EA 028309B1 20171130

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000028309b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Химерный белок, содержащий белок фактора VIII ("Ф-VIII") и фрагмент фактора Виллебранда (ФВ), которые связаны ковалентной связью, при этом указанный фрагмент ФВ содержит домен D' и домен D3 ФВ и связывается с белком Ф-VIII.

2. Химерный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный домен D' содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную аминокислотам 764-866 из SEQ ID NO: 2, и/или указанный домен D3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 867-1240 из SEQ ID NO: 2.

3. Химерный белок по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что указанный белок Ф-VIII содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную SEQ ID NO: 18, при этом указанный белок Ф-VIII обладает активностью Ф-VIII.

4. Химерный белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный белок Ф-VIII содержит тяжелую цепь фактора VIII и легкую цепь фактора VIII, при этом указанная тяжелая цепь фактора VIII содержит аминокислоты 1-740 SEQ ID NO: 16 и указанная легкая цепь фактора VIII содержит аминокислоты 1649-2332.

5. Химерный белок по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ковалентная связь предотвращает диссоциацию фрагмента ФВ от белка Ф-VIII в присутствии эндогенного ФВ.

6. Химерный белок по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ предотвращает выведение белка Ф-VIII в процессе выведения ФВ или указанный фрагмент ФВ подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII, экранируя или блокируя ФВ-связывающий участок на белке Ф-VIII.

7. Химерный белок по п.6, отличающийся тем, что ФВ-связывающий участок является аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотам 1669-1689 и 2303-2332 из SEQ ID NO: 16.

8. Химерный белок по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что время полужизни белка Ф-VIII продлевается за пределы ограничения времени полужизни белка Ф-VIII в присутствии эндогенного ФВ.

9. Химерный белок по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что фрагмент ФВ содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н1) и необязательный линкер между фрагментом ФВ и указанным гетерологичным компонентом (Н1).

10. Химерный белок по п.9, отличающийся тем, что гетерологичный компонент (Н1) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, связывающее альбумин вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов.

11. Химерный белок по п.10, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н1) содержит первую Fc-область.

12. Химерный белок по п.9, отличающийся тем, что химерный белок содержит линкер между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом (Н1), который является отщепляемым линкером.

13. Химерный белок по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что белок Ф-VIII дополнительно содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2).

14. Химерный белок по п.13, отличающийся тем, что гетерологичный компонент (Н2) способен продлевать время полужизни белка Ф-VIII.

15. Химерный белок по п.13 или 14, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), его производное, связывающее альбумин вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов.

16. Химерный белок по п.13, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит вторую Fc-область.

17. Химерный белок по любому из пп.1-16, который содержит первый полипептид, содержащий фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент и линкер, и второй полипептид, содержащий белок Ф-VIII и второй гетерологичный компонент, при этом первый полипептид и второй полипептид связаны друг с другом ковалентной связью.

18. Химерный белок по п.17, отличающийся тем, что указанные первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент связаны друг с другом ковалентной связью, при этом ковалентная связь препятствует замещению фрагмента ФВ в первом полипептиде эндогенным ФВ in vivo.

19. Химерный белок по любому из пп.13-18, отличающийся тем, что линкер между белком Ф-VIII и вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером.

20. Химерный белок по любому из пп.1-19, содержащий формулу, выбранную из: (a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2, (b) H2-L2-C-L3-H1-L1-V, (c) C-L2-H2-L3-V-L1-H1, (d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C, (e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2, (f) H2-L2-C-L3-V-L1-H1, (g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C, (h) C-L2-H2-L3-H1-L1-V, (i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C, (j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2, (k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2 и (l) H2-L3-H1-L1-C-L2-V, где V содержит указанный фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ; L1 является необязательным линкером; L2 является необязательным линкером; L3 в (a)-(f) является необязательным линкером, L3 в (g)-(l) является необязательным scFc линкером, каждый из Н1 или Н2 содержит необязательный гетерологичный компонент; С содержит указанный белок Ф-VIII; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот.

21. Химерный белок по любому из пп.1-19, содержащий формулу, выбранную из: (m) V-L1-H1:H2-L2-C, (n) V-L1-H1:C-L2-H2; (о) H1-L1-V:H2-L2-C; (р) H1-L1-V:C-L2-H2; (q) V:C-L1-H1:H2; (r) V:H1-L1-C:H2; (s) H2:H1-L1-C:V, (t) C:V-L1-H1:H2 и (u) C:H1-L1-V:H2, где V является указанным фрагментом ФВ, содержащим домен D' и домен D3 ФВ; L1 является необязательным линкером; L2 является необязательным линкером; Н1 является первым гетерологичным компонентом; Н2 является вторым гетерологичным компонентом; С является указанным белком Ф-VIII; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; (:) представляет ковалентную связь между Н1 и Н2.

22. Химерный белок по любому из пп.20-22, отличающийся тем, что Н1 содержит первую Fc-область, Н2 содержит вторую Fc-область или Н1 содержит первую Fc-область и Н2 содержит вторую Fc-область.

23. Химерный белок по любому из пп.1-22, отличающийся тем, что белок Ф-VIII содержит третий гетерологичный компонент (Н3), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5) или шестой гетерологичный компонент (Н6).

24. Химерный белок по пп.1-23, который дополнительно содержит линкер между белком Ф-VIII и указанным фрагментом ФВ.

25. Химерный белок по п.24, отличающийся тем, что линкер представляет собой распознающий сортазу мотив.

26. Химерный белок по любому из пп.1-25, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ, по существу, состоит из домена D' и домена D3 ФВ.

27. Химерный белок по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 либо обоим остаткам 1099 и 1142 из SEQ ID NO: 2.

28. Химерный белок по любому из пп.1-27, отличающийся тем, что последовательность указанного фрагмента ФВ содержит аминокислоты 764-1240 из SEQ ID NO: 2.

29. Химерный белок по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ дополнительно содержит домен D1, домен D2 или домены D1 и D2 ФВ.

30. Химерный белок по любому из пп.1-29, отличающийся тем, что белок Ф-VIII содержит домен В или его часть.

31. Химерный белок по любому из пп.1-30, отличающийся тем, что белок Ф-VIII содержит одноцепочечный Ф-VIII или Ф-VIII с двумя цепями.

32. Химерный белок по любому из пп.1-31, отличающийся тем, что химерный белок не содержит фактор, ограничивающий время полужизни белка Ф-VIII.

33. Полинуклеотид или набор полинуклеотидов, которые кодируют химерный белок по любому из пп.1-32.

34. Вектор или набор векторов, которые содержат полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.33 и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или набором полинуклеотидов.

35. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.39 или вектор или набор векторов по п.34.

36. Клетка-хозяин по п.35, которая является клеткой млекопитающего.

37. Клетка-хозяин по п.36, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего выбрана из группы, состоящей из клетки HEK293, клетки СНО и клетки BHK.

38. Фармацевтический состав, содержащий химерный белок по любому из пп.1-32 и фармацевтически приемлемый носитель.

39. Фармацевтический состав, содержащий полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.33 и фармацевтически приемлемый носитель.

40. Способ предотвращения или подавления взаимодействия белка Ф-VIII с эндогенным ФВ, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанный фрагмент ФВ предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.

41. Способ предотвращения или подавления взаимодействия белка Ф-VIII с эндогенным ФВ, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанный фрагмент ФВ предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.

42. Способ устранения или снижения фактора, ограничивающего время полужизни белка Ф-VIII, при этом данный способ включает введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанный химерный белок предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.

43. Способ устранения или снижения фактора, ограничивающего время полужизни белка Ф-VIII, при этом указанный способ включает введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанный химерный белок, кодируемый полинуклеотидом, предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.

44. Способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-VIII, при этом указанный способ включает введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом фрагмент ФВ химерного белка предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.

45. Способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-VIII, при этом указанный способ включает введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом фрагмент ФВ химерного белка предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.

46. Способ лечения заболевания или болезненного состояния, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанное заболевание или болезненное состояние, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций.

47. Способ лечения заболевания или болезненного состояния, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанное заболевание или болезненное состояние, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций.

48. Способ получения химерного белка, включающий трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом или набором нуклеотидов по п.33 или вектором или набором векторов по п.34 и экспрессию фрагмента ФВ или химерного белка в клетке-хозяине.

49. Способ конструирования химерного белка по любому из пп.1-32, включающий лигирование фрагмента ВФ с белком Ф-VIII ковалентной связью в присутствии фермента сортазы.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

25. Химерный белок по п.24, отличающийся тем, что линкер представляет собой распознающий сортазу мотив.

30. Химерный белок по любому из пп.1-29, отличающийся тем, что белок Ф-VIII содержит домен В или его часть.

33. Полинуклеотид или набор полинуклеотидов, которые кодируют химерный белок по любому из пп.1-32.

36. Клетка-хозяин по п.35, которая является клеткой млекопитающего.

Евразийское ои 028309 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента (51) Int. Cl. А61К38/37 (2006.01)
2017.11.30
(21) Номер заявки 201491186
(22) Дата подачи заявки
2013.01.12
(54) ПОЛИПЕПТИДЫ ХИМЕРНОГО ФАКТОРА VIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 61/586,099; 61/586,654; 61/667,901; 61/734,954
(32) 2012.01.12; 2012.01.13; 2012.07.03;
2012.12.07
(33) US
(43) 2015.05.29
(86) PCT/US2013/021330
(87) WO 2013/106787 2013.07.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАЙОДЖЕН ЭМЭЙ ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Чабра Экта Сет, Лю Туняо, Питерс Роберт, Цзян Хайянь (US)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(56) WO-A2-2011069164 US-A1-20100285021 US-A1-20090118185
(57) В изобретении предложены фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетерологичный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, а также способы их применения. Полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, являющегося объектом изобретения, связывается или является соединенной с полипептидной цепью, содержащей белок Ф-VIII, и полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ, может предотвращать или подавлять связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. Путем предотвращения или подавления связывания эндогенного ФВ с Ф-VIII, которое является фактором, ограничивающим время полужизни связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII, фрагмент ФВ может индуцировать продление времени полужизни белка Ф-VIII. В изобретении также предложены нуклеотиды, векторы, клетки-хозяева, способы применения фрагмента ФВ или химерные белки.
Уровень техники
Свертывание является сложным процессом образования кровью тромбов. Важной частью гемостаза является прекращение тока крови из поврежденного сосуда, при котором стенка поврежденного сосуда покрывается бляшками и содержащими фибрин тромбами для того, чтобы остановить кровотечение и начать восстановление поврежденного сосуда. Нарушения свертываемости крови могут привести к повышенному риску возникновения кровотечений (геморрагии) или образованию закупоривающих тромбов (тромбозу).
Свертывание начинается практически сразу после того, как при повреждении кровеносного сосуда была повреждена эндотелиальная выстилка сосуда. Воздействие на кровь таких белков, как тканевой фактор, инициирует изменения в тромбоцитах и плазменном белке фибриногене - факторе свертывания крови. Тромбоциты мгновенно образуют пробку в месте повреждения; это называется первичным гемостазом. Одновременно происходит вторичный гемостаз: белки, находящиеся в плазме крови, которые называются факторами коагуляции или факторами свертывания крови, откликаются сложным каскадом реакций, образуя фибриновые нити, которые укрепляют тромбоцитарную пробку. Неограничивающие факторы коагуляции включают, но не ограничиваются этим, фактор I (фибриноген), фактор II (протромбин), тканевый фактор, фактор V (проакцелерин, лабильный фактор), фактор VII (стабильный фактор, проконвертин), фактор VIII (антигемофильный глобулин А), фактор IX (антигемофильный глобулин В или кристмас-фактор), фактор X (фактор Стюарта-Прауэра), фактор XI (плазменный предшественник тромбопластина), фактор XII (фактор Хагемана), фактор XIII (фибринстабилизирующий фактор), ФВ, прекалликреин (фактор Флетчера), высокомолекулярный кининоген (ВМК) (фактор Фитцджеральда), фибронектин, антитромбин III, кофактор гепарина II, протеин С, протеин S, протеин Z, плазминоген, альфа 2-антиплазмин, тканевой активатор плазминогена (ТАП), урокиназа, ингибитор активатора плаз-миногена-1 (ИАП-1), ингибитор активатора плазминогена-2 (ИАП-2).
Гемофилия А является нарушением свертываемости крови, возникающим из-за дефектов в гене, кодирующем фактор коагуляции VIII (Ф-VIII), и проявляющимся у 1-2 из 10000 младенцев мужского пола; Grawet et al., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Пациентов, страдающих гемофилией А, можно лечить путем вливаний очищенного или полученного с помощью рекомбинантных технологий Ф-VIII. При этом все коммерчески доступные продукты, содержащие Ф-VIII, как известно, имеют время полужизни, составляющее 8-12 ч, и требуют частых внутривенных введений пациентам; смотрите Weiner M.A. and Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Помимо этого было предпринято большое количество попыток с целью продлить время полужизни Ф-VIII. Например, подходы в разработках для продления времени полужизни факторов свертывания крови включают пэгилирование, гликопэгили-рование и конъюгацию с альбумином; смотрите Dumontet al., Blood. 119(13): 3024-3030 (опубликовано онлайн 13 января 2012 г.) Независимо от используемой белковой инженерии, разрабатываемые в последнее время содержащие Ф-VIII продукты длительного действия обладают продленными временами полужизни, но эти времена полужизни, как сообщается, ограничены - на доклинических животных моделях было получено продление - всего лишь в около 1,5-2 раза; смотрите Id. Схожие результаты были продемонстрированы для людей, например, сообщалось, что для пациентов, страдающих гемофилией А, время полужизни rFVIIIFc продлено в ~1,7 раз по сравнению с ADVATE(r); смотрите Id. Следовательно, продление времени полужизни, несмотря на небольшое увеличение, может указывать на присутствие других ограничивающих Т1/2 факторов; See Liu, Т. et al., 2007 ISTH meeting, abstract #P-M-035; Henrik, A. et al., 2011 ISTH meeting, abstract #P=MO-181; Liu, T. et al., 2011 ISTH meeting abstract #P-WE-131.
Плазменный фактор Виллебранда (ФВ) имеет время полужизни, составляющее приблизительно 12 ч (в диапазоне от 9 до 15 ч); http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm (последний визит 22 октября 2011 г.). На время полужизни ФВ может воздействовать большое количество факторов: профиль гликозилирования, ADAMTS-13 (дезинтегрин и металлопротеаза в сочетании с тромбоспонди-ном мотив-13), а также различные мутации в ФВ.
В плазме 95-98% Ф-VIII циркулирует в тесном нековалентном комплексе с полноразмерным ФВ. Образование этого комплекса важно для поддержки соответствующих плазменных уровней Ф-VIII in vivo; Lenting et al., Blood. 92(11): 3983-96 (1998); Lenting et al., J. Thromb. Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Полноразмерный Ф-VIII дикого типа в основном находится в виде гетеродимера, содержащего тяжелую цепь (ММ 200 кДа) и легкую цепь (ММ 73 кДа). Когда Ф-VIII активируется благодаря протеолизу на позициях 372 и 740 тяжелой цепи и на позиции 1689 легкой цепи, связанный с Ф-VIII ФВ отделяется от активированного Ф-VIII. Активированный Ф-VIII вместе с активированным фактором IX, кальцием и фосфолипидом ("теназный комплекс") участвуют в активации фактора X, вырабатывая большие количества тромбина. Тромбин, в свою очередь, расщепляет фибриноген до образования растворимых мономеров фибрина, которые затем спонтанно полимеризуются до образования растворимого фибринового полимера. Тромбин также активирует фактор XIII, который вместе с кальцием служит для перекрестного связывания и стабилизации растворимого фибринового полимера, образуя перекрестно-связанный (нерастворимый) фибрин. Активированный Ф-VIII быстро удаляется из циркуляции при помощи протеоли-за.
Из-за частого дозирования и неудобств, связанных с режимом дозирования, до сих пор существует потребность в разработке продуктов, содержащих Ф-VIII, которые требуют менее частого применения, т.е. содержащего Ф-VIII продукта, который имеет время полужизни, превышающее ограничение в 1,5-2-кратное увеличение времени полужизни.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к химерному белку, содержащему белок фактора VIII ("Ф-VIII") и дополнительный компонент ("ДК"), причем дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. Белок Ф-VIII и дополнительная группа связаны между собой ковалентной связью для того, чтобы предотвратить диссоциацию дополнительного компонента в присутствии эндогенного ФВ. В одном варианте реализации изобретения ковалентная связь представляет собой пептидную связь, дисульфидную связь или линкер, который является достаточно сильным для того, чтобы предотвратить диссоциацию дополнительного компонента от белка Ф-VIII в присутствии эндогенного ФВ. В другом варианте реализации изобретения дополнительный компонент предотвращает выведение белка Ф-VIII в процессе выведения ФВ. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII путем экранирования или блокирования ФВ-связывающего участка белка Ф-VIII. Например, ФВ-связывающий участок находится в домене A3 или домене С2 белка Ф-VIII, или в обоих - домене A3 и домене С2.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок включает конструкцию, содержащую белок Ф-VIII и дополнительный компонент, которые связаны между собой ковалентной связью, при этом химерный белок не содержит фактор, ограничивающий время полужизни Ф-VIII, который индуцирует ограничение времени полужизни белка Ф-VIII, например полноразмерный белок ФВ или зрелый белок ФВ. Следовательно, в некоторых вариантах реализации изобретения время полужизни белка Ф-VIII химерного белка выходит за пределы ограничения по времени полужизни белка Ф-VIII в присутствии эндогенного ФВ.
В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент обладает по меньшей мере одним ФВ-подобным Ф-^П-защитным свойством. Примеры ФВ-подобного Ф-\ТП-защитного свойства включают, но не ограничиваются этим, защиту белка Ф-VIII от одного или более расщеплений протеазой, защиту белка Ф-VIII от активации, стабилизацию тяжелой цепи и/или легкой цепи белка Ф-VIII или предотвращение выведения белка Ф-VIII одним или более фагоцитарными рецепторами. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент содержит полипептид, неполипеп-тидный компонент или оба этих компонента. В другом варианте реализации изобретения дополнительный компонент может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность длиной в по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 50, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 70, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 90, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 110, по меньшей мере около 120, по меньшей мере около 130, по меньшей мере около 140, по меньшей мере около 150, по меньшей мере около 200, по меньшей мере около 250, по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 350, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 450, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 550, по меньшей мере около 600, по меньшей мере около 650, по меньшей мере около 700, по меньшей мере около 750, по меньшей мере около 800, по меньшей мере около 850, по меньшей мере около 900, по меньшей мере около 950 или по меньшей мере около 1000 аминокислот. В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент содержит фрагмент ФВ, константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения дополнительный компонент представляет собой неполипептидный компонент, содержащий полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов.
В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент содержит фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, при этом фрагмент ФВ связан с белком Ф-VIII некова-лентной связью в дополнение к ковалентной связи между белком Ф-VIII и дополнительным компонентом (фрагментом ФВ). В одном примере фрагмент ФВ является мономером. В другом примере фрагмент ФВ содержит два, три, четыре, пять или шесть фрагментов ФВ, связанных друг с другом одной или более связями.
В одном аспекте реализации изобретения химерный белок содержит дополнительный компонент, например фрагмент ФВ, и по меньшей мере один гетерологичный компонент (H1) и произвольный линкер между дополнительным компонентом, например фрагментом ФВ, и гетерологичным компонентом (H1). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) может содержать вещество, которое продлевает время полужизни белка Ф-VIII, например полипептид, выбранный из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбу-мин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов, либо неполипептидный компонент, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала
(ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) содержит первую Fc-область. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере около 50 аминокислот, по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере около 150 аминокислот, по меньшей мере около 200 аминокислот, по меньшей мере около 250 аминокислот, по меньшей мере около 300 аминокислот, по меньшей мере около 350 аминокислот, по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот, по меньшей мере около 850 аминокислот, по меньшей мере около 900 аминокислот, по меньшей мере около 950 аминокислот или по меньшей мере около 1000 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит линкер между дополнительным компонентом, например фрагментом ФВ, и гетерологичным компонентом (H1), который является отщепляемым линкером.
В другом аспекте реализации изобретения белок Ф-VIII в химерном белке содержит Ф-VIII и по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2). В одном варианте реализации изобретения гетеро-логичный компонент (Н2) способен продлевать время полужизни белка Ф-VIII, например полипептида, выбранного из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов, либо неполипептидного компонента, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит вторую Fc-область.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент и линкер, и вторую полипептидную цепь, содержащую белок Ф-VIII и второй гетерологичный компонент, при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь связаны друг с другом ковалентной связью. В одном примере первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент связаны друг с другом ковалентной связью, например дисульфидной связью, пептидной связью или линкером, при этом ковалентная связь препятствует замещению фрагмента ФВ в первой полипептидной цепи эндогенным ФВ in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер между белком Ф-VIII и вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером.
В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (H1), связанный с фрагментом ФВ, и второй гетерологичный компонент (Н2), связанный с белком Ф-VIII, связаны посредством линкера, например линкера оц-Fc, который является процессируемым линкером.
В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII химерного белка дополнительно содержит третий гетерологичный компонент (Н3), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетеро-логичный компонент (Н5), шестой гетерологичный компонент (Н6) или любые их комбинации. В одном варианте реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного компонента (Н3), четвертого гетерологичного компонента (Н4), пятого гетерологичного компонента (Н5), шестого гетерологич-ного компонента (Н6) способны продлевать время полужизни белка Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения третий гетерологичный компонент (Н3), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5) и шестой гетерологичный компонент (Н6) связаны с С-концом или N-концом Ф-VIII либо вставлены между двумя аминокислотами Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения один или более из третьего гетерологичного компонента (Н3), четвертого гетероло-гичного компонента (Н4), пятого гетерологичного компонента (Н5) или шестого гетерологичного компонента (Н6) содержит аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере около 50 аминокислот, по меньшей мере около 100 аминокислот, по меньшей мере около 150 аминокислот, по меньшей мере около 200 аминокислот, по меньшей мере около 250 аминокислот, по меньшей мере около 300 аминокислот, по меньшей мере около 350 аминокислот, по меньшей мере около 400 аминокислот, по меньшей мере около 450 аминокислот, по меньшей мере около 500 аминокислот, по меньшей мере около 550 аминокислот, по меньшей мере около 600 аминокислот, по меньшей мере около 650 аминокислот, по меньшей мере около 700 аминокислот, по меньшей мере около 750 аминокислот, по меньшей мере около 800 аминокислот, по меньшей мере около 850 аминокислот, по меньшей мере около 900 аминокислот, по меньшей мере около 950 аминокислот или по меньшей мере около 1000 аминокислот.
В некоторых вариантах реализации изобретения линкер между белком Ф-VIII и вторым гетероло-гичным компонентом или линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом дополнительно содержит первый сайт расщепления (Р1) на N-концевом участке линкера, второй сайт расщепления (Р2) на С-концевом участке линкера, либо оба этих компонента. В других вариантах реализации изобретения один или более элементов из линкера между белком Ф-VIII и дополнительным компонентом, линкера между белком Ф-VIII и вторым гетерологичным компонентом и линкера между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом имеют длину от около 1 до около 2000 аминокислот.
В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок Ф-VIII и дополнительный компонент, которые связаны посредством линкера между белком Ф-VIII и дополнительным компонентом, при этом линкер дополнительно содержит распознающий сортазу мотив, например последовательность LPXTG (SEQ ID NO: 106).
Настоящее изобретение относится к фрагменту фактора Виллебранда (ФВ), содержащему домен D' и домен D3 ФВ, причем фрагмент ФВ связывается с фактором VIII (Ф-VIII) и препятствует связыванию эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, являющийся объектом изобретения, не является аминокислотами от 764 до 1274 из SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации изобретения белок Ф-VIII без фрагмента ФВ имеет время полужизни сравнимое с Ф-VIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения белок Ф-VIII является слитым белком, содержащим Ф-VIII и гетерологичный компонент, который способен продлевать время полужизни Ф-VIII. Гете-рологичный компонент может являться полипептидом, неполипептидным компонентом или обоими этими компонентами. Гетерологичный полипептидный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения гетеро-логичный полипептидный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью, например Fc-областью. В других вариантах реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая полипептидная цепь содержит Ф-VIII и первую Fc-область, а вторая полипептидная цепь содержит вторую Fc-область без Ф-VIII.
В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ продлевает время полужизни Ф-VIII. Аминокислотная последовательность домена D' может быть по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам от 764 до 866 из SEQ ID NO: 2. Также аминокислотная последовательность домена D3 может быть по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам от 867 до 1240 из SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 либо им обоим из SEQ ID NO: 2. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2. Фрагмент ФВ может дополнительно содержать домен D1, домен D2 или домены D1 и D2, принадлежащие ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ дополнительно содержит домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена СК, одного или более их фрагментов и любых комбинаций этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ является пэгили-рованным, гликопэгилированным, гэкилированным или полисиалилированным.
Настоящее изобретение также относится к химерному белку, содержащему описанный в данном тексте фрагмент ФВ, гетерологичный компонент и произвольный линкер между фрагментом ФВ и гете-рологичным компонентом. Гетерологичный компонент может являться полипептидом, неполипептид-ным компонентом или обоими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения гетеро-логичный полипептидный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент представляет собой первую Fc-область. Химерный белок может дополнительно содержать вторую Fc-область, при этом вторая Fc-область связана или соединена с первой Fc-областью либо связана или соединена с фрагментом ФВ.
В одном аспекте химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:
(аа) V-L1-H1-L2-H2,
(бб) H2-L2-H1-L1-V,
(вв) H1-L1-V-L2-H2, и
(гг) H2-L2-V-L1-H1, где V является одним или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ; каждый из L1 и L2 является произвольным линкером; H1 является первым гетерологичным компонентом; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот;
Н2 является произвольным вторым гетерологичным компонентом.
В одном варианте реализации изобретения H1 является первым гетерологичным компонентом, например продлевающей время полужизни молекулой, известной в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является полипептидом. Первый гете-рологичный полипептидный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения H1 является неполипептидным компонентом, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтило-вого крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. Н2 является произвольным вторым гетерологичным компонентом, например продлевающей время полужизни молекулой, известной в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любой комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 является неполипептидным компонентом, который выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения H1 является первой Fc-областью, а Н2 является второй Fc-областью. Первая Fc-область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или различными, и могут быть связаны друг с другом линкером или ковалентной связью, например дисульфидной связью. В другом варианте реализации изобретения вторая Fc-область связана или соединена с белком фактора VIII. В некоторых случаях может присутствовать третий гетерологичный компонент Н3, который продлевает время полужизни и который связан с фрагментом ФВ, первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента могут включать полипептидный или неполипептидный компоненты либо оба эти компонента. В одном варианте реализации изобретения третий гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента или любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 является неполипептидным компонентом, который может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения Н3 связан с фрагментом ФВ или первым либо вторым гетероло-гичным компонентом посредством отщепляемого линкера, например тромбин-отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров приведены в другом месте данного текста.
В другом аспекте изобретения предложен химерный белок, содержащий описанный в данном тексте фрагмент ФВ, белок Ф-VIII и произвольный линкер между фрагментом ФВ и белком Ф-VIII. Фрагмент ФВ может быть связан с белком Ф-VIII. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, который связан с гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может являться компонентом, который продлевает время жизни белка, который содержит полипептид, неполипептидный компонент или оба эти компонента. Примеры такого гете-рологичного полипептида включают, например, константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов. Примеры неполи-пептидного компонента включают, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидро-ксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент является первой Fc-областью, связанной с фрагментом ФВ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит вторую Fc-область, связанную с белком Ф-VIII. Фрагмент ФВ или белок Ф-VIII могут быть связаны с первой Fc-областью или второй Fc-областью соответственно посредством линкера. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, например с первой Fc-областью, и белок Ф-VIII, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например с второй Fc-областью, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом (например, второй Fc-областью) или белком Ф-VIII посредством линкера или ковалентной связью либо первый гетерологичный компонент (например, Fc-область) дополнительно связан с белком Ф-VIII или вторым гетерологичным компонентом (например, второй Fc-областью) посредством линкера или ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII химерного белка содержит частичный В-домен. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII с неполным В-доменом является Ф-\ЩП98 (SEQ ID NO: 105). В других вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит распознающий сортазу мотив.
В некоторых вариантах реализации результатом изобретения является продление времени полу
жизни белка Ф-VIII по сравнению с белком Ф-VIII без фрагмента ФВ или Ф-VIII дикого типа. Время полужизни белка Ф-VIII по меньшей мере в 1,5 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раз, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 11 раз или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка Ф-VIII без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни Ф-VIII приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10-кратно превышает время полужизни Ф-VIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни Ф-VIII продлено в от около 2 до около 10 раз, от около 2 до около 9 раз, от около 2 до около 8 раз, от около 2 до около 7 раз, от около 2 до около 6 раз, от около 2 до около 5 раз, от около 2 до около 4 раз, от около 2 до около 3 раз, от около 2,5 до около 10 раз, от около 2,5 до около 9 раз, от около 2,5 до около 8 раз, от около 2,5 до около 7 раз, от около 2,5 до около 6 раз, от около 2,5 до около 5 раз, от около 2,5 до около 4 раз, от около 2,5 до около 3 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 3 до около 9 раз, от около 3 до около 8 раз, от около 3 до около 7 раз, от около 3 до около 6 раз, от около 3 до около 5 раз, от около 3 до около 4 раз, от около 4 до около 6 раз, от около 5 до около 7 раз или от около 6 до около 8 раз по сравнению с Ф-VIII дикого типа или белком Ф-VIII без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-VIII составляет по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 26, по меньшей мере около 27, по меньшей мере около 28, по меньшей мере около 29, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 31, по меньшей мере около 32, по меньшей мере около 33, по меньшей мере около 34, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 36, по меньшей мере около 48, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 72, по меньшей мере около 84, по меньшей мере около 96 или по меньшей мере около 108 ч. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-VIII составляет от около 15 ч до около двух недель, от около 16 ч до около одной недели, от около 17 ч до около одной недели, от около 18 ч до около одной недели, от около 19 ч до около одной недели, от около 20 ч до около одной недели, от около 21 ч до около одной недели, от около 22 ч до около одной недели, от около 23 ч до около одной недели, от около 24 ч до около одной недели, от около 36 ч до около одной недели, от около 48 ч до около одной недели, от около 60 ч до около одной недели, от около 24 ч до около шести дней, от около 24 ч до около пяти дней, от около 24 ч до около четырех дней, от около 24 ч до около трех дней или от около 24 ч до около двух дней.
В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни Ф-VIII у пациента составляет около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23 ч, около 24 ч (1 дня), около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 40, около 44 ч, около 48 ч (2 дней), около 54, около 60 ч, около 72 ч (3 дней), около 84 ч, около 96 ч (4 дней), около 108 ч, около 120 ч (5 дней), около шести дней, около семи дней (одной недели), около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14 дней.
В другом аспекте химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:
ром; ром;
(а)
V-L1-H1-L3-C-L2-H2,
(Ь)
H2-L2-C- L3-H1-L1-V,
(с)
C-L2-H2- L3-V-L1-H1,
(d)
Hl-Ll-V- L3-H2-L2-C,
(е)
H1-L1-V-L3-C-L2-H2,
(f)
H2-L2-C- L3-V-L1-H1,
(g)
V-L1-H1-L3-H2-L2-C,
(h)
C-L2-H2- L3-H1-L1-V,
(i)
H2-L3-H1-L1-V-L2-C,
C-L2-V-L1-H1-L3-H2,
(k)
V-L2-C-L1-H1-L3-H2, и
(1)
H2-L3-H1-L1-C-L2-V,
где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ; каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, н
(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот.
В других аспектах химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:
(т)
V-L1-H1: H2-L2-C,
(п)
V-L1-H1:C-L2-H2,
(о)
H1-L1-V:H2-L2-C,
(Р)
H1-L1-V:C-L2-H2,
(q)
V:C-L1-H1:H2,
(г)
V:H1-L1-C:H2,
(s)
H2:H1-L1-C:V,
(t)
C:V-L1-H1:H2, и
(и)
C:H1-L1-V:H2,
где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ;
каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, например тромбин-отщепляемым линкером;
каждый из H1 или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; С является белком Ф-VIII;
(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот;
(:) представляет химическое или физическое соединение между H1 и Н2, между V и С, и между V и H1 и С и Н2. (:) представляет собой химическое соединение, например по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т.е. (:), является ковалентной связью. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение между H1 и Н2 является ковалентной связью, например дисульфидной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т.е. (:), является нековалентным взаимодействием, например ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В определенных вариантах реализации изобретения соединение между белком Ф-VIII и фрагментом ФВ является нековалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является непептидной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В одном варианте реализации изобретения H1 является первым гетерологичным компонентом. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент способен продлевать время полужизни активности Ф-VIII. В другом варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является полипептидом, неполипептидным компонентом или обеими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2 является вторым гетерологичным компонентом. Второй гетерологичный компонент также может являться известным в данной области техники веществом, продлевающим время полужизни, и являться полипептидным, неполипептидным компонентом или обеими этими компонентами. В одном варианте реализации изобретения второй гетероло-гичный компонент выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, трансферрина или его фрагмента и любых комбинаций этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения неполипептидный компонент выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК), их производных и любых комбинаций этих компонентов. В конкретном варианте реализации изобретения H1 является первой Fc-областью. В некоторых вариантах реализации изобретения Н2 является второй Fc-областью. В некоторых случаях может присутствовать третий гетерологичный компонент Н3, который продлевает время полужизни. Н3 может быть связан с одним или более элементом из V, С, H1 или Н2 посредством произвольного линкера, например отщепляемого линкера, например тромбин-отщепляемого линкера. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента могут включать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, полиэтиленгликоль (ПЭГ), последовательность PAS, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) или их производные.
В определенных вариантах реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых для соединения друг с другом фрагмента ФВ, белка Ф-VIII, первого гетерологичного компонента и/или вто
рого гетерологичного компонента, соответствующих формулам от (а) до (u), является отщепляемым линкером. Один или более из сайтов расщепления химерного белка могут отщепляться протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора XIa, фактора XIIa, калликреина, фактора VIIa, фактора IXa, фактора Ха, фактора IIa (тромбина), эластазы-2, гранзима В, ВГТ, энтерокиназы, протеазы 3С, сортазы А, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20. В других вариантах реализации изобретения один или более линкеров, применяемых в формулах от (а) до (l) (например, L3), содержат процессируемый линкер. Про-цессируемые линкеры могут отщепляться внутриклеточным ферментом непосредственно после секреции. Процессируемый линкер может содержать первый сайт расщепления (Р1) на N-концевом участке линкера, второй сайт расщепления (Р2) на С-концевом участке линкера, либо оба этих компонента.
В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых в изобретении, имею длину в по меньшей мере от около 1 до около 2000 аминокислот. В определенном варианте реализации изобретения один или более из линкеров, применяемых в изобретении, имею длину в по меньшей мере около 20, 35, 42, 48, 73, 98, 144, 288, 324, 576 или 864 аминокислот. В конкретном варианте реализации изобретения один или более из линкеров содержат пептид gly/ser. Пептид gly/ser может представлять собой (Gly4 Ser)3 или (Gly4 Ser)4.
В других аспектах реализации изобретения белок Ф-VIII в химерном белке является функциональным белком фактора VIII. Белок Ф-VIII может содержать один или более доменов Ф-VIII, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена В, домена A3, домена С1, домена С2, одного или более их фрагментов и любых их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения белок Ф-VIII содержит В-домен или его часть. В другом варианте реализации изобретения белок Ф-VIII является Ф-VIII-SQ с удаленным В-доменом. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII содержит одиночную цепь Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII содержит тяжелую цепь Ф-VIII и легкую цепь фактора VIII, при этом тяжелая цепь и легкая цепь соединены между собой металлической связью. В определенных вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII обладает низкой аффинностью к либо не связывается с белком, родственным рецептору липопротеинов низкой плотности (БРР). Например, белок Ф-VIII, применяемый в изобретении, может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая снижает аффиность к или исключает связывание с БРР. Неограничивающими примерами по меньшей мере одной аминокислотной замены являются замены остатков полноразмерного зрелого Ф-VIII, соответствующих остатку 471, остатку 484, остатку 487, остатку 490, остатку 497, остатку 2092, остатку 2093 либо двум или более их комбинациям. В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII в химерном белке, являющемся объектом данного изобретения, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая обуславливает стабильность белка Ф-VIII большую, чем у белка Ф-VIII без замены. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII содержит по меньшей мере две аминокислотных замены в домене А2 и по меньшей мере одну аминокислотную замену в домене A3, при этом домен А2 и домен А2 соединены между собой ковалентной связью. Неограничивающими примерами аминокислотной замены в домене А2 являются замены остатков полноразмерного зрелого Ф-VIII, соответствующих остатку 662 или 664. Вдобавок, неограничивающими примерами аминокислотной замены в домене A3 являются замены остатков полноразмерного зрелого полисиалилированного Ф-VIII, соответствующих остатку 1826 или 1828.
В дополнительных аспектах изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий описанный в данном тексте фрагмент ФВ или описанный в данном тексте химерный белок, либо группа полинуклео-тидов, содержащая первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, при этом первая нуклео-тидная цепь колирует фрагмент ФВ, а вторая нуклеотидная цепь кодирует вторую Fc-область, или фактор свертывания крови, или его фрагмент, принадлежащие химерному белку. В одном варианте реализации изобретения группа полинуклеотидов дополнительно содержит третью полипептидную цепь, которая кодирует пропротеин конвертазу, которая принадлежит семейству субтилизин-подобных пропротеин конвертаз. Неограничивающие примеры пробелка конвертазы включают пропротеин конвертазу субти-лизин/кексин типа 3 (РАСЕ или PCSK3), пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 5 (PCSK5 или РС5), пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 7 (PCSK7 или РС7) или дрожжевую протеазу Kex 2. В других аспектах изобретение включает вектор, содержащий полинуклеотид или группу полинуклео-тидов и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или группой поли-нуклеотидов, либо группу векторов, содержащую первый вектор и второй вектор, при этом первый вектор кодирует первую полинуклеотидную цепь группы полинуклеотидов, а второй вектор кодирует вторую полинуклеотидную цепь группы полинуклеотидов. Группа векторов может дополнительно содержать третий вектор, который содержит третью полинуклеотидную цепь, кодирующую PC5 или РС7. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор дополнительно содержит РАСЕ. В некоторых вариантах реализации изобретения РАСЕ отщепляет домены D1D2 фрагмента ФВ.
Некоторые аспекты изобретения относятся к фармацевтическому составу, содержащему фрагмент ФВ, химерный белок, полинуклеотид, группу полинуклеотидов, вектор или группу векторов и фармацевтически приемлемый носитель. Состав, являющийся объектом данного изобретения, может продлевать время полужизни фактора VIII. В других аспектах изобретение включает клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, группу полинуклеотидов, вектор или группы векторов.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к химерному белку, содержащему белок Ф-VIII, дополнительный компонент и произвольный линкер, при этом дополнительный компонент подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII и обладает по меньшей мере одним ФВ-подобным Ф^Ш-защитным свойством. ФВ-подобное Ф-^П-защитное свойство включает защиту белка Ф-VIII от одного или более расцеплений протеазой, защиту белка Ф-VIII от активации, стабилизацию тяжелой цепи и/или легкой цепи белка Ф-VIII или предотвращение выведения белка Ф-VIII одним или более фагоцитарными рецепторами.
Дополнительный компонент химерного белка может подавлять или предотвращать связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII путем защиты или блокирования ФВ-связывающего участка белка Ф-VIII. В некоторых вариантах реализации изобретения ФВ-связывающий участок находится в домене A3 или домене С2 белка Ф-VIII, или в обоих - домене A3 и домене С2 белка Ф-VIII. В другом варианте реализации изобретения ФВ-связывающий участок представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам от 1669 до 1689 и от 2303 до 2332 из SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидным, неполипептид-ным компонентом или обоими этими компонентами. Полипептид, применяемый в качестве дополнительного компонента, может содержать аминокислотную последовательность длиной по меньшей мере в 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 аминокислот. Например, полипептид, применяемый в качестве дополнительного компонента, может быть выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части, альбумина или его фрагмента, альбумин-связывающего вещества, последовательности PAS, последовательности НАР, других продлевающих время полужизни соединений и любых комбинаций этих компонентов. Неполипептидный компонент, применяемый в качестве дополнительного компонента, может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисиаловой кислоты, гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) или их производных и любых комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент является описанным в данном тексте фрагментом ФВ. Дополнительный компонент и белок Ф-VIII могут быть связанными, например, посредством линкера, или соединенными друг с другом. Линкер может содержать отщепляемый линкер, например тромбин-отщепляемый линкер.
В одном аспекте изобретения предложен способ предотвращения или подавления связывания белка Ф-VIII с эндогенным ФВ, включающий введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок Ф-VIII или полинук-леотид, кодирующий белок Ф-VIII, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII. В другом аспекте изобретение включает способ предотвращения или подавления связывания белка Ф-VIII с эндогенным ФВ, включающий введение эффективного количества химерного белка, полинуклеотида или группы по-линуклеотидов нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII и тем самым предотвращает или подавляет связывание белка Ф-VIII. В некоторых аспектах изобретение включает способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-VIII, при этом способ включает введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы поли-нуклеотидов в клетку, содержащую белок Ф-VIII или полинуклеотид, кодирующий белок Ф-VIII, или нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII. Другие аспекты изобретения относятся к способу предотвращения или подавления выведения белка Ф-VIII из клетки, при этом способ включает введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, поли-нуклеотида или группы полинуклеотидов в клетку, содержащую белок Ф-VIII или полинуклеотид, кодирующий белок Ф-VIII, или нуждающемуся в этом пациенту, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII.
Другой аспект изобретения относится к способу лечения заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающему введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинуклеотида или группы полинуклеотидов, при этом заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В других вариантах реализации изобретения лечение является профилактическим или осуществляется по требованию. В других вариантах реализации изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения, связанного с болезнью Виллебранда типа 2N, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества фрагмента ФВ, химерного белка, полинук-леотида или группы полинуклеотидов, при этом заболевание или нарушение излечивается.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 А-Е - схематические изображения белков ФВ. На фиг. 1 А показаны два фрагмента ФВ, содержащие аминокислоты от 1 до 276 из SEQ ID NO: 73 (аминокислоты от 764 до 1039 из SEQ ID NO: 2). ФВ-001 синтезирован без пре/пропептидных последовательностей ФВ, а ФВ-009 синтезирован с пре/пропептидными последовательностями (домены D1 и D2). Препептид ФВ-009 отщепляется во время синтеза, а ФВ-009 содержит пропептид с последовательностями доменов D' и D3. На фиг. 1Б показаны три фрагмента ФВ, содержащие аминокислоты от 1 до 477 из SEQ ID NO: 73 (аминокислоты от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2). ФВ-002 синтезирован без пре/пропептидных последовательностей. ФВ-010 содержит домены D1D2 дополнительно к доменам D'D3. ФВ-013 содержит домены D1D2DD3 дополнительно к остаткам аланина, замещающим цистеин в остатках 336 и 379 из SEQ ID NO: 72. На фиг. 1В показаны два фрагмента ФВ, содержащие домены D'D3 и часть домена А1. ФВ-003 содержит аминокислоты от 764 до 1274 из SEQ ID NO: 2. ФВ-011 содержит домены D1D2 дополнительно к доменам D'D3. На фиг. 1 Г показаны две конструкции -ФВ-004 и ФВ-012. ФВ-004 содержит домены D'D3 и полную последовательность домена А1. ФВ-012 содержит домены D1D2D'D3 и полную последовательность домена А1. На фиг. 1 Д показаны три конструкции. ФВ-006 содержит домены D1D2D'D3 и домен СК ФВ (цис-теиновый узловой домен - от англ. "cysteineknotdomain"). ФВ-008 является полноразмерным ФВ. ФВ-031 (ФВ-Fc) демонстрирует конструкцию, содержащую домены D1D2DD3, связанные с одиночной Fc-областью посредством отщепляемого линкера. ФВ-053 представляет собой домены D1D2. На фиг. 1E показан полноразмерный белок ФВ, содержащий пропептид (домены D1 и D2) и зрелые субъединицы (домены D', D3, A1, A2, A3, D4, B1-3, C1-2). Белок ФВ является белком в около 250 кДа и образует муль-тимеры (> 20 МДа) путем дисульфидного связывания. Белок ФВ объединяется с Ф-VIII (95-98%) в неко-валентный комплекс и далее продлевает время полужизни Ф-VIII, защищая Ф-VIII от отщепления про-теазой/активации, стабилизируя тяжелую и легкую цепь и предотвращая очищение от Ф-VIII фагоцитарными рецепторами. Белок ФВ также может ограничивать время полужизни Ф-VIII путем очищения комплекса ФЛТП-ФВ при помощи рецепторов ФВ и предотвращая пиноцитоз и рециклинг рФ-VIIIFc.
Фиг. 2 - схематические изображения примеров конструкций гетеродимеров ФВ:Ф-\ТП. Левая конструкция демонстрирует фрагмент ФВ, содержащий домены D'D3 полноразмерного ФВ (аминокислоты 1-477 из SEQ ID NO: 73) и содержащий замены аланина в остатках 336 и 379 из SEQ ID NO: 72. Конструкция химерного белка (Ф-VIII 064/065) содержит С-конец фрагмента ФВ, связанный с первой Fc-областью посредством линкера, а Ф-VIII связан со второй Fc-областью, при этом вторая Fc-область дополнительно связана с N-концом фрагмента ФВ посредством линкера (например, формула C-H1-L1-V-Ь2-Н2, в которой V является фрагментом ФВ, С является Ф-VIII, H1 и Н2 являются Fc-областями, a L1 и L2 являются отщепляемыми линкерами). Конструкция на фиг. 2б является внутриклеточно процессиро-ванной конструкцией гетеродимера ФВ:Ф-\ТП, в которой был отщеплен линкер между второй Fc-областью и N-концом фрагмента ФВ. Ф-\ТП-064 содержит домены D'D3 ФВ (аминокислоты от 1 до 477 из SEQ ID NO: 73 с заменами С336А и С379). Ф-\Ш-065 содержит домены D'D3 ФВ (аминокислоты от 1 до 276 из SEQ ID NO: 73). Ф-\Ш-136 содержит Ф-VIIIFc, связанную с Fc-фрагментом D'D3 посредством линкера, который может процессировать внутриклеточный протеазный фермент. Когда экспрессируется Ф-УШ-136, фермент отщепляет линкер между второй Fc-областью (соединенной с Ф-\ТП-ЛЦ) и D'D3 фрагментом ФВ (соединенным с первой Fc-областью), в то время как Fc-область, соединенная с (или связанная с) Ф-\ТП-ЛЦ, образует ковалентную связь (например, дисульфидную связь) с первой Fc-областью, соединенной с (или связанной с) фрагментом ФВ. Ф-\ТП-148 является одноцепочечным Ф-VIIIFc с фрагментом D'D3 (одноцепочечный Ф-VIII, получен путем внесения мутации R1645А/R1648А в ген Ф-VIII).
Фиг. 3 - схематические изображения примеров конструкций гетеродимеров ФВ: Ф-VIII, содержащие примеры переменных линкеров между ФВ и Fc-областью. Конструкции (Ф-\Ш-064, Ф-\Ш-159, Ф-VIII-160, Ф-\Ш-178 и Ф-\ЩЫ79) имеют общую структуру, представленную формулой C-H1-L1-V-L2-H2, но содержат в качестве примеров различные линкеры или аминокислотные замены. Показанные конструкции содержат одинаковый фрагмент ФВ, который представляет собой домены D' и D3 ФВ (т.е. аминокислоты от 1 до 477 из SEQ ID NO: 73 с аминокислотными заменами С336А и С379). Конструкция Ф-VIII 64 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. L2) между фрагментом ФВ и Fc-областью (т.е. Н2), который содержит 20 аминокислот. Конструкция Ф-VIII 159 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. L2) между фрагментом ФВ и Fc-областью (т.е. Н2), который содержит 35 аминокислот. Конструкция Ф-VIII 160 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. L2) между фрагментом ФВ и Fc-областью (т.е. Н2), который содержит 48 аминокислот. Конструкции Ф-\Ш-180, Ф-\Ш-181 и Ф-\Ш-182 являются производными Ф-\Ш-160, содержащими мутацию 0092А в домене С1 Ф-VIII, мутацию 0093А в домене С1 Ф-VIII и мутации K2092А/K2093А в домене С1 Ф-VIII соответственно. Конструкция Ф-\Ш-178 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. L2) между фрагментом ФВ и Fc-областью (т.е. Н2), который содержит 73 аминокислоты. Конструкция Ф-\ТП-179 содержит тромбин-отщепляемый линкер (т.е. L2) между фрагментом ФВ и Fc-областью (т.е. Н2), который содержит 98 аминокислот.
Фиг. 4 - схематические изображения примеров конструкций Ф-\ТП-ФВ, в которых ФВ является D1D2DD3 фрагментом ФВ, линкер является линкером переменной длины, содержащим сайт расщепле
ния, например сайт расщепления тромбином, ОЦ Ф-VIII является одноцепочечным Ф-VIII, который содержит замены R1645A/R1648A, Н является гетерологичным компонентом, например константной областью иммуноглобулина или ее частью, компонентом для конъюгации полиэтиленгликоля (ПЭГ) и/или ПЭГ, альбумином или фрагментом альбумина, альбумин-связывающим веществом, последовательностью НАР, компонентом для полисиалирования и/или полисиаловой кислотой, компонентом для гидро-ксиэтилового крахмала (ГЭК) и/или ГЭК или последовательностью PAS и т.д., ТЦ Ф-VIII является тяжелой цепью Ф-VIII, ЛЦ Ф-VIII является легкой цепью Ф-VIII, a Fc является Fc-областью константной области иммуноглобулина. На фиг. 4А приведена формула ФВ-линкер-ОЦ Ф-VIII. На фиг. 4Б приведена формула ФВ-линкер-Н-линкер-ОЦ Ф-VIII. Линкеры (первый линкер между ФВ и Н и второй линкер между Н и ОЦ Ф-VIII) могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4В приведена формула ФВ-линкер-ОЦ Ф-\ТП-линкер-Н. Линкеры (первый линкер между ФВ и ОЦ Ф-VIII и второй линкер между ОЦ Ф-VIII и Н) могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Г приведена формула ФВ-линкер-ТЦ Ф-VIII-Н-линкер-ЛЦ Ф-VIII. Линкеры (первый линкер между ФВ и ТЦ Ф-VIII и второй линкер между Н и ЛЦ Ф-VIII) могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Д приведена формула ТЦ ФЛТП-Н-ЛЦ Ф-VIII-линкер-первая Fc-линкер-ФВ-линкер-вторая Fc. Линкеры (первый линкер между ЛЦ Ф-VIII и первой Fc-областью, второй линкер между первой Fc-областью и ФВ и третий линкер между ФВ и второй Fc-областью) могут быть одинаковыми или разными. Линкеры могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Fc-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на N-конце и/или С-конце линкера. Первая Fc-область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Е приведена формула ТЦ Ф-VIII-Н-LC Ф-\ТП-линкер-первая Fc-линкер-ФВ-линкер-вторая Fc. Линкеры (первый линкер между ЛЦ Ф-VIII и первой Fc-областью, второй линкер между первой Fc-областью и ФВ и третий линкер между ФВ и второй Fc-областью) могут быть одинаковыми или разными. Один или более линкеров могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Fc-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на N-конце и/или С-конце линкера. Первая Fc-область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или разными. На фиг. 4Ж приведена формула ОЦ Ф-VIII-линкер-Fc-линкер-ФВ-Н-линкер-Fc. На фиг. 4З приведена формула пэгилированной или гэкилированной ОЦ Ф-VIII-линкер-Fc-линкер-ФВ-Н-линкер-Fc. Линкеры (первый линкер между ОЦ Ф-VIII и первой Fc-областью, второй линкер между первой Fc-областью и ФВ и третий линкер между Н и второй Fc-областью) могут быть одинаковыми или разными. Один или более линкеров могут являться отщепляемыми линкерами. Например, линкер между первой Fc-областью и ФВ может являться отщепляемым линкером, содержащим сайт расщепления на N-конце и/или С-конце линкера. Первая Fc-область и вторая Fc-область могут быть одинаковыми или разными.
Фиг. 5 - схематические изображения системы совместной трансфекции гетеродимеров Ф-\ТП-ФВ. Конструкция Ф-\ТП-155 содержит полноразмерную последовательность Ф-VIII (с замещением остатком аланина остатков аргинина в позициях 1645 и 1648), связанную с Fc-областью. ФВ-031 содержит фрагмент D1D2D'D3 (с замещением остатком аланина остатков цистеина в позициях 336 и 379), который связан с другой Fc-областью посредством 48 тромбин-отщепляемым линкером. После внутриклеточного процессирования конструкция Ф-\ТП-155 продуцирует полноразмерный одноцепочечный Ф-VIII (ОЦФ-VIII), соединенный с одним Fc-фрагментом, конструкция ФВ-031 продуцирует фрагмент D'D3 длиной в 477 аминокислот, связанный с другим Fc-фрагментом. Две ковалентные связи могут образовываться между Fc-фрагментами, которые связаны с ОЦ Ф-VIII или фрагментом D'D3, что, в свою очередь, делает возможной ковалентное соединение Ф-VIII и D'D3, которое является основной характеристикой требуемого конечного продукта.
Фиг. 6 иллюстрирует невосстановительный и восстановительный ДСН-ПААГ ФВ-009 (D1D2DD3 аминокислоты 1-276 х 6 HIS), который показывает, что ФВ-009 существует в виде мономера. Непроцес-сированный обозначает ФВ-009 с пропептидом (домены D1D2).
Фиг. 7 иллюстрирует невосстановительный и восстановительный ДСН-ПААГ ФВ-002 (D'D3 аминокислоты 1-447 х 6 his) или ФВ-010 (D1D2DD3 аминокислоты 1-447 х 6 his), который показывает, что ФВ-002 существует в виде мономера, а ФВ-010 существует в виде димера.
На фиг. 8 показано расщепление тромбином гетеродимера Ф-\ТП-ФВ, приведенного на фиг. 2(б). На дорожке 1 показан маркер. Дорожка 2 соответствует рФ-VIII-Fc без тромбина. Дорожка 3 соответствует рФ-VIII-Fc с тромбином. Дорожка 5 соответствует Ф-^/ППх-ФВ. Дорожка 6 соответствует Ф-VIIIFc-ФВ и тромбину. А1 обозначает домен А1 Ф-VIII, А2 обозначает домен А2 Ф-VIII, а Аа3 ЛЦ обозначает легкую цепь Ф-VIII.
На фиг. 9А, Б показана активность Ф-VIII, определенная при помощи хромогенного анализа Ф-VIII. На фиг. 9А показан фармакокинетический профиль рФ-VIII и рФ-VIIIFc для мышей с гемофилией А. На фиг. 9Б показан ФК профиль рФ-VIII и рФ-VIIIFc для мышей с двойным Ф-\ТП/ФВ генным нокаутом (ДГН). На оси Y показана активность Ф-VIII в мМЕ/мл, а на оси X показано время.
На фиг. 10А, Б показана защита Ф-VIII фрагментами D'D3, что отражает уровень мФ-VIII в плазме (мМЕ/мл) и уровень экспрессии ФВ (нМ/мл) через 48 ч после плазмидной инъекции. Фрагментами ФВ,
применяемыми для демонстрации защиты Ф-VIII, являются ФВ-001 (276ак, мономер), ФВ-009 (276ак, мономер), ФВ-002 (477ак, мономер), ФВ-010 (477ак, димер), ФВ-003 (511ак, мономер), ФВ-011 (511ак, димер), ФВ-004 (716ак, мономер), ФВ-012 (716ак, димер), ФВ-006 и ФВ-008.
На фиг. 11 показан фармакокинетический профиль рУВД-Ф-VIII для Ф-\ТП-ФВ ДГН мышей при совместном применении с фрагментами D'D3. На фиг. 11А показана активность Ф-VIII (мМЕ/мл), определенная при помощи хромогенного анализа Ф-VIII, после совместного применения рУВД-Ф-VIII и ФВ-002, или рУВД-Ф-VIII и ФВ-010, или одного рУВД-Ф-VIII к Ф-\ТИ/ФВ ДГН мышам. На фиг. 11Б показан уровень ФВ-002 и ФВ-010 в плазме (нг/мл) после применения. Ось X отображает время в часах.
На фиг. 12 показан фармакокинетический профиль рФ-VIIIFc для мышей, экспрессирующих D'D3 ФВ. На фиг. 12А показана последовательность гидродинамической инъекции (ГДИ) плазмидной ДНК, кодирующей домен D'D3 (день -5), внутривенного дозирования рФ-VIIIFc (день 0) и забора образца ФК (день 0-3) На фиг. 12Б показана активность плазменного Ф-VIII (мМЕ/мл) после инфузии рФ-VIIIFc, определенная при помощи хромогенного анализа для Ф-\ТП/ФВ ДГН мышей, которым проводили ГДИ доменов D1D2DD3 (477ак) (кружки) и доменов D1D2DD3 (477ак) с цистеиновыми заменами (прямоугольники). Активность Ф-VIII для контрольных мышей без ГДИ доменов D'D3 показана в виде треугольников. На фиг. 12В показан уровень D'D3 в плазме (нг/мл) после применения ГДИ D1D2DD3 ди-мерной или D1D2DD3 мономерной конструкции ДНК. Ось X отображает время в часах.
На фиг. 13 показана подборка линкеров D'D3-Fc по ГДИ для Ф-\ТП/ФВ ДГН мышей. Между доменами D'D3 и Fc-областью были вставлены линкеры различной длины (20ак (Ф-\ТП-064), 35ак (Ф-VIII-159) или 48ак (Ф-\ТП-160)). Активность Ф-VIII (мМЕ/мл) определяли при помощи хромогенного анализа после ГДИ для Ф-\ТП/ФВ ДГН мышей.
На фиг. 14 показана ГДИ одноцепочечного гетеродимера Ф-VIIIFc/D'D3 Ф-\ТИ/ФВ ДГН мышам. Активности Ф-VIII процессированного (двухцепочечного) рФ-^/ППх^ТО (п^У№Ф-\ТП-136) и одно-цепочечного рФ-^/ППх^ТО (п^У^Ф-^ЛП-Ш) определяли через 24 и 48 ч после ГДИ.
На фиг. 15 показана аффинность связывания гетеродимера Ф-\Ш-155/ФВ-031 с обездвиженным чФВ, определенная при помощи платформы Octet. Ф-VIIIFc, Ф-VIII и IgG также использовали в качестве контроля. На оси х показано время в часах, а на оси у показано связывание в нанометрах (нм).
На фиг. 16 показана фармакокинетика Ф-\ТП-155/ФВ-031 для мышей с дефицитом Ф-\ТП/ФВ (Ф-VIII/ФВ ДГН). На оси х показано время в часах, а на оси у показано восстановление Ф-VIII относительно исходного уровня в процентах.
Фиг. 17 - схематические изображения примеров конструкций фрагментов ФВ, в которых ФВ является D1D2DD3 фрагментом ФВ; линкер является линкером переменной длины, содержащим сайт расщепления, например сайт расщепления тромбином; Н является гетерологичным компонентом, например константной областью иммуноглобулина или ее частью, компонентом для конъюгации полиэтиленгли-коля (ПЭГ) и/или ПЭГ, альбумином или фрагментом альбумина, альбумин-связывающим веществом, последовательностью НАР, компонентом для полисиалирования и/или полисиаловой кислотой, компонентом для гидроксиэтилового крахмала (ГЭК) и/или ГЭК или последовательностью PAS и т.д.; и Fc является Fc-областью иммуноглобулина. На фиг. 17 А приведена формула D1D2-D'-составляющей D3^-составляющая D3-линкер-Fc. На фиг. 17Б приведена формула D1D2-составляющей D'-H- составляющая D'D3-линкер-Fc. На фиг. 17В приведена формула D1D2-пэгилированной или гэкилированной D'D3-линкер-Fc. В некоторых случаях линкер может быть отщеплен.
Фиг. 18А - показана потеря со временем Ф-\Ш-активности Ф-VIIIFc как в гемА-плазме (ромбы), так и в ДГН-плазме (квадраты). Активность Ф-VIII определена при помощи хромогенного анализа. На оси х показано время в часах, а на оси у показана относительная активность. На фиг. 18Б показано, что потеря Ф-\ТП-активности происходит из-за диссоциации или деградации тяжелой цепи (ТЦ). На левой панели показан иммунопреципитационный анализ, в котором использовалось овечье поликлональное антитело к Ф-VIII в Bio-rad 4-15% геле. Гель был гидрирован и визуализирован при помощи системы Bio-rad. На дорожке 1 показан неокрашенный маркер Bio-rad; на дорожке 2 показаны Ф-VIIIFc и ФБР; на дорожке 3 показаны Ф-VIIIFc и ДГН-плазма; и на дорожке 5 показано одно овечье поликлональное антитело к Ф-VIII. На правой панели показан вестерн-блоттинг геля, в котором использовалось антитело к тяжелой цепи Ф-VIII (GMA012). На дорожке 1 показан неокрашенный маркер Bio-rad; на дорожке 2 показаны Ф-VIIIFc и ФБР; на дорожке 3 показаны Ф-VIIIFc и ДГН-плазма; и на дорожке 4 показано одно овечье поликлональное антитело к Ф-VIII.
На фиг. 19 показана Ф-\ТП-активность как функция времени для Ф-VIIIFc дикого типа (кружки), оцФ-VIIIFc (одноцепочечного Ф-VIII) (закрашенные треугольники) или гетеродимеров Ф-\ПП:ФВ (например, Ф-\ТШ55/ФВ031) (пустые треугольники), определенная при помощи хромогенного анализа в плазме ДГН мышей (левая панель) и плазме гемА мышей (правая панель). На оси У показана относительная активность Ф-VIII. Ф-VIIIFc дикого типа содержит двойную цепь Ф-VIII (т.е. тяжелую цепь Ф-VIII и легкую цепь Ф-VIII, которые удерживаются вместе нековалентной связью) и, таким образом, имеет три цепи - тяжелую цепь Ф-VIII, легкую цепь Ф-VIII, сшитую с Fc, и саму Fc-область. ОцФ-VHIIFc содержит одиночную цепь Ф-VIII и, таким образом, имеет две цепи, одну, в которой одиночная цепь Ф-VIII сшита с Fc, и другую, содержащую только Fc. Гетеродимер Ф-\Ш:ФВ (например, Ф-
VIII155/ФВ031) содержит одиночную цепь Ф-VIII, сшитую с Fc, и фрагмент ФВ (D'D3), сшитый с Fc.
На фиг. 20 показан процессинг домена D1D2, принадлежащего фрагменту ФВ (например, ФВ-031(D1D2D'D3Fc)), при помощи РС5 или РАСЕ (фурина) различных концентраций. Процессинг D1D2 показан в Bio-rad 4-15% геле в восстановительных условиях при помощи устройства для визуализации Bio-rad. На дорожке 1 показан один ФВ031; на дорожке 2 показан один РС5; на дорожке 3 показан один РАСЕ; на дорожке 4 показаны ФВ031 и РС5 при 2,5%; на дорожке 5 показаны ФВ031 и РС5 при 5%; на дорожке 6 показаны ФВ031 и РС5 при 7,5%; на дорожке 7 показаны ФВ031 и РС5 при 10%; на дорожке 8 показаны ФВ031 и РАСЕ при 2,5%; на дорожке 9 показаны ФВ031 и РАСЕ при 5%; на дорожке 10 показан ФВ031 при 7,5%; и на дорожке 11 показаны ФВ031 и РАСЕ при 10%.
Фиг. 21А - приведен анализ связывания гетеродимера Ф-\ПП:ФВ (например, Ф-\Ш-155/ФВ-031), проведенный при помощи октетной установки ForteBio. Для анализа при помощи сенсора APS был снят полноразмерный ФВ. На нижней левой панели показано связывание Ф-VIIIFc и Ф-VIII с полноразмерным ФВ. На нижней правой панели показано отсутствие связывания между Ф-\ЩП680 (мутантом, не обладающим аффинностью к ФВ) и гетеродимером ФЛТП:ФВ (Ф-\ПП55/ФВ031). На фиг. 21Б приведен другой связывания гетеродимера Ф-\ПП:ФВ (например, ФЛТП-155/ФВ-031). При проведении этого анализа конструкции (конструкция ФВ031, Ф-\ПП55/ФВ031 или Ф-VIII) были обездвижены на G-белковом сенсоре. Было определено связывание конструкций с Ф-VIII.
На фиг. 22 показана аффинность связывания доменов D'D3 ФВ с молекулой Ф-VIII, определенная экспериментом по поверхностному плазмонному резонансу. Конструкция ФВ031 (100 КЕ) захватывалась античеловеческим IgG в 1000 КЕ. Ф-VIII с удаленным В-доменом применяли в одноцикловом кинетическом режиме в соотношении 1:1. Общее количество составляло 4.
На фиг. 23 показано влияние различной длины линкеров в гетеродимерных конструкциях Ф-VIIIFc/ФВ на фармакокинетику при применении на Ф-\ТП/ФВ ДГН мышах. Между D'D3 и Fc были вставлены три различных линкера (в 48 ак, 73 ак или 98 ак), т.е. ФВ031, ФВ035 и ФВ036. Активность Ф-VIII, нормированная относительно 5-минутной, величины (%) показана на оси У.
На фиг. 24 показаны примеры лигирования сортазой фрагмента ФВ с Ф-VIII. На фиг. 24А) показаны две конструкции лигирования, где (1) фрагмент ФВ в области С-конца сшит с распознающим сортазу мотивом (например, LPXTG), и (2) Ф-VIII содержит глицин (n) в области N-конца. После реакции с сортазой фрагмент ФВ и распознающий сортазу мотив оказываются лигированными к N-концу Ф-VIII. На фиг. 24Б) показаны две конструкции лигирования, где (1) Ф-VIII в области С-конца сшит с распознающим сортазу мотивом, и (2) фрагмент ФВ содержит глицин (n) в области N-конца. После реакции с сортазой Ф-VIII и распознающий сортазу мотив оказываются сшитыми с фрагментом ФВ в N-конце фрагмента ФВ. На фиг. 24В) показаны две конструкции лигирования, где (1) фрагмент ФВ сшит с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, и (2) Ф-VIII в области N-конца сшит с глицином (n). После реакции с сортазой ФВ, сшитый при помощи линкера с распознающим сортазу мотивом, оказывается лигированным к N-концу Ф-VIII. На фиг. 24Г) показаны две конструкции лигирования, где (1) Ф-VIII сшит с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, и (2) фрагмент ФВ в области N-конца сшит с глицином (n). После реакции с сортазой Ф-VIII, сшитый при помощи линкера с распознающим сортазу мотивом, оказывается лигированным к N-концу фрагмента ФВ. На фиг. 24Д) показана конструкция лигирования, содержащая фрагмент ФВ, сшитый с распознающим сортазу мотивом при помощи линкера переменной длины, который также сшит с сайтом расщепления протеазой (например, сайтом расщепления тромбином), сшитом с Fc при помощи линкера переменной длины.
На фиг. 25 показано схематическое сравнение Ф-\ПП55 и Ф-\ЩП98. Ф-\ПП55 кодирует одноце-почечный белок Ф-VIIIFc. Ф-\ПП98 является одноцепочечной молекулой-226Ж Ф-VIIIFc, содержащей частичный В-домен. 226 обозначает 226 N-концевых аминокислот В-домена Ф-VIII, а N6 обозначает шесть участков N-гликозилирования в В-домене.
Фиг. 26А) показан анализ стабильности, в котором определяется относительная активность Ф-VIII155 и Ф-\ТШ98 в ДГ Н-плазме как функция времени. Как видно из чертежа, наличие частичного В-домена в Ф-\ЩП98 повысило стабильность одноцепочечного Ф-VIIIFc по сравнению с Ф-\ПП55; на фиг. 26Б) показано сравнение времен полужизни Ф-\ПП55 и Ф-\ПП98 и двухцепочечного (дцФ-VIIIFc) в ДГН мышах. Как видно из чертежа, для одноцепочечного Ф-VIII (Ф-\ТШ55) наблюдается увеличение времени полужизни в 1,5 раз по сравнению с двухцепочечным Ф-VIII. Одноцепочечный Ф-VIII с 266N6 В-доменом (Ф-\ТШ98) демонстрирует дополнительно увеличение времени полужизни в 1,5 раз. На графике показана зависимость восстановления Ф-VIII от 5-минутного значения (%) как функция времени.
Детальное описание изобретения Определения
Стоит отметить, что употребление единственного числа по отношению к какому-либо объекту относится к одному или более объектам, например, под выражением "нуклеотидная последовательность" подразумевается одна или более нуклеотидных последовательностей. Соответственно фирма единственного числа и термины "один или более" и "по меньшей мере один" могут взаимозаменяемо употребляться в данном тексте.
Термин "полинуклеотид" или "нуклеотид" включает в себя как одиночную нуклеиновую кислоту, так и множественные нуклеиновые кислоты, и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например информационной РНК (иРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). В определенных вариантах реализации изобретения полинуклеотид содержит обычную фосфодиэфирную связь или альтернативную связь (например, амидную связь, которую можно обнаружить в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин "нуклеиновая кислота" относится к какому-либо одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под " выделенными" нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из своей естественной среды. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид фактора VIII, содержащийся в векторе, считается выделенным в контексте настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичной клетке-хозяине или очищенные (частично или в значительной степени) от других полинуклеотидов в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или invitro РНК транскрипты полинуклеотидов, являющихся объектами настоящего изобретения. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетическим способом. Вдобавок поли-нуклеотид или нуклеиновая кислота может содержать регуляторные элементы, такие как промоторы, энхансеры, участки связывания рибосом или сигналы терминации транскрипции.
При употреблении в данном тексте "кодирующая область" или "кодирующая последовательность" представляют собой фрагмент полинуклеотида, который состоит из кодонов, которые могут транслироваться в аминокислоты. Хотя "стоп-кодон" (TAG, TGA или ТАА) обычно не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, но любые фланкирующие последовательности, например промоторы, участки связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и тому подобные элементы не являются частью кодирующей области. Границы кодирующей области обычно определяются стартовым кодоном на 5'-конце, кодирующем аминоконец результирующего полипептида, и трансляционным стоп-кодоном на 3'-конце, кодирующем карбоксильный конец результирующего полипептида. Две или более кодирующих областей согласно настоящему изобретению могут присутствовать в одиночной полинуклеотидной конструкции, например в одиночном векторе, или в отдельных полинук-леотидных конструкциях, например в отдельных (различных) векторах. Следовательно, отсюда вытекает, что одиночный вектор может содержать только одиночную кодирующую область или содержать две или более кодирующих областей, например одиночный вектор может отдельно кодировать связывающий домен-А и связывающий домен-В, как описано ниже. Вдобавок вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, являющиеся объектами данного изобретения, могут кодировать гетерологичные кодирующие области, как сшитые, так и несшитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей связывающий домен согласно изобретению. Гетерологичные кодирующие области без ограничений включают специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.
Определенные белки, секретируемые клетками млекопитающих, связаны с секреторным сигнальным пептидом, который отщепляется от зрелого белка, как только инициируется экспорт растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области техники известно, что сигнальные пептиды в общем случае сшиты с N-концом полипептида для того, чтобы вырабатывать секретируемую или "зрелую" форму полипептида. В определенных вариантах реализации изобретения применяется нативный сигнальный пептид, например сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, либо функциональное производное такой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией функционально связанного с ней полипептида. В альтернативном варианте может применяться гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего, например человеческий тканевой активатор плазминогена (ТАП) или мышиный сигнальный пептид Р-глюкуронидазы, либо его функциональное производное.
Термин " нижележащая" относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 3' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения нижележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые следуют за точкой старта транскрипции. Например, кодон инициации трансляции гена расположен ниже сайта старта транскрипции.
Термин " вышележащая" относится к нуклеотидной последовательности, которая расположена в направлении 5' от основной нуклеотидной последовательности. В определенных вариантах реализации изобретения вышележащие нуклеотидные последовательности относятся к последовательностям, которые расположены на 5' стороне кодирующей области или точки старта транскрипции. Например, большинство промоторов располагаются выше сайта старта транскрипции.
При употреблении в данном тексте "регуляторная область" относится к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (в направлении 5' некодирующих последовательностей), в рамках или ниже (в направлении 3' некодирующих последовательностей) кодирующей области, и которые оказывают влияние на транскрипцию, процессинг РНК, стабильность или трансляцию связанной с ней коди
рующей области. Регуляторные области могут включать промоторы, трансляционные лидерные последовательности, интроны, последовательности распознавания полиаденилирования, участки процессинга РНК, участки связывания эффекторов и структуры типа "стебель - петля". Если кодирующая область предназначена для экспрессии в эукариотической клетке, сигнальная последовательность полиаденили-рования и последовательность терминации транскрипции обычно расположены в направлении 3' относительно кодирующей последовательности.
Полинуклеотид, который кодирует генный продукт, например полипептид, может включать промотор и/или другие транскрипционные или трансляционные контрольные элементы, функционально связанные с одной или более кодирующими областями. Находящаяся в функциональной связи кодирующая область для генного продукта, например полипептида, связана с одной или более регуляторными областями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта оказалась под влиянием или контролем регуля-торной области (областей). Например, кодирующая область и промотор являются функционально связанными, если индукция действия промотора приводит к транскрипции иРНК, кодирующей генный продукт, кодируемый кодирующей областью, и если природа связи между промотором и кодирующей областью не препятствует возможности промотора управлять экспрессией генного продукта или не препятствует возможности транскрибирования ДНК-матрицы. Другие транскрипционные контрольные элементы, кроме промотора, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, также могут быть функционально связанными с кодирующей областью для того, чтобы управлять экспрессией генного продукта.
Специалистам в данной области техники известно множество транскрипционных контрольных областей. Они включают без ограничения транскрипционные контрольные области, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как промоторные и энхансерные сегменты цитомегаловирусов (пред-ранний промотор в сочетании с интроном-А), вирус обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусы (такие как вирус саркомы Рауса). Другие транскрипционные контрольные области включают те, которые получены из генов позвоночных, такие как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и кроличий Р-глобин, а также другие последовательности, способные контролировать генную экспрессию в эукарио-тических клетках. Дополнительные подходящие транскрипционные контрольные области включают тка-неспецифические промоторы и энхансеры, а также лимфокин-индуцибельные промоторы (например, индуцибельные интерферонами или интерлейкинами промоторы).
Аналогично, специалистам в данной области техники известно множество трансляционных контрольных элементов. Они включают без ограничения участки связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы или УВПР, также называемый CITE-последовательностью).
Употребляемый в данном тексте термин "экспрессия" относится к процессу, посредством которого полинуклеотид продуцирует генный продукт, например РНК или полипептид. Он включает без ограничения транскрипцию полинуклеотида в информационную РНК (иРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК (мшРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК) или любой другой РНК-продукт, и трансляцию иРНК в полипептид. При помощи экспрессии получают "генный продукт". При употреблении в данном тексте генный продукт может представлять нуклеиновую кислоту, например информационную РНК, полученную посредством транскрипции гена, или полипептид, который был транслирован с транскрипта. Описанные в данном тексте генные продукты дополнительно включают нуклеиновые кислоты, прошедшие пост-транскрипционные модификации, например полиаденилирование или сплайсинг, или полипептиды, прошедшие пост-транскрипционные модификации, например метилирование, гликозилирование, добавление липидов, объединение с другими белковыми субъединицами или протеолитическое расщепление.
" Вектор" относится к любому средству для клонирования и/или переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Вектор может являться репликоном, к которому может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. "Ре-пликон" относится к любому генетическому элементу (например, плазмиде, фагу, космиде, хромосоме, вирусу), который функционирует как автономная единица репликации in vivo, т.е. способен к самостоятельно управляемой репликации. Термин "вектор" включает как вирусной, так и невирусной природы средства для внесения нуклеиновой кислоты в клетку invitro, ex vivo или in vivo. В данной области техники известно и применяется большое количество векторов, включая, например, плазмиды, модифицированные эукариотические вирусы или модифицированные бактериальные вирусы. Вставку полинуклео-тида в подходящий вектор можно осуществить путем лигирования соответствующих фрагментов поли-нуклеотида в выбранный вектор, который имеет комплементарные липкие концы.
Векторы могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать селектируемые маркеры или репортеры, которые обеспечивают отбор или идентификацию клеток, в которые был инкорпорирован вектор. Экспрессия селектируемых маркеров или репортеров позволяет осуществлять идентификацию и/или отбор клеток-хозяев, которые инкорпорируют и экспрессируют другие кодирующие области, содержащиеся в векторе. Примеры известных и применяемых в данной области техники генов селектируемых маркеров включают: гены, обеспечивающие устойчивость к ампициллину, стрептомицину, ген
тамицину, канамицину, гигромицину, гербициду биалафос, сульфонамиду и тому подобным веществам; и гены, которые применяются в качестве фенотипических маркеров, т. е. регуляторные гены антоцианов, ген изопентенил трансферазы и тому подобные. Примеры известных и применяемых в данной области техники репортеров включают: люциферазу (Люц), зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ), хлорамфени-кол-ацетилтрансферазу (ХАТ), -галактозидазу (ЛакЗ), -глюкуронидазу (Гуз) и тому подобные вещества. Селектируемые маркеры также могут считаться репортерами.
Термин " плазмида" относится к внехромосомному элементу, часто несущему ген, который не является частью центрального метаболизма клетки, и обычно находящемуся в форме кольцевых двухцепо-чечных молекул ДНК. Такие элементы могут являться автономно реплицирующимися последовательностями, интергирующимися в геном последовательностями, фагом или нуклеотидными последовательностями, линейными, кольцевыми или сверхспиральными одно- или двухцепочечных ДНК или РНК, полученными из произвольного источника, в которых определенное число нуклеотидных последовательностей было соединено или рекомбинировано в уникальную конструкцию, которая способна внести в клетку фрагмент промотора и последовательность ДНК для выбранного генного продукта вместе с соответствующей 3' нетранслируемой последовательностью.
Эукариотические вирусные векторы, которые могут применяться, включают, но не ограничиваются этим, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные векторы, по-ксвирус, например векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе бакуловирусов или векторы на основе вируса герпеса. Невирусные векторы включают плазмиды, липосомы, электрически заряженные липиды (цитофектины), ДНК-белковый комплексы и биополимеры.
"Клонирующий вектор" относится к "репликону", который является единицей длины нуклеиновой кислоты, которая последовательно реплицируется и которая содержит точку начала репликации, такую как плазмида, фаг или космида, к которой может быть присоединен сегмент другой нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы привести к репликации присоединенного сегмента. Определенные клонирующие векторы способны к репликации в одном типе клеток, например в бактериальных клетках, и экспрессии в другом, например в эукариотических клетках. Клонирующие векторы обычно содержат одну или более последовательностей, которые могут применяться для отбора клеток, содержащих вектор, и/или один или более множественных клонирующих участков для вставки представляющих интерес нук-леотидных последовательностей.
Термин "экспрессионный вектор" относится к элементу, сконструированному для того, чтобы сделать возможной экспрессию вставленной нуклеотидной последовательности после внесение в клетку-хозяина. Вставленная нуклеотидная последовательность размещается в функциональной связи с регуля-торными областями, как описано выше.
Векторы вносят в клетки-хозяев способами, хорошо известными в данной области техники, например путем трансфекции, электропорации, микроинъекции, трансдукции, клеточного слияния, при помощи диэтиламиноэтилдекстрана, осаждения фосфата кальция, липофекции (слияния лизосом), применения генной пушки или транспортера ДНК-вектора.
При употреблении в данном тексте "культивировать", "культивирование" и "культивация" обозначают инкубацию клеток в таких invitro условиях, которые способствуют росту клеток или делению, или поддержанию клеток в живом состоянии. При употреблении в данном тексте "культивированные клетки" обозначают клетки, которые были размножены invitro.
При употреблении в данном тексте термин "полипептид" включает в себя как одиночный "полипептид", так и множественные "полипептиды", и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин "полипептид" относится к любой цепи или цепям двух или более аминокислот и не относится к специфичной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, "белок", "аминокислотная цепь" либо любой другой термин, применяемый для обозначения цепи или цепей двух или более аминокислот, включены в определение "полипептида", а термин "полипептид" может применяться вместо либо взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Термин "полипептид" также относится к продуктам пост-экспрессионной модификации полипептида, включая без ограничений гликозилирование, аце-тилирование, фосфорилирование, амидирование, дериватизацию известными защитными/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию аминокислотами неприродного происхождения. Полипептид может быть получен из природного биологического ресурса или при помощи рекомбинатной технологии, но не обязательно являться транслированным из определенной нуклеотидной последовательности. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез.
" Выделенный" полипептид или его фрагмент, вариант или производное обозначает полипептид, который не находится в своем естественном окружении. Никакой конкретный уровень очистки не требуется. Например, выделенный полипептид может быть просто удален из своего природного или естественного окружения. Полученные при помощи рекомбинантных технологий полипептиды и белки, экспрес-сируемые в клетках-хозяевах, считаются выделенными в контексте данного изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы либо частично или в зна
чительной степени очищены любым подходящим способом.
Также в настоящее изобретение включены фрагменты или варианты полипептидов и любые их комбинации. Термин "фрагмент" или "вариант" в отношении связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые свойства (например, аффинность связывания с FcRn в случае FcRn-связывающего домена или Fc-варианта, активность коагуляции в случае Ф-\ТП-варианта или Ф-\ТП-связывающую активность в случае фрагмента ФВ) основного полипептида. Фрагменты полипептидов включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты дополнительно к специфическим фрагментам антител, обсуждаемым в другом месте данного текста, но не включают полноразмерный полипептид природного происхождения (или зрелый полипептид). Варианты связывающих доменов полипептидов или связывающих молекул, являющихся объектами настоящего изобретения, включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. Варианты могут быть природного и неприродного происхождения. Варианты неприродного происхождения могут быть получены путем известных в данной области техники методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавки.
Употребляемый в данном тексте термин "фрагмент ФВ" или "фрагменты ФВ" обозначает любые фрагменты ФВ, которые взаимодействуют с Ф-VIII и сохраняют по меньшей мере одно или более свойств, которые обычно обеспечивает Ф-VIII полноразмерный ФВ, например предотвращение преждевременной активации Ф-VIIIa, предотвращение преждевременного протеолиза, предотвращение связывания с фосфолипидными мембранами, которое может привести к преждевременному клиренсу, предотвращение связывания с клиренс-рецепторами Ф-VIII, которые могут связывать незащищенный Ф-VIII, но не ФВ-связанный Ф-VIII, и/или стабилизацию взаимодействий тяжелой цепи и легкой цепи Ф-VIII. Употребляемый в данном тексте термин "фрагмент ФВ" не включает полноразмерный или зрелый белок ФВ. В конкретном варианте реализации изобретения упоминаемый в данном тексте "фрагмент ФВ" содержит домен D' и домен D3 белка ФВ, но не содержит домен А1, домен А2, домен A3, домен D4, домен В1, домен В2, домен В3, домен С1, домен С2 и домен CK белка ФВ.
Употребляемый в данном тексте термин "фактор, ограничивающий время полужизни" или "фактор, ограничивающий время полужизни Ф-VIII" определяет фактор, который предупреждает продление времени полужизни белка Ф-VIII более чем в 1,5 раз или 2 раза по сравнению с Ф-VIII дикого типа (например, ADVATE(r) или REFACTO(r)). Например, полноразмерный или зрелый ФВ может действовать как фактор, ограничивающий время полужизни Ф-VIII, индуцируя выведение комплекса Ф-VIII и ФВ из системы в процессе одного или более каскадов выведения ФВ. В одном примере эндогенный ФВ является фактором, ограничивающим время полужизни Ф-VIII. В другом примере полноразмерная рекомбинант-ная молекула ФВ, нековалентно связанная с белком Ф-VIII, является фактором, ограничивающим время полужизни Ф-VIII.
Употребляемый в данном тексте термин "эндогенный ФВ" определяет молекулы ФВ, присутствующие в плазме в природном состоянии. Эндогенная молекула ФВ может являться мультимером, но может быть и мономером или димером. Эндогенный ФВ в плазме связывается с Ф-VIII и образует с Ф-VIII нековалентный комплекс.
" Консервативной аминокислотной заменой" является такая, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутами, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, ала-нин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, если аминокислота в полипептиде замещается другой аминокислотой, принадлежащей тому же семейству боковых цепей, такая замена считается консервативной. В другом варианте реализации изобретения ряд аминокислот может быть консервативно заменен структурно подобным рядом, который отличается порядком и/или составом представителей семейства боковых цепей.
Как известно в данной области техники "идентичность последовательностей" между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотной последовательности одного полипептида с последовательностью второго полипептида. При обсуждении в данном тексте определение того, является ли любой конкретный полипептид идентичным по меньшей мере на около 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% другому полипептиду, осуществляется при помощи известных в данной области техники методов и компьютерных программ/программного обеспечения, включающих, но не ограничивающихся этим, программу BESTFIT (WisconsinSequenceAnalysisPackage, Версия 8 для Unix, GeneticsComputer-Group, UniversityResearchPark, 575 ScienceDrive, Madison, WI 53711). BESTFIT использует алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, AdvancesinAppliedMathematics 2:482-489 (1981), для того, чтобы
найти сегмент наибольшей гомологии между двумя последовательностями. При применении BESTFIT или любой другой программы для выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной основной последовательности согласно настоящему изобретению, параметры устанавливают, конечно, таким образом, что процент идентичности рассчитывается относительно полной длины основной полипептидной последовательности и допускаются расхождения в гомологии до 5% относительно общего числа аминокислот в основной последовательности.
При употреблении в данном тексте "аминокислота, соответствующая чему-либо" или "эквивалентная аминокислота" в последовательности ФВ или последовательности белка Ф-VIII определяются по выравниванию с целью максимизировать идентичность или сходство между первой последовательностью ФВ или Ф-VIII и второй последовательностью ФВ или Ф-VIII. Число, применяемое для определения эквивалентной аминокислоты во второй последовательности ФВ или Ф-VIII, зависит от числа, применяемого для определения соответствующей аминокислоты в первой последовательности ФВ или Ф-
VIII.
" Слитый" или "химерный" белок содержит первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, с которой она не связана в естественном состоянии. Аминокислотные последовательности, которые обычно присутствуют в разных белках, могут быть соединены вместе в слитом полипептиде, либо аминокислотные последовательности, которые обычно присутствуют в одном белке, могут быть размещены в новом порядке в слитом полипептиде, примером чего является слияние домена фактора VIII, являющегося объектом данного изобретения, с Fc-доменом иммуноглобулина. Слитый белок создают, например, путем химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, в котором пептидные области кодируются в необходимом взаиморасположении. Химерный белок может дополнительно содержать вторую аминокислотную последовательность, связанную с первой аминокислотной последовательностью ковалентной, непептидной связью или неко-валентной связью.
Употребляемый в данном тексте термин "время полужизни" относится к биологическому времени полужизни конкретного полипептида in vivo. Время полужизни может обозначать время, необходимое для того, чтобы половина количества введенного испытуемому объекту препарата была выведена из кровообращения и/или других тканей животного. При построении кривой выведения данного полипептида как функции времени кривая обычно является двухфазной с быстрой сс-фазой и более длинной Р-фазой. сс-фаза обычно отображает равновесное распределение введенного Fc полипептида между внутрисосуди-стым и внесосудистым пространством и частично определяется размером полипептида. Р-фаза обычно отображает катаболизм полипептида во внутрисосудистом пространстве. В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-VIII и содержащие Ф-VIII химерные белки являются монофазными и, таким образом, не имеют альфа-фазы, а только бета-фазу. Следовательно, в определенных вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин время полужизни относится ко времени полужизни полипептида в Р-фазе. Обычное время полужизни Р-фазы человеческого антитела у человека составляет 21 день.
При применении к полинуклеотиду или полипептиду термин "гетерологичный" означает, что поли-нуклеотид или полипептид получены из объекта, отличного от того объекта, с которым проводится сравнение. Следовательно, гетерологичный полипептид, связанный с фрагментом ФВ, обозначает полипептидную цепь, которая связана с фрагментом ФВ и не является частью фрагмента ФВ природного происхождения. Например, гетерологичный полипептид или антиген может быть получен от различных видов, из различных типов клеток особи либо одинаковых или различных типов клеток различных особей.
Употребляемый в данном тексте термин "связанный" относится к первой аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, ковалентно или нековалентно соединенной со второй аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью соответственно. Термин "ковалентно связанный" или "ковалентная связь" относится к ковалентной связи, например ди-сульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислотам, например линкеру, между двумя связанными между собой компонентами. Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность может быть прямым образом связана или соединена со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, или в другом варианте промежуточная последовательность может ковалентно связывать первую последовательность со второй последовательностью. Термин "связанный" обозначает не только сшивание первой аминокислотной последовательности со второй аминокислотной последовательностью в области С-конца или N-конца, но также включает вставку полной первой аминокислотной последовательности (или второй аминокислотной последовательности) между любыми двумя аминокислотами второй аминокислотной последовательности (или первой аминокислотной последовательности соответственно). В одном варианте реализации изобретения первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством пептидной связи или линкера. Первая аминокислотная последовательность может быть соединена со второй аминокислотной последовательностью посредством фосфодиэфирной связи или линкера. Линкер может представ
лять собой пептид или полипептид (для полипептидных цепей) или нуклеотид или нуклеотидную цепь (для нуклеотидных цепей) либо любое химическое соединение (как для полипептидных, так и для поли-нуклеотидных цепей). Ковалентную связь иногда обозначают как (-) или дефис.
Употребляемый в данном тексте термин "связанный с" относится к ковалентной или нековалентной связи, образованной между первой аминокислотной цепью и второй аминокислотной цепью. В одном варианте реализации изобретения термин "связанный с" обозначает ковалентную, непептидную связь или нековалентную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения такую связь обозначают двоеточием, т. е. (:). В другом варианте реализации изобретения он обозначает ковалентную связь за исключением пептидной связи. В других вариантах реализации изобретения употребляемый в данном тексте термин "ковалентно связанный" обозначает связь между двумя компонентами посредством ковалентной связи, например дисульфидной связи, пептидной связи или одной или более аминокислот (например, линкера). Например, аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик с тиольной группой второго остатка цистеина. В большинстве молекул IgG природного происхождения области СН1 и CL связаны дисульфидной связью, а две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в позициях, соответствующих 239 и 242 согласно системе нумерации Кабата (позиции 226 и 229 в Европейской системе нумерации). Примеры ковалентных связей включают, но не ограничиваются этим, пептидную связь, металлическую связь, водородную связь, ди-сульфидную связь, сигма-связь, пи-связь, дельта-связь, гликозидную связь, агностическую связь, изогнутую связь, диполярную связь, пи-обратную связь, двойную связь, тройную связь, четвертную связь, пятерную связь, шестерную связь, конъюгацию, гиперконъюгацию, ароматичность, гаптичность или антисвязывание. Неограничивающие примеры нековалентной связи включают ионную связь (например, ка-тионную пи-связь или соляную связь), металлическую связь, водородную связь (например, диводород-ную связь, диводородный комплекс, низкобарьерную водородную связь или симметричную водородную связь), Ван-дер-Ваальсовы силы, лондоновские дисперсионные силы, механическую связь, галогенную связь, аурофильность, интеркаляцию, стэкинг, энтропийные силы или химическую полярность.
Употребляемый в данном тексте термин "мономерно-димерный гибрид" относится к химерному белку, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, которые связаны друг с другом дисульфидной связью, при этом первая цепь содержит фактор свертывания крови, например фактор VIII, и Fc-область, а вторая цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из Fc-области без фактора свертывания крови. Мономерно-димерная гибридная конструкция, таким образом, является гибридом, содержащим мономерную часть, содержащую только один фактор свертывания крови, и димерную часть, содержащую две Fc-области.
Употребляемый в данном тексте термин "сайт расщепления" или "сайт ферментного расщепления" относится к сайту, распознаваемому ферментом. Определенные сайты ферментного расщепления содержат сайт внутриклеточного процессинга. В одном варианте реализации изобретения полипептид содержит сайт ферментного расщепления, расщепляемый ферментом, который активируется во время каскада свертывания таким образом, что расщепление таких сайтов происходит на участке образования тромба. Примеры таких сайтов включают, например, те, которые распознаются тромбином, фактор XIa или фактор Ха. Примеры сайтов расщепления Ф-XIa включают, например, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47) и SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 48). Примеры сайтов расщепления тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO: 50), LVPRG (SEQ ID NO: 55) и ALRPR (аминокислоты от 1 до 5 из SEQ ID NO: 51). Другие сайты ферментного расщепления известны в данной области техники.
Употребляемый в данном тексте термин "сайт процессинга" или "сайт внутриклеточного процес-синга" относится к такому типу сайтов ферментного расщепления в полипептиде, являющемся целью для ферментов, которые действуют после трансляции полипептида. В одном варианте реализации изобретения такие ферменты действуют во время переноса из полости аппарата Гольджи в транс-Гольджи компартмент. Ферменты внутриклеточного процессинга расщепляют полипептиды перед секрецией белка из клетки. Примеры таких сайтов процессинга включают, например, те, на которые нацелены представители семейства РАСЕ/фурин (где РАСЕ является акронимом от англ. "PairedbasicAminoacidCleavin-gEnzyme" - фермент, расщепляющий спаренные основные аминокислоты) эндопептидаз. Эти ферменты находятся в мембране Гольджи и расщепляют белки со стороны карбоксильного конца мотива последовательности Arg-[любой остаток]-(Lys или Arg)-Arg. Упоминаемые в данном тексте представители "фу-ринового" семейства ферментов включают, например, PCSK1 (также известный как PC1/Pc3), PCSK2 (также известный как РС2), PCSK3 (также известный как фурин или РАСЕ), PCSK4 (также известный как РС4), PCSK5 (также известный как PC5 или РС6), PCSK6 (также известный как РАСЕ4) или PCSK7 (также известный как PC7/LPC, РС8 или SPC7). Другие сайты процессинга известны в данной области техники.
Термин "фурин" относится к ферментам, соответствующим ECNo. 3.4.21.75. Фурин является субти-лизин-подобной пробелковой конвертазой, которая также известна под названием РАСЕ (Pairedbasi-cAminoacidCleavingEnzyme). Фурин удаляет секции неактивных белков-предшественников для того, чтобы конвертировать их в биологически активные белки. Во время своего внутриклеточного перемеще
ния пропептид отщепляется от зрелой молекулы ФВ ферментом фурином в аппарате Гольджи.
Понятно, что в конструкциях, содержащих более одного сайта процессинга или расщепления, данные сайты могут быть одинаковыми либо разными.
При употреблении в данном тексте гемостатическое нарушение означает генетически унаследованное или приобретенное заболевание, которое характеризуется склонностью к кровоизлияниям, как к спонтанным, так и в результате травмы, из-за нарушения способности или неспособности образовывать фибриновые сгустки. Примеры таких нарушений включают разные виды гемофилии. Тремя основными формами являются гемофилия А (дефицит фактора VIII), гемофилия В (дефицит фактора IX или "болезнь Кристмаса") и гемофилия С (дефицит фактора XI, склонность к умеренным кровотечениям). Другие гемостатические нарушения включают, например, болезнь Виллебранда, дефицит фактора XI (дефицит ПТП), дефицит фактора XII, дефицит или структурные аномалии фибриногена, протромбина, фактора V, фактора VII, фактора X или фактора XIII, синдром Бернара-Сулье, который является дефектом или дефицитом GPIb. GPIb - рецептор для ФВ - может быть дефективным и приводить к недостатку первичного тромбообразования (первичного гемостаза) и повышенной склонности к кровотечениям, и тромба-стении Гланцманна и Негели (тромбастении Гланцманна). При печеночной недостаточности (острой и хронической формах) наблюдается недостаточная выработка факторов свертывания крови печенью, что может привести к повышенному риску кровотечений.
Химерные молекулы, являющиеся объектом данного изобретения, можно применять в профилактических целях. Употребляемый в данном тексте термин "профилактическое лечение" относится к применению данной молекулы до случая кровотечения. В одном варианте реализации изобретения пациенту, нуждающемуся в общем гемостатическом средстве, проводят или собираются проводить хирургическую операцию. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять до или после хирургической операции в качестве профилактики. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять во время или после хирургической операции для контролирования острых случаев кровотечения. Хирургическая операция может включать, но не ограничивается этим, трансплантацию печение, резекцию печени, стоматологические процедуры или трансплантацию стволовых клеток.
Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, также применяется для лечения по требованию (также называемому "эпизодическим"). Термин "лечение по требованию" или "эпизодическое лечение" относится к применению химерной молекулы в ответ на проявление симптомов случая кровотечения или перед действием, которое может вызвать кровотечение. В одном аспекте реализации лечение пациента по требованию (эпизодическое лечение) может проводиться тогда, когда кровотечение началось, например, после травмы, или тогда, когда кровотечение ожидается, например, перед хирургической операцией. В другом аспекте реализации лечение пациента по требованию может проводиться до действий, которые повышают риск кровотечения, например, в случае контактного спорта.
Употребляемый в данном тексте термин "острое кровотечение" относится к случаю кровотечения вне зависимости от его причин. Например, пациент может получить травму, страдать уремией, наследственным нарушением, связанным с кровотечением (например, дефицитом фактора VII), нарушением тромбоцитарного звена гемостаза или обладать сопротивлением благодаря выработке антител к факторам свертывания крови.
При употреблении в данном тексте лечение, проведение лечения, осуществление лечения относится, например, к снижению степени тяжести заболевания или болезненного состояния; снижению продолжительности заболевания; уменьшению интенсивности одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием, без обязательного излечения заболевания или болезненного состояния или предупреждения одного или более симптомов, связанных с заболеванием или болезненным состоянием. В одном варианте реализации изобретения термин "лечение" или "проведение лечения" означает поддержание у пациента минимального уровня Ф-VIII, составляющего по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 МЕ/дЛ, путем введения химерного белка или фрагмента ФВ, которые являются объектами данного изобретения. В другом варианте реализации изобретения лечение или проведение лечения означает поддержание минимального уровня Ф-VIII между около 1 и около 20 МЕ/дЛ, около 2 и около 20 МЕ/дЛ, около 3 и около 20 МЕ/дЛ, около 4 и около 20 МЕ/дЛ, около 5 и около 20 МЕ/дЛ, около 6 и около 20 МЕ/дЛ, около 7 и около 20 МЕ/дЛ, около 8 и около 20 МЕ/дЛ, около 9 и около 20 МЕ/дЛ или около 10 и около 20 МЕ/дЛ. Лечение или проведение лечения заболевания или болезенного состояния также может включать поддержание активности Ф-VIII у пациента на уровне, сравнимом по меньшей мере приблизительно с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% активности Ф-VIII у пациента, не страдающего гемофилией. Минимальный уровень, необходимый для проведения лечения может быть определен при помощи одного или более известных способов и может быть подобран (увеличен или уменьшен) для каждого отдельного пациента.
Химерные белки.
Настоящее изобретение относится к продлению времени полужизни белка фактора VIII путем предотвращения или подавления in vivo связывания фактора, ограничивающего время полужизни Ф-VIII (например, эндогенного ФВ) с белком Ф-VIII. Эндогенный ФВ связывает от около 95 до около 98% Ф-
VIII в нековалентные комплексы. Известно, что связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII защищает Ф-VIII разными способами. Например, полноразмерный ФВ (в виде мультимера размером в около 250 кДа) может защитить Ф-VIII от протеазного расщепления и активации Ф-VIII, стабилизировать тяжелую цепь и/или легкую цепь Ф-VIII и предотвратить выведение Ф-VIII фагоцитарными рецепторами. При этом в то же время эндогенный ФВ ограничивает время полужизни Ф-VIII, путем предотвращения пино-цитоза и путем выделения комплекса Ф-\ТП-ФВ из системы в процессе очищения ФВ. Считается, как показано в примерах, что эндогенный ФВ является ограничивающим время полужизни фактором, который препятствует продлению времени полужизни белка Ф-VIII, слитого с компонентом, продлевающим время полужизни, более чем приблизительно в два раза по отношению к Ф-VIII дикого типа. Следовательно, в настоящем изобретение предотвращается или подавляется взаимодействие между эндогенным ФВ и белком Ф-VIII при помощи дополнительного компонента, и тем самым предотвращается выведение белка Ф-VIII в процессе очищения ФВ и/или индукция пиноцитоза. В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент способен предотвращать или подавлять связывание белка Ф-VIII с эндогенным ФВ и обладает по меньшей мере одним ФВ-подобным Ф-^П-защитным свойством. Вдобавок дополнительный компонент снижает выведение Ф-VIII из системы, предотвращая или подавляя взаимодействие с эндогенным ФВ. Дополнительные компоненты, являющиеся объектами настоящего изобретения, связываются или ассоциируют с (например, путем нековалентного связывания) белком Ф-VIII и/или физически или химически блокируют ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII. Таким образом, белок Ф-VIII, связанный с дополнительным компонентом, выводится из кровообращения клиренс-рецепторами ФВ более медленно по сравнению с Ф-VIII дикого типа или несвязанным с дополнительным компонентом Ф-VIII.
Примеры дополнительных компонентов, являющихся объектами настоящего изобретения, включают, например, полипептиды либо химические или физические модификации, добавления, делеции или вариации белка Ф-VIII. Дополнительный компонент, применяемый в настоящем изобретении, может содержать полипептид, неполипептидный компонент или оба эти компонента. Неограничивающие примеры полипептида, применяемого в качестве дополнительного компонента, включают, например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ, константную область иммуноглобулина или ее часть, трансфер-рин или его фрагмент, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность НАР, последовательность PAS, или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любую комбинацию этих компонентов. Другие подобные компоненты, применяемые в настоящем изобретении, известны в данной области техники.
В одном варианте реализации изобретения дополнительный компонент соединен (или связан) с белком Ф-VIII ковалентной или нековалентной связью. При этом, в некоторых случаях, физическое блокирование или химическая связь (например, нековалентное связывание) между дополнительным компонентом и белком Ф-VIII могут быть недостаточно сильными для того, чтобы обеспечить существование устойчивого комплекса, содержащего белок Ф-VIII и дополнительный компонент, в присутствии эндогенного ФВ. Например, фрагмент ФВ, образующий нековалентную связь с белком Ф-VIII без каких-либо дополнительных соединений, может легко быть отделен in vivo от белка Ф-VIII в присутствии эндогенного ФВ, при этом фрагмент ФВ (например, рекомбинантного ФВ, т.е. рФВ) замещается эндогенным ФВ. Следовательно, нековалентно связанный с эндогенным ФВ белок Ф-VIII будет подвержен процессу очистку выведения ФВ и будет выведен из системы. С целью предотвращения отделения дополнительного компонента от белка Ф-VIII в некоторых вариантах реализации изобретения связь между белком Ф-VIII и дополнительным компонентом является ковалентной связью, например пептидной связью, одной или более аминокислотами либо дисульфидной связью. В определенных вариантах реализации изобретения соединение (т.е. связь) между дополнительным компонентом и белком Ф-VIII является пептидной связью или линкером между белком Ф-VIII и дополнительным компонентом ("линкер ФЛТП/ДК") Неограничивающие примеры линкеров описаны в другом месте данного текста. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим по меньшей мере из 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000,
1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 или 4000 аминокислот. В других
вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим из от около 100 до около 200 аминокислот, от около 200 до около 300 аминокислот, от около 300 до около 400 аминокислот, от около 400 до около 500 аминокислот, от около 500 до около 600 аминокислот, от около 600 до около 700 аминокислот, от около 700 до около 800 аминокислот, от около 800 до около 900 аминокислот или от около 900 до около 1000 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент, ковалентно связанный с белком Ф-VIII, является фрагментом ФВ, описанным в другом месте данного текста.
В определенных вариантах реализации изобретения дополнительный компонент химически (например, нековалентно) связывается с или физически блокирует один или более ФВ-связывающих участков белка Ф-VIII. ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII расположен в пределах домена A3 или домена С2 белка Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII
расположен в пределах домена A3 и домена С2. Например, ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII может соответствовать аминокислотам от 1669 до 1689 и/или от 2303 до 2332 из SEQ ID NO: 16 [полноразмерный зрелый Ф-VIII].
В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит белок Ф-VIII, связанный с дополнительным компонентом, при этом дополнительный компонент является молекулой ФВ, например фрагментом ФВ, содержащим домен D' и домен D3, но не содержащим участок связывания клиренс-рецептора ФВ, и экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ. В некоторых вариантах реализации изобретения дополнительный компонент является фрагментом ФВ. Фрагмент ФВ, применяемый в настоящем изобретении, содержит домен D' и домен D3, обеспечивая белку Ф-VIII одно или более преимуществ ФВ-подобных свойств, но при этом фрагмент ФВ не подвергается процессу выведения ФВ. Белок Ф-VIII и дополнительный компонент могут быть ковалентно связанными посредством линкера (например, линкера Ф-'УШ/ДК). В одном варианте реализации изобретения линкер может являться отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров приведены в другом месте данного текста.
В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит белок Ф-VIII и константную область иммуноглобулина или ее часть (т.е. дополнительный компонент), при этом константная область иммуноглобулина или ее часть экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ. В других вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть является Fc-областью.
Один аспект реализации настоящего изобретения относится к химерному или слитому белку либо гибриду, содержащему один или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ, и его применению. Химерный или слитый белок может быть сшит или связан с одним или более гетерологичным компонентом (иногда обозначаемом в данном тексте как Н или H1). В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) является гетерологичным пептидом или гетерологичным полипептидом, который в естественных условиях не встречается с и/или связан с фрагментом ФВ. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) является неполипептидным компонентом, например химической модификацией или комбинацией пептида или полипептида и неполипептид-ного компонента. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты ФВ связаны или соединены с гетерологичным компонентом (H1) посредством линкера (также называемым в данном тексте "ФВ-линкером"). В одном варианте реализации изобретения ФВ-линкер является отщепляемым линкером. Неограничивающие примеры линкеров между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом (H1) раскрыты в другом месте данного текста.
В одном варианте реализации гетерологичный компонент (H1), применяемый в данном изобретении, улучшает одно или более из фармакокинетических свойств фрагментов ФВ без заметного влияния на биологическую активность или функционирование фрагментов ФВ (например, их связывание или соединение с белком Ф-VIII). В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (H1), связанный с фрагментом ФВ, может продлевать время полужизни фрагментов ФВ. Неограничивающие примеры гетерологичного полипептидного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры гетерологичного неполипептидного компонента включают поли-этиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов.
В некоторых вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) может применяться для соединения фрагмента ФВ и белка Ф-VIII ковалентной связью. Примеры гетерологичного компонента, который может обеспечить ковалентное связывание, включают, но не ограничиваются этим, константную область иммуноглобулина или ее часть, содержащую шарнирный участок, например Fc-область или партнера по связыванию FcRn. В отдельном примере белок Ф-VIII связан с первой Fc-областью, а фрагмент ФВ связан со второй Fc-областью, при этом первая Fc-область и вторая Fc-область образуют одну или более дисульфидную связь.
В некоторых вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н" или "H1") является константной областью иммуноглобулина или ее частью. Неограничивающие примеры константной области иммуноглобулина или ее части могут быть выбраны из группы, состоящей из домена СН1, домена СН2, домена СН3, домена СН4, шарнирного домена и двух или более комбинаций этих компонентов. В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один домен СН1, по меньшей мене один домен СН2, по меньшей мене один домен СН3, по меньшей мене один домен СН4 или их функциональные фрагменты. В другом варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один шарнирный домен или его часть и по меньшей мене один домен СН2 или его часть (например, в ориентации шарнир-СН2). В других вариантах реализации изобрете
ния константная область иммуноглобулина или ее часть содержит по меньшей мене один домен СН2 или его часть и по меньшей мене один домен СН3 или его часть (например, в ориентации СН2-СН3). Примеры комбинаций включают, но не ограничиваются этим, домен СН2, домен СН3 и шарнирный домен, которые также известны как Fc-область (или Fc-домен), например первая Fc-область. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) связан с фрагментом ФВ посредством линкера. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) является партнером по связыванию FcRn, как описано в другом месте данного текста. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (H1) является шарнирным участком.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок дополнительно содержит второй (или дополнительный) гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н2"). Стоит отметить, что первый гетерологичный компонент (H1) и второй гетерологичный компонент (Н2) могут применяться взаимозаменяемо и быть одинаковыми либо разными. Второй гетерологичный компонент (Н2) может быть связанным с белком Ф-VIII или с любым участком химерного белка пептидной связью, одной или более аминокислотами или посредством линкера (например, линкера Ф-VIII в случае связывания с Ф-VIII). Такие конструкции иногда могут называться гетеродимерами Ф-\ТП/ФВ. В одном варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит гетерологичный полипептид. В другом варианте реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит неполипеп-тидный компонент. В других вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент (Н2) содержит комбинацию гетерологичного компонента и неполипептидного компонента. Второй гетерологичный компонент (Н2) может являться компонентом, продлевающим время полужизни. Неограничивающие примеры второго гетерологичного полипептидного компонента (Н2) включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры гетерологичного неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (H1) и второй гетерологичный компонент являются одинаковыми или разными. Каждый или оба компонента - первый гетерологичный компонент (H1) и второй гетероло-гичный компонент (Н2) могут обеспечить продление времени полужизни белка Ф-VIII в химерном белке, обеспечить соединение, более сильное, чем нековалентная связь, т. е. одну или более ковалентных связей между белком Ф-VIII и фрагментом ФВ в химерном белке, либо и то и другое. После того как фрагмент ФВ, сшитый или связанный с гетерологичным компонентом (H1) снимает ограничение по времени полужизни путем предотвращения или подавления взаимодействия между белком Ф-VIII и эндогенным белком ФВ, связанный с гетерологичными компонентами белок Ф-VIII может достичь своего полного потенциала и может иметь время полужизни, более чем 2-кратно превышающее таковое у Ф-VIII дикого типа.
В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент (например, первая Fc-область), связанный с фрагментом ФВ, и второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область), связанный с белком Ф-VIII, соединены друг с другом таким образом, что это соединение препятствует замещению фрагмента ФВ эндогенным ФВ in vivo. В одном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент является второй Fc-областью, при этом вторая Fc-область связана или соединена с первым гетерологичным компонентом, например, первой Fc-областью, ковалентной связью, например дисульфидной связью, пептидной связью или посредством линкера (одной или более аминокислотами). Например, второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область), связанный с белком Ф-VIII со стороны одного конца, может быть дополнительно связанным с первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью), связанным с фрагментом ФВ посредством линкера (например, оц-Fc линкером), или соединенным с первым гетерологичным компонентом ковалент-ной или нековалентной связью. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область) связан с фрагментом ФВ, который уже связан с первым гетероло-гичным компонентом. В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент, и вторую полипептидную цепь, содержащую белок Ф-VIII и второй гетерологичный компонент, при этом первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь соединены, причем соединение между первой полипептидной цепью, содержащей первый гетерологичный компонент, и второй полипептидной цепью, содержащей второй гетерологичный компонент, является ковалентной связью, тем самым создавая возможность фрагменту ФВ и белку Ф-VIII поддерживать взаимодействие друг с другом. В то же время эндогенный ФВ, который может образовывать нековалентную связь с белком Ф-VIII, не может заместить ковалентно связанную полипептидную цепь, содержащую фрагмент ФВ.
Линкер между первым гетерологичным компонентом (H1) и фрагментом ФВ (например, ФВ-линкер) может являться отщепляемым линкером, например тромбин-отщепляемым линкером. Отщепляемые линкеры могут отщепляться протеазой, выбранной из группы, состоящей из фактора XIa, фактора XIIa, калликреина, фактора VIIa, фактора IXa, фактора Ха, фактора IIa (тромбина), эластазы-2, гран
зима В, ВГТ, энтерокиназы, протеазы 3С, сортазы А, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20 и их комбинаций. Эти отщепляемые линкеры обеспечивают возможность отщепления и отделения фрагмента ФВ от белка Ф-VIII после активации каскада реакций свертывания, что приводит к получению белка Ф-VIII с полным потенциалом действия.
В других вариантах реализации изобретения химерный белок получают в виде одиночной полипептидной цепи, содержащей фрагмент ФВ, отщепляемый линкер, первый гетерологичный компонент (H1), процессируемый линкер, белок Ф-VIII и второй гетерологичный компонент (Н2) в любом порядке. После синтеза процессируемый линкер может перед секрецией отщепляться внутриклеточным протеазным ферментом, образуя, таким образом, две полипептидные цепи, как описано выше. В случае конструкции, содержащей одиночную цепь, перед секрецией второй гетерологичный компонент (например, вторая Fc-область) может связываться с фрагментом ФВ посредством процессируемого линкера. В определенных других вариантах реализации изобретения один или более линкеров могут содержать один или более сайтов расщепления.
В некоторых вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, дополнительно содержит третий гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н3"). Третий гетерологичный компонент (Н3) может продлевать время полужизни. Гетерологичный компонент (Н3) может содержать гетерологичный полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Неограничивающие примеры третьего гетерологичного компонента (Н3) включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, любые производные или варианты, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. Первый гетерологичный компонент (H1), связанный с фрагментом ФВ, второй гетерологичный компонент (Н2), связанный с белком Ф-VIII, и третий гетерологичный компонент (Н3) могут быть одинаковыми либо разными. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (H1) идентичен второму гетерологичному компоненту (Н2), но отличается от третьего гетерологичного компонента (Н3). В другом варианте реализации изобретения третий гетерологичный компонент (Н3) сшит или связан с белком Ф-VIII или фрагментом ФВ химерного белка. В некоторых вариантах реализации третий гетерологичный компонент вставлен в один или более доменов белка Ф-VIII или между двумя доменами белка Ф-VIII.
В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая цепь содержит белок Ф-VIII, связанный с первым гетерологичным компонентом (H1), например, первой Fc-областью, посредством произвольного линкера (например, Ф-\/Ш-линкера), а вторая цепь содержит фрагмент ФВ, связанный со вторым гетерологичным компонентом (Н2), например, второй Fc-областью, посредством произвольного линкера (например, ФВ-линкера). Белок Ф-VIII может дополнительно содержать третий гетерологичный компонент (Н3), например любой продлевающий время полужизни компонент, например альбумин или последовательность PAS, между тяжелой цепью Ф-VIII и легкой цепью Ф-VIII (т.е. аминокислотный остаток 1648 из SEQ ID NO: 16), являясь, таким образом, одноцепочечным белком Ф-VIII. В альтернативном варианте белок Ф-VIII может являться двухцепочечным белком, т.е. содержащим тяжелую цепь Ф-VIII и легкую цепь Ф-VIII, которые соединены друг с другом ковалентной или нековалентной связью (например, металлической связью), при этом тяжелая цепь дополнительно связана с третьим гетерологичным компонентом (Н3), например, неструктурным полипептидом, продлевающим время полужизни, альбумином или его фрагментом или последовательностью PAS. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, при этом первая цепь содержит белок Ф-VIII, связанный с первым гетерологичным компонентом (H1), например, первой Fc-областью, посредством произвольного линкера (например, Ф-уТП-линкера), а вторая цепь содержит фрагмент ФВ, связанный с третьим гетерологичным компонентом (Н3), например, неструктурным полипептидом, продлевающим время полужизни, альбумином или последовательностью PAS, который связан со вторым гетерологичным компонентом (Н2), например, второй Fc-областью, посредством произвольного линкера. В некоторых вариантах реализации изобретения третий гетерологичный компонент (Н3) (например, полипептид, продлевающий время полужизни) может быть связан с С-концом или N-концом белка Ф-VIII или вставлен между двумя доменами белка Ф-VIII или между двумя аминокислотами в домене белка Ф-VIII.
В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, дополнительно содержит четвертый гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н4") и/или пятый гетерологичный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н5"). Четвертый и пятый гетерологичные компоненты также можгут продлевать время полужизни. Четвертый гете-рологичный компонент и/или пятый гетерологичный компонент могут быть одинаковыми или разными с третьим гетерологичным компонентом. Гетерологичный компонент может содержать гетерологичный полипептид, неполипептидный компонент либо комбинациию этих компонента. Неограничивающие
примеры четвертого или пятого гетерологичного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, любые производные или варианты, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. Первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент могут быть одинаковыми либо разными. В некоторых вариантах реализации изобретения четвертый гетерологичный компонент (например, полипептид, продлевающий время полужизни) может быть связан с С-концом или N-концом белка Ф-VIII или вставлен между двумя доменами белка Ф-VIII или между двумя аминокислотами в домене белка Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения пятый гетерологичный компонент (например, полипептид, продлевающий время полужизни) также может быть связан с С-концом или N-концом белка Ф-VIII или вставлен между двумя доменами белка Ф-VIII или между двумя аминокислотами в домене белка Ф-VIII.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок Ф-VIII, фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологич-ный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент, при этом первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент образуют связь (например, ко-валентную связь) между цепью, содержащей белок Ф-VIII, и цепью, содержащей фрагментов, а третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент и пятый гетерологичный компонент являются продлевающими время полужизни компонентами, и при этом связь между цепью, содержащей белок Ф-VIII, и цепью, содержащей фрагментов, является более сильной, чем нековалентное взаимодействие между Ф-VIII и фрагментом ФВ, и тем самым предотвращается связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII in vivo, in vitro или ex vivo.
В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит белок Ф-VIII, фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент, второй гетерологичный компонент, третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент, пятый гетерологичный компонент и шестой гетерологич-ный компонент (иногда обозначаемый в данном тексте как "Н6"), при этом первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент образуют связь между цепью, содержащей белок Ф-VIII, и цепью, содержащей фрагментов, а третий гетерологичный компонент, четвертый гетерологичный компонент, пятый гетерологичный компонент и шестой гетерологичный компонент являются продлевающими время полужизни компонентами, и при этом связь между цепью, содержащей белок Ф-VIII, и цепью, содержащей фрагментов, является более сильной, чем взаимодействие между Ф-VIII и фрагментом ФВ, и тем самым предотвращается связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII in vivo, in vitro или ех vivo.
В некоторых вариантах реализации изобретения химерный белок содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:
(аа) V-L1-H1-L2-H2,
(bb) H2-L2-H1-L1-V,
(сс) H1-L1-V-L2-H2, и
(dd) H2-L2-V-L1-H1, где V содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ; каждый из L1 или L2 является произвольным линкером; и H1 содержит первый гетерологичный компонент; и
Н2 содержит произвольный второй гетерологичный компонент. Первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент либо оба могут являться компонентом, продлевающим время полужизни. В одном варианте реализации изобретения H1 содержит полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Полипептид, применяемый в качестве H1, может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, любые производные или варианты, либо любые комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту и гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 содержит полипептид, неполипептидный компонент либо оба эти компонента. Полипептид, применяемый в качестве Н2, может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, любые производные или варианты, либо любые комбинации этих компонентов. Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения линкер между H1 и Н2 в формулах (аа) и (бб) является процессируемым линкером. В других вари
антах реализации изобретения линкер между фрагментом ФВ и H1 в формулах (аа) и (бб) является отщепляемым линкером, например тромбин-отщепляемым линкером, который может отщепляться тромбином.
Ориентация приведенных в данном тексте формул полипептидов идет от N-конца (слева) до С-конца (справа). Например, формула H-L-V означает формулу NH2-H-L-V-COOH. В одном варианте реализации изобретения описанные в данном тексте формулы могут содержать дополнительные последовательности между двумя компонентами. Например, формула V-L1-H1-L2-H2 может дополнительно содержать последовательностина N-конце V, между V и L1, между L1 и H1, между H1 или L2, между L2 или Н2, или на С-конце Н2, если не указано иное. В другом варианте реализации изобретения дефис (-) указывает на наличие пептидной связи либо одной или более аминокислот.
В конкретных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит, состоит преимущественно из или состоит из одной или более формул, выбранных из группы, состоящей из (a1) V-H, (a2) H-V, (а3) V-L-H, (a4) H-L-V, (а5) V-L1-H1-H2, (а6) H2-H1-L1-V, (а7) V-L1-H1:H2, (a8) H2:H1-L1-V, (a9) V-H1:H2, (б1) H2:H1-V, (б2) V-L1-H1-L2-H2, (б3) H2-L2-H1-L1-V, (б4) H1-V-H2, (б5) H1-L1-V-L2-H2 и (б6) H2-L2-V-L1-H1, где V один или более из описанных в данном тексте фрагментов ФВ, L, L1 или L2 содержит линкер, Н или H1 содержит первый гетерологичный компонент. В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (H1) может являться полипептидом, неполипептидным компонентом либо и тем и другим. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента, применяемого в качестве H1, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. В другом варианте реализации изобретения Н2 содержит второй гетерологичный компонент. Второй гетерологичный компонент может являться полипептидом, не-полипептидным компонентом либо и тем и другим. Гетерологичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР или любые комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента, применяемого в качестве H1, включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения линкер между первым гетерологичным компонентом и вторым гетерологичным компонентом является процессируемым линкером. В других вариантах реализации изобретения линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером, который содержит один или более сайтов расщепления, например тромбин-отщепляемым линкером.
Химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из (аа), (бб), (вв), (гг), (a1), (a2), (а3), (а4), (а5), (а6), (а7), (а8), (а9), (б1), (б2), (б3), (б4), (б5) и (б6), и белок Ф-VIII, который ковалентно связан или ковалентно соединен с фрагментом ФВ, первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью) или вторым гетерологичным компонентом (например, второй Fc-областью) из формулы. В одном варианте реализации изобретения белок Ф-VIII связан или соединен с фрагментом ФВ ковалентной или нековалентной связью либо посредством линкера. В другом варианте реализации изобретениям белок Ф-VIII может быть связан с первым гетерологичным компонентом или вторым гетерологичным компонентом ковалентной или некова-лентной связью либо посредством линкера.
В одном варианте реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ, ковалентно связанный или ковалентно соединенный с белком Ф-VIII. Например, химерный белок может содержать фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, при этом фрагмент ФВ и белок Ф-VIII связаны ковалентной непептидной связью, пептидной связью, нековалент-ной связью или посредством линкера, например отщепляемого линкера. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ и белок Ф-VIII связаны или взаимодействуют друг с другом посредством одной или более дисульфидных связей. В другом конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связан или взаимодействует с белком Ф-VIII в области домена A3 Ф-VIII, домена С2 Ф-VIII или обоих - домена A3 и домена С2 Ф-VIII - посредством нековалентной связи. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный или взаимодействующий с белком Ф-VIII, связан или сшит с первым гетерологичным компонентом. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII, связанный или взаимодействующий с фрагментом ФВ, дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный или взаимодействующий с белком Ф-VIII, дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, а белок Ф-VIII дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом. В определенных вариантах реализации изобретения первая полипептидная цепь, содержащая фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент, и вторая полипептидная цепь, содержащая белок Ф-VIII и второй гетерологичный компонент, соединены друг с другом таким образом, что это соединение не дает возможности белку Ф-VIII
взаимодействовать с другими компонентами, например, эндогенным ФВ. В одном варианте реализации изобретения соединение представляет собой ковалентную связь, например дисульфидную связь.
Как фрагмент ФВ, так и белок Ф-VIII могут быть соединены или связаны с первым или вторым ге-терологичным компонентом посредством линкера, например отщепляемого линкера, например тромбин-отщепляемого линкера. Линкер между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом может обозначаться в данном тексте как ФВ-линкер. Линкер между белком Ф-VIII и вторым гетерологичным компонентом может обозначаться в данном тексте как Ф-VIII-линкер. Либо оба компонента - фрагмент ФВ и белок Ф-VIII могут быть соединены или связаны с первым или вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например отщепляемого линкера, например тромбин-отщепляемого линкера. В определенных вариантах реализации изобретения первый гетерологичный компонент, связанный с фрагментом ФВ, содержит полипептидный, неполипептидный компонент либо оба. Неограничивающие примеры первого гетерологичного полипептидного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэти-ленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант, или любые комбинации этих компонентов. В других вариантах реализации изобретения второй ге-терологичный компонент, связанный с белком Ф-VIII, содержит полипептидный, неполипептидный компонент либо оба. Неограничивающие примеры второго гетерологичного компонента включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, либо две или более комбинации этих компонентов. Неограничивающие примеры неполипептидного компонента включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное или вариант, или любые комбинации этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ присоединен к Ф-VIII при помощи опосредованного сортазой in vitro лигиро-вания белка. В некоторых вариантах реализации изобретения применяется распознающий сортазу мотив.
В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью. В конкретном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент является первой Fc-областью. В некоторых вариантах реализации изобретения второй гетерологичный компонент является константной областью иммуноглобулина или ее частью. В конкретном варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент является второй Fc-областью. В конкретном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, при этом фрагмент ФВ связан с константной областью иммуноглобулина или ее частью, которая является Fc-областью. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, при этом белок Ф-VIII связан с константной областью иммуноглобулина или ее частью, которая является Fc-областью. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, при этом фрагмент ФВ связан с первой с константной областью иммуноглобулина, которая является первой Fc-областью, а белок Ф-VIII связан со второй константной областью иммуноглобулина, которая является второй Fc-областью, и при этом фрагмент ФВ и белок Ф-VIII связаны или взаимодействуют друг с другом посредством нековалентной связи, либо первая Fc-область и вторая Fc-область соединены друг с другом посредством ковалентной связи. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с первым гетерологичным компонентом, дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, посредством линкера, например процессируемого линкера. В одном аспекте реализации фрагмент ФВ связан с первым гетерологичным компонентом посредством линкера, например ФВ-линкера, например отщепляемого линкера. В другом аспекте реализации белок Ф-VIII связан со вторым гетерологичным компонентом посредством линкера, например ФЛЛП-линкера, например отщепляемого линкера. Неограничивающие примеры гетерологич-ных компонентов раскрыты в другом месте данного текста, например константная область иммуноглобулина или ее часть в параграфах [0165]-[0193], альбумин, его фрагмент или вариант в параграфах [0194]-[0198], последовательность НАР в параграфе [0293], трансферрин, его фрагмент или вариант в параграфах [0204]-[0205], полимер, например полиэтиленгликоль, в параграфах [0206]-[0213], ГЭК в параграфах [0214]-[0219] или последовательности PSA в параграфе [0220] и PAS в параграфах [0199]-
[0202].
В некоторых вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит, в значительной степени описывается из или описывается формулой, выбранной из группы, состоящей из:
(а)
V-L1-H1-L3-C-L2-H2,
(Ь)
H2-L2-C- L3-H1-L1-V,
(с)
C-L2-H2- L3-V-L1-H1,
(d)
Hl-Ll-V- L3-H2-L2-C,
(е)
H1-L1-V-L3-C-L2-H2,
(g)
H2-L2-C- L3-V-L1-H1,
(g)
V-L1-H1-L3-H2-L2-C,
(g)
C-L2-H2- L3-H1-L1-V,
(i)
H2-L3-H1-L1-V-L2-C,
(i)
C-L2-V-L1-H1-L3-H2,
(k)
V-L2-C-L1-H1-L3-H2, и
(1)
H2-L3-H1-L1-C-L2-V,
где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ;
каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, например отщепляемым линкером, например тромбин-отщепляемым линкером;
L3 является произвольным линкером, например оц-Fc линкером, например процессируемым линкером;
каждый из H1 или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; и С является белком Ф-VIII; и
(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот.
В других аспектах химерный белок, являющийся объектом изобретения, содержит формулу, выбранную из группы, состоящей из:
(ш)
V-L1-H1: H2-L2-C,
(п)
V-L1-H1:C-L2-H2;
(о)
H1-L1-V:H2-L2-C;
(р)
H1-L1-V:C-L2-H2;
(q)
V:C-L1-H1:H2;
V:H1-L1-C:H2;
(s)
H2:H1-L1-C:V,
(t)
C:V-L1-H1:H2, и
(и)
C:H1-L1-V:H2.
где V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ;
каждый из L1 или L2 является произвольным линкером, например тромбин-отщепляемым линкером;
каждый из H1 или Н2 является произвольным гетерологичным компонентом; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; и С является белком Ф-VIII; и
(:) представляет химическое или физическое соединение между H1 и Н2.
В одном варианте реализации изобретения один или более гетерологичных компонентов являются соединениями, продлевающими время полужизни. Соединения, продлевающие время полужизни, известны в данной области техники, а неограничивающие примеры таких продлевающих время полужизни соединений включают константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, производное либо вариант или две или более комбинации этих компонентов. Неполипеп-тидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтило-вый крахмал (ГЭК), производное или любые комбинации этих компонентов.
В одном варианте реализации изобретения (:) в формулах от (н) до (х) представляет химическое соединение, например по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т.е. (:), является ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т.е. (:), является нековалентным взаимодействием, например ионным взаи
модействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является непептидной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) в формулах от (н) до (х) представляет физическое соединение между двумя последовательностями, при этом часть первой последовательности находится в непосредственной близости ко второй последовательности так, что первая последовательность защищает или блокирует часть второй последовательности от взаимодействия с другим компонентом, и, дополнительно к этому, данное физическое соединение поддерживается таким образом, что не дает возможности второй последовательности взаимодействовать с другими компонентами.
Формулы (а)-(х) включены в данный текст в качестве неограничивающих примеров конструкций, являющихся объектами настоящего изобретения. Ориентация формул полипептидов идет от N-конца (слева) до С-конца (справа). Например, формула V-L1-H1-L3-C-L2-H2 означает формулу NH2-V-L1-H1-L3-C-L2-H2-COOH. Дополнительно (:) может являться соединением или взаимодействием между двумя полипептидными цепями посредством ковалентной связи или нековалентной связи между любой частью первой цепи и любой частью второй цепи, если не указано иное. Например, формула V-H1:H2-C содержит две полипептидные цепи, первую цепь представляет V-H1, а вторую цепь представляет С-Н2, при этом V из первой цепи взаимодействует или соединено с С из второй цепи и/или H1 из первой цепи взаимодействует или соединено с Н2 С из второй цепи. В других некоторых реализации изобретения (:) обозначает ковалентную, непептидную связь или нековалентную связь.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит, в значительной степени описывается из или описывается формулой, выбранной из группы, состоящей из:
(1)
V:C,
(2)
H-V:C or C:V-H,
(3)
V:C-Hor H-C:V,
(4)
V-H1:H2-C orHl-V:C-H2,
(5)
V:C-H1:H2 orH2:Hl-C:V,
(6)
H2:H1-V:C orC:V-Hl:H2,
(7)
H-L-V:C or C:V-L-H,
(8)
V:C-L-H or H-L-C:V,
(9)
V-C or C-V,
(10)
H-V-C or C-V-H,
(П)
V-H-C or C-H-V,
(12)
V-C-H or H-C-V,
(13)
V-H1-C-H2 or H2-C-H1-V,
(14)
H1-V-C-H2 or H2-C-V-H1,
(15)
H1-V-H2-C or C-H2-V-H1,
(16)
V-H1-H2-C or C-H2-H1-V,
(17)
V-L-C or C-L-V,
(18)
H-L-V-C or C-V-L-H,
(19)
H-V-L-C or C-L-V-H,
(20)
V-L-H-C or C-H-L-V,
(21)
V-H-L-C or C-L-H-V,
(22)
V-L-C-H or H-C-L-V,
(23) V-C-L-H or H-L-C-V, (24) H-L1-V-L2-C or C-L2-V-L1-H,
(25) V-L-Hl :H2-C or C-H2:H1-L-V,
(26) V-Hl :H2-L-C or C-L-H2:H1-V,
(27) V:C-Hl-H2orH2-Hl-C:V,
(28) H2-H1-V:C or C:V-H1-H2,
(29) V:C-L-H1:H2 or H2:H1-L-C:V,
(30) H2:H1-L-V:C or C:V-L-H1:H2,
(31) V-L1-H1:H2-L2-C or L-L2-H2:H1-L1-V,
(32) V:C-L-H1-H2 or H2-H1-L-C:V,
(33) V:C-Hl-L-H2orH2-L-Hl-C:V,
(34) V:C-L1-H1-L2-H2 or H2-L2-H1-L1-C:V,
(35) H2-H1-V:C or C:V-H1-H2,
(36) H2-H1-L-V:C or C:V-L-H1-H2,
(37) H2-L-H1-V:C or C:V-H1-L-H2,
(38) H2-L2-H1-L1-V:C or C:V-L1-H1-L2-H2,
(39) V-L1-H-L2-C or C-L2-H-L1 -V,
(40) V-L 1-C-L2-H or H-L2-C-L1 -V,
(41) V-L-H1-C-H2 orH2-C-Hl-L-V,
(42) V-H1-C-L-H2 orH2-L-C-Hl-V,
(43) V-Hl-L-C-H2orH2-C-L-Hl-V,
(44) Hl-L-V-C-H2orH2-C-V-L-Hl,
(45) Hl-V-L-C-H2orH2-C-L-V-Hl,
(46) Hl-V-C-L-H or H-L-C-V-Hl,
(47) H1-L-V-H2-C or C-H2-V-L-H1,
(48) H1-V-L-H2-C or C-H2-L-V-H1,
(49) H1-V-H2-L-C or C-L-H2-V-H1,
(50) V-L-H1-H2-C or C-H2-H1-L-V,
(51) V-H1-L-H2-C or C-H2-L-H1-V,
(52) V-H1-H2-L-C or C-L-H2-H1-V,
(53) V-L1-H1-L2-C-H2 or H2-C-L2-H1-L1-V,
(54) V-L1-H1-C-L2-H2 or H2-L2-C-H1-L1-V,
(55) V-L1-H1-L2-C-L3-H2 or H2-L3-C-L2-H1-L1-V,
(56) V-H1-L1-C-L2-H2 or H2-L2-C-L1-H1-V,
(57) H1-L1-V-L2-C-H2 or H2-C-L2-V-L1-H1,
(58) H1-L1-V-C-L2-H2 or H2-L2-C-V-L1-H1,
(59) H1-L1-V-L2-C-L3-H2 or H2-L3-C-L2-V-L1-H1,
(60) H1-V-L1-C-L2-H2 orH2-L2-C-Ll-V-Hl,
(61) H1-L1-V-L2-H2-C or C-H2-L2-V-L1-H1,
(62) H1-L1-V-H2-L2-C or C-L2-H2-V-L1-H1,
(63) H1-L1-V-L2-H2-L3-C or C-L3-H2-L2-V-L1-H1,
(64) H1-V-L1-H2-L2-C or C-L2-H2-L1-V-H1,
(65) V-L1-H1-L2-H2-C or C-H2-L2-H1-L1-V,
(66) V-L1-H1-H2-L2-C or C-L2-H2-H1-L1-V,
(67) V-L1-H1-L2-H2-L3-C or C-L3-H2-L2-H1-L1-V, и
(68) V-H1-L1-H2-L2-C or C-L2-H2-L1-H1-V,
(25)
V является описанным в данном тексте фрагментом ФВ; С является белком Ф-VIII;
H1 или Н2 является гетерологичным компонентом или первым гетерологичным компонентом; Н2 является вторым гетерологичным компонентом; первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент могут быть одинаковыми или разными; каждый из L, L1 или L2 является произвольным линкером; (-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот;
(:) представляет химическое или физическое соединение. Линкеры могут быть одинаковыми или разными и каждый может являться отщепляемым линкером, содержащим один или более сайтов расщепления ферментами. Гетерологичные компоненты могут представлять известную в данной области техники технологию и являться полипептидом, неполипептидными компонентами или обоими этими компонентами. Полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, любые их производные либо варианты или любые комбинации этих компонентов (например, Fc-область). Неполипептидный компонент может содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), поли-сиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производное либо вариант или любые комбинации этих компонентов. Каждый из Н, H1 или Н2 может быть выбран отдельно на основе своих характеристик, и эти компоненты могут все быть одинаковыми или разными. Неограничивающие примеры гетерологичных компонентов раскрыты в другом месте данного текста, например константная область иммуноглобулина или ее часть - в параграфах [0126]-[0153], альбумин или его фрагмент либо вариант - в параграфах [0154]-[0157], полимер, например полиэтиленгликоль, - в параграфах [0166]-[0173], и последовательность PAS - в параграфах [0159]-[0162]. Формулы (1)-(68) включены в данный текст в качестве неограничивающих примеров конструкций, являющихся объектами настоящего изобретения.
В одном варианте реализации изобретения (:) представляет химическое соединение, например по меньшей мере одну непептидную связь. В определенных вариантах реализации изобретения химическое соединение, т. е. (:), является ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения соединение, т.е. (:), является нековалентным взаимодействием, например ионным взаимодействием, гидрофобным взаимодействием, гидрофильным взаимодействием, Ван-дер-Ваальсовским взаимодействием, водородной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является непептидной ковалентной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) является пептидной связью. В других вариантах реализации изобретения (:) представляет физическое соединение между двумя последовательностями, при этом часть первой последовательности находится в непосредственной близости ко второй последовательности так, что первая последовательность защищает или блокирует часть второй последовательности от взаимодействия с другим компонентом, и, дополнительно к этому, данное физическое соединение поддерживается таким образом, что не дает возможности второй последовательности взаимодействовать с другими компонентами.
В одном варианте реализации изобретения первый гетерологичный компонент (Н или H1), связанный с фрагментом ФВ в химерном белке, является первой Fc-областью. В другом варианте реализации изобретения второй гетерологичный компонент (или Н2), связанный с белком Ф-VIII в химерном белке, является второй Fc-областью.
В определенных вариантах изобретения химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит две полипептидные цепи, с первой цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей Ф-VIII (например, одноцепочеч-ный Ф-VIII), и первого гетерологичного компонента (например, первой Fc-области) и второй цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3, второго гетерологичного компонента (например, второй Fc-области) и линкера между фрагментом ФВ и вторым Fc-доменом (например, ФВ-линкера). Линкер между фрагментом ФВ и вторым Fc-доменом может являться тромбин-отщепляемым линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный белок Ф-VIII содержит третий гетерологичный компонент, например продлевающий время полужизни компонент, который связан с N-концом, С-концом или одним или более участками в составе последовательности Ф-VIII.
В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит три полипептидные цепи, при этом первая цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из тяжелой цепи Ф-VIII, вторая цепь, содержит, состоит преимущественно из или состоит из легкой цепи Ф-VIII, сшитой с первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью), и третья полипептидная цепь содержит, состоит преимущественно из или состоит из фрагмента ФВ, содержащего домен D' и домен D3, второго гетерологичного компонента (например, второй Fc-области) и линкера. Линкер между фрагментом ФВ и вторым гетерологичным компонентом может являться тром-бин-отщепляемым линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь Ф-VIII связана с третьим гетерологичным компонентом, например продлевающим время полужизни компонентом, который может быть связан с N-концом, С-концом или одним или более участками в составе последовательности Ф-VIII.
В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит две полипептидные цепи с первой цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из тяжелой цепи Ф-VIII, и второй цепью, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из легкой цепи Ф-VIII, первого гетерологичного компонента (например, первой Fc-области), первого линкера (например, сайта расщепления протеазой, содержащего один или более сайтов внутриклеточного процессинга), фрагмента ФВ, второго линкера (например, тромбин-отщепляемого линкера) и второго гетерологичного компонента (например, второй Fc-области), при этом легкая цепь Ф-VIII связана с первым гетерологичным компонентом (например, первой Fc-областью), который дополнительно связан с фрагментом ФВ посредством первого линкера (например, процессируемого линкера, содержащего сайт расщепления протеазой, содержащего один или более сайтов внутриклеточного процессинга), а фрагмент ФВ связан со второй Fc-областью посредством второго линкера (например, тромбин-отщепляемого линкера). В определенных вариантах реализации изобретения первый линкер и второй линкер являются идентичными либо разными.
В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит одну полипептидную цепь, которая содержит одноцепочечный белок Ф-VIII, первый гетерологичный компонент (например, первую Fc-область), первый линкер (например, тромбин-отщепляемый линкер), фрагмент ФВ, второй линкер (например, тромбин-отщепляемый линкер) и второй гетерологичный компонент (например, вторую Fc-область), при этом одноцепочечный белок Ф-VIII связан с первым гетерологичным компонентом, который дополнительно связан с фрагментом ФВ посредством первого линкера, а фрагмент ФВ связан со второй Fc-областью посредством второго линкера. В одном варианте реализации изобретения первый линкер является отщепляемым линкером, содержащим первый сайт расщепления и второй сайт расщепления. В другом варианте реализации изобретения второй линкер является отщепляемым линкером, содержащим один или два сайта расщепления. В конкретном варианте реализации изобретения второй линкер является тромбин-отщепляемым линкером. Линкер, применяемый в данном изобретении, может иметь любую длину, например, по меньшей мере 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 или 700 аминокислот. Например, линкер может состоять из 20, 35, 42, 73 или 98 аминокислот.
В определенных вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ напрямую связан с белком Ф-VIII посредством пептидной связи или линкера. В качестве одного из способов связывания фрагмента ФВ и белка Ф-VIII напрямую или посредством линкера может применяться ферментативное лигирование (например, с участием сортазы). Например, сортаза относится к группе прокариотических ферментов, которые модифицируют поверхностные белки путем распознавания и расщепления карбоксил-терминального сортировочного сигнала. Для большинства субстратов ферментов сортазы распознающий сигнал состоит из мотива LPXTG (Leu-Pro-любая аминокислота-Thr-Gly) (SEQ ID NO: 106), затем идет высокогидрофобная трансмембранная последовательность, затем - кластер из основных остатков, таких как аргинин. Расщепление происходит между Thr и Gly с временным присоединением через остаток Thr к Cys остатку активного участка лигационного партнера, за чем следует транспептидация, во время которой белок ко-валентно присоединяется к стенке клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения лигационный партнер содержит Gly(n).
В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством произвольного линкера, может быть сшит с белком Ф-VIII, связанным сортазой с Gly(n), при этом п может иметь любое численное значение. Лигационная конструкция содержит фрагмент ФВ (N-концевая часть конструкции) и белок Ф-VIII (С-концевая часть конструкции), при этом между ними вставлен распознающий сортазу мотив. Пример конструкции показан на фиг. 24(А). Другая лигационная конструкция содержит фрагмент ФВ (N-концевая часть конструкции), линкер, распознающий сортазу мотив и белок Ф-VIII (С-концевая часть конструкции) (например, фиг. 24(В)). В другом варианте реализации изобретения белок Ф-VIII, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством произвольного линкера, может быть сшит с фрагментом ФВ, связанным сортазой с Gly(n), при этом п может иметь любое численное значение. Полученная лигационная конструкция содержит белок Ф-VIII (N-концевая часть конструкции) и фрагмент ФВ (С-концевая часть конструкции), при этом между ними вставлен распознающий сортазу мотив. Пример конструкции показан на фиг. 24(Б). Другая лигационная конструкция содержит белок Ф-VIII (N-концевая часть конструкции), линкер, распознающий сортазу мотив и фрагмент ФВ (С-концевая часть конструкции) (например, фиг. 24(Г)). В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, связанный с распознающим сортазу мотивом посредством первого произвольного линкера, может быть сшит с гетерологичным компонентом, например, константной областью иммуноглобулина или ее частью, например Fc-областью, связанной с сайтом расщепления тромбином посредством второго произвольного линкера. Полученная конструкция может содержать фрагмент ФВ (N-концевая часть), первый линкер, распознающий сортазу мотив, сайт расщепления протеазой, второй произвольный линкер и гетерологичный компонент (например, фиг. 24(Д)). В определенных вариантах реализации изобретения эта полученная конструкция является частью химерного белка, содержащего белок Ф-VIII и второй гетерологичный компонент, например константную область иммуноглобулина или ее часть, например Fc-область. В другом примере химерный белок содержит три полипептидные
цепи с первой цепью, содержащей фрагмент ФВ, первый линкер, распознающий сортазу мотив, сайт расщепления протеазой, второй произвольный линкер, первый гетерологичный компонент, второй цепью, содержащей легкую цепь белка Ф-VIII и второй гетерологичный компонент, и третьей цепью, содержащей тяжелую цепь белка Ф-VIII.
В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, причем фрагмент ФВ и белок Ф-VIII ковалентно соединены друг с другом либо ковалентно связаны друг с другом, обладает меньшей иммуногенностью чем белок Ф-VIII без фрагмента ФВ. Сниженная иммуногенность включает, но не ограничивается этим, более слабый гуморальный иммунный ответ, например более низкий титр нейтрализующих антител, или более слабый клеточно-опосредованный иммунный ответ на Ф-VIII, например меньшую выработку различных цитокинов.
В других вариантах реализации результатом данного изобретения было продление времени полужизни белка Ф-VIII (либо химерного белка) по сравнению с белком Ф-VIII без фрагмента ФВ или Ф-VIII дикого типа. Время полужизни белка Ф-VIII по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 2,5, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 6, по меньшей мере в 7, по меньшей мере в 8, по меньшей мере в 9, по меньшей мере в 10, по меньшей мере в 11 или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка Ф-VIII без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни Ф-VIII приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10 кратно превышает время полужизни Ф-VIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни Ф-VIII продлено в от около 2 до около 10 раз, от около 2 до около 9 раз, от около 2 до около 8 раз, от около 2 до около 7 раз, от около 2 до около 6 раз, от около 2 до около 5 раз, от около 2 до около 4 раз, от около 2 до около 3 раз, от около 2,5 до около 10 раз, от около 2,5 до около 9 раз, от около 2,5 до около 8 раз, от около 2,5 до около 7 раз, от около 2,5 до около 6 раз, от около 2,5 до около 5 раз, от около 2,5 до около 4 раз, от около 2,5 до около3 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 3 до около 9 раз, от около 3 до около 8 раз, от около 3 до около 7 раз, от около 3 до около 6 раз, от около 3 до около 5 раз, от около 3 до около 4 раз, от около 4 до около 6 раз, от около 5 до около 7 раз или от около 6 до около 8 раз по сравнению с Ф-VIII дикого типа или белком Ф-VIII без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-VIII составляет по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 26, по меньшей мере около 27, по меньшей мере около 28, по меньшей мере около 29, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 31, по меньшей мере около 32, по меньшей мере около 33, по меньшей мере около 34, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 36, по меньшей мере около 48, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 72, по меньшей мере около 84, по меньшей мере около 96 или по меньшей мере около 108 ч. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-VIII составляет от около 15 ч до около двух недель, от около 16 ч до около одной недели, от около 17 ч до около одной недели, от около 18 ч до около одной недели, от около 19 ч до около одной недели, от около 20 ч до около одной недели, от около 21 ч до около одной недели, от около 22 ч до около одной недели, от около 23 ч до около одной недели, от около 24 ч до около одной недели, от около 36 ч до около одной недели, от около 48 ч до около одной недели, от около 60 ч до около одной недели, от около 24 ч до около шести дней, от около 24 ч до около пяти дней, от около 24 ч до около четырех дней, от около 24 ч до около трех дней или от около 24 ч до около двух дней.
В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни Ф-VIII у пациента составляет около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23 ч, около 24 ч (1 дня), около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 40, около 44 ч, около 48 ч (2 дней), около 54, около 60 ч, около 72 ч (3 дней), около 84 ч, около 96 ч (4 дней), около 108 ч, около 120 ч (5 дней), около 6 дней, около 7 дней (одной недели), около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14 дней.
В определенных вариантах реализации изобретения время полужизни белка Ф-VIII, ковалентно связанного с фрагментом ФВ, было продлено в случае мышей с двойным Ф-VIII/ФВ генным нокатутом ("ДГН") по сравнению с полипептидом, состоящим из Ф-VIII или мономер-димерного гибрида Ф-VIII.
А) Фрагменты фактора Виллебранда (ФВ).
ФВ (также известный как Ф8ФВ) является крупным мультимерным гликопротеином, который находится в плазме крови и постоянно вырабатывается в эндотелии (в тельцах Вейбеля-Палада), мегака-риоцитах ( <с-гранулах тромбоцитов) и субэндотелиальной соединительной ткани. Основной мономер ФВ представляет собой белок из 2813 аминокислот. Каждый мономер содержит определенное количество специфических доменов со специфическими функциями, домены D' и D3 (которые совместно связываются с фактором VIII), домен А1 (который связывается с тромбоцитарным GPIb-рецептором, гепарином и/или, возможно, коллагеном), домен A3 (который связывается с коллагеном), домен С1 (в котором домен RGD связывается с тромбоцитарным интегрином <сПЪР3, когда он находится в активированном со
стоянии) и "цистеин-узловой" домен у С-терминального конце белка (который ФВ делит с тромбоцитарным фактором роста (PDGF), трансформирующим фактором роста Р (TGFP) и Р человеческим хориони-ческим гонадотро пином (РХГЧ)).
Состоящая из 2813 аминокислот последовательность человеческого ФВ представлена в Genbank как
Accession Number _NP_000543.2 . Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий ФВ,
представлена в Genbank как Accession Number NM 000552.3 . Нуклеотидная последовательность человеческого ФВ обозначена как SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1. Каждый из доменов ФВ перечислен в табл. 1.
Таблица 1
Домены ФВ
Аминокислотная последовательность
Сигнальный
MIPARFAGVL LALALILPGT LC 22
пептид ФВ
(Аминокислоты
от 1 до 22 из
SEQIDNO: 2)
D1D2 участок
2 3AEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM
YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG
101
TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL
(Аминокислоты
151
SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC
201
ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC
от 23 до 763 из
251
EKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGME
SEQIDNO: 2)
301
YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC
351
VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD
401
NRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG
451
LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM
501
DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG
551
NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS
601
PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL
651
NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD
701
CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD
751
AVLSSPLSHRSKR7 63
Домен D' ФВ
7 64 SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTK
TCONYDLECM
(Аминокислоты
801
SMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCV
от 764 до 866 из
851
CRDRKWNCTD HVCDAT866
SEQIDNO: 2)
Домен D3 ФВ
867
CSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGS
901
NPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDE
(Аминокислоты
951
THFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFD
от 867 до 1240 из
1001 1051
GIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNI MKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACF
SEQIDNO: 2)
1101
CDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCA
1151
PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE
1201 1240
VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEP
Домен А1 ФВ
1241
GGLWPPTDA
1251
PVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFV
(Аминокислоты
1301
VDMMERLRISQKWVRVAWEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYA
от 1241 до 1479
1351 1401
GSQVASTSEVLKYTLFQIFSKIDRPEASRIALLLMASQEPQRMSRNFVRY VQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLKQIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQR
из SEQIDNO: 2)
1451
DEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVG 14 7 9
1480
PGLLGVSTLGPKRNSMVLDVA
1501
FVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYSYMVTVEY
1551
PFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQA 1600
PNLVYMVTGNPASDEIKRLPGDIQWPIGVGPNANVQELERIGWPNAPIL
1601
1651
IQDFETLPREAPDLVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSS
1701
S FPAS YFDEMKS FAKAFIS KANIGPRLTQVS VLQYGSITTIDVPWNWPE
1751
KAHLLS LVDVMQREGGP SQIGDALGFAVRYLT S EMHGARPGAS KAWILV
1801
T D VS VD S VD AAAD AAR S N RVT VF PIGIGDRY D AAQ L RI LAG P AG D S N WK
1851
LQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCH
1901
TVTCQPDGQTLLKSHRWCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVC
1951 TGSSTRHIVTFDGQNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQG
2 001 CMKSIEVKHSALSVEXHSDMEVTWGRLVSVPYVGGNMEWVYGAIMHEV
2 051 RFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYGLCGICDENGANDFMLRD
2101 GTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILEEQCLVPDSSHCQVLLLPLFAEC
2151 HKVLAPATFYAICQQDSCHQEQVCEVIASYAHLCRTNGVCVDWRTPDFCA
22 01 MSCPPSLVYNHCEHGCPRHCDGNVSSCGDHPSEGCFCPPDKVMLEGSCVP
22 51 EEACTQCIGEDGVQHQFLEAWVPDHQPCQICTCLSGRKWCTTQPCPTAK
2301 APTCGLCEVARLRQNADQCCPEYECVCDPVSCDLPPVPHCERGLQPTLTN
2 351 PGECRPNFTCACRKEECKRVSPPSCPPHRLPTLRKTQCCDEYECACNCVN
24 01 STVSCPLGYLASTATNDCGCTTTTCLPDKVCVHRSTIYPVGQFWEEGCDV
2451 CTCTDMEDAVMGLRVAQCSQKPCEDSCRSGFTYVLHEGECCGRCLPSACE
2501 WTGSPRGDSQSSWKSVGSQWASPENPCLINECVRVKEEVFIQQRNVSCP
2 551 QLEVPVCPSGFQLSCKTSACCPSCRCERMEACMLNGTVIGPGKTVMIDVC
2 601 TTCRCMVQVGVISGFKLECRKTTCNPCPLGYKEENNTGECCGRCLPTACT
2 651 IQLRGGQIMTLKRDETLQDGCDTHFCKWERGEYFWEKRVTGCPPFDEHK
27 01 CLAEGGKIMKIPGTCCDTCEEPECNDITARLQYVKVGSCKSEVEVDIHYC
2751 QGKCASKAMYSIDINDVQDQCSCCSPTRTEPMQVALHCTNGSWYHEVLN
2801 AMECKCSPRK CSK
Нуклеотидная последовательность
ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTTGCCAGGGACCCTTTGTGC AGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC
TACTAAGGACGGTCTAAACGGCCCCACGACGAACGAGACCGGGAGTAAAACGGTCCCTGGGAAACACG TCTTCCTTGAGCGCCGTCCAGTAGGTGCCGGG
GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATGTACAGCTTTGCGGGATAC TGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA
CTACGTCGGAAAAGCCTTCACTGAAGCAGTTGTGGAAACTACCCTCGTACATGTCGAAACGCCCTATG ACGTCAATGGAGGACCGTCCCCCGACGGTCTT
ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCCTCTCCGTGTATCTTGGGG AATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT
TGCGAGGAAGAGCTAATAACCCCTGAAGGTCTTACCGTTCTCTCACTCGGAGAGGCACATAGAACCCC T TAAAAAACT GTAG GTAAACAAACAGTTAC CA
ACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGGGCTGTATCTAGAAACTGA GGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT
TGGCACTGTGTCCCCCTGGTTTCTCAGAGGTACGGGATACGGAGGTTTCCCGACATAGATCTTTGACT CCGACCCATGATGTTCGACAGGCCACTCCGGA
ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTGTCAGACAGATACTTCAAC AAGACCTGCGGGCTGTGTGGCAACTTTAACAT
TACCGAAACACCGGTCCTAGCTACCGTCGCCGTTGAAAGTTCAGGACGACAGTCTGTCTATGAAGTTG TTCTGGACGCCCGACACACCGTTGAAATTGTA
CTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACCCTTATGACTTTGCCAACT CATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT
GAAACGACTTCTACTGAAATACTGGGTTCTTCCCTGGAACTGGAGCCTGGGAATACTGAAACGGTTGA GTACCCGAGACTCGTCACCTCTTGTCACCACA
G AA CGGGCATCTCCTCCCAG CA G С T С AT G С A^ CAT CTCCTCTGGG G AaiAT G CA GA^ GGGCCTGTGG GA GCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGT
CTTGCCCGTAGAGGAGGGTCGTCGAGTACGTTGTAGAGGAGACCCCTTTACGTCTTCCCGGACACCCT CGTCACGGTCGAAGACTTCTCGTGGAGCCACA
TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGTGAGAAGACTTTGTGTGAG TGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC
AACGGGCGACGGTGGGAGACCACCTGGGGCTCGGAAAACACCGGGACACACTCTTCTGAAACACACTC ACACGACCCCCCGACCTCACGCGGACGGGACG
CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACGGCTGGACCGACCACAGCG CGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG
GGAGGACCTCATGCGGGCCTGGACACGGGTCCTCCCTTACCACGACATGCCGACCTGGCTGGTGTCGC GCACGTCGGGTCACACGGGACGACCATACCTC
TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACATCAATGAAATGTGTCAGGA GCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG
ATATCCGTCACACACAGGGGAACGCGGTCCTGGACGGTCTCGGACGTGTAGTTACTTTACACAGTCCT CGCTACGCACCTACCGACGTCGACGGGACTCC
GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGCGTGCATTCCGGAAAGCGC TACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG
CTGTCGAGGACCTACTTCCGGAGACGCACCTCTCGTGGCTCACAGGGACGCACGTAAGGCCTTTCGCG ATGGGAGGGCCGTGGAGGGAGAGAGCTCTGAC
CAACACCTGCATTTGCCGAAACAGCCAGTGGATCTGCAGCAATGAAGAATGTCCAGGGGAGTGCCTTG TCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC
GTTGTGGACGTAAACGGCTTTGTCGGTCACCTAGACGTCGTTACTTCTTACAGGTCCCCTCACGGAAC AGTGACCAGTTAGGGTGAAGTTCTCGAAACTG
028309
AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGATTGCCAGGACCACTCCTT
CTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG
TTGTCTATGAAGTGGAAGTCACCCTAGACGGTCATGGACGACCGGGCCCTAACGGTCCTGGTGAGGAA
GAGGTAACAGTAACTCTGACAGGTCACACGAC
ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGCCTGCACAACAGCCTTGTG
AAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA
TACTGGCGCTGCGACACACGTGGGCGAGGCAGTGGCAGGCCGACGGACCGGACGTGTTGTCGGAACAC
TTTGACTTCGTACCCCGTCCTCAACGGTACCT
TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGCATACAGTGACGGCCTCCG
TGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG
ACCGGTCCTGTAGGTCGAGGGGGAGGACTTTCCACTGGAGGCGTAGGTCGTATGTCACTGCCGGAGGC
ACGCGGAGTCGATGCCCCTCCTGGACGTCTAC
GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGCCGGGAAGACCTGCGGCCT
GTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG
CTGACCCTACCGGCGCCCTCCGACGACCACTTCGACAGGGGGCAGATACGGCCCTTCTGGACGCCGGA
CACACCCTTAATGTTACCGTTGGTCCCGCTGC
ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCRGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGGAACGCCTGGAAGCTGCAC
GGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG
TGAAGGAATGGGGGAGACCCGACCGYCTCGGGGCCCACCTCCTGAAGCCCTTGCGGACCTTCGACGTG
CCCCTGACGGTCCTGGACGTCTTCGTCGTGTC
CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGTGCGCGGTCCTGACGTCCC
CCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC
GCTAGGGACGCGGGAGTTGGGCGCGTACTGGTCCAAGAGGCTCCTCCGCACGCGCCAGGACTGCAGGG
GGTGTAAGCTCCGGACGGTAGCACGGCAGTCG
CCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGACGGCCGCGAGTGCCTGTG
CGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG
GGCGACGGGATGGACGCCTTGACGGCGATGCTGCACACGAGGACGAGCCTGCCGGCGCTCACGGACAC
GCCGCGGGACCGGTCGATACGGCGCCGGACGC
CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTGAACTGCCCGAAAGGCCAG
GTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT
GCCCCTCTCCGCACGCGCAGCGCACCGCGCTCGGTCCGGCGACACTCGACTTGACGGGCTTTCCGGTC
CACATGGACGTCACGCCCTGGGGGACGTTGGA
GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCCTGGAGGGCTGCTTCTGCC
CCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC
CTGGACGGCGAGAGAGAGAATGGGCCTACTCCTTACGTTACTCCGGACGGACCTCCCGACGAAGACGG
GGGGTCCCGAGATGTACCTACTCTCCCCCCTG
TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCAGCCAGAAGACATCTTCTC
AGACCATCACACCATGTGCTACTGTGAGGATG
ACGCACGGGTTCCGGGTCACGGGGACAATGATACTGCCACTCTAGAAGGTCGGTCTTCTGTAGAAGAG
TCTGGTAGTGTGGTACACGATGACACTCCTAC
GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGACGCTGTCCTCAGCAGTCCC
CTGTCTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTG
CGAAGTACGTGACATGGTACTCACCTCAGGGGCCTTCGAACGACGGACTGCGACAGGAGTCGTCAGGG
GACAGAGTAGCGTCGTTTTCCTCGGATAGGAC
TCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTGAAGGGCTCGAGTGTACCA
AAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATG
AGCCGGGGGGTACCAGTTCGACCACACAGGGCGACTGTTGGACGCCCGACTTCCCGAGCTCACATGGT
TTTGCACGGTCTTGATACTGGACCTCACGTAC
AGCATGGGCTGTGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAACAGATGTGTGGC
CCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCA
TCGTACCCGACACAGAGACCGACGGAGACGGGGGGCCCGTACCAGGCCGTACTCTTGTCTACACACCG
GGACCTTTCCACAGGGACGAAGGTAGTCCCGT
AGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTCTGTCGGGACCGGAAGTGG
AACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTG
TCCTCATACGGGGACCTCTTTGTCACTTCTAACCGACGTTGTGAACACAGACAGCCCTGGCCTTCACC
TTGACGTGTCTGGTACACACACTACGGTGCAC
CTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACCTGTTCCCCGGGGAGTGCC
AGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGT
GAGGTGCTAGCCGTACCGGGTGATGGAGTGGAAGCTGCCCGAGTTTATGGACAAGGGGCCCCTCACGG
TCATGCAAGACCACGTCCTAATGACGCCGTCA
AACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAA
ACGGGTCACCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGA
TTGGGACCCTGGAAAGCCTAGGATCACCCCTTATTCCCTACGTCGGTGGGGAGTCACTTTACGTTCTT
TGCCCAGTGGTAGGACCACCTCCCTCCTCTCT
TTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAGACTCACTTTGAGGTGGTG
GAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGG
AACTCGACAAACTGCCCCTCCACTTACACTTCTCCGGGTACTTCCTACTCTGAGTGAAACTCCACCAC
С T CAGAC С G G С CAT GTAG TAAGAC GAC GAC С С
CAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGG
AGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGAT
GTTTCGGGAGAGGCACCAGACCCTGGCGGTGGACTCGTAGAGGCACCAGGACTTCGTCTGTATGGTCC
028309
TCTTTCACACACCGGACACACCCTTAAAACTA
GGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAA
CTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACA
CCGTAGGTCTTGTTACTGGAGTGGTCGTCGTTGGAGGTTCACCTCCTTCTGGGACACCTGAAACCCTT
GAGGACCTTTCACTCGAGCGTCACACGACTGT
CCAGAAAA.GTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTG
GATTCCTCCTGTAGAATCCTTACCAGTGACGT
GGTCTTTTCACGGAGACCTGAGTAGGGGACGGTGGACGGTATTGTTGTAGTACTTCGTCTGCTACCAC
С TAAG GAG GACAT С T TAG GAAT G G T CAC T G CA
CTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACACCTGCT
CCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCTGCTTC
GAAGGTCCTGACGTTGTTCGACCACCTGGGGCTCGGTATAGACCTACAGACGTAAATGCTGTGGACGA
GGACACTCAGGTAACCCCTGACGCGGACGAAG
TGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGACGGC
CACAT TGTGCCCC CAGAG CT G С GAG GAGAG GA
ACGCTGTGGTAACGACGGATACGGGTGCACACACGGGTCGTACCGTTCCACCACTGGACCTCCTGCCG
GTGTAACACGGGGGTCTCGACGCTCCTCTCCT
ATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACG
TGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGT
TAGAGGCCCTCTTGCCCATACTCACACTCACCGCGATATTGTCGACACGTGGACGGACAGTTCAGTGC
ACAGTCGTGGGACTCGGTGACCGGACGGGACA
GCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAA.TCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCT
GCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAG
CGTCACACACCTCCCGACGGTACGGGTGACGGGAGGTCCCTTTTAGGACCTACTCGAAAA.CGTCTGGA
CGCAACTGGGACTTCTGACAGGTCACACACTC
GTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCA
GATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCT
CACCGACCGGCCGCAAAA.CGGAGTCCTTTCTTTCAGTGGAACTTAGGGTCACTGGGACTCGTGACGGT
С TAAAC G G T GACAC TACAACAG T T G GAG T G GA
GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACT
CTGTATGTGGAGGACATCTCGGAACCGCCGTT
CACTTCGGACGGTCCTCGGCCCTCCGGACCACCACGGAGGGTGTCTACGGGGCCACTCGGGGTGGTGA
GACATACACCTCCTGTAGAGCCTTGGCGGCAA
GCACGATTTCTACTGCAGCAGGCTACTGGACCTGGTCTTCCTGCTGGATGGCTCCTCCAGGCTGTCCG
AGGCTGAGTTTGAAGTGCTGAAGGCCTTTGTG
CGTGCTAAAGATGACGTCGTCCGATGACCTGGACCAGAAGGACGACCTACCGAGGAGGTCCGACAGGC
TCCGACTCAAACTTCACGACTTCCGGAAACAC
GTGGACATGATGGAGCGGCTGCGCATCTCCCAGAAGTGGGTCCGCGTGGCCGTGGTGGAGTACCACGA
CGGCTCCCACGCCTACATCGGGCTCAAGGACC
CACCTGTACTACCTCGCCGACGCGTAGAGGGTCTTCACCCAGGCGCACCGGCACCACCTCATGGTGCT
GCCGAGGGTGCGGATGTAGCCCGAGTTCCTGG
GGAAGCGACCGTCAGAGCTGCGGCGCATTGCCAGCCAGGTGAAGTATGCGGGCAGCCAGGTGGCCTCC
ACCAGCGAGGTCTTGAAATACACACTGTTCCA
CCTTCGCTGGCAGTCTCGACGCCGCGTAACGGTCGGTCCACTTCATACGCCCGTCGGTCCACCGGAGG
TGGTCGCTCCAGAACTTTATGTGTGACAAGGT
AATCTTCAGCAAGATCGACCGCCCTGAAGCCTCCCGCATCGCCCTGCTCCTGATGGCCAGCCAGGAGC
CCCAACGGATGTCCCGGAACTTTGTCCGCTAC
TTAGAAGTCGTTCTAGCTGGCGGGACTTCGGAGGGCGTAGCGGGACGAGGACTACCGGTCGGTCCTCG
GGGTTGCCTACAGGGCCTTGAAACAGGCGATG
GTCCAGGGCCTGAAGAAGAAGAAGGTCATTGTGATCCCGGTGGGCATTGGGCCCCATGCCAACCTCAA
GCAGATCCGCCTCATCGAGAAGCAGGCCCCTG
CAGGTCCCGGACTTCTTCTTCTTCCAGTAACACTAGGGCCACCCGTAACCCGGGGTACGGTTGGAGTT
CGTCTAGGCGGAGTAGCTCTTCGTCCGGGGAC
AGAACAAGGCCTTCGTGCTGAGCAGTGTGGATGAGCTGGAGCAGCAAAGGGACGAGATCGTTAGCTAC
CTCTGTGACCTTGCCCCTGAAGCCCCTCCTCC
TCTTGTTCCGGAAGCACGACTCGTCACACCTACTCGACCTCGTCGTTTCCCTGCTCTAGCAATCGATG
GAGACACTGGAACGGGGACTTCGGGGAGGAGG
TACTCTGCCCCCCGACATGGCACAAGTCACTGTGGGCCCGGGGCTCTTGGGGGTTTCGACCCTGGGGC
CCAAGAGGAACTCCATGGTTCTGGATGTGGCG
GGTTCTCCTTGAGGTACCAAGACCTACACCGC
TTCGTCCTGGAAGGATCGGACAAAATTGGTGAAGCCGACTTCAACAGGAGCAAGGAGTTCATGGAGGA
GGTGATTCAGCGGATGGATGTGGGCCAGGACA
AAGCAGGACCTTCCTAGCCTGTTTTAACCACTTCGGCTGAAGTTGTCCTCGTTCCTCAAGTACCTCCT
CCACTAAGTCGCCTACCTACACCCGGTCCTGT
GCATCCACGTCACGGTGCTGCAGTACTCCTACATGGTGACCGTGGAGTACCCCTTCAGCGAGGCACAG
TCCAAAGGGGACATCCTGCAGCGGGTGCGAGA
CGTAGGTGCAGTGCCACGACGTCATGAGGATGTACCACTGGCACCTCATGGGGAAGTCGCTCCGTGTC
AGGTTTCCCCTGTAGGACGTCGCCCACGCTCT
GATCCGCTACCAGGGCGGCAACAGGACCAACACTGGGCTGGCCCTGCGGTACCTCTCTGACCACAGCT
TCTTGGTCAGCCAGGGTGACCGGGAGCAGGCG
028309
CTAGGCGATGGTCCCGCCGTTGTCCTGGTTGTGACCCGACCGGGACGCCATGGAGAGACTGGTGTCGA
AGAACCAGTCGGTCCCACTGGCCCTCGTCCGC
CCCAACCTGGTCTACATGGTCACCGGAAATCCTGCCTCTGATGAGATCAAGAGGCTGCCTGGAGACAT
CCAGGTGGTGCCCATTGGAGTGGGCCCTAATG
GGGTTGGACCAGATGTACCAGTGGCCTTTAGGACGGAGACTACTCTAGTTCTCCGACGGACCTCTGTA
GGTCCACCACGGGTAACCTCACCCGGGATTAC
CCAACGTGCAGGAGCTGGAGAGGATTGGCTGGCCCAATGCCCCTATCCTCATCCAGGACTTTGAGACG
CTCCCCCGAGAGGCTCCTGACCTGGTGCTGCA
GGTTGCACGTCCTCGACCTCTCCTAACCGACCGGGTTACGGGGATAGGAGTAGGTCCTGAAACTCTGC
GAGGGGGCTCTCCGAGGACTGGACCACGACGT
GAGGTGCTGCTCCGGAGAGGGGCTGCAGATCCCCACCCTCTCCCCTGCACCTGACTGCAGCCAGCCCC
TGGACGTGATCCTTCTCCTGGATGGCTCCTCC
CTCCACGACGAGGCCTCTCCCCGACGTCTAGGGGTGGGAGAGGGGACGTGGACTGACGTCGGTCGGGG
ACCTGCACTAGGAAGAGGACCTACCGAGGAGG
AGTTTCCCAGCTTCTTATTTTGATGAAATGAAGAGTTTCGCCAAGGCTTTCATTTCAAAAGCCAATAT
AGGGCCTCGTCTCACTCAGGTGTCAGTGCTGC
TCAAAGGGTCGAAGAATAAAACTACTTTACTTCTCAAAGCGGTTCCGAAAGTAAAGTTTTCGGTTATA
TCCCGGAGCAGAGTGAGTCCACAGTCACGACG
AGTATGGAAGCATCACCACCATTGACGTGCCATGGAACGTGGTCCCGGAGAAAGCCCATTTGCTGAGC
CTTGTGGACGTCATGCAGCGGGAGGGAGGCCC
TCATACCTTCGTAGTGGTGGTAACTGCACGGTACCTTGCACCAGGGCCTCTTTCGGGTAAACGACTCG
GAACACCTGCAGTACGTCGCCCTCCCTCCGGG
CAGCCAAATCGGGGATGCCTTGGGCTTTGCTGTGCGATACTTGACTTCAGAAATGCATGGTGCCAGGC
CGGGAGCCTCAAAGGCGGTGGTCATCCTGGTC
GTCGGTTTAGCCCCTACGGAACCCGAAACGACACGCTATGAACTGAAGTCTTTACGTACCACGGTCCG
GCCCTCGGAGTTTCCGCCACCAGTAGGACCAG
ACGGACGTCTCTGTGGATTCAGTGGATGCAGCAGCTGATGCCGCCAGGTCCAACAGAGTGACAGTGTT
CCCTATTGGAATTGGAGATCGCTACGATGCAG
TGCCTGCAGAGACACCTAAGTCACCTACGTCGTCGACTACGGCGGTCCAGGTTGTCTCACTGTCACAA
GGGATAACCTTAACCTCTAGCGATGCTACGTC
CCCAGCTACGGATCTTGGCAGGCCCAGCAGGCGACTCCAACGTGGTGAAGCTCCAGCGAATCGAAGAC
CTCCCTACCATGGTCACCTTGGGCAATTCCTT
GGGTCGATGCCTAGAACCGTCCGGGTCGTCCGCTGAGGTTGCACCACTTCGAGGTCGCTTAGCTTCTG
GAGGGATGGTACCAGTGGAACCCGTTAAGGAA
CCTCCACAAACTGTGCTCTGGATTTGTTAGGATTTGCATGGATGAGGATGGGAATGAGAAGAGGCCCG
GGGACGTCTGGACCTTGCCAGACCAGTGCCAC
GGAGGTGTTTGACACGAGACCTAAACAATCCTAAACGTACCTACTCCTACCCTTACTCTTCTCCGGGC
CCCTGCAGACCTGGAACGGTCTGGTCACGGTG
ACCGTGACTTGCCAGCCAGATGGCCAGACCTTGCTGAAGAGTCATCGGGTCAACTGTGACCGGGGGCT
GAGGCCTTCGTGCCCTAACAGCCAGTCCCCTG
TGGCACTGAACGGTCGGTCTACCGGTCTGGAACGACTTCTCAGTAGCCCAGTTGACACTGGCCCCCGA
CTCCGGAAGCACGGGATTGTCGGTCAGGGGAC
TTAAAGTGGAAGAGACCTGTGGCTGCCGCTGGACCTGCCCCTGYGTGTGCACAGGCAGCTCCACTCGG
CACATCGTGACCTTTGATGGGCAGAATTTCAA
AATTTCACCTTCTCTGGACACCGACGGCGACCTGGACGGGGACRCACACGTGTCCGTCGAGGTGAGCC
GTGTAGCACTGGAAACTACCCGTCTTAAAGTT
GCTGACTGGCAGCTGTTCTTATGTCCTATTTCAAAACAAGGAGCAGGACCTGGAGGTGATTCTCCATA
ATGGTGCCTGCAGCCCTGGAGCAAGGCAGGGC
CGACTGACCGTCGACAAGAATACAGGATAAAGTTTTGTTCCTCGTCCTGGACCTCCACTAAGAGGTAT
TACCACGGACGTCGGGACCTCGTTCCGTCCCG
TGCATGAAATCCATCGAGGTGAAGCACAGTGCCCTCTCCGTCGAGSTGCACAGTGACATGGAGGTGAC
GGTGAATGGGAGACTGGTCTCTGTTCCTTACG
ACGTACTTTAGGTAGCTCCACTTCGTGTCACGGGAGAGGCAGCTCSACGTGTCACTGTACCTCCACTG
CCACTTACCCTCTGACCAGAGACAAGGAATGC
TGGGTGGGAACATGGAAGTCAACGTTTATGGTGCCATCATGCATGAGGTCAGATTCAATCACCTTGGT
CACATCTT CACATT CACT CCACAAAACAATGA
ACCCACCCTTGTACCTTCAGTTGCAAATACCACGGTAGTACGTACTCCAGTCTAAGTTAGTGGAACCA
GTGTAGAAGTGTAAGTGAGGTGTTTTGTTACT
GTTCCAACTGCAGCTCAGCCCCAAGACTTTTGCTTCAAAGACGTATGGTCTGTGTGGGATCTGTGATG
AGAACGGAGCCAATGACTTCATGCTGAGGGAT
CAAGGTTGACGTCGAGTCGGGGTTCTGAAAACGAAGTTTCTGCATACCAGACACACCCTAGACACTAC
TCTTGCCTCGGTTACTGAAGTACGACTCCCTA
GGCACAGTCACCACAGACTGGAAAACACTTGTTCAGGAATGGACTGTGCAGCGGCCAGGGCAGACGTG
CCAGCCCATCCTGGAGGAGCAGTGTCTTGTCC
CCGTGTCAGTGGTGTCTGACCTTTTGTGAACAAGTCCTTACCTGACACGTCGCCGGTCCCGTCTGCAC
GGTCGGGTAGGACCTCCTCGTCACAGAACAGG
CCGACAGCTCCCACTGCCAGGTCCTCCTCTTACCACTGTTTGCTGAATGCCACAAGGTCCTGGCTCCA
G С CACAT T CTAT G С CAT С T G С CAG CAG GACAG
GGCTGTCGAGGGTGACGGTCCAGGAGGAGAATGGTGACAAACGACTTACGGTGTTCCAGGACCGAGGT
CGGTGTAAGATACGGTAGACGGTCGTCCTGTC
TTGCCACCAGGAGCAAGTGTGTGAGGTGATCGCCTCTTATGCCCACCTCTGTCGGACCAACGGGGTCT
028309
GCGTTGACTGGAGGACACCTGATTTCTGTGCT
AACGGTGGTCCTCGTTCACACACTCCACTAGCGGAGAATACGGGTGGAGACAGCCTGGTTGCCCCAGA
CGCAACTGACCTCCTGTGGACTAAAGACACGA
ATGTCATGCCCACCATCTCTGGTCTACAACCACTGTGAGCATGGCTGTCCCCGGCACTGTGATGGCAA
CGTGAGCTCCTGTGGGGACCATCCCTCCGAAG
TACAGTACGGGTGGTAGAGACCAGATGTTGGTGACACTCGTACCGACAGGGGCCGTGACACTACCGTT
GCACTCGAGGACACCCCTGGTAGGGAGGCTTC
GCTGTTTCTGCCCTCCAGATAAAGTCATGTTGGAAGGCAGCTGTGTCCCTGAAGAGGCCTGCACTCAG
TGCATTGGTGAGGATGGAGTCCAGCACCAGTT
CGACAAAGACGGGAGGTCTATTTCAGTACAACCTTCCGTCGACACAGGGACTTCTCCGGACGTGAGTC
ACGTAACCACTCCTACCTCAGGTCGTGGTCAA
CCTGGAAGCCTGGGTCCCGGACCACCAGCCCTGTCAGATCTGCACATGCCTCAGCGGGCGGAAGGTCA
ACTGCACAACGCAGCCCTGCCCCACGGCCAAA
GGACCTTCGGACCCAGGGCCTGGTGGTCGGGACAGTCTAGACGTGTACGGAGTCGCCCGCCTTCCAGT
TGACGTGTTGCGTCGGGACGGGGTGCCGGTTT
GCTCCCACGTGTGGCCTGTGTGAAGTAGCCCGCCTCCGCCAGAATGCAGACCAGTGCTGCCCCGAGTA
TGAGTGTGTGTGTGACCCAGTGAGCTGTGACC
CGAGGGTGCACACCGGACACACTTCATCGGGCGGAGGCGGTCTTACGTCTGGTCACGACGGGGCTCAT
ACTCACACACACACTGGGTCACTCGACACTGG
TGCCCCCAGTGCCTCACTGTGAACGTGGCCTCCAGCCCACACTGACCAACCCTGGCGAGTGCAGACCC
AACTTCACCTGCGCCTGCAGGAAGGAGGAGTG
ACGGGGGTCACGGAGTGACACTTGCACCGGAGGTCGGGTGTGACTGGTTGGGACCGCTCACGTCTGGG
TTGAAGTGGACGCGGACGTCCTTCCTCCTCAC
CAAAA.GAGTGTCCCCACCCTCCTGCCCCCCGCACCGTTTGCCCACCCTTCGGAAGACCCAGTGCTGTG
AT GAGTAT GAGT GT GC CT GCAACT GT GT CAAC
GTTTTCTCACAGGGGTGGGAGGACGGGGGGCGTGGCAAACGGGTGGGAAGCCTTCTGGGTCACGACAC
TACTCATACTCACACGGACGTTGACACAGTTG
TCCACAGTGAGCTGTCCCCTTGGGTACTTGGCCTCAACCGCCACCAATGACTGTGGCTGTACCACAAC
CACCTGCCTTCCCGACAAGGTGTGTGTCCACC
AGGTGTCACTCGACAGGGGAACCCATGAACCGGAGTTGGCGGTGGTTACTGACACCGACATGGTGTTG
GTGGACGGAAGGGCTGTTCCACACACAGGTGG
GAAGCACCATCTACCCTGTGGGCCAGTTCTGGGAGGAGGGCTGCGATGTGTGCACCTGCACCGACATG
GAGGATGCCGTGATGGGCCTCCGCGTGGCCCA
CTTCGTGGTAGATGGGACACCCGGTCAAGACCCTCCTCCCGACGCTACACACGTGGACGTGGCTGTAC
CTCCTACGGCACTACCCGGAGGCGCACCGGGT
GTGCTCCCAGAAGCCCTGTGAGGACAGCTGTCGGTCGGGCTTCACTTACGTTCTGCATGAAGGCGAGT
GCTGTGGAAGGTGCCTGCCATCTGCCTGTGAG
CACGAGGGTCTTCGGGACACTCCTGTCGACAGCCAGCCCGAAGTGAATGCAAGACGTACTTCCGCTCA
CGACACCTTCCACGGACGGTAGACGGACACTC
GTGGTGACTGGCTCACCGCGGGGGGACTCCCAGTCTTCCTGGAAGAGTGTCGGCTCCCAGTGGGCCTC
CCCGGAGAACCCCTGCCTCATCAATGAGTGTG
CACCACTGACCGAGTGGCGCCCCCCTGAGGGTCAGAAGGACCTTCTCACAGCCGAGGGTCACCCGGAG
GGGCCTCTTGGGGACGGAGTAGTTACTCACAC
TCCGAGTGAAGGAGGAGGTCTTTATACAACAAAGGAACGTCTCCTGCCCCCAGCTGGAGGTCCCTGTC
TGCCCCTCGGGCTTTCAGCTGAGCTGTAAGAC
AGGCTCACTTCCTCCTCCAGAAATATGTTGTTTCCTTGCAGAGGACGGGGGTCGACCTCCAGGGACAG
ACGGGGAGCCCGAAAGTCGACTCGACATTCTG
CTCAGCGTGCTGCCCAAGCTGTCGCTGTGAGCGCATGGAGGCCTGCATGCTCAATGGCACTGTCATTG
GGCCCGGGAAGACTGTGATGATCGATGTGTGC
GAGTCGCACGACGGGTTCGACAGCGACACTCGCGTACCTCCGGACGTACGAGTTACCGTGACAGTAAC
CCGGGCCCTTCTGACACTACTAGCTACACACG
ACGACCTGCCGCTGCATGGTGCAGGTGGGGGTCATCTCTGGATTCAAGCTGGAGTGCAGGAAGACCAC
CTGCAACCCCTGCCCCCTGGGTTACAAGGAAG
TGCTGGACGGCGACGTACCACGTCCACCCCCAGTAGAGACCTAAGTTCGACCTCACGTCCTTCTGGTG
GACGTTGGGGACGGGGGACCCAATGTTCCTTC
AAAATAACACAGGTGAATGTTGTGGGAGATGTTTGCCTACGGCTTGCACCATTCAGCTAAGAGGAGGA
CAGAT CAT GACACT GAAG CGT GAT GAGACG CT
TTTTATTGTGTCCACTTACAACACCCTCTACAAACGGATGCCGAACGTGGTAAGTCGATTCTCCTCCT
GTCTAGTACTGTGACTTCGCACTACTCTGCGA
CCAGGATGGCTGTGATACTCACTTCTGCAAGGTCAATGAGAGAGGAGAGTACTTCTGGGAGAAGAGGG
TCACAGGCTGCCCACCCTTTGATGAACACAAG
GGTCCTACCGACACTATGAGTGAAGACGTTCCAGTTACTCTCTCCTCTCATGAAGACCCTCTTCTCCC
AGTGTCCGACGGGTGGGAAACTACTTGTGTTC
TGTCTTGCTGAGGGAGGTAAAA.TTATGAAAATTCCAGGCACCTGCTGTGACACATGTGAGGAGCCTGA
GTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATG
ACAGAACGACTCCCTCCATTTTAATACTTTTAAGGTCCGTGGACGACACTGTGTACACTCCTCGGACT
CACGTTGCTGTAGTGACGGTCCGACGTCATAC
TCAAGGTGGGAAGCTGTAAGTCTGAAGTAGAGGTGGATATCCACTACTGCCAGGGCAAATGTGCCAGC
AAAGCCATGTACTCCATTGACATCAACGATGT
AGTTCCACCCTTCGACATTCAGACTTCATCTCCACCTATAGGTGATGACGGTCCCGTTTACACGGTCG
TTTCGGTACATGAGGTAACTGTAGTTGCTACA
GCAGGACCAGTGCTCCTGCTGCTCTCCGACACGGACGGAGCCCATGCAGGTGGCCCTGCACTGCACCA
ATGGCTCTGTTGTGTACCATGAGGTTCTCAAT
CGTCCTGGTCACGAGGACGACGAGAGGCTGTGCCTGCCTCGGGTACGTCCACCGGGACGTGACGTGGT
TACCGAGACAACACATGGTACTCCAAGAGTTA
GCCATGGAGTGCAAATGCTCCCCCAGGAAGTGCAGCAAGTGA
Настоящее изобретение относится к фрагменту фактора Виллебранда (ФВ), содержащему домен D' и домен D3 ФВ, отличающемуся тем, что фрагмент ФВ препятствует связыванию эндогенного ФВ (полноразмерного ФВ) с белком Ф-VIII. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается или соединяется с белком Ф-VIII. Путем связывания или соединения с белком Ф-VIII фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, защищает Ф-VIII от расщепления протеазой и активации Ф-VIII, стабилизирует тяжелую цепь и легкую цепь Ф-VIII и предотвращает выведение Ф-VIII фагоцитарными рецепторами. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ связывается или соединяется с белком Ф-VIII и блокирует или предотвращает связывание белка Ф-VIII с фосфолипидом и активированным протеином С. Путем предотвращения или подавления связывания белка Ф-VIII с эндоген
ным полноразмерным ФВ фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения снижает выведение Ф-VIII клиренс-рецепторами ФВ и, таким образом, продлевает время полужизни Ф-VIII. Продление времени полужизни белка Ф-VIII происходит, следовательно, благодаря связыванию или соединению фрагмента ФВ, в котором отсутствует участок связывания с клиренс-рецептором ФВ, с белком Ф-VIII и экранированию или защите фрагментом ФВ белка Ф-VIII от эндогенного ФВ, который содержит участок связывания с клиренс-рецептором ФВ. Наличие белка Ф-VIII, связанного или защищенного фрагментом ФВ, также дает возможность рециклинга белка Ф-VIII. Следовательно, фрагмент ФВ не может являться полноразмерным зрелым ФВ. Из-за удаления участков связывания клиренс-рецепторов ФВ, содержащихся в полноразмерной молекуле ФВ, гетеродимеры Ф-\ТП/ФВ, являющиеся объектами данного изобретения, выключаются из процесса выведения ФВ, что позволяет дополнительно продлить время полужизни Ф-VIII.
Фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3, может дополнительно содержать домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, домена D1, домена D2, домена D4, домена В1, домена В2, домена В3, домена С1, домена С2, домена СК, одного или более их фрагментов или любых их комбинаций. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из: (1) принадлежащих ФВ доменов D' и D3 или их фрагментов; (2) принадлежащих ФВ доменов D1, D' и D3 или их фрагментов; (3) принадлежащих ФВ доменов D2, D' и D3 или их фрагментов; (4) принадлежащих ФВ доменов D1, D2, D' и D3 или их фрагментов; или (5) принадлежащих ФВ доменов Dl, D2, D', D3 и А1 или их фрагментов. Описанный в данном тексте фрагмент ФВ не содержит участок, связывающийся с клиренс-рецептором ФВ. В другом варианте реализации изобретения описанный в данном тексте фрагмент ФВ не является аминокислотами от 764 до 1274 из SEQ ID NO: 2. Фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, может содержать любые другие последовательности, связанные или сшитые с фрагментом ФВ, но не являться полноразмерным ФВ. Например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ может дополнительно содержать сигнальный пептид.
В одном варианте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит домен D' и домен D3 ФВ, при этом домен D' является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97%, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 764 до 866 из SEQ ID NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII, защищает, подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. В другом варианте реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домен D' и домен D3 ФВ, при этом домен D3 является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 867 до 1240 из SEQ ID NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. В некоторых вариантах реализации изобретения описанный в данном тексте фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из домена D' и домена D3 ФВ, которые являются по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95,
96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит, состоит преимущественно из или состоит из доменов D1, D2, D', D3 и является по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96,
97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотам от 23 до 1240 из SEQ ID NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с белком Ф-VIII, или подавляет, или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ дополнительно содержит функционально связанный с ним сигнальный пептид.
В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, состоит преимущественно из или состоит из (1) домена D'D3, домена D1D'D3, домена D2D'D3 или домена D1D2D'D3 и (2) дополнительной последовательности ФВ, содержащей до около 10 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2 до аминокислот от 764 до 1250 из SEQ ID NO: 2), до около 15 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2 до аминокислот от 764 до 1255 из SEQ ID NO: 2), до около 20 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2 до аминокислот от 764 до 1260 из SEQ ID NO: 2), до около 25 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2 до аминокислот от 764 до 1265 из SEQ ID NO: 2) или до около 30 аминокислот (например, любые последовательности от аминокислот от 764 до 1240 из SEQ ID NO: 2 до аминокислот от 764 до 1260 из SEQ ID NO: 2). В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ, содержащий или состоящий преимущественно из домена D' и домена D3 не представляет собой как аминокислоты от 764 до 1274 из SEQ ID NO: 2, так и полноразмерный зрелый ФВ.
В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ, содержащий домены D'D3, связанные с доменами D1D2, дополнительно содержит внутриклеточный сайт расщепления (например, сайт расщепления РАСЕ или РС5), что делает возможным отщепление доменов D1D2 от доменов D'D3 после экспрессии. Неограничивающие примеры внутриклеточных сайтов расщепления раскрыты в другом месте данного текста.
В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домен D' и домен D3, но не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (1) аминокислот от
1241 до 2813 из SEQ ID NO: 2, (2) аминокислот от 1270 до аминокислот 2813 из SEQ ID NO: 2, (3) аминокислот от 1271 до аминокислот 2813 из SEQ ID NO: 2, (4) аминокислот от 1272 до аминокислот 2813 из SEQ ID NO: 2, (5) аминокислот от 1273 до аминокислот 2813 из SEQ ID NO: 2 и (6) аминокислот от 1274 до аминокислот 2813 из SEQ ID NO: 2.
В других вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит, состоит преимущественно из или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей домену D', домену D3 и домену А1, при этом аминокислотная последовательность является по меньшей мере на 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичной аминокислотам от 764 до 1479 из SEQ ID NO: 2, при этом фрагмент ФВ связывается с Ф-VIII. В конкретном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ не представляет собой аминокислоты от 764 до 1274 из SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит домен D' и домен D3, но не содержит по меньшей мере один домен ФВ, выбранный из группы, состоящей из (1) домена А1, (2) домена А2, (3) домена A3, (4) домена D4, (5) домена В1, (6) домена В2, (7) домена В3, (8) домена С1, (9) домена С2, (10) домена CK, (11) домена CK и домена С2, (12) домена CK, домена С2 и домена С1, (13) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, (14) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, (15) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2 и домена В1, (16) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1 и домена D4 domain, (17) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4 и домена A3, (18) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3 и домена А2, (19) домена CK, домена С2, домена С1, домена В3, домена В2, домена В1, домена D4, домена A3, домена А2 и домена A1 domain, и (20) любых комбинаций этих доменов.
В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ содержит домены D'D3 и один или более доменов или модулей. Примеры таких доменов и модулей включают, но не ограничиваются этим, домены и модули, описанные в работе Zhour et al., Blood, опубликованной онлайн 6 апреля 2012 г.: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Например, фрагмент ФВ может содержать домен D'D3 и один или более доменов или модулей, выбранных из группы, состоящей из домена А1, домена А2, домена A3, модуля D4N, модуля VWD4, модуля С8-4, модуля TIL-4, модуля С1, модуля С2, модуля С3, модуля С4, модуля С5, модуля С5, модуля С6 и любых комбинаций этих элементов.
В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ связан с гетерологичным компонентом, при этом гетерологичный компонент связан с N-концом или С-концом фрагмента ФВ либо вставлен между двумя аминокислотами во фрагменте ФВ. Например, инсерционным участком для гетерологичного компонента во фрагменте ФВ может являться домен D', домен D3 либо они оба. Гетерологичный компонент может являться компонентом, продлевающим время полужизни.
В определенных вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, образует мультимер, например димер, тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер либо мультимеры высших порядков. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ является мономером, содержащим только один фрагмент ФВ. В некоторых вариантах реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, может одердать одну или более аминокислотных замен, делеций, присоединений или модификаций. В одном варианте реализации изобретения фрагмент ФВ может содержать аминокислотные замены, делеций, присоединения или модификации, которые приводят к тому, что фрагмент ФВ становится неспособным к образованию дисульфидной связи или образованию димера или мультимера. В другом варианте реализации изобретения аминокислотная замена находится в пределах домена D' и домена D3. В конкретном варианте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену на месте остатка, соттветствую-щего остатку 1099, остатку 1142 или обоим остаткам 1099 и 1142 из SEQ ID NO: 2. По меньшей мере одна аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, которые в естественном состоянии не встречаются в ФВ дикого типа. Например, аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, кроме цистеина, например изолейцин, аланин, лейцин, аспарагин, лизин, ас-парагиновую кислоту, метионин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, треонин, глутамин, триптофан, глицин, валин, пролин, серин, тирозин, аргинин или гистидин. В другом примере аминокислотная замена содержит одну или более аминокислот, которые предотвращают или подавляют образование мультиме-ров фрагментами ФВ.
В определенных вариантах реализации фрагмент ФВ, применяемый в данном изобретении, может быть дополнительно модифицирован с целью улучшения его взаимодействия с Ф-VIII, например улучшения аффинности связывания с Ф-VIII. В качестве неограничивающего примера можно привести фрагмент ФВ, который содержит остаток серина на месте остатка, соответствующего аминокислоте 764 из SEQ ID NO: 2, и остаток лизина на месте остатка, соответствующего аминокислоте 773 из SEQ ID NO: 2. Остатки 764 и/или 773 могут влиять на аффинность связывания фрагментов ФВ с Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения фрагмент ФВ может содержать другие модификации, например фрагмент может пэгилированным, гликозилированным, гэкилированным или полисиалилированным.
Б) Гетерологичные компоненты.
Гетерологичный компонент может являться гетерологичным полипептидным или неполипептид-ным компонентом. В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичный компонент является продлевающей время полужизни молекулой, которая известна в данной области техники, и содержит полипептидн, неполипептидный компонент либо комбинацию обоих этих компонентов. Гетероло-гичный полипептидный компонент может содержать константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, альбумин-связывающее вещество, трансферрин или его фрагмент, последовательность PAS, последовательность НАР, их производные либо варианты или любые комбинации этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения неполипептидный связывающий компонент содержит полиэтиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), производное или любые комбинации этих компонентов. В определенных вариантах реализации изобретения может быть один, два, три или более гетерологичных компонентов, которые могут являться одинаковыми либо разными молекулами.
1) Константная область иммуноглобулина или ее часть.
Константная область иммуноглобулина состоит из доменов, называемых СН (константными тяжелыми - от англ. "constant heavy") доменами (CH1, CH2 и т.д.). В зависимости от изотипа (т.е. IgG, IgM, IgA IgD или IgE) константная область может состоять из трех или четырех СН доменов. Некоторые изо-типы (например, IgG) константных областей также содержат шарнирный участок. Смотрите Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
Константную область иммуноглобулина или ее часть для получения химерного белка, являющегося объектом настоящего изобретения, можно получить из большого числа различных источников. В предпочтительных вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть получена из человеческого иммуноглобулина. При этом понятно, что константная область иммуноглобулина или ее часть может быть получена из иммуноглобулина других видов млекопитающих, включая, к примеру, виды грызунов (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или приматов за исключением человека (например, шимпанзе, макаку). Более того, константная область иммуноглобулина или ее часть может быть получена из иммуноглобулина любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и иммуноглобулина любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном варианте реализации изобретения применяется человеческий изотип IgG1.
Большое количество генетических последовательностей константной области иммуноглобулина (например, человеческих генетических последовательностей константной области) доступны в виде открытых баз данных. Можно выбрать последовательность доменов константной области, имеющую определенную эффекторную функцию (или с отсутствием определенной эффекторной функции), или с определенной модификацией для снижения иммуногенности. Было опубликовано большое количество данных последовательностей антител и кодирующих антитела генов, и подходящие последовательности константной области Ig (например, шарнирная, СН2 и/или СН3 последовательности или их части) можно получить из этих последовательностей, используя общепринятые в данной области техники методы. Генетический материал, полученный любым из вышеописанных способов, может затем быть изменен либо синтезирован для того, чтобы получить полипептиды, являющиеся объектами настоящего изобретения. Следует также принять во внимание, что в объем данного изобретения включены аллели, варианты и мутации ДНК последовательностей константной области.
Последовательности константной области иммуноглобулина или ее части можно клонировать, например, при помощи полимеразной цепной реакции и праймеров, которые выбраны таким образом, чтобы амплифицировать представляющий интерес домен. Для того чтобы клонировать константную область иммуноглобулина или ее часть из антитела, можно выделить иРНК из клеток гибридомы, селезенки или лимфоцитов, обратно транскрибировать в ДНК, а гены антитела амплифицировать ПЦРМетоды ПЦР-амплификации детально описаны в патентах US № 4683195; 4683202; 4800159; 4965188; и, например, в "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). ПЦРможет инициироваться консенсусными праймерами константной области или более специфичными праймерами на основе опубликованных данных по ДНК- и аминокислотным последовательностям тяжелой и легкой цепи. Как обсуждалось выше, ПЦРтакже можно применять для выделения клонов ДНК, кодирующих легкую и тяжелую цепи антитела. В этом случае скрининг библиотек может проводиться по консенсусному прай-меру или более крупным гомологичным зондам, таким как зонды мышиной константной области. В данной области техники известны многочисленные группы праймеров, подходящих для амплификации генов антител (например, 5'-концевые праймеры на основе N-концевой последовательности очищенных антител (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); быстрая амплификация концов кДНК (Ru-berti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); лидерные последовательности антител (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Клонирование последовательностей антител дополнительно описано в Newman et al., патент US № 5658570, зарегистрированного 25 января 1995 г., который включен в данный текст посредством ссылки.
Применяемая в данном изобретении константная область иммуноглобулина может содержать все
домены и шарнирный участок либо их части. В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит домен СН2, домен СН3 и шарнирный участок, например Fc-область или FcRn партнера по связыванию.
Употребляемый в данном тексте термин "Fc-область" определяется как часть полипептида, которая соответствует Fc-области нативного иммуноглобулина, т.е. как так, что образована путем димерной ассоциации соответствующих Fc-доменов своих двух тяжелых цепей. Нативная Fc-область образует гомо-димер с другой Fc-областью. В противоположность этому, употребляемый в данном тексте термин "ге-нетически-слитая Fc-область" или "одноцепочечная Fc-область" (оц-Fc-область) относится к синтетической димерной Fc-области, состоящей из Fc-доменов, генетически связанных в пределах одной полипептидной цепи (т. е. кодируемых одиночной непрерывной генетической последовательностью).
В одном варианте реализации изобретения термин "Fc-область" относится к части одиночной тяжелой цепи иммуноглобулина, начиная с шарнирного участка выше сайта расщепления папаином (т.е. остатка 216 в IgG, принимая, что первый остаток тяжелой цепи константной области имеет номер 114) и заканчивая С-концом антитела. Соотвественно полная Fc-область содержит, по меньшей мере, шарнирный участок, домен СН2 и домен СН3.
Fc-область константной области иммуноглобулина в зависимости от изотипа иммуноглобулина может содержать домены СН2, СН3 и СН4, а также шарнирный участок. Химерные белки, содержащие Fc-область иммуноглобулина, приобретают некоторое количество необходимых свойст химерного белка, включая повышенную стабильность, повышенное сывороточное время полужизни (смотрите Capon et al., 1989, Nature 337:525), а также связывание с Fc-рецепторами, такими как неонатальный Fc-рецептор (FcRn) (патенты US № 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US2003-0235536A1), которые в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки.
Константная область иммуноглобулина или ее часть может являться партнером по связыванию FcRn. FcRn активен во взрослых эпителиальных тканях и экспрессируется в полости кишечника, в легочных дыхательных путях, на носовых поверхностях, на вагинальных поверхностях, поверхностях толстой и прямой кишок (патент US № 6485726). Партнер по связыванию FcRn представляет собой часть иммуноглобулина, которая связывается с FcRn.
FcRn-рецептор выделяли из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности человеческого FcRn, обезьяннего FcRn, крысиного FcRn и мышиного FcRn (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). FcRn-рецептор связывает IgG (но не связывает другие классы иммуноглобулина, такие как IgA, IgM, IgD и IgE) при относительно низком уровне рН, активно транспортирует IgG трансцеллюлярно в направлении от люминального к серозному, а затем высвобождает IgG при относительно более высоком уровне рН, характерном для интерстициальных жидкостей. Он экспрессируется во взрослой эпителиальной ткани (патенты US № 6485726, 6030613, 6086875; WO 03/077834; US2003-0235536A1), включая легочный и кишечный эпителий (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), почечный проксимальный тубулярный эпителий (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), а также эпителий носовой полости, вагинальные поверхности и поверхности желчных протоков.
Партнеры по связыванию FcRn, применяемые в настоящем изобретении, включают молекулы, которые могут специфически связываться с FcRn-рецептором, всключая целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты, которые содержат полный связывающий участок FcRn-рецептора. Участок той части Fc-области IgG, которая связывается с FcRn-рецептором, был описан на основе рентгеноструктурной кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Основная контактная область Fc с FcRn находится в районе соединения доменов СН2 и СН3. Все контакты Fc-FcRn находятся в пределах одиночной тяжелой цепи Ig. Партнеры по связыванию FcRn включают целый IgG, Fc-фрагмент IgG и другие фрагменты IgG, которые содержат полный связывающий участок FcRn. Основные контактные участки включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 домена СН2 и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 домена СН3. Все ссылки, приведенные на нумерацию иммуноглобулинов или фрагментов либо цчастков иммуноглобулина, основаны на Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.
Fc-области или партнеры по связыванию FcRn, связанные с FcRn, могут эффективно переноситься через эпителиальные барьеры посредством FcRn, что, таким образом, обеспечивает неинвазионные средства для систематического введения необходимой терапевтической молекулы. Вдобавок, слитые белки, содержащие Fc-области или партнеров по связыванию FcRn, эндоцитозируются клетками, экспресси-рующими FcRn. Но, вместо того, чтобы помечаться для дальнейшей деградации, эти слитые белки снова возвращаются в циркуляцию, что, таким образом, увеличивает in vivo время полужизни этих белком. В определенных вариантах реализации изобретения части константных областей иммуноглобулина являются Fc-областью или партнером по связыванию FcRn, которые обычно объединяются при помощи ди-сульфидных связей и других неспецифических взаимодействий с другой Fc-областью или другим партнером по связыванию FcRn для того, чтобы образовать димер или мультимеры более высоких порядков.
Два FcRn-рецептора могут связывать одиночную Fc-молекулу. Кристаллографические данные позволяют предположить, что каждая молекула FcRn связывает одиночный полипептид гомодимера Fc. В одном варианте реализации изобретения присоединение партнера по связыванию FcRn, например Fc
фрагмента IgG, к биологически активной молекуле обеспечивает средства доставки биологически активной молекулы перорально, буккально, подъязычно, ректально, вагинально, в виде назально применяемого аэрозоля или через легочные дыхательные пути, либо через окулярные пути. В другом варианте реализации изобретения химерный белок можно вводить инвазионно, например подкожно, внутривенно.
Участок партнера по связыванию FcRn является такой молекулой или ее частью, которая может специфически связываться FcRn-рецептором с последующим активным транспортом посредством FcRn-рецептора Fc-области. Специфическое связываниет обозначает образование двумя молекулами комплекса, который является относительно стабильным в физиологических условиях. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и емкостью от низкой до умеренной в отличие от неспецифического связывания, которое обычно обладает низкой аффинностью с емкостью от умеренной до высокой. Как правило, связывание считается специфическим, когда постоянная аффинности КА выше чем 106 М-1 или выше чем 108 М-1. В случае необходимости неспецифическое связывание може быть снижено без существенного влияния на специфическое связывание при помощи варьирования условий связывания. Соответствующие условия связывания, такие как концентрация молекул, ионная сила раствора, температура, время, отведенное на связывание, концентрация блокирующего вещества (например, сывороточного альбумина, молочного казеина) и т.д., могут быть оптимизированы специалистов в данной области техники при помощи стандартных методов.
В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит один или более процессированных Fc-областей, которые, несмотря на это, способны обеспечивать Fc-области связывающие свойства Fc-рецептора (FcR). Например, часть Fc-области, которая связывается с FcRn (т.е. связывающая часть FcRn), содержит аминокислоты, приблизительно соответствующие 282-438 аминокислотам IgG1 по европейской нумерации (с первичными контактными участками, соответстсующими аминокислотам 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314, принадлежащим домену СН2, и аминокислотным остаткам 385-387, 428 и 433-436, принадлежащим домену СН3). Таким образом, Fc-область, являющаяся объектом данного изобретения, может содержать или состоять из связывающей части FcRn. Связывающие части FcRn могут быть получены из тяжелых цепей любого изотипа, включая IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. В одном варианте реализации изобретения используется связывающая часть FcRn из антитела человеческого изотипа IgG1. В другом варианте реализации изобретения используется связывающая часть FcRn из антитела человеческого изотипа IgG4.
В другом варианте реализации изобретения "Fc-область" содержит аминокислотную последовательность Fc-домена или полученную из Fc-домена. В определенных вариантах реализации изобретения Fc-область содержит по меньшей мере один элемент из: шарнирного (например, верхнего, среднего и/или нижнего шарнирного участка) домена (приблизительно соответствующего аминокислотам 216-230 Fc-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН2 (приблизительно соответствующего аминокислотам 231-340 Fc-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН3 (приблизительно соответствующего аминокислотам 341-438 Fc-области антитела согласно европейской нумерации), домена СН4 либо их варианта, части или фрагмента. В других вариантах реализации изобретения Fc-область содержит полный Fc-домен (т.е. шарнирный домен, домен СН2 и домен СН3). В некоторых вариантах реализации изобретения Fc-область содержит, состоит преимущественно из или состоит из шарнирного домена (или его части), сшитого с доменом СН3 (или его частью), шарнирного домена (или его части), сшитого с доменом СН2 (или его частью), домена СН2 (или его части), сшитого с доменом СН3 (или его частью), домена СН2 (или его части), сшитого с шарнирным доменом (или его частью) и доменом СН3 (или его частью). В других вариантах реализации изобретения в Fc-области отсутствует по меньшей мере часть домена СН2 (например, весь домен СН2 или его часть). В конкретном варианте реализации изобретения Fc-область содержит или состоит из аминокислот, соответствующих номерам от 221 до 447 по европейской нумерации.
Fc-области, обозначаемые в данном тексте как F, F1 или F2, могут быть получены из большого количества различных источников. В одном варианте реализации изобретения Fc-область полипептида получена из человеческого иммуноглобулина. При этом понятно, что Fc-область может быть получена из иммуноглобулина других видов млекопитающих, включая, к примеру, виды грызунов (например, мышь, крысу, кролика, морскую свинку) или приматов за исключением человека (например, шимпанзе, макаку). Более того, полипептид Fc-доменов или его части могут быть получены из иммуноглобулина любого класса, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и иммуноглобулина любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В другом варианте реализации изобретения используется человеческий изотип IgGl.
В определенных вариантах реализации изобретения Fc-вариант приводит к изменению по меньшей мере в одной эффекторной функции, обеспечиваемой Fc-областью, содержащей указанный Fc-домен дикого типа (например, улучшению или снижению способности Fc-области связываться с Fc-рецепторами (например, FcyRI, FcyRII или FcyRIII) или белками комплемента (например, C1q), либо к триггерной антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ), фагоцитозу или комплементзависи-мой клеточной цитотоксичности (КЗКЦ)). В других вариантах реализации изобретения Fc-вариант об-кспечивает наличие сконструированного остатка цистеина.
Fc-области, являющиеся объектами данного изобретения, могут включать принятые в данной об- 44
ласти техники Fc-варианты, которые, как известно, приводят к изменению (например, усилению или снижению) в эффекторной функции и/или связывании FcR или FcRn. В частности, связывающая молекула, являющаяся объектом данного изобретения, может содержать, например, изменение (например, замену) в одной или более аминокислотных позициях, подобное описанным в международных публикациях согласно РСТ WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2,
WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2 и WO06/085967A2; патентных
публикациях US №№ US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766,
US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; или патентах US 5648260; 5739277; 5834250; 5869046; 6096871; 6121022; 6194551; 6242195; 6277375; 6528624; 6538124; 6737056; 6821505; 6998253; 7083784; 7404956 и 7317091, которые все включены в данный текст посредством ссылки. В одном варианте реализации изобретения может быть внесено конкретное изменение (например, конкретная замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники) в одну или более из описанных аминокислотных позиций. В другом варианте реализации изобретения может быть внесено отличное изменение в одну или более из описанных аминокислотных позиций (например, отличная замена одной или более аминокислот, описанная в данной области техники).
Fc-область или партнер по связыванию FcRn, принадлежащие IgG, могут быть модифицированы в соответствии с общепринятыми процедурами, такими как сайтнаправленный мутагенез и тому подобное, для получения модифицированных фрагментов IgG или Fc или их частей, которые будут связываться FcRn. Такие модификации включают модификации удаленные от контактных участков FcRn, a также модификации. Находящиеся в пределах контактных участков FcRn, которые сохраняют или даже усиливают связывание с FcRn. Например, следующие одиночные аминокислотные остатки в Fc человеческого IgGl (Fc yl) можно заменить без значительной потери аффинности связывания Fc к FcRn
Р238А,
S239A, К246А, К248А, D249A, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A,
Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А,
Н285А, N286A, Т289А, К290А, R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A,
S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A,
К317А, Е318А, К320А, К322А, S324A, К326А, A327Q, Р329А, A330Q, Р331А,
ЕЗЗЗА, К334А, Т335А, S337A, К338А, К340А, Q342A, R344A, Е345А, Q347A,
R355A, Е356А, М358А, Т359А, К360А, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A,
A378Q, Е380А, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A, Y391F,
К392А, L398A, S400A, D401A, D413A, К414А, R416A, Q418A, Q419A, N421A,
V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, К439А, S440A, S444A и К447А, где, например, Р238А представляет пролин дикого типа, замещенный аланином в позиции номер 238. В качестве примера конкретный вариант реализации изобретения включает мутацию N297A, при помощи которой удаляется высококонсервативный участок N-гликозилирования. Вдобавок к аланину другие аминокислоты могут замещать аминокислоты дикого типа в позициях, приведенных выше. Мутации могут одиночно вноситься в Fc, что приводит к получению более чем сотни Fc-областей, отличных от нативной Fc. Вдобавок, комбинации двух, трех или более из этих отдельных мутаций могут вноситься совместно, что приводит к получению сотен дополнительных Fc-областей. Более того, одна или более из Fc-областей конструкции, являющейся объектом данного изобретения, может быть мутированной, в то время как другая Fc-область конструкции не является мутированной, либо они обе могут быть мутированными, но содержать различные мутации.
Отдельные из вышеописынных мутаций могут приводить к новым функциональным возможностям Fc-области или партнера по связыванию FcRn. Например, один вариант реализации изобретения включает N297A, при помощи которой удаляется высококонсервативный участок N-гликозилирования. Действие этой мутации состоит в снижении иммуногенности, тем самым повышая время полужизни циркуляции Fc-области, и в приведении Fc-области в состояние, в котором она не способна связываться с FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB и FcyRIIIA без потери аффинности к FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Дополнительным примером новых функциональных возможностей, обусловленных вышеописанными мутациями, является возможное в некоторых случаях повышение аффинности к FcRn по сравнению с таковой для дикого типа. Эта повышенная аффинность может отражаться на повышенной скорости ассоциации, сниженной скорости диссоциации либо как повышенной скорости ассоциации, так и сниженной скорости диссоциа
ции. Примеры мутаций, которые, как считается, приводят к повышенной аффинности к FcRn, включают, но не ограничиваются этим, Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
Вдобавок, обнаружилось, что по меньшей мере три человеческих Fc гамма рецептора распознают связывающий участок IgG в пределах нижнего шарнирного участка, а именно, аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новых функциональных возможностей и потенциально сниженной имму-ногенности может обуславливаться мутациями в этой области, например, замещением аминокислот 233236 человеческого IgGl "ELLG" соответствующей последовательностью из IgG2 "PVA" (с одной аминокислотной делецией). Было показано, что FcyRI, FcyRII и FcyRIII, которые опосредуют различные эффек-торные функции, не будут связываться с IgG1 в случае внесения таких мутаций. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 и Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
В одном варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть, например Fc-область, представляет собой полипептид, содержащий последовательность PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 3) и в некоторых случаях дополнительно содержащий последовательность, выбранную из
HQSLGTQ (SEQ ID NO: 4), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 5), HQNISDGK (SEQ ID NO: 6) или VISSHLGQ
(SEQ ID NO: 7) (патент US № 5739277).
В другом варианте реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть содержит аминокислотную последовательность в шарнирном участке или его части, который образует одну или более дисульфидных связей с другой константной областью иммуноглобулина или ее частью. Дисульфидная связь, образованная константной областью иммуноглобулина или ее частью, приводит к размещению вместе первого полипептида, содержащего Ф-VIII, и второго полипептида, содержащего фрагмент ФВ, таким образом, что эндогенный ФВ не замещает фрагмент ФВ и не связывается с Ф-VIII. Следовательно, дисульфидная связь между первой константной областью иммуноглобулина или ее частью и второй константной областью иммуноглобулина или ее частью предотвращает взаимодействие между эндогенным ФВ и белком Ф-VIII. Подавление взаимодействия между ФВ и белком Ф-VIII дает возможность выйти за пределы 2-кратного увеличения времени полужизни белка Ф-VIII. Шарнирный участок или его часть может быть дополнительно связан с одним или более доменами из CH1, CH2, СН3, их фрагментами или любыми их комбинациями. В конкретном примере константная область иммуноглобулина или ее часть содержит шарнирный участок и участок СН2 (например, аминокислоты 221-340 Fc-области).
В определенных вариантах реализации изобретения константная область иммуноглобулина или ее часть является гемигликозилированной. Например, химерный белок, содержащий две Fc-области или двух партнеров по связыванию FcRn, может содержать первую гликозилированную Fc-область (например, гликозилированный участок СН2) или партнера по связыванию FcRn и вторую агликозилированную Fc-область (например, агликозилированный участок СН2) или партнера по связыванию FcRn. В одном варианте реализации изобретения между гликозилированной и агликозилированной областями может быть помещен линкер. В другом варианте реализации изобретения Fc-область или партнер по связыванию FcRn является полностью гликозилированным, т.е. все Fc-области гликозилированы. В других вариантах реализации изобретения Fc-область может быть агликозилированной, т.е. ни один из компонентов Fc не является гликозилированным.
В определенных вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит аминокислотную замену в константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-варианты), которая изменяет антиген-независимые эффекторные функции константной области Ig, в частности время полужизни циркуляции белка.
Такие белки демонстрируют как повышенное, так и сниженное связывание с FcRn по сравнению с белками, у которых отсутствуют подобные замены, и, следовательно, характеризуются соответственно увеличенным или сниженным временем полужизни в сыворотке крови. Предполагается, что Fc-варианты с улучшенной аффинностью к FcRn характеризуются более продолжительным временем полужизни в сыворотке крови, и такие молекулы имеют полезные применения в способах лечения млекопитающих, в которых требуется продолжительное время полужизни применяемого полипептида, например, для лечения хронического заболевания или нарушения (смотрите, например, патенты US 7348004, 7404956 и 7862820). В противоположность этому считается, что Fc-варианты со сниженной аффинностью связывания FcRn характеризуются более короткими временами полужизни, и такие молекулы также применимы, например, для введения млекопитающим в случае, когда более короткое время циркуляции может быть более преимущественным, например, для in vivo диагностической визуализации или в ситуациях, когда исходный полипептид имеет токсические побочные эффекты при нахождении в циркуляции на протяжении продолжительных периодов. Также Fc-варианты со сниженной аффинностью связывания FcRn имеют меньшую вероятность прохождения через плаценту и, следовательно, применимы также для лечения заболеваний или нарушений у беременных женщин. Вдобавок, другие применения, в которых может требоваться сниженная аффинность связывания FcRn, включают такие применения, в которых требуется локализация мозга, почки и/или печени. В одном иллюстративном варианте реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, демонстрирует сниженный транспорт из сосудистой системы через эпителий почечных клубочков. В другом варианте реализации химерный белок, являющийся
объектом данного изобретения, демонстрирует сниженный транспорт через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) из мозга в сосудистое пространство. В одном варианте реализации изобретения белок с измененным связыванием FcRn содержит по меньшей мере одну Fc-область или одного партнера по связыванию FcRn (например, одну или две Fc-области или партнеров по связыванию FcRn), содержащую одну или более аминокислотных замен в пределах "FcRn-связывающей петли" константной области Ig. FcRn-связывающая петля состоит из аминокислотных остатков 280-299 (согласно европейской нумерации) полноразмерной Fc-области дикого типа. В других вариантах реализации изобретения константная область Ig в химерном белке или ее часть, являющаяся объектом данного изобретения и имеющая измененную аффинность связывания FcRn, содержит по меньшей мере одну Fc-область или одного партнера по связыванию FcRn, содержащую одну или более аминокислотных замен в пределах -й "контактной зоны" FcRn. Употребляемый в данном тексте термин 15А-ая "контактная зона" FcRn включает в себя остатки в следующих позициях полноразмерного Fc-компонента дикого типа: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (европейская нумерация). В других вариантах реализации изобретения константная область Ig или ее часть, являющаяся объектом данного изобретения и имеющая измененную аффинность связывания FcRn, содержит по меньшей мере одну Fc-область или одного партнера по связыванию FcRn, содержащую одну или более аминокислотных замен в аминокислотной позиции, соответствующей любой из следующих позиций согласно европейской нумерации: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (например, N434A или N434K) и 438. Примеры аминокислотных замен, которые изменяют активность связывания FcRn, раскрыты в международной публикации согласно РСТ № WO05/047327, которая включена в данный текст посредством ссылки.
Fc-область или партнер по связыванию FcRn, применяемые в данном изобретении, могут также содержать общепринятую в данной области техники аминокислотную замену. Которая изменяет гликози-лирование химерного белка. Например, Fc-область или партнер по связыванию FcRn химерного белка, связанные с фрагментом ФВ или белком Ф-VIII, могут содержать Fc-область, содержащую мутацию, которая приводит к сниженному гликозилированию (например, N- или О-связанному гликозилирова-нию), либо могут содержать измененную гликоформу Fc-компонента дикого типа (например, гликан с низким содержанием или отсутствием фукозы).
В одном варианте реализации непроцессированный химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, может содержать генетически сшитую Fc-область (т.е. оц-Fc-область), содержащую одну или более непрерывных константных областей или их частей, независимо выбранных из описанных в данном тексте константных областей или их частей. В одном варианте реализации изобретения Fc-области димерной Fc-области являются одинаковыми. В другом варианте реализации изобретения по меньшей мере две Fc-области являются разными. Например, Fc-области или партнеры по связыванию FcRn, принадлежащие белкам, являющимся объектами данного изобретения, содержат одинаковое количество аминокислотных остатков либо они могут отличаться по длине на один или более аминокислотных остатков (например, на около 5 аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков), около 10 остатков, около 15 остатков, около 20 остатков, около 30 остатков, около 40 остатков или около 50 остатков). В других вариантах реализации Fc-области или партнеры по связыванию FcRn, принадлежащие белку, являющемуся объектом данного изобретения, могут отличаться в последовательности по одной или более аминокислотным позициям. Например, по меньшей мере две Fc-области или два партнера по связыванию FcRn могут отличаться по около 5 аминокислотным позициям (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотным позициям), около 10 позициям, около 15 позициям, около 20 позициям, около 30 позициям, около 40 позициям или около 50 позициям).
2) Альбумин или его фрагмент, или вариант.
В определенных вариантах реализации изобретения, гетерологичный компонент, связанный с фрагментом ФВ или связанный с белком Ф-VIII, является альбумином или его функциональным фрагментом. В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-VIII и альбумин или его фрагмент, при этом альбумин или его фрагмент экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА или СА) - белок, имеющий полноразмерную форму из 609 аминокислот - отвечает за значительную часть осмотического давления сыворотки, а также действует как носитель эндогенных и экзогенных лигандов. Употребляемый в данном тексте термин "альбумин" включает в себя полноразмерный альбумин или его функциональный фрагмент, вариант, производное или аналог.
В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и альбумин, его фрагмент или вариант, при этом фрагмент ФВ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ связан с альбумином или его фрагментом или вариантом, белок, имеющий активность VIII, связан с альбумином или его фрагментом или вариантом, либо и фрагмент ФВ и белок, имеющий активность VIII, связаны с альбуми
ном или его фрагментом или вариантом. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, и дополнительно связанный с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, которые связаны друг с другом, при этом белок Ф-VIII связан с альбумином или его фрагментом или вариантом и дополнительно связан с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, и белок Ф-VIII, связанный с альбумином или его фрагментом или вариантом, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК и ПЭГ, а белок Ф-VIII дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК
и ПЭГ.
В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-VIII, является альбумин или его фрагмент или вариант, который продлевает (или способен продлевать) время полужизни фрагмента ФВ или белка Ф-VIII. Дополнительные примеры альбумина или его фрагментов или вариантов раскрыты в патентных публикациях US № 2008/0194481 А1, 2008/0004206 А1, 2008/0161243 А1, 2008/0261877 А1, или 2008/0153751 А1 или заявки на публикацию на патентную публикацию US № 2008/033413 А2, 2009/058322 А1 или 2007/021494 А2.
3) Альбумин-связывающее вещество.
В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-VIII, является альбумин-связывающее вещество, которое содержит аль-бумин-связывающий пептид, бактериальный альбумин-связывающий домен, фрагмент альбумин-связывающего антитела или любые комбинации этих компонентов. Например, альбумин-связывающий белок может являться бактериальным альбумин-связывающим белком, антителом или фрагментом антитела, включая доменные антитела (смотрите патент US № 6,696,245). Альбумин связывающий белок, к примеру, может являться бактериальным альбумин-связывающим доменом, таким как домен стрептококкового протеина G (Konig, Т. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Другие примеры альбумин-связывающих пептидов, которые могут применяться в качестве конъюгационных партнеров, включают, например, те, кторые содержат консенсусные последовательности Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Хаа4-Cys, где Xaa1 является Asp, Asn, Ser, Thr или Trp; Xaa2 является Asn, Gln, H является, Ile, Leu или Lys; Xaa3 является Ala, Asp, Phe, Trp или Tyr; и Xaa4 является Asp, Gly, Leu, Phe, Ser и Thr, как описано в патентной заявке US 2003/0069395 или в Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem.277, 35035-35043).
4) Последовательность PAS.
В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-VIII, является последовательность PAS. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и последовательность PAS, при этом фрагмент ФВ связан с последовательностью PAS. В другом варианте реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-VIII и последовательность PAS, при этом последовательность PAS экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
При употреблении в данном тексте выражение последовательность PAS обозначает аминокислотную последовательность, содержащую, главным образом, остатки аланина и серина, или содержащую, главным образом, остатки аланина, серина и пролина, аминокислотную последовательность, образующую произвольную спиральную конформацию в физиологических условиях. Соотвественно, последовательность PAS является строительным блоком, аминокислотным полимером либо кассетой последовательности, содержащей, состоящей преимущественно из или состоящей из аланина, серина и пролина, и которая может быть использована как часть гетерологичного компонента в химерном белке. При этом специалисту в данной области техники известно, что аминокислотный полимер также может образовывать произвольную спиральную конформацию в случае, когда отличные от аланина, серина и пролина остатки добавляют в последовательность PAS в качестве минорных компонентов. Употребляемый в данном тексте термин "минорный компонент" означает, что аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, можно добавлять в последовательность PAS до определенной степени, например до около 12%, т.е. около 12 из 100 аминокислот последовательности PAS, до около 10%, т.е. около 10 из 100 аминокислот последовательности PAS, до около 9%, т.е. около 9 из 100 аминокислот, до около 8%, т.е. около 8 из 100 аминокислот, около 6%, т.е. около 6 из 100 аминокислот, около 5%, т.е. около 5 из 100 аминокислот, около 4%, т.е. около 4 из 100 аминокислот, около 3%, т.е. около 3 из 100 аминокислот, около 2%, т.е. около 2 из 100 аминокислот, около 1%, т. е. около 1 из 100 из аминокислот. Аминокислоты, отличные от аланина, серина и пролина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu,
Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr и Val.
В физиологических условиях участок последовательности PAS образует произвольную спиральную конформацию и тем самым может опосредовать повышенную in vivo и/или in vitro устойчивость к фактору ФВ или белку коагулирующей активности. Так как произвольная спиральная конформация сама по себе не образует устойчивой структуры или не функционирует, биологическая активность, опосредованная фрагментом ФВ или белком Ф-VIII, с которым она сшита, сохраняется в значительной степени. В других вариантах реализации изобретения последовательности PAS, которые образуют произвольную спиральную конформацию, являются биологически инертными, в особенности в отношении протеолиза в плазме крови, иммуногенности, изоэлектрической точки/изоэлектрического поведения, связывания с рецепторами клеточных поверхностей или интернализации, но в то же время являются биоразлагаемыми, что обеспечивает чистое преимущество перед синтетическими полимерами, такими как ПЭГ.
Неограничивающие примеры последовательностей PAS, образующих произвольную спиральную конформацию, включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 8), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 9),
APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 10), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 11), SSPSAP-SPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 12), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 13) и ASAAA-PAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 14) или любых их комбинаций. Дополнительные примеры последовательностей PAS известны из, например, патентной публикации US № 2010/0292130 А1 и заявки на публикацию на патентную публикацию US № WO 2008/155134 Al.
5) Последовательность НАР.
В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-VIII, является богатый глицином гомо-аминокислотный полимер (НАР -от англ. "homo-amino-acid polymer"). Последовательность НАР может содержать повторяющуюся последовательность глицина, которая составляет по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 аминокислот в длину. В одном варианте реализации изобретения последовательность НАР способна продлевать время полужизни компонента, сшитого или связанного с последовательностью НАР. Неограничивающие примеры последовательности НАР включают, но не ограничиваются этим, (Gly)n, (Gly4Ser)n или S(Gly4Ser)n, где n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20. IB одном варианте реализации изобретения, n равно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40. В другом варианте реализации изобретения, n равно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200; смотрите, например, Schlapschy M. et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).
6) Трансферрин или его фрагмент.
В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, связанным с фрагментом ФВ или белком Ф-VIII, является трансферрин или его фрагмент. Для получения химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, может быть использован любой трансферрин. Примером может служить человеческий Тф(Тф) дикого типа, который является белком из 679 аминокислот, примерно в 75 КДа (без учета гликозилирования), с двумя основными доменами - N (около 330 аминокислот) и С (около 340 аминокислот), происхождение которого связано с дупликацией гена; см. учетные номера GenBank NM001063, XM002793, М12530, ХМ039845, ХМ 039847 и S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/), которые в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки. Трансферрин содержит два домена - домен N и домен С. Домен N содержит два субдомена - домен N1 и домен N2, а домен С содержит два субдомена - домен С1 и домен С2.
В одном варианте реализации изобретения часть трансферрина химерного белка содержит сплайс-вариант трансферрина. В одном примере сплайс-вариант трансферрина может являться сплайс-вариантом человеческого трансферрина, например это номер Genbank AAA61140. В другом варианте реализации изобретения часть трансферрина химерного белка содержит один или более доменов последовательности трансферрина, например домен N, домен С, домен N1, домен N2, домен С1, домен С2 или любые их комбинации.
7) Полимер, например полиэтиленгликоль (ПЭГ).
В других вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку, характеризующемуся коагулирующей активностью, например Ф-VIII-активностью, является растворимый полимер, известный в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль, кополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцел-люлозу, декстран или поливиниловый спирт. Гетерологичный компонент, такой как растворимый полимер, может быть присоединен в любой позиции в пределах фрагмента ФВ или белка Ф-VIII, либо к N-или С-концу. В других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-VIII и ПЭГ, при этом ПЭГ экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
В определенных вариантах реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и ПЭГ, при этом фрагмент ФВ связан с ПЭГ. В другом варианте реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, которые связаны друг с другом, при этом
фрагмент ФВ связан с ПЭГ, белок Ф-VIII связан с ПЭГ либо и фрагмент ФВ и белок Ф-VIII связаны с ПЭГ. IB других вариантах реализации изобретения химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, связанный с ПЭГ, дополнительно связан с гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, которые связаны друг с другом, при этом белок Ф-VIII дополнительно связан гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта. В других вариантах реализации изобретения химерный белок содержит фрагмент ФВ, связанный с ПЭГ, и белок Ф-VIII, связанный с ПЭГ, которые связаны друг с другом, при этом фрагмент ФВ дополнительно связан с первым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта, а белок Ф-VIII дополнительно связан со вторым гетерологичным компонентом, выбранным из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина или ее части (например, Fc-области), последовательности PAS, ГЭК, альбумина, его фрагмента или варианта.
Также в изобретении предложены химически модифицированные производные химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, которые могут обеспечивать дополнительные преимущества, такие как повышенные растворимость, стабильность и время циркуляции полипептида либо сниженная иммуногенность (смотрите патент US № 4179337). Химические компоненты для модификации могут быть выбраны из группы, состоящей из водорастворимых полимеров, включая, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль, кополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу, дек-стран или поливиниловый спирт. Химерный белок может быть модифицирован в произвольных позициях в пределах молекулы или в N- или С-концах либо в заданных позициях в пределах молекулы, и может содержать один, два, три или более присоединенных химических компонентов.
Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветв-ленным. Для полиэтиленгликоля, в одном варианте реализации изобретения, молекулярная масса составляет величину между около 1 и около 100 кДа для удобства в эксплуатации и производстве. Могут использоваться и другие размеры в зависимости от необходимого профиля (например, необходимой продолжительности пролонгированного высвобождения, воздействий в случае какой-либо биологической активности, удобства в эксплуатации, степени или отсутствия антигенности и других известных воздействий полиэтиленгликоля на белок или его аналог). Например, полиэтиленгликоль может имень среднюю молекулярную массу, составляющую около 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500,
5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500,
13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500,
20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000,
90,000, 95,000 или 100,000 кДа.
В некоторых вариантах реализации изобретения полиэтиленгликоль может иметь разветвленную структуру. Разветвленные полиэтиленгликоли описаны, например, в патенте US № 5643575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjevet al., NucleosidesNucleotides 18:2745-2750 (1999) и Calicetiet al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), которые все в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки.
Также может варьироваться количество (т. е. степень замещения) полиэтиленгликольных компонентов, присоединенных к каждому химерному белку, фрагменту ФВ или белку Ф-VIII, которые являются объектами данного изобретения. Например, пэгилированные белки, которые являются объектами данного изобретения, могут быть связаны в среднем с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 или более молекулами полиэтиленгликоля. Аналогично, средняя степень замещения находится в пределах диапазонов,
таких как 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19
или 18-20 полиэтиленгликольных компонентов на молекулу белка. Способы определения степени замещения обсуждаются, например, в Delgado et al., Crit. Rev. Them. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992).
В некоторых вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII может быть ПЭГилированным. ПЭ-Гилированный фактор VIII может обозначать конъюгат, образованный между фактором VIII и по меньшей мере одной молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ).
В других вариантах реализации применяемый в изобретении белок Ф-VIII конъюгирован с одним или более полимерами. Полимер может быть водораствомимым и ковалентно либо нековалентно присоединенным к фактору VIII или другим компонентам, конъюгированным с фактором VIII. Неограничивающими примерами могут быть поли(оксид алкилена), поли(винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиоксазолин или поли(акрилоилморфолин). Дополнительные типы полимер-конъюгированного Ф-VIII раскрыты в патенте US № 7199223.
8) Гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК).
В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку Ф-VIII, является полимер, например гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) или его производное. В одном варианте реализации изобретения химерный белок содержит описанный в данном тексте фрагмент ФВ и ГЭК, при этом фрагмент ФВ связан с ГЭК. IB других вариантах реализации химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, содержит белок Ф-VIII, сшитый с гидроксиэтиловым крахмалом (ГЭК), при этом гидроксиэтиловый крахмал или его производное экранирует или защищает ФВ-связывающий участок белка Ф-VIII от эндогенного ФВ, тем самым подавляя или предотвращая взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
Гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК) является производным амилопектина природного происхождения и в организме расщепляется альфа-амилазой. ГЭК является замещенным производным углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации до 95% по массе. ГЭК проявляет полезные биологические свойства и применяется клиниками в качестве вещества для замещения объема крови в гемодилюционной терапии (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987) и Weidler et al., Arzneim.-Forschung/DrugRes., 41, 494-498 (1991)).
Амилопектин содержит компоненты глюкозы, при этом в основной цепи находятся альфа-1,4-гликозидные связи, а в разветвляющихся участках находятся альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы определяются, главным образом, типом гликозидных связей. Благодаря разорванной альфа-1,4-гликозидной связи получают спиральные структуры, содержащие около шести мономеров глюкозы на виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы при помощи замещения. При помощи щелочного гидроксиэтилирования можно осуществлять введение гидроксиэтиловой группы. Подбирая условия реакции можно получить различную реактивность соответствующей гидрокси-группы в незамещенном мономере глюкозы по отношению к гидроксиэтилированию. Благодаря этому факту, специалист в данной области техники может в ограниченной степени влиять на схему замещения.
ГЭК главным образом характеризуется распределением молекулярной массы и степенью замещения. Степень замещение, обозначаемая как СЗ, обозначает молярное замещение, известное специалистам в данной области; смотрите Sommermeyer et al.,Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), как указано выше, в частности, с. 273.
В одном варианте реализации изобретения гидроксиэтиловый крахмал имеет среднюю молекулярную массу (среднюю массу), составляющую от 1 до 300 кД, от 2 до 200 кД, от 3 до 100 кД или от 4 до 70 кД. Гидроксиэтиловый крахмал может дополнительно иметь степень молярного замещения, составляющую от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, предпочтительно от 0,1 до 0,8, и соотношение между С2: С6 заменой в диапазоне от 2 до 20 по отношению к гидроксиэтило-вым группам. Неограничивающим примером ГЭК, имеющего среднюю молярную массу около 130 кД, является ГЭК со степенью замещения, составляющей от 0,2 до 0,8, например 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8, предпочтительно от 0,4 до 0,7, например 0,4, 0,5, 0,6 или 0,7. В конкретном варианте реализации изобретения ГЭК со средней молярной массой около 130 кД является ВОЛЮВЕН(r) от Fresenius. ВОЛЮ-ВЕН(r) является искусственным коллоидом, применяемым, например, для замещения объема, которое используется в показаниях к применению для лечения или профилактики гиповолемии. Характеристиками ВОЛЮВЕН являются средняя молярная масса в 130,000+/-20,000 Д, молярное замещение 0,4 и соотношение С2:С6 около 9:1. В других вариантах реализации изобретения диапазоны средней молекулярной массы гидроксиэтилового крахмала составляют, например, от 4 до 70 кД, или от 10 до 70 кД, или от 12 до 70 кД, или от 18 до 70 кД, или от 50 до 70 кД, или от 4 до 50 кД, или от 10 до 50 кД, или от 12 до 50 кД, или от 18 до 50 кД, или от 4 до 18 кД, или от 10 до 18 кД, или от 12 до 18 кД, или от 4 до 12 кД, или от 10 до 12 кД, или от 4 до 10 кД. В других вариантах реализации изобретения средняя молекулярная масса применяемого гидроксиэтилового крахмала находится в диапазоне от более чем 4 кД и до 70 кД, например около 10 кД, или в диапазоне от 9 до 10 кД, или от 10 до 11 кД, или от 9 до 11 кД, или около 12 кД, или в диапазоне от 11 до 12 кД, или от 12 до 13 кД, или от 11 до 13 кД, или около 18 кД, или в диапазоне от 17 до 18 кД, или от 18 до 19 кД, или от 17 до 19 кД, или окло 30 кД, или в диапазоне от 29 до 30 кД, или от 30 до 31 кД, или около 50 кД, или в диапазоне от 49 до 50 кД, или от 50 до 51 кД, или от 49 до
51 кД.
В определенных вариантах реализации изобретения гетерологичным компонентом могут быть смеси гидроксиэтиловых крахмалов, имеющих различные средние молекулярные массы и/или различные степени замещения, и/или различные соотношения С2: С6 замещения. Следовательно, могут применяться смеси гидроксиэтиловых крахмалов, имеющие различные средние молекулярные массы и различные степени замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и различные степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени
замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и различные степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и различные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые либо приблизительно одинаковые средние молекулярные массы и одинаковые либо приблизительно одинаковые степени замещения, и одинаковые либо приблизительно одинаковые соотношения С2: С6 замещения. 9) Полисиаловые кислоты (ПСК).
В определенных вариантах реализации изобретения неполипептидным гетерологичным компонентом, присоединенным к фрагменту ФВ или белку Ф-VIII, является полимер, например полисиаловые кислоты (ПСК) или их производные. Полисиаловые кислоты (ПСК) имеют природное происхождение и являются неразветвленными полимерами сиаловой кислоты, которые синтезируются определенными бактериальными штаммами или в определенных клетках млекопитающих Roth J., et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F.A. (Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), p. 335-348. Их можно синтезировать с различной степенью полимеризации от П=ОКОЛО 80 или более остатков сиаловой кислоты до n=2 при помощи ограниченного кислотного гидролиза или при помощи расщепления нейраминидазами, или при помощи фракционирования природных, полученных из бактерий форм полимера. Состав различных полисиаловых кислот также варьируется таким образом, что существуют гомополимерные формы, т. е. альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота, содержащая капсульный полисахарид штамма К1 E. coli и менингококки группы В, которую также можно обнаружить в эмбриональной форме адгезивных молекул нервных клеток (N-CAM - от англ. "neuronal cell adhesion molecule"). Также существуют гетерополимерные формы, такие как чередующаяся альфа-2,8 и альфа-2,9 полисиало-вая кислота штамма К92 Е. coli и полисахариды группы С N. meningitidis. Сиаловую кислоту также можно обнаружить в чередующихся кополимерах с мономерами, отличающимися от сиаловой кислоты, таких как группа W135 или группа Y N. meningitidis. Полисиаловые кислоты обладают важными биологическими функциями, включая уклонение патогенных бактерий от иммунной системы и системы комплемента и регуляцию глиальной адгезионной способности незрелых нейронов во время фетального развития (при этом полимер имеет анти-адгезионную функцию) Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 1142711431, хотя рецепторы полисиаловых кислот у млекопитающих не известны. Альфа-2,8-связанная поли-сиаловая кислота штамма К1 E. coli также известна как "коломиновая кислота" и используется (с разными длинами) в качестве примера реализации настоящего изобретения. Были описаны различные способы присоединения или конъюгации полисиаловых кислот к полипептиду (например, смотрите патент US № 5846951; WO-A-0187922 и US 2007/0191597 А1, которые все в полном объеме включены в данный текст посредством ссылки.
С) Белок Ф-VIII.
Употребляемое в данном тексте выражение "белок Ф-VIII" обозначает функциональный полипептид Ф-VIII в своей обычной роли в коагуляции, если не указано иное. Термин белок Ф-VIII включает в себя функциональный фрагмент, вариант, аналог или производное, которые сохраняют функцию полноразмерного фактора VIII дикого типа в процессе коагуляции. Выражение "белок Ф-VIII" взаимозаменяемо употребляется с выражение полипептид (или белок) Ф-VIII или просто Ф-VIII. Примеры функций Ф-VIII включают, но не ограничиваются этим, способность активировать коагуляцию, способность действовать как кофактор фактора IX или способность образовывать теназный комплекс с фактором IX в присутствии Са2+ и фосфолипидов, которые затем преобразует фактор X в активированную форму Ха. Белок Ф-VIII может являться человеческим, свиным, собачьим, крысиным или мышиным белком Ф-VIII. Вдобавок, при сравнении Ф-VIII, полученного от людей и других видов, были обнаружены консервативные остатки, которые, вероятно, являются необходимыми для функционирования (Cameron et al., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6251632).
Существует большое количество тестов для оценки функции системы свертывания крови: тест на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), хромогенный анализ, метод ротационной тромбоэластометрии (РОТЭМ), тест на протромбиновый индекс (ПИ) (также применяемый для определения MHO), фибриноген-тест (часто проводимый методом Клауса), количество тромбоцитов, тестирование тромбоцитарной функции (часто проводимый при помощи PFA-100), тромбиновое время, время кровотечения, тест смешивания (показывающий, исправляется ли нарушение при смешивании плазмы крови пациента с нормальной плазмой), анализ фактора свертывания крови, антифосфолипидные антитела, D-димер, генетические тесты (например, фактор V Ляйдена, мутация протромбина G20210A), время разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT-тест), различные тесты тромбоцитарной функции, тром-боэластография (ТЭГ или Соноклот), тромбоэластометрия (ТЭМ(r), например РОТЭМ(r)) или время лизиса эуглобулина (ВЛЭ).
АЧТВ-тест является показателем эффективности и определяет эффективность как "внутреннего" (также называемого механизмом активации свертывания крови), так и общего механизма коагуляции.
Этот тест обычно применяется для определения коагулирующей активности коммерчески доступных рекомбинантных факторов свертывания крови, например Ф-VIII или Ф-IX. Он применяется совместно с тестом на протромбиновый индекс (ПИ), который определяет внешний механизм.
РОТЭМ-анализ дает информацию о полной кинетике гемостаза: времени свертывания крови, образовании тромбов, стабильности тромбов и лизисе. Разные параметры в тромбоэластометрии зависят от активности плазматической коагулирующей системы, тромбоцитарной функции, фибринолиза или многих факторов, которые влияют на эти взаимодействия. Данный метод может дать полную информацию о вторичном гемостазе.
Известны полипептидные и полинуклеотидные последовательности Ф-VIII, как и последовательности большого количества функциональных фрагментов, мутантов и модифицированных версий. Примеры последовательностей (полноразмерных) человеческого Ф-VIII приведены как подпоследовательности в SEQ ID NO: 16 или 18.
Таблица 2
Полноразмерный Ф-VIII (сигнальный пептид Ф-VIII выделен подчеркиванием; тяжелая цепь Ф-VIII выделена двойным подчеркиванием; В-домен выделен курсивом и легкая цепь Ф-VIII показана обычным текстом)С Сигнальный пептид: (SEQIDNO: 15)
MQIELSTCFFLCLLRFCFS
Зрелый факторVIII (SEQIDNO: 16)*
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK NSLMQDRDAASARAWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEM DWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKH LKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMS
DKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYI LSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSS CDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQiVSPffPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRТРМРК IQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPE SGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFG KKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVS ISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMS NKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEK SVEGQNFLSEKNKVWGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQE NWLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLE GLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTP STLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAAS YRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGK VELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKNNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLL DPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTE PLCSQJVPPVLXRffQPEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVE RLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTF RNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKD VHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYR FHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEM LPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSI NAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNV DSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFA TWSPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWT LFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVWSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
Таблица 3
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный Ф-VIII (SEQ ID NO: 17)*
661 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTG
721 CTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGC
781 AGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAG
841 ATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGAC
901 TCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGAT
9 61 GGGTCTGCTAGGTCCTAC CAT С CAG G С T GAG GT T TAT GATACAGT G GT CAT TACAC T TAA
1021 GAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTC
10 81 T GAG G GAG С T GAATAT GAT GAT СAGAC СAGT СAAAG G GAGAAAGAAGAT GATAAAGT С T T
1141 CCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTC
12 01 TGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAA
12 61 T T CAG G С С T CAT T G GAG С С С TAC TAGTAT GTAGAGAAG G GAG T С T GG С СAAG GAAAAGAC
1321 ACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCA
13 81 CTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCC
14 41 TAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCA
15 01 CAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAAT
15 61 ATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTC
1621 GCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTT
1681 T T GT СATAT С T С T T С С СAC СAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TAT GT CAAAGTAGACAG С T G
17 41 T С СAGAG GAAC С С СAAC TAC GAAT GAAAAATAAT GAAGAAG С GGAAGAC TAT GAT GAT GA
18 01 TCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTAT
18 61 CCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGA
1921 AGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAG
19 81 T СAATAT T T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAGT С С GAT T TAT
2 041 G G СATACACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG С TAT T СAGCAT GAAT CAG GAAT С T T
2101 G G GAC CTTTACTT TAT G G G GAAGT T G GAGACACAC T GT T GAT TATAT T TAAGAAT СAAG С
2161 AAG СAGAC СATATAACAT С TAC С С T СAC G GAAT СAC T GAT GTCCGTCCTTT GTAT T СAAG
2221 GAGAT TAC СAAAAG GT GTAAAACAT T T GAAG GAT T T T С СAAT T С T GC CAG GAGAAATAT T
22 81 СAAATATAAAT G GACAGT GAC T GTAGAAGAT G G G С СAAC TAAAT СAGAT CCTCGGTGCCT
2341 GACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGG
2 4 01 CCCTCTCCT CAT С T G С TACAAAGAAT С T GTAGAT СAAAGAG GAAAC СAGATAAT GT СAGA
2 4 61 CAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGA
2 521 GAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCA
2 5 81 AG С С T С СAACAT CAT G СACAG CAT СAAT G G С TAT GT T T T T GATAG T T T G СAGT T GT СAGT
2 641 TTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCT
27 01 TTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCAC
2 7 61 CCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGAT
2 821 TCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTC
2 8 81 TAGT T GT GACAAGAACAC T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T CAG СATA
2 941 CTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCCCAGAATTCAAGACACCC
3 0 01 TAG С AC T AG G С AAAAG С AAT T T AAT G С С AC С AC AAT T С С AGAAAAT GAC AT AGAGAAGAC
3 0 61 TGACCCTTGGTTTGCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAAATGTCTCCTCTAGTGA
3121 TTTGTTGATGCTCTTGCGACAGAGTCCTACTCCACATGGGCTATCCTTATCTGATCTCCA
3181 AGAAG С С AAAT AT GAGAC T T T T T С T GAT GAT С CAT С AC С T G GAG С AAT AGAC AGT AAT AA
32 41 CAG С С T GT С T GAAAT GACACAC T T CAG G С СACAG С T С CAT СACAG T G G G GACAT G GTAT T
33 01 TAC С С С T GAGT CAG G С С T С СAAT TAAGAT TAAAT GAGAAAC T GG G GACAAC T G CAG СAAC
3361 AGAGTT GAAGAAAC T T GAT T T CAAAGTTT СTAGTACAT СAAATAATСT GATTT СAACAAT
3421 TCCATCAGACAATTTGGCAGCAGGTACTGATAATACAAGTTCCTTAGGACCCCCAAGTAT
34 81 G С С AGT T CAT TAT GAT AGT С AAT T AGAT AC С AC T С TAT T T G G CAAAAAGT CAT С T С С С С T
3541 TACTGAGTCTGGTGGACCTCTGAGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTTAGA
3 601 ATCAGGTTTAATGAATAGCCAAGAAAGTTCATGGGGAAAAAATGTATCGTCAACAGAGAG
3 661 TGGTAGGTTATTTAAAGGGAAAAGAGCTCATGGACCTGCTTTGTTGACTAAAGATAATGC
3721 С T TAT T CAAAGT TAG CAT CTCTTTGT TAAAGACAAACAAAAC T T С CAATAAT T CAG СAAC
37 81 TAATAGAAAGAC T СACAT T GAT G G С С CAT CAT TAT TAAT T GAGAAT AGT С CAT СAGT С T G
3841 G СAAAATATAT TAGAAAGT GACAC T GAGT T TAAAAAAGT GACAC С T T T GAT T CAT GACAG
3 9 01 AAT G С T TAT G GACAAAAAT G С TACAG С T T T GAG G С TAAAT СATAT GT СAAATAAAAC TAC
3 9 61 T T CAT СAAAAAACAT G GAAAT G GT С СAACAGAAAAAAGAG G G С С С CAT T С САС СAGAT G С
4 021 ACAAAAT С СAGATAT GTCGTTCTT TAAGAT G С TAT T С T T G С СAGAAT CAG СAAG GT G GAT
4 0 81 ACAAAGGACTCATGGAAAGAACTCTCTGAACTCTGGGCAAGGCCCCAGTCCAAAGCAATT
4141 AGTAT С С T TAG GAC СAGAAAAAT С T GT G GAAG GT СAGAAT TTCTTGTCT GAGAAAAACAA
42 01 AGTGGTAGTAGGAAAGGGTGAATTTACAAAGGACGTAGGACTCAAAGAGATGGTTTTTCC
42 61 AAG CAG С AGAAAC С TAT T T С T T AC T AAC T T G GAT AAT T T AC AT GAAAAT AAT AC AC AC AA
4 321 T СAAGAAAAAAAAAT T CAG GAAGAAATAGAAAAGAAG GAAACAT TAAT С СAAGAGAAT GT
4381 AGTTTTGCCT СAGATACATACAGT GAC T G G СAC TAAGAAT T T CAT GAAGAAC CTTTTCTT
4 4 41 ACT GAG СAC TAG G СAAAAT GTAGAAG GT T СATAT GAC G G G G СATAT G С T С СAGTAC T T СA
4 5 01 AGAT T T TAG GT CAT TAAAT GAT T СAACAAATAGAACAAAGAAACACACAG С T CAT T T С T С
4 5 61 AAAAAAAGGGGAGGAAGAAAACT T GGAAGGСT T GGGAAAT СAAAC CAAGСAAAT T GTAGA
4 621 GAAATAT G CAT G СAC СACAAG GATAT С T С С TAATACAAG С СAGCAGAAT T T T GT СAC G СA
4 681 AC GTAGTAAGAGAG С T T T GAAACAAT T СAGAC T С С СAC TAGAAGAAACAGAAC T T GAAAA
4741 AAG GATAAT T GT G GAT GACAC С T СAAC CCAGTGGTC СAAAAACAT GAAACAT T T GAC С С С
4 8 01 GAG СAC С С T СACACAGATAGAC ТACAAT GAGAAG GAGAAAG G GG С CAT TACT СAGT С T С С
4 8 61 С T TAT СAGAT TGCCTTAC GAG GAGT СATAG CAT С С С T CAAG СAAATAGAT С T С CAT TAC С
4 921 CAT T G СAAAG GTAT CAT CAT T T С CAT С TAT TAGAC С TATATAT С T GAC CAG G GT С С TAT T
4 9 81 CCAAGACAACTCTTCTCATCTTCCAGCAGCATCTTATAGAAAGAAAGATTCTGGGGTCCA
5 041 AGAAAG СAGT CAT T T С T TACAAG GAG С СAAAAAAAATAAC CTTTCTTTAGC CAT T С TAAC
5101 CTTGGAGATGACTGGTGATCAAAGAGAGGTTGGCTCCCTGGGGACAAGTGCCACAAATTC
5161 AGT CACAT ACAAGAAAGT T GAGAACACT GT T CT С С С GAAAC С AGACT T GC С CAAAACAT С
5221 TGGCAAAGTTGAATTGCTTCCAAAAGTTCACATTTATCAGAAGGACCTATTCCCTACGGA
52 81 AACTAGCAATGGGTCTCCTGGCCATCTGGATCTCGTGGAAGGGAGCCTTCTTCAGGGAAC
5341 AGAG G GAG С GAT TAAGT G GAAT GAAG СAAACAGAC С T G GAAAAGT TCCCTTTCT GAGAGT
54 01 AGCAACAGAAAGCTCTGCAAAGACTCCCTCCAAGCTATTGGATCCTCTTGCTTGGGATAA
54 61 С С AC TAT G GT AC T С AGAT AC С AAAAGAAGAGT G GAAAT С С С AAGAGAAGT С AC С AGAAAA
5521 AACAGCTTTTAAGAAAAAGGATACCATTTTGTCCCTGAACGCTTGTGAAAGCAATCATGC
55 81 AATAG CAG СAATAAAT GAG G GACAAAATAAG С С С GAAATAGAAGT CAC С T G G G СAAAG СA
5 641 AGGTAGGACTGAAAGGCTGTGCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGA
57 01 AATAAC TCGTACTACTCTT СAGT СAGAT СAAGAG GAAAT T GACTAT GAT GATAC СATAT С
57 61 AGT T GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GACAT T TAT GAT GAG GAT GAAAAT СAGAG С С С С С G
5 821 CAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTA
5 8 81 TGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCA
5 941 GTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCG
60 01 T G GAGAAC TAAAT GAACAT T T G G GAC TCCTGGGGC СATATATAAGAG СAGAAGT T GAAGA
60 61 TAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCT
6121 TAT T T С T TAT GAG GAAGAT СAGAG G CAAG GAG СAGAAC С TAGAAAAAAC T T T GT CAAG С С
6181 TAAT GAAAC СAAAAC TTACTTTTG GAAAGT G СAACAT СATAT GG СAC С CAC TAAAGAT GA
62 41 GTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTC
63 01 AGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAG
63 61 ACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTG
6421 GTAC T T CAC T GAAAATAT G GAAAGAAAC T G CAG GGCTCCCTG CAATAT С СAGAT G GAAGA
64 81 T С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С G С T T С CAT G CAAT CAAT G G CTACATAAT G GATACAC T
6541 ACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAG 6601 CAAT GAAAACAT С CAT T CTAT T CAT T T CAGT GGACAT GT GT T CAC T GTAC GAAAAAAAGA 6661 GGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTT 6721 ACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGG
67 81 GATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTC
68 41 T G GACACAT TAGAGAT T T T СAGAT TACAG С T T СAG GACAATAT G GACAGT G G G С С С СAAA
69 01 GCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTC 69 61 TTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGC 7 021 CCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGG 7 081 GAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAA 7141 T GT G GAT T CAT С T G G GATAAAACACAATAT T T T TAAC С С T С CAAT TAT T G С T С GATACAT 72 01 CCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTG 72 61 T GAT T TAAATAGT T G CAG CAT G С CAT T G G GAAT G GAGAGTAAAG СAATAT СAGAT G СACA 7321 GATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCG 7381 AC T T CAC С T С CAAG G GAG GAGTAAT G С С T G GAGAC С T СAG GT GAATAAT С СAAAAGAGT G 7 4 41 GCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAA 7501 ATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCA 7 5 61 TCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTC 7 621 CTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCA 7 681 CCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACA 7741 GGACCTCTAC
*Выделенные подчеркиванием нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид.
Полипептиды Ф-VIII включают полноразмерный Ф-VIII, полноразмерный Ф-VIII минус Met на N-конце, зрелый Ф-VIII (минус сигнальная последовательность), зрелый Ф-VIII с добавочным Met на N-конце и/или Ф-VIII с полной или частичной делецией В-домена. В определенных вариантах реализации изобретения варианты Ф-VIII включают делеции В-домена, как частичные, так и полные.
Ген человеческого Ф-VIII был выделен и экспрессирован в клетках млекопитающих (Toole, J.J., et al., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., et al., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W.I., et al., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G.A., et al., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558 и патент US № 4757006). Аминокислотная последовательность Ф-VIII была получена с кДНК, как показано в патенте US № 4965199. Ф-VIII с частично или полностью удаленным В-доменом дополнительно приведен в патентах US № 4994371 и 4868112. В некоторых вариантах реализации изобретения В-домен человеческого Ф-VIII замещен В-доменом человеческого фактора V, как показано в патенте US № 5004803. Последовательность кДНК, кодирующая человеческий фактор VIII, и аминокислотная последовательность приведены в SEQ ID NOs: 17 и 16 соответственно из заявки на патентную публикацию
US № 2005/0100990.
Данные о последовательности свиного Ф-VIII были опубликованы: в Toole, J.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). В Healey, J.F., et al., Blood 88:4209-4214 (1996) дополнительно сообщалось о полной свиной последовательности кДНК, полученной при помощи ПЦР амплификации последовательностей Ф-VIII из библиотеки кДНК из свиной селезенки. В патенте US № 5364771 авторства Lollar и Runge и в WO 93/20093 описаны гибридный человеческий/свиной Ф-VIII, содержащий замены всех доменов, всех субъединиц, и и специфические аминокислотные последовательности. Недавно в WO 94/11503 были опубликованы нуклеотидная и соответствующай ей аминокислотная последовательности доменов А1 и А2 свиного Ф-VIII и химерного Ф-VIII, в котором свиные домены А1 и/или А2 замещают соответствующие человеческие домены. В патенте US № 5859204, Lollar, J.S., также описаны последовательность свиной кДНК и полученные аминокислотные последовательности. В патенте US № 6458563 описан Ф-VIII с удаленным В-доменом.
В патенте US № 5859204 авторстава Lollar, J. S. сообщается о функциональных мутантах Ф-VIII, обладающих сниженной антигенностью и сниженной иммунореактивностью. В патенте US № 6376463 авторстава Lollar, J.S. также сообщается о мутантах Ф-VIII, обладающих сниженной иммунореактивно-стью. В заявке на патентную публикацию US № 2005/0100990 авторства Saenko et al. сообщается о функциональных мутациях в домене А2 Ф-VIII.
В одном варианте реализации изобретения Ф-VIII (или часть Ф-VIII в химерном белке) может быть по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичным аминокислотной последовательности Ф-VIII из аминокислот от 1 до 1438 из SEQ ID NO: 18 или аминокислот от 1 до 2332 из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 (без сигнальной последовательности), или аминокислотной последовательности Ф-VIII из аминокислот от 19 до 1438 из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 18 или аминокислот от 19 до 2332 из SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 (с сигнальной последовательностью), при этом Ф-VIII обладает коагулирующей активностью, например активирует как кофактор фактор IX для того, чтобы преобразовать фактор X в активированный фактор X. Ф-VIII (или часть Ф-VIII в химерном белке) может быть идентичным аминокислотной последовательности Ф-VIII из аминокислот от 1 до 1438 из SEQ ID NO: 18 или аминокислот от 1 до 2332 из SEQ ID NO: 16 (без сигнальной последовательности). Ф-VIII может дополнительно содержать сигнальную последовательность.
Употребляемое в данном тексте выражение "В-домен" Ф-VIII означает то же самое, что и известный в данной области техники В-домен, который определяется внутренней идентичностью аминокислотной последовательности и сайтами протеолитического расщепления, например это остатки Ser741-Arg1648 полноразмерного человеческого Ф-VIII. Другие домены человеческого Ф-VIII определяются
следующими аминокислотными остатками: А1, остатки Ala1-Arg372; A2, остатки Ser373-Arg740; A3, остатки Ser1690-Asn2019; C1, остатки Lys2020-Asn2172; С2, остатки Ser2173-Tyr2332. Последовательность А3-С1-С2 включает остатки Ser1690-Tyr2332. Оставшуюся последовательность, включающую остатки Glu1649-Arg1689, обычно называют а3 кислотным участком. Расположение границ для всех доменов, включая В-домены, для свиного, мышиного и собачьего Ф-VIII также известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения В-домен Ф-VIII удален ("фактор VIII с удаленным В-доменом" или "УВД"). Примером Ф-VIII с удаленным В-доменом является РЕФАКТО(r) (рекомби-нантный Ф-VIII с удаленным В-доменом), который имеет ту же последовательность, что и часть последовательности фактора VIII в табл. 4. (тяжелая цепь Ф-VIII с удаленным В-доменом выделена двойным подчеркиванием; В-домен выделен курсивом; и легкая цепь Ф-VIII с удаленным В-доменом показана обычным текстом).
Таблица 4
Ф-VIIIc удаленным В-доменом (SEQ ID NO: 18)
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK NSLMQDRDAASARAWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEM DWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKH LKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMS DKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYI LSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSS CDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQJVPPyLKRffQPEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKE DFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQP LYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFW KVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKS WYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFS GHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASG HIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQF IIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLN SCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGV TTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVWSLDPPLLTRYLRIHPQSWV HQIALRMEVLGCEAQDLY
Таблица 5
Нуклеотидная последовательность, кодирующая Ф-VIIIc удаленным В-доменом (SEQ ID NO: 19)*
661 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTC
721 TGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAAC
781 TGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTC
841 CTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTG
901 TAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGC
9 61 TAGGTCCTAC CAT С CAG G С T GAG G T T TAT GATACAGT G GT CAT TACAC T TAAGAACAT G G
1021 CTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAG
10 81 С T GAATAT GAT GAT СAGAC СAGT СAAAG G GAGAAAGAAGAT GATAAAGT CTTCCCTGGTG
1141 GAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCAC
12 01 TGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCC
12 61 T CAT T G GAG С С С TAC TAGTAT GTAGAGAAG G GAGT С T G G С CAAG GAAAAGACACAGAC С T
1321 TGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAA
13 81 CAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGC
14 41 ACACAGT CAAT G GT TAT GTAAACAG GT С T С T G С CAG G T С T GAT T G GAT G С СACAG GAAAT
15 01 CAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCG
15 61 AAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAA
1621 CTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATA
1681 TCTCTTCC CAC СAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TAT GT СAAAG TAGACAG С T GT С СAGAG G
17 41 AAC С С С AAC T AC GAAT GAAAAAT AAT GAAGAAG С G GAAGAC T AT GAT GAT GAT С T T AC T G
18 01 ATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTC
18 61 GCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGG
1921 ACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATT
19 81 T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAG T С С GAT T TAT G G СATACA
2 041 СAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG С TAT T CAG CAT GAAT CAG GAAT С T T G G GAC С T T
2101 TAC T T TAT G G G GAAGT T G GAGACACAC T GT T GAT TATAT T TAAGAAT CAAG CAAG СAGAC
2161 СATATAACAT С TAC С С T CAC G GAAT CAC T GAT GTCCGTCCTTT GTAT T CAAG GAGAT TAC
2221 СAAAAG GT GTAAAACAT T T GAAG GAT T T T С CAAT T С T G С CAG GAGAAATAT T СAAATATA
22 81 AATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCT
2 341 ATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCC
2 4 01 T CAT С T G С T AC AAAGAAT С T GT AGAT С AAAGAG GAAAC С AGAT AAT GT С AGAC AAGAG GA
2 4 61 AT GT CAT CCTGTTTTCT GTAT T T GAT GAGAAC С GAAG CTGGTACCT CACAGAGAATATAC
2 521 AACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCA
2581 ACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGC
2 641 ATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCT
2 7 01 TCTTCTCTG GATATAC С T T СAAACACAAAAT G GT С TAT GAAGACACAC T CAC С С TAT ТСС
2 7 61 CATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGT
2 821 GCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTG
2 8 81 ACAAGAACAC T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T СAGCATAC T T G С T GA
2 941 GTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCC
3 0 01 AT СAAC G G GAAATAAC TCGTACTACTCTT СAGT СAGAT СAAGAG GAAAT T GAC TAT GAT G
3061 AT AC CAT AT CAGT T GAAAT GAAGAAGGAAGAT T T T GACAT T TAT GAT GAG GAT GAAAAT С
3121 AGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGC
3181 TCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCA
32 41 GTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGC
33 01 С С T TATAC С GT G GAGAAC TAAAT GAACAT T T G G GAC TCCTGGGGC СATATATAAGAG CAG
33 61 AAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCT
3421 AT TCTAGCCT TAT T T С T TAT GAG GAAGAT СAGAG G CAAG GAG CAGAAC С TAGAAAAAAC T
34 81 T T GT CAAG С С TAAT GAAAC СAAAAC TTACTTTTG GAAAGT G СAACAT СATAT G G CAC С СA
3541 CTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAG
3 601 ATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTG
3 661 С T CAT G G GAGACAAGT GACAGTACAG GAAT TTGCTCTGTTTTT СAC СAT С T T T GAT GAGA
3721 CCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCC
37 81 AGAT G GAAGAT С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С G С T T С CAT G CAAT CAAT G G С TACATAA
3 8 41 TGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCA
3901 G CAT G G G CAG CAAT GAAAACAT С CAT T С TAT T CAT T T CAGT G GACAT GT G T T CAC T GTAC
3961 GAAAAAAAGAG GAGTATAAAAT G G CAC T GTACAAT С T С TAT С CAG GTGTTTTT GAGACAG
4 021 TGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATC
4 081 TACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGG
4141 GAAT GGCTTCTG GACACAT TAGAGAT T T T СAGAT TACAG С T T CAG GACAATAT G GACAGT
42 01 GGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGG
42 61 AGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGA
4 321 CCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATA
4381 GTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCT
4441 TCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTG
4 5 01 CTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGT
4 5 61 T GAT G G G С T GT GAT T TAAATAGT T G CAG CAT G С CAT T G G GAAT G GAGAGTAAAG СAATAT
4 621 CAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTT
4 681 CAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATC
4 7 41 СAAAAGAGT G G С T G СAAGT G GAC T T С СAGAAGACAAT GAAAG T СACAG GAGTAAC TAC T С
4 8 01 AGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTC
4 8 61 AAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAA
4 921 ATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACC
4 9 81 TTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCT
5 041 G С GAG G СACAG GAC С T С TAC
*Выделенные подчеркиванием нуклеиновые кислоты кодируют сигнальный пептид. "Ф-VIII с удаленным В-доменом" может содержать полные либо частичные делеции, описанные в патентах US № 6316226, 6346513, 7041635, 5789203, 6060447, 5595886, 6228620, 5972885, 6048720, 5543502, 5610278, 5171844, 5112950, 4868112 и 6458563. В некоторых вариантах реализации последовательность Ф-VIII с удаленным В-доменом, являющаяся объектом настоящего изобретения, содержит любую из делеций, приведенных в патенте US № 6316226 (также в патенте US 6346513) от кол. 4, строка 4
до кол. 5, строка 28, и в примерах 1-5. В другом варианте реализации изобретения фактор VIII с удален-
ным В-доменом является фактором VIII с удаленным В-доменом S743/Q1638 (SQ УВД Ф-VIII) (напри-
мер, фактором VIII, содержащим делецию от аминокислоты 744 до аминокислоты 1637, например фак-
тором VIII, содержащим аминокислоты 1-743 и аминокислоты 1638-2332 из SEQ ID NO: 16, т.е. SEQ ID NO: 18). В некоторых вариантах реализации Ф-VIII с удаленным В-доменом, являющийся объектом настоящего изобретения, содержит делецию, приведенную в кол. 2, строки 26-51 и примерах 5-8 патента US № 5,789,203 (а также в патентах US 6060447, 5595886 и 6228620). В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-VIII с удаленным В-доменом содержит делецию, приведенную в патенте US № 5972885, от кол. 1, строка 25 до кол. 2, строка 40; в патенте US № 6048720, кол. 6, строки 1-22 и пример 1; в патенте US № 5543502, кол. 2, строки 17-46; в патенте US № 5171844, от кол. 4, строка 22 до кол. 5, строка 36; в патенте US № 5112950, кол. 2, строки 55-68, фиг. 2 и пример 1; в патенте US № 4868112, от кол. 2, строка 2 до кол. 19, строка 21 и табл. 2; в патенте US № 7041635, от кол. 2, строка 1 до кол. 3, строка 19, от кол. 3, строка 40 до кол. 4, строка 67, от кол. 7, строка 43 до кол. 8, строка 26, и от кол. 11, строка 5 до кол. 13, строка 39; или в патенте US № 6458563, кол. 4, строки 25-53.
В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-VIII с удаленным В-доменом содержит делецию большей части В-домена, но при этом сохраняет аминотерминальные последовательности В-домена, которые выжны для in vivo протеолитического процессинга продукта первичной трансляции в двуполипеп-тидную цепь, как описано в WO 91/09122. В некоторых вариантах реализации изобретения конструкция Ф-VIII с удаленным В-доменом содержит делецию аминокислот 747-1638, т.е. фактически полную делецию В-домена. Hoeben R.C., et al. J. Biol. Chem. 265 (13): 7318-7323 (1990). Фактор VIII с удаленным В-доменом также может содержать делецию аминокислот 771-1666 или аминокислот 868-1562 Ф-VIII. Meulien P., et al. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Дополнительные делеции В-домена, которые являются частью данного изобретения, включают: делецию аминокислот от 982 до 1562 или от 760 до 1639 (Toole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), от 797 до 1562 (Eaton, et al. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), от 741 до 1646 (Kaufman (заявка на публикацию согласно РСТ № WO 87/04187)), 7471560 (Sarver, et al., DNA (1987) 6:553-564)), от 741 до 1648 (Pasek (заявка на публикацию согласно РСТ № 88/00831)) или от 816 до 1598 либо от 741 до 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) № 82:16-25, ЕП 295597)). В других вариантах реализации изобретения Ф-VIII с удаленным В-доменом содержит полипептид Ф-VIII, содержащий фрагменты В-домена, в которых сохранены один или более N-связанных участков гликозилирования, например остатки 757, 784, 828, 900, 963 или, в некоторых случаях, 943, которые соответствуют аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности Ф-VIII. Примеры фрагментов В-домена включают 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена, как описано в Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A., et al., J. Thromb. Haemost. 6: 1352-1359 (2008) и Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (т.е. сохранены первые 226 аминокислот или 163 аминокислоты В-домена). В некоторых вариантах реализации изобретения Ф-VIII, содержащий частичный В-домен, является Ф-\^Ш198 (SEQ ID NO: 105). Ф-\^Ш198 является одноцепочечной мо-лекулой-226№ Ф-VIIIFc, содержащей частичный В-домен. 226 обозначает 226 N-концевых аминокислот В-домена Ф-VIII, a N6 обозначает шесть участков N-гликозилирования в В-домене. В других вариантах реализации изобретения Ф-VIII с удаленным В-доменом дополнительно содержит точечную мутацию в остатке 309 (от Phe до Ser) для того, чтобы улучшить экспрессию белка Ф-VIII с удаленным В-доменом. Смотрите Miao, H.Z., et al., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). В других вариантах реализации изобретения Ф-VIII с удаленным В-доменом содержит полипептид Ф-VIII, содержащий часть В-домена, но не содержащий один или более сайтов расщепления фурином (например, Arg1313 и Arg 1648). Смотрите Pipe, S.W., et al., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011). Каждую из вышеописанных делеций можно внести в любую последовательность Ф-VIII.
Белок Ф-VIII, применяемый в настоящем изобретении, может включать Ф-VIII, содержащий одну или более гетерологичных последовательностей или их химических или физических модификаций, которые не оказывают влияния на коагулирующую активность Ф-VIII. Подобные гетерологичные последовательности или их химические или физические модификаций могут быть сшитыми с С-концом или N-концом белка Ф-VIII либо вставленными между одним или более из двух аминокислотных остатков в белке Ф-VIII. Такие вставки в белок Ф-VIII не оказывают влияния на коагулирующую активность Ф-VIII или функционирование Ф-VIII. В одном варианте реализации изобретения данные вставки улучшают фармакокинетические свойства белка Ф-VIII (например, время полужизни). В другом варианте реализации изобретения вставки могут быть сделаны на более чем двух, трех, четырех, пяти или шести участках.
В одном варианте реализации изобретения белок Ф-VIII расщепляется сразу за аргинином при аминокислоте 1648 (в полноразмерном факторе VIII или SEQ ID NO: 16), аминокислоте 754 (в факторе VIII с удаленным В-доменом S743/Q1638 или SEQ ID NO: 16), или соответствующим аргинину остатком (в других вариантах), тем самым приводя к наличию тяжелой цепи и легкой цепи. В другом варианте реализации изобретения Ф-VIII содержит тяжелую цепь и легкую цепь, которые связаны или соединены посредством ион-опосредованной нековалентной связи.
В других вариантах реализации изобретения Ф-VIII является одноцепочечным Ф-VIII, который не был расщеплен сразу за аргинином при аминокислоте 1648 (в полноразмерном факторе VIII или SEQ ID NO: 16), аминокислоте 754 (в факторе VIII с удаленным В-доменом S743/Q1638 или SEQ ID NO: 18), или соответствующим аргинину остатком (в других вариантах). Одноцепочечный Ф-VIII может содержать одну или более аминокислотных замен. В одном варианте реализации изобретения аминокислотная за
мена проведена в остатке, соответствующем остатку 1648, остатку 1645 или им обоим полипептида полноразмерного зрелого фактора VIII (SEQ ID NO: 16), либо остатку 754, остатку 751 или им обоим фактора VIII с удаленным В-доменом (SEQ ID NO: 18). Аминокислотная замена может представлять собой любые аминокислоты, кроме аргинина, например изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, пролин, селеноцистеин, серин, тирозин, гистидин, орнитин, пирролизин или таурин.
Ф-VIII может дополнительно расщепляться тромбином, а затем активироваться как Ф-VIIIa, выполняя функцию кофактора для активированного фактора IX (Ф-IXa). Активированный Ф-IX совместно с активированным Ф-VIII образует комплекс Х-азу и преобразует фактор X в активированный фактор X (ФХа). Для активации Ф-VIII расщепляется тромбином за тремя остатками аргинина в аминокислотах 372, 740 и 1689 (соответствующих аминокислотам 372, 740 и 795 в последовательности Ф-VIII с удаленным В-доменом), при этом расщепление приводит к образованию Ф-VIIIa, содержащего цепи А1 в 50 кДа, А2 в 43 кДа и А3-С1-С2 в 73 кДа. В одном варианте реализации белок Ф-VIII, применяемый в настоящем изобретении, является неактивированным Ф-VIII. В другом варианте реализации изобретения белок Ф-VIII является активированным Ф-VIII.
Белок, содержащий полипептид Ф-VIII, связанный или соединенный с фрагментом ФВ, может содержать последовательность по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную SEQ ID NO: 16 или 18, при этом последовательность обладает коагулирующей активностью Ф-VIII, например активирует фактор IX как кофактор для преобразования фактора X в активированный фактор
X (ОХа).
Употребляемое в данном тексте выражение "гибридные" полипептиды и белки означает комбинацию первой полипептидной цепи, например фрагмента ФВ, в некоторых случаях связанной с первым гетерологичным компонентом, со второй полипептидной цепью, например белком Ф-VIII, в некоторых случаях связанной со вторым гетерологичным компонентом, образующую, таким образом, гетеродимер. В одном варианте реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид в гибриде связаны друг с другом посредством белок-белковых взаимодействий, таких как заряд-зарядное или гидрофобное взаимодействия. В другом варианте реализации изобретения первый полипептид и второй полипептид в гибриде связаны друг с другом посредством дисульфидной или другой ковалентной связи(ей). Гибриды описаны, к примеру, в патенте US 2004/101740 и патенте US 2006/074199. Второй полипептид может являться идентичной копией первого полипептида или быть неидентичным полипептидом. В одном варианте реализации изобретения первый полипептид является слитым белком из фрагмента ФВ и Fc, а второй полипептид является полипептидом, содержащим, состоящим преимущественно из или состоящим из FcRn-связывающего домена, при этом первый полипептид и второй полипептид связаны друг с другом. В другом варианте реализации изобретения первый полипептид содержит слитый белок из фрагмента ФВ и Fc, а второй полипептид содержит слитый белок из Ф-VIII и Fc, что превращает гибрид в гетеродимер. Первый полипептид и второй полипептид могут быть связаны посредством ковалентной связи, например дисульфидной связи между первой Fc-областью и второй Fc-областью. Первый полипептид и второй полипептид могут быть дополнительно связаны друг с другом посредством связывания между фрагментом ФВ и белком Ф-VIII.
Г) Линкеры.
Химерный белок, являющийся объектом настоящего изобретения, дополнительно содержит линкер. Между двумя белками может находиться один или более линкеров, например между дополнительным компонентом и белком Ф-VIII (иногда также называемый "Ф-Х'ТПУДК линкер"), между фрагментом ФВ и первым гетерологичным компонентом (иногда также называемый "ФВ линкер"), например, первая Fc-область, между белком Ф-VIII и вторым гетерологичным компонентом (иногда также называемый "Ф-VIII линкер"), например, вторая Fc-область, между фрагментом ФВ и белком Ф-VIII (например, Ф-VIII/ДК линкер), между фрагментом ФВ и вторым гетерологичным компонентом и/или между белком Ф-VIII и первым гетерологичным компонентом. Все линкеры могут иметь одинаковую или разную последовательность. В одном варианте реализации изобретения линкер является полипептидным линкером. В другом варианте реализации изобретения линкер является неполипептидным линкером.
Линкер, применяемый в настоящем изобретении, может содержать любую органическую молекулу. В одном варианте реализации изобретения линкер является полимером, например полиэтиленгликолем (ПЭГ) или гидроксиэтиловым крахмалом (ГЭК). В другом варианте реализации изобретения линкер представляет собой аминокислотную последовательность (например, полипептидный линкер). Полипептидный линкер может содержать по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 или 2000 аминокислот. Линкер может содержать 1-5 аминокислот, 1-10 аминокислот, 1-20 аминокислот, 10-50 аминокислот, 50100 аминокислот, 100-200 аминокислот, 200-300 аминокислот, 300-400 аминокислот, 400-500 аминокислот, 500-600 аминокислот, 600-700 аминокислот, 700-800 аминокислот, 800-900 аминокислот или 9001000 аминокислот.
Примеры полипептидных линкеров хорошо известны в данной области техники. В одном варианте реализации изобретения линкер содержит последовательность Gn. Линкер может содержать последова
тельность (GA)n. Линкер может содержать последовательность (GGS)n ограничиваются этим, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 22), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 23), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 24), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 25),
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26), линкеры в табл. 13 (SEQ ID NOs: 92, 93 и 94), и линкеры в табл. 14А (SEQ ID NOs: 95, 96 и 97). Линкер не блокирует и не снижает активность фрагмента ФВ или коагулирующую активность фактора VIII. В некоторых случаях линкер усиливает активность фрагмента ФВ или коагулирующую активность белка фактора VIII, например, дополнительно снижая эффекты сте-рического несоответствия и обеспечивая фрагменту ФВ или части фактора VIII больший доступ к их целевому связывающему участку.
В одном варианте реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15-25 аминокислот. В другом варианте реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15-20 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 10-25 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения длина линкера, применяемого в химерном белке, составляет 15 аминокислот. В других вариантах реализации изобретения линкер, применяемый в химерном белке, представляет собой (GGGGS)n (SEQ ID NO: 27), где G является глицином, S является серином, а n является целым числом в диапазоне 1-20.
Д) Сайты расщепления.
Линкер также может содержать компонент, который может отщепляться химически (например, гидролиз или эфирная связь), ферментативно (т. е. включение последовательности расщепления протеа-зой) или фотолитически (например, хромофор, такой как 3-амино-(2-нитрофенил) проприоновая кислота (АНП)), с целью отделить одну молекулу от другой.
В одном варианте реализации изобретения линкер является отщепляемым линкером. Отщепляемые линкеры могут содержать один или более сайтов расщепления на N-конце или С-конце, либо на обоих. В другом варианте реализации изобретения отщепляемый линкер состоит преимущественно из или состоит из одного или более отщепляемых участков. В других вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит описанные в данном тексте гетерологичные аминокислотные линкерные последовательности или полимеры и один или более отщепляемых участков.
В определенных вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые могут расщепляться в клетке-хозяине (т. е. сайты внутриклеточного про-цессинга). Неограничивающие примеры сайтов расщепления включают RRRR (SEQ ID NO: 52), RKRRKR (SEQ ID NO: 53) и RRRRS (SEQ ID NO: 54).
В других вариантах реализации изобретения отщепляемый линкер содержит один или более сайтов расщепления, которые расщепляются протеазой после введения пациенту химерного белка, содержащего отщепляемый линкер. В одном варианте реализации изобретения сайт расщепления расщепляется про-теазой, выбранной из группы, состоящей из фактора XIa, фактора XIIa, калликреина, фактора VIIa, фактора IXa, фактора Ха, фактора IIa (тромбина), эластазы-2, ММП-12, ММП-13, ММП-17 и ММП-20. В другом варианте реализации изобретения сайт расщепления выбран из группы, состоящей из сайта расщепления Ф-XIa (например, KLTR I AET (SEQ ID NO: 29)), сайта расщепления Ф-XIa (например, DFTR I VVG (SEQ ID NO: 30)), сайта расщепления Ф-XIIa (например, TMTR I IVGG (SEQ ID NO: 31)), сайта расщепления калликреином (например, SPFR I STGG (SEQ ID NO: 32)), сайта расщепления Ф-VIIa (например, LQVR I IVGG (SEQ ID NO: 33)), сайта расщепления Ф-IXa (например, PLGR I IVGG (SEQ ID NO: 34)), сайта расщепления ФХа (например, IEGR I TVGG (SEQ ID NO: 35)), сайта расщепления ФПа (тромбином) (например, LTPR I SLLV (SEQ ID NO: 36)), сайта расщепления эластазой-2 (например, LGPV I SGVP (SEQ ID NO: 37)), сайта расщепления гранзимом В (например, VAGD I SLEE (SEQ ID NO: 38)), сайта расщепления ММР-12 (например, GPAG I LGGA (SEQ ID NO: 39)), сайта расщепления ММР-13 (например, GPAG I LRGA (SEQ ID NO: 40)), сайта расщепления ММР-17 (например, APLG I LRLR (SEQ ID NO: 41)), сайта расщепления ММР-20 (например, PALP I LVAQ (SEQ ID NO: 42)), сайта расщепления ВГТ (например, ENLYFQ I G (SEQ ID NO: 43)), сайта расщепления энтерокиназой (например, DDDK I IVGG (SEQ ID NO: 44)), сайта расщепления протеазой 3С (PRESCISSION(tm)) (например, LEVLFQ I GP (SEQ ID NO: 45)) и сайта расщепления сортазой А (например, LPKT I GSES) (SEQ ID NO: 46). В определенных вариантах реализации изобретения сайты расщепления Ф-XIa включают, но не
ограничиваются этим, например, TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 47) и SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 48). Неограничивающие примеры сайта расщепления тромбином включают, например, DFLAEGGGVR (SEQ ID
NO: 49), TTKIKPR (SEQ ID NO: 50) или LVPRG (SEQ ID NO: 55), и последовательность, содержащую,
состоящую преимущественно из или состоящую из ALRPR (например, ALRPRVVGGA (SEQ ID NO:
51)).
В конкретном варианте реализации изобретения сайтом расщепления является TLDPRSFLLRN-
PNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 56).
Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и способы их получения.
Также в изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий описанный в данном тексте фрагмент ФВ, химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и гетерологичный компонент, химерный белок, содержащий белок Ф-VIII и дополнительный компонент, или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII. В случае, когда фрагмент ФВ в химерном белке связан с гетерологичным компонентом или белком Ф-VIII в виде одиночной полипептидной цепи, данное изобретение относится к поли-нуклеотиду, кодирующему фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом или белком Ф-VIII. В случае, когда химерный белок содержит первую и вторую полипептидные цепи, с первой полипептидной цепью, содержащей фрагмент ФВ и первый гетерологичный компонент (например, первую Fc-область), и второй полипептидной цепью, содержащей фрагмент ФВ и второй гетерологичный компонент (например, вторую Fc-область), причем первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь соединены друг с другом, полинуклеотид может содержать первую нуклеотидную последовательность и вторую нуклеотидную последовательность. В одном варианте реализации изобретения первая нуклео-тидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность принадлежат одному и тому же полинуклеотиду. В другом варианте реализации изобретения первая нуклеотидная последовательность и вторая нуклеотидная последовательность принадлежат двум разным полинуклеотидам (например, разным векторам). В определенных вариантах реализации настоящее изобретение относится группе поли-нуклеотидов, содержащей первую нуклеотидную цепь и вторую нуклеотидную цепь, причем первая нук-леотидная цепь кодирует фрагмент ФВ химерного белка, а вторая нуклеотидная цепь кодирует белок Ф-
VIII.
В других вариантах реализации изобретения группа полинуклеотидов дополнительно содержит добавочную нуклеотидную цепь (например, вторую нуклеотидную цепь, если химерный белок кодируется одиночной полинуклеотидной цепью, или третью нуклеотидную цепь, если химерный белок кодируется двумя полинуклеотидными цепями), которая кодирует протеин-конвертазу. Протеин-конвертаза может быть выбрана из группы, состоящей из пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 5 (PCSK5 или РС5), пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 7 (PCSK7 или РС7), дрожжевой протеазы Кех 2, пропротеин конвертазы субтилизин/кексин типа 3 (РАСЕ или PCSK3) и двух или более комбинаций этих компонентов. В некоторых вариантах реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РАСЕ, PC5 или РС7. В конкретном варианте реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РС5 или РС7; смотрите международную заявку № PCT/US2011/043568, которая включена в данный текст посредством ссылки. В другом варианте реализации изобретения протеин-конвертаза представляет собой РАСЕ/фурин.
В определенных вариантах реализации данное изобретение относится группе полинуклеотидов, содержащей первую нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ, вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Ф-VIII, и третью нук-леотидную последовательность, кодирующую домен D1 и домен D2 ФВ. В этом варианте реализации изобретения домен D1 и домен D2 экспрессируются отдельно (и не связаны с доменом D'D3 фрагмента ФВ) с целью образования подходящей дисульфидной связи и филдинга доменов D'D3. Экспрессия домена D1D2 может происходить как в цис-, так и в транс-форме.
Употребляемое в данном тексте выражение экспрессионный вектор относится к любой нуклеотид-ной конструкции, которая содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности или, в случае вирусного РНК вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции при внесении в соответствующую клетку-хозяина. Экспрессионные векторы могут включать плазмиды, фадмиды, вирусы и их производные.
Экспрессионные векторы, являющиеся объектами данного изобретения, будут содержать полинук-леотиды, кодирующие фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ.
В одном варианте реализации изобретения последовательность, кодирующая фрагмент ФВ, второй гетерологичный компонент (например, вторую Fc-область) или белок Ф-VIII, функционально связанная с управляющей экспрессионной последовательностью. В данном контексте две нуклеотидные последовательности являются функционально связанными, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы обеспечить сохранение функциональности каждого компонента нуклеотидной последовательности. Считается, что кодирующая последовательность и управляющая генной экспрессией последовательность функционально связаны, когда они ковалентно связаны таким образом, чтобы экспрессия или транскрипция и/или трансляция кодирующей последовательности оказалась под влиянием или управлением последовательности, управляющей генной экспрессией. Считается, что две последовательности ДНК функционально связаны, если индукция промотора в 5' последовательности генной экспрессии приводит к транскрипции кодирующей последовательности и если природа связи между двумя последовательностями ДНК не (1) приводит к внесению мутации со сдвигом рамки, (2) препятствует возможности про-моторной области управлять транскрипцией кодирующей последовательности или (3) препятствует возможности соответствующего РНК-транскрипта быть транслированным в белок. Таким образом, последо
вательность генной экспрессии будет функционально связана с кодирующей нуклеотидной последовательностью, если последовательность генной экспрессии способна осуществить транскрипцию данной кодирующей нуклеотидной последовательности так, что полученный транскрипт транслируется в необходимый белок или полипептид.
В данном контексте управляющая генной экспрессией последовательность представляет собой любую регуляторную нуклеотидную последовательность, такую как промоторная последовательность или промоторно-энхансерная комбинация, которая способствует эффективной транскрипции и трансляции кодирующей нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Управляющая генной экспрессией последовательность может, к примеру, являться промотором млекопитающего или вируса, таким как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные промоторы млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, промоторы для следующих генов: гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГРТ), аденозиндеаминазы, пируваткиназы, промотор бета-актина и другие конститутивные промоторы. Примеры вирусных промоторов, которые конститутивно функционируют в эукариотических клетках, включают, например, промоторы из цитомегаловируса (ЦМВ), вируса обезьяны (например, SV40), вируса папилломы, аденовируса, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Рауса, цитомегаловируса, длинные концевые повторы (ДКП) вируса лейкоза Мо-лони и другие ретровирусы, а также тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса. Другие конститутивные промоторы известны специалистам в данной области техники. Промоторы, применимые в качестве последовательностей генной экспрессии согласно изобретению, также включают индуцибель-ные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессируются в присутствии индуктора. Например, индукция промотора металлотионеина для стимуляции транскрипции или трансляции происходит в присутствии определенных ионов металлов. Другие индуцибельные промоторы известны специалистам в данной области техники.
В общем случае управляющая генной экспрессией последовательность будет включать, при необходимости, 5' нетранскрибируемые и 5' нетранслируемые последовательности, участвующий в инициации, соответственно транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность ЦААТ и им подобные. В частности, такие 5' нетранскрибируемые последовательности будут включать промоторную область, которая содержит промоторную последовательность для управления транскрипцией функционально присоединенной кодирующей нуклеиновой кислоты. Последовательности генной экспрессии в некоторых случаях содержат энхансерные последовательности или вышележащие активаторные последовательности, если они необходимы.
Вирусные векторы включают, но не ограничиваются этим, нуклеотидные последовательности следующих вирусов: ретровируса, такого как вирус лейкоза мышей Молони, вирус саркомы мышей Харви, вирус опухоли молочной железы мышей и вирус саркомы Рауса; аденовируса, адено-ассоциированного вируса; вирусов типа SV40; полиомавирусов; вирусов Эпштейна-Барра; вирусов папилломы; вируса герпеса; вируса осповакцины; полиовируса; и РНК-вируса, такого как ретровирус. Также можно применять другие хорошо известные в данной области техники векторы. Определенные вирусные векторы происходят от нецитопатических эукариотических вирусов, в которых несущественные гены были заменены генами, представляющими интерес. Нецитопатические вирусы включают ретровирусы, жизненный цикл которых включает обратную транскрипцию геномной вирусной РНК в ДНК с последующим провирус-ным внедрением в клеточную ДНК хозяина. Ретровирусы были апробированы в экспериментах по генной терапии человека. Наиболее подходящими есть такие ретровирусы, которые являются дефектными по репликации (т. е. способными к прямому синтезу необходимых белков, но неспособными к созданию инфекционных частиц). Такие генетически измененные ретровирусны экспрессионные векторы в общем случае используются для высокоэффективной трансдукции генов in vivo. Стандартные протоколы по получению дефектных по репликации ретровирусов (включая этапы внесения экзогенного генетического материала в плазмиды, трансфекции пакующей клеточной линии плазмидами, получения рекомбинант-ных ретровирусов при помощи пакующей клеточной линии, забора вирусных частиц из тканевой куль-туральной среды и инфекцирования целевых клеток вирусными частицами) приведены в Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) и Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
В одном варианте реализации изобретения вирус является адено-ассоциированным вирусом, двух-цепочечным ДНК-вирусом. Адено-ассициированный вирус может быть сконструирован так, чтобы быть дефектным по репликации, и способным инфицировать большое количество типов и видов клеток. Дополнительно он обладает такими преимуществами, как устойчивость к температуре и липидным растворителям; высокие частоты трансдукции в клетках из различных клеточных линий, включая гемопоэтиче-ские клетки; и отсутствие ингибирования суперинфекции, что дает возможность осуществления множественных серий трансдукций. Согласно имеющимся сведениям адено-ассоциированный вирус может интегрироваться в человеческую клеточную ДНК сайт-специфическим образом, тем самым минимизируя возможность инсерционного мутагенеза и вариабельность экспрессионных характеристик ретровирусной инфекции вставленного гена. Вдобавок, адено-ассоциированные вирусные инфекции дикого типа претерпели в тканевой культуре более чем 100 переносов в отсутствии селективного давления, что указыва
ет на то, что геномная интеграция адено-ассоциированного вируса является относительно стабильным явлением. Адено-ассоциированный вирус также может функционировать внехромосомным способом.
Другие векторы включают плазмидные векторы. Плазмидные векторы были подробно описаны в данной области техники и хорошо известны специалистам; смотрите, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. В последние несколько лет было обнаружено, что плазмидные векторы являются исключительно удобными для доставки генов в клетки in vivo благодаря своей неспособности реплицироваться внутри клетки и интегрироваться в геном организма-хозяина. При этом плазмиды имеют промотор, совместимый с клеткой-хозяином, и могут экспрессировать пептид из гена, функционально кодируемого в пределах плазмиды. Некоторые широкоприменяемые плазмиды, предлагаемые частными поставщиками, включают pBR322, pUC18, pUC19, различные плазмиды pcDNA, pRC/CMV, различные плазмиды pCMV, pSV40 и pBlueScript. Дополнительные примеры отдельных плазмид включают pcDNA3.1, номер в каталоге V79020; pcDNA3.1/гигро, номер в каталоге V87020; pcDNA4/myc-His, номер в каталоге V86320; и pBud-CE4.1, номер в каталоге V53220, предоставляемые все компанией Инвитроген (Карлсбад, Калифорния). Другие плазмиды известны специалистам в данной области техники. Вдобавок, плазмиды могут быть разработаны индивидуально при помощи стандартных методов молекулярной биологии для удаления и/или добавления отдельных фрагментов ДНК.
В одной экспрессионной системе насекомого происхождения, которую можно применять для получения белков, являющихся объектами данного изобретения, для экспрессии чужеродных генов в качестве вектора используется вирус ядерного полигидроза Autographa californica (AcNPV). Вирус выращивается в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована в несущественные области (например, ген в форме многогранника) вируса и помещена под управления промотора AcNPV (например, промотора в форме многогранника). Успешная вставка кодирующей последовательности приведет к инактивации гена в форме многогранника и получению невкрапленного рекомбинант-ного вируса (т. е. вируса с отсутствием белкового покрытия, кодируемого геном в форме многогранника). Эти рекомбинантные вирусы впоследствии применяются для инфицирования клеток Spodoptera frugiper-da, в которых экспрессируется вставленный ген. (смотрите, например, Smith et al. (1983) J Virol 46:584; патент US № 4215051). Дополнительные примеры подобной экспрессионной системы можно найти в Ausubel et al., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley In-terscience.
Другой системой, которую можно применять для получения белков, являющихся объектами данного изобретения, является система генной экспрессии глутамин синтетазы, также называемая "экспресси-онной системой ГС" (Lonza Biologies PLC, Berkshire UK). Эта экспрессионная система детально описана в патенте US № 5981216.
В клетках-хозяевах, принадлежащих млекопитающим, может применяться большое количество экспрессионных систем на вирусной основе. В случаях, когда в качестве экспрессионного вектора применяется аденовирус, кодирующая последовательность может быть лигирована к аденовирусному комплексу, управляющему транскрипцией/трансляцией, например позднему промотору и трехкомпонентной лидерной последовательности. Затем этот химерный ген может быть вставлен в геном аденовируса путем in vitro или in vivo рекомбинации. Вставка несущественной области вирусного генома (например, области Е1 или Е3) приведет к образованию рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способным экспрессировать пептид в инфицированном организме-хозяине; смотрите, например, Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). В качестве альтернативного варианта может применяться промотор 7.5 К осповакцины; см., например, Mackettet al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Macket-tet al. (1984) J Virol 49:857; Panicali et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.
Для повышения эффективности производства полинуклеотиды могут быть сконструированы таким образом, чтобы кодировать множественные звенья белка, являющегося объектом данного изобретения, разделенные сайтами расщепления ферментами. Результирующий полипептид может быть расщеплен (например, путем обработки соответствующим ферментом) с целью восстановления звеньев полипептида. Это может увеличить выход полипептидов, управляемых одиночным промотором. При применении в соответствующих вирусных экспрессионных системах управление трансляцией каждого полипептида, кодируемого иРНК, происходит внутри транскрипта, например осуществляется участком внутренней посадки рибосомы или УВПР. Таким образом, полицистронная конструкция управляет транскрипцией одиночной, крупной полицистронной иРНК, которая, в свою очередь, управляет трансляцией множественных отдельных полипептидов. В этом подходе не используется получение и ферментативный процес-синг полипротеинов, что может значительно повысить выход полипептидов, управляемых одиночным промотором.
Применяемые для трансформации векторы обычно будут содержать селектируемый маркер, который используется для идентификации трансформантов. В бактериальных системах они могут включать гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин и канамицин. Селектируемые маркеры для применения в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным препаратам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер
может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Одним из амплифицируемых селектируемых маркеров является ген дегидрофолатредуктазы (ДГФР). Simonsen C.C. et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Обзор по селектируемым маркерам сделан Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, But-terworth Publishers, Stoneham, Mass., а выбор селектируемых маркеров не составит трудности для специалистов в данной области техники.
Селектируемые маркеры могут быть внесены в клетку при помощи отдельной плазмиды одновременно с представляющим интерес геном, либо они могут быть внесены при помощи той же самой плаз-миды. В случае применения одной плазмиды селектируемый маркер и представляющий интерес ген могут находиться под управлением разных промоторов или одного и того же промотора, при этом последняя конфигурация приводит к получению двухцистронной иРНК. Конструкции такого типа известны в данной области техники (например, патент US № 4713339).
Экспрессионные векторы могут кодировать метки, которые дают возможность легкого выведения рекомбинантно произведенного белка. Примеры включают, но не ограничиваются этим, вектор pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J 2:1791), в котором кодирующие последовательности для экспрессируемого белка могут быть лигированными в вектор в рамку с кодирующей областью lac z таким образом, что это приводит к получению меченного слитого белка; векторы pGEX можно применять для экспрессии белков, являющихся объектами данного изобретения, с глутатион^-трансферазной (GST) меткой. Обычно эти белки растворимы и легко могут быть выведены из клеток путем адсорбции на глутатион-арагозных гранулах с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы содержат сайты расщепления (тромбином или протеазой фактора Ха или PRESCISSION PROTEASE(tm) (Pharmacia, Peapack, N.J.)) для легкого удаления метки после выведения.
Затем экспрессионные векторы трансфицируются или ко-трансфицируются в подходящую клетку-мишень, которая будет экспрессировать полипептиды. Известные в данной области техники трансфекци-онные методы включают, но не ограничиваются этим, осаждение фосфата кальция (Wigler et al. (1978) Cell 14:725), электропорацию (Neumann et al. (1982) EMBO J 1:841) и реагенты на основе липосом. Для экспрессии описанных в данном тексте белков можно применять большое количество систем хозяи-экспресионный вектор, включая как прокариотические, так и эукариотические клетки. Такие системы включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli), трансформированные при помощи рекомбинантной ДНК бактериофага или экспрессионных векторов плаз-мидной ДНК, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; дрожжевые или мице-лиальные грибы, трансформированные при помощи рекомбинантных дрожжевых или грибных экспрес-сионных векторов, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы насекомого происхождения, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловируса), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы растительного происхождения, инфицированные рекомбинантными вирусными экс-прессионными векторами (например, вируса мозаики цветной капусты или вируса табачной мозаики) или трансформированные при помощи рекомбинантных плазмидных экспрессионных векторов (например, Ti-плазмиды), содержащих соответствующую кодирующую последовательность; или клеточные системы животного происхождения, включая клетки млекопитающих (например, клетки HEK 293, СНО, Cos, HeLa, HKB11 и BHK).
В одном варианте реализации изобретения клеткой-хозяином является эукариотическая клетка. При употреблении в данном тексте эукариотическая клетка относится к любой животной или растительной клетке, имеющей сформировавшееся ядро. Эукариотические клетки животных включают клетки позвоночных, например млекопитающих, и клетки беспозвоночных, например насекомых. Эукариотические клетки растений, в частности, могут без ограничений включать дрожжевые клетки. Эукариотическая клетка отличается от прокариотической клетки, например бактерии.
В некоторых вариантах реализации изобретения эукариотическая клетка является клеткой млекопитающего. Клеткой млекопитающего является любая клетка, полученная от млекопитающего. Клетки млекопитающих включают, в частности, но не ограничиваются этим, клеточные линии млекопитающих. В одном варианте реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой человека. IB другом варианте реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой HEK 293, которая принадлежит к клеточной линии из человеческих эмбриональных почек. Клетки HEK 293 предоставляются под маркировкой CRL-1533 американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, и под маркировкой клетки 293-Н, каталог № 11631-017, или клетки 293-F, каталог № 11625-019 Инвитроген (Карлсбад, Калифорния). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой PER.C6(r), которая принадлежит к человеческой клеточной линии, полученной из сетчатки. Клетки PER.C6(r) предоставляются Crucell (Ляйден, Нидерланды). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой яичников китайского хомячка (СНО - от англ. "Chinese hamster ovary"). Клетки СНО предоставляются американской коллекцией типовых культур, Манас-сас, Вирджиния, (например, СНО-Ю; CCL-61). В других вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой почки новорожденного хомячка (BHK - от англ. "baby hamster kidney").
Клетки BHK предоставляются американской коллекцией типовых культур, Манассас, Вирджиния, (например, CRL-1632). В некоторых вариантах реализации изобретения клетка млекопитающего является клеткой HKB11, которая представляет гибридную клеточную линию из линий клеток HEK293 и человеческих В-клеток; Mei et al., Mol. Biotechnol. 34(2): 165-78 (2006).
В одном варианте реализации плазмида, кодирующая фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, дополнительно содержит селектируемый маркер, например, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и трансфицируется в клетки HEK 293 для продуцирования фрагмента ФВ или химерного белка.
В другом варианте реализации первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор VIII-Fc, и первый селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc, и второй селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к неомицину, котрансфици-руются в клетки HEK 293 для создания гибрида фактор VIII-Fc - фрагмент ФВ-Fc. Первая и вторая плаз-миды могут быть внесены в одинаковых количествах (т.е. в соотношении 1:1), либо они могут быть внесены в неодинаковых количествах.
В некоторых вариантах реализации изобретения первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор VIII-Fc, и первый селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc, и второй селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к неомицину, и третья плазмида, содержащая последовательность, кодирующую протеинконвертазу (например, РС5 или фурин), и третий селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к гигромицину, котрансфицируются в клетки HEK 293 для создания гибрида фактор VIII-фрагмент ФВ. Первая и вторая плазмиды могут быть внесены в одинаковых количествах (т. е. в молярном соотношении 1:1), либо они могут быть внесены в неодинаковых количествах. В определенных вариантах реализации изобретения первая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую слитый белок фактор VIII-Fc, последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc, и первый селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к зеоцину, и вторая плазмида, содержащая последовательность, кодирующую про-теинконвертазу (например, РС5 или фурин), и второй селектируемый маркер, например ген, отвечающий за устойчивость к гигромицину, котрансфицируются в клетки HEK 293 для создания гибрида фактор VIII-фрагмент ФВ. В одном варианте реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательность Ф-VIII-Fc и последовательность ФВ-Fc, могут быть соединены для того, чтобы кодировать один единственный полипептид. В другом варианте реализации изобретения нуклео-тидные последовательности, кодирующие последовательность Ф-VIII-Fc и последовательность ФВ-Fc, могут кодировать две полипептидные цепи. Промоторы последовательности, кодирующей слитый белок фактор VIII-Fc, и последовательности, кодирующей фрагмент ФВ-Fc, могут быть разными либо одинаковыми.
В некоторых вариантах реализации изобретения плазмида, содержащая фурин, котрансфицируется с плазмидой, содержащей последовательность, кодирующую Ф-VIII-Fc, и/или последовательность, кодирующую ФВ-Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на той же плазмиде, которая содержит последовательность, кодирующую слитый белок Ф-VIII-Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на той же плазмиде, которая содержит последовательность, кодирующую фрагмент ФВ-Fc. В некоторых вариантах реализации изобретения белок фурин находится на отдельной плазмиде.
В других вариантах реализации изобретения трансфицированные клетки являются стабильно трансфицированными. Эти клетки могут быть собраны и сохранены в качестве стабильной клеточной линии при помощи традиционных методов, известных специалисту в данной области техники.
Клетки-хозяева, содержащие ДНК-конструкции белка, выращиваются в подходящей питательной среде. Употребляемый в данном тексте термин "подходящая питательная среда" обозначает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для роста клеток. Питательные вещества, необходимые для роста клеток, могут включать источник углерода, источник азота, незаменимые аминокислоты, витамины, минералы и факторы роста. В некоторых случаях среда может содержать один или более селективных факторов. В некоторых случаях среда может содержать телячью сыворотку или фетальную телячью сыворотку (ФТС). В одном варианте реализации изобретения среда практически не содержит IgG. В общем случае питательная среда рассчитана на клетки, содержащие ДНК-конструкцию, при помощи, например, отбора по чувствительности к лекарственному препарату или дефициту незаменимого питательного веществ, которая дополнена селектируемым маркером на ДНК-конструкции или котрансфици-руется с ДНК-конструкцией. Культивируемые клетки млекопитающих в общем случае выращивают на коммерчески доступных содержащих сыворотку или бессывороточных средах (например, MEM, DMEM, DMEM/F12). В одном варианте реализации изобретения средой является CD293 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния). В другом варианте реализации изобретения средой является CD17 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния). Выбор среды, подходящей для конкретной применяемой клеточной линии, является стандартным навыком для специалиста в данной области техники.
Для того чтобы экспрессировать фрагмент ФВ и второй гетерологичный компонент или белок Ф-VIII, клетки-хозяева культивируются в условиях, которые обеспечивают возможность экспрессии фрагмента ФВ и второго гетерологичного компонента или белка Ф-VIII. Употребляемый в данном тексте термин культивирование относится к сохранению живых клеток in vitro на протяжении, по меньшей мере, определенного времени. Сохранение может, но не обязательно, включать рост популяции живых клеток. Например, сохраняемые в культуре клетки могут иметь статическую популяцию, но при этом жизнеспособными и способными к продуцированию необходимого продукта, например рекомбинантного белка или рекомбинантного слитого белка. Условия, подходящие для культивирования эукариотических клеток, хорошо известны в данной области техники и включают подходящий выбор питательной среды, добавок к среде, температуры, уровня рН, насыщения кислородом и тому подобное. В коммерческих целях культивирование может включать использование любых из множества типов систем для расширения масштаба, включая шуттель-аппараты, роллерные флаконы, биореакторы с полыми волокнами, биореакторы с механическим перемешиванием, эрлифтные биореакторы, волновые биореакторы и другие.
Условия культивирования клеток также выбираются таким образом, чтобы обеспечить возможность связывания фрагмента ФВ со вторым гетерологичным компонентом или белком Ф-VIII. Условия, которые обеспечивают возможность экспрессии фрагмента ФВ и/или белка Ф-VIII, могут включать наличие источника витамина K. Например, в одном варианте реализации изобретения стабильно трансфициро-ванные клетки HEK 293 культивируются в среде CD293 (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния) или в среде OptiCHO (Инвитроген, Карлсбад, Калифорния), дополненной 4 мМ глутамина.
В одном аспекте реализации настоящее изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения фрагмента ФВ, являющегося объектом изобретения, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, и б) культивирование клетки-хозяина в культу-ральной среде в условиях, подходящих для экспрессии фрагмента ФВ, при этом фрагмент ФВ экспресси-руется. В одном варианте реализации изобретение относится к способу получения зрелого белка ФВ или его фрагмента, включающему, а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим белок ФВ или его фрагмент, который сшит с пропептидом ФВ, и вторым полинуклеотидом, кодирующим протеинконвертазу, например РС5, РС7 или фурин, и б) культивирование клетки-хозяина в культу-ральной среде в условиях, подходящих для экспрессии зрелого белка ФВ или его фрагмента. Полинук-леотид, кодирующий белок ФВ или его фрагмент, также может быть сшит с препептидом ФВ. Последовательность препептида может отщепляться во время внесения в эндоплазматический ретикулум перед секрецией.
В другом аспекте реализации данное изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, связанный или соединенный с гетерологичным компонентом белка Ф-VIII, включающему а) трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклео-тидом или группой полинуклеотидов, кодирующими химерный белок, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В одном варианте реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом, и вторым полинуклеотидом, кодирующим белок Ф-VIII, связанный с гетерологичным компонентом, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. Первый полинуклеотид и второй полинуклеотид могут находиться в одном векторе или в двух векторах. В другом варианте реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, связанный с гетерологичным компонентом, вторым полинуклеотидом, кодирующим белок Ф-VIII, связанный с гетерологичным компонентом, и третьим полинуклеотидом, кодирующим протеинконвертазу, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В других вариантах реализации изобретение относится к способу экспрессии, создания или получения химерного белка, включающему а) трансфекцию клетки-хозяина первым полинуклеотидом, кодирующим фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3, связанный с гетерологичным компонентом, вторым полинуклеотидом, кодирующим белок Ф-VIII, связанный с гетерологичным компонентом, и третьим полинуклеоти-дом, кодирующим домен D1 и домен D2 ФВ, и б) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии химерного белка. В одном варианте реализации изобретения первый полинуклеотид, второй полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе или в разных векторах. В другом варианте реализации изобретения первый полинуклеотид и второй полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а третий полинуклеотид может находиться в другом векторе. В других вариантах реализации изобретения первый полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а второй полинуклеотид может находиться в другом векторе. В некоторых вариантах реализации изобретения второй полинуклеотид и третий полинуклеотид могут находиться в одном векторе, а первый полинуклеотид может находиться в другом векторе.
В дополнительных вариантах реализации изобретения белковый продукт, содержащий фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, секретируется в среду. Среду отделяют от клеток,
концентрируют, фильтруют, а затем пропускают через две или три колонки для аффинной хроматографии, например колонку протеина А и одну или более анионообменных колонок.
В определенных аспектах реализации настоящее изобретение относится к полипептиду фрагмента ФВ или химерного белка, получаемому описанными в данном тексте способами.
In vitro производство дает возможность для расширения масштаба для получения больших количеств необходимых измененных полипептидов, являющихся объектами данного изобретения. Методы культивирования клеток млекопитающих в условиях тканевого культивирования известны в данной области техники и включают гомогенное суспензионное культивирование, например, в эрлифтном реакторе или реакторе с механическим перемешиванием для непрерывного культивирования, или культивирование иммобилизованных или обездвиженных клеток, например, в полых волокнах, микрокапсулах, на арагозных микрогранулах или пьезокерамических головках. При необходимости и/или при желании растворы полипептидов могут быть очищены при помощи принятых хроматографических методов, например гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием (ХГВ), хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе или аффинной хроматографии.
Фармацевтический состав.
Составы, содержащие фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами настоящего изобретения, могут содержать подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Например, они могут содержать наполнители и/или вспомогательные вещества, которые способствуют превращению активных компонентов в препараты, предназначенные для доставки в место действия.
Фармацевтический состав может быть приготовленным для парентерального введения (т.е. внутривенного, подкожного или внутримышечного) при помощи болюсной инъекции. Лекарственная форма для инъекции может быть представлена в виде единичной дозировки, например, в ампулах или в много-дозовых контейнерах с добавление консерванта. Составы могут иметь вид суспензий, растворов или эмульсий на основе масляных или водных растворителей, и содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. В альтернативном варианте активный ингредиент может находиться в виде порошка для соединения с подходящим растворителем, например апирогенной водой.
Подходящие лекарственные формы для парентерального введения также включают водные растворы активных компонентов в водорастворимой форме, например водорастворимые соли. Вдобавок, могут применяться суспензии активных компонентов в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или среды включают жирные масла, например кунжутное масло, или эфиры синтетических жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и декстран. В некоторых случаях суспензия также может содержать стабилизаторы. Также могут использоваться липосомы для инкапсуляции молекул, являющихся объектами данного изобретения, для доставки их в клетки или интерстициальное пространство. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологически совместимые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые вещества, изотонические и замедляющие всасывание вещества, вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстроза, глицерол, этанол и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения состав содержит изотонические вещества, например сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол, или хлорид натрия. В других вариантах реализации изобретения составы содержат фармацевтически приемлемые вещества, такие как смачивающие вещества, или небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, консерванты или буферы, которые повышают срок годности или эффективность активных ингредиентов.
Составы, являющиеся объектами данного изобретения, могут находиться в различных формах, включая, например, жидкость (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии, суспензии, полутвердые и твердые дозировочные формы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения.
Состав может быть изготовлен в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомной или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного препарата. Стерильные растворы для инъекций можно изготовить путем внесения необходимого количества активного ингредиента в подходящий растворитель, в случае необходимости - с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, с последующей фильтрующей стерилизацией. В общем случае дисперсии изготавливают путем внесения активного ингредиента в стерильный растворитель, который содержит базовую дисперсную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для изготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами изготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, которая на выходе дает порошок из активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый ингредиент из исходного стерильно-отфильтрованного раствора. Необходимую текучесть раствора можно сохранить, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем сохранения необходимого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированное всасывание составов
для инъекций может быть достигнуто путем включения в состав вещества, которое замедляет всасывание, например, солей моностеарата или желатина.
Активный ингредиент может быть изготовлен так, чтобы иметь форму приспособление для контролируемого высвобождения. Примеры таких лекарственных форм и приспособлений включают импланты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биораз-лагаемые, биосовместимые полимеры, например этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полилактидная кислота. Способы изготовления таких лекарственных форм и приспособлений известны в данной области техники; смотрите, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Депо лекарственных препаратов для инъекций может быть создано путем образования микроинкап-сулированных матриц препаратов в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения препарата и полимера и природы применяемого полимера можно контролировать скорость высвобождения препарата. Другими примерами биоразлагаемых полимеров являются полиортоэфиры и полиангидриды. Депо лекарственных препаратов для инъекций может быть изготовлено путем заключения препарата в липосомы или микроэмульсии.
В составы могут включаться дополнительные активные соединения. В одном варианте реализации фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, изготавливается вместе с другим фактором свертывания крови или его вариантом, фрагментом, аналогом или производным. Например, факторы свертывания крови включают, но не ограничиваются этим, фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбин, фибриноген, фактор Виллебранда или рекомбинантный растворимый тканевой фактор (ррТФ) либо активированные формы любого из предыдущих веществ. Фактор свертывания крови гемостатического средства также может содержать антифибринолитические препараты, например эпсилон-амино-капроновую кислоту, транек-самовую кислоту.
Схемы приема лекарственных препаратов можно подобрать таким образом, чтобы они обеспечивали оптимальные необходимый ответ. Например, можно вводить единичную болюсную дозу, можно вводить несколько отдельных доз в течение продолжительного периода или дозы можно пропорционально уменьшать или увеличивать как того требует терапевтическая ситуация. Парентеральные составы удобно изготавливать в виде единичной дозировки для облегчения введения и постоянства дозировки; смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980).
Дополнительно к активному соединению жидкая форма дозировки может содержать инертные ингредиенты, такие как вода, этиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, глицерол, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот или сорбитан.
Неограничивающие примеры подходящих фармацевтических носителей также описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences авторства Martin. Некоторые примеры наполнителей включают крох-мал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силиконовый гель, стеарат натрия, гли-церол моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерол, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Состав также может содержать рН буферные реагенты и смачивающие или эмульгирующие вещества.
Для перорального введения фармацевтический состав может иметь форму таблеток или капсул, изготовленных стандартными способами. Также состав может быть изготовлен в виде жидкости, например сиропа или суспензии. Жидкость может содержать суспендирующие вещества (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенезированные пищевые жиры), эмульгирующие вещества (лецитин или гуммиарабик), неводные растворители (например, миндальное масло, жирные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновую кислоту). Препараты также могут содержать ароматизирующие, окрашивающие вещества и подсластители. В альтернативном варианте состав может представлять собой сухой продукт для соединения с водой либо другим подходящим растворителем.
Для буккального введения состав может иметь форму таблеток или леденцов в соответствии о стандартными протоколами.
Для введения путем ингаляции соединения для применения согласно настоящему изобретению обычно доставляются в форме распыляемого аэрозоля с или без наполнителей или в форме спрей-аэрозоля из аэрозольной упаковки или ингалятора, в некоторых случаях с пропеллентом, например ди-хлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафтрометаном, двуокисью углерода или другим подходящим газом. В случае аэрозольной упаковки единичная дозировка может быть определена, если нажатие клапана приводит к выделению дозированного количества вещества. Капсулы и картриджы из, к примеру, желатина, для использования в ингаляторе или инжекторе, можно изготовить с содержанием порошкообразной смеси из соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Также можно изготовить фармацевтический состав для ректального введения в виде суппозитория или микроклизмы с удержанием, например, с содержанием обычных основ для суппозитория, таких как
кокосовое масло или другие глицериды. Генная терапия.
Фрагмент ФВ или содержащий его химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, могут продуцироваться in vivo в организме млекопитающего, например пациента-человека, при применении терапевтически эффективных подходов генной терапии в лечении заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, выбранного из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией. В другом варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией А. Лечение включает введение подходящего фрагмента ФВ или нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный белок, функционально связанной с подходящей управляющей экспрессией последовательностью. В определенном варианте реализации изобретения эти последовательности включены в вирусный вектор. Подходящие вирусные векторы для указанной генной терапии включают аденовирусные векторы, лентивирусные векторы, бакуловирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барра, паповавирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе вируса простого герпеса и аденоассоциированные вирусные (ААВ) векторы. Вирусный вектор может являтьться дефектным по репликации вирусным вектором. В других вариантах реализации изобретения аденовирусный вектор содержит делецию в гене Е1 или в гене Е3. При применении аденовирусного вектора организм млекопитающего можно не подвергать обработке нуклеиновой кислотой, кодирующей ген селектируемого маркера. В других вариантах реализации изобретения последовательности включены в невирусный вектр, известный специалистам в данной области техники.
Способы применения фрагмента ФВ или химерного белка.
Один аспект реализации настоящего изобретения относится к предотвращению или подавлению взаимодействия Ф-VIII с эндогенным ФВ путем блокирования или экранирования ФВ-связывающего участка на Ф-VIII от эндогенного ФВ. В одном варианте реализации изобретение относится к способу создания белка Ф-VIII, который имеет время полужизни большее, чем Ф-VIII дикого типа, или мономер-но-димерного гибрида Ф-VIII, при этом способ включает ковалентное соединение дополнительного компонента с белком Ф-VIII, тем самым создавая химерный белок, содержащий белок Ф-VIII и дополнительный компонент, причем дополнительный компонент экранирует или предотвращает взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ. Химерный белок, применяемый в данном способе, включает один или более описанных в данном тексте химерных белков.
Другой аспект реализации изобретения включает способ введения нуждающемуся в этом пациенту белка Ф-VIII, который имеет время полужизни большее, чем Ф-VIII дикого типа, или мономерно-димерного гибрида Ф-VIII, который состоит из двух полипептидных цепей, с первой цепью, состоящей из аминокислотной последовательности, кодирующей Ф-VIII и Fc-область, и второй цепью, состоящей из Fc-области, при этом способ включает введение описанного в данном тексте фрагмента ФВ или описанного в данном тексте химерного белка пациенту. Аминокислотная последовательность Ф-VIII в мо-номерно-димерном гибриде может являться последовательностью Ф-VIII или Ф-VIII дикого типа.
В одном варианте реализации изобретение относится к способу применения вспосогательного компонента, например, описанного в данном тексте фрагмента ФВ или химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, для того, чтобы предотвратить или подавить взаимодействие эндогенного ФВ с белком Ф-VIII. В другом варианте реализации изобретения белок Ф-VIII, который способен взаимодействовать с фрагментом ФВ, является эндогенным Ф-VIII. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII, который способен взаимодействовать с фрагментом ФВ, является составом Ф-VIII, который вводится пациенту отдельно, до или после либо одновременно с фрагментом ФВ или химерным белком, содержащим фрагмент ФВ. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII, который способен связываться с фрагментом ФВ, является составом Ф-VIII, который вводится пациенту вместе с фрагментом ФВ или химерным белком. В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII, который способен связываться с фрагментом ФВ, является Ф-VIII, присутствующим с фрагментом ФВ или соединенным с фрагментом ФВ в химерном белке. Фрагмент ФВ или химерный белок, содержащий фрагмент ФВ, связывается или соединен с белком Ф-VIII и, таким образом, продлевает время полужизни белка Ф-VIII, связанного с фрагментом ФВ или химерным белком. Белок Ф-VIII, связанный с фрагментом ФВ или химерным белком экранирован или защищен от процесса выведения ФВ и, таким образом, характерихуется сниженным выведением по сравнению с белком Ф-VIII, не связанным с фрагментом ФВ или химерным белком. Таким образом, экранированный белок Ф-VIII имеет большее время полужизни чем белок Ф-VIII, не связанный или не соединенный с фрагментом ФВ или химерным белком. В определенных вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII, соединенный с или защищенный фрагментом ФВ или химерным белком, являющимися объектами данного изобретения, не выводится клиренс-рецепторами ФВ.
В других вариантах реализации изобретения белок Ф-VIII, соединенный с или защищенный фрагментом ФВ или химерным белком, выводится из системы медленнее, чем белок Ф-VIII, не соединенный с или не защищенный фрагментом ФВ.
В одном аспекте реализации фрагмент ФВ, являющийся объектом данного изобретения, или содержащий его химерный белок характеризуется сниженным выведение из циркуляции, так как данный фрагмент ФВ или химерный белок не содержит участка связывания клиренс-рецепторов ФВ. Фрагмент ФВ предотвращает или подавляет выведение из системы Ф-VIII, связанного или соединенного с фрагментом ФВ, в процессе выведения ФВ. Применяемые в настоящем изобретении фрагменты ФВ также могут обеспечивать по меньшей мере одно или более из ФВ-подобных Ф-Х'ТП-защитных свойств, которые обеспечиваются эндогенным ФВ. В определенных вариантах реализации изобретения фрагменты ФВ также могут маскировать один или более из участков связывания клиренс-рецепторов Ф-VIII, тем самым предотвращая выведение Ф-VIII в процессе его собственного выведения.
В другом аспекте реализации фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, можно применять для лечения или предотвращения заболевания или нарушения, связанного с болезнью Виллебранда (БВ) типа 2N. БВ типа 2N является качественным дефектом ФВ, который есть следствием нарушения связывания ФВ с Ф-VIII и в результате приводит к низким уровням циркулирующего Ф-VIII. Следовательно, фрагмент ФВ или химерный белок, являющиеся объектами данного изобретения, путем связывания с или будучи связанными с белком Ф-VIII, не только стабилизируют белок Ф-VIII, но также предотвращают выведение белка Ф-VIII из циркуляции.
В некоторых вариантах реализации изобретения предотвращение или подавление связывания белка Ф-VIII с эндогенным ФВ фрагментом ФВ или химерным белком может происходить in vitro или in vivo.
Также предложен способ увеличения времени полужизни белка Ф-VIII, включающий введение фрагмента ФВ или химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, и белка Ф-VIII нуждающемуся в этом пациенту. Время полужизни неактивированного Ф-VIII, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ, в плазме крови составляет от 12 до 14 ч. При БВ типа 3, когда в циркуляции практически отсутствует ФВ, время полужизни Ф-VIII составляет всего около 6 ч, что приводит к появлению у таких пациентов симптомов легкой или умеренной формы гемофилии А по причине пониженных концентраций Ф-VIII. Время полужизни белка Ф-VIII, связанного или соединенного с фрагментом ФВ, являющимся объектом настоящего изобретения, может возрастать по меньшей мере приблизительно в 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9 или 4,0 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного Ф-VIII, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни белка Ф-VIII, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает по меньшей мере приблизительно в 2, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7, 8, 9 или 10 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного Ф-VIII, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В другом варианте реализации изобретения время полужизни белка Ф-VIII, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает в от около 2 до около 5 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 5 до около 15 раз, от около 10 до около 20 раз, от около 15 до около 25 раз, от около 20 до около 30 раз, от около 25 до около 35 раз, от около 30 до около 40 раз, от около 35 до около 45 раз по сравнению со временем полужизни неактивированного Ф-VIII, связанного или соединенного с полноразмерным ФВ. В конкретном варианте реализации изобретения время полужизни белка Ф-VIII, связанного или соединенного с фрагментом ФВ в химерном белке возрастает по меньшей мере в около 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 раз по сравнению со временем полужизни Ф-VIII дикого типа у мышей с двойным Ф-VIII- и ФВ-генным нокаутом. В некоторых вариантах реализации изобретения время полужизни химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, сшитый с первым гетерологичным компонентом, например, первой Fc-областью, и белок Ф-VIII, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, превышает время полужизни химерного белка, содержащего белок Ф-VIII и две Fc-области, где белок Ф-VIII связан с одной из двух Fc-областей (т.е. мономерно-димерный гибрид Ф-VIII). В других вариантах реализации изобретения время полужизни химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, сшитый с первым гетерологичным компонентом, например, первой Fc-областью, и белок Ф-VIII, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, превышает по меньшей мере в около 1,5, 2, 2,5, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,5 или 5,0 раз время полужизни химерного белка, содержащего белок Ф-VIII и две Fc-области, где белок Ф-VIII связан с одной из двух Fc-областей (т.е. мономерно-димерный гибрид Ф-VIII).
В некоторых вариантах реализации результатом изобретения является продление времени полужизни белка Ф-VIII по сравнению с белком Ф-VIII без фрагмента ФВ или Ф-VIII дикого типа. Время полужизни белка Ф-VIII по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 2,5, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 6, по меньшей мере в 7, по меньшей мере в 8, по меньшей мере в 9, по меньшей мере в 10, по меньшей мере в 11 или по меньшей мере в 12 раз больше, чем время полужизни белка Ф-VIII без фрагмента ФВ. В одном варианте реализации изобретения время полужизни Ф-VIII приблизительно 1,5-20-кратно, приблизительно 1,5-15-кратно или приблизительно 1,5-10-кратно превышает время полужизни Ф-VIII дикого типа. В другом варианте реализации изобретения время полужизни Ф-VIII продлено в от около 2 до около 10 раз, от около 2 до
около 9 раз, от около 2до около 8 раз, от около 2 до около 7 раз, от около 2 до около 6 раз, от около 2 до около 5 раз, от около 2 до около 4 раз, от около 2 до около 3 раз, от около 2,5 до около 10 раз, от около 2,5 до около 9 раз, от около 2,5 до около 8 раз, от около 2,5 до около 7 раз, от около 2,5 до около 6 раз, от около 2,5 до около 5 раз, от около 2,5 до около 4 раз, от около 2,5 до около 3 раз, от около 3 до около 10 раз, от около 3 до около 9 раз, от около 3 до около 8 раз, от около 3 до около 7 раз, от около 3 до около 6 раз, от около 3 до около 5 раз, от около 3 до около 4 раз, от около 4 до около 6 раз, от около 5 до около 7 раз или от около 6 до около 8 раз по сравнению с Ф-VIII дикого типа или белком Ф-VIII без фрагмента ФВ. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-VIII составляет по меньшей мере около 17, по меньшей мере около 18, по меньшей мере около 19, по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 21, по меньшей мере около 22, по меньшей мере около 23, по меньшей мере около 24, по меньшей мере около 25, по меньшей мере около 26, по меньшей мере около 27, по меньшей мере около 28, по меньшей мере около 29, по меньшей мере около 30, по меньшей мере около 31, по меньшей мере около 32, по меньшей мере около 33, по меньшей мере около 34, по меньшей мере около 35, по меньшей мере около 36, по меньшей мере около 48, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 72, по меньшей мере около 84, по меньшей мере около 96 или по меньшей мере около 108 ч. В других вариантах реализации изобретения время полужизни Ф-VIII составляет от около 15 ч до около двух недель, от около 16 ч до около одной недели, от около 17 ч до около одной недели, от около 18 ч до около одной недели, от около 19 ч до около одной недели, от около 20 ч до около одной недели, от около 21 ч до около одной недели, от около 22 ч до около одной недели, от около 23 ч до около одной недели, от около 24 ч до около одной недели, от около 36 ч до около одной недели, от около 48 ч до около одной недели, от около 60 ч до около одной недели, от около 24 ч до около шести дней, от около 24 ч до около пяти дней, от около 24 ч до около четырех дней, от около 24 ч до около трех дней или от около 24 ч до около двух дней.
В некоторых вариантах реализации изобретения среднее время полужизни Ф-VIII у пациента составляет около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23 ч, около 24 ч (1 дня), около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 40, около 44 ч, около 48 ч (2 дней), около 54, около 60 ч, около 72 ч (3 дней), около 84 ч, около 96 ч (4 дней), около 108 ч, около 120 ч (5 дней), около 6 дней, около 7 дней (одной недели), около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14 дней.
В конкретном варианте реализации время полужизни химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, примерно в два раза больше, чем время полужизни Ф-VIII дикого типа или Ф-VIII с удаленным В-доменом. В другом варианте реализации изобретения время полужизни химерного белка примерно в три раза больше, чем время полужизни Ф-VIII дикого типа или Ф-VIII с удаленным В-доменом.
В изобретении дополнительно предложен способ лечения или предотвращения заболевания или нарушения, связанного с кровотечением, включающий введение эффективного количества фрагмента ФВ или химерного белка (например, химерного белка, содержащего фрагмент ФВ, связанный с первым гете-рологичным компонентом, например, первой Fc-областью, и белок Ф-VIII, связанный со вторым гетерологичным компонентом, например, второй Fc-областью, где фрагмент ФВ связан или соединен с белком Ф-VIII). В одном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшин-ном пространстве и кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. В конкретном варианте реализации изобретения заболевание или нарушение, связанное с кровотечением, является гемофилией А.
Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что фрагмент ФВ и химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например, описанный в данном тексте фрагмент ФВ, и белок Ф-VIII, изготовленный согласно изобретению, имеют много применений, включая, но не ограничиваясь этим, способы лечения пациента с нарушением гемостатики и способы лечения нуждающегося в общем гемостатическом средстве пациента. В одном варианте реализации изобретение относится к способу лечения пациента с нарушением емостатики, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества фрагмента ФВ или химерного белка.
Часть белка Ф-VIII в составе химерного белка излечивает или предотвращается нарушение гемоста-тики, выполняя роль кофактора фактору IX на негативно заряженной фосфолипидной поверхности, образуя тем самым комплекс Хазы. Связывание активированных факторов свертывания крови с фосфолипид-ной поверхностью локализирует этот процесс на поврежденных участках сосуда. На фосфолипидной поверхности фактор Villa повышает максимальную скорость активации фактора X фактором Ixa приблизительно в 200,000 раз, что приводит к второй большой волне образования тромбина.
Химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например фрагмент ФВ, и белок Ф-
VIII, можно применять для лечения любого нарушения гемостатики. Нарушения гемостатики, которые могут лечиться введением химерного белка, являющегося объектом данного изобретения, включают, но не ограничиваются этим, гемофилию А, а также дефицит или структурные аномалии в отношении фактора VIII. В одном варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является гемофилией А.
Химерный белок, содержащий дополнительный компонент, например фрагмент ФВ, и белок Ф-VIII, можно применять профилактически для лечения пациента с нарушением гемостатики. Химерный белок, являющийся объектом данного изобретения, можно применять для лечения острых случаев кровотечения у пациента с нарушением гемостатики. В другом варианте реализации изобретения нарушение гемостатики может быть результатом дефективности фактора свертывания крови, например фактора Виллебранда. В одном варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является наследственным нарушением. В другом варианте реализации изобретения нарушение гемостатики является приобретенным нарушением. Приобретенное нарушение может являться следствием первопричинного заболевания или состояния. Состоянием, не связанным с заболеванием, в качестве примера, но не ограничения, может являться рак, аутоиммунное заболевание или беременность. Приобретенное нарушение может являться следствием преклонного возраста или медикаментозного лечения первопричинного заболевания (например, химиотерапии при раке).
Изобретение также относится к способам лечения пациента, который не имеет врожденного нарушения гемостатики, но имеет первопричинное заболевание или состояние, которое приводит к появлению нарушения гемостатики, например, вследствие выработки антител к Ф-VIII или хирургической операции. Таким образом, изобретение относится к способу лечения нуждающегося в общем гемостатиче-ском средстве пациента, включающему введение пациенту терапевтически эффективного количества химерного белка, содержащего фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, изготовленного согласно представленным способам.
Настоящее изобретение также относится к способам снижения иммуногенности Ф-VIII или индуцирования меньшей иммуногенности против Ф-VIII, сключающим введение эффективного количества описанного в данном тексте фрагмента ФВ, описанных в данном тексте химерных белков или кодирующих их полинуклеотидов.
В одном варианте реализации изобретения пациенту, нуждающемуся в общем гемостатическом средстве, проводят или собираются проводить хирургическую операцию. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, можно применять до, во время или после хирургической операции в качестве профилактики. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, можно применять до, во время или после хирургической операции для контролирования острых случаев кровотечения.
Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, можно применять для лечения острых случаев кровотечения у пациента без нарушениея гемостатики. Острые случаи кровотечения могут являться следствием тяжелой травмы, например хирургической операции, автомобильной катастрофы, ранения, проникающего огнестрельного ранения или любого травматического происшествия, которое приводит к неконтролируемому кровотечению. Неограничивающие примеры случаев кровотечения включают нарушение свертываемости крови, гемартроз, мышечное кровотечение, кровотечение в полости рта, кровоизлияние, кровоизлияние в мышцы, кровоизлияние в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, кровоизлияние в брюшную полость, внутригрудное кровоизлияние, переломы костей, кровотечение в центральной нервной системе, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве, кровотечение во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любые их комбинации.
При профилактических применениях один или более составов, содержащих химерный белок или фрагмент ФВ, являющиеся объектами данного изобретения, либо их смесь вводят пациенту, у которого еще не наблюдается болезненного состояния, для того, чтобы повысить устойчивость пациента или облегчить симптомы, связанные с заболеванием или нарушением. Такое количество препарата определяется как "эффективная профилактическая доза". При терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая дозировка (например, от 1 до 400 мг/кг полипептида на дозу, при этом дозировки в диапазоне от 5 до 25 мг являются более общеупотребимыми для радиоиммуноконьюгатов и более высокие дозы - для полипептидов, модифицированных цитотоксичными препаратами) при относительно коротких интервалах до того времени, пока прогрессирование заболевания снизится или закончится, и пока у пациента не появятся признаки частичного либо полного уменьшения интенсивности симптомов заболевания. После этого пациент может быть переведен на профилактический режим.
В некоторых вариантах реализации химерный белок, фрагмент ФВ или состав, являющиеся объектами данного изобретения, применяются для лечения по требованию, которое включает лечение случая кровотечения, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве или кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. Пациент может нуждаться в оперативной профилактике, периоперативной терапии
или лечении для осуществления хирургической операции. Такие хирургические операции включают, например, малые хирургические операции, обширные хирургические операции, удаление зубов, тонзи-лэктомию, паховое грыжесечение, синовэктомию, полную замену коленного сустава, краниотомию, ос-теосинтез, травматическую хирургию, внутричерепную хирургию, внутрибрюшинную хирургию, внут-ригрудную хирургию или операции по протезированию суставов.
В одном варианте реализации изобретения химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, вводится внутривенно, подкожно, внутримышечно или через любую слизистую поверхность, например, перорально, подъязычно, буккально, назально, ректально, вагинально или через легочные дыхательные пути. Химерный белок, содержащий фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, может быть находиться в составе или быть связанным с биополимерным твердофазным носителем, что дает возможность медленного высвобождения химерного белка в месте кровотечения, или находиться в составе пропитки бандажа/повязки. Дозировка химерного белка, содержащего фрагмент ФВ и белок Ф-VIII, будет варьироваться в зависимости от пациента и от конкретно применяемого способа введения. Дозировки могут находиться в диапазоне от 0,1 до 100000 мкг/кг массы тела. В одном варианте реализации изобретения диапазон дозировок составляет 0,1-1000 мкг/кг. В другом варианте реализации изобретения диапазон дозировок составляет 0,1-500 мкг/кг. Белок может вводиться в непрерывном режиме или через определенные временные интервалы. Для определения оптимальных диапазонов дозировок и/или графиков введения препаратов можно применять методы in vitro аналитики. Методы in vitro аналитики для измерения активности фактора свертывания крови известны в данной области техники, например это анализ коагулирующей активности VIIa-rTF STA-CLOT или анализ коагулирующей активности РОТЭМ. Вдобавок, эффективные дозировки могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных при испытаниях на жи-вотньгх моделях, например на собаках с гемофилией (Mount et al. 2002, Blood 99(8) 2670).
После детального описания настоящего изобретения его содержание станет более понятным с отсылкой на нижеприведенные примеры, которые включены в данный текст исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают данное изобретение. Все патенты и публикации, упоминаемые в данном тексте, включены в прямой форме посредством ссылки.
Примеры
Во всех примерах, если не указано иное, применяли нижеприведенные материалы и способы. Материалы и способы.
В общем случае в осуществлении настоящего изобретения применяют, если не указано иное, общепринятые методы химии, биофизики, молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК-технологии, иммунологии (в частности, например, технологии антител) и стандартных методов электрофореза; смотрите, например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., CS.H.L. Press, Pub. (1999); и Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
Пример 1. Клонирование различных доменов ФВ (фиг. 1).
(а) Клонирование pSYN^-001, 002, 003 и 004.
pSYN-ФВ от 001 до 004 содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты ФВ, которыми являются аминокислоты 1-276 (001), аминокислоты 1-477 (002), аминокислоты 1-511 (003) и аминокислоты 1-716 (004) белковой последовательности ФВ-D'D3А. Следующая нумерация аминокислот представляет последовательность зрелого ФВ без пропептида и соответствует аминокислотам 7641039 (001), аминокислотам 764-1240 (002), аминокислотам 764-1274 (003) и аминокислотам 764-1479 (004) из SEQ ID NO: 2 соответственно. Все четыре конструкции содержат сигнальный пептид Ф-VIII при N-конце, что делает возможной необходимую секрецию синтезированного белка, за которым следует метка 6xHis при С-конце, которая используется для очистки белка. Вышеприведенные конструкции синтезировали при помощи следующих комбинаций праймеров:
pSYNOB-OOl:
ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC
CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO: 57)
ESC50- Обрати.- ФВ- частичный D'D3 (аминокислоты 1-276) с сайтом 6 His и Notl
TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCAGAGGCACTTTTCTGGTG Т С AG С AC AC Т G ( SEQIDNO: 58)
pSYN ФВ- 002:
ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO: 59) ESC51- Обрати.- ФВ D'D3 (аминокислоты 1-477) с сайтом 6 His и Notl TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCGGCTCCTGGCAGGCTTCA CAGGTGAGGTTGACAAC(SEQIDNO: 60)
pSYT^B- 003:
ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC
CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO: 61)
ESC52- Обратн.-ФВ-Б'БЗ PartialAl (аминокислоты 1-511) с сайтом 6 His и Notl
TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCCTGCTGCAGTAGAAATCG TGCAACGGCGGTTC(SEQIDNO: 62)
pSYN ФВ- 004:
ESC48- Прям. - ФВ-Б'БЗ с сигналом VIII и сайтом BsiWl
TCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGC CTTTTGCGATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQIDNO:63) ESC53-Обрати.- ФВ-БТ)ЗА1 (аминокислоты 1-716) с сайтом 6 His и Notl
TGACCTCGAGCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGGCCCACAGTGACTTGTGCC ATGTGGGG(SEQIDNO: 64)
Предполагается, что белки из конструкций ФВ-001, 002, 003 и 004 существуют в виде мономера.
Реакцию ПЦР проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ESC 48/ESC50, ESC 48/ESC 51, ESC 48/ESC52, ESC48/ESC53 и полноразмерной ФВ-плазмидой в качестве матрицы, используя двухэтапный цикл ПЦР-амплификации: 94°С 2 мин; 21 цикл с (96°С 30 с, 68°С 2 мин). Полосы правильного размера (~960 п.н.о. для ФВ 001; 1460 для ФВ 002, 1520 п.н.о. для ФВ 003; и 2150 п.н.о. для ФВ 004) очищали гелем при помощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) и клонировали в сайты рестрикции BsiWI и Not1 пцДНК 4 для получения pSYN-ФВ 001,002,003 и 004 соответственно.
(б) Клонирование pSYN-ФВ-006.
pSYN-ФВ-006 содержит домен D1D2D'D3-CK (от англ. "cysteine knot") ФВ. Для клонирования этой конструкции использовали синтез фрагмента ДНК, содержащего часть домена D3 и домена CK (Genscript - идентификационный номер последовательности 122026, показано ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепленную BamH1/EcoRV pSYN-ФВ 008, т.е. вектор, кодирующий полноразмерный ФВ.
Genscript-Номер последовательности - 122026 (SEQIDNO: 65)
GGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAGAAACGGGTCACCATCCTGGTG GAG G GAG GAGAGAT T GAG С T GT T T GAC G G G GAG GT GAAT GT GAAGAG G С С CAT GAAG GAT GAGAC T CAC T T TGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGGCAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCC ACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGAT GGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGACCCTGTGGACTTTGGGAACTC CTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATA ACAACAT CAT GAAG СAGAC GAT G GT G GAT T С С T С С T GTAGAAT С С T TAC CAGT GAC GT С T T С CAG GAC T G С AACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGG GGACTGCGCCTGCTTCTGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGTGGTGA CCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGTGT GAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCC
TGTGCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGGATGAGCTTTTGCAGACCT GCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACC TTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCTGTGAAGCCTG CCAGGAGCCGGGAGGCCTGGTGGTGCCTCCCACAGATGCCCCGGTGAGCCCCACCACTCTGTATGTGGATG AGACGCTCCAGGATGGCTGTGATACTCACTTCTGCAAGGTCAATGAGAGAGGAGAGTACTTCTGGGAGAAG AGGGTCACAGGCTGCCCACCCTTTGATGAACACAAGTGTCTTGCTGAGGGAGGTAAAATTATGAAAATTCC AGGCACCTGCTGTGACACATGTGAGGAGCCTGAGTGCAACGACATCACTGCCAGGCTGCAGTATGTCAAGG TGGGAAGCTGTAAGTCTGAAGTAGAGGTGGATATС
(в) Клонирование pSYN-ФВ-009, 010, 011, 012 и 013.
Конструкция pSYN ФВ 008 содержит последовательность полноразмерного ФВ в пцДНК 3.1 (аминокислоты 1-2813 из SEQ ID NO: 2). Она содержит пропептид длиной в 763 аминокислоты (т.е. домены D1D2), за которым следует остальная последовательность из 2050 аминокислот зрелого ФВ. pSYN-ФВ-009, 010, 011 и 012 содержат одинаковые кодирующие последовательности как и ФВ 001, 002, 003 и 004 соответственно, но дополнительно содержат домены D1D2 (пропептида ФВ) при N-конце вместо сигнального пептида Ф-VIII. pSYN ФВ 008 содержит сайт BamH1 в Arg907 и сайт Not1 в конце кодирующей области (после стоп-кодона). pSYN-ФВ-008, 001, 002, 003 и 004 расщепляли рестрикционными ферментами BamH1 и Not1. Вставки из pSYN-ФВ-001 (423 п.н.о.), pSYN-ФВ-002 (1026 п.н.о.), pSYN-ФВ-003 (1128 п.н.о.) и pSYN-ФВ-004 (1743 п.н.о.) были лигированы в расщепленную bamH1/Not1 pSYN-ФВ-008 (8242 п.н.о.), чтобы получить pSYN-ФВ-009 (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1039 из SEQ ID NO: 2); pSYN-ФВ-010 (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1240 из SEQ ID NO: 2); pSYN-ФВ-011 (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1274 из SEQ ID NO: 2); pSYN-ФВ-012 (D1D2D'D3: аминокислоты 1-1479). Все 4 конструкции содержат метку 6xHis при С-конце. В трансфицированных клетках pSYN-ФВ-009, 010, 011 и 012 синтезируются с пропептидом, но вследствие внутриклеточного процессинга секретируемые продукты не содержат про-пептид (D1D2). Белок, экспрессируемый из конструкции ФВ-009, существует в виде мономера, а белки, экспрессируемые из конструкции ФВ-010, 011 и 012, как предполагается, существуют в виде димеров, как показано на фиг. 6 и 7, где в качестве приверов взяты соответственно ФВ-009 и ФВ-010.
pSYN-ФВ^Ю использовали для получения pSYN-ФВ^О, которая содержит две точечные мутации в С336А и С379А, соответствующие SEQ ID NO: 73 (нумерация аминокислот представляет последовательность зрелого ФВ без ФВ последовательности 2 доменов D1D2). Эти мутации должны предотвращать димеризацию домена D'D3 ФВ.
(г) Клонирование pSYN-ФВ-025 и 029.
pSYN-ФВ-025 содержит D1D2D'D3 последовательности дикого типа полноразмерного ФВ в векторе pLIVE, в то время как pSYN-ФВ-029 содержит домены D1D2D'D3 с мутациями С336А/С379А в векторе pLIVE. Для клонирования pSYN-OB-025 и 029 использовали следующие комбинации праймеров: ESC 89-прям. с сайтом Nhe 1=С Т С AC Т AT AG G GAGAC С CAAG С T G G С TAG С С G( SEQIDNO:
66)
ESC 91-обрати, с Sail=
CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG(SEQIDNO: 67) Реакцию ПЦР проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ESC 89/ESC91 и плазмидами pSYN-ФВ-010 (для pSYN-ФВ-025) или pSYN-ФВ-013 (для pSYN-ФВ-029) в качестве матрицы, используя трех-этапный цикл ПЦР-амплификации: 94°С - 2 мин; 21 цикл с (96°С - 30 с, 55°С - 30 с, 68°С - 4 мин). Полосу с ожидаемым размером (~3800 п.н.о.) очищали гелем при помощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) и клонировали в рестрикционные сайты Nhe1 и Sal1 вектора pLIVE-Mirus (Инвитро-ген, Карлсбад, Калиф.) для получения pSYN-ФВ-025 и 029.
(д) Клонирование pSYN-ФВ-031.
pSYN-ФВ-031 является D1D2D'D3(C336A/C379A)-Fc конструкцией, котораясодержиттромбин-отщепляемыйлинкердлинойв 48 аминокислот (8x GGGGS (SEQ ID NO: 110) + тромбин-сайт) междупос-ледовательностямиФВ D1D2D'D3(C336A/C379A) и Fc. Для создания этой конструкции область ФВ-Fc амплифицировали из конструкции pSYN^-VIII-064 (смотрите нижеприведенную конструкцию Ф-VIII-ФВ). pSYN-Ф-VШ-ФВ расщепляли Xba1 и Nhe1. Полученную область вставки в 4165 п.н.о., содержащую фрагмент ФВ и Fc-область, использовали в качестве матрицы для амплификации ФВ и Fc-области при помощи комбинаций праймеров LW 22/LW23.
LW 22-ПРЯМ.-ФВ-0'ВЗ с сигнальными последовательностями ФУШ и сайтом BsiWl
GCGCCGGCCGTACGATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGC GATTCTGCTTTAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATG(SEQroNO: 68)
LW 23-Обратн.- Fc со стоп-кодоном и сайтом Notl
TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC(SEQIDNO: 69)
Нуклеотидная последовательность ФВ 031 (SEQIDNO: 108)
ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTT
GCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC
101
GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATG
151
TACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA
201
ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCC
251
TCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT
301
ACСGTGACACAGGGGGACСAAAGAGTСTССATGСССTATGССТССAAAGG
351
GCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT
401
ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTG
451
Т СAGACAGATАС Т Т СAACAAGAC CTGCGGGCTGTGTGG СAAC Т Т Т AACAT
501
С Т Т Т G С Т GAAGAT GAC Т Т TAT GAC С СAAGAAG GGACCTTGACCTCGGACC
551
CTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT
601
GAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAAT
651
GCAGAAGGGCCTGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGT
701
TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGT
751
GAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC
801
CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACG
851
GCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG
901
TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACAT
951
CAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG
001
GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGC
051
GTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG
101
С ААС АС С Т G CAT Т Т G С С GAAAC AG С CAGT G GAT С T G CAG CAAT GAAGAAT
151
GTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC
201
AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGA
251
TTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG
301
ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGC
351
CTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA
401
TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGC
451
ATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG
501
GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGC
551
CGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG
601
ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGG
651
AACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG
701
CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGT
751
GCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC
801
UUGUTGCCUTAUUTGCGGAAUTGUCGtJTAUGAUGTGTGUTUUTGCTUGGA
851
CGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG
901
CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTG
951
AACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT
001
GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCC
051
TGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC
101
TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCA
151
G С СAGAAGACAT С T T С T СAGAC CAT СACAC CAT GTGCTACTGTGAGGAT G
201
GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGAC
251
GCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTG
301
TCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTG
351
AAGGGCTCGAGTGTAC СAAAAC G T G С СAGAAC TAT GAC С T G GAGT GCAT G
401
AGCATGGGCTGTGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCA
451
TGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCA
501
AGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTC
551
T GT С GGGACСGGAAGT GGAACT GCACAGAC CAT GT GT GT GAT GCCACGT G
601
CTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACC
651
TGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGT
701
AACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCC
751
С T CAGT GAAAT G СAAGAAAC G G G T CAC CAT С С T G GT G GAG G GA GGAGAGA
801
TTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAG
851
ACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGG
901
CAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCC
951
T GAAGCAGACATACCAGGAGAAAGT GT GT GGC CT GT GT GGGAAT TTT GAT
001
G G CAT С СAGAACAAT GAC С T СAC CAG CAG СAAC С T С CAAG T G GAG GAAGA
3 051 CCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACA
3101 CCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATC
3151 AT GAAG СAGAC GAT G GT G GAT T С С T С С T GTAGAAT С С T TAC CAGT GAC GT
32 01 CTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCT
32 51 GCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCGCATTC
33 01 TGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGT
3351 GGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGA
34 01 ATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGGCTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCA
34 51 CCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGT
35 01 GCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGG
3551 ATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAG
3 601 GTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAG
3 651 TGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCT
37 01 GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGG
3751 GGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATC
3 8 01 CGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCG
3 8 51 GTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCA
3 9 01 GAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGA
3 951 CACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACG
4 0 01 TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG
4 051 GAG GT G С AT AAT G С С AAGAC AAAG С С G С G G GAG GAG С AGT AC AAC AG CAC
4101 GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG
4151 GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC
42 01 GAGAAAAC CAT С T С СAAAG С СAAAG G G CAG С С С С GAGAAC СACAG GT GTА
42 51 CACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
4 3 01 CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG
4 351 AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGA
4 4 01 CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCA
4 4 51 GGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG
4 5 01 CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Белковая последовательность ФВ 031 (SEQIDNO: 109)
1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC
2 01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC
2 51 E KT L С E CAG G L E CAC PAL L E YART СAQ E GMVL Y GWT DHSACSPVC PAGME
301 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC
351 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD
401 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHS FSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD
7 01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECM
8 01 SMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCV
851 CRDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGS
901 NPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDE
951 THFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFD
10 01 GIQNNDLTS SNLQVEEDPVDFGNSWKVS SQCADTRKVPLDS S PATCHNNI
1051 MKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCAAF
1101 CDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYEAEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE
12 01 VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEPISGGGGSGGG
12 51 GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAP
1301 ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
1351 EVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
14 01 EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE
14 51 SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
1501 HNHYTQKSLS LSPGK*
Конструкция ДНК
Линкер между ФВ Fc
ФВ035
73 ак= IS{11X(GGGGS)}LVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 96)
ФВ036
98 ак= IS{16X(GGGGS)}LVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 97)
ФВ= D'D3 (ак 1-477 с С336А/С379А)
Продукт ПЦР, полученный амплификацией LW22/LW23 (~2300 п.н.о.) клонировали в расщепляемую BsiW1/Not1 pSYN-ФВ-002 для получения промежуточного продукта pSYN-ФВ-014. pSYN-ФВ-014 содержит 20-аминокислотный тромбин-отщепляемый линкер между сигнальным пептидом Ф-VIII и D'D3, за которым следует Fc-область.
Для создания конструкции D1D2D'D3-Fc область D1D2D'D3 амплифицировали обычным ПЦР-методом из pSYN-OB-013, используя комбинацию праймеров LW24/LW27.
LW24- Прям.- ФВ D1D2D'D3 клонирующий олиго с сайтом BsiWl
GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG(SEQmNO: 70)
Ь\У27-Обратн.-ФВ DT> 3 олигосЕсоЯУ
CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ ГО N0:71) Продукт ПЦР, полученный амплификацией LW22/LW23 (-3750 п.н.о.) клонировали в расщепляемую BsiW1/EcoRV pSYN-ФВ-014 для получения промежуточного продукта pSYN-ФВ-015. Длина линкера между фрагментом ФВ и Fc-областью изменили, чтобы получить pSYN-ФВ-031. Белковая последовательность полноразмерного ФВ приведена в табл. 1.
Белковая последовательность OB-DlD2D'D3 16 (SEQIDNO: 72)
1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC
2 01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC
2 51 E KT L С E CAGGL E CAC PAL L E YART CAQ E GMVL YGWT DH SAC S PVC PAGME
301 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC
351 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD
4 01 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHS FSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD
7 01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD
7 51 AVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECM
8 01 SMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCV
8 51 CRDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGS
9 01 NPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDE 951 THFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFD
10 01 GIQNNDLTS SNLQVEEDPVDFGNSWKVS SQCADTRKVPLDS S PATCHNNI
1051 MKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACF
1101 CDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCA
1151 PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE
12 01 VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEP*
Белковая последовательность ФВ-БГОЗ 2 (SEQIDNO: 73)
1 SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPG
51 MVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCRDRKWNCTDHVC
101 DATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKG
151 CSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNVKRPMKDETHFEWESGRYII
2 01 LLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFDGI QNNDLTS SNLQ
2 51 VEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRIL
301 TSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQ
351 HGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPL
4 01 ACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVT
451 LNPSDPEHCQICHCDWNLTCEACQEP
Пример 2. Гетеродимерные конструкции, содержащие Ф-VIII-Fc и ФВ^^3 домен при аминоконце второй цепи Fc (гетеродимер ФЛ^Ш-ФВ^, фиг. 2).
(а) Клонирование pSYN^-VIII-064.
Плазмида Ф-VШ-064 содержит одноцепочечный остов FC (scFc) с сайтами расщепления ферментами, которые процессируются во время синтеза в клетке. Конструкция содержит Ф^Ш-связывающий домен полноразмерного ФВ (D'D3).
Плазмида (pSYN^-VIII-064) была сконструирована для экспрессии гетеродимера Ф-VIII-Fc и ФВ-Fc, в котором домены D'D3 предназначены для связывания Ф-VIII и предотвращения взаимодействия Ф-VIII с фосфолипидами и активированным протеином С и/или предотвращения или подавления связывания с эндогенным ФВ. Белок из pSYN^-VIII-064 экспрессируется в клетке в виде одиночного полипептида, где С-конец субъединицы Ф-VIII-Fc связан с N-концом субъединицы ФВ D'D3-Fc посредством полипептидного линкера 6x (GGGGS) (SEQ ID NO: 74). Дополнительно в 5'- и 3'-концы полипептидного линкера были вставлены последовательности RRRRS (SEQ ID NO: 75) и RKRRKR (SEQ ID NO: 76) соответственно для внутриклеточного расщепления пропротеинконвертазами сразу после последнего Arg в каждой последовательности. Следовательно, клетки могут экспрессировать двухцепочечный гетероди-мер Ф^т^ШТО^, в котором цепь Ф-VIII-Fc содержит последовательность RRRRS (SEQ ID NO: 75) в С-конце, но при это остаток последовательности линкера удален. Другой полипептидный линкер 3x (GGGGS) (SEQ ID NO: 28) вместе с сайтом расщепления тромбином вставляли между доменами ФВ и Fc-областью для того, чтобы способствовать отделению фрагмента ФВ от Ф-VIII в случае активации ге-теродимерного белка Ф-"УТП-ФВ тромбином, которая делает возможным взаимодействие Ф-VIII с другими факторами свертывания крови.
Проводили синтез фрагментов ДНК, содержащих часть первой Fc-области, за которой следует 6x (GGGGS) (SEQ ID NO: 74), домен ФВ-DD domain (ак 1-477; мутация С336А/С379А), 3x (GGGGS) (SEQ ID NO:28), сайт расщепления тромбином и часть второй Fc-области (Genscript-номер последовательности 103069, показана ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую SalI/RsRII pSYN^-VIII-049, которая являетсяконструкцией Ф-VIII-Fc с отщепляемым линкером между двумя Fc-доменами. Genscript-номер последовательности 103069 (SEQ ID NO: 82):
CCGTCGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACGGCGCCGCCGGAGCGGTGGCGGCGGATCAGG TGGGGGTGGATCAGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGGGGTGGAT CAAGGAAGAGGAGGAAGAGAAGCCTATCCTGTCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAAC CTGCGGGCTGAAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATGAGCATGGGCTG TGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCATGAGAATCGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTC CCTGCTTCCATCAGGGCAAGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTCTGT CGGGACCGGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTGCTCCACGATCGGCATGGCCCACTA CCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACCTGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCG GCAGTAACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCCCTCAGTGAAATGCAAG AAACGGGTCACCATCCTGGTGGAGGGAGGAGAGATTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCC CATGAAGGATGAGACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGGCAAAGCCC TCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCCTGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGT GGCCTGTGTGGGAATTTTGATGGCATCCAGAACAATGACCTCACCAGCAGCAACCTCCAAGTGGAGGAAGA CCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACACCAGAAAAGTGCCTCTGGACT CATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATCATGAAGCAGACGATGGTGGATTCCTCCTGTAGAATCCTTACC AGTGACGTCTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCTGCATTTACGACAC CTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCGCATTCTGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTG CCCAGCATGGCAAGGTGGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGAATCTC CGGGAGAACGGGTATGAGGCTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCACCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCA CCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGTGCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCC TGGATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAGGTGGCTGGCCGGCGTTTT GCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAGTGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGT CAACCTCACCTGTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATCGATGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCCTGG TCCCCCGGGGCAGCGGAGGCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGA CCGTCA
(б) Клонирование pSYN^-VIII-065.
Плазмида Ф-VШ-065 содержит первые 276 аминокислот домена D'D3 ФВ, присоединенные ко второй Fc-области. Фрагмент ФВ амплифицировали при помощи ПЦР из полноразмерной плазмиды pSYN-ФВ-008, используя комбинации праймеров ESC17 и ESC41.
Е8С17-Прям.- ФВ клонирующий олиго с Clal GTCCGGCATGAGAATCGATGTGTG(SEQIDNO: 77)
ESC41- Обрати.-ФВ с EcoRV
С С Т С С АС С G С С AGAT AT С AGAG G CAC T T T T С (SEQ ГОЖ): 78) Полосу с ожидаемым размером (~692 п.н.о.) очищали гелем при помощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) и клонировали в сайты Cla1 и EcoRV pSYN^-VIII-064 для получения pSYN^-VIII-065.
Пример 3. Клонирование pSYN^-VIII-159, 160, 178, 179 (фиг. 3).
С целью изменения длины линкера между фрагментом ФВ и Fc-областью в месте соединения ФВ и начала 20-аминокислотного линкера в pSYN^-VIII-064 вставляли сайт EcoRV, затем линкеры переменной длины использовали для замещения 20-ак линкера в pSYN^-VIII-064. Новыми конструкциями ДНК являются: pSYN^-VIII-159, 160, 178 и 179, которые содержат 35-ак, 48-ак, 73-ак и 98-ак линкеры соот-вественно.
Для того чтобы вставить 35-аминокислотный линкер в pSYN^-VIII-159 были заказаны два олиго (ESC78 - 105 п.н.о. и ESC79 - 107 п.н.о.) от Integrated DNA Technologies, Inc (Коралвилль, Айова). Олиго ренатурировали и продлевали при помощи стандартного метода ПНР.
Праймеры:
ESC78- Прям, с сайтом EcoRV
7A7AAGTGCCTCTGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGG GGATCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGG (SEQ Ш NO: 79)
ESC79- Обрати, с сайтом RsRII
GAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGT GTGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCCAC (SEQ ГО NO: 80)
Реакцию ПЦР по ренатурированию и продлению олиго проводили в 50 мкл с комбинациями праймеров ESC78/ESC79, используя трехэтапный цикл ПЦР-амплификации: 25 циклов с (96°С 30 с, 55°С 30 с, 68°С 30 с).
Полосу с ожидаемым размером (~186 п.и.о.) очищали гелем при помощи Gel Extraction kit (Киаген (Qiagen), Валенсия, Калиф.) и клонировали в рестрикционные сайты EcoRV и RsRII pSYN^-VIII-064 для получения pSYN^-VIII-159.
(б) Клонирование pSYN^-VIII-160, 178 и 179.
pSYN-VIII-160 содержит 48-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 48-аминокислотный линкер
(ISGG
GGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS LVPRGS GGGGS GGGGS) (SEQ Ш NO: 81) и часть FoC^jmCITi (Geiiscrip^
Последовательность номер-132601, показана ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^-VIII-0159 (упомянуто выше). Genscript-Последовательность номер-132601 (SEQ ID NO: 83)
AAAGTGCCTCTGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGG AGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGAGGTTCCG GTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCA GTCTTCC
SYN-VIII-178 содержит 73-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 73-аминокислотный линкер
{ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVP RGSGGGGSGGGGS) (SEQ Ш NO: 84) и часть Fc-области (Genscript-Последовательность номер-144849, показано ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^-VIII-0159 (упомянуто выше). Genscript-Последовательность номер-144849 (SEQ ID NO: 85)
GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGG TGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCG GCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGGTGGA GGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCCCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGA CCGTCAGTCTTCCTC
SYN-VIII-179 содержит 98-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 98-аминокислотный линкер
(ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPKGSGGGGSGGGGS) (SE() ш NQ. 86) и
часть Fc-области (Genscript-Последовательность номер-144849, показано ниже). Фрагмент конструкции Genscript субклонировали в расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^-VIII-0159 (упомянуто выше).
Genscript-Последовательность номер-144849 (SEQ ID NO: 87)
GCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGG TGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCG GCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGT TCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCCTGGTCCCCCGGGGCAGCGGCGG TGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGG GCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC
Клонирование pSYN^-VIII-180, 181 и 182.
pSYN^-VIII-180, 181 и 182 получали из pSYN^-VIII-160. В pSYN^-VIn-160FVIn в домен C1 Ф-VIII вносили мутации К2093А или F2093A или K2093A/F2093A для создания соответственно pSYN-Ф-VIII-180, pSYN^-VIn-181 и pSYN^-VIII-182.
Белковая последовательность гетеродимера Ф-VШ-ФВ-Fc (SEQ ID NO: 88) (аминокислотные позиции 1-1457 последовательности Ф-VIII; область, выделенная подчеркиванием, представляет Fc-область; выделение подчеркиванием волнистой линией представляет отщепляемый линкер между первой Fc-областью и фрагментом ФВ; выделенная двойным подчеркиванием область представляет фрагмент ФВ; выделенная жирным шрифтом область представляет отщепляемый линкер переменной длины между фрагментом ФВ и Fc. Длина линкера отличается для конструкций Ф-УШ-064, 159, 160, 178 и 179).
1 MQIELSTCFF LCLLRFCFSA TRRYYLGAVE LSWDYMQSDL GELPVDARFP
51 PRVPKSFPFN TSWYKKTLF VEFTDHLFNI AKPRPPWMGL LGPTIQAEVY
101 DTWITLKNM ASHPVSLHAV GVSYWKASEG AEYDDQTSQR EKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVL KENGPMASDP LCLTYSYLSH VDLVKDLNSG LIGALLVCRE
2 01 GSLAKEKTQT LHKFILLFAV FDEGKSWHSE TKNSLMQDRD AASARAWPKM
251 HTVNGYVNRS LPGLIGCHRK SVYWHVIGMG TTPEVHSIFL EGHTFLVRNH
301 RQASLEISPI TFLTAQTLLM DLGQFLLFCH ISSHQHDGME AYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNE EAEDYDDDLT DSEMDWRFD DDNSPSFIQI RSVAKKHPKT
4 01 WVHYIAAEEE DWDYAPLVLA PDDRSYKSQY LNNGPQRIGR KYKKVRFMAY
451 TDETFKTREA IQHESGILGP LLY'GEVGDTL LIIFKNQASR PYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRL PKGVKHLKDF PILPGEIFKY KWTVTVEDGP TKSDPRCLTR
551 YYSSFVNMER DLASGLIGPL LICYKESVDQ RGNQIMSDKR NVILFSVFDE
601 NRSWYLTENI QRFLPNPAGV QLEDPEFQAS NIMHSINGYV FDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILS IGAQTDFLSV FFSGYTFKHK MVYEDTLTLF PFSGETVFMS
701 MENPGLWILG CHNSDFRNRG MTALLKVSSC DKNTGDYYED SYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRS FSQNPPVLKR HQREITRTTL QSDQEEIDYD DTISVEMKKE
801 DFDIYDEDEN QSPRSFQKKT RHYFIAAVER LWDYGMSSSP HVLRNRAQSG
851 SVPQFKKWF QEFTDGSFTQ PLYRGELNEH LGLLGPYIRA EVEDNIMVTF
901 RNQASRPYSF YSSLISYEED QRQGAEPRKN FVKPNETKTY FWKVQHHMAP
951 TKDEFDCKAW AYFSDVDLEK DVHSGLIGPL LVCHTNTLNP AHGRQVTVQE
1001 FALFFTIFDE TKSWYFTENM ERNCRAPCNI QMEDPTFKEN YRFHAINGYI
1051 MDTLPGLVMA QDQRIRWYLL SMGSNENIHS IHFSGHVFTV RKKEEYKMAL
1101 YNLYPGVFET VEMLPSKAGI WRVECLIGEH LHAGMSTLFL VYSNKCQTPL
1151 GMASGHIRDF QITASGQYGQ WAPKLARLHY SGSINAWSTK EPFSWIKVDL
1201 LAPMIIHGIK TQGARQKFSS LYISQFIIMY SLDGKKWQTY RGNSTGTLMV
1251 FFGNVDSSGI KHNIFNPPII ARYIRLHPTH YSIRSTLRME LMGCDLNSCS
1301 MPLGMESKAI SDAQITASSY FTNMFATWSP SKARLHLQGR SNAWRPQWN
1351 PKEWLQVDFQ KTMKVTGVTT QGVKSLLTSM YVKEFLISSS QDGHQWTLFF
1401 QNGKVKVFQG NQDSFTPWN SLDPPLLTRY LRIHPQSWVH QIALRMEVLG
LNGKEYKCKV
SNKALPAPIE
KTISKAKGQP
REPQVYTLPP
SRDELTKNQV
SLTCLVKGFY
PSDIAVEWES
NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS
FFLYSKLTVD
KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH
NHYTQKSLSL
SPGKRRRRSG
JS^SGGGGSG
GGGSGJSGJiSG^
JjGGS"iGiiSP^
KRRKRSLSCR
PPMVKLVCPA
DNLRAEGLEC
TKTCQNYDLE
CMSMGCVSGC
LCPPGMVRHE
NRCVALERCP
CFHQGKEYAP
GETVKIGCNT
CVCRDRKWNC
TDHVCDATCS
TIGMAHYLTF
DGLKYLFPGE
COYVLVODYC
GSNPGTFRIL
VGNKGCSHPS
VKCKKRVTIL
VEGGEIELFD
GEVNVKRPMK
DETHFEWES
GRYIILLLGK
ALSWWDRHL
SISWLKOTY
QEKVCGLCGN
FDGIQNNDLT
SSNLQVEEDP
VDFGNSWKVS
SQCADTRKVP
LDSSPATCHN
NIMKQTMVDS
SCRILTSDVF
QDCNKLVDPE
PYLDVCIYDT
CSCESIGDCA
AFCDTIAAYA
HVCAQHGKW
TWRTATLCPQ
SCEERNLREN
GYEAEWRYNS
CAPACOVTCO
HPEPLACPVO
CVEGCHAHCP
PGKILDELLO
TCVDPEDCPV
CEVAGRRFAS
GKKVTLNPSD
PEHCOICHCD
WNLTCEACO
EPIDGGGGSG
GGGSLVPRGS
GGDKTHTCPP
CPAPELLGGP
SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE
VTCVWDVSH
EDPEVKFNWY
VDGVEVHNAK
TKPREEQYNS
TYRWSVLTV
LHQDWLNGKE
YKCKVSNKAL
PAPIEKTISK
AKGQPREPQV
YTLPPSRDEL
TKNQVSLTCL
VKGFYPSDIA
VEWESNGQPE
NNYKTTPPVL
DSDGSFFLYS
KLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVM
HEALHNHYTQ
KSLSLSPGK
14 51 CEAQDLYDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW
1501 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW 1551 1601 1651 1701 1751 1801 1851 1901 1951 2001 2051 2101 2151 2201 2251 2301 2351 2401
Пример 4. Пример ДНК-конструкций ФЛлИ-ФВ (фиг. 4).
Фрагмент ФВ и белок Ф-VIII могут быть связаны вместе посредством линкера или другого белка, или полипептида при помощи общепринятых рекомбинантных ДНК-технологий, как показано на фиг. 4. На фиг. 4 А домен D1D2D'D3 ФВ связан с белком Ф-VIII посредством 48-ак линкера -ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 89)и защищает Ф-VIII от преждевременного выведения. Для того чтобы дополнительно увеличить Ф^Ш-защитную активность D'D3 в конструкцию можно включить другой белок или полипептид, который обладает свойством продления времени полужизни, такой как альбумин или последовательность PAS (гетерологичные
компоненты). Гетерологичный компонент, например белок альбумина или последовательность PAS, можно вносить в различные позиции молекулы Ф-VIII; несколько примеров показано на фиг. 4Б-4Г: в N-конце Ф-VIII (4Б), в С-конце Ф-VIII (4В) или в В-области (4Г). В этих конструкциях дополнительные белковые последовательности могут увеличить защитную активность D'D3 и дополнительно продлить время полужизни Ф-VIII.
Вдобавок, гетерологичный компонент, например альбумин или последовательность PAS, также можно вносить в гетеродимерные конструкции.
Ф-VIII/ФВ как показано на фиг. 4Д-4Ж. На фиг. 4Д гетерологичный компонент, например альбумин или последовательность PAS, внесен в В-доменную область Ф-VIII, белка Ф-VIII-148; на фиг. 4Е гетеро-логичный компонент, например альбумин или последовательность PAS, внесен в В-доменную область Ф-VIII, белка Ф-VIII-136; на фиг. 4Ж гетерологичный компонент, например альбумин или последовательность PAS, используется в качестве линкера для соединения фрагмента D'D3 и Fc. Ожидается, что в этих конфигурациях общий эффект от D'D3, Fc и гетерологичного компонента, который является продлевающим время полужизни веществом (например, альбумин/последовательность PAS), отразится на продлении времени полужизни Ф-VIII.
Пример 5. Плазмидное конструирование системы котрансфекции для гетеродимера Ф-VIIIFc-ФВ (фиг. 5).
Для получения гетеродимера Ф-VIIIFc-ФВ создавали систему котрансфекции, которая содержит три конструкции ДНК. Первая конструкция ДНК - pSYN^-VIII-155 - кодирует слитый белок Ф-VIII-Fc, в котором одноцепочечный белок Ф-VIII напрямую сшит с одиночным фрагментом Fc, a второй конструкцией ДНК является pSYN-ФВ-031, которая кодирует слитый белок D'D3-Fc (упомянутый выше в примере 1). Клетки HEK293F трансфицировали двумя плазмидами совместно с третьей плазмидой (РС5) в соотношении 80:15:5. Котрансфекцию РС5 проводили для того, чтобы точно обеспечить полный про-пептидный процессинг областей D1 и D2, чтобы в итоге получить зрелые домены D'D3. Синтезированные белки секретировались в виде гетеродимера Ф-VIIIFc/D'D3Fc и гомодимера D'D3Fc, после чего гете-родимер Ф-VIIIFc/D'D3Fc отделяли от гомодимера D'D3Fc при помощи очистки белка.
Последовательность зрелого белка pSYN-0-VIII-155 (SEQ ID NO: 90)
ATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGL LGPTIQAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLK ENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETK NSLMQDRDAASARAWPKMHTWGYWRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEM DWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKH LKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMS DKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYI LSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSS CDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKAHQAEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKE DFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQP LYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFW KVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKS WYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFS GHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASG HIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQF IIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLN SCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGV TTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVWSLDPPLLTRYLRIHPQSWV HQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Последовательность ДНК pSYN-0-VIII-155 DNA (SEQ ID NO: 91)
ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATA CTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAA GATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTA GAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCAT CCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATG CTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAA GAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAAT GGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAG GCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAA TTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCA GGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTC TGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAA GTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTC GCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCT CTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGA AT GAAAAATAAT GAAGAAG С G GAAGAC TAT GAT GAT GAT С T TAC T GAT T С T GAAAT G GAT GT G GT СAG GT T TGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTAC ATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTAT AAAAGT СAATAT T T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAG T С С GAT T TAT G G СATA CACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG С TAT T CAG CAT GAAT CAG GAAT С T T G GGAC С T T TAC T T TAT G GG GAAGT T G GAGAC AC AC T GT T GAT TAT AT T T AAGAAT CAAG CAAG CAGAC С AT AT AAC AT С T AC С С T CAC GGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCC AAT T С T G С CAG GAGAAATAT T СAAATATAAAT G GACAGTGACT GTAGAAGAT GGGCCAACTAAAT CAGAT С CTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGC CCT CT CCT CAT CT GCTACAAAGAAT CT GTAGAT CAAAGAGGAAACCAGATAATGT CAGACAAGAGGAAT GT CATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCA AT С CAG С T G GAGT G CAG С T T GAG GAT С СAGAGT T С CAAG С С T С СAACAT CAT G CACAG CAT CAAT G G С TAT GTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGC ACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACAC TCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGG T G С СACAAC T CAGAC T T T С G GAACAGAG G CAT GAC CGCCTTACT GAAG GT TTCTAGTTGT GACAAGAACAC T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T CAG СATAC T T G С T GAGTAAAAACAAT G С CAT T GAAC CAAGAAGCTTCTCTCAAAACCCACCAGTCTTGAAAGCCCATCAGGCGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAG T CAGAT СAAGAG GAAAT T GAC TAT GAT GATAC СATAT СAGT T GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GACAT T TA T GAT GAG GAT GAAAAT СAGAG С С С С С G CAG С Т Т Т СAAAAGAAAACAC GACAC ТAT Т Т ТAT Т G С Т G CAGT G G AGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTC CCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGA AC ТAAAT GAACAT Т Т G G GAC TCCTGGGGC СATATATAAGAG СAGAAGT T GAAGATAATAT CAT G GTAAC T T TCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAA GGAG СAGAAC С TAGAAAAAAC T T T GT CAAG С С TAAT GAAAC СAAAAC TTACTTTT GGAAAGT G СAACAT СA TATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAG ATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGA CAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGA AAATAT G GAAAGAAAC T G CAG GGCTCCCTG СAATAT С CAGAT G GAAGAT С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С GCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATT CGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCAC TGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAA TGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGC
ACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTT T CAGAT TACAG С T T CAG GACAATAT G GACAGT G G G С С С СAAAG С Т G G С СAGACT Т CAT TAT Т С С G GAT САА TCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCAC GGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAG TCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATG TGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCA ACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCC AT Т G G GAAT G GAGAGTAAAG СAATATCAGAT GCACAGATTACT GCT Т CAT С CTACT TTACCAATAT GTTTG CCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAAT AAT С СAAAAGAGT G G С T G СAAGT G GAC T T С СAGAAGACAAT GAAAG T СACAG GAG TAAC TACT CAG G GAGT AAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGA CTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAAC TCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCT GAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCC CGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTG TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAA
Ниже перечислены дополнительные сконструированные фрагменты ФВ и гетеродимеры Ф-VIIIFC-
ФВ.
Фрагменты ФВ и гетеродимерные конструкции Ф-УШ/ФВ
pSYN-VWF-025
D1D2D'D3 -область (1-477 ак, 6xHis) в pLPVE
pLPVE
pSYN-VWF-029
D1D2D'D3-область (1-477 ак, С336АУС379А, 6x His) в pLIVE
pLPVE
pSYN-VWF-030
Сигнальный пептид <ЈVIII-D'D3 (1-477ак, C336A/C379A)-
одиночная Fc с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина
pcDNA 4
pSYN-VWF-031
D1D2D'D3 (1-477ак, С336А/С379А)- одиночная Fc с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина
pcDNA 4
pSYN-VWF-032
Сигнальный пептид <1)VIII-D'D3 (1-477ак, ДТ)- одиночная
Fc с 48ак линкером, содержащим сайт тромбина
pcDNA 4
pSYN-VWF-033
Сигнальный пептид <1)VIII-D'D3 (1-477ак, ДТ)- одиночная
Fc с 35ак линкером, содержащим сайт тромбина
pcDNA 4
FVIII
pSYN-FVIIF055
УВД-ФУШ оцРс с R336I и Y1680F
pBUD
pSYN-FVIIF056
УВД-ФУШ оцРс с R336I, R562 и Y1680F
pBUD
pSYN-FVIII-057
УВД-ФУШ OHFC С Y1680F
pBUD
pSYN-FVIIF058
УВД-ФУШ OHFC С S488A
pBUD
pSYN-FVIIF059
УВД-ФУШ оцРс с R336I, R562K, S488A
pBUD
pSYN-FVIIF060
УВД-ФУШ OHFC С R336I, R562K, Y1680F
pBUD
pSYN-FVIII-061
\ -1 Л Т I .1. \ 'III I ¦ _ ППУТ I ^ _- f ~1 I ' I ¦ 11111 \ Л - 1 f 1) / \ i ¦
у СД-Ф v ш оцгс с KJ)^OI, KJOZJV, дч-оо/\, i юоиг
pBUD
pSYN-FVIII-064
УВД-ФУШ отщепляемая OHFC С ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ DD3 (1-276ак) на
pSYN-FVIIF065
второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIIF083
УВД-ФУШ оцРс с R336I, S488A,R562K, Y1680F, E1984V
pBUD
pSYN-FVIIF086
УВД-ФУШоцРсс 6x(GGGGS) линкероммеждуС2 ФУШиРс
pBUD
pSYN-FVIII-095
УВД-ФУШ оцРс с S104C, R562K,Y1680F, G1960C
pBUD
pSYN-FVIII-101
УВД-ФУШ онрс из ФУШ-041 в пцДНК 3.3. Торо
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIIF102
УВД-ФУШ (M662C/D1828C для дисульфидной связи; АРС мутации расщепления R336PR562K; вместе с мутацией Y1680F для связывания ФВ)
pBUD
pSYN-FVIIF103
УВД-ФУШ оцРс (Y662C/T1828C)
pBUD
pSYN-FVIIF104
УВД-ФУШ оцРс (G655C/ST1788C)
pBUD
pSYN-FVIH-113
УВД-ФУШ (R490A/H497A) отщепляемая оцРс с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIII-114
УВД-ФУШ (R490A/H497A) отщепляемая онрс с ФВ D'D3 (1-276) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIIF126
УВД-ФУШ OHFC (M662C/D1828C)
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIIF127
УВД-ФУШ оцРс (M662C/D1828C для дисульфидной связи; АРС мутации расщепления R336FR562K; вместе с мутацией Y1680F для связывания ФВ)
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIIF128
УВД-ФУШ оцРс (Y664C/T1826C)
pcDNA3.3 Topo
мутация R336I R562K R490A Н497А N1224A на фоне
pSYN-FVIII-129
pSYN-VIII-64
pBUD
мутация R336I R562K R490A Н497А N1224A на фоне
pSYN-FVIII-130
pSYN-VIII-65
pBUD
мутация R471A Y487A R490A Н497А N1224A на фоне
pSYN-FVIII-131
pSYN-VIII-64
pBUD
мутация R471A Y487A R490A Н497А N1224A на фоне
pSYN-FVIII-132
pSYN-VIII-65
pBUD
pSYN-FVIII-135
УВД-ФУШ онрс с R1645A/R1648A
pcDNA 3.3 Topo
pSYN-FVIII-136
УВД-ФУШ отщепляемая OHFC С ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-137
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ DD3 (1-276ак) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-145
УВД-ФУШ онрс с R471A/Y487A, R490A/H497A
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVin-146
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс (R471A/Y487A) с ФВ DD3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-147
УВД- ФУШ отщепляемая oupc (R471A/Y487A) с ФВ D'D3 (1-276ак) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-148
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс (R1645A/R1648A) с ФВ DD3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-149
УВД- ФУШ отщепляемая OHFC (R1645A/R1648A) with ФВ D'D3 (1-276ак) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-155
УВД-ФУШ сшитый с одиночной Fc (R1645A/R1648A)
pcDNA 4
pSYN-FVIH-159
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ DD3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 35ак тромбин-отщепляемым линкером между
pBUD
pSYN-FVIII-160
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ DD3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIII-164
УВД-ФУШ отщепляемая онрс (R490A/H497A, R1645A/R1648A) с ФВ D'D3 ( 1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-165
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс (R336I/R562K, R490A/H497A, R1645A/R1648A) с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 20ак тромбин-отщепляемым линкером
pcDNA3.3 Topo
pSYN-FVIII-178
УВД-ФУШ отщепляемая OHFC С ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 73ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIII-179
УВД-ФУШ отщепляемая оцРс с ФВ DD3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 98ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIII-180
УВД-Футп (К2092А) отщепляемая оцРс с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIII-181
УВД-ФУШ (F2093A) отщепляемая онрс с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
pSYN-FVIII-182
УВД-ФУШ (K2092A/F2093A) отщепляемая онрс с ФВ D'D3 (1-477ак, С336А/С379А) на второй Fc и 48ак тромбин-отщепляемым линкером между ними
pBUD
Пример 6. Белковая очистка. Белковая очистка фрагментов ФВ.
Фрагменты ФВ очищали с применением двухэтапного метода очистки. Для первичной очистки использовали заряженную колонку с сульфатом никеля для афинной хроматографии на иммобилизованном металле (АХИМ), а для окончательной очистки использовали ионообменную колонку с ДЭАЭ-фрактогелем. Ниже детально описан способ очистки.
(а) Первичная очистка фрагмента ФВ на АХИМ никеле.
14-мл никелевую АХИМ колонку с НР-сефарозой [XK26/3] уравновешивали 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Приблизительно 7.2 л ФВ-кондиционированной среды доводили 100 мл 1 М ГЭПЭС @ рН 7,5 и 600 мл 5 М NaCl. Затем добавляли 80 мл 1 М имидазола (@ рН 7.5) до достижения конечной концентрации в 10 мМ. Затем 7,8 L доведенной ФВ-кондиционированной среды загружали в колонку при 2-8°С при 10 мл/мин [113 см/ч]. Этапы отмывки проводили при 13.3 мл/мин [150 см/ч]. Сначала проводили отмывку 2х объемов колонки (ОК) с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5 в нормальном потоке {"нисходящем потоке"}. Затем проводили отмывку 3хОК с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% ТВИН-20 @ рН 7,5 в обратном потоке {"восходящем потоке"}. И наконец, проводили отмывку 3хОК с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5 в нормальном потоке {"нисходящем потоке"}. Элюирование проводили как градиент 10хОК до 50% В1 (25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ
NaCl, 500 мМ имидазола и 0,05% ТВИН-20 @ рН 7,5). Объем фракции положили равным 10 мл. Затем колонку очищали 100% В1. После этого проводили отмывку с 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Вторую очистку проводили с 1H NaOH. Затем колонку промывали с 1 М Трис, 1 М NaCl @ рН 7,8, и после этого - 25 мМ ГЭПЭС, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазола и 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. В конце колонку промывали с 5 ОК ФСБД + 20% этанола и хранили при 4°С. (б) Вторичная очистка фрагмента ФВ на ДЭАЭ-фрактогеле.
Вторичную очистку фрагмента ФВ проводили на ДЭАЭ-фрактогеле @ рН 7,5. Сначала 20 мл элюа-та АХИМ никеля (что соответствует пику фрагмента ФВ) доводили 200 мг цвиттергента 3-14 цвиттери-онного детергента, чтобы попытаться разделить агрегированные частицы без применения денатурации или восстановительных добавок. После растворения детергента белок оставляли при комнатной температуре приблизительно на 15 мин. Затем белок доводили 4 г трегалозы, 1 мл 10% Твин-20, 5 мл 1 М ГЭ-ПЭС @ рН 7,5 и 174 мл воды "Милли-Кью". Равновесный буфер "А12" содержал 25 мМ ГЭПЭС, 50 мМ NaCl, 1% трегалозы, 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Элюирующий буфер "В1" содержал 25 мМ ГЭПЭС, 1000 мМ NaCl, 1% трегалозы, 0,05% Твин-20 @ рН 7,5. Элюирование проводили как градиент 10 ОК до 50% В1 с удерживанием 5+ ОК, после чего следовал этап доведения до 100% В1. Затем колонку очищали 0,85% ортофосфорной кислоты, и после этого - 1 М Трис, 1 М NaCl @ рН 7,5. Затем колонку очищали 1H NaOH, 2 М NaCl и после этого - 1 М Трис, 1 M NaCl @ рН 7,5. Затем колонку промывали с 25 мМ ГЭ-ПЭС, 100 мМ NaCl + 20% этанола @ рН 7,5 для хранения.
(с) Белковая очистка гетеродимера Ф-УШ-ФВ.
Сначала гетеродимер Ф-УШ-ФВ очищали на аффинной колонке (GE VIIISelect), после чего проводили очистку на ионообменной колонке, содержащей фрактогель ТМАЕ. (McCue J.T. Selvitelli K. Walker J. J ChromatogrA. 2009 Nov 6; 1216(45):7824-30. Epub 2009 Sep 23.)
Для очистки Ф-УШ-155/ФВ-31 проводили этап тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ) для замены буфера очищаемой кондиционированной среды. Затем при помощи аффинной хроматографии проводили захват целевых белков в фильтрате. После этого проводили этап слабой анионообменной хроматографии для уменьшения количества высокомолекулярных компонентов. Чистоту и размер молекул оценивали при помощи эксклюзионной ВЭЖХ и ДСН-ПААГ. Наличие разных доменов Ф-УШ-155/ФВ-31 дополнительно подтверждали Вестерн-блоттингом. Специфическая активность молекул была сравнима с Ф-VIII с удаленным В-доменом.
(г) Расщепление тромбином гетеродимера Ф-УШ-ФВ (фиг. 8).
Гетеродимер Ф-УШ-ФВ или Ф-VIII-Fc (контроль) смешивали с тромбином в соотношении 1:10 в тромбин-расщепляющем буфере (50 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 5% глицерола). Реакцию инкубировали при 37°С на протяжении 20 мин. Расщепленный продукт проводили в 4-12% восстановительном трис-глициновом геле. Нерасщепленный белок использовали в качестве контроля. Полосы визуализировали красителем кумасси.
(д) Оценка ФВ-связывающей способности Ф-УШ-155/ФВ-31 при помощи октетного анализа.
ФВ-связывающую способность Ф-УШ-155/ФВ-31 определяли при помощи измерений на основе био-слоевой интерферометрии (БСИ) (октетный анализ) при 25°С при помощи измерительной установки ForteBio Octet 384 с использованием буферного раствора Трис (50 мМ Tris, pH 7,2, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Октетный анализ для определения связывания Ф-УШ основан на гидрофобной иммобилизации человеческого фактора Виллебранда (чФВ) (Haematologic Technologies, каталог № на АФС-биосенсоре, за которой следует связывание 1,0% бычьего сывороточного альбумина (Jackson Im-munoResearch, каталог № 001-000-161). Вкратце, чФВ (38,5 нМ) растворяли в Трис-буфере и загружали на АФС-биосенсоры на 600 с, получая приблизительно 3,0-3,5 нм связывание на реакционных зондах. Контрольные АФС-зонды загружали 1,0% БСА в отсутствие чФВ для базового вычитания. После загрузки все зонды инкубировали в Трис-буфере на протяжении 300 с для установления новой базовой линии. После этого биосенсорные зонды инкубировали в растворах Ф-УШ-155/ФВ-031, лекарственного вещества с содержанием Ф-УГПТс или рФ-УШ (60 нМ) на протяжении 5 мин при комнатной температуре с последующим 5-минутным этапом диссоциации. При помощи программного обеспечения для октетного анализа данных связывающий отклик (нм) получали путем вычетания данных (реакционный зонд минус контрольный зонд). Как показано на фиг. 15, по сравнению с ФВ-связывающей активностью рФ-УППх и рФ-УШ ФВ-связывающая активность Ф-УШ-155/ФВ-031 является значительно более слабой. Это указывает на успешное экранирование Ф-УШ от полноразмерного ФВ фрагментом D'D3 гетеродимера Ф-УППх/ФВ.
Пример 7. ФВ-Ф-УШ взаимодействие является ограничивающим фактором для продления времени полужизни Ф-УШ.
Большая часть циркулирующего Ф-УШ существует в виде комплекса Ф-УШ-ФВ (> 95% плазменного Ф-УШ). Это Ф-УШ-ФВ взаимодействие способствует выведению Ф-УШ в процессе выведения ФВ, тем самым делая время полужизни ФВ (Т1/2) ограничителем для продления времени полужизни Ф-УШ. Для оценки этой гипотезы при помощи Fc-технологий проводили испытания по ограничению продления времени полужизни Ф-УШ у мышей с дефицитом Ф-УШ (мышей с гемофилией А, которые имеют ин-тактный ген ФВ) и у мышей с дефицитом Ф-УШ/ФВ (с двойным Ф-УШ-ФВ генным нокаутом (ДГН)).
Мышей с гемофилией А или Ф-УШ-ФВ ДГН мышей лечили путем введения единичной внутривенной дозы рФ-УШ или рФ-УШFc в рассчете 125 МЕ/кг в случае мышей с гемофилией А или 200 МЕ/кг в случае ДГН мышей. Образцы крови брали до 72 ч у мышей с гемофилией А или до 8 ч у Ф-УШ/ФВ ДГН мышей. Затем измеряли активность Ф-УШ в образцах плазмы крови при помощи хромогенного анализа Ф-УШ. Фармакокинетический (ФК) профиль двух вариаций рФ-УШ анализировали при помощи программы WinNonline.
Как показано в табл. 7 и на фиг. 9, для Ф-УШ/ФВ ДГН мышей рФ-УШFc продемонстрировал приблизительно в 4,8 раз большее Т1/2 (т.е. Т1/2 1,2 ч) по сравнению с Т1/2 рФ-УШ (т.е. Т1/2 в 0,25 ч). В противоположность этому, при испытаниях на мышах с гемофилией А рФ-УШFc имел только в 1,8 раз большее Тш по сравнению с рФ-УШ. Т1/2 рФ-УШFc составило 13,7 ч, что совпадает со временем полужизни эндогенного мышиного ФВ. Это указывает на то, что Ф-УШ-ФВ взаимодействие является ограничивающим фактором для продления времени полужизни Ф-УШ. Для того чтобы достичь более чем 2-кратного увеличения времени полужизни Ф-УШ, Ф-УШ-ФВ взаимодействие должно быть устранено.
Хромогенный анализ Ф-УШ.
Активность Ф-УШ определяли при помощи набора инструментов COATEST SP FУШ от DiaPharma (lot# N089019), а все инкубирования проводили на плоском нагревателе при 37°С с встряхиванием.
Диапазон калибровочной пробы рФ-УШ составлял от 100 до 0,78 мМЕ/мл. Смешанные образцы контрольной нормальной человеческой плазмы и плазмы (разведенные в 1X буфере Coatest) добавляли в 96-луночные планшеты Immulon 2HB в дубликате (25 мкл/лунку). Свежеприготовленную смесь IXa/ФХ/Фосфолипид (50 мкл), 25 мкл 25 мМ CaCl2 и 50 мкл субстрата ФХа последовательно добавляли в каждую лунку с 5 мин инкубации между добавлениями. После инкубации с субстратом добавляли 25 мкл 20% уксусной кислоты для терминации цветной реакции и измеряли поглощение OD405 при помощи установки SpectraMAX plus (Molecular Devices). Данные анализировали при помощи программного обеспечения SoftMax Pro (версия 5.2). Нижний предел количественного определения (НПКО) равен 7,8 мМЕ/мл.
Пример 8. Димер ФВ D'D3 защищает Ф-УШ от Ф-УШ-протеолиза и выведения (фиг. 10).
Ф-УШ-защитную активность фрагментов ФВ оценивали по их способности защищать эндогенный мышиный Ф-УШ от выведения у мышей с дефицитом ФВ. В циркуляцию крови мышей с дефицитом ФВ вводили разные фрагменты ФВ, перечисленные в табл. 8, колонка 1 (фиг. 1, пример 1), при помощи гидродинамической инъекции соответствующих конструкций ДНК в расчете 100 мкг/мышь. Образцы плазмы крови брали через 48 ч после инъекции, а плазменную активность мышиного Ф-УШ измеряли при помощи хромогенного анализа Ф-УШ. Уровень экспрессии ФВ измеряли при помощи ELISA ФВ.
Исследовали четыре фрагмента ФВ разной длины, составляющей 276, 477, 511 и 716 аминокислот. Диапазон аминокислот от 276 до 716 исследовали, чтобы определить длину фрагментов ФВ, которая требуется для связывания Ф-УШ (276 ак) в отсутствие связывающего домена клиренс-рецептора ФВ (716 ак). Полноразмерный ФВ и мультимер D1D2D'D3CK использовали в качестве положительного контроля для защиты Ф-УШ. В циркуляции крови фрагменты ФВ, синтезированные с доменом D1D2, существуют в виде димера и в виде мономеров, если они синтезированы без доменов D1D2.
Повышение активности мышиного Ф-УШ в плазме крови после гидродинамической инъекции определяет Ф-УШ-защитное действие фрагментов ФВ. Как показано в табл. 8 и на фиг. 10А-Б, первые 276 ак фрагмента D'D3He проявляют Ф-УШ-защитной активности, что демонстрируют одинаковые уровни Ф-УШ в плазме крови до/после инъекции (фиг. 10А). При этом введение других фрагментов ФВ привело к значительному повышению уровня Ф-УШ в плазме крови, что указывает на то, что эти фрагменты ФВ могут защищать Ф-УШ от выведения.
В табл. 8 приведены значение активности плазменного Ф-VIII и плазменный уровень антигена фрагментов ФВ, которые содержат домен D'D3 полноразмерного ФВ, после инъекции. Аналогичные по-слеинъекционные значения Ф^Ш/ФВ наблюдали для полноразмерного ФВ и двух димерных форм фрагментов ФВ, что означает, что эти два димера фрагментов ФВ обеспечивают такую же защиту Ф-VIII, что и полноразмерный ФВ. Вдобавок, 3-кратно превышающее значение ФЛЧП/ФВ наблюдали для димерных изоформ фрагмента ФВ по сравнению с соответствующими им мономерами: димер D'D3 (477 ак) характеризуется значением Ф^Ш/ФВ в 38,7 мМЕ/нмоль; мономер D'D3 (477 ак) характеризуется значением Ф^Ш/ФВ в 11,6 мМЕ/нмоль: димер D'D3A1 (511 ак) характеризуется значением ФЛЧП/ФВ в 32,9 мМЕ/нмоль; и мономер D'D3 (511 ак) характеризуется значением Ф^Ш/ФВ в 13,8 мМЕ/нмоль, что указывает на то, что димерные изоформы фрагментов ФВ обеспечивают лучшую защиту Ф-VIII по сравнению с соответствующими им мономерами.
Таблица 9
Гидродинамическая инъекция.
Гидродинамическая инъекция является эффективным и безопасным методом доставки генов в печень небольших животных, таких как мыши и крысы. Впервые он был описан как быстрая инъекция чистой плазмидной ДНК/солевого раствора без содержания эндотоксинов в размере десятой части от массы тела животного, проводимая за 5-7 с. Чистая плазмидная ДНК содержит представляющий интерес ген, а целевой белок, вырабатывающийся в печени из инъектированной ДНК, можно обнаружить в пределах 24 ч после инъекции. Затем образцы плазмы крови брали для изучения терапевтических свойств экспресси-руемого белка.
Во всех гидродинамических инъекциях, которые проводили в рамках данной патентной заявки, мышам массой 20-35 г в течение 4-7 с путем внутривенной инъекции в хвостовую вену доставляли 2 мл плазмидной ДНК в 0,9% стерильном солевом растворе. За мышами внимательно наблюдали на протяже
нии первых нескольких часов до тех пор, пока не восстанавливалась нормальная активность. После того, как при помощи метода отбора образцов крови из ретроорбитального синуса образцы крови были взяты, из них получали образцы плазмы крови и хранили при -80°С для дальнейшего анализа. ELISA ФВ.
Для ELISA ФВ использовали козлиное антитело к ФВ (аффинно очищенное, аффинно биологическое, КАФВ-АО) в качестве иммобилизованного антитела в количестве 0,5 мкг/лунку, а ФВ-ИФА-Д (Affinity Biologicals, ФВ-ИФА-Д, разведение 1:100) использовали в качестве детектирующего антитела. Анализ ELISA проводили согласно стандартной процедуре ELISA, в качестве субстрата ПХ использовали ТМБ, в качестве блокирующего и связывающего буфера использовали буфер ФСБТ/1,5% БСА/0,5М NaCl. Стандартный диапазин анализа составляет от 100 нг до 0,78 нг, а нижний предел количественного определения (НПКО) в анализе равен 7,8 нг/мл.
Пример 9. Совместное введение полноразмерного D,D3-фрагмента ФВ продлевает время полужизни рУВД-Ф-VIII у Ф-ЛЛП-ФВ ДГН мышей.
Пример 8 продемонстрировал, что полноразмерный фрагмент D'D3 может защитить эндогенный Ф-VIII от процесса его выведения. Для того чтобы дополнительно оценить Ф^Ш-защитную активность белка D'D3, Ф-УШ-ФВ ДГН мышам вводили совместно Ф-VIII с удаленным В-доменом (рУВД-Ф-VIII) и димер D'D3 (ФВ-010) или рУВД-Ф-VIII и мономер D'D3 (ФВ-002) при помощи внутривенной инъекции в расчете 200 МЕ/кг для рУВД-Ф-VIII, 770 мкг/кг для димера D'D3 и 590 мкг/кг для мономера D'D3. ФК профиль рУВД-Ф-VIII изучали по его плазменной активности после инъекции. Из-за короткого in vivo времени полужизни фрагментов D'D3 через 3 ч после первичной совместной инъекции вводили еще одну дозу D'D3 тем же самым путем для того, чтобы поддерживать необходимый уровень D'D3 в плазме крови.
Для анализа ФК образцы плазмы крови получали при помощи метода отбора образцов крови из ре-троорбитального синуса через 5, 30 мин, 1, 2, 4 и 6 ч после инъекции, активность плазменного Ф-VIII и уровень ангигена D'D3 анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-VIII и ELISA ФВ.
Как показано на фиг. 11 и в табл. 10, мономер D'D3 продлил время полужизни рУВД-Ф-VIII в 2,5 раз и улучшил его восстановление в 1,8 раз. Димер D'D3 продлил время полужизни рУВД-Ф-VIII в 4,1 раз и улучшил его восстановление в 3,5 раз. Также для обеих изоформ наблюдали улучшенные параметры среднего времени нахождения, выведения и ПИК. При этом димер D'D3 показывал лучшие результаты по всем ФК параметрам по сравнению со своей мономерной формой.
Таким образом, совместное введение полноразмерного D'D3 защищает Ф-VIII от процесса выведения, что показывает улучшение профиля ФК рУВД-Ф-VIII. Потенциальное клиническое значение этого открытия нуждается в дополнительной оценке.
Таблица 10
Пример 10. Мономер D'D3, синтезированный с доменом D1D2, и его димерная изоформа обладают такой же Ф^Ш-защитной активностью и дополнительно продлевают время полужизни Ф-VIIIFc приблизительно в ~4 раза у ФЛлШ-ФВ ДГН мышей.
Для того чтобы количественно оценить Ф^Ш-защитную способность доменов D'D3 и выяснить, является ли димеризация D'D3 необходимой для Ф^Ш-защитной активности, каждую из двух конструкций ДНК (т.е. ФВ-025 (содержащую последовательность ДНК, кодирующую D1D2D'D3) и ФВ-029 (содержащую D1D2D'D3 кодон ДНК с мутациями С336А и С379А)) вводили Ф^Ш/ФВ ДГН мышам путем гидродинамической инъекции. Эта инъекция приводила к экспрессии димера D'D3 (ФВ-025) или экспрессии мономера (ФВ-029) у Ф^Ш/ФВ ДГН мышей. На 5 день после гидродинамической инъекци-ивводили единичную внутривенную дозу рФ-VIIIFc в расчете 200 МЕ/кг, а образцы плазмы крови брали через 5 мин, 4, 8, 16, 24, 31, 40, 55, 66 ч после инъекции рФ-VIIIFc IV. Исследование ФК рФ-VIIIFc, проводимое на ранее не подвергавшихся экспериментам Ф^Ш-ФВ ДГН мышах с аналогичными дозировками, использовалось в качестве базовой линии времени полужизни рФ-VIIIFc. Активность плазменного Ф-VIII анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-VIII. Плазменный уровень D'D3 измеряли при помощи ELISA ФВ, а ФК профиль рФ-VIIIFc анализировали при помощи программы WinNonlin.
Как показано в табл. 11 и на фиг. 12, при наличии в циркуляции D,D3-фрагментов ФВ исходное восстановление рФ-VIIIFc возрастает от 42 до 75% для димера D'D3 и 60% для мономера D'D3. T1/2 для
рФ-VIIIFc также возросло от 2,5 ч до 9,3 ч и 9,2 ч соответственно. Вместе с Т1/2 наблюдали улучшенные параметры среднего времени нахождения, выведения и объемного распределения у мышей, экспресси-рующих мономеры и димеры D'D3. В целом, наблюдали приблизительно 8-кратное увеличение времени полужизни рФ-VIIIFc и 6-кратное увеличение ППК у мышей, экспрессирующих и мономеры и димеры D'D3. Так же, как и его димерная изоформа, мономер D'D3 полноразмерного ФВ, который синтезировали с пропептидом (D1D2) ФВ, может обеспечивать полный Ф^Ш-защитный эффект, что и полноразмерная молекула ФВ.
У Ф^Ш/ФВ ДГН мышей Ф-VIII дикого типа имеет 0,25 ч Т1/2. Метод слияния Fc повышает Т1/2 Ф-VIII до 1,2 ч, что является приблизительно 4,8-кратным увеличением. Когда метод слияния Fc объединили с доменами D'D3, T1/2 Ф-VIII возросло до 9,3 ч (димер D'D3) и 9,2 ч (мономер D'D3), что в целом является приблизительно 37-кратным увеличением (табл. 10). Этот результат демонстрирует синергетиче-ский эффект слияния Fc и D'D3-фрагмента ФВ на продление времени полужизни Ф-VIII.
Таблица 11
Пример 11. ФК гетеродимеров Ф^Ш-ФВ у мышей с гемофилией А.
На мышах с гемофилией А проводят исследование ФК профиля основных представителей гетеродимеров Ф^Ш-ФВ (таких как Ф^Ш-155/ФВ-031) для того, чтобы оценить их способность экранировать Ф-VIII от эндогенного ФВ и их способность продлевать время полужизни Ф-VIII.
Мышей с гемофилией А обрабатывают единичной внутривенной дозой основных представителей в расчете 200 МЕ/кг, затем берут образцы плазмы крови через 5 мин, 4, 8, 24, 48, 72, 96 и 120 ч, исследуют активность плазменного Ф-VIII при помощи хромогенного анализа Ф-VIII, а изменение времени полужизни Ф-VIII рассчитывают при помощи программы WinNonlin.
В оптимальной конфигурации гетеродимера Ф^Ш/ФВ, связывание Ф-VIII с эндогенным ФВ будет полностью подавляться, следовательно, базовая линия времени полужизни рФ-VIII снизится от 7,6 до 0,25 ч, как показано в примере 7. При нековалентном соединении фрагмента D'D3 с Ф-VIII наблюдали приблизительно 8-кратное увеличение времени полужизни (пример 9). У основных представителей гете-родимеров Ф^Ш/ФВ фрагмент ФВ ковалентно соединен с молекулой Ф-VIII, соответственно должна быть достигнута лучшая защита Ф-VIII. Изобретение, описанное в данной заявке, открывает двери дальнейшему продлению времени полужизни Ф-VIII за границу 2-кратного увеличения с применением доступных способов продления времени полужизни, пациенты с гемофилией А в ближайшем будущем могут надеяться на вариант Ф-VIII более длительного действия.
На мышах с гемофилией А и Ф^Ш/ФВ ДГН мышах исследовали ФК профиль ФЛ/1П-155/ФВ-031 для того, чтобы оценить способность фрагмента D'D3 экранировать компонент Ф-VIII от эндогенного ФВ. Мышей с гемофилией А и Ф^Ш/ФВ ДГН мышей лечили единичной внутривенной дозой Ф-VIII-155/ФВ-031 в расчете 200 МЕ/кг, затем брали образцы плазмы крови через 5 мин, 8, 24 и 48 ч после дозирования. Ф^Ш-активность образца плазмы исследовали при помощи хромогенного анализа Ф-VIII, а время полужизни ФЛ/1П-155/ФВ-031 рассчитывали при помощи программы WinNonlin.
Методом биослоевой интерферометрии для ФЛ/1П-155/ФВ-031 по сравнению с рФ-VIIIFc и рФ-VIII было зарегистрировано очень слабое связывание с иммобилизованным ФВ (фиг. 15, Октет; ForteBio Inc., Менло-Парк, Калифорния). Это показывает, что домен D'D3 в молекуле успешно блокирует связывание Ф-VIII с нативными молекулами ФВ. Следовательно, ожидается, что для двух разных мышиных линий времена полужизни рФ^Ш-155/ФВ-031 будут сходными. Результаты исследования приведены на фиг. 16 и в табл. 12А. Как и предсказывалось, ФК профайл рФЛ/1П-155/ФВ-031 сравним в обоих случаях -мышей с гемофилией А и Ф^Ш/ФВ ДГН мышей, что указывает на то, что время полужизни гетеродимера Ф^ГПТс/ФВ не зависит от времени полужизни эндогенного ФВ. Результаты показывают, что подавление взаимодействия рФ-VIIIFc с эндогенным ФВ D'D3-доменами ФВ дает возможность снять ограничение по времени полужизни Ф-VIII и открывает возможность продления времени полужизни Ф-VIII за границы времени полужизни, достигаемые в отсутствие D'D3-доменов ФВ (приблизительно в два раз по сравнению с Ф-VIII дикого типа).
Ф-VШ-защитную способность доменов D'D3 оценивали путем сравнения t1/2 для Ф-VШ-155/ФВ-031 с Ф-VIIIFc у Ф^Ш/ФВ ДГН мышей. После одноразового введения IV брали образцы крови через 5 мин, 8 ч, 24 ч и 48 ч для ФЛаП-155/ФВ-031, и через 5 мин, 1, 2, 4, 6 и 8 ч для Ф-VIIIFc. Активность Ф-VIII образцов плазмы крови исследовали при помощи хромогенного анализа Ф-VIII, а время полужизни Ф-VШ-155/ФВ-031 рассчитывали при помощи программы WinNonlin.
Фиг. 16Б и табл. 12Б демонстрируют значительно улучшенный ФК профиль для Ф-VIII-155/ФВ-031 по сравненю с рФ-VIIIFc для ДГН мышей: приблизительно 6-кратное увеличение для t1/2; и приблизительно 5-кратное увеличение для параметров выведения и ПИК. Этот результат демонстрирует, что домен D'D3 гетеродимера Ф-VШFc/ФВ защищает компонент Ф-VIII от некоторых процессов выведения, обеспечивая, таким образом, часть защиты, которую обычно обеспечивает полноразмерный ФВ. Этот вывод был также подтвержден в случае мышей с гемофилией А. По сравнению с рФ-VIIIFc у мышей с гемофилией А рФ^Ш-155/ФВ-031 имеет более короткое t1/2 и меньшую ППК, что означает, что в такой конфигурации домены D'D3 (ФВ-031) успешно предотвращают связывание белка Ф-VIII (рФЛ/Ш-155) с эндогенным ФВ, который до определенной степени обладает свойствами продления времени полужизни, равно как и свойствами, ограничивающими время полужизни Ф-VIII. Полноразмерный ФВ имеет длину в 250 кДа и образует мультимеры так, что эндогенный ФВ может иметь длину до 2 МДа, и, таким образом, это согласуется с гипотезой о том, что в данном контексте D'D3-участок ФВ длиной в 55 кДа не обеспечивает защиту в той же степени, в какой ее предоставляет гораздо более крупный эндогенный ФВ. Так как фрагмент ФВ предотвращает связывание эндогенным ФВ рФЛ/Ш-155/ФВ-031, в этой конкретной конструкции время полужизни у мышей с гемофилией А сокращается. Следовательно, результаты, приведенные в табл. 12Б, указывают на то, что молекула рФЛ/Ш-155/ФВ-031 способна предотвращать связывание рФ-VIII-155/ФВ-031 с компонентом, продлевающим время полужизни Ф-VIII (эндогенным ФВ). При этом эксперименты показывают, что устранение фактора, ограничивающего время полужизни Ф-VIII, открывает возможность продления времени полужизни белка Ф-VIII за пределы ранее осуществляемого 1,5-кратного или 2-кратного увеличения. Комбинируя Ф-VIII с другими продлевающими время полужизни элементами, можно выйти за ограничение на более чем 2-кратное продление времени полужизни.
Таблица 12Б
Пример 12. Оптимизация D'D3-Fc линкера гетеродимера Ф^ШЛЗТО (фиг. 13).
Для того чтобы обеспечить возможность рФ-VIIIFc избежать процесса выведения ФВ и устранить ограничение в виде 2-кратного увеличения времени полужизни Ф-VIII, D,D3-фрагмент ФВ вносили в молекулу рФ-VIIIFc (фиг. 2), что приводило к образованию гетеродимера Ф^ППх/ФВ. Чтобы исключить взаимодействие междк рФ-VIIIFc и эндогенным ФВ и максимизировать Ф^Ш-защитный потенциал D'D3, между доменом D'D3 и Fc-областью добавляли линкер, чтобы обеспечить возможность оптимального связывания Ф^ШЛЭТ)3. Более оптимальный линкер обеспечит домену D'D3 возможность предоставлять большую защиту D'D3, чем это делает менее оптимальная конструкция линкера. Это предположение можно проверить путем проведения гидродинамической инъекции конструкций ДНК Ф-VIII/ФВ ДГН мышам. Более оптимальная конструкция приведет к более стабильной экспрессии гетеродимера Ф-утш^лэта
Для того чтобы выбрать оптимальный линкер было создано три разных гетеродимера Ф-VIIIFc/D'D3 (фиг. 3, пример 3). Возможные линкеры между доменами D'D3 и Fc-областью перечислены в табл. 13. Данные конструкции ДНК вводили Ф^Ш/ФВ ДГН мышам при помощи гидродинамической инъекции ("ГДИ") в расчете 100 мкг/мышь, образцы плазмы брали через 48 ч после ГДИ. Активность циркулирующего гетеродимера Ф-VШFc/D,D3 анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-VIII.
Результаты исследований показаны на фиг. 13. Через 48 ч после ГДИ наблюдали одинаковый уровень экспрессии, достигаемый Ф-\ЧП-064 и ФЛЧП-159, что указывает на то, что 20 ак линкер и 35 ак линкер обеспечивают одинаковый уровень взаимодействия Ф-\ЧП/ТШ3. С другой стороны, ФЛЧП-160 продемонстрировал значительно более высоку экспрессию, чем Ф^Ш-064, что указывает на то, что 48 ак линкер обеспечивает возможность лучшего связывания Ф-\ЧПЛЭТ)3 по сравнению с 20 ак и 35 ак линкерами.
Оптимальный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью является одним из ключевых элементов в гетеродимере Ф^ППх/ФВ. Нахождение лучшего линкера позволит получить оптимальное взаимодействие между Ф-VIII и фрагментом ФВ, предотвратит связывание Ф-VIII с эндогенным ФВ, даст возможность Ф-VIII избежать процесса выведения ФВ и продлит время полужизни Ф-VIII за пределы времени полужизни плазменного ФВ.
Пример 13. Стабильность одноцепочечного Ф-VIII.
Одноцепочечный белок Ф-VIII должен быть более стабильным, чем его изоформа с двойной цепью. Для проверки этой гипотезы были созданы две конструкции ДНК: Ф^Ш-136 (процессируемый Ф-VIIIFc с доменом D'D3) и Ф^Ш-148 (одноцепочечный (ОЦ) Ф-VIIIFc с доменом D'D3, который содержит мутацию R1645A/R1648A, чтобы предотвратить расщепление между тяжелой цепью и легкой цепью Ф-
VIII).
Обе плазмиды вводили Ф^Ш/ФВ ДГН мышам при помощи гидродинамической инъекции. Образцы плазмы брали через 24 и 48 ч после инъекций для того, чтобы измерить уровень экспрессии двух изоформ Ф-VШFc/D,D3. Как показано на фиг. 14 для обеих временных точек лучшую экспрессию наблюдали для конструкции ОЦ-Ф-VШFc/D,D3 (Ф^Ш-148) (р=0,12, р=0,19), что указывает на то, что одноцепочечный Ф-VIII может являться более стабильным или лучше экспрессируемым, чем его двухце-почечная изоформа (Ф^Ш-136). ФК профиль двух изоформ Ф-VIII и уровни их экспрессии в клеточной культуре будут дополнительно исследованы. Одноцепочечную изоформу Ф-VIII потенциально можно использовать для замещения традиционной двухцепочечной изоформы для достижения лучшей выработки белка и лучшего in vivo времени полужизни Ф-VIII.
Пример 14. ПЭГилирование.
Одну или более молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) можно присоединить к любой области белка Ф-VIII, фрагмента ФВ или их обоих. Так как согласно данным по кристаллической структуре Ф-VIII не содержит на своей поверхности свободного цистеина (PDB:2R7E, Shen et al., Blood 111:1240 (2008); PDB:3CDZ, Ngo, Structure, 16:597-606 (2008)), одним из подходов является либо вставка цистеин-содержащего пептида (например, GGGSGCGGGS) (SEQ ID NO: 107), либо его присоединение к белку Ф-VIII, фрагменту ФВ или им обоим. Затем молекулы ПЭГ, содержащие малеимид, могут быть специфически конъюгированы с цистеином, внедренным в рекомбинантный белок Ф-VIII. Вкратце, рекомбинант-ный белок Ф-VIII, содержащий Cys-вставку, можно сконструировать при помощи стандартной молеку
лярной технологии, а экспрессируемый в экспрессионной системе млекопитающего рекомбинантный белок Ф-VIII (например, в клетках HEK293, СНО, BHK21, PER.C6 и САР) можно очистить при помощи аффинной и ионообменной хроматографии. Очищенный рекомбинантный белок Ф-VIII восстанавливают трис-(2-карбоксиэтил)фосфином (ТКЭФ) для того, чтобы открыть тиоловую группу внедренного цистеи-на, а затем проводят реакцию с содержащим малеимид ПЭГ. Полученный рекомбинантный белок Ф-VIII исследуют на предмет прокоагулирующей активности и продления времени полужизни.
ПЭГ присоединяют в одной из позиций, раскрытых в патентной заявке US № 61/670,553, которая в полном объеме включена в данный текст посредством ссылки, либо в других подходящих для вставки позициях. Активность циркулирующего гетеродимера Ф-\ТП-активность ПЭГилированного рекомби-нантного белка Ф-VIII анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-VIII. OK ПЭГилированного рекомбинантного белка Ф-VIII анализировали для мышей с гемофилией А и Ф-\ТП-ФВ ДГН мышей как описано выше.
Пример 15. Стабильность Ф-VIII в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным Ф-VIII/ФВ генным нокаутом (ДГН).
Плазменную стабильность разных слитых белков Ф-VIIIFc исследовали в плазме крови мышей с гемофилией А и мышей с двойным Ф-\ТП/ФВ генным нокаутом (ДГН). Для анализа стабильности 5 МЕ/мл разных белков Ф-VIIIFc инкубировали вместе с с плазмой крови мышей с гемофилией А или ДГН мышей при 37°С. Аликвоты брали для разных временных точек, чтобы измерить активность при помощи хромогенного анализа Ф-VIII. Активность для каждой временной точки измеряли дважды, а среднюю активность наносили на график как функцию времени.
Для анализа иммунопреципитации Ф-VIIIFc 5 мкг Ф-VIIIFc инкубировали с 250 мкл ОСБ или плазмой крови ДГН мыши на протяжении 24 ч при 37°С. Ф-VIIIFc иммунопреципитировали путем добавления 5 мкг овечьего поликлонального антитела к Ф-VIII (ab61370) на протяжении 1 ч при комнатной температуре и 100 мкл гранул протеина А. После 4x1 мл ФСБ отмывок гранулы пересуспендировали в 50 мл 1х восстановительного ДСН-ПААГ буфера. После кипячения 20 мкл (т.е. ~1мкг Ф-VIIIFc) загружали в 415% не содержащий красителей Bio-Rad гель. Гель визуализировали при помощи установки Bio-Rad и после этого проводили вестерн-блоттинг с антителом к тяжелой цепи Ф-VIII (GMA012).
Активность Ф-VIIIFc (двухцепочечной молекулы Ф-VIII, которая содержит отдельные тяжелую и легкую цепи Ф-VIII, удерживающиеся посредством нековалентных взаимодействий) уменьшается со временем в плазме крови как мышей с гемофилией А, так и ДГН мышей (фиг. 18А). Из-за отсутствия опосредованной ФВ защитыуменыпение активности Ф-VIIIFc более четко выражено в плазме крови ДГН мышей. Это уменьшение активности Ф-VIII происходит, главным образом, из-за диссоциации или деградации тяжелой цепи (ТЦ) Ф-VIII. После 24-часовой инкубации в плазме крови ДГН мышей наблюдали около 75% уменьшение тяжелой цепи Ф-VIIIFc (фиг. 18Б). Для легкой цепи (ЛЦ) (данные не приведены) или непроцессированного/одноцепочечного Ф-VIIIFc (т.е. молекулы Ф-VIII, в которой легкая цепь и тяжелая цепь удерживаются вместе посредством ковалентной связи - верхняя полоса в гель-изображении) не наблюдали значительного уменьшения (фиг. 18Б).
Так как предполагается, что ФВ повышает стабильность Ф-VIII in vivo, проводили исследования, чтобы выяснить, будет ли химерный белок гетеродимера ФЛЧП-ФВ (Ф-\ТШ55:ФВ31, который содержит D'D3 ФВ, ковалентно присоединенный к Ф-VIII через Fc) более стабильным в плазме крови мышей с гемофилией А и ДГН мышей. Согласно приведенным на фиг. 19 данным по плазменной стабильности, наличие D'D3 повышает стабильность Ф-VIIIc в плазме крови как мышей с гемофилией А, так и ДГН мышей. Одноцепочечный Ф-VIIIFc без D'D3 использовали в этих экспериментах в качестве контроля (оцФ-VIII). Согласно Фиг. 19, одноцепочечный Ф-VIII оказался более стабильным, чем двухцепочечный Ф-VIIIFc; при этом наличие D'D3 значительно повышает плазменную стабильность одноцепочечной молекулы Ф-VIIIFc. На основе этого можно предположить, что D'D3 стабилизирует Ф-VIII не только путем удержания вместе тяжелой и легкой цепей, но также при помощи других неизвестных механизмов.
Пример 16. Применение фурина/РАСЕ для процессинга ФВ.
ФВ является уникальным белком в том смысле, что он содержит очень большой пропептид (т.е. домен D1D2 ФВ, ~85 кДа). Пропептид ФВ исполняет роль внутреннего шаперона для правильного фолдин-га молекулы ФВ. Два фермента - PC5 и фурин (РАСЕ) исследовали на предмет процессинга ФВ. Конструкцией ФВ031 (D1D2D'D3Fc) временно трансфицировали клетки HEK293 у применение разных концентраций РС5 или РАСЕ. Через четыре дня культуральную тканевую среду собирали и подвергали понижению протеина А. Даже при более низкой концентрации (2,5%) фурин (РАСЕ) был более эффективным, чем 10% РС5, в удалении пропептида (D1D2) из D'D3Fc (фиг. 20). Удаление D1D2 является важным, так как известно, что D1D2 приводит к предотвращению взаимодействия D'D3 с Ф-VIII.
Пример 17. Фрагмент ФВ в гетеродимере Ф-\ТП-ФВ предотвращает взаимодействие Ф-VIII с полноразмерным ФВ.
Для исследования связывания гетеродимерной конструкции Ф-VIII 155/ФВ31 с полноразмерным ФВ использовали октетную установку ForteBio (фиг. 21 А). Для проведения анализа связывания полноразмерный ФВ иммобилизовали при помощи АФС-сенсора, после чего блокировали 1% БСА. После
блокирования исследовали разные конструкции Ф-VIII на предмет связывания с ФВ. Как и предполагалось, Ф-VIII дикого типа и Ф-VIIIFc прочно связываются с сенсорами ФВ. Ф^Ш-мутант Y1680F, для которого, как известно, характерна низкая аффинность или отсутствие аффинности к ФВ, демонстрировал в значительной степени сниженное связывание ФВ. Гетеродимер ФЛГШ155/ФВ31 вообще не связывался с полноразмерным ФВ, что подтверждает экранирование Ф-VIII D'D3 в гетеродимере ФЛЧП-ФВ.
Тот же самый эксперимент проводили наоборот, чтобы определить, может ли часть D'D3 гетеродимера Ф^Ш-ФВ взаимодействовать с другими молекулами Ф-VIII, которые не являются ковалентно присоединенными к D'D3. Как показано на фиг. 21Б, конструкция ФВ31 (D'D3Fc), иммобилизованная на сенсоре из протеина G, сама может прочно связываться с Ф-VIII, при этом D'D3 в гетеродимере Ф-VШ155:ФВ31 не проявляет связывания с Ф-VIII. Протеин G вместе с Ф-VIII использовали в качестве контроля. Эти эксперименты по связыванию подтвердили, что D'D3 в гетеродимере может взаимодействовать только с молекулой Ф-VIII, которая ковалентно присоединена к нему, и предотвращать взаимодействие Ф-VIII с полноразмерными молекулами ФВ дикого типа.
Для определения точного значения аффинности связывания D'D3 ФВ с молекулой Ф-VIII для ФВ031 проводили эксперимент по поверхностному плазмонному резонансу (фиг. 22). Конструкцию ФВ031 (D'D3Fc) иммобилидовали при помощи анти-человеческого IgG, а Ф-VIII с удаленным В-доменом проводили через чип, содержащий D'D3Fc. Для Ф-VIII наблюдали KD, составляющую около 10 нМ. Такая аффинность приблизительно в 25 раз ниже по сравнению молекулой ФВ дикого типа и соответствует той величине, о которой ранее сообщалось в литературе.
Пример 18. Влияние разной длины линкеров между D'D3 и Fc на активность и ФК гетеродимера.
Чтобы проверить, оказывает ли влияние на ФК и активность гетеродимера Ф^Ш-ФВ изменение длины тромбин-отщепляемого линкера между D'D3 и Fc, разные конструкции ФВ экспрессировали совместно с Ф-VIII 155. Исследовали конструкции линкеров трех разных длин, перечисленных в табл. 14А (ФВ031, ФВ035 и ФВ036). Каждую плазмиду смешивали с плазмидой ФЛЧП155 (Пример 5) и трансфи-цировали клетки HEK293. На четвертый день после трансфекции культуральную клеточную среду собирали и концентрировали до 10 МЕ/мл хромогенной активности Ф-VIII.
Затем концентрированную клеточную среду вводили 8-12 недельным Ф-ЛТП/ФВ ДГН мышам в дозировке 100 МЕ/10 мл/кг. Образцы плазмы крови брали через 5 мин, 8, 16, 24, 32 и 48 ч после дозирования. Ф^Ш-активность образцов плазмы анализировали при помощи хромогенного анализа Ф-VIII, а время полужизни рассчитывали при помощи программы WinNonlin-Phoenix.
Как показано на фиг. 23, когда длину линкера между D'D3 и Fc-фрагментом увеличили от 48 ак до 73 ак или 98 ак, время полужизни соответствующего гетеродимера Ф-VШFc/ФВ увеличилось и достигло 12,2 ч и 13,3 ч соответственно. Это отвечает от 1,5-1,6-кратному увеличению по сравнению с вариантом длиной в 48 ак. На сегодняшний день 98 ак линкер является наиболее оптимальным линкером при использовании Ф^Ш-защитной активности фрагмента D'D3, и именно его включают в состав гетеродимера Ф-VШFc/ФВ для дополнительного увеличения его времени полужизни.
Для сравнения влияния линкера на активность Ф-VIII проводили хромогенный анализ Ф-VIII и АЧТВ-анализ культуральной тканевой среды из клеток, экспрессирующих разные гетеродимеры Ф-VIII-ФВ. Хотя для гетеродимерных конструкций АЧТВ-активность оказалась в 2 раза меньшей по сравнению с хромогенной активностью, не наблюдали значительных различий между разными линкерами, за исключением случая, когда линкер содержит сайт PAR1 рядом с сайтом тромбина (табл. 14Б).
Пример 19. Связывание Ф-VIII с фрагментом ФВ при помощи фермента сортазы.
В другом аспекте реализации изобретения фрагмент ФВ (например, домен D1D2D'D3 или D'D3) присоединяют к Ф-VIII при помощи опосредованного сортазой метода in vitro белкового лигирования. В одном примере распознающий сортазу A (LPXTG) мотив Staphylococcus aureus вносили в С-конец фрагмента ФВ, а остаток Gly(n) - в N-конец Ф-VIII (где количество остатком глицина может меняться). Применяемая молекула Ф-VIII может являться как одноцепочечной, так и двухцепочечной. Катализированная сортазой реакция транспептидации ковалентно присоединяет фрагмент ФВ к Ф-VIII. Обратную ориентацию распознающего мотива также можно применять для того, чтобы связать эти два белка, при этом Ф-VIII будет находиться на N-конце с мотивом LPXTG, а фрагмент ФВ - на С-конце с Gly(n) (смотрите фиг. 24 - пример сортазного лигирования для ссылки). Мотив LPXTG и остатки глицина можно заменить другими распознающими сортазу последовательностями.
Также создали фрагмент ФВ, содержащий распознающую сортазу А последовательность слитого Fc-белка. Для конструкций слияния Fc, D1D2D'D3-фрагмент ФВ сшивали с Fc-областью IgG посредством GS-линкера, который содержит распознающую сортазу последовательность и сайт расщепления тромбином (табл. 15 и 16). После того как белок экспрессируют и очищают на протеин А-колонке, Fc-область можно отделить при помощи расщепления тромбином. Полученный фрагмент ФВ с распознающим сортазу участком можно затем использовать для лигирования с молекулой Ф-VIII (фиг. 24 - пример сортазного лигирования для ссылки - ряд Д).
pSYN-ФВ-051 содержит 54-аминокислотный линкер с сортазным и тромбиновым сайтами между фрагментом ФВ и Fc-областью. Проводили синтез фрагмента ДНК, кодирующего 54-аминокислотный линкер (ISGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLPETGALR PRVVGGGGSG GGGS) (SEQ ID NO: 98) и часть Fc-области (Genewiz - Последовательность №-10-210746313, показана ниже). Фрагмент конструкции Genewiz субклонировали в расщепляемый EcoRV/RsRII pSYN-ФВ-031. Genewiz - Последовательность №-10-210746313 (SEQ ID NO: 99)
AGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCG
GTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGGTGGCGGGGGATCCTTACCTGAAACTGGAGCCCTGCGGCCCC GGGTCGTCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAG CTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTT Последовательность одноцепочечного Ф-VIII, содержащего N-концевой пентаглицин, приведена в табл. 17 и 18.
Таблица 15
Нуклеотидная последовательность pSYN-ФВ051 (D1D2D'D3Fc ФВ с распознающим сортазу А мотивом и тромбин-отщепляемым линкером между фрагментом ФВ и Fc) (SEQ ID NO: 100)
1 ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTT
51 GCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC
101 GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATG
151 TACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA
2 01 ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCC
251 TCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT
3 01 AC С GT GACACAG G G G GAC СAAAGAGTCT С CAT GC С CTAT GC С T С CAAAGG
351 GCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT
4 01 ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTG
451 T СAGACAGATAC T T СAACAAGAC CTGCGGGCTGTGTGG СAAC T T T AACAT
501 CTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACC
551 CTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT
601 GAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAAT
651 GCAGAAGGGCCTGTGGGAGCAGTGCCAGCTTCTGAAGAGCACCTCGGTGT
7 01 TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGT
7 51 GAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC
8 01 CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACG
8 51 GCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG
9 01 TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACAT
951 CAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG
10 01 GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGC
1051 GTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG
1101 СAACAC С T G CAT T T G С С GAAACAG С CAGT G GAT С T G CAG CAAT GAAGAAT
1151 GTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC
12 01 AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGA
12 51 TTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG
13 01 ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGC
1351 CTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA
14 01 TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGC
14 51 ATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG
15 01 GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGC
1551 CGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG
1601 ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGG
1651 AACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG
17 01 CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGT
17 51 GCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC
18 01 CCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGA
18 51 CGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG
19 01 CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTG
1951 AACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT
2 0 01 GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGGAATGCAATGAGGCCTGCC
2 051 TGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC
2101 TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCA
2151 G С СAGAAGACAT С T T С T CAGAC CAT СACAC CAT GTGCTACTGT GAGGAT G
22 01 GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGAC
22 51 GCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGGAGCCTATCCTG
2 3 01 TCGGCCCCCCATGGTCAAGCTGGTGTGTCCCGCTGACAACCTGCGGGCTG
2 351 AAGGGCTCGAGTGTACCAAAACGTGCCAGAACTATGACCTGGAGTGCATG
2 4 01 AGCATGGGCTGTGTCTCTGGCTGCCTCTGCCCCCCGGGCATGGTCCGGCA
2 4 51 TGAGAACAGATGTGTGGCCCTGGAAAGGTGTCCCTGCTTCCATCAGGGCA
2 5 01 AGGAGTATGCCCCTGGAGAAACAGTGAAGATTGGCTGCAACACTTGTGTC
2 551 TGTCGGGACCGGAAGTGGAACTGCACAGACCATGTGTGTGATGCCACGTG
2 601 CTCCACGATCGGCATGGCCCACTACCTCACCTTCGACGGGCTCAAATACC
2 651 TGTTCCCCGGGGAGTGCCAGTACGTTCTGGTGCAGGATTACTGCGGCAGT
2 7 01 AACCCTGGGACCTTTCGGATCCTAGTGGGGAATAAGGGATGCAGCCACCC
2 7 51 С T CAGT GAAAT G СAAGAAAC G G GT CAC CAT С С T G GT G GAG G GAG GAGAGA
2 8 01 TTGAGCTGTTTGACGGGGAGGTGAATGTGAAGAGGCCCATGAAGGATGAG
2 8 51 ACTCACTTTGAGGTGGTGGAGTCTGGCCGGTACATCATTCTGCTGCTGGG
2 901 CAAAGCCCTCTCCGTGGTCTGGGACCGCCACCTGAGCATCTCCGTGGTCC
2 951 TGAAGCAGACATACCAGGAGAAAGTGTGTGGCCTGTGTGGGAATTTTGAT
3 0 01 G G CAT С СAGAACAAT GAC С T CAC CAG CAG СAAC С T С СAAGT G GAG GAAGA
3 051 CCCTGTGGACTTTGGGAACTCCTGGAAAGTGAGCTCGCAGTGTGCTGACA
3101 CCAGAAAAGTGCCTCTGGACTCATCCCCTGCCACCTGCCATAACAACATC
3151 AT GAAG CAGAC GAT G GT G GAT T С С T С С T GTAGAAT С С T TAC CAGT GAC GT
32 01 CTTCCAGGACTGCAACAAGCTGGTGGACCCCGAGCCATATCTGGATGTCT
32 51 GCATTTACGACACCTGCTCCTGTGAGTCCATTGGGGACTGCGCCGCATTC
33 01 TGCGACACCATTGCTGCCTATGCCCACGTGTGTGCCCAGCATGGCAAGGT
3351 GGTGACCTGGAGGACGGCCACATTGTGCCCCCAGAGCTGCGAGGAGAGGA
34 01 ATCTCCGGGAGAACGGGTATGAGGCTGAGTGGCGCTATAACAGCTGTGCA
34 51 CCTGCCTGTCAAGTCACGTGTCAGCACCCTGAGCCACTGGCCTGCCCTGT
35 01 GCAGTGTGTGGAGGGCTGCCATGCCCACTGCCCTCCAGGGAAAATCCTGG
3551 ATGAGCTTTTGCAGACCTGCGTTGACCCTGAAGACTGTCCAGTGTGTGAG
3 601 GTGGCTGGCCGGCGTTTTGCCTCAGGAAAGAAAGTCACCTTGAATCCCAG
3 651 TGACCCTGAGCACTGCCAGATTTGCCACTGTGATGTTGTCAACCTCACCT
028309
3701
GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCTGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGG
3751
GGATCCGGCGGTGGAGGTTCCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATC
3801
CGGTGGCGGGGGATCCTTACCTGAAACTGGAGCCCTGCGGCCCCGGGTCG
3851
TCGGCGGTGGAGGTTCCGGTGGCGGGGGATCCGACAAAACTCACACATGC
3901
CCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTT
3951
CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA
4001
CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC
4051
TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA
4101
GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
4151
ACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA
4201
GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
4251
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCA
4301
AGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC
4351
AT С G С С GT G GAGT G G GAGAG CAAT G G G CAG С С G GAGAACAAC TACAAGAC
4401
CACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC
4451
TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC
4501
GT GAT G CAT GAG G С T С T G СACAAC CAC TACAC G СAGAAGAG CCTCTCCCT
4551
GTCTCCGGGTAAATGA
Таблица 16
Белковая последовательность ФВ051 ((D1D2D'D3Fc ФВ с распознающим сортазу А мотивом и тромбин-отщепляемым линкером между фрагментом ФВ и Fc; сайт сортазы А выделен жирным) (SEQ ID NO: 101)
1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG
01 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL
51 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC
01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC
51 EKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGME
01 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC
51 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD
01 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG
51 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM
01 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG
51 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS
01 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL
51 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD
01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD
51 AVLSSPLSHRSKRSLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECM
01 SMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVALERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCV
51 CRDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKYLFPGECQYVLVQDYCGS
01 NPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEWVKRPMKDE
51 THFEWESGRYIILLLGKALSWWDRHLSISWLKQTYQEKVCGLCGNFD
01 GIQNNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNI
51 MKQTMVDSSCRILTSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCAAF
01 CDTIAAYAHVCAQHGKWTWRTATLCPQSCEERNLRENGYEAEWRYNSCA
51 PACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKILDELLQTCVDPEDCPVCE
01 VAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVWLTCEACQEP IS GGGGS GGG
51 GS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS LPETGALRPRWGGGGS GGGGS DKTHTC
01 PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN
51 WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
01 ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD
51 IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS
01 VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
Таблица 17
Нуклеотидная последовательность Ф-VIII 265 (одноцепочечной молекулы Ф-VIII с пентаглицином на N-конце) (SEQ Ш NO: 102)
1 ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTG
51 CTTTAGTGGAGGAGGAGGAGGAGСCACСAGAAGATACTACCTGGGTGCAG
101 TGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTG
151 GACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTC
2 01 AGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCA
2 51 ACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATC
3 01 CAG G С T GAG GT T TAT GATACAGT G GT CAT TACAC T TAAGAACAT G GC T T С
351 CCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTG
4 01 AGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGAT
4 51 AAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGA
5 01 GAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTT
551 CTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTA
601 С TAGTAT GTAGAGAAG G GAGT С T G G С CAAG GAAAAGACACAGAC С T T G СA
651 CAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACT
7 01 CAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGG
751 GCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCC
8 01 AGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAA
8 51 TGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTT
9 01 CTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTT
951 CCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTT
10 01 GT СATAT С T С T T С С CAC СAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TAT G T CAAAGTA
1051 GACAGCTGTCCAGAG GAAC С С СAAC TAC GAAT GAAAAATAAT GAAGAAGC
1101 GGAAGACTAT GAT GAT GAT CTTACT GATT CT GAAAT GGAT GT GGT CAGGT
1151 TTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAG
12 01 AAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTG
12 51 GGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTC
13 01 AATAT T T GAACAAT G G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAGT С
1351 С GAT T TAT G G СATACACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAGC TAT T СA
14 01 GCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACA
14 51 CAC T GT T GAT TATAT T TAAGAAT CAAG CAAG CAGAC СATATAACAT С TAC
15 01 CCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAA
1551 AGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCA
1601 AATATAAAT GGACAGTGACT GTAGAAGAT GGGССAACTAAATCAGAT CCT
1651 CGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCT
17 01 AGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAG
17 51 AT CAAAGAGGAAAC CAGATAAT GT СAGACAAGAGGAAT GT CAT С С T GT T T
18 01 T С T GTAT T T GAT GAGAAC С GAAG CTGGTACCT СACAGAGAATATACAAC G
18 51 CTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAG
19 01 С С T С СAACAT CAT G СACAG CAT CAAT G G С TAT GT T T T T GATAGT T T G CAG
1951 TTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGG
2 001 AGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAAC
2 051 ACAAAAT G GT С TAT GAAGACACAC T CAC С С TAT ТСС CAT T С T CAG GAGAA
2101 ACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCA
2151 CAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTA
22 01 GT T GT GACAAGAACACT GGT GAT TAT TAC GAGGACAGT TAT GAAGATAT T
22 51 T CAG СATAC T T G С T GAGTAAAAACAAT G С CAT T GAAC СAAGAAG С T T С T С
2 3 01 T СAAAAC С CAC CAGT С T T GAAG G С С CAT CAG G С С GAAATAAC TCGTACTA
2351 CTCTT CAGT CAGAT СAAGAG GAAATT GACTAT GAT GATACCATAT CAGTT
2 4 01 GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GACAT T TAT GAT GAG GAT GAAAAT CAGAG
2 4 51 CCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGG
2 5 01 AGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAAC
2 551 AGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGA
2 601 ATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATG
2 651 AACAT TTGGGCCTCCTCGGCC СATATATAAGAG СAGAAGT T GAAGATAAT
2 7 01 ATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTC
2 7 51 TAG С С T TAT T T С T TAT GAG GAAGAT CAGAG G CAAG GAG СAGAAC С TAGAA
2 8 01 AAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAA
2 8 51 CAT СATAT G G CAC С CAC TAAAGAT GAGT T T GAC T G СAAAG CCTGGGCTTA
2 901 TTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGAC
2 951 CCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAA
3001 GTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAA
3 051 AAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCA
3101 ATAT С CAGAT G GAAGAT С С CAC T T T TAAAGAGAAT TAT С G С T T С CAT G CA
3151 AT CAAT G G С TACATAAT G GATACAC TACCTGGCT TAGTAAT G GC T CAG GA
32 01 TCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCC
3251 ATTCTATT CAT T T СAGT G GACAT GTGTTCACTGTAC GAAAAAAAGAG GAG
33 01 TATAAAAT G G CAC T GTACAAT С T С TAT С СAG GT GT T T T T GAGACAGT G GA
3351 AATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCG
34 01 AG CAT С TACAT G С T G G GAT GAG СACAC TTTTTCTGGT GTACAGCAATAAG
3451
TGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGAT
3501
TACAG С T T CAG GACAATAT G GACAGT G G G С С С СAAAG С Т G G С CAGAC Т Т С
3551
ATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGG
3601
AT СAAG GT G GAT С T GT T G G CAC CAAT GAT TAT T CAC G G CAT СAAGAC С СA
3651
GGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCA
3701
T GTATAGT С T T GAT G G GAAGAAGT G G CAGAC T TAT С GAG GAAAT T С CAC T
3751
GGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACA
3801
CAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAA
3851
CTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGAT
3901
T TAAATAGT T G CAG CAT G С CAT T G G GAAT G GAGAGTAAAG СAATAT СAGA
3951
TGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGT
4001
CTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGA
4051
CCT СAG GT GAATAAT С СAAAAGAGT G G С T G СAAGT G GAC T T С CAGAAGAC
4101
AATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCA
4151
GCAT GTAT GT GAAGGAGTT CCT CAT CT CCAGCAGT СAAGAT GGC CATCAG
4201
TGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCA
4251
AGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTC
4301
GCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGG
4351
ATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGA
Таблица 18
Белковая последовательность Ф-VIII 265 (одноцепочечной молекулы Ф-VIII с пентаглицином на N-конце; пентаглицин выделен жирным) (SEQ ID NO: 103)
1 MQIELSTCFFLCLLRFCFSGGGGGATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPV
51 DARFPPRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTI
101 QAEVYDTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDD
151 KVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGAL
2 01 LVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASAR
251 AWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTF
301 LVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKV
351 DSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAK
4 01 KHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKV
451 RFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIY
501 PHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDP
551 RCLTRYYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILF
601 SVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQ
651 LSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGE
7 01 TVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDI
751 SAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKAHQAEITRTTLQSDQEEIDYDDTISV
8 01 EMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRN
851 RAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDN
901 IMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQ
951 HHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQ
1001 VTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHA 1051 INGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEE 1101 YKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNK 1151 CQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSW
12 01 IKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNST 1251 GTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCD
13 01 LNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWR
1351 PQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQ
14 01 WTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPWNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALR 14 51 MEVLGCEAQDLY*
Пример 20. Плазменная стабильность и ФК Плазменную стабильность ФЛПШ98 (которая является одноцепочечной Ф-VШFc-226М6-молекулой, частично содержащей В-домен; где 226 представляет 226 N-концевых аминокислот В-домена Ф-VIII, а N6 представляет шесть участков N-гликозилирования в В-домене) сравнивали с Ф-VIIIFc (Ф-VIII 155/Fc) в в плазме крови мышей с двойным Ф^Ш/ФВ генным нокаутом (ДГН). Схематическое изображение ФЛПШ55 и Ф-VIII198 представлено на фиг. 25.
Для анализа стабильности 5 МЕ/мл белков Ф-VIII 198 или Ф-VIIIFc с мышиной или ДГН плазмой при 37°С. Аликвоты брали для разных временных точек, чтобы измерить активность при помощи хромогенного анализа Ф-VIII. Активность для каждой временной точки измеряли дважды, а среднюю активность наносили на график как функцию времени. Анализ стабильности показал, что наличие частичного В-домена повышает стабильность одноцепочечного Ф-VIIIFc (фиг. 26А).
Время полужизни Ф-VIII 198 (одноцепочечная B226N6) также сравнивали с Ф-VIII155 (одноцепочечный Ф-VIII с удаленным В-доменом) для ДГН мышей. Ф-VIII 198 имеет по менбшей мере приблизительно в 1,5 раз большее время полужизни по сравнению с Ф-VIII155 (фиг. 26Б). Эти эксперименты позволяют предположить, что возможно существование взаимосвязи между стабильностью Ф-VIII и его in-vivo временем полужизни.
Нуклеотидная последовательность белка ФЛГШ198 (Ф-VIIIFc с частичным В-доменом. 226N6)(SEQ ГО N0: 104)
ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTG
CTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGG
101
ACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCT
151
CCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAA
201
GACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAA
251
GGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTAT
301
GATACAGT G GT CAT ТACAC Т ТAAGAACAT G G С Т Т С С CAT С С Т GT CAGT С Т
351
TCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATG
401
AT GAT CAGACCAGT CAAAGGGAGAAAGAAGAT GATAAAGT CT ТСС CT GGT
451
GGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGC
501
CTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGG
551
TAAAAGAC T T GAAT T CAG G С С T CAT T G GAG С С С TAC TAGTAT GTAGAGAA
601
G G GAGT С T G G С CAAG GAAAAGACACAGAC С T T G СACAAAT T TATACTAC T
651
TTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACT
701
CCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATG
751
CACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATG
801
CCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTG
851
AAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCAT
901
CGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAAC
951
ACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCC
1001
ACCAACAT GAT G G CAT G GAAG С T TATGT CAAAGTAGACAGCT GT С CAGAG
1051
GAAC С С СAAC TAC GAAT GAAAAATAAT GAAGAAG С G GAAGAC TAT GAT GA
1101
T GAT CTTACT GATT CT GAAAT GGAT GT GGT CAGGTTT GAT GAT GACAACT
1151
CTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACT
1201
TGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTT
1251
AGTCCTCGCCCCC GAT GACAGAAGT TATAAAAGT CAATAT T T GAACAAT G
1301
G С С С T CAG С G GAT T G GTAG GAAGTACAAAAAAGT С С GAT T TAT G GCATAC
1351
ACAGAT GAAAC С T T TAAGAC T С GT GAAG С TAT T CAG CAT GAAT СAGGAAT
1401
CTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATAT
Т Т AAGAAT CAAG CAAG CAGAC С AT AT AAC AT С T AC С С T CAC G GAAT CAC T GAT GTCCGTCCTTT GTAT T CAAGGAGAT TAC CAAAAGGT GTAAAACAT TT GAAG GAT T T T С CAAT T С T G С СAG GAGAAATAT T СAAATATAAAT G GACAG TGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGC TATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCAT TGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACC AGATAAT GT СAGACAAGAGGAAT GT CAT С CT GT T T T CT GTAT TT GAT GAG AAC С GAAG CTGGTACCT СACAGAGAATATACAAC GCTTTCTCCC CAAT С С AGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGC ACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTG CATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTT CCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATG AAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCG ATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCG GAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACA С T G GT GAT TAT TAC GAG GACAGT TAT GAAGATAT T T CAG СATAC T T G С T G AGTAAAAACAAT G С CAT T GAAC СAAGAAG С T T С T С T СAGAAT T СAAGACA С С С TAG CAC TAG G СAAAAG CAAT T TAAT G С CAC СACAAT T С СAGAAAAT G ACATAGAGAAGAC T GAC CCTTGGTTTG СACACAGAACAC С TAT GC С TAAA ATACAAAATGTCTCCTCTAGTGATTTGTTGATGCTCTTGCGACAGAGTCC TAC T С СACAT G G G С TAT CCT TAT С T GAT С T С СAAGAAG С СAAATAT GAGA CTTTTTCT GAT GAT С CAT CAC С T G GAG СAATAGACAGTAATAACAGC С T G T С T GAAAT GACACAC T T CAG G С СACAG С T С CAT СACAGT G G G GACAT GGT AT TTACCCCT GAGT CAG G С С T С CAAT TAAGAT TAAAT GAGAAAC T GG G GA СAAC T G СAG СAACAGAGT T GAAGAAAC T T GAT T T CAAAGT TTCTAGTACA T СAAATAAT CT GATTT CAACAATT СCAT CAGACAATTT GGCAGCAGGTAC T GATAATACAAGT TCCTTAGGACCCC СAAGTAT G С CAGT T СAT TAT GATA GT CAAT TAGATAC CAC T С TAT T T G G СAAAAAGT CAT CTCCCCTTACT GAG TCTGGTGGACCTCTGAGCTTGAGTGAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTT AGAAT СAG GT T TAAT GAATAG С СAAGAAAGT T CAT G G G GAAAAAAT GTAT CGT CAGAAATAACT CGTACTACT CTT CAGT CAGAT СAAGAGGAAATT GAC TAT GAT GATAC СATAT СAGT T GAAAT GAAGAAG GAAGAT T T T GACAT T TA T GAT GAG GAT GAAAAT CAGAG С С С С С G CAG С Т Т Т СAAAAGAAAACAC GAC ACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGC TCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTT CAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCT ТATАС С GT G GAGAAC ТAAAT GAACAT Т Т G G GAC TCCTGGGGC CATATATA AGAG СAGAAGT T GAAGATAATAT CAT GGTAACTTT CAGAAATCAGGCСT С
х^'ох^^^хгл.х x^^x i^ini x^x r-i.'o ^ ^ x ini x x^x ini U/HJ u/inun x ^nun
G G CAAG GAG СAGAAC С TAGAAAAAAC T T T GT CAAG С С TAAT GAAAC СAAA ACTTACTTTTG GAAAGT G СAACAT СATAT G G CAC С CAC TAAAGAT GAGT T TGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATG TGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTG AACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTT CAC CAT С T T T GAT GAGAC СAAAAG CTGGTACTT CAC T GAAAATAT GGAAA GAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAA GAGAAT TAT С G С T T С CAT G CAAT CAAT G G С TACATAAT G GATACACTAC С TGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCA TGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTC AC T GTAC GAAAAAAAGAG GAGTATAAAAT G G CAC T GTACAATCT CTAT CC AGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGC GGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTT TTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGG ACACAT TAGAGAT T T T CAGAT TACAG CTT CAG GACAATAT G GACAGT G G G CCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGC ACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGAT TATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCT ACAT CT CT CAGTTTAT CAT CAT GTATAGT CTT GAT GGGAAGAAGT GGCAG ACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGT GGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTC GATACAT С С GT T T G CAC С СAAC T CAT TATAG CAT T С G CAG СACT С T T С G С ATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAAT GGAGAGTAAAGCAATAT CAGAT GCACAGATTACT GCTT CAT С CTACTTTA CCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAA
4 651 G G GAG GAGTAAT G С С T G GAGAC С T СAG GT GAATAAT С СAAAAGAGT G G С T
4 7 01 G СAAGT G GAC T T С СAGAAGACAAT GAAAGT СACAG GAGTAAC TAC T CAG G
4 7 51 GAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCC
4 8 01 AGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGT
4 851 AAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTC
4 9 01 TAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGG
4 951 GTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGA
5 0 01 CCTCTACGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCCAGAACTCC
5 051 TGGGCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC
5101 ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA
5151 CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC
52 01 ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT
52 51 GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA
53 01 GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA
5351 CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG
54 01 CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT
54 51 GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG
55 01 GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGAC
5551 GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA
5 601 GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC
5 651 ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Последовательность белка Ф-VIII 198 (SEQ ID NO: 105)
1 MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFP
51 PRVPKSFPFNTSWYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVY
101 DTWITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPG
151 GSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCRE
2 01 GSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKM
251 HTWGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNH
301 RQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPE
351 EPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKT
4 01 WVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAY
451 TDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGIT
501 DVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTR
551 YYSSFWMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDE
601 NP.SWYLTENIQP.FLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCL
651 HEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMS
7 01 MENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLL
751 SKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPK
8 01 IQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSL
851 SEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSST
901 SNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTE
951 SGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSEITRTTLQSDQEEID
1001 YDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQS PRS FQKKTRHYFIAAVERLWDYGMS S
1051 SPHVLRNRAQSGSVPQFKKWFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYI
1101 RAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETK
1151 TYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTL
12 01 NPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFK
1251 ENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVF
13 01 TVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTL
1351 FLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWS
14 01 TKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQ
1451 TYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLR
15 01 MELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQ
1551 GRSNAWRPQWNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLIS
1601 SSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVWSLDPPLLTRYLRIHPQSW
1651 VHQIALRMEVLGCEAQDLYDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL
1701 MISRTP E VT CWVDVS H E D P E VK FNWYVD GVE VHNAKT KPREEQYNSTYR
1751 WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
18 01 PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
1851 GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*
Пример 21. Экспрессия белка D1D2 ФВ.
Правильный фолдинг домена D'D3 важен для его связывания с Ф-VIII.
Пропептид ФВ (D1D2 - аминокислоты 1-763) необходим для эффективного образования дисульфидной связи и фолдинга D'D3. Он действует как внутренний шаперон для фолдинга D'D3. Конструкции ФВ, создающие фрагменты ФВ, также могут экспрессироваться там, где пропептид ФВ (т.е. домен D1D2) напрямую связан с доменом D'D3, и удаляться во время регулярного внутриклеточного процес-синга D'D3 (т.е. в цис-форме), или же, он может экспрессироваться с другой плазмиды, т.е. в трансформе. Гетеродимер Ф^Ш-ФВ был сконструирован таким образом, чтобы D1D2 мог экспрессироваться как в цис-, так и в транс-форме.
Клонирование ФВ 053: клон ФВ 053 экспрессирует пропептид ФВ (домен D1D2) для экспрессии
D1D2 в транс-форме. Пропептид ФВ амплифицировали ПЦР из полноразмерной формы при помощи
ESC 54 и ESC124.
ESC54-q> B прямая с сайтом BsiWl (SEQIDNO: 111)
(CGCTTCGCGACGTACGGCCGCCACCATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTC) ESC 124 - D1D2 клонирующий олиго с сайтом Notl - обратная (SEQIDNO: 112)
(CTAGACTCGAGCGGCCGCTCACCTTTTGCTGCGATGAGACAGGGGACTGCTGAGGACAGC)
Продукт ПЦР расщепляли BsiW1 и Not1 лигировали в BsiW1/Not1-расщепленный пЦДНК 4. Нуклеотидная последовательность ФВ 053 (пропептид D1D2 ФВ) (SEQ ID NO: 113)
ATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTGCTGCTTGCTCTGGCCCTCATTTT
GCCAGGGACCCTTTGTGCAGAAGGAACTCGCGGCAGGTCATCCACGGCCC
101
GATGCAGCCTTTTCGGAAGTGACTTCGTCAACACCTTTGATGGGAGCATG
151
TACAGCTTTGCGGGATACTGCAGTTACCTCCTGGCAGGGGGCTGCCAGAA
201
ACGCTCCTTCTCGATTATTGGGGACTTCCAGAATGGCAAGAGAGTGAGCC
251
TCTCCGTGTATCTTGGGGAATTTTTTGACATCCATTTGTTTGTCAATGGT
301
ACCGTGACACAGGGGGACCAAAGAGTCTCCATGCCCTATGCCTCCAAAGG
351
GCTGTATCTAGAAACTGAGGCTGGGTACTACAAGCTGTCCGGTGAGGCCT
401
ATGGCTTTGTGGCCAGGATCGATGGCAGCGGCAACTTTCAAGTCCTGCTG
451
T СAGACAGATAC T T СAACAAGAC CTGCGGGCTGTGTGG СAAC T T TAACAT
501
CTTTGCTGAAGATGACTTTATGACCCAAGAAGGGACCTTGACCTCGGACC
551
CTTATGACTTTGCCAACTCATGGGCTCTGAGCAGTGGAGAACAGTGGTGT
601
GAACGGGCATCTCCTCCCAGCAGCTCATGCAACATCTCCTCTGGGGAAAT
651
GCAGAAGGGC CT GT GGGAGCAGT GC CAGCTT CT GAAGAGCAC CT С GGT GT
701
TTGCCCGCTGCCACCCTCTGGTGGACCCCGAGCCTTTTGTGGCCCTGTGT
751
GAGAAGACTTTGTGTGAGTGTGCTGGGGGGCTGGAGTGCGCCTGCCCTGC
801
CCTCCTGGAGTACGCCCGGACCTGTGCCCAGGAGGGAATGGTGCTGTACG
851
GCTGGACCGACCACAGCGCGTGCAGCCCAGTGTGCCCTGCTGGTATGGAG
901
TATAGGCAGTGTGTGTCCCCTTGCGCCAGGACCTGCCAGAGCCTGCACAT
951
CAATGAAATGTGTCAGGAGCGATGCGTGGATGGCTGCAGCTGCCCTGAGG
1001
GACAGCTCCTGGATGAAGGCCTCTGCGTGGAGAGCACCGAGTGTCCCTGC
1051
GTGCATTCCGGAAAGCGCTACCCTCCCGGCACCTCCCTCTCTCGAGACTG
1101
CAACAC CT GCAT TT GC CGAAACAGC CAGT GGAT CT GCAGCAATGAAGAAT
1151
GTCCAGGGGAGTGCCTTGTCACTGGTCAATCCCACTTCAAGAGCTTTGAC
1201
AACAGATACTTCACCTTCAGTGGGATCTGCCAGTACCTGCTGGCCCGGGA
1251
TTGCCAGGACCACTCCTTCTCCATTGTCATTGAGACTGTCCAGTGTGCTG
1301
ATGACCGCGACGCTGTGTGCACCCGCTCCGTCACCGTCCGGCTGCCTGGC
1351
CTGCACAACAGCCTTGTGAAACTGAAGCATGGGGCAGGAGTTGCCATGGA
1401
TGGCCAGGACATCCAGCTCCCCCTCCTGAAAGGTGACCTCCGCATCCAGC
1451
ATACAGTGACGGCCTCCGTGCGCCTCAGCTACGGGGAGGACCTGCAGATG
1501
GACTGGGATGGCCGCGGGAGGCTGCTGGTGAAGCTGTCCCCCGTCTATGC
1551
CGGGAAGACCTGCGGCCTGTGTGGGAATTACAATGGCAACCAGGGCGACG
1601
ACTTCCTTACCCCCTCTGGGCTGGCGGAGCCCCGGGTGGAGGACTTCGGG
1651
AACGCCTGGAAGCTGCACGGGGACTGCCAGGACCTGCAGAAGCAGCACAG
1701
CGATCCCTGCGCCCTCAACCCGCGCATGACCAGGTTCTCCGAGGAGGCGT
1751
GCGCGGTCCTGACGTCCCCCACATTCGAGGCCTGCCATCGTGCCGTCAGC
1801
CCGCTGCCCTACCTGCGGAACTGCCGCTACGACGTGTGCTCCTGCTCGGA
1851
CGGCCGCGAGTGCCTGTGCGGCGCCCTGGCCAGCTATGCCGCGGCCTGCG
1901
CGGGGAGAGGCGTGCGCGTCGCGTGGCGCGAGCCAGGCCGCTGTGAGCTG
1951
AACTGCCCGAAAGGCCAGGTGTACCTGCAGTGCGGGACCCCCTGCAACCT
2001
GACCTGCCGCTCTCTCTCTTACCCGGATGAGG7AATGCAATGAGGCCTGCC
2051
TGGAGGGCTGCTTCTGCCCCCCAGGGCTCTACATGGATGAGAGGGGGGAC
2101
TGCGTGCCCAAGGCCCAGTGCCCCTGTTACTATGACGGTGAGATCTTCCA
2151
G С СAGAAGACATCT T CT CAGAC CAT CACAC CAT GT GCTACT GTGAGGATG
2201
GCTTCATGCACTGTACCATGAGTGGAGTCCCCGGAAGCTTGCTGCCTGAC
2251
GCTGTCCTCAGCAGTCCCCTGTCTCATCGCAGCAAAAGG
Белковая последовательность ФВ 053 (пропептид D1D2 ФВ) (SEQ ID NO: 114)
1 MIPARFAGVLLALALILPGTLCAEGTRGRSSTARCSLFGSDFVNTFDGSM
51 YSFAGYCSYLLAGGCQKRSFSIIGDFQNGKRVSLSVYLGEFFDIHLFVNG
101 TVTQGDQRVSMPYASKGLYLETEAGYYKLSGEAYGFVARIDGSGNFQVLL
151 SDRYFNKTCGLCGNFNIFAEDDFMTQEGTLTSDPYDFANSWALSSGEQWC
2 01 ERASPPSSSCNISSGEMQKGLWEQCQLLKSTSVFARCHPLVDPEPFVALC
251 EKTLCECAGGLECACPALLEYARTCAQEGMVLYGWTDHSACSPVCPAGME
301 YRQCVSPCARTCQSLHINEMCQERCVDGCSCPEGQLLDEGLCVESTECPC
351 VHSGKRYPPGTSLSRDCNTCICRNSQWICSNEECPGECLVTGQSHFKSFD
4 01 NRYFTFSGICQYLLARDCQDHSFSIVIETVQCADDRDAVCTRSVTVRLPG
451 LHNSLVKLKHGAGVAMDGQDIQLPLLKGDLRIQHTVTASVRLSYGEDLQM
501 DWDGRGRLLVKLSPVYAGKTCGLCGNYNGNQGDDFLTPSGLAEPRVEDFG
551 NAWKLHGDCQDLQKQHSDPCALNPRMTRFSEEACAVLTSPTFEACHRAVS
601 PLPYLRNCRYDVCSCSDGRECLCGALASYAAACAGRGVRVAWREPGRCEL
651 NCPKGQVYLQCGTPCNLTCRSLSYPDEECNEACLEGCFCPPGLYMDERGD
7 01 CVPKAQCPCYYDGEIFQPEDIFSDHHTMCYCEDGFMHCTMSGVPGSLLPD
751 AVLSSPLSHRSKR
Вышеприведенное описание характерных вариантов реализации раскрывает общий характер данного изобретения в настолько полном объеме, что другие специалисты могут, применяя знания в данной области техники, с легкостью модифицировать и/или адаптировать эти характерные варианты реализации для различных применений, без проведения лишних экспериментов и без отступления от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, такие адаптации и модификации находятся в пределах содержания и серии эквивалентов раскрытых вариантов реализации на основе представленных в данном тексте идеи и методологических принципов. Стоит понимать, что употребляемая в данном тексте фразеология и терминология имеет цель описания, но не ограничения, поэтому специалистам в данной области техники следует интерпретировать терминологию или фразеологию описания настоящего изобретения в свете его идеи и методологических принципов.
Существование других вариантов реализации изобретения будет очевидным для специалистов в данной области техники из приведенных в тексте обсуждения и реализации изобретения. Описание изобретения и примеры стоит рассматривать как иллюстративные, а подлинные суть и объем данного изобретения определены прилагающейся формулой изобретения.
Все перечисленные в данном тексте патентные публикации в полном объеме включены в текст посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ИНК. Чабра, Экта Сет Лю, Туняо Питерс, Роберт
<120> ПОЛИПЕПТИДЫ ХИМЕРНОГО ФАКТОРА VIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130> 2159.359PC04/EKS/C-K/E-H
<140> На присвоение <141> 2013-01-11
<150> США 61/586,099
<151> 2012-01-12
<150> США 61/586,654 <151> 2012-01-13
<150> США 61/667,901 <151> 2012-07-03
<150> США 61/734,954 <151> 2012-12-07
<160> 114
<170> Патентная версия 3.5
<210> 1 <211> 16842 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc tactaaggac ggtctaaacg 120 gccccacgac gaacgagacc gggagtaaaa cggtccctgg gaaacacgtc ttccttgagc 180 gccgtccagt aggtgccggg gatgcagcct tttcggaagt gacttcgtca acacctttga 240 tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc ctggcagggg gctgccagaa 300 ctacgtcgga aaagccttca ctgaagcagt tgtggaaact accctcgtac atgtcgaaac 360 gccctatgac gtcaatggag gaccgtcccc cgacggtctt acgctccttc tcgattattg 420 gggacttcca gaatggcaag agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca 480 tccatttgtt tgtcaatggt tgcgaggaag agctaataac ccctgaaggt cttaccgttc 540 tctcactcgg agaggcacat agaacccctt aaaaaactgt aggtaaacaa acagttacca 600 accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 660 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct tggcactgtg tccccctggt 720 ttctcagagg tacgggatac ggaggtttcc cgacatagat ctttgactcc gacccatgat 780
gttcgacagg ccactccgga atggctttgt ggccaggatc gatggcagcg gcaactttca 840
agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg ctgtgtggca actttaacat 900
taccgaaaca ccggtcctag ctaccgtcgc cgttgaaagt tcaggacgac agtctgtcta 960
tgaagttgtt ctggacgccc gacacaccgt tgaaattgta ctttgctgaa gatgacttta 1020
tgacccaaga agggaccttg acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga 1080
gcagtggaga acagtggtgt gaaacgactt ctactgaaat actgggttct tccctggaac 1140
tggagcctgg gaatactgaa acggttgagt acccgagact cgtcacctct tgtcaccaca 1200
gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 1260
ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt cttgcccgta gaggagggtc 1320
gtcgagtacg ttgtagagga gaccccttta cgtcttcccg gacaccctcg tcacggtcga 1380 agacttctcg tggagccaca ttgcccgctg ccaccctctg gtggaccccg agccttttgt 1440
ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg ctggagtgcg cctgccctgc 1500
aacgggcgac ggtgggagac cacctggggc tcggaaaaca ccgggacaca ctcttctgaa 1560 acacactcac acgacccccc gacctcacgc ggacgggacg cctcctggag tacgcccgga 1620 cctgtgccca ggagggaatg gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag 1680 tgtgccctgc tggtatggag ggaggacctc atgcgggcct ggacacgggt cctcccttac 1740 cacgacatgc cgacctggct ggtgtcgcgc acgtcgggtc acacgggacg accatacctc 1800 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 1860 tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg atatccgtca cacacagggg 1920 aacgcggtcc tggacggtct cggacgtgta gttactttac acagtcctcg ctacgcacct 1980 accgacgtcg acgggactcc gacagctcct ggatgaaggc ctctgcgtgg agagcaccga 2040 gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc acctccctct ctcgagactg 2100 ctgtcgagga cctacttccg gagacgcacc tctcgtggct cacagggacg cacgtaaggc 2160 ctttcgcgat gggagggccg tggagggaga gagctctgac caacacctgc atttgccgaa 2220 acagccagtg gatctgcagc aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat 2280 cccacttcaa gagctttgac gttgtggacg taaacggctt tgtcggtcac ctagacgtcg 2340 ttacttctta caggtcccct cacggaacag tgaccagtta gggtgaagtt ctcgaaactg 2400 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 2460 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg ttgtctatga agtggaagtc 2520 accctagacg gtcatggacg accgggccct aacggtcctg gtgaggaaga ggtaacagta 2580 actctgacag gtcacacgac atgaccgcga cgctgtgtgc acccgctccg tcaccgtccg 2640
gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat ggggcaggag ttgccatgga 2700
tactggcgct gcgacacacg tgggcgaggc agtggcaggc cgacggaccg gacgtgttgt 2760
cggaacactt tgacttcgta ccccgtcctc aacggtacct tggccaggac atccagctcc 2820 ccctcctgaa aggtgacctc cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct 2880
acggggagga cctgcagatg accggtcctg taggtcgagg gggaggactt tccactggag 2940
gcgtaggtcg tatgtcactg ccggaggcac gcggagtcga tgcccctcct ggacgtctac 3000
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 3060
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg ctgaccctac cggcgccctc 3120 cgacgaccac ttcgacaggg ggcagatacg gcccttctgg acgccggaca cacccttaat 3180 gttaccgttg gtcccgctgc acttccttac cccctctggg ctggcrgagc cccgggtgga 3240 ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag gacctgcaga agcagcacag 3300 tgaaggaatg ggggagaccc gaccgyctcg gggcccacct cctgaagccc ttgcggacct 3360 tcgacgtgcc cctgacggtc ctggacgtct tcgtcgtgtc cgatccctgc gccctcaacc 3420 cgcgcatgac caggttctcc gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg 3480
cctgccatcg tgccgtcagc gctagggacg cgggagttgg gcgcgtactg gtccaagagg 3540
ctcctccgca cgcgccagga ctgcaggggg tgtaagctcc ggacggtagc acggcagtcg 3600 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 3660
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg ggcgacggga tggacgcctt 3720
gacggcgatg ctgcacacga ggacgagcct gccggcgctc acggacacgc cgcgggaccg 3780
gtcgatacgg cgccggacgc cggggagagg cgtgcgcgtc gcgtggcgcg agccaggccg 3840
ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag tgcgggaccc cctgcaacct 3900 gcccctctcc gcacgcgcag cgcaccgcgc tcggtccggc gacactcgac ttgacgggct 3960 ttccggtcca catggacgtc acgccctggg ggacgttgga gacctgccgc tctctctctt 4020 acccggatga ggaatgcaat gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct 4080
acatggatga gaggggggac ctggacggcg agagagagaa tgggcctact ccttacgtta 4140
ctccggacgg acctcccgac gaagacgggg ggtcccgaga tgtacctact ctcccccctg 4200 tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 4260 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg acgcacgggt tccgggtcac 4320 ggggacaatg atactgccac tctagaaggt cggtcttctg tagaagagtc tggtagtgtg 4380 gtacacgatg acactcctac gcttcatgca ctgtaccatg agtggagtcc ccggaagctt 4440 gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc agcaaaagga gcctatcctg 4500
cgaagtacgt gacatggtac tcacctcagg ggccttcgaa cgacggactg cgacaggagt 4560 cgtcagggga cagagtagcg tcgttttcct cggataggac tcggcccccc atggtcaagc 4620 tggtgtgtcc cgctgacaac ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga 4680 actatgacct ggagtgcatg agccgggggg taccagttcg accacacagg gcgactgttg 4740 gacgcccgac ttcccgagct cacatggttt tgcacggtct tgatactgga cctcacgtac 4800 agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 4860 tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca tcgtacccga cacagagacc 4920 gacggagacg gggggcccgt accaggccgt actcttgtct acacaccggg acctttccac 4980 agggacgaag gtagtcccgt aggagtatgc ccctggagaa acagtgaaga ttggctgcaa 5040 cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac catgtgtgtg atgccacgtg 5100 tcctcatacg gggacctctt tgtcacttct aaccgacgtt gtgaacacag acagccctgg 5160 ccttcacctt gacgtgtctg gtacacacac tacggtgcac ctccacgatc ggcatggccc 5220 actacctcac cttcgacggg ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg 5280
tgcaggatta ctgcggcagt gaggtgctag ccgtaccggg tgatggagtg gaagctgccc 5340
gagtttatgg acaaggggcc cctcacggtc atgcaagacc acgtcctaat gacgccgtca 5400 aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 5460 tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgggaccct ggaaagccta 5520 ggatcacccc ttattcccta cgtcggtggg gagtcacttt acgttctttg cccagtggta 5580 ggaccacctc cctcctctct ttgagctgtt tgacggggag gtgaatgtga agaggcccat 5640
gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg tacatcattc tgctgctggg 5700
aactcgacaa actgcccctc cacttacact tctccgggta cttcctactc tgagtgaaac 5760 tccaccacct cagaccggcc atgtagtaag acgacgaccc caaagccctc tccgtggtct 5820 gggaccgcca cctgagcatc tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg 5880
gcctgtgtgg gaattttgat gtttcgggag aggcaccaga ccctggcggt ggactcgtag 5940
aggcaccagg acttcgtctg tatggtcctc tttcacacac cggacacacc cttaaaacta 6000 ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 6060 tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccgtaggtct tgttactgga 6120 gtggtcgtcg ttggaggttc acctccttct gggacacctg aaacccttga ggacctttca 6180 ctcgagcgtc acacgactgt ccagaaaagt gcctctggac tcatcccctg ccacctgcca 6240 taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt agaatcctta ccagtgacgt 6300 ggtcttttca cggagacctg agtaggggac ggtggacggt attgttgtag tacttcgtct 6360
gctaccacct aaggaggaca tcttaggaat ggtcactgca cttccaggac tgcaacaagc 6420 tggtggaccc cgagccatat ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca 6480 ttggggactg cgcctgcttc gaaggtcctg acgttgttcg accacctggg gctcggtata 6540 gacctacaga cgtaaatgct gtggacgagg acactcaggt aacccctgac gcggacgaag 6600 tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 6660 aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga acgctgtggt aacgacggat 6720 acgggtgcac acacgggtcg taccgttcca ccactggacc tcctgccggt gtaacacggg 6780 ggtctcgacg ctcctctcct atctccggga gaacgggtat gagtgtgagt ggcgctataa 6840 cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct gagccactgg cctgccctgt 6900 tagaggccct cttgcccata ctcacactca ccgcgatatt gtcgacacgt ggacggacag 6960
ttcagtgcac agtcgtggga ctcggtgacc ggacgggaca gcagtgtgtg gagggctgcc 7020
atgcccactg ccctccaggg aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg 7080 aagactgtcc agtgtgtgag cgtcacacac ctcccgacgg tacgggtgac gggaggtccc 7140 ttttaggacc tactcgaaaa cgtctggacg caactgggac ttctgacagg tcacacactc 7200 gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 7260 cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct caccgaccgg ccgcaaaacg 7320 gagtcctttc tttcagtgga acttagggtc actgggactc gtgacggtct aaacggtgac 7380
actacaacag ttggagtgga gtgaagcctg ccaggagccg ggaggcctgg tggtgcctcc 7440
cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag gacatctcgg aaccgccgtt 7500 cacttcggac ggtcctcggc cctccggacc accacggagg gtgtctacgg ggccactcgg 7560 ggtggtgaga catacacctc ctgtagagcc ttggcggcaa gcacgatttc tactgcagca 7620 ggctactgga cctggtcttc ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg 7680 aagtgctgaa ggcctttgtg cgtgctaaag atgacgtcgt ccgatgacct ggaccagaag 7740 gacgacctac cgaggaggtc cgacaggctc cgactcaaac ttcacgactt ccggaaacac 7800
gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 7860
taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc cacctgtact acctcgccga 7920 cgcgtagagg gtcttcaccc aggcgcaccg gcaccacctc atggtgctgc cgagggtgcg 7980 gatgtagccc gagttcctgg ggaagcgacc gtcagagctg cggcgcattg ccagccaggt 8040 gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc ttgaaataca cactgttcca 8100 ccttcgctgg cagtctcgac gccgcgtaac ggtcggtcca cttcatacgc ccgtcggtcc 8160 accggaggtg gtcgctccag aactttatgt gtgacaaggt aatcttcagc aagatcgacc 8220
gccctgaagc ctcccgcatc gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt 8280 cccggaactt tgtccgctac ttagaagtcg ttctagctgg cgggacttcg gagggcgtag 8340 cgggacgagg actaccggtc ggtcctcggg gttgcctaca gggccttgaa acaggcgatg 8400 gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 8460 aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg caggtcccgg acttcttctt 8520 cttccagtaa cactagggcc acccgtaacc cggggtacgg ttggagttcg tctaggcgga 8580 gtagctcttc gtccggggac agaacaaggc cttcgtgctg agcagtgtgg atgagctgga 8640 gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt gcccctgaag cccctcctcc 8700 tcttgttccg gaagcacgac tcgtcacacc tactcgacct cgtcgtttcc ctgctctagc 8760 aatcgatgga gacactggaa cggggacttc ggggaggagg tactctgccc cccgacatgg 8820 cacaagtcac tgtgggcccg gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact 8880
ccatggttct ggatgtggcg atgagacggg gggctgtacc gtgttcagtg acacccgggc 8940
cccgagaacc cccaaagctg ggaccccggg ttctccttga ggtaccaaga cctacaccgc 9000 ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 9060 atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca aagcaggacc ttcctagcct 9120 gttttaacca cttcggctga agttgtcctc gttcctcaag tacctcctcc actaagtcgc 9180 ctacctacac ccggtcctgt gcatccacgt cacggtgctg cagtactcct acatggtgac 9240 cgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac atcctgcagc gggtgcgaga 9300 cgtaggtgca gtgccacgac gtcatgagga tgtaccactg gcacctcatg gggaagtcgc 9360 tccgtgtcag gtttcccctg taggacgtcg cccacgctct gatccgctac cagggcggca 9420 acaggaccaa cactgggctg gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc 9480
agggtgaccg ggagcaggcg ctaggcgatg gtcccgccgt tgtcctggtt gtgacccgac 9540
cgggacgcca tggagagact ggtgtcgaag aaccagtcgg tcccactggc cctcgtccgc 9600
cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 9660
ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg gggttggacc agatgtacca 9720
gtggccttta ggacggagac tactctagtt ctccgacgga cctctgtagg tccaccacgg 9780
gtaacctcac ccgggattac ccaacgtgca ggagctggag aggattggct ggcccaatgc 9840
ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag gctcctgacc tggtgctgca 9900
ggttgcacgt cctcgacctc tcctaaccga ccgggttacg gggataggag taggtcctga 9960
aactctgcga gggggctctc cgaggactgg accacgacgt gaggtgctgc tccggagagg 10020
ggctgcagat ccccaccctc tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc 10080
ttctcctgga tggctcctcc ctccacgacg aggcctctcc ccgacgtcta ggggtgggag 10140 aggggacgtg gactgacgtc ggtcggggac ctgcactagg aagaggacct accgaggagg 10200 agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 10260 gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc tcaaagggtc gaagaataaa 10320 actactttac ttctcaaagc ggttccgaaa gtaaagtttt cggttatatc ccggagcaga 10380 gtgagtccac agtcacgacg agtatggaag catcaccacc attgacgtgc catggaacgt 10440 ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc atgcagcggg agggaggccc 10500 tcataccttc gtagtggtgg taactgcacg gtaccttgca ccagggcctc tttcgggtaa 10560 acgactcgga acacctgcag tacgtcgccc tccctccggg cagccaaatc ggggatgcct 10620 tgggctttgc tgtgcgatac ttgacttcag aaatgcatgg tgccaggccg ggagcctcaa 10680 aggcggtggt catcctggtc gtcggtttag cccctacgga acccgaaacg acacgctatg 10740 aactgaagtc tttacgtacc acggtccggc cctcggagtt tccgccacca gtaggaccag 10800 acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 10860 acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag tgcctgcaga gacacctaag 10920 tcacctacgt cgtcgactac ggcggtccag gttgtctcac tgtcacaagg gataacctta 10980 acctctagcg atgctacgtc cccagctacg gatcttggca ggcccagcag gcgactccaa 11040 cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg gtcaccttgg gcaattcctt 11100 gggtcgatgc ctagaaccgt ccgggtcgtc cgctgaggtt gcaccacttc gaggtcgctt 11160 agcttctgga gggatggtac cagtggaacc cgttaaggaa cctccacaaa ctgtgctctg 11220
gatttgttag gatttgcatg gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga 11280
ccttgccaga ccagtgccac ggaggtgttt gacacgagac ctaaacaatc ctaaacgtac 11340 ctactcctac ccttactctt ctccgggccc ctgcagacct ggaacggtct ggtcacggtg 11400 accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 11460 cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg tggcactgaa cggtcggtct 11520 accggtctgg aacgacttct cagtagccca gttgacactg gcccccgact ccggaagcac 11580
gggattgtcg gtcaggggac ttaaagtgga agagacctgt ggctgccgct ggacctgccc 11640
ctgygtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc tttgatgggc agaatttcaa 11700 aatttcacct tctctggaca ccgacggcga cctggacggg gacrcacacg tgtccgtcga 11760 ggtgagccgt gtagcactgg aaactacccg tcttaaagtt gctgactggc agctgttctt 11820 atgtcctatt tcaaaacaag gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca 11880 gccctggagc aaggcagggc cgactgaccg tcgacaagaa tacaggataa agttttgttc 11940
ctcgtcctgg acctccacta agaggtatta ccacggacgt cgggacctcg ttccgtcccg 12000 tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagstgca cagtgacatg 12060 gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg acgtacttta ggtagctcca 12120 cttcgtgtca cgggagaggc agctcsacgt gtcactgtac ctccactgcc acttaccctc 12180 tgaccagaga caaggaatgc tgggtgggaa catggaagtc aacgtttatg gtgccatcat 12240 gcatgaggtc agattcaatc accttggtca catcttcaca ttcactccac aaaacaatga 12300 acccaccctt gtaccttcag ttgcaaatac cacggtagta cgtactccag tctaagttag 12360 tggaaccagt gtagaagtgt aagtgaggtg ttttgttact gttccaactg cagctcagcc 12420 ccaagacttt tgcttcaaag acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca 12480 atgacttcat gctgagggat caaggttgac gtcgagtcgg ggttctgaaa acgaagtttc 12540 tgcataccag acacacccta gacactactc ttgcctcggt tactgaagta cgactcccta 12600 ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca gcggccaggg 12660 cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgtgtcagt ggtgtctgac 12720 cttttgtgaa caagtcctta cctgacacgt cgccggtccc gtctgcacgg tcgggtagga 12780 cctcctcgtc acagaacagg ccgacagctc ccactgccag gtcctcctct taccactgtt 12840 tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc cacattctat gccatctgcc agcaggacag 12900
ggctgtcgag ggtgacggtc caggaggaga atggtgacaa acgacttacg gtgttccagg 12960
accgaggtcg gtgtaagata cggtagacgg tcgtcctgtc ttgccaccag gagcaagtgt 13020 gtgaggtgat cgcctcttat gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga 13080 ggacacctga tttctgtgct aacggtggtc ctcgttcaca cactccacta gcggagaata 13140 cgggtggaga cagcctggtt gccccagacg caactgacct cctgtggact aaagacacga 13200 atgtcatgcc caccatctct ggtctacaac cactgtgagc atggctgtcc ccggcactgt 13260 gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag tacagtacgg gtggtagaga 13320 ccagatgttg gtgacactcg taccgacagg ggccgtgaca ctaccgttgc actcgaggac 13380 acccctggta gggaggcttc gctgtttctg ccctccagat aaagtcatgt tggaaggcag 13440 ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg cattggtgag gatggagtcc agcaccagtt 13500 cgacaaagac gggaggtcta tttcagtaca accttccgtc gacacaggga cttctccgga 13560 cgtgagtcac gtaaccactc ctacctcagg tcgtggtcaa cctggaagcc tgggtcccgg 13620 accaccagcc ctgtcagatc tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc 13680 agccctgccc cacggccaaa ggaccttcgg acccagggcc tggtggtcgg gacagtctag 13740
acgtgtacgg agtcgcccgc cttccagttg acgtgttgcg tcgggacggg gtgccggttt 13800
gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga ccagtgctgc 13860 cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc cgagggtgca caccggacac 13920 acttcatcgg gcggaggcgg tcttacgtct ggtcacgacg gggctcatac tcacacacac 13980 actgggtcac tcgacactgg tgcccccagt gcctcactgt gaacgtggcc tccagcccac 14040 actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc gcctgcagga aggaggagtg 14100
acgggggtca cggagtgaca cttgcaccgg aggtcgggtg tgactggttg ggaccgctca 14160
cgtctgggtt gaagtggacg cggacgtcct tcctcctcac caaaagagtg tccccaccct 14220 cctgcccccc gcaccgtttg cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt 14280
gtgcctgcaa ctgtgtcaac gttttctcac aggggtggga ggacgggggg cgtggcaaac 14340
gggtgggaag ccttctgggt cacgacacta ctcatactca cacggacgtt gacacagttg 14400 tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaaccg ccaccaatga ctgtggctgt 14460 accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc aggtgtcact cgacagggga 14520
acccatgaac cggagttggc ggtggttact gacaccgaca tggtgttggt ggacggaagg 14580
gctgttccac acacaggtgg gaagcaccat ctaccctgtg ggccagttct gggaggaggg 14640 ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg atgggcctcc gcgtggccca 14700 cttcgtggta gatgggacac ccggtcaaga ccctcctccc gacgctacac acgtggacgt 14760 ggctgtacct cctacggcac tacccggagg cgcaccgggt gtgctcccag aagccctgtg 14820 aggacagctg tcggtcgggc ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt 14880 gcctgccatc tgcctgtgag cacgagggtc ttcgggacac tcctgtcgac agccagcccg 14940 aagtgaatgc aagacgtact tccgctcacg acaccttcca cggacggtag acggacactc 15000 gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 15060 tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg caccactgac cgagtggcgc 15120 ccccctgagg gtcagaagga ccttctcaca gccgagggtc acccggaggg gcctcttggg 15180 gacggagtag ttactcacac tccgagtgaa ggaggaggtc tttatacaac aaaggaacgt 15240 ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc tttcagctga gctgtaagac 15300 aggctcactt cctcctccag aaatatgttg tttccttgca gaggacgggg gtcgacctcc 15360 agggacagac ggggagcccg aaagtcgact cgacattctg ctcagcgtgc tgcccaagct 15420 gtcgctgtga gcgcatggag gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga 15480 ctgtgatgat cgatgtgtgc gagtcgcacg acgggttcga cagcgacact cgcgtacctc 15540 cggacgtacg agttaccgtg acagtaaccc gggcccttct gacactacta gctacacacg 15600
acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 15660
aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag tgctggacgg cgacgtacca 15720 cgtccacccc cagtagagac ctaagttcga cctcacgtcc ttctggtgga cgttggggac 15780 gggggaccca atgttccttc aaaataacac aggtgaatgt tgtgggagat gtttgcctac 15840 ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca ctgaagcgtg atgagacgct 15900 ttttattgtg tccacttaca acaccctcta caaacggatg ccgaacgtgg taagtcgatt 15960 ctcctcctgt ctagtactgt gacttcgcac tactctgcga ccaggatggc tgtgatactc 16020 acttctgcaa ggtcaatgag agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc 16080 caccctttga tgaacacaag ggtcctaccg acactatgag tgaagacgtt ccagttactc 16140 tctcctctca tgaagaccct cttctcccag tgtccgacgg gtgggaaact acttgtgttc 16200 tgtcttgctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 16260 gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg acagaacgac tccctccatt 16320 ttaatacttt taaggtccgt ggacgacact gtgtacactc ctcggactca cgttgctgta 16380 gtgacggtcc gacgtcatac tcaaggtggg aagctgtaag tctgaagtag aggtggatat 16440 ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac tccattgaca tcaacgatgt 16500 agttccaccc ttcgacattc agacttcatc tccacctata ggtgatgacg gtcccgttta 16560 cacggtcgtt tcggtacatg aggtaactgt agttgctaca gcaggaccag tgctcctgct 16620 gctctccgac acggacggag cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg 16680 tgtaccatga ggttctcaat cgtcctggtc acgaggacga cgagaggctg tgcctgcctc 16740 gggtacgtcc accgggacgt gacgtggtta ccgagacaac acatggtact ccaagagtta 16800 gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 16842
<210> 2 <211> 2813 <212> Белок
<213> Homo sapiens
<220>
<221> примечание <222> (1)..(22)
<223> Сигнальный пептид ФВ
<220>
<221> примечание
<222> (23)..(763)
<223> БЮ2-участок ФВ
<220>
<221> примечание
<222> (764)..(866)
<223> Домен Б'ФВ
<220>
<221> примечание
<222> (867)..(1240)
<223> Домен D3 ФВ
<220>
<221> примечание
<222> (1241)..(1479)
<223> Домен A1 ФВ
<220>
<221> примечание
<222> (2016)..(2016)
<223> Xaa может являться аминокислотой природного происхождения
<400> 2
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185
190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680
685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
1235 1240 1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
1250 1255 1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
1265 1270 1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
1280 1285 1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
1295 1300 1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
1310 1315 1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
1325 1330 1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
1340 1345 1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
1355 1360 1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
1370 1375 1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
1385 1390 1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
1400 1405 1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
1415 1420 1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
1430 1435 1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
1445 1450 1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met
1460 1465 1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu
1475 1480 1485
Gly Pro Lys Arg Asn Ser Met Val Leu Asp Val Ala Phe Val Leu
1490 1495 1500
Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala Asp Phe Asn Arg Ser Lys
1505 1510 1515
Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg Met Asp Val Gly Gln Asp
1520 1525 1530
Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr Ser Tyr Met Val Thr Val
1535 1540 1545
Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser Lys Gly Asp Ile Leu Gln
1550 1555 1560
Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly Gly Asn Arg Thr Asn Thr
1565 1570 1575
Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp His Ser Phe Leu Val Ser
1580 1585 1590
Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr
1595 1600 1605
Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile
1610 1615 1620
Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu
1625 1630 1635
Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp
1640 1645 1650
Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg
1655 1660 1665
Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile Pro Thr Leu Ser Pro Ala
1670 1675 1680
Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val Ile Leu Leu Leu Asp Gly
1685 1690 1695
Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe Asp Glu Met Lys Ser Phe
1700 1705 1710
Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn Ile Gly Pro Arg Leu Thr
1715 1720 1725
Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser Ile Thr Thr Ile Asp Val
1730 1735 1740
Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala His Leu Leu Ser Leu Val
1745 1750 1755
Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro Ser Gln Ile Gly Asp Ala
1760 1765 1770
Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr Ser Glu Met His Gly Ala
1775 1780 1785
Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val Ile Leu Val Thr Asp Val
1790 1795 1800
Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ser Asn
1805 1810 1815
Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile Gly Asp Arg Tyr Asp Ala
1820 1825 1830
Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro Ala Gly Asp Ser Asn Val
1835 1840 1845
Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu Pro Thr Met Val Thr Leu
1850 1855 1860
Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys Ser Gly Phe Val Arg Ile
1865 1870 1875
Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys Arg Pro Gly Asp Val Trp
1880 1885 1890
Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val Thr Cys Gln Pro Asp Gly
1895 1900 1905
Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val Asn Cys Asp Arg Gly Leu
1910 1915 1920
Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser Pro Val Lys Val Glu Glu
1925 1930 1935
Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro Cys Val Cys Thr Gly Ser
1940 1945 1950
Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp Gly Gln Asn Phe Lys Leu
1955 1960 1965
Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe Gln Asn Lys Glu Gln Asp
1970 1975 1980
Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala Cys Ser Pro Gly Ala Arg
1985 1990 1995
Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val Lys His Ser Ala Leu Ser
2000 2005 2010
Val Glu Xaa His Ser Asp Met Glu Val Thr Val Asn Gly Arg Leu
2015 2020 2025
Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn Met Glu Val Asn Val Tyr
2030 2035 2040
Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe Asn His Leu Gly His Ile
2045 2050 2055
Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu Phe Gln Leu Gln Leu Ser
2060 2065 2070
Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr Gly Leu Cys Gly Ile Cys
2075 2080 2085
Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met Leu Arg Asp Gly Thr Val
2090 2095 2100
Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln Glu Trp Thr Val Gln Arg
2105 2110 2115
Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu Glu Glu Gln Cys Leu Val
2120 2125 2130
Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu Leu Leu Pro Leu Phe Ala
2135 2140 2145
Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala Thr Phe Tyr Ala Ile Cys
2150 2155 2160
Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln Val Cys Glu Val Ile Ala
2165 2170 2175
Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn Gly Val Cys Val Asp Trp
2180 2185 2190
Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser Cys Pro Pro Ser Leu Val
2195 2200 2205
Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro Arg His Cys Asp Gly Asn
2210 2215 2220
Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser Glu Gly Cys Phe Cys Pro
2225 2230 2235
Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser Cys Val Pro Glu Glu Ala
2240 2245 2250
Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly Val Gln His Gln Phe Leu
2255 2260 2265
Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro Cys Gln Ile Cys Thr Cys
2270 2275 2280
Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr Thr Gln Pro Cys Pro Thr
2285 2290 2295
Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys Glu Val Ala Arg Leu Arg
2300 2305 2310
Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu Tyr Glu Cys Val Cys Asp
2315 2320 2325
Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val Pro His Cys Glu Arg Gly
2330 2335 2340
Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly Glu Cys Arg Pro Asn Phe
2345 2350 2355
Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys Lys Arg Val Ser Pro Pro
2360 2365 2370
Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr Leu Arg Lys Thr Gln Cys
2375 2380 2385
Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn Cys Val Asn Ser Thr Val
2390 2395 2400
Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser Thr Ala Thr Asn Asp Cys
2405 2410 2415
Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro Asp Lys Val Cys Val His
2420 2425 2430
Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln Phe Trp Glu Glu Gly Cys
2435 2440 2445
Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu Asp Ala Val Met Gly Leu
2450 2455 2460
Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro Cys Glu Asp Ser Cys Arg
2465 2470 2475
Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu Gly Glu Cys Cys Gly Arg
2480 2485 2490
Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val Thr Gly Ser Pro Arg Gly
2495 2500 2505
Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val Gly Ser Gln Trp Ala Ser
2510 2515 2520
Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu Cys Val Arg Val Lys Glu
2525 2530 2535
Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val Ser Cys Pro Gln Leu Glu
2540 2545 2550
Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln Leu Ser Cys Lys Thr Ser
2555 2560 2565
Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu Arg Met Glu Ala Cys Met
2570 2575 2580
Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly Lys Thr Val Met Ile Asp
2585 2590 2595
Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys 2600 2605
Met Val Gln Val Gly Val Ile Ser
2610
Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg 2615 2620
Lys Thr Thr Cys Asn Pro Cys Pro
2625
Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn 2630 2635
Asn Thr Gly Glu Cys Cys Gly Arg 2640
Cys Leu
2645
Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln Leu Arg Gly Gly Gln Ile
2650 2655
Met Thr 2660
Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu Gln Asp Gly Cys Asp Thr
2665 2670
His Phe 2675
Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly Glu Tyr Phe Trp Glu Lys 2680 2685
Arg Val 2690
Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp Glu His Lys Cys Leu Ala 2695 2700
Glu Gly 2705
Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro Gly Thr Cys Cys Asp Thr
2710 2715
Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn 2720 2725
Asp Ile Thr Ala Arg Leu Gln Tyr
2730
Val Lys Val Gly Ser Cys Lys
2735 2740
Ser Glu Val Glu Val Asp Ile His
2745
Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala 2750 2755
Ser Lys Ala Met Tyr Ser Ile Asp
2760
Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln 2765 2770
Cys Ser Cys Cys Ser Pro Thr Arg
2775
Thr Glu Pro Met Gln Val Ala 2780 2785
Leu His Cys Thr Asn Gly Ser Val
2790
Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met Glu Cys Lys Cys Ser Pro
2795 2800 2805
Arg Lys Cys Ser Lys
2810
<210> 3 <211> 11 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> полипептид
<400> 3
Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro
1 5 10
<210> 4 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> полипептид
<400> 4
His Gln Ser Leu Gly Thr Gln 1 5
<210> 5 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> полипептид
<400> 5
His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys 1 5
<210> 6 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> полипептид
<400> 6
His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys
1 5
<210> 7 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> полипептид <400> 7
Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln 1 5
<210> 8 <211> 20 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 8
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala
<210> 9 <211> 20 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 9
Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser 20
<210> 10 <211> 20 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 10
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser Ser 20
<210> 11
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность PAS <400> 11
Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala
1 5 10 15
Ser Pro Ser
<210> 12 <211> 20 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 12
Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Pro Ala 20
<210> 13 <211> 24 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 13
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala
<210> 14 <211> 20 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность PAS
<400> 14
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala 20
<210> 15 <211> 19 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Сигнальный пептид ФУШ
<400> 15
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser
<210> 16
<211> 2332 <212> Белок <213> Homo sapiens
<400> 16
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg
740 745 750
Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys
755 760 765
Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn
770 775 780
Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro
785 790 795 800
His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe
805 810 815
Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser
820 825 830
Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val
835 840 845
Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly
850 855 860
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser
865 870 875 880
Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala
885 890 895
Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His
900 905 910
Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro
915 920 925
Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp
930 935 940
Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp
945 950 955 960
Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys
965 970 975
Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys
980 985 990
Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala
995 1000 1005
Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu
1010 1015 1020
Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu
1025 1030 1035
Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp
1040 1045 1050
Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr
1055 1060 1065
Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly
1070 1075 1080
Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys
1085 1090 1095
Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His
1100 1105 1110
Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln
1115 1120 1125
Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr
1145 1150 1155
Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn
1160 1165 1170
Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His
1175 1180 1185
Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr
1190 1195 1200
Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr
1205 1210 1215
Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg
1220 1225 1230
Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu
1235 1240 1245
Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys
1250 1255 1260
His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu
1265 1270 1275
Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys
1280 1285 1290
Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr
1295 1300 1305
Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu
1310 1315 1320
Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr
1340 1345 1350
Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser
1355 1360 1365
Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala
1370 1375 1380
Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser
1385 1390 1395
Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser
1400 1405 1410
Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val
1415 1420 1425
Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu
1430 1435 1440
Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu
1445 1450 1455
Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys
1460 1465 1470
Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr
1475 1480 1485
Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys
1490 1495 1500
Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu
1505 1510 1515
Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile
1520 1525 1530
Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg
1535 1540 1545
Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp
1550 1555 1560
Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu
1565 1570 1575
Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys
1580 1585 1590
Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His
1595 1600 1605
Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu
1610 1615 1620
Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln
1625 1630 1635
Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr
1640 1645 1650
Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile
1655 1660 1665
Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp
1670 1675 1680
Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr
1685 1690 1695
Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser
1700 1705 1710
Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro
1715 1720 1725
Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe
1730 1735 1740
Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
1745 1750 1755
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val
1760 1765 1770
Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser
1775 1780 1785
Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
1790 1795 1800
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys
1805 1810 1815
Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys
1820 1825 1830
Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His
1835 1840 1845
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
1850 1855 1860
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
1865 1870 1875
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1880 1885 1890
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1895 1900 1905
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1910 1915 1920
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1925 1930 1935
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1940 1945 1950
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1955 1960 1965
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1970 1975 1980
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1985 1990 1995
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
2000 2005 2010
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
2015 2020 2025
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
2030 2035 2040
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
2045 2050 2055
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
2060 2065 2070
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
2075 2080 2085
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
2090 2095 2100
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
2105 2110 2115
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
2120 2125 2130
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
2135 2140 2145
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
2150 2155 2160
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
2165 2170 2175
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
2180 2185 2190
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
2195 2200 2205
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
2210 2215 2220
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
2225 2230 2235
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
2240 2245 2250
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
2255 2260 2265
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
2270 2275 2280
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
2285 2290 2295
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
2300 2305 2310
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
2315 2320 2325
Gln Asp Leu Tyr
2330
<210> 17 <211> 7053
<212> ДНК <213> Homo sapiens
<400> 17
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctcccaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340 ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400 atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460 gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520 cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580
catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640 aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700 tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760 agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820 tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880 aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940 aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct 3000 gctttgttga ctaaagataa tgccttattc aaagttagca tctctttgtt aaagacaaac 3060 aaaacttcca ataattcagc aactaataga aagactcaca ttgatggccc atcattatta 3120 attgagaata gtccatcagt ctggcaaaat atattagaaa gtgacactga gtttaaaaaa 3180 gtgacacctt tgattcatga cagaatgctt atggacaaaa atgctacagc tttgaggcta 3240 aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa 3300 gagggcccca ttccaccaga tgcacaaaat ccagatatgt cgttctttaa gatgctattc 3360 ttgccagaat cagcaaggtg gatacaaagg actcatggaa agaactctct gaactctggg 3420 caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag 3480 aatttcttgt ctgagaaaaa caaagtggta gtaggaaagg gtgaatttac aaaggacgta 3540 ggactcaaag agatggtttt tccaagcagc agaaacctat ttcttactaa cttggataat 3600 ttacatgaaa ataatacaca caatcaagaa aaaaaaattc aggaagaaat agaaaagaag 3660 gaaacattaa tccaagagaa tgtagttttg cctcagatac atacagtgac tggcactaag 3720 aatttcatga agaacctttt cttactgagc actaggcaaa atgtagaagg ttcatatgac 3780 ggggcatatg ctccagtact tcaagatttt aggtcattaa atgattcaac aaatagaaca 3840 aagaaacaca cagctcattt ctcaaaaaaa ggggaggaag aaaacttgga aggcttggga 3900 aatcaaacca agcaaattgt agagaaatat gcatgcacca caaggatatc tcctaataca 3960 agccagcaga attttgtcac gcaacgtagt aagagagctt tgaaacaatt cagactccca 4020 ctagaagaaa cagaacttga aaaaaggata attgtggatg acacctcaac ccagtggtcc 4080 aaaaacatga aacatttgac cccgagcacc ctcacacaga tagactacaa tgagaaggag 4140 aaaggggcca ttactcagtc tcccttatca gattgcctta cgaggagtca tagcatccct 4200 caagcaaata gatctccatt acccattgca aaggtatcat catttccatc tattagacct 4260 atatatctga ccagggtcct attccaagac aactcttctc atcttccagc agcatcttat 4320 agaaagaaag attctggggt ccaagaaagc agtcatttct tacaaggagc caaaaaaaat 4380 aacctttctt tagccattct aaccttggag atgactggtg atcaaagaga ggttggctcc 4440
ctggggacaa gtgccacaaa ttcagtcaca tacaagaaag ttgagaacac tgttctcccg 4500 aaaccagact tgcccaaaac atctggcaaa gttgaattgc ttccaaaagt tcacatttat 4560 cagaaggacc tattccctac ggaaactagc aatgggtctc ctggccatct ggatctcgtg 4620 gaagggagcc ttcttcaggg aacagaggga gcgattaagt ggaatgaagc aaacagacct 4680 ggaaaagttc cctttctgag agtagcaaca gaaagctctg caaagactcc ctccaagcta 4740 ttggatcctc ttgcttggga taaccactat ggtactcaga taccaaaaga agagtggaaa 4800 tcccaagaga agtcaccaga aaaaacagct tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860 aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920 atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980 gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040 attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100 gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160 gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220 gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280 tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340 tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400 ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460 cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520 catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580 gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640 acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg acagtacagg aatttgctct gtttttcacc 5700 atctttgatg agaccaaaag ctggtacttc actgaaaata tggaaagaaa ctgcagggct 5760 ccctgcaata tccagatgga agatcccact tttaaagaga attatcgctt ccatgcaatc 5820 aatggctaca taatggatac actacctggc ttagtaatgg ctcaggatca aaggattcga 5880 tggtatctgc tcagcatggg cagcaatgaa aacatccatt ctattcattt cagtggacat 5940 gtgttcactg tacgaaaaaa agaggagtat aaaatggcac tgtacaatct ctatccaggt 6000 gtttttgaga cagtggaaat gttaccatcc aaagctggaa tttggcgggt ggaatgcctt 6060 attggcgagc atctacatgc tgggatgagc acactttttc tggtgtacag caataagtgt 6120 cagactcccc tgggaatggc ttctggacac attagagatt ttcagattac agcttcagga 6180 caatatggac agtgggcccc aaagctggcc agacttcatt attccggatc aatcaatgcc 6240 tggagcacca aggagccctt ttcttggatc aaggtggatc tgttggcacc aatgattatt 6300
cacggcatca agacccaggg tgcccgtcag aagttctcca gcctctacat ctctcagttt 6360 atcatcatgt atagtcttga tgggaagaag tggcagactt atcgaggaaa ttccactgga 6420 accttaatgg tcttctttgg caatgtggat tcatctggga taaaacacaa tatttttaac 6480 cctccaatta ttgctcgata catccgtttg cacccaactc attatagcat tcgcagcact 6540 cttcgcatgg agttgatggg ctgtgattta aatagttgca gcatgccatt gggaatggag 6600 agtaaagcaa tatcagatgc acagattact gcttcatcct actttaccaa tatgtttgcc 6660 acctggtctc cttcaaaagc tcgacttcac ctccaaggga ggagtaatgc ctggagacct 6720 caggtgaata atccaaaaga gtggctgcaa gtggacttcc agaagacaat gaaagtcaca 6780 ggagtaacta ctcagggagt aaaatctctg cttaccagca tgtatgtgaa ggagttcctc 6840 atctccagca gtcaagatgg ccatcagtgg actctctttt ttcagaatgg caaagtaaag 6900 gtttttcagg gaaatcaaga ctccttcaca cctgtggtga actctctaga cccaccgtta 6960 ctgactcgct accttcgaat tcacccccag agttgggtgc accagattgc cctgaggatg 7020 gaggttctgg gctgcgaggc acaggacctc tac 7053
<210> 18 <211> 1438
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> OVTII с удаленным В-доменом
<400> 18
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 10 15
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100
105
110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600
605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His
740 745 750
Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755 760 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820 825 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865 870 875 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900 905 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro
995 1000 1005
Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg
1010 1015 1020
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu
1025 1030 1035
Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met
1040 1045 1050
Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val
1055 1060 1065
Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn
1070 1075 1080
Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys
1085 1090 1095
Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His
1100 1105 1110
Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln
1115 1120 1125
Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile
1130 1135 1140
Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg
1145 1150 1155
Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro
1160 1165 1170
Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His
1175 1180 1185
Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr
1190 1195 1200
Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
1205 1210 1215
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe
1220 1225 1230
Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn
1265 1270 1275
Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp
1280 1285 1290
Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr
1295 1300 1305
Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn
1310 1315 1320
Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val
1325 1330 1335
Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly
1340 1345 1350
Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro
1385 1390 1395
Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg
1400 1405 1410
Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu
1415 1420 1425
Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1430 1435
<210> 19 <211> 4371
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> OVTII с удаленным В-доменом
<400> 19
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctctcaaa acccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340 cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400 gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460
cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520 catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580 caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640 ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700 agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760 cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820 ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940 ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000 tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060 gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120 tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180 caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240 attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300 tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360 tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480 cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540 tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600 ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660 ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720 cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780 aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840 tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900 atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960 tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020 agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080 aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200 cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260 tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320
cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta c 4371
<210> 20 <211> 500
<212> Белок <213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
195 200
205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
405 410 415
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
420 425 430
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser 500
<210> 21
<211> 800
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<220>
<221> ПОВТОР <222> (1)..(300)
<223> Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 100 раз
<220>
<221> ПОВТОР
<222> (301)..(800)
<223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 100 раз
<400> 21
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
85 90 95
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
405 410 415
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
420 425 430
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
485 490 495
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
530 535 540
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
545 550 555 560
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
580 585 590
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
595 600 605
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
610 615 620
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
625 630 635 640
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
645 650 655
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
660 665 670
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
690 695 700
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
705 710 715 720
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
725 730 735
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
740 745 750
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
755 760 765
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
770 775 780
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
785 790 795 800
<210> 22 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 22
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5
<210> 23 <211> 15 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 23
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 24 <211> 16 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 24
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25 <211> 18 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 25
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 26 <211> 15 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<220>
<221> ПОВТОР <222> (1)..(15)
<223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 3 раз
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 27
<211> 100
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<220>
<221> ПОВТОР
<222> (1)..(100)
<223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 20 раз
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser
100
<210> 28 <211> 15 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<220>
<221> ПОВТОР <222> (1)..(15)
<223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор от 1 до 3 раз
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 29 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления OXIa
<400> 29
Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr
1 5
<210> 30 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления OXIa
<400> 30
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly
1 5
<210> 31 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления OXIIa
<400> 31
Thr Met Thr Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 32 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления калликреином
<400> 32
Ser Pro Phe Arg Ser Thr Gly Gly
1 5
<210> 33 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления OVIIa
<400> 33
Leu Gln Val Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 34 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления OIXa
<400> 34
Pro Leu Gly Arg Ile Val Gly Gly
1 5
<210> 35
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления OXa
<400> 35
Ile Glu Gly Arg Thr Val Gly Gly
1 5
<210> 36
<211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления OIIa (тромбином)
<400> 36
Leu Thr Pro Arg Ser Leu Leu Val
1 5
<210> 37
<211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления эластазой-2
<400> 37
Leu Gly Pro Val Ser Gly Val Pro
1 5
<210> 38 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления гранзимом-В
<400> 38
Val Ala Gly Asp Ser Leu Glu Glu
1 5
<210> 39
<211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления MMP-12
<400> 39
Gly Pro Ala Gly Leu Gly Gly Ala
1 5
<210> 40 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления MMP-13
<400> 40
Gly Pro Ala Gly Leu Arg Gly Ala
1 5
<210> 41 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления MMP-17
<400> 41
Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Arg 1 5
<210> 42 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления MMP-20
<400> 42
Pro Ala Leu Pro Leu Val Ala Gln
1 5
<210> 43 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (6)..(7)
<223> Сайт расщепления ВГТ
<400> 43
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> Сайт расщепления энтерокиназой
<400> 44
Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly 1 5
<210> 45 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание <222> (6)..(7)
<223> Сайт расщепления протеазой С (PRESCISSION)
<400> 45
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 46 <211> 8 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<220>
<221> примечание
<222> (4)..(5)
<223> СортазаА
<400> 46
Leu Pro Lys Thr Gly Ser Glu Ser
1 5
<210> 47 <211> 9 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> отщепляемый линкер
<400> 47
Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg 1 5
<210> 48 <211> 10 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 48
Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg
1 5 10
<210> 49 <211> 10 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 49
Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg 1 5 10
<210> 50 <211> 7 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 50
Thr Thr Lys Ile Lys Pro Arg 1 5
<210> 51 <211> 10 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 51
Ala Leu Arg Pro Arg Val 1
1 5 10
Gly Gly Ala
<210> 52
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 52
Arg Arg Arg Arg
<210> 53 <211> 6 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 53
Arg Lys Arg Arg Lys Arg 1 5
<210> 54 <211> 5 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 54
Arg Arg Arg Arg Ser 1 5
<210> 55 <211> 5 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления
<400> 55
Leu Val Pro Arg Gly 1 5
<210> 56
<211> 25
<212> Белок <213> Искусственная
<220>
<223> сайт расщепления и линкера <400> 56
Thr Leu Asp Pro Arg Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr
1 5 10 15
Glu Pro Phe Trp Glu Asp Glu Glu Lys
20 25
<210> 57
<211> 99
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC48-Прям-ФВ-D'D3 с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN ФВ-001
<400> 57
tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99
<210> 58 <211> 68
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC50- Обратн- ФВ- частичный D'D3 (аминокислоты 1-276) с сайтом 6 His и Not1 для pSYN ФВ- 001
<400> 58
tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatgca gaggcacttt tctggtgtca 60 gcacactg 68
<210> 59 <211> 99
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC48- Прям - ФВ-D'D3 с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN
ФВ- 002
<400> 59
tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99
<210> 60 <211> 71 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC51- Обратн- ФВ D'D3 (аминокислоты 1-477) с сайтом 6His и Not 1 для pSYN ФВ- 002
<400> 60
tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatgcc tgctgcagta gaaatcgtgc 60
aacggcggtt c 71
<210> 61 <211> 99
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC48- Прям - ФВ-D'D3 с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN
ФВ- 003
<400> 61
tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99
<210> 62 <211> 65
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC52- Обратн-ФВ-D'D3 Частичный A1 (аминокислоты 1-511) с сайтом 6His и Not1 для pSYN ФВ- 003
<400> 62
tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatggc ccacagtgac ttgtgccatg 60
tgggg 65
<210> 63 <211> 99
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC48- Прям - ФВ-D'D3 с сигналом VIII и сайтом BsiW1 для pSYN
ФВ- 004
<400> 63
tcgcgacgta cggccgccac catgcaaata gagctctcca cctgcttctt tctgtgcctt 60 ttgcgattct gctttagcct atcctgtcgg ccccccatg 99
<210> 64 <211> 65
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC53-Обратн- ФВ-D'D3A1 (аминокислоты 1-716) с сайтом 6His и Not1 для pSYN ФВ- 004
<400> 64
tgacctcgag cggccgctca gtggtgatgg tgatgatggc ccacagtgac ttgtgccatg 60 tgggg 65
<210> 65 <211> 1313
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> клонированный вектор
<400> 65
ggatcctagt ggggaataag ggatgcagcc acccctcagt gaaatgcaag aaacgggtca 60
ccatcctggt ggagggagga gagattgagc tgtttgacgg ggaggtgaat gtgaagaggc 120
ccatgaagga tgagactcac tttgaggtgg tggagtctgg ccggtacatc attctgctgc 180
tgggcaaagc cctctccgtg gtctgggacc gccacctgag catctccgtg gtcctgaagc 240
agacatacca ggagaaagtg tgtggcctgt gtgggaattt tgatggcatc cagaacaatg 300
acctcaccag cagcaacctc caagtggagg aagaccctgt ggactttggg aactcctgga 360
aagtgagctc gcagtgtgct gacaccagaa aagtgcctct ggactcatcc cctgccacct 420
gccataacaa catcatgaag cagacgatgg tggattcctc ctgtagaatc cttaccagtg 480
acgtcttcca ggactgcaac aagctggtgg accccgagcc atatctggat gtctgcattt 540
acgacacctg ctcctgtgag tccattgggg actgcgcctg cttctgcgac accattgctg 600
cctatgccca cgtgtgtgcc cagcatggca aggtggtgac ctggaggacg gccacattgt 660
gcccccagag ctgcgaggag aggaatctcc gggagaacgg gtatgagtgt gagtggcgct 720
ataacagctg tgcacctgcc tgtcaagtca cgtgtcagca ccctgagcca ctggcctgcc 780
ctgtgcagtg tgtggagggc tgccatgccc actgccctcc agggaaaatc ctggatgagc 840
ttttgcagac ctgcgttgac cctgaagact gtccagtgtg tgaggtggct ggccggcgtt 900
ttgcctcagg aaagaaagtc accttgaatc ccagtgaccc tgagcactgc cagatttgcc 960
actgtgatgt tgtcaacctc acctgtgaag cctgccagga gccgggaggc ctggtggtgc 1020
ctcccacaga tgccccggtg agccccacca ctctgtatgt ggatgagacg ctccaggatg 1080
gctgtgatac tcacttctgc aaggtcaatg agagaggaga gtacttctgg gagaagaggg 1140
tcacaggctg cccacccttt gatgaacaca agtgtcttgc tgagggaggt aaaattatga 1200
aaattccagg cacctgctgt gacacatgtg aggagcctga gtgcaacgac atcactgcca 1260
ggctgcagta tgtcaaggtg ggaagctgta agtctgaagt agaggtggat atc 1313
<210> 66 <211> 32 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC 89-прям с сайтом Nhe1
<400> 66
ctcactatag ggagacccaa gctggctagc cg 32
<210> 67 <211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC 91-обратн с Sal1
<400> 67
ctggatcccg ggagtcgact cgtcagtggt gatggtgatg atg 43
<210> 68 <211> 92
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> LW 22-ПРЯМ-ФВ-D'D3 с сигнальной последовательностью Ф\ТП и сайтом BsiW1
<400> 68
gcgccggccg tacgatgcaa atagagctct ccacctgctt ctttctgtgc cttttgcgat 60 tctgctttag cctatcctgt cggcccccca tg 92
<210> 69 <211> 47
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> LW 23-Обратн- Fc со стоп-кодоном и сайтом Not1
<400> 69
tcatcaatgt atcttatcat gtctgaattc gcggccgctc atttacc 47
<210> 70 <211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> LW24- Прям- ФВ D1D2DD3 клонирующий олиго с сайтом BsiW1
<400> 70
gcgccggccg tacgatgatt cctgccagat ttgccggggt g 41
<210> 71
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> LW27-Обратн-ФВ D'D3 олиго с EcoRV
<400> 71
ccaccgccag atatcggctc ctggcaggct tcacaggtga g 41
<210> 72 <211> 1240
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> ФВ-D1D2D'D3
<400> 72
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890
895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro 1235 1240
<210> 73 <211> 477
<212> Белок <213> Искусственная
<220>
<223> OB-D'D3
<400> 73
Ser Leu Ser Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp
1 5 10 15
Asn Leu Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr
20 25 30
Asp Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys
50 55 60
Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys
65 70 75 80
Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr
85 90 95
Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr
100 105 110
Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr
115 120 125
Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile
130 135 140
Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys
145 150 155 160
Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly
165 170 175
Glu Val Asn Val Lys Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val
180 185 190
Val Glu Ser Gly Arg Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser
195 200 205
Val Val Trp Asp Arg His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr
210 215 220
Tyr Gln Glu Lys Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln
225 230 235 240
Asn Asn Asp Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val
245 250 255
Asp Phe Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg
260 265 270
Lys Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
275 280 285
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val
290 295 300
Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
305 310 315 320
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala Cys
325 330 335
Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln His Gly
340 345 350
Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln Ser Cys Glu
355 360 365
Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu Trp Arg Tyr Asn
370 375 380
Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln His Pro Glu Pro Leu
385 390 395 400
Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro
405 410 415
Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp
420 425 430
Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys
435 440 445
Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys
450 455 460
Asp Val Val Asn Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro
465 470 475
<210> 74
<211> 30
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Домен ФВ-DTO (1-477 aK; мутация C336A/C379A)
<220>
<221> ПОВТОР
<222> (1)..(30)
<223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор 6 раз
<400> 74
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 75 <211> 5 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 75
Arg Arg Arg Arg Ser 1 5
<210> 76 <211> 6 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 76
Arg Lys Arg Arg Lys Arg 1 5
<210> 77 <211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC17-Прям- ФВ клонирующий олиго с Cla1
<400> 77
gtccggcatg agaatcgatg tgtg 24
<210> 78 <211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC41- Обратн-ФВ с EcoRV
<400> 78
cctccaccgc cagatatcag aggcactttt c 31
<210> 79 <211> 105
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC78- Прям с сайтом EcoRV <400> 79
aaagtgcctc tgatatctgg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccgg tggcggggga 60 tccggtggcg ggggatccgg tggcggggga tccctggtcc cccgg 105
<210> 80
<211> 107 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> ESC79- Обратн с сайтом RsRII <400> 80
gaagaggaag actgacggtc cgcccaggag ttctggagct gggcacggtg ggcatgtgtg 60
agttttgtcg cctccgctgc cccgggggac cagggatccc ccgccac 107
<210> 81 <211> 48
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 81
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 82 <211> 1781 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pSYNHI> VnI-049, которая является конструкцией ФЛ^Ш-Рс с отщепляемым линкером между двумя Рс-доменами; Genscript-Номер последовательности 103069
<400> 82
ccgtcgacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg 60 ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa cggcgccgcc 120
ggagcggtgg cggcggatca ggtgggggtg gatcaggcgg tggaggttcc ggtggcgggg 180 gatccggcgg tggaggttcc ggtgggggtg gatcaaggaa gaggaggaag agaagcctat 240
cctgtcggcc ccccatggtc aagctggtgt gtcccgctga caacctgcgg gctgaagggc 300
tcgagtgtac caaaacgtgc cagaactatg acctggagtg catgagcatg ggctgtgtct 360
ctggctgcct ctgccccccg ggcatggtcc ggcatgagaa tcgatgtgtg gccctggaaa 420
ggtgtccctg cttccatcag ggcaaggagt atgcccctgg agaaacagtg aagattggct 480
gcaacacttg tgtctgtcgg gaccggaagt ggaactgcac agaccatgtg tgtgatgcca 540
cgtgctccac gatcggcatg gcccactacc tcaccttcga cgggctcaaa tacctgttcc 600
ccggggagtg ccagtacgtt ctggtgcagg attactgcgg cagtaaccct gggacctttc 660
ggatcctagt ggggaataag ggatgcagcc acccctcagt gaaatgcaag aaacgggtca 720
ccatcctggt ggagggagga gagattgagc tgtttgacgg ggaggtgaat gtgaagaggc 780
ccatgaagga tgagactcac tttgaggtgg tggagtctgg ccggtacatc attctgctgc 840
tgggcaaagc cctctccgtg gtctgggacc gccacctgag catctccgtg gtcctgaagc 900
agacatacca ggagaaagtg tgtggcctgt gtgggaattt tgatggcatc cagaacaatg 960
acctcaccag cagcaacctc caagtggagg aagaccctgt ggactttggg aactcctgga 1020
aagtgagctc gcagtgtgct gacaccagaa aagtgcctct ggactcatcc cctgccacct 1080
gccataacaa catcatgaag cagacgatgg tggattcctc ctgtagaatc cttaccagtg 1140
acgtcttcca ggactgcaac aagctggtgg accccgagcc atatctggat gtctgcattt 1200
acgacacctg ctcctgtgag tccattgggg actgcgccgc attctgcgac accattgctg 1260
cctatgccca cgtgtgtgcc cagcatggca aggtggtgac ctggaggacg gccacattgt 1320
gcccccagag ctgcgaggag aggaatctcc gggagaacgg gtatgaggct gagtggcgct 1380
ataacagctg tgcacctgcc tgtcaagtca cgtgtcagca ccctgagcca ctggcctgcc 1440 ctgtgcagtg tgtggagggc tgccatgccc actgccctcc agggaaaatc ctggatgagc 1500 ttttgcagac ctgcgttgac cctgaagact gtccagtgtg tgaggtggct ggccggcgtt 1560 ttgcctcagg aaagaaagtc accttgaatc ccagtgaccc tgagcactgc cagatttgcc 1620 actgtgatgt tgtcaacctc acctgtgaag cctgccagga gccgatcgat ggcggtggag 1680 gttccggtgg cgggggatcc ctggtccccc ggggcagcgg aggcgacaaa actcacacat 1740 gcccaccgtg cccagctcca gaactcctgg gcggaccgtc a 1781
<210> 83 <211> 220
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Фрагмент конструкции Genscript был субклонирован в
расщепляемую EcoRV/RsRII pSYN^VIII-0159; Genscript-Последовательность №-132601
<400> 83
aaagtgcctc tgatatctgg cggtggaggt tccggtggcg ggggatccgg cggtggaggt 60
tccggcggtg gaggttccgg tggcggggga tccggtggcg ggggatccct ggtcccccgg 120
ggcagcggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccgaca aaactcacac atgcccaccg 180
tgcccagctc cagaactcct gggcggaccg tcagtcttcc 220
<210> 84
<211> 73
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> pSYN-VIII-178 содержит 73-аминокислотный линкер между фрагментом ФВ и Fc-областью; синтез фрагмента ДНК, кодирующего 73-аминокислотный линкер
<400> 84
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70
<210> 85
<211> 299
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Genscript-Последовательность №-144849
<400> 85
gcctgccagg agccgatatc tggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga 60
ggttccggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggtggcggg 120
ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg 180
ggatccctgg tcccccgggg cagcggcggt ggaggttccg gtggcggggg atccgacaaa 240
actcacacat gcccccgtgc ccagctccag aactcctggg cggaccgtca gtcttcctc 299
<210> 86
<211> 98 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> линкер
<400> 86
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser
<210> 87 <211> 380
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Genscript-Последовательность №-144849
<400> 87
gcctgccagg agccgatatc tggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga 60
ggttccggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggtggcggg 120
ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga 180
ggttccggtg gcgggggatc cggcggtgga ggttccggcg gtggaggttc cggtggcggg 240
ggatccggtg gcgggggatc cctggtcccc cggggcagcg gcggtggagg ttccggtggc 300
gggggatccg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag ctccagaact cctgggcgga 360 ccgtcagtct tcctcttccc 380
<210> 88
<211> 2449 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Гетеродимер Ф^/П^ФВ^
<400> 88
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215
220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe
995 1000 1005
Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys
1025 1030 1035
Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr
1040 1045 1050
Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe
1070 1075 1080
Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met
1100 1105 1110
Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser
1130 1135 1140
Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg
1145 1150 1155
Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser
1175 1180 1185
Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro
1190 1195 1200
Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp
1220 1225 1230
Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu
1235 1240 1245
Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn
1250 1255 1260
Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro
1265 1270 1275
Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly
1280 1285 1290
Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn
1310 1315 1320
Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln
1325 1330 1335
Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val
1355 1360 1365
Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp
1400 1405 1410
Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr
1415 1420 1425
Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala
1430 1435 1440
Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp
1445 1450 1455
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1460 1465 1470
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1475 1480 1485
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
1490 1495 1500
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
1505 1510 1515
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
1520 1525 1530
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
1535 1540 1545
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
1550 1555 1560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
1565 1570 1575
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1580 1585 1590
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
1595 1600 1605
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
1610 1615 1620
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
1625 1630 1635
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
1640 1645 1650
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
1655 1660 1665
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1670 1675 1680
Lys Arg Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1685 1690 1695
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1700 1705 1710
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Arg Arg Lys Arg Ser Leu Ser
1715 1720 1725
Cys Arg Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu
1730 1735 1740
Arg Ala Glu Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp
1745 1750 1755
Leu Glu Cys Met Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro
1760 1765 1770
Pro Gly Met Val Arg His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg
1775 1780 1785
Cys Pro Cys Phe His Gln Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr
1790 1795 1800
Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp
1805 1810 1815
Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly
1820 1825 1830
Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Leu Lys Tyr Leu Phe Pro
1835 1840 1845
Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp Tyr Cys Gly Ser Asn
1850 1855 1860
Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys Gly Cys Ser His
1865 1870 1875
Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu Val Glu Gly
1880 1885 1890
Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys Arg Pro
1895 1900 1905
Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg Tyr
1910 1915 1920
Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
1925 1930 1935
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys
1940 1945 1950
Val Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp
1955 1960 1965
Leu Thr Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe
1970 1975 1980
Gly Asn Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys
1985 1990 1995
Val Pro Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met
2000 2005 2010
Lys Gln Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp
2015 2020 2025
Val Phe Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu
2030 2035 2040
Asp Val Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp
2045 2050 2055
Cys Ala Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys
2060 2065 2070
Ala Gln His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys
2075 2080 2085
Pro Gln Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu
2090 2095 2100
Ala Glu Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr
2105 2110 2115
Cys Gln His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu
2120 2125 2130
Gly Cys His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu
2135 2140 2145
Leu Gln Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val
2150 2155 2160
Ala Gly Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro
2165 2170 2175
Ser Asp Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn
2180 2185 2190
Leu Thr Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Asp Gly Gly Gly Gly
2195 2200 2205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Asp
2210 2215 2220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
2225 2230 2235
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
2240 2245 2250
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
2255 2260 2265
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
2270 2275 2280
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
2285 2290 2295
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
2300 2305 2310
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
2315 2320 2325
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
2330 2335 2340
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
2345 2350 2355
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
2360 2365 2370
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
2375 2380 2385
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
2390 2395 2400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
2405 2410 2415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
2420 2425 2430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
2435 2440 2445
Lys
<210> 89 <211> 48
<212> Белок <213> Искусственная
<220>
<223> 48-аминокислотный линкер
<400> 89
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 90 <211> 1665 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> зрелый белок pSYN-OVIH-155
<400> 90
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
35 40 45
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65 70 75 80
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
85 90 95
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505
510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Ala His
740 745 750
Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755 760 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820 825 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865 870 875 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900 905 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro
995 1000 1005
Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg
1010 1015 1020
Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu
1025 1030 1035
Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met
1040 1045 1050
Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val
1055 1060 1065
Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn
1070 1075 1080
Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys
1085 1090 1095
Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His
1100 1105 1110
Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln
1115 1120 1125
Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile
1130 1135 1140
Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg
1145 1150 1155
Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro
1160 1165 1170
Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His
1175 1180 1185
Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr
1190 1195 1200
Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp
1205 1210 1215
Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe
1220 1225 1230
Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn
1265 1270 1275
Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp
1280 1285 1290
Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr
1295 1300 1305
Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn
1310 1315 1320
Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val
1325 1330 1335
Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly
1340 1345 1350
Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro
1385 1390 1395
Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg
1400 1405 1410
Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu
1415 1420 1425
Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Thr His Thr
1430 1435 1440
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1445 1450 1455
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
1460 1465 1470
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
1475 1480 1485
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
1490 1495 1500
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
1505 1510 1515
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
1520 1525 1530
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
1535 1540 1545
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
1550 1555 1560
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
1565 1570 1575
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
1580 1585 1590
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
1595 1600 1605
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
1610 1615 1620
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
1625 1630 1635
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
1640 1645 1650
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1655 1660 1665
<210> 91 <211> 5052
<212> ДНК <213> Искусственная
<220>
<223> pSYN-OVIII-155
<400> 91
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctctcaaa acccaccagt cttgaaagcc catcaggcgg aaataactcg tactactctt 2340 cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400 gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460 cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520 catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580 caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640 ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700 agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760 cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820 ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880 gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940 ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000 tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060 gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120 tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180 caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240 attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300 tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360 tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420 gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480 cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540 tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600 ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660
ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720 cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780 aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840 tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900 atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960 tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020 agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080 aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200 cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260 tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320 cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact 4380 cacacatgcc caccgtgccc agctccagaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc 4440 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc 4920
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 4980
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 5040
tctccgggta aa 5052
<210> 92 <211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> GOVIII-159
<400> 92
Ile Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ser Gly
<210> 93
<211> 34
<212> Белок <213> Искусственная
<220>
<223> GOVIII-160
<400> 93
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly
20 25 30
Ser Gly
<210> 94
<211> 48 <212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> OVIII-064
<400> 94
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 95 <211> 48 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФВ031
<400> 95
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 96 <211> 73 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФВ035
<400> 96
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70
<210> 97
<211> 98 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФВ036 <400> 97
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
85 90 95
Gly Ser
<210> 98 <211> 54 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> линкер pSYN-OB-051
<400> 98
Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Pro Glu Thr Gly Ala Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
gcggtggagg ttccggtggc gggggatccg gtggcggggg atccttacct gaaactggag 120
ccctgcggcc ccgggtcgtc ggcggtggag gttccggtgg cgggggatcc gacaaaactc 180
acacatgccc accgtgccca gctccagaac tcctgggcgg accgtcagtc tt 232
<210> 100 <211> 4566
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> pSYN-ФB051
<400> 100
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120 gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180 ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240 agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300 accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420 gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480 ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540 acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720
gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780
ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840 gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080 acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140 aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320 acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380 ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440 cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740 gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980 tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220 agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280 agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340 ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400 agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460 tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520 acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580 catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640 ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700 aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820 gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940 tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000 ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060 tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120 tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180 agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240 ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300 tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360 aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420 gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480 gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540
aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600 gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660 cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatctggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga 3780 ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccttac ctgaaactgg agccctgcgg 3840
ccccgggtcg tcggcggtgg aggttccggt ggcgggggat ccgacaaaac tcacacatgc 3900 ccaccgtgcc cagctccaga actcctgggc ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 3960 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 4020 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 4080 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 4140 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 4200 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 4260 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 4320 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 4380 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc 4440 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 4500 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 4560 aaatga 4566
<210> 101 <211> 1521 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФВ051
<400> 101
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810
815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1250 1255 1260
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Ala
1265 1270 1275
Leu Arg Pro Arg Val Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1280 1285 1290
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1295 1300 1305
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
1310 1315 1320
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
1325 1330 1335
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
1340 1345 1350
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
1355 1360 1365
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
1370 1375 1380
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
1385 1390 1395
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
1400 1405 1410
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
1415 1420 1425
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
1430 1435 1440
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
1445 1450 1455
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
1460 1465 1470
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
1475 1480 1485
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
1490 1495 1500
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
1505 1510 1515
Pro Gly Lys
1520
<210> 102 <211> 4389
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> OVIII 265
<400> 102
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgga 60 ggaggaggag gagccaccag aagatactac ctgggtgcag tggaactgtc atgggactat 120 atgcaaagtg atctcggtga gctgcctgtg gacgcaagat ttcctcctag agtgccaaaa 180 tcttttccat tcaacacctc agtcgtgtac aaaaagactc tgtttgtaga attcacggat 240 caccttttca acatcgctaa gccaaggcca ccctggatgg gtctgctagg tcctaccatc 300 caggctgagg tttatgatac agtggtcatt acacttaaga acatggcttc ccatcctgtc 360 agtcttcatg ctgttggtgt atcctactgg aaagcttctg agggagctga atatgatgat 420 cagaccagtc aaagggagaa agaagatgat aaagtcttcc ctggtggaag ccatacatat 480 gtctggcagg tcctgaaaga gaatggtcca atggcctctg acccactgtg ccttacctac 540 tcatatcttt ctcatgtgga cctggtaaaa gacttgaatt caggcctcat tggagcccta 600 ctagtatgta gagaagggag tctggccaag gaaaagacac agaccttgca caaatttata 660 ctactttttg ctgtatttga tgaagggaaa agttggcact cagaaacaaa gaactccttg 720 atgcaggata gggatgctgc atctgctcgg gcctggccta aaatgcacac agtcaatggt 780 tatgtaaaca ggtctctgcc aggtctgatt ggatgccaca ggaaatcagt ctattggcat 840 gtgattggaa tgggcaccac tcctgaagtg cactcaatat tcctcgaagg tcacacattt 900 cttgtgagga accatcgcca ggcgtccttg gaaatctcgc caataacttt ccttactgct 960 caaacactct tgatggacct tggacagttt ctactgtttt gtcatatctc ttcccaccaa 1020 catgatggca tggaagctta tgtcaaagta gacagctgtc cagaggaacc ccaactacga 1080 atgaaaaata atgaagaagc ggaagactat gatgatgatc ttactgattc tgaaatggat 1140 gtggtcaggt ttgatgatga caactctcct tcctttatcc aaattcgctc agttgccaag 1200 aagcatccta aaacttgggt acattacatt gctgctgaag aggaggactg ggactatgct 1260 cccttagtcc tcgcccccga tgacagaagt tataaaagtc aatatttgaa caatggccct 1320 cagcggattg gtaggaagta caaaaaagtc cgatttatgg catacacaga tgaaaccttt 1380 aagactcgtg aagctattca gcatgaatca ggaatcttgg gacctttact ttatggggaa 1440
gttggagaca cactgttgat tatatttaag aatcaagcaa gcagaccata taacatctac 1500 cctcacggaa tcactgatgt ccgtcctttg tattcaagga gattaccaaa aggtgtaaaa 1560 catttgaagg attttccaat tctgccagga gaaatattca aatataaatg gacagtgact 1620 gtagaagatg ggccaactaa atcagatcct cggtgcctga cccgctatta ctctagtttc 1680 gttaatatgg agagagatct agcttcagga ctcattggcc ctctcctcat ctgctacaaa 1740 gaatctgtag atcaaagagg aaaccagata atgtcagaca agaggaatgt catcctgttt 1800 tctgtatttg atgagaaccg aagctggtac ctcacagaga atatacaacg ctttctcccc 1860 aatccagctg gagtgcagct tgaggatcca gagttccaag cctccaacat catgcacagc 1920 atcaatggct atgtttttga tagtttgcag ttgtcagttt gtttgcatga ggtggcatac 1980 tggtacattc taagcattgg agcacagact gacttccttt ctgtcttctt ctctggatat 2040 accttcaaac acaaaatggt ctatgaagac acactcaccc tattcccatt ctcaggagaa 2100 actgtcttca tgtcgatgga aaacccaggt ctatggattc tggggtgcca caactcagac 2160 tttcggaaca gaggcatgac cgccttactg aaggtttcta gttgtgacaa gaacactggt 2220 gattattacg aggacagtta tgaagatatt tcagcatact tgctgagtaa aaacaatgcc 2280 attgaaccaa gaagcttctc tcaaaaccca ccagtcttga aggcccatca ggccgaaata 2340 actcgtacta ctcttcagtc agatcaagag gaaattgact atgatgatac catatcagtt 2400 gaaatgaaga aggaagattt tgacatttat gatgaggatg aaaatcagag cccccgcagc 2460 tttcaaaaga aaacacgaca ctattttatt gctgcagtgg agaggctctg ggattatggg 2520 atgagtagct ccccacatgt tctaagaaac agggctcaga gtggcagtgt ccctcagttc 2580 aagaaagttg ttttccagga atttactgat ggctccttta ctcagccctt ataccgtgga 2640 gaactaaatg aacatttggg cctcctcggc ccatatataa gagcagaagt tgaagataat 2700 atcatggtaa ctttcagaaa tcaggcctct cgtccctatt ccttctattc tagccttatt 2760 tcttatgagg aagatcagag gcaaggagca gaacctagaa aaaactttgt caagcctaat 2820 gaaaccaaaa cttacttttg gaaagtgcaa catcatatgg cacccactaa agatgagttt 2880 gactgcaaag cctgggctta tttctctgat gttgacctgg aaaaagatgt gcactcaggc 2940 ctgattggac cccttctggt ctgccacact aacacactga accctgctca tgggagacaa 3000 gtgacagtac aggaatttgc tctgtttttc accatctttg atgagaccaa aagctggtac 3060 ttcactgaaa atatggaaag aaactgcagg gctccctgca atatccagat ggaagatccc 3120 acttttaaag agaattatcg cttccatgca atcaatggct acataatgga tacactacct 3180 ggcttagtaa tggctcagga tcaaaggatt cgatggtatc tgctcagcat gggcagcaat 3240 gaaaacatcc attctattca tttcagtgga catgtgttca ctgtacgaaa aaaagaggag 3300
tataaaatgg cactgtacaa tctctatcca ggtgtttttg agacagtgga aatgttacca 3360 tccaaagctg gaatttggcg ggtggaatgc cttattggcg agcatctaca tgctgggatg 3420 agcacacttt ttctggtgta cagcaataag tgtcagactc ccctgggaat ggcttctgga 3480 cacattagag attttcagat tacagcttca ggacaatatg gacagtgggc cccaaagctg 3540 gccagacttc attattccgg atcaatcaat gcctggagca ccaaggagcc cttttcttgg 3600 atcaaggtgg atctgttggc accaatgatt attcacggca tcaagaccca gggtgcccgt 3660 cagaagttct ccagcctcta catctctcag tttatcatca tgtatagtct tgatgggaag 3720 aagtggcaga cttatcgagg aaattccact ggaaccttaa tggtcttctt tggcaatgtg 3780 gattcatctg ggataaaaca caatattttt aaccctccaa ttattgctcg atacatccgt 3840 ttgcacccaa ctcattatag cattcgcagc actcttcgca tggagttgat gggctgtgat 3900 ttaaatagtt gcagcatgcc attgggaatg gagagtaaag caatatcaga tgcacagatt 3960 actgcttcat cctactttac caatatgttt gccacctggt ctccttcaaa agctcgactt 4020 cacctccaag ggaggagtaa tgcctggaga cctcaggtga ataatccaaa agagtggctg 4080 caagtggact tccagaagac aatgaaagtc acaggagtaa ctactcaggg agtaaaatct 4140 ctgcttacca gcatgtatgt gaaggagttc ctcatctcca gcagtcaaga tggccatcag 4200 tggactctct tttttcagaa tggcaaagta aaggtttttc agggaaatca agactccttc 4260 acacctgtgg tgaactctct agacccaccg ttactgactc gctaccttcg aattcacccc 4320
cagagttggg tgcaccagat tgccctgagg atggaggttc tgggctgcga ggcacaggac 4380 ctctactga 4389
<210> 103 <211> 1462
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> OVIII 265
<400> 103
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly
20 25 30
Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu
35 40 45
Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe
Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp
65 70 75 80
His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu
85 90 95
Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu
100 105 110
Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser
115 120 125
Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln
130 135 140
Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr
145 150 155 160
Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu
165 170 175
Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu
180 185 190
Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu
195 200 205
Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala
210 215 220
Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu
225 230 235 240
Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His
245 250 255
Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys
260 265 270
His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro
275 280 285
Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn
290 295 300
His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala
305 310 315 320
Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile
325 330 335
Ser Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser
340 345 350
Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu
355 360 365
Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe
370 375 380
Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys
385 390 395 400
Lys His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp
405 410 415
Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys
420 425 430
Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys
435 440 445
Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu
450 455 460
Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu
465 470 475 480
Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro
485 490 495
Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser
500 505 510
Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu
515 520 525
Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly
530 535 540
Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe
545 550 555 560
Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu
565 570 575
Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser
580 585 590
Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser
595 600 605
Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly
610 615 620
Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser
625 630 635 640
Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His
645 650 655
Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe
660 665 670
Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr
675 680 685
Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met
690 695 700
Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp
705 710 715 720
Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp
725 730 735
Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala
740 745 750
Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln
755 760 765
Asn Pro Pro Val Leu Lys Ala His Gln Ala Glu Ile Thr Arg Thr Thr
770 775 780
Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val
785 790 795 800
Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln
805 810 815
Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala
820 825 830
Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu
835 840 845
Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val
850 855 860
Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly
865 870 875 880
Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu
885 890 895
Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro
900 905 910
Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln
915 920 925
Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr
930 935 940
Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe
945 950 955 960
Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp
965 970 975
Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr
980 985 990
Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu
995 1000 1005
Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu
1010 1015 1020
Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu
1025 1030 1035
Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly
1040 1045 1050
Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln
1055 1060 1065
Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile
1070 1075 1080
His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys
1085 1090 1095
Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe
1100 1105 1110
Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val
1115 1120 1125
Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu
1130 1135 1140
Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala
1145 1150 1155
Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr
1160 1165 1170
Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser
1175 1180 1185
Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val
1190 1195 1200
Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly
1205 1210 1215
Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
1220 1225 1230
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn
1235 1240 1245
Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser
1250 1255 1260
Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr
1265 1270 1275
Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg
1280 1285 1290
Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu
1295 1300 1305
Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser
1310 1315 1320
Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala
1325 1330 1335
Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val
1340 1345 1350
Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met
1355 1360 1365
Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr
1370 1375 1380
Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly
1385 1390 1395
His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe
1400 1405 1410
Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp
1415 1420 1425
Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp
1430 1435 1440
Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala
1445 1450 1455
Gln Asp Leu Tyr
1460
<210> 104
<211> 5691
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> OVIII198
<400> 104
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660 tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720 gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780 ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840 accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900 cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960 gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020 gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080 gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140 gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200 tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260 cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320 aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380 attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440 ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctctcaga attcaagaca ccctagcact aggcaaaagc aatttaatgc caccacaatt 2340 ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa 2400 atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat 2460 gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca 2520 cctggagcaa tagacagtaa taacagcctg tctgaaatga cacacttcag gccacagctc 2580 catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag 2640 aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca 2700 tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca 2760 agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta 2820 tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa 2880 aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga 2940 aaaaatgtat cgtcagaaat aactcgtact actcttcagt cagatcaaga ggaaattgac 3000 tatgatgata ccatatcagt tgaaatgaag aaggaagatt ttgacattta tgatgaggat 3060 gaaaatcaga gcccccgcag ctttcaaaag aaaacacgac actattttat tgctgcagtg 3120 gagaggctct gggattatgg gatgagtagc tccccacatg ttctaagaaa cagggctcag 3180 agtggcagtg tccctcagtt caagaaagtt gttttccagg aatttactga tggctccttt 3240 actcagccct tataccgtgg agaactaaat gaacatttgg gactcctggg gccatatata 3300 agagcagaag ttgaagataa tatcatggta actttcagaa atcaggcctc tcgtccctat 3360 tccttctatt ctagccttat ttcttatgag gaagatcaga ggcaaggagc agaacctaga 3420 aaaaactttg tcaagcctaa tgaaaccaaa acttactttt ggaaagtgca acatcatatg 3480 gcacccacta aagatgagtt tgactgcaaa gcctgggctt atttctctga tgttgacctg 3540 gaaaaagatg tgcactcagg cctgattgga ccccttctgg tctgccacac taacacactg 3600 aaccctgctc atgggagaca agtgacagta caggaatttg ctctgttttt caccatcttt 3660 gatgagacca aaagctggta cttcactgaa aatatggaaa gaaactgcag ggctccctgc 3720
aatatccaga tggaagatcc cacttttaaa gagaattatc gcttccatgc aatcaatggc 3780 tacataatgg atacactacc tggcttagta atggctcagg atcaaaggat tcgatggtat 3840 ctgctcagca tgggcagcaa tgaaaacatc cattctattc atttcagtgg acatgtgttc 3900 actgtacgaa aaaaagagga gtataaaatg gcactgtaca atctctatcc aggtgttttt 3960 gagacagtgg aaatgttacc atccaaagct ggaatttggc gggtggaatg ccttattggc 4020 gagcatctac atgctgggat gagcacactt tttctggtgt acagcaataa gtgtcagact 4080 cccctgggaa tggcttctgg acacattaga gattttcaga ttacagcttc aggacaatat 4140 ggacagtggg ccccaaagct ggccagactt cattattccg gatcaatcaa tgcctggagc 4200 accaaggagc ccttttcttg gatcaaggtg gatctgttgg caccaatgat tattcacggc 4260 atcaagaccc agggtgcccg tcagaagttc tccagcctct acatctctca gtttatcatc 4320 atgtatagtc ttgatgggaa gaagtggcag acttatcgag gaaattccac tggaacctta 4380 atggtcttct ttggcaatgt ggattcatct gggataaaac acaatatttt taaccctcca 4440 attattgctc gatacatccg tttgcaccca actcattata gcattcgcag cactcttcgc 4500 atggagttga tgggctgtga tttaaatagt tgcagcatgc cattgggaat ggagagtaaa 4560 gcaatatcag atgcacagat tactgcttca tcctacttta ccaatatgtt tgccacctgg 4620 tctccttcaa aagctcgact tcacctccaa gggaggagta atgcctggag acctcaggtg 4680 aataatccaa aagagtggct gcaagtggac ttccagaaga caatgaaagt cacaggagta 4740 actactcagg gagtaaaatc tctgcttacc agcatgtatg tgaaggagtt cctcatctcc 4800 agcagtcaag atggccatca gtggactctc ttttttcaga atggcaaagt aaaggttttt 4860 cagggaaatc aagactcctt cacacctgtg gtgaactctc tagacccacc gttactgact 4920 cgctaccttc gaattcaccc ccagagttgg gtgcaccaga ttgccctgag gatggaggtt 4980 ctgggctgcg aggcacagga cctctacgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagct 5040 ccagaactcc tgggcggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 5100 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 5160 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 5220 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 5280 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 5340 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 5400 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 5460 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 5520 aagaccacgc ctcccgtgtt ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 5580
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 5640 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg a 5691
<210> 105 <211> 1896
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФУШ 198
<400> 105
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 10 15
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
20 25 30
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
50 55 60
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65 70 75 80
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
85 90 95
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440
445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro
755 760 765
Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp
770 775 780
Ile Glu Lys Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys
785 790 795 800
Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser
805 810 815
Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr
820 825 830
Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn
835 840 845
Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly
850 855 860
Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu
865 870 875 880
Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys
885 890 895
Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn
900 905 910
Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met
915 920 925
Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys
930
935
940
Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu
945 950 955 960
Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu
965 970 975
Ser Ser Trp Gly Lys Asn Val Ser Ser Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu
980 985 990
Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu
995 1000 1005
Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln
1010 1015 1020
Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala
1025 1030 1035
Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His
1040 1045 1050
Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys
1055 1060 1065
Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro
1070 1075 1080
Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro
1085 1090 1095
Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg
1100 1105 1110
Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser
1115 1120 1125
Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
1130 1135 1140
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His
1145 1150 1155
His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala
1160 1165 1170
Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
1175 1180 1185
Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala
1190 1195 1200
His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr
1205 1210 1215
Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu
1220 1225 1230
Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr
1235 1240 1245
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met
1250 1255 1260
Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg
1265 1270 1275
Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile
1280 1285 1290
His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr
1295 1300 1305
Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val
1310 1315 1320
Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu
1325 1330 1335
Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val
1340 1345 1350
Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His
1355 1360 1365
Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp
1370 1375 1380
Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala
1385 1390 1395
Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu
1400 1405 1410
Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln
1415 1420 1425
Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser
1430 1435 1440
Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly
1445 1450 1455
Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys
1460 1465 1470
His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
1475 1480 1485
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu
1490 1495 1500
Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu
1505 1510 1515
Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe
1520 1525 1530
Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His
1535 1540 1545
Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro
1550 1555 1560
Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr
1565 1570 1575
Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr
1580 1585 1590
Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp
1595 1600 1605
Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn
1610 1615 1620
Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu
1625 1630 1635
Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln
1640 1645 1650
Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu
1655 1660 1665
Tyr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1670 1675 1680
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
1685 1690 1695
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
1700 1705 1710
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
1715 1720 1725
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
1730 1735 1740
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
1745 1750 1755
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
1760 1765 1770
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
1775 1780 1785
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
1790 1795 1800
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
1805 1810 1815
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
1820 1825 1830
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
1835 1840 1845
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
1850 1855 1860
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
1865 1870 1875
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
1880 1885 1890
Pro Gly Lys
1895
<210> 106
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> распознающий сортазу мотив
<220>
<221> примечание <222> (3)..(3)
<223> Xaa может являться любой аминокислотой природного происхождения
<400> 106
Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5
<210> 107 <211> 10 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> цистеин-содержащий пептид
<400> 107
Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 108 <211> 4548
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФВ 031
<400> 108
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120 gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180 ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240 agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420 gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480 ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540 acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720 gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780 ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840 gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080 acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140 aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320 acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380 ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440 cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740 gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980 tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160
atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220 agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280 agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340 ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400 agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460 tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520 acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580 catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640 ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700 aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760
tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820 gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880
tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940 tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000 ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060 tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120 tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180 agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240 ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgccgcattc 3300 tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360 aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420 gaggctgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480 gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540 aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600 gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660 cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720
atatctggcg gtggaggttc cggtggcggg ggatccggcg gtggaggttc cggcggtgga 3780 ggttccggtg gcgggggatc cggtggcggg ggatccctgg tcccccgggg cagcggcggt 3840
ggaggttccg gtggcggggg atccgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagctcca 3900 gaactcctgg gcggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 3960 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 4020
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 4080 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 4140 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 4200 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 4260 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 4320 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 4380 accacgcctc ccgtgttgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 4440 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 4500 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 4548
<210> 109 <211> 1515 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФВ 031 <400> 109
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
755 760 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
770 775 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785 790 795 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
805 810 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
820 825 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
835 840 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
850 855 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865 870 875 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
885 890 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
900 905 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
915 920 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
930 935 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945 950 955 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
965 970 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
980 985 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
995 1000 1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
1010 1015 1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
1025 1030 1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
1040 1045 1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
1055 1060 1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
1070 1075 1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
1085 1090 1095
Ala Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
1100 1105 1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Ala Glu
1130 1135 1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
1145 1150 1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
1160 1165 1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
1175 1180 1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
1190 1195 1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
1205 1210 1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1250 1255 1260
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser
1265 1270 1275
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr
1280 1285 1290
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
1295 1300 1305
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
1310 1315 1320
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
1325 1330 1335
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
1340 1345 1350
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
1355 1360 1365
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
1370 1375 1380
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
1385 1390 1395
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
1400 1405 1410
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
1415 1420 1425
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
1430 1435 1440
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
1445 1450 1455
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
1460 1465 1470
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
1475 1480 1485
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
1490 1495 1500
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1505 1510 1515
<210> 110 <211> 40 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<220>
<221> ПОВТОР <222> (1)..(5)
<223> Gly-Gly-Gly-Gly-Ser повтор
<400> 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40
<210> 111
<211> 62 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ESC54-ФВ в прямом направлении с сайтом BsiW1
<400> 111
cgcttcgcga cgtacggccg ccaccatgat tcctgccaga tttgccgggg tgctgcttgc 60 tc 62
<210> 112 <211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ESC 124 - D1D2 клонирующий олиго с сайтом Not1 site-в обратном направлении
<400> 112
ctagactcga gcggccgctc accttttgct gcgatgagac aggggactgc tgaggacagc 60
<210> 113 <211> 2289
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ФВ 053 фЮ2-пропептид ФВ)
<400> 113
atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60
ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120
gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180
ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240
agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300
accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360
gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420
gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480
ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540 acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720 gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780 ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840 gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960
tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020
ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080 acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140 aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc actggtcaat cccacttcaa gagctttgac 1200 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320 acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380 ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac atccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440 cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500
gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560
tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620
ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680
gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740 gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860
tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920
gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980 tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040
gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100
tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220 agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280 agcaaaagg 2289
<210>
114
<211>
763
<212>
Белок
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
ФВ 053 фЮ2-пропептид ФВ)
<400>
114
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
35 40 45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
50 55 60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65 70 75 80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
85 90 95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
100 105 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
115 120 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
130 135 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145 150 155 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
165 170 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
180 185 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
195 200 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
210 215 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225 230 235 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
245 250 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
260 265 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
275 280 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
290 295 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305 310 315 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
325 330 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
340 345 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
355 360 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
370 375 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385 390 395 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
405 410 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
420 425 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
435 440 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
450 455
460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465 470 475 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
485 490 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
500 505 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
530 535 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545 550 555 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
565 570 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
580 585 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
595 600 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
610 615 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625 630 635 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
645 650 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
660 665 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
675 680 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
690 695 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705 710 715 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
725 730 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
740 745 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg 755 760
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Химерный белок, содержащий белок фактора VIII ("Ф-VIII") и фрагмент фактора Виллебранда (ФВ), которые связаны ковалентной связью, при этом указанный фрагмент ФВ содержит домен D' и домен D3 ФВ и связывается с белком Ф-VIII.
2. Химерный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный домен D' содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную аминокислотам 764-866 из SEQ ID NO: 2, и/или указанный домен D3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотам 867-1240 из
SEQ ID NO: 2.
3. Химерный белок по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что указанный белок Ф-VIII содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную SEQ ID NO: 18, при этом указанный белок Ф-VIII обладает активностью Ф-VIII.
4. Химерный белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный белок Ф-VIII содержит тяжелую цепь фактора VIII и легкую цепь фактора VIII, при этом указанная тяжелая цепь фактора VIII содержит аминокислоты 1-740 SEQ ID NO: 16 и указанная легкая цепь фактора VIII содержит аминокислоты 1649-2332.
5. Химерный белок по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что ковалентная связь предотвращает диссоциацию фрагмента ФВ от белка Ф-VIII в присутствии эндогенного ФВ.
6. Химерный белок по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ предотвращает выведение белка Ф-VIII в процессе выведения ФВ или указанный фрагмент ФВ подавляет или предотвращает связывание эндогенного ФВ с белком Ф-VIII, экранируя или блокируя ФВ-связывающий участок на белке Ф-VIII.
7. Химерный белок по п.6, отличающийся тем, что ФВ-связывающий участок является аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотам 1669-1689 и 2303-2332 из SEQ ID NO:
16.
8. Химерный белок по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что время полужизни белка Ф-VIII продлевается за пределы ограничения времени полужизни белка Ф-VIII в присутствии эндогенного ФВ.
9. Химерный белок по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что фрагмент ФВ содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н1) и необязательный линкер между фрагментом ФВ и указанным гетерологичным компонентом (Н1).
10. Химерный белок по п.9, отличающийся тем, что гетерологичный компонент (Н1) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, связывающее альбумин вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент, полиэти-ленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), их производные или любые комбинации этих компонентов.
11. Химерный белок по п.10, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н1) содержит первую Fc-область.
12. Химерный белок по п.9, отличающийся тем, что химерный белок содержит линкер между фрагментом ФВ и гетерологичным компонентом (Н1), который является отщепляемым линкером.
13. Химерный белок по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что белок Ф-VIII дополнительно содержит по меньшей мере один гетерологичный компонент (Н2).
14. Химерный белок по п.13, отличающийся тем, что гетерологичный компонент (Н2) способен продлевать время полужизни белка Ф-VIIL
15. Химерный белок по п.13 или 14, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит константную область иммуноглобулина или ее часть, альбумин или его фрагмент, поли-этиленгликоль (ПЭГ), полисиаловую кислоту, гидроксиэтиловый крахмал (ГЭК), его производное, связывающее альбумин вещество, последовательность PAS, последовательность НАР, трансферрин или его фрагмент или любые комбинации этих компонентов.
16. Химерный белок по п.13, отличающийся тем, что указанный гетерологичный компонент (Н2) содержит вторую Fc-область.
17. Химерный белок по любому из пп.1-16, который содержит первый полипептид, содержащий фрагмент ФВ, первый гетерологичный компонент и линкер, и второй полипептид, содержащий белок Ф-VIII и второй гетерологичный компонент, при этом первый полипептид и второй полипептид связаны друг с другом ковалентной связью.
18. Химерный белок по п.17, отличающийся тем, что указанные первый гетерологичный компонент и второй гетерологичный компонент связаны друг с другом ковалентной связью, при этом ковалентная связь препятствует замещению фрагмента ФВ в первом полипептиде эндогенным ФВ in vivo.
19. Химерный белок по любому из пп.13-18, отличающийся тем, что линкер между белком Ф-VIII и
вторым гетерологичным компонентом является отщепляемым линкером.
20. Химерный белок по любому из пп.1-19, содержащий формулу, выбранную из:
(a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2,
(b) H2-L2-C-L3-H1-L1-V,
(c) C-L2-H2-L3-V-L1-H1,
(d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C,
(e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2,
(f) H2-L2-C-L3-V-L1-H1,
(g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C,
(h) C-L2-H2-L3-H1-L1-V,
(i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C,
(j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2,
(k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2 и
(l) H2-L3-H1-L1-C-L2-V,
где V содержит указанный фрагмент ФВ, содержащий домен D' и домен D3 ФВ;
L1 является необязательным линкером;
L2 является необязательным линкером;
L3 в (a)-(f) является необязательным линкером,
L3 в (g)-(l) является необязательным scFc линкером,
каждый из Н1 или Н2 содержит необязательный гетерологичный компонент; С содержит указанный белок Ф-VIII;
(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот.
21. Химерный белок по любому из пп.1-19, содержащий формулу, выбранную из: (m) V-L1-H1:H2-L2-C,
(n) V-L1-H1:C-L2-H2;
(о) H1-L1-V:H2-L2-C; (р) H1-L1-V:C-L2-H2;
(q) V:C-L1-H1:H2;
(r) V:H1-L1-C:H2; (s) H2:H1-L1-C:V,
(t) C:V-L1-H1:H2 и
(u) C:H1-L1-V:H2,
где V является указанным фрагментом ФВ, содержащим домен D' и домен D3 ФВ;
L1 является необязательным линкером;
L2 является необязательным линкером;
Н1 является первым гетерологичным компонентом;
Н2 является вторым гетерологичным компонентом;
С является указанным белком Ф-VIII;
(-) представляет пептидную связь либо одну или более аминокислот; (:) представляет ковалентную связь между Н1 и Н2.
22. Химерный белок по любому из пп.20-22, отличающийся тем, что Н1 содержит первую Fc-область, Н2 содержит вторую Fc-область или Н1 содержит первую Fc-область и Н2 содержит вторую Fc-область.
23. Химерный белок по любому из пп.1-22, отличающийся тем, что белок Ф-VIII содержит третий гетерологичный компонент (Н3), четвертый гетерологичный компонент (Н4), пятый гетерологичный компонент (Н5) или шестой гетерологичный компонент (Н6).
24. Химерный белок по пп.1-23, который дополнительно содержит линкер между белком Ф-VIII и указанным фрагментом ФВ.
25. Химерный белок по п.24, отличающийся тем, что линкер представляет собой распознающий сортазу мотив.
26. Химерный белок по любому из пп.1-25, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ, по существу, состоит из домена D' и домена D3 ФВ.
27. Химерный белок по любому из пп.1-26, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в остатке, соответствующем остатку 1099, остатку 1142 либо обоим остаткам 1099 и 1142 из SEQ ID NO: 2.
28. Химерный белок по любому из пп.1-27, отличающийся тем, что последовательность указанного фрагмента ФВ содержит аминокислоты 764-1240 из SEQ ID NO: 2.
29. Химерный белок по любому из пп.1-28, отличающийся тем, что указанный фрагмент ФВ дополнительно содержит домен D1, домен D2 или домены D1 и D2 ФВ.
30. Химерный белок по любому из пп.1-29, отличающийся тем, что белок Ф-VIII содержит домен В или его часть.
31. Химерный белок по любому из пп.1-30, отличающийся тем, что белок Ф-VIII содержит одноце
22.
почечный Ф-VIII или Ф-VIII с двумя цепями.
32. Химерный белок по любому из пп.1-31, отличающийся тем, что химерный белок не содержит фактор, ограничивающий время полужизни белка Ф-VIII.
33. Полинуклеотид или набор полинуклеотидов, которые кодируют химерный белок по любому из
пп.1-32.
34. Вектор или набор векторов, которые содержат полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.33 и один или более промоторов, функционально связанных с полинуклеотидом или набором полинук-леотидов.
35. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.39 или вектор или набор векторов по п.34.
36. Клетка-хозяин по п.35, которая является клеткой млекопитающего.
37. Клетка-хозяин по п.36, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего выбрана из группы, состоящей из клетки HEK293, клетки СНО и клетки BHK.
38. Фармацевтический состав, содержащий химерный белок по любому из пп.1-32 и фармацевтически приемлемый носитель.
39. Фармацевтический состав, содержащий полинуклеотид или набор полинуклеотидов по п.33 и фармацевтически приемлемый носитель.
40. Способ предотвращения или подавления взаимодействия белка Ф-VIII с эндогенным ФВ, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанный фрагмент ФВ предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
41. Способ предотвращения или подавления взаимодействия белка Ф-VIII с эндогенным ФВ, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанный фрагмент ФВ предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
42. Способ устранения или снижения фактора, ограничивающего время полужизни белка Ф-VIII, при этом данный способ включает введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанный химерный белок предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
43. Способ устранения или снижения фактора, ограничивающего время полужизни белка Ф-VIII, при этом указанный способ включает введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанный химерный белок, кодируемый полинуклеотидом, предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
44. Способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-VIII, при этом указанный способ включает введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом фрагмент ФВ химерного белка предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
45. Способ продления или увеличения времени полужизни белка Ф-VIII, при этом указанный способ включает введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом фрагмент ФВ химерного белка предотвращает или подавляет взаимодействие белка Ф-VIII с эндогенным ФВ.
46. Способ лечения заболевания или болезненного состояния, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества химерного белка по любому из пп.1-32, при этом указанное заболевание или болезненное состояние, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций.
47. Способ лечения заболевания или болезненного состояния, связанного с кровотечением, у нуждающегося в этом пациента, включающий введение эффективного количества полинуклеотида или набора полинуклеотидов по п.33, при этом указанное заболевание или болезненное состояние, связанное с кровотечением, выбрано из группы, состоящей из нарушения свертываемости крови, гемартроза, мышечного кровотечения, кровотечения в полости рта, кровоизлияния, кровоизлияния в мышцы, кровоизлияния в полость рта, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, кровоизлияния в брюшную полость, внутригрудного кровоизлияния, перелома костей, кровотечения в центральной нервной системе, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве, кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы и любых их комбинаций.
48. Способ получения химерного белка, включающий трансфекцию одной или более клеток-хозяев полинуклеотидом или набором нуклеотидов по п.33 или вектором или набором векторов по п.34 и экспрессию фрагмента ФВ или химерного белка в клетке-хозяине.
34.
49. Способ конструирования химерного белка по любому из пп.1-32, включающий лигирование фрагмента ВФ с белком Ф-VIII ковалентной связью в присутствии фермента сортазы.
Разные конструкции ФВ
001
D1 Р
2 Q;D3
011
Bl ы вз
Фиг. 1А-Д
Пропептид
Фактор Виллебранда
Зрелая субъединица
Конструкции Ф-VIII (разные линкеры)
| Variable linker
Конструкция ДНК
Линкер между ФВ и Fc
OV1II-0S4
20ак = ID {2X(6GGOS)RVPf№SGC
ФУ11М59
35ак = IS{5X[GGGGS)}LVPRGS6G
Ф\Л11-160 и его производные
Ф\ЛИ-160
48акс "{6X|GGGGS)HVPRGSGGGGSGGGGS
Ф\ЛИ-1В0
(CVIII-160 с мутацией К2092А в С1-домене Ф\ЛИ
ФУ11МВ1
Ф\Л11-160 с мутацией К20ЭЗА в С1-домене ФУШ
ФУШ-1В2
Ф\ЛН-160 с мутацией K2092A/F2093A в С1-домене Ф\ЛИ
ФУ111-17В
73an=l5{llX[6SGeS)}L.VPRGSGGGGSGGGGS
ФУ11М7В
"ак* IS{J6X:GGGGS" IVPftGSGGGGSGGGGS
ФВ= D'D3 (1-477 ак С СЭ36А/С379А)
ФУШ-ОбЧ,159,160,178, 179
* In vivo процеесируемый линкер
Фиг. 3
4Д L^Ј5^(tm)(tm)J д_ kjJStffl^J-L_.ЈЈ.
Конструкции Ф-VIII 35-
ФВ = D1 D2-DD3 (1 J,77aKj ci3(MЂ3im
Н = гетерологичный компонент
Линкер (в некоторых случаях
отщепляемый)
^ In vivo процеесируемый линкер
43 t
к ::,, ..: :W*W ., v.:j-4 Ft jj^
^ = ПЭГ или гэк
ФВ= 01"2-РШ (1.477аК,СЗЗ*А/079А>
Н = гетерплигнчный компонент Лникер (в некоторых случаях отщепляемый) }Ц in vivo процеесируемый линкер
Фиг. 4
Конструкции Ф-VIII (система котрансфекции)
ФШ~-\55 ФВ-031
Внутриклеточный процессинг
(DVIII-155
Одноцепочечный (ОЦ) - ФУШ R1645A/R1648A, напрямую связанный с одиночной Fc
Фрагмент D1D2D'D3 (1-477 аке С336А/С379А), связанный с одиночной Fc 4Й ак тромбин-отщепляемым линкером
Фиг. 5
Взаимодействие Ф^Ш-ФВ является ограничивающим фактором для продления времени полужизни Ф-VIII
Фиг. 9
Полноразмерный димер D'D3 обеспечивает такую же защиту Ф-VIII, как и полноразмерная молекула ФВ
Ш 1000
Плазменный уровень эндогенного ФУШ через 48 ч после инъекции плазм ид
10-
Л* ^ Л* ^ ^ V # ^
^ чч <5 ^ ^ ^ <Г <У Фиг. 10А
Полноразмерный димер D'D3 обеспечивает такую же защиту Ф-VIII, как и полноразмерная молекула ФВ
ё юо
Уровень экспрессии доменов ФВ через 48 ч после инъекции плазмид
В т о 10
s о
и <и а. с
о о.
^ Фг ^ Су* ЧЧ <Ь tf* &
Г # <Р Ъч С? "Г <Г Фиг. 10Б
ФК УВД-Ф-VIII у Ф-УШ-ФВ ДГН мышей при совместной инъекции ФВ-010 или ФВ-002 А Б
Фиг. 11
ФК рФ-VIIIFc у мышей, экспрессирующих D'D3 ФВ
IV дозирование pOVIIIFc
-3
День 0
Забор образцов ФК
ДеньЗ
•-Мононар D'D3 (D1D2D'D3C-A*?7")
Димер D'D3 и его мономер, синтезированный вместе с доменом Dl D2 обеспечивает аналогичную защиту ФУШ Циркуляция фрагментов D'D3 ФВ обуславливает дополнительное 8-кратное продление времени полужшни Восстановление ptbVIIIFc возросло or 40% ло 70%
Фиг. 12
Отбор D'D3-Fc линкеров путем ГДИ у Ф-УШ/ФВ ДГН мышей
ГДИ D'D3-Fc линкерных конструкций ФУШУФВ ДГН мышам (48 часов после инъекции)
Ш 512'
ФУШ-064: рФУШРс-ФВ с 22 ак линкером E"VIII-159: pOVIIIFc-OB с 35 ак линкером ФУИМбО: рФУШРс-ФВ с 48 ак линкером
Фиг. 13
ГДИ одноцепочечного и двухцепочечного гетеродимера Ф-УШГс/Б'БЗ у Ф-УШ/ФВ ДГН мышей
Р=0.1%
Р=0.19
OVIII-148
OL4-p0VIIIFc-D'D3 * Процеесируемый линкер
Фиг. 14
Октетный анализ Ф-УШ-155/ФВ-031 связывания с иммобилизованным ФВ
Выбранный этап: ассоциация (информация с сенсора)
440 460 480 500 520 540 560 580 600 Время (с)
- 0VIII-155/AD-O31
OVIIIFc
Фиг. 15
20 40 Время (часы)
Фиг. 16
Конструкции ФВ
17А. 17Б. 17В.
Линкер переменной длины - (в некоторых случаях расщепляемый Х1а, тромбином, Ха и т.д.)
|| - гетерологичный компонент
Ш 15 Время (часы)
Фиг. 18А
Снижение активности Ф-VIII вследствие диссоциации/деградации тяжелой цепи (ТЦ)
Во к ст. ¦ Вюталиштор Bio-rad
Вестерн- ОМАО^лити- i Щ
добавляя 5 мкг овечьего поликлонального акгитсла к CDVJll (аЬ61370) на протяжении 1 ч при КТ и 100 мкл гранул протеина А. После
отмывки 4x1 ил ФСБ гранулы ржуспендирошли в восстановительном ДСН-ПААГ буфере. 20 мкл загружали в 4-15% гель (т.е. - 1 мкг (DVHIrc)
Фиг. 18Б
Измерение активности Ф-VIIIFc хромогенным методом
Мышиная ДГН плазма
Мышиная гемА плазма
Фиг. 19
Процессинг ФВ-031 (DlD2D'D3Fc) РС5 или РАСЕ
РС5 РАСЕ
DlD2D-D3Fu -
Дорожка 1 - один ФВОЗ1 Дорожка 2- один РС5 Дорожка 3- один РАСЕ Дорожка 4-ФВО31 I РС5-2,5Ч-П Дорожка 5-ФВОЗ 1 I РС5-5% Дорожка 6- ФВОЗ 1 I РС5-7,5% Дорожка 7-ФВОЗ 1 I РС5-10% Дорожка 8- ФВОЗ 1 I РАСЕ-2,5% Дорожка 9- ФВОЗ 1 i РАСЕ 5% Дорожка 10-ФВОЗ 1 i РАСЕ-7,5% Дорожка 11-ФВОЗ I ¦ РАСЕ-10%
Отсутствие связывания Ф-VIII-155/ФВ-031 с ФВ
Сенсор: APS
¦ А5, ФВ- 155,031 E5;0> B- ¦ В5, ФВ - 155,031 " С5, ФВ - Y1680F = D5, ФВ - Y1680F
¦ G5, ФВ-ФУШ (tm) Н5: ФВ - IgG
-А5.ФВ- 155,031 - В5;ФВ-155,031 -C5,OB-Y1680F D5,OB-Y1680F E5, - А5, ФВ - 155,031 - В5, ФВ - 155,031
- С5, ФВ - Y1680F D5, ФВ - Y1680F
Фиг. 21 А
ФЛШ!-155/ФВ-031 не связывается с Ф-VIII
I-155,031 - ФУШ -031-ФУШ -IgG-ФУШ
Сенсор: Протеин G
Фиг. 21 Б
Взаимодействие Ф-VIII с ФВ-031
¦ 1000 КЕ иммобилизованного козлиного античеловеского IgG
¦ 100 КЕ ФВ-031
• OVIII (с удаленным В-доменом) применяли в одноцикловом кинетическом режиме
¦ 1:1 соотношение; п = 4
KD= 10 ± 1 нМ (В 25 раз слабее, чем с FL-ФВ в качестве лиганда)
Фиг. 22
Влияние различной длины линкеров гетеродимеров Ф^ПШс/ФВ на ФК у Ф-VIII/ФВ ДГН мышей
ФК гетеродимеров VJIIFc.' B уФУШФВДГНмышей
D1D2DT3 (1-477 ак с C336AJC379A}. й с одиночной Fc посредством 4вак
Фрагмент D1D2D'D3 (1-477 ак с СЗЗвА/С37ЭА|, связанный с одиночной Fc посредством 73ак тромбин-отщелляемого линкера
Фрагмент D1D2D!D3 (1-477 ак с C336AJC378A), связанный с одиночной Fc посредством Мак тромбин-отщелляеиого линкера
LPXTG
Пример лигирования сортазой
Фрагмент ФВ ;
Дополненный ФВ и ФУШ
?ЛАНС
сортаза
Дополненный ФВ и ФУШ
: Фрагмент ФВ
сортаза
Дополненный ФВ и ФУШ
Д) I Фрагмент ФЬ i/VrvJl1> NҐTVAl fe I
Фиг. 24
линкер переменной д.
Схематическое сравнение одноцепочечного Ф-VIIIFc (ФЛШП55) и частичного В-домена, содержащего одноцепочечный Ф-VIIIFc (Ф-VIII 1 98)
(В-домен -226N6)
OVIII 155:Fc OVIII 198:Fc
(одноцепочечный OVIIIFc) (одноцепочечный OVIIIFc
с 226N6)
Фиг. 25
Частичный В-домен увеличивает время полужизни Ф-VIII 198 в 1,5 раз по сравнению с Ф-VIII 155
Иннубяцнн ФУШ в ДГН плазме Время (часы)
Ю "IS 20
Время (чаеы)
Фиг. 26
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028309
028309
- 1 -
- 1 -
028309
028309
- 1 -
- 1 -
028309
028309
- 4 -
- 3 -
028309
028309
- 6 -
- 6 -
028309
028309
- 7 -
- 7 -
028309
028309
- 30 -
- 30 -
028309
028309
- 31 -
- 31 -
028309
028309
- 35 -
- 35 -
- 36 -
- 36 -
- 39 -
- 39 -
028309
028309
- 40 -
- 40 -
028309
028309
- 43 -
028309
028309
- 46 -
- 46 -
028309
028309
- 55 -
- 55 -
028309
028309
- 56 -
- 56 -
028309
028309
- 77 -
- 77 -
028309
028309
- 79 -
- 79 -
028309
028309
- 84 -
- 84 -
028309
028309
- 85 -
- 85 -
028309
028309
- 86 -
- 86 -
028309
028309
- 87 -
- 87 -
028309
- 99 -
- 98 -
028309
028309
- 101 -
- 101 -
028309
028309
- 103 -
- 103 -
028309
028309
- 104 -
- 104 -
028309
028309
- 107 -
- 107 -
028309
028309
- 115 -
116
028309
028309
- 118 -
- 118 -
028309
028309
- 118 -
- 118 -
028309
028309
- 120 -
- 120 -
028309
028309
- 120 -
- 120 -
028309
028309
- 147 -
- 147 -
028309
028309
- 147 -
- 147 -
028309
028309
- 149 -
- 149 -
028309
028309
- 149 -
- 149 -
028309
028309
- 156 -
- 156 -
028309
028309
- 156 -
- 156 -
028309
028309
- 170 -
- 170 -
028309
028309
- 170 -
- 170 -
028309
028309
- 171 -
- 171 -
028309
028309
- 175 -
- 175 -
028309
028309
- 179 -
- 179 -
028309
028309
- 179 -
- 179 -
028309
028309
- 183 -
- 183 -
028309
028309
- 184 -
- 184 -
028309
028309
- 187 -
- 187 -
028309
028309
- 189 -
- 189 -
028309
028309
- 189 -
- 189 -
028309
028309
- 199 -
- 199 -
028309
028309
- 199 -
- 199 -
028309
028309
- 201 -
- 201 -
028309
028309
- 201 -
- 201 -
028309
028309
- 207 -
208
028309
028309
- 210 -
- 210 -
028309
028309
- 212 -
- 212 -
028309
028309
- 218 -
- 218 -
028309
028309
- 218 -
- 218 -
028309
028309
- 224 -
- 224 -
028309
028309
- 224 -
- 224 -
028309
028309
- 235 -
- 235 -
028309
028309
- 235 -
- 235 -
028309
028309
- 237 -
- 237 -
028309
028309
- 237 -
- 237 -
028309
028309
- 241 -
- 241 -
028309
028309
- 245 -
- 245 -
028309
028309
- 251 -
- 251 -
028309
028309
- 252 -
- 252 -
028309
028309
- 255 -
- 255 -
028309
028309
- 255 -
- 255 -
028309
028309
- 257 -
- 257 -
028309
028309
- 260 -
- 260 -
028309
028309
- 260 -
- 260 -
028309
028309
- 260 -
- 260 -
028309
028309
- 261 -
- 261 -
028309
028309
- 261 -
- 261 -
028309
028309
- 261 -
- 261 -
028309
028309
- 261 -
- 261 -
028309
028309
- 261 -
- 261 -
028309
028309
- 262 -
- 262 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 263 -
- 263 -
028309
028309
- 264 -
- 264 -
028309
028309
- 264 -
- 264 -
028309
028309
- 264 -
- 264 -
028309
028309
- 265 -
- 265 -
028309
028309
- 265 -
- 265 -
028309
028309
- 265 -
- 265 -
028309
028309
- 265 -
- 265 -
028309
028309
- 266 -
- 266 -
028309
028309
- 266 -
- 266 -
028309
028309
- 266 -
- 266 -
028309
028309
- 266 -
- 266 -
028309
028309
- 267 -
- 267 -
028309
028309
- 267 -
- 267 -
028309
028309
- 267 -
- 267 -
028309
028309
- 267 -
- 267 -
028309
028309
- 267 -
- 267 -
028309
028309
- 267 -
- 267 -
028309
028309
- 268 -
- 268 -
028309
028309
- 268 -
- 268 -
028309
028309
- 268 -
- 268 -