EA 027487B1 20170731

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000027487b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Трансгенное растение вида Solanum tuberosum или часть такого растения, в геном которого стабильно интегрированы первая двухцепочечная ДНК и вторая двухцепочечная ДНК для придания патогенной устойчивости к оомицету рода Phytophthora, при этом нуклеотидные последовательности кодирующих цепей первой и второй ДНК полностью или частично обратно комплементарны друг другу так, что это приводит к образованию двухцепочечной РНК, отличающееся тем, что первая ДНК включает: (а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последовательностей (а) или (б), либо (г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с нуклеотидной последовательностью в соответствии с (а), (б) или (в) в жестких условиях.

2. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что эти растения проявляют устойчивость к Phytophthora infestans.

3. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что двухцепочечная РНК представляет собой mi-РНК или si-РНК.

4. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что первая ДНК и вторая ДНК оперативно связаны по крайней мере с одним промотором.

5. Часть растения по п.1, отличающаяся тем, что она представляет собой семя или клетку.

6. Способ получения трансгенного растения вида Solanum tuberosum по п.1, проявляющего устойчивость к оомицету рода Phytophthora, состоящий из следующих шагов: (i) получение трансформированного растения первой родительской линии, содержащего первую двухцепочечную ДНК, которая стабильно интегрирована в геном родительского растения и которая включает: (а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последовательностей (а) или (б), либо (г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с нуклеотидной последовательностью в соответствии с (а), (б) или (в) в жестких условиях; (ii) получение трансформированного растения второй родительской линии, содержащего вторую двухцепочечную ДНК, которая стабильно интегрирована в геном родительского растения, при этом нуклеотидные последовательности кодирующих цепей первой и второй ДНК частично или полностью обратно комплементарны друг другу; (iii) скрещивание растения первой родительской линии с растением второй родительской линии; (iv) отбор растения, в геноме которого первая двухцепочечная ДНК и вторая двухцепочечная ДНК стабильно интегрированы для придания патогенной устойчивости к оомицету рода Phytophthora так, что при этом может образовываться двухцепочечная РНК.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная устойчивость является устойчивостью к Phytophthora infestans.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что двухцепочечная РНК представляет собой mi-РНК или si-РНК.

9. Композиция для наружной обработки растений для придания растению Solanum tuberosum устойчивости к оомиценту рода Phytophthora, содержащая двухцепочечную РНК, одна цепочка которой соответствует транскрипту двухцепочечной ДНК, включающей: (а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последовательностей (а) или (б), либо (г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с нуклеотидной последовательностью в соответствии с (а), (б) или (в) в жестких условиях.

10. Композиция по п.9 для придания устойчивости к оомицету рода Phytophthora, в частности к Phytophthora infestans.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

2. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что эти растения проявляют устойчивость к Phytophthora infestans.

3. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что двухцепочечная РНК представляет собой mi-РНК или si-РНК.

5. Часть растения по п.1, отличающаяся тем, что она представляет собой семя или клетку.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная устойчивость является устойчивостью к Phytophthora infestans.

8. Способ по п.6, отличающийся тем, что двухцепочечная РНК представляет собой mi-РНК или si-РНК.

10. Композиция по п.9 для придания устойчивости к оомицету рода Phytophthora, в частности к Phytophthora infestans.

Евразийское
патентное
ведомство
027487
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201500164
(22) Дата подачи заявки 2013.08.06
(51) Int. Cl. C12N15/82 (2006.01)
(54)
ТРАНСГЕННОЕ РАСТЕНИЕ ВИДА SOLANUM TUBEROSUM С УСТОЙЧИВОСТЬЮ К PHYTOPHTHORA
(31) 10 2012 016 009.7
(32) 2012.08.08
(33) DE
(43) 2015.05.29
(86) PCT/DE2013/000446
(87) WO 2014/023285 2014.02.13
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КВС СААТ АГ (DE)
(72) Изобретатель:
Шталь Дитмар Юрген, Темме Нора
(DE)
(74) Представитель:
Королева С.В. (BY) (56) DATABASE EMBL [Online], 28 January 2005 (2005-01-28), "PE006G1 mycelium, carbon starvation Phytophthora infestans cDNA, mRNA sequence", XP002717637, retrieved from EBI accession no. EM_EST:CV909836, Database accession no. CV909836, sequence
US-A1-2011167514
DATABASE EMBL [Online], 15 November 2012 (2012-11-15), "Sequence 12097 from patent US 8299318", retrieved from EBI accession
no. EM_PAT:GZ562039, Database accession no. GZ562039, sequence
PIETER VAN WEST ET AL.: "Internuclear Gene Silencing in Phytophthora infestans",
MOLECULAR CELL, vol. 3, no. 3, 1 March 1999 (1999-03-01), pages 339-348, XP055092086, ISSN:
1097-2765, DOI: 10.1016/S1097-2765(00)80461-X, cited in the application, the whole document
WO-A2-2006047495 WO-A2-2009112270
(57) В изобретении представлено трансгенное растение вида Solanum Tuberosum с устойчивостью к Phytophthora. Изобретение касается трансгенного растения вида Solanum tuberosum с устойчивостью к оомицету рода Phytophthora, трансгенных частей такого растения, способа их получения и композиции для наружной обработки растений. С одной стороны, представлены нуклеотидные последовательности SEQ ID NOS: 1-43 из Phytophthora, относящиеся к механизму индуцированного растением-хозяином сайленсинга генов в растениях картофеля, а с другой стороны - фунгицид для обработки растений.
Настоящее изобретение относится к трансгенному растению вида Solanum tuberosum с устойчивостью к оомицету рода Phytophthora, трансгенным частям такого растения, способу его получения и композиции для наружной обработки растений.
До сих пор фитофтороз, возбуждаемый Phytophthora infestans, является наиболее распространенной и самой экономически значимой болезнью картофеля.
Во всем мире ежегодные потери урожая картофеля, вызываемые этим патогеном, достигают более 20%. Растет стоимость таких потерь. Это требует применения дорогостоящих средств химической защиты растений, так как природные защитные механизмы растений для борьбы с P. infestans, приостановки развития болезни и ее подавления не являются достаточными и не действуют постоянно.
Известно, что такие природные защитные механизмы растений, как гиперчувствительная реакция в месте поражения, лигнификация клеточных стенок, образование PR-белков (имеющих отношение к патогенезу) и синтез фитоалексинов способствуют повышению устойчивости, но одновременно всегда сопровождаются большими энергетическими затратами у зараженных растений, а значит, приводят к снижению их продуктивности. Природные защитные механизмы растений включают также экспрессию так называемых генов устойчивости (R-генов), генные продукты которых взаимодействуют с генами авиру-лентности (Avr-гены) микробного патогена (ген-на-ген гипотеза) и таким образом включают специфические защитные реакции. Однако такая устойчивость может теряться в случае, когда, например, патоген P. infestans не участвует в синтезе Avr-генов, поэтому распознавание патогена и последующая специфическая защитная реакция у растения-хозяина не проявляются.
Fire et al. (1998) показали, что двухцепочечная РНК (ds-РНК) может запускать последовательность-специфическую деградацию гомологичной РНК. Исходя из этого, вскоре были созданы трансгенные растения, которые в результате индуцируемого растением-хозяином сайленсинга консервативных и главных генов, например, у нематод или насекомых семейства Lepidoptera и Coleoptera, по механизму РНК-интерференции (РНК-i), способны проявлять устойчивость к этим паразитам in vitro и in vivo.
Кроме того, было показано, что взаимодействие между растением-хозяином и фитопатогенным грибом может означать проявление индуцированного хозяином сайленсинга генов (host-induced gene silencing - HIGS) (EP 1716236).
Van West et al. (1999) вначале применили механизм сайленсинга генов Phytophthora для проведения функционального анализа этих оомицет-специфических генов.
В международной публикации WO 2006/070227 впервые описано применение РНК-интерференции для борьбы с грибными патогенами на основании контакта ds-РНК с грибными клетками вне грибной клетки. Здесь же предложен способ получения патоген-устойчивого растения. РНК-интерференция может быть направлена против одного или нескольких генов патогена, а также против нескольких патогенов. Гриб Phytophthora infestans назван в качестве возможного грибного патогена, а растение картофеля в качестве возможного растения-хозяина.
Предыдущие исследования дали начало гипотезе о том, что индуцируемый растением-хозяином сайленсинг генов не работает в отношении всех генов, поэтому для функционального сайленсинга важное значение имеет выбор целевых генов. Показано, например, что редуцирование Н+-АТФазы плазматической мембраны PnMA1 Phytophthora parasitica под действием индуцированного растением-хозяином сайленсинга генов не может быть значительным, чтобы обеспечить эффективную защиту от патогена (Zhang et al., 2011). Это также свидетельствует о первостепенном значении выбора целевых генов для обеспечения надежной защиты от патогенов (Yin et al., 2011).
Недавно была предложена система скрининга, призванная облегчить выбор подходящих генов паразита для создания конструкций сайленсинга в целях получения растений, устойчивых к патогенам (US 2010/0257634). Авторы идентифицировали также подходящие тест-конструкции для индуцирования фи-тоустойчивости картофеля. Целевые гены для этого определяли либо на основании биоинформационного анализа геномных последовательностей, либо на основе гомологии между последовательностями главных генов и факторов вирулентности известных модельных организмов. В этом документе отсутствуют какие-либо указания на гены по данному изобретению для создания устойчивости к оомицету рода Phy-tophthora.
Способ получения трансгенных растений с устойчивостью широкого спектра действия против многочисленных грибов раскрыт в международной публикации WO 2009/112270. По одному из вариантов осуществления способа по указанному изобретению устойчивость широкого спектра действия направлена против Uncinula necator, Plasmopora viticola, Uromyces spec., Phakopsora pachyrhizi, Erysiphe sp., а также против P. infestans.
В международной публикации WO 2006/047495 раскрыто получение растений картофеля, устойчивых к Phytophthora infestans, по механизму РНК-ьиндуцированного сайленсинга. С одной стороны, в данной публикации описано получение растений, несущих последовательности гена p-РНК Phytophthora infestans для РНК-интерференции.
Конструкция для сайленсинга, как показано в WO 2006/047495, направленная против гена p-РНК Phytophthora infestans, содержит 1-600 пар оснований (номер регистрации AJ54293), а также 32 п.о. кодирующего участка гена 18S p-РНК и целый кодирующий участок гена 5,8S p-РНК фузариозного патогена.
При выборе целевых генов для механизма HIGS, в целях применимости очень важно, чтобы она имела возможно более короткие, а предпочтительно вообще не имела, гомологии с генными последовательностями нецелевых организмов, превышающих 17 последовательных пар оснований. В противном случае при потреблении трансгенных растений, содержащих такие последовательности, или уборке урожая таких растений, экспрессия генов нецелевых организмов может подавляться (эффект "выключения" генов). Последовательность по WO 2006/047495 включает 32 п.о. гена 18S p-РНК P. infestans и имеет 100% сходство с гомологичной последовательностью гена 18S p-РНК человека (Homo sapiens), свиней (Sus scrofa) и крупного рогатого скота (Bos Taurus). Ежегодное потребление картофеля в Азии в 2005 г. составило 26 кг на человека, в Северной Америке - 58 кг и в Европе - 96 кг (FAOSTAT). В свете высокого уровня потребления картофеля людьми и животными последовательности p-РНК Phytophthora infestans, описанные в WO 2006/047495 в качестве целевых генов для механизма HIGS, делают содержащие их трансгенные растения непригодными для потребления в целях безопасности.
С другой стороны, в WO 2006/047495 раскрыто получение растений, которые несут последовательности гена катепсина В Myzus persicae и гена INF1 элиситина P. infestans для РНК-интерференции и таким образом проявляют устойчивость к двум растительным патогенам. Используемый при этом целевой ген INF1 кодирует элиситор. Устойчивость, основанная на элиситоре как факторе патогенности, не является преимуществом, так как ген INF1 элиситина не всегда требуется для заражения картофеля Phy-tophthora infestans (Kamoun., 1998).
Целью настоящего изобретения является получение трансгенного растения вида Solanum tuberosum, устойчивого к оомицету рода Phytophthora, и при этом пригодного для потребления.
Согласно изобретению поставленная цель достигается тем, что первая и вторая двухцепочечные ДНК стабильно интегрируются в трансгенное растение, при этом первая ДНК включает (а) нуклеотид-ную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последовательностей (а) или (б), либо (г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с одной из нук-леотидных последовательностей (а), (б) или (в) в жестких условиях.
Неожиданным образом было обнаружено, что первая ДНК этого типа особенно подходит для придания патогеноустойчивости растениям картофеля посредством индуцированного хозяином сайленсинга генов.
Первая и вторая ДНК стабильно интегрируются в геном трансгенного растения вида Solanum tube-rosum. Предпочтителен вариант стабильной интеграции обеих ДНК в хромосому растения. Однако возможна их интеграция и в экстрахромосомный элемент. Преимущество стабильной интеграции заключается в том, что эти ДНК могут передаваться следующим поколениям трансгенного растения.
Двухцепочечная ДНК состоит из кодирующей и некодирующей цепочек.
При этом нуклеотидная последовательность кодирующей цепочки второй ДНК является обратно комплементарной нуклеотидной последовательности кодирующей цепочки первой ДНК. Термин "обратно комплементарная", применяемый здесь в отношении нуклеотидной последовательности в 5'-3' ориентации, означает нуклеотидную последовательность в 3'-5' ориентации, основания которой, согласно правилам спаривания оснований, соответствуют основаниям первой ДНК и располагаются в обратно/зеркальной последовательности. Например, если нуклеотидная последовательность кодирующей цепочки первой ДНК имеет вид atggttc, то обратно комплементарная нуклеотидная последовательность кодирующей цепочки второй ДНК имеет вид gaaccat. Этот факт известен также как смысловая и соответствующая антисмысловая (обратно комплементарная) ориентация нуклеотидных последовательностей.
В частности, нуклеотидная последовательность кодирующей цепочки второй ДНК может быть обратно комплементарной нуклеотидной последовательности кодирующей цепочки первой ДНК по всей длине последовательности. В то же время она может быть только частично обратно комплементарной, т.е. обратно комплементарной по ограниченной длине. Нуклеотидная последовательность кодирующей цепочки второй ДНК может также быть обратно комплементарной по нескольким участкам, например двум или трем участкам своей длины по отношению к нуклеотидной последовательности кодирующей цепочки первой ДНК.
На основании полной или частичной обратной комплементарности нуклеотидных последовательностей кодирующих цепочек первой и второй ДНК образуется двухцепочечная РНК. Двухцепочечная структура РНК является результатом образования водородных связей между комплементарными нуклео-тидами. Участки двухцепочечной РНК могут образовываться по одной цепочке нуклеиновой кислоты, частично комплементарной самой себе, либо по двум разным прерывистым комплементарным цепочкам нуклеиновой кислоты. Образование водородных связей может быть как интрамолекулярным, так и интермолекулярным.
Согласно настоящему изобретению первая ДНК включает одну из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NOS: 1-43, при этом эти нуклеотидные последовательности являются нуклеотидными последовательностями выбранных целевых генов Phytophthora infestans. В группу этих целевых генов входят главные гены первичного метаболизма и синтеза аминокислот, в частности биосинтеза алифатиче
ских аминокислот (валина, лейцина, изолейцина) и биосинтеза глутамата, гены клеточной регуляции и сигнальной трансдукции, а также редокс-регуляции, гены сигнализации кальция, сигнализации G-белка, сигнализации MAP-киназы и факторов транскрипции, гены компонентов трансляционного аппарата, ген, выполняющий функции процессинга РНК, гены, кодирующие белки развития и дифференцировки, например, с функциями образования клеточных стенок, а также гены, которые кодируют транспортеры, канальные и мембранные белки. Перечень целевых генов Phytophthora, используемых для проектирования индуцированного хозяином сайленсинга генов, приведен в таблице.
№ пп/п
Целевой ген_Ш
Функция
Категория
Тип
РГГС_03410
Ацетолактатсинтаза
Биосинтез аминокислоты
PITG_00375
Гаусторий-специфический мембранный белок (Pihmp 1)
Развитие/ дифференци-ровка
PITG_13490
Урокиназа
Биосинтез глутамата
PITG_00146
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
Первичный метаболизм
PITG_00561
Биосинтез убихинона Со Q9
Первичный метаболизм
PITG_06732
Ацил-КоА-дегидрогеназа
Первичный метаболизм
PITG_07405
Пируваткиназа
Первичный метаболизм
PITG_12228
НАДН-цитохром-В5-редуктаза
Первичный метаболизм
PITGJ5476
Малатдегидрогеназа
Первичный метаболизм
PITGJ8076
Фосфоглицератмутаза
Первичный метаболизм
PITG 19736
Алкогольдегидрогеназа
Первичный
метаболизм
PITG_20129
Ацил-КоА-дегидрогеназа
Первичный метаболизм
PITG_00221
Триптофансинтаза
Биосинтез аминокислоты
PITGJ)5318
N-(5 '-фосфорибозил) антранилат-изомераза
Биосинтез аминокислоты
PITGJ3139
Треонинсинтаза
Биосинтез аминокислоты
PITG_00578
Имидазолон-пропионаза
Биосинтез глутамата
PITG_15100
Гистидин аммоний-лиаза
Биосинтез глутамата
PITG_11044
Протеинфосфотаза
Передача сигнала
PITG_21987
Протеинфосфотаза 2С
Передача сигнала
PITG_01957
Кальциневрин-подобная каталитическая субъединица А
Сигнализация кальция
PITG_02011
Субъединица В кальциневрина
Сигнализация кальция
PITGJ6326
Кальциневрин-подобная каталитическая субъединица А
Сигнализация кальция
PITG_00708
Тиоредоксин
Редокс-регуляция
PITG_00715
Тиоредоксин
Редокс-регуляция
PITG_00716
Тиоредоксин
Редокс-регуляция
PITG_09348
Глутаредоксин
Редокс-регуляция
РГГС_08393
PsGRl 1 рецептор, сопряженный с G-белком
Сигнализация G-белка
PITG_10447
Гомолог стресс-активируемой протеинкиназы (SAPK)
Сигнализация МАР-киназы
PITG_06748
Myb-подобный ДНК-связывающий белок
Фактор транскрипции
PITG_19177
С2Н2-транскрипционный фактор (PsCZFl гомолог)
Фактор транскрипции
PITG 06873
Аспартил-тРНК-синтетаза
Трансляция
PITG_09442
408-субчастица рибосомного белка S21
Трансляция
PITG 16015
Рибонуклеаза
РНК-процессинг
PITG_09306
PnMas2 гомолог
Развитие/ дифференцировка
PITG_03335
Каллоза-синтаза (Fks 1/2 гомолог)
Образование клеточной стенки
PITG 05079
Гликозилтрансфераза
Образование
(Fks 1/2 гомолог)
клеточной стенки
PITGJ8356
Белок, связанный с синтезом бета-глюкана (KRE6 гомолог)
Образование Клеточной стенки
PITG 09193
Аквапорин
Канал
PITG_00562
Митохондриальный трикарбоксилатный переносчик
Транспортер
PITG_08314
Суперсемейство белков ABC
Транспортер
PITG_12289
Транслокация АТФазы с ионами Н или Na F-типа
Транспортер
PITG_12999
Транспортер MFS-суперсемейства
Транспортер
PITG_16478
Ацил-КоА-дегидрогеназа
Первичный метаболизм
Термин "сайленсинг генов" или сайленсинг означает процесс "выключения" генов. Сайленсинг может быть, например, транскрипционным или посттранскрипционным. Сайленсинг генов включает также антисмысловой механизм, РНК-i и ds-РНК.
Экспрессия нуклеотидной последовательности целевого гена Phytophthora infestans селективно ин-гибируется путем сайленсинга генов. В этом случае целевая нуклеотидная последовательность может
быть представлена необработанной молекулой РНК, последовательностью мРНК или рибосомной РНК.
Целевые гены были идентифицированы на основании (i) общедоступных результатов исследований, например микроаррэй анализов дифференциации и заражения оомицетами, и общедоступных данных по исследованию метаболических процессов в ходе дифференциации и заражения оомицетами (Grenville-Briggs et al., 2005, Judelson et al., 2009a, Judelson et al., 2009b) (A), (ii) результатов тщательного анализа сравнительных биоинформационных исследований (BioMax Bioinformatic Framework) (В), (iii) результатов тщательного анализа метаболических путей, а также (iv) оценки общедоступных данных, касающихся характеристики гомологичных генов в эукариотических организмах (Roemer et al., 1994, Inoue et al., 1995, Mazur et al., 1995, Lesage et al., 2004, Avrova et al., 2008, Wang et al., 2009, Li et al., 2010, Wang et al., 2010) (D).
При выборе целевых генов обращалось внимание на то, чтобы нуклеотидные последовательности этих генов были P. infestans специфичными для исключения нежелательного сайленсинга генов растений и человека. Для этого белки выбранных целевых генов сравнивали с протеомом Solanum tuberosum и So-lanum lycopersicum (программа BlastX). Одновременно нуклеотиды в нуклеотидных последовательностях целевых генов сравнивали с геномом Solanum tuberosum, Solarium lycopersicum (программа BlastN), а также проводили общий поиск по подобию нуклеотидных последовательностей с помощью BlastN (критерии: BlastN; база данных: геномная последовательность человека + транскрипт; оптимальный результат: поиск сходных последовательностей (blastn)). Целевые гены считались весьма подходящими, если не имели гомологии с нуклеотидными последовательностями Solanum tuberosum и Solarium lycopersicum, а также не имели или имели только частичную гомологию по коротким участкам последовательностей ( < 17 нуклеотидов) в результате общего поиска по подобию с помощью BlastN, чтобы взаимосвязь с нук-леотидными последовательностями эндогенных генов растений ингибировалась или не происходила.
В соответствии с настоящим изобретением используемые нуклеотидные последовательности могут быть разной длины. Например, длина одной нуклеотидной последовательности SEQ ID NOS: 1-43 может составлять от 501 до 735 нуклеотидов.
Используемые нуклеотидные последовательности могут представлять собой один или несколько фрагментов одной или нескольких нуклеотидных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43. При этом фрагменты включают по крайней мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50,
60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 100,
1100, 1200 или 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400 или 2500 последовательных нуклеотидов одной или нескольких нуклеотидных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43. Особенно походящим фрагментом является фрагмент нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, состоящий из 290 нуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения используются комбинации из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более фрагментов из той же нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, либо из разных нуклеотидных последовательностей SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 или 43. Предпочтительная комбинация состоит из фрагментов нуклеотидных последовательностей SEQ ID NOS: 4, 23, 27 или 28, гены которых вовлечены в трансдукцию сигналов. Еще одна предпочтительная комбинация включает фрагменты нуклеотидных последовательностей SEQ ID NOS: 3, 16 и 17 генов биосинтеза глутамата P. infestans. Другие предпочтительные комбинации включают нуклеотидные последовательности или фрагменты нуклеотидных последовательностей генов образования клеточных стенок (SEQ ID NOS: 25, 36, 37), сигнализации кальция (SEQ ID NOS: 20, 21, 22), генов первичного метаболизма (SEQ ID NOS: 5, 6, 7), генов редокс-регуляции (SEQ ID NOS: 24, 25, 26), либо включают несколько нуклеотидных последовательностей или фрагментов нуклеотидных последовательностей генов-транспортеров в соответствии с SEQ ID NOS: 39, 40, 41, 42. Еще другие предпочтительные комбинации включают нуклеотидные последовательности или фрагменты нуклеотидных последовательностей различных групп целевых генов, например генов сигнализации G-белка, сигнализации MAP-киназы, генов первичного метаболизма и редокс-регуляции (SEQ ID NOS: 27, 28, 4, 23). Комбинирование нескольких целевых генов означает вероятность избежать возможную потерю устойчивости трансгенным растением вследствие естественной мутации оомицета.
Первая двухцепочечная ДНК, интродуцируемая в растение картофеля по данному изобретению, может иметь нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с одной из следующих нуклеотидных последовательностей: (а) нуклеотидной последовательностью SEQ ID NOS: 1-43, либо (б) фрагментом по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности SEQ ID NOS: 1-43, либо (в) нуклеотидной последовательностью, комплементарной одной из нуклеотидных последовательностей, упомянутых в (а), (б) или (в). Примеры жестких условий: гибридизация в 4xSSC буфере при 65°C и отмывка несколько раз в 0,1xSSC при 65°C в течение около 1 ч. Используемый здесь термин "жесткие условия гибридизации" может также означать: гибридизация при 68°C в буфере, содержащем 0,25 M фосфата натрия (pH 7,2), 7% SDS, 1 мМ EDTA и 1% BSA, в течение 16 ч и отмывка в двух сменах буфера 2xSSC и 0,1% SDS при температуре 68°C.
Более того, настоящее изобретение охватывает, в частности, такие фрагменты нуклеотидных последовательностей, которые включают несколько, например 1 или 2, нуклеотидов, не являющихся комплементарными последовательности целевого гена Phytophthora infestans. Изменения в последовательности, которые возникают, например, у оомицетов в результате генетической мутации, например, вследствие вставки, делеции или замены нуклеотидов, или генетического полиморфизма штамма Phytophthora in-festans и которые приводят к неправильному спариванию на участке из 1, 2 или нескольких нуклеотидов, могут допускаться до тех пор, пока РНК, образующаяся в трансгенном растении картофеля, все еще способна интерферировать с РНК целевого гена из оомицета.
В соответствии с настоящим изобретением трансгенное растение картофеля вида Solanum tubero-sum проявляет патогеноустойчивость к оомицету рода Phytophthora. Для определения степени устойчивости трансгенное растение картофеля сравнивали с контрольным растением, которое в идеале обладало генотипом, идентичным трансгенному растению, и выращивалось в идентичных условиях, но в котором отсутствовала ДНК, интродуцированная в трансгенное растение. Устойчивость можно определять, используя метод визуальной оценки по шкале от балла 0 (растение невосприимчивое) до балла 100 (растение очень восприимчивое). Предпочтительны трансгенные растения по данному изобретению с устойчивостью, вызывающей, по сравнению с контрольным растением, снижение пораженности поверхности растений по крайней мере на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100% (см. оценка устойчивости трансгенных растений картофеля в условиях открытого грунта).
Род Phytophthora включает различные виды, например, alni, cactorum, capsici, cinnamomi, citrophtho-ra, clandestina, fragariae, hedraiandra, idaei, infestans, ipomoeae, iranica, kernoviae, mirabilis, megakarya, nico-tianae, palmivora, parasitica, phaseoli, ramorum, pseuodotsugae, quercina, sojae или tentaculata.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансгенное растение картофеля проявляет устойчивость к Phytophthora infestans.
Проводившиеся испытания в лабораторных и полевых условиях показали, что в результате ингиби-рования биосинтеза алифатических аминокислот валина, лейцина и изолейцина конструкцией, направленной против ацетолактатсинтазы из P. infestans, пораженность фитофторой значительно падает, а устойчивость листьев существенно повышается. Комбинирование в одной конструкции нескольких целевых генов, например генов сигнализации G-белка, сигнализации MAP-киназы, первичного метаболизма, биосинтеза аминокислот и редокс-регуляции может приводить к еще большему повышению эффекта устойчивости, так как в этом случае использование патогеном альтернативных путей сигнализации и метаболических путей ингибируется комбинированной конструкцией с множественным действием.
Защитные свойства растений картофеля по данному изобретению против изолятов P. infestans с разной степенью агрессивности удивительным образом изменяются так, что растения приобретают устойчивость, которая эффективно и постоянно защищает их от этих наиболее важных патогенов.
Неожиданно было обнаружено, что приобретаемая устойчивость не требует от растений картофеля значительных энергетических затрат и не приводит к негативным изменениям их агрономических свойств. Опыты по культивированию растений в условиях, приближенных к полевым, не выявили какого-либо вредного воздействия на их качество. Тщательный выбор целевых генов P. infestans, исключающий любую гомологию длиной более 17 последовательных пар оснований с генами нецелевых организмов (картофель, человек, свиньи, крупный рогатый скот), означает отсутствие ограничений на использование растений в качестве продукта питания и корма, а также отсутствие ограничений на посев, выращивание, уборку и переработку урожая. Эти растения можно свободно использовать в качестве сельскохозяйственных, продуктов питания или корма.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения двухцепочечная РНК представляет собой mi-РНК или si-РНК. mi-РНК представляет собой короткую интеферирующую РНК и включает природные mi-РНК и синтетические mi-РНК, которые, например, можно получать рекомби-нантным путем или синтезировать химическим путем, а также путем процессинга первичной mi-РНК. si-РНК представляет собой короткую интерферирующую РНК и включает природные si-РНК и синтетические si-РНК, которые, например, можно получать рекомбинантным путем или синтезировать химическим путем, а также путем процессинга ds-РНК.
Из интродуцированной двухцепочечной ДНК у трансгенного растения продуцируется ds-РНК, которая подвергается процессингу по механизму РНК-i или сайленсинга эндогенных генов с образованием si-РНК и mi-РНК.
Для получения ds-РНК может быть использована первая двухцепочечная ДНК с нуклеотидной последовательностью в соответствии с одной из SEQ ID NOS: 1-43 или ее фрагментом в смысловой ориентации и вторая двухцепочечная ДНК в антисмысловой ориентации, которые разделены интроном, не имеющим сходства с целевыми генами, о которых идет речь. Как пример, ДНК с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 может быть направлена против гена ацетолактатсинтазы Phytophthora in-festans. При экспрессии в растительной клетке образуется транскрипт РНК, который вследствие гомологии между смысловыми и антисмысловыми участками последовательности способен к спариванию и образованию ds-РНК. Поскольку в области интрона недостает пар оснований, то ds-РНК образует шпилькообразную структуру. dsHK со шпилькообразной структурой можно также получить при помощи
одной двухцепочечной ДНК с нуклеотидной последовательностью в соответствии с одной из SEQ ID NOS: 1-43 в смысловой ориентации и другой - в антисмысловой ориентации различной длины. При этом нуклеотидная последовательность в смысловой ориентации может быть на почти 190 нуклеотидов длиннее, чем нуклеотидная последовательность в антисмысловой ориентации, и наоборот.
Определенные участки последовательности выбранных нуклеотидных последовательностей целевых генов амплифицируют, используя ПЦР, и клонируют в смысловой и антисмысловой ориентации в вектор, подходящий для синтеза шпилькообразных структур. При этом в один вектор могут быть клонированы несколько фрагментов с участками последовательностей разных целевых генов с целью образования комбинированной шпилькообразной конструкции. Векторы могут быть введены в растительную клетку при помощи методов трансформации, известных в области биотехнологии растений. Специалистам известно также, что, например, одна нуклеотидная последовательность какого-либо целевого гена может быть клонирована в один вектор в смысловой ориентации и эта же нуклеотидная последовательность этого же гена может быть клонирована в другой вектор в антисмысловой ориентации и затем введена в растительную клетку, например, путем ко-трансформации.
Механизм сайленсинга запускается ds-РНК, например, шпилькообразными структурами РНК или дуплексами генов. Из ds-РНК при помощи ds-РНК-специфической эндонуклеазы (dicer) образуются короткие ds-РНК, которые посредством более длинных нуклеотидных последовательностей преобразовываются в короткие фрагменты ds-РНК предпочтительно длиной 21-25 пар оснований, Этот процесс подобен процессу образования структур типа "стебель-петля", а также процессу образования длинных комплементарных ds-РНК-предшественников. Белки Argonaute, как центральные компоненты комплексов сайленсинга, индуцированного РНК (RISC), связывают и разматывают si-РНК и mi-РНК таким образом, что направляющая цепочка дуплекса специфически соединяется посредством спаривания оснований с m-РНК и вызывает ее деградацию. При помощи mi-РНК процесс РНК-i протекает сравнительно сходным образом с той лишь разницей, что получаемая mi-РНК содержит также частичные участки, которые не идентичны целевым генам.
После заражения растения-хозяина Phytophthora infestans между растением-хозяином и оомицетами может происходить обмен образующейся в растении РНК, которая направлена против одной или нескольких Phytophthora-специфических целевых последовательностей. У оомицетов эти РНК могут вызывать последовательность-специфический сайленсинг одного или нескольких целевых генов. В этом процессе возможно участие белков и белковых комплексов, таких как dicers, RISC (комплекс сайленсинга, индуцированного РНК), а также РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP).
Известно, что эффект si-РНК в растениях будет продолжаться, если RdRP будет синтезировать новые si-РНК из деградированных фрагментов m-РНК. Этот вторичный или транзитивный процесс РНК-i способен приводить к усилению сайленсинга, а также вызывать сайленсинг различных транскриптов, в которые входят эти высококонсервативные последовательности.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения первая ДНК и вторая ДНК оперативно связаны по крайней мере с одним промотором.
"Промотор" представляет собой нетранслируемую последовательность ДНК обычно в направлении вверх по течению от кодирующего участка, содержащего сайт связывания РНК-полимеразы и инициирующего транскрипцию ДНК. Промотор включает специальные элементы, которые функционируют как регуляторы экспрессии генов (например, cis-регуляторные элементы). Термин "оперативно связанный" означает, что ДНК содержащая интегрированную нуклеотидную последовательность, связывается с промотором таким образом, что он обеспечивает экспрессию этой нуклеотидной последовательности. Интегрированная нуклеотидная последовательность может связываться с последовательностью сигнала терминации транскрипции в направлении вниз по течению в качестве еще одного компонента.
Промотор может быть растительного, животного или микробного происхождения. Он может быть синтетического происхождения и может выбираться, например, из одной из следующих групп промоторов: конститутивных, индуцибельных, специфичных для развития, клеточно-специфичных, ткане-специфичных или органоспецифичных. Если конститутивные промоторы проявляют активность в большинстве ситуаций, то индуцибельные промоторы экспрессируются только в ответ на какой-нибудь сигнал, индуцируемый биотическими стрессами, например, такими как воздействие патогенов, либо абиотическими стрессами, такими как холод, засуха или применение химикатов.
Примерами промоторов являются конститутивный промотор CaMV 35S (Benfey et al., 1990), а также промотор C1, который проявляет активность в зеленой части ткани (Stahl et al., 2004).
Первая и вторая ДНК могут также оперативно связываться с двойным промотором, например, таким как двунаправленный активный промотор TR1' и TR2' (Saito et al., 1991).
Кроме того, первая и вторая ДНК могут каждая в отдельности оперативно связываться с промотором.
Использование двух промоторов, каждый из которых фланкирует молекулу нуклеиновой кислоты как с 3'-конца, так и с 5'-конца, вызывает экспрессию соответствующей индивидуальной цепочки ДНК, в которой происходит образование двух комплементарных РНК, которые гибридизуются и образуют одну ds-РНК. Более того, два промотора могут располагаться таким образом, что один из них дает начало
транскрипции выбранной нуклеотидной последовательности, а второй дает начало транскрипции нук-леотидной последовательности, комплементарной первой нуклеотидной последовательности. В результате транскрипции обеих нуклеотидных последовательностей образуется ds-РНК.
Кроме того, возможно расположение двунаправленного промотора, который вызывает экспрессию двух нуклеотидных последовательностей в обоих направлениях, при этом одна нуклеотидная последовательность считывается в направлении 3'-конца, а вторая нуклеотидная последовательность считывается в направлении 5'-конца. В результате комплементарности обеих нуклеотидных последовательностей образуется ds-РНК.
Настоящее изобретение относится также к частям трансгенного растения вида Solanum tuberosum.
В контексте данной заявки термин "части" трансгенного растения, в частности, означает семена, корни, листья, соцветия, а также клетки растения по данному изобретению. Термин "клетки" следует понимать как означающий, например, изолированные клетки с наличием клеточной стенки и их агрегаты, а также их протопласты. Термин "трансгенные части" трансгенного растения означает также части, урожай которых можно собирать, например, клубни картофеля.
Более того, настоящее изобретение касается способа получения трансгенного вида Solanum tubero-sum с устойчивостью к оомицету рода Phytophthora.
В биотехнологии растений известны подходящие методы трансформации растительных клеток. Каждый из этих методов может быть использован для инсерции выбранной нуклеиновой кислоты, предпочтительно в вектор, в растительную клетку с целью получения трансгенного растения согласно настоящему изобретению. Методы трансформации могут включать методы прямой и косвенной трансформации и использоваться для трансформации двудольных растений и прежде всего для трансформации однодольных растений. К подходящим методам прямой трансформации относятся PEG-индуцированный захват ДНК, перенос ДНК в составе липосом, биолистические методы бомбардировки частицами, элек-тропорация и микроинъекция. Примерами методов косвенной трансформации являются методы трансформации, индуцированной агробактериями, или заражения вирусами с использованием вирусных векторов.
Предпочтительным используемым методом трансформации является индуцированный агробакте-риями перенос ДНК при помощи бинарных векторов. После трансформации растительных клеток производят отбор трансформированных клеток по одному или нескольким маркерам с введенной ДНК по данному изобретению и содержащих гены, предпочтительно индуцирующие устойчивость к антибиотикам, например ген неомицинфосфотрансферазы II (NPTII), обеспечивающий устойчивость к канамицину, и ген гигромицинфосфотрансферазы II (HPTII), обеспечивающий устойчивость к гигромицину.
Трансформированные клетки регенерируют в целые растения. После переноса ДНК и регенерации осуществляется проверка полученных растений методом количественной ПЦР на присутствие в них ДНК по данному изобретению. Затем следуют тесты на устойчивость этих растений к Phytophthora in-festans in vitro и в условиях теплицы. В дальнейшем соответственно подготовленным персоналом могут проводиться стандартные фенотипические исследования в условиях теплицы и открытого грунта. Исследуемые трансформированные растения можно высаживать сразу в грунт.
Способ получения трансгенного растения вида Solanum tuberosum с устойчивостью к оомицету рода Phytophthora согласно данному изобретению состоит из следующих шагов:
(i) получение трансформированного растения первой родительской линии, содержащего первую двухцепочечную ДНК, которая стабильно интегрирована в геном родительского растения и включает (а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последовательностей (а) или (б), либо (г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с одной из нуклеотидных последовательностей (а), (б) или (в) в жестких условиях;
(ii) получение трансформированного растения второй родительской линии, содержащего вторую двухцепочечную ДНК, которая стабильно интегрирована в геном родительского растения, при этом нук-леотидные последовательности кодирующих цепочек первой и второй ДНК частично или полностью обратно комплементарны друг другу;
(iii) скрещивание растения первой родительской линии с растением второй родительской линии;
(iv) отбор растения, в геноме которого первая двухцепочечная ДНК и вторая двухцепочечная ДНК стабильно интегрированы для придания патогеноустойчивости к оомицету рода Phytophthora так, что при этом может образовываться двухцепочечная РНК.
Согласно данному изобретению эта ds-РНК представляет собой нуклеотидную последовательность или фрагмент нуклеотидной последовательности SEQ ID NOS: 1-43 Phytophthora infestans.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения двухцепочечная РНК может быть mi-РНК или si-РНК.
Изобретение касается также композиции для наружной обработки растений.
Композиция для наружной обработки растений готовится следующим образом. Она включает двух-цепочечную РНК, в которой одна ее цепочка соответствует транскрипту двухцепочечной ДНК, содер
жащей (а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо (в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотид-ных последовательностей (а) или (б), либо (г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизиру-ется с одной из нуклеотидных последовательностей (а), (б) или (в) в жестких условиях.
Двухцепочечная РНК для приготовления композиции согласно данному изобретению может быть получена in vitro с использованием известных специалистам методов. Например, двухцепочечная РНК может быть синтезирована in vitro непосредственно по РНК-матрице. Двухцепочечная РНК может быть также синтезирована по матрице двухцепочечной ДНК с формированием m-РНК-транскрипта, который, например, затем образует шпилькообразную структуру.
Композиция по данному изобретению может использоваться в качестве фунгицида для обработки растения или его семян. В этом случае композиция используется для блокировки роста патогена, подавления его размножения и обработки зараженных растений. Например, композиция как фунгицид может применяться в виде спрея для опрыскивания или путем иного известного специалисту стандартного способа наружной обработки растительной ткани, либо для опыления почвы или добавления в почву до или после прорастания растений.
Еще одним вариантом применения композиции по данному изобретению является ее использование для предпосевной обработки семян. Для этого композицию вначале добавляют в субстрат-носитель и затем обрабатывают семена в комбинации, включающей двухцепочечную РНК и субстрат-носитель, при этом субстрат-носитель обладает, например, РНК-стабилизирующим эффектом. Таким образом, стабильность РНК и в результате ее воздействие на выбранные целевые гены Phytophthora infestans могут усиливаться, например, вследствие таких химических модификаций, как замена рибозы на гексозу. Ли-посомы, которые инкапсулируют молекулы РНК, могут использоваться в качестве РНК-стабилизаторов.
В идеальном варианте осуществления изобретения растениями, подлежащими обработке композицией, являются растения вида Solanum tuberosum.
Все вышесказанное в отношении получения растения по настоящему изобретению и способа его получения относится также к композиции.
Изобретение иллюстрируется ссылками на следующие чертежи и перечни последовательностей.
Фиг. 1 - плазмида рРНК-i как пример вектора, который может быть использован для образования шпилькообразных конструкций, направленных против целевого гена.
Вектор содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S.
Фиг. 2 - плазмида рРНК-i_PITG_03410 как пример вектора, содержащего фрагмент интрона в смысловой-антисмысловой ориентации для образования ds-РНК, направленной против целевого гена (здесь PITG 03410). Вектор дополнительно содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S.
Фиг. 3 - плазмида рРНК-iHIGSCoA как пример вектора, содержащего различные определенные последовательности фрагмента интрона в смысловой-антисмысловой ориентации, который должен приводить к образованию ds-РНК, направленной против различных целевых генов. Вектор дополнительно содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S.
Фиг. 4 - плазмида pGBTV/EcoRI_kan. Бинарная Ti-плазмида, которая использовалась в качестве вектора клонирования.
Фиг. 5 - плазмида pGBTV/EcoRI_kan_PITG_03410. Бинарная Ti-плазмида, которая использовалась для трансформации, индуцированной агробактериями.
Фиг. 6 - плазмида pAM, которая использовалась в качестве вектора клонирования.
Фиг. 7 - плазмида pAM_HIGS_CoA, как пример одной из плазмид, использовавшейся в качестве вектора клонирования.
Фиг. 8 - плазмида p95P-Nos. Бинарная Ti-плазмида, которая использовалась в качестве вектора клонирования.
Фиг. 9 - плазмида p95N_HIGS_CoA. Бинарная Ti-плазмида, которая использовалась для трансформации, индуцированной агробактериями.
Фиг. 10 - плазмида p95N_HIGS_dP-РНК-i_PITG_03410 как пример бинарного вектора для образования ds-РНК, направленной против целевого гена (здесь PITG 03410), с использованием двух промоторов CaMV 35S, каждый из которых фланкирует молекулу нуклеиновой кислоты с 3'-конца и 5'-конца.
Фиг. 11 - побег трансгенного растения на селективной среде на стадии регенерации после трансформации.
Фиг. 12 - диагностическое тестирование на основе ПЦР на трансгенность растений картофеля (PR-H4) после трансформации бинарным вектором pGBTV/EcoRI_kan_PITG_03410. Детекция смыслового
фрагмента (370 п.о.) (праймер S334 5'-ATCCCACTATCCTTCGCAAG-3'xS1259 5'-TTGATATCGCGGAAGGCGAGAGAAGACATCG-3') и антисмыслового фрагмента (450 п.о.) (S329 5'-CTAAGGGTTTCTTATATGCTCAAC-3'xS1259 5'-TTGATATCGCGGAAGGCGAGAGAACATCG-3'). Реакционная смесь: PCR-MasterMix, PCR monitoring. Маркер: TrackIt(tm) 1 Kb ДНК Ladder.
Фиг. 13 - детекция si-РНК в трансгенных растениях картофеля после трансформации бинарным вектором pGBTV/EcoRI-kan_PITG_03410 (А) и бинарным вектором p95N_HIGS_PITG_00375 (В). Детекцию проводили методом Нозерн-блот гибридизации с использованием радиоактивно меченного зонда ds-РНК_PITG03410 (А) или радиоактивно меченного зонда ds-РНК_PITG00375 (В). А: Многократное использование различных проб линий PR-H4_T007 и T011. В: Однократное использование проб линий PR-H2T040, T045, Т047 и Т049.
Фиг. 14А - плазмида pABM-70Sluci_ds-РНК.PITG_00375 как пример вектора, содержащего фьюжн конструкцию, включающую репортерный ген люциферазы и тестовый целевой фрагмент PITG_00375 для механизма HIGS. Вектор дополнительно содержит двойной промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, кодирующую последовательность гена luc Photinus pyralis, который кодирует люци-феразу и выделен из модифицированного интрона PIV2 картофельного гена St-LS1 (Eckes et al., 1986, Vancanneyt et al., 1990), еще один сайт множественного клонирования, а также Nos-терминатор гена но-палинсинтазы Agrobacterium tumefaciens.
Фиг. 14В - плазмида pABM-70Sluci_ds-РНК.PITG_03410 как пример вектора, содержащего фьюжн конструкцию, включающую репортерный ген люциферазы и тестовый целевой фрагмент PITG_03410 для механизма HIGS.
Фиг. 15А - относительная активность люциферазы трансгенных линий картофеля генотипа Baltica со стабильной интеграцией конструкции HIGS_РНК-i, направленной против гена PITG 03410 P. infestans, после бомбардировки частицами, нагруженными вектором pABM-70Sluci_ds-РНК.PITG_03410. В: Baltica (нетрансгенный контроль); T003, Т005: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 15В - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Baltica трансформировали с помощью конструкцией РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 03410 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Baltica (в среднем в 4-кратной биологической повторности). В: Baltica (нетранс-генный контроль); T003, Т005: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 16А - относительная активность люциферазы трансгенных линий картофеля генотипа Hermes со стабильной интеграцией конструкции HIGS_РНК-i, направленной против гена PITG 03410 P. infestans, после бомбардировки частицами, нагруженными вектором pABM-70Sluci_ds-РНК.PITG_03410. H: Hermes (нетрансгенный контроль); Т004, Т011: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 16В - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Hermes трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 03410 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Baltica (в среднем в 4-кратной биологической повторности). Н: Hermes (нетранс-генный контроль); Т004, T011: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 17А - относительная активность люциферазы трансгенной линии картофеля генотипа Desiree со стабильной интеграцией конструкции HIGS_РНК-i, направленной против гена PITG 03410 P. infestans, после бомбардировки частицами, нагруженными вектором pABM-70Sluci_ds-РНК.PITG_03410. D: Desiree (нетрансгенный контроль), Т098: трансгенная линия картофеля на основе HIGS.
Фиг. 17В - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенной линии на основе HIGS. Линию картофеля сорта Desiree трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 03410 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этой линии отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Baltica (в среднем в 4-кратной биологической повторности). D: Desiree (нетранс-генный контроль); Т098: трансгенная линия картофеля на основе HIGS.
Фиг. 18А - относительная активность люциферазы трансгенных линий картофеля генотипа Desiree со стабильной интеграцией конструкции HIGS_РНК-i, направленной против гена PITG 00375 P. infestans, после бомбардировки частицами, нагруженными вектором pABM-70Sluci_ds-РНК.PITG_00375. D: Desiree (нетрансгенный контроль); Т042, T044, T047, T049: трансгенные линии картофеля на основе
HIGS.
Фиг. 18В - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий HIGS. Линии картофеля сорта Desiree трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 00375 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с не-трансгенным сортом Baltica (в среднем в 4-кратной биологической повторности). D: Desiree (нетрансген-ный контроль); Т042, Т044, Т047, Т049: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 19А - степень пораженности трансгенных линий картофеля генотипа Hermes со стабильной интеграцией конструкции HIGS_РНК-i, направленной против гена PITG 03410 P. infestans после заражения растений P. infestans в условиях, приближенных к естественным. Серый треугольник: Baltica, Desiree и Russet Burbank (нетрансгенный контроль); черный квадрат: растения генотипа Hermes; сплошная линия: Hermes (нетрансгенный контроль); пунктирная линия: PR-H-4-7 и штриховая линия: PR-H-4-11: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 19В - фотодокументирование степени пораженности трансгенных линий PR-H-4-7 и PR-H-4-11 картофеля генотипа Hermes со стабильной интеграцией конструкции HIGS_РНК-i, направленной против гена PITG 03410 P. infestans после заражения растений P. infestans в условиях, приближенных к естественным, по сравнению с нетрансгенным контролем Hermes. Фотографии сделаны через 32 дня после заражения.
Фиг. 20 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Russet Burbank трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 03410 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Russet Burbank (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Russet Burbank (нетрансгенный контроль); Н-4-Т084, Н-4-Т096: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 21 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Hermes трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК под контролем конструкции двойного промотора HIGS_d-РНК-i_PITG_03410, направленной против гена PITG 03410 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Hermes (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Hermes (нетрансгенный контроль); Н-23-
Т0003, Н-23-Т026, Н-23-Т038, Н-23-Т062, Н-23-Т063, Н-23-Т066: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 22 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Russet Burbank трансформировали с помощью конструкции РНК-i_HIGS_CoA для образования ds-РНК, направленной против генов PITG 00146, PITG 08393, PITG_10447 и PITG_00708 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Russet Burbank (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Russet Burbank (нетрансгенный контроль); Н-13-Т050, Н-13-Т053, Н-13-Т036, Н-13-Т032: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 23 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Russet Burbank трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 06748 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Russet Burbank (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Russet Burbank (нетрансгенный контроль); Н-15-Т008, Н-15-Т010: трансгенные линии картофеля на основе
HIGS.
Фиг. 24 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенной линии на основе HIGS. Линию картофеля сорта Russet Burbank трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 09306 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этой линии отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Russet Burbank (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Russet Burbank (нетрансгенный контроль); Н-10-Т111: трансгенная линия картофеля на основе HIGS.
Фиг. 25 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Russet Burbank трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 09193 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Russet Burbank (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Russet Burbank (нетрансгенный контроль); Н-12-Т194, Н-12-Т195, Н-12-Т222, Н-12-Т239: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 26 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Desiree трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG 09193 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Desiree (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Desiree (нетрансген-ный контроль); Н-12-Т187, Н-12-Т216, Н-12-Т237, Н-12-Т245: трансгенные линии картофеля на основе
HIGS.
Фиг. 27 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенных линий на основе HIGS. Линии картофеля сорта Russet Burbank трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG19177 P. infestans. После заражения P. infestans
методом изолированных листьев у этих линий отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Russet Burbank (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Russet Burbank (нетрансгенный контроль); Н-9-Т271, Н-9-Т305, Н-9-Т308: трансгенные линии картофеля на основе HIGS.
Фиг. 28 - относительные показатели образования спорангиев P. infestans у трансгенной линии на основе HIGS. Линию картофеля сорта Desiree трансформировали с помощью конструкции РНК-i для образования ds-РНК, направленной против гена PITG19177 P. infestans. После заражения P. infestans методом изолированных листьев у этой линии отмечено уменьшение количества спорангиев по сравнению с нетрансгенным сортом Desiree (в среднем в 3-кратной биологической повторности). Desiree (нетрансген-ный контроль); Н-9-Т280: трансгенная линия картофеля на основе HIGS.
Фиг. 29 - плазмида p95N_РНК-i_PITG_06748 как пример вектора, содержащего фрагмент интрона в смысловой-антисмысловой ориентации для образования ds-РНК, направленной против целевого гена (здесь PITG_06748). Вектор дополнительно содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S.
Фиг. 30 - плазмида p95N_РНК-i_PITG_09306 как пример вектора, содержащего фрагмент интрона в смысловой-антисмысловой ориентации для образования ds-РНК, направленной против целевого гена (здесь PITG_09306). Вектор дополнительно содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S.
Фиг. 31 - плазмида p95N_РНК-i_PITG_09193 как пример вектора, содержащего фрагмент интрона в смысловой-антисмысловой ориентации для образования ds-РНК, направленной против целевого гена (здесь PITG_09193). Вектор дополнительно содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S.
Фиг. 32 - плазмида p95N_РНК-i_PITG_19177 как пример вектора, содержащего фрагмент интрона в смысловой-антисмысловой ориентации для образования ds-РНК, направленной против целевого гена (здесь PITG_19177). Вектор дополнительно содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S.
Примеры осуществления изобретения
Подготовка конструкций.
Определенные участки последовательностей выбранных целевых генов амплифицировали, используя ПЦР, и клонировали в смысловой и антисмысловой ориентации в вектор рРНК-i, подходящий для системы шпилькообразных структур (фиг. 2). Таким образом несколько фрагментов, несущих участки последовательностей разных целевых генов, могут быть клонированы в вектор для образования комбинированной шпилькообразной конструкции (фиг. 3).
С матрицы геномной ДНК Phytophthora infestans участок последовательности длиной 290 п.о. кодирующей области гена PITG 03410 амплифицировали с помощью ПЦР, расщепляли по сайтам рестрикции Xhol и Smal, введенным в последовательности праймеров, и клонировали в вектор рРНК-i (праймер 1: cgctcgaggctggatctcgcgctgaggt, праймер 2: ttgatatcgcggaaggcgagagacatcg). Этот вектор содержит промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, интрон гена AtAAP6, кодирующего аминокислотную пермеазу Arabidopsis thaliana, еще один сайт множественного клонирования, а также терминатор CaMV 35S. Вектор расщепляли с помощью Xhol и EcI136II. Фрагмент вектора 4098 кб сепарировали электрофорезом в агарозном геле и затем выделяли. Раствором для лигирования трансформировали клетки E. coli штамма XL1- Blue (Stratagene, LaJolla, CA). Этот же фрагмент PITG 03410 затем клонировали в плазмиду рРНК-i_PITG_03410-sense в антисмысловой ориентации. После этого снова амплифицировали фрагмент геномной ДНК Phytophthora infestans с помощью ПЦР, расщепляли по сайтам рестрикции Xhol и Smal, введенным в последовательности праймеров, и лидировали в вектор рРНК-i_PITG_03410_sense, который был расщеплен Smal-Sall и затем линеаризирован (фиг. 1). Фрагмент гена с интроном в смысловой-антисмысловой ориентации (РНК-i-PITG_03410) выгрезали из вектора рРНК-i и клонировали в вектор pGBTV/EcoRI_kan (фиг. 4). После этого оба вектора pGBTV/EcoRI_kan и рРНК-i_PITG_03410 расщепляли с помощью HindIII и лигировали до образования плазмиды pGBTV/EcoRI_kan_PITG_03410 (фиг. 5). В альтернативном варианте конструкции HIGS-РНК-i, такие как HIGS-CoA, сначала клонировали в вектор pAM (ДНК Cloning Service e.K., Гамбург) (фиг. 6). Оба вектора pAM и рРНК-i_PITG_03410 расщепляли с помощью HindIII и лигировали до образования плазмиды pAM_HIGS_CoA (фиг. 7). Из вектора pAM фрагмент HIGSCoA встраивали в вектор p95P-Nos (ДНК Cloning Service e.K., Гамбург) путем переваривания под действием фермента Sfil и лигирования (фиг. 8) до образования плазмиды p95N_HIGS_CoA (фиг. 9), которую использовали для трансформации картофеля.
Кроме вышеописанного вектора, подходящего для синтеза шпилькообразных структур, какой-либо отрезок кодирующего участка целевого гена картофеля можно "заставить" экспрессироваться с помощью двух противоположно (обратно) ориентированных промоторов (фиг. 10). Возможен и вариант сайлен
синга генов посредством искусственных micro-РНК конструкций (ami-РНК) с использованием протокола Web micro-РНК Designers (WMD3). Искусственные mi-РНК представляют собой одноцепочечные 21-mer РНК, которые можно синтезировать с целью специфической для желаемых генов негативной регуляции экспрессии в растениях. Регуляция происходит, как и в случае с si-РНК, посредством расщепления m-РНК. Эти конструкции РНК-i затем клонируются в бинарный вектор и подвергаются индуцированной Agrobacterium tumefaciens трансформации в растениях картофеля. Трансформация и регенерация.
Трансформацию растений картофеля осуществляли по модифицированному протоколу Pel et al. (2009) с использованием антибиотика канамицина. Донорский материал культивировали в 80 мл среды MS(D) (25°C; фотопериод день/ночь - 16/8 ч; 2000 лк) в течение 3-4 недель. Для трансформации (С1) из донорского материала вырезали междоузлия в качестве эксплантов длиной 0,5 см. Экспланты культивировали в чашках Петри с 10 мкл среды MS(D) (15-20 эксплантов на чашку) и 70 мкл культуры Agrobacte-rium tumefaciens, которую наращивали в течение ночи при 28°, а до этого подвергли трансформации конструкцией HIGS_РНК-i, являющейся частью бинарного вектора, например p95N, смесь инкубировали в течение 2 дней при 25°C в темноте. Затем экспланты высушивали на фильтровальной бумаге и помещали в чашки Петри на среду MSW с селективным антибиотиком (400 мг/л тиментина + 75 мг/л канамицина), которые герметично закрывали и культивировали в течение 2 недель (25°C; фотопериод день/ночь - 16/8 ч; 2000 лк) (C2). Операцию селекции повторяли раз в две недели до регенерации побегов (из C3). Регенерированные побеги (фиг. 11) инкубировали на среде MS (30 г/л сахарозы) с селективным антибиотиком (250 мг/л тиментина +100 мг/л канамицина), чтобы стимулировать у них процесс корнеоб-разования. С помощью ПЦР проводили проверку факта вставки конструкции, подлежащей трансформации, и, таким образом, факта присутствия нуклеиновых кислот по данному изобретению. Использование праймеров Во2299 (5'-GTGGAGAGGCTATTCGGTA-3') и Во2300 (5'-CCACCATGATATTCGGCAAG-3') приводило к амплификации фрагмента ДНК длиной 553 п.о. бактериального гена NPTII, кодирующего неомицинфосфотрансферазу. С помощью ПЦР осуществляли детекцию фрагмента в смысловой и антисмысловой ориентации, чтобы убедиться, что вставка конструкции была полной (фиг. 12). ПЦР проводили с использованием 10 нг геномной ДНК, праймера в концентрации 0,2 мкМ при температуре отжига 55°C в Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, США). Размножение побегов, давшее положительный результат ПЦР, проводили на питательной среде MS с добавлением 30 г/л сахарозы и 400 мг/л ам-пицилина.
Детекция процессированных двухцепочечной РНК и si-РНК.
В трансформированных растениях экспрессирующиеся шпилькообразные или двухцепочечные РНК подвергали процессингу по механизмам РНК-i в природных растениях таким образом, что эти молекулы РНК деградировались в короткие одноцепочечные РНК. Эти si-РНК размещаются на m-РНК соответствующего целевого гена в оомицетах и вызывают сайленсинг этого гена. В результате срабатывает механизм самозащиты растения от воздействия патогенов. Исходя из этой концепции, можно получать трансгенные растения картофеля с повышенной устойчивостью к P. infestans.
Особенность трансформации растений картофеля конструкциями для экспрессии шпилькообразных или двухцепочечных РНК должна заключаться в том факте, что процессинг получаемых в результате ds-РНК в si-РНК предпочтительно происходит по механизмам РНК-i в природных растениях. Для определения фрагментации ds-РНК из трансгенных растений выделяли целую РНК по методике с использованием тризола (Chomczynski and Sacchi, 1987). К 15 мкг целой РНК/пробу добавляли формамид, смесь денатурировали и разделяли электрофоретически в 1%-ном агарозном геле с 10%-ным формальдегидом в 1xMOPS буфере (0,2 М MOPS (соль натрия), 0,05 М NaOAc, 0,01 М EDTA в DEPC dH2O (pH 7,0) с NaOH). Выделенную РНК переносили из геля на нейлоновую мембрану (положительно зараженную), используя метод Нозерн-блоттинга, в 20xSSC буфер (цитратно-солевой буфер), осуществляли гибридизацию с радиоактивно меченным зондом, комплементарным последовательности фрагмента целевого гена, присутствовавшего в смысловой и антисмысловой ориентации в конструкции, встроенной в растения путем трансформации. С использованием прибора фосфоимиджер проводилась маркировка и детекция фрагментов РНК, комплементарных последовательности фрагмента ds-РНК.
Особенность трансформации растений картофеля конструкциями для экспрессии шпилькообразных или двухцепочечных РНК должна заключаться в том факте, что процессинг получаемых в результате ds-РНК в si-РНК предпочтительно происходит по механизмам РНК-i в природных растениях. Для определения фрагментации ds-РНК из трансгенных растений выделяли целую РНК по методике с использованием тризола (Chomczynski and Sacchi, 1987). К 15 мкг целой РНК/пробу добавляли формамид, смесь денатурировали и разделяли электрофоретически в полиакриламидном геле с 15% буферной системой Tris/борная кислота/EDTA (ТВЕ) и мочевая кислота в 0,5хТВЕ. Перенос выделенной РНК из геля на нейлоновую мембрану (нейтральную) осуществляли с помощью Tank-блоттинга в 0,5хТВЕ, осуществляли гибридизацию с радиоактивно меченным зондом, комплементарным последовательности целевого гена, присутствовавшего в смысловой и антисмысловой ориентации в конструкции, встроенной в растения путем трансформации. С использованием прибора фосфоимиджер проводилась маркировка и детекция
si-РНК, комплементарных отрезкам последовательности фрагмента ds-РНК.
В различных трансгенных линиях картофеля, например, таких как PR-H4 или PR-Ш, детектировались указанные si-РНК (фиг. 13А, В). Это говорит о том, что конструкции, встроенные в растения путем трансформации, узнаются и процессируются по механизмам РНК-i в растениях таким образом, что образуются si-РНК против целевых генов HIGS P. infestans, приводящие к сайленсингу этого гена в патогене.
Оценка устойчивости трансгенных растений картофеля методом изолированных листьев.
Для тестирования устойчивости трансгенного картофеля по листьям трансгенные растения, полученные in vitro, культивировали в теплице в 5 л горшках. Через 6-8 недель из каждого растения выгрезали по 2 боковые доли листа и помещали в герметичные пластиковые боксы на влажные маты Grodan так, чтобы листовой стерженек был погружен во влажный субстрат Grodan. Таким образом обеспечивалась высокая влажность. Боксы инкубировали при 18°C с фотопериодом день/ночь (солнечный свет, февраль-сентябрь). Доли инокулировали суспензией зооспор Phytophthora infestans, которую наносили в виде капель (объемом 10 мкл; 104 зооспор/мл). Через 24 ч крышки боксов приоткрывали для обеспечения мягкой циркуляции воздуха. Спустя 6 дней осуществляли визуальную оценку в баллах и проводили прямой подсчет количества зооспор. Визуальная оценка показала степень пораженности и повреждения долей листьев P. infestans. Прямой подсчет спорангиев позволил дать количественную оценку репродуктивной способности патогена в растениях. Для этого предварительно зараженные доли листа инкубировали в 5 мл пробирках типа Falcon на шейкере в течение 2 ч до открепления спорангиев от листа. Подсчет спорангиев проводили под микроскопом с помощью счетной камеры Thoma.
В различных линиях картофеля на основе HIGS, полученных путем трансформации растений разных генотипов, отмечалось уменьшение количества спорангиев после заражения P. infestans (6 точек/дюйм) (фиг. 15В-18В). Это говорит о том, что репродуктивная способность патогена у трансгенных растений ограничена.
Ген PITG 03410 тестировали в качестве целевого гена HIGS, используя генетический фон картофеля сортов Baltica, Hermes и Desiree, а также Russet Burbank, с помощью вектора, показанного на фиг. 5. Результаты анализа этих трансгенных растений методом изолированных листьев показали, что у трансгенных растений сорта Russet Burbank репродуктивная способность патогена ограничена по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями (фиг. 20). В качестве альтернативы векторам, подходящим для синтеза шпилькообразных структур, в растения картофеля сорта Hermes вводили вектор, показанный на фиг. 10, который содержит целевой ген PITG 03410, и трансгенные линии исследовали методом изолированных листьев (фиг. 21). И в этом случае также показано, что у трансгенных растений репродуктивная способность P. infestans ограничена по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями.
Растения картофеля сорта Russet Burbank, трансформированные комбинированным вектором, направленным против генов PITG 00146, PITG 00708, PITG 10447 и PITG 08363 (фиг. 3), тестировали также методом изолированных листьев. Было найдено, что у трансгенных растений репродуктивная способность P. infestans ограничена по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями (фиг. 22).
Аналогичным образом анализ методом изолированных листьев показал, что репродуктивная способность P. infestans у трансгенных растений сорта Russet Burbank ограничивается при трансформации вектором, показанным на фиг. 29-32, который направлен против генов PITG_06748 (фиг. 23), PITG_09306 (фиг. 24), PITG_09193 (фиг. 25) или PITG_19177 (фиг. 27).
Даже у трансгенных растений сорта Desiree, трансформированных вектором, показанным на фиг. 31 или 32, который направлен против гена PITG 09193 (фиг. 25) или гена PITG19177 (фиг. 27), анализ методом изолированных листьев показал ограничение репродуктивной способности P. infestans по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями.
Тест-система транзиентной экспрессии векторов РНК-i в листьях картофеля.
Birch et al. (2010) была разработана тест-система транзиентной экспрессии для изучения функциональности векторов РНК-i, направленных против выбранных последовательностей целевого гена P. infestans. Посредством ко-бомбардировки вектор РНК-i, нацеленный на целевой ген, транзиентно экспрес-сировался в листьях картофеля вместе с фьюжн конструкцией, состоящей из репортерного гена люцифе-разы и тестируемого целевого фрагмента. Если процессинг конструкции ds-РНК происходит в векторе РНК-i, то должно обеспечиваться образование ds-РНК и образование в результате их процессинга si-РНК. Эти si-РНК должны не только вызывать деградацию транскриптов фрагмента целевого гена, но и вызывать появление сплавленных транскриптов репортерного гена, так что с помощью функциональной конструкции РНК-i можно наблюдать снижение активности люциферазы. Плазмида pABM-70Sluci включает двойной промотор CaMV 35S, сайт множественного клонирования, кодирующую последовательность гена luc Photinus pyralis, который кодирует люциферазу и выделен из модифицированного ин-трона PIV2 гена St-LS1 картофеля (Eckes et al., 1986, Vancanneyt et al., 1990), еще один сайт множественного клонирования, а также Nos-терминатор гена нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens. Амлифи-цированный с помощью ПЦР фрагмент участка кодирующей последовательности, например гена PITG 03410, клонировали в плазмиду pABM_70Sluci, которая была также клонирована в вектор рРНК-i для получения конструкции ds-РНК (фиг. 14А).
Тест-систему транзиентной экспрессии можно использовать не только для оценки общей функцио
нальности конструкции РНК-i, но и для исследования различных участков последовательности какого-либо гена, что касается эффекта его сайленсинга, и в конечном итоге для выбора наилучших участков последовательности гена в целях его оптимального сайленсинга. Кроме того, бомбардировка частицами трансгенных растений, стабильно трансформированных конструкцией РНК-i, может служить для определения эффективности сайленсинга генов в отдельных трансгенных линиях картофеля на основе HIGS, которая может значительно различаться в зависимости от места вставки конструкции. В различных трансгенных линиях картофеля на основе HIGS, которые получены трансформацией различных генотипов картофеля и которые демонстрируют снижение количества спорангиев после заражения P. infestans, отмечается также сокращение активности люциферазы (фиг. 15А-18А). Это говорит о функциональности конструкций HIGS, процессированных до si-РНК, в том, что касается сайленсинга последовательности целевого гена в трансгенных растениях.
Если каждая кодирующая последовательность генов, подлежащих сайленсингу комбинационной конструкцией, например рРНК-i HIGS-CoA (целевые гены: PITG 08393, PITG 00146, PITG 10447, PITG_00708), клонирована в вектор pABM_70Sluci за кодирующей последовательностью гена luc Phot-inus pyralis (pABM_70Sluci_PITG_08393, pABM_70Sluci_PITG_00146, pABM_70Sluci_PITG_10447, pABM_70Sluci_PITG_00708), и вместе с вектором рРНК-iHIGSCoA должна транзиентно экспрессиро-ваться в листьях картофеля, то эффективность сайленсинга комбинационной конструкции можно анализировать по разным целевым генам. Это также возможно путем бомбардировки трансгенных растений, стабильно трансформированных комбинационной конструкцией РНК-i, частицами отдельных фьюжн конструкций, состоящих из репортерного гена люциферазы и тестовых кодирующих последовательностей различных целевых генов.
Активность люциферазы определяли с помощью Dual Luciferase(r) Reporter Assays (Promega, Mannheim) (Schmidt et al., 2004).
Оценка устойчивости трансгенных растений картофеля в условиях открытого грунта.
Для тестирования устойчивости трансгенных растений в условиях открытого грунта трансгенные растения культивировали в начале года (март) из растений in vitro в условиях теплицы в ячеистых поддонах в течение 3 недель. Эти растения затем пересаживали в теплицу с крышей из проволочной сетки прямо в грунт, создавая тем самым для растений естественные условия - температуру, солнечное освещение, осадки и влажность, схожие с полевыми условиями. Растения высаживали на 3 грядки так, чтобы на каждую грядку приходилось по 6 растений. Через 8 недель одну боковую долю листа из 2 растений каждой грядки инокулировали P. infestans путем опрыскивания (750 мкл; 104 зооспор/мл). Доли листьев помещали под пластиковые мешочки для обеспечения повышенной влажности и активации заражения. Через 2 дня пластиковые мешочки снимали. Раз в неделю осуществляли визуальную оценку в баллах и фотодокументирование роста спор гриба Phytophthora infestans в условиях теплицы. Критериями для визуальной оценки пораженности вначале служили только пораженные доли листа (0 баллов: отсутствие пораженности; 1 балл: слабое поражение (поражение проявляется на 1/2 части всех долей); 2 балла: поражение более 1/2 поверхности долей листа; 3 балла: поражение всей поверхности долей листа), затем распространение поражения на растение и на всю грядку (4 балла: распространение поражения на другие листья растения; 6 баллов: распространение поражения на другие растения; 8 баллов: распространение поражения на большую часть растений; 10 баллов: 10% растений поражены/погибли; 20 баллов: 20% растений поражены/погибли; 100 баллов: 100% растений поражены/погибли).
В различных трансгенных линиях картофеля на основе HIGS (PR-H-4-7, PR-H-4-11), полученных путем трансформации картофеля генотипа Hermes, отмечено значительное уменьшение степени пора-женности Phytophthora infestans по сравнению с трансформируемым генотипом Hermes, который культивировали, высаживали и инфицировали в качестве контроля точно так, как трансгенные растения. Уменьшение степени пораженности сначала характеризовалось значительным снижением способности патогена вызывать поражение инокулированных долей листьев (подсчет через 21 день после заражения: PR-H-4-7 - 3,3; PR-H-4-11 - 3,2; Hermes - 7,6) и позднее значительным снижением способности патогена к размножению в этих растениях (подсчет через 32 дня после заражения: PR-H-4-7 - 26; PR-H-4-11-15; Hermes - 80) (фиг. 19А и В).
С помощью описанных тестов можно не только продемонстрировать процессинг конструкции HIGS в si-РНК в трансгенных растениях картофеля, но и функциональность этих конструкций в отношении сайленсинга последовательности целевого гена в этих растениях, а также определить количественно повышение их устойчивости к P. infestans по снижению образования спорангиев патогена на этих растениях-хозяевах. Поскольку идентификация функциональных целевых генов HIGS не представляется возможной без тщательного тестирования их функциональности, то детально описанные здесь методы анализа особенно подходят для определения генов, которые эффективны в конструкции HIGS и для получения устойчивых растений на основе HIGS.
cgtcaagatg ctgcggaggt ctgtgctgcc gttggcacgt cgtgccttcc cgcggtccgc 60
ggctagccta gcgccgtcct gtgctgctcc caagtacttt tcacgtgcct tcagcgttgc 120
ggagcagagt cagcggcatg tgatcgccgc gctggttgtc aaccagcctg gttgtctggc 180
cgagatcgcc aacctcttcg ccgctcgagg taactatcga tacgcaaaga cgctggccac 240
aggagatcct aaacatggtg tgatgcaggc tacaatattg acagtctggt tgtgggtcgc 300
acggaggtcg aggagctctc ccgtatgacg gttgtcgtca acggcactgc gcagagtgtt 360
gtcaacgtac gtatagtaat tacagagaca ggagcagtag gtgattgaca ctcaatgtgt 420
ctttgcagat gaagaagcag ctcgaggatg tcgtgtatgt tgctgtggtc aatatcctga 480
gcagtggcaa gaacgctgaa aagaactacg tcgagcgcga cctgatgctg gccaaggtgt 540
ccacggccgg tacgtcggac gctgatctga taccctacca ccaccggaat tcgtgaacat 600
ggacctgacg taaacatttg ctggtgtgtg tgctggctac agaggctgga tctcgcgctg 660
aggtggtgga gcttgccaac ctgttcgacg ccaaggtgat tgacgtgcga ccgcaccagg 720
ttatggtaca actggctggc acccctggtc gcattgaggc atttttggac ctgctaaagc 780
cgctgggtat cacagagatc caccgcagtg gggtcattgc gatggctcgc agcaccagtg 840
tgaccgacga cctgggcgat ctctcgacgt ttgagggcgc cacgcgaacg cttctggacg 900
aggccgatga cgaagagttc gatgtctctc gccttccgcc tggataatat gttggtagag 960 ttatgatcat gccatcacct ttttcttcga taggacttgt gcctgatgac aattgcagca 1020 aggaacgtgc tagcgaagat tg 1042
<210> 2 <211> 3072 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 2
atggtgctcc gagcggttcg gctgatcgtc caggcatctc tgctcctgca agtgctccag 60
tgtggcgcct ccgtaactgg tgctcaagta aatgaaaact ttgagaacac tgagcttacc 120
tcgaacgata aactgggaac agtggctccg gccgacatcc cgtcttcaca agacgagaat 180
ctcaagaaac aggaagagcg tggcttcttt gactggtttg gcaatggcga cgacacgcct 240
gccccggctg ctgacgacaa ctccggtaaa tatgcgacta cgacaccgat ccctggcacg 300
gctgcgcggc cgtctacgag tagtctgatg tcaaagtatg gtagtatgct cggtgacttt 360
actaaagaca cgacgccggc ctcggaagcc gatgagcgca caacgagcgc acgtagcgct 420
gccacccgtg ccacctcgga ctcctcttca ggtagtacct ctggcagcgc ggcagcagaa 480
gtcaagccga agagaaagaa gaccaagaag cctgtggttg ccgccgcgtc tgaaagcgga 540
gagagtgcaa gtgacgacga tgccagcgag gcgagcgctt cgggcagtga ggcaaagccc 600
aagaagagga caaccaagaa gacgaggaag ccggtcgtag ctgctgcgtc gacgtctgaa 660
tccgaggatg cctcgacgtc tgaatccgag gatgcttcgg gcagtgaggc aaagcctaag 720
aagaagacaa ccaagaagac tagaaggccg gtagcagctg ctgcatcgac gtctgaatcg 780
gaggatgctt cgggcagctc ggacgagtcg ggaagcgacg atctgtcgga tctgctcggc 840
agctcggcgg gttccggaag cgaagatgac atgtcggccc ttctcggtag cgcgggaggt 900
tccgggactg acgacgcctt atcagctctg ctggggtcgg gagtcggtgg ctcgggtagt 960
atgcttagtt tcgaagactt tatgaagaat tacggtagca tgttcggttc gggaagtagt 1020
gctgtcgacc tgttcggaga cccgagcacg ccccagaaca acacgattga cgacgaagat 1080
atcatcctcg gcgaactgta cggtggcaag gagcacggcg acgccttctc ggacatcagg 1140
aacatcaagt ttggtcagat gatcctgaac attacagttc gcggtcaaga gcgcgtggat 1200
tccattggta ttacagtgat gactcaagaa gctgttggta accttgtgca cggtggtgaa 1260
ggtggtaccg aaggattcat tgaaccggag atgggtgaca ctattgatac cgtcgaagta 1320
cactgggaca agaacaaggg caagacgtgc atcttctacc tcaagatggc gacttctggc 1380
ggtaagacga ttgcgacggg aacgaagacg gccaacagcg ccgtcatcaa gccgcccaag 1440
ggctaccagc ttgctggatt ccatggtcgt gccagtagtt ctggtatctt ttgtattggt 1500
ggaatcttca ccaagcaaga cgcgacggat ctcgcagtca cggacgtgat ggccatctcc 1560
agtaagggct ctcctgatat ctacaactac gacaccacca ttcgtaactg ggtgggacct 1620
ctagagacag cgagtgacaa cgcctgttac cagaagagag tcgacgtcag cagcaaggga 1680
atgtgtccgt cgggtttcaa caaggacgac gacaggtgca tcacccaatg tcctctcaac 1740
taccccattg actgcttgat ggagtgcatg cctcaaaaca gtgactgcac ccagttgatt 1800
gtcgctaagg tttccgccgt cgttgctgtc gctttaaatg ccgctacgat gggtatcttc 1860
ggtacgctgg tggctgccta cagaaccgct aactttgctc tcacctgcgc catcaacgtt 1920
gtgaacgctg tcaagtcgct gatttactac ctgcgttaca agcagacctt gatcccgact 1980
acggacacgg agaagttgat ggacaaggcg ttccagctgc agattgtcat tcttgacttg 2040
cctctggcta tctgttcttg cctgggcatc aagattcctc ctaagctcca gttctcggct 2100
accattctgg ctgtcgtgtc ggccattgtc atgatggctg tcatggtcgg tgaggccctc 2160
ttcgcgtcgt cgaacaacgt catgctcatg cttcgtgagt cgggcgcttt taacacttct 2220
gctctgaacg gagacaccat tgagcttgat acgttcctca acaccaagaa cggcacgtgt 2280
ggttacgaga tgagaactct cactaaccgc gtcatgggca aggtctacga aatccgtaac 2340
aacacgccga atgctgatgc cgatgatgta cgtgttgagg tgagcaagtc gtccatcatt 2400
acggatgaca tccccattgt gaccaaccac tgcatgggtg atatctggac caacaagacg 2460
ggcgcgtcgt cgtacaagac gcgcaacctg ctgcgtaaga ccctcagtgt aattgttgac 2520
cagctcgttg aggacggtac gaccgatatg ggtaagcatg tgaccaagaa ggagaaggct 2580
ctcgaatact cgaatatggg tcttttcgtg ctgtccatgt tcgatccgac gggtattgcc 2640
tggatggctt ccgagttcgt gcagcccatt tgtggaccca ctgagtacct gggtgagatc 2700
gatgatggta cgctgtacga cgctctgggt ctaaacacgg tcgaccaggc gttcctggga 2760
agctacggtg tgtggaagaa gaagggtgat ggctccgtca cggtttactt cgagagtgtt 2820
gacaagttcc ctgtgtctgt ggtgatcacg tccggtggtg acaagctcaa ggaggtcaag 2880
gtgcctgcta acggcaacgt cacgtggaca tctacggtgg aggagcttgg tgacaagact 2940
ctttaccttg accgctggcg tcctggtctc tttggcctgc ctggtacggg cggtggttcg 3000
ctactgatgt ggatcccgcg atcgtctgag ggtggccagc ttgttcttca tgctcgcttg 3060
aatgttagct aa 3072
<210> 3
<211> 2405
<212> ДНК
<213> Phytophthora infestans
<220>
<221> misc_feature
<222> (949)..(1048)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
atgtcatccg tagacttgag tatcctgcgc aacggcatcc cggccgagct gccggcgcac 60
ccgggcaacc accccgaccc gacgctgccc aaggctccgc accgcaacat cgacggtctg 120
tccaaggacg atctcgtgct ggccgtgcag aacgcgttac ggtacttccc cgagaggttc 180
cacgccactc tggctcccga gttcgcgcag gaactcaagg acgagggcca catctacatg 240
caccgcttcc gtcccgtgca gtacgagatg aaggcgtacc ccattgacca atacccggcc 300
aaatgcaaac aggcagctag tatcatgctt atgatcatga acaacctcga ccgtcgcgtt 360
gcacagttcc ccaaccacct ggtcacttac ggtggcaacg gtagtgtctt ccagaactgg 420
gcacagtact tggtggccat gcgctacctg tccgaactca cggaacagca gacgctcgtc 480
atgtactctg gtcaccctat gggtttgttc cctagtcgtc ctgcagctcc acgtatggta 540
gtgaccaacg gtctaatgat ccccaactac tccacacgcg ctcagtacga caaggcctac 600
gctatgggta acacccagta cggtcagatg actgctggca gctactgcta cattggtccg 660
cagggtattg tacacggtac gaccattact gtactgaaaa cctactgacg aggtctatgg 720
cggttcagat gagagcaatc taccttcctt ctagaaaaat gctaaacaat tccagtggat 780
gttgtatagg tcttgacaat caatattgcc ccctacgatt ttgtcaatat taacaatcag 840
tttatttctt ccaatccctg attttacagt gaggatttcg agagtgggaa cgtggaaaca 900
aaatcattgt caaatttgag cgagcctttc tcgccgatgc cagactggnn nnnnnnnnnn 960
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 1020
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnngc gtcatctccg gtgtcatctc cgtcactgca 1080
gagatcgacg aatctgcagt gaagaagcgt cacgaacagg gctgggttga cgaggtcgtg 1140
agcgacctgg acgcctgtgt cgttcgtatc cgtgaggcaa aagccaaggg cgaggtggtg 1200
agcttggcgt accacggcaa cgtcgtcact ctttgggaac gtctcgccga cgaggctgaa 1260
gctacgggcg agctgctcgt ggagctcggc tcggaccaga cttccctaca caacccgttc 1320
aacggcggct actacccggt ccagttgtcg ttcgaggagt ctcagcgcgt catggctgaa 1380
gacccggagc gcttccagga actggtacag gagtctctgc gtcgtcacgc tgtcgctatc 1440
aaccgtctga cagccaaggg catgcggttc tgggactacg gtaactcgtt cctattggag 1500
gcacaacgtg ccggcgcgga cgtgttgcgt cccggtgtta agcccgagga ggctgctgtc 1560
tcgactactg cctttaagta ccctagttac gttcaggaca tcatgggcga cattttctcg 1620
cttggtttcg gtccgttccg ctgggtctgt acgtcgggtg accacgcgga cctgcagaag 1680
acagacgcca ttgctgcccg tgtgatgcgc gagctgctgg ccgaaccgga agtgccggac 1740
cgggtcgcgg ctcagctgcg tgacaacttg cgctggattg aggctgcaga ggagaacaaa 1800
ctggtcgtgg gatcggaggc gcgtatcctg tacgctgacc gtgtgggtcg cggcacgatc 1860
gccatggcgt tcaacgccgc tgtggctagc ggcgagctct cggcacccgt cgtgctcagc 1920
cgcgaccacc acgacgtcag cggcaccgac agtccgttcc gtgagacgtc gaatgtgacg 1980
gacggctcgg ctttctgtgc cgatatggcg gtgcagaacg cgctgggcga cgccgctcgc 2040
ggagctacgt ggatcgcact gcacaacggc ggcggtgtcg gctggggcga ggtcatgaac 2100
ggtggcttcg gaatggtact ggacggctcg gatgacgcgc gcgagaaggc ggcgtgcatg 2160
ctcggctggg acgtcaacaa cggcgtggca cgtcgtgcgt gggcgcgcaa cgccaacgcg 2220
cgcttcgcta ttgagcgcga gatgaaggcg gaccctttgg tacgtttgtt tggttacgag 2280
cttgagactt tggaagcgtt agattttaat gtgtgtgtat ctttgtggta ttgcagctga 2340
cggtgacgct ggctaacgag gccgacgacg cgagcgtgcg tgacgctgtg agcaagctct 2400
tctag 2405
<210> 4 <211> 1735 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 4
atgctctcgc agcttaaacg cagattcacc ctgggacgac gttgtcagac cgaagaagaa 60
gaccactcga ggatcaccat gagcctttcc aacagcaaca gtaccagctc cttgccccct 120
gtggacgagc accacggctg tgagtacctg gatacggcgc tgacgatctt tgtaatcggc 180
gcgtcgggcg atctggccaa gaagaagacg tatccgtcgc tctttgcgct ctacaccatg 240
ggctacctgc ctgaacacgc ggtcatcgtg ggctacgctc gcagcgccaa gaatgatgcc 300
gacttccgcg cgcaaattgc gccctggatc aagcctaaga cacccgaggc cgaggctcgc 360
aaggaggcct tcctcaacaa gtgcatctac cgcagcggca aatacgactc aactgaagat 420
gtgggcaagg taagcaagga gatggaggca ttggaagaag cccatggatc gcctgtggcc 480
aaccgcctct tctacttcgc catcccgccc acagtcttcg tgcccatcgg cacgagcatc 540
aagaaggcgg cactgaccac gcgtggttgg aaccgtctca tcgtcgagaa gccatttggc 600
cacgatctcg actcgttcga caagttgtct caggacatgg gcgcgctgta cagcgaagac 660
gagatctacc gtatcgatca ctacttgggc aaggaaatgg tgcagaactt gctcgtgttg 720
cgcttcggca atgcaatctt cgagcccatt tggaaccgca actacgtgtc cagtgtgacc 780
atcactttca aggaagacat cggcactcag ggccgcggtg gctacttcga ctcgttcggt 840
atcatccgtg acgtcatgca gaaccacctg cttcaggtgc tgtcacttgt ggccatggag 900
ccaccaatcc aagctgctgg tgacaactac tccaactata tccgtgatga gaaggtcaag 960
gtgcttaact gcattgagcc tatcaagatc gagaacaccg tcctgggcca gtatgaaggc 1020
agcaaggagc tcaacgagcc gggctacctc gaggacccga cggtgcccaa gggatcagtg 1080
acccccacct tcgccacagc tgttatgtat gtcaacaacc cgcgttggtc tggtgttccg 1140
ttcatcatga aggctggtaa ggccttgaac gaacgcaagg gtgagatccg tgtgcaattc 1200
cgcccgcctc ctggagcgca gcacttgttc ccaggtgtca agatcccagt acaagagttg 1260
gtgctgcgtc tacagccgga ggaagccgtc tacttgaaga tgaacgtcaa gagtcctggt 1320
ctgcagaccc aggcgatctc aagcgagctg gacttgtcgt acgccgagcg ttacgagggt 1380
gcagaggtgc cggacgccta cactcgcttg atcctggacg tgctgcgtgg taagcaggcc 1440
gcattcgtgc gtgatgacga gctccgtgct gcatggaaga tcttcacgcc attgctgaac 1500
gagattgaga cgcagaaggt gaagccgctg cagtatacgt tcggctcgcg tggccccaag 1560
gagagcgacg agctggtgaa cagagctggc ttccagtacc accagggcga ataccagtgg 1620
cagccgcgtg tgcgcactac cagtgcacta taggttgtct ctttggttga gcacaaagat 1680
gcccggaagt ctggcataaa tatgatggtt gagccagcta gtcttcaata aggga 1735
<210> 5 <211> 1245 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 5
gggagcttaa aagtgctaca ggaagtcgct atcatggcgt caagaagtct cgtccgccgc 60
tcggcgcgtc tcgccactgc catcgctact aagcgcagct tcgttcgcgc cgcttccgcg 120
tcggtgaacc tccagtgctt tcagacagca cccgccactc gccagacccg tcttcagagt 180
acgcagacaa gctccagcga tgagccgccc aaaacggagt ccccagtaga cccagagcag 240
ctcattctgg ccaaggctct ggaccatgtg atttcccacg ggtacgttat ggtttaagtg 300
ctataaaagc gaagatatcc taggttgtaa cgctctcgaa tgcaaggtgg gccattgagg 360
ctctagcagc tggcgccacg gatcttggct acccttcggt ggctcacggc atgttccagc 420
gcggagctat tgatttggtg gattatttta tggactcgtg tctcgccaag ctacgcgaga 480
cgctgattgt caacacggaa aagttgcagg ccatgacggt gactgaacgt ctcaagtttg 540
gcgtctgcac gcgtctgcag atgctggagc ctgtgttggc tacatggcca caggctatgg 600
ccattggcgc tctaccgcag aacgcacctg gtactgcaaa gagactggcc cagctctcgg 660
atgaaatctg gtacttcgct ggtgacaagt ccacggatct atcatggtac accaagcgcg 720
ctattctcac gggcatctac gctagcacgg agctgtttat gctgaatgac aagtcgccga 780
acttccagga cacgtgggat ttcttggacc gccgtgtgga cgaaacgatc caactcggag 840
aactgcctca gaacgtacgt gaagctgttt gagtctctta taaggcttag ctgttgacgt 900
gactaactac ttgtgtgctg gtctgtgtct gagcagctga acgatgtggc tgggatggcc 960
agtattgggc tgcagtcggt gttttcggct gtgacgtcgc ttgcgggtcc tctggccagt 1020
cagatcatct cgaactcgcc tttgagtcaa gttccgaacc cgatttcagc tgtgggcagt 1080
gtggttcctc cctcggttgt atcggctgtt gcctctggaa tgccatttag caatcctact 1140
tctgctggac atgacggtat ggcgttcaag tcgaaggatc tggacgaaat taaccaagag 1200
cttgagaagc tcggcggcct tgacgcgagt gaacgacgga actaa 1245
<210> 6 <211> 1461 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 6
ccacgtccag ctcaagccaa ttgccatgct gtccgctact cgccgcctta cgcgatctct 60
gcgtcgccct tctgcactgg gatgccgcct cgagtcctca ttcgctcccc tcactcagct 120
atccgaggag gaaaccatgt tcaaggacac agtcgcccgg ttcgcggctg acgtggtagc 180
tccgaatgtc cgcgccatgg acacagcggg ggagatggac catgctatca cacgaggact 240
attcgagaat ggactgctgt cggtagagat cccagcagac tacggaggta gcgaggcctc 300
gttcatgaac ctctgcttga ctattgagga gctgtccaaa gtggatcccg tcgtgggact 360
gctcgtggat ctacagaaca cagttgtgaa caacgtcttc ctggtgagtg aagagtacga 420
ttggtattct aaattctgta gctgaccatt gtgttgcagg tgcacggcac ggacgagcag 480
aaagaaaagt acctgccgag actcagcgcg gacatggtgc gtgcatcaat atttggaaat 540
attgtgataa tactaatatt gtacggtgtt gtagatcggc agtttctgtt tgtcagaggc 600
tggatcaggt agtgacgcgt tcgcgctgaa gacacgggcg gaggcctcgc cggacgggag 660
ctactactcc atcactggtc agaagatgtg gatctccaac gccgagtact ctggcgtgta 720
cttggtgttc gccaatgtgg acccgtccaa gggctacaag ggtatcacgt gctttatcgt 780
ggaccgagac atggaaggac tggagatcgg taagcccgaa gagaagctcg gcatccgcgc 840
atcgtcgaca tgtcccgtca cactgacgga tgtgaaggtc ccgaaggaga acattctggg 900
agagctgggc aagggataca agatcgcaat cagcacgttg aatgaaggac gcattggcat 960
tgcgtcgcag atgctgggac tggctcaggg agtctacgac cagacgttgc cgtacttgtt 1020
cgagcgccaa cagttcggct ctcccatcgg agagttccag gcgatgcagc accaatatgc 1080
ggaggcagcg ctcgatatcg agacggcgcg tttgttggtg tataacgcag cgcgtctcaa 1140
ggatgctggc caaccgttcg tcaaacaggc tgctatggcg aagcttcatg cctcgcgtgt 1200
ggcagagaag acggcatcca agtgcatcga gctgcttgga ggcattggct ttaccaagta 1260
cttgcttgcg gagaaattct atcgtgacgc aaagatcgga gctatctacg aaggaaccag 1320
taacatgcag ctgacgacga ttgcgaagct tgtgtcggag gaatacaaga ggtaattgaa 1380
tgtcgtgatc ctgtactcag acttgatcct tgtagcaaac caaacaagta acatttccgg 1440
agaacgagcg ttagaaccag a 1461
<210> 7 <211> 1580 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 7
atgctgcgtc gtcttgccct ccgtaccgtg aagccttctg tgcgcaactt cgcctccgcc 60
tcggagctgt acaagaaccc gcgcagctcc aagttcagca tgaccaagat cgtggccact 120
atcggccccg tgtcggagca gctggacatg ctacagaaga tcacggacga aggtttgcgt 180
atcatgcgca ttaacttctc acacgccgag tacgacgagg ccttgctgcg cgtcactaac 240
cttcgtgcct gtcgcggcgt gcacgccgag ggtcaggcca aattcaacct acgtgccgtg 300
ctacacgaca ccaaaggacc cgagatccgt acgggtaaga tgcgtgacgg caagaaaatc 360
acgttagaga gtggcaagtc ggtggtgctc acgaccgacc cggctttcga gcttgagggt 420
accgccgaca agttctacgt tacgtatcag cagttagccg aaaccgttaa ggtgggcgat 480
acagtgttac tatctgacgg ccttatccgt ctcacctgta cgtcagtggg taaggatgag 540
attacgtgcc acatccacaa taccgaggaa atcggtaacc gtaagggtgt aaacctcccg 600
ggtttgatcg tcgagttgcc tgctctatct gataaggaca aacgcgacct ggattggggt 660
gtcgagcacg atatcgactt tatcgcggcc tcgttcatcc gtaaggccag cgacgtgaac 720
tcgatccgtt cgttcgtggg agagtgcgtt aagaaacact ggggtaacca acctggttac 780
attgccccta agatcatctc taagatcgag aacctcgaag gtatccagaa ctttgaggag 840
atcctcgagg cctcggatgg catcatgtgt gcccgtggcg atttgggtgt cgaagtgccg 900
gcacagaagg tcctgacata ccagaagatg atggtggacc gctgtaacgc cgtcggaaag 960
ccggttattg tggcgacgca gatgctcgaa tccatgcaga acaacccgcg ccccacgcgt 1020
gccgaagtgt cggatgtcgg caatgccgtg ctggacggcg cggactgcgt catgctcagt 1080
ggcgagtcgg ctcagggcaa gtacccgatc gagtctgtgg ccacgatgaa cacggtgatc 1140
aaggaggccg accagctcct actcaagcct aactaccagg ccaagttcca gttcgagccg 1200
cccacgtcgg acgtcgagtc agccgtgtcg tcggcagtca agacggccaa cgagatgcac 1260
gcgcagctcc tgattgtgct cacccgtacc ggttacacgg cccgaaaggt cgccaagtac 1320
aaaccgactg tgccggtcat gtgcttcacc accgacctta aggtcggccg tcagctccag 1380
atccaccgcg gtctgtaccc ggtggtgccg gactaccttg accgtgcccc gactaccgcg 1440
gaggccatcg ctcacgccaa gaagatggga tggttgtctg ccggcgaccg tgtcgtcgtg 1500
atcagcggcg acaagctgtc ggacgatctc ggccgggaaa tcctcatcgg cgtcgctgac 1560
gtccagtaag acggagacaa 1580
<210> 8 <211> 900 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 8
atgtggtcga cgatgatcat gcggttccct acgcaggcca agtccgtgtc gcgcagcgcg 60
cttgtggcgg caggtatggc tgcgttcgct gccttctcca gtgtttcctc tactcgctgc 120
gaagaggaga agtccaaggt ggcgttgagc cccaaggagt tccgttcttt cactgtgcgt 180
aaagttgaga ccgtgaacta caacacgaag cgcgtgacgt tcgctcttcc cacacccgag 240
cacgagatgg gtctcacgac gcctagttgc cttatggctc gtgccaaggt agacggcaag 300
acagtggtgc gcccctacac gcctgtcaac gtgaacgacg agaagggttt cttggagctc 360
gtagtcaagg gttacccaca gggaaagctc agcaagcaca tcgtgcagct caaagaagga 420
gactctcttg acatgaaagg tccctttccc aagttcaatt actaccccaa caggtacaag 480
agcatcggca tgatcgctgg cggctccggt atcaccccca tgctgcagct catcaaggcc 540
atttgccgca acccggagga ccgcaccgag atcacgctgc tgtactgcag tgtctcggaa 600
gaagatatca tcctgcgtga agaagtggag gccatgatgt acctgtaccc gcagatctcc 660
gtgatccacg tgctcagcaa cccgtccgcc gagtggaagg gtcttacagg cttcgtgtcc 720
aaggagatga tcgaaaagta catgccggag ccgtcagacg acaacctcgt gtgtgtgtgc 780
ggtcctccgc caatgatgta ccacgtctcg ggtgacaagg cgaaggacag gtctcagggc 840
gtcgagcaca agaccaacac tcctgcacca tgactaccct caagatcgtc gtttccggcg 60
ccgccggcca aattgcgtac tcgttgctgc ctctcagtac gtccgtctcc ttccctcttg 120
tgtcttctcc ataccctaac gtctcaccat gttgcagtct gcatcggcca cgtcttcggc 180
cccaaccagc gcgtggagct gcgcctgctg gacatcgaac ccgcccagga agcgcttgag 240
ggcgtcaaga tggagctcca ggactgtgcc ttcaacctag tggacgctat catccccaca 300
gccgatctgg agactgcttt caaggacgcg gacgtcgcaa tcctcgtggg cggcttcccg 360
cgcaagcaag gcatgcagcg caaggatctg attgagaaga atgtagccat ttttaaggct 420
cagggagctg ctatcgacca gttcgccagt cgcgacgtta aggtgcttgt tgtggccaat 480
ccagccaata cgaactgcct cattgccatg gagaacgcac ccagcatccc gcggcgcaat 540
ttctcggcac tgacgcgtct ggaccatgag cgtttgcgct cgttcctagt ggagaaggtc 600
aacgagaccc aaagcccgaa agttacgtcg aaggacgtca acaaggtcgt gatctggggc 660
aatcactcga gcacgcaagt gcccgacgtc acgaacgcag aagtgaaggg ccagccgctt 720
gataagatcg tctcggacaa ggattgggct gagaagaagc tcgtcaagga cgtgcaggag 780
cgcggtgcag ccatcattaa ggctcgcaag ctctcgagcg ccatgtcggc tgccgccgct 840
atcggcgccc acctgcgcga ctggttcaat ggctccaagg acggcgagct cgtgtctatg 900
gccatttgct cggacggcaa caagtacggt gtgcccgagg ggctcattta ctcgttccca 960
gtcaagtgcg cgggcaacgg cgcgtacgag gtggtgaacg gtcttcccat ctcgccgcgt 1020
atcgacgcaa tgatgaaagc cactgcgcag gagctgacag aggagaaggc cgacgctgtg 1080
gagatcctgt cgcgccagtg agcagtattc agctaatagc tggacgatgg caacgtcgtc 1140
atgtcgtctt cattttgtca gctatccaag cgcgtgctgc agtatcttcg acatgagcat 60
ccacatcgtc tatttccctc catcggtcga agacgcaaac tcccaggcat aaacctcgac 120
ggaagatctc agcggtgatg gcgcgtggtt agccgcaagg tgttccgatg cacaccacac 180
actactcgcg aaaacgacca tacttctgtc ggccagggta acctctgggg agctgcacaa 240
cggccgtctt tttagcttat tttagcgagc caacaggttg tgcctcattg gccacgtgtt 300
cacgcacgta cgtcacgtgt gtgctcattt taatattaaa gatcccgttg aagacgaaaa 360
gcttctttgc tggcatcatg cgcttccaga cgttgttgct cgtccttgtc gcactagtca 420
tcgccccgtt tcaggccctg tctccaccca gcgagtccaa cgtgccgttc actcttcggt 480
acgtcccggg cttctttaaa caaggtaccc cgtccgtgga gattccacct tcaaattcaa 540
ggcatctcgg gctacttgac aacgtcacgt ggacggatgt agacgcctac attgctgcac 600
gagccgctca aggcgtggac gtcaagttgt tcctcttctt acgtcatgga gaaggcctcc 660
acaacgtcgc cgaagccact tacggcaccg aagcctggga cagattctac agcaaactag 720
cgaaatatac tgacgccaag ttgacgaaac ttgggatgca acaggctgtc aaagcgtcgg 780
aaaggatcga cgaggagctt aagagaggac tgagcctgga ggaagtcgtg gtttccccgt 840
tggagcgtac actacatacg gcaatgatcg cgtgccagaa tcaccacgag atcccgaagc 900
ggtcgatgga atggccccgc gagaccatcg gcgtctgcac gtgcgactta cgcggcacca 960
tctccgccaa ggccgagctg tacccaagta tcgacttcag tgatatctgg agtgatgcag 1020
acccgtggtg gacgcctgat catcgtgaga ccgagctgca catcaacgac cgcgctcgca 1080
tcttcctgaa ccgcgtcttc tacggtcaca agtcagtgcg tgttggtgtg gtgacgcaca 1140
gtggactaac caccgccgcg atgcgtgtca ttggccatcg taagtacagt gttgcgacgg 1200 cggaagtgat accgttcctg cttgaagaca ccacggtgca cacgatcctg tcgatcttct 1260 ctggtaaaga agacatgtag 1280
<210> 11 <211> 1016 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 11
atgtcgtcct atcgtgctgt ccaagttgta aagttgacta aggacttccg cgccgctacc 60
agaatcgtga gtgtccccga actacccacc gctgggcccg acagcatcgt tgttaagaac 120
cgcttcttgg gaattaactc gaccgacgtc aatcttacga atggcatgta tcatgacaag 180
ctgccgtttc tcgcgggcgt tgaaggtgca ggtctcgtca ctgaggtcgg gagtaacgtc 240
acgactgtga aagtgggcga cgctgtcatg taccagacgc tgggagccta tgcggactac 300
gtacaagtgc ccgtgtcggc cgccatcaag atcccagagc tgtcgaagaa cgctctaccg 360
gttgcagtgg gcggcgtctc tgcgtccatc tgccttgaat gtctcggtga gatgaagtcg 420
aatgagaccg ttcttgtgac tgctgctgct gggggaaccg gacagtttgt cgtacagctc 480
gccaaacttg ctggcaacca tgttatcggc actaccagct ctgacgagaa agtggaggct 540
ttgacgaaac tgggctgcga ccgtgtaata aattacaaca aggagaatgt cggcgatgtg 600
ctaaagaagg agtatccgaa tggagtagac atcgttttcg agtccattgg aggcgacatg 660
ttccgtgctg ctgtcgataa cattgcagtc cgtggtcgta tcatcaagat tggcttcatc 720
tcgcgagtat tggagaccaa agacaagacg actccccaag gccgcctccg ctgctatcgt 780
gggaagcgaa caagaagatt: ctgatgaagt ctgcttccat ccgagggctc ttcatgtatc 840
actttgagga acacattcga gagcacacgg agcgattgct gaagctcatt agcgagggca 900
cgttgaagcc tggcgttgac cccactacgt acaagaaatt cgagtccatt ccgaatgcaa 960
tcgaccgcat gttcgcccgt gaaaatgtag gcaaactcat cgtagagctc gagtag 1016
<210> 12 <211> 267 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 12
atgggcaagc acacggagcg agccaaggag agtccattca agcagcagtc gatgatcctc gtgcctatgg acacaccagg cgtgcaggtc gtgaagccca tgcatgtctt tggctacgac gacgcaccgc acggacacat ggatatgctg ttcaaggacg tgcgtgtgcc gttcagcaac gtgttgctcg gtgaaggtcg cggctttgag atcgctcagg atcgtcttgg acctggccgt atccaccact gtatgcgagc catctga
<210> 13 <211> 1147 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 13
atgcgcaaaa tattgaatat tgattggtta aaacctggtc ttggcatcct tatgaccaat
tacagttatt gagtgcttta agcggggcag acgtccacta cgtcacactc agaatctcca
cacaagcaac agaccgacac aatgagcagg tgcgagtggc atcccagcaa cttcgtgcaa
atttagcctt gttatattaa ttgtataacg tggcatgttg cagaccgacg atctcagagg
ttatcgccga gcggaaggcc aacaacactg cggctttcat caccttcgtg ccctgcggct
tcaagactaa ggctgacaca gtggacattc ttctgggact gcagcgcggc ggcgcgaaca
tcatagaggt gggcattccg tactcggacc cacaggccga tggcccgacc atccagcgcg
cacaccaggt gggcgtggac cagggcatca cgctgcatga cgtcctggcc acagtgagcg
aggcgcgaac taagggcctt actacgcctg tggtgcttat gggctactac aacaacattt
tgcagtacgg cgaagtcaaa atctgccccg acgcccagaa aggtacgcct gtaatcgacc
acaggagaga tttgtgggct caaaaactga caataaacgt atttgtagct ggggtggacg
gattcattat tgtggacctg ccgcctgagg aggcaaagac gctcagtgac gacgcagcta
agcacggact tgcgtacatc ccgttggtgt ccccaacgac gacggaggag cgtatgaagc 780
tcatcgactc ggtggcacat ggttttgtgt attgcgtgag tctcaccggt gtcacgggcg 840
ctcgtaacga gctgcctccg aacctcgacg cgttcatggc caagagtaag ttgcttttcg 900
cgctttagtt tattttaatt gtcgagctaa cgtggtccct tgattcgctg cagttcgtgc 960
caacgtgaag caccctctcg ctcttggctt cggtctgtcg acccgccagc acttcgttca 1020
agccagcgcg cttgcggacg gcgttgtgat cggctcgaag attgtcaaga tcatcgagga 1080
cgcgcctgac acagccacgc gtgctgccaa tgtggaggca tttgccaaga gcatcgtgaa 1140
cccttag 1147
<210> 14 <211> 1917 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 14
atgggtaaca tcctggagga gatcgcagcg cagcgccgtc tggacgtggc ggccgccaag 60
caggtcatat ccgccgatga tctggccaag aagatcgagc acgcggaggt cgttttcggc 120
tcgaccctgc ccgtgcttga ccgccttaac gcacccacgg tgcgtccggc agtgcaggga 180
atctggagaa gaatctgcgt ctaacgcagc taccgctgta ctgtattttt tccttgtatt 240
tatggcagag agaggggtgg tccgacgtgg ctctggctgc cgagtttaag cgtgcgagcc 300
ccagcaaagg tgacatcgcc acggagctca atctgcgtga gcaagtgcag gcctacgcca 360
acgcaggtgc cagtatgatc tccgtactga cagagcccaa gtggtttaag ggatcgctag 420
acgacatgag ggcagcccgg gaggtggtcg agggcatgag tcagcgtcct gccatcctgc 480
gcaaggattt catcatcgac gtgtaccagt tgctggaggc ccgcgcttac ggagcggatt 540
gcgtgttgct catcgttgcg ctgctgtccc aggagcagct tatcgagctc attgacgtac 600
gtcgccccgc ttgcactaca tgtagtgggt ttactgtaca ctgacaagcc tcttgttggt 660
ttgtaggcca cccacaatct cggtatgtgc gctctggtcg aggtgaacag catccaggag 720
ctggacatcg ctctggctgc gagggctcga ctcattggcg tcaacaaccg cgatctccgc 780
acgtttaagg tagacatgaa cacgacggct cgcgttgcag acgctattcg tgagcgtggg ctttcgctgg gacgtgacgg cgttacgctc tttgctctca gtggcattcg ctcgcacgca gacgtggtca agtacgagaa gtgcggcgcc cggggcatct tggtgggcga gtacttgatg aagagtggtg atattgccgc gacggtgaag gatctcttgc agaatgtgac gcgtcacacc gagtcgggcg aattcgcttt ggctcctccg cttgccaaag tgtgcggcgt cacgacagtg gagtacgcgc tggcggcctt gcgtaatggt gccaatatga ttggtatcat catggcggaa cactcacccc gctatgtcca agtggaggaa gccaaggcca ttgcccaggc tgtgtgggag tatggggagc gcacgggccc tattctctca gacattgtgg agactcactt ggacggcaag aacgactggt ttcatagaaa tgtccttgcg ttgcgtgaag cttgctcgcg tgcacctctc gtggtcggag tgtttgtcaa caagacagct gccgagatga acgcgactgc aaaggaaatc ggactggact tggtacagct acacggcgac gaggggtttc agatctgcag ggacattaag taccccacca ttcgcgcgtt gcatctgccc gacaccacgc tctgcgacgg cgtggacgca gaagccgttc tacagcaggt tcaggaaggc cttgccaact acattctgct tgatacgacc gtgaagggtc agcagggcgg cactggcgtc acattcgact ggaagattgc agccatcttt gcgcaggcac gacttccctg cctcatggct ggtggcctta cccctgagaa cgtggtgaag gctctatcgg tcggtcaccc cgttggggtg gatgttagca gtggagtgga agtgaaaggt tcacctggtg tgaaggatat ggacaaggtg actgcgttcc taaaggctgt gaaggattac ctctcgattg ctacgcttaa gatcgaggag gagacggaaa cctagagaga gaccctcgga gtgttctaat caatgagggc cactaatgaa gtgcttttac gttacgagct tggatgc
<210> 15 <211> 1494 <212> ДНК
<213> Phytophthora "infestans <400> 15
atggtgcact atcgtagtac tcgcggcggc gtccgcggcc ttagctttga gcaggcggtg
ctgacgggct tggcttccga ccgtggcctg ctgatacccg aagctgacga gttccctacg 120
cttccagctg atgcgctgga gaagtgggcg tctctttcgt accaggaatt ggccgtggag 180
gtcatgcgcc ttttcattga cgaaagcgag atctcgcgtg accagctgcg tgagcttgtg 240
accaagagtt acaacgcgac cacgttccgc tccgatgagg tggcgccggt ggtcaaggtg 300
acggatcaaa tgctggtgct tgagctcttc catggcccca cgtttgcctt taaggatatc 360
gctctccagt ttctaggcaa ccttttcgag tttttcttaa agcgcaagaa cgaggcgctg 420
ccttctgacg ctcctaaaca ccagatcaca gtcgtgggcg ccacctcagg cgacaccggt 480
agctcggcca tatacggtct ccgcggcaag gagaacgtcg aggtgttcat cctcttcccc 540
gagggtcgtg tgagcgccat tcagcagcga cagatgacta ctgtattgga ccagaacatc 600
cacaacgtgg ctgtgaaggg cacgttcgac gactgccagg ctatcgtcaa ggaccttttt 660
gccaacgctg acttcaaggc caagtacaac ctaggtgccg tcaactcgat taactttgcg 720
cgtatcttgg cgcagatcgt gtactacgtc tgggcctact tccgtgctca cgacgagggt 780
gttagcggcg aggttgcctt ctccgtccca acaggcaact tcggtgacat ccttgccggt 840
ttctacgcca agaagctcgg tgttcccatt ggcaagctga ttgtggctac caacgagaac 900
gatatcctgc accgcttttt ctccacagga aaataccacc gccgcgacat cgagcacacg 960
atttccccgt ccatggacat ttgcgtgtcg agtaactttg aacgttatct cttcgctctg 1020
tccggcgaga accacgacat tctacgcggc tggatgcagg ctttcgagca gactaatgag 1080
ctcacgatct cgggcgagct gctctccaag gcacaagacg agatggcatc gtatgcggtg 1140
cttcaggagc aggtgcgctc cactattgcg gagtacaaaa cgatgcatca gtacctcttc 1200
gacccgcaca gcgctattgg cgcagcagct gccatgcact ttgtccagga taaccttgca 1260
gacaagccaa actcggcggt agttgtagtc ggcactgccc actacggcaa gttcctcccc 1320
gtggtgtcga aggcactagg tgtcgctgag tcagagattg agcaacaccc gatcctcaag 1380
gcgctggaat cactgcccac ccggctttcc gttgccagca actcgagtga aactgtggct 1440
gagcatattc gcaagattat tgctgagaag aacgacgaag cctgtagtga ttga 1494
<210> 16 <211> 1299 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 16
atgagctcgt tccgtcttcg tattgccaac gcgcgccaga tcgttcaagt ttgtgcgaac 60
ggcgagccgt ttaagaccgg cgcggcccaa aaggatctgg ctgtgctcga gaatgcgtca 120
cttgtcgtgg acaaggcagg taagatcgcc ttcgttggtc ctgccgctga cgtagagaag 180
tggctgagca cgcagctgca gcccgtgagc tttgagaagg acgtggacgc tcgtgacatg 240
gtcgtactgc cgggttttgt ggatgcgcac acgcacccag tgtggagcgg caaccgtgtc 300
aacgagtttg ccatgaagct ggctggcgct acctacatgg aagttcacga gagcggcggc 360
ggcatcaaca acacggtgcg tcacaccaag aagagttcag aaactgagct gttggagctg 420
ctgcgtacgc gactagaccg catgttgcgt agcggtacga cgcttatcga agcgaagagc 480
ggatacggtc tcgagactga cactgagctc aagatgctgc gtgttttaca ctccgcatcg 540
acgggtgaca acgcacaccc tgtggagatc gtgtccaact acctgggtgg tcactcggtt 600
cctgacggca tgactgctgc tgaggccacg gaggatatca tcacgaagca gattcctgct 660
cttgtgcagg ccaagaagga cggcaccatc tcgcccgaat tcatcgacgt gttctgcgag 720
aagggtgtgt tcgagcacaa cgactctcac cgtattctag aggcaggcaa gaaggcggga 780
ttggacatta acttccacgg tgatgagatg tgtccgatgc agtccggtac cttggcggca 840
actctgggcg cccgtgcaat ctcgcactgt gagatgctga ctgctgagga tcttcaggct 900
atggcagcgc acaagccaga gcctgtattc gccgtgcttc tgcctactac caagtatatc 960
ctgaagctgc ccaatccgcc agcacgcgac atgatcgctg ccggtgttcc tgttgctctg 1020
ggcagtgact acaacccgaa cgctcattgc ctttccatgg cactgaccat gaacatggca 1080
tgtgtgctgt tcggtatgac catgaaggag gctcttgtag gcgccaccat caacgccgct 1140
gcctccatca accggtcggc tactcacggc agtctcgagg tcggcaagca gggcgacttg 1200
gtcctgatgc gtgctacgca gtgggagcag atcatctacg aaatgggcga ccctcctatt 1260
gcaacgaaca agtctcttcg ttccacttcc gtttcacctc gtcgtcatgg ccatcgccaa 60
ttcgaacacg aagtctgagc tcgttctgga cggcgagtct ctctgtgctg aagacctggt 120
gcagctgtcc aagggagaca cgagaatctc gctaagtcaa gaagcctgga agcgcgtggc 180
ttgtggccgt gaggtcgtgg acaatatcct caaggacaag actcgtgtgg cgtacggtat 240
taacacgggc ttcggactct tctccaacgt cattatcggc cccgagaagc tcacagagtt 300
gcaggaaaac ctcatccgct cgcactcgtc tggcacaggc gagccgttga cattcgctca 360
gacgcgtatg ctgctcgcgc tgcgtatcaa tgtattggct aagggacact cggggatccg 420
tgtgcacact ctggagcagc taatagacgc ctttaacgcc gactgtctgt ccgtggtgcc 480
agccagaggc actgtgggcg cctcgggcga cttggctccg ctagcacacc ttgcactcgg 540
tatgatgggt gaaggaccca tgtgggataa ggtggatggt cagttcgtca tcagcgaggc 600
ctccaaggtc ctggccaagc acggactgaa gcctgttcag ctcggagcaa aggaaggtct 660
ggctatgatc aacggcacac aactcatcac gtcggtgggt gctgaggcgg ttgtccgtgc 720
tcagaacgtc gctaactgcg ctgatatcgc cgtcgcattg acactcgagg tgctctgcgg 780
tactgtcaac gccttccacc cgcgtattca tgcagcccgt ccgcacactg gccagatgct 840
cgttgcctcg cgtattcgca cactactacg tgctgacaac ccgtccgagc tgttccgtag 900
ccacaactac gaaggaaagg tgcaggacgc ctacactcta cgttgtgcgc ctcaggtgca 960
cggcattgtg cacgacacga tcaacttcgt acgtggtgtg ctggacgtcg agatgaacag 1020
tgccacagac aaccccatgg tcttcacggg tagtgccgag gtcacgacgg atctgtctcc 1080
ttcaattgac acgaatcaag tcaagcccaa catcgaacag gtagaacacg agatcacgga 1140
tctgaatgac gccaaggagg agatcaagcg tcttaaggct cttgttgcac agaagcagaa 1200
gcctgtggaa cacccggcgg cgggtatgaa gcgcacatcg gacacgttct accgtggcgg 1260
cggtggcttt gtcatctctg gcggcaactt ccacggcgag tatccggcta aggtgctgga 1320
ctacctggca attggtatcc acgagattgc tagcgttagt gagcgtcgta ttgagcgtct 1380
agtgaaccca acgctcagca acctgccggc tttcctcgtg ccagagggcg gtctgaactc 1440
gggttttatg attgctcact gtacggcagc cgctctggtt tcggagaaca aggtgctcac 1500
acacccgtcg tcggtggact cgatctctac gagtggagcc aaggaggacc acgtgtcgat 1560
gggaggcttt gctgctcgta aggcgcttac ggttgtggag catgtcgaga ctgtagttgc 1620
tattgagatt ctggcagcgt gtcaagccct tgacttgctg cgtccgctgc gtacgacgga 1680
ggctcttgaa gctgtccacg gactggtacg cacccgcgtg gctaggtttg acaaggatcg 1740
cttcatgaag cccgacattg acgccgtgct ggacctcgtt cgtagtggag ctatctgcga 1800
cgttgtagct ccgttcttgt caaaactgca cgtgtcagga ctttaa 1846
<210> 18 <211> 1218 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 18
ccgcacagag caactgccac taggcatcat gctgcaccga cttggccgcc gctcgactgc 60 cacttccgcc cagcggtcac tgcgccgatc agccatgacg ccaccgcagc gccaatcctt 120 tcatttcagc tcgtcagcac gcaagccggc atctttggat gctcagaacc gcgtagctgg 180 tgctgcctcc tttttcctgg acgccaaggc cgtttgcaag ggcaagcgct gtgcattggg 240 caagaacaac agcggtattg gagctaaccc ggccacatgc ggggaggatt cgttcttcct 300 cacacctgac gtggtgggcg tggctgacgg cgtcggtggt tggaacgaga acggcgtgga 360 tccaggcaag atatcgcgct cgctaatgcg caacgcggca ttatttgtgc agcagcagac 420 ggccaatagc gagagtgcca ccacgcaaca ggttctggct cacggctaca agcaggcgct 480 gctggatgac gaggtggagg cgggtagcac gacagcctgt atcgtgagac tgaagcagtc 540
gtctgagggc aaacccgtgc ttgagtactc gaacctcgga gattctggct tcgtggtcat 600
ccgcaacggc gagataatct tccgcagtaa atttcaggtt cgaattgact gttgggagtg 660
acagtagaag agttactgac ggcgttgctt tagtattatg gacgtgctcc gtaccaactg 720
gcaaagatcc ctctgcggtt taagcagtat ggtgctattg agaatcaccc tgatgatgta 780
agtctgcttc gcatttggat actatttatg ctggagacag tacaatgcta acggttattg 840
ctccaggcgg actcgggtga gattgacgtg caagacggag acctcgttgt actagccact 900
gatggtgttt gggacaactt cgcccccgac ctccagaaag ctccttcgca gttcccggta 960
agattcttta ccgccgtgtt cgagctacct gtaattactg actttgtttc tcgttattgt 1020
ctgctatttc taccgtagcc gatgctctcc tggcgaagat attggtcagg tgaactcgca 1080
tcttttgtgg atgttattgc agagaacccc gacaaggctg ccgaaaatat cgtcctggcc 1140
tcgctccgcc acaaccttaa gcccgacgac atcactgtcg tcgtggcaaa ggtagtcgtg 1200
atggcatcaa agctgtag 1218
<210> 19 <211> 735 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 19
atgaagcagt tactgcagcc gatctcgttc tctggtgctg cgagtgtgtt cgtcgtggtg 60 gcaaagcaac gcaagaaacg ctgccgtgcc aatgacaagg aagatgacgc tgttaaggac 120 gacgaagaga ctgagacagc agaggacgaa ctggacgagg aagaccaacc cacgcgactg 180 tacgtggcca atgtgggcga ctgtcgagct gttttgtgca ctgcagacgc cttagcagtc 240 gacatgacga cggatcacaa ggcgtcgcta ccggctgaac aggagcgtat cgaggcgtca 300 ggtggcttcg tgcacaacgg ccgactggac ggcattctgc agatctcccg tggcttcggt 360 gacttggcgc acaaacagga tggccacttg gtggtcacgc cagatgtggt ggagcatctc 420 gtgaacccgt cggaccagtt cttgctgctt gcaagtgacg ggctcttcga cgtgttgacg 480
tcgcagcaag ctgtcaactt tgtgctgcgt aaacttcaga cccatggaga cgtccaactc 540
gcagctcagg agctggtgct caaggcgcaa gcttacttcg cacacgataa catcagtgtg 600
gtcattgtgg cgttgaacca gaaaggtgac gcgtgaaatg aacagcggct tctattgact 660
acggaagatc ggagaccgac gaagaagcag aaaacccgga gatcaagctc gagatccaag 720
<210> 20
<211> 1845
<212> ДНК
<213> Phytophthora infestans
<400> 20
aaattatgaa caaga 735
atgcgacgca aggagaccaa ggtgttgttg acgctcgaag aggtgcgcga ggccttcgag 60
cagcagacgc cgctggccgt caaggacgcg ctgggtgtca ttcatgaggc gcagttcatc 120
atgaacctgg agccgaacct tgtggccgtg cggcaaagag cttcaacata tgtttttgga 180
gatatccatg gccagttcta cgacctgatg cagctgatgg acgccgttgg cgttgccgac 240
ttggccgagc gtgatgtcca gctggtgttt ctgggagact acgtggaccg cggggccttc 300
tcgtgcgaag tgatgctcta tctgctactg ctcaagatcc gattttccga caaagttgtt 360
ctcctccgtg gcaatcacga gtgcgaatcg atttcatcct tctacggatt tcgcaacgag 420
tgtaagggga agtacggcat ctcagcctac taccacttct tgtcctgttt ccaatcgatg 480
ccagtggctg cgctgctgtc cacgtcgcgt gggcaagttc tgtgtgtgca cggtggcctc 540
tcacccgagc tgaaaacaat cgaagacatt caaactatgg accgacggcg ggaaatccct 600
accacggggc tgttatgcga ccttttatgg tcggacccga agacttcgca cactcgcgat 660
gtggacgcag aggtggacac tcagccagga tgggagccca atcaggcccg tggatgctcc 720
tactacttca attcggcggc attgttcgag tttttaggca ccaacaagct gctgtcgatg 780
cttcgtgcac atgagttcga ggatgaaggc ttcacgtatc acttcaactc gcaggagtat 840
caagagctgg atactcgagt ggacaagtcc atgcctccac tcattaccgt tttttcggcg 900
ccgaactact gcgacagcta cggcaacacg gccgcctatt tgctcttccg gaatgaacct 960
ttctcgtggg aaatccagca aattaactcc gcgggacatc cagccccacc gattgcgagc
gcagaacgag gatccgacat gtggcgacta ttcaatcaaa cgttgccatt cctcccagca
agcaaggaat tctttgagga agttttgtgg ttagcagaag gacgacgacg tcttacaagt
gaaatgcacc cacaagctat ccgaaagatg ttggatgacg aagtgaacaa atgggaattg
gtagaagaaa cgccaacgcg cagctcgggg ccagcgtctc ctcctcgaat ccaccgcaga
ccttctttga gtaatctgga cgagacccaa acggacgagc gtccaagtct gcttactccg
caagagatgg acacaattaa gctgatgttt tcattaatgg acacggatgg cagcttggaa
ctcagctcga ctaaagtgtc tcagttcatt ctcaatattc tgggtgaaaa aatcagcact
gcggacgcgg aggcttattt ggatgctttg gactacgacc gcaacggagt ggtggatttc
gcggatattc tgtcgtgggt tgccgtgatg aaggcgaatc gcaacaagca cgagtcgagc
cgactcctga gttggccaac tgtacagagc ggtgtgcgca tgttgactcg tgggattttt
tccagtaaag tcttgctatg gctcgcattc ggctgcttac tacgcgatat tatcgtccca
aagcagcgaa aagtgatcaa gtcgtcgtcg atccgagtgc tgggctcagc gtcgctagtc
ctgtacatgg tgggcgtatt gtcagggcga gagcgtggct ggctgcggct tttctctctg
caacgcgctg tcggaattat gacgcagcga ttcgtatcaa agtag
<210> 21 <211> 1489 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 21
atgatgccgc ggggcttacc accacgaggc ccacctggca gtttcccacc tactagtgtt gcggctgtac cccctgcagg cggtgccgct gcagctcgtt tcggcaagct ctctgtgaag gtgttgcgtg cgtttgacct aaaaaagctg ggaatgctgg acactgcaga cccgtatgtg aagctcacga tcggcacgca gaacgtacag actaaggtcc aagcaggcgg tggcaagacg cctgagttta atgagacctt cgacttcaat attgcaaccg agaaggagct cgtggtcgaa
gtttgggacc aagaaaaagg aggacaagac cggttcatgg cgcaggcgaa ggtggagatc 360
gtgtcgtggc tatcaaaggg tggctttgaa ggtgacgtcg agctacggga tcgcgagaac 420
agccctgccg ggaagctggc gatcgttgcc aagttcacga agcccgaaat tggcgcgaca 480
ggacccgtca aggctccacc catggcccct ccgatactct caggtcctgc agtggctccg 540
ttgcccccag gagcgaatgc cgtatctgtt cctggtgcgc tgccattggc accgtccgaa 600
ccgcctcgag acccgaacgg caagttcacc gacaaggaga ttctcgaggc atttaaagcc 660
tttgatctgg atcacaataa ctatgtgggt gctgcggaaa tccgccatgt gctaataaat 720
attggcgagg cgcctacaga cgaagaagta gatgaaatga tcaagatggt tgacaaggat 780
ggcgatggcc aggtgagctt tgccgagttt tacgcgatgg ttacgaaagg gaagcagccc 840
ccacccggat tgggtgtcac tacagctctt ccggagaaag ctgcagctcc tggaggtgca 900
gtttcgggcg ctcaggccat tcagcttcgt aatcagcgca aaatggcgct ggaagagttt 960
gcacgcgata acggtatcaa acccgagagt gtgaagaagg cgtacaagcg attccaagcc 1020
acagataaag atggatcggg ccagatcgac tactcggagt tctgcgaggt gctgcaggtg 1080
gatccatcgc cgcagtgcga gaaggtgttc cagttgttcg acaatgacaa gacgggtcgg 1140
atcgacgtcc gggagttcat gattgcgttg tctaatttca cgggtgctga gaaggaggag 1200
aaactaaagt tcgcgttcct cgtgtttgat gaagatggta acggtgtgat cacgcgacaa 1260
gaactgatga agatcctgaa ggcgaaccac atggcctcta gcgaatcgga agttgcgcgc 1320
aaggcggaca ctattatgtc ccaaggggat aaggacggcg acggagttat ctcgttcgac 1380
gagttctcag ttgtgagcaa gaagtttcct aatattttgt tcccagccta cacgctaggt 1440
acggccaaag attagaatac ccgatgaata caatatcctt atctctcgt 1489
<210> 22 <211> 2862 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 22
atggctagca agctcaacgc gttcctggcc gcggtgcctg cgaacgccaa cgtgcccagc 60
ccgcccaaga cagcgccggc cgtgatggcg ttcccgcagc ttgagttcaa ggaagcgccc 120
gagaacgtgg gcgcattcgc ccccaccacg ccgcagccgc ccgtggtgcg tcgtcgccag 180
cgcaaaaata accccagcct caagctggag ctggactcga accaggaaca tgacagacct 240
gaggatgatc gagatatgtc gcgtccttcc cctctaaaga gcttcatggc cgcccaagca 300
gccgccgtta agctgaaggc acagacggag aagcacgata tcccaacacc agacttggcg 360
cgcacaagca gcgggtccga gctggacgcc aagtcggagg cgggacccat gcgcatggcc 420
agcgtacaag gctcgcacca ccgtcgcgtg tccaccgaca caacgctatt taaccggtat 480
ctgcgtcaac aagcagacct ggatattagt cacgacacgg tgcagtattt cgcaaatgtc 540
ccggtcatta ccgccactgc agctgccgtt gatgctctgg aatgcgaaat gagtgtggat 600
aataacgccg acgaggagca cgcgatcatc gtacaggaac ccgaggagat ccttgctgtc 660
ttccgactcg gaggcaccat ccctgtgtcc agtgcgctgg aaattgtacg acgagctacg 720
aacctcatgg cactagagca gaacgtcatc tcgattcgtg cgccgtacac tctagtgggg 780
gatctccacg gccagttcca ggacttgctc gaactcttcc gagtacacgg ctctcctgcc 840
gtggacaacc cgttcttgtt cctaggtgac tatgtggacc gtggcgtgtc ttcgtgcgag 900
ataatcttat tgctcttggc cttcaaagtg gctttcccgg acagtgtcca tttattgcga 960
ggcaatcacg agtgtcggag tttgagtaca ttttacggtt tccgtgccga atgcctcaag 1020
aagtacggac ctgtgctcta taaccgtatg atcaagtgtt tcgagagtat gccactggct 1080
gcacgactcg agacagcgca cggcacgttc ctggctgtac atggcggact gtcgcccgat 1140
attcagttcg tgggggacat taacggacaa gtgaaccgct ttatggagcc tgaaccaaac 1200
ggagctctgt gcgacttgtt gtggtcagat cctgcgaagg gcgaagctca ggagcaggag 1260
tgggcaccca atgggatgcg tggctgctcg ttcacattta atgaacgcgc ctgtcgcgaa 1320
tttctgaagc gcaacaacct cctggccatt gtacgtgctc atgaactgga agaaaatggt 1380
tataaggagc actttcgaca cgaaggagac cgcacagaag aagacgagga cgggaaactg 1440
gctctacctg cggttgtgac ggtgttttca gctccggagt actgcaacac gaaccacaat 1500
gtcggcgcga cgctgaaaat tccctgggaa agacaaaatg gtcgtctgct gcagtatcag 1560
cagcataaac gcagtcaatg ttccgagttt gagttcacgc gagccagcga ggagacggcg 1620
gccaaggcgt ttctggagga gaatttgccg ttcttgccga ttgactttta cgacttggtg 1680
aatgtgtgtc ggcagctgcg gctcactctt gagagagcag cgagtatcac cccagcacct 1740
gcttcagaac ctattcgcaa gctgtcgctt gtgtcgtcgc tgtgtgcgcc agcaactagt 1800
ctggaaacga ggatcgagga ggaagaccca gagcttcccg tgtcgccacc tgcttctgca 1860
ccagcaaatg aagtggagaa ggaagctaca gcaactctga aggcagtggg cgagtcgttg 1920
caggattggg aacttgttga gacgaagagt gtcgaggttg acactaggaa ggtgaagaaa 1980
gacaagaaga aggagaaaaa ggagaaaaaa ctgaaggaga agatcgaaaa gaagaagcaa 2040
aaggacaaga agaagtggga tacgagtcga attgctagcg gttggaagct ctgccctggg 2100
tttgtacgct tctacgaccg ctacttctca agagacagta tgaagaagag cgagccggag 2160
atcacctcag ctcctggcca tctaggcaag cggccgtcgt ggatctcaaa ctacaaaaca 2220
ccttttagac gctcgacttc gaccggcgag gcccccaccg acactgaaac tgtcgacacc 2280
gtcttggact ctaccggtcc tgctcgacgg aagagtatga cggattggat gcccatgccg 2340
tcgttcgagc aggtggcgca gctgacgaac acgcttcagg gtcacattcc cgtgcagtcg 2400
aacggcgtca atgtattcac gaaggcacag tggcaagctc tgaagttgta cttctcgatc 2460
ctggatctgg atggcaatgg cgttttgatg gaagagagct tcgttgttct cctcgcagag 2520
caagacagcg gtgggttgag ttaaagtgaa gtgaggatgt gaatttgttg ctaatttaaa 2580
ttgttgttgg tgttgtgtgc agatgcatac gcgactgaag acgaactgag tctgttgatg 2640
gaagtcatgg actgcaacgc cgacaatatg atcactgagc aagatttctt gctattcgca 2700
taccgagcct tactgcgatg gaaaaaagct ctacatggct ccgactagag tgtgcaggag 2760
cggaatcgaa ctgacgtagc gaagtatgaa caatgccaga ttagaatcca cagtagcgcg 2820
gcatatgccc ataatgaaga acgagaaatc tattagttga aa 2862
<210> 23 <211> 984 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 23
atgtccgcgc cgaccttcca tcgatcattc cgcaatttgc agcttccaag tcaacagtcc 60
aagctccaaa ccgaaacaag agtgatgatc gcaatttcga cagctgagga tttccactct 120
gccgtggccg ctgcgactca gaagccgttg gttgcctgtt tctccgcgcc gtggtgcggc 180
ggttgcaagt tggtggcgcc caaggtggac aagctagccg aggagcttgc cgagaccgtc 240
tcgtttgcca gggtgagtgc tgaggagcac gagacgttat gcgaagaagt ggaagtggac 300
agcttcccgc acttccgcgt gtacagggac ggcaagattg tgggtgacta cacgagctcc 360
aagttcgaca aggtggagtc ctttatccgc ggccatgtgg ctcctaatac tgtgcaggag 420
accgaggaaa cacctgaagg cgaggttacg gaggaaacgg cggagaagga tgctgcgaaa 480
gaggaggaag tgtcagctga ggctgcgacg gaaggctcaa agaagcgcca ggagcgtgaa 540
gaggaggaga cgaatgacga gcaggtggct aagaaggcca agacggagga ggaggcgtcg 600
acggaggctg agaaggctgc aactacggag ccagctgaga aggttgagga agcggcaacg 660
gaggagaccg agacggctga aaaggattca tcagaagaga agatcgaagc tgctcccgtt 720
gagaagtctg aaacggccgg gaaagacact gctccagtcg atgctgctgc tgcttaaacg 780
acactgctct gctttgcatg atgtctaaat cgacggacat cttctgtggg ctagctgggg 840
gctgattgat ccagctgaaa tcaagatgaa acaataaaaa aagaagtatt ttatggcgat 900
tcttttgttt gtgcccgata tcctcgacat gttctgaata catgtacatg tgctctgcct 960
tcttgtcaga acaatgtgga atgc 984
<210> 24 <211> 501 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 24
caagcagtga agctaaggaa caacaagatc aaacaaacca tacacctatc tacgatgcct 60
gtcgagatca acacccccga agagttcaac gccgctatcg gcgagaagaa gctgacggtc 120
gtgcagttct ctgcgccgtg gtgcggcggc tgcaagatgg tggcccccaa ggtgaccaaa 180
ctgatggagt cggacttcgc tgacgtcaag ttcctcaagg tgagcgcgga ggagctagag 240
gatttctgcg aggagatcga cgtcgacagc ttcccaacgt tccgcgtgta caaggacggc 300
gaagtggcgg cgtcttacgt gagctccaag tttgagaagg tagagcagtt catccgtgag 360
aatgcgaagt aagcgtgacg gcgatttgcg accgtctatc aaagctcgcg catggtgatc 420
tacaggcttg atgacctacg ctaagatggt ggagagcgag tgagtttggt ccccggcatt 480
<210> 25
<211> 734
<212> ДНК
<213> Phytophthora infestans
<400> 25
gcgtatcggc agtggactga a 501
gacaagcagt gaagctaagg aacaacaaga tcaaacaaac catacaccca tctaagatgc 60
ctgtcgagat caacaccccc gaagagttca acgccgctat cggcgagaag aagctgacgg 120
tcgtgcagtt ctctgcgccg tggtgcggcg gctgcaagat ggtggccccc aaggtgacca 180
aactgatgga gtcggacttc gctgacgtca agttcctcaa ggtgagcgcg gaggagctag 240
aggatttctg cgaggagatc gacgtcgaca gcttcccaac gttccgcgtg tacaaggacg 300
gcgaagtggc ggcgtcttac gtgagctcca agtttgagaa ggtagagcag ttcatccgtg 360
agaatgcgaa gtaagcgtga cggcgatttg cgaccgtcta tcaaagctcg cgcatggtga 420
tctacaagct tgatgaccta cgctaagatg gtggagagcg agtgagtttg gtccccggca 480
ttgcgtatcg gcagtggact gaaggatgct actaatatat tgaaatagga aaccatttta 540
acgaagaccc tgagcctcag gctcattctc aaccggaaat atagaccgca tgcggtccca 600
ggaggacaaa tagagtcttc taattggctt acggggtagg tggtcgcatg cgacgaagtt 660
cataaaaaga cgctcatgcg gcaatttgcc cgcatgcgct aaacttgccg cacagtagag 720
ctcgagccca agcgacaatg gcggcggtga ctggcagtgt ggtaagcgtt cagagtgtgg 60
cgcagttcga cgaggcaacg gcgcgcgagt cgacgctatc cgtgagtttc ttctgggccg 120
aatttcacga ggcctgccgt cccaatggac agctggacgt ggtggtgcgc cagctcgcga 180
ctctgcaccc tcgcatccgc ttcctcaagg tggcggccga ggagattccg gagctctcgg 240
agcgttttca gatcgccgta gtgcccactt tcgtcgtcgc acagggtcgc gccgtgctgg 300
acaaactcga gggcgccaat gtggccgaac tggccaagcg cgtggatgtt ctgagcaaga 360
gcgtggccaa gagcagctcc acatccgcgt ccacagccga ggacgccccg aaaccgctgg 420
atgacgcgct cgaataccgt ctcaagaagc tcatcagcgc gtcacccgtc atgctcttca 480
tgaagggcaa tccgacggag cccaagtgcg gctttagtcg acagatggtg gcgctgttga 540
acgaagaaaa gatccaattc ggcacctttg acatcctcaa tgacgacgaa gtgcgtcaag 600
gactcaagca gttttccaac tggcccactt accctcagct ctatgtgaat ggctcgctca 660
ttggcggact ggacatcgtc aaggagatga agtccgaggg atccatcgtc gagcaactag 720
gactcacgaa gaacgtcgag gaggctgaag ctgccttcca agagagtctc cgtgcactcg 780
tcaactccgc tccagtgctg ctcttcatga aaggccatcc gtccgagccc aaatgcggct 840
ttagcaagaa gacagtcaag ctcctacgtg accaccagat tggcttcagt tcgttcgaca 900
tcttgagtga cgagcaggtg cgtcaaggtc ttaagaagtt ctccaactgg cctacgtacc 960
cgcagctgta cgtcaagggc aaactcgttg gtgggctgga tatcctgaac gagatggcgg 1020
aggacggcga cctcagtgaa cagcttggcg tggagaagaa ggccaagaag gagaacaaat 1080
acgaacagct aatcaaccgc gctcgcgtca tgatcttcat caagggaacg ccccagcagc 1140
cgcagtgtgg cttcagtcgc aagctcgtgg acatcctgga cgccgagggc ttcaagtacg 1200
actactttga catcctcacg gacgacagcg tgcgtcaggg actgaaggag cactcgaact 1260
ggcccacgtt cccgcagctt tacgtcaatg gcgagttgat cggcggactg gacatcgtgc 1320
agcagctgca ggaggacgga gaactcgccg agctcaagga gtagacgacc aggtcatcct 1380
tcgcgtaaaa cgaatacaga aaatcatttc tcttatcctg catgtgtatg ctgggtttga 1440
tggtttaa 1448
<210> 27 <211> 1106 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 27
gtcggaagag gtcgtcggtc gtccatgcag ctgcagacgt tggcgtacgc catctccggc 60
gccttcacgc tgctttccat tatcctttcg ggatggctca tctggacaca cttgctgtac 120
aatccgtcag ccggcatccg caagcacgtg atccgcatcc tcatgatggt ccccatttac 180
gcgctaacgt cctacatggc gctggtattc aacgagtcca aactgttgtt cgagactgtg 240
cgcgatctgt acgaagcctt cgcgctctat tcgtttcact gcttcctggt cgagtatctg 300
ggtggccaat ccgttctagc aagcaccatg cgctccaagc cgcagatgac acacgtcttc 360
cctttctgct gtgtacagcc gtggtccatg ggcggcaagt tcctgcgtca aaccaccatc 420
ggcatcttgc agtacattcc cattaagctg cttatgagca tcgtcatgct catcacgagc 480
ttggcaggtg tatacggaga aggagagctc atgaaccccc tagtgagcta cggctacgtg 540
tgctttatcc tcagtgcgtc gcagacgtgg gcactttact gtctgctgat attcttccac 600
ggagctcacg aggagttgca gcccatgcgg ccatggccca agttcctggc cattaaggca 660
attattttct ttacgtactg gcagtcgatc atgattagtg gacttgtaag tgtcggggtc 720
atctcggaga agtggcatat cggctgtccg gactgctggg acgctcagaa aatcgcctcc 780
gcactgaatg actttgtcat ctgcgtcgag atgctgggct ttgccattgc ccaccactac 840
gccttcgcga ttgaagactt tttgtcgccg tcaggtacgg caggtgttag tgtgccgtct 900
tcgaacgtca aggcaccact gctggccaat tttatggacg ctatcaacgt gacggacgtg 960
tcgacagacc tcaagaactc ccggaacgag attctcacca agaaacaggc gctggctgcc 1020
aagttcgagc gcatgaactc gacttcacct ggtggtggca tgttttaata gcgtcagtta 1080
aaagggagcg atacagtaag cacacg 1106
<210> 28 <211> 2007 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 28
atgagctcac aggacggcgc tggtcgcgca tctgaggaca agaatggaga cggcgtgtac 60
gtgacgaaga accgctcgct cttctccatg tggctgcacg gcaaggcgat tccaagccgt 120
tctggtccgg ccgtggtgtt ccgctcggcc gacgtgatac aggaagggta tttgctcaag 180
cagggcctgc gacttaaaat gtggtcccgc cgctacttta tactgcgact cgaggagcga 240
cacatgactc tagggtatta taccagcaag gactctctga ctttatgctc cgagacgccc 300
atcggaccag gacacttgtt gggacacgtc aacacgacca aatacccgcg tcgtctcgag 360
ttgcgctgcg gtacaaaggt catggtactc gaggcggagg accaaaagtc gtatgaagcc 420
tggaagaacg ccctccaaga agcgatacgc tggaaccacg ccatggtgcc ttcaaaagac 480
ggcagttttg tcacgtacgg gaagcaagcg accgaggata taaaacaaga ggaacgcagt 540
cgcgccgagg cggccaagaa gctgcgagag aagcagcgag cggacgaggc cgccgccgcc 600
gccaacgccg ccaataaacc caaatatctg cccgcgacac gccccgggac gcaatgcttt 660
atgacatcga atacaagatt tgagattccc tctcatttcg aatatgtcaa aaccatcggc 720
tcgggcgcct acggagtcgt catctccgct acgagctcgc aaacaggcac cacggtggca 780
attaagaaca tccagcgcgc gttcgacgac ctgacggacg ccaagcgcat tgtacgcgag 840
attaagctca tgcgccactt gaaccacaag tgcgtgcttg gggtggagga cattttcgag 900
cccgtggcgc tgtccaagtt cgaagacgtg tacattgtgt cccaattgat ggctacagat 960
ctccaccgcg tcatctactc gagacacgcg ctgtcggacg aacacatcgc cttcttcatg 1020
taccagatgc aagccgtcca gcgagaggcg taccgagcgc tccatgggct tacattgatc tactttttga cccaacccga
.""",
gcccatccgt ttcgattttg gacgagatga agcagtgtcg gtagagcaag acgccaacag aatagcgaca ggcgaaccag tgtgtgccat acgtcctggt ttttccccga cggagatcat gtatcttcgc agctgcatct gcaacgcgcg cgaagcctct agatgctggt acttggctgc actttgagaa ggcatttcca ctaccacgca acacaacaga cgtcagagga agatccatag ctcgggaagt gaagtacgtg gaacgccaac agaagagctg gctggggtgt cgagatgatg catcatgaac tgctaggaag ggcgcacatg gattgacccg gatccggaat cgagaaattg ccctgaagtg ggcttctatc gacgacaagt agccaagcca gacagacaaa cgcataa cactcggcca tgcgagctca gaattgacag atgaagtaca tcgcgcaagc gcgctggggg ttcatgaacg ttcgcagatt aataagcgga gtggaggacg acgaaacccg ggcgacgaga acacccgtga gacagctcgg gaagacgaag ctgacagacg acgtgatcca agatctgcga aatacgtagt ctcgggaggt ctcttttccc ctccaaacga ccgagttcca cgcctccaga ttagtgtgga agacgaccgc tgctgcagag cagcgacgga cacctgtgac acgcccctgt acggggaaca cacagacgcg ccgagacctg cttcggactg cacaagatgg ggacgtctgg gggacaggac ccaggatctc gaagcgcgga cgctctggat cgaggcgctg cacttcgagc actgatctgg gggagatgac ccccgctacg caaggtatcg acacagcacc acaagaggcc
<210> 29 <211> 2053 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 29
gctcaagcca gagtccaaac gctcgttcaa cgcccattca acgctcgagc aacggctgat accgacatga accgtaagct ggagctcatg gagctggaca gcggcggcgc cagccctaac agcagcaaca gtggaagccc cagtccgact ctcgacctgc tgcatcgctc tgattcgagt
agcagtaacc aggggggtga gatgcctctt gtcggggttg cccacaaccc agacgtacgt 240
cgtctgcctt tctctatttg tagtgatagt attttcacgt agacgtttgt tacagctgag 300
ttatttgagg gcaactgcaa cacatggagg cagcagcacg accagcagca agtatggcag 360
ccccgaggag tcatttggtg aagaggacga ggacaacaac aagaagacgg cgcgtcgcaa 420
gaccgactcc aacagcaagc gtccgtggac acgcgaggag aatgacaagc tcatgcaact 480
cgtcaagcag tacggcgcca agcgctggtc tctcatcgcc atgcacctgc caggccgtgt 540
cggtaagcaa tgccgtgaga gatggcacaa ccacttgaat ccgtcggtcc gcaaggacgc 600
atggacggct gaagaggact atgtcatctt cgagtgccac aagaatgtgg gcaaccaatg 660
ggccgagatt tccaagatgt tgcctggcag gacggacaat gccatcaaaa accgctacta 720
ctcgaccatg cgtcgcatgc agaggcagtc aatccgcaaa aaaggtccca tgcgtgatgg 780
caagagcatc cgcgtggcgt cagtcacgtc gtctcccgtg caaaacaaca accaaatggg 840
tcctgctccc agccagcgat ctttgactgg catgcaacac cagttgccac cgcaacaaca 900
gcttccgcac cgaggggtga gtttccaatc cacatatcaa cggctcttct cggaggcctc 960
tggggacgcc gcacgcgtga gtcccgctgc ttcgaattaa ttggagagga tcgatactaa 1020
ctattatggt gttgatatat aatgcaggat ggcaactcga tagtggactt tgaacgttca 1080
aacatgatgt ccgcatcact acgacaaccc acgatggtct acccgctaaa cggaggtagc 1140
ttttcaaacg ggatgaaccc ggactatagt cgtcccatgt ccatgacgtc gtctccctgc 1200
tcggtgtccc ccgccgatga tctgaatcat aacagccaga acgagacctt tgactacgtt 1260
ccgatgcaat cttcgatcca gcgtgtacgg tcatctagtc cggttgtgat gggcactcct 1320
ccttcgacgt caataggcat gatgaactca ccttacggct cgcctgcaag tcacatccaa 1380
cagcaacagc ctggcaacta catgatggca ggaaacccat attctaacaa caacgtgcgt 1440
gggatgtact ttgggacgtc tgggcttgct cagcaatacc gtcctgatgc ccctgtaaac 1500
gtcccacaca agcgcctcct cgacgtccag ggttcacaac gtgatatgtg gaagaatgat 1560
agccctgtat cggtagcagc accgatattc cgcggtatgc cggcgacgca catgcagcaa 1620
ggtcaagtca gcgaaccgat ggcattgcag cagtccaagc cagcttccat gccactgtat 1680
aggcaagcgc cgaatatggg tcacttcaac agcatggagc aggtatggac ggatgatgca 1740
tatctgtgat tggaccgcca ttgtggcatg ctcctgatag actgcatgaa acaaatttaa 1800
agttattact taccaaagac agtggcttct cttactcttt acttggttaa cttttttcgc I860
ttgatctaca gcggtttcac gttaggtagc tgtagctcct gatcgagttg cttattaaat 1920
agcaccactt gttgacaggg attgatatta aaatgaattt ttttcagact aatatattag 1980
ctgatattac atgtaccaaa atgtcaaact aatagctgac tattagtttg aaaaaggcgc 2040
caaaacaagc taa 2053
<210> 30 <211> 1173 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 30
atgcttggcg acgtagacag tttcggcggt ctgggtccca ttccgtccat gaacgcggtg 60
ttggagaagc gcacgtcaag tcagttttcc attagctcgc tgctgccccc gtccgtgagt 120
gtctcgagta ctggtgtgtt aaacacaact gttacacgga gcgagagcgc agtgacagat 180
agtgttgaag caactaccga taatgaaggc caaggatctg caccaagggt gtctaccaca 240
actgcagagg ggtctggtgg caacaccaag tacatggacc ccactacggg cgactacatg 300
tacccggaca acgtcaagcc catgagcttc tacgacaaac aacgtcttgt gcagaagatt 360
acgatgcttc ccagtcaata tctgcgtggc ctcatggacg tcatcagcaa gtaccagcca 420
gatactgtac gtcagatcga cgacgatggc tacgcgttcg atctgggtca gatgaacgag 480
aatactgtgt gggctatcag tgactacgta aaggactcga tgattgagct ggatggatac 540
attaaatcac tcaaccaaac tgctattgac cttgctgccg gtgaggatcg acatggagaa 600
actgttctga cggccgcaag tgcggctaca cccaccagca gtgcggttcg ccacttgacc 660
gacactctgg cgatgaacac gtccaagatg tctgtcatca ctaataacga gaatcagaat 720
aaattcctgg aacaggtgga gatgtattcc aaacccaaag tgaccaagtc gcgtgtaaag 780
cccagcaaga agcaccagtg tccgacgtgt aacaagcaat tccgcggacg ctccgagctg 840
cagaaccata tcagaactca cacaggcgag aagccactca aatgctcgta cgcgggatgc 900
acgaagcgat atgcacacag ctcgaatctg cgtgcacacg agcgaacaca cgccggaata 960
aagccgtata catgtcacta cgacggctgc gggaagagct tcgcccactc tgtatcactt 1020
aaggaacata tttggatgca tgcaggattc cagccctacg tgtgtccgta cgagggatgc 1080
cagaagaagt ttacgcaggt ctcaaatttt gcccgacaca agaagacgca cgagaaggaa 1140
gacaacgaac actcgattga gagcgataat tag 1173
<210> 31 <211> 754 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 31
atgattaagc tcgcggccgg tgtgtccaag aaatccgtcg tcgatgtgta tgtcactctc 60
agtgtgcccg acagccccgt acttagcacg gcacagaaga acgtggagct gaacgtcgag 120
aagttcttcg tggtcagcaa gactctgcct gaattgcctt ccaggtagaa gacgctgccc 180
gccccgacgc cttcgtcaag gcaacggatc ctcctacgtg aacgtcggtc tggaggatcg 240
tctcaactcc cgtccgcttg acctgcatac acctgccaac cagtgtatca agcgcatcca 300
ggccgctgtg ggccagctgt tccgtgcatt cctcatccag cgcgacttcg tggagaccca 360
cacacccaag ctggtcgctg gcgcctcggg gagcggagcc aactgcttca cactcaagta 420
cttcgattag gacgtcatct tggctcagag tccgcagaag tacaagcaga tggcgtgtgc 480
tgctgctggt ctcgagcgcg tgttcgagat cggcccggtc ttctgtgctg agaactcgag 540
cacgcaccgt cacatgtgcg agttcgtggg tctggatctg gagatgacta ttaaggagca 600
ctaccacgag gtcctggagg tgttctcgga cctgtacatc tacattttcg atggcttgaa 660
ggaacgttac gccaacgaat tggctactat caacaatcag tacccgttcg agccgctcaa 720
gtacattaag ccgtcgctta tcatcaactt ctag 754
<210> 32 <211> 659 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 32
gggctccatg tcatctgcga ctttggacgg agctctctat tgtagaattc aactgactct 60
agacaagtaa ccatgcagaa cgaggccggc cagtcgatcg acatctacat cccgcgcaag 120
tggtgcgtat tgcgctggtg actttaatac gctcagagct actggagcta actggtgctt 180
gctattgtct gtcatcgtta tatagctcgt ggaccaaccg catcctggcg gccaaggacc 240
acgcctcggt gcagatcaac gtcggccgcg tgaacgccaa cggcgtcttc acgggtgagt 300
cggacacctt cgctcttgct ggctacattc gccaccacgg tgagggcgac atggccatca 360
ccgagctggc tcgccaggcg gacgccaaga actaagcaga ccaagttgtc gtgatcgcgc 420
gctgctgctg cgaagtggag tgtgcgttca tctacgtcta gctggcagtt caggaggctg 480
gtgattacga tatgtatcaa cagatacgtc tgtgatcgct ggcaggaatt gcggtaccgt 540
cgcttatgga gtcggttgtt tgcgggttcg acctcgcctt ttgatttgat cgggtgtagg 600
<210> 33
<211> 1049
<212> ДНК
<213> Phytophthora infestans
<400> 33
cttagtattt aactctggcc aacggacgag caagaataaa gtagttcaaa cccgtcaga 659
ctcgagcgca agacgatctc cgctatcgcc ccaccatgtt cgccagcttc gccactgccc 60
tcatcgcttc cactctccgg ccctcgagcg cagccgccac caactatgcc ggtggctggc 120
ttccgtcgga ccccaccaac cagtgtgtgg atatttgctc cgctccgtcc aagacgtgcc 180
tcacttcgga cgctgcctgc ctcgccaagt cgatggtccc gggcgacttc gactatatgg 240
tcctggagca gctcttcgtg ccgcagttct gccgtgacct gctaaagggt gtcgactcca 300
ctatttcgca ccaaaacatc gatatgtacc cgaacggcac agcctgcgtg gagagtgtgg 360
tcaagagtga gctcacgatt cacggtctgt ggcccaatta caacgatggc tacgtgagct 420
gctgcaatcc gagctcagcg gtggccaacg acccttataa cgccgctgac ttcgctgccg 480
cccaaagcag cctactcacc accatgggtg agaagtgggt ggacgctacg caagccacta 540
cgtacgaatc gctatgcgag atctacaacc acgagttcca gaagcacggt ctctgctatg 600
ccgctgacga cgctgattac atctcggctg ctgtcacgta cttcactgct acgctgagca 660
cggcggaccg catcagttca gccaccgagc agatcaacaa gtgggcagct cagtcgacgc 720
ctcagacgac tctggccgag attgaggctc tctacggcca cagtgtcatg gtgttgtgct 780
cggctgtgga tggcaacaac caactgtcgg ctatccgtac gtgctacgag aagccgacaa 840
acatcacgag cgagggagcg tccgcgcaga ttgactgcgc agccgcgacg gccacctcct 900
cgttctccgt atgctccggt gactcgccga tcactctgac tgcatacaca gcccccacct 960
cggcttcgat gcaataagct ccgacgatag agcgacggtg cagtctgcta gtataaagtt 1020
caatgcacca gttacttaaa aatgtacca 1049
<210> 34 <211> 1203 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 34
atgaccaagt ggggggttgt agtggcacta acactgctgt tagcgacgcc tagtttagtg 60
ctaggcgcct gccccaacaa gtgttccgga cacggcaaat gcggtctcaa tgacgtctgc 120
caatgcatgc agaactgggt cggcggtgat tgctcgggtc ggcaatgtgc gttcactcgc 180
gcgtggcaag atacagcaca gcgcgacgac gacgcacact accacgcaga atgtggcagc 240
cgcggaacgt gtgatcgagc tactggagaa tgcacatgtg acgcaggatt catcggcagc 300
ggctgtcgac gaatgcagtg tcccaatgac tgcagtggcc acggcacgtg tgagtttatt 360
gaggaattgg cgacggatac ggcccacaag cggattgggg gagtggcagg tcgtaaatac 420
acgctttggg accaagagaa gatcatgggc tgcgtatgtg acgccaacta cgaaggtcac 480
gattgctcga tgcgctcgtg tcctagaggc gacgatcctc tgaccccgaa tcaatacgac 540
atggtgcaag ctattattct tgataaggct ggcggtgagg ggtacttgac gtactatgat 600
ccgtacggca atgcgtatac tacggagaaa atcacgcttg gtggaacgct gagtgtcgct 660
tttcaaccaa cagacgatga taccacatgt gcaaacattc agaaggcgct ccgccgttta 720
ccgaacaacg tgctcaacac agtcactgtg gtagctgttg acaggtttta tgccttcaag 780
cgctctgacc caacggactc gttggggtat ggaacgttaa acaaaattgt aaatgacgac 840
gctgcagcgt acgcaggaac cggaactcaa attaaagcga tgtgcgaggt gatttttacg 900
tcggagccgg gcactacggg gtatcagaat ttgctggatt gcaatgttgc cgcgcatggc 960
gatactaagg gccagcaccc gcttactact ggtgtaacgt ctggcacttg cgtcgttaaa 1020
gaagtctatc cggtgacgct tggcacgagc aacatgcttg ccgaagatac tccagcgtat 1080
cgtccattga ccgagctcac cgagtgtgct ggtcgcggca cctgcgacta cgacacagga 1140
acatgcgagt gcttcgcggg ccacatgggc ttggcatgcc agaagcagga agcgctcgtc 1200
tag 1203
<210> 35 <211> 7947 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 35
atggcgcgcg ctccggcaca attggcgcag cttttactag cggcgctgct gctgtcagcg 60 atgtgtgagg cgttattgcc tatcacgaac gcgctgcagc gtgcccgcca aaacctcacg 120 gccttgcagc ggcaatggat cgatccggac acggacccca agttctacaa catatcagtc 180 cccaagggtg ccttcaactt cggtggcaac tcgagctaca acaacgagta caagctcatc 240 ttctcggacg agtttaatag ctccaagcgc acgttcgagt cgggtttcga ctccaaatgg 300 acggcagtca acctccgcga taccaccaac atggggcagc actacttttt gccccaggct 360 gtgcagatcg acaagggcaa cctcatcatc acgacctcca agcccaaaca gcgctaccgt 420 ggcactaagt acgtcagcgg tgctgtgcag acatggaaca agttctgtta caccggcggc 480
tacgtcgagg taagggccat tctgcccggc aagtggggta tccccggcac gtggcctgct 540
atctggatca tgggcaatat cggccgtgcg ccattcctcg gatcccagga cggtacgtgg 600
ccgtggagct tcgactattg cgccccctac gtggagaagg ccgagaaggt caagcagaag 660
atcaatgcct gtggcaatct gaccaacaaa cacgacaagg aatcgtatcc agagatgtac 720
ggcttgaacc cctttcaggg tcgtggagcc acggaaatcg atgtgattga agcgcagatt 780
cgtgctcgtg atgagcctgc attcatctcc acgtccctgc agatccgtcc cagtctgtac 840
gatgatatgc gcccggcttc agagtcgctc cctgctcctg gacaatggta ccagggtctc 900
aagtttggtg agttcacgaa aatcaatagc gactactacg gtgagatggg cctcgactcc 960
atttcggctc tgacacagct cgagtccaat gcgttcaagt cgttccactt gttccgcctg 1020
gactggtctc ctggtcccga aggttacatt cgatggtgga tggacaacag cttcgtgttc 1080
gaaatccctg gatccgcgct gaataagtgg gtaggtgctg tcccccctcg ccagatcccc 1140
gtggagccta gttatctcat tctgagtacg gctgtttcgg agaagttctc tccaccgtgc 1200
gatgggcaga tttgtaactc gctatggccc tccaacttta cgatcgacta cgtacgcgtc 1260
tatcaaggca acccgaaccg gtatacttcg gtgggatgca atccggaagc ctacccgacg 1320
aaagattgga tctacgccca cccagtggaa tacggtctcc cgtggtatgt ttcactacgt 1380
gtggacatcg gtctgctgca tcttttcgct gtggttaatg cgctgctggg tctcttcatg 1440
gcgttccgtg gcacgtccca accgaagatg ttgtcagcgt acgccagctc gttgtggctg 1500
actgcagcct tttatggagc tcttagttca agcgcccccg tagaccttgc ttggattcag 1560
actgcgcttg cgtgtctgtg cgggctggta cttggcggtc tttgttgctt ggtgtacccg 1620
gtttcgcttg gtgcaatgct tggactgtat ggcggggtga tagctagcca attcgtgcct 1680
ttgctgtcta cgcgcgtgat cactgcatta ctggttggtg tgggaatcgc gctaggatct 1740
gctccacaga tcgacacgaa gcacgttgtg attctgtcga cctctttgct tggtagtttg 1800
gcgtttctgc tctctgtatc gctgtgggtg agtgaaggcg atattgctga gaatgcgtgg 1860
aatctcgctg gcttcatttt caatggtaac aacgatgacc acgtgggttt ctgcacgaaa 1920
tattgcctgg cgatgtatat tctgcttgtc gtactcagtg cggtgagcac tacgtatgga 1980
tacctccgta tgcgtggcgt gacgctgcgc accaacccgc gtgaggccaa gttccccgcg 2040
gtgtcagcaa gttctgacgc gcgggcttgg agacctgatg atgatgcggg cgtggagaag 2100
actacggtga attttttctc gccatccaag ctgccgtaca acatgcagca gttcagtacc 2160
atcttccgta tcgctgtgaa cgtgcagcgc tcgtttggct tccaacttga caacttccgc 2220
aaccagacgg aacacgttgt ggtgcttctc accaacaact cgcgaaagag cggaaatcct 2280
taccgcaagc tgcacgattt ggtgttttcc aactacaaca actggtgctg caagcttaag 2340
atccagcctc tgaactgggg cgagcagcga ccaccgcagg gtggtctcac aatggtggac 2400
gagatgtcgg tggacttgtg tctgttcttc tttatctggg gtgaggccag caacctgcgt 2460
cactcgcctg agttcctgtg tttcctgttt cacaagatga aagaagagtt cccgtccgtc 2520
cgtcactcag agcgcgaggc tggatacttt ttggatacgg tggtgacacc tgtctacggc 2580
ttgctgaagg ctgagatgac ttcaaagtac gaccatgagg accgtcacaa ctacgacgac 2640
ttcaacgagt tcttctggac gaagagatgt ctgaagtatg actacaaaca cgaagaggtc 2700
attgatttgg cgtcacccaa tccggctatg atctacaaac agaagcagca gcaacgtcaa 2760
ggtctgactg gccttggagc ccaaaaggct cgaggtggac tcaacggtgg ctcgaacggc 2820
tccaacttgt tcaacaagcg tcaaagtatt gccgagggat tcaccgagtc tgccaagacg 2880
ttcgttgaga agcgtacgtg gctgctaccg ctgcgcgctt tcaaccgtat cttcaacttc 2940
cacgtcatcg cgttccactt cttggcaatg ctcgcgttcg cgaatgagca agagatggac 3000
ttccaggacg cctgcaagat tatctcgagc actttgatat ctcacttctt gctggacatt 3060
ttacgtgatg gactcgacat tttcgctgtt tacgacgagc accggaaagt attctcaatg 3120
gcgcgttccg tgatgcgtgt gtttctgcat ctggctcttg tggtggtcac gtcgatgtta 3180
tactggtatg cgtgggcgta cggtggtgcc tggtggcagt cgtactacgt gaccgcggtg 3240
ctattccacg tgccaggcct gattaactgc gtcatgcaag tgatgcctgg tcttaccaac 3300
tggacacggc gcacggcgtt tgctcctgtt gcatttatcc gtgacattgt gagtccgatg 3360
aaccgcttat acgtgggtga caacgtgctg gatccggagt cgatgagcgt aggctaccag 3420
ttcttctgga tgtcgctatt ggcttggaag ttatacttcg gctacgagtt tgagatctac 3480
ccgcttgtgg tgccgagctt tctgctgtat gctgaccacg tggagaacaa cgtgagcatg 3540
attacgacag tgttcctcat cttcctaaac tggatgccgt tcttcttggt gttctgcgtt 3600
gacattacga tttggaactc gatctggatg gcattcacgg gtacgttcgt tggcttttcg 3660
tcgcgcattg gtgagattcg caacttcacc cgcgttcgat ctgcgttcag tcgtgctgtg 3720
gatgcattta acgcaaaggt gattgcgcga agctccaaga cgggacttca actctcggac 3780
agcaatggca cgtcgtatgg atcgacatca gtaggtcacg aggtgcttga tcgtgttgcc 3840
ggtggtgcgg atccgacgtc ccgcctcctg ttgcagcgcc ggacatcagc ccatgacgac 3900
gagactccgt tactgtcttt ctcgcgtcgc aaacagacgc ctacggagcg ccaagctgct 3960
cgtcgccgca agtggttctc gttctctgtg gcctgggaca ctatcatcga tagcatgcgc 4020
gcggatgatt tgatctcaaa caaggagaaa tctctgcttc atttccaccg tcttgacggc 4080
taccagcgcg aaatttacct gccgcagttc caacttgctg gttgcttcga gaactttacg 4140
tcgcacattc ttgatattta ctcgtcgaac aacggcaagg tctcggagcg tgtgctgcaa 4200
gacaaactac tggaaattct cagtgataac ccaatggtgg aggagtcact tgaagagata 4260
tgggagcttg cgaactgggt gctggttaat gtgcttggtc cctgtcacgc gaatgatgtg 4320
aagtacatca catgtgtgct caactcgtgg gccgctcgtg gtgtgttccg tgcgctgaac 4380
ttgcaaaagg tggctccatg tggccgcgct ttggcgggtt tgatctcgct cttgaaggcc 4440
aacgtccgag gatggaagag caacgccaag gttatccctg ttcgcaaaga cccatccgac 4500
tacgcttcgt acgagtttcc gcaacagtct agctcctacc gtccttcgtc ggggcttact 4560
aagtctgcaa gtacgacagg tctgtcgtcg ttgggtctcg aaccacctcg tcgtagtcgt 4620
ggctctggtg ttgcgcgtat tgcacgtatg cagcagcaga cgcacaaacc agctgtcaac 4680
aatggcaagc ttactcattc tatctccagc tctcacatca tgcagattcg cgagcgcgtg 4740
cgtacgttcc tgaatcttgg aaaggagatt ctggcccacg tccacgagca agaccccgtg 4800
ttcgctgaaa gcaagggaat ttcggatcgg ttgacgtgga ttcttacaca ggagcgtggt 4860
tttatgtggg acgataatta tacgggtgaa caaatcactc tcacagcgtt tgagagccac 4920
accgatgtgg tgttatcgca tctgcacgga cttttgacct tgcagaagat tgatgcggag 4980
ccccagtcgt acgatgctcg tcgccgcttg ctgttcttcg tgaattcgct gttcatggac 5040
atgccgcttg ctccgctgct cgaggaaatg aagtcgtgga gcgtcatcac tccgttctat 5100
gccgaagacg ttctgtactc cagaaaggat ttggaaagca aacaggacgg tctggacgtg 5160
cacacgctgt tgttcttgca gacgctgtac aagcgagact gggagaactt cttggagcgt 5220
gtgaagccta agaagaacat ctggaaagac ccggagactg cgatcgagtt gcgtatgtgg 5280
gcttctctgc gtggccagac actgtcacgt acggtgcagg gtatgatgta cggtgaagct 5340
gccattcgtt tgctggctga gatcgaacaa gttccccaac agaaacttga ggagttgatc 5400
aacacaaagt tcacgtacgt ggtggcctgc caaatttatg gacgtcagaa gaagaacaac 5460
gacccgaagg cgagtgacat tgagtttttg ctgcaccgat tccctaactt gcgcgtggca 5520
tacatcgatg aggtccgtgt gaactaccaa aaggaacagt catacttctc ggtgctcatc 5580
aagggcggcg aggaactcgg ctcagttcac gagatctacc gcgtgcgtct gcctggcaat 5640
cctatcttgg gcgagggcaa acctgagaac cagaacgcag ccattgtttt cactcgcggt 5700
gaaaatctgc aggctatcga tatgaaccag gatggatatc ttgaagagaa cttgaagatg 5760
cgaaacctac tcgaagagtt tgacaagggt acggcagacc ggccgtacac gatcgtgggt 5820
atcccggagc acatattcac gggtagtgtg agctcgctgg caaactacat ggcgctgcag 5880
gagacgtcgt ttgtgacgct aagtcaacgt acgttggcgc gtccgctgcg tagccgtctg 5940
cactacggtc atcccgatgt gttcaacaaa cttttcttca taacgcgtgg cggtattagc 6000
aaggccagta agggtatcaa cctcagtgaa gatatctttg ctggctacaa caattgtatg 6060
cgtggcggtt ccgtgacttt cccggagtac accaagtgcg gcaagggacg tgatgtggga 6120
atgcagcaga tctacaagtt cgaggcaaag ttagcgcagg gtgcagctga gcaatcgcta 6180
tcgcgtgacg tgtaccgtat tagccagcgt ctcgactttt tcaagttgtt gtcgttctac 6240
tacaaccatg tgggcttcta cctggcgatg tcaatcatca tctggactgt gtactttctg 6300
ctgtactgca acttattgcg tgcactgctg tcggttgagg gtgttggcgg tcgtgaaccg 6360
gtattgctaa gtaagctgca gttgatgctt ggatcggtgg cattcttcac tactgcgcca 6420
ctgctggcga cgatttcagt cgagcgtggc tttaaggcgg cgttgaacga gatcattgtc 6480
ctgttcgtga ctggaggccc gctgtacttc cttttccaca ttggcacgaa atggttctac 6540
ttcggacaga cgattcttgc tggtggcgcc aagtatcgtg cgaccggccg tggattcgtg 6600
acaaagcact cttcttttga tgagctttat cgtttctacg ctagcagcca cctctatgct 6660
gcagtggaga ttgccattgg gctttccgtt tactacaagt tcacggtcgg caatcagtac 6720
ttcgcgctga catggtcgct atggcttgtg ttcgtgtcat ggtactggtc gccgttctgg 6780
ttcaacccac tggcgttcga atggtctgac gttatggagg acttccgtct atggttcaaa 6840
tggatgcgtg gtgacggtgg taaccctgat caatcgtggg aggcgtggtt caaagaggag 6900
aacgcgtact tttcgacgct tcgaccgtgg tccaaggcgt gcattacgat caagggcgtg 6960
ctgttcgcgt tgatcgccgt ctctatctct tcgacgagtg acaaatatca ctcgatcttg 7020
acggaaacca cgtggcttcc gctgcttatc tgcttatcga tggccgcggt gtatcttagt 7080
gcagaggctg tcttcttcac ctcgtcgcgt tcgggcgaga ccgggcttgt tcgcttcctg 7140
aagctccttc tggtgattgt gctgggcgct ggtctgattc tcgctttcat ctacgcggac 7200
ggtatgtggc agatgctgct gagtatggga tatctcgctg cagctatggg ctgttgggcg 7260
cttgtgatcc ttggtagcaa ctcgcgcttt gttggaacgc tttacttcgt tcatgacgcc 7320
gtgctgggtt tggtttcgct gagtctcatt ctgttgctct cggcgctcta cgttccgggc 7380
aagatccaga catggctact gtacaataat gctttgagtc gtggcgtggt gattgaagat 7440
attctgcgag ccaactcgag caatgatgaa cgcgatgatg atctgtcagt gcagcagatg 7500
cgctccatca tccttgagca gcagcgtttc atcaacgctc tgactgctag cggcagcgag 7560
actgacatcc gcggtgctgg tcctgggaag aaagaagatc taatgcacgc tatgagcgac 7620
aacacgctga acgcggtact gaggaatatg tcggagtcgg aactcagtgc gctgcaggac 7680
tcgtcgattc gtctgcaggc catcatgtcg gaggaggagc gcaaggccgc acaacgcaag 7740
cagcaacaag aagagcagag actcaccgag gcaggaatga actcgtcgtt gtcgcgcacg 7800
cgtcgtgcct tctccacgag cgatttctcc gccatcccgc tgaatgctag cccctacagt 7860
cttgctccta ctcaggatgg ttccgctgca cccgtcaacc gccccactaa cggttctgct 7920
gctcacggag cttatcctga tgtgtag 7947
<210> 36 <211> 6744 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 36
atggccacga cgcccggcgg caagatggac cggcgccgcg ccggctccaa ctacttccag 60
ctcgatgcgg accgcaagcg caacacgtcc aacaaccgca gcaactacgg cgacggccgt 120
ggcaccttcg gagaccgctt gagcttgatg gaggtgcttc ctcccaacac acagggcggc 180
aaccagatgc gcggcggtgg cttacagggc gactttgcgg acgaagtgtc gatcgatttt 240
tgctgcgagg tactgtacaa caagttcggc ttccagtcag gcagtgtgga caaccagcgc 300
gagcacgtgc tgctgctatt ggccaattcc aaggcgcgtg ccaagcccca ggaccctccg 360
ggacaccacg tcgtcacgct gcacaaaaag ctcatgagca actacacgga atggtgccag 420
ttcatcggcg ttcccagcat ctcgtactcg ggacagccac agggagacct caagaaccct 480
ctgcacatgg acattatgct cttcctgttg ctatggggag aggctggtaa cttgaggcat 540
atgcctgagt gcctctgcta cttgtaccac cagtcgctaa acttgctgaa ccaggacttc 600
ctcggtcagc agaaagtacc tgaaggttgg tacttaaggc aggtggtgcg ccccatctgg 660
aaggaggcgt ctaacatgca gaggaagaac agcttgggca agaacttgga gcacacccaa 720
gtgcgcaact acgacgatat caacgagtat ttctggaaaa aatactgtct taacgtggat 780
gtcacgcaga tcggcgagga gctgaccaag aagcacacca agacatacta cgagcaccgc 840
agtatcttca cgctcgtact gaactactac cgtatttttc agttcaacat gatgttcatg 900
atggtcctga tggcgatcgg ctttatctcg gccatctcgc ctagcggagg acagcagtgg 960
ttcgctcagt tcgggtctat gggagaagtg gttgagcctt accagaaaca ggacgttaag 1020
ctgacctacg tggggattgt gttcgccctc tcctcgatgg gattctgcaa gaccgtcctc 1080
gaagcgtgtc acggatggca cttactcact gccagtgagt cgtcacagac gtcgtctcgt 1140
tcgttcaact acggtggtgc ccttgtggtt cgaatgctct ggaatggcgc gttcgctggc 1200
attttcggct tgatgatcta caccccgttg atcacgagca agaacacaga actgctcgat 1260
aaggctgcac cggcgtctgt tgcctacatc ctgcctggcg cacttattat cgtcgtgcag 1320
gcctttgctc catcggttgt aaccaaatcg tttgcggcca agtttatccg tgagggagaa 1380
acgtgctacg ttggccgcaa catggcgcct ccactgagct accagctcaa gtacatcact 1440
ttctggatca ttctgtgggc gctgaaggcg ttcgtctcat acttcattct agttcgccca 1500
ttggttctcc cgtcgctggc catttacgag atggagctcg agtacggtag caatgttgtt 1560
tcgttccaca acttcggagt catcgctgcg ctgtggctgc ctgtgatctt catcttcaac 1620
tacgataccc agatttactt taccgtgttc caggctacac ttggtggcgt tcagggtctc 1680
atcatgaaga ctggcgagat tcacggcatc aaggagatta ccaaggcttt ccgtgtggct 1740
ccacaactct ttgaccagaa ggttgtgacc aatctggctc gctcgaacga cgctgcggct 1800
gacggatctg ctgctgcata ccagtcgcaa atgatgctgc gcttcgtggt cgtctggaac 1860
gagattgtca actcgttccg cgaaggtgac ctggtggacg acaaggaggc tgccatcctg 1920
cagtatgaca tccagagctc gggcgacgtg ttcgaacctg tgttcctttc ggcgggtaaa 1980
ctgatggaag ctctggacta cacggttaag attgccaagg aaggtaaggg cgactcgcag 2040
cttcaagtgt acatggtgca gaaggattgt ctatcggctg tgcgcagctt cttcacagcc 2100
agcatgtacg tgatggaggc tctgctgggc agtgacgatg cagacattct tgatgcgctg 2160
cgtcaaatgg aggcgattgc tgcgaacagc agtttcatga gcacgtttga cgccaagagt 2220
ctagtgcagc tgcgcacagt ctcgatggag ttcctggaag ctgtgatgga tctgcccgac 2280
ccggatgcgc agtcctcgca catgacatcg tctcgagtgc acaccatggg agttgtgcgt 2340
aacttcgtga ccaagatgga aaacctgctc aacgctattc gcattttcgc caaccgcccg 2400
gagctcgctg ccaagttcag caactctaag ttctgctcga gcgccaacgg ctacgtgttt 2460
gctgctcgtg gcctcgtgaa cctgttccac aacgacactg cgatgggtgc tgctacccgt 2520
gcgtacctct tgatgtcgct cgagaaggcc gatgctatgc cccgtgtgcc tgaggctcaa 2580
cgtcgtcttg gttttttcat gaagtctctt ttgatggaca tcccgcagtt gacgtctgtg 2640
aaggagatgc actcgttctc cgtcgtgacg ccgttctaca gtgaaagtgt gttgatctca 2700
ttgtcggagc tgaacgatcc gctggccaac cacccggtct tccagaaggt ggaggagaag 2760
ggcaagaaca ttactattct gaagtatctg attaccatcc accccgagga gtgggagaac 2820
tttttggaac gtattgatgt gagcactgca gaggaagcac aagccaacta cccgctggaa 2880
atccgtctgt gggcgtcgta ccgtggtcaa accctggcac gtactgttca aggtatgatg 2940
ctgtacgagg atgctatcaa gattcttcac tggcttgaga ttggttcaag tcccggcaag 3000
tcggcggagc agaagcaggc tcaacttgag gacatggtgc gtctgaagtt ctcgtacatt 3060
tgtgcgtgtc aggtgtacgg taagcatcgc gcagagggca aggcccaggc cgatgatatc 3120
gactatctgc tcaagacgta cccgaacctg cgtgttgcct acgtcgacac catcgtgatg 3180
gacggtggca agcagttcga cacggtgttg atcaagagtg aaggcaatga aattgccgaa 3240
gtttaccgct acgagctgcc tggagacccg attcttggtg aaggtaagcc cgagaaccag 3300
aacaacgcgc ttccattcac gcgtggcgaa tacctccaga cgattgatat gaaccagcag 3360
cactacttcg aggagtgtct gaagatgccg cagcttctgg tgactgctga cctgcaccct 3420
tccaagaaac ctgtgtccat tattggtatg cgtgagcaca ttttcacggg taacgcttca 3480
tcgctgtcaa agtttaagtc gtggcaggag ctggtgttcg tgacgctgtc tcagcgtgtg 3540
ctggccgacc cgctgtatgt tcgtatgcac tacggtcacc ccgatatttt cgacaagatc 3600
attgctatgc ctcgtggtgg agtgtccaag gcttccaagg gcattaactt gtctgaggat 3660
gtgttcgctg gttttaactc gacgcttcgt ggtggtgtgg tgacgcacgt ggagttcatg 3720
cagtgtggta agggtcgtga tgtggctctg tcgcagattt ccatgttcga gggtaagctg 3780
gctaacggtg ctggcgagac gtctctcgct cgtgaggctc atcgtatggg ccagttcatg 3840
gacttcttcc gtctgaactc catgtactac tcgcacacgg gtttctactt cgccacgtgg 3900
atgacaattg tcacgacctt cgtgtacatg tactgcaagg tgtacttggc tctagcgggt 3960
gtgcagcagc agattgtgta cgatatgaac acgaccgctg tgatcaccga gaacatcgca 4020
aacaacttcg acgggcgtgt gttcaccgat ctgaaggctg tgctgaacac gcagttctac 4080
atccaagccg gtactttcct catgcttccg ctcatgtgtg tgtacttcgg tgaaggaggc 4140
ttcgtgcgcg gtatgactcg attcatcgac atgatcatca cgctgggccc tgccttcttc 4200
gtgttccagg tcggtacgac gatgcactac ttcgacaaca acatcgtgca cggtggcgcc 4260
aagtatcagg ctacaggtcg tggcttcaag atttcccgtg agacgctggt gctgctgtac 4320
aaggcgtatg caagctccca ctatcgaaag gcctgggagc tcatcgggtt gtgtcttgtg 4380
tacatggcgt tcggtaattt ttacatctgt cggaccgatg cggctgccaa cgacaacact 4440
tttgcgtccg actactgtga gactgctcag gcttacgggg tgcagacgtt ctcggtgtgg 4500
ttcatctcca tcttgtgggt ggtgggtccg ttcctcttca acagtgacgg tctggactac 4560
aggaaaacca aggtggatat ccagcagtgg tgcatgtgga tgtttgcccc cgaagactac 4620
aaggacgacg acccggccaa caagggaggc tgggtaggct ggtggaaggg cgatctggag 4680
cagctgcacg gctccaacat gatctcgcgc gtcacggtca tcctccgcga gtgtcgccac 4740
ttcctgctca tgttctacgt ggctacactc gagacgtccg acgtcatgta cgtggcgtac 4800
tcgttcggtg ctgcggtcgc gacgattgtt ctgcttggcg tgttccatgg ctttggtatg 4860
ggcatgcgct ccatgagccc ggtgacgcgc gctgtgatct acatggggac cgtcgcagcc 4920
atcgtgacgg cctacttctt ggccacttgg atcgtgctgg actggaaatt caagtacgcc 4980
atgtcgctct ggttcgccta cgtggctgcg ctctacggta tcaacgagtg cttccgcatg 5040
tggagtttcc caagctcgtc gatcgctggc attgctgtgt tccagcagct acagttcctc 5100
ttcgacttta tcttctgcat tggtatgatc atcccgcttg tggtcatgtc gtgcatcccg 5160
ttcctgaaca tcatccagac gcgtatgatg tacaacgaag gcttctccaa ggtcatgtct 5220
gcttcttcgc agtatgcctt ctctctggca gccttcatgg gaatcctggg cggtatcggt 5280
gtcggctggc tgttcaactt gctgtcaacg ctggagcagt ctgcgagttt cgcaagttac 5340
gtcgtcacgt acgatggcgt cctaagtgga aacgtgggcg atggcaccac gacgtacatg 5400
ctctacggtg cctgtgtggt gggtacgatc atcgctggct tcctcaactt cttcctgggt 5460
cgtcgtctgg ctattgttgc gggtggtctc ttcagtacgc tcggtatggt ggctgtcagt 5520
gccaacgacg atctccgttc gacgctgctg atgcctggta tcggtctgct tggagcctcg 5580
tgcggtattc tgctaccgtc gttggccatc tacatcttcg agatctcgac caaggagatg 5640
cgaggcaaag ccatgttgtt gctgggaatc ggcttcatca tcggcagttt gctgggcggc 5700
attttcgcga ccgtgaacca gctgggatgg atctggcaga cgtttgctgc ctgcatcgtg 5760
atcgccctgg tcacgccagt cgtcaatgtg ttcccagaga gtccgtactg ggtgctggat 5820
cgcaagggct gggacgcctg tgaagcctgt ctcgttatcc tgcgtcgtaa acctgatgtc 5880
caagaggagc tcaaggtcat gcgagaagag gaaacggcag atgaaggcgg cgccggcgcc 5940
tacaagttcc tcatcggtct cttcctcatg ctcgtgtcct ctctgactac tggtttcctc 6000
aacgccttca tcagctacaa gggagcgagc gagtacacgg accaagacca gctgttcgtg 6060
aacgcgatgg cgctgcagat ctccggtgct gcgatcgcca tcttctacat cgacaagctg 6120
gaccacaagt cgattctctt cggaacgttg atccctatcg ctatctgtgc tggcattctg 6180
ggcttcaacg agaactcaga gatgctggga gacaaagagg gctcgggtct gtacctcagt 6240
cttgtagtca tgctcatgta cttcttcatg gggctgggca cgagctctgc tctgtggtcc 6300
gcatgcgtcg gcatgttcaa tactcgcggc cgcgcctcgt ccaccaccat gctgttcgct 6360
atcttcttcc tggcggatat gggctacgtc tacttgcaca cggacgactc gatgatgcag 6420
aacgaatatt cctatctcta cgccatcgca ggcttcagtg tcgtcgccct ggtgctgtta 6480
atgggcgcag gcaccaagaa gaacggcgtc atctgtacca agtcagaagc tcagcgcgat 6540
cgcgaccgta tcgctcgtat gcgtgccgaa cgtgcaagtc gcaacacgcg gacgcctgga 6600
actgcgcgcc agcggaatct cagtcgcgtg cggtccaagt cgaacgctgg cggccagcgg 6660
ggcaacgcgg cgcatggcgg tggctaccaa atgtacgaaa cacccgccaa cgctgcgccg 6720
attcgagaga tttttcgaac tctgacatcg ttgcaaccat aacttgcctg cattaaggtg 60
ctcctcaact gtacccatgc cgagcaccca tcgactctgc cagtacgatg cttcaccaaa 120
gttttagtcc acaagaaaag ccgaaacgta catgtcgtaa cggaagccgt gcgacctttt 180
accgttcgtg cgctggtctc acgtagcttc attctccttc ttccctagcc agcaaaggcg 240
tctcccaaga tatcccagca attgtctatc ggttaagatc aaggagtaaa atgcactcgg 300
cgctgttctc gtgctcaact ttggctttga tcacgagttt ggtctcctca gagcgtgccg 360
actcgatgat caaatctcgg tctggattga gcccctgggt ggacgttgac acccccgaga 420
gtgcactcaa cgtcacgtcg tcgcgtggag atacgtggac gttggtcatg agcgacgaat 480
ttaacgttcc tgggcgtaat tttacgcccg gttcggatca catgtggacg gcgttagaaa 540
tgcccgacgg tgtcaatgca gctctcgaat actacagctt caatatgacc gataccgtaa 600
cggaatcgga cggtcgtggt gtcttccgga taaagattat ggaagaggac aacatcacct 660
acacggtgtg gaacacgtac gctaagcctg cgggtttcga gacccatcac atgtactacc 720
gagccggtat ggtgcaatcc tggaacaaat tctgtttcca aggaggaagg atggaagtgg 780
tggctcaatt accagcaaca accagctcta gtaaccccga tatgggtgac atcaaaggtc 840
gcgtcaagac gaacagcttc tatcccacgt ggcctggtat ttggcttcta ggaaatctag 900
gacgagctct attctcccaa tcgaccagtc ggatgtggcc ttggagttac gacgaatgtg 960
acgaaaaatt cgaatccagt caaagaatca gtgcgtgtga cggtaatcca ggaagtggat 1020
tgaatgctca tcaaggacga ggagcgccgg aaatagatct actggaagga ggaggtgtag 1080
ccatctccac aagtatccag gtcgctcctg gaatgcccga taaattccgt atcattgctc 1140
ccacggatga taaaagtccc ttctgcgtct tcacggccga gtgtactact attggtgcta 1200
actttcctgg gatcccagcc aaagcgtacg aagctcgaga ttatgaaagc tggtatcaag 1260
gactacggta cgctccaaat actctttgta gcccagttgg cagcttgatg caagatccca 1320
aaacggtgct tgcaaatgcc gagaaaggct tcacttctaa tacgtgtaaa ggagtcaatg 1380
cgtgtccagc ttcgggtgac ggatactccg atttaggctt gatcgacggg aaagggcctg 1440
attactgggg ggttaacaaa gaaggcggct gtatgccggt tattaacgga tacacgggag 1500
ctttcctatg tgaccctgac agttccaaca aaaaatgttc ctctccgtta ggtgcggaag 1560
aacccaagag taaagttatg gaaccattcg agtatcagat ggacgccctg tccgctaatt 1620
ggccagttca gctcgcagca tatacaagtt atgtgaaata ccaagtcgaa tgggtcatgg 1680
gctcacaagg ttacattcgc tggatggtcg aggatattgt gatttttgaa attccagccg 1740
agtcggtcga gaatgttcca caagatgctg ccaagtccaa ccctaagaaa ctcatgttgg 1800
aagaacccat gtacgtgatt ttcaacgtcg ctctgtcaac tagttggggt accacgccac 1860
cgaatccagg gtcgccatgt cgtggagatg ggagcaatgc gcaacataac gctatttgtg 1920
acggtttccc catgttcatg aagatcgact acattcgtat ctatcaggat ctctcttcca 1980
actccacgat ggctatcggg tgtgacccgt ctactcatcc gactaaacaa tggatcgagg 2040
atcacattga tgagtatgag acgacggaga ataaatggat tgaggttcac ggtggagcca 2100
attgcaagac tgataacgac tgtacggtca gtacttctca cattttgacg gggaaatgta 2160
gcaagaaaca tcgctgtaga tgcggatctt ccggtgcttg gggtggtcca cgttgcacaa 2220
ctccactagc tgatacagcg aatggagaag gcttcggacc accaacagtt attacgagct 2280
tggttggtgc attcgtcatt gtgcttttgg tctttgtggt gtacaagata atggaccaac 2340
gcagcaagaa ggcgatggtg ggagctggga ttactcaacc agcaattctc tccaagatcg 2400
agatggacga catcccacgt tcaaataaaa gccagagcgg ctcggaggat aaggtggtgt 2460
ag 2462
<210> 38
<211> 942 <212> ДНК
<2ГЗ> Phytophthora infestans <400> 38
atggctccac tgccatccgc aaccttgacc acacccgacg tggctcctgt cacagctacc 60
accgcctcgc agcccttcga cgacctagtt gacaaggtcg agagtggcta tgcggctatg 120
cctaccaccc caaaggcggt ggctcccttc ccaacctcca aaccgcaagg tctccagcgt 180
ttcgccgttc agagcgtgca cctgcgcgag tgcttcgccg agttcctcgg caccttcgtc 240
atgatcgtct tcggtatggg cgtcaacaac caagtgacca actcacacga cgccaacggc 300
acgtggctca gcatcaatat gtgctggggg attggtgtac tcatcggcgt ctactgctcc 360
gagggcatca gtggtgctaa cctcaacaca gccgtgacgt tggcacattg cgtgtacggc 420
cgtctaccat ggtggaaagc acccggttac atgatctcac agctattggg cgccttctgt 480
ggagctttca ttatctacgt catgcagtac cagaacctca acgtcattga cccgtatcgc 540
gagaccacac agagcagctt ctcgacgtat ccgagcgaca acatctccaa ctacacagcc 600
ttctacaccg agttcatcgg tactgctatg cttgtgctca gtatctacgc catcacggac 660
aagcgcaaca gatctgccgg tctcgtgggt tctcccttcg ccttctgtct aatgatcatg 720
gcgttgggca tggcctttgg catgaacacg ggctacgctg tgaaccctgc acgtgacttc 780
ggcccccgca tcttcacggc catcgcgggc tggggctcca aggtctttac cactcggaac 840
tactacttct ggatcccgat cgtggccgat tctatgggcg gaattgctgg tgctggactc 900
tatcggctgc ttgtggagat ccaccaccca cccctctcgt ag 942
<210> 39 <211> 1636 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 39
atgtccgacg accaagtgcc accgttttcg ctcggtacga aacaccttac acgcatgacg 60 tgcagcgcac agttcagaga tgactaactg gccatgctgc cgctacgtgt atttaccaga 120
taagccgcgc cacgatactt cgacgtacgt cggtcggtgg cgtaagtttg cggagctcgt 180
gtcgccaaag tacgtcaaac aaggtagacg atggaaaaag tgtggctcta aacatcatgc 240
tggggcttta ggtggctctt tctaagctcg gagcagattc agcacgcgac gcagactctg 300
gaggacttcc gcaacggtaa aatcgcccct ggtcagttca aggatgcgga actttggaat 360
cttcgccagg gtacgaaaca atgcgacagg atggtaccaa cttgtggttt ttgctgacgt 420
tttggtgata attgaatcga tatgtagcgt acgaggctgc cgtgcaccct cagactggcg 480
agacagttcc ggctgtgttt cggctgtcgg ctttcgtgcc tgtgaacatt cccatttgcg 540
ttggcatgct gctcgctcct gccacggtat gtaaagtctt gctgcacttg taacaatagc 600
tttattttaa tttaaatgct cacttaaata tgcttacagt tgggaaacac gatcttctgg 660
caatgggtta accagagcta cagcgccggt ttcaactacg ctaaccgcaa cgccagcagt 720
gaacaggaca actccaccat cttcagtacg aagttctcga tgctaatggc cttctttcag 780
cgttctaaca cggctctttg catcgtatca cagagtcgta cgctaccgcg acgctcgtgt 840
cttgctcgac tgccgttggt ctgggtaaga tggtggagaa agccaagaga ctttctccca 900
gcacgcgttc cttcctcgga aaggttaaaa ctgctaaatg ccgaatgctg tgctccttat 960
gtgactgaat ttttgggctg caacttgatc agatggttcc tttcgttgct gtcgcgagcg 1020
caggtgcttt caacgccgtg tcgatgcgct tcaacgagtt ccagtacgtg tagagtgtct 1080
tgcactggaa atatgatgct gttgtgctca ttggagtgtg gtgatgcgtt acagagaggg 1140
aattgatatc atggacgagc acggagatgt tcacgggcgt tcagttgccg ctggacgtca 1200
gtcgcttggc caagtggcac tcacgcgtat tgcgctaccc atgcccagta cgtcctcgca 1260
ttgacaagct cttcttgggt gaattatgtc taatattggt ggacttggac agttttgctg 1320
ctcccgccgt acctgtatga gatcatgaag aaaaccaaca tcatgcccaa ggccaagtac 1380
ccgaagcttg ctgcggagct cggtacgtgc attatttctg ccatagtccg cggtaatgag 1440
ctaacttatt gcgtctctgc ctgcatctat gatagtcgtg ttaacgatgt gtctgtgggg 1500
tgccatgccc agcgctgtgg cgctcttccc gcagttggga acgatttcgg ctgacagcgt 1560
tgaggaggaa ttccgatctc gggtggatcg caacggccag cccattcgtc acttcatcta 1620 caacaaggga atctga 1636
<210> 40 <211> 960 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 40
atgagcaccg ccaataaaga agcatctccc tttgtggagc ttcgccgtct taactttgcg 60
ttcgccaaag ttactatcgg tggccaactc atcaatcgct tgcagcatga ccccgctact 120
gctgacgcca tggaagacga cgatcgagtc ctgcgtgacg tgaatctaac gctgcagtct 180
ggtcagcgcc tgttggtcgt gggtggtaat ggagctggca aaagcacgct actcagtatc 240
ttggctggca agcacctgac ggctgacgac acggcgctga tcttcggtcg agacagcttc 300
cgtgacacga cactcaacgc tttaaggact ttcgttagtg ccgactgggg gcagcgctcg 360
gtggcgttcg caacgcacgc aatggcttac tcggctgaca tggcggtgga agaaatgatg 420
acgaaactgc agagtgaaca cccggagcga cgccaaaagt tactgaaggt gttgcgtatt 480
gacccaaagt ggcgtttaca tcgcctgtcg gacggtcaac gtcgccgcgt tcagctcttt 540
ctggcgctac tgagaccttc gcagctcatc gtactggacg aagtgctggg aatgctcgac 600
atcatctcgc gcgaaaacgt actggcattc ctaaaggagg aaacagagac tcgacaagcc 660
acggtgttgc tagccacgca catcttcgat gggacggacg tctgggcatc tcatgtgctg 720
tatattcgtc gcggtactgt tgggttctat ggtccgattc agcagtgtac tgatggaggg 780
aagatcccga tgtataaggt ggtggaacac tggctacgtg aggaattggc cgacgacgac 840
cgtgtggaat gcgaggcggt gggcccaagt ggtgagttcg acctgggcaa cgcgcagaac 900
cgcgcaggag ggtatgccga cggtcgactg ggtggtgtcg atgtcaccac atcgttttaa 960
<210> 41
<211> 510
<212> ДНК
<213> Phytophthora infestans
<400> 41
atgagcgacg gtactaagct cattgccgtg atcggagacg aagacaccgt cacgggcttt 60
atcctcgcgg gtgtcggcca tcgaacggcc gagggaacca actttctcgt cgtcaaaccc 120
tgtgcgtcgg cattcccgaa aggatttttt taaagcttag attaactact aacacgcgtc 180
acatacgacg gtgctgcagc tactccaatc tccgctattg aggccagttt ccggacgctc 240
tcgagccgtg acgatatcgc aattatcctc atcaaccagc acgtacggca tcctagttag 300
aacccactct gaggtataag cctttatgtt tttctcactc gcttgatatt attgtttggg 360
caggttgctg aggagatccg tcaccttctc aacacgtacg acaagaccat tcccacggtg 420
ctagagatcc cgagcaaaga ctcgccttac gacccagcta aggactatat catgaagcgc 480
<210> 42
<211> 1491
<212> ДНК
<213> Phytophthora infestans
<400> 42
gtgaatctca tgcttggagg agagtcgtga 510
atggtcgctg aagacgcggt gttcacggaa gcgaagacgc ccaaggccgg cgatgtccag 60
gccggcagat ccgtcccgct ctcgccgacc ttctggttca gcctcgcggt gctgctcctg 120
ctccccttcc agttcggctg gtcggtcggc cagctcaacc tcacgacctt caacgacgaa 180
gacgagtgca acgcgcgacc tctagtcgac ggaacgtgcc tceitgtttcc cggtcatagc 240
agcacggaat ggaccttgat cgtgaacgcg tggattgtag gcggtatgat cgggagtctc 300
ggttgtggcg ttatctccga acgtttcggt cgcaagaagg tattgctggc gaacgccgtc 360
gtcatgttgg ccggcgctgt cattcaagcg agtacgtcga gtatctcggt ttttatggtc 420
gggcgtatcg tcgccggtat cgcgtcgggt tgtgcgacgg gtatggtggg tggctacatc 480
agtgagatta cacccccgag tctccgtaac tcgtacggca cgttcatgca ggtatctctc 540
tctgccggta tcttagtagt gaccatcagt tttttcttcg cggataccag tagcggctgg 600
aggtacatcg ccgcatttcc cgttcttaac gccggtttct tcttggcgtt cgcaccgttc 660
gttcttgtag agagtcccgc gtggcttttg gaaaagggcg accgggagca tgcggagcgg 720
gagatcgcca gactttacgg cttcgatttc gtcccagtag cactgacgtg gatggaacca 780
ggtatcaata ctgacctgga gtcagaggaa ctgtgcggcg aacagcacga aggcggcaca 840
ttgtcgctgc tgttttcgcc gctctttatc aagcaactgc ttgtggctct tggtgtatca 900
gctgcgcaac aacttacggg tatcaacgcg gtgtgctatt actcgtccga tatcttctcg 960
gatgcaggga tgtcggatgg tcgtgtgggt ggcgtcatcg tgtacgtgct gatgttacta 1020
ccgacgatgg ctgttgcgcg attgtcggag cgattcggca accgacggct tctgcttact 1080
ggactggccg ggatgtttat tagtgctacg ggtataactt tggcgcttgc gttgtcggtc 1140
gaggtactct ctatcgtctt catgggtaca ttcgttgcgt tcttctctgc gagcgtgggg 1200
ccgcttatct agcctatcac ggccgcgctg ttcacggact cggtacgcgc cactgccgtc 1260
tctatgtgca tctttatcaa ttgggtatgc aacttgatca ttggcgtctg cttcccgtac 1320
gtctcggatg cgctagacga gtacaagttt gtccccttta tggtgaccac cgctgcgttt 1380
ttcttcttca ctcagttttg gatcccggag actgcaggta agagcaccga ggagatccaa 1440
gccacgttcc gatctaggaa agctcagaag ccggtggtgg tgttaagctg a 1491
<210> 43 <211> 2462 <212> ДНК
<213> Phytophthora infestans <400> 43
ttgtgctact cgagtgcctt cttctccatg acgcagcaag acgttcgcca ggcgctggac 60 gcccccgcat tagcagccta catccactcg cgactgggtg catcgcacgg cgccatcgcg 120 tccatccgtc agttccagca tggccagtcc aacccgacgt acctcttgac aatggccggc 180 tcgaaagcca agtgggtgtt gcgtaagaag ccgcacggtc agatcctgcc gtcagctcac 240 gccgtagagc gcgaatatcg tgttctagag gctctggagc actcggaggt gcccgttccc 300 cgcgctgtgt tgctatgtga agaccccaaa gtcattggca cacctttcta cctcatggaa 360
tacatacatg gtcgtatctt ccaagaccca tcgctgcctg gcattaaacc tatgtatcgc 420
tacgccatgt acagctcggc agtagacgcg ttggttaagt tgcacgagct ggactacaag 480
aagatcggac tggccgactt cggtcgcccc gagaagtact gccaccgtgt cgtgacgcgc 540
tggagtcgac aagtccaaag tggccagaag gtctttagtg aagctggagt gaaggagaac 600
ccgaagatga cgcagctgca acgttggctg gagcagaacg ccgacgacgc cgagaaggcc 660
acgaccagtg ccgagggagc gagtatcgtc cacggagact tccgcattga caacatgatc 720
ttccacccga cggagcctcg tgtgttggcc attctggact gggagctgtg tactatcggc 780
aatccgttct cggatgtagc cacattggcg tcggcctaca gactgccact ggacaactcg 840
aacacaatca tgacgcctgg tctctcggat gctccgttga agacactcgg catcccatcg 900
gagagtgaat tgttgctagg ctactgtcgt cgtgccagac ggttccctct acccactcag 960
acgtggcatt ttttcatggg gatgatcgta taccgcttcg cagccatctg ccacggtgta 1020
tacgcccgcg cactgctcgg caacgcgtcg tcggccaacg cagcatgtgc caagacgacg 1080
atggaccgac tcttggccat gagcgacgac atcatggacg catcggctga tatttacccg 1140
gagccggagc tgacgcacat tctgccgttc ccgatccgtc ctcatgctct gcagatgtac 1200
aagaagctgc taaagttttg ccagaaccga gtgtaccccg ctgagtccgt ccacattgct 1260
cagatcgcca aggcgagaga agaaggacgg gagtggcaga gtgtgcctcc tgttattgaa 1320
gagctcaaga cggaagccaa ggcgctggga ctctggaacc tcttcctgcc tcagtgtgtg 1380
gtgccagctc tggatggcaa tggaccagac gtcaactacg gtggagacct gacgaatctc 1440
gagtacggac tcatgtgtga ggtcatggga cgctccattg tgttggctcc ggaggttttc 1500
aactgctcag cacccgatac cggcaacatg gagatcttga cgcggttctg cactgtggag 1560
cagaagcatc agtggcttgt tcctcttctt caaggtgaga tccgatcgtg tttcgcgatg 1620
acggagaagc gtgtggcttc gtcggatgcg acgaacatcg agacgcgcat tgtacgcgac 1680
gaacagcgtc aagaatacgt catcaatggc cacaagttct acatctctgg agctggagac 1740
ccacgatgca agatcattgt gctcatgggc aagcacacgg aacgagccaa ggagagtcca 1800
ttcaagcagc agtcgatgat cctcgtgcct atggacacac ccggcgtgca ggtcgtgaag 1860
cccatgcatg tctttggcta cgacgacgca ccgcacggac acatggagat gctgttcaag 1920
gacgtgcgtg tgccgttcag caacgtgttg ctcggtgaag gtcgcggctt tgagatcgct 1980
caggctcgtc ttggacctgg ccgtatccac cactgtatgc gagccatcgg agctgctgag 2040
cgttgtcttg agctgatggt gcagcgagcc aagacacgca cagcgttcaa gcagctcctg 2100
gccgagaatc cgctcgtgtg ttcgcagatt gccaagtcgc gttgtgaatt ggacagcgcg 2160
cgcttgttga cgctccaggc tgcacatcag atggacaagc acggcaacaa ggtggcgcaa 2220
caggccatcg ctatgatcaa gatcgtggcg cctaacatgg cactggacgt ctgcgaccga 2280
gccatccaga tccacggcgc ttctggcgtg agtcaggact ttgtcctgtc ttacttgtac 2340
gccgccctgc gcacgctacg tatcgccgac ggaccggatg aagtgcacat gcggaccatc 2400
gcaaaactcg agctgagcca ctcgaagttg taagagaaat gtaaggcaaa agcaagcgtg 2460
aa 2462
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Трансгенное растение вида Solanum tuberosum или часть такого растения, в геном которого стабильно интегрированы первая двухцепочечная ДНК и вторая двухцепочечная ДНК для придания патогенной устойчивости к оомицету рода Phytophthora, при этом нуклеотидные последовательности кодирующих цепей первой и второй ДНК полностью или частично обратно комплементарны друг другу так, что это приводит к образованию двухцепочечной РНК, отличающееся тем, что первая ДНК включает:
(а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо
(б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последователь-
ности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо
(в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последователь-
ностей (а) или (б), либо
(г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с нуклеотидной последовательно-
стью в соответствии с (а), (б) или (в) в жестких условиях.
2. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что эти растения проявляют устойчивость к Phytophthora infestans.
3. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что двухцепочечная РНК представляет собой mi-РНК или si-РНК.
4. Трансгенное растение по п.1, отличающееся тем, что первая ДНК и вторая ДНК оперативно связаны по крайней мере с одним промотором.
5. Часть растения по п.1, отличающаяся тем, что она представляет собой семя или клетку.
6. Способ получения трансгенного растения вида Solanum tuberosum по п.1, проявляющего устойчивость к оомицету рода Phytophthora, состоящий из следующих шагов:
(i) получение трансформированного растения первой родительской линии, содержащего первую двухцепочечную ДНК, которая стабильно интегрирована в геном родительского растения и которая включает:
(а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо
(б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последователь-
ности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо
(в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последователь-
ностей (а) или (б), либо
(г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с нуклеотидной последовательно-
стью в соответствии с (а), (б) или (в) в жестких условиях;
(ii) получение трансформированного растения второй родительской линии, содержащего вторую двухцепочечную ДНК, которая стабильно интегрирована в геном родительского растения, при этом нук-леотидные последовательности кодирующих цепей первой и второй ДНК частично или полностью обратно комплементарны друг другу;
(ii)
(iii) скрещивание растения первой родительской линии с растением второй родительской линии;
(iv) отбор растения, в геноме которого первая двухцепочечная ДНК и вторая двухцепочечная ДНК стабильно интегрированы для придания патогенной устойчивости к оомицету рода Phytophthora так, что при этом может образовываться двухцепочечная РНК.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанная устойчивость является устойчивостью к Phytophthora infestans.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что двухцепочечная РНК представляет собой mi-РНК или si-РНК.
9. Композиция для наружной обработки растений для придания растению Solanum tuberosum устойчивости к оомиценту рода Phytophthora, содержащая двухцепочечную РНК, одна цепочка которой соответствует транскрипту двухцепочечной ДНК, включающей:
(а) нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо
(б) фрагмент по крайней мере из 15 последовательных нуклеотидов нуклеотидной последователь-
ности в соответствии с SEQ ID NOS: 1-43, либо
(в) нуклеотидную последовательность, комплементарную одной из нуклеотидных последователь-
ностей (а) или (б), либо
(г) нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с нуклеотидной последовательно-
стью в соответствии с (а), (б) или (в) в жестких условиях.
10. Композиция по п.9 для придания устойчивости к оомицету рода Phytophthora, в частности к Phy-
tophthora infestans.
Russet H-10-T-111 Burbank Фиг. 24
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027487
027487
- 1 -
- 1 -
027487
027487
- 1 -
- 1 -
027487
027487
- 1 -
- 1 -
027487
027487
- 1 -
- 1 -
027487
027487
- 1 -
- 1 -
027487
027487
- 2 -
- 1 -
027487
027487
- 1 -
- 1 -
027487
027487
- 4 -
- 3 -
027487
027487
- 16 -
- 16 -
027487
027487
- 73 -
- 73 -
027487
- 75 -
- 74 -
027487
- 75 -
- 74 -
027487
027487
- 77 -
- 77 -
027487
027487
- 78 -
- 78 -
027487
027487
- 81 -
- 81 -
027487
027487
- 82 -
- 82 -