[RU]

1. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), полученного из консенсусной последовательности домена FN3, включающий стадии получения полипептида из консенсусной последовательности домена FN3, имеющего по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).

2. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), включающий стадии получения полипептида, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16 для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).

(57) Реферат / Формула:

1. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), полученного из консенсусной последовательности домена FN3, включающий стадии получения полипептида из консенсусной последовательности домена FN3, имеющего по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).

2. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), включающий стадии получения полипептида, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16 для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).

---

Евразийское
патентное
ведомство
028304
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.11.30
(21) Номер заявки 201170635
(22) Дата подачи заявки 2009.10.27
(51) Int. Cl. C07K16/00 (2006.01)
(54)
СПОСОБЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ БИБЛИОТЕКИ БЕЛКОВОГО КАРКАСА НА ОСНОВЕ ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА ТИПА III (FN3)
(31) 61/110,120
(32) 2008.10.31
(33) US
(43) 2011.12.30
(86) PCT/US2009/062200
(87) WO 2010/051274 2010.05.06
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
СЕНТОКОР ОРТО БАЙОТЕК ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Джекобс Стивен, О'Нил Кэрин (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20080220049 US-A1-20080015339 US-A1-20040259781 US-A1-20070184476 US-A1-20060040278
DUTTA et al. High-affinity fragment complementation of a fibronectin type III domain and its application to stability enhancement. Protein Sci. 2005, vol. 14(11), p.2838-2848
(57) Изобретение относится к способам конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к белковым каркасам с новыми свойствами, включая возможность связываться с клеточными мишенями, а именно к белковому каркасу, основанному на консенсус-ной последовательности повтора домена фибронектина типа III (FN3).
Предпосылки создания изобретения
Способом выбора в ситуациях, когда терапевтический белок должен иметь высокую аффинность и специфичность к молекуле-мишени, являются моноклональные антитела. Однако для биофармацевтической промышленности большой интерес также представляет изготовление не являющихся антителами белков, которые способны связываться с такими мишенями. Такие альтернативные белковые каркасы могут иметь преимущества перед традиционными антителами по причине малого размера, отсутствия двусернистых связей, высокой стабильности и возможности экспрессироваться в прокариотических клетках-хозяевах. Они допускают применение новых способов очистки, с легкостью конъюгируются с лекарственными средствами/токсинами, эффективно проникают в ткани и легко упаковываются в муль-тиспецифические связывающие вещества (Skerra 2000, Binz and Pluckthun 2005). Одним из таких альтернативных белковых каркасов является укладка цепи иммуноглобулинов (Ig). Эта укладка цепи встречается в переменных участках антител, а также в тысячах белков, не являющихся антителами. Исследования показывают, что один из таких белков Ig, десятый повтор домена фибронектина типа III (FN3) из человеческого фибронектина, может допускать ряд мутаций в поверхностных петлях, сохраняя при этом общую структуру укладки цепи Ig. Таким образом, в эти петли вставили библиотеки вариантов аминокислот и выбрали специфические связывающие вещества для ряда разных мишеней (Koide et al. 1998, Karatan et al. 2004). Было обнаружено, что созданные подобным образом домены FN3 связывают мишени с высокой аффинностью, сохраняя при этом важные биофизические свойства (Parker et al. 2005).
К числу желательных физических свойств, которые должны иметь потенциальные альтернативные молекулы каркаса, относятся высокая термальная стабильность и обратимость термального фолдинга и анфолдинга. Для увеличения эффективной термальной стабильности белков и ферментов применяли несколько способов, включая создание рациональной структуры путем сравнения с близкими по строению термостабильными последовательностями, создание стабилизирующих дисульфидных мостиков, мутации с целью увеличения склонности к формированию а-спиралей, создание солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию и создание консенсусных последовательностей (Lehmann and Wyss 2001). Высокая термальная стабильность относится к числу желательных свойств таких каркасов, поскольку она может увеличивать выход получаемого рекомбинантного белка, улучшать растворимость очищенной молекулы, повышать активность внутриклеточных каркасов, снижать иммуногенность и сводить к минимуму потребность в "холодовой цепи" при производстве.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), способам генерации белкового каркаса и выделенному белковому каркасу.
Настоящее изобретение предоставляет белковый каркас на основе белка с повтором домена фибро-нектина типа III (FN3), кодирующие или комплементарные нуклеинозые кислоты, векторы, клетки-хозяева, композиции, комбинации, препараты, устройства и способы их получения и применения. В предпочтительном воплощении белковый каркас содержит консенсусную последовательность нескольких доменов FN3 из человеческого тенасцина-С (в дальнейшем "тенасцин"). В другом предпочтительном воплощении белковый каркас по настоящему изобретению является консенсусной последовательностью 15 доменов FN3. Белковые каркасы по изобретению могут быть предназначены для связывания различных молекул, например, клеточного белка-мишени.
Белковые каркасы по изобретению могут включать дополнительные молекулы или части, например участок Fc антитела, альбуминсвязывающий домен либо другую часть, влияющую на период полувыведения. В других воплощениях белковые каркасы по изобретению могут связываться с молекулой нуклеиновой кислоты, которая может кодировать белковый каркас.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу экспрессии по меньшей мере одного белкового каркаса на основе консенсусной последовательности нескольких доменов FN3 в клетке-хозяине, включающему культивирование клетки-хозяина, как описано в настоящем документе, в условиях, которые позволяют экспрессировать по меньшей мере один белковый каркас в количествах, допускающих детекцию и/или восстановление.
Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, содержащей а) белковый каркас на основе консенсусной последовательности нескольких доменов FN3 и/или кодирующую нуклеиновую кислоту, как описано в настоящем документе; и b) подходящий и/или фармацевтически приемлемый носитель либо разбавитель.
Настоящее изобретение также относится к способу генерации библиотек белкового каркаса на основе белка с повтором домена фибронектина типа III (FN3), предпочтительно консенсусной последовательности нескольких доменов FN3 и наиболее предпочтительно консенсусной последовательности нескольких доменов FN3 из человеческого тенасцина. Библиотека формируется путем создания последова
тельных генераций каркасов за счет изменения (мутации) аминокислот или количества аминокислот в молекулах в отдельных позициях в частях каркаса, например участках петель. Библиотеки могут быть получены путем изменения аминокислотной композиции одной петли или одновременного изменения нескольких петель либо дополнительных позиций молекулы каркаса. Изменяемые петли могут быть соответствующим образом удлинены или сокращены. Возможна генерация подобных библиотек таким образом, чтобы они содержали все возможные аминокислоты в каждой позиции или особое подмножество аминокислот. Элементы библиотеки могут быть использованы для скрининга с помощью дисплея, например дисплея in vitro (ДНК, РНК, рибосомного и т.д.), дрожжевого, бактериального и фагового.
Белковые каркасы по настоящему изобретению имеют улучшенные биофизические свойства, например стабильность в условиях восстановления и растворимость при высоких концентрациях; они могут быть экспрессированы и фолдированы в прокариотических системах, например Е. coli, в зукариоти-ческих системах, например дрожжах, и в системах транскрипции/трансляции in vitro, например лизате ретикулоцитов кролика.
Дополнительно настоящее изобретение предоставляет способ генерации молекулы каркаса, способной связываться со специфической мишенью, заключающийся в пэннинге библиотеки каркаса по изобретению относительно мишени и затем детекции связывающих веществ. Помимо этого изобретение включает способы скрининга, которые могут быть использованы для генерации или аффинного созревания белковых каркасов с требуемой активностью, например способных связываться с белками-мишенями с определенной аффинностью. Аффинное созревание может достигаться многократными процедурами мутагенеза и селекции с помощью таких систем, как фаговый дисплей или дисплей in vitro. Мутагенез в ходе этого процесса может являться результатом сайт-направленного мутагенеза к специфическим остаткам каркаса, случайным мутагенезом из-за ошибок в ПЦР либо перестановки в ДНК и/или комбинации этих способов. Настоящее изобретение также относится к любым изобретениям, описанным в настоящем документе.
Описание фигур
Фиг. 1. Анализ методом SDS-PAGE очищенного Tencon с помощью бис-трис-геля NuPAGE 4-12% (Invitrogen) и окрашивание Кумасси синим. N означает нативные условия, R - условия восстановления. Фиг. 2. Анализ Tencon в PBS методом спектроскопии кругового дихроизма.
Фиг. 3. Анализ 3-го домена FN3 из тенасцина и Tencon в PBS методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Были получены температуры плавления 54 и 78°С соответственно.
Фиг. 4. Фагмидный плазмидный вектор pTencon-pIX. Экспрессию стимулируют промотор Lac и секреция посредством сигнальной последовательности OmpA.
Фиг. 5. Дисплей Мус-Tencon на фаге М13. Результаты ИФА, показывающие связывание фага с покрытыми а-Мус и CNTO95 лунками, а также непокрытыми лунками.
Фиг. 6. Структура петель 3-го домена FN3 из человеческого тенасцина.
Фиг. 7. Скрининг результатов селекции IgG методом ИФА. В качестве контроля отдельные клоны протестировали на связывание с биотинилированным IgG или биотинилированным HSA.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), полученного из консенсусной последовательности домена FN3, включающий стадии:
получения полипептида из консенсусной последовательности домена FN3, имеющего по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; и
осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронек-тина типа III (FN3).
Настоящее изобретение относится к способу конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), включающий стадии
получения полипептида, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16; и
осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей аминокислотную последовательности SEQ ID NO:16 для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).
Настоящее изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетическим белковым каркасам на основе консенсусной последовательности белка с повтором домена фибронектина типа III (FN3), в частности каркасам, полученным из млекопитающих, а также композициям и кодирующим молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий белковый каркас на основе консенсусной последовательности FN3. Настоящее изобретение также относится среди прочего к способам изготовления и использования таких нуклеиновых кислот и белковых каркасов, в том числе к диагностическим и терапевтическим композициям, способам и устройствам.
Белковые каркасы по настоящему изобретению имеют преимущества перед традиционными способами лечения, например возможность местного введения, перорального приема и преодоления гематоэн-цефалического барьера, возможность экспрессии в Е. Coli, при которой экспрессия белка увеличивается в зависимости от ресурсов (в отличие от экспрессии в клетках млекопитающего), возможность создания биспецифических молекул, связывающихся с несколькими мишенями или несколькими антигенными детерминантами одной мишени, возможность конъюгирования для получения лекарственного средства, полимеров и проб, возможность создания препаратов с высокими концентрациями и способность таких молекул эффективно проникать в пораженные ткани и опухоли.
Кроме того, белковые каркасы обладают многими свойствами антител с точки зрения укладки, которая имитирует переменный участок антитела. Эта ориентация позволяет делать петли FN3 поверхностными по аналогии с гипервариабельными участками (CDR) антител. Предполагается, что они смогут связываться с клеточными мишенями и петли можно будет изменять, например подвергать аффинному созреванию, для улучшения некоторых свойств связывания и т.п.
Три из шести петель белкового каркаса по изобретению топологически соответствуют гипервариабельным участкам (CDR 1-3) антитела, т.е. участкам, связывающим антигены, а оставшиеся три петли являются поверхностными по аналогии с участками CDR антител. Эти петли образуются у или возле остатков 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81 в SEQ ID NO: 16, как показано в табл.3 ниже и на фиг. 6. Для получения специфичности связывания и аффинности предпочтительно связываются участки петель у или возле остатков 22-28, 51-54 и 75-81. Один или несколько этих участков петель перемешиваются случайным образом с другими участками петель и/или другими цепями с сохранением их последовательности в качестве остовных частей библиотеки, при этом из библиотеки могут быть выбраны высокоактивные связывающие вещества с высокой аффинностью к конкретному белку-мишени. Один или несколько участков петель могут взаимодействовать с белком-мишенью по аналогии с тем, как участок CDR антитела взаимодействует с белком.
Каркасы по настоящему изобретению могут включать другие субъединицы, например, через кова-лентное взаимодействие. Постоянный участок антитела может быть полностью или частично связан с каркасом для придания последнему свойств, характерных для антитела, например комплементарной активности (ADCC), периода полувыведения и т.д. К примеру можно обеспечивать и/или контролировать эффекторную функцию, изменяя связывание C1q и/или связывание FcyR, в результате чего изменяется активность CDC и/или активность ADCC. Эффекторные функции отвечают за активацию или уменьшение биологической активности (например, у испытуемого). К эффекторным функциям относятся, в частности, связывание C1q; комплементзависимая цитотоксичность (CDC); связывание рецептора Fc; анти-телозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; супрессирующий эффект на рецепторы клеточной поверхности (например, рецептор клеток В (BCR)) и т.д. Такие эффекторные функции могут потребовать связывания участка Fc со связывающим доменом (петлями белкового каркаса и т.д.) и могут быть оценены с помощью различных способов анализа (например, анализа связывания Fc, анализа ADCC, анализа CDC и т.д.).
Кроме того, для получения требуемых свойств к молекуле каркаса могут быть присоединены молекулы конъюгата токсина, альбумина или связывающего альбумин вещества, полиэтиленгликоля (PEG). Любые из этих соединений могут быть получены стандартными способами, например путем экспрессии рекомбинантного белка из рекомбинантного гибридного гена, сконструированного из общедоступных последовательностей генов.
Каркасы по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими в мономерной форме и би-или мультиспецифическими (для разных белков-мишеней или антигенных детерминант одного белка-мишени) в многомерной форме. Присоединения могут быть ковалентными или нековалентными. Например, двумерный биспецифический каркас имеет одну субъединицу со специфичностью к первому белку-мишени или первой антигенной детерминанте и вторую субъединицу со специфичностью ко второму белку-мишени или второй антигенной детерминанте. Субъединицы каркаса могут соединяться в разные структуры, тем самым увеличивается валентность и, как следствие, авидность связывания антигенов.
В настоящем документе термин "антитело" означает любую белок- или пептидсодержащую молекулу, которая состоит по меньшей мере из части молекулы иммуноглобулина, в частности по меньшей мере из одного гипервариабельного участка (CDR) тяжелой или легкой цепи либо его лигандсвязующей части, переменного участка тяжелой или легкой цепи, постоянного участка тяжелой или легкой цепи, каркасного участка или их части. В некоторых случаях такое антитело воздействует на специфический лиганд, в частности может модулировать, снижать, увеличивать, не допускать, предотвращать, уменьшать, смягчать, блокировать, ингибировать, уничтожать и/или нарушать по меньшей мере одну активность или связь либо активность или связь рецептора in vitro, in situ и/или in vivo.
Дополнительно термин "антитело" означает антитела, продукты расщепления, указанные части и их варианты, в частности миметики антител или составные части антител, имитирующие структуру и/или функцию антитела или его указанного фрагмента либо части, в том числе одноцепочечные антитела, од-нодоменные антитела и их фрагменты. Функциональные фрагменты включают антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с конкретной мишенью. Например, в изобретение включены фрагмен
ты антител, способные связываться с определенной мишенью, или их части, в частности фрагменты Fab (например, в результате расщепления папаином), Fab' (например, в результате расщепления пепсином и частичного восстановления) и F(ab')2 (например, в результате расщепления пепсином), facb (например, в результате расщепления плазмином), pFc' (например, в результате расщепления пепсином или плазми-ном), Fd (например, в результате расщепления пепсином, частичного восстановления и реагрегации), Fv или ScFv (например, с помощью методов молекулярной биологии) (см., например, Colligan Immunology, supra).
Такие фрагменты могут быть получены путем ферментативного расщепления, методами синтеза или рекомбинации, известными из уровня техники и/или описанными в настоящем документе. Антитела также могут быть получены в различных усеченных формах с использованием генов антител, в которых один или несколько стоп-кодонов добавлены выше естественного сайта терминации.
Например, возможно создание комбинационного гена, кодирующего часть тяжелой цепи F(ab')2, содержащего последовательности ДНК, кодирующие домен CH1 и/или шарнирный участок тяжелой цепи. Различные части антител могут быть соединены химическим способом с использованием традиционных способов или получены в виде единого белка с использованием методов генной инженерии.
Белковый каркас по настоящему изобретению может быть использован с целью измерить, вызвать в клетке, ткани, органе или животном (включая млекопитающих и человека), диагностировать, монитори-ровать, модулировать, вылечить, смягчить, предотвратить или снизить симптомы по меньшей мере одного заболевания или состояния, в частности по меньшей мере одного заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из иммунного нарушения или заболевания, сердечно-сосудистого нарушения или заболевания, инфекции, злокачественного заболевания и/или неврологического нарушения или заболевания, а также других известных или указанных связанных состояний.
Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, которым требуется такого рода модулирование, лечение, смягчение, предотвращение или сокращение симптомов, эффектов либо механизмов. Эффективное количество - это количество от 0,001 до 500 мг/кг за одно (болюсное и т.д.) многократное или постоянное введение либо количество, необходимое для достижения концентрации в сыворотке 0,01-5000 мг/мл за одно многократное или постоянное введение, либо любой эффективный диапазон или значение из него, применяемые и определенные с помощью известных способов, описанных в настоящем документе или известных из уровня техники.
Белковый каркас по настоящему изобретению - изготовление и генерация.
По меньшей мере один белковый каркас по настоящему изобретению может быть в некоторых случаях получен с помощью линии клеток, смешанной линии клеток, иммортализованной клетки или кло-нальной популяции иммортализованных клеток, хорошо известных из уровня техники (см., например, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
Аминокислоты белкового каркаса могут быть изменены, добавлены и/или удалены для снижения иммуногенности или сокращения, улучшения либо изменения связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, периода полувыведения, стабильности, растворимости или другого соответствующего свойства, известного из уровня техники.
В некоторых случаях могут изготавливаться белковые каркасы с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в некоторых случаях белковые каркасы могут быть получены путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных искусственных продуктов с помощью трехмерных моделей родительских и искусственных последовательностей. Трехмерные модели широкодоступны и известны специалистам в данной области техники. Существуют компьютерные программы, иллюстрирующие и показывающие вероятные трехмерные конформационные структуры отобранных последовательностей-кандидатов и способные измерять потенциальную иммуногеничность (например, программа Immunofilter разработки Xencor, Inc., Монровия, Калифорния). Изучение таких иллюстраций позволяет проанализировать предполагаемую роль остатков в функционировании последовательности-кандидата, например остатков, влияющих на способность белкового каркаса-кандидата связывать его антиген. Таким образом, возможны селекция и комбинирование остатков из родительской и референсной последовательностей с целью получения требуемого свойства, например аффинности к антигенам-мишеням. Помимо вышеуказанных процедур или в дополнение к ним могут быть использованы другие подходящие способы инженерии.
Скрининг.
Скрининг белкового каркаса на предмет специфического связывания схожих белков или фрагментов без труда осуществляется с помощью библиотек дисплеев нуклеотидов (дисплея ДНК или РНК) или пептидов, например дисплея in vitro. Этот способ включает скрининг больших количеств пептидов на
предмет отдельных пептидов, имеющих требуемую функцию или структуру. Последовательности нук-леотидов или пептидов в дисплее могут содержать от 3 до 5000 и более нуклеотидов или аминокислот в длину, часто от 5 до 100 аминокислот в длину и периодически от 8 до 25 аминокислот в длину. Помимо способов прямого химического синтеза из уровня техники известны несколько способов рекомбинант-ных ДНК для генерации библиотек пептидов. Один из таких способов предусматривает дисплей последовательности пептидов на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или каждая клетка содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую отдельно взятую видимую последовательность пептидов. Такие способы описаны в патентных публикациях РСТ № 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278.
Другие системы для генерации библиотек пептидов применяют как методы химического синтеза in vitro, так и рекомбинантные методы (см. патентные публикации РСТ № 92/05258, 92/14843 и 96/19256, см. также патенты США №№ 5658754 и 5643768). В продаже имеются библиотеки пептидных дисплеев, векторы и комплекты для скрининга таких производителей, как Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) и Cambridge Antibody Technologies (Кембриджшир, Великобритания) (см., например, патенты США №№
4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456,
полученные Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, полученные Dyax, 5427908, 5580717, полученные Affymax; 5885793, полученные Cambridge Antibody Technologies; 5750373, полученные Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, полученные Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; или Sambrook, supra.
Белковые каркасы по изобретению могут связывать белки человека или других млекопитающих с разной степенью аффинности (KD). В предпочтительном воплощении по меньшей мере один белковый каркас по настоящему изобретению может в некоторых случаях связываться с белком-мишенью с высокой аффинностью, например с KD, равным или менее чем приблизительно 10-7 М, в частности 0,1-9,9 (либо любой диапазон или значение из него) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 либо любой диапазон или значение из него, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса или методом, используемыми специалистами в данной области техники.
Аффинность или авидность белковых каркасов к антигену может быть определена экспериментальным путем с помощью любого подходящего способа (см., например, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," в Fundamental Immunology, Paul W.E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992); и описанные в настоящем документе способы.). Измеренная аффинность отдельно взятого комплекса "белковый каркас-антиген" может меняться в зависимости от условий измерения (концентрации соли, рН и т.д.). Следовательно, измерения аффинности и других параметров связывания антигена (KD, Kon, Koff и т.д.) предпочтительно производить с использованием стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена и стандартизированного буфера, например, описанного в настоящем документе.
Возможно проведение анализа конкурентного связывания белкового каркаса по настоящему изобретению с целью определить, какие белки, антитела и другие антагонисты конкурируют за связывание белка-мишени с белковым каркасом по настоящему изобретению и/или совместно используют участок антигенной детерминанты. Эти анализы, хорошо известные средним специалистам в данной области техники, предназначены для оценки конкуренции между антагонистами или лигандами за ограниченное количество сайтов связывания у белка. Белок и/или антитела нейтрализуют или переводят в нерастворимую форму до или после конкурентного анализа, и пробу, связавшуюся с белком-мишенью, отделяют от несвязавшейся пробы, например, путем переливания (если белок/антитело предварительно перевели в нерастворимую форму) или центрифугирования (если белок/антитело осадили после реакции конкурентного анализа). Кроме того, конкурентное связывание можно определить по тому, изменена ли функция в результате связывания или несвязывания белкового каркаса с белком-мишенью: например, молекула белкового каркаса может ингибировать или стимулировать ферментативную активность, к примеру, метки. Возможно использование ИФА и других функциональных анализов, хорошо известных из уровня техники.
Молекулы нуклеиновых кислот.
Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, кодирующие белковый каркас, могут иметь форму РНК, например мРНК, гяРНК, тРНК или любую другую форму, либо форму ДНК, в частности кДНК и геномной ДНК, полученной путем клонирования, синтеза или любой комбинации этих способов. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной и одноцепочечной либо комбинированной. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может быть кодирующей цепью, также называемой смысловой цепью, или некодирующей цепью, также называемой антисмысловой цепью.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут включать молекулы нуклеиновых кислот, содержащие открытую рамку считывания (ORF), в некоторых случаях с одним или несколькими интронами, в частности по меньшей мере одну указанную часть по меньшей мере одного белкового каркаса; молекулы нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность для белкового каркаса или участок петли, который связывается с белком-мишенью; и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность нуклеотидов, существенно отличающуюся от вышеописан
ных, но из-за дегенерации генетического кода по-прежнему кодирующую белковый каркас, как описано в настоящем документе и/или известно из уровня техники. Очевидно генетический код хорошо известен из уровня техники. Следовательно, специалист в данной области техники без труда может получить такие дегенерировавшие варианты нуклеиновой кислоты, которые кодируют специфические белковые каркасы по настоящему изобретению (см., например, Ausubel, et al., supra), такие варианты нуклеиновой кислоты относятся к настоящему изобретению.
Как указано в настоящем документе, молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, которые составляют нуклеиновую кислоту, кодирующую белковый каркас, могут включать, в частности, следующее: молекула, кодирующая последовательность аминокислот одного фрагмента белкового каркаса; кодирующая последовательность всего белкового каркаса или его части; кодирующая последовательность белкового каркаса, фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, например кодирующая последовательность по меньшей мере одного сигнального пептида или слитого пептида с вышеуказанными дополнительными кодирующими последовательностями или без них, например по меньшей мере один интрон совместно с дополнительными некодирующими последовательностями, в частности некодирующими 5'- и 3'-концевыми последовательностями, например транскрибированными не подвергшимися трансляции последовательностями, которые играют роль в транскрипции, обработке мРНК, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например, связывание рибосом и стабильность мРНК); дополнительная кодирующая последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, например, обеспечивающие дополнительные функции. Таким образом, последовательность, кодирующая белковый каркас, может быть соединена с маркирующей последовательностью, например последовательностью, кодирующей пептид, который способствует очищению слитого белкового каркаса, содержащего фрагмент или часть белкового каркаса.
Селективная гибридизация полинуклеотидов в описанный здесь полинуклеотид.
Настоящее изобретение включает выделенные нуклеиновые кислоты, которые в описанных здесь условиях селективной гибридизации образуют описанный здесь полинуклеотид. Таким образом, поли-нуклеотиды по этому воплощению могут быть использованы для выделения, детекции и/или подсчета нуклеиновых кислот, составляющих подобного рода полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации, выделения или амплификации частичных либо полноразмерных клонов в подготовленной библиотеке. В некоторых воплощениях по-линуклеотиды являются последовательностями геномной ДНК или кДНК, выделенными или иным образом комплементарными относительно кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.
Библиотека кДНК предпочтительно содержит по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полноразмерных последовательностей и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеки кДНК могут быть нормализованы с целью увеличения количества редких последовательностей. Для последовательностей, мало идентичных комплементарным последовательностям, обычно, но не исключительно гибридизацию осуществляют в условиях низкой или умеренной жесткости. Для последовательностей с большей идентичностью в некоторых случаях применяют условия средней и высокой жесткости. Условия низкой жесткости допускают селективную гибридизацию последовательностей с уровнем идентичности приблизительно 70% и могут быть использованы для идентификации ортологических или паралогических последовательностей.
В некоторых случаях полинуклеотиды по настоящему изобретению кодируют по меньшей мере часть белкового каркаса, кодируемого описанными здесь полинуклеотидами. Полинуклеотиды по настоящему изобретению включают последовательности нуклеиновых кислот, которые могут использоваться для селективной гибридизации в полинуклеотид, кодирующий белковый каркас по настоящему изобретению (см., например, Ausubel, supra; Colligan, supra), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.
Конструирование нуклеиновых кислот.
Выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть получены с помощью а) рекомбинантных способов, b) способов синтеза, с) способов очистки и/или d) их комбинаций, хорошо известных из уровня техники.
Нуклеиновые кислоты могут быть без труда дополнены последовательностями, помимо полинук-леотида по настоящему изобретению. Например, в нуклеиновую кислоту можно вставить сайт множественного клонирования, содержащий один или несколько сайтов рестрикции эндонуклеазы, чтобы способствовать выделению полинуклеотида. Кроме того, могут быть вставлены транслируемые последовательности, чтобы способствовать выделению транслированного полинуклеотида по настоящему изобретению. К примеру удобным способом очистки белков по настоящему изобретению является гексагисти-дин-маркирующая последовательность. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению, за исключением кодирующей последовательности, может в некоторых случаях являться вектором, адаптером или линкером для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению.
В подобные клонирующие и/или экспрессирующие последовательности могут быть добавлены до
полнительные последовательности, чтобы оптимизировать их функционирование при клонировании и/или экспрессии, способствовать выделению полинуклеотида или улучшить проникновение полинук-леотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессирующих векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно из уровня техники (см., например, Ausubel, supra или Sambrook, supra). Рекомбинантные способы конструирования нуклеиновых кислот.
Выделенные композиции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например РНК, кДНК, геномная ДНК или их комбинация, могут быть получены из биологических источников с помощью любого количества способов клонирования, известных специалистам в данной области техники. В некоторых воплощениях пробы олигонуклеотидов, в результате селективной гибридизации в жестких условиях образующие полинуклеотиды по настоящему изобретению, используются для идентификации требуемой последовательности в библиотеке кДНК или геномной ДНК. Выделенные РНК и конструирование библиотек кДНК и геномной ДНК хорошо известны средним специалистам в данной области техники (см., например, Ausubel, supra или Sambrook, supra).
Способы скрининга и выделения нуклеиновых кислот.
Библиотека кДНК или геномной ДНК может быть подвергнута скринингу с помощью пробы, основанной на последовательности полинуклеотида по настоящему изобретению, например, описанного здесь. Пробы могут быть использованы для гибридизации с последовательностями геномной ДНК или кДНК для выделения гомологичных генов в одинаковых либо разных организмах. Специалистам в данной области техники будет ясно, что при анализе можно варьировать жесткость условий гибридизации, при этом жесткие условия могут иметь как гибридизационная, так и промывочная среда. Чем жестче условия гибридизации, тем выше должна быть комплементарность между пробой и мишенью, чтобы мог образоваться дуплекс. Жесткость условий можно контролировать одним или несколькими из следующих параметров: температура, ионная сила, рН и присутствие частично денатурирующего разбавителя, например формамида. К примеру жесткость условий гибридизации удобно регулировать путем изменения полярности реагирующего раствора, например через подбор концентрации формамида в диапазоне от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичности последовательностей), необходимая для детекции связывания, зависит от жесткости условий гибридизационной и/или промывочной среды. Оптимальной является степень комплементарности, равная 100, 70-100% либо любой диапазон или значение из него. Однако следует понимать, что незначительные изменения последовательности в пробах и праймерах могут быть компенсированы за счет снижения жесткости гибридизационной и/или промывочной среды.
Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны из уровня техники и могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением без лишних экспериментов и на основании представленных здесь инструкций и рекомендаций.
К известным способам амплификации РНК или ДНК относятся, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и соответствующие процессы амплификации (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188 авторства Mullis, et al.; 4795699 и 4921794 авторства Tabor, et al; 5142033 авторства Innis; 5122464 авторства Wilson, et al.; 5091310 авторства Innis; 5066584 авторства Gyllensten, et al.; 4889818 авторства Gelfand, et al.; 4994370 авторства Silver, et al.; 4766067 авторства Biswas; 4656134 авторства Ringold) и РНК-опосредованная амплификация, применяющая антисмысловую РНК к целевой последовательности в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238 авторства Malek, et al., торговое наименование: NASBA); каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки (см., например, Ausubel, supra или Sambrook, supra).
К примеру метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) может быть использован для амплификации последовательностей полинуклеотидов по настоящему изобретению и связанных генов напрямую из библиотек геномной ДНК или кДНК. ПЦР и другие способы амплификации in vitro могут быть также полезны, например, для клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих белки, которые требуется экспрессировать, чтобы получить пробы нуклеиновых кислот для детекции присутствия требуемой мРНК в пробах, секвенирования нуклеиновых кислот или иных целей. Примеры способов, на основании которых специалист в данной области техники может уяснить способы амплификации in vitro, приведены в Berger, supra, Sambrook, supra, и Ausubel, supra, а также в Mullis, et al., патент США № 4683202 (1987); и Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Имеющиеся в продаже наборы для ПЦР-амплификации геномной последовательности известны из уровня техники (см., например, набор Advantage-GC Genomic PCR (Clontech)). Кроме того, возможно использование, например, белка Т4 gene 32 protein (Boehringer Mannheim) для увеличения количества продуктов при ПЦР длинных фрагментов.
Синтетические способы конструирования нуклеиновых кислот.
Выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть также получены прямым химическим синтезом с помощью известных способов (см., например, Ausubel, et al., supra). Химический синтез обычно позволяет получить одноцепочечный олигонуклеотид, который может быть трансформирован в двухцепочечную ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или полимеризации с использованием ДНК-полимеразы и одиночной цепи в качестве матрицы. Специалистам в данной области техники известно, что химический синтез ДНК может быть ограничен последо
вательностями длиной в 100 или более оснований, однако короткие последовательности можно лигиро-вать, тем самым получив более длинные последовательности. Рекомбинантные экспрессирующие кассеты.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Последовательность нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, например последовательность кДНК или геномной ДНК, кодирующая белковый каркас по настоящему изобретению, может быть задействована для конструирования рекомбинант-ной экспрессирующей кассеты, которая может быть введена по меньшей мере в одну требуемую клетку-хозяина. Рекомбинантная экспрессирующая кассета, как правило, содержит полинуклеотид по настоящему изобретению, функционально связанный с транскрипционными инициационными регуляторными последовательностями, которые направляют транскрипцию полинуклеотида в требуемой клетке-хозяине. Для направления экспрессии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут применяться как гетерологичные, так и негетерологичные (т.е. эндогенные) промоторы.
В некоторых осуществлениях выделенные нуклеиновые кислоты, выступающие промотором, эн-хансером или другим элементом, могут быть введены в соответствующей позиции (выше, ниже или в интроне) негетерологичной формы полинуклеотида по настоящему изобретению, чтобы увеличить или сократить экспрессию полинуклеотида по настоящему изобретению. Например, эндогенные промоторы могут быть изменены in vivo или in vitro в результате мутации, делеции и/или замены.
Векторы и клетки-хозяева.
Настоящее изобретение также относится к векторам, которые содержат выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, клетки-хозяева, полученные путем генной инженерии при помощи рекомбинантных векторов, и изготовлению по меньшей мере одного белкового каркаса с помощью рекомбинантных способов, хорошо известных из уровня техники (см., например, Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.
Полинуклеотиды могут быть в некоторых случаях вставлены в вектор, содержащий селектируемый маркер, с целью размножения в клетке-хозяине. Как правило, плазмидный вектор вводят в осадок, например осадок фосфата кальция, или в комплекс с заряженным липидом. Если в качестве вектора используется вирус, то он может быть упакован in vitro с помощью соответствующей пакующей линии клеток и затем введен в клетки-хозяева.
Вставку ДНК необходимо функционально связать с соответствующим промотором. Экспрессион-ные конструкции также содержат сайты для инициации транскрипции, терминирования, а в транскрибированном участке - сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемая конструкциями, предпочтительно содержит трансляцию, инициированную в начале, и стоп-кодон (UAA, UGA или UAG и т.д.), соответствующим образом расположенные в конце транслируемой мРНК, причем для экспрессии клеток млекопитающих или эукариотических клеток предпочтительны UAA и UAG.
Экспрессионные векторы предпочтительно, но необязательно содержат по меньшей мере один селектируемый маркер. К подобным маркерам, в частности, относятся метотрексат (МТХ), дигидрофолат-редуктаза (DHFR, патенты США №№ 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017, ампициллин, неомицин (G418), микофенолокислота или гены устойчивости к глутаминсинтетазе (GS, патенты США №№ 5122464; 5770359; 5827739) для эукариотических клеточных культур и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования в Е. coli и других бактериях или прокариотических средах (вышеуказанные патенты полностью включены в текст настоящего документа путем ссылки). Соответствующие питательные среды и условия для вышеуказанных клеток-хозяев известны из уровня техники. Подходящие для этих целей векторы известны специалистам в данной области техники. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина может осуществляться путем кальций-фосфатной транс-фекции, DEAE-декстран-опосредованной трансфекции, трансфекции, опосредованной катионными ли-пидами, электропорации, трансдукции, инфекции или других известных способов. Такие способы известны из уровня техники, например, описаны у Sambrook, supra, главы 1-4 и 16-18; Ausubel, supra, главы 1, 9, 13, 15, 16.
По меньшей мере один белковый каркас по настоящему изобретению может быть экспрессирован в измененном виде, например в виде рекомбинантного белка, и может содержать не только сигналы секреции, но и дополнительные гетерологичные функциональные участки. Например, в N-конце белкового каркаса может быть добавлен участок дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, для повышения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине в процессе очистки или последующих процедур обработки и хранения. Кроме того, в белковый каркас по настоящему изобретению могут быть добавлены пептидные части для улучшения очистки. Такие участки могут быть удалены перед окончательной подготовкой белкового каркаса или по меньшей мере его одного фрагмента. Такие способы описаны в многочисленных стандартных лабораторных руководствах, например Sambrook, supra, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; Ausubel, supra, главы 16, 17 и 18.
Средним специалистам в данной области техники известны многочисленные экспрессионные сис
темы, позволяющие экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению. Кроме того, нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в клетке-хозяине путем манипуляций в клетке-хозяине, которая содержит эндогенную ДНК, кодирующую белковый каркас по настоящему изобретению. Такие способы хорошо известны из уровня техники, например описаны в патентах США №№ 5580734, 5641670, 5733746 и 5733761, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.
Примерами клеточных культур, подходящих для получения белковых каркасов, указанных частей или их вариантов, являются бактериальные, дрожжевые клетки и клетки млекопитающих, известные из уровня техники. Системы клеток млекопитающих часто используются в виде монослоев клеток, однако также могут быть использованы суспензии или биореакторы клеток млекопитающих. Из уровня техники известны несколько подходящих линий клеток-хозяев, способных экспрессировать интактные гликози-лированные белки, в частности линии клеток COS-1 (например, АТСС CRL 1650), COS-7 (например, АТСС CRL-1651), HEK293, BHK21 (например, АТСС CRL-10), СНО (например, АТСС CRL 1610) и
BSC-1 (например, АТСС CRL-26), клетки Cos-7, клетки СНО, клетки hep G2, клетки P3X63Ag8.653,
SP2/0-Ag14, 293, клетки HeLa и т.п., например, производства American Type Culture Collection, Манассас, Вирджиния (www.atcc.org). К предпочтительным клеткам-хозяевам относятся клетки лимфоидного происхождения, например миеломные и лимфомные. Наиболее предпочтительны клетки-хозяева P3X63Ag8.653 (входящий номер АТСС CRL-1580) и клетки SP2/0-Ag14 (входящий номер АТСС CRL-1851). В наиболее предпочтительном воплощении в качестве рекомбинантной клетки используется клетка P3X63Ab8.653 или SP2/0-Ag14.
Экспрессионные векторы для таких клеток могут содержать, в частности, одну или несколько следующих последовательностей контроля экспрессии: точка начала репликации; промотор (например, поздние или ранние промоторы SV40, промотор CMV (патенты США №№ 5168062; 5385839), промотор HSV tk, промотор pgk (фосфоглицераткиназа), промотор EF-1 alpha (патент США №5266491), по меньшей мере один промотор человека; энхансер и/или сайты обработки информации, например сайты связывания рибосомы, сайты сплайсинга PHK, сайты полиаденилирования (например, сайт добавления SV40 large T Ag poly А) и транскрипционные терминирующие последовательности (см., например, Au-subel et al., supra; Sambrook, et al., supra). Для получения нуклеиновых кислот или белков по настоящему изобретению могут использоваться другие известные клетки, в том числе заказываемые по каталогу American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) либо у других известных или коммерческих поставщиков.
В случае использования эукариотических клеток-хозяев в вектор обычно добавляют последовательности полиаденилирования или транскрипционные терминирующие последовательности.
Например, в качестве терминирующей последовательности может использоваться последовательность полиаденилирования из гена гормона роста крупного рогатого скота. Возможно также добавление последовательностей для точного сплайсинга транскрипта. Например, в качестве последовательности сплайсинга может быть использован интрон VP1 из SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Кроме того, в вектор могут быть добавлены последовательности генов для контроля репликации в клетке-хозяине, известные из уровня техники.
Очистка белкового каркаса.
Белковый каркас может быть восстановлен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными способами, в частности очистка белком А, осаждение сульфатом аммония или спиртом, экстрагирование кислотой, анионо- или катионообменная хроматография, хроматография на фосфоцел-люлозе, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография, хроматография на гидроксилапатите и хроматография на лектине. Для очистки можно также использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) (см., например, Colligan, Current Protocols in Immunology или Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, 10), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.
Белковые каркасы по настоящему изобретению включают натурально очищенные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными способами из прокариотического или эукариотического хозяина, в частности клетки Е. Coli, дрожжевые, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в рекомбинантном способе, белковый каркас по настоящему изобретению может быть гликозилированным или негликозилированным. Такие способы описаны в многочисленных стандартных лабораторных руководствах, например Sambrook, supra, разделы 17.37-17.42; Ausubel, supra, главы 10, 12, 13, 16, 18 и 20, Colligan, Protein Science, supra, главы 12-14, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.
Коды аминокислот.
Аминокислоты, составляющие белковые каркасы по настоящему изобретению, часто указываются в виде аббревиатур. Наименования аминокислот могут указываться с помощью однобуквенного кода аминокислоты, трехбуквенного кода, названия или кодона из трех нуклеотидов, что хорошо известно из уровня техники (см. Alberts, В., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). Белковый каркас по настоящему изобретению может содержать одну или несколько
замен, делений или добавлений аминокислот либо в результате естественных мутаций, либо в результате человеческих манипуляций, как указано в настоящем документе. Аминокислоты в белковом каркасе по настоящему изобретению, играющие важную роль в его функционировании, могут быть идентифицированы с помощью известных из уровня техники способов, например сайт-направленного мутагенеза или сканирующего аланином мутагенеза (например, Ausubel, supra, главы 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Последняя процедура включает добавление одной мутации аланина в каждом остатке в молекуле. Полученные в результате мутировавшие молекулы затем тестируют на предмет биологической активности, в частности по меньшей мере одной нейтрализующей активности. Особенно важные для связывания белкового каркаса сайты могут быть также идентифицированы путем структурного анализа, например кристаллизации, ядерно-магнитного резонанса или фотоаффинного мечения (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
Специалистам в данной области техники будет ясно, что настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному биологически активному белковому каркасу по настоящему изобретению. Биологически активные белковые каркасы имеют специфическую активность по меньшей мере 20, 30 или 40%, предпочтительно 50, 60 или 70% и наиболее предпочтительно 80, 90 либо 95-1000% или более от активности естественного (несинтетического), эндогенного или связанного и известного белкового каркаса. Способы качественного и количественного анализа ферментативной активности и субстратной специфичности хорошо известны специалистам в данной области техники.
Изобретение также относится к белковым каркасам и фрагментам, как описано здесь, которые модифицируются путем ковалентного присоединения органической части. Такая модификация позволяет получить фрагмент белкового каркаса с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, увеличенным периодом полувыведения в сыворотке in vivo). В качестве органической части может быть использована линейная или разветвленная гидрофильная полимерная группа, группа жирных кислот или группа эфиров жирных кислот. В некоторых воплощениях гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу приблизительно 800-120000 Да и представлять собой полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль (PPG)), углеводный полимер, аминокислотный полимер или поливинилпиролидон, а группа жирных кислот или группа эфиров жирных кислот может содержать от приблизительно восьми до приблизительно сорока атомов углерода.
Модифицированные белковые каркасы и фрагменты по изобретению могут содержать одну и более органических частей, ковалентно связанных напрямую или опосредованно с антителом.
Каждая органическая часть, связанная с белковым каркасом или фрагментом по изобретению, может независимо от остальных являться гидрофильной полимерной группой, группой жирных кислот или группой эфиров жирных кислот. В настоящем документе в термин "жирная кислота" включаются моно-карбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. Используемый в настоящем документе термин "гидрофильная полимерная группа" означает органический полимер, который лучше растворяется в воде, чем в октане. Например, полилизин лучше растворяется в воде, чем в октане. Таким образом, в объем изобретения включен белковый каркас, модифицированный ковалентным присоединением полилизина. К линейным или разветвленным гидрофильным полимерам, пригодным для модификации белкового каркаса по изобретению, относятся, в частности, полиалкангликоли (например, PEG, монометокси-полиэтиленгликоль (mPEG), PPG и т.п.), углеводы (например, декстран, целлюлоза, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиас-партат и т.п.), полиалкана оксиды (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинил-пиролидон. Гидрофильный полимер, модифицирующий белковый каркас по изобретению, предпочтительно имеет молекулярную массу от приблизительно 800 до приблизительно 150000 Да как отдельная молекулярная субстанция. Например, могут быть использованы PEG5000 и PEG20000, где индекс означает средний молекулярный вес полимера в Да. Гидрофильная полимерная группа может быть заменена группами алкилов, жирных кислот или эфиров жирных кислот в количестве от одной до приблизительно шести. Гидрофильные полимеры, заменяемые группами жирных кислот или эфиров жирных кислот, могут быть приготовлены с помощью подходящих способов. Например, полимер, содержащий группу аминов, может связываться с карбоксилатом жирной кислоты или эфира жирной кислоты, а активированный карбоксилат (например, активированный с помощью N, N-карбонил-диимидазола) на жирной кислоте или эфире жирной кислоты может связываться с гидроксильной группой на полимере.
Жирные кислоты и эфиры жирных кислот, пригодные для модификации белковых каркасов по изобретению, могут быть насыщенными или могут содержать одну и более связей ненасыщенности. К жирным кислотам, пригодным для модификации белкового каркаса по изобретению, относятся, в частности, n-додеканоат (C12, лаурат), n-тетрадеканоат (C14, миристат), n-октадеканоат (C18, стеарат), n-эйкозаноат (С20 арахидат), n-докозаноат (С22, бегенат), n-триаконтаноат (С30), n-тетраконтаноат (С40), cis-A9-октадеканоат (C18, олеат), все cis-A5, 8, 11, 14-эйкозатетраэноаты (С20, арахидонат), октандиовая кислота, тетрадекандиовая кислота, октадекандиовая кислота, докозандиовая кислота и т.п. К пригодным эфирам жирных кислот относятся моноэфиры дикарбоновых кислот, содержащие линейную или разветвленную низшую алкильную группу. Низшая алкильная группа может содержать от одного до приблизительно
двенадцати, предпочтительно от одного до приблизительно шести атомов углерода.
Модифицированные белковые каркасы и фрагменты могут быть получены с использованием подходящих способов, например, путем реакции с одним или несколькими модифицирующими веществами. Используемый в настоящем документе термин "модифицирующее вещество" означает подходящий органический полимер (например, гидрофильный полимер, жирную кислоту, эфир жирной кислоты), который включает активирующую группу. Под "активирующей группой" понимаются химический элемент или функциональная группа, которые при соответствующих условиях могут вступать в реакцию со второй химической группой, тем самым образуя ковалентную связь между модифицирующим веществом и второй химической группой. Например, к аминреактивным активирующим группам относятся электро-фильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), N-гидроксисукцинимидила (NHS) эфиры и т.п. К активирующим группам, способным реагировать с тиолами, относятся, например, малеимид, йодацетил, акрилолил, пиридила дисульфиды, 5-тиол-2-нитробензойная кислота-тиол (TNB-тиол) и т.п. Функциональная группа альдегида может быть связана с амин- или гидразидсодержащими молекулами, а группа азида может реагировать с трехвалентной фосфорной группой с образованием фосфорамидатных или фосфоримидных связей. Способы введения активирующих групп в молекулы известны из уровня техники (см., например, Hermanson GX, Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Активирующая группа может быть связана непосредственно с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, эфиром жирной кислоты) или через линкер, например двухвалентную группу С1-С12, в которой один или несколько атомов углерода могут быть заменены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. К пригодным линкерам относятся, например, тетраэтиленгликоль, -(СН2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- и -СН^О-СН^СН^О-СН^СН^О-СН-NH-. Модифицирующие вещества, содержащие линкер, могут быть получены, например, путем реакции моно-Вос-алкилдиамина (например, моно-Вос-этилендиамина, моно-Вос-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Защитная группа Вос может быть удалена из продукта путем обработки с помощью трифторуксусной кислоты (TFA) с образованием первичного амина, который может быть связан с другой карбоновой кислотой, как описано здесь, или может вступить в реакцию с малеиновым ангидридом, после чего конечный продукт может быть циклизирован для получения активированного малеимидного производного жирной кислоты (см., например, Thompson, et al., WO 92/16221, информация из этого источника полностью включена в текст настоящего документа путем ссылки).
Модифицированные белковые каркасы по изобретению могут быть получены путем реакции белкового каркаса или фрагмента с модифицирующим веществом. К примеру органические части могут быть связаны с белковым каркасом не сайт-специфичным способом с использованием амин-реактивного модифицирующего вещества, например NHS-эфира PEG. Модифицированные белковые каркасы и фрагменты, содержащие органическую часть, связанную со специфическими сайтами белкового каркаса по настоящему изобретению, могут быть получены с использованием соответствующих способов, таких как обратная реакция протеолиза (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6 (10) :2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56 (4) :456-463 (1997)), и способов, описанных в Hermanson GT., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)).
Композиции белкового каркаса, содержащие дополнительные терапевтически активные вещества.
Композиции белкового каркаса по настоящему изобретению могут в некоторых случаях дополнительно содержать эффективное количество по меньшей мере одного соединения или белка (малую или большую молекулу), выбранного из противоинфекционного лекарственного средства, сердечнососудистого лекарственного средства, лекарственного средства для центральной нервной системы (ЦНС), лекарственного средства для вегетативной нервной системы (ВНС), лекарственного средства для респираторного тракта, лекарственного средства для желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), гормонального лекарственного средства, лекарственного средства для водно-солевого баланса, гематологического лекарственного средства, противоопухолевого лекарственного средства, иммуномодулирующего лекарственного средства, лекарственного средства для органов зрения, слуха или обоняния, лекарственного средства местного действия, питательного препарата и т.п. Такие лекарственные средства хорошо известны из уровня техники, включая формулы, показания, дозировку и способ введения для каждого из представленных здесь (см., например, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).
Противоинфекционное лекарственное средство может быть по меньшей мере одним амебоцидным средством или по меньшей мере одним средством, выбранным из противопротозойного, противоглистного, фунгицидного, противомалярийного, противотуберкулезного, или по меньшей мере одним средством, выбранным из противолепрозного средства, аминогликозидов, пенициллинов, цефалоспоринов, тет-рациклинов, сульфонамидов, фторхинолонов, противовирусных, макролидных и прочих противоинфек
ционных лекарственных средств. Сердечно-сосудистое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из инотропных, антиаритмических, противоангинных, гипотензивных средств, антилипе-мических и прочих сердечно-сосудистых лекарственных средств. Лекарственное средство для ЦНС может быть выбрано по меньшей мере из ненаркотических анальгетиков или по меньшей мере из жаропонижающих, нестероидных противовоспалительных, наркотических или опиоидных анальгетиков, успокоительных/снотворных средств, антиконвульсантов, антидепрессантов, противотревожных, нейролептических средств, стимуляторов центральной нервной системы, антипаркинсонических и прочих лекарственных средств для ЦНС. Лекарственное средство для ВНС может быть выбрано по меньшей мере из холинергиков (парасимпатомиметиков), антихолинергиков, адренергетиков (симпатомиметиков), адре-ноблокаторов (симпатолитиков), миорелаксантов скелетных мышц и нервно-мышечных блокаторов. Лекарственное средство для респираторного тракта может быть выбрано по меньшей мере из антигиста-минных средств, бронхолитиков, отхаркивающих средств или по меньшей мере из противокашлевых и прочих лекарственных средств для дыхательных путей. Лекарственное средство для ЖКТ может быть выбрано по меньшей мере из антацидов, по меньшей мере из адсорбентов, по меньшей мере из ветрогонных, пищеварительных ферментов или по меньшей мере из лекарственных средств против желчнокаменной болезни, антидиарейных, слабительных, противорвотных и противоязвенных лекарственных средств. Гормональное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из кортикостерои-дов, андрогенов, по меньшей мере из анаболических стероидов, эстрогенов, по меньшей мере из прогес-тина, гонадотропина, антидиабетического лекарственного средства или по меньшей мере из глюкагона, гормона щитовидной железы, антагониста гормона щитовидной железы, гормона гипофиза и подобного гормону паращитовидных желез лекарственного средства. Лекарственное средство для водно-солевого баланса может быть выбрано по меньшей мере из мочегонных средств, электролитов, по меньшей мере из замещающих растворов, подкислителей или по меньшей мере из подщелачивающих средств. Гематологическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из лекарственных средств, повышающих количество гемоглобина в крови, антикоагулянтов, производных крови и тромболитиче-ских ферментов. Противоопухолевое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из алкилирующих лекарственных средств, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, противоопухолевых лекарственных средств, изменяющих гормональный баланс, а также прочих противоопухолевых лекарственных средств. Иммуномодулирующее лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из иммунодепрессантов, вакцин, по меньшей мере из анатоксинов, антитоксинов или по меньшей мере из противоядия, иммунной сыворотки и модификатора биологического отклика. Лекарственное средство для органов зрения, слуха или обоняния может быть выбрано по меньшей мере из офтальмологических противоинфекционных, офтальмологических противовоспалительных, миотических, мидриатических, офтальмологических вазоконстрикторов, прочих лекарственных средств для органов зрения, слуха или обоняния. Лекарственное средство местного действия может быть выбрано по меньшей мере из противоинфекционных лекарственных средств местного действия, противочесоточных или по меньшей мере из педикулицидов либо кортикостероидов местного действия. Питательный препарат может быть выбран по меньшей мере из витаминов, минералов или питательных веществ (см., например, Nursing 2001 Drug Handbook, supra).
По меньшей мере одно амебоцидное или противопротозойное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из атовакуона, хлорохина гидрохлорида, хлорохина фосфата, метронидазола, метронидазола гидрохлорида и пентамидина изетионата. По меньшей мере одно противоглистное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из мебендазола, пирантела памоата и тиабенда-зола. По меньшей мере один фунгицид может быть выбран по меньшей мере из амфотерицина В, холе-стерил-сульфатного комплекса амфотерицина В, липидного комплекса амфотерицина В, липосомального амфотерицина В, флуконазола, флуцитозина, гризеофульвина микрокристаллической формы, гризео-фульвина ультрамикрокристаллической формы, итраконазола, кетоконазола, нистатина и тербинафина гидрохлорида. По меньшей мере одно противомалярийное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлорохина гидрохлорида, хлорохина фосфата, доксициклина, гидроксихлорохина сульфата, мефлохина гидрохлорида, примахина фосфата, пириметамина и пириметамина с сульфадокси-ном. По меньшей мере одно противотуберкулезное или противолепрозное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из клофазимина, циклосерина, дапсона, этамбутола гидрохлорида, изо-ниазида, пиразинамида, рифабутина, рифампицина, рифапентина и стрептомицина сульфата. По меньшей мере один аминогликозид может быть выбран по меньшей мере из амикацина сульфата, гентамици-на сульфата, неомицина сульфата, стрептомицина сульфата и тобрамицина сульфата. По меньшей мере один пенициллин может быть выбран по меньшей мере из амоксициллина/клавуланата калия, амокси-циллина тригидрата, ампициллина, ампициллина натрия, ампициллина тригидрата, ампициллина на-трия/сульбактама натрия, клоксациллина натрия, диклоксациллина натрия, мезлоциллина натрия, на-фциллина натрия, оксациллина натрия, пенициллина G бензатина, пенициллина G калия, пенициллина G прокаина, пенициллина G натрия, пенициллина V калия, пиперациллина натрия, пиперациллина на-трия/тазобактама натрия, тикарциллина динатрия и тикарциллина динатрия/клавуланата калия. По меньшей мере один цефалоспорин может быть выбран по меньшей мере из цефаклора, цефадроксила,
цефазолина натрия, цефдинира, цефепима гидрохлорида, цефиксима, цефметазола натрия, цефоницида натрия, цефоперазона натрия, цефотаксима натрия, цефотетана динатрия, цефокситина натрия, цефпо-доксима проксетила, цефпрозила, цефтазидима, цефтибутена, цефтизоксима натрия, цефтриаксона натрия, цефуроксима аксетила, цефуроксима натрия, цефалексина гидрохлорида, цефалексина моногидрата, цефрадина и лоракарбефа. По меньшей мере один тетрациклин может быть выбран по меньшей мере из демеклоциклина гидрохлорида, доксициклина кальция, доксициклина гиклата, доксициклина гидрохлорида, доксициклина моногидрата, миноциклина гидрохлорида и тетрациклина гидрохлорида. По меньшей мере один сульфонамид может быть выбран по меньшей мере из ко-тримоксазола, сульфадиа-зина, сульфаметоксазола, сульфизоксазола и сульфизоксазола ацетила. По меньшей мере один фторхи-нолон может быть выбран по меньшей мере из алатрофлоксацина мезилата, ципрофлоксацина, энокса-цина, левофлоксацина, ломефлоксацина гидрохлорида, налидиксовой кислоты, норфлоксацина, офлокса-цина, спарфлоксацина и тровафлоксацина мезилата. По меньшей мере один фторхинолон может быть выбран по меньшей мере из алатрофлоксацина мезилата, ципрофлоксацина, эноксацина, левофлоксаци-на, ломефлоксацина гидрохлорида, налидиксовой кислоты, норфлоксацина, офлоксацина, спарфлокса-цина и тровафлоксацина мезилата. По меньшей мере одно противовирусное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из абакавира сульфата, ацикловира натрия, амантадина гидрохлорида, ампренавира, цидофовира, делавирдина мезилата, диданозина, эфавиренца, фамцикловира, фомивир-зена натрия, фоскарнета натрия, ганцикловира, индинавира сульфата, ламивудина, ламивуди-на/зидовудина, нелфинавира мезилата, невирапина, осельтамивира фосфата, рибавирина, римантадина гидрохлорида, ритонавира, саквинавира, саквинавира мезилата, ставудина, валацикловира гидрохлорида, залцитабина, занамивира и зидовудина. По меньшей мере одно макролидное противоинфекционное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из азитромицина, кларитромицина, дирит-ромицина, эритромицина в виде основания, эритромицина эстолата, эритромицина этилсукцината, эритромицина лактобионата и эритромицина стеарата. По меньшей мере одно прочее противоинфекционное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из азтреонама, бацитрацина, хлорамфени-кола натрия сукцината, клиндамицина гидрохлорида, клиндамицина пальмитата гидрохлорида, клинда-мицина фосфата, имипенема и циластатина натрия, меропенема, нитрофурантоина макрокристалличе-ской формы, нитрофурантоина микрокристаллической формы, квинупристина/дальфопристина, спекти-номицина гидрохлорида, триметоприма и ванкомицинаа гидрохлорид (см., например, с. 24-214 в Nursing
2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно инотропное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из амринона лактата, дигоксина и милринона лактата. По меньшей мере одно антиаритмическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аденозина, амиодарона гидрохлорида, атропина сульфата, бретилия тозилата, дилтиазема гидрохлорида, дизопирамида, дизопирамида фосфата, эсмо-лола гидрохлорида, флекаинида ацетата, ибутилида фумарата, лидокаина гидрохлорида, мексилетина гидрохлорида, морицизина гидрохлорида, фенитоина, фенитоина натрия, прокаинамида гидрохлорида, пропафенона гидрохлорида, пропранолола гидрохлорида, хинидина бисульфата, хинидина глюконата, хинидина полигалактуроната, хинидина сульфата, соталола, токаинида гидрохлорида и верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно противоангинное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из амлодипидина бесилата, амилнитрита, бепридила гидрохлорида, дилтиазема гидрохлорида, изосорбида динитрата, изосорбида мононитрата, надолола, никардипина гидрохлорида, нифедипи-на, нитроглицерина, пропранолола гидрохлорида, верапамила и верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно гипотензивное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из ацебутолола гидрохлорида, амлодипина бесилата, атенолола, беназеприла гидрохлорида, бетаксолола гидрохлорида, бисопролола фумарата, кандесартана цилексетила, каптоприла, картеолола гидрохлорида, карведилола, клонидина, клонидина гидрохлорида, диазоксида, дилтиазема гидрохлорида, доксазозина мезилата, эна-лаприлата, эналаприла малеата, эпросартана мезилата, фелодипина, фенолдопама мезилата, фозиноприла натрия, гуанабенза ацетата, гуанадрела сульфата, гуанфацина гидрохлорида, гидралазина гидрохлорида, ирбесартана, исрадипина, лабеталола гидрохлорида, лизиноприла, лозартана калия, метилдопа, метилдо-пата гидрохлорида, метопролола сукцината, метопролола тартрата, миноксидила, моэксиприла гидрохлорида, надолола, никардипина гидрохлорида, нифедипина, нисолдипина, нитропруссида натрия, пен-бутолола сульфата, периндоприла эрбумина, фентоламина мезилата, пиндолола, празозина гидрохлорида, пропранолола гидрохлорида, квинаприла гидрохлорида, рамиприла, телмисартана, теразозина гидрохлорида, тимолола малеата, трандолаприла, валсартана и верапамила гидрохлорида. По меньшей мере одно антилипемическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аторвастатина кальция, церивастатина натрия, холестирамина, колестипола гидрохлорида, фенофибрата (микронизиро-ванного), флувастатина натрия, гемфиброзила, ловастатина, ниацина, правастатина натрия и симвастати-на. По меньшей мере одно прочее сердечно-сосудистое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из абциксимаба, алпростадила, арбутамина гидрохлорида, цилостазола, клопидогреля бисульфата, дипиридамола, эптифибатида, мидодрина гидрохлорида, пентоксифиллина, тиклопидина гидрохлорида и тирофибана гидрохлорида (см., например, с. 215-336 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно ненаркотическое анальгетическое или жаропонижающее лекарственное
средство может быть выбрано по меньшей мере из ацетаминофена, аспирина, холина магния трисалици-лата, дифлунизала и магния салицилата. По меньшей мере одно нестероидное противовоспалительное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из целекоксиба, диклофенака калия, дик-лофенака натрия, этодолака, фенопрофена кальция, флурбипрофена, ибупрофена, индометацина, индо-метацина натрия тригидрата, кетопрофена, кеторолака трометамина, набуметона, напроксена, напроксе-на натрия, оксапрозина, пироксикама, рофекоксиба и сулиндака. По меньшей мере один наркотический или опиоидный анальгетик может быть выбран по меньшей мере из алфентанила гидрохлорида, бупре-норфина гидрохлорида, буторфанола тартрата, кодеина фосфата, кодеина сульфата, фентанила цитрата, фентанила в виде трансдермальной системы, фентанила для введения через слизистую оболочку, гидро-морфона гидрохлорида, меперидина гидрохлорида, метадона гидрохлорида, морфина гидрохлорида, морфина сульфата, морфина тартрата, нальбуфина гидрохлорида, оксикодона гидрохлорида, оксикодона пектината, оксиморфона гидрохлорида, пентазоцина гидрохлорида, пентазоцина гидрохлорида и налок-сона гидрохлорида, пентазоцина лактата, пропоксифена гидрохлорида, пропоксифена напсилата, реми-фентанила гидрохлорида, суфентанила цитрата и трамадола гидрохлорида. По меньшей мере одно успокоительное/снотворное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлоралгидрата, эстазолама, флуразепама гидрохлорида, фенобарбитала, фенобарбитала натрия, фенобарбитала натрия, секобарбитала натрия, темазепама, триазолама, залеплона и золпидема тартрата. По меньшей мере один антиконвульсант может быть выбран по меньшей мере из ацетазоламида натрия, карбамазепина, клона-зепама, клоразепата дикалия, диазепама, дивалпроекса натрия, этосуксимида, фосфенитоина натрия, га-бапентина, ламотриджина, магния сульфата, фенобарбитала, фенобарбитала натрия, фенитоина, фени-тоина натрия, фенитоина натрия (пролонгированного действия), примидона, тиагабина гидрохлорида, топирамата, вальпроата натрия и вальпроевой кислоты. По меньшей мере один антидепрессант может быть выбран по меньшей мере из амитриптилина гидрохлорида, амитриптилина памоата, амоксапина, бупропиона гидрохлорида, циталопрама гидробромида, кломипрамина гидрохлорида, дезипрамина гидрохлорида, доксепина гидрохлорида, флуоксетина гидрохлорида, имипрамина гидрохлорида, имипрами-на памоата, миртазапина, нефазодона гидрохлорида, нортриптилина гидрохлорида, пароксетина гидрохлорида, фенелзина сульфата, сертралина гидрохлорида, транилципромина сульфата, тримипрамина ма-леата и венлафаксина гидрохлорида. По меньшей мере одно противотревожное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из алпразолама, буспирона гидрохлорида, хлордиазепоксида, хлордиазепоксида гидрохлорида, клоразепата дикалия, диазепама, доксепина гидрохлорида, гидроксизи-на эмбоната, гидроксизина гидрохлорида, гидроксизина памоата, лоразепама, мепробамата, мидазолама гидрохлорида и оксазепама. По меньшей мере одно нейролептическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлорпромазина гидрохлорида, клозапина, флуфеназина деканоата, флуфеназина энантата, флуфеназина гидрохлорида, галоперидола, галоперидола деканоата, галоперидола лактата, локсапина гидрохлорида, локсапина сукцината, месоридазина бесилата, молиндона гидрохлорида, оланзапина, перфеназина, пимозида, прохлорперазина, кветиапина фумарата, рисперидона, тиорида-зина гидрохлорида, тиотиксена, тиотиксена гидрохлорида и трифлуоперазина гидрохлорида. По меньшей мере один стимулятор центральной нервной системы может быть выбран по меньшей мере из амфетамина сульфата, кофеина, декстроамфетамина сульфата, доксапрама гидрохлорида, метамфетамина гидрохлорида, метилфенидата гидрохлорида, модафинила, пемолина и фентермина гидрохлорида. По меньшей мере одно антипаркинсоническое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из амантадина гидрохлорида, бензотропина мезилата, биперидена гидрохлорида, биперидена лакта-та, бромокриптина мезилата, карбидопы/леводопы, энтакапона, леводопы, перголида мезилата, прами-пексола дигидрохлорида, ропинирола гидрохлорида, селегилина гидрохлорида, толкапона и тригексифе-нидила гидрохлорида. По меньшей мере одно прочее лекарственное средство для центральной нервной системы может быть выбрано по меньшей мере из бупропиона гидрохлорида, донепезила гидрохлорида, дроперидола, флувоксамина малеата, лития карбоната, лития цитрата, наратриптана гидрохлорида, никотина полакрилекса, никотина в виде трансдермальной системы, пропофола, ризатриптана бензоата, си-бутрамина гидрохлорида моногидрата, суматриптана сукцината, такрина гидрохлорид и золмитриптана (см., например, с. 337-530 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере один холинергик (например, парасимпатомиметик) может быть выбран по меньшей мере из бетанехола хлорида, эдрофониума хлорида, неостигмина бромида, неостигмина метилсуль-фата, физостигмина салицилата и пиридостигмина бромида. По меньшей мере один антихолинергик может быть выбран по меньшей мере из атропина сульфата, дицикломина гидрохлорида, гликопирролата, гиосциамина, гиосциамина сульфата, пропантелина бромида, скополамина, скополамина бутилбромида и скополамина гидробромида. По меньшей мере один адренергетик (симпатомиметик) может быть выбран по меньшей мере из добутамина гидрохлорида, допамина гидрохлорида, метараминола битартрата, норэ-пинефрина битартрата, фенилэфрина гидрохлорида, псевдоэфедрина гидрохлорида и псевдоэфедрина сульфата. По меньшей мере один адреноблокатор (симпатолитик) может быть выбран по меньшей мере из дигидроэрготамина мезилата, эрготамина тартрата, метисергида малеата и пропранолола гидрохлорида. По меньшей мере один миорелаксант скелетных мышц может быть выбран по меньшей мере из бак-лофена, карисопродола, хлорзоксазона, циклобензаприна гидрохлорида, дантролена натрия, метокарба
мола и тизанидина гидрохлорида. По меньшей мере один нервно-мышечный блокатор может быть выбран по меньшей мере из атракурия бесилата, цизатракурия бесилата, доксакурия хлорида, мивакурия хлорида, панкурония бромида, пипекурония бромида, рапакурония бромида, рокурония бромида, сукци-нилхолина хлорида, тубокурарина хлорида и векурония бромида (см., например, с. 531-84 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно антигистаминное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бромфенирамина малеата, цетиризина гидрохлорида, хлорфенирамина малеата, клемастина фу-марата, ципрогептадина гидрохлорида, дифенгидрамина гидрохлорида, фексофенадина гидрохлорида, лоратадина, прометазина гидрохлорида, прометазина теоклата и трипролидина гидрохлорида. По меньшей мере один бронхолитик может быть выбран по меньшей мере из альбутерола, альбутерола сульфата, аминофиллина, атропина сульфата, эфедрина сульфата, эпинефрина, эпинефрина битартрата, эпинефри-на гидрохлорида, ипратропия бромида, изопротеренола, изопротеренола гидрохлорида, изопротеренола сульфата, левалбутерола гидрохлорида, метапротеренола сульфата, окстрифиллина, пирбутерола ацетата, сальметерола ксинафоата, тербуталина сульфата и теофиллина. По меньшей мере одно отхаркивающее или противокашлевое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бензонатата, кодеина фосфата, кодеина сульфата, декстраметорфана гидробромида, дифенгидрамина гидрохлорида, гуафенизин и гидроморфона гидрохлорида. По меньшей мере одно прочее лекарственное средство для респираторного тракта может быть выбрано по меньшей мере из ацетилцистеина, беклометазона дипро-пионата, берактанта, будесонида, калфактанта, кромолина натрия, дорназы альфа, эпопростенола натрия, флунизолида, флутиказона пропионата, монтелукаста натрия, недокромила натрия, паливизумаба, три-амцинолона ацетонида, зафирлукаста и зилеутона (см., например, с. 585-642 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере один антацид, адсорбент или одно ветрогонное лекарственное средство может быть выбран по меньшей мере из алюминия карбоната, алюминия гидроксида, кальция карбоната, ма-галдрата, магния гидроксида, магния оксида, симетикона и натрия бикарбоната. По меньшей мере один пищеварительный фермент или одно лекарственное средство против желчно-каменной болезни может быть выбрано по меньшей мере из панкреатина, панкрелипазы и урсодиола. По меньшей мере одно ан-тидиарейное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аттапульгита, висмута субсалицилата, кальция поликарбофила, дифеноксилата гидрохлорида и атропина сульфата, лоперамида, октреотида ацетата, настойки опия и настойки опия (с камфорой). По меньшей мере одно слабительное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бисакодила, кальция поликарбофила, каскары саграды, ароматического жидкого экстракта каскары саграды, жидкого экстракта каскары сагра-ды, касторового масла, докузата кальция, докузата натрия, глицерина, лактулозы, магния цитрата, магния гидроксида, магния сульфата, метилцеллюлозы, минерального масла, полиэтиленгликоля или раствора электролита, подорожника, сенны и натрия фосфатов. По меньшей мере одно противорвотное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из хлорпромазина гидрохлорида, дименгидрина-та, доласетрона мезилата, дронабинола, гранисетрона гидрохлорида, меклизина гидрохлорида, меток-лопрамида гидрохлорида, ондансетрона гидрохлорида, перфеназина, прохлорперазина, прохлорперазина эдизилата, прохлорперазина малеата, прометазина гидрохлорида, скополамина, тиэтилперазина малеата и триметобензамида гидрохлорида. По меньшей мере одно противоязвенное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из циметидина, циметидина гидрохлорида, фамотидина, лансопразо-ла, мизопростола, низатидина, омепразола, рабепрозола натрия, ранитидина висмута цитрата, ранитиди-на гидрохлорида и сукральфата (см., например, с. 643-95 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере один кортикостероид может быть выбран по меньшей мере из бетаметазона, бе-таметазона ацетата или бетаметазона натрия фосфата, бетаметазона натрия фосфата, кортизона ацетата, дексаметазона, дексаметазона ацетата, дексаметазона натрия фосфата, флудрокортизона ацетата, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, гидрокортизона ципионата, гидрокортизона натрия фосфата, гидрокортизона натрия сукцината, метилпреднизолона, метилпреднизолона ацетата, метилпреднизолона натрия сукцината, преднизолона, преднизолона ацетата, преднизолона натрия фосфата, преднизолона тебу-тата, преднизона, триамцинолона, триамцинолона ацетонида и триамцинолона диацетата. По меньшей мере один андроген или анаболический стероид может быть выбран по меньшей мере из даназола, флю-оксиместерона, метилтестостерона, нандролона деканоата, нандролона фенпропионата, тестостерона, тестостерона ципионата, тестостерона энантата, тестостерона пропионата и тестостерона в виде транс-дермальной системы. По меньшей мере один эстроген или прогестин может быть выбран по меньшей мере из этерифицированных эстрогенов, эстрадиола, эстрадиола ципионата, эстрадио-ла/норэтиндронацетата в виде трансдермальной системы, эстрадиола валерата, эстрогенов (конъюгиро-ванных), эстропипата, этинилэстрадиола, этинилэстрадиола и дезогестрела, этинилэстрадиола и этино-диола диацетата, этинилэстрадиола и левоноргестрела, этинилэстрадиола и норэтиндрона, этинилэстра-диола и норэтиндрона ацетата, этинилэстрадиола и норгестимата, этинилэстрадиола и норгестрела, эти-нилэстрадиола, норэтиндрона, ацетата и железа фумарата, левоноргестрела, медроксипрогестерона ацетата, местранола и норэтиндрона, норэтиндрона, норэтиндрона ацетата, норгестрела и прогестерона. По меньшей мере один гонадотропин может быть выбран по меньшей мере из ганиреликса ацетата, гонадо
релина ацетата, гистрелина ацетата и менотропина. По меньшей мере одно антидиабетическое лекарственное средство или глюкагон может быть выбрано по меньшей мере из акарбозы, хлорпропамида, гли-мепирида, глипизида, глюкагона, глибурида, инсулинов, метформина гидрохлорида, миглитола, пиогли-тазона гидрохлорида, репаглинида, розиглитазона малеата и троглитазона. По меньшей мере один гормон щитовидной железы может быть выбран по меньшей мере из левотироксина натрия, лиотиронина натрия, лиотрикса и тироида. По меньшей мере один антагонист гормона щитовидной железы может быть выбран по меньшей мере из метимазола, калия йодида, калия йодида (насыщенного раствора), про-пилтиоурацила, радиоактивного йода (натрия йодида 1311) и раствора люголя. По меньшей мере один гормон гипофиза может быть выбран по меньшей мере из кортикотропина, косинтропина, десмопресси-на ацетата, лейпролида ацетата, кортикотропина продленного действия, соматрема, соматропина и вазо-прессина. По меньшей мере одно подобное гормону паращитовидных желез лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из кальцифедиола, кальцитонина (человека), кальцитонина (лосося), кальцитриола, дигидротахистерола и этидроната динатрия (см., например, с. 696-796 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно мочегонное средство может быть выбрано по меньшей мере из ацетазола-мида, ацетазоламида натрия, амилорида гидрохлорида, буметанида, хлорталидона, этакрината натрия, этакриновой кислоты, фуросемида, гидрохлоротиазида, индапамида, маннитола, метолазона, спироно-лактона, торасемида, триамтерена и мочевины. По меньшей мере один электролитический или замещающий раствор может быть выбран по меньшей мере из кальция ацетата, кальция карбоната, кальция хлорида, кальция цитрата, кальция глубионата, кальция глуцептата, кальция глюконата, кальция лактата, кальция фосфата (двухосновного), кальция фосфата (трехосновного), декстрана (с высокой молекулярной массой), декстрана (с низкой молекулярной массой), гидроксиэтилкрахмала, магния хлорида, магния сульфата, калия ацетата, калия бикарбоната, калия хлорида, калия глюконата, раствора Рингера, раствора Рингера (лактата) и натрия хлорида. По меньшей мере один подкислитель или одно подщелачивающее средство может быть выбрано по меньшей мере из натрия бикарбоната, натрия лактата и трометамина (см., например, с. 797-833 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно лекарственное средство, повышающее количество гемоглобина в крови, может быть выбрано по меньшей мере из железа фумарата, железа глюконата, железа сульфата, железа сульфата (высушенного), железа декстрана, железа сорбита, железополисахаридного комплекса, комплекса натрия и железа глюконата. По меньшей мере один антикоагулянт может быть выбран по меньшей мере из ардепарина натрия, дальтепарина натрия, данапароида натрия, эноксапарина натрия, гепарина кальция, гепарина натрия и варфарина натрия. По меньшей мере одно производное крови может быть выбрано по меньшей мере из альбумина 5%, альбумина 25%, антигемофильного фактора, антиин-гибиторного коагулянтного комплекса, антитромбина III (человека), фактора IX (человека), комплекса фактора IX и фракции белков плазмы. По меньшей мере один тромболитический фермент может быть выбран по меньшей мере из альтеплазы, анистреплазы, ретеплазы (рекомбинантной), стрептокиназы и урокиназы (см., например, с. 834-66 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно алкилирующее лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бусульфана, карбоплатина, кармустина, хлорамбуцила, цисплатина, циклофосфамида, ифосфа-мида, ломустина, хлорметина гидрохлорида, мелфалана, мелфалана гидрохлорида, стрептозоцина, темо-золомида и ТиоТЭФ. По меньшей мере один антиметаболит может быть выбран по меньшей мере из ка-пецитабина, кладрибина, цитарабина, флоксуридина, флударабина фосфата, фторурацила, гидроксимо-чевины, меркаптопурина, метотрексата, метотрексата натрия и тиогуанина. По меньшей мере один противоопухолевый антибиотик может быть выбран по меньшей мере из блеомицина сульфата, дактиноми-цина, даунорубицина цитрата липосомальной формы, даунорубицина гидрохлорида, доксорубицина гидрохлорида, доксорубицина гидрохлорида липосомальной формы, эпирубицина гидрохлорида, идаруби-цина гидрохлорида, митомицина, пентостатина, пликамицина и вальрубицина. По меньшей мере одно противоопухолевое лекарственное средство, изменяющее гормональный баланс, может быть выбрано по меньшей мере из анастрозола, бикалютамида, эстрамустина натрия фосфата, экземестана, флутамида, госерелина ацетата, летрозола, лейпролида ацетата, мегестрола ацетата, нилутамида, тамоксифена цитрата, тестолактона и торемифена цитрата. По меньшей мере одно прочее противоопухолевое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из аспарагиназы, бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) (живой внутрипузырной), дакарбазина, доцетаксела, этопозида, этопозида фосфата, гемцитабина гидрохлорида, иринотекана гидрохлорида, митотана, митоксантрона гидрохлорида, паклитаксела, пэгаспаргазы, порфимера натрия, прокарбазина гидрохлорида, ритуксимаба, тенипозида, топотекана гидрохлорида, трастузумаба, третиноина, винбластина сульфата, винкристина сульфата и винорельбина тартрата (см., например, с. 867-963 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере один иммунодепрессант может быть выбран по меньшей мере из азатиоприна, ба-зиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба, лимфоцитарного иммуноглобулина, муромонаба CD3, мико-фенолятмофетила, микофенолятмофетила гидрохлорида, сиролимуса и такролимуса. По меньшей мере одна вакцина или анатоксин может быть выбран по меньшей мере из вакцины БЦЖ, вакцины холеры, дифтерийно-столбнячных анатоксинов (адсорбированных), дифтерийно-столбнячных анатоксинов и бес
клеточной коклюшная вакцины адсорбированной, дифтерийно-столбнячных анатоксинов и цельнокле-точной коклюшной вакцины, конъюгированных вакцин Haemophilius В, вакцины против гепатита А (инактивированной), вакцины против гепатита В (рекомбинантной), вакцины против вируса гриппа 19992000 трехвалентных типов А и В (очищенного поверхностного антигена), вакцины против вируса гриппа 1999-2000 трехвалентных типов А и В (субвирионной или очищенной субвирионной), вакцины против вируса гриппа 1999-2000 трехвалентных типов А и В (полностью вирионной), вакцины против вируса японского энцефалита (инактивированной), вакцины против болезни Лайма (рекомбинантной OspA), вакцины против кори, эпидемического паротита и краснухи (живая), вакцины против кори, эпидемического паротита и краснухи (живой ослабленной), вакцины против кори (живой ослабленной), полисаха-ридной менингококковой вакцины, вакцины против эпидемического паротита (живой), вакцины от чумы, пневмококковой вакцины (поливалентной), полиомиелитной вакцины (инактивированной), полиомие-литной вакцины (живой, пероральной, трехвалентной), вакцины против бешенства (адсорбированной), вакцины против бешенства (человеческие диплоидные клетки), вакцины против краснухи и эпидемического паротита (живой), вакцины против краснухи (живой, ослабленной), столбнячного анатоксина (адсорбированного), столбнячного анатоксина (жидкости), вакцины против брюшного тифа (пероральной), вакцины против брюшного тифа (парентеральной), полисахаридной вакцины против брюшного тифа Vi, вакцины против ветряной оспы и вакцины против желтой лихорадки. По меньшей мере один антитоксин или одно противоядие может быть выбрано по меньшей мере из противоядия от укуса паука "черная вдова", противоядия от укуса змеи Crotalidae (поливалентное), дифтерийного антитоксина (лошади) и противоядия против укуса змеи Micrurus fulvius. По меньшей мере одна иммунная сыворотка может быть выбрана по меньшей мере из иммуноглобулина цитомегаловирусного (внутривенно), иммуноглобулина человеческого против гепатита В (человека), иммуноглобулина внутримышечно, иммуноглобулина внутривенно, иммуноглобулина против бешенства (человека), иммуноглобулина против респираторного синцитиального вируса внутривенно (человека), иммуноглобулина Rh0 (D) (человека), иммуноглобулина Rh0(D) внутривенно (человека), иммуноглобулина против столбняка (человека) и иммуноглобулина против ветряной оспы. По меньшей мере один модификатор биологического отклика может быть выбран по меньшей мере из альдеслейкина, эпоэтина альфа, филграстима, глатирамера ацетата для инъекций, интерферона альфакон-1, интерферона альфа-2а (рекомбинантного), интерферона альфа^ (рекомбинант-ного), интерферона бета-Ы, интерферона бета-Ш (рекомбинантного), интерферона гамма-Ш, левамизола гидрохлорида, опрелвекина и сарграмостима (см., например, с. 964-1040 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно офтальмологическое противоинфекционное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из бацитрацина, хлорамфеникола, ципрофлоксацина гидрохлорида, эритромицина, гентамицина сульфата, офлоксацина 0,3%, полимиксина В сульфата, сульфацетамида натрия 10%, сульфацетамида натрия 15%, сульфацетамида натрия 30%, тобрамицина и видарабина. По меньшей мере одно офтальмологическое противовоспалительное лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из дексаметазона, дексаметазона натрия фосфата, диклофенака натрия 0,1%, флуорометолона, флурбипрофена натрия, кеторолака трометамина, преднизолона ацетата (суспензии) и преднизолона натрия фосфата (раствора). По меньшей мере одно миотическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из ацетилхолина хлорида, карбахолина (внутриглазного), карба-холина (местного действия), эхотиофата йодида, пилокарпина, пилокарпина гидрохлорида и пилокарпина нитрата. По меньшей мере одно мидриатическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из атропина сульфата, циклопентолата гидрохлорида, эпинефрина гидрохлорида, эпинеф-рила бората, гоматропина гидробромида, фенилэфрина гидрохлорида, скополамина гидробромида и тро-пикамида. По меньшей мере один офтальмологический вазоконстриктор может быть выбран по меньшей мере из нафазолина гидрохлорида, оксиметазолина гидрохлорида и тетрагидрозолина гидрохлорида. По меньшей мере одно прочее офтальмологическое лекарственное средство может быть выбрано по меньшей мере из апраклонидина гидрохлорида, бетаксолола гидрохлорида, бримонидина тартрата, картеоло-ла гидрохлорида, дипивефрина гидрохлорида, дорзоламида гидрохлорида, эмедастина дифумарата, флу-оресцеина натрия, кетотифена фумарата, латанопроста, левобунолола гидрохлорида, метипранолола гидрохлорида, натрия хлорида (гипертонического) и тимолола малеата. По меньшей мере одно лекарственное средство для органов слуха может быть выбрано по меньшей мере из борной кислоты, карбамида перекиси, хлорамфеникола и триэтаноламина полипептида олеата конденсата. По меньшей мере одно лекарственное средство для носа может быть выбрано по меньшей мере из беклометазона дипропионата, будесонида, эфедрина сульфата, эпинефрина гидрохлорида, флунизолида, флутиказона пропионата, на-фазолина гидрохлорида, оксиметазолина гидрохлорида, фенилэфрина гидрохлорида, тетрагидрозолина гидрохлорида, триамцинолона ацетонида и ксилометазолина гидрохлорида (см., например, с. 1041-97 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере одно противоинфекционное лекарственное средство местного действия может быть выбрано по меньшей мере из ацикловира, амфотерицина В, крема с азелаиновой кислотой, бацит-рацина, бутоконазола нитрата, клиндамицина фосфата, клотримазола, эконазола нитрата, эритромицина, гентамицина сульфата, кетоконазола, мафенида ацетата, метронидазола (местного действия), миконазола нитрата, мупироцина, нафтифина гидрохлорида, неомицина сульфата, нитрофуразона, нистатина, сереб
ра сульфадиазина, тербинафина гидрохлорида, терконазола, тетрациклина гидрохлорида, тиоконазола и толнафтата. По меньшей мере одно противочесоточное или один педикулицид может быть выбрано по меньшей мере из кротамитона, линдана, перметрина и пиретринов. По меньшей мере один кортикосте-роид местного действия может быть выбран по меньшей мере из бетаметазона дипропионата, бетамета-зона валерата, клобетазола пропионата, дезонида, дезоксиметазона, дексаметазона, дексаметазона натрия фосфата, дифлоразона диацетата, флуоцинолона ацетонида, флюоцинонида, флурандренолида, флутика-зона пропионата, галцинонида, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, гидрокортизона бутирата, гидрокортизона валерата, мометазона фуроата и триамцинолона ацетонида (см., например, с. 1098-1136 в Nursing 2001 Drug Handbook).
По меньшей мере один витамин или минерал может быть выбран по меньшей мере из витамина А, комплекса витаминов группы В, цианокобаламина, фолиевой кислоты, гидроксокобаламина, лейковори-на кальция, ниацина, ниацинамида, пиридоксина гидрохлорида, рибофлавина, тиамина гидрохлорида, витамина С, витамина D, холекальциферола, эргокальциферола, аналога витамина D, доксеркальциферо-ла, парикальцитола, витамина Е, аналога витамина K, фитонадиона, натрия фторида, натрия фторида (местного действия), микроэлементов, хрома, меди, йода, марганца, селена и цинка. По меньшей мере одно питательное вещество может быть выбрано по меньшей мере из вливания аминокислот (кристаллических), вливания аминокислот в декстрозе, вливания аминокислот с электролитами, вливания аминокислот с электролитами в декстрозе, вливания аминокислот против печеночной недостаточности, вливания аминокислот против высокого метаболического стресса, вливания аминокислот против почечной недостаточности, декстрозы, жировых эмульсий и триглицеридов со средней цепью (см., например, с. 1137-63 в Nursing 2001 Drug Handbook).
Композиции белковых каркасов по настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно любое пригодное и эффективное количество композиции либо фармацевтической композиции, содержащей белковый каркас, путем реакции либо введения взаимодействующий с клеткой, тканью, органом, животным или пациентом, нуждающимися в такого рода модулировании, лечении или терапии, в некоторых случаях дополнительно содержащей по меньшей мере одно вещество, выбранное из антагониста TNF (в частности, химического или белкового антагониста TNF, моноклонального или поликлонального антитела либо фрагмента TNF, растворимого рецептора TNF (например, р55, р70 и р85) или фрагмента, их слитых полипептидов или антагониста TNF с малой молекулой, например TNF-связующего белка I или II (ТВР-1 или TBP-II), нерелимонмаба, инфликсимаба, этанерцепта, CDP-571, CDP-870, афелимомаба, ленерцепта и т.п.), противоревматического лекарственного средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, натрия ауротиомалата, гидрокси-хлорохина сульфата, лефлуномида, сульфазалцина), миорелаксанта, наркотика, нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП), анальгетика, обезболивающего, успокоительного, местного обезболивающего, нервно-мышечного блокатора, антимикробного лекарственного средства (например, аминог-ликозида, противогрибкового, противопаразитарного, противовирусного, карбапенемама, цефалоспори-на, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, другого антимикробного средства), противопсориазного, кортикостероида, анаболического стероида, противодиабетического лекарственного средства, минерала, питательного вещества, связанного с щитовидной железой вещества, витамина, связанного с кальцием гормона, антидиарейного, противокашлевого, противорвотного, противоязвенного, слабительного, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, G-CSF, нейпогена), сарграмостима (GM-CSF, лейкина), иммунизации, иммуноглобулина, иммунодепрессанта (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклизумаба), гормона роста, гормон-заместительного лекарственного средства, модулятора рецептора эстрогена, мидриатика, лекарственного средства против циклоплегии, алкилирующего лекарственного средства, антиметаболита, митотического ингибитора, радиофармпрепарата, антидепрессанта, противоманиакального, антипсихотического, ан-ксиолитического, гипнотического, симпатомиметика, стимулятора, донепезила, такрина, лекарственного средства против астмы, бета-агониста, вдыхаемого стероида, ингибитора лейкотриенов, метилксантина, кромолина, эпинефрина или аналога, дорназа альфа (пульмозима), цитокина или антагониста цитокинов. Неограничивающими примерами таких цитокинов являются цитокины с IL-1 по IL-28 (IL-1, IL-2 и т.д.). Подходящие дозы хорошо известны из уровня техники (см., например, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).
Такие противораковые или противоинфекционные лекарственные средства могут также включать молекулы токсина, которые связаны, соединены, объединены в один препарат или вводятся совместно по меньшей мере с одним белковым каркасом по настоящему изобретению. Токсин может в некоторых случаях воздействовать на патологическую клетку или ткань с целью ее уничтожения. В качестве патологической клетки может выступать раковая или другая клетка. В частности, к таким токсинам относятся очищенный или рекомбинантный токсин либо фрагмент токсина, содержащий по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, например, по меньшей мере выбранный из рицина, дифтерийного токсина, ядовитого токсина или бактериального токсина. Термин "токсин" также включа
ет эндотоксины и экзотоксины, выделяемые любыми естественными, мутантными или рекомбинантными бактериями либо вирусами, которые могут вызывать любое патологическое состояние у человека и других млекопитающих, включая токсический шок, способный привести к смерти. К таким токсинам относятся, в частности, термолабильный энтеротоксин (LT), термостабильный энтеротоксин энтеротоксиген-ных (ST) E. coli, цитотоксин шигелл, энтеротоксины аэромонас, токсин-1 токсического шока (TSST-1), энтеротоксин А стафилококков (SEA), В (SEB) или С (SEC), энтеротоксины стрептококков и т.п. К таким бактериям относятся, в частности, штаммы энтеротоксигенных Е. coli (ETEC), энтерогеморрагических Е. coli (например, штаммы серотипа 0157:Н7), разновидностей стафилококков (например, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), разновидностей шигелл (например, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii и Shigella sonnei), разновидностей сальмонелл (например, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), разновидностей клостридий (например, Clostridium perfringens, Clos-tridium dificile, Clostridium botulinum), разновидностей кампилобактера (например, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), разновидностей хеликобактера (например, Heliobacter pylori), разновидностей аэро-монас (например, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), разновидностей Pleisomo-nas shigelloides, Yersina enterocolitica, Vibrios (например, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), разновидностей клебсиелл, Pseudomonas aeruginosa и стрептококков. См., например, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Man-dell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Ber-kow et al., eds. The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway N.J., 1992; Wood et al., FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).
Соединения, композиции или комбинации белковых каркасов по настоящему изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно подходящее вспомогательное вещество, в частности разбавитель, связывающее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные разбавители, консервант, адъювант и т.п. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Неограничивающие примеры таких стерильных растворов и способов их получения хорошо известны из уровня техники, в частности описаны в Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Фармацевтически приемлемые носители можно подобрать обычным способом исходя из способа введения, растворимости и/или стабильности белкового каркаса, фрагмента либо варианта композиции, как хорошо известно из уровня техники или описано в настоящем документе.
К фармацевтическим наполнителям и добавкам, пригодным для использования в настоящей композиции, относятся, в частности, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахар, в том числе моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; производные сахаров, например альдит, альдоновая кислота, этерифицированные сахара и т.п.; полисахариды или полимеры сахара), которые могут присутствовать по отдельности или в комбинации, составляя по отдельности или в комбинации 199,99 % по весу или объему. К белковым наполнителям относятся, в частности, сывороточный альбумин, например человеческий сывороточный альбумин (HSA), рекомбинантный человеческий альбумин (rHA), желатин, казеин и т.п. К аминокислотным/белковым компонентам, которые также могут использоваться как буфер, относятся, в частности, аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т.п. Одной из предпочтительных аминокислот является глицин.
К углеводным наполнителям, пригодным для использования в изобретении, относятся, в частности, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как раффиноза, мелицито-за, мальтодекстрины, декстраны, крахмал и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцитол), миоинозитол и т.п. Предпочтительными углеводными наполнителями для использования в настоящем изобретении являются маннит, трегалоза и раффиноза.
Композиции белкового каркаса могут также включать буфер или рН-регулирующее вещество; как правило, буфером является соль, полученная из органической кислоты или основания. К таким буферам относятся, в частности, соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, углекислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; буферы с трис, трометамина гидрохлоридом, фосфатом. Предпочтительными буферами для использования в настоящих композициях являются соли органических кислот, такие как цитрат.
Кроме того, композиции белкового каркаса по изобретению могут включать полимерные наполнители/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-р-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, ароматизаторы, антимикробные агенты, подсластители, антиоксиданты, антистатики, поверхностно-активные вещества (например, полисорбаты, такие как Tween 20 и Tween 80), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатные агенты (например, EDTA).
Эти и другие известные фармацевтические наполнители и/или добавки, пригодные для использования в белковом каркасе, его части или вариантах композиций по изобретению, известны из уровня техники, например, указаны в Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19th ed., Williams & Williams, (1995) и Physician's Desk Reference, 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), каждый вышеуказанный источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки. Предпочтительными носителями или наполнителями являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитрат) или полимерные агенты. Образцовой молекулой-носителем является мукополисахарид, гиа-луроновая кислота, которая может быть пригодна для внутрисуставного введения.
Препараты.
Как отмечалось выше, изобретение относится к стабильным препаратам, которые предпочтительно содержат фосфатный буфер с физиологическим раствором или выбранной солью, а также консервированные растворы и препараты, содержащие консервант, а также консервированные препараты для многократного использования, подходящие для применения в фармацевтических или ветеринарных целях, содержащие по меньшей мере один белковый каркас в фармацевтически приемлемом препарате. Консервированные препараты содержат по меньшей мере один известный консервант или в некоторых случаях по меньшей мере один консервант, выбранный из фенола, m-крезола, р-крезола, о-крезола, хлорокрезола, бензилового спирта, фенилртути нитрита, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, магния хлорида (например, гексагидрата), алкилпарабена (метила, этила, пропила, бутила и т.п), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала, полимеров или их смесей в водном разбавителе. Возможно использование любой подходящей концентрации или смеси, известной из уровня техники, например 0,0015% либо любого диапазона, его значения или части. Неограничивающими примерами являются (без консервантов) приблизительно 0,1-2% m-крезола (например, 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,9; 1,0%), приблизительно 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5; 0,9; 1,1; 1,5; 1,9; 2,0; 2,5%), приблизительно 0,001-0,5% тимеросала (например, 0,005; 0,01), приблизительно 0,001-2,0% фенола (например, 0,05; 0,25; 0,28; 0,5; 0,9; 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабенов (например, 0,00075; 0,0009; 0,001; 0,002; 0,005; 0,0075; 0,009; 0,01; 0,02; 0,05; 0,075; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75; 0,9; 1,0%) и т.п.
Как отмечалось выше, изобретение относится к изделию, включающему упаковочный материал и по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного белкового каркаса с указанными буферами и/или консервантами, в некоторых случаях в водном разбавителе, при этом данный упаковочный материал содержит этикетку с указанием, что раствор разрешается хранить в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 ч или дольше. Изобретение также относится к изделию, включающему упаковочный материал, один флакон, содержащий по меньшей мере один лиофили-зированный белковый каркас, и второй флакон, содержащий водный разбавитель указанного буфера или консерванта, отличающемуся тем, что упаковочный материал содержит этикетку с указанием для пациента разбавить по меньшей мере один белковый каркас в водном разбавителе для получения раствора, который разрешается хранить в течение 24 ч или дольше.
По меньшей мере один белковый каркас, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть получен рекомбинантным способом, в том числе из клеток млекопитающих или трансгенных препаратов, либо путем очистки других биологических источников, как описано здесь или известно из уровня техники.
Диапазон по меньшей мере одного белкового каркаса в изделии по настоящему изобретению включает объемы, дающие после разбавления в случае сухой/влажной системы концентрации от приблизительно 1,0 мкг/мл до приблизительно 1000 мг/мл, хотя более низкие и высокие концентрации также функциональны и зависят от предполагаемого способа доставки, например введение препарата в виде раствора отличается от введения такими способами, как трансдермальный пластырь, через легкие, через слизистую, осмотический насос или микронасос.
Предпочтительно водный разбавитель в некоторых случаях содержит фармацевтически приемлемый консервант. К предпочтительным консервантам относятся: фенол, m-крезол, р-крезол, о-крезол, хлорокрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и т.п), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, натрия дегидроацетат и тимеросал или их смеси. Концентрация консерванта, используемая в препарате, должна быть достаточна для достижения противомикробного действия. Такая концентрация зависит от выбранного консерванта и будет ясна специалисту.
В некоторых случаях и предпочтительно в разбавитель добавляют другие наполнители, например агенты изотонического действия, буферы, антиоксиданты и средства, усиливающие консервацию. Агенты изотонического действия, например глицерин, широко используются в известных концентрациях. Предпочтительно добавление физиологически приемлемого буфера для улучшения контроля рН. Препараты могут включать широкий диапазон рН, например от приблизительно рН 4 до приблизительно рН 10, предпочтительно от приблизительно рН 5 до приблизительно рН 9 и наиболее предпочтительно от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0. Предпочтительно препараты по настоящему изобретению имеют рН приблизительно от 6,8 до приблизительно 7,8. Предпочтительны фосфатные буферы, наиболее предпочтителен натрия фосфат, в частности забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).
В некоторых случаях для сокращения агрегации в препараты или композиции могут быть добавле
ны другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые разбавители, например Tween 20 (полиокси-этилена (20) сорбитана монолаурат), Tween 40 (полиоксиэтилена (20) сорбитана монопальмитат), Tween 80 (полиоксиэтилена (20) сорбитана моноолеат), Pluronic F68 (блок-сополимеры полиоксиэтилена и по-лиоксипропилена) и PEG (полиэтиленгликоль) или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 либо полоксамер 184 или 188, поли-L Pluronic(r), другие блок-сополимеры и хелаторы, такие как EDTA и EGTA. Эти добавки особенно полезны, если для введения препарата используется насос или пластиковый контейнер. Наличие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества снижает склонность белка к агрегации.
Препараты по настоящему изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и консерванта, выбранного из группы, состоящей из фенола, m-крезола, р-крезола, о-крезола, хлорокрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метила, этила, пропила, бутила и т.п.), бензалкония хлорида, бензетония хлорида, натрия дегидроацетата и тимеросала или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и консерванта в водном разбавителе осуществляется с использованием обычных процедур растворения и смешивания. Например, чтобы подготовить подходящий препарат, отмеренное количество по меньшей мере одного белкового каркаса в буферном растворе связывают с требуемым консервантом в буферном растворе в количестве, достаточном для получения требуемой концентрации белка и консерванта. Вариации этого процесса хорошо ясны среднему специалисту в данной области техники. Например, для оптимизации с учетом концентрации и способа введения могут быть изменены такие факторы, как порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых получают препарат.
Заявляемые препараты могут поставляться пациентам в виде прозрачных растворов или двухком-понентных флаконов, где первый флакон содержит по меньшей мере один лиофилизированный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находятся вода, консервант и/или наполнители, предпочтительно фосфатный буфер и/или физиологический раствор и выбранная соль, в водном разбавителе. Как однокомпонентный флакон с раствором, так и двухкомпонентный флакон с раствором, предполагающий смешивание, могут быть использованы многократно и подходят для одного или нескольких циклов лечения пациента, что более удобно по сравнению с существующим в настоящее время подходом.
Заявляемые в настоящем документе изделия пригодны для введения как немедленно, так и в течение 24 ч или дольше. Соответственно заявляемые в настоящем документе изделия обеспечивают значительные преимущества для пациентов. Препараты по изобретению в некоторых случаях могут храниться при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 40°С и сохраняют биологическую активность белка в течение длительных периодов времени, поэтому на этикетке упаковки может быть указано, что раствор разрешается хранить и/или использовать в течение б, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 ч или дольше. Если используется разбавитель с консервантом, то на этикетке может быть указан срок годности до 1-12 месяцев, полугода, полутора лет и/или двух лет.
Растворы по меньшей мере одного белкового каркаса по изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса в водном разбавителе. Смешивание осуществляется с использованием обычных процедур растворения и смешивания. Например, чтобы подготовить подходящий разбавитель, отмеренное количество по меньшей мере одного белкового каркаса в воде или буфере связывают в количестве, достаточном для получения требуемой концентрации белка и в некоторых случаях консерванта или буфера. Вариации этого процесса хорошо ясны среднему специалисту в данной области техники. Например, для оптимизации с учетом концентрации и способа введения могут быть изменены такие факторы, как порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых получают препарат.
Заявляемые изделия могут поставляться пациентам в виде прозрачных растворов или двухкомпо-нентных флаконов, где первый флакон содержит по меньшей мере один лиофилизированный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находится водный разбавитель. Как одноком-понентный флакон с раствором, так и двухкомпонентный флакон с раствором, предполагающий смешивание, могут быть использованы многократно и подходят для одного или нескольких циклов лечения пациента, что более удобно по сравнению с существующим в настоящее время подходом.
Заявляемые изделия могут поставляться пациентам не напрямую (через аптеки, поликлиники или другие учреждения) в виде прозрачных растворов или двухкомпонентных флаконов, где первый флакон содержит по меньшей мере один лиофилизированный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находится водный разбавитель. В этом случае объем прозрачного раствора может составлять один литр и больше, тем самым обеспечивается большая емкость, из которой аптека или поликлиника может отмерять раствор по меньшей мере одного белкового каркаса однократно или многократно небольшими порциями для переноса во флаконы меньшего размера с целью предоставления своим клиентам и/или пациентам.
К известным устройствам, содержащим однофлаконные системы, относятся, в частности, шприцы
ручки для введения растворов, например BD Pens, BD Autojector(r), Humaject(r), NovoPen(r), B-D(r)Pen, AutoPen(r), and OptiPen(r), GenotropinPen(r), Genotronorm Pen(r), Humatro Pen(r), Reco-Pen(r), Roferon Pen(r), Biojector(r), Iject(r), J-tip Needle-Free Injector(r), Intraject(r), Medi-Ject(r), например, выпускаемые или изготавливаемые Becton Dickensen (Фрэнклин Лейкс, Нью-Джерси, www.bectondickenson.com), Disetronic (Бургдорф, Швейцария, www.disetronic.com; Bioject, Портленд, Орегон (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Питерборо, Великобритания, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Миннеаполис, Миннесота, www.mediject.com), и аналогичные подходящие устройства. К известным устройствам, содержащим двухфлаконные системы, относятся, в частности, шприцы-ручки для разбавления лиофилизированного лекарственного средства в картридже для введения разбавленного раствора, например HumatroPen(r). К числу других подходящих устройств относятся, в частности, предварительно заполненные шприцы, автоматические инъекционные шприцы, безыгольные инъекционные шприцы и безыгольные наборы для в/в вливания.
Заявляемые в настоящем документе изделия включают упаковочный материал. В дополнение к информации в соответствии с предписаниями контролирующих органов на упаковочном материале также указываются условия, при которых может быть использовано изделие. Упаковочный материал по настоящему изобретению содержит инструкции для пациента по разбавлению по меньшей мере одного белкового каркаса в водном разбавителе для получения раствора и использованию раствора в течение 224 ч или дольше в случае двухфлаконного сухого/влажного изделия. В случае однофлаконного изделия в виде раствора на упаковке указывается, что такой раствор может быть использован в течение 2-24 ч или дольше. Заявляемые в настоящем документе изделия предназначены для использования человеком в фармацевтических целях.
Препараты по настоящему изобретению могут быть получены способом, включающим смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и выбранного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, содержащего физиологический раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного белкового каркаса и буфера в водном разбавителе осуществляется с использованием обычных процедур растворения и смешивания.
Например, чтобы подготовить подходящий препарат, отмеренное количество по меньшей мере одного белкового каркаса в воде или буфере связывают с требуемым буферным веществом в воде в количестве, достаточном для получения требуемой концентрации белка и буфера. Вариации этого процесса хорошо ясны среднему специалисту в данной области техники. Например, для оптимизации с учетом концентрации и способа введения могут быть изменены такие факторы, как порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых получают препарат.
Заявляемые стабильные или консервированные препараты могут поставляться пациентам в виде прозрачных растворов или двухкомпонентных флаконов, где первый флакон содержит лиофилизирован-ный белковый каркас, смешиваемый с содержимым второго флакона, где находится консервант или буфер и наполнители в водном разбавителе. Как однокомпонентный флакон с раствором, так и двухкомпо-нентный флакон с раствором, предполагающий смешивание, могут быть использованы многократно и подходят для одного или нескольких циклов лечения пациента, что более удобно по сравнению с существующим в настоящее время подходом.
Другие препараты или способы стабилизации белкового каркаса могут дать результаты, отличающиеся от прозрачного раствора лиофилизированного порошка, содержащего белковый каркас. К непрозрачным растворам относятся, в частности, препараты, содержащие взвешенные частицы, которые являются композициями, содержащими белковый каркас в структуре переменной размерности, и известны как микросферы, микрочастицы, наночастицы, наносферы или липосомы. Такие относительно однородные, в целом, сферические препараты в виде частиц, содержащие активное вещество, могут быть получены путем связывания водной фазы, содержащей активное вещество и полимер, с неводной фазой с последующим испарением неводной фазы и соединением частиц из водной фазы, как описано в патенте США № 4589330. Пористые микрочастицы могут быть получены, если в качестве первой фазы использовать суспензию, содержащую активное вещество и полимер, диспергированные в непрерывно действующем разбавителе, и удалить указанный разбавитель из суспензии методом сублимационной сушки или разбавления, экстрагирования и осаждения, как описано в патенте США № 4818542. Предпочтительными полимерами для таких препаратов являются естественные или синтетические сополимеры либо полимеры, выбранные из желатинового агара, крахмала, арабиногалактана, альбумина, коллагена, поли-гликолевой кислоты, полимолочной кислоты, гликолид^(-)лактида поли(эпсилонкапролактона), по-ли(эпсилонкапролактон-СО-молочной кислоты), поли(эпсилонкапролактон-СО-гликолевой кислоты), полиф-гидроксимасляной кислоты), полиэтиленоксида, полиэтилена, поли(алкил-2-цианакрилата), поли (гидроксиэтилметакрилата), полиамидов, поли(аминокислот), поли(2-гидроксиэтил DL-аспартамида), поли(эфира мочевины), поли^-фенилаланинэтиленглико^1,6-диизоцианатогексана) и по-ли(метилметакрилата). Наиболее предпочтительными полимерами являются полиэфиры, такие как поли-гликолевая кислота, полимолочная кислота, гликолид^(-) лактид поли(эпсилон-капролактон), по-ли(эпсилон-капролактон-СО-молочная кислота) и поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевая кислота). К
разбавителям, пригодным для растворения полимера и/или активного вещества, относятся вода, гексаф-торизопропанол, метиленхлорид, тетрагидрофуран, гексан, бензол или гексафторацетона полуторагид-рат. Процесс диспергирования содержащей активное вещество фазы с помощью второй фазы может включать принудительный пропуск первой фазы через отверстие в сопле для получения каплеобразной формы.
Препараты в виде сухого порошка могут быть получены способами помимо лиофилизации, например путем распылительной сушки, экстрагирования разбавителя испарением либо осаждения кристаллической композиции, за которыми следуют одно или несколько действий по удалению водного или неводного разбавителя. Подготовка препарата белкового каркаса путем распылительной сушки описана в
патенте США № 6019968.
Композиции белкового каркаса в виде сухого порошка могут быть получены путем распылительной сушки растворов или суспензий белкового каркаса и в некоторых случаях наполнителей в разбавителе при условиях, обеспечивающих получение вдыхаемого сухого порошка. В качестве разбавителей могут быть использованы, в частности, полярные соединения, такие как вода и этанол, которые можно легко высушить. Стабильность белковых каркасов может быть повышена, если процедуры распылительной сушки проводятся в отсутствии кислорода, например, под азотной подушкой или с помощью азота в качестве сушильного газа. Другой препарат в виде относительно сухого порошка получают диспергированием множества перфорированных микроструктур в суспензионной среде, обычно содержащей пропел-лент гидрофторалкан, как описано в WO 9916419. Стабилизированный диспергированный препарат может быть введен в легкие пациента с помощью ингалятора отмеренных доз. Оборудование, пригодное для коммерческого производства лекарственного средства путем распылительной сушки, выпускается Buchi Ltd. или Niro Corp.
По меньшей мере один белковый каркас в виде стабильного или консервированного препарата или раствора, как описано здесь, может быть введен пациенту в соответствии с настоящим изобретением с помощью различных способов, включая подкожные или внутримышечные инъекции, трансдермальный, через легкие, через слизистую, имплантат, осмотический насос, картридж, микронасос или другие средства, ясные специалисту, как хорошо известно из уровня техники.
Терапевтическое применение.
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения заболеваний в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, как известно из уровня техники или описано здесь, с использованием по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению, например посредством взаимодействия терапевтически эффективного количества белкового каркаса с клеткой, тканью, органом, животным или пациентом путем введения либо реакции. Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения заболеваний в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранных из ожирения, иммунного заболевания, сердечнососудистого заболевания, инфекционного заболевания, злокачественного заболевания или неврологического заболевания.
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного иммунного заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного и: ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита в системной форме в начальной стадии, псориатического артрита, анкилозирую-щего спондилита, язвы желудка, серонегативных артропатий, остеоартроза, остеолиза, асептического расшатывания ортопедических имплантатов, воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, системной красной волчанки, антифосфолипидного синдрома, иридоциклита/увеита/неврита зрительного нерва, идиопатического легочного фиброза, системного васкулита/гранулематоза Вегенера, саркоидоза, орхита/обратной операции при вазэктомии, аллергических/атопических заболеваний, астмы, аллергического ринита, экземы, аллергического контактного дерматита, аллергического конъюнктивита, пневмо-нита на фоне гиперчувствительности, заболеваний, связанных с пересадкой органов, отторжения пересаженных органов, болезни "трансплантат против хозяина", синдрома системной воспалительной реакции, синдрома сепсиса, грамположительного сепсиса, грамотрицательного сепсиса, отрицательного в культуре сепсиса, грибкового сепсиса, нейтропенической лихорадки, уросепсиса, менингококцемии, травмы/кровотечения, ожогов, ионизирующего облучения, острого панкреатита, респираторного дистресс-синдрома взрослых, ревматоидного артрита, алкогольного гепатита, хронических воспалительных патологий, саркоидоза, болезни Крона, серповидно-клеточной анемии, диабета, нефроза, атопических заболеваний, реакций гиперчувствительности, аллергического ринита, сенной лихорадки, перениального ринита, конъюнктивита, эндометриоза, астмы, крапивницы, системной анафилаксии, дерматита, злокачественной анемии, гемолитических заболеваний, тромбоцитопении, отторжения трансплантата органа или ткани, отторжения трансплантата почки, отторжения трансплантата сердца, отторжения трансплантата печени, отторжения трансплантата поджелудочной железы, отторжения трансплантата легкого, отторжения трансплантата костного мозга, отторжения аллотрансплантата кожи, отторжения трансплантата хряща, отторжения трансплантата кости, отторжения трансплантата тонкой кишки, отторжения имплантата тимуса плода, отторжения трансплантата паращитовидных желез, отторжения ксенотрансплантата орга
на или ткани, отторжения аллотрансплантата, реакций гиперчувствительности с участием антирецепторов, болезни Грейвса, болезни Рейно, инсулиннезависимого диабета 2-го типа, астмы, миастении, антитело-опосредованной цитотоксичности, реакций гиперчувствительности типа III, POEMS-синдрома (по-линейропатии, органомегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии и синдрома изменения кожи), полиневропатии, органомегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии, синдрома изменения кожи, антифосфолипидного синдрома, пузырчатки, склеродермии, смешанного заболевания соединительной ткани, идиопатической болезни Аддисона, сахарного диабета, хронического активного гепатита, первичного билиарного цирроза, витилиго, васкулита, посткардиотомного синдрома после ИМ, гиперчувствительности типа IV, контактного дерматита, пневмонита на фоне гиперчувствительности, отторжения аллотрансплантата, гранулемов на фоне внутриклеточных организмов, чувствительности к лекарственному средству, метаболического/идиопатического заболевания, болезни Вильсона-Коновалова, гемохроматоза, дефицита альфа-1-антитрипсина, диабетической ретинопатии, тиреоидита Хашимото, остеопороза, оценки гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, первичного билиарного цирроза, тиреоидита, энцефаломиелита, кахексии, кистозного фиброза, неонатального хронического заболевания легких, хронической обструктивной болезни легких (COPD), семейного гемофагоцитарного лимфоцитарного гистиоцитоза, дерматологических состояний, псориаза, облысения, нефротического синдрома, нефрита, клубочкового нефрита, острой почечной недостаточности, гемодиализа, уремии, токсичности, преэклампсии, терапии OKT3, терапии анти-CD3, цитокин-терапии, химиотерапии, лучевой терапии (в частности, астении, анемии, кахексии и т.п.)/ хронической интоксикации салицилатами и т.п. (см., например, Merck Manual, 12-17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного сердечно-сосудистого заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного из синдрома снижения сердечной активности, инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности, инсульта, ишемического инсульта, кровоизлияния, острого коронарного синдрома, артериосклероза, атеросклероза, рестеноза, диабетического артериосклероза, гипертонии, артериальной гипертензии, вазоренальной гипертензии, обморока, шока, сифилиса сердечнососудистой системы, сердечной недостаточности, легочного сердца, первичной легочной гипертензии, сердечной аритмии, предсердной экстрасистолы, трепетания предсердий, фибрилляции предсердий (постоянной или пароксизмальной), постперфузионного синдрома, воспаления на фоне искусственного кровообращения, хаотической или мультифокальной предсердной тахикардии, регулярной тахикардии с узкими QRS-комплексами, специфических аритмий, фибрилляции желудочков, аритмий пучка Гиса, ат-риовентрикулярной блокады, блокады ножки пучка Гиса, ишемических нарушений миокарда, ишемиче-ской болезни сердца, стенокардии, инфаркта миокарда, кардиомиопатии, дилатационной застойной кар-диомиопатии, рестриктивной кардиомиопатии, пороков сердца, эндокардита, заболевания перикарда, сердечных опухолей, аневризмов аорты и периферийных артерий, расслоения аорты, воспаления аорты, окклюзии брюшной аорты и ее ветвей, периферических сосудистых расстройств, окклюзионных расстройств артериального кровообращения, атеросклеротического заболевания периферических артерий, облитерирующего тромбангиита, функциональных расстройств периферических артерий, явления и болезни Рейно, акроцианоза, эритромелалгии, венозных заболеваний, венозного тромбоза, варикозных вен, артериовенозной фистулы, лимфедемы, жирового отека, нестабильной стенокардии, реперфузионного повреждения, синдрома полиорганной недостаточности после искусственного кровообращения, ишеми-чески-реперфузионного повреждения и т.п. Такой способ может в некоторых случаях включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, в клетки, ткани, органы, животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия.
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного инфекционного заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного из острой или хронической бактериальной инфекции, острых и хронических паразитарных или инфекционных процессов, включая бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, ВИЧ-инфекции/ВИЧ-невропатии, менингит, гепатит (например, А, В или С и т.п.), септический артрит, перитонит, пневмонию, эпиглоттит, е. coli 0157:h7, гемолитический уремический син-дром/тромболитическую тромбоцитопеническую пурпуру, малярию, геморрагическую лихорадку Денге, лейшманиоз, проказу, синдром токсического шока, стрептококковый миозит, газовую гангрену, мико-бактериальный туберкулез, mycobacterium avium intracellulare, пневмоцистную пневмонию, воспалительное заболевание тазовых органов, орхит/эпидидимит, легионеллы, болезнь Лайма, грипп типа а, вирус Эпштейна-Барра, вирус-ассоциированный гемафагоцитарный синдром, вирусный энцефалит/асептический менингит и т.п.
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного злокачественного заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере выбранного из лейкоза, острого лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (ALL), ост- 24
рого лимфоцитарного лейкоза, В-клеточного, Т-клеточного или FAB ALL, острого миелолейкоза (AML), острого миелогенного лейкоза, хронического миелоцитарного лейкоза (CML), хронического лимфолей-коза (CLL), волосатоклеточного лейкоза, миелодиспластического синдрома (MDS), лимфомы, болезни Ходжкина, злокачественной лимфомы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта, множественной миелома, саркомы Капоши, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака носоглотки, злокачественного гистиоцитоза, паранеопластического синдрома/гиперкальциемии при злокачественных новообразованиях, солидных опухолей, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака эндометрия, рака головы, рака шеи, наследственного неполипозного рака, лимфомы Ходжки-на, рака печени, рака легких, немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака простаты, почечно-клеточного рака, рака яичек, аденокарциномов, сарком, злокачественной ме-ланомы, гемангиомы, метастаз, связанной с раком резорбции костей, связанных с раком болей в костях и т.п. Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного неврологического заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере одного из следующего ряда: нейродегенеративные заболевания, рассеянный склероз, мигрень, СПИД-дементный комплекс, демиелинизирующие заболевания, например рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидные и мозжечковые расстройства, например поражения кортико-спинальной системы; заболевания базальных ганглиев; гиперкинетические двигательные расстройства, например хорея Хантингтона и старческая хорея; медикаментозные двигательные расстройства, например, вызванные лекарственными средствами, которые блокируют рецепторы дофамина ЦНС; гипокинетические двигательные расстройства, например болезнь Паркинсона; прогрессирующий надъ-ядерный паралич; структурные поражения мозжечка; спиноцеребеллярные дегенерации, например спинная атаксия, атаксия Фридрейха, церебеллярные кортикальные дегенерации, дегенерации множественных систем (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager и Machado-Joseph); системные нарушения (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телеангиэктазия и митохондриальные расстройства множественных систем); демиелинизирующие заболевания мозга, например рассеянный склероз, острый поперечный миелит; расстройства моторной единицы, например нейрогенная мышечная атрофия (дегенерация клеток переднего рога спинного мозга, например боковой амиотрофический склероз, инфантильная спинальная мышечная атрофия и ювенильная спинальная мышечная атрофия); болезнь Альцгеймера; синдром Дауна в среднем возрасте; заболевание с диффузными тельцами Леви; сенильная деменция, ассоциированная с тельцами Леви; синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейтцфельдта-Якоба; подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Халлеррордена-Шпатца; де-менция боксеров; нейротравмы (например, травма спинного мозга, черепно-мозговая травма, сотрясение мозга, повторное сотрясение мозга); боль; воспалительные боли; аутизм; депрессия; инсульт; когнитивные расстройства; эпилепсия и т.п. Такой способ может в некоторых случаях включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело к TNF, указанную часть или вариант, в клетки, ткани, органы, животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия См., например, Merck Manual, 16th Edition, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).
Настоящее изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одной раны, травмы, повреждения тканей или связанного хронического состояния в клетках, тканях, органах, животных либо пациентах, в частности по меньшей мере одного из следующего ряда: телесные повреждения или травмы, связанные с челюстно-лицевой хирургией, в том числе хирургией пародонта, удаление зубов, эндодонтическое лечение, установка зубных имплантатов, применение и использование зубного протеза; или раны из следующего ряда: асептические раны, ушибы, резаные раны, рваные раны, непроникающие раны, открытые раны, проникающие раны, сквозные раны, колотые раны, гнойные раны, инфаркты и подкожные раны; или раны из следующего ряда: ишемические язвы, пролежни, свищи, сильные укусы, термические ожоги и раны донорского участка; или раны, являющейся афтозной раной, травматической раной или герпес-ассоциированной раной.
Раны и/или язвы обычно выступают на коже или на поверхности слизистой оболочки либо возникают в результате инфаркта в органе. Рана может являться результатом повреждения мягких тканей, поражения или основного заболевания. В данном контексте термин "кожа" относится к внешней поверхности тела животных, в том числе человека, и включает неповрежденную или почти неповрежденную кожу, а также поврежденную поверхность кожи. Термин "слизистая оболочка" относится к неповрежденной или поврежденной слизистой оболочке животных, например, человека, и включает слизистую оболочку рта, щек, ушей, носа, легких, глаз, желудочно-кишечного тракта, вагинальную и прямой кишки.
В данном контексте термин "рана" означает телесные повреждения с нарушением нормальной целостности тканевых структур. Этот термин также включает понятия "кожная болезнь", "поражение", "некроз" и "язва". Распространенный термин "кожная болезнь" обычно означает практически любое поражение кожи или слизистых оболочек, а термин "язва" является локальным дефектом, полостью на поверхности органа или ткани, которая возникает в результате отторжения некротических тканей. "Поражение" в целом относится к любому дефекту ткани. "Некроз" относится к ткани, омертвевшей в результате инфекции, травмы, воспаления или инфарктов.
Термин "рана" в данном контексте означает любую рану (см. классификацию ран ниже) на любом отдельном этапе процесса заживления, в том числе на этапе до начала лечения или даже нанесения специальной раны, например, хирургического разреза (профилактическое лечение). Настоящее изобретение предназначено для предотвращения и/или лечения, например, следующих ран: асептические раны, ушибы, резаные раны, рваные раны, непроникающие раны (т.е. раны без нарушения кожи, но с повреждением нижележащих структур), открытые раны, проникающие раны, сквозные раны, колотые раны, гнойные раны, подкожные раны и т.д. Примерами кожных болезней являются пролежни, афтозные стоматиты, хромовые язвы, герпес и т.д. Примерами язв являются язвенная болезнь, язва двенадцатиперстной кишки, язва желудка, подагрическая язва, диабетическая язва, гипертоническая ишемическая язва, варикозная язва, язва нижних конечностей (венозная язва), подъязычная язва, подслизистая язва, симптоматическая язва, трофическая язва, тропическая язва и венерическая язва, например, вызванная гонореей (в том числе уретрит, эндоцервицит и проктит). К состояниям, связанным с ранами или кожными болезнями, которые могут успешно излечиваться с помощью изобретения, относятся ожоги, сибирская язва, столбняк, газовая гангрена, скарлатина, рожа, сикоз, фолликулит, контагиозное импетиго или буллезное импетиго и т.д. Термины "рана" и "язва", а также "рана" и "кожная болезнь" часто используются для обозначения одного и того же состояния; эти термины также часто являются взаимозаменяемыми без какой-либо последовательности. Поэтому, как упоминалось выше, в данном контексте термин "рана" включает термины "язва", "поражение", "кожная болезнь" и "инфаркт", причем, если не указано иного, эти термины являются взаимозаменяемыми.
Типы ран, поддающихся лечению с помощью изобретения, также включают (I) общие раны, например, хирургические, травматические, инфекционные, ишемические, тепловые, химические и буллезные раны; (II) раны, специфические для полости рта, например, возникающие после удаления, эндодонтиче-ские раны, особенно связанные с лечением кист и абсцессов, язвы и поражения бактериального, вирусного или аутоиммунного генеза, механические, химические, тепловые, инфекционные и лихеноидные раны, герпес, афтозный стоматит, острый некротизирующий язвенный гингивит и синдром жжения полости рта; а также (III) раны на коже, например, неоплазмы, ожоги (например, химические, тепловые), поражения (бактериальные, вирусные, аутоиммунные), укусы и хирургические разрезы. Согласно другой классификации раны разделяются на (i) небольшие потери ткани в связи с хирургическими разрезами, небольшими ссадинами и мелкими укусами и (II) значительные потери ткани. В последнюю группу входят ишемические язвы, пролежни, свищи, рваные раны, сильные укусы, тепловые ожоги, раны донорского участка (в мягких и твердых тканях) и инфаркты.
В связи с настоящим изобретением важное значение также имеют такие раны, как ишемические язвы, пролежни, свищи, сильные укусы, тепловые ожоги и раны донорского участка. Ишемические язвы и пролежни - это раны, которые обычно заживают очень медленно, и в таких случаях улучшение и ускорение процесса заживления очень важны для пациента. Кроме того, когда заживление улучшается и ускоряется, стоимость лечения пациентов, страдающих от таких ран, заметно снижается.
Раны донорского участка - это раны, возникающие, к примеру, в связи с переносом твердых тканей из одной части тела в другую, например в результате трансплантации. Раны, возникающие в результате таких операций, крайне болезненны, поэтому задача улучшения лечения является исключительно важной. Термин "кожа" используется в очень широком смысле и включает эпидермальный слой кожи, а в тех случаях, когда поверхность кожи повреждена в той или ной степени, также дермальный слой кожи. Не считая рогового слоя, эпидермальный слой кожи является внешним (эпителиальным) слоем, а более глубокий слой соединительной ткани кожи называется дермой.
Любой способ по настоящему изобретению может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, в клетки, ткани, органы, животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия. Такой способ в некоторых случаях включает совместное введение или комбинированную терапию для лечения таких заболеваний или расстройств, при которых до, во время и/или после введения по меньшей мере одного указанного белкового каркаса, его указанной части или варианта дополнительно вводится по меньшей мере одно лекарственное средство из следующего ряда: антагонист TNF (в частности, химический или белковый антагонист TNF, моноклональное или поликлональное антитело либо фрагмент TNF, растворимый рецептор TNF (например, р55, р70 и р85) или фрагмент, их слитые полипептиды или антагонист TNF с малой молекулой, например TNF-связующий белок I или II (ТВР-1 или TBP-II), нерелимонмаб, инфликсимаб, этанерцепт (Enbrel(tm)), адалимумаб (Humira(tm)), CDP-571, CDP-870, афелимомаб, ленерцепт и т.п.), противоревматическое лекарственное средство (например, метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, натрия ауротиомалат, гидроксихлорохина сульфат, лефлуномид, сульфазалцин), миорелаксант, наркотик, нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП), анальгетик, обезболивающее, успокоительное, местное обезболивающее, нервно-мышечный блокатор, антимикробное лекарственное средство (например, аминогликозид, противогрибковое, противопаразитарное, противовирусное, карбапенемам, цефалоспорин, фторхинолон, макролид, пенициллин, сульфонамид, тетрациклин, другое антимикробное), противопсориазное, кортикостероид, анаболический стероид, противодиабетическое лекарственное средство, минерал, питательное вещество,
связанное с щитовидной железой вещество, витамин, связанный с кальцием гормон, антидиарейное, про-тивокашлевое, противорвотное, противоязвенное, слабительное, антикоагулянт, эритропоэтин (например, эпоэтин альфа), филграстим (например, G-CSF, нейпоген), сарграмостим (GM-CSF, лейкин), иммунизация, иммуноглобулин, иммунодепрессант (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон роста, гормон-заместительное лекарственное средство, модулятор рецептора эстрогена, мидриа-тик, лекарственное средство против циклоплегии, алкилирующее лекарственное средство, антиметаболит, митотический ингибитор, радиофармпрепарат, антидепрессант, противоманиакальное, антипсихотическое, анксиолитическое, гипнотическое, симпатомиметик, стимулятор, донепезил, такрин, лекарственное средство против астмы, бета-агонист, вдыхаемый стероид, ингибитор лейкотриенов, метилксан-тин, кромолин, эпинефрин или аналог, дорназа альфа (пульмозим), цитокин или антагонист цитокинов. Подходящие дозы хорошо известны из уровня техники (см., например, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ., каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки).
Цитокины включают любые известные цитокины (см., например, CopewithCytokines.com). Антагонисты цитокинов включают, в частности, белковый каркас, антитело, фрагмент или миметик, растворимый рецептор, фрагмент или миметик, антагонист с малой молекулой или их комбинацию.
Как правило, лечение патологических состояний осуществляется путем введения эффективного количества или дозы по меньшей мере композиции белкового каркаса, которая в среднем содержит по меньшей мере приблизительно 0,01-500 мг по меньшей мере одного белкового каркаса на килограмм пациента за одну дозу и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,1-100 мг белкового каркаса на килограмм пациента за одно или несколько введений в зависимости от конкретного действия активного вещества, содержащегося в композиции. Кроме того, эффективная концентрация в сыворотке может составлять 0,1-5000 мкг/мл сыворотки за одно или несколько введений. Подходящие дозы известны медицинским специалистам и, разумеется, зависят от конкретного патологического состояния, конкретного действия вводимой композиции и конкретного пациента, подвергающегося лечению. В некоторых случаях для достижения требуемого терапевтического количества может потребоваться неоднократное введение, т.е. неоднократные отдельные введения особой мониторируемой или отмеренной дозы, повторяющиеся до достижения требуемой суточной дозы или эффекта.
Предпочтительные дозы могут в некоторых случаях содержать приблизительно 0,1-99 и/или 100500 мг/кг за одно введение либо любой диапазон, его значение или часть либо могут быть направлены на достижение концентрации в сыворотке приблизительно 0,1-5000 мкг/мл за одно или несколько введений либо любой диапазон, его значение или часть. Предпочтительный диапазон дозировки для белкового каркаса по настоящему изобретению составляет от приблизительно 1 до приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 6 или приблизительно 12 мг/кг массы тела пациента.
Кроме того, вводимая доза может варьироваться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного вещества, режим и способ его введения, возраст, состояние здоровья и вес пациента, характер и масштаб симптомов, характер проводимого параллельно лечения, частота лечения и требуемый эффект. Обычно доза активного вещества составляет приблизительно 0,1-100 мг на килограмм веса тела. Для достижения желаемых результатов обычно достаточно 0,1-50 мг и предпочтительно 0,1-10 мг на килограмм за одно введение или в форме длительного действия.
Неограничивающим примером является лечение людей или животных путем однократного или периодического введения по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению в количестве приблизительно 0,1-100 мг/кг или любого диапазона, его значения или части в день по меньшей мере в один из дней 1-40 или в качестве альтернативы либо дополнительно по меньшей мере в одну из недель 1-52 или в качестве альтернативы либо дополнительно по меньшей мере в один из 1-20 лет (возможно любое сочетание временных сроков) с использованием однократного введения, в/в вливания или неоднократного введения.
Лекарственные формы (композиция), пригодные для внутреннего введения, обычно содержат от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 500 мг активного вещества на единицу или контейнер. В этих фармацевтических композициях активное вещество обычно присутствует в количестве приблизительно 0,5-99,999% в пересчете на общую массу композиции.
Для парентерального введения белковый каркас может быть приготовлен в виде раствора, суспензии, эмульсии, частиц, порошка или лиофилизированного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем или может поставляться раздельно с таким носителем. Примерами таких носителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и человеческий сывороточный альбумин приблизительно 1-10%. Возможно также использование липосом и неводных наполнителей, таких как жирные масла. Наполнитель или лиофилизированный порошок может содержать добавки, способствующие изотонности (например, хлорид натрия, маннит) и химической ста
бильности (например, буферы и консерванты). Препарат стерилизуется известными или приемлемыми способами.
Приемлемые фармацевтические носители описаны в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, которое является наиболее авторитетным источником в данной области техники. Альтернативные способы введения.
В соответствии с настоящим изобретением для введения фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению могут быть использованы многие известные и разработанные способы. Далее описано ингаляционное введение, однако в соответствии с настоящим изобретением также могут быть использованы другие способы введения, дающие приемлемые результаты. Белковые каркасы по настоящему изобретению могут доставляться в носителе в виде раствора, эмульсии, коллоида, суспензии или сухого порошка, с помощью разнообразных устройств и способов, пригодных для введения ингаляционным или другим способом, описанным здесь либо известным из уровня техники.
Парентеральные препараты и введение.
Препараты для парентерального введения могут в качестве общих наполнителей содержать стерильную воду, физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и т.п. Водные или масляные суспензии для инъекций могут быть получены с помощью соответствующего эмульгатора или увлажнителя и суспендирующего вещества с использованием известных способов. Для инъекций могут быть использованы нетоксичные разбавители, не предназначенные для перорального введения, например водный раствор, стерильный раствор для инъекций или суспензия в разбавителе. В качестве носителя или разбавителя допускается использовать воду, раствор Рингера, изотонический физиологический раствор и т.д.; в качестве обычного разбавителя или суспендирующего разбавителя может быть использовано стерильное нелетучее масло. Для этих целей допускается использовать любого рода нелетучее масло и жирную кислоту, включая естественные, синтетические и полусинтетические жирные масла или жирные кислоты, естественные, синтетические и полусинтетические моно-, ди- и триглицериды. Парентеральное введение известно из уровня техники и осуществляется, в частности, с помощью традиционных видов инъекций, пневматического безыгольного инъекционного устройства, описанного в патенте США № 5851198, и лазерного перфоратора, как описано в патенте США № 5839446; каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки.
Альтернативные способы доставки.
Изобретение также относится к введению по меньшей мере одного белкового каркаса следующими способами: парентеральный, подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрисуставный, внутри-бронхиальный, внутрибрюшной, интракапсулярный, внутрихрящевой, внутриполостной, интрацелиаль-ный, интрацеребеллярный, интрацеребровентрикулярный, внутрь толстой/ободочной кишки, интрацер-викальный, внутрижелудочный, внутрипеченочный, интрамиокардиальный, внутрикостный, внутритазо-вый, интраперикардиальный, внутрибрюшинный, внутриплевральный, внутрипростатический, внутриле-гочный, интраректальный, интраренальный, интраретинальный, интраспинальный, интрасиновиальный, внутригрудный, внутриматочный, интравезикулярный, внутрь пораженных тканей, болюсный, вагинальный, ректальный, буккальный, сублингвальный, интраназальный или трансдермальный. По меньшей мере одна композиция белкового каркаса может быть приготовлена к использованию для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) или любого другого введения, в частности в виде жидких растворов или суспензий; для вагинального или ректального введения, в частности в полутвердых формах, в том числе в виде кремов и суппозиториев; для буккального или сублингвального введения, в частности в виде таблеток или капсул; для интраназального введения, в частности в виде порошков, капель или аэрозолей в нос либо определенных веществ; для трансдермального введения, в частности в виде геля, мази, лосьона, суспензии или пластыря с химическими усиливающими веществами, такими как диметилсульфоксид, добавленными с целью изменить структуру кожи или увеличить концентрацию препарата в трансдермальном пластыре (Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994, источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки), с окисляющими веществами, позволяющими применять на коже препараты с содержанием белков и пептидов (WO 98/53847), с применением электрического поля для создания промежуточных путей доставки, например путем электропорации, для ускорения движения заряженных лекарственных средств через кожу, например путем ионофореза, применения ультразвука, например соно-фореза (патенты США №№ 4309989 и 4767402) (вышеуказанные публикации и патенты полностью включены в текст настоящего документа путем ссылки).
Легочное/назальное введение.
При легочном введении предпочтительно по меньшей мере одна композиция белкового каркаса доставляется в виде частиц, размер которых достаточен для проникновения в нижние дыхательные пути легких или синусы. В соответствии с изобретением по меньшей мере один белковый каркас может быть доставлен с помощью разнообразных ингаляционных или назальных устройств для введения лекарственного средства при вдыхании, известных из уровня техники. Такие устройства, предназначенные для
доставки аэрозольных препаратов в полости синуса или альвеолы пациента, включают ингаляторы отмеренных доз, небулайзеры, генераторы сухого порошка, распылители и т.п. Из уровня техники также известны другие устройства, пригодные для легочного или назального введения белковых каркасов. Все устройства такого рода могут доставлять препараты, подходящие для введения белкового каркаса в виде аэрозоля. Такие аэрозоли могут содержать либо растворы (как водные, так и неводные), либо твердые частицы.
Ингаляторы отмеренных доз, например Ventolin(r), как правило, задействуют пропеллент и должны приводиться в действие во время вдоха (см., например, WO 94/16970, WO 98/35888). Порошковые ингаляторы, например Turbuhaler(tm) (Astra), Rotahaler(r) (Glaxo), Diskus(r) (Glaxo), Spiros(tm) (Dura), устройства, поставляемые Inhale Therapeutics, и порошковые ингаляторы Spinhaler(r) (Fisons), приводятся в действие дыханием и подают смешанный порошок (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, каждый источник полностью включен в текст настоящего документа путем ссылки). Небулайзеры, например AERx(tm) Aradigm, небулайзер Ultravent(r) (Mallinckrodt) и небулайзер Acorn II(r) (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376)
(вышеуказанные источники полностью включены в текст настоящего документа путем ссылки), подают аэрозоли из растворов, тогда как ингаляторы отмеренных доз, порошковые ингаляторы и т.д. подают аэрозоли с мелкими частицами. Эти имеющиеся в продаже ингаляционные устройства приведены в качестве примеров конкретных устройств, пригодных для применения настоящего изобретения, и не ограничивают объем изобретения.
Предпочтительно композиция, включающая по меньшей мере один белковый каркас, доставляется с помощью порошкового ингалятора или распылителя. Ингаляционное устройство для введения по меньшей мере одного белкового каркаса по настоящему изобретению отличается рядом преимуществ. Например, доставка с помощью ингаляционного устройства характеризуется надежностью, воспроизводимостью и точностью. Для улучшения вдыхания ингаляционное устройство может в некоторых случаях доставлять малые сухие частицы, например менее приблизительно 10 мкм, желательно приблизительно 1-5 мкм.
Введение композиций белкового каркаса в виде спрея.
Спрей, содержащий композицию белкового каркаса, может быть получен путем принудительного пропуска суспензии или раствора по меньшей мере одного белкового каркаса через сопло под давлением. Размер и конфигурации сопла, действующее давление и скорость подачи жидкости могут быть выбраны в соответствии с требуемыми результатами и размером частиц. Например, электрораспыление осуществляется с помощью электрического поля и подачи через капиллярную трубку или сопло. Преимуществом распылителя является то, что доставляемые им частицы по меньшей мере одной композиции белкового каркаса имеют размер менее 10 мкм, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 3 мкм.
Препараты по меньшей мере одной композиции белкового каркаса, подходящие для использования с распылителем, обычно включают композицию белкового каркаса в водном растворе с концентрацией по меньшей мере одной композиции белкового каркаса на мл раствора или мг/гм от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 100 мг или с любым диапазоном, его значением или частью. Препарат может включать такие вещества, как наполнитель, буфер, агент изотонического действия, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Препарат может также включать наполнитель или вещество для стабилизации композиции белковых каркасов, например буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. К белкам-наполнителям, пригодным для приготовления композиций белкового каркаса, относятся альбумин, протамин и т.п. К типичным углеводам, пригодным для приготовления композиций белкового каркаса, относятся сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза и т.п. Препарат композиции белкового каркаса может также содержать поверхностно-активное вещество, способное уменьшить или предотвратить агрегацию композиции белкового каркаса на поверхности, вызываемую превращением раствора в аэрозоль. Можно использовать ряд традиционных поверхностно-активных веществ, таких как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты и полиоксиэтиленсорбитано-вые эфиры жирных кислот. Количества, как правило, составляют от 0,001 до 14 вес.% препарата. Наиболее предпочтительными поверхностно-активными веществами для целей настоящего изобретения являются полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 и т.п. В препарат могут быть также включены известные из уровня техники дополнительные вещества, подходящие для добавления в препарат белка, такого как белковый каркас, его указанные части или варианты.
Введение композиций белкового каркаса с помощью небулайзера.
Композиции белкового каркаса по изобретению могут вводиться с помощью небулайзера, например компрессорного или ультразвукового. В компрессорном небулайзере обычно используется источник сжатого воздуха для подачи струи воздуха через отверстие с высокой скоростью. По мере того как газ за соплом расширяется, возникает область низкого давления, под действием которой раствор композиции белкового каркаса подается через капиллярную трубку, соединенную с резервуаром с жидкостью. На выходе из капиллярной трубки поток жидкости разделяется на неустойчивые струи и капли, тем самым
образуется аэрозоль. Для достижения требуемых характеристик можно подобрать компрессорный небу-лайзер с соответствующими параметрами конфигурации, скорости потока и типа экрана. В ультразвуковом небулайзере высокочастотная электрическая энергия используется для создания механических колебаний, как правило, с помощью пьезоэлектрического преобразователя. Эта энергия передается препарату композиции белкового каркаса напрямую или через связующую жидкость, в результате чего образуется аэрозоль, содержащий композицию белкового каркаса. Преимуществом небулайзера является то, что доставляемые им частицы композиции белкового каркаса имеют размер менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно от приблизительно 1 мкм до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 мкм до приблизительно 3 мкм.
Препараты по меньшей мере одного белкового каркаса, подходящие для использования с компрессорным или ультразвуковым небулайзером, обычно содержат по меньшей мере один белковый каркас в концентрации от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 100 мг на мл раствора. Препарат может включать такие вещества, как наполнитель, буфер, агент изотонического действия, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Препарат может также включать наполнитель или вещество для стабилизации по меньшей мере одной композиции белкового каркаса, например буфер, восстановитель, белок-наполнитель или углевод. К белкам-наполнителям, пригодным для приготовления композиций, содержащих по меньшей мере один белковый каркас, относятся альбумин, протамин и т.п. К типичным углеводам, пригодным для приготовления композиций, содержащих по меньшей мере один белковый каркас, относятся сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза и т.п. Препарат композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, может также содержать поверхностно-активное вещество, способное уменьшить или предотвратить агрегацию композиции, содержащей по меньшей мере один белковый каркас, на поверхности, вызываемую превращением раствора в аэрозоль. Можно использовать ряд традиционных поверхностно-активных веществ, таких как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спирты и полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот. Количества, как правило, составляют приблизительно от 0,001 до 4 вес.% препарата. Наиболее предпочтительными поверхностно-активными веществами для целей настоящего изобретения являются полиоксиэтиленсорби-танмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 и т.п. В препарат могут быть также включены известные из уровня техники дополнительные вещества, подходящие для добавления в препарат белка, такого как белковый каркас.
Введение композиций белкового каркаса с помощью ингалятора отмеренных доз.
В ингаляторе отмеренных доз (MDI) пропеллент, по меньшей мере один белковый каркас и любые наполнители или другие добавки находятся в канистре в виде смеси, содержащей сжиженный сжатый газ. Срабатывание дозирующего клапана приводит к выпуску смеси в виде аэрозоля, предпочтительно содержащего частицы размером менее приблизительно 10 мкм, предпочтительно от приблизительно 1 мкм до приблизительно 5 мкм и наиболее предпочтительно от приблизительно 2 мкм до приблизительно 3 мкм. Требуемый размер частиц аэрозоля можно варьировать, используя различные способы приготовления композиции белкового каркаса, известные специалистам в данной области техники, в том числе размол на струйной мельнице, распылительную сушку, конденсацию в критических точках и т.п. Предпочтительными являются ингаляторы отмеренных доз, выпускаемые 3М или Glaxo и использующие в качестве пропеллента гидрофторуглерод. Препараты по меньшей мере с одним белковым каркасом для использования в ингаляторе отмеренных доз обычно включают мелкодисперсный порошок, содержащий по меньшей мере один белковый каркас в виде суспензии в неводной среде, например взвешенный в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Пропеллент может быть выбран из числа веществ, традиционно используемых в этих целях, например хлорфторуглерода, гидрохлорфторуглерода, гидрофторуглерода или углеводорода, в том числе трихлорфторметана, дихлордифторметана, тетраф-тордихлорэтана и 1, 1, 1,2-тетрафторэтана, HFA-134a (гидрофторалкана-134а), HFA-227 (гидрофторалка-на-227) и т.п. Предпочтительным пропеллентом является гидрофторуглерод. Поверхностно-активное вещество может служить таким целям, как стабилизация по меньшей мере одного белкового каркаса в виде суспензии в пропелленте, защита активного вещества от химической деградации и т.п. В качестве поверхностно-активных веществ могут быть использованы, в частности сорбитана триолеат, соевый лецитин, олеиновая кислота и т.п. В некоторых случаях предпочтительными являются аэрозоли растворов, в которых применяются разбавители, такие как этанол. В препарат белка могут быть также включены известные из уровня техники дополнительные вещества, подходящие для добавления в препарат белка. Средним специалистам в данной области техники будет ясно, что способы текущего изобретения могут быть достигнуты путем легочного введения по меньшей мере одной композиции белкового каркаса через устройства, не описанные в настоящем документе.
Пероральные препараты и введение.
Препараты для перорального введения предполагают совместное введение с адъювантами (например, резорцинами и неионогенными поверхностно-активными веществами, такими как полиоксиэтилена олеиловый эфир и n-гексадецил-полиэтилена эфир) для искусственного увеличения проницаемости стенок кишечника, а также совместное введение с ферментативными ингибиторами (например, ингибиторами трипсина поджелудочной железы, диизопропилфлуорофосфатом (DFF) и трасилолом) для подавле
ния ферментативной деградации. Препараты для доставки гидрофильных веществ, включая белки, белковые каркасы и комбинации по меньшей мере двух поверхностно-активных веществ, предназначенные для перорального, буккального, мукозального, назального, легочного, вагинального, трансмембранного или ректального введения, описаны в патенте США № 6309663. Активное соединение, входящее в состав твердой лекарственной формы для перорального введения, может быть смешано по меньшей мере с одной добавкой, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу, раффинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакант, гуммиарабик, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Эти лекарственные формы могут также содержать добавки других типов, например неактивный разбавитель, скользящее вещество, такое как стеарат магния, парабен, консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол, антиоксидант, такой как цистеин, дезинтегратор, связывающее вещество, загуститель, буферное вещество, подсластитель, ароматизатор, отдушку и т.п.
Таблетки и пилюли могут быть дополнительно покрыты кишечно-растворимой оболочкой. К жидким препаратам для перорального введения относятся эмульсия, сироп, эликсир, суспензия и раствор, подходящие для медицинского применения. Эти препараты могут содержать неактивные разбавители, традиционно используемые в данной области техники, например воду. В качестве систем доставки инсулина и гепарина также предложены липосомы (патент США № 4239754). В недавнем времени для доставки лекарственного средства были предложены микросферы из искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеиноидов) (патент США № 4925673). Кроме того, из уровня техники известны носители, описанные в патентых США №№ 5879681 и 5871753 и предназначенные для перорального введения биологически активных веществ.
Мукозальные препараты и введение.
Препарат для перорального введения биологически активного вещества, инкапсулированного в одном или нескольких биосовместимых полимерных или сополимерных наполнителях, предпочтительно в биоразлагаемых полимерах или сополимерах, таким образом представляющий собой микрокапсулы, которые в силу соответствующего размера способны обеспечить получение вещества групповыми лимфатическими фолликулами животного, называемыми также бляшками Пейера или GALT, без потери эффективности, характерной при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Аналогичные групповые лимфатические фолликулы содержатся в бронхах (BALT) и толстой кишке. Вышеуказанные ткани в целом называются лимфоретикулярными тканями, ассоциированными со слизистыми оболочками (MALT). К композициям и способам для введения по меньшей мере одного белкового каркаса через слизистые оболочки относится эмульсия, содержащая множество субмикронных частиц, мукоадгезивную макромолекулу, биологически активный пептид и непрерывную водную фазу, способствующую всасыванию через слизистые оболочки за счет мукоадгезии частиц эмульсии (патент США № 5514670). Способы введения эмульсий по настоящему изобретению через слизистые оболочки включают роговичный, конъюнк-тивальный, буккальный, сублингвальный, назальный, вагинальный, легочный, желудочный, кишечный и ректальный. Препараты для вагинального или ректального введения, например суппозитории, в качестве наполнителей могут содержать, например, полиалкиленгликоли, вазелин, масло какао и т.п. Препараты для интраназального введения могут быть твердыми и в качестве наполнителей содержать, например, лактозу, или могут быть водными либо масляными растворами в виде капель для носа. Для буккального введения могут применяться такие наполнители, как сахар, кальция стеарат, магния стеарат, прежелати-нированный крахмал и т.п. (патент США № 5849695).
Трансдермальные препараты и введение.
Для трансдермального введения по меньшей мере один белковый каркас инкапсулируется в средстве доставки, таком как липосомы или полимерные наночастицы, микрочастицы, микрокапсулы или микросферы (совместно именуемые микрочастицами, если не указано иного). Известен ряд приемлемых средств, в том числе микрочастицы из синтетических полимеров, таких как полигидроксикислоты, например полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры, полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены, и естественных полимеров, таких как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды и их комбинации (патент США № 5814599).
Препараты и введение, обеспечивающие пролонгированное действие.
Возможны ситуации, в которых однократно введенные соединения по настоящему изобретению должны доставляться пациенту в течение длительного периода времени, например от одной недели до одного года. Возможно применение различных лекарственных форм для замедленного высвобождения, пролонгированного действия или имплантации. К примеру лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединений, которая имеет низкую степень растворимости в жидкостях организма, например а) соль присоединения кислоты с многоосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памоевая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталина моно- или ди-сульфокислоты, поли-галактуроновая кислота и т.п.; b) соль с поливалентным катионом металла, таким как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и т.п., либо с органическим катионом, образованным, например, из N, N-дибензил-этилендиамина или этилендиамина, либо с) комбинации а) и
b), например соль танната цинка. Кроме того, соединения по настоящему изобретению или предпочтительно относительно нерастворимая соль, например, из числа вышеуказанных, могут быть получены в виде геля, в частности подходящего для инъекций гелеобразного алюминия моностеарата, например, с кунжутным маслом. Наиболее предпочтительными солями являются соли цинка, соли танната цинка, соли памоевой кислоты и т.п. Другой тип препарата замедленного высвобождения или пролонгированного действия для инъекций содержит соединение или соль, диспергированные для инкапсуляции в медленно деградирующем, нетоксичном, неантигенном полимере, таком как полимер полимолочной кисло-ты/полигликолевой кислоты, как описано, например, в патенте США № 3773919. Соединения или предпочтительно относительно нерастворимые соли, например, из числа вышеуказанных, могут быть также получены в виде капсул Silastic с холестериновым матриксом, особенно подходящих для использования у животных. В литературе также упоминаются другие препараты для замедленного высвобождения, пролонгированного действия или имплантации, например липосомы в виде газа или жидкости (патент США № 5770222 и "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker,
Inc., N.Y., 1978).
Приведенное выше общее описание изобретения дополнительно разъясняется далее с помощью примеров, которые представлены в качестве иллюстрации и не являются ограничивающими.
Примеры
Пример 1. Конструирование Tencon.
Третий домен FN3 человеческого тенасцина (SEQ ID NO: 3) может быть использован в качестве альтернативного каркаса, способного в результате некоторых трансформаций связываться со специфическими молекулами-мишенями через поверхностные петли, структурно аналогичные гипервариабельным участкам (CDR) антител. Температура плавления этого домена составляет 54°С в PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) в нативной форме. Для получения молекулы каркаса с аналогичной структурой и улучшенными физическими свойствами, например улучшенной термической стабильностью, была сконструирована консенсусная последовательность на основе сопоставления 15 доменов FN3 из человеческого тенасцина (SEQ ID NO: 1-15).
Анализ сопоставления последовательностей в табл. 1 показывает, что идентичность последовательностей между собой у этих 15 доменов составляет от 13 до 80%, при этом средняя идентичность последовательностей между парами равна 29%. Была сконструирована консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 16) путем включения сохранившейся лучше остальных (наиболее частой) аминокислоты в каждой позиции по результатам согласования, показанного в табл.1. В попарных сопоставлениях консенсус-ная последовательность по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 16), называемая Tencon, идентична доменам FN3 из тенасцина в 34-59% позиций, при этом средняя идентичность последовательностей равна 43%.
Экспрессия и очистка.
Последовательность аминокислот Tencon (SEQ ID NO: 16) подвергли обратной трансляции, получив последовательность ДНК, показанную на SEQ ID NO: 17. Эту последовательность сконструировали с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами, субклонировали с образованием модифицированного вектора рЕТ15, трансформировали в BL21Star(DE3) Е. coli (Invitrogen) и поместили на агаровые пластины с лизогенной культурой, содержащие 75 мкг/мл карбенициллина. Одну колонию выбрали и оставили на ночь для выращивания при 37°С в 50 мл богатой питательной среды, содержащей 2%-ную глюкозу и 100 мкг/мл карбенициллина. Эту культуру использовали для посева в 500 мл аутоиндукционной среды (Overnight Express Instant ТВ media, Novagen) в 2,5-л колбе Ultra Yield (Thomson Instrument Company). Выращивание и экспрессию осуществляли по двойной программе (3 ч при 37°С, 300 об/мин, затем 16 ч при 30 С, 250 об/мин) в шейкере-инкубаторе ATR Multitron.
Культуру собрали и центрифугировали при 7000 об/мин в течение 15 мин в роторе JL8.1 для осаждения клеток. Клетки ресуспендировали в 30 мл буфера, содержащего 20 мМ натрия фосфата, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 10%-ный глицерин, 20 мМ имидазола, 0,37 мг/мл лизоцима, ингибитор 1X Complete Protease (без EDTA; Roche) и Benzonase (Sigma-Aldrich, 0,25 мкл/мл оконч.), и лизировали с помощью соникатора XL2020 Misonix в течение 5 мин на льду в импульсном режиме (работа 5 с, пауза 30 с). Нерастворимый материал удалили центрифугированием при 17000 об/мин в течение 30 мин в роторе JA-17.
Белок Tencon отделили от растворимого лизата с помощью 2-этапного хроматографического процесса. Сначала белок зафиксировали путем аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, добавив в лизат 2 мл гранул агарозы Ni-NTA (Qiagen) и поместив его на качающуюся платформу на 1 ч при 4°С. Смолу затем поместили в колонку Poly-Prep (Bio-Rad) и промыли 20 мМ натрия фосфата, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 10%-ного глицерина и 20 мМ имидазола для удаления несвязанного материала. Белки элюировали из смолы с помощью 20 мМ натрия фосфата, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 10%-ного глицерина и 500 мМ имидазола. Фракции проанализировали с помощью SDS-PAGE, включая окрашивание Кумасси и вестерн-блоттинг с использованием HRP-конъюгированных антител к гистамину (Immunology Consultants Laboratory). Требуемые фракции объединили и диализовали в PBS рН 7,4. На второй стадии очистки белок загрузили в колонку Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare), уравновешенную в PBS. Фракции проанализировали с помощью SDS-PAGE, затем фракции, содержащие Tencon, объединили и концен
трировали в концентраторе Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).
Концентрацию белка определили с помощью измерительного устройства BioTek путем измерения оптической плотности пробы при 280 нм. Окончательный препарат проанализировали путем окрашивания Кумасси (фиг. 1), вестерн-блоттинга с использованием антител к гистамину и с помощью эксклюзи-онной ВЭЖХ в колонке G3000SW-XL (TOSOH Biosciences), уравновешенной в PBS. Анализ SDS-PAGE показывает, что масса Tencon варьируется от 6 до 14 кДа, что согласуется с ожидаемой массой 10,7 кДа для мономерного белка. Выход чистого белка Tencon составил > 50 мг чистого белка на литр культуры.
Биофизическая характеристика.
Структуру и стабильность Tencon характеризовали путем спектроскопии кругового дихроизма и дифференциальной сканирующей калориметрии соответственно. Измерения кругового дихроизма проводили на спектрометре AVIV при 20°С в PBS и в концентрации 0,2 мг/мл. Спектр на фиг. 2 показывает минимальное значение при 218 нм, свидетельствующее о структуре р листа, которую, как и предполагалось, должен иметь белок, принадлежащий семейству N3. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии были получены путем нагрева 0,5 мг/мл раствора 3-го домена FN3 из тенасцина или Tencon в PBS с 35 до 95°С со скоростью 1°С/мин в калориметре N-DSCII (Applied Thermodynamics). Отдельную кривую буфера удалили для получения профилей, показанных на фиг. 3. Исходя из этих данных с помощью программного обеспечения CpCalc (Applied Thermodynamics) рассчитали температуры плавления 54 и 78°С для 3-го домена FN3 и Tencon соответственно. Фолдинг и анфолдинг обоих доменов обратим при этих температурах.
Анализ иммуногенности.
Для сравнения предполагаемой иммуногенности последовательностей аминокислот, представляющих 3-й домен FN3 человеческого тенасцина, Tencon и несколько терапевтических антител (см. табл. 2), использовали компьютерную программу, моделирующую иммуногенность человека к последовательностям аминокислот. После анализа химерических моноклональных антител и человеческого монокло-нального антитела (адалимумаба) в программе применили порог толерантности (удалив 9-мерные пептиды, на 100% идентичные последовательности, кодируемой зародышевой линией человека). К тенасцину и Tencon порог толерантности не применяли. Порог толерантности предполагает широкую толерантность Т-клеток к последовательностям моноклональных антител, кодируемым зародышевой линией, и позволяет сосредоточить внимание на анализе новой последовательности преимущественно в CDR и фланкирующих доменах.
Результаты этих анализов позволяют предположить низкий иммуногенный риск тенасцина и Tencon исходя из вероятности того, что 9-мерный пептид, полученный из проанализированной последовательности, свяжет одну или несколько молекул HLA. Оценка является взвешенной по распространенности каждого аллеля HLA. Оценки для моделей были суммированы по каждой последовательности, чтобы получить одно число, описывающее общий предполагаемый иммуногенный риск каждой последовательности (суммарную оценку). Результаты этого анализа приведены в табл. 2. Тенасцин получил наименьшую общую оценку (11,9). Tencon, как и тенасцин, заработал баллы преимущественно за несвязы-вающие вещества и агретопы с низким предполагаемым иммуногенным риском (оценка=13,2). Оценки последовательностей тенасцина и Tencon оказались лучше оценок терапевтических антител.
Дисплей Tencon на фаге М13 путем соединения с pIX.
Ген, кодирующий последовательность аминокислот Tencon, субклонировали в экспрессионный вектор-фагмид рРер9 с помощью ПЦР и рестрикционного клонирования с частичным расщеплением, в результате чего получили вектор pTencon-pIX. Эта система экспрессирует N-терминально Мус-меченый Tencon как соединение С-конца с N-концом белка М13 pIX (фиг. 4). Промотор Lac обеспечивает низкий уровень экспрессии без IPTG и повышенный уровень экспрессии после добавления IPTG. К N-концу Tencon добавили сигнальную последовательность OmpA, чтобы способствовать эффективной транслокации в периплазму. Между Tencon и pIX сконструировали короткий линкер TSGGGGS (SEQ ID NO: 141) для предотвращения стерических взаимодействий между этими белками.
Чтобы подтвердить присутствие на поверхности фаговых частиц М13, pTencon-pIX трансформировали в XL1-Blue E. coli и одну колонию использовали для посева в 5 мл лизогенной культуры с добавлением ампициллина. Эту культуру выращивали при 37°С до достижения середины логарифмического роста, затем добавили 610 БОЕ фага-помощника VCSM13, и культуру инкубировали при 37°С в течение 10 мин без встряхивания, затем 50 мин со встряхиванием. Восстановленную с помощью фага-помощника культуру затем разбавили в 50 мл среды 2YT с добавлением ампициллина и канамицина и выращивали при 37°С со встряхиванием до достижения значения 0,7 у O.D.600, после чего добавили IPTG для получения окончательной концентрации 1 мМ, и понизили температуру до 30°С. Спустя 16 ч культуру центрифугировали при 4000 g в течение 20 мин, затем собрали супернатант и поместили его на хранение при 4°С для анализа.
Чтобы подтвердить присутствие композиции Мус-Tencon на поверхности фага М13, использовали связывание фаговых частиц с антителом к микоплазме (Invitrogen). Пластину Maxisorp оставили покрытой а-Мус или антителом анти-av (отрицательный контроль) на ночь при концентрации 2,5 мкг/мл и
блокировали с помощью SuperBlock T20 (Pierce). Вышеуказанный супернатант фагмидной культуры дважды последовательно разбавили в PBS и добавили в лунки покрытой пластины. Через 1 ч пластину промыли TBST, в каждую лунку добавили антитело a-M13 HRP и после инкубации в течение 1 ч промыли TBST. Добавили субстрат Roche BD ELISA POD и измерили люминесценцию с помощью измерительного устройства (Tecan). На фиг. 5 показано, что фаговые частицы Мус-Tencon связываются с a-myc, но не те лунки пластины, которые были покрыты антителами анти-av, и непокрытые контрольные лунки (в зависимости от концентрации), что подтверждает специфическое присутствие Мус-Tencon на фаговой частице М13.
Возможно сконструировать дополнительный вектор-фагмид для отображения Tencon и элементов библиотеки (см. пример 2) на фаге М13 в виде соединений с белком оболочки pIII. В этой системе ген для pIX заменяется геном, кодирующим усеченную версию pIII (Bass et al. 1990). К дополнительным изменениям по сравнению с системой, показанной на фиг. 4, относится замена сигнальной последовательности OmpA сигнальной последовательностью DsbA, поскольку известно, что секреция с использованием этой последовательности полезна для подтверждения присутствия стабильных альтернативных молекул каркаса (Steiner et al. 2006).
Пример 2. Генерация библиотек Tencon.
Библиотеки вариантов Tencon могут быть получены многими различными способами в зависимости от требуемой сложности и относительного расположения мутаций в молекуле. Для генерации мутаций, распределенных по гену Tencon, предпочтительны способы синтеза ДНК. Возможно также использование клонирования с помощью ферментов рестрикции, позволяющее рекомбинировать фрагменты ДНК, содержащие мутации в различных участках гена. Насыщающий мутагенез в узком участке, например одной петле Tencon, может быть введен методом направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов и олигонуклеотид-направленного мутагенеза (Kunkel et al. 1987).
Создали библиотеку Tencon, библиотеку FG7, предназначенную для замены петли FG на 7 случайных аминокислот с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Синтезировали олигонуклео-тид (TconFG7-For-5'pho) с вырожденной последовательностью NNS с 21 парой оснований (п.о.) в позициях, кодирующих петлю FG, и двумя фланкирующими последовательностями нуклеотидов с 20-27 п.о., комплементарных кодирующей последовательности Tencon. При такой конструкции все 20 аминокислот могут быть представлены в петле FG. Расчетное разнообразие на уровне нуклеотидов равно 1,3x10 .
GAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSCCGCTGTCTG
CGGAATTCAC
Матрицу для олигонуклеотид-направленного мутагенеза, pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-pIII, сконструировали путем замены последовательности, кодирующей петлю F:G Tencon, на последовательность типа "стебель-петля", содержащую сайт рестрикции AscI. Эта система допускает ликвидацию фоновой ДНК-матрицы после мутагенеза за счет расщепления полученной ДНК с помощью AscI до трансформации. Для очистки одноцепочечной ДНК-матрицы для мутагенеза одну колонию Е. coli CJ236, содержащую pDsbA-Tencon-Asc-петля-Мус-pШ, поместили в 5 мл питательной среды 2YT с карбенициллином (50 мкг/мл окончательной концентрации) и хлорамфениколом (10 мкг/мл). Спустя 6 ч добавили фаг-помощник VCSM13 до окончательной концентрации 1010 БОЕ/мл и инкубировали без встряхивания в течение 10 мин, затем перенесли в 150 мл 2YT с карбенициллином (10 мкг/мл) и уридином (0,25 мкг/мл) и инкубировали при 37°С со встряхиванием при 200 об/мин в течение ночи. Клетки осадили центрифугированием, супернатант собрали и фаг осадили с помощью PEG NaCl. Одноцепочечную ДНК получили из этого осадка с помощью набора QIAprep Spin M13 (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.
Чтобы ренатурировать вырожденный олигонуклеотид с ДНК-матрицей, 5 мкг ДНК-матрицы соединили с олигонуклеотидом TconFG7-For-5-pho с молярным отношением 10:1 в трис-HCl (50 мМ, рН 7,5) и MgCl2 (10 мМ) и инкубировали при 90°С в течение 2 мин, 60°С - в течение 3 мин и 20°С - в течение 5 мин. После реакции ренатурирования в реакционную смесь добавили АТР (10 мМ), dNTP (25 мМ каждый), DTT (100 мМ), Т4-лигазу (7 единиц) и Т7-ДНК-полимеразу (10 единиц) и инкубировали при 14°С в течение 6 ч, затем при 20°С - в течение 12 ч. Полученную ДНК очистили с помощью набора для очистки ПЦР (Qiagen) и восстановили в 100 мкл воды. Библиотеку ДНК расщепили с помощью 10 единиц AscI в течение 4 ч, затем снова очистили с помощью набора для очистки ПЦР (Qiagen). Окончательную библиотеку ДНК восстановили в 50 мкл воды. Полученную двухцепочечную ДНК трансформировали в Е. coli MC1061F' электропорацией.
Продукты трансформации собрали в 20 мл среды SOC и оставили восстанавливаться на 1 ч при 37°С. По завершении восстановления аликвот трансформации последовательно разбавили и посеяли на пластинах с карбенициллином (100 мкг/мл), содержащих 1%-ную глюкозу, для оценки общего количества продуктов трансформации. Оставшуюся культуру SOC затем использовали для посева в 1 л среды 2xYT с карбенициллином и 1 %-ной глюкозой, которую выращивали до достижения значения 0,6 у OD60(0 В 100 мл этой культуры посеяли фаг-помощник М13 до 1010/мл и инкубировали при 37°С, затем центри-
TconFG7-For5'pho: (SEQ ID NO: 18)
фугировали. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 500 мл свежей среды 2xYT, содержащей карбенициллин (100 мкг/мл) и канамицин (35 мкг/мл), и оставили на ночь для выращивания при 30°С, затем центрифугировали. Фаговые частицы осадили добавлением PEG/NaCl и поместили на хранение при -80°С.
Вторая библиотека, BC6/FG7, предназначалась для внесения разнообразия одновременно в петлях В:С и F:G Tencon. Для этого синтезировали два олигонуклеотида TC-BC6-For-5'phos и РОР149. Начальный олигонуклеотид был фосфорилирован и содержал 18 оснований кодона NNS в каждой позиции, кодирующей петлю В:С, в то время как конечный олигонуклеотид был биотинилирован на 5'-конце и содержал 21 основание кодона NNS в каждой позиции, кодирующей петлю F:G. Оба олигонуклеотида фланкируются двумя последовательностями нуклеотидов с 18 п.о., идентичными участку, идущему до и после участка, который подвергается мутагенезу (см. ниже сведения о праймере).
Tc-BC6-For-5'phos: (SEQ ID NO: 19)
gactctctgcgtctgtcttggNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTCGACTCTTTCCTGATCC
AGTACC
POP 2149: (SEQ ID NO: 20)
GTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNAACACCGTAGATAGAAA
Для конструирования библиотеки осуществили 16 ПЦР со 100 мкл с использованием t-олигонуклеотидов Tc-CB6-For5'phos и РОР2149 для амплификации ДНК-матрицы Tencon, при этом одновременно вводили кодоны NNS в петли В:С и F:G. Двухцепочечный продукт ПЦР смешали с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (Dynal), в буфере B &W (10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ EDTA, 2M NaCl, 0,1%-ный Tween-20), инкубировали в течение 20 мин, отделили с помощью магнитного поля и дважды промыли буфером B &W. Начальную цепь элюировали из частиц с помощью 300 мкл 150 мМ NaOH. Этот "мегапраймер", смесь длинных праймеров с теоретическим разнообразием свыше 8x1016, использовали для ренатурирования с матрицей одноцепочечной библиотеки. Библиотеку сконструировали по аналогии с вышеописанной библиотекой FG7.
Пример 3. Селекция связывающих веществ IgG.
Для селекции элементов библиотеки Tencon, связывающихся с IgG, рекомбинантный IgG (подтип человеческого IgG1) биотинилировали с помощью сульфо-№К-Ю-биотина (Pierce), затем подвергли диализу в PBS. Чтобы произвести селекцию, 200 мкл библиотек FG7 или BC6/FG7 на фаговом дисплее блокировали 200 мкл Chemiblocker, затем добавили биотинилированный IgG в концентрациях 500 нМ (стадия 1) или 100 нМ (стадии 2 и 3). Связанные фаги были восстановлены магнитными частицами, покрытыми нейтравидином (Seradyne), на стадии 1 и магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (Promega), на стадиях 2 и 3. Несвязанные фаги удалили с частиц путем 5-10 промывок 1 мл трис-буферного физиологического раствора с Tween (TBST), затем 2 раза по 1 мл трис-буферного физиологического раствора (TBS). Связанные фаги элюировали с частиц добавлением Е. coli MC1061F' на середине логарифмического роста. Пораженные клетки посеяли на агаровых пластинах с лизогенной культурой с добавлением карбенициллина и глюкозы. На следующий день клетки сняли с пластин и вырастили до середины логарифмического роста, затем восстановили с помощью фага-помощника VCSM13 и оставили на ночь для выращивания. Фаговые частицы выделяли осаждением с PEG/NaCl и использовали для следующей стадии селекции.
После 3 стадий пэннинга относительно IgG полученный продукт субклонировали до вектора рЕТ27, модифицированного таким образом, чтобы он включал лигаза-независимый сайт клонирования, путем ПЦР-амплификации гена Tencon. Этот продукт ПЦР ренатурировали с вектором и трансформировали в клетки BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). Отдельные колонии собрали в культуры по 1 мл на 96-луночных планшетах с глубокими лунками (Corning) и оставили на ночь для выращивания до насыщения при 37°С. На следующий день 50 мкл выросшей за ночь культуры использовали для посева свежего 1 мл культуры. Культуры выращивали при 37°С в течение 2 ч, затем добавили IPTG до 1 мМ, и понизили температуру до 30°С. Клетки собрали путем центрифугирования спустя 16 ч после индукции и лизировали 100 мкл BugBuster (Novagen). Полученные лизаты осветлили путем центрифугирования и использовали для проверки на предмет связывания с IgG методом ИФА.
Пластины Maxisorp (Nunc) покрыли 0,1 мкг антитела к гистамину (Qiagen) и оставили на ночь, затем промыли TBST и блокировали с помощью Starting Block T20 (Thermo Scientific). Осветленные лизаты, разведенные в соотношении 1:4 со Starting Block, добавили на пластины и оставили на 1 ч для связывания, затем промыли TBST. Биотинилированный IgG или биотинилированный HSA добавили в концентрации 1 мкг/мл и промыли TBST после инкубации в течение 1 ч. Детекцию связанного IgG или HSA осуществляли добавлением стрептавидин-HRP (Jackson Immunoresearch) и применением хемилюминес-центного субстрата POD. Результаты ИФА показаны на фиг. 7. Композиции, связавшие биотинилиро-ванный IgG в 10 раз больше, чем биотинилированный HSA согласно сигналу ИФА, секвенировали. После завершения нескольких селекционных экспериментов получили 60 уникальных связывающих после
довательностей из библиотеки FG7 и 10 уникальных последовательностей из библиотеки BC6FG7; в табл. 4 показаны репрезентативные последовательности связывающих веществ IgG, где петли В:С и/или F:G показаны в том объеме, в котором они отличаются от аналогичных в SEQ ID NO: 16. В табл. 4 также показаны многочисленные мутации в других участках каркаса.
Термальная стабильность сконструированного, экспрессированного и очищенного здесь белка Tencon на 26°С лучше этого показателя у 3-го домена FN3 из человеческого тенасцина, который использовался в качестве альтернативной молекулы каркаса. На основании этого повышения устойчивости можно предположить, что эта молекула каркаса с большой долей вероятности будет податливее для аминокислотной замены и проще в изготовлении. С повышением стабильности каркаса ожидается улучшение порога толерантности к мутациям, уменьшающим стабильность белка, поэтому каркас с повышенной стабильностью, вероятно, обеспечит более функциональные, оптимально фолдированные связывающие вещества из библиотеки вариантов каркаса. Поскольку этот новый белок не относится к белкам, кодируемым геномом человека, при использовании в терапевтических целях риск вызвать иммунный ответ у него ниже по сравнению, например, с нативным человеческим тенасцином (в целом с ним сопряжен меньший риск, чем в случае с лекарственным средством, основанным на домене дикого типа).
Для целей настоящего изобретения 70-100%-ная идентичность последовательности аминокислот или нуклеотидов (то есть 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 либо любой диапазон или значение из него) определяется с помощью подходящего компьютерного алгоритма, известного из уровня техники.
Очевидно изобретение может быть реализовано способами помимо конкретных способов, указанных в вышеприведенных описаниях и примерах. В соответствии с вышеуказанной информацией возможны многочисленные изменения и вариации настоящего изобретения, которые, таким образом, включаются в прилагаемую формулу изобретения.
Таблица 1
(1) 1 ДО ?0 ,30 ,40 ?С ?0 70 ?0 ?р_ 100
1 (1) - SPPKDLWTEVTEETVNLAWDN-EMRVTEYLVVYTPTH--EGGLEMQFRVPGDQTSTIIQELEPGVEYFIRVFAILENKKSIPVSABVAT
2 (V TYLPAPEGLKFKSIKErSVEVEWDPLDIAFBTWEIIFRNMN-KEDEGBITKSbRRPErSYBQTGLAPGQEYEISLHIVKNNTRGPGLKRVTTTRLD
3 (1) DAPSQIEVKDVTDTTALITMFKPLAEIDGIELTYGIKD-VPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLISKRGDMSSNPAKETFTT
4 (1) TGLDAPRNLRRVSQTDNSITLEWRNGKAAIDSYRIKYAPISGGDHAEVDVPKSQQATTKTTLTGLRPGTEYGIGVSAVKEDKESNPATINAATELDTPKD
5 (1) DTPKDLQVSETAETSLTLLWKTPLAKFDRYRLNYSLPT GOWVGVQLPRNTTSYVLRGLEPGQEYHVLLTAEKGRHKSKPAKSKPARVK
6 (1) -QAPELENLTVTEVGWDGLRLNWTAADQAYEHFIIQVQEAM-KVEAARNLTVPGSLRAVDIPGLKAATPYTVSIYGVIQGYRTEVLSAEASTGE
7 (1) -ETPH1GEVWAEVGWDALKLNWTAPEGAYEYFFIQVQEAD-TVEAAQNLTVPGGLRSTDLPGLKAATHYTITIRGVTQDFSTTPLSVEVLTE
8 (1) -EVPDMGNLTVTEVSWDALRLNWTTPDGTYDQFTIQVQEAD-QVEEAHNLTVPGSLRSMEIPGLRAGTPYTVTLHGEVRGHSTRPLAVEWTE
9 (1) -DLPQLGDLAVSEVGWDGLRLNWTAADNAYEHFVIQVQEVN-KVEAAQNLTLPGSLRAVDIPGLEAATPYRVSIYGVIRGYRTPVLSAEASTAKEPE--
10 (1) -KEPEIGNLNVSDITPESFNLSWMATDGIFETFTIEIIDSN-RLLETVEYNISGAERTAHISGLPPSTDFIVYLSGLAPSIRTKTISATATTE
11 (1) -ALPLLENLTISDINPYGFTVSWMASENAFDSFLVTWDSG-KLLDPQEFTLSGTQRKLELRGLITGIGYEVMVSGFTQGHQTKPLRAEIVTE
12 (1) -AEPEVDNLLVSDATPDGFRLSWTADEGVFDNFVLKIRDTK--KQSEPLEITLLAPERTRDLTGLREATEYEIELYGISKGRRSQTVSAIATTAM
13 (1) - GSPKEVIFSDITENSATVSWRAPTAQVESFRITYVPITG GT P SMVTVDGTKTQTRLVKLIPGVEYLVSIIAMKGFEES EPVSGS FTTAL
14 (1) - DGPSGLVTANITDSEALARWQPAIATVDSYVISYTGEK VPEITRTVSGHTVEYALT DLE PATEYTLRIFAEKGPQKS STITAKFTT DL
15 (1) DSPRDLTATEVQSETALLTWRPPRASVTGYLLVYESVD GTVKEVIVGPDTTSYSLADLSPSTHYTAKIQALNGPLRSNMIQTIFTTIGL
Последовательности:
SEQ ID No. 1:
sppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpthegglemqfrvpgdqtstiiqe lepgveyfirvfailenkksipvsarvat SEQ ID No. 2:
tylpapeglkfksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpets yrqtglapgqeyeislhivknntrgpglkrvtttrld SEQ ID No. 3:
dapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygikdvpgdrttidltedenqysig nlkpdteyevslisrrgdmssnpaketftt SEQ ID No. 4
tgldaprnlrrvsqtdnsitlewrngkaaidsyrikyapisggdhaevdvpksqqatt kttltglrpgteygigvsavkedkesnpatinaateldtpkd SEQ ID No. 5
dtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnyslptgqwvgvqlprnttsyvlrgl epgqeynvlltaekgrhkskpakskparvk SEQ ID No. 6
qapelenltvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravd ipglkaatpytvsiygviqgyrtpvlsaeastge SEQ ID No. 7
etpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvqeadtveaaqnltvpgglrstd lpglkaathytitirgvtqdfsttplsvevlte SEQ ID No. 8
evpdmgnltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsme ipglragtpytvtlhgevrghstrplavevvte SEQ ID No. 9
dlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviqvqevnkveaaqnltlpgslravd ipgleaatpyrvsiygvirgyrtpvlsaeastakepe SEQ ID No. 10
kepeignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertah isglppstdfivylsglapsirtktisatatte SEQ ID No. 11
alpllenltisdinpygftvswmasenafdsflvtvvdsgklldpqeftlsgtqrkle lrglitgigyevmvsgftqghqtkplraeivte SEQ ID No. 12
aepevdnllvsdatpdgfrlswtadegvfdnfvlkirdtkkqsepleitllapertrd ltglreateyeielygiskgrrsqtvsaiattam SEQ ID No. 13
gspkevifsditensatvswraptaqvesfrityvpitggtpsmvtvdgtktqtrlvk lipgveylvsiiamkgfeesepvsgsfttal SEQ ID No. 14
dgpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdl epateytlrifaekgpqksstitakfttdl SEQ ID No. 15
dsprdltatevqsetalltwrpprasvtgyllvyesvdgtvkevivgpdttsysladl spsthytakiqalngplrsnmiqtifttigl SEQ ID No. 16
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT SEQ ID No. 17
ctgccggcgccgaaaaacctggttgtttctgaagttaccgaagactctctgcgtctgt cttggaccgcgccggacgcggcgttcgactctttcctgatccagtaccaggaatctgaaaaag ttggtgaagcgatcaacctgaccgttccgggttctgaacgttcttacgacctgaccggtctga aaccgggtaccgaatacaccgtttctatctacggtgttaaaggtggtcaccgttctaacccgc tgtctgcggaattcaccacc
Последовательность Tencon, показывающая петли (SEQ ID NO:
16)
Петля A-B Петля B-C Петля C-D
1-LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEA
Петля D-E Петля E-F Петля F-G
INLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT-89
KQIPPIL (81)
LSLSSVL (82)
HMLLPLP (83)
V74A
MIGPLIP (84)
TIGPHIP (85)
EIGPCLP (86)
EIGPVLP (87)
KIGPCLP (88)
Y35H
MIGPVLP (89)
QIGPILP (90)
S52P
QIGPILP (90)
Q36R
QIGPILP (90)
EVGPILP (91)
QVGPLLP (92)
A23T
QIGPVMP (93)
QIGPCVP (94)
QIGPLVP (95)
RGLVMPM (96)
V74A
MIGPILP (97)
QIGPILP (90)
E37G
QIGPILP (90)
T68A
QIGPILP (90)
T22I
QIGPILP (90)
S52F
QIGPILP (90)
Y56H
QIGPILP (90)
A44V
QIGPILP (90)
P24S
RIGPILP (61)
CIGPMVP (98)
FIGPVLP (99)
HIGPILP (100)
HIGPIMP (101)
HIGPYLP (102)
HVGPILP (103)
IIGPLLP (104)
LIGPLLP (105)
MVGPLLP (10 6)
NIGPYLP (107)
NIGPYLP (108)
QIGPHLP (109)
QIGPIIP (46)
QIGPILG (110)
QIGPILS (111)
QIGPILT (112)
QIGPIMP (113)
QIGPIPI (114)
QIGPLLN (115)
QIGPLLP (62)
QIGPVFP (116)
QIGPVLS (117)
QIGPWLP (118)
QVGPILP (71)
QVGPILR (118)
QVGPIMN (119)
QVGPIMP (120)
QVGPIVP (121)
QVGPLLS (122)
QVGPVLP (12 3)
QVGPVLT (12 4)
100
RIGPIMP (125)
101
RIGPIVP (126)
102
RIGPMFP (127)
103
RIGPMIP (128)
104
RIGPMVP (129)
105
RIGPVIP (130)
106
RVGPILP (131)
107
RVGPLLP (132)
108
TVGPHIP (133)
<110> JACOBS, STEVEN О'NEIL, KARYN
<12 0> КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ КАРКАСА НА ОСНОВЕ ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА ТИПА III
<130> CEN5240PCT
<140> PCT/US2009/062200 <141> 2009-10-26
<150> 61/110120 <151> 2008-10-31
<160> 141
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 87
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val
15 10 15
Asn Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val
20 25 30
Tyr Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gin Phe Arg Val Pro
35 40 45
Gly Asp Gin Thr Ser Thr lie lie Gin Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu
50 55 60
Tyr Phe lie Arg Val Phe Ala lie Leu Glu Asn Lys Lys Ser lie Pro
65 70 75 80
Val Ser Ala Arg Val Ala Thr 85
<210> 2
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe Lys Ser lie Lys Glu
15 10 15
Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp lie Ala Phe Glu Thr
20 25 30
Trp Glu lie lie Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu Asp Glu Gly Glu lie
35 40 45
Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr Arg Gin Thr Gly Leu
50 55 60
Ala Pro Gly Gin Glu Tyr Glu lie Ser Leu His lie Val Lys Asn Asn
65 70 75 80
Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Val Thr Thr Thr Arg Leu Asp
85 90 95
<210> 3
<211> 88
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Ala Pro Ser Gin He Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala
15 10 15
Leu He Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu He Asp Gly He Glu Leu
20 25 30
Thr Tyr Gly He Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr He Asp Leu
35 40 45
Thr Glu Asp Glu Asn Gin Tyr Ser He Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr
50 55 60
Glu Tyr Glu Val Ser Leu He Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn
65 70 75 80
Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85
<210> 4
<211> 100
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
Thr Pro Lys Asp 100
<210> 5
<211> 88
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Thr Pro Lys Asp
1 5 Thr Leu Leu Trp Lys 20
Asn Tyr Ser Leu Pro 35
Asn Thr Thr Ser Tyr 50
Asn Val Leu Leu Thr 65
Lys Ser Lys Pro Ala 85
<210> 6
<211> 92
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gin Ala Pro Glu Leu
1 5 Gly Leu Arg Leu Asn 20
He He Gin Val Gin 35
Thr Val Pro Gly Ser 50
Ala Thr Pro Tyr Thr 65
Thr Pro Val Leu Ser 85
Leu Gin Val
Thr Pro Leu
Thr Gly Gin 40
Val Leu Arg 55
Ala Glu Lys 70
Arg Val Lys
Glu Asn Leu
Trp Thr Ala
Glu Ala Asn 40
Leu Arg Ala 55
Val Ser He 70
Ala Glu Ala
Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu
Gly Leu Glu Pro Gly Gin Glu Tyr 60
Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala
Thr Val Thr Glu Val Gly Trp Asp
10 15 Ala Asp Gin Ala Tyr Glu His Phe 25 30 Lys Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu 45
Val Asp He Pro Gly Leu Lys Ala 60
Tyr Gly Val He Gin Gly Tyr Arg
75 80 Ser Thr Gly Glu 90
<210> 7
<211> 91
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp
15 10 15
Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe
Phe He Gin Val Gin Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gin Asn Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala
50 55 60
Ala Thr His Tyr Thr He Thr He Arg Gly Val Thr Gin Asp Phe Ser
65 70 75 80
Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu
<210> 8
<211> 91
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp
15 10 15
Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gin Phe
20 25 30
Thr He Gin Val Gin Glu Ala Asp Gin Val Glu Glu Ala His Asn Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ser Met Glu He Pro Gly Leu Arg Ala
50 55 60
Gly Thr Pro Tyr Thr Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser
65 70 75 80
Thr Arg Pro Leu Ala Val Glu Val Val Thr Glu
<210> 9
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 9
Asp Leu Pro Gin Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Glu Val Gly Trp Asp
15 10 15
Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe
20 25 30
Val He Gin Val Gin Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gin Asn Leu
35 40 45
Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp He Pro Gly Leu Glu Ala
50 55 60
Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser He Tyr Gly Val He Arg Gly Tyr Arg
65 70 75 80
Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu
<210> 10
<211> 91
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 10
Lys Glu Pro Glu He Gly Asn Leu Asn Val Ser Asp He Thr Pro Glu
15 10 15
Ser Phe Asn Leu Ser Trp Met Ala Thr Asp Gly He Phe Glu Thr Phe
20 25 30
Thr He Glu He He Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr
35 40 45
Asn He Ser Gly Ala Glu Arg Thr Ala His He Ser Gly Leu Pro Pro
50 55 60
Ser Thr Asp Phe He Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser He Arg
65 70 75 80
Thr Lys Thr He Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu
<210> 11
<211> 91
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ala Leu Pro Leu Leu
1 5 Gly Phe Thr Val Ser 20
Leu Val Thr Val Val 35
Thr Leu Ser Gly Thr 50
Gly He Gly Tyr Glu 65
Thr Lys Pro Leu Arg 85
<210> 12
<211> 92
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 12
Ala Glu Pro Glu Val
1 5 Gly Phe Arg Leu Ser 20
Val Leu Lys He Arg 35
Thr Leu Leu Ala Pro 50
Ala Thr Glu Tyr Glu 65
Ser Gin Thr Val Ser 85
Glu Asn Leu Thr He Ser Asp He Asn Pro Tyr
10 15 Trp Met Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe
25 30 Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gin Glu Phe
40 45 Gin Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu He Thr
55 60
Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gin Gly His Gin
70 75 80
Ala Glu He Val Thr Glu 90
Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp
10 15 Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp Asn Phe
25 30 Asp Thr Lys Lys Gin Ser Glu Pro Leu Glu He
Glu Arg Thr Arg Asp Leu Thr Gly Leu Arg Glu
55 60
He Glu Leu Tyr Gly He Ser Lys Gly Arg Arg
70 75 80
Ala He Ala Thr Thr Ala Met 90
<210> 13
<211> 89
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 13
Gly Ser Pro Lys Glu Val He Phe Ser Asp He Thr Glu Asn Ser Ala
15 10 15
Thr Val Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gin Val Glu Ser Phe Arg He
20 25 30
Thr Tyr Val Pro He Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp
35 40 45
Gly Thr Lys Thr Gin Thr Arg Leu Val Lys Leu He Pro Gly Val Glu
50 55 60
Tyr Leu Val Ser He He Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro
65 70 75 80
Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu 85
<210> 14
<211> 88
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 14
Asp Gly Pro Ser Gly Leu Val Thr Ala Asn He Thr Asp Ser Glu Ala
15 10 15
Leu Ala Arg Trp Gin Pro Ala He Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val He
20 25 30
Ser Tyr Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu He Thr Arg Thr Val Ser Gly
35 40 45
Asn Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr
50 55 60
Thr Leu Arg He Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gin Lys Ser Ser Thr He
65 70 75 80
Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu 85
<210> 141 <211> 7 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность белкового каркаса на основе домена фибронектина человека типа III (FN3)
<400> 141
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), полученного из консенсусной последовательности домена FN3, включающий стадии
получения полипептида из консенсусной последовательности домена FN3, имеющего по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; и
осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронек-тина типа III (FN3).
2. Способ конструирования библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3), включающий стадии
получения полипептида, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 16; и осуществления замены или вставки аминокислот по меньшей мере в один остаток участка петли, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81, указанной последовательности, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16 для получения библиотеки белкового каркаса на основе домена фибронектина типа III (FN3).
кДа 188
98 62 49
38 28
17 14
N R Фиг. 1
15-
ность (грг
10-
Элл1
200 210 220 230 240 250 260
Длина волны (нм)
Фиг. 2
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
028304
028304
- 1 -
- 1 -
028304
028304
- 1 -
- 1 -
028304
028304
- 1 -
- 1 -
028304
028304
- 1 -
- 1 -
028304
028304
- 4 -
- 3 -
028304
028304
- 23 -
028304
028304
- 26 -
- 26 -
028304
028304
- 37 -
- 37 -
028304
028304
- 38 -
- 38 -
028304
028304
- 39 -
- 39 -
028304
028304
- 41 -
- 40 -
028304
028304
- 41 -
- 40 -
028304
028304
- 41 -
- 40 -
028304
028304
- 41 -
- 40 -
028304
028304
- 41 -
- 40 -
028304
028304
- 41 -
- 40 -
028304
028304
- 41 -
- 40 -
028304
028304
- 41 -
- 42 -
028304
028304
- 41 -
- 42 -
028304
028304
- 41 -
- 42 -
028304
028304
- 41 -
- 42 -
028304
028304
- 43 -
- 43 -
028304
028304
- 58 -
- 58 -
028304
028304
- 59 -
- 59 -