|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Растительный экстракт для регулирования уровня глюкозы в крови или для применения в качестве лекарственного средства для лечения вызванных пигментацией состояний, полученный из листьев растений рода Morus, у которого значение IC 50 для ингибирования α-глюкозидазы I составляет менее чем 90 мкг/мл, содержащий 5-40 мас.% иминосахаров, включая по меньшей один из следующих: 1-дезоксиноиримицин (DNJ), фагомин и N-метил-DNJ, при определении посредством количественной высокоэффективной жидкостной хроматографии и/или жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии; 20-70 мас.% аминокислот; причем экстракт имеет бледно-желтый или почти белый цвет и является легкорастворимым в воде, а способ его получения включает следующие стадии: a) водное или спиртовое экстрагирование листового материала; b) очистка хроматографией на колонке с использованием сильнокислой катионообменной смолы с промыванием колонки водой и элюированием раствором аммиака и последующим сбором элюента со значением рН от 9,0 до 11,0 и удалением из него аммиака. 2. Растительный экстракт по п.1, отличающийся тем, что значение IC 50 для ингибирования α-глюкозидазы I составляет 5-40 мкг/мл. 3. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что общее содержание иминосахаров в нем составляет 8-30 мас.%. 4. Растительный экстракт по п.3, отличающийся тем, что общее содержание иминосахаров в нем составляет 15-20 мас.%. 5. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что к указанным иминосахарам также относятся 1,4-дидезокси-1,4-имино-D-арабинитол (DAB), 2-О- α-D-галактопиранозил-DNJ (GAL-DNJ) и калистегин В. 6. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что общее содержание аминокислот в нем составляет 30-60 мас.%. 7. Растительный экстракт по п.6, отличающийся тем, что общее содержание аминокислот в нем составляет 40-50 мас.%. 8. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что растение рода Morus выбрано из группы, включающей a) Morus alba L. b) Morus alba var. multicaulis L. c) Morus nigra и d) Morus australis Poir. 9. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 1-20 мас.% от общей массы экстракта. 10. Растительный экстракт по п.9, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 2-10 мас.% от общей массы экстракта. 11. Растительный экстракт по п.10, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 4-6 мас.% от общей массы экстракта. 12. Растительный экстракт по п.9, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 1-3 мас.% от общей массы экстракта. 13. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что имеет значение рН 5,5-6,5 в 1%-ном водном растворе. 14. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что УФ-спектр экстракта демонстрирует максимальное поглощение при 218 и 263 нм. 15. Растительный экстракт по п.1, предназначенный для лечения вызванных пигментацией состояний посредством снижения продуцирования меланина. 16. Растительный экстракт по п.1 или 15 для лечения гиперпигментации, в том числе веснушек, хлоазмы, рубцов беременности и старческих пятен. 17. Способ получения экстракта из листьев растения рода Morus по п.1, который включает стадии: a) водное или спиртовое экстрагирование листового материала; b) очистка хроматографией на колонке с использованием сильнокислой катионообменной смолы с промыванием водой и элюированием раствором аммиака, сбором элюента со значением рН от 9,0 до 11,0 и удалением из него аммиака. 18. Способ по п.17, который дополнительно включает стадии: c) хроматография элюента на колонке с использованием макропористой абсорбционной смолы и сбор раствора и d) концентрирование и высушивание экстракта. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что a) листья растений сушат и измельчают в крупный порошок, стадию экстрагирования проводят 5-8-кратным объемом 0-40% низкомолекулярного спирта из расчета на массу листьев растения рода Morus (в массовом отношении) и повторяют ее до 5 раз, b) колонку промывают водой в количестве 1-2 объемов колонки, смыв выбрасывают, колонку элюируют 0,2-1,0н. водным раствором аммиака в количестве 2-8 объемов колонки при скорости элюирования, составляющей 1-3 объема колонки в час, c) колонку элюируют при объемном соотношении между раствором и колонкой в пределах от 20:1 до 5:1 и d) высушенный экстракт измельчают до прохождения через сито 80 меш. 20. Косметическое или лекарственное средство, содержащее растительный экстракт по любому из пп.1-14, в сочетании с одним или несколькими отбеливающими кожу компонентами, выбранными из витамина С и его производных, койевой кислоты, арбутина, диацетилболдина, азелаевой кислоты, октадецендиоевой кислоты, ундециленоилфенилаланина, экстракта солодки, экстракта алоэ, экстракта жерухи лекарственной, экстракта Ascophyllum, экстракта хмеля, глутатиона, экдизона и/или эллагиновой кислоты. 21. Косметическое или лекарственное средство по п.20, отличающееся тем, что указанным производным витамина С является L-аскорбил-2-фосфат магния (VC-PMG). 22. Косметическое или лекарственное средство по п.20 или 21, отличающееся тем, что соотношение между экстрактом и другими отбеливающими кожу компонентами находится в пределах от 10:1 до 1:1. 23. Ингредиент фармацевтического препарата, нутрацевтика, продукта питания или напитка или биологически активная добавка, содержащие растительный экстракт по любому из пп.1-14. 24. Пищевой продукт или напиток, содержащий растительный экстракт по любому из пп.1-14.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Растительный экстракт для регулирования уровня глюкозы в крови или для применения в качестве лекарственного средства для лечения вызванных пигментацией состояний, полученный из листьев растений рода Morus, у которого значение IC 50 для ингибирования α-глюкозидазы I составляет менее чем 90 мкг/мл, содержащий 5-40 мас.% иминосахаров, включая по меньшей один из следующих: 1-дезоксиноиримицин (DNJ), фагомин и N-метил-DNJ, при определении посредством количественной высокоэффективной жидкостной хроматографии и/или жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии; 20-70 мас.% аминокислот; причем экстракт имеет бледно-желтый или почти белый цвет и является легкорастворимым в воде, а способ его получения включает следующие стадии: a) водное или спиртовое экстрагирование листового материала; b) очистка хроматографией на колонке с использованием сильнокислой катионообменной смолы с промыванием колонки водой и элюированием раствором аммиака и последующим сбором элюента со значением рН от 9,0 до 11,0 и удалением из него аммиака. 2. Растительный экстракт по п.1, отличающийся тем, что значение IC 50 для ингибирования α-глюкозидазы I составляет 5-40 мкг/мл. 3. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что общее содержание иминосахаров в нем составляет 8-30 мас.%. 4. Растительный экстракт по п.3, отличающийся тем, что общее содержание иминосахаров в нем составляет 15-20 мас.%. 5. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что к указанным иминосахарам также относятся 1,4-дидезокси-1,4-имино-D-арабинитол (DAB), 2-О- α-D-галактопиранозил-DNJ (GAL-DNJ) и калистегин В. 6. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что общее содержание аминокислот в нем составляет 30-60 мас.%. 7. Растительный экстракт по п.6, отличающийся тем, что общее содержание аминокислот в нем составляет 40-50 мас.%. 8. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что растение рода Morus выбрано из группы, включающей a) Morus alba L. b) Morus alba var. multicaulis L. c) Morus nigra и d) Morus australis Poir. 9. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 1-20 мас.% от общей массы экстракта. 10. Растительный экстракт по п.9, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 2-10 мас.% от общей массы экстракта. 11. Растительный экстракт по п.10, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 4-6 мас.% от общей массы экстракта. 12. Растительный экстракт по п.9, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 1-3 мас.% от общей массы экстракта. 13. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что имеет значение рН 5,5-6,5 в 1%-ном водном растворе. 14. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что УФ-спектр экстракта демонстрирует максимальное поглощение при 218 и 263 нм. 15. Растительный экстракт по п.1, предназначенный для лечения вызванных пигментацией состояний посредством снижения продуцирования меланина. 16. Растительный экстракт по п.1 или 15 для лечения гиперпигментации, в том числе веснушек, хлоазмы, рубцов беременности и старческих пятен. 17. Способ получения экстракта из листьев растения рода Morus по п.1, который включает стадии: a) водное или спиртовое экстрагирование листового материала; b) очистка хроматографией на колонке с использованием сильнокислой катионообменной смолы с промыванием водой и элюированием раствором аммиака, сбором элюента со значением рН от 9,0 до 11,0 и удалением из него аммиака. 18. Способ по п.17, который дополнительно включает стадии: c) хроматография элюента на колонке с использованием макропористой абсорбционной смолы и сбор раствора и d) концентрирование и высушивание экстракта. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что a) листья растений сушат и измельчают в крупный порошок, стадию экстрагирования проводят 5-8-кратным объемом 0-40% низкомолекулярного спирта из расчета на массу листьев растения рода Morus (в массовом отношении) и повторяют ее до 5 раз, b) колонку промывают водой в количестве 1-2 объемов колонки, смыв выбрасывают, колонку элюируют 0,2-1,0н. водным раствором аммиака в количестве 2-8 объемов колонки при скорости элюирования, составляющей 1-3 объема колонки в час, c) колонку элюируют при объемном соотношении между раствором и колонкой в пределах от 20:1 до 5:1 и d) высушенный экстракт измельчают до прохождения через сито 80 меш. 20. Косметическое или лекарственное средство, содержащее растительный экстракт по любому из пп.1-14, в сочетании с одним или несколькими отбеливающими кожу компонентами, выбранными из витамина С и его производных, койевой кислоты, арбутина, диацетилболдина, азелаевой кислоты, октадецендиоевой кислоты, ундециленоилфенилаланина, экстракта солодки, экстракта алоэ, экстракта жерухи лекарственной, экстракта Ascophyllum, экстракта хмеля, глутатиона, экдизона и/или эллагиновой кислоты. 21. Косметическое или лекарственное средство по п.20, отличающееся тем, что указанным производным витамина С является L-аскорбил-2-фосфат магния (VC-PMG). 22. Косметическое или лекарственное средство по п.20 или 21, отличающееся тем, что соотношение между экстрактом и другими отбеливающими кожу компонентами находится в пределах от 10:1 до 1:1. 23. Ингредиент фармацевтического препарата, нутрацевтика, продукта питания или напитка или биологически активная добавка, содержащие растительный экстракт по любому из пп.1-14. 24. Пищевой продукт или напиток, содержащий растительный экстракт по любому из пп.1-14.
Евразийское ои 027471 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201290150
(22) Дата подачи заявки 2010.09.16
(51) Int. Cl. A61K36/605 (2006.01) A61P3/08 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A61K 127/00 (2006.01)
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ШЕЛКОВИЦЫ, ЭКСТРАКТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ДАННЫМ СПОСОБОМ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 200910307065.X
(32) 2009.09.16
(33) CN (43) 2014.11.28
(86) PCT/CN2010/076988
(87) WO 2011/032502 2011.03.24
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БОТЭНИК СЕНТЧЕРИ (БЕЙДЖИН) КО. ЛТД. (CN)
(72) Изобретатель:
Се Чэнь, Цзоу Иншу (CN)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(57) Изобретение имеет отношение к растительному экстракту, полученному из листьев шелковицы. Растительный экстракт, получаемый из листьев растений рода Morus, и у которого значение IC50 для ингибирования а-глюкозидазы I составляет менее чем 90 мкг/мл. В упомянутом экстракте предпочтительно общее содержание иминосахаров составляет 5-40 мас.% и общее содержание аминокислот составляет 20-70 мас.%. Экстракт получают при помощи трехстадийного процесса экстрагирования и очистки; его можно применять с целью снижения продуцирования меланина для лечения болезненных состояний или заболеваний, вызванных пигментацией, таких как веснушки, хлоазма, рубцы беременности и старческие пятна. Экстракт можно также применять для регулирования уровня глюкозы в крови.
Настоящее изобретение имеет отношение к растительному экстракту, композициям, содержащим упомянутый экстракт, способу экстрагирования и применению упомянутого экстракта.
Предпосылки создания изобретения
Листья шелковицы имеют долгую историю медицинского применения в азиатских странах, в частности в Китае. В последние годы фитохимики выделили из листьев шелковицы ряд составляющих, представляющих собой иминосахара, такие как 1-дезоксиноиримицин (DNJ), фагомин и N-метил-дезоксиноиримицин. Химическая структура иминосахаров подобна химической структуре моносахаридов. В большинстве своем они являются полигидроксильными гетероциклическими соединениями с 5-6-членными циклами. Ключевым различием между соединениями двух упомянутых типов являются гете-роатомы гетероцикла. Первое упомянутое соединение содержит атомы азота (N), в то время как в состав последнего упомянутого соединения входит атом кислорода (О).
Было показано, что составляющие листьев шелковицы, представляющие собой иминосахара, проявляют определенную ингибирующую активность в отношении а-глюкозидазы I и а-глюкозидазы II, причем наибольшей активностью среди них отличается DNJ. В ходе дальнейших фармакологических экспериментов было выявлено, что DNJ воздействует на меланоциты, ингибируя процесс созревания тирозиназы (TYR), следствием чего является снижение продуцирования меланина (Genji Imokawa, Analysis of Carbohydrate Properties Essential for Melanogenesis in TYRs of Cultured Malignant Melanoma Cells by Differential Carbohydrate Processing Inhibition. The Journal of Investigative dermatology, 1990, 95(l):39-49; Ju Young Park, hyunjung Choi, Jae Sung hwang, Junoh Kim, Ih-Seop Chang, Enhanced depigmenting effects of N-glycosylation inhibitors delivered by pH-sensitive liposomes into HM3KO melanoma cells, Journal of Cosmetic Science, 2008,59:139-150).
Авторы настоящего изобретения провели ряд экспериментов с энзимами и установили, что полный экстракт иминосахаров (определяемый по содержанию 1-дезоксиноиримицина (DNJ), N-метил-дезоксиноиримицина и фагомина) из листьев шелковицы, как описано для экстрактов, соответствующих настоящему изобретению, обладает более выраженной ингибирующей активностью в отношении а-глюкозидазы I и а-глюкозидазы II, чем химически чистый DNJ. Этот факт позволяет применять такие экстракты шелковицы для ингибирования а-глюкозидазы I и а-глюкозидазы II при более низких концентрациях DNJ, что снижает вероятность развития возможной негативной реакции на лекарственный препарат (ADR) и делает готовый продукт более безопасным при использовании. Кроме того, поскольку затраты на производство экстракта шелковицы, как описано в настоящем изобретении, намного ниже затрат на производство химически чистого DNJ, стоимость лечения болезненных состояний, связанных с гиперпигментацией, могла бы быть значительно снижена.
Таким образом, косметические средства и лекарственные препараты, изготовленные из таких экстрактов, имеют огромные преимущества по эффективности, безопасности и стоимости по сравнению с косметическими средствами и лекарственными препаратами, содержащими чистые химические вещества, такие как DNJ, структура которого приведена ниже
Структура 1-дезоксиноиримицина (DNJ)
В прошлом как в Китае, так и за рубежом множество исследователей пытались организовать товарное производство косметических средств на основе экстрактов шелковицы для отбеливания и уменьшения пятен на коже. Однако по сравнению с такими средствами экстракт по настоящему изобретению имеет совершенно иные характеристики и предоставляет ряд преимуществ.
В патенте Китая ZL 99123894X раскрыта композиция на основе растительных экстрактов для ухода за кожей с целью предотвращения пигментации, представляющая собой комбинацию трех основных ингредиентов, а именно экстракта из растений рода Morus, экстракта из растений рода Scutellaria и производных салициловой кислоты. Экстракты из растений рода Morus по этому изобретению были получены из корня шелковицы, который содержит, главным образом, куванон; точное определение этого экстракта в описании отсутствует.
В заявке на патент США № 347884 раскрыто применение экстракта из ветвей шелковицы с теми же косметическими целями, где активными составляющими экстрактов являются оксиресвератрол и мул-берросид. В сравнении с двумя упомянутыми изобретениями настоящее изобретение имеет нижеследующие преимущества и особенности.
1. Преимущество сырья.
Сырье, листья шелковицы, используемое в настоящем изобретении, легче восстанавливается и является более постоянным источником по сравнению с корнями и ветвями. Оно также имеет относительно более низкую стоимость, чем сырье в двух вышеупомянутых изобретениях.
2. Разные механизмы действия.
В двух вышеупомянутых изобретениях активность достигалась посредством конкурентного инги
бирования TYR. В настоящем изобретении механизм действия заключается в снижении продуцирования меланина посредством ингибирования а-глюкозидазы, результатом чего является менее зрелая (и менее активная/неактивная) TYR.
3. Различные действующие вещества.
В вышеупомянутых патентах действующими веществами были флавоноиды, например куваноны, или дифенилы, содержащие этиленовую связь, например оксиресвератрол и мулберросиды. В противоположность этому действующими веществами настоящего изобретения являются иминосахара, и для выделения экстрактов, богатых этими иминосахарами, применяются различные способы получения.
4. Уникальный процесс получения.
Упомянутый процесс предназначен для обеспечения оптимального экстрагирования активных ингредиентов и их очистки, что улучшает, например, физические свойства экстракта, делая его более пригодным для применения, например, в косметических средствах.
Меланин является наиболее важным фактором при определении цвета человеческой кожи. Биосинтез меланина происходит в меланосомах меланоцитов в базальном слое эпидермиса. При нормальных физиологических условиях меланин защищает кожу от повреждения ультрафиолетовым излучением. В случае нарушения метаболизма синтеза меланина внешними факторами, гормональными расстройствами, сенильными процессами и т.п. содержание меланина в базальном слое эпидермиса увеличивается, и кожа темнеет. Следствием этого, в свою очередь, являются болезненные состояния либо заболевания, связанные с гиперпигментацией, такие как веснушки, хлоазма, рубцы беременности, старческие пятна и меланома. Кроме того, имеется большое количество людей, заботящихся о красоте, которые стремятся иметь более белую кожу, и соответственно существует потребность в компонентах и косметических средствах, способствующих осветлению, отбеливанию и сокращению количества пятен на коже.
Вкратце, биосинтез меланина включает следующие стадии
Тирозиназа (TYR) представляет собой разновидность гликопротеина, содержащего ионы меди, и является ключевым ферментом биосинтеза меланина. Она катализирует реакцию по превращению тирозина в ДОФА и допахинон. TYR считается важной мишенью для снижения пигментации и часто используется в сфере научных исследований для продуктов с функцией отбеливания кожи и сокращения количества пятен.
В настоящее время основным способом целенаправленного воздействия на TYR является ингиби-рование ее образования и активности для снижения продуцирования меланина. К числу современных средств, содержащих ингибиторы TYR, относятся 1,4-дигидроксибензол (гидрохинон) и его производные, койевая кислота и ее производные и арбутин.
Наряду с тем, что 1,4-дигидроксибензол и его производные способны обеспечивать 100%-ное инги-бирование активности TYR, они также стимулируют меланоциты и демонстрируют цитотоксичность. Длительное их применение в сочетании с воздействием света может вызвать возникновение пигментных пятен экзогенного характера. По этой причине их применение в средствах для ухода за кожей запрещено.
Койевая кислота очень устойчива и оказывает хорошее воздействие на снижение пигментных пятен посредством хелатирования ионов меди со снижением активности TYR. Однако следствием длительного применения койевой кислоты может быть цитотоксичность, ведущая к возникновению кожных заболеваний. Японские исследователи продемонстрировали, что койевая кислота может вызывать рак печени (Tamotsu Takizawa, Toshio Imai, Jun-ichi Onose, Makoto Ueda, Toru Tamura, Kunitoshi Mitsumori, Keisuke Izumi and Masao Hirose. Enhancement of Hepatocarcinogenesis by Kojic Acid in Rat Two-Stage Models after Initiation with N-bis(2-hydroxypropyl)nitrosamine or N-diethylnitrosamine. Toxicological Sciences 2004
81(1):43-49).
Арбутин считают отбеливающим и уменьшающим пятна на коже косметическим средством с очень незначительными побочными эффектами, но он очень чувствителен к свету, и, как следствие, к готовому продукту необходимо добавлять большие количества солнцезащитных веществ, что повышает нагрузку на кожу и, тем самым, ускоряет процесс ее старения.
Перечисленные выше недостатки ограничивают применение продуктов, имеющихся на рынке косметических средств, для отбеливания кожи и сокращения количества пятен.
TYR является белком с сахарной цепью (гликопротеин). Современные исследования в области био
химии выявили, что в процессе своего образования (и созревания) исходная сахарная цепь должна быть подвергнута ряду модификаций для преобразования новообразованной TYR в зрелую TYR, которая имеет нормальные биологические функции. Ключевыми ферментами в этом процессе являются а-глюкозидаза I и а-глюкозидаза II. а-глюкозидаза I отвечает, главным образом, за "отщепление" глюкозо-содержащей группы с а-1,2 связью на дальнем конце сахарной цепи, в то время как а-глюкозидаза II в две стадии отщепляет две оставшиеся глюкозосодержащие группы, связанные а-1,3 связью. (Mehta A., Zitzmann N., Rudd P.M., Block T.M., Dwek R.A а-Glucosidase inhibitors as potential broad based anti-viral agentsI, FEBS Letters, 1998. 430(1): 17-22).
Считается, что при ингибировании а-глюкозидазы I и а-глюкозидазы II замедляется модификация сахарной цепи гликопротеина, вследствие чего не происходит образования зрелой TYR. При "незрелой TYR" объемы продуцирования меланина соответственно сокращаются (Hiroyuki Takahashi, Peter G. Parsons. Rapid and reversible inhibition of TYR activity by glucosidase inhibitors in human melanoma cells, The Journal of Investigative dermatology. 1992, 98(4):481-487.)
Таким образом, для снижения продуцирования меланина и, в свою очередь, пигментации кожи очень подходящим был бы подход, заключающийся в ингибировании а-глюкозидазы I и а-глюкозидазы II для минимизации образования зрелой TYR, как показано на фиг. 4, на которой изображен предлагаемый механизм действия по ингибированию синтеза меланина. Основная модификация тирозиназы, катализируемая а-глюкозидазой, ингибируется экстрактом из растений рода Morus, следствием чего является образование неактивной тирозиназы.
Сущность изобретения
Согласно настоящему изобретению предлагается растительный экстракт, полученный из листьев растений рода Morus, и у которого значение IC50 для ингибирования а-глюкозидазы I составляет менее чем 90 мкг/мл.
Предпочтительно значение IC50 для ингибирования а-глюкозидазы I упомянутого растительного экстракта составляет менее чем 70 мкг/мл, более предпочтительно от 5 до 60 мкг/мл и еще более предпочтительно 5-40 мкг/мл.
Значение IC50 может быть определено как указано в эксперименте 1.
Считают, что улучшение активности упомянутых экстрактов по сравнению с чистым выделенным DNJ обусловлено активностью других иминосахаров, присутствующих в экстракте. Предпочтительно общее содержание иминосахаров в экстракте составляет 5-40 мас.% при определении посредством количественной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC, ВЭЖХ) и/или жидкостной хромато-графии/масс-спектрометрии (LC-MS). К иминосахарам, содержание которых было измерено, относятся 1-дезоксиноиримицин (DNJ), N-метил-дезоксиноиримицин и фагомин.
Более предпочтительно в экстракте общее содержание иминосахаров составляет 8-30 мас.%, еще более предпочтительно общее содержание иминосахаров составляет 15-20 мас.%.
Благодаря точному контролированию содержания характерных химических составляющих появилась возможность эффективного контролирования качества продукта с обеспечением тем самым определенной гарантии косметического или терапевтического действия упомянутого продукта.
Наиболее предпочтительно экстракт также содержит иминосахара 1,4-дидезокси-1,4-имино^-арабинитол (DAB), 2-О-а^-галактопиранозил^Ш (GAL-DNJ) и калистегин В.
Присутствие DAB, являющегося ингибитором гликогенфосфорилазы, может иметь значение в случае применения экстрактов для регулирования метаболизма сахаров, при этом данный вариант применения составляет следующий аспект настоящего изобретения.
Кроме иминосахаров, экстракт предпочтительно содержит аминокислоты, общее содержание которых составляет 20-70 мас.%.
Более предпочтительно общее содержание аминокислот в экстракте составляет 30-60 мас.%, еще более предпочтительно общее содержание аминокислот составляет 40-50 мас.%.
К числу аминокислот, присутствующих в экстракте, относятся 8 незаменимых аминокислот, которые человеческий организм продуцировать не может, в том числе аргинин, лейцин, лизин и фенилала-нин, которые стимулируют секрецию инсулина. Как хорошо известно, аминокислоты незаменимы для поддержания влажности и эластичности кожи. Дефицит аминокислот ослабляет метаболизм кожи и ускоряет процесс ее старения (Marty J.P., NMF and cosmetology of cutaneous hydration. Annales de Derma-tologie et de Vunuriiologie, 2002, 129(1 Pt 2): 131-136.). Экстракт по настоящему изобретению также предназначен для использования как вспомогательное вещество для поддержания кожи в здоровом состоянии.
Экстракт по настоящему изобретению получают из листьев шелковицы семейства Moraceae, род Morus, выбранной из:
a) Morus alba L.,
b) Morus alba var. multicaulis L.,
c) Morus nigra и
d) Morus australis Poir.
Авторы настоящего изобретения провели химический анализ веществ, содержащихся в листях обычных растений рода Morus, и установили, что листья растений всех вышеупомянутых видов имели сравнительно более высокое содержание иминосахаров по сравнению с другими видами, и что листья М. alba имели наивысшее содержание иминосахаров.
Более предпочтительно содержание иминосахаров выражают в пересчете на содержание DNJ, количество которого составляет 1-20 мас.% от общей массы экстракта, более предпочтительно 2-10 мас.% от общей массы экстракта и в зависимости от предполагаемого применения или 4-6 мас.% от общей массы экстракта, или 1-3 мас.% от общей массы экстракта. DNJ также является преобладающим иминосаха-ром (наивысший выход) из числа присутствующих.
Экстракт по настоящему изобретению отличается от применяемых в настоящее время экстрактов шелковицы по ряду признаков, в том числе
по цвету - он бледно-желтого цвета,
по растворимости - он легко растворим в воде,
по значению рН - значение рН экстракта составляет 5,5-6,5 в 1%-ном водном растворе, и по УФ-спектру - экстракт демонстрирует максимальное поглощение при 218 и 263 нм. Экстракт может быть получен с использованием нового способа экстрагирования и очистки, включающего три основные стадии, причем упомянутый способ представляет собой следующий аспект настоящего изобретения.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ получения экстракта из листьев растения рода Morus, у которого значение IC50 для ингибирования а-глюкозидазы I составляет менее чем 90 мкг/мл, который включает стадии:
a) выполнение водного или спиртового экстрагирования из листового материала;
b) выполнение очистки хроматографированием на колонках с использованием сильнокислой катио-нообменной смолы с промыванием водой и элюированием раствором аммиака, сбором элюента и удалением из него аммиака;
c) выполнение хроматографирования элюента на колонках с использованием макропористой абсорбционной смолы и сбором раствора и
d) концентрирование и высушивание экстракта.
Предпочтительно листья растений сушат в печи, измельчают с получением крупного порошка и
a) стадию экстрагирования выполняют 5-8-кратным объемом 0-40% низкомолекулярного спирта из расчета на массу листьев растения рода Morus (в массовом отношении), и повторяют ее до 5 раз,
b) колонку промывают водой в количестве 1-2 объемов колонки, смыв выбрасывают, колонку элю-ируют 0,2-1,0н. водным раствором аммиака в количестве 2-8 объемов колонки при скорости элюирова-ния, составляющей 1-3 объема колонки в час, и собирают элюент со значением рН в пределах от 9,0 до
11,0,
c) колонку элюируют при объемном соотношении между раствором и колонкой в пределах от 20:1 до 5:1, и
d) высушенный экстракт измельчают до прохождения через сито 80 меш.
Более детальное описание процесса экстрагирования с получением экстракта по настоящему изобретению представлено ниже. Экстрагирование (стадия 1).
Листья растения сушат в печи, после чего превращают в крупный порошок. Порошок 1-5 раз экстрагируют 5-18-кратным объемом 0-40% низкомолекулярного спирта из расчета на количество сырья (в массовом отношении), предпочтительно 10-13-кратным объемом 20-30% низкомолекулярного спирта из расчета на количество сырья (в массовом отношении) и более предпочтительно 11-кратным объемом 25% низкомолекулярного спирта из расчета на количество сырья (в массовом отношении) с получением жидкого экстракта.
Очистка 1 (стадия 2).
Хроматография на колонках с использованием катионообменной смолы. После фильтрации жидкого экстракта, полученного на стадии (1), раствор пропускают через колонку, заполненную сильнокислой катионообменной смолой. Колонку элюируют водой в количестве 1-2 объемов колонки, предпочтительно 1,5 объемов колонки, и выбрасывают элюент. Колонку дополнительно элюируют 0.2-1,0н. водным раствором аммиака в количестве 2-8 объемов колонки, предпочтительно 0,7н. водным раствором аммиака в количестве 5 объемов колонки со скоростью элюирования 1-3 объема колонки в час, предпочтительно 1,5 объема колонки в час. Собирают элюент со значениями рН в пределах от 9,0 до 11,0.
Очистка (стадия 3).
Хроматография на колонках с использованием макропористой абсорбционной смолы. Удаляют аммиак из элюента на стадии (2) и доводят раствор до рН 7. Пропускают раствор через колонку, заполненную макропористой абсорбционной смолой. Объемное соотношение между раствором и колонкой должно составлять от 20:1 до 5:1, предпочтительно от 15:1 до 10:1 и более предпочтительно 13:1. Концентрируют собранную жидкость, пропущенную через колонку, и высушивают концентрат, который в последующем измельчают до прохождения через сито 80 меш для получения экстракта по настоящему изобре
тению.
Исходя из вышеупомянутого способа экстрагирования на стадии (1). упомянутым низкомолекулярным спиртом должен быть алкиловый спирт с неразветвленной цепью, имеющий не более 4 атомов углерода, предпочтительно метанол или этанол. Упомянутый способ экстрагирования представляет собой экстрагирование кипячением с обратным холодильником в течение 1-3 ч, предпочтительно в течение 1-2 ч и более предпочтительно в течение 2 ч.
После фильтрации жидкого экстракта, полученного на стадии (1), могут быть выполнены дополнительные операции по удалению большего количества примесей, повышению биологической активности экстракта и обесцвечиванию экстракта. Эти операции включают осаждение спиртом, флокулирование и другие приемлемые операции для удаления белков, танинов и полисахаридов. Осадки могут быть удалены центрифугированием или фильтрацией. Предпочтительным способом очистки в данном случае является осаждение спиртом и центрифугирование: экстракт концентрируют до 1/4 исходного объема, добавляют 1-3 объема 95% этанола, перемешивают в течение получаса, отстаивают в течение 8-12 ч, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин. Сохраняют супернатант для дополнительной очистки.
Исходя из описанного способа экстрагирования суммарный объем жидкого экстракта на стадии (2) должен составлять 2-20 объемов колонки с катионообменной смолой, предпочтительно 10-15 объемов и более предпочтительно 13 объемов.
При подобных условиях активные составляющие могут эффективно абсорбироваться катионооб-менной смолой, которая помогает повысить содержание активных химических продуктов.
Сильнокислая катионообменная смола, используемая в настоящем изобретении, может быть выбрана из числа приведенных ниже: 001X7 (#732), Amberlite IR-120, Dowex-50, Lewatit-100, Zrolit 225 или Diaion SK-1 и т.п., причем наиболее предпочтительной является смола 001X7 (732) благодаря ее лучшим абсорбционным свойствам для концентрации активных составляющих и более низкой цене.
В процессе элюирования водным раствором аммиака колонки с катионообменной смолой значение рН элюента постепенно увеличивается. Результаты биологического и химического анализов элюента показали, что наивысшую активность проявляло содержимое фракций с рН 9-11, поэтому собирали только фракции с рН 9-11.
Исходя из описанного способа экстрагирования скорость потока на стадии (3) должна составлять 14 объема колонки в час, предпочтительно 2 объема колонки в час. Этим обеспечивается максимальная абсорбция макропористой смолой окрашенных примесей, следствием чего является хорошее обесцвечивание.
Для выполнения вышеупомянутого хроматографирования на колонках могут быть выбраны макропористые смолы четырех типов: АВ-8, НР20, S-8 и YWD03F4. После проведения сравнительного анализа и оценки качества было установлено, что наилучшие результаты по обесцвечиванию были обеспечены смолой S-8, поэтому смола типа S-8 является предпочтительной макропористой смолой.
Экстракт листьев шелковицы, полученный по вышеописанному способу, имеет максимум интенсивности абсорбирования при 218,3 нм при УФ-сканировании и окрашен в бледно-желтый цвет, который отличается от цвета других экстрактов листьев шелковицы, доступных в настоящее время на рынке. Большинство экстрактов листьев шелковицы, используемых в косметических средствах, имеющихся на рынке, имеет более темную окраску, т.е. желтую или коричневато-желтую, следствием чего являются окрашенные готовые продукты, что не считается идеальным внешним видом.
Экстракт, описанный в настоящем изобретении, легко растворяется в воде и тем самым способствует лучшей диффузии и абсорбированию активных ингредиентов на участке нанесения. Экстракты шелковицы, используемые в настоящее время в косметических средствах для отбеливания кожи, содержат флавоноиды (например, куваноны) и дифенилы, содержащие этиленовую связь (например, оксиресве-ратрол и мулберросид), и в результате они имеют относительно низкую водорастворимость со средней диффузионной способностью, что фактически требует применения низкомолекулярного спирта для улучшения растворимости с повышением, тем самым, нагрузки на кожу.
Экстракт, описанный в настоящем изобретении, имеет значение рН в пределах 5,5-6,5 в 1%-ном водном растворе. Этот слегка кислый рН близок к рН слоя кожного сала на поверхности кожи, величина которого составляет 4,5-6,6. Благодаря этому при введении упомянутого экстракта в состав средств для ухода за кожей снижается раздражение кожи, вызываемое активными составляющими.
Экстракт по настоящему изобретению можно вводить в состав лекарственного препарата или косметического средства для использования в качестве отбеливающего кожу компонента или для снижения гиперпигментации кожи, или в качестве ингредиента лекарственного препарата, нутрицевтика, пищевого продукта или напитка для регуляции уровня глюкозы в крови. Таким образом, он может применяться, например, для лечения диабета II типа либо для снижения гликемического индекса пищевого продукта или напитка.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен растительный экстракт, соответствующий первому аспекту настоящего изобретения, или продукт способа, соответствующего второму аспекту настоящего изобретения, для применения в качестве косметического средства или лекарственного средства для лечения состояний, вызванных пигментацией.
Предпочтительно косметическое или терапевтическое применение предназначено для снижения продуцирования меланина, включая лечение болезненных состояний или заболеваний, вызванных гиперпигментацией, в том числе веснушек, хлоазмы, рубцов беременности и старческих пятен.
Результаты фармакологических экспериментов с использованием экстракта листьев шелковицы по настоящему изобретению показали, что упомянутый экстракт эффективно ингибирует активность а-глюкозидазы с более высокой эффективностью, чем количественно эквивалентный образец чистого DNJ. Упомянутому экстракту необходима лишь половина концентрации DNJ для достижения такого же эффекта, который достигается чистым DNJ. При испытании на линиях клеток упомянутый экстракт продемонстрировал значительное ингибирующее действие против образования меланина в клетках меланомы линий А375 и В16, и его активность была выше активности часто применяемых ингредиентов в имеющихся на рынке косметических средствах для отбеливания кожи, таких как арбутин и L^M^ra^-фосфат магния. Механизм действия экстракта листьев шелковицы по настоящему изобретению отличается от механизма действия арбутина и L-аскорбил-2-фосфата магния. Два последних непосредственно и конкурентно ингибируют активность TYR, в то время как упомянутый экстракт листьев шелковицы ин-гибирует, главным образом, образование зрелого активного TYR. К числу преимуществ упомянутого экстракта листьев шелковицы относится более высокая активность и большая продолжительность действия. Из-за различных механизмов действия упомянутый экстракт по настоящему изобретению можно применять самостоятельно или вместе с вышеупомянутыми ингибиторами TYR. Результаты клинических исследований на людях подтверждают эти in vitro данные, и после 28 дней местного применения 0,2 или 0,5% экстракта листьев шелковицы в виде крема наблюдалось значительное снижение пигментации кожи (Р <0,001) и значительное отбеливание кожи (Р <0,001)
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предложен растительный экстракт, соответствующий первому аспекту настоящего изобретения, или продукт способа, соответствующий второму аспекту настоящего изобретения, для применения с целью регулирования уровня глюкозы в крови.
Предпочтительно экстракт, предназначенный для применения с целью регулирования уровня глюкозы в крови, дополнительно содержит ингибитор гликогенфосфорилазы.
В экспериментах на животных с использованием в качестве модели крыс линии Wistar и в клинических испытаниях на людях экстракт листьев шелковицы по настоящему изобретению продемонстрировал значительное влияние на снижение уровня глюкозы в крови.
Экстракт по настоящему изобретению особенно хорош, поскольку его благотворное действие основано на комбинации действующих веществ. Так, входящий в его состав иминосахар, такой как DNJ, ин-гибирует а-глюкозидазу в кишечнике, следствием чего является снижение абсорбирования сахаридов (AsanoN. Glycosidase inhibitors: update and perspectives on practical use. Glycobiology, 2003, 13(10): 93R-104R.). Было выявлено, что еще один из иминосахаров, 1,4-дидезокси-1,4-имино^-арабинитол (D-AB1), обладает сильной ингибирующей активностью против гликогенфосфорилазы печени, а также ингибирует in vivo разложение гликогена печени. Как следствие, он оказывает антигипергликемическое действие. Кроме того, присутствие аминокислот, таких как аргинин, лейцин, лизин и фенилаланин, стимулирует секрецию инсулина.
Таким образом, экстракты, описанные в настоящем изобретении, можно применять для регулирования уровня глюкозы в крови после приема пищи и регулирования баланса глюкозы в крови.
Такие экстракты можно применять в качестве лекарственного или лечебно-профилактического средства (например, в качестве пищевой добавки) для регулирования уровня глюкозы в крови.
Согласно третьему аспекту экстракт можно применять в качестве косметического или лекарственного средства, содержащего вспомогательные вещества и факультативно один или несколько альтернативных активных ингредиентов.
Для применения в качестве отбеливающих кожу компонентов другие активные ингредиенты могут быть выбраны, например, из числа витамина С и его производных, таких как комплекс витамин-фосфатидат магния, койевой кислоты, арбутина, диацетилболдина, азелаевой кислоты, октадецендиоевой кислоты, ундециленоилфенилаланина (DEP-11), экстракта солодки, экстракта алоэ, экстракта жерухи лекарственной (Nasturtium officinale), экстракта Ascophyllum (Ascophyllum nodosum), экстракта хмеля (Humulus lupulus), глутатиона, экдизона и/ или эллагиновой кислоты.
Предпочтительное косметическое или лекарственное средство содержит экстракт по настоящему изобретению вместе с производным витамина С. L-аскорбил-2-фосфатом магния (VC-PMG).
Предпочтительно в комбинированном продукте экстракт представлен в соотношении от 10:1 до 1:1 с другим отбеливающим кожу компонентом, более предпочтительно 5:1.
При изготовлении косметических средств или лекарственных препаратов для лечения кожных болезней с использованием экстракта листьев шелковицы по настоящему изобретению или композиции, также содержащей другие ингредиенты, могут быть использованы все традиционные основные вещества, пригодные для изготовления лекарственных препаратов, к числу которых относятся водорастворимые основные вещества, такие как глицерин, полиэтиленгликоль, производные целлюлозы и т.п., и жирорастворимые основные вещества, такие как жир, липиды, углеводороды и т.п. Традиционно используются
приведенные ниже вспомогательные вещества, к числу которых относятся консерванты, такие как нипа-гины, хлорбутанол и сорбиновые кислоты; антиоксиданты, такие как сульфат натрия, бисульфит натрия, ВНТ (бутилокситолуол) и т.п.; загустители, такие как стеариновая кислота, пчелиный воск, парафин, ла-уриловый спирт, карбоксиметилцеллюлоза (CMC) и т.п.; эмульгаторы, такие как триэтаноламин, моно-стеарат глицерина, твины и т.п.; солнцезащитные вещества, такие как октилметоксициннамат, бензофе-нон-3 и т.п.; влагоудерживающие вещества (увлажнители), такие как глицерин, пропиленгликоль, сорбит и т.п.; дезодоранты, ароматизаторы, красящие вещества и т.п. Количества вышеупомянутых вспомогательных веществ известны специалисту.
При использовании упомянутого экстракта в косметических средствах для снижения продуцирования меланина его рекомендованное количество в готовом изделии должно составлять 0,05-2 мас.%, предпочтительно 0,1-1 мас.% и более предпочтительно 0,2-0,5 мас.%.
Согласно четвертому аспекту экстракт можно вводить в состав лекарственного препарата или нут-рицевтика, добавлять к пищевому продукту или напитку или предоставлять в качестве добавки для введения в состав последних в эффективном количестве.
Роль экстракта в пищевом продукте или напитке заключается в снижении гликемического индекса. В подобных случаях можно использовать количество от 50 до 600 мг на дозу (в зависимости от величины).
При изготовлении лекарственных средств для перорального применения с целью регулирования уровня глюкозы в крови экстракт листьев шелковицы по настоящему изобретению можно вводить в состав с традиционными вспомогательными веществами для лекарственных средств для перорального применения, такими как разрыхляющие средства (например, сухой крахмал, карбоксиметил-крахмал натрия, L-HPC (низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза), сшитый PVP (поливинилпирролидон) и т.п.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, гигиенический тальк, бензоат натрия, полиэти-ленгликоль 4000 и т.п.) и клейкие вещества (например, CMC (карбоксиметилцеллюлоза)).
В случае применения упомянутого экстракта для регулирования уровня глюкозы в крови исходя из концентрации активных составляющих в упомянутом экстракте его рекомендованное количество каждый раз составляет 25-600 мг, 3 раза в день; предпочтительно каждый раз 100-300 мг, 3 раза в день; более предпочтительно каждый раз 50-150 мг, 3 раза в день.
Традиционно косметическим средствам или лекарственным препаратам для лечения болезней кожи при изготовлении могут быть приданы приведенные ниже формы. В число этих форм входят растворы, содержащие воду, воду-спирт или масло, гель/коллоидные растворы, содержащие воду или масло, микроэмульсии, разбавленные или неразбавленные эмульсии, рассыпные или плотные пудры (порошки), дисперсии с маслом в водной фазе, образованные с помощью микрочастиц, таких как полимерные частицы или капсулы, и лучше всего ионные или неионные липидные пузырьки.
При изготовлении косметических средств или лекарственных препаратов для лечения болезней кожи с использованием экстракта листьев шелковицы или композиции им могут быть приданы приведенные ниже "дозированные лекарственные формы" с относительной текучестью крем, мазь, лосьон, молочная жидкость, эмульгированная жидкость, слизь, паста, пена, аэрозоль и безводный твердый препарат (например, в форме косметического карандаша).
При изготовлении лекарственных препаратов для перорального введения с использованием экстракта листьев шелковицы по настоящему изобретению для регулирования уровня глюкозы в крови им могут быть приданы традиционно используемые лекарственные формы для перорального введения, такие как таблетки, капсулы и порошки.
Краткое описание фигур
Ниже приведено подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения со ссылкой на прилагаемые фигуры, на которых
фиг. 1 - хроматограмма растительного экстракта из примера 1. Верхняя кривая представляет собой стандартную хроматограмму DNJ; нижняя кривая представляет собой хроматограмму растительного экстракта из примера 1;
фиг. 2 - УФ-спектр растительного экстракта из примера 1;
фиг. 3 - УФ-спектр экстракта, известного из уровня техники;
фиг. 4 - схема, иллюстрирующая механизм действия в случае уменьшения пигментации;
фиг. 5а и 5b показывают уровень ингибирования а-глюкозидазы экстрактом растения рода Morus
(5a) и DNJ (5b);
фиг. 6 - сравнительное воздействие DNJ, арбутина и экстракта растения рода Morus на тирозиназу; фиг. 7 - сравнительное воздействие DNJ, VC-PMG и экстракта растения рода Morus на ингибирова-ние синтеза меланина;
фиг. 8а, 8b и 8с показывают сравнительную клеточную токсичность DNJ (a), VC-PMG (b) и экстракта растения рода Morus (с);
фиг. 9 - влияние экстракта растения рода Morus на снижение уровня глюкозы у крыс линии Wistar; фиг. 10 - влияние экстракта растения рода Morus на снижение уровня глюкозы у людей; и фиг. 11а и 11b -влияние экстракта растения рода Morus на отбеливание кожи у людей.
Подробное описание изобретения
Хроматограмма, представленная на фиг. 1, была получена с помощью перечисленного ниже оборудования и реактивов:
установка: жидкостная хроматографическая установка w600-2420-717, компания Waters (США), система обработки данных Empower;
колонка: колонка Old Shodex Asahipak NH2P-50E (250г4,65 мкм), используемая в режиме с обращенной фазой;
реактивы: смесь ацетонитрил-вода, содержащая 6,5 нмоль ацетата аммония; колонка: температура 40°С; скорость потока: 1,0 мл/мин;
детектор: W2420 ELSD;
усиление: 100; температура дрейфовой трубки 50°С; уровень нагревания распылителя 60%; подвижная фаза: ацетонитрил:вода (смесь содержит 6,5 нмоль ацетата аммония) (84:16). УФ-спектр, представленный на фиг. 2 и 3, был получен с использованием: прибор: спектрофотометр UNICO UV-2100; длина волны сканирования: 200-600 нм; концентрация пробы: 1 мг/мл.
Растительный экстракт по настоящему изобретению может быть получен по методике, описанной со ссылкой на примеры 1-5, с использованием различных листьев шелковицы, как показано со ссылкой на примеры 6-9.
Полученный растительный экстракт можно вводить в состав косметического или лекарственного средства или же использовать в качестве добавки к пищевому продукту или напитку, как показано со ссылкой на примеры 10-16.
Примеры различных активных ингредиентов экстракта приведены ниже в описании экспериментов
1-8.
Пример 1.
Измельчали 100 кг сухих листьев шелковицы вида Morus alba и трижды экстрагировали кипячением с обратным холодильником (каждый раз в течение 1 ч) 12-кратным количеством 30% этанола (из расчета на массу сырья). Конденсировали экстракт до заданного объема и пропускали через колонку, заполненную сильнокислой катионообменной смолой, такой как смола 001X7. Объем колонки составлял 1/14 объема экстрагированной жидкости. Колонку промывали водой (1,5 объема колонки), и представляющий интерес компонент (иминосахара) выделяли из колонки с помощью 0,7н. раствора аммиака в воде (5 объемов колонки) со скоростью протекания 1,5 объема колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммиака с рН9-11. Элюент конденсировали до заданного объема, аммоний удаляли, и рН доводили до рН 7. После этого элюент пропускали через колонку, заполненную макропористой смолой, такой как смола S-8. Объем колонки составлял 1/10 жидкого элюента, а скорость протекания составляла 2 объема колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушенный продукт измельчали до прохождения через сито 80 меш. Получали 1,4 кг бледно-желтого порошка, который содержал 5,8% DNJ, 21% иминосахаров (общее содержание) и 48% аминокислот (общее содержание).
Содержание иминосахаров определяли с помощью приведенного ниже анализа; результаты представлены на фиг. 1, где нижняя кривая представляет собой жидкостную хроматограмму, на которой показаны основные пики иминосахаров (стандарт DNJ представлен на верхней кривой).
a) Точно отвешивали соответствующее количество DNJ в качестве контроля, добавляли метанол до получения раствора с концентрацией 0,1 мг/мл и хорошо взбалтывали. Переносили точно отмеренный 1 мл раствора в 25 мл мерную колбу, в которую добавляли 1 мл буферного раствора борной кислоты-хлорида калия (0,4 моль/л, рН 8,5) и 2 мл раствора FMOC-CI в безводном ацетонитриле (5 ммоль/л). После обработки ультразвуком в течение 20 мин при комнатной температуре немедленно добавляли 2 мл раствора глицина (0,2 моль/л) и 0,1%-ный раствор уксусной кислоты до объема мерной колбы и хорошо взбалтывали для получения контрольного раствора образца.
b) Растворяли 0.3 г экстракта в соответствующем количестве воды и пропускали через предварительно обработанную полиамидную колонку. Элюировали раствором хлористо-водородной кислоты (рН 3). Собирали элюент, и конденсировали его под вакуумом до приблизительно 10 мл. Вносили раствор в предварительно обработанную колонку с анионообменной смолой. Промывали колонку водой, и собирали элюент. После конденсирования под вакуумом до приблизительно 30 мл переносили элюент в 50 мл мерную колбу, и добавляли воду до объема мерной колбы. Переносили точно отмеренный 1 мл раствора в 25 мл мерную колбу, и, следуя вышеописанной в разделе а) методике, начиная со слов "в которую добавляли 1 мл...", приготовляли исследуемый раствор.
c) Подвергали полученные растворы жидкостному хроматографированию, как описано ниже, и определяли в них содержание иминосахаров (с помощью системы обработки данных Empower). Абсорбент: C18-ODS; подвижная фаза: смесь ацетонитрил:0,1%-ный раствор уксусной кислоты (30:70), протекание в течение 30 мин, заменяли подвижную фазу на смесь ацетонитрил:0,1%-ный раствор уксусной кислоты
a)
(70:30), протекание в течение 10 мин. Перед введением следующего образца систему уравновешивали с помощью исходной подвижной фазы. Время записи хроматограммы составляло 30 мин с длиной волны детектирования 265 нм. Вводили в хроматографическую установку точно отмеренные 20 мкл контрольного и исследуемого растворов соответственно и пропускали через колонку для получения результатов хроматографирования.
Общее содержание аминокислот определяли с использованием стандартного аминокислотного анализатора.
Пример 2.
Измельчали 100 кг сухих листьев шелковицы вида Morus alba и трижды экстрагировали кипячением с обратным холодильником (каждый раз в течение 1 ч) 18-кратным количеством воды (из расчета на массу сырья). Пропускали экстракт через колонку, заполненную сильнокислой катионообменной смолой, такой как смола Dowex-50. Объем колонки составлял 1/20 экстракта. Промывали колонку сначала водой (2 объема колонки), а затем 0,5н. раствором аммония в воде (8 объемов колонки) со скоростью протекания 3 обьема колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммония с рН 9-11. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний, и рН доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой, такой как смола НР20. Объем колонки составлял 1/20 элюента, а скорость протекания составляла 4 объема колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушенный продукт измельчали до прохождения через сито 80 меш. Получали 1,4 кг бледно-желтого порошка, который содержал 4,3% DNJ, 19% иминосахаров (общее содержание) и 40% аминокислот (общее содержание).
УФ-спектр представлен на фиг. 2. Два четко выраженных пика отличают упомянутый экстракт от других экстрактов растений рода Morus (см. фиг. 3), которые имеют более высокое содержание примесей. Из-за наличия примесей пики не различаются, что может привести к более низкой эффективности.
Пример 3.
Измельчали 20 кг сухих листьев шелковицы вида Morus alba и трижды экстрагировали кипячением с обратным холодильником 5-кратным количеством 40% этанола (из расчета на массу сырья). Фильтровали смешанный экстракт, к которому был добавлен равный объем этанола, перемешивали с постоянной скоростью в течение получаса и отстаивали в течение ночи. Удаляли осадок центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 мин, выделяли этанол до заданного объема. Пропускали супернатант через колонку, заполненную сильнокислой катионообменной смолой, такой как смола 001X7. Объем колонки составлял 1/3 жидкости. Промывали колонку водой (1 объем колонки) и элюировали 1,0н. водным раствором аммиака (2 объема колонки) со скоростью протекания 1 объем колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммиака с рН 9-11. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний, и рН доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой, такой как смола S-8. Объем колонки составлял 1/13 элюента при скорости протекания 1 объем колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушенный продукт измельчали до прохождения через сито 80 меш. Получали 0,11 кг почти белого порошка, который содержал 9.1 % DNJ, 29% иминосахаров (общее содержание) и 32% аминокислот (общее содержание).
Пример 4.
Измельчали 50 кг сухих листьев шелковицы вида Morus alba и трижды экстрагировали кипячением с обратным холодильником 12-кратным количеством 40% этанола (из расчета на массу сырья). Фильтровали смешанный экстракт, добавляли осадитель, сульфат алюминия-калия, до рН 3, и перемешивали в течение 30 мин. После отстаивания в течение 2 ч удаляли осадок центрифугированием. Доводили супер-натант до рН 7. Пропускали супернатант через колонку, заполненную катионообменной смолой 001X7. Объем колонки составлял 1/13 жидкости. Промывали колонку водой (2 объема колонки) и элюировали 0,2н водным раствором аммиака (8 объемов колонки) со скоростью протекания 1 объем колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммония с рН 9-11. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний, и рН доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой АВ-8. Объем колонки составлял 1/20 элюента при скорости протекания 2 объема колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, высушенный продукт измельчали, и пропускали через сито 80 меш. Получали 0,12 кг почти белого порошка, который содержал 18,6% DNJ, 39% имино-сахаров (общее содержание) и 21% аминокислот (общее содержание).
Пример 5.
Измельчали 50 кг сухих листьев шелковицы вида Morus alba и четырежды экстрагировали кипячением с обратным холодильником 11-кратным количеством 25% этанола (из расчета на массу сырья). Фильтровали смешанный экстракт, после чего пропускали его через колонку, заполненную катионооб-менной смолой типа Amberlite IR-120 (H+). Объем колонки составлял 1/15 жидкости. Промывали колонку водой (1,5 объема колонки), и элюировали 0,7н водным раствором аммиака (5 объемов колонки) со скоростью протекания 1,5 объема колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммиака с рН 9-11. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний и доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой S-8. Объем колонки составлял 1/5 элюента при скорости протекания 1 объем колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушен
ный продукт измельчали до прохождения через сито 80 меш. Получали 0,46 кг бледно-желтого порошка, который содержал 5,6% DNJ, 24% иминосахаров (общее содержание) и 48% аминокислот (общее содержание).
Пример 6.
Измельчали 5 кг сухих листьев шелковицы вида Morus alba var. multicaulis L. и трижды экстрагировали кипячением с обратным холодильником 11-кратным количеством 25% этанола (из расчета на массу сырья). Фильтровали смешанный экстракт, после чего пропускали его через колонку, заполненную ка-тионообменной смолой типа 001X7. Объем колонки составлял 1/13 жидкости. Элюировали колонку сначала водой (2 объема колонки), затем 0,5н. водным раствором аммиака (5 объемов колонки) со скоростью протекания 1,5 объема колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммиака с рН 9-11. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний и доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой НР20. Объем колонки составлял 1/10 элюента при скорости протекания 4 объема колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушенный продукт измельчали до прохождения через сито 80 меш. Получали 48 г бледно-желтого порошка, который содержал 2,1% DNJ, 8,3% иминосахаров (общее содержание) и 65% аминокислот (общее содержание).
Пример 7.
Измельчали 5 кг сухих листьев шелковицы вида Morus nigra и трижды экстрагировали кипячением с обратным холодильником 8-кратным количеством 80% этанола (из расчета на массу сырья). Фильтровали смешанный экстракт, и конденсировали его до приблизительно 6 л, к которым добавляли приблизительно 12 л этанола. Перемешивали с постоянной скоростью в течение получаса, и отстаивали в течение ночи. Удаляли осадок центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 мин, выделяли этанол до заданного объема, и добавляли соответствующее количество флокулянта, такого как сульфат алюминия. После отстаивания с полным осаждением удаляли осадок центрифугированием. Пропускали супернатант через колонку, заполненную катионообменной смолой, такой как смола 001X7. Объем колонки составлял 1/10 жидкости. Промывали колонку сначала водой (1 объем колонки), затем 0,5н. водным раствором аммиака (4 объема колонки) со скоростью протекания 3 объема колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммиака с рН 9-11. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний и доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой НР20. Объем колонки составлял 1/15 элюента при скорости протекания 4 объема колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушенный продукт измельчали до прохождения через сито 80 мет. Получали 40 г почти белого порошка, который содержал 3,9% DNJ, 15% иминосахаров (общее содержание) и 58% аминокислот (общее содержание).
Пример 8.
Измельчали 5 кг сухих листьев шелковицы вида Morus anstralis Poir. и трижды экстрагировали кипячением с обратным холодильником 8-кратным количеством 80% этанола (из расчета на массу сырья). Фильтровали смешанный экстракт, после чего пропускали его через колонку, заполненную катионооб-менной смолой типа Amberlite IR-120 (H+). Объем колонки составлял 1/10 жидкости. Элюировали колонку сначала водой (1,5 объема колонки), затем 0,7н. водным раствором аммиака (5 объемов колонки) со скоростью протекания 1,5 объема колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммиака с рН 911. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний и доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой АВ-8. Объем колонки составлял 1/13 элюента при скорости протекания 2 объема колонки в час. После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушенный продукт измельчали до прохождения через сито 80 меш. Получали 42 г бледно-желтого порошка, который содержал 1,4% DNJ, 5,2% иминосахаров (общее содержание) и 68% аминокислот (общее содержание).
Пример 9.
Измельчали 50 кг сухих листьев шелковицы вида Morus alba и один раз экстрагировали кипячением с обратным холодильником 10-кратным количеством 30% этанола (из расчета на массу сырья). Фильтровали экстракт, после чего пропускали его через колонку, заполненную катионообменной смолой типа Amberlite IR-120 (H+). Объем колонки составлял 1/13 жидкости. Элюировали колонку сначала водой (1,5 объема колонки), затем 0,7н. водным раствором аммиака (7 объемов колонки) со скоростью протекания 2 объема колонки в час. Собирали элюент в водном растворе аммиака с рН 9-11. Конденсировали до заданного объема, удаляли аммоний и доводили до рН 7. Пропускали элюент через колонку, заполненную макропористой смолой АВ-8. Объем колонки составлял 1/15 элюента при скорости протекания 1 объем колонки в час После этого собранную жидкость сушили под вакуумом, и высушенный продукт измельчали до прохождения через сито 80 меш. Получали 0,5 кг бледно-желтого порошка, который содержал 4,2% DNJ, 22% иминосахаров (общее содержание) и 46% аминокислот (общее содержание).
Пример 10.
Смешивали 8 частей стеариновой кислоты, 5 частей моностеарата глицерина, 3 части парафинового масла, 8 частей спермацетового воска, 1 часть пчелиного воска, 5 частей силиконового масла и нагревали до температуры 75°С (получая "Основу 1"). Смешивали 0,7 части триэтаноламина, 5 частей глицерина,
0,05 части метилпарабена и нагревали до температуры 75°С (получая "Основу 2"). К смешанным основам 1 и 2 добавляли 3 части (в массовом отношении) экстракта листьев шелковицы из примера 1, хорошо перемешивали и добавляли воду до 100 мл. После остывания добавляли достаточное количество ароматизирующего вещества для получения косметического отбеливающего крема, содержащего упомянутый экстракт листьев шелковицы. Пример 11.
Смешивали 7 частей (в массовом отношении) глицерина, 4 части пропиленгликоля, 0,2 части 30% раствора NaOH и 0,1 части сорбата калия. Добавляли дистиллированную воду до 100 мл для получения водной фазы. Отдельно смешивали 10 частей стеариновой кислоты, 8 частей бутилстеарата, 1 часть мо-ностеарата глицерина, 3 части стеарилового спирта и нагревали для получения масляной фазы. Нагревали вышеупомянутую водную фазу до температуры 95°С. Медленно вливали масляную фазу в водную фазу при такой же температуре с непрерывным помешиванием. При температуре приблизительно 45°С добавляли к упомянутой смеси 2 части экстракта листьев шелковицы из примера 4, 0,4 части L-аскорбил-2-фосфата магния, несколько капель ароматизирующего вещества и продолжали помешивание до смешивания двух упомянутых фаз. Охлаждали для получения пасты.
Пример 12.
Смешивали 7 частей (в массовом отношении) глицерина, 4 части пропиленгликоля, 0,2 части 30% раствора NaOH и 0,1 части сорбата калия. Добавляли дистиллированную воду до 100 мл для получения водной фазы. Отдельно смешивали 10 частей стеариновой кислоты, 8 частей бутилстеарата, 1 часть мо-ностеарата глицерина, 3 части стеарилового спирта и нагревали для получения масляной фазы. Нагревали вышеупомянутую водную фазу до температуры 95°С. Медленно вливали масляную фазу в водную фазу при такой же температуре с непрерывным помешиванием. При температуре приблизительно 60°С добавляли к упомянутой смеси 2 части экстракта листьев шелковицы из примера 1 и 0,2 части DEP-11. Добавляли несколько капель ароматизирующего вещества, и продолжали помешивание до смешивания двух упомянутых фаз. Охлаждали для получения пасты.
Пример 13.
К 0,4 части (в массовом отношении) экстракта листьев шелковицы из примера 5 добавляли 0,1 части этилпарабена, 0,5 части бисульфата натрия, 0,1 части эдентата динатрия, 9 частей глицерина и добавляли дистиллированную воду до 100 мл для получения лосьона.
Пример 14.
Хорошо смешивали 5 кг экстракта листьев шелковицы из примера 1 с 1,8 кг крахмала, 1,5 кг микрокристаллической целлюлозы, 0,45 кг структурированного PVP (поливинилпирролидон), 0,55 кг CSM-Na и соответствующими количествами стеарата магния и силиконового микропорошка. Изготовляли 20000 таблеток, каждая массой приблизительно 0,5 г.
Пример 15.
Смешивали 1 кг экстракта листьев шелковицы из примера 3 с соответствующим количеством крахмала, заполняли 10000 капсул так, чтобы каждая капсула содержала 100 мг экстракта. Пример 16.
К 2 кг экстракта листьев шелковицы из примера 3 добавляли 0,5 кг витамина С, 1,0 кг лимонной кислоты, 0,8 кг бикарбоната натрия, 0,08 кг маннита, PVP, PEG 6000, вкусовую добавку и связующее вещество для получения шипучих гранул.
Эксперименты с определением активности.
Эксперимент 1. Анализ активности ингибирования экстрактом листьев шелковицы а-глюкозидазы.
Цель эксперимента заключалась в исследовании активности ингибирования а-глюкозидазы экстрактом листьев шелковицы по настоящему изобретению. Перечень реагентов и оборудования приведен ниже:
1) Экстракт листьев шелковицы из примера 1,
2) DNJ - стандартный эталонный химикат,
3) а-глюкозидаза (типа I из хлебопекарных дрожжей. ЕС232.604.7) в растворе (0,42 ед./мл), полученном с использованием буфера, содержащего фосфорную кислоту (0.1 моль/л, рН 6.8),
4) pNPG (4-нитрофенил-р^-глюкуроновая кислота) в растворе (5 ммоль/л), полученном с использованием буфера, содержащего фосфорную кислоту (0.1 моль/л),
5) pNP (n-нитрофенил) в растворе (200 мкмоль/л), полученном с использованием буфера, содержащего фосфорную кислоту (0.1 моль/л, рН 6.8),
6) устройство для считывания микропланшетов Multiskan Ascent (компания Thermo Electron Co.,
США).
Методика проведения эксперимента изложена ниже. Стандартная кривая.
Разбавляли раствор pNP (200 мкмоль/л) буфером, содержащим фосфорную кислоту (0.1 моль/л), с получением таких концентраций: 100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 мкмоль/л. Из каждого разбавленного раствора отбирали по 200 мкл для определения ошической плотности при 405 нм, и использовали значения
оптической плотности для вычерчивания стандартной кривой. Анализ исследуемых образцов.
1) В отдельные лунки микропланшета вносили по 80 мкл каждого исследуемого образца различных концентраций и 80 мкл буферного раствора, содержащего фосфорную кислоту, в качестве плацебо.
2) В каждую лунку добавляли 30 мкл фермента (0,42 ед./мл), устанавливали на 30 с на лабораторный стенд, инкубировали вместе с субстратом (pNPG) в течение 15 мин при температуре 37°С, включали устройство для считывания микропланшетов на кинетический режим измерения при температуре 37°С с 10 с интервалом. Снимали показания 13 раз (суммарно в течение 2 мин).
3) В каждую лунку добавляли 90 мкл субстрата (раствор (5 ммоль/л) pNPG), взбалтывали на стенде в течение 30 с, помещали в устройство для считывания микропланшетов, нажимали кнопку "ПУСК", и непрерывно измеряли показания оптической плотности при температуре 37°С.
4) Принимая концентрации pNP за ось X, а значения оптической плотности за ось Y, строили стандартную кривую. Используя значения оптической плотности, полученные на стадии (3), определяли с помощью стандартной кривой соответствующие количества продукта реакции.
5) Для плацебо и исследуемых образцов различных концентраций, откладывая время по оси X и количество продукта по оси Y, строили кривую развития реакции. Наклон прямой линии показывал скорость прохождения реакции.
6) Откладывая концентрацию исследуемых образцов по оси X и скорость прохождения реакции по оси Y, строили кривую концентрации исследуемых образцов, и определяли IC50. Активность ингибирования (ед./мкг)=(0,5г активностъ фермента в каждой лунке)/(Ю5о объем образцов в каждой лун-ке)=(0,5х0,42х0,03)/ (IC50x0,08)=0,07875/IC50.
Результаты и обсуждение.
Результаты вышеописанного эксперимента показали, что значение IC50 экстракта листьев шелковицы из примера 1 составляло 13,6 мкг/мл при ингибировании а-глюкозидазы, в то время как соответствующий показатель для чистого DNJ составлял 70 мкг/мл. Это доказывает, что активность экстракта листьев шелковицы была намного большей, чем активность DNJ. Принимая во внимание тот факт, что содержание DNJ в экстракте листьев шелковицы из примера 1 составляло всего 3.5%, оказывается возможным применение упомянутого экстракта для достижения такой же или лучшей активности с одновременным снижением вероятности возникновения негативных реакций, вызываемых применением более высоких концентраций чистого соединения. Смотри фиг. 5а и 5b, которые показывают соответственно in vitro ингибирование а-глюкозидазы экстрактом листьев растения рода Morus и DNJ на графиках зависимости начальной скорости реакции от концентрации.
Эксперимент 2. Анализ активности ингибироваиия TYR экстрактом листьев шелковицы и арбутином.
Цель эксперимента заключалась в исследовании воздействия и механизмов действия исследуемых образцов на активность TYR в клетках меланомы линии В16. Перечень реагентов и оборудования приведен ниже:
1) Экстракт листьев шелковицы из примера 1.
2) DNJ - стандартный эталонный химикат.
3) Арбутин - стандартный эталонный химикат.
4) Раствор L-дофа (1 мг/мл) в буфере, содержащем фосфорную кислоту (рН 6,8), приготовленный непосредственно перед использованием.
5) WIP - буфер для лизиса клеток.
6) Планшет для культивирования клеток (24-луночный и 96-луночный).
7) Оптический микроскоп.
8) Центрифуга.
9) Устройство для считывания микропланшетов.
Методика проведения экспериментов изложена ниже.
Клетки меланомы линии В16 промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатом, и собирали в центрифужную пробирку. После центрифугирования к дебрису добавляли WIP-лизисный буфер, содержащий фенилметилсульфонилфторид (PMSF), для лизиса клеток; раствор отстаивали на льду в течение 30 мин. После этого раствор центрифугировали в течение 10 мин при 12000g и температуре 4°С. Супернатант (клеточный экстракт), содержащий клеточные компоненты, сохраняли для дальнейшего анализа.
Для определения непосредственного воздействия DNJ, арбутина и экстракта растения рода Morus на каталитическую активность тирозиназы к 60 мкл клеточного экстракта в 96-луночном микропланшете добавляли 60 мкл DNJ, арбутина и экстракта растения рода Morus (концентрация используемых соединений различна). Планшет инкубировали при температуре 37°С в течение 1 ч, после чего в каждую лунку добавляли 80 мкл раствора L-дофа. Оптическую плотность (492 нм) каждой лунки регистрировали с 5 мин интервалами в течение 30 мин при температуре 37°С с использованием устройства для считывания микропланшетов.
Для определения косвенного воздействия DNJ, арбутина и экстракта растения рода Morus на каталитическую активность тирозиназы клетки меланомы линии В16 культивировали в течение трех дней с различными концентрациями DNJ, арбутина и экстракта растения рода Morus перед выполнением экстрагирования и оценивания. После экстрагирования в 96-луночный микропланшет помещали 40 мкл клеточного экстракта, 120 мкл фосфатного буфера (рН 6,8) и 40 мкл раствора L-дофа (2 мг/мл), и значения оптической плотности каждой лунки при 492 нм регистрировали с 5 мин интервалами в течение 30 мин при температуре 37°С с использованием устройства для считывания микропланшетов.
Результаты и обсуждение.
Результаты анализов представлены на фиг. 6. Светлые столбцы показывают непосредственное воздействие DNJ, арбутина и экстракта растения рода Morus на активность тирозиназы в клеточных экстрактах, в то время как темные столбцы показывают результаты косвенного воздействия упомянутых соединений на активность тирозиназы.
В ходе анализа непосредственной активности арбутин снижал активность тирозиназы дозозависи-мым образом, в то время как DNJ и экстракт растения рода Morus не оказывали воздействия на активность тирозиназы. Вместе с тем, в ходе анализа косвенной активности после инкубирования клеток в течение трех дней в присутствии исследуемых соединений наблюдалось дозозависимое снижение активности тирозиназы в группах DNJ и экстракта растения рода Morus, тогда как клетки, инкубированные с арбутином, не проявляли воздействия на активность тирозиназы.
Эти данные соответствуют литературным данным и служат подтверждением предложенному в этом изобретении особенному механизму действия ингибиторов а-глюкозидазы, DNJ и экстракта растения рода Morus. При анализе непосредственной активности арбутин непосредственно взаимодействует с ти-розиназой, связываясь с активным центром и инактивируя фермент, снижая тем самым окисление L-дофа до о-допахинона. Ингибиторы а-глюкозидазы не оказывают непосредственного воздействия на активность тирозииазы, и это отражено в результатах анализа непосредственной активности, которые продемонстрировали, что DNJ и экстракт растения рода Morus не проявляют ингибирующей активности в отношении тирозиназы.
В ходе анализа косвенной активности было выявлено, что как DNJ, так и экстракт растения рода Morus не проявляли ингибирующей активности в отношении тирозиназы. Ингибиторы а-глюкозидазы воздействуют на незрелую тирозиназу и, предотвращая связывание кальнексина при созревании тирози-назы, вызывают конформационные изменения, которые оказывают воздействие на энзиматическую активность зрелой тирозиназы. Эти изменения были подтверждены снижением энзиматической активности после трехдневного инкубирования с DNJ и экстрактом растения рода Morus. Арбутин непосредственно конкурирует за активный центр тирозиназы, и при проведении косвенного анализа, в котором арбутин в исследуемом растворе отсутствовал, ингибирования энзиматической активности не наблюдалось.
Эксперимент 3. Воздействие, оказываемое экстрактом листьев шелковицы по настоящему изобретению на содержание меланина в меланоцитах.
Цель эксперимента заключалась в исследовании воздействия исследуемых образцов на содержание меланина в клетках меланомы линии В16. Перечень реагентов и оборудования приведен ниже:
1) Экстракт листьев шелковицы из примера 1.
2) DNJ - стандартный эталонный химикат.
3) VC PMG - стандартный эталонный химикат.
4) WIP - буфер для лизиса клеток.
5) Оптический микроскоп.
6) Планшет для культивирования клеток (24-луночный и 96-луночный).
7) Центрифуга.
8) Устройство для считывания микропланшетов. Методика проведения экспериментов изложена ниже.
1. Собирают клетки меланомы линии В16 в логарифмической фазе и доводят клеточную суспензию до соответствующей концентрации, разделяют на 24-луночные планшеты, и позволяют клеткам прилипнуть к лункам.
2. В каждую лунку добавляют 1 мл раствора исследуемого образца различной концентрации, полученной посредством разведения питательной средой (4 повтора для каждой концентрации). Инкубируют в течение 2 дней, освежают раствор образца, и продолжают инкубирование в течение 2 дней.
3. Собирают клетки на 4 день и тщательно дважды промывают с помощью PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор). Добавляют 250 мкл WIP-лизисного буфера, выдерживают для ли-зирования на ледяной бане с энергичным перемешиванием каждые 5 мин 4-5 раз.
4. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин при температуре 4°С. Сливают супернатант, растворяют осадок 400 мкл 1н. раствора NaOH, и выдерживают раствор на водяной бане при температуре 80°С в течение 1 ч.
5. С помощью устройства для считывания микропланшетов определяют значение оптической плотности при 405 нм и вычисляют относительное содержание.
1.
Результаты и обсуждение.
Результаты анализов представлены на фиг. 7. Столбцы среднего тона показывают ингибирующее воздействие DNJ на содержание меланина в клетках меланомы линии В16, в то время как темные и светлые столбцы показывают результаты ингибирующего воздействия VC-PMG и экстракта растения рода Morus на содержание меланина в клетках меланомы линии В16. Все воздействия регистрировали после 3 дней инкубирования с DNJ, VC-PMG или экстрактом растения рода Morus в различной концентрации.
По сравнению с контрольным образцом содержание меланина при обработках DNJ, VC-PMG и экстрактом листьев шелковицы из примера 1 в различных концентрациях существенно снизилось дозозави-симым образом. Интенсивность активности трех упомянутых соединений, от сильной до слабой, выглядела следующим образом: DNJ> экстракт растения рода Morus> VC-PMG.
DNJ представляет собой активное соединение, идентифицированное в экстракте растения рода Mo-rus как ингибитор а-глюкозидазы, которое может снижать активность тирозиназы, что ведет к снижению содержания меланина в клетках меланомы линии В-16. Поскольку содержание природного DNJ во всех растениях очень низко, использовать природный DNJ в промышленных целях невозможно. Однако в случае экстракта растения рода Morus, несмотря на то что содержание DNJ в нем составляет всего 2-5%, упомянутый экстракт растения рода Morus все же демонстрирует уровень активности, подобный DNJ, что указывает на то, что в составе экстракта растения рода Morus DNJ может действовать синергично с другими активными соединениями, оказывая сильное антипигментационное действие.
По результатам наблюдений, выполненных изобретателями, если концентрация VC-PMG, воздействующего на клетки меланомы линии В16, превышает 200 млн-1 (частей на миллион), то жизнеспособность клеток снижается, что указывает на то, что чрезмерная концентрация VC-PMG может причинять клеткам вред. Экстракт растения рода Morus как природный продукт имеет лучший профиль безопасности и более высокую эффективность по сравнению с VC-PMG, и механизм его действия отличается от механизма действия VC-PMG, благодаря чему экстракт растения рода Morus можно применять самостоятельно или в сочетании с VC-PMG для достижения лучшего антипигментационного действия.
При подборе дозировки экстракта растения рода Morus, пригодной для использования его в качестве отбеливающего компонента в косметических средствах, изобретатели рассмотрели обычно применяемую при изготовлении косметических средств дозировку отбеливающего ингредиента: арбутин - 1-5%, койевая кислота - 0,2-3%, производные витаминов - <3%. Исходя из результатов выполненного изобретателями исследования рекомендуемая дозировка для экстракта листьев шелковицы из примера 1 составляет менее 3%.
Эксперимент 4. Воздействие, оказываемое экстрактом листьев шелковицы по настоящему изобретению на рост меланоцитов. Методы.
Жизнеспособность клеток.
Выживаемость клеток определяли посредством МТТ-метода, основанного на превращении бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия митохондриальным ферментом в живых клетках в кристаллы МТТ-формазана. Свежий раствор МТТ (2 мг/мл) приготовляли с использованием забуферен-ного фосфатом физиологического раствора (PBS). Клетки (2х104 клеток/мл) высевали на 96-луночные планшеты. В культуральную среду добавляли DNJ, VC-PMG, экстракт растения рода Morus или DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла). В ходе проведения эксперимента через различные промежутки времени в лунки добавляли 20 мкл аликвоты маточного раствора МТТ, и планшет инкубировали при температуре 37°С в течение 4 ч во влажном инкубаторе при 5% концентрации СО2. Через 4 ч кристаллы формазана из этих клеток растворяли в 100 мкл DMSO при осторожном встряхивании. Через 10 мин количество формазана определяли спектрофотометрическим способом с помощью устройства для считывания микропланшетов ELISA при 540 нм.
Определение содержания меланина в клетках меланомы.
Клетки меланомы линии В16 высевали с плотностью 4х104 клеток на лунку на 24-луночные куль-туральные планшеты и инкубировали при температуре 37°С в течение 24 ч в инкубаторе при 5% концентрации CO2. После этого клетки в течение 3 дней обрабатывали растворами, содержащими различное количество DNJ, VC-PMG или экстракта растения рода Morus. Клетки промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатом, и собирали в центрифужную пробирку. После центрифугирования дебрис разрушали с помощью WIP-лизисного буфера, содержащего фенилметилсульфонилфторид (PMSF), на льду в течение 30 мин. Раствор центрифугировали в течение 10 мин при 12000g при температуре 4°С, дебрис растворяли в 1н. растворе NaOH посредством кипячения в течение 1 ч при температуре 70°С. Содержание меланина определяли с помощью спектрофотометра при 405 нм.
Результаты и обсуждение.
Воздействие DNJ, VC-PMG и экстракта растения рода Morus на жизнеспособность клеток. Результаты анализа жизнеспособности клеток меланомы линии В16 с применением МТТ приведены на фиг. 8А, 8В и 8С.
При заданной концентрации DNJ, VC-PMG и экстракт растения рода Morus не индуцировали инги
бирования роста клеток меланомы линии В16. Эти данные ясно показывают нецитотоксическую природу DNJ, VC-PMG и экстракта растения рода Morus относительно клеток меланомы линии В16 при концентрации ниже 200 млн-1.
Эксперимент 5. Воздействие экстракта листьев шелковицы по настоящему изобретению на уровень глюкозы в крови крыс линии Wistar.
Перечень реагентов и оборудования приведен ниже:
1) Экстракт листьев шелковицы из примера 1.
2) Физиологический раствор.
3) Миглитол - стандартный эталонный химикат.
4) 64 крысы линии Wistar.
5) Глюкометр One Touch Ultra (компания Джонсон и Джонсон) и тест-полоски (код 9) для глюко-метра.
Методика проведения эксперимента изложена ниже.
Животные получали экстракт растения рода Morus посредством внутрибрюшинной инъекции (15 или 30 мг/кг) или внутрижелудочно (25 или 50 мг/кг). В качестве положительного контроля применяли миглитол (Glyset(r)) (25 мг/кг), ингибитор а-глюкозидазы, разрешенный к применению для лечения диабета II типа. Уровни сахара в крови натощак регистрировали в качестве исходного уровня; после приема крахмальной муки уровни сахара в крови измеряли через 0,5, 1 и 2 ч. Перед приемом крахмальной муки животным вводили экстракт растения рода Morus.
Результаты и обсуждение.
Уровень глюкозы в крови через 0,5, 1,2 ч после введения крахмала (X+SD, п=10)
Группы
Доза (мг/к!)
Уровень глюкозы в крови натощак (ммоль/л)
0,5 ч (ммоль/л)
1 ч
(ммоль/л)
Нормальный контроль
3,07±0,79
3,0610,77
3,51+0.76
3.22+0,47
Внутрижелудочно
25 мг/кг
3,02+0,71
2,38+0,49*
3,2010,56
3,0510,59
Внутрижелудочн о
50 мг/кг
3,02±О,73
2,2310,40**
2,8910,59
2.7+0.59*
Внутрибрюшинно
15 мг/кг
3,05±0,80
2,61±0,54
3,29±0,39
3,1510,50
Внутрибрюшинно
30 мг/кг
3,06+0,78
2.34Ю.41*
3.43±0,54
2,9710.41
Положительный контрольл
25 мг/кг
3,04+0,74
2,27+0,71**
2,98±0,52
2,6910.35*
Результаты показали, что экстракт растения рода Morus существенно снижал уровень глюкозы в крови. При внутрижелудочном введении активные соединения имеют хорошую пероральную биодоступность и не инактивируются в процессе метаболизма. Как внутрижелудочные, так и внутрибрюшин-ные дозы значительно снижали уровень глюкозы в крови, причем доза 50 мг/кг при проведении этого исследования демонстрировала такую же эффективность, как и миглитол (Glyset(r)) (см. фиг. 9).
Эксперимент 6. Влияние экстракта растения рода Morus на снижение уровня глюкозы в крови людей.
Методы.
При проведении исследования на небольшом количестве людей участники получали 400 мг экстракта растения рода Morus или плацебо плюс 50 г пищевого сахара после голодания в течение ночи. Уровень сахара в крови контролировали в течение трех часов. Кроме того, один пациент получил 50 г миглитола, который использовали в качестве положительного контроля.
Результаты и обсуждение.
Данные показали, что экстракт растения рода Morus значительно снижал уровень сахара в крови: снижение начального пикового уровня сахара в крови составляло 59,91%, снижение уровня сахара в крови через два часа составляло 50,78%, и снижение сахара в крови через три часа составляло 47,18%. Экстракт растения рода Morus снижал гликемический индекс мягкого сахара с 83,8 до 41,2 (см. фиг. 10).
Эксперимент 7. Воздействие экстракта растения рода Morus на отбеливание кожи у людей.
Методы.
Для проведения исследования экстракт листьев шелковицы из примера 1 был введен в состав крема с содержанием действующего вещества 0,2 и 0,5%. Двадцать женщин (в возрасте от 18 лет и старше), давшие информированное согласие, дважды в день наносили крем обоих составов на заранее определенные участки предплечья. Перед первой обработкой на определенных участках с помощью прибора Chromameter CR300 были проведены измерения цвета кожи.
После 28-дневной обработки пациенты возвратились в исследовательскую лабораторию, где на тех же самых участках, что и в 0 день, были проведены новые измерения цвета кожи.
Оценивание проводили по следующим трем исследуемым параметрам:
L* (от темного до светлого). Это параметр белизны кожи. Повышение этого параметра характеризует отбеливание кожи;
b* (от голубого до желтого). Снижение этого параметра характеризует снижение желтой состав
ляющей кожи;
ITA° (Individual Typological Angle - индивидуальный типологический угол). Этот параметр показывает степень пигментации кожи субъекта с использованием параметров белизны (L*) и кожного меланина (b*). Повышение ITA° характеризует снижение пигментации кожи.
Результаты и обсуждение.
Параметр L* значительно увеличился (Р <0,001) после 28 дней ежедневного применения 0,2% средства (в среднем+0.54 AUC (площадь под кривой)), что указывает на повышение степени белизны кожи. Такой результат наблюдался у 90% субъектов (см. фиг. 11 А).
Параметр индивидуального типологического угла (ITA°) значительно увеличился (Р <0,001) после 28 дней ежедневного применения 0,2% средства (в среднем+1 AUC), что указывает на снижение степени пигментации кожи. Такой результат наблюдался у 57% субъектов (см. фиг. 11В).
Для 0,5% средства: параметр L* значительно увеличился (Р <0,001) после 28 дней ежедневного применения, что указывает на повышение степени белизны кожи. Такой результат наблюдался у 86% субъектов (см. фиг. 11А).
Параметр индивидуального типологического угла (ITA°) значительно увеличился (Р <0,001) после 28 дней ежедневного применения 0,5% средства, что указывает на снижение степени пигментации кожи. Такой результат наблюдался у 67% субъектов (см. фиг. 11В).
Эксперимент 8. Данные по экстракту.
Как показано в приведенной ниже таблице, экстракты по настоящему изобретению (образцы 1-3) по своим характеристикам отличаются от экстрактов известного уровня техники.
Образец
1С5о (мкг/мл) для а-глюкозидазы I
Содержание иминосахаров
Цвет
Водораствори мость
12%
Бледно-желтый
Легкорастворимый
19%
Бледно-желтый
Легкорастворимый
29%
Почти белый
Легкорастворимый
240
Желтовато-коричневый
Средняя степень растворимости
180
Желтый
Растворимый
204
Коричневато-зеленый
Средняя степень растворимости
110
12%
Коричневато-зеленый
Растворимый
150
Коричневато-желтый
Средняя степень растворимости
Пояснения к приведенной выше таблице:
Образцы 1-3 относятся к средствам, изготовленным в примерах 1-3. Образец 4 относится к средству, изготовленному по патенту 03139028.5.
Образец 5 был получен способом, описание которого приведено ниже. Измельчали листья шелковицы, и трижды (каждый раз в течение 1-2 ч) экстрагировали 80% этанолом кипячением с обратным холодильником. При первом экстрагировании использовали 6-кратное (в массовом отношении) из расчета на массу сырья количество этанола с последующим применением 4-кратного количества как для второго, так и для третьего экстрагирования. Смешивали экстракты, и отстаивали смесь в течение 24 ч перед фильтрацией. Концентрировали фильтрат, и 5 раз экстрагировали сконденсированный экстракт водой при температуре 70-80°С. Каждый раз использовали 10-кратное из расчета на массу исходного материала (листья шелковицы) количество воды. Доводили рН смешанного экстракта до рН 3-4, и добавляли NaCl до 3-5% концентрации. Жидкость подвергали хроматографированию на колонке (60 см (высота) х3 см (диаметр)), заполненной макропористой смолой D101. Промывали водой до тех пор, пока элюент не становился прозрачным, после чего элюировали 30-50% этанолом в количестве 5 объемов колонки при скорости протекания 20 мл/мин. Собирали элюент, конденсировали, высушивали, и получали образец (5).
Образец 6 был получен способом, описание которого приведено ниже. Измельчали листья шелковицы, и дважды экстрагировали 50-60% этанолом при температуре 50°С, каждый раз используя 10-12-кратное из расчета на массу листьев шелковицы количество этанола. Концентрировали экстракт, пропускали его через колонку, заполненную сильнокислой макропористой смолой D72, и собирали жидкость (фракция 1). Элюировали этанолом для получения фракции 2, после чего элюировали 70% этанолом, содержащим 2% аммония, для получения фракции 3. Центрифугировали и концентрировали фракции 1, 2 и 3 соответственно. Высушивали, смешивали и получали образец 6.
Образец 7 был получен способом, описание которого приведено ниже. Измельчали листья шелковицы и дважды экстрагировали водой (10-15-кратное количество воды) при температуре 80°С. Доводили рН смешанных экстрактов до рН 2-3 и охлаждали до температуры 0°С с полным осаждением. Фильтровали и хроматографировали концентрированный фильтрат на колонке, заполненной катионообменной смолой. Элюировали сначала водой, затем смесью равных количеств 50% этанола и аммиачной воды до тех пор, пока элюент не становился бесцветным. Концентрировали, высушивали элюент, и получали образец (7).
Образец 8 был получен способом, описание которого приведено ниже Измельчали листья шелко
вицы и трижды экстрагировали 30% этанолом (каждый раз 5-кратным количеством из расчета на массу листьев шелковицы) Смешанные экстракты концентрировали, и к конценграгу добавляли этанол для осаждения. Добавляли воду к концентрированному супернатанту, пропускали через колонку, заполненную макропористой смолой D101, и собирали жидкость. Элюировали 3-кратным количеством воды, смешивали жидкость и водный элюент, и получали фракцию 1. Продолжали элюирование колонки 60% этанолом (5-кратное количество), и получали фракцию 2. Доводили рН фракции 1 до 4, и пропускали фракцию через катионообменную колонку. Промывали колонку водой до тех пор, пока элюент не становился бесцветным. Элюировали 0,5н. раствором аммиака (8-кратное количество), собирали элюент, и получали фракцию 3. Концентрировали и высушивали фракции 2 и 3 соответственно, и получали образец (8).
Термины, использованные для обозначения степени растворимости в приведенной выше таблице, определены ниже:
"Легкорастворимый" - 1 г образца растворяется в менее чем 1 мл воды,
"Растворимый" - 1 г образца растворяется в 10-30 мл воды,
"Средняя степень растворимости" - 1 г образца растворяется в 30-100 мл воды.
Представленные выше результаты демонстрируют, что продукт по настоящему изобретению превосходит имеющиеся в настоящее время продукты по активности, содержанию основного действующего вещества, цвету и водорастворимости.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Растительный экстракт для регулирования уровня глюкозы в крови или для применения в качестве лекарственного средства для лечения вызванных пигментацией состояний, полученный из листьев растений рода Morus, у которого значение IC50 для ингибирования а-глюкозидазы I составляет менее чем 90 мкг/мл, содержащий
5-40 мас.% иминосахаров, включая по меньшей один из следующих: 1-дезоксиноиримицин (DNJ), фагомин и №метил^Ш, при определении посредством количественной высокоэффективной жидкостной хроматографии и/или жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии;
20-70 мас.% аминокислот;
причем экстракт имеет бледно-желтый или почти белый цвет и является легкорастворимым в воде, а способ его получения включает следующие стадии:
a) водное или спиртовое экстрагирование листового материала;
b) очистка хроматографией на колонке с использованием сильнокислой катионообменной смолы с промыванием колонки водой и элюированием раствором аммиака и последующим сбором элюента со значением рН от 9,0 до 11,0 и удалением из него аммиака.
2. Растительный экстракт по п.1, отличающийся тем, что значение IC50 для ингибирования а-глюкозидазы I составляет 5-40 мкг/мл.
3. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что общее содержание иминосахаров в нем составляет 8-30 мас.%.
4. Растительный экстракт по п.3, отличающийся тем, что общее содержание иминосахаров в нем составляет 15-20 мас.%.
5. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что к указанным иминосахарам также относятся 1,4-дидезокси-1,4-имино^-арабинитол (DAB), 2-О-а^-галактопиранозил-DNJ (GAL-DNJ) и калистегин В.
6. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что общее содержание аминокислот в нем составляет 30-60 мас.%.
7. Растительный экстракт по п.6, отличающийся тем, что общее содержание аминокислот в нем составляет 40-50 мас.%.
8. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что растение рода Morus выбрано из группы, включающей
a) Morus alba L.
b) Morus alba var. multicaulis L.
c) Morus nigra и
d) Morus australis Poir.
9. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 1-20 мас.% от общей массы экстракта.
10. Растительный экстракт по п.9, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 2-10 мас.% от общей массы экстракта.
11. Растительный экстракт по п.10, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 4-6 мас.% от общей массы экстракта.
12. Растительный экстракт по п.9, отличающийся тем, что содержание DNJ в нем составляет 1-3 мас.% от общей массы экстракта.
10.
13. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что имеет значение рН 5,5-6,5 в 1%-ном водном растворе.
14. Растительный экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что УФ-спектр экстракта демонстрирует максимальное поглощение при 218 и 263 нм.
15. Растительный экстракт по п.1, предназначенный для лечения вызванных пигментацией состояний посредством снижения продуцирования меланина.
16. Растительный экстракт по п.1 или 15 для лечения гиперпигментации, в том числе веснушек, хлоазмы, рубцов беременности и старческих пятен.
17. Способ получения экстракта из листьев растения рода Morus по п.1, который включает стадии:
a) водное или спиртовое экстрагирование листового материала;
b) очистка хроматографией на колонке с использованием сильнокислой катионообменной смолы с промыванием водой и элюированием раствором аммиака, сбором элюента со значением рН от 9,0 до 11,0 и удалением из него аммиака.
18. Способ по п.17, который дополнительно включает стадии:
c) хроматография элюента на колонке с использованием макропористой абсорбционной смолы и сбор раствора и
d) концентрирование и высушивание экстракта.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что
a) листья растений сушат и измельчают в крупный порошок, стадию экстрагирования проводят 5-8-кратным объемом 0-40% низкомолекулярного спирта из расчета на массу листьев растения рода Morus (в массовом отношении) и повторяют ее до 5 раз,
b) колонку промывают водой в количестве 1-2 объемов колонки, смыв выбрасывают, колонку элю-ируют 0,2-1,0н. водным раствором аммиака в количестве 2-8 объемов колонки при скорости элюирова-ния, составляющей 1-3 объема колонки в час,
c) колонку элюируют при объемном соотношении между раствором и колонкой в пределах от 20:1 до 5:1 и
d) высушенный экстракт измельчают до прохождения через сито 80 меш.
20. Косметическое или лекарственное средство, содержащее растительный экстракт по любому из пп.1-14, в сочетании с одним или несколькими отбеливающими кожу компонентами, выбранными из витамина С и его производных, койевой кислоты, арбутина, диацетилболдина, азелаевой кислоты, окта-децендиоевой кислоты, ундециленоилфенилаланина, экстракта солодки, экстракта алоэ, экстракта жерухи лекарственной, экстракта Ascophyllum, экстракта хмеля, глутатиона, экдизона и/или эллагиновой кислоты.
21. Косметическое или лекарственное средство по п.20, отличающееся тем, что указанным производным витамина С является L-аскорбил-2-фосфат магния (VC-PMG).
22. Косметическое или лекарственное средство по п.20 или 21, отличающееся тем, что соотношение между экстрактом и другими отбеливающими кожу компонентами находится в пределах от 10:1 до 1:1.
23. Ингредиент фармацевтического препарата, нутрацевтика, продукта питания или напитка или биологически активная добавка, содержащие растительный экстракт по любому из пп.1-14.
24. Пищевой продукт или напиток, содержащий растительный экстракт по любому из пп.1-14.
Фиг. 11b
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027471
- 1 -
027471
- 1 -
027471
- 1 -
027471
- 1 -
027471
- 1 -
027471
- 1 -
027471
- 4 -
027471
- 19 -
|
