EA 028325B1 20171130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/028325 Полный текст описания [**] EA201390752 20111123 Регистрационный номер и дата заявки EP10192207.8 20101123 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2011/070835 Номер международной заявки (PCT) WO2012/069546 20120531 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21711 Номер бюллетеня [**] ПРИМЕНЕНИЕ ГЛЮКОЗИДАЗЫ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ МОЛОЧНОГО ПРОДУКТА Название документа [8] A23C 9/12, [8] A23C 9/127, [8] A23C 19/032, [8] A23C 11/10 Индексы МПК [DK] Якобсен Йонас, [DK] Винд Сандра Люкке, [DK] Квист Карстен Бруун Сведения об авторах [DK] КР. ХАНСЕН А/С Сведения о патентообладателях [DK] КР. ХАНСЕН А/С Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000028325b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ получения молочного продукта с повышенной плотностью геля, включающий: a) получение молочного субстрата и b) обработку молочного субстрата ферментом с N-связанной гликозидазной активностью.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию c) ферментирования молочного субстрата микроорганизмом, таким как молочнокислые бактерии, с получением ферментированного молочного продукта.

3. Способ по п.2, в котором стадию b) проводят перед или во время стадии с).

4. Способ по п.2 или 3, в котором микроорганизм принадлежит к видам, выбранным из группы, включающей Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii подвид Bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesnteroides подвид cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовариант diacetylactis, Lactobacillus casei подвид Casei, Lactobacillus paracasei подвид Paracasei, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором N-связанная гликозидаза представляет собой гликозидазу, выбранную из группы, включающей пептид-N(4)-(N-ацетил- β-глюкозамил) аспарагинамидазу (EC номер 3.5.1.52; альтернативные названия: N-глюкозидаза-F или PNGаза-F) и эндо- β-N-ацетилглюкозамидазу Н (EC номер 3.2.1.96; альтернативное название ENDO-H).

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором молочный субстрат выбран из группы, состоящей из молока животных и молока растительного происхождения.

7. Способ по п.6, в котором молоко животных представляет собой молоко коровы, овцы, козы, буйволицы или верблюдицы.

8. Способ по п.6, в котором молоко растительного происхождения представляет собой соевое молоко, овсяное молоко, рисовое молоко, миндальное молоко.

9. Способ по п.2, в котором ферментированный молочный продукт выбран из группы, включающей йогурт, пахту, ацидофильное молоко, кефир, кумыс и творог-кварк.

10. Молочный продукт, получаемый способом по любому предшествующему пункту, содержащий эффективное количество N-связанной гликозидазы.

11. Применение N-связанной гликозидазы в способе получения молочного продукта по любому из пп.1-9 для придания ему повышенной плотности геля.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Способ получения молочного продукта с повышенной плотностью геля, включающий: a) получение молочного субстрата и b) обработку молочного субстрата ферментом с N-связанной гликозидазной активностью.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию c) ферментирования молочного субстрата микроорганизмом, таким как молочнокислые бактерии, с получением ферментированного молочного продукта.

3. Способ по п.2, в котором стадию b) проводят перед или во время стадии с).

4. Способ по п.2 или 3, в котором микроорганизм принадлежит к видам, выбранным из группы, включающей Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii подвид Bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesnteroides подвид cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовариант diacetylactis, Lactobacillus casei подвид Casei, Lactobacillus paracasei подвид Paracasei, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором N-связанная гликозидаза представляет собой гликозидазу, выбранную из группы, включающей пептид-N(4)-(N-ацетил- β-глюкозамил) аспарагинамидазу (EC номер 3.5.1.52; альтернативные названия: N-глюкозидаза-F или PNGаза-F) и эндо- β-N-ацетилглюкозамидазу Н (EC номер 3.2.1.96; альтернативное название ENDO-H).

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором молочный субстрат выбран из группы, состоящей из молока животных и молока растительного происхождения.

7. Способ по п.6, в котором молоко животных представляет собой молоко коровы, овцы, козы, буйволицы или верблюдицы.

8. Способ по п.6, в котором молоко растительного происхождения представляет собой соевое молоко, овсяное молоко, рисовое молоко, миндальное молоко.

9. Способ по п.2, в котором ферментированный молочный продукт выбран из группы, включающей йогурт, пахту, ацидофильное молоко, кефир, кумыс и творог-кварк.

10. Молочный продукт, получаемый способом по любому предшествующему пункту, содержащий эффективное количество N-связанной гликозидазы.

11. Применение N-связанной гликозидазы в способе получения молочного продукта по любому из пп.1-9 для придания ему повышенной плотности геля.


Евразийское 028325 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201390752
(22) Дата подачи заявки
2011.11.23
(51) Int. Cl.
A23C 9/12 (2006.01) A23C 9/127 (2006.01) A23C19/032 (2006.01) A23C11/10 (2006.01)
(54) ПРИМЕНЕНИЕ ГЛЮКОЗИДАЗЫ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ МОЛОЧНОГО ПРОДУКТА
(31) 10192207.8
(32) 2010.11.23
(33) EP
(43) 2013.11.29
(86) PCT/EP2011/070835
(87) WO 2012/069546 2012.05.31
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КР. ХАНСЕН А/С (DK)
(72) Изобретатель:
Якобсен Йонас, Винд Сандра Люкке, Квист Карстен Бруун (DK)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (56) EP-A1-1489135
Е. CASES ET AL.: JOURNAL OF FOOD SCIENCE, vol. 68, no. 8, 20 March 2001 (2001-03-20), pages 2406-2410, XP002628214, cited in the application, the whole document
US-B2-7560127
US-A1-2003113405
WO-A1-2008000895
WO-A2-2009072904
WO-A1-2008037839
MINKIEWICZ P. ET AL.: "THE CONTRIBUTION OF N-ACETYLNEURAMINIC
ACID IN THE STABILIZATION OF MICELLAR CASEIN", POLISH JOURNAL OF FOOD AND NUTRITION SCIENCES, POLSKA AKADEMIA NAUK, OLSZTYN-KORTOWO, PL, vol. 2, no.
3, 1 September 1993 (1993-09-01), pages 39-48, XP001014588, ISSN: 1230-0322, the whole document
US-A1-2007036883
WO-A1-9619582
(57) Способ получения молочного продукта (например, йогурта), включающий добавление эффективного количества N-связанной гликозидазы в молоко.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения молочного продукта (например, йогурта), включающему добавление эффективного количества N-связанной гликозидазы и/или O-связанной глико-зидазы в молоко.
Уровень техники
Из уровня техники хорошо известны молочные продукты, такие как, например, ферментированные молочные продукты (например, йогурт).
Как известно из уровня техники, важными свойствами для соответствующих молочных продуктов являются вязкость и плотность геля.
Вообще говоря, если можно получить большую вязкость и/или плотность геля при использовании той же самой молочной композиции, можно получить ту же вязкость и/или плотность геля при использовании меньшего количества сухих веществ молока (или иных), это позволит сэкономить сырьевой материал (или получить больший выход).
Для ферментированных молочных продуктов с низким содержанием жира, таких как, например, йогурт с низким содержанием жира, может быть трудно получить оптимальную предпочтительную текстуру продуктов, точнее проблема может состоять, например, в получении в таких продуктах с низким содержанием жира текстуры с достаточно высокой вязкостью.
Стандартной процедурой для улучшения текстуры йогуртов с низким содержанием жира считается добавление белка, как правило, сухого обезжиренного молока или сывороточных белков. Однако такое решение может быть дорогостоящим и не полностью соответствует концепции низкокалорийных продуктов, поскольку добавленный белок вносит свой вклад в общую энергетическую ценность.
Для улучшения текстуры в US 2005/0095316 A1 абзац [0005] предлагается добавление так называемых текстурирующих агентов (загустители, желирующие агенты), таких как крахмал, пектин или желатин. Однако известно, например, что дополнительный пектин или желатин в йогуртовом продукте может быть не предпочтительным.
В последние годы так называемые текстурирующие культуры, основывающиеся на производстве внеклеточных полисахаридов (EPS), позволяют значительно улучшить вязкость таких молочных продуктов с низким содержанием жира, например, в документе WO 2007/095958 A1 (Chr. Hansen A/S) описывается, что штаммы Streptococcus thermophilus синтезируют EPS, который позволяет придавать заданную "тягучую" или вязкую текстуру ферментированным молочным продуктам.
Соответственно, можно сказать, что, например, для йогурта с низким содержанием жира проблема вязкости текстуры на сегодняшний день очень хорошо решается использованием, например, культур, продуцирующих ЕРС. Однако, как указано в статье A.N. Hassan et al. (J. Dairy Sci: 86: 1632-1638; 2003), так называемая плотность геля может значительно снижаться при использовании таких культур, продуцирующих EPS, по сравнению с культурами, не продуцирующими EPS.
Соответственно, можно сказать, что на сегодняшний день ситуация такова, что, например, для йо-гуртовых продуктов с низким содержанием жира существовавшая ранее проблема вязкости, по существу, решена за счет использования культур, продуцирующих EPS, однако использование культур, продуцирующих EPS, может "создавать" новые проблемы, связанные со снижением плотности геля.
В статье A.N. Hassan et al., в кратком изложении содержания указывается на снижение модулей вяз-коэластичности, специалисту известно, что модули вязкоэластичности являются признаком, относящимся к плотности геля, в том смысле, что, если продукт имеет более низкий модуль вязкоэластичности, он будет иметь более низкую плотность геля.
На фиг. 1, приложенной к статье, показано, что сдвиговое напряжение EPS йогуртов значительно выше, специалисту понятно, что это напрямую указывает на более высокую вязкость.
Как указано выше, для молочных продуктов в общем таких, как, например, ферментированные молочные продукты (например, йогурт), так называемая плотность геля является очень существенным свойством. Например, гель с низкой плотностью может вызвать нежелательные ощущения во рту при потреблении молочного продукта.
Дополнительно, если, например, йогурт имеет гель с низкой плотностью, он будет слишком жидким и легко текучим, например, на ложке или, например, в чашке.
Дополнительно, если, например, йогурт имеет гель с низкой плотностью, то он может быть склонен к синерезису (см. ниже) из-за отделения сыворотки.
Как хорошо известно из уровня техники, для получения сыра используют ферменты, свертывающие молоко, такие как протеаза - химозин (имеющий альтернативное название ренин), который вызывает коагуляцию и образование сгустка.
Как хорошо известно, получение сыра включает три стадии или три этапа, которые все происходят в результате добавления молокосвертывающего фермента: образование сгустка (или мягкого геля), отверждение или уплотнение сгустка и последующее удаление сыворотки, последний процесс также называется синерезис.
Как видно, например, при получении йогурта отсутствует заинтересованность в получении такого эффекта, как синерезис, т.е. разделение молока на сгусток из сухих веществ и жидкую сыворотку.
Соответственно, использование молокосвертывающих ферментов, таких как химозин, как правило, не является предпочтительным при получении, например, йогурта.
В US 2005/0095317 A1 (Danone) описывается применение протеазы с каппа-казеинолетической активностью в процессе получения ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт. Протеаза может, например, представлять химозин, см., например, [0028] в заявке US.
Протеазы (например, химозин) гидролизуют казеин в молоке, следовательно, можно предположить, что протеазы предположительно (например, химозин) могут вызвать при производстве йогурта нежелательный эффект синерезиса.
Однако в абзаце [0008] указывается, что удивительно и неожиданно было установлено, что использование протеаз, таких как "улучшение текстуры и, в частности, повышение вязкости йогуртов и ферментированного молока без индуцирования в результате синерезиса, который неприемлем для ферментированных молочных продуктов".
US 2005/0095316 А1 (Danone) по существу относится к той же самой технологии, что и приведенная выше в US 2005/0095317 A1 (Danone), однако в этой заявке US соответствующие протеазы определяют, как бактериальные протеазы (химозин получают от коров, т.е. он не является бактериальной протеазой).
В US 7560127 B2 (DSM) описывается применение специальных дегликозилирующих ферментов в процессе получения сыра. Дегликозилирующие ферменты определяют, как ферменты, которые могут дегликозилировать каппа-казеин (K-казеин), присутствующий в молоке. Как указано ниже, казеин представляет собой белок с так называемым О-связанным гликозилированием. Следовательно, указанные в этом патенте US дегликозилирующие ферменты представляют ферменты, которые могут дегликозилиро-вать O-связанные гликозилированные белки, такие как каппа-казеин (каппа-казеин представляет собой так называемый О-связанный гликопротеин).
См. в колонке 1, строки в патенте US 51-58.
"Неожиданно было обнаружено, что дегликозилирование K-казеина приводит к свертыванию за счет сахаров, связанных с ним, несущих отрицательный заряд, который стабилизирует мицеллы казеина. Свертывание молока, таким образом, в результате приводит к процессу, в котором большая часть K-казеина сохраняется в сыре, и может быть получен более высокий выход, чем при использовании проте-олитической активности химозина".
В общем можно сказать, что в патенте US 7560127 B2 по существу описывается, что можно получить при производстве сыра требуемое свертывание с использованием указанных родственных O-связанных дегликозилирующих ферментов вместо химозина. Поскольку этот патент US 7560127 B2 относится к получению сыра и в п.1 формулы изобретения указано, что он позволяет получить сыр без использования протеазы (такой как химозин), специалисту в области техники, к которой относится изобретение, косвенно понятно, что применение родственных О-связанных дегликозилирующих ферментов должно приводить к значительному синерезису.
Следует отметить, что US 7560127 B2 относится к производству сыра, где требуется значительный синерезис. Следовательно, специалист в данной области не будет ожидать, что его применение будет относиться к ферментированному молочному продукту, такому как йогурт, где синерезис, как правило, очень нежелателен.
Дополнительно, в US 7560127 B2 отсутствует явное указание на соответствующее свойство плотности геля, т.е. можно сказать, что оно явно указывает только на эффект свертывания/синерезиса, связанный с использованием вместо химозина указанных О-связанных дегликозилирующих ферментов.
В статье Е. Cases et al. (Journal of Food Science; vol. 68, № 8, 2003, pages 2406-2410) описывается дегликозилирование химически подкисленного молока О-связанным дегликозилирующим ферментом (нейраминидаза; EC 3.2.1.18).
Молоко химически подкислено химическим GDL (см. с. 2407, часть "Acid milk coagulation"), соответственно, в статье Е. Cases et al. не описывается "ферментированный молочный" продукт, инокулиро-ванный соответствующими микроорганизмами (например, йогурт).
В статье Е. Cases et al. описывается, что применение O-связанного дегликозилирующего фермента -нейраминидазы (EC 3.2.1.18) дает более высокую конечную плотность геля ферментативно обработанному или химически подкисленному молоку.
Следует отметить, что в статье Е. Cases et al. ничего не говорится о возможном эффекте синерезиса при использовании O-связанного дегликозилирующего фермента - нейраминидазы (EC 3.2.1.18). В статье Е. Cases et al., не приводятся соответствующие доказательства чистоты используемой нейраминидазы (EC 3.2.1.18) - препарата О-связанного дегликозилирующего фермента.
В связи с этим утверждается, что используемый ферментативный препарат может содержать некоторые соответствующие ферменты с протеазной активностью и что эти ферменты с протеазной активностью могут быть ответственны за описанный эффект плотности геля, как указано выше, в US 2005/0095317 A1 (Danone) описывается, что применение протеазы может улучшать плотность геля.
Значимость этого подозрения дополнительно усиливается тем фактом, что Clostridium perfringens -микроорганизм, продуцирующий нейраминидазу, из статьи Е. Cases et al. (см. часть Materials and Method), содержит более чем 140 протеолитических ферментов, см., например, авторитетную базу дан
ных по пептидазе Merops (Ошибка! Недопустимый объект гиперссылки. 83;type=peptidase).
При отсутствии информации о чистоте обеспеченного ферментного препарата, следовательно, представляется весьма вероятным, что он не был очищен для исключения всех соответствующих протео-литических ферментов, которые могут оказывать влияние на плотность геля, описанного в статье Е. Cases et al., article.
Как известно из уровня техники, О-связанный дегликозилирующий фермент - нейраминидаза (EC 3.2.1.18) также может обладать некоторой N-связанной гликозидазной активностью. Однако в указанной выше статье Е. Cases et al., указывается только О-связанная гликозидазная активность нейраминидазы (EC 3.2.1.18), когда соответствующие ферментативные активности нейраминидазы описаны в статье Е. Cases et al.
ЕР 1489135 А1 можно рассматривать, как связанный с применением дегликозилированного олеуро-пеина (получен из экстракта листьев оливы) для повышения плотности геля подкисленной молочной сыворотки и йогурта. Бета-гликозидаза (Р-1,6-глюкозидаза) и лактаза в этом документы указываются, как "просто" используемые для дегликозилирования олеуропеина, т.е. указанные ферменты не являются активными компонентами для повышения плотности геля молока/йогурта. Олеуропеин не представляет собой белок/пептид с ферментативной активностью. Способ по изобретению предпочтительно не включает добавление активированного экстракта листьев оливы (или других экстрактов), как описано в ЕР 1489135 А1, в субстрат молока животных.
Краткое описание
Решение проблемы настоящим изобретением состоит в обеспечении нового способа улучшения/повышения плотности геля соответствующего молочного продукта, например ферментированного молочного продукта, такого как йогурт, в частности ферментированного молочного продукта с низким содержанием жира, такого как йогурт с низким содержанием жира. Дополнительно, предпочтительно новый способ не оказывает негативного влияния на вязкость продукта.
Решение основывается на том, что авторы настоящего изобретения установили, что использование дегликозилирующего фермента (т.е. гликозидазы) позволяет получить молочный продукт (например, йогурт) со значительно повышенной/улучшенной плотностью геля. Дополнительно, авторы настоящего изобретения установили, что применение соответствующих гликозидаз может быть осуществлено способом, при котором не возникает указанный выше значительный эффект синерезиса, отсутствие значительного эффекта синерезиса является большим преимуществом, например, в отношении получения ферментированного молочного продукта, такого как йогурт. В частности, в отношении применения O-связанной гликозидазы авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что она может быть применена без значительного эффекта синерезиса. Также авторы настоящего изобретения установили, что применение дегликозилирующего фермента не оказывает негативного влияния на вязкость продукта.
В рабочем примере 4 по изобретению показано, что применение гликозидазы PNGаза-F позволяет получить йогурт с низким содержанием жира со значительно повышенной/улучшенной плотностью геля без оказания какого-либо негативного влияния на вязкость йогурта с низким содержанием жира.
Как указано в рабочем примере 1 по изобретению, ферментные препараты гликозидазы, используемые в рабочих примерах по изобретению, подверглись анализу, и в них не было обнаружено контами-нант, т.е. они не содержали контаминант, таких как ферменты с протеазной активностью. Следует отметить, что PNGаза-F представляет собой гликозидазу, которая работает на "N-связанных гликанах", т.е. дегликозилирует N-связанные гликопротеины.
Как указано выше, казеин представляет собой гликопротеин, содержащий О-связанные гликаны, и, следовательно, PNGаза-F не может как таковая дегликозилировать казеин, соответственно, причина, по которой PNGаза-F позволяет получить по изобретению хорошую плотность геля не является результатом, по сути относящимся к механизму дегликозилирования казеина, как, например, описано в US 7560127 B2 (см. выше).
Короче, и не желая быть ограниченными какой-либо теорией, тот факт, что авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что N-связанная гликозидаза, такая как PNGаза-F, работает в контексте настоящего изобретения (т.е. позволяет получить гель с улучшенной плотностью), иллюстрирует, что основной механизм, стоящий за получением в настоящей заявке соответствующего геля с улучшенной плотностью, полностью отличается от "гликозилирования казеина" - базового механизма, предложенного в US 7560127 B2 в отношении применения О-связанных гликозидаз в качестве заменителя химозина при получении сыра (см. выше).
Другими словами, можно сказать, что тот факт, что N-связанная гликозидаза, такая как PNGаза-F, работает в контексте настоящего изобретения (т.е. позволяет получить гель с улучшенной плотностью), является очень большой неожиданностью для специалиста в данной области в связи с предшествующим уровнем техники, как описано, например, в US 7560127 B2. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают возможным объяснением того, что применение глико-зидазы как таковой позволяет получить в настоящей заявке соответствующий гель с улучшенной плотностью, удаление гликозидазой гликанов из соответствующих не казеиновых белков сыворотки.
Например, N-связанная гликозидаза, такая как PNGаза-F, может удалять N-гликаны из некоторых из сывороточных гликопротеинов, таких как а-лактальбумин, который, как известно, N-гликозилирован. Сывороточные белки также в некоторой степени участвуют в образовании белковой сетки, что позволяет повысить свойство прочности геля.
Удаление гидрофильных гликанов и изменение заряда, вызванное реакцией деаминирования, может благоприятствовать образованию более ригидной белковой сетки и, следовательно, позволяет получить гель с улучшенной плотностью.
Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что некоторые соответствующие сывороточные гликопротеины также включают О-связанные гликаны. Соответственно, авторы настоящего изобретения провели тестирование на предмет того, позволяет ли О-связанная гликозидаза также в настоящем изобретении получить соответствующий гель с улучшенной плотностью.
В рабочем пример 5 по изобретению показано, что применение О-связанной гликозидазы, такой как GalNAC, также позволяет получить в настоящем изобретении соответствующий гель с улучшенной плотностью. С теоретической точки зрения можно предположить, что соответствующее преимущество применения N-связанной гликозидазы, такой как PNGаза-F, позволяет ограничить (или нет) нежелательный эффект синерезиса, например, в отношении получения йогуртового продукта.
Одной из причин для такой теоритической точки зрения является то, что N-связанная гликозидаза, такая как PNGаза-F, не работает на казеине и, как описано, например, в US 7560127 B2, позволяет получить требуемое свертывание (синерезис) при получении сыра при использовании указанных выше родственных O-связанных дегликозилирующих ферментов (для дегликозилирования казеина) вместо химозина.
В рабочем примере 4 по изобретению показано, что N-связанная гликозидаза - PNGаза-F позволяет избежать в настоящем изобретении нежелательного эффекта синерезиса в отношение получения йогурта.
Авторы настоящего изобретения провели тестирование нежелательного эффекта синерезиса в отношении, например, получения йогурта для О-связанной гликозидазы, такой как GalNAC.
Как показано в рабочем примере б по изобретению, можно говорить о том, что авторы настоящего изобретения неожиданно установили отсутствие нежелательного эффекта синерезиса в отношении получения йогурта при использовании О-связанной гликозидазы - GalNAC для получения йогурта.
В рабочем примере 4 по изобретению показано, что применение гликозидазы (здесь PNGаза-F) позволяет получить в настоящем изобретении соответствующий гель с улучшенной плотностью в обоих случаях, и в случае молочнокислых бактерий (LAB), и в случае химически подкисленного молока.
Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения предполагают, что влияние гликозидазы на плотность геля является физическим влиянием (т.е. дегликозилирование сывороточных белков, как указано выше) - а не биологическое влияние (т.е. влияние, при котором глико-зидаза по существу только оказывает негативное влияние иногда в отношении функциональности LAB, как таковой). В рабочих Примерах, приведенных выше, использовали молоко, уже прошедшее тепловую обработку, т.е. гликозидазный фермент добавляют в молоко после соответствующей тепловой обработки.
Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что гликозидаза, например, PNGаза-F, должна также работать (т.е. получить соответствующее улучшение плотности геля) при добавлении в сырое молоко (т.е. в не прошедшее тепловую обработку молоко) с последующим проведением соответствующей тепловой обработки.
Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения молочного продукта, включающему следующие стадии:
(i) добавление N-связанной гликозидазы и/или О-связанной гликозидазы в молочный субстрат; и
(ii) если требуется, подкисление (например, ферментирование) молочного субстрата, и/или если
требуется, проведение адекватной стадии (стадий) для получения молочного продукта, причем адекват-
ную стадию (стадии) проводят в условиях, при которых эффективное количество гликозидазы придает
молочному продукту - в результате ее присутствия повышенную плотность геля.
Молочный субстрат может быть выбран из группы, состоящей (таких как коровы, овцы, овецматки (ewes), козы, буйволицы или верблюдицы) и молока растительного происхождения (такое как соевое молоко, овсяное молоко, рисовое молоко, миндальное молоко).
Вариант выполнения по первому аспекту настоящего изобретения относится к способу получения молочного продукта, включающему следующие стадии:
(i) добавление эффективного количества N-связанной гликозидазы и/или О-связанной гликозидазы
в молочный субстрат; и
(ii) проведение адекватной стадии (стадий) для получения молочного продукта, где адекватную
стадию (стадии) проводят в условиях, при которых эффективное количество гликозидазы придает мо-
лочному продукту - в результате ее присутствия повышенную плотность геля;
при условии, что гликозидаза представляет собой только O-связанную гликозидазу (такую как а
галактозидаза, N-ацетил-галактозамидаза [GalNAC] и нейраминидаза), способную проводить дегликози-лирование К-казина, присутствующего в молоке, тогда молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, инокулированный соответствующими микроорганизмами (ферментированный молочный продукт не является сырным продуктом со значительным удалением молочной сыворотки).
Используемый в описании настоящего изобретения термин "эффективное количество гликозидазы, позволяющее получить в результате ее присутствия гель с повышенной плотностью в молочном продукте" стадии (ii) первого аспекта может быть в качестве альтернативы определен термином "эффективное количество гликозидазы, позволяющее получить в результате ее присутствия гель с улучшенной плотностью в молочном продукте".
Используемый в описании настоящего изобретения термин "проведение адекватной стадии (стадий) для получения молочного продукта" стадии (ii) следует понимать, как соответствующие адекватные стадии для получения интересующего молочного продукта (например, йогурта).
Очевидно, что специалист в данной области прекрасно осведомлен, что такая адекватная стадия(и), которая, например, при получении йогурта включает инокуляцию подходящими культурами кисломолочных бактерий (LAB).
Для специалиста в данной области рутинной является работа по измерению плотности геля интересующего молочного продукта (например, йогурта).
В рабочем примере 2 по изобретению обеспечен подходящий стандартный метод измерения плотности геля интересующего молочного продукта, предпочтительно в настоящем изобретении соответствующая плотность геля измеряется согласно методу, описанному в этом примере 2.
В статье A.N. Hassan et al. (J. Dairy Sci: 86: 1632-1638; 2003), указанной выше, также описывается подходящий стандартный метод измерения плотности геля.
См., например, раздел статьи материалы и методы, где определяют модуль эластичности и модуль вязкоэластичности, как можно видеть в примере 2 по изобретению, параметры модуля эластичности и модуля вязкоэластичности используют для определения плотности геля, из которых можно, если требуется, получить так называемый комплексный модуль, как описано в примере 2 по изобретению.
Поскольку специалист в данной области может легко измерить плотность геля интересующего молочного продукта, то для специалиста в данной области также легко определить требования к стадии (ii) способа по первому аспекту по изобретению, относящиеся к условию: "эффективное количество глико-зидазы, позволяющее получить в результате ее присутствия гель с улучшенной плотностью в молочном продукте".
Для определения этого требования специалист в данной области должен просто провести "адекватную стадию (стадии) для получения молочного продукта" стадии (ii) с или без присутствия эффективного количества гликозидазы, и затем определить в настоящем изобретении соответствующее влияние на плотность соответствующего геля добавленного количества гликозидазы.
Если устанавливают улучшенную/повышенную плотность геля, тогда в молочный субстрат в соответствии со стадией (i) первого аспекта добавлено эффективное количество гликозидазы, и адекватная стадия(и) стадии (ii) также была проведена в условиях, при которых эффективное количество гликозида-зы позволяет получить в результате ее присутствия гель с улучшенной плотностью в молочном продукте.
Специалисту в данной области известно, что различные методы измерения плотности геля могут давать различные результаты в абсолютных показателях. Однако в отношении измерения улучшенной плотности геля, как указано в настоящей заявке, по существу определяют относительное улучшение плотности геля, т.е. улучшение с или без присутствия эффективного количества гликозидазы.
Как понятно специалисту в данной области метод измерения плотности геля, как, например, описанный в рабочем примере 2 по изобретению и показанный статье A.N. Hassan et al. (с относительно малыми погрешностями измерения), будет давать те же самые относительные результаты, т.е. независимо от используемого специфического метода измерения будут получаться те же самые результаты в отношении относительного улучшения плотности геля. Условие способа по первому аспекту могут выглядеть, как отрицание по отношению к указанному выше в US 7560127 B2 и указанному в статье Е. Cases et al. (Journal of Food Science; vol. 68, № 8, 2003, с. 2406-2410).
Как указано выше, в статье Е. Cases et al., не описывается "ферментированный молочный" продукт, инокулирвоанный соответствующими микроорганизмами (например, йогурт).
Как указано выше, в US 7560127 B2 отсутствует явное указание на соответствующее свойство плотности геля, т.е. можно сказать, что оно явно указывает только на эффект свертывания/синерезиса, связанный с использованием вместо химозина указанных О-связанных дегликозилирующих ферментов.
Однако можно утверждать, что при добавлении в US 7560127 B2 указанных О-связанных деглико-зилирующих ферментов в молочный субстрат в процессе получения сырного молочного продукта, теоретически явно не было добавлено эффективное количество гликозидазы, что могло бы позволить получить соответствующий гель с улучшенной плотностью. Условие относится к ситуации, когда гликозида-за представляет собой только О-связанную гликозидазу, в US 7560127 B2 не указывается какая-либо ре-леватность в отношении применения N-связанной гликозидазы по изобретению, соответственно, если
эффективное количество гликозидазы (т.е. покрывает одну или более гликозидазу) добавлено на стадии (i) первого аспекта, может быть, например смесь N-связанной гликозидазы и О-связанной гликозидазы, то это может не быть ситуацией, когда гликозидаза представляет собой только О-связанную гликозидазу.
В контексте настоящего изобретения специалист в данной области может рутинно определить, является ли молочный продукт сырным продуктом, как указано в US 7560127 B2, или другим соответствующим молочным продуктом, таким как, например, ферментированный молочный продукт, такой как йогурт.
Определения
Используемый в описании настоящего изобретения термин "гликан" относится к полисахариду или олигосахариду. Гликаны могут представлять гомо- или гетерополимеры моносахаридных остатков и могут быть линейными или разветвленными. Гликан также может быть использован для указания углеводной части гликоконъюгата, такого как гликопротеин, гликолипид или протеогликан.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "гликопротены" относится к белкам, содержащим цепочки олигосахаридов (гликанов), ковалентно соединенных с боковыми цепями полипептида. Углевод соединен с белком в котрансляционной или посттрансляционной модификации.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "гликозидаза" (также называемая глико-зидная гидролаза) относится к ферменту, катализирующему гидролиз гликозидной связи, гликозидная связь представляет собой тип ковалентной связи, которая соединяет молекулу углевода (сахар) с другой группой, которая может быть или может не быть другим углеводом. Гликозидаза, которая частично или полностью дегликозилирует N-связанные гликаны, может быть определена в описании настоящего изобретения, как N-связанная гликозидаза. Аналогично, гликозидаза, которая частично или полностью дег-ликозилирует О-связанные гликаны, может быть определена в описании настоящего изобретения, как О-связанная гликозидаза.
Используемый в описании настоящего изобретения термин N-связанная гликозидаза является четко определенным термином в предшествующем уровне техники, и специалист в данной области знает, является ли специфическая гликозидаза интересующей N-связанной гликозидазой или нет.
Аналогично, используемый в описании настоящего изобретения термин О-связанная гликозидаза является четко определенным термином в предшествующем уровне техники, и специалист в данной области знает, является ли специфическая гликозидаза интересующей О-связанной гликозидазой или нет.
Также в описании настоящего изобретения гликозидаза может быть определена, как дегликозили-рующий фермент.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "гликозилирование" относится к ферментативному процессу, в котором гликаны присоединяются к белкам, липидам или другим органическим молекулам.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "N-связанные гликаны" относится к гликанам, присоединенным в норме к азоту боковой цепи аспарагина или аргинина. Используемый в описании настоящего изобретения термин "О-связанные гликаны" относится к гликанм, присоединенным в норме к гидрокси, кислороду боковой цепи серина, треонина, тирозина, гидроксилизина или гид-роксипролина или к кислороду на липидах, таких как церамиды.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "молочнокислые бактерии" относится к грамположительным микроаэрофильным или анаэробным бактериям, которые ферментируют сахара с продуцированием кислот, включая молочную кислоту как основную продуцируемую кислоту, уксусную кислоту и пропионовую кислоту. Наиболее используемые в промышленном производстве бактерии относятся к семейству "Lactobacillales", которое включает Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. и Propionibacterium spp. Дополнительно, бактерии, продуцирующие молочную кислоту, принадлежат к группе облигатных анаэробных бактерий, бифидобактерии, т.е. Bifidobacterium spp., как правило, включаются в группу молочнокислых бактерий. Их часто используют в качестве пищевых культур сами по себе или в комбинации с другими молочнокислыми бактериями.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "молочный субстрат" может представлять любое сырое и/или прошедшее технологическую обработку молочное сырье, которое может быть подвергнуто обработке (и возможно ферментировано) способом по изобретению. Следовательно, используемый молочный субстрат включает без ограничения растворы/суспензии любого молока или мо-локоподобных продуктов, включающих белок, таких как цельное молоко или молоко с низким содержанием жира, обезжиренное молоко, пахта, восстановленное сухое молоко, концентрированное молоко, сухое молоко, сыворотка, пермеат сыворотки, лактоза, маточная жидкость после кристаллизации лактозы, концентрат сывороточного белка или сливки. Очевидно, что молочный субстрат может быть получен от любого животного (млекопитающего) или не животного источника, например, он может представлять по существу чистое молоко или восстановленное сухое молоко. Предпочтительно по меньшей мере часть белка в молочном субстрате представляет собой белки, изначально присутствующие в молоке, такие как казеин или сывороточный белок. Однако часть белка может представлять белки, которые не являются изначально присутствующими в молоке. Перед ферментацией молочный субстрат может быть гомогени
зирован и пастеризован согласно способам по предшествующему уровню техники.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "молоко" включает в объем понятия секрет молочных желез, полученный доением млекопитающих, таких как коровы, овцы, козы, буйволицы или верблюдицы. В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения молоко представляет собой молоко коровы. Термин молоко также включает в объем понятия молоко не животного или растительного происхождения (например, из растительных или злаковых источников), такое как соевое молоко, овсяное молоко, рисовое молоко, миндальное молоко. Другие источники представляют хлопок, пшеницу, солод, кукурузу, картофель, бобы, люпины и сорго. Если требуется, молоко может быть подкислено, например, добавлением кислоты (такой как лимонная, уксусная или молочная кислота), или смешано, например, с водой. Молоко может представлять сырое или прошедшее обработку, например, фильтрацию, стерилизацию, пастеризацию, гомогенизацию и т.п. или может представлять восстановленное сухое молоко. Важным примером "коровьего молока" по изобретению является пастеризованное коровье молоко. Следует понимать, что молоко может быть подкислено, обработано гликозидазой, смешано или подвергнуто обработке перед, во время и/или после инокуляции бактериями.
В контексте настоящего изобретения термин молочный продукт представляет собой продукт, полученный обработкой молочного субстрата N или О-связанной глюкозидазой, если требуется, продукт также ферментируют или подкисляют. Термин включает в объем ферментированные молочные продукты (которые могут представлять питьевые, с нарушенным сгустком или с ненарушенным сгустком) и сыры.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "гомогенизация" относится к интенсивному перемешиванию с получением суспензии или эмульсии. В случае, когда гомогенизацию проводят перед ферментацией, она может быть проведена, таким образом, чтобы уменьшить размер молочного жира, таким образом, чтобы он больше не отделялся от молока. Это может быть достигнуто проталкиванием молока под давлением через маленькие отверстия.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "ферментация" относится к превращению углеводов в спирты или кислоты при воздействии микроорганизмов. Предпочтительно ферментация в способах по изобретению включает превращение лактозы в молочную кислоту.
Молочнокислые бактерии включают бактерии видов Lactobacillus sp. и Streptococcus thermophilus, которые, как правило, используют при производстве молочных продуктов в виде, как замороженных, так и лиофильных культур, для выращивания производственной закваски, или так называемых "культур прямого высевания" (DVS), предназначенных для непосредственной инокуляции в ферментер или бродильный чан для получения молочного продукта, такого как продукт из ферментированного молока. Такие культуры, как правило, указываются как "заквасочные культуры" или "закваски".
Если требуется, ферментированный молочный субстрат подвергают тепловой обработке для инактивации микроорганизмов.
Процесс ферментации, используемый для получения продуктов из ферментированного молока, хорошо известен, и специалист в данной области хорошо знает, как выбрать подходящие технологические условия, такие как температура, кислород, добавление углеводов, количество и характеристики микроор-ганизма(ов) и время обработки. Очевидно, что условия ферментации выбирают, таким образом, чтобы способствовать получению продукта по изобретению, т.е. получению ферментированного молочного продукта.
В контексте настоящего изобретения йогуртная заквасочная культура представляет собой предпочтительно бактериальную культуру, включающую по меньшей мере один штамм Lactobacillus, например штамм Lactobacillus bulgaricus, и по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus. В соответствии с настоящим изобретением йогурт представляет собой ферментированный молочный продукт, получаемый инокулированием и ферментированием молока штаммом Lactobacillus и штаммом Streptococcus thermophilus.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "густой (spoonable)" следует понимать, как потребляемый при использовании ложки. Используемый в описании настоящего изобретения термин "густой молочный продукт" включает в свой объем продукты с нарушенным сгустком. Используемый в описании настоящего изобретения термин "продукт с нарушенным сгустком", в частности, относится к продукту из ферментированного молока, который подвергают механической обработке после ферментации, с получением в результате разрушенного и ожиженного сгустка, полученного на стадии ферментации. Как правило, механическую обработку без ограничения проводят перемешиванием, перекачиванием, фильтрацией или гомогенизацией геля или смешиванием с другими ингредиентами.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "продукт с ненарушенным сгустком" включает в объем понятия продукт на основе молока, инокулированный заквасочной культурой, например, стартовой культурой, и упакованный после стадии инокуляции с последующей ферментацией в упаковке.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "питьевой продукт" включает в объем понятия напитки, такие как "питьевой йогурт" и аналогичное им. Используемый в описании настоящего изобретения термин "питьевой продукт" включает напитки, такие как "питьевой йогурт" и аналогичное
им. Используемый в описании настоящего изобретения термин "питьевой йогурт", как правило, включает в объем понятия молочный продукт, полученный ферментацией комбинацией видов Lactobacillus и Streptococcus thermophilus. Как правило, питьевой йогурт имеет содержание обезжиренных сухих веществ молока 8% или более. Дополнительно, количество культуры живых бактерий в питьевых йогуртах, как правило, составляет по меньшей мере 106 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл.
Детальное описание
Молочный продукт.
Говоря по сути, pH предпочтительного молочного продукта по изобретению, включающего молочный продукт (т.е. продукт на основе молока животных), имеет значение от 36,5; более предпочтительно pH от 3,5 до 5,75.
Как известно специалисту в данной области можно получить соответствующий pH молочного продукта, например, ферментацией подходящей культурой молочнокислых бактерий.
Однако, как известно специалисту в данной области можно просто добавить подходящую кислоту (такую как молочная кислота) с получением требуемого pH.
В качестве альтернативы, может быть добавлен лактон (например, GDL лактон) с получением требуемого pH или при использовании других подходящих способов (например, ферментативные способы или обработкой диоксидом углерода с приложением высокого давления) с получением заданного pH.
Как указано выше, применение гликозидазы для улучшения плотности геля может быть по существу полезно в отношении так называемых молочных продуктов с низким содержанием жира.
Соответственно, в предпочтительном варианте выполнения по изобретению молочный субстрат, используемый на стадии (i) способа по первому аспекту, представляет собой молочный субстрат с низким содержанием жира, т.е. с содержанием жира менее чем 3,5%; более предпочтительно с содержанием жира менее чем 1,5% и еще более предпочтительно с содержанием жира менее чем 0,75%.
Как указано выше, преимуществом применения гликозидазы для улучшения плотности геля является отсутствие необходимости в повышении содержания белка, например, в молочном продукте с низким содержанием жира, для получения достаточно адекватной плотности геля, минимизируя, таким образом, дополнительно общую калорийность/энергетическую ценность готового молочного продукта с низким содержанием жира (например, йогурта с низким содержанием жира).
Соответственно, в предпочтительно варианте выполнения по изобретению готовый молочный продукт (например, йогурт) имеет общую калорийность/энергетическую ценность менее чем 150 килокалорий на 100 г молочного продукта, более предпочтительно готовый молочный продукт (например, йогурт) имеет общую калорийность/энергетическую ценность менее чем 100 килокалорий на 100 г молочного продукта.
Для специалиста в данной области рутинной является работа по определению калорийности интересующего молочного продукта.
Подходящим примером молочного продукта является ферментированный молочный продукт или
сыр.
В предпочтительном варианте выполнения по изобретению молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт.
В предпочтительном варианте выполнения по изобретению ферментированный молочный продукт представляет собой, по меньшей мере, ферментируемый молочный продукт, выбираемый из группы, состоящей из йогурта, йогурта на альтернативной культуре, пахты, ацидофильного молока, кефира, кумыса и творога-кварка. Наиболее предпочтительно ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт.
В контексте настоящего изобретения термины "йогурт" и "ферментированное молоко" имеют их обычные значения. В US 2005/0095316 A1 и US 2005/0095317 A1 (оба от Danone) эти термины определяют в соответствии с соответствующим официальным указом/нормой во Франции, ниже по существу приведена ссылка на те же самые известные определения этого термина.
Как известно специалисту в данной области для получения "йогурта или ферментированного молочного" продукта по существу признано, что не должно быть существенного удаления молочной сыворотки и что должна быть проведена тепловая обработка, по меньшей мере, эквивалентная пастеризации.
Подходящей релевантной тепловой обработкой для получения ферментированного молочного продукта, такого как, например йогурт, является, например, тепловая обработка при температуре от 85 до 98°С в течение от 15 с до 30 мин.
При применении тепловой обработки, которая является, по меньшей мере, эквивалентной стандартной пастеризации, белки молочной сыворотки молочного субстрата денатурируют в большей или меньшей степени (около от 25 до 99% белков).
Как очевидно специалисту в данной области, поскольку для йогурта или ферментированного молочного продукта "не должно быть значительного удаления молочной сыворотки", то йогурт или ферментированный молочный продукт не является сырным продуктом, как указано в US 7560127 B2 (см. выше).
Используемый в описании настоящего изобретения термин "ферментированное молоко" относится
к молочному продукту, полученному из обезжиренного или не обезжиренного молока, концентрированного или порошкообразного молока, обогащенного или не обогащенного составляющими молока, которое было подвергнуто тепловой обработке, по меньшей мере, эквивалентной пастеризации, инокулиро-вано микроорганизмом, принадлежащим к видам, которые являются или не являются характерными для каждого продукта.
Содержание свободной молочной кислоты предпочтительно не должно составлять более чем 0,6 г на 100 г на момент продажи потребителю.
Ферментированное молоко должно предпочтительно сохраняться вплоть до момента продажи потребителю при температуре, предотвращающей его порчу.
Используемый в описании настоящего изобретения термин "йогурт" относится к ферментированному молочному продукту, полученному согласно принятым и традиционным нормам, предпочтительно за счет развития специфических термофильных молочнокислых бактерий, таких как Lactobacillus del-bruekii подвид bulgaricus и Streptococcus thermophilus, которые предпочтительно должны быть инокули-рованны одновременно и предпочтительно остаются живыми в готовом продукте в количестве по меньшей 10 миллионов бактерий на 1 г в отношении молокосодержащей части.
Ферментированный молочный продукт в норме получают:
(A) инокулированием от 105 до 1013 КОЕ/мл (предпочтительно от 106 до 1011 КОЕ/мл) культурой молочнокислых бактерий (LAB) субстрата; и
(B) ферментированием молочного субстрата в течение от 2 до 120 ч при температуре от 10°С до
55°С.
Как известно специалисту в данной области подходящие виды молочнокислых бактерий включают Bifidobacterium, Lactobacillus (такие как Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, Lactobacillus acidophi-lus, Lactobacillus casei или Lactobacillus helveticus), Streptococcus (такой как Streptococcus thermophilus), Lactococcus (такой как Lactococcus lactis), Leuconostoc (такие как Leuconostoc lactis, Leuconostoc mes-enteroides).
Когда молочный субстрат инокулируют (ферментом, продуцируемым) штаммами Lactobacillus del-brueckii подвид bulgaricus и Streptococcus thermophilus, как правило, продукт определяют как йогурт.
Как известно из уровня техники, термин "йогурт на альтернативной культуре" относится к ферментированному молочному продукту, полученному при использовании культур Streptococcus thermophilus и любой Lactobacillus species.
Как известно из уровня техники, термин "ацидофильное молоко" относится к ферментированному молочному продукту, полученному при использовании культуры Lactobacillus acidophilus.
Как известно из уровня техники, термин "кефир" относится к ферментированному молочному продукту, полученному при использовании заквасочной культуры, полученной из кефирного грибка, Lacto-bacillus kefiri, видов рода Leuconostoc, Lactococcus и Acetobacter, растущих в сильно специфических взаимоотношениях. Кефирные грибки состоят из обоих, и дрожжей, ферментирующих лактозу (Kluyvero-myces marxianus), и дрожжей, ферментирующих не лактозу (Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cer-evisiae и Saccharomyces exiguus).
Как известно из уровня техники, термин "кумыс" относится к ферментированному молочному продукту, полученному при использовании культур Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Kluyveromy-ces marxianus.
В предпочтительном варианте выполнения по изобретению молочный продукт представляет собой йогурт, где йогурт получают инокуляцией культурой йогуртных молочнокислых бактерий, включающих Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Streptococcus thermophiles, способных синтезировать внеклеточные полисахариды (EPS), этот предпочтительный вариант выполнения по изобретению может быть по существу соответствующим, если йогурт представляет собой йогурт с низким содержанием жира, т.е. когда молочный субстрат, используемый на стадии (i) способа по первому аспекту, представляет собой молочный субстрат с низким содержанием жира, т.е. с содержанием жира менее чем 3,5% жира, более предпочтительно с содержанием жира менее чем 1,5% и еще более предпочтительно с содержанием жира менее чем 0,75%.
Как указано выше, в предшествующем уровне техники описывается множество таких штаммов Streptococcus thermophiles, которые продуцируют EPS, см., например, WO 2007/095958 A1 (Chr. Hansen
A/S).
Соответственно, специалист в данной области может рутинным образом определить количество таких EPS, продуцируемых штаммами, и также он может рутинным образом определить, способен ли интересующий штамм синтезировать EPS или нет.
Пример по изобретению позволяет компании разработать соответствующий теоретический бизнес-сценарий с получением концентрированного молока/сухого молока при использовании гликозидазы, как описано в настоящем изобретении, и затем продать это концентрированное молоко/сухое молоко, например, производителю йогурта, который использует его в процессе получения йогурта с получением йогурта с улучшенной/повышенной плотностью геля без дополнительного добавления, таким образом, гликозидазы в процессе получения йогурта как такового.
Как понятно специалисту в данной области такой теоретический бизнес-сценарий может быть примером способа по перовому аспекту настоящего изобретения, как указано выше. Концентрированное молоко/сухое молоко рассматривается, как пример молочного продукта, полученного способа по первому аспекту. Дополнительно, как понятно специалисту в данной области в контексте настоящего изобретения готовый йогурт будет иметь улучшенную/повышенную плотность геля из-за проведенного ранее добавления гликозидазы в молоко, т.е. производитель йогурта также реализует цель способа по первому аспекту, как указано выше.
Гликозидаза.
Как указано выше, используемый в описании термин "гликозидаза" (также называемая гликозидная гидролаза) относится к ферменту, катализирующему гидролиз гликозидной связи, гликозидная связь представляет собой тип ковалентной связи, которая соединяет молекулу углевода (сахар) с другой группой, которая может быть или может не быть другим углеводом.
Как указано выше, гликозидаза также может быть определена, как дегликозилирующий фермент. Гликозидаза может представлять натуральную гликозидазу, или она может представлять вариант/мутант натуральной гликозидазы, как известно специалисту в данной области можно получить мутантные варианты интересующего фермента (здесь гликозидаза), например, для улучшения стабильности фермента при сохранении ключевой ферментативной активности (здесь гликозидазная активность) фермента. Например, для получения минимального нежелательного синерезиса (в частности, если молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, такой как йогурт) может быть предпочтительно, чтобы гликозидаза представляла N-связанную гликозидазу.
Как указано выше, используемый в описании настоящего изобретения термин "N-связанная глико-зидаза" является четко определенным термином в предшествующем уровне техники, и специалист в данной области знает, является ли специфическая гликозидаза интересующей N-связанной гликозидазой или нет. Дополнительно, в предшествующем уровне техники описано множество подходящих N-связанных гликозидаз.
Примеры подходящих для настоящего изобретения N-связанных гликозидаз могут представлять по меньшей мере одну гликозидазу, выбираемую из группы, состоящей из пептид-^4)-^-ацетил-р-глюкозамил)аспарагинамидазы (EC номер: 3.5.1.52; альтернативные названия: ^гликозидаза^ или PNGаза-F) и эндо-р-№ацетилглюкозамидазы Н (EC номер: 3.2.1.96; альтернативное название ENDO-H).
Указанные непосредственно выше N-связанные гликозидазы могут быть в контексте настоящего изобретения описаны, как гликозидазы, которые обладают N-связанной гликозидазной активностью и не обладает значительной О-связанной гликозидазной активностью.
Соответственно, в настоящем изобретении может быть предпочтительно, чтобы N-связанная гликозидаза представляла N-связанную гликозидазу, которая не обладает соответствующей O-связанной гликозидазной активностью (такой как не О-связанная гликозидазная активность). N-глтикозидаза-Е, также известная как PNGаза-F, используемая в способе, представляет собой аспарагинамидазу (EC 3.5.1.52), которая может быть получена из Flavobacterium mesingosepticum. Она катализирует полное и интактное (intact) расщепление N-связанных олигосахаридов от гликопротеинов (It catalyses the complete and intact cleavage of N-linked oligosaccaharides from glycoproteins). Доступна как коммерческий продукт от New England Biolabs Inc. под торговой маркой PNGase-F или получена рекомбинантно в штамме, таком как Escherichia coli, как было осуществлено авторами настоящего изобретения при использовании плазмид и способа, описанного в рабочем примере 1 по изобретению.
Эндо-р-№ацетилглюкозамидаза Н (EC 3.2.1.96), также известная как ENDO-H, может быть получена из Streptomyces plicatus. ENDO-H катализирует гидролиз гликозидной связи между двумя N-ацетилгликозаминами N-связанных гликозилатов (glycosylations). Доступна как коммерческий продукт от New England Biolabs Inc. под торговой маркой ENDO-H.
Примеры подходящих для настоящего изобретения O-связанных гликозидаз могут представлять по меньшей мере одну гликозидазу, выбираемую из группы, состоящей из a-N-ацетил-галактозамидазы (EC номер: 3.2.1.49; альтернативное название: GalNAC); а-галактозидазы (EC номер: 3.2.1.22); и нейраминидазы (EC номер: 3.2.1.18).
GalNAC представляет собой высоко специфичную экзогликозидазу, катализирующую гидролиз остатков а-связанного D-N-ацетил-галактозамина. Доступна как коммерческий продукт от New England Biolabs Inc.
Как указано выше, используемый в описании настоящего изобретения термин О-связанная глико-зидаза является четко определенным термином в предшествующем уровне техники, и специалист в данной области знает, является ли специфическая гликозидаза интересующей О-связанной гликозидазой или нет. Дополнительно, в предшествующем уровне техники описано множество подходящих O-связанных гликозидаз.
Эффективное количество/активность гликозидазы в настоящем изобретении определяют согласно предшествующему уровню техники.
Согласно предшествующему уровню техники для N-связанной гликозидазы (такой, как например,
PNGase-F и Endo-H) единицу активности определяют, как количество фермента, требуемое для удаления > 95% углеводов из 10 мкг денатурированной RNGазы-B в течение 1 ч при температуре 37°C в общем реакционном объеме 10 мкл.
Для GalNAC (О-связанная гликозидаза) единицу активности определяют, как количество фермента, требуемое для расщепления > 95% терминального а^-^ацетил-галактозамина из 1 нмоль (Gal-NAca 1-3)(Fuca 1-2)Gala 1-4Glc-7-амино-4-метил-кумарина (АМС), в течение 1 ч при температуре 37°C в общем реакционном объеме 10 мкл.
Множество соответствующих гликозидазных ферментов коммерчески доступно от компании New England Biolabs, также сделана ссылка на каталог продуктов New England Biolabs (как, например, доступно он-лайн на их сайте) для дополнительных деталей в отношении специфических стандартных определений соответствующих единиц гликозидазной активности.
Стадия (i) способа по первому аспекту.
Стадия (i) описанного способа по первому аспекту настоящего изобретения представляет: "(i): добавление эффективного количества N-связанной гликозидазы и/или O-связанной гликозидазы в молочный субстрат".
Как понятно специалисту в данной области в контексте настоящего изобретения N-связанную гликозидазу и/или O-связанную гликозидазу в норме добавляют в субстрат в качестве композиции по существу чистой гликозидазы, например, композиция гликозидазы, где гликозидазная активность составляет по меньшей мере 5% от общей ферментативной активности композиции гликозидазы, как таковой. Это может быть композиция гликозидазы, где гликозидазная активность составляет по меньшей мере 25% от общей ферментативной активности композиции гликозидазы, или композиция гликозидазы, где гликози-дазная активность составляет по меньшей мере 50% от общей ферментативной активности композиции гликозидазы.
Предпочтительно такая композиция по существу чистой гликозидазы представляет собой композицию гликозидазы, где гликозидазная активность составляет по меньшей мере 90% от общей ферментативной активности композиции гликозидазы.
Эффективное количество гликозидазы может быть представлено одним специфическим типом гли-козидазы (например, PNGаза-F) или смесью соответствующих гликозидазных ферментов (например, двух различных N-связанных гликозидаз или одной N-связанной и одной О-связанной гликозидаз). Когда в описании настоящего изобретения указывается, что предпочтительно, чтобы гликозидаза, добавленная на стадии (i) способа первого аспекта, представляла N-связанную гликозидазу, это конечно означает, что должно быть добавлено эффективное количество N-связанной гликозидазы на стадии (i), и эта N-связанная гликозидаза позволяет получить в результате ее присутствия гель с улучшенной плотностью в молочном продукте.
Однако когда указывается, что N-связанная гликозидаза является предпочтительной, это не значит, что на стадии (i) не должна добавляться какая-либо О-связанная гликозидаза.
То же самое применимо в описании настоящего изобретения, когда указывается, что О-связанная гликозидаза является предпочтительной, т.е. должна быть добавлена О-связанная гликозидаза на стадии (i), но также может быть добавлена N-связанная гликозидаза.
Напротив и как очевидно специалисту в данной области, когда в описании настоящего изобретения указывается, что гликозидаза представляет собой только О-связанную гликозидазу, тогда на стадии (i) первого аспекта не должна быть добавлена N-связанная гликозидаза. То же самое применимо в описании настоящего изобретения, когда указывается, что гликозидаза представляет собой только N-связанную гликозидазу, тогда на стадии (i) первого аспекта не должна быть добавлена О-связанная гликозидаза. Как известно из уровня техники, молочный продукт, как правило, проходит тепловую обработку. Как известно из уровня техники, при тепловой обработке, как правило, используют температуру ниже кипения, поскольку при очень высоких температурах, мицеллы казеина необратимо агрегируют (или "сворачиваются").
В контексте настоящего изобретения используемый в описании настоящего изобретения термин "пастеризованный" в отношении пастеризованного молочного продукта относится к стадии стандартной пастеризации (т.е. при использовании подходящей тепловой обработки молока). В контексте настоящего изобретения очевидно, что специалист в данной области знает, является ли интересующий специфический молочный продукт пастеризованным молочным продуктом или нет. Как понятно специалисту в данной области стадия стандартной пастеризации может представлять тепловую обработку при температуре около 71-72°C в течение около 15-20 с.
Как указано выше, для получения "йогурта или ферментированного молочного" продукта по существу признано, что не должно быть существенного удаления молочной сыворотки и что должна быть проведена тепловая обработка, по меньшей мере, эквивалентная пастеризации.
Подходящая соответствующая тепловая обработка для получения ферментированного молочного продукта, такого, например как йогурт, представляет, например, тепловую обработку при температуре от 85 до 98°C в течение от 15 с до 30 мин.
В зависимости от типа используемой тепловой обработки, тепловая обработка может представлять
тепловую обработку молока при температуре от 65 до 150°C от доли секунды до 30 мин.
Как указано выше, когда молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт такой, например как йогурт, должна быть проведена тепловая обработка, по меньшей мере, эквивалентная пастеризации.
Гликозидаза на стадии (i) может быть добавлена перед или после стадии тепловой обработки, т.е. тепловой обработки при температуре от 65 до 150°C от доли секунды до 30 мин. В некоторых случаях может быть предпочтительно, чтобы гликозидазу добавляли в уже прошедшее тепловую обработку молоко. Как указано выше, когда молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, молочный субстрат инокулируют и ферментируют соответствующей культурой молочнокислых бактерий (LAB).
Когда молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, гликозидаза может быть добавлена перед, вместе или после инокуляции молочного субстрата культурой молочнокислых бактерий (LAB).
В отношении молочного продукта в целом может быть предпочтительно, чтобы гликозидазу добавляли перед достижением pH молочного субстрата ниже 6.
В отношении ферментированного молочного продукта предпочтительно добавление гликозидазы перед окончанием процесса ферментации соответствующими молочнокислыми бактериями, т.е. предпочтительно до достижения pH молочного субстрата ниже 6. Авторы настоящего изобретения считают, что добавление от 10 единиц активности гликозидазы на мл молока до 1000 единиц активности на мл молока достаточно для достижения эффективного количества гликозидазы, т.е. достаточно для достижения соответствующей улучшенной плотности геля.
В соответствии с конкретными целями можно добавлять больше глтикозидазы, например, вплоть до 20000 единиц активности гликозидазы на мл молока. Как указано выше, эффективное количество/активность гликозидазы в настоящем изобретении определяют согласно предшествующему уровню техники.
Стадия (ii) способа по первому аспекту.
Стадия (ii) описанного способа по первому аспекту настоящего изобретения представляет: "(ii) проведение адекватной стадии (стадий) для получения молочного продукта, где адекватную стадию (стадии) проводят при условиях, что эффективное количество гликозидазы позволяет получить в результате ее присутствия гель с улучшенной плотностью в молочном продукте".
Как указано выше, проведение адекватной стадии (стадий) для получения интересующего молочного продукта является рутинной работой для специалиста в данной области, например, если молочный продукт представляет, например, йогурт, специалист в данной области конечно, знает адекватную стадию (стадии) для получения интересующего йогурта.
В отношение условий, что эффективное количество гликозидазы позволяет получить гель с улучшенной плотностью в молочном продукте, очевидно, что эти условия, должны представлять условия, при которых гликозидазный фермент остается активным в течение достаточного периода времени.
Как показано в рабочих Примерах по изобретению, авторы настоящего изобретения определили, что множество различных гликозидазных ферментов обладают подходящей активностью в течение нормальных подходящих условий (например, температура, pH и т.п.) для получения соответствующего молочного продукта, такого как йогурт.
Короче и как понятно специалисту в данной области предпочтительные условия для получения предпочтительной соответствующей гликозидазной активности в настоящем изобретении зависят от используемого специфического гликозидазного фермента(ов) (например, PNGаза-F) и получаемого специфического молочного продукта (например, йогурт).
В контексте настоящего изобретения примеры подходящих условий реакции для гликозидазы, позволяющие получить соответствующий гель с улучшенной плотностью, могут представлять
температуру от 10 до 50°C (такую как от 20 до 40°C);
pH от 3 до 9 (такой как pH от 4 до 7,5; от 3 до 7 или от 3 до 6,5);
период времени от 10 мин до 120 ч (такой как от 1 до 120 ч или от 0,5 до 5 ч).
В предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения присутствие гликозидазы на стадии (ii) позволяет получить в 1,25 раз улучшенную плотность геля в молочном продукте; более предпочтительно в 1,50 раз улучшенную плотность геля в молочном продукте и еще более предпочтительно присутствие гликозидазы на стадии (ii) позволяет получить в 1,7 раз улучшенную плотность геля в молочном продукте.
Как указано выше, авторы настоящего изобретения установили, что применение гликозидазы не оказывает негативного влияния на вязкость готового молочного продукта.
Соответственно, в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения стадию (ii) проводят в условиях, при которых эффективное количество гликозидазы в результате ее присутствия не оказывает негативного влияния на вязкость молочного продукта.
Для специалиста в данной области рутинной работой является измерение вязкости интересующего молочного продукта (например, йогурта).
В рабочем примере 2 по изобретению приведен подходящий стандартный способ измерения вязкости интересующего молочного продукта, предпочтительно в настоящем изобретение соответствующую вязкость измеряют согласно способу по примеру 2.
В статье A.N. Hassan et al. (J. Dairy Sci: 86: 1632-1638; 2003) также описывается подходящий стандартный способ измерения вязкости.
См., например, раздел материалы и методы (materials and method) на фиг. 1, приложенной к статье, где показано определенное сдвиговое напряжение, как можно видеть в примере 2 описания изобретения, параметр сдвигового напряжения используют в качестве показателя для измерения вязкости.
Поскольку специалисту в данной области легко измерить вязкость интересующего молочного продукта, то специалисту в данной области конечно же, легко определить предпочтительный вариант выполнения стадии (ii) способа по первому аспекту относительно того, если: "стадию (ii) проводят в условиях, при которых эффективное количество гликозидазы в результате ее присутствия не оказывает негативного влияния на вязкость молочного продукта".
Для определения этого требования специалист в данной области должен просто провести "адекватную стадию (стадии) для получения молочного продукта" стадии (ii) с или без присутствия эффективного количества гликозидазы, и затем определить в настоящем изобретении соответствующее влияние на вязкость добавленного количества гликозидазы.
Как можно видеть в рабочих примерах по изобретению, фактически можно получить улучшенную вязкость при использовании гликозидазы, как указано в описании настоящего изобретения.
Соответственно, в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения присутствие гликозидазы на стадии (ii) позволяет получить в 1,10 раз повышенную вязкость молочного продукта; более предпочтительно в 1,20 раз повышенную вязкость молочному продукту.
Как понятно специалисту в данной области метод измерения вязкости, как, например, описанный в рабочем примере 2 по изобретению и показанный статье A.N. Hassan et al. (с относительно малыми погрешностями измерения), будет давать те же самые относительные результаты, т.е. независимо от используемого способа измерения будут получаться те же самые результаты в отношении относительного улучшения вязкости.
Как указано выше, в рабочих примерах по изобретению показано, что обе, и N-связанная, и О-связанная гликозидаза не приводят к возникновению нежелательного эффекта синерезиса в отношении получения йогурта.
Соответственно, в предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения стадию (ii) проводят в условиях, при которых эффективное количество гликозидазы в результате ее присутствия не повышает эффект синерезиса у молочного продукта.
Это не повышает эффект синерезиса, в частности соответствующе, когда молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт, такой как, например, йогурт.
Для специалиста в данной области рутинной работой является измерение эффекта синерезиса интересующего молочного продукта (например, йогурта).
В рабочем примере 3 по изобретению приведен подходящий стандартный способ измерения сине-резиса интересующего молочного продукта, предпочтительно в настоящем изобретении соответствующий синерезис измеряют согласно способу по примеру 3.
По существу стандартный способ измерения эффекта синерезиса по примеру 3 основывается собственно на соответствующем хранении интересующего молочного продукта и измерении количества сыворотки в верхней части интересующего молочного продукта.
Поскольку специалисту в данной области легко измерить синерезис интересующего молочного продукта, то специалисту в данной области конечно же, легко определить предпочтительный вариант выполнения стадии (ii) способа по первому аспекту относительно того, если "стадию (ii) проводят в условиях, при которых эффективное количество гликозидазы в результате ее присутствия не приводит к синерезису молочного продукта".
Для определения этого требования специалист в данной области должен просто провести "адекватную стадию (стадии) для получения молочного продукта" стадии (ii) с или без присутствия эффективного количества гликозидазы, и затем определить в настоящем изобретении соответствующее влияние на синерезис добавленного количества гликозидазы.
Также настоящее изобретение относится к способу получения молочного продукта, указанный способ включает:
a) получение молочного субстрата;
b) обработку молочного субстрата ферментом с N-связанной гликозидазной активностью; и
c) если требуется, ферментацию молочного субстрата микроорганизмом, таким как молочнокислые бактерии.
В интересующем варианте выполнения настоящего изобретения стадию b) проводят перед или во время стадии c).
Как указано выше, молочный субстрат может быть из любого животного или не животного источника. Молочный продукт предпочтительно получают по существу без или полностью без добавления
загустителя и/или стабилизатора, такого как пектин, желатин, крахмал, модифицированный крахмал, каррагенан, альгинат и гуаровая камедь. В интересующем варианте выполнения настоящего изобретения микроорганизм представляет собой молочнокислые бактерии и/или микроорганизмы, продуцирующие полисахариды, такие как экзополисахариды (EPS).
Микроорганизм может представлять молочнокислые бактерии, предпочтительно принадлежащие к видам, выбираемым из группы, состоящей из Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii подвид Bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremo-ris, Pseudoleuconostoc mesenteroides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовариант diacetylactis, Lactobacillus casei подвид Casei, Lactobacillus paracasei подвид Paracasei, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum.
Интересующие варианты выполнения любого способа по изобретению представляют
способ, где молочный субстрат подвергают пастеризации перед подкислением, и ферментативную обработку проводят перед пастеризацией;
способ, где молочный субстрат подвергают тепловой обработке перед обработкой ферментом, обладающим N-связанной гликозидазной активностью;
способ, где молочный продукт выбирают из группы, состоящей из ферментированного молочного продукта с ненарушенным сгустком, питьевого ферментированного молочного продукта и густого (spoonable) ферментированного молочного продукта;
способ, где молочный продукт имеет содержание сухих обезжиренных веществ молока менее чем
8%;
способ, где молочный продукт имеет содержание жира менее чем 2%;
способ, где молочный продукт имеет содержание жира менее чем 0,5%;
способ, где молочный продукт расфасовывают (т.е. способ включает расфасовку); и/или
способ, где гликозидазу выбирают из группы, состоящей из а^-ацетил-галактозамидазы; GalNAC); а-галактозидазы; нейрамидазы; пептид^(4)-^-ацетил-р-глюкозамил) аспарагинамидазы; N-глюкозидазы-F; RNGазы-F; эндо-р-№ацетилглюкозамидазы Н; ENDO-H и любого фермента, классифицированного в EC 3.2.1.49, EC 3.2.1.18, EC 3.2.1.22, EC 3.5.1.52, или EC 3.2.1.96.
В контексте настоящего изобретения используемый в описании настоящего изобретения термин "расфасовка" (подходящее количество продукта в подходящей упаковке) относится к готовому расфасованному продукту с получением продукта в продаваемой форме, таким образом, что продукт может быть потреблен, например, индивидуумом или группой индивидуумов. Подходящей упаковкой может быть бутылка, контейнер, пакет или аналогичное им, и подходящее количество может составлять, например, от 10 или до 5000 мл, но, по существу, предпочтительно количество в упаковке составляет от 50 до 1000 мл. Такой расфасованный продукт является частью настоящего изобретения.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к молочному продукту, получаемому способом по изобретению.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к молочному продукту, получаемому способом, включающим добавление N-связанной гликозидазы и/или О-связанной гликозидазы в молочный субстрат. Для достижения заданной плотности геля гликозидаза должна быть добавлена в "эффективном количестве".
Молочные продукты по изобретению могут быть ферментированы инокуляцией культурой молочнокислых бактерий перед и/или во время и/или после обработки гликозидазой. Молочный продукт может быть расфасован, например, в укупоренный контейнер объемом в пределах от 10 до 5000 мл, такой как контейнер объемом от 25 до 1500 мл или объемом от 50 до 1000 мл.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению N-связанной глюкозидазы в способе получения молочного продукта, такого как ферментированный молочный продукт (такого как йогурт) или сыр (такого как молодой незрелый сыр, мягкий сыр с низкой жирностью, творог-кварк и т.п.).
Также настоящее изобретение относится к применению N-связанной глюкозидазы в способе улучшения текстуры (такой как плотность геля) молочного продукта, такого как ферментированный молочный продукт (такого как йогурт) или сыр (такого как, молодой незрелый сыр, мягкий сыр с низкой жирностью, творог-кварк и т.п.).
По существу в предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к применению фермента, обладающего N-связывающей и/или О-связывающей гликозидазной активностью, для улучшения ощущения во рту при потреблении молочного продукта, такого как йогурт.
Применение может включать таковое, где молочный продукт был получен при использовании молочнокислых бактерий, продуцирующих полисахариды, такие как экзополисахариды(EPS).
Используемые в описании настоящего изобретения (в частности, в приложенной формуле изобретения) формы единственного числа включают и множественное число, если в контексте ясно не просматривается иное. Используемые в описании настоящего изобретения глагол "содержать", "иметь", "состоять из", "включать" и его формы следует интерпретировать в открытом, а не закрытом значении, если ясно не указано иное (т.е. в значение "включая без ограничения"), если ясно не указано иное. Приведен
ные пределы значений приведены, как способ кратко показать весь диапазон, т.е. каждый отдельный показатель из этого диапазона, если ясно не указано иное. Все описанные в настоящем изобретении способы могут быть проведены любым подходящим образом, если ясно не указано иное, или если из контекста ясно не просматривается иное. Использование в описании настоящего изобретения любого примера или всех примеров или терминов, указывающих на приведение примера (например, такой как) приведено для лучшего понимания и иллюстрации и не ограничивает объем притязаний настоящего изобретения, изложенный в приложенной формуле изобретения. Ни одна формулировка в описании не должна рассматриваться, как указывающая на любой не изложенный в формуле изобретения элемент как существенный для осуществления настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Гликозидазы.
Примеры гликозидаз, использованных в способе по изобретению, представляли аспарагинамидазу, ацетилглюкозамидазу или галактозамидазу.
^гликозидаза^, также известная, как PNGаза-F, использованная в способе, представляет собой ас-парагинамидазу (EC 3.5.1.52), которая может быть получена из Flavobacterium mesingosepticum. Она катализирует полное и интактное (intact) расщепление N-связанных олигосахаридов от гликопротеинов (It catalyses the complete and intact cleavage of N-linked oligosaccaharides from glycoproteins). Доступна как коммерческий продукт от New England Biolabs Inc. под торговой маркой PNGase-F или получена реком-бинантно в штамме, таком как Escherichia coli, как было сделано при использовании плазмид и способа, описанного в Loo et al. (Protein Expression and Purification 24, 90-98, 2002).
Эндо-р-№ацетилглюкозамидаза Н (EC 3.2.1.96), также известная как ENDO-H, может быть получена из Streptomyces plicatus. ENDO-H катализирует гидролиз гликозидной связи между двумя N-ацетилглюкозаминами N-связанных гликозилатов (glycosylations). Доступна как коммерческий продукт от New England Biolabs Inc. под торговой маркой ENDO-H.
а-^ацетил-галактозамидаза (EC 3.2.1.49) представляет собой высоко специфичную экзогликозида-зу, катализирующую гидролиз остатков а-связанного D-N-ацетил-галактозамина. Доступна как коммерческий продукт от New England Biolabs Inc под торговой маркой а^-ацетил-галактозамидаза.
Для самостоятельно полученной на месте RNGазы-F авторами настоящего изобретения была подтверждена высокая степень (> 95%) чистоты при использовании электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с последующим окрашиванием кумассией бриллиантовой голубой (СВВ). Для дополнительного подтверждения чистоты собранный фермент разделяли при использовании SDS-PAGE и окрашивали при использовании серебра. При последующем проведении анализа с использованием масс-спектрометрии появление полос подтверждает присутствие RNGазы-F и только RNGазы-F.
Потенциальную а-специфическую протеолитическую активность самостоятельно полученной на месте очищенной RNGазы-F оценивали при проведении протеолитического анализа при использовании коровьего каппа-казеина (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата. В этом анализе авторы настоящего изобретения провели тестирование протеолитической активности при различных показателях pH, имитирующее естественное снижение pH, происходящее при ферментации. Для проверки системы авторы настоящего изобретения использовали 20-кратное повышение концентрации фермента по сравнению со способом по изобретению и инкубировали в течение 4 ч при каждом показателе pH. При этих условиях авторы настоящего изобретения не обнаружили какой-либо а-специфической протеолитической активности.
Заключение.
Исходя из приведенных выше результатов, ясно, что так называемая самостоятельно полученная на месте PNGаза-F свободна от контаминантов.
Другие коммерчески доступные гликозидазы, приведенные выше, также свободны от контамина-тов, как указывается производителем.
Пример 2. Способ измерения плотности и вязкости геля.
Плотность геля измеряли при использовании реометра Anton Paar MCR, снабженного автоматическим устройством для замены образцов (Physica DSR Rheometer + ASC). Измеряемый грузик поместили в измерительную чашу, содержащую 20 мл образца, который перемешали вручную и нагрели до температуры 13°C. Затем грузик поместили в образец и выдержали его там. Далее провели измерение плотности геля при использовании осцилляции. Напряжение поддерживали на постоянном уровне при значении 0,3%, а частоту повышали от 0,5 Гц до 30 Гц. По данным модуля эластичности (G') и модуля вязкости (G") может быть рассчитан их комплексный модуль (G*):
Q* _VGJ + G 1
G* при 1 Гц использовали в качестве меры плотности геля, используемой для сравнения различных образцов.
При использовании одного и того же реометра (Anton Paar rheometer) проводили измерение вязко
сти при повышении градиента сдвига с 0,2707 1/с до 300 1/с по контрольно-измерительным точкам (напряжение сдвига) каждые 10 с. Затем градиент сдвига снизили с 275 1/с до 0,2707 1/с по контрольно-измерительным точкам (напряжение сдвига) каждые 10 с. Напряжение сдвига при 300 1/с использовали, как меру вязкости продукта. Заключение.
Основываясь на приведенных выше стандартных способах измерения плотности геля и вязкости, для специалиста в данной области рутинной работой является определение того, достигнуто ли улучшение плотности геля и/или вязкости интересующего молочного продукта при добавлении гликозидазы согласно способу получения молочного продукта по изобретению.
Пример 3. Способы измерения синерезиса.
В настоящем изобретении использовали два различных способа измерения синерезиса:
Способ 1. 50 мл йогурта (получено по примеру 4) поместили в пробирку Эппендорфа и поместили на холодильное хранение (5°C) в течение 14 дней, после чего провели измерение количества сыворотки в верхней части йогурта при использовании мерной линейки (в мм).
Специалисту в данной области очевидно, что также можно измерить эффект синерезиса другого молочного продукта, иного чем йогурт, помещением молочного продукта на хранение и измерением количества сыворотки в верхней части интересующего молочного продукта.
Способ 2. Обезжиренное молоко обогатили 2% сухого обезжиренного молока (SMP, производитель (SMP, producer)) и поместили в холодильник на ночь. Партию подвергли тепловой обработке в течение 20 мин при температуре 90°C. 75 мл молочного раствора поместили в 100 мл мерную колбу вместе с йо-гуртной культурой 0,02% YoFlex(r) Advance 2.0 (доступна от Chr. Hansen A/S, Denmark) и ферментом (или PNGазой или GalNAC). Регистрировали общую массу молока, культуры и фермента. Раствор нагревали до температуры 43°C и ферментировали до достижения pH 4,55, после чего пробирки помещали на холодильное хранение в течение 7 дней. Через 7 дней сливали верхнюю часть йогурта и взвесили. Сине-резис рассчитывали в процентах.
Специалисту в данной области очевидно, что также можно измерить эффект синерезиса другого молочного продукта, иного чем йогурт, помещением молочного продукта на хранение и измерением количества сыворотки в верхней части интересующего молочного продукта.
Заключение.
Основываясь на приведенных выше стандартных способах измерения синерезиса, для специалиста в данной области рутинной работой является определение того, имеет ли место значительный эффект синерезиса интересующего молочного продукта при добавлении гликозидазы согласно способу получения молочного продукта по изобретению.
Пример 4. Влияние RNGазы-F на плотность геля (2 лабораторный эксперимент).
2 л обезжиренного молока (0,1% жира, Aria Express, Slagelse) обогатили 1,6% сухого обезжиренного молока (SMP, производитель (SMP, producer)) и поместили в холодильник на ночь. Партию подвергли тепловой обработке в течение 20 мин при температуре 90°C и охладили до температуры 43 °C, инокули-ровали йогуртной культурой 0,02% YoFlex(r) Advance 2.0 (доступна от Chr. Hansen A/S, Denmark) и внесли или 10 мл RNGазы-F или в контрольном образце 10 мл 20 мМ Na-фосфатного буфера с pH 7,5, содержащего 50 мМ NaCl, и ферментировали до достижения pH 4,55. При достижении pH 4,55 йогурт перемешали и пропустили через устройство для пост-обработки (PTU), в котором йогурт подвергли воздействию повышенного давления 2 бар (20 кПа) при температуре 25°C. Готовый продукт подвергли реометрическому анализу на 5 день.
Для N-гликозидазы единицу активности определяли, как количество фермента, требуемое для удаления > 95% углеводов из 10 мкг денатурированной RNазы-B в течение 1 ч при температуре 37°C в общем реакционном объеме 10 мкл.
Числовые значения в табл. 1 показали, что PNGаза-F повысила плотность геля йогурта с низким содержанием жира. При этих условиях разница составила 75% по сравнению с контролем. Вязкость, полученная в присутствии RNGазы-F, сравнима или немного лучше таковой у контрольного образца. В данных, не приведенных здесь, авторы настоящего изобретения обнаружили, что повышение плотности геля
в ответ на обработку PNGазой-F дозозависимо. Также авторы настоящего изобретения провели оценку синерезиса при использовании способа 1 примера 3 и обнаружили, что синерезис снизился в ответ на обработку PNGазой-F. Заключение.
Приведенные выше результаты продемонстрировали, что PNGаза-F повышает плотность геля йогурта с низким содержанием жира. При этих условиях разница составила 75% (т.е. в 1,75 раза) по сравнению с контролем.
Дополнительно, было обнаружено, что синерезис снизился в ответ на обработку PNGазой-F. Полученная вязкость в присутствии RNGазы-F сравнима или немного лучше таковой у контрольного образца.
Пример 5. Тестирование различных гликозидаз в йогурте с низким содержанием жира.
Йогурты получали непосредственно в 20 млм чашах для проведения реометрического анализа. Обезжиренное молоко (0,1% жира, Aria Express, Slagelse) обогатили 2% сухого обезжиренного молока (SMP) и поместили в холодильник на ночь. Раствор подвергли тепловой обработке в течение 20 мин при температуре 90°C и охладили до температуры 43°C, инокулировали йогуртной культурой 0,02% YoFlex(r) Advance 2.0 и различными дегликозидазами, и ферментировали (табл. 1). Затем образцы поместили в холодильник и провели измерение реологии на 3 день по примеру 2.
Для N-гликозидаз RNGазы-F и Endo-H единицы определяют по табл. 1. Для а-№ацетил-галактозаминидазы, О-связанной гликозидазы единицу активности определяют, как количество фермента, требуемое для расщепления > 95% терминального а^-№ацетил-галактозамина из 1 нмоль (Gal- NAca 1-3) (Fuca 1-2)Gala 1-4Glc-7-амино-4-метил-кумарин (АМС), в течение 1 ч при температуре 37°C в общем реакционном объеме 10 мкл.
Для всех протестированных гликозидаз, N-глюкозидаз наряду с О-глюкозидазой GalNAC, было отмечено значительное улучшение плотности геля. Было установлено, что при тестируемых концентрациях коммерчески доступная PNGаза-F оказала самое сильное влияние на плотность геля йогурта с низким содержанием жира. Заключение.
Результаты показали, что у всех протестированных гликозидаз, N-глюкозидаз наряду с О-глюкозидазой GalNAC, было отмечено значительное улучшение плотности геля.
Пример 6: Эксперимент на синерезис при использовании гликозидазы, работающей на О-связанное гликозилирование.
В US 7560127 показано, что а-глюкозидаза GalNAC приводит к образованию сырного сгустка/свертыванию. Авторы настоящего изобретения провели анализ влияния GalNAC на синерезис йогурта с низким содержанием жира. Эксперимент проводили по примеру 3 способ 2. Йогурты получали непосредственно в 100 мл чашах для проведения реометрического анализа. Обезжиренное молоко (0,1% жира, Aria Express, Slagelse) обогатили 2% сухого обезжиренного молока (SMP, Aria Express, Slagelse) и поместили в холодильник на ночь. Раствор подвергли тепловой обработке в течение 20 мин при температуре 90°C и охладили до температуры 43°C, инокулировали йогуртной культурой 0,02% YoFlex(r) Advance 2.0 и GalNAC в концентрации 100 U/мл молока. Для контрольных образцов без фермента процент сыворотки через 21 день составил 0,3+0,04°%, в то время как фракция сыворотки для образца, обработанного ферментом, составила 0,2+0,08%. Неожиданно было обнаружено, что обработка GalNAC не повысила синерезис по сравнению с контрольным образцом, ферментированным той же самой культурой. Этот результат явился неожиданным, поскольку в US 7560127 указано, что удаление О-связанных глика-нов приводит к образованию сгустка и, следовательно, отделению сыворотки. Заключение.
Приведенные выше результаты продемонстрировали, что протестированная О-связанная гликози-
даза не повышает синерезис в процессе получения йогурта. Пример 7. LAB и химически подкисленное молоко.
В этом Примере авторы настоящего изобретения хотели выяснить, оказывает ли влияние PNGаза-F в зависимости от механизма подкисления. Эксперимент был проведен сравнением влияния RNGазы-F на ферментированный йогурт и на йогурт, подкисленный химически, при использовании глюконо-5-лактона (GDL).
Молоко, содержавшее 9,5% сухих веществ, инокулировали или YoFlex(r) Advance 2.0 или глюконо-5-лактоном (GDL) и PNGазой-F, как указано в табл. 3, нагрели до температуры 43°C и ферментировали до pH 4,55. Затем образцы хранили в течение 3 дней при температуре 5°C, образцы перемешали при использовании мешалки и перелили в чаши для реологического анализа, реологический анализ и измерения проводили по примерам 2 и 3.
Результаты, приведенные в табл. 3, подтвердили, что влияние RNGазы-F может быть описано, как физический феномен. У химически подкисленного йогурта наблюдался более плотный гель по сравнению с таковым у культуры Advance 2.0. Однако для обоих способов очевидно, что добавление RNGазы-F улучшает плотность геля.
Заключение.
Приведенные выше результаты продемонстрировали для обоих способов подкисления очевидность того факта, что добавление RNGазы-F улучшило плотность геля.
Предпочтительные варианты выполнения настоящего изобретения включают наилучший способ осуществления настоящего изобретения, известный его авторам. Варианты предпочтительных вариантов выполнения настоящего изобретения очевидны для специалиста в данной области при прочтении описания настоящего патента. Авторы настоящего изобретения ожидают от специалиста в данной области использования таких вариантов в установленном порядке, и авторы настоящего изобретения подразумевают, что настоящее изобретение может быть осуществлено иным способом, чем приведенный в описании настоящего изобретения. Следовательно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета притязаний, изложенного в приложенной формуле изобретения. Дополнительно, любая комбинация указанных выше элементов во всех возможных вариантах входит в объем притязаний настоящего изобретения, если ясно не указано иное или если в контексте ясно не просматривается иное.
Ссылки
1. US2005/0095316A1 (Danone)
2. US2005/0095317A1 (Danone)
3. WO2007/095958A1 (Chr. Hansen A/S) 4. A.N. Hassan et al (J. Dairy Sci : 86: 1632-1638; 2003)
5. US7560127B2 (DSM)
6. E. Cases et al (Journal of Food Science; Vol. 68, Nr. 8, 2003, стр. 2406-2410)
7. EP1489135A1
8. R. Scott, ( 1986), Cheesemaking process, second ed., Elsevier Applied Science Publishers, London and New York.
9. G. Bylund, (1995), Dairy processing handbook, Tetra Pak Processing Systems, Lund, Sweden
10. F. Kosikowski, (1982), Cheese and fermented milk
foods, second ed., Kosikowski & Asso- ciates, New York Все ссылки в настоящем патенте приведены в полном объеме.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения молочного продукта с повышенной плотностью геля, включающий:
a) получение молочного субстрата и
b) обработку молочного субстрата ферментом с N-связанной гликозидазной активностью.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию c) ферментирования молочного субстрата микроорганизмом, таким как молочнокислые бактерии, с получением ферментированного молочного продукта.
3. Способ по п.2, в котором стадию b) проводят перед или во время стадии с).
4. Способ по п.2 или 3, в котором микроорганизм принадлежит к видам, выбранным из группы, включающей Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii подвид Bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis подвид cremoris, Leuconostoc mesnteroides подвид cremoris, Pseudoleuconostoc mesenter-oides подвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis подвид lactis биовариант diacetylactis, Lactobacillus casei подвид Casei, Lactobacillus paracasei подвид Paracasei, Bifidobacterium bifidum и Bifido-bacterium longum.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором N-связанная гликозидаза представляет собой гликозидазу, выбранную из группы, включающей пептид^(4)-^-ацетил-р-глюкозамил) аспарагинамидазу (EC номер 3.5.1.52; альтернативные названия: ^глюкозидаза^ или PNGаза-F) и эндо-p-N-ацетилглюкозамидазу Н (EC номер 3.2.1.96; альтернативное название ENDO-H).
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором молочный субстрат выбран из группы, состоящей из молока животных и молока растительного происхождения.
7. Способ по п.6, в котором молоко животных представляет собой молоко коровы, овцы, козы, буйволицы или верблюдицы.
8. Способ по п.6, в котором молоко растительного происхождения представляет собой соевое молоко, овсяное молоко, рисовое молоко, миндальное молоко.
9. Способ по п.2, в котором ферментированный молочный продукт выбран из группы, включающей йогурт, пахту, ацидофильное молоко, кефир, кумыс и творог-кварк.
10. Молочный продукт, получаемый способом по любому предшествующему пункту, содержащий эффективное количество N-связанной гликозидазы.
11. Применение N-связанной гликозидазы в способе получения молочного продукта по любому из пп.1-9 для придания ему повышенной плотности геля.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028325
- 1 -
(19)
028325
- 1 -
(19)
028325
- 4 -
(19)