|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Многокомпонентная буферная система для очистки рекомбинантного белка посредством последовательности хроматографических стадий, включающих аффинную хроматографию и где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит: (а) органическую кислоту, (b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой (а), и (с) органическое основание, при этом буферная система не содержит NaCl. 2. Система по п.1, где для аффинной хроматографии используют суперантиген, иммобилизованный на твердой фазе. 3. Система по п.2, где суперантиген выбирают из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L. 4. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическую кислоту выбирают из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты, глицина, глицилглицина, янтарной кислоты, TES (2- {[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты)) и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты). 5. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание выбирают из группы, состоящей из основания Трис, бис-Трис, бис-Трис-пропана, бицина (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицина), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновой кислоты) и трицина (N-трис(гидроксиметил)метилглицина). 6. Система по любому из предшествующих пунктов, где соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой, представляет собой соль натрия, калия или аммония и основания, сопряженного с органической кислотой. 7. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту. 8. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание представляет собой основание Трис. 9. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту и основание, сопряженное с уксусной кислотой, представляет собой соль натрия. 10. Система по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантный белок представляет собой антигенсвязывающий белок. 11. Система по п.10, где антигенсвязывающий белок представляет собой антитело класса IgG. 12. Система по п.10, где антигенсвязывающий белок представляет собой один вариабельный домен иммуноглобулина. 13. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий дополнительно включает анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию и/или смешанную хроматографию. 14. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает: (а) хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию или (b) хроматографию на белке А, проточную анионообменную хроматографию и катионообменную хроматографию. 15. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5. 16. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5. 17. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и катионообменную хроматографию в присутствии 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0. 18. Способ очистки белка от его контаминированного раствора с использованием многокомпонентной буферной системы в последовательности хроматографических стадий, где хроматографические стадии включают аффинную хроматографию и где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит: (а) органическую кислоту, (b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой (а), и (с) органическое основание; где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферов, которые получают без добавления NaCl. 19. Способ по п.18, где последовательность хроматогрофических стадий дополнительно включает одно или комбинацию из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и смешанной хроматографии. 20. Способ по п.18, в котором стадия аффинной хроматографии представляет собой хроматографию на белке А, которая включает: (а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе; (с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5; и (d) выделение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А, который содержит 1,8 мМ ацетата натрия, 28,2 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 3,6, где все буферы получают без добавления NaCl. 21. Способ по п.20, который дополнительно включает следующую стадию после стадии (с) и перед стадией (d): удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5, где второй промывочный буфер для белка А получают без добавления NaCl. 22. Способ по п.20 или 21, который дополнительно включает следующие стадии после стадии (d): (e) титрование раствора, который содержит выделенный белок, приблизительно до рН 3,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl; (f) предоставление раствору со стадии (е) возможности оставаться при рН приблизительно 3,0 в течение приблизительно от 30 приблизительно до 60 мин и (g) корректировку рН раствора со стадии (f) приблизительно до рН 7,5 с использованием 1 М Трис. 23. Способ по п.22, который дополнительно включает фильтрование раствора, полученного посредством стадии (g) по п.18. 24. Способ по п.22 или 23 для очистки белка от раствора, полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23 посредством проточной анионообменной хроматографии, который содержит: (а) уравновешивание анионообменной матрицы анионным уравновешивающим буфером, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (b) нанесение контаминированного раствора на анионообменную матрицу и сбор первого элюата и (с) нанесение анионного промывочного буфера, содержащего 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5, на анионообменную матрицу и сбор второго элюата, где все буферы получают без добавления NaCl. 25. Способ по п.24, где первый элюат и второй элюат комбинируют в один объединенный проточный раствор. 26. Способ по п.24 или 25, где рН первого элюата, второго элюата и одного объединенного проточного раствора корректируют приблизительно до рН 5,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl. 27. Способ по любому из пп.22-26 для очистки белка от контаминированного раствора, выбранного из раствора, полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23, первого или второго элюата по п.24, одного проточного объединенного раствора по п.25 и элюата со скорректированным рН, полученного по п.26, посредством катионообменной хроматографии, который содержит: (а) уравновешивание катионообменной матрицы катионным уравновешивающим буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0; (b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на катионообменной матрице; (с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым катионным промывочным буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0 и (d) выделение белка из твердой фазы с использованием катионного элюирующего буфера, который содержит 175 мМ ацетата натрия, 75 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0, где все буферы получают без добавления NaCl.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Многокомпонентная буферная система для очистки рекомбинантного белка посредством последовательности хроматографических стадий, включающих аффинную хроматографию и где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит: (а) органическую кислоту, (b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой (а), и (с) органическое основание, при этом буферная система не содержит NaCl. 2. Система по п.1, где для аффинной хроматографии используют суперантиген, иммобилизованный на твердой фазе. 3. Система по п.2, где суперантиген выбирают из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L. 4. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическую кислоту выбирают из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты, глицина, глицилглицина, янтарной кислоты, TES (2- {[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты)) и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты). 5. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание выбирают из группы, состоящей из основания Трис, бис-Трис, бис-Трис-пропана, бицина (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицина), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновой кислоты) и трицина (N-трис(гидроксиметил)метилглицина). 6. Система по любому из предшествующих пунктов, где соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой, представляет собой соль натрия, калия или аммония и основания, сопряженного с органической кислотой. 7. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту. 8. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание представляет собой основание Трис. 9. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту и основание, сопряженное с уксусной кислотой, представляет собой соль натрия. 10. Система по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантный белок представляет собой антигенсвязывающий белок. 11. Система по п.10, где антигенсвязывающий белок представляет собой антитело класса IgG. 12. Система по п.10, где антигенсвязывающий белок представляет собой один вариабельный домен иммуноглобулина. 13. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий дополнительно включает анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию и/или смешанную хроматографию. 14. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает: (а) хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию или (b) хроматографию на белке А, проточную анионообменную хроматографию и катионообменную хроматографию. 15. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5. 16. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5. 17. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и катионообменную хроматографию в присутствии 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0. 18. Способ очистки белка от его контаминированного раствора с использованием многокомпонентной буферной системы в последовательности хроматографических стадий, где хроматографические стадии включают аффинную хроматографию и где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит: (а) органическую кислоту, (b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой (а), и (с) органическое основание; где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферов, которые получают без добавления NaCl. 19. Способ по п.18, где последовательность хроматогрофических стадий дополнительно включает одно или комбинацию из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и смешанной хроматографии. 20. Способ по п.18, в котором стадия аффинной хроматографии представляет собой хроматографию на белке А, которая включает: (а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе; (с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5; и (d) выделение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А, который содержит 1,8 мМ ацетата натрия, 28,2 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 3,6, где все буферы получают без добавления NaCl. 21. Способ по п.20, который дополнительно включает следующую стадию после стадии (с) и перед стадией (d): удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5, где второй промывочный буфер для белка А получают без добавления NaCl. 22. Способ по п.20 или 21, который дополнительно включает следующие стадии после стадии (d): (e) титрование раствора, который содержит выделенный белок, приблизительно до рН 3,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl; (f) предоставление раствору со стадии (е) возможности оставаться при рН приблизительно 3,0 в течение приблизительно от 30 приблизительно до 60 мин и (g) корректировку рН раствора со стадии (f) приблизительно до рН 7,5 с использованием 1 М Трис. 23. Способ по п.22, который дополнительно включает фильтрование раствора, полученного посредством стадии (g) по п.18. 24. Способ по п.22 или 23 для очистки белка от раствора, полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23 посредством проточной анионообменной хроматографии, который содержит: (а) уравновешивание анионообменной матрицы анионным уравновешивающим буфером, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (b) нанесение контаминированного раствора на анионообменную матрицу и сбор первого элюата и (с) нанесение анионного промывочного буфера, содержащего 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5, на анионообменную матрицу и сбор второго элюата, где все буферы получают без добавления NaCl. 25. Способ по п.24, где первый элюат и второй элюат комбинируют в один объединенный проточный раствор. 26. Способ по п.24 или 25, где рН первого элюата, второго элюата и одного объединенного проточного раствора корректируют приблизительно до рН 5,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl. 27. Способ по любому из пп.22-26 для очистки белка от контаминированного раствора, выбранного из раствора, полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23, первого или второго элюата по п.24, одного проточного объединенного раствора по п.25 и элюата со скорректированным рН, полученного по п.26, посредством катионообменной хроматографии, который содержит: (а) уравновешивание катионообменной матрицы катионным уравновешивающим буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0; (b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на катионообменной матрице; (с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым катионным промывочным буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0 и (d) выделение белка из твердой фазы с использованием катионного элюирующего буфера, который содержит 175 мМ ацетата натрия, 75 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0, где все буферы получают без добавления NaCl.
Евразийское 028326 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201391402
(22) Дата подачи заявки
2012.03.29
(51) Int. Cl. C07K1/16 (2006.01)
(54) МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ БУФЕРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКА
(31) 61/468,814
(32) 2011.03.29
(33) US
(43) 2014.01.30
(86) PCT/US2012/031076
(87) WO 2012/135415 2012.10.04
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи (US)
(72) Изобретатель:
Гоклин Кент И., Суда Эрик Дж., Убиера Антонио Рауль (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20100234577 US-A1-20080193981
"Mixed-mode Selection Chromatographi Guide" Pall Coporation. Availble on the Internet: Retrieved from the Internet: 30 May 2012, entire document
US-A1-20060118492
WO-A2-2006138553 WO-A1-2010127069
(57) Способ очистки белка с использованием упрощенной, не содержащей хлорид натрия буферной системы, которая состоит из двух компонентов (пары кислоты и основания) для подходящего контроля рН раствора; и третьего компонента для контроля ионной силы, где третий компонент представляет собой соль натрия и основания, сопряженного с кислотой.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области очистки рекомбинантных белков от клеточной культуры или ферментативного бульона с использованием последовательности элементарных хроматографиче-ских операций. Более конкретно, изобретение относится к не содержащей хлорид натрия буферной системе, используемой в последовательности элементарных операций для очистки белка; где кислотный и основный компонент, наряду с третьим буферным компонентом солью натрия, комбинируют в заданных соотношениях для того, чтобы обеспечить подходящий контроль рН и проводимости для надежности хроматографической операции.
Предпосылки изобретения
Способы ортогональной очистки для выделения рекомбинантных белков являются общепризнанными в биотехнологической промышленности, и их продолжают развивать для повышения пропускной способности, очистки от примесей, снижения стоимости продуктов, уменьшения времени улучшения, масштабируемости и т.д. В последние годы значительно усовершенствованы платформенные подходы до такой степени, что общие шаблонные способы, которые требуют минимальных усилий по улучшению, можно использовать при выделении различных подклассов рекомбинантных белков, в частности, моно-клональных антител. В этом случае, основная идея, лежащая в основе улучшения платформенного способа для моноклональных антител и других белков, заключается в идентификации и реализации обыкновенных элементарных операций, которые можно применять к широкому классу целевых молекул, что ведет к общей схеме стадий очистки, которую можно использовать для быстрой разработки масштабируемых, надежных способов. При разработке условий работы для последовательности из стадий хроматографии и мембраны/фильтрований, ключевой учитываемый фактор заключается в тщательном выборе компонентов буфера, что ведет к надежности и повышенной производительности способа. Без систематического подхода способ выбора буфера посредством традиционных лабораторных экспериментов часто может вести к большому числу компонентов, которые не обязательно являются общими от элементарной операции к элементарной операции и могут быть трудоемкими для реализации в крупномасштабном производстве. Так, например, в документе US 2010/0234577 (Mazzola Gregory J. et al, 16.09.2010) раскрыто использование керамического гидроксиапатита (СНА) в качестве хроматографической смолы для очистки моноклональных антител. При этом, в указанном документе описано несколько буферов, которые могут быть использованы, однако отсутствуют сведения о применении таких буферов как компонентов многобуферной системы без NaCl. В хроматографических стадиях, описанных в US 2010/0234577 использовали по меньшей мере один буферный раствор, который включает NaCl. Для того чтобы решить эти вопросы и ограничить число компонентов буфера, необходимых для единого способа, авторы настоящего изобретения предлагают в настоящем документе не содержащую хлорид натрия двухкомпонентную буферную систему.
Сущность изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к многокомпонентной буферной системе для очистки белков посредством последовательности хроматографических стадий, где способ хроматографии выбирают из группы, состоящей из хроматографии на белке А, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и смешанной хроматографии, где способы хроматографии можно осуществлять или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит органическую кислоту, соль щелочного металла или аммония и основания, сопряженного с органической кислотой, и органическое основание, и где способы хроматографии осуществляют с использованием буферов, которые получают без добавления NaCl.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки белка от его контаминиро-ванного раствора посредством хроматографии на белке А, который включает: (а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А, содержащим 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (b) адсорбирование белка из кон-таминированного раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе; (с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5; и (d) выделение белка из твердой фазы с использованием элюирующего буфера для белка А, который содержит 1,8 мМ ацетата натрия, 28,2 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 3,6, где все буферы получают без добавления NaCl.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки белка от его контаминиро-ванного раствора посредством проточной анионообменной хроматографии, который включает: (а) уравновешивание анионообменной матрицы анионным уравновешивающим буфером, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (v) нанесение контаминиро-ванного раствора на анионообменную матрицу и сбор первого элюата; и (с) нанесение анионного промывочного буфера, содержащего 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5, на анионообменную матрицу и сбор второго элюата, где все буферы получают без добавления NaCl.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки белка от его контаминиро
ванного раствора посредством катионообменной хроматографии, который включает: (а) уравновешивание катионообменной матрицы катионным уравновешивающим буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0; (b) адсорбирование белка из конта-минированного раствора на катионообменную матрицу; (с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым катионным промывочным буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0; и (d) выделение белка из твердой фазы катионным элюирующим буфером, который содержит 175 мМ ацетата натрия, 75 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0, где все буферы получают без добавления NaCl. Исключение хлорида натрия из способа обеспечивает контроль и полное устранение коррозионного влияния растворов хлоридов высокой концентрации на технологическое оборудование из нержавеющей стали.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: Диаграмма нисходящей последовательности операций для мАТ платформы. Представлены ключевые диапазоны рН и ионной силы для управления промышленной хроматографией.
Фиг. 2: Диаграмма идеального крупномасштабного получения буфера из концентратов для минимизации требований к сырью и резервуарам.
Фиг. 3: Вычисленные и экспериментальные кривые рН, ионной силы и буферной емкости для буферной системы из уксусной кислоты и основания Трис.
Фиг. 4: Вычисленные и экспериментальные кривые рН, ионной силы и буферной емкости для буферной системы из лимонной кислоты и основания Трис.
Фиг. 5: Вычисленные и экспериментальные кривые рН, ионной силы и буферной емкости для буферной системы из уксусной кислоты и фосфата натрия.
Фиг. 6: Вычисленные и экспериментальные кривые рН, ионной силы и буферной емкости для буферной системы из лимонной кислоты и фосфата натрия.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными способами, реактивами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, конечно, можно менять. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология служит только цели описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена в качестве ограничения. Как используют в этом описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число до тех пор, пока содержание явным образом не диктует иное. Таким образом, например, упоминание о "полипептиде" включает сочетание двух или более полипептидов и т.п.
Подразумевают, что "приблизительно", как используют в настоящем документе, когда упоминают об измеримых значениях, таких как количество, длительность во времени и т.п., охватывает колебания ±20% или ±10%, включая ±5%, ±1% и ±0,1% от точно определенного значения, поскольку такие колебания подходят для того, чтобы осуществлять раскрытые способы.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, в каком их обыкновенно понимает специалист в той области, к которой относится изобретение. Несмотря на то, что любые способы и вещества, схожие или эквивалентные описанным в настоящем документе, можно использовать на практике для тестирования настоящего изобретения, предпочтительные вещества и способы описаны в настоящем документе. В описании настоящего изобретения и формуле изобретения использована следующая терминология.
Эффекты двухкомпонентной буферной системы, не содержащей хлорид натрия, можно реализовать с использованием широкого спектра компонентов буфера, подходящих для биотехнологии, например, уксусной кислоты и основания Трис. Однако эта конкретная пара компонентов, наряду с третьим основанием соли натрия, сопряженным с кислотой (например, ацетат натрия), обеспечивает преимущества для платформы для моноклональных антител, которая в частности включает анионо- и катионообменную хроматографию в качестве стадий доочистки после захвата. Для хроматографии на белке А эти буферные частицы особенно подходят; где уравновешивание, загрузку, промывание обычно осуществляют при нейтральном рН и для элюирования необходимо ступенчатое изменение до низкого рН. Здесь смесь уксусная кислота/Трис можно разрабатывать для поддержания рН 7,0-8,0 для уравновешивания, смесь уксусная кислота/ацетат натрия/основание Трис для промывания при этом самом рН с использованием повышения ионной силы ацетатом натрия высокой концентрации для оптимальной очистки от родственных и производственных примесей, и смесь уксусная кислота/ацетат натрия для элюирования при низком рН (3,6-3,8). Одно другое преимущество просто связано с минимальной электростатической адсорбцией или обменом буферных частиц ацетата и Трис во время соответствующей ионообменной хроматографиче-ской операции. Более конкретно, поскольку ион основания Трис обладает положительным зарядом при нейтральном рН (где обыкновенно осуществляют анионообменную хроматографию для типичного антитела с высокой изоэлектрической точкой), он будет по большей части оставаться в растворе на всем протяжении стадии анионообменной проточной хроматографии, обеспечивая подходящие буферные свойства в жидкой фазе при низкой ионной силе. Наоборот, ацетат-ион обладает отрицательным зарядом и остается в растворе на всем протяжении катионообменной хроматографии, также избегая обмена одноименно заряженных ионов буфера и обеспечивая буферные свойства при кислом рН (например, рН 5,0).
Этот подход при умеренных концентрациях буфера помогает поддерживать постоянных рН при ступенчатых изменениях, избегая скачков рН, которые могут вести к снижению производительности очистки от примесей и снижению производительности стадий [1], [2], [3]. Другое ключевое преимущество связано с единственными значениями pKa этих частиц и буферными емкостями при значениях рН, которые больше всего имеют отношение к каждой стадии в платформенном способе (фиг. 1). Единственный pKa ацетатного буфера, например, позволяет снижать количество сильной кислоты и основания, которое необходимо для достижения целевого низкого рН или нейтрализации во время стадии инактивации вируса, минимизируя увеличение ионной силы, к которому ведет добавление. Минимизация ионной силы во время этой стадии является критичной для максимальной производительности следующей стадии проточной анионообменной хроматографии. Тогда низкая ионная сила в продукте анионного обмена делает возможной высокую связывающую способность на стадии катионообменной хроматографии, полностью объединяя все четыре стадии в способе (с точки зрения выбора буфера) и избегая необходимости TFUF или разбавления между стадиями. Наконец, исключение хлорида натрия из способа обеспечивает контроль или полное устранение коррозионного влияния растворов хлоридов высокой концентрации на технологическое оборудование из нержавеющей стали. Коррозия связана с растворами хлоридов высокой концентрации, в частности, при кислых уровнях рН (необходимых, например, во время катионообменной хроматографии), и сообщалось, что это создает проблемы для производственного оборудования [4].
Настоящее изобретение, в частности, относится к использованию упрощенной буферной системы кислота/основание в контексте платформенного способа в комбинации с компонентом буфера солью натрия в качестве замены хлорида натрия, основанием Трис высокой концентрации или другим компонентом для модуляции ионной силы. Этот подход ведет к более устойчивому рН и контролю проводимости в диапазоне рН 3,4-7,7 и, в свою очередь, повышает производительность каждой хроматографической стадии, относительно более традиционного способа, который включает большее число компонентов буфера.
"Полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в настоящем документе, чтобы отослать к полимеру из аминокислотных остатков. Полипептид может быть естественного происхождения (получен из ткани), может быть получен рекомбинантной или естественной экспрессией из препаратов прокариотических или эукариотических клеток или получен химически синтетическими способами. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе аминокислотным полимерам и невстре-чающимся в природе аминокислотным полимерам. Аминокислотны миметики относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которая выполняет функции, схожие со встречающейся в природе аминокислотой. Неестественные остатки подробно описаны в научной и патентной литературе; некоторые образцовые неестественные композиции, которые можно использовать в качестве миметиков естественных аминокислотных остатков, и руководства описаны ниже. Миметики ароматических аминокислот можно создавать посредством замены, например, на D-или L-нафтилаланин; D- или L-фенилглицин; D- или L-2 тиенилаланин; D-или L-1, -2,3- или 4-пиренилаланин; D- или L-3 тиенилаланин; D- или L-(2-пиридинил)аланин; D- или L-(3-пиридинил)аланин; D- или L-(2-пиразинил)аланин; D- или L-(4-изопропил)фенилглицин: D-(трифторметил)фенилглицин; D-(трифторметил)фенилаланин: D-п-фторфенилаланин; D- или L-p-бифенилфенилаланин; K- или L-п-метоксибифенилфенилаланин: D-или L-2-индол(алкил)аланины; и D-или L-алкилаланины, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изотил, изопентил, или не кислые аминокислоты. Ароматические кольца неестественных аминокислот включают, например, тиазолиловое, тиофенило-вое, пиразолиловое, бензимидазолиловое, нафтиловое, фураниловое, пирролиловое и пиридиловое ароматические кольца.
"Пептид", как используют в настоящем документе, включает пептиды, которые представляют собой консервативные вариации тех пептидов, которые конкретно представлены в качестве примера в настоящем документе. "Консервативная вариация", как используют в настоящем документе, обозначает замену аминокислотного остатка на другой, биологически схожий остаток. Примеры консервативных вариаций включают, но не ограничиваясь этим, замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, аланин, цистеин, глицин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин, норлейцин или метионин, на другой, или замену одного полярного остатка на другой, такую как замена аргинина на лизин, глута-миновой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин, и т.п. Нейтральные гидрофильные аминокислоты, которые могут быть заменены на другую, включают аспарагин, глутамин, серин и треонин. "Консервативная вариация" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной родительской аминокислоты при условии, что антитела, которые индуцировали к замещенному полипептиду, также обладают иммунореактивностью к незамещенному полипептиду. Такие консервативные замены входят в определение классов пептидов по изобретению. "Катионный", как используют в настоящем документе, относится к какому-либо пептиду, который обладает суммарным положительным зарядом при рН 7,4. Биологическую активность пептидов можно определять стандартными
способами, которые известны специалистам в данной области и описаны в настоящем документе.
"Рекомбинантный", когда используют в отношении белка, указывает на то, что белок модифицировали посредством введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка.
Как используют в настоящем документе, "терапевтический белок" относится к какому-либо белку и/или полипептиду, который можно вводить млекопитающему для того, чтобы вызывать биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, желаемую, например, исследователем или клиницистом. Терапевтический белок может вызывать больше чем одну биологическую или медицинскую реакцию. Кроме того, термин "терапевтически эффективное количество" обозначает какое-либо количество, которое по сравнению с соответствующим субъектом, не получившим такое количество, ведет к, но не ограничиваясь этим, лечению, предотвращению или уменьшению интенсивности заболевания, нарушения или побочного эффекта или снижению скорости развития заболевания или нарушения. Объем термина также включает количества, которые эффективны для усиления нормальной физиологической функции, а также количества, которые эффективно вызывают физиологическую функцию у пациента, которая усиливает терапевтический эффект второго фармацевтического средства или способствует ему.
Все "аминокислотные" остатки, идентифицированные в настоящем документе, находятся в естественной L-конфигурации. Согласно стандартной номенклатуре полипептидов сокращения для аминокислотных остатков показаны в следующей таблице.
Талина 1. Сокращения для аминокислот
обозначение
обозначение
Туг
L-тирозин
Gly
L-глицин
Phe
L-фенилаланин
Met
L-метионин
Ala
L-аланин
Ser
L-серин
L-изолейцин
Leu
L-лейцин
Thr
L-триптофан
Val
L-валин
Pro
L-пролин
Lys
L-лизин
His
L-гистидин
Gin
L-глутамин
Glu
L-глутаминовая кислота
Trp
L-триптофан
Arg
L-аргинин
Asp
L-аспарагиновая кислота
Asn
L-аспарагин
Cys
L-цистеин
Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены в настоящем документе с помощью формул, которые в ориентации слева направо находятся в стандартном направлении от N-конца к С-концу.
В другом варианте осуществления полипептид представляет собой антигенсвязывающий полипептид. В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий полипептид выбирают из группы, состоящей из растворимого рецептора, антитела, фрагмента антитела, одного вариабельного домена иммуноглобулина, Fab, F(ab')2, Fv, Fv с дисульфидной связью, scFv, полиспецифического антитела в закрытой конформации, scFv с дисульфидной связью или диатела.
Термин "антигенсвязывающий полипептид", как используют в настоящем документе, относится к антителам, фрагментам антител и другим белковым конструкциям, которые способны связываться с антигеном.
Термины Fv, Fc, Fd, Fab или F(ab)2 используют в их стандартных значениях (см., например, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
"Химерное антитело" относится к типу сконструированных антител, которые содержат встречающуюся в природе вариабельную область (легкая цепь и тяжелые цепи), полученную из донорного антитела, в сочетании с константными областями легкой и тяжелой цепей, полученными из акцепторного антитела.
"Гуманизированное антитело" относится к типу сконструированных антител, которые содержат CDR, полученные из не относящегося к человеку донорного иммуноглобулина, остальные полученные из иммуноглобулинов части молекулы получают из одного (или более) иммуноглобулинов человека. Кроме того, поддерживающие остатки каркаса можно изменять для того, чтобы сохранять аффинность связывания (см., например, Queen et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991)). Подходящее акцепторное антитело человека может представлять собой антитело, выбранное из стандартной базы данных, например, базы данных KABAT.RTM, базы данных Los Alamos и базы данных SwissProt, по гомологии с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями донорного антитела. Антитело человека, отличающееся гомологией с каркасными областями донорного антитела (на основе аминокислотной последовательности) может подходить для того, чтобы предоставить константную область тяжелой цепи и/или вариабельную каркасную область тяжелой цепи для вставки донорных CDR. Подходящее акцепторное антитело, способное служить донором константных или вариабельных каркасных областей легкой цепи, можно отбирать схожим образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не обязательно должны происходить из одного и того же акцепторного антитела. В известном уровне техники описано несколько способов получения таких гуманизированных антител - см., например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.
Термин "донорное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), которое служит источником аминокислотных последовательностей своих вариабельных областей, CDR или других функциональных фрагментов или их аналогов для первого иммуноглобулина-партнера с тем, чтобы предоставить измененную кодирующую область иммуноглобулина и получаемое экспрессируемое измененное антитело с антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, характерными для донорного антитела.
Термин "акцепторное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), гетерологичному донорному антителу, которое служит источником всех (или какой-либо части, но в некоторых вариантах осуществления всех) аминокислотных последовательностей, кодирующих его каркасные области тяжелых и/или легких цепей и/или его константные области тяжелых и/или легких цепей, для первого иммуноглобулина-партнера. В определенных вариантах осуществления антитело человека представляет собой акцепторное антитело.
"CDR" определяют как аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей антитела, которые представляет собой гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулина. См., например, Rabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). В вариабельной части иммуноглобулина существует три CDR (или области CDR) тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Таким образом, "CDR", как используют в настоящем документе, относится ко всем трем CDR тяжелой цепи или всем трем CDR легкой цепи (или ко всем CDR тяжелой и всем CDR легкой цепи, если уместно). Структура и укладка белка антитела могут подразумевать, что другие остатки считают частью антигенсвязы-вающей области, и они будут восприняты так специалистом. См., например, Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883.
Как используют в настоящем документе, термин "домен" относится к структуре укладки белка, который имеет третичную структуру, независимо от остального белка. В целом, домены отвечают за отдельные функциональные свойства белков, и во многих случаях их можно добавлять, удалять или переносить в другие белки без утраты функции остальной части белка и/или домена. "Один вариабельный домен антитела" представляет собой домен уложенного полипептида, который содержит последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Следовательно, он включает целые вариабельные домены и модифицированные вариабельные домены антител, в которых, например, одна или несколько петель заменены на последовательности, которые не характерны для вариабельных доменов антитела, или вариабельные домены антитела, которые усечены или содержат N- или С-концевые вставки, а также уложенные фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют по меньшей мере связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
"Один вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), который специфически связывает антиген или эпитоп, независимо от другой V области или домена. Один вариабельный домен иммуноглобулина может присутствовать в определенной форме (например, гомо- или гетеромультимера) с другими, отличающимися вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена одним вариабельным доменом иммуноглобулина (т.е., где один вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо дополнительных вариабельных доменов). Как этот термин используют в настоящем
документе, "доменное антитело" или "dAb" представляет собой то же самое, что и "один вариабельный домен иммуноглобулина", который способен связываться с антигеном. Один вариабельный домен иммуноглобулина может представлять собой вариабельный домен антитела человека, но также включает один вариабельный домен антитела от другого вида, такого как грызун (например, как раскрыто в WO 00/29004), акула-нянька и VHH dAb верблюдовых (нанотела). VHH верблюдовых представляют собой полипептиды одного вариабельного домена иммуноглобулина, которые получают от видов, которые включают верблюда, ламу, альпаку, дромедара и гуанако, которые в природе продуцируют тяжелую цепь антитела, которая свободна от легких цепей. Такие домены VHH могут быть гуманизированы в соответствии со стандартными способами, доступными в данной области, и такие домены все еще считают "доменными антителами" в соответствии с изобретением. Как используют в настоящем документе, "VH включает домены VHH верблюдовых. NARV представляют собой другой тип одного вариабельного домена иммуноглобулина, который идентифицировали у хрящевых рыб, включая акулу-няньку. Эти домены также известны как вариабельная область нового антигенного рецептора (обыкновенно сокращают до V(NAR) или NARV). Более подробно см. Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) и US 20050043519A.
Термин "связывающий эпитоп домен" относится к домену, который специфически связывает антиген или эпитоп, независимо от другой V области или домена, он может представлять собой доменное антитело (dAb), например, один вариабельный домен иммуноглобулина человека, верблюдового или акулы.
Как используют в настоящем документе, термин "участок связывания антигена" относится к месту на белке, которое способно специфически связываться с антигеном, он может представлять собой один домен, например, связывающий эпитоп домен, или он может представлять собой спаренные домены VH/VL, как можно найти на стандартном антителе. В некоторых аспектах по изобретению одноцепочеч-ные Fv (ScFv) домены могут предоставлять участки связывания антигена.
Термины "mATdAb" и "dAbmAT" используют в настоящем документе для обозначения антигенсвя-зывающих белков по настоящему изобретению. Два термина можно использовать взаимозаменяемо, и предполагается, что они имеют одно и то же значение, как используют в настоящем документе.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к многокомпонентной буферной системе для очистки белков посредством последовательности хроматографических стадий, где способы хроматографии выбирают из группы, состоящей из аффинной хроматографии, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и смешанной хроматографии, где способы хроматографии осуществляют или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит органическую кислоту, соль щелочного металла или аммония и основания, сопряженного с органической кислотой, и органическое основание и где способы хроматографии осуществляют с использованием буферов, которые получают без добавления NaCl.
В одном из вариантов осуществления аффинную хроматографию осуществляют с использованием суперантигена. "Суперантиген" относится к универсальным лигандам, которые взаимодействуют с элементами надсемейства иммуноглобулинов в месте, которое отличается от сайтов связывания целевых лигандов этих белков. Стафилококковые энтеротоксины представляют собой примеры суперантигенов, которые взаимодействуют с рецепторами Т-клеток. Суперантигены, которые связывают антитела, включают, но не ограничиваясь этим, белок G, который связывает константную область IgG (Bjorck and Kron-vall, J. Immunol., 133:969 (1984)); белок А, который связывает константную область и VH домены IgG (Forsgren and Sjoquist, J. Immunol, 97:822 (1966)); и белок L, который связывает VL домены (Bjorck, J. Immunol., 140: 1194 (1988)). В одном из вариантов осуществления суперантигеном является белок А.
Во многих случаях может быть более благоприятным фактически выбирать условия, в которых конкретный белок будет проходить насквозь, а контаминанты при этом будут связываться. Этот режим связывания часто обозначают как "проточный режим". В настоящей заявке раствор, который проходит насквозь во время хроматографии, обозначают как "проточный".
Когда используют в настоящем документе, термин "белок А" охватывает белок А, выделенный из его нативного источника, белок А, полученный синтетически (например, посредством синтеза пептидов или посредством рекомбинантных способов), и их варианты, которые сохраняют способность связывать белки, которые имеют область CH2/CH3. Можно приобретать коммерческий белок А в Repligen, Pharmacia и Fermatech.
Суперантиген иммобилизуют на твердой фазе. Под "твердой фазой" понимают неводную матрицу, к которой суперантиген может прилипать. Твердая фаза, представляющая интерес, в настоящем документе в целом представляет собой твердую фазу, которая содержит поверхность из стекла, диоксида кремния, агарозы или полистирола. Твердая фаза может представлять собой колонку для очистки или прерывную фазу из дискретных частиц. В предпочтительных вариантах осуществления твердая фаза представляет собой стеклянную колонку с контролируемым размером пор или колонку с кремниевой кислотой. В определенных вариантах осуществления твердую фазу покрывают реактивом (таким как глицерин), который предназначен для того, чтобы предотвращать неспецифическую адгезию контами-нантов к твердой фазе.
"Буфер" представляет собой буферный раствор, который препятствует изменениям рН посредством
действия его кислотно-основных сопряженных компонентов.
"Уравновешивающий буфер" в настоящем документе представляет собой буфер, который используют для того, чтобы получать твердую фазу для хроматографии.
"Загрузочный буфер" представляет собой буфер, который используют для того, чтобы загружать смесь белка и контаминанта(ов) на хроматографическую матрицу.
Уравновешивающий и загрузочный буферы могут представлять собой одно и то же.
"Элюирующий буфер" используют для того, чтобы элюировать белки из хроматографической матрицы.
"Соль" представляет собой соединение, сформированное посредством взаимодействия кислоты и основания.
В одном из вариантов осуществления органическая кислота включает, но не ограничиваясь этим, муравьиную кислоту, уксусную кислоту, молочную кислоту, лимонную кислоту, яблочную кислоту, ма-леиновую кислоту, глицин, фосфорную кислоту, глицилглицин, янтарную кислоту, TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновую кислоту), MOPS (3-(№морфолино)пропан-сульфоновую кислоту), PIPES (пиперазин-^№-бис(2-этансульфоновую кислоту)) и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту).
В одном из вариантов осуществления органическое основание включает, но не ограничиваясь этим, группу, состоящую из основания Трис, аргинина, бис-трис, бис-трис-пропана, бицина (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицина), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновой кислоты) и трицина (N-трис(гидро-ксиметил)метилглицина).
В одном из вариантов осуществления основание, сопряженное с органической кислотой, представляет собой соль натрия, калия или аммония и основания, сопряженного с органической кислотой. В одном из вариантов осуществления органическая кислота представляет собой уксусную кислоту и основание, сопряженное с уксусной кислотой, представляет собой соль натрия.
В одном из вариантов осуществления белок представляет собой антигенсвязывающий белок. В одном из вариантов осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой антитело. В одном из вариантов осуществления антитело относится к классу IgG. В одном из вариантов осуществления анти-генсвязывающий белок представляет собой один вариабельный домен иммуноглобулина.
В одном из вариантов осуществления последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию. В одном из вариантов осуществления последовательность хроматографический стадий включает хроматографию на белке А, проточную анионообменную хроматографию и катионообменную хроматографию.
В одном из вариантов осуществления последовательность хроматографических стадий содержит хроматографию на белке А, которую осуществляют в присутствии приблизительно 55 мМ основания Трис, приблизительно 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5.
В одном из вариантов осуществления последовательность хроматографических стадий включает проточную анионообменную хроматографию, которую осуществляют в присутствии приблизительно 55 мМ основания Трис, приблизительно 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5.
В одном из вариантов осуществления последовательность хроматографических стадий включает катионообменную хроматографию, которую осуществляют в присутствии приблизительно 25 мМ ацетата натрия, приблизительно 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу очистки белка от его контамини-рованного раствора посредством хроматографии на белке А, который включает: (а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А, который содержит приблизительно 55 мМ основания Трис, приблизительно 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе; (с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, который содержит приблизительно 55 мМ основания Трис, приблизительно 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5 и (d) выделение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А, который содержит приблизительно 1,8 мМ ацетата натрия, приблизительно 28,2 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 3,6, где все буферы получают без добавления NaCl.
В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает следующую стадию после стадии (с) и перед стадией (d): удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка А, который содержит приблизительно 55 мМ основания Трис, приблизительно 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5, где второй промывочный буфер для белка А получают без добавления NaCl.
В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает следующие стадии после стадии (d): (e) титрование раствора, который содержит выделенный белок, приблизительно до рН 3,0 с использованием приблизительно 30 мМ уксусной кислоты, приблизительно 100 мМ HCl; (f) предоставление раствору со стадии (е) возможности оставаться при рН приблизительно 3,0 в течение приблизи
тельно от 30 приблизительно до 60 минут; и (g) корректировка рН раствора со стадии (f) приблизительно до рН 7,5 с использованием приблизительно 1 М Трис.
В одном из вариантов осуществления способ дополнительно содержит фильтрование раствора, полученного посредством стадии (g) по п.18.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу очистки белка от его контамини-рованного раствора посредством проточной анионообменной хроматографии, которая содержит: (а) уравновешивание анионообменной матрицы анионным уравновешивающим буфером, который содержит приблизительно 55 мМ основания Трис, приблизительно 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5; (b) нанесение контаминированного раствора на анионообменную матрицу и сбор первого элюата; и (с) нанесение анионного промывочного буфера, содержащего 55 мМ основания Трис, приблизительно 45 мМ уксусной кислоты, приблизительно 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5 на анионообменную матрицу и сбор второго элюата, где все буферы получают без добавления NaCl.
В одном из вариантов осуществления контаминированный раствор представляет собой раствор, полученный посредством стадии (g) по п.18, или фильтрованный раствор по п.19.
В одном из вариантов осуществления первый элюат и второй элюат объединяют в один объединенный проточный раствор.
В одном из вариантов осуществления рН первого элюата, второго элюата и одного объединенного проточного раствора корректируют приблизительно до рН 5,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу очистки белка от его контамини-рованного раствора посредством катионообменной хроматографии, который включает:
(a) уравновешивание катионообменной матрицы катионным уравновешивающим буфером, который содержит приблизительно 25 мМ ацетата натрия, приблизительно 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0;
(b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на катионообменной матрице;
(c) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым катионным промывочным буфером, который содержит приблизительно 25 мМ ацетата натрия, приблизительно 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0; и
(d) выделение белка из твердой фазы с использованием катионного элюирующего буфера, который содержит 175 мМ ацетата натрия, 75 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0, где все буферы получают без добавления NaCl.
В одном из вариантов осуществления контаминированный раствор выбирают из первого элюата по п.20 или 21, второго элюата по п.20 или 21, одного проточного объединенного раствора по п.22 и элюата со скорректированным рН, полученного по п.23.
Пример 1.
Проводили оценку множества потенциальных компонентов буфера, которые можно реализовать в двухкомпонентной буферной системе, наряду с третьим компонентом для модуляции ионной силы (преднамеренно без хлорида натрия), посредством платформенного способа для очистки антител. В таблице 2 перечислены эти компоненты, которые в целом считают совместимыми с биотехнологиями. В этих экспериментах, как показано на фиг. 2, систему для жидкостной хроматографии с возможностью доставки градиента использовали для того, чтобы смешивать концентрированные буферные растворы и измерять рН и проводимость при различных соотношениях. На фиг. 3, 4, 5, 6 представлены результаты для образцов для уксусной кислоты/основания Трис, лимонной кислоты/основания Трис, уксусной кислоты/фосфата натрия и лимонной кислоты/фосфата натрия соответственно. На этих фигурах светлые круглые экспериментальные точки представляют экспериментально измеренные значения рН в виде функции от молярности буфера, тогда как сплошные и штриховые линии представляют вычисленные значения рН, проводимости (в целом пропорциональной проводимости раствора) и буферной емкости, определяемые через решение общепринятой математической модели Дэвиса [5] для предсказания поведения ионов в водных растворах. Эти кривые делают возможным определение требуемых буферных соотношений, необходимых для получения смеси ионных частиц, которые ведут к конкретному уровню рН и ионной силы, и, таким образом, являются инструментом для оценки пригодности буфера для конкретной хроматографической стадии.
Например, на фиг. 3 представлены эти результаты для смеси уксусной кислоты и основания Трис, которые демонстрируют, что для того, чтобы добиться буферных свойств, например, при рН 7,5, необходима композиция из 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, которая обеспечивает емкость 19 мМ. В целом, буферы считают "подходящими" буферами, когда буферная емкость приближается к 20 мМ. Другие комбинации различных компонентов, представленных в табл. 2, можно оценивать таким образом и затем тестировать в хроматографических экспериментах.
Этот подход применяли для того, чтобы дополнительно определять композицию уксусной кислоты и основания Трис, которая необходима для того, чтобы достичь желаемых диапазонов рН и проводимости для общего платформенного способа, представленного на фиг. 1. Конкретный диапазон значений рН необходим для каждой хроматографической элементарной операции в платформе в диапазоне от 3,6 до 7,5 единиц рН, наряду с диапазоном уровней проводимости от низкой до высокой. Это последнее требование (контроль проводимости) можно выполнять с использованием различных компонентов. В этом примере ацетат натрия выбирали в качестве основания, сопряженного с уксусной кислотой, который использовали для повышения ионной силы буфера, где ион натрия обеспечивает прямое повышение ионной силы. В табл. 3 обобщены конечные буферные композиции этой двухкомпонентной буферной системы, подлежащие использованию в экспериментах по очистке. В этой таблице следует отметить использование ацетата натрия в высокой концентрации на стадиях промывания белка А и элюирования при катионообменной хроматографии и отсутствие хлорида натрия.
Корректировочный буфер с низким рН
Элюат белка А, титрованный до рН 3,5 с использованием 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ НС1
Инактивирующее выдерживание
Выдерживание ^3 0 минут, не превышая 60 минут
Корректировка рН после выдерживания
Титрованный продукт с низким рН, скорректированный до рН 7,5 с использованием 1 М основания Трис
Анионообменная хроматография
Предварительное уравновешивание
Вода для инъекций (ВДИ)
Уравновешивание
55 мМ основание Трис, 45 мМ уксусная кислота, рН 7,5±0,2
Загрузка
Скорректированный по рН титрованный продукт с низким рН
Промывание 1
55 мМ основание Трис, 45 мМ уксусная кислота, рН 7,5±0,2
Очистка
1,0 М гидроксид натрия
Хранение
0,1 М гидроксид натрия
Катионообменная хроматография
Уравновешивание
25 мМ ацетат натрия, 12,1 мМ уксусная кислота, рН 5,0±0,2
Загрузка
рН 5,0±0,10 скорректированный продукт анионного обмена
Промывание 1
25 мМ ацетат натрия, 12,1 мМ уксусная кислота, рН 5,0±0,2
Элюирование
175 мМ ацетат натрия, 75 мМ уксусная кислота, рН 5,0±0,2
Очистка
1,0 М гидроксид натрия
Хранение
0,1 М гидроксид натрия
Пример 2.
Все хроматографические способы осуществляют с использованием системы АКТА Explorer 100 производства GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA). MabSelect SuRe Protein А и среду для хроматографии CaptoQ получали из GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA). Катионообменную смолу GigaCapS 650M получали из Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA, USA). Среду для хроматографии загружали слоем высотой 25 см, согласно рекомендациям производителя, в колонки Vantage диаметром 1,1 см, которые получали из Millipore Corporation (Bedford, MA, USA). Моноклональные антитела IgG, использованные для этой работы, экспрессировали рекомбинантным способом с использованием культуры клеток млекопитающего в GlaxoSmithKline в месте Upper Merion (King of Prussia, PA, USA). Все химические вещества получали из JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA) или Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) и они обладали фармацевтической степенью чистоты.
Хроматография на белке А
Очистку моноклональных антител посредством аффинной хроматографии на белке А с использованием MabSelect SuRe осуществляют согласно табл.2. Сначала колонку уравновешивают с использованием 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, рН 7,5. Затем осветленную жидкость культуры клеток наносят на колонку до тех пор, пока не нанесут на колонку достаточную массу для загрузки. Затем колонку промывают 55 мМ основанием Трис, 45 мМ уксусной кислотой, 300 мМ ацетатом натрия, рН 7,5. Перед элюированием колонку повторно уравновешивают 55 мМ основанием Трис, 45 мМ уксусной кислотой, рН 7,5. Затем осуществляют ступенчатое элюирование колонки с использованием 1,8 мМ ацетата натрия, 28,2 мМ уксусной кислоты, рН 3,6.
Обработка низким рН для инактивации вируса
Элюат белка А из предыдущей стадии корректируют до рН 3,5 с использованием 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ HCl. Вещество со скорректированным низким рН выдерживают в течение от 3 0 до 60 минут, затем нейтрализуют до рН 7,5 1 М основанием Трис. Затем нейтрализованный пул фильтруют при подготовке к последующим стадиям очистки.
Проточная анионообменная хроматография
Дополнительную очистку осуществляют посредством уравновешивания колонки CaptoQ 55 мМ основанием Трис, 45 мМ уксусной кислотой, рН 7,5 после споласкивания ВДИ (водой для инъекций) при предварительном уравновешивании. Следует отметить, что тот же уравновешивающий буфер, используемый для уравновешивания белка А, повторно используют на этой стадии, что дает преимущество минимизации буферных растворов, которые необходимо получать. Затем нейтрализованный пул наносят на колонку, где проходил белок, представляющий интерес, и собирают, в то время как контаминанты остаются связанными с колонкой. Затем после нанесения белка колонку промывают подходящим уравновешивающим буфером так, что остающийся белок смывают с колонки и его можно собирать.
Катионообменная хроматография
Протеин, собранный на анионообменной проточной стадии, титруют до рН 5,0 с использованием 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ HCl. Снова следует отметить повторное использование раствора для обработки с низким рН для корректировки рН на этой стадии. Колонку GigaCapS 650M уравновешивают 25 мМ ацетатом натрия, 12,1 мМ уксусной кислотой, рН 5,0. Затем титрованное вещества наносят на колонку до тех пор, пока не будет достигнута желаемая масса для загрузки. Затем колонку повторно уравновешивают 25 мМ ацетатом натрия, 12,1 мМ уксусной кислотой, рН 5,0. Затем осуществляют ступенчатое элюирование колонки посредством нанесения на колонку 175 мМ ацетата натрия, 75 мМ уксусной кислоты, рН 5,0. Элюат из колонки собирают и сохраняют для дальнейшей обработки.
Цитируемая литература
1. Ghose, S. ; McNerney, Т. М. Hubbard, В. рН transitions in ion-exchange systems: Role in the development of a cation exchange process for a recombinant protein. Biotechnol. Prog. 2002, 18, 530-537.
2. Soto Perez, J. and Frey, D. D. Behavior of the Inadvertent pH Transient Formed by a Salt Gradient in the Ion-Exchange Chromatography of Proteins, Biotechnol. Prog. 2005, 21, 902-910.
3. Pabst, T.M., Carta, G. pH transitions in cation exchange chromatographic columns containing weak acid groups. (2007) Journal of Chromatography A, 1142, pp. 19-31.
4. Zhou, J. X., et al. pH-conductivity hybrid gradient cation-exchange chromatography for process-scale monoclonal antibody purification. Journal of Chromatography A, 1175 (2007) 69-80.
5. Butler, J. N., Ionic Equilibrium: Solubility and pH Calculations. John Wiley and Sons (1998).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Многокомпонентная буферная система для очистки рекомбинантного белка посредством последовательности хроматографических стадий, включающих аффинную хроматографию и где хроматогра-фические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит:
(a) органическую кислоту,
(b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой
(а), и
(c) органическое основание, при этом буферная система не содержит NaCl.
2. Система по п.1, где для аффинной хроматографии используют суперантиген, иммобилизованный на твердой фазе.
3. Система по п.2, где суперантиген выбирают из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.
4. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическую кислоту выбирают из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты, глицина, глицилглицина, янтарной кислоты, TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновой кислоты), MOPS (3-^-морфолино)пропан-сульфоновой кислоты), PIPES (пиперазин-^№-бис(2-этансульфоновой кислоты)) и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты).
5. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание выбирают из группы, состоящей из основания Трис, бис-Трис, бис-Трис-пропана, бицина Ш^-бис(2
2.
гидроксиэтил)глицина), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновой кислоты) и трицина (№трис(гидро-ксиметил)метилглицина).
6. Система по любому из предшествующих пунктов, где соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой, представляет собой соль натрия, калия или аммония и основания, сопряженного с органической кислотой.
7. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту.
8. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание представляет собой основание Трис.
9. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту и основание, сопряженное с уксусной кислотой, представляет собой соль натрия.
10. Система по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантный белок представляет собой антигенсвязывающий белок.
11. Система по п. 10, где антигенсвязывающий белок представляет собой антитело класса IgG.
12. Система по п.10, где антигенсвязывающий белок представляет собой один вариабельный домен иммуноглобулина.
13. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий дополнительно включает анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию и/или смешанную хроматографию.
14. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает:
(a) хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию или
(b) хроматографию на белке А, проточную анионообменную хроматографию и катионообменную хроматографию.
15. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5.
16. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5.
17. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и катионообменную хроматографию в присутствии 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0.
18. Способ очистки белка от его контаминированного раствора с использованием многокомпонентной буферной системы в последовательности хроматографических стадий, где хроматографические стадии включают аффинную хроматографию и где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит:
(a) органическую кислоту,
(b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой
(а), и
(c) органическое основание;
где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферов, которые получают без добавления NaCl.
19. Способ по п.18, где последовательность хроматогрофических стадий дополнительно включает одно или комбинацию из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и смешанной хроматографии.
20. Способ по п.18, в котором стадия аффинной хроматографии представляет собой хроматографию на белке А, которая включает:
(a) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5;
(b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе;
(c) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5; и
(d) выделение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А, который содержит 1,8 мМ ацетата натрия, 28,2 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 3,6, где все буферы получают без добавления NaCl.
21. Способ по п.20, который дополнительно включает следующую стадию после стадии (с) и перед
стадией (d): удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5, где второй промывочный буфер для белка А получают без добавления NaCl.
22. Способ по п.20 или 21, который дополнительно включает следующие стадии после стадии (d):
(e) титрование раствора, который содержит выделенный белок, приблизительно до рН 3,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl;
(f) предоставление раствору со стадии (е) возможности оставаться при рН приблизительно 3,0 в течение приблизительно от 30 приблизительно до 60 мин и
(g) корректировку рН раствора со стадии (f) приблизительно до рН 7,5 с использованием 1 М Трис.
23. Способ по п.22, который дополнительно включает фильтрование раствора, полученного посредством стадии (g) по п.18.
24. Способ по п.22 или 23 для очистки белка от раствора, полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23 посредством проточной анионообменной хроматографии, который содержит:
(a) уравновешивание анионообменной матрицы анионным уравновешивающим буфером, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5;
(b) нанесение контаминированного раствора на анионообменную матрицу и сбор первого элюата и
(c) нанесение анионного промывочного буфера, содержащего 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5, на анионообменную матрицу и сбор второго элюата, где все буферы получают без добавления NaCl.
25. Способ по п.24, где первый элюат и второй элюат комбинируют в один объединенный проточный раствор.
26. Способ по п.24 или 25, где рН первого элюата, второго элюата и одного объединенного проточного раствора корректируют приблизительно до рН 5,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl.
27. Способ по любому из пп.22-26 для очистки белка от контаминированного раствора, выбранного из раствора, полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23, первого или второго элюата по п.24, одного проточного объединенного раствора по п.25 и элюата со скорректированным рН, полученного по п.26, посредством катионообменной хроматографии, который содержит:
(a) уравновешивание катионообменной матрицы катионным уравновешивающим буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0;
(b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на катионообменной матрице;
(c) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым катионным промывочным буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0 и
(d) выделение белка из твердой фазы с использованием катионного элюирующего буфера, который содержит 175 мМ ацетата натрия, 75 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0, где все буферы получают без добавления NaCl.
(a)
Вычисленные и экспериментальные кривые рН, ионной силы и
буферной емкости для буферной системы из лимонной кислоты и основания Трис.
Фиг. 4
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028326
- 1 -
(19)
028326
- 1 -
(19)
028326
- 1 -
(19)
028326
- 4 -
(19)
028326
- 14 -
|
