содержатся в пробиотических композициях. Благоприятный эффект может проявляться, в частности, в улучшении микрофлоры желудочно-кишечного тракта. При этом другие нежелательные микроорганизмы могут подавляться микрофлорой путем прямых взаимодействий между пробиотическими микроорганизмами и нежелательными микроорганизмами, путем прямых взаимодействий через снижение метаболизма нежелательных микроорганизмов продуктами жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов или путем укрепления естественной иммунной системы. В целом, допускается, что основной механизм содержит как важный эффективный элемент конкурентоспособное заселение желудочно-кишечного тракта, в результате чего нежелательные микроорганизмы более не могут населять слизистую оболочку в опасных количествах либо вытесняются полностью.
Одна из групп пробиотических микроорганизмов формируется, к примеру, штаммами лактобакте-рий. Это типичные грамположительные, микроаэрофильные или анаэробные бактерии, которые ферментируют сахар с образованием кислот, в частности молочной кислоты.
Фармацевтическая композиция, содержащая среди прочего лактобактерии, известна из US 5716615. Одно из применений этой композиции состоит в лечении болезней желудочно-кишечного тракта.
Штаммы лактобактерий, известные из WO 2004/087891, подходят для получения фармацевтических или диетических композиций при лечении инфекций желудочно-кишечного тракта, вызванных Helico-bacter pylori.
Взаимодействие лактобактерий с Helicobacter pylori описано среди всего прочего в публикациях Wang et al., Am. J. Clin. Nutr. 80:737-41 (2004); Felley et al., Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 17 (5): 785-791 (2003); Cazzato et al., Scandinavian Journal of Nutrition 48(1): 26-31 (2004) и Sgouras et al., Applied and Environmental Microbiology 70 (1): 518-526 (2004).
Helicobacter pylori является спиралевидной бактерией, населяющей желудок, при этом уровень pH в желудке повышается благодаря выработке уреазы, которая таким образом защищает бактерии от желудочной кислоты. Бактерии проникают сквозь слизистую оболочку и осаждаются на клетках эпителия. Подобная инфекция активирует собственную иммунную систему организма, но при этом иммунная реакция является недостаточно эффективной для уничтожения бактерий, в результате чего возрастает интенсивность иммунной реакции, что приводит к хроническому воспалению и болезням, таким как гастрит, язва желудка и в конечном итоге к раку.
Процесс, при котором клетки объединяются друг с другом и формируют агломераты, называют агрегацией. Когда в образование агрегатов вовлечен лишь один тип клеток, говорят об автоагрегации или самоагрегации. Если в формировании агрегатов участвуют хотя бы два типа клеток, то такой процесс называется коагрегацией. В WO 2007/073709 заявитель описывает коагрегаты лактобактерий с Helico-bacter pylori, которые могут быть задействованы для профилактики, лечения и/или эрадикационной терапии инфекций, вызываемых Helicobacter pylori; в частности, было достигнуто уменьшение количества Helicobacter pylori. Более того, штаммы лактобактерий, соответствующие таким целям, описаны в патенте WO 2007/073709 (зарегистрированном в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-39124 Braunschweig, Germany), в частности, это DSM 17646, DSM 17647, 'DSM 17648, DSM 17649, DSM 17650, DSM 17651, DSM 17652 и DSM 17653.
Соответствующие клетки лактобактерий образуют коагрегаты при контакте с клетками Helicobacter pylori. Образование коагрегатов препятствует проникновению Helicobacter pylori в слизистую оболочку желудка. Клетки Helicobacter pylori, в частности поверхности этих клеток, блокируются клетками лакто-бактерий; таким образом, клетки Helicobacter pylori более не способны связываться с клетками желудочного эпителия. В результате предотвращения связывания Helicobacter pylori с клетками желудочного эпителия можно избежать воспалительных реакций. Заблокированные, а следовательно, инактивирован-ные клетки Helicobacter pylori проходят через желудочно-кишечный тракт в виде коагрегатов и выводятся наружу. Таким образом, применяя соответствующие клетки лактобактерий, можно снизить количество или полностью уничтожить Helicobacter pylori в желудке. Применение клеток лактобактерий может быть как профилактическим, так и лечебным. Как бы то ни было, этот терапевтический подход требует усовершенствования.
Поэтому целью данного изобретения является разработка усовершенствованного способа для профилактики и лечения инфекций, вызываемых Helicobacter pylori. В частности, требуется такой способ, который обеспечил бы улучшенное образование коагрегатов, при котором заселение слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori подавлялось/сокращалось бы значительно быстрее посредством образующихся коагрегатов.
О применении и получении высушенных распылением лактобактерий известно из предшествующих публикаций, к примеру Gardiner et al., Comparative Survival Rates of Human-Derived Probiotic Lacto
bacillus paracasei and L. salivarius Strains during Heat Treatment and Spray Drying (Сравнительный уровень выживаемости полученных из человеческого организма штаммов пробиотиков Lactobacillus paracasei и L. salivarius при тепловой обработке и распылительной сушке), Applied and Enviromental Microbiology 66 (6): 2605-2612 (2000); Teixeira et al., Survival of Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus Following Spray-Drying (Жизнеспособность Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus при высушенном распылении), J. Dairy Sci 78:1025-1031 (1995) и Tos et al., Spray Drying, Freeze Drying, or Freezing of three different lactic acid bacteria species (Распылительная сушка, лиофильная сушка или вымораживание трех различных видов лактобактерий), Journal of Food Sci., Wiley-Blackwell Publ., Inc. (US).
При этом нигде не описано применение высушенных распылением лактобактерий для образования коагрегатов с Helicobacter pylori и, следовательно, возможность их применения в фармацевтических или диетических композициях.
Как ни удивительно, но усовершенствовать лечение и профилактику инфекций, вызываемых Heli-cobacter pylori, можно в случае, когда высушенные распылением клетки лактобактерий используются для коагрегации.
Особым преимуществом является то, что высушенные распылением клетки лактобактерий способны образовывать большие коагрегаты с Helicobacter pylori и, таким образом, вызывать эффективное сокращение популяции Helicobacter pylori. Высушивание распылением клеток лактобактерий исключительно выгодно приводит к уменьшению размера клеток лактобактерий и отличается тем, что при этом происходит дополнительное разделение клеток. В противоположность другим способам высушивания или способам, не включающим высушивание, для высушивания распылением характерным является наличие отдельных клеток (моноклеток) или сдвоенных (димерных) клеток (фиг. 2б), а не образование цепей, объединяющих от двух до десяти клеток лактобактерий (фиг. 2а). Эти высушенные распылением "клетки-зародыши" после попадания в желудочную среду прекрасно подходят для непосредственного образования коагрегатов, в итоге получают полезные высокоплотные, компактные и эффективные коаг-регаты, состоящие из клеток лактобактерий и Helicobacter pylori, которые, к тому же, на протяжении фазы образования коагрегатов имеют низкое стерическое несоответствие. Согласно данному изобретению подобные высушенные распылением клетки лактобактерий обладают более высокой связывающей способностью применимо к Helicobacter pylori чем, к примеру, те, которые можно получить согласно техническому описанию, содержащемуся в WO 2007/073709. В результате более высокой связывающей способности большее число клеток Helicobacter pylori может быть блокировано и связано меньшим количеством клеток лактобактерий. Также более высокая связывающая способность ведет к большей стабильности образующихся коагрегатов.
Еще одно преимущество состоит в том, что высушенные распылением клетки лактобактерий содержат в более высокой пропорции неживые клетки и/или фрагменты клеток лактобактерий, которые также способствуют спонтанному образованию коагрегатов. Содержание неживых клеток и/или фрагментов клеток лактобактерий может составлять более 80%, более 90% и даже 100%.
Согласно изобретению коагрегаты проходят желудочно-кишечный тракт и природным образом выводятся из организма. Даже в случае, когда инфицирование уже произошло, описанный в изобретении механизм действия высушенных распылением штаммов лактобактерий действенен, так как предотвращает дальнейшее инфицирование дополнительными бактериями Helicobacter pylori; это облегчает борьбу с существующей инфекцией путем инактивации/выведения имеющихся в наличии бактерий Helicobacter pylori. Вдобавок, согласно изобретению штаммы лактобактерий, вероятно, способны снижать активность уреазы Helicobacter pylori, таким образом, бактерии Helicobacter pylori в коагрегатах лишены защиты от действия желудочной кислоты. В этом смысле достигается синергический эффект.
Особым преимуществом высушенных распылением штаммов или клеток лактобактерий является увеличение связывающей способности относительно Helicobacter pylori (выше). Из-за того, что поверхность Helicobacter pylori блокируется клетками лактобактерий, предотвращается проникновение Helico-bacter pylori в слизистую оболочку и, соответственно, возникновение вызываемых Helicobacter pylori инфекций, в том числе и хронических воспалительных процессов, а также эффективно предотвращаются вторичные болезни, такие как гастрит, язва желудка и рак желудка.
Более того, согласно изобретению коагрегаты, содержащие высушенные распылением клетки лак-тобактерий и клетки Helicobacter pylori, проявляют повышенную стабильность, поэтому большее количество Helicobacter pylori может быть включено в эти коагрегаты и, вдобавок, не происходит повторного освобождения ранее связанных клеток Helicobacter pylori, к примеру, вследствие сокращений желудка. Это преимущество позволяет использовать более низкую эффективную дозировку по сравнению с коаг-регатами, описанными в предыдущих публикациях. Согласно изобретению высушенные распылением клетки лактобактерий обеспечивают также эффективное повышение растворимости в воде, таким образом, достигается лучшее распределение высушенных распылением клеток лактобактерий и образующихся коагрегатов в полости желудка.
Также заявители обнаружили, что высушивание распылением клеток лактобактерий предотвращает неконтролируемое образование агрегатов самими лактобактериями (автоагрегацию) либо оно, как минимум, резко снижается в сравнении со свежими высушенными не распылением лактобактериями. Связы
вающие участки для блокировки Helicobacter pylori оказываются занятыми из-за автоагрегации клеток лактобактерий друг с другом. Снижение или предотвращение автоагрегации, таким образом, приводит к более низкой эффективной дозировке используемых лактобактерий в сравнении с предыдущими публикациями.
Согласно изобретению распылительный способ приводит к морфологическим изменениям лакто-бактерий, так что возрастает их связывающая способность по отношению к Helicobacter pylori, вследствие чего становится возможным улучшенное образование коагрегатов.
Таким образом, изобретение относится к применению фармацевтической или диетической композиции, содержащей высушенные распылением клетки лактобактерий для профилактики и лечения вызываемых Helicobacter pylori инфекций у людей и животных, в частности у млекопитающих.
При дальнейшей модификации изобретения высушенные распылением клетки лактобактерий содержатся в композициях преимущественно в мономерной и/или димерной формах (выше, фиг. 2б).
Таким образом, изобретение также относится к применению такой композиции, в которой согласно изобретению а) клетки лактобактерий высушены распылением, б) полученные высушенные распылением клетки лактобактерий включены в состав физиологически совместимых носителей (типичные примеры физиологически совместимых носителей приведены ниже).
Также изобретение относится к применению такой композиции, в которой после применения ее к человеку или животному коагрегаты с Helicobacter pylori образуются непосредственно в желудочной среде и являются преимущественно большими и не меньшими чем 50 мкм, в частности большими и не меньшими чем 100 мкм, 150 мкм, большими чем 500 мкм, в частности предпочтительно большими чем 1000 мкм или 1100 мкм.
В понимании данного изобретения термин "клетки лактобактерий" (или лактобацилл, или в более широком смысле молочно-кислых бактерий) включает в себя те микроорганизмы, которым для ферментации молочной кислоты нужны углеводы, в частности глюкоза и лактоза, и которые для биосинтеза используют преимущественно гликолиз (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнеса). С точки зрения таксономии, клетки лактобактерий относятся к семейству Lactobacteriaceae. Они являются грамположительными, не-спорообразующими и в целом неподвижными. Клетки лактобактерий живут анаэробно, при этом они аэротолерантны, несмотря на то что не содержат каких-либо геминов (цитохром, каталазу) (Schleifer et al., System. Appl. Microb.: 18, 461-467 (1995) or Ludwiq et al., System. Appl. Microb. 15: 487-501 (1992)). Наличие клеток лактобактерий или их видов может быть определено по способу ферментации углеводов, в частности, с помощью теста API (analytical profile index или API - тест на идентификацию бактерий, разработанный bioMerieux). Согласно изобретению сюда входят, в частности, те виды, которые способны к гомоферментативному образованию молочной кислоты или гетероферментативному образованию молочной кислоты. Далее предпочтение отдается клеткам лактобактерий, отобранным из группы, включающей в себя Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lacto-bacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus and Lactobacillus plantarum (все являются гомоферментативны-ми), a также Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens и Bifidobacterium bifidum (все являются гетероферментативными). Типичные клетки лактобактерий, отвечающие требованиям заявителей,
представлены штаммами DSM 17646, DSM 17647, DSM 17648, DSM 17649, DSM 17650, DSM 17651,
DSM 17652 и DSM 17653 (выше). Предпочтительными согласно изобретению являются Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus buchneri и Lactobacillus pentosus.
Также согласно изобретению используются те "клетки лактобактерий", что включают "производные", "аналоги" или "мутанты", которые могут быть инактивированными, живыми или неживыми либо представленными в виде частей или фрагментов, например продуктов ферментного или механического распада (например, после френч-пресса и подобных приспособлений) клеток лактобактерий в той мере, пока они подходят для коагрегации.
Термины "производные", "аналоги", "мутанты" или "инактивированные" в данном случае включают клеточные или ферментные надосадочные жидкости, лизаты, фракции или экстракты из "клеток лакто-бактерий" при условии, что эти клеточные или ферментные надосадочные жидкости, лизаты, фракции или экстракты имеют преимущественно свойства лактобактериальных клеток/штаммов/ микроорганизмов в соответствии с изобретением. В связи с этим термин "лизат" так же, как и "экстракт", обозначает в данном случае водный раствор или суспензию используемых в изобретении клеток микроорганизмов и включает в себя макромолекулы, например ДНК, РНК, белки, пептиды, липиды, углеводы и подобные и, в частности, клеточные остатки. Лизат преимущественно включает в себя еще и клеточную стенку или составляющие клеточной стенки. Способы получения лизатов в достаточной мере известны человеку, осведомленному в данной области; это, например, применение "френч-пресса" или ферментного лизиса - шаровой дробилки со стеклянными гранулами или железными шариками. Также клетки могут разрушаться ферментативно, физически или химически. Примерами ферментативного клеточного лизиса могут служить как индивидуальные ферменты, так и смесь ферментов, таких как протеа
зы, протеиназа К, липазы, гликозидазы; химический лизис может осуществляться ионофорами, такими детергентами, как додецилсульфат натрия, кислоты или основания; физический способ может осуществляться с помощью высоких давлений, таких как во френч-прессе, осмолярностей, температур или чередования холодных и горячих условий. Более того, можно комбинировать химический, физический и ферментативный способы.
"Производные", "аналоги", "мутанты" или "инактивированные" лактобактериальные клетки/ штаммы/микроорганизмы в соответствии с изобретением преимущественно обладают теми же самыми свойствами, что и упомянутые штаммы. В связи с этим у "инактивированных (форм)", "производных" или "аналогов" преимущественно отсутствует метаболическая активность.
"Аналоги" лактобактериальных клеток/штаммов/микроорганизмов согласно изобретению являются лизатами или фрагментами. "Фрагменты" лактобактериальных клеток/штаммов/микроорганизмов согласно изобретению представляют собой части клеток, например клеточную мембрану, макромолекулы, такие как ДНК, РНК, белки, пептиды, углеводы и подобные, равно как и клеточные остатки. Человеку, осведомленному в данной области, будет легко определить правильное значение терминов "аналоги", "фрагменты", "производные" или "мутанты" и интерпретировать эти термины согласно смыслу данного изобретения. Также для определения значения мутантов, производных, фрагментов или аналогов лакто-бактериальных клеток/штаммов/микроорганизмов человек, осведомленный в данной области, может обратиться к общедоступной стандартной литературе, в которой раскрываются способы, применяемые для получния мутантов, производных, фрагментов или аналогов.
Мутанты или генетически модифицированные разновидности либо производные являются генетически модифицированными, например, путем рекомбинантной ДНК-технологии (клонирование, секве-нирование, трансформация рекомбинантных нуклеиновых кислот), физического мутагенеза, например, путем ультрафиолетового облучения, а также с помощью химических веществ, таких как этилметан-сульфонат. Для этой цели могут быть выбраны изменения в определенных свойствах как целенаправленно, так и через оценку совокупности полученных мутантов. Генетически модифицированные мутанты в соответствии с изобретением включают клетки микроорганизмов и рекомбинантные нуклеиновые кислоты в хромосомах и/или плазмидах бактерий. Модификации, осуществленные путем точечной мутации, могут дополнительно оказывать эффект на экспрессию/транскрипцию/трансляцию, как это происходит при спонтанных мутациях без прямой генетической манипуляции (см., к примеру, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Molecular cloning: a laboratory manual (Холодное молекулярное клонирование: лабораторное пособие)^!!^ Harbor Laboratory Press, 3rd edition (2001)).
Все упомянутые микроорганизмы выше и далее по тексту именуются "клетками лактобактерий".
Необходимые условия культивирования в человеческом желудке включают в себя уровень pH в диапазоне от 1.8 до 4.5 и присутствие пепсина, а также NaCl. Характерная для таких условий культивирования эталонная среда включает следующие компоненты: вода, NaCl (5 г/л) и пепсин (3 г/л), в то время как уровень pH с помощью соляной кислоты доводится до 2.0 либо 4.0 с целью имитировать пустой или полный желудок.
Термин "коагрегация" в понимании данного изобретения обозначает образование клеточных агрегатов с размерами не менее 50 или 100 мкм и больше, содержащих согласно изобретению высушенные распылением клетки лактобактерий и клетки Helicobacter pylori в суспензиях согласно следующим примерам и, в частности, в эталонной среде, как описано выше.
Термин "высушенные распылением клетки лактобактерий" в понимании данного изобретения означает, что клетки лактобактерий высушены с помощью распылительной сушки, при этом суспензия клеток лактобактерий, к примеру, состоит из мельчайших капелек и существует возможность получения порошка.
Согласно изобретению во время распылительной сушки раствор или суспензия, содержащая клетки лактобактерий, распыляется в горячий осушитель, где и высушивается. Смесь для распыления может быть представлена в виде раствора, эмульсии, суспензии или дисперсии. Она распылена на миллионы отдельных капелек с помощью форсунки или центрифуги, что приводит к существенному увеличению поверхности. Растворитель, такой как вода, мгновенно испаряется в горячем воздухе и удаляется. Более того, высушенными распылением остаются только клетки лактобактерий.
Способ распылительной сушки выделяется среди других способов сушки тем, что требует применения форсунки или подобных приспособлений, таких как одинарная форсунка, полоконусная форсунка, механическая форсунка, двойная форсунка внешнего смешивания, пневматическая форсунка, двойная форсунка внутреннего смешивания, распыливающий диск или ультразвуковой распылитель.
Способы распылительной сушки описаны в предыдущих публикациях и известны тем, кто осведомлен в данной области (см. Gardiner et al., Teixeira et al. (выше) или EP 74050 и EP 285682). Известны и описаны и соответствующие устройства, такие как распылительные мини-сушилки В-191 или В-290, разработанные Buchi Labortechnik AG (Германия) или SD-6.3-R компании GEA Niro (Дания). Известно также, что можно использовать дополнительные адьюванты и добавки.
Изобретение также относится к применению фармацевтической и/или диетической композиции, содержащей согласно изобретению физиологически эффективную дозу высушенных распылением кле
ток лактобактерий и физиологически совместимый носитель. Фармацевтические композиции - это композиции, которые служат исключительно для терапевтических и профилактических целей и отличаются тем, что вдобавок к клеткам лактобактерий в них присутствуют адьюванты и/или вспомогательные вещества, обычные среди галеновых препаратов. Диетические композиции в понимании данного изобретения - это композиции, которые кроме высушенных распылением согласно изобретению клеток лактобак-терий содержат пищевые продукты или продукты питания (см., к примеру (не полностью), Директиву EC 2002/46/EC от 10 июня, 2002 г.), и/или корм для домашних животных и/или сельскохозяйственных животных, и/или диетические добавки, необязательно содержащие адьюванты и добавочные вещества.
Также изобретение относится к использованию или применению высушенных распылением согласно изобретению клеток лактобактерий для получения фармацевтической или диетической композиции, либо лекарственного средства или диетической добавки, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий, либо фармацевтической или диетической композиции, в частности для профилактики и/или лечения болезней, вызываемых инфекцией Helicobacter pylori, например желудочно-кишечных заболеваний. Последние включают, в частности, гастрит, язву желудка и рак желудка. Также учитываются такие болезни и симптомы, как дискомфорт в животе, в частности дискомфорт в верхней части живота, тяжесть в желудке, желудочные спазмы, боль в животе, боль или давление в верхней части живота, ощущение жжения в верхней части живота, хронически повторяющиеся расстройства желудка, постоянное ощущение наполненности, снижение аппетита, боль в пустом желудке, вздутие живота, изжога, диарея, нерегулярный стул, недомогание, тошнота и рвота, пищевая непереносимость, нарушение всасывания, несварение желудка (функциональная диспепсия), гастрит, повреждения слизистой оболочки или гастродуоденальная язва.
Также изобретение касается дальнейшего применения высушенных распылением согласно изобретению клеток лактобактерий в качестве лекарственного средства либо диетической добавки, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий, или фармацевтической либо диетической композиции для уничтожения или эрадикационной терапии Helicobacter pylori, необязательно в комбинации с другими подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики.
Фармацевтическая или диетическая композиция, в частности диетическая добавка или лекарственное средство (лекарство), согласно изобретению, могут характеризоваться содержанием высушенных
2 15 4 8 12
распылением клеток лактобактерий в количестве от 10 до 10 , предпочтительно от 10 или 10 до 10 , в частности от 108 до 1010. Исходное количество в данном случае определяется применяемой единицей, к примеру, таблеткой. Композиция предназначается преимущественно для орального применения.
Согласно изобретению галеновы препараты, содержащиеся в фармацевтической или диетической композициях, в частности в диетической добавке или лекарственном средстве (лекарстве), могут быть получены способом, который широко практикуется в данной области. Подходящие твердые или жидкие галеновы формы препаратов включают, к примеру, гранулы, порошки, таблетки в сахарной оболочке, таблетки-(микро)капсулы, жесткие капсулы, суппозитории, сиропы, соки, суспензии или эмульсии, при получении которых используются стандартные адьюванты, такие как вспомогательные вещества, разрыхлители, связывающие вещества, глазировочные средства, вещества, способствующие набуханию, скользящие и смазывающие вещества, вкусовые добавки, подсластители и солюбилизаторы. Адьюванты, нуждающиеся в упоминании, включают стеарат магния, хлорид натрия, карбонат магния, диоксид титана, лактозу, маннит и другие сахара, тальк, молочный белок, желатин, крахмал, целлюлозу и соответствующие производные, животные и растительные жиры, такие как рыбий жир, подсолнечное масло, арахисовое или кунжутное масло, полиэтиленгликоли и растворители, такие как дистиллированная вода, и одноатомные и многоатомные спирты, такие как глицерин. Согласно изобретению фармацевтическая композиция может быть получена при смешивании как минимум одного штамма лактобактерий, используемых в соответствии с изобретением в определенной дозировке, с фармацевтически подходящим и физиологически совместимым носителем и, необязательно, с другими подходящими активными ингри-диентами, добавками и адьювантами в определенных дозировках и в требуемой форме применения. Возможные носители включают, в частности, вещества, отобранные из группы, в которую входят мальто-декстрины, микрокристаллическая целлюлоза, крахмал, в частности кукурузный крахмал, фруктоза, лактоза, декстроза и комбинации этих веществ. Композиция может содержать от 0,1 до 95 вес.% или от 5 до 99,9 вес.% высушенных распылением клеток лактобактерий относительно общего количества клеток и носителя.
В случае диетической композиции и/или диетической добавки предусматривается, что композиция
2 15 4 12 8 10
может содержать от 10 до 10 , предпочтительно от 10 до 10 и более точно от 10 до 10 клеток лак-тобактерий. Исходное количество определяется применяемой единицей, например упаковкой продукта питания, продаваемой конечному потребителю. Физиологически совместимый носитель в общем случае будет представляться пищевыми продуктами, которые отобраны из группы, состоящей из молочных продуктов, кисломолочных продуктов, молока, йогурта, сыра, злаков, злаковых батончиков, хлебобулочных изделий, напитков и продуктов детского питания. Подходящими пищевыми продуктами и продуктами питания, включая воду, согласно изобретению, являются те, что перечислены, к примеру (не полностью), в Положении (EC) № 178/2002 от 28 января 2002 г.
Изобретение также относится к способу получения фармацевтической и/или диетической композиции, согласно изобретению, в частности диетической добавки или лекарственного средства (лекарства), в которых высушенные распылением клетки лактобактерий смешаны с физиологически совместимым носителем и предназначены преимущественно для орального употребления.
Более того, изобретение также делает возможным такой способ получения композиции, в которой клетки лактобактерий являются (а) необязательно инокулированными и обогащенными, (б) ферментированными и (в) высушенными распылением, впоследствии смешанными с физиологически совместимым носителем и предназначенными преимущественно для орального употребления.
И, наконец, изобретение относится к способу профилактики или лечения людей или животных, в частности больных и находящихся в зоне риска пациентов или испытуемых, от заболеваний, вызванных инфицированием Helicobacter pylori, в частности гастрита и язвы желудка, при котором пациент принимает эффективную дозу фармацевтической и/или диетической композиции, в соответствии с изобретением от одного до пяти раз на день. Применение может продолжаться ограниченный период времени, например от 1 до 30 недель, или без ограничения по времени. Последнее, в частности, подходит для перманентной профилактики и для предупреждения рецидивов.
Далее изобретение будет описано более детально, на конкретных примерах его применения, не исчерпывающих возможности изобретения.
Примеры и фигуры Пример 1. Хранение используемых штаммов.
Штаммы лактобактерий сохраняли в замороженном состоянии. 1 мл культуры, культивированной до стационарной фазы (оптическая плотность на длине волны 600 нм или ОП600/мл - 4-8) в MRS-среде (среда для культивирования лактобактерий по Ману, Рогозе и Шарпу) (55 г/л, pH 6,5; Difco, США), смешивали с 500 мкл 50% стерильного раствора глицерина, после чего смесь замораживали при температуре -80°С.
Helicobacter pylori сохраняли в замороженном состоянии. 1 мл культуры, культивированной до стационарной фазы в бруцеллярном бульоне (Brucella broth) (28 г/л, pH 7,0; BD, США), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Biochrom) смешивали с 500 мкл 50% стерильного раствора глицерина, после чего смесь замораживали при температуре -80°С.
Пример 2. Процесс получения высушенных распылением клеток лактобактерий.
Высушенные распылением лактобактерии, которые способны коагрегировать с Helicobacter pylori в условиях культивирования в человеческом желудочно-кишечном тракте, в частности в желудке, получали способом, описанным ниже.
Стартовую культуру 1 помещали в 15 мл реакционный резервуар в 10 мл MRS-среды. Среду иноку-лировали свежекультивированными, глубокозамороженными, лиофилизированными или высушенными распылением клетками лактобактериальных штаммов. Стартовую культуру 1 выдерживали в анаэробных условиях на протяжении 24 ч при 37°C. Все количество стартовой культуры 1 использовали для инокуляции стартовой культуры 2. Стартовая культура 2 состояла из 240 мл MRS-среды с добавлением 10 мл стартовой культуры 1. Стартовую культуру 2 выдерживали в анаэробных условиях 19 ч при 37°C. После этого для каждой стартовой культуры определяли оптическую плотность, уровень pH и КОЕ (колоние-образующие единицы).
Для ферментации лактобактерии использовали 5 л MRS-среды. Ферментер, включая все необходимые компоненты, стерилизовали. Необходимые величины температуры и скорости смешивания составляли 37°C и 150 об/мин соответственно. Концентрация при инокуляции составляла 5%. По завершению процесса ферментации определяли число клеток, колониеобразующих единиц, уровень pH, оптическую плотность на длине волны 600 нм и концентрации глюкозы и соли молочной кислоты. После этого ферментативный бульон концентрировали десяти-двадцатикратно. После концентрат замораживали.
Перед высушиванием двадцатикратный концентрат размораживали и центрифугировали на протяжении 15 мин при 4300g. Потом клетки промывали 0,9% раствором NaCl и снова центрифугировали на протяжении 15 мин при 4300g. После этого клетки перерастворяли в 500 мл 10% раствора NaCl.
Процесс распылительной сушки проводили в распылительной минисушке Buchi В-191. Температура на входе составляла 140°C. Температура на выходе составляла 86°C. Поток горячего воздуха составлял 500 л/ч. Мощность аспиратора составляла 75%, скорость накачки - 5%. Клеточную суспензию высушивали при описанных выше условиях, после чего извлекали высушенный распылением порошок лакто-бактерий.
Определяли полное число клеток, так же как и число жизнеспособных клеток лактобактериальных штаммов, приходящееся на 1 г высушенного распылением порошка. Микроскопические исследования высушенного распылением порошка (фиг. 2б) показали, что в нем клетки лактобактерий меньше, чем высушенные не распылением клетки лактобактерий (фиг. 2а), и что высушенные распылением клетки лактобактерий представлены в мономерной и димерной формах, в то время как высушенные не распылением клетки лактобактерий образуют более длинные цепи. Высушенные распылением клетки лактобак-терий сохраняли для дальнейшего применения при температуре 4°C.
Пример 3. Сравнение коагрегации Helicobacter pylori высушенными не распылением и высушенны
ми распылением штаммами или клетками лактобактерий в условиях желудочной среды.
Клетки лактобактерий культивировали в закрытых 15 мл пробирках в MRS-среде при 37°C на протяжении 24 ч. Высушенный распылением порошок перерастворяли в фосфатно-солевом буферном растворе при концентрации 10 мг/мл для исследования высушенных распылением лактобактерий. Helico-bacter pylori культивировали на протяжении приблизительно двух дней в колбах Эрленмейера при мик-роаэрофильных условиях в бруцеллярном бульоне (28 г/л, pH 7,0; BD, США) с добавлением 10% феталь-ной телячьей сыворотки (Biochrom) при 37°C. После культивирования микроскопическим способом анализировали клеточную морфологию Helicobacter pylori. Испытания проводили с клетками, которые обладали сигмоидальной или сферической морфологией. Также исследовали культуры со смешанной морфологией.
Соответствующие клетки собирали путем центрифугирования при 3200g на протяжении 10 мин, а надосадочную жидкость удаляли. Клетки лактобактерий однократно промывали в 5 мл буфера и перерастворяли в 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора (содержащего 1,5 г/л Na2HPO4-2H2O, 0,2 г/л KH2PO4 и 8,8 г/л NaCl). Клетки Helicobacter pylori однократно промывали в 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора и перерастворяли в 5 мл искусственного желудочного сока (содержащего 5 г/л NaCl и 3 г/л пепсина (Sigma)). Для соответствующих клеток измеряли величину ОП600 и приводили ее к значению 2 для Helicobacter pylori и значению 4 для лактобактерий путем добавления искусственного желудочного сока и фосфатно-солевого буферного раствора соответственно.
По 2,5 мл полученных таким образом суспензий каждого вида клеток (Helicobacter pylori/ лактобактерий) смешивали, после чего смесь взбалтывали от 10 с до 10 мин. Результат определяли визуально благодаря значительной флоккуляции в образцах, содержащих Helicobacter pylori и лактобактерии, и анализировали микроскопически.
На фиг. 1а представлена микрофотография коагрегатов, содержащих Helicobacter pylori и высушенные не распылением клетки лактобактерий штамма DSM 17648. На фиг. 16 представлена микрофотография коагрегатов, содержащих Helicobacter pylori и высушенные распылением клетки лактобактерий штамма DSM 17648. Эти коагрегаты значительно больше коагрегатов, содержащих высушенные не распылением клетки лактобактерий. Контрольные эксперименты, относящиеся к самоагрегации, проводили отдельно; в них анализировали соответствующие культуры, содержащие по отдельности Helicobacter pylori и лактобактерии. Ни коагрегации, ни самоагрегации не наблюдали на фиг. 1в, 1г и 1д. На фиг. 1в представлена микрофотография свежекультивированных клеток лактобактерий DSM 17648 в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду. На фиг. 1г представлена микрофотография высушенных распылением клеток лактобактерий штамма DSM 17648 в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду. На фиг. 1д представлена микрофотография свежекультивированных клеток Hel-icobacter pylori в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду.
Пример 4. Испытание стабильности коагрегатов между высушенными распылением клетками лак-тобактерий и клетками Helicobacter pylori.
Как и в примере 3, проводили эксперименты по испытанию стабильности коагрегатов в естественных условиях. Коагрегаты между клетками лактобактерий и Helicobacter pylori, образующиеся после пятиминутного взбалтывания, подвергали воздействию сил трения путем пипетирования суспензии на протяжении 1 мин или интенсивного взбалтывания на протяжении 2 мин. После этого размер коагрегатов анализировали микро- и макроскопически. Размеры коагрегатов, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий и Helicobacter pylori, не уменьшились, в то время как размеры коагрегатов высушенных не распылением клеток лактобактерий и Helicobacter pylori уменьшились.
Пример 5. Получение фармацевтической композиции, содержащей штаммы лактобактерий согласно изобретению.
Клетки одного или нескольких штаммов лактобактерий, использующихся в изобретении, приготавливали по примерам 1 и 2 и высушивали распылением. Затем высушенный распылением порошок измельчали до размеров частиц не более 1 мм в диаметре. Полученные гранулы смешивали со вспомогательными веществами и/или адьювантами с применением следующих пропорций (в вес.%): 20% гранул, 2% диоксида кремния (Syloid AL-IFP, GRACE Davidson), 1% стеарата магния (MF-2-V, Ackros), 77% микрокристаллической целлюлозы (Avicel PH 112, FMC).
Смешивание проводили в микромиксере Quintech в позиции 70, уровень II. Все компоненты добавляли одновременно. Смешивание проводили приблизительно 120 с. После этого полученную смесь сжимали с применением серийного таблеточного пресса при обычных условиях, при этом использовали низкую силу сжатия ( <10 кН) для получения таблеток весом приблизительно 500 мг. В каждой таблетке содержалось примерно от 108 до 1010 высушенных распылением клеток лактобактерий.
Пример 6. Сравнение коагрегации Helicobacter pylori высушенными не распылением и высушенными распылением штаммами или клетками лактобактерий с применением разного количества клеток лак-тобактерий.
Клетки лактобактерий культивировали в закрытых 15 мл пробирках в MRS-среде при 37°C на протяжении 24 ч. Высушенный распылением порошок перерастворяли в фосфатно-солевом буферном растворе при концентрации 10 мг/мл для исследования высушенных распылением клеток лактобактерий.
Helicobacter pylori культивировали на протяжении приблизительно двух дней в колбах Эрленмейера при микроаэрофильных условиях в бруцеллярном бульоне (28 г/л, pH 7,0; BD, США) с добавлением 10% фе-тальной телячьей сыворотки (Biochrom) при 37°C. После культивирования микроскопическим способом анализировали клеточную морфологию Helicobacter pylori. Испытания проводили с клетками, которые обладали сигмоидальной или сферической морфологией. Также исследовали культуры со смешанной морфологией.
Соответствующие клетки собирали путем центрифугирования при 3,200g на протяжении 10 мин, а надосадочную жидкость удаляли. Клетки лактобактерий однократно промывали в 5 мл буфера и перерастворяли в 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора (содержащего 1,5 г/л Na2HPO4-2H2O, 0,2 г/л KH2PO4 и 8,8 г/л NaCl). Клетки Helicobacter pylori однократно промывали в 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора и перерастворяли в 5 мл искусственного желудочного сока (содержащего 5 г/л NaCl и 3 г/л пепсина (Sigma)). Для соответствующих клеток измеряли величину ОП600 и приводили ее к значению 2 для Helicobacter pylori и значению 4 для лактобактерий путем добавления искусственного желудочного сока и фосфатно-солевого буферного раствора соответственно.
Определение количества клеток для суспензий лактобактерий проводили с помощью счетной камеры Тома, а разжижение проводили таким образом, чтобы получить разное количество клеток. По 2,5 мл полученных таким образом суспензий каждого вида клеток (Helicobacter pylori/лактобактерий) смешивали, после чего смесь взбалтывали на протяжении 5 мин. По окончании двухминутной выдержки результат определяли визуально благодаря значительной флоккуляции в образцах, содержащих Helicobacter pylori и лактобактерии; также результат определяли микроскопически (фигуры не приведены). 1 мл набирали из фазы, не содержащей коагрегаты (надосадочная жидкость; осадочные коагрегаты) так, чтобы оценить количество коагрегатов, и определяли величину ОП600. Используя формулу
Степень коагрегации, %
(^"^Н.pylori ^^лактобактерий) ^^Н.р.+лактобактерии ^ ^QQ
(^^Н. pylori ОПГшктобактерии)
определяли степень коагрегации (в %). На фиг. 3 и 4 показана степень коагрегации свежекультивированных и высушенных распылением клеток лактобактерии штамма DSM 17648 по отношению к Helicobacter pylori. 0% соответствуют ОП600 Helicobacter pylori (в надосадочной жидкости) без добавления клеток лактобактерий (отсутствие коагрегации или осаждения вследствие коагрегации). 100% степень агрегации соответствует максимальной степени коагрегации, т.е. ОП600, равной нулю, или ОП600 среды, не содержащей клетки (все клетки Helicobacter pylori осаждаются вследствие коагрегации, и в надосадочной жидкости клетки Helicobacter pylori не регистрируются путем измерения ОП).
При одинаковом количестве клеток степень коагрегации высушенных распылением клеток лакто-бактерии с Helicobacter pylori более чем в два раза превышает соответствующую величину для свеже-культивированных клеток (фиг. 3 и 4).
Описание фигур
На фиг. 1а показаны коагрегаты, содержащие свежекультивированные не высушенные распылением клетки лактобактерий штамма DSM 17648 и Helicobacter pylori (размеры коагрегатов от 40 мкм и больше) в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду.
На фиг. 1б показан очень большой коагрегат, содержащий высушенные распылением клетки лакто-бактерий штамма DSM 17648 и Helicobacter pylori (размеры коагрегатов от 150 мкм и больше) в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду. Фиг. 1в-1д служат для контроля экспериментов.
На фиг. 1в показаны свежекультивированные клетки лактобактерий штамма DSM 17648 в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду. Самоагрегация не наблюдается.
На фиг. 1г показаны высушенные распылением клетки лактобактерий штамма DSM 17648 в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду. Самоагрегация не наблюдается.
На фиг. 1д показаны свежекультивированные клетки Helicobacter pylori в искусственных условиях, имитирующих желудочную среду. Самоагрегация не наблюдается. (фиг. ^-д увеличены в 1000 раз). На Фиг. 2а и 2б показана морфология клеток лактобактерий.
На фиг. 2а показаны высушенные не распылением клетки лактобактерий. Клетки образовывают цепи, содержащие от 2 до 10 клеток.
На фиг. 2б показаны высушенные распылением клетки лактобактерий. Клетки находятся в мономерной и димерной формах (от 1 до 2 клеток) и значительно меньше, чем высушенные не распылением клетки.
Фиг. 3. Сравнение степени коагрегации свежекультивированных и высушенных распылением клеток лактобактерий штамма DSM 17648 по отношению к Helicobacter pylori. В каждом случае для тестов использовали 1.4х108 клеток лактобактерий. При одинаковом количестве клеток степень коагрегации с Helicobacter pylori высушенных распылением клеток лактобактерий более чем вдвое превышает таковую для свежекультивированных клеток. 0% соответствует ОП600 Helicobacter pylori (в надосадочной жидко
сти) без добавления клеток лактобактерий (отсутствие коагрегации или осаждения вследствие коагрега-ции). 100% степень агрегации соответствует максимальной степени коагрегации, т.е. ОП600, равной нулю, или ОП600 среды, не содержащей клетки (все клетки Helicobacter pylori осаждаются вследствие ко-агрегации, и в надосадочной жидкости клетки Helicobacter pylori не регистрировали путем измерения
ОП).
Фиг. 4. Сравнение степени коагрегации свежекультивированных и высушенных распылением клеток лактобактерий штамма DSM 17648 по отношению к Helicobacter pylori. В каждом случае для тестов использовали разное количество клеток лактобактерий. Степень коагрегации с Helicobacter pylori высушенных распылением клеток лактобактерий вдвое превышает таковую для свежекультивированных клеток. 0% соответствует ОП600 Helicobacter pylori (в надосадочной жидкости) без добавления клеток лак-тобактерий (отсутствие коагрегации или осаждения вследствие коагрегации). 100% степень агрегации соответствует максимальной степени коагрегации, т.е. ОП600, равной нулю, или ОП600 среды, не содержащей клетки (все клетки Helicobacter pylori осаждаются вследствие коагрегации, и в надосадочной жидкости клетки Helicobacter pylori не регистрировали путем измерения ОП).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение композиции, содержащей высушенные распылением клетки лактобактерий для лечения и профилактики инфекций, вызываемых Helicobacter pylori у людей и животных.
2. Применение по п.1, в котором высушенные распылением клетки лактобактерий находятся в мономерной и/или димерной формах.
3. Применение по пп.1 и 2, в котором а) клетки лактобактерий высушены распылением и б) полученные высушенные распылением клетки лактобактерий добавлены в физиологически совместимый носитель.
4. Применение по п.3, в котором размеры коагрегатов не меньше чем 50 мкм и, в частности, больше чем 500 мкм.
5. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором клетки лактобактерий отобраны из группы, состоящей из Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus и Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lac-tobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens, DSM 17646, DSM 17647, DSM 17648, DSM 17649, DSM 17650, DSM 17651, DSM 17652, DSM 17653, предпочтительно Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacil-lus reuteri, Lactobacillus buchneri и Lactobacillus pentosus.
6. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором указанная композиция находится, в частности, в составе пищевых продуктов, и/или кормах для домашних животных и/или сельскохозяйственных животных, и/или диетических добавок и необязательно содержит адьюванты и добавочные вещества.
7. Применение по любому из предыдущих пунктов для эрадикационной терапии Helicobacter pylori в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики.
8. Способ получения композиции, лекарственного средства или диетической добавки, содержащих высушенные распылением клетки лактобактерий, в котором клетки лактобактерий ферментируют и высушивают распылением и полученные клетки лактобактерий смешивают с физиологически совместимым носителем.
9. Способ по п.8, в котором клетки лактобактерий предварительно инокулируют и обогащают.
10. Применение высушенных распылением клеток лактобактерий для получения фармацевтической и/или диетической композиции для профилактики и/или лечения болезней, вызванных инфицированием Helicobacter pylori.
11. Применение по п.10, где болезни, вызванные инфицированием Helicobacter pylori, выбирают из следующих: болезни желудочно-кишечного тракта, такие как гастрит, язва желудка и рак желудка, дискомфорт в животе, в частности дискомфорт в верхней части живота, тяжесть в желудке, желудочные спазмы, боль в животе, боль или давление в верхней части живота, ощущение жжения в верхней части живота, хронически повторяющиеся расстройства желудка, постоянное ощущение наполненности, снижение аппетита, боль в пустом желудке, вздутие живота, изжога, диарея, нерегулярный стул, недомогание, тошнота и рвота, пищевая непереносимость, нарушение всасывания, несварение желудка (функциональная диспепсия), гастрит, повреждения слизистой оболочки или гастродуоденальная язва.
12. Применение высушенных распылением клеток лактобактерий для эрадикационной терапии Hel-icobacter pylori.
13. Применение по п.12, в котором высушенные распылением клетки лактобактерий применяют в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики.
14. Применение лекарственного средства или диетической добавки, содержащих высушенные рас
10.
пылением клетки лактобактерий, для профилактики или лечения заболеваний, вызванных инфицированием Helicobacter pylori.
15. Применение по п.14, в котором заболевания, вызванные инфицированием Helicobacter pylori, представляют собой следующие: заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как гастрит, язва желудка и рак желудка, дискомфорт в животе, дискомфорт в верхней части живота, тяжесть в желудке, желудочные спазмы, боль в животе, боль или давление в верхней части живота, ощущение жжения в верхней части живота, хронически повторяющиеся расстройства желудка, постоянное ощущения наполненности, снижение аппетита, боль в пустом желудке, вздутие живота, изжога, диарея, нерегулярный стул, недомогание, тошнота и рвота, пищевая непереносимость, нарушение всасывания, несварение желудка (функциональная диспепсия), гастрит, повреждения слизистой оболочки или гастродуоденальная язва.
16. Применение по п.14 или 15, в котором лекарственное средство применяют при эрадикационной терапии Helicobacter pylori в комбинации с дополнительными подходящими активными ингредиентами, такими как антибиотики.
15.
0,0Е+00 1,0Е+08 2,0Е+08 3,0Е+08
Использованное количество лактобактерий
Фиг. 4
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028340
- 1 -
028340
- 1 -
028340
- 1 -
028340
- 1 -
028340
- 4 -
028340
- 11 -
|
