|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ селективного получения алкилового эфира жирной кислоты, включающий обеспечение жидкой среды, содержащей одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, один или более спиртов и нативный пататин, и обеспечение реакции указанной одной или более жирных кислот с указанным одним или более спиртами с получением алкилового эфира жирной кислоты, при этом указанный пататин присутствует в иммобилизованной форме, а спирт представляет собой метанол и/или этанол. 2. Способ селективного получения алкилового эфира жирной кислоты, включающий обеспечение жидкой среды, содержащей одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, один или более спиртов и нативный пататин, и обеспечение реакции указанной одной или более жирных кислот с указанным одним или более спиртами с получением алкилового эфира жирной кислоты, при этом указанный пататин присутствует в растворенной или молекулярно диспергированной форме, а спирт представляет собой по меньшей мере один C 1 -С 3 одноатомный спирт. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что жирная кислота представляет собой С 4 -С 12 жирную кислоту, при этом алкиловый эфир жирной кислоты представляет собой метиловый или этиловый эфир С 4 -С 12 жирной кислоты. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная среда содержит, по существу, только содержащее жирные кислоты исходное сырье, содержащее коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, и метанол или этанол. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная среда не содержит растворитель. 6. Способ получения биодизельного топлива, включающий смешивание пататина с исходным сырьем, содержащим жирные кислоты, и с одним или более спиртами, при этом исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, и обеспечение реакции указанных одной или более жирных кислот с указанными одним или более спиртами, при этом указанный пататин присутствует в иммобилизованной форме, а спирт представляет собой метанол и/или этанол. 7. Способ получения биодизельного топлива, включающий смешивание пататина с исходным сырьем, содержащим жирные кислоты, и с одним или более спиртами, при этом исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, и обеспечение реакции указанных одной или более жирных кислот с указанными одним или более спиртами, при этом указанный пататин присутствует в растворенной или молекулярно диспергированной форме, а спирт представляет собой по меньшей мере один С 1 -С 3 одноатомный спирт. 8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что жирная кислота представляет собой С 4 -С 12 жирную кислоту, при этом алкиловый эфир жирной кислоты представляет собой метиловый или этиловый эфир С 4 -С 12 жирной кислоты. 9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что исходное сырье содержит, по существу, только содержащее жирные кислоты исходное сырье, содержащее коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, и метанол или этанол. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что исходное сырье не содержит растворителя.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ селективного получения алкилового эфира жирной кислоты, включающий обеспечение жидкой среды, содержащей одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, один или более спиртов и нативный пататин, и обеспечение реакции указанной одной или более жирных кислот с указанным одним или более спиртами с получением алкилового эфира жирной кислоты, при этом указанный пататин присутствует в иммобилизованной форме, а спирт представляет собой метанол и/или этанол. 2. Способ селективного получения алкилового эфира жирной кислоты, включающий обеспечение жидкой среды, содержащей одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, один или более спиртов и нативный пататин, и обеспечение реакции указанной одной или более жирных кислот с указанным одним или более спиртами с получением алкилового эфира жирной кислоты, при этом указанный пататин присутствует в растворенной или молекулярно диспергированной форме, а спирт представляет собой по меньшей мере один C 1 -С 3 одноатомный спирт. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что жирная кислота представляет собой С 4 -С 12 жирную кислоту, при этом алкиловый эфир жирной кислоты представляет собой метиловый или этиловый эфир С 4 -С 12 жирной кислоты. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная среда содержит, по существу, только содержащее жирные кислоты исходное сырье, содержащее коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, и метанол или этанол. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная среда не содержит растворитель. 6. Способ получения биодизельного топлива, включающий смешивание пататина с исходным сырьем, содержащим жирные кислоты, и с одним или более спиртами, при этом исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, и обеспечение реакции указанных одной или более жирных кислот с указанными одним или более спиртами, при этом указанный пататин присутствует в иммобилизованной форме, а спирт представляет собой метанол и/или этанол. 7. Способ получения биодизельного топлива, включающий смешивание пататина с исходным сырьем, содержащим жирные кислоты, и с одним или более спиртами, при этом исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит одну или более С 4 -С 26 жирных кислот, и обеспечение реакции указанных одной или более жирных кислот с указанными одним или более спиртами, при этом указанный пататин присутствует в растворенной или молекулярно диспергированной форме, а спирт представляет собой по меньшей мере один С 1 -С 3 одноатомный спирт. 8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что жирная кислота представляет собой С 4 -С 12 жирную кислоту, при этом алкиловый эфир жирной кислоты представляет собой метиловый или этиловый эфир С 4 -С 12 жирной кислоты. 9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что исходное сырье содержит, по существу, только содержащее жирные кислоты исходное сырье, содержащее коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, и метанол или этанол. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что исходное сырье не содержит растворителя.
Евразийское 027459 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201491987
(22) Дата подачи заявки
2013.07.03
(51) Int. Cl.
C12P 7/64 (2006.01) A23C19/04 (2006.01) C11B 3/00 (2006.01) C11C 3/00 (2006.01)
C11C 3/02 (2006.01)
(54) ЛИПАЗА В КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНОЙ ЭТЕРИФИКАЦИИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
(31) 12174894.1
(32) 2012.07.04
(33) EP
(43) 2015.06.30
(86) PCT/NL2013/050489
(87) WO 2014/007622 2014.01.09
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КООПЕРАТИ АВЕБЕ Ю.А. (NL)
(72) Изобретатель:
Спелбринк Робин Эрик Якобус, Джузеппин Марко Луиджи Федерико, Эгмонд Маартен Роберт (NL)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(56) PINSIRODOM P. ET AL.: "Selectivity of celite-immobilized patatin (lipid acyl hydrolase) from potato (Solarium tuberosum L.) tubers in esterification reactions as influenced by water activity and glycerol analogues as alcohol acceptors", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 48, no. 2, 1 February 2000 (2000-02-01), pages 155-160, XP001147929, ISSN: 0021-8561, DOI: 10.1021/ JF990338G, abstract; figures 2-5, page 155, left-hand column, paragraph 1 - right-hand column, last paragraph, page 156, left-hand column, last paragraph - right-hand column, paragraph 1
PRAPHAN PINSIRODOM ET AL.: "Fatty
acid and product selectivities of potato tuber lipid acyl hydrolase in esterification reactions with glycerol in
organic media", JOURNAL OF THE AMERICAN
OIL CHEMISTS' SOCIETY, vol. 76, no. 10, 1 October 1999 (1999-10-01), pages 1119-1125, XP055044701, ISSN: 0003-021X, DOI: 10.1007/s11746-999-0083-6, abstract; table 1
PRAPHAN PINSIRODOM ET AL.:
"Selectivity of potato tuber lipid acyl hydrolase toward long-chain unsaturated FA in esterification reactions with glycerol analogs in organic media",
JOURNAL OF THE AMERICAN OIL CHEMISTS' SOCIETY, vol. 80, no. 4, 1 April 2003 (2003-04-01),
pages 335-340, XP055044641, ISSN: 0003-021X, DOI: 10.1007/s11746-003-0699-8, abstract, page 335, left-hand column, paragraph 2 - right-hand column, paragraph 3; figures 1, 4, 5
ALASDAIR R. MACRAE ET AL.:
"Application of potato lipid acyl hydrolase for the synthesis of monoacylglycerols", JOURNAL OF
THE AMERICAN OIL CHEMISTS' SOCIETY, vol.
75, no. 11, 1 November 1998 (1998-11-01), pages
1489-1494, XP55044737, ISSN: 0003-021X, DOI:
10.1007/s11746-998-0083-y, abstract, page 1493, left-hand column, lines 3-23; table 6 US-B1-6398707
ISO MAMORU ET AL.: "Production of
biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase", JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS. B, ENZYMATIC, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 16, no. 1,
20 November 2001 (2001-11-20), pages 53-58, XP002417337, ISSN: 1381-1177, DOI: 10.1016/
S1381-1177(01)00045-5, abstract
(57) Было обнаружено, что пататин, представляющий собой липазу, получаемую из картофеля, обладает преимуществами в реакции этерификации жирных кислот с получением алкильных эфиров жирных кислот. Описаны способы применения этой липазной активности, а также применение пататина в различных промышленных процессах.
Введение
Хорошо известно, что липазы способны катализировать образование сложных эфиров в органических средах. Таким образом, с помощью липазы карбоновые кислоты можно превращать в сложные эфи-ры в присутствии достаточного количества свободных гидроксизамещенных соединений.
Липазы часто применяют в промышленности. Примеры включают разделение рацемических лекарственных средств, модификацию жиров и липидов, синтез вкусоароматических веществ и производство фармацевтической продукции и нутрицевтиков. Подавляющее большинство липаз, применяемых в настоящее время, получают с помощью грибковых или бактериальных ферментных систем, хотя иногда также применяют и липазы животного происхождения. Липазы растительного происхождения сравнительно редко применяют в промышленности.
Большинство промышленно применимых липаз получают из смесей, образующихся при бактериальной ферментации. Впоследствии липазы необходимо выделить с применением трудоемкой дальнейшей обработки. Это сложный и дорогостоящий процесс, ограничивающий доступность таких липаз. Следовательно, такие липазы обычно имеют низкую чистоту, как общую, так и в отношении белка, а также содержат большое количество углеводов и солей и обладают возможными нежелательными побочными действиями. Кроме того, коммерческие препараты липаз обычно содержат широкий спектр небелковых веществ, солей и ферментов, не являющихся липазами (Bjurlin et al., 2001, JAOCS 78-2, p. 153-160).
Обычно реакции этерификации, для проведения которых требуются жирные кислоты, основаны на применении ферментационных осадков, содержащих большое количество свободных жирных кислот. Это приводит к высокой изменчивости составов смесей, в которых свободные жирные кислоты присутствуют в качестве одного из компонентов наряду со множеством примесей. Фосфолипиды, присутствующие в клеточных мембранах, представляют собой важную составляющую этих примесей. Например, для получения сложного эфира из масла с применением широко используемого фермента липазы - No-vozyme 435 - требуются очищенные от смол масла; присутствие фосфолипидов ингибирует реакцию эте-рификации. Липазам обычно трудно справляться с высоким содержанием примесей, что приводит к неэффективному синтезу сложных эфиров жирных кислот.
Фермент липазу растительного происхождения можно получать из картофеля. Белки картофеля можно разделить на три категории: (i) семейство пататина, высокогомологичные кислые гликопротеины с молекулярной массой 43 кДа (40-50 мас.% картофельных белков), (ii) основные ингибиторы протеазы, 5-25 кДа (30-40 мас.% картофельных белков) и (iii) другие белки, в основном белки с высокой молекулярной массой (10-20 мас.% картофельных белков). Известно, что семейство пататина обладает некоторой липазной активностью и что данные белки можно получить при помощи одностадийного хромато-графического процесса с последующим концентрированием и сушкой. Очень удобный способ выделения, среди прочих, пататина с высокой чистотой описан в заявке WO 2008/069650.
Однако на практике картофельные белки, в том числе картофельную белковую липазу, называемую пататином, в основном применяют в качестве корма для животных из-за отсутствия практического коммерческого применения.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении предложены средства применения пататина для синтеза конкретных сложных эфиров. Таким образом, пататин можно применять для получения сложных эфиров из С4-С26 жирных кислот, предпочтительно С4-С12 жирных кислот и более предпочтительно С6-С10 жирных кислот, наиболее предпочтительно Q-Qo жирных кислот. Сложные эфиры, полученные по способу согласно настоящему изобретению, получают из Q-С спиртов, предпочтительно из одноатомных спиртов, более предпочтительно из этанола или метанола и наиболее предпочтительно из метанола.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: остаточная активность липазы при различных концентрациях метанола.
Фиг. 2: тонкослойная хроматограмма алкильных эфиров жирных кислот (АЭЖК), синтезированных с помощью пататина. Дорожка 1 содержит свободные жирные кислоты (СЖК, в частности, лауриновую кислоту, С12), дорожка 2 содержит метиловый эфир жирной кислоты (МЭЖК) на основе кокосового масла, дорожки с 3 по 7 содержат продукты реакции лауриновой кислоты с метанолом, этанолом, н-пропанолом, изопропанолом и н-бутанолом, соответственно.
Фиг. 3: осаждение жирных кислот в присутствии повышенной концентрации соли. Слева: неосаж-денная октановая кислота в двухфазной системе октановая кислота-деминерализованная вода. Справа: осаждение жирной кислоты, представляющей собой октановую кислоту, в двухфазной системе октановая кислота-насыщенный водный раствор KCl.
Подробное описание изобретения
Для целей настоящего изобретения под пататином понимают фракцию с высокой молекулярной массой (ВММ) нативных картофельных белковых изолятов, высокогомологичное семейство гликопро-теинов, имеющих молекулярную массу 30 кДа или более, предпочтительно 35 кДа или более и более предпочтительно примерно 43 кДа, и изоэлектрическую точку менее 5,8, предпочтительно от 4,8 до 5,5, которая составляет примерно 40-50 мас.% картофельных белков. Пататин представляет собой семейство
гликопротеинов, которые демонстрируют ацилгидролазную активность и составляют до 40 мас.% от общей массы растворимого белка в клубнях картофеля. В заявке WO 2008/069650, содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, подробно описано выделение пататина из картофельного плодового сока (КПС) или картофельной плодовой воды (КПВ).
В этом способе картофельный плодовый сок подвергают флокуляции катионом двухвалентного металла при рН 7-9, и проводят центрифугирование флокулированного картофельного плодового сока с получением таким образом супернатанта. Затем супернатант подвергают адсорбционной хроматографии с расширенным слоем адсорбента, проводимой при рН менее 11 и температуре 5-35°С с использованием адсорбента, способного связывать картофельный белок, с обеспечением таким образом адсорбции на-тивного картофельного белка адсорбентом. Затем по меньшей мере один изолят нативного картофельного белка элюируют из адсорбента элюентом. Этот способ позволяет, в частности, выделить нативный пататин высокой чистоты, содержащий минимум денатурированного белка и характеризуемый стабильной растворимостью.
Картофельный плодовый сок предварительно обрабатывают катионом двухвалентного металла при рН 7-9, предпочтительно 7,0-7,5, с обеспечением флокуляции нежелательных веществ, и далее отделяют хлопья центрифугированием. Особенно подходящим катионом двухвалентного металла является Са2+. Эта предварительная обработка позволяет удалить из картофельного плодового сока нежелательные вещества, такие как отрицательно заряженные полимеры, пектины, гликоалкалоиды и микроорганизмы. В частности, является предпочтительным удаление пектинов и гликоалкалоидов, так как эти соединения присоединяются к картофельным белкам и могут вызвать флокуляцию, что приводит к получению белкового изолята, нестабильного в отношении растворимости и других физических свойств.
На второй стадии способа супернатант подвергают адсорбционной хроматографии с расширенным слоем адсорбента. Предпочтительно поддерживать температуру исходного материала ниже 35°С для лучшей стабильности пататина. Кроме того, предпочтительно использовать умеренно высокую скорость потока, обычно в диапазоне от 600-1200 см/ч. Адсорбционную хроматографию с расширенным слоем адсорбента проводят при рН менее 11, предпочтительно при рН менее 10.
Нативные картофельные белки в предварительно обработанном картофельном плодовом соке выделяют из супернатанта путем связывания их на подходящем адсорбенте в адсорбционной колонке с расширенным слоем адсорбента. Материалы колонки, которые связывают некоторое количество нативных картофельных белков, включают смешанные адсорбенты, такие как Amersham Streamline(tm) Direct CST I (GE Healthcare), адсорбенты Fastline (Upfront Chromatography A/S), макропористые адсорбенты, такие как Amberlite(tm) XAD7HP (компании Rohm &) и ионообменные адсорбенты. Адсорбент с адсорбированными нативными картофельными белками затем элюируют подходящим элюентом для извлечения изолята нативного картофельного белка, такого как пататин. Элюент предпочтительно имеет рН в диапазоне 412, более предпочтительно в диапазоне 5,5-11,0.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения с применением смешанных адсорбентов белки можно фракционировать как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе. Это позволяет разделять, например, фракции пататина и ингибиторов протеазы. Изоляты пататина элюи-руют при рН 5,7-8,7, предпочтительно при рН 5,8-6,5.
Под ацилгидролазной активностью обычно понимают способность фермента (класса ферментов) катализировать гидролиз сложноэфирной связи с помощью молекулы воды с образованием отдельных компонентов: карбоновой кислоты и спирта. Эта реакция может быть обращена путем подходящей адаптации условий реакции, в результате чего происходит этерификация карбоновой кислоты и спирта. Условия реакции, которые могут влиять на направление реакции, включают, например, температуру, идентичность реагента и/или количество воды, присутствующие карбоновую кислоту и спирта.
В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что пататин имеет относительно сильную устойчивость к органической среде. Кроме того, поскольку пататин выделяют из обычного растительного материала, его легко получить в больших количествах, намного легче, чем выделить липазы, получаемые из ферментационной среды и провести трудоемкую последующую обработку.
По этой причине пататин особенно подходит для получения сложных эфиров из С4-С26 жирных кислот, предпочтительно С4-С12 жирных кислот и более предпочтительно С6-С10 жирных кислот, наиболее предпочтительно C8-Q0 жирных кислот. Сложные эфиры получают путем реакции со спиртами, предпочтительно низкомолекулярными спиртами, т.е. Q-С спиртами. Низкомолекулярные спирты могут поставляться в чистом виде или в виде смеси нескольких низкомолекулярных спиртов. Предпочтительно используют одноатомные спирты, еще более предпочтительно этанол или метанол и наиболее предпочтительно метанол.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения получают метиловый и этиловый сложные эфиры С4-С26 жирных кислот, предпочтительно С4-С12 жирных кислот и более предпочтительно С6-С10 жирных кислот, наиболее предпочтительно Q-Qo жирных кислот, с применением C1 или С2 одноатомных спиртов, т.е. метанола или этанола или их смеси.
В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что ацилгидролазная реакционная
способность пататина в соответствии с настоящим изобретением может привести к этерификации жирных кислот с низкомолекулярными спиртами. Следовательно, ацилгидролазную активность пататина можно применять для синтеза сложных эфиров. Таким образом, пататин можно применять в способе для получения алкильных эфиров короцепочечных жирных кислот, даже если эта смесь содержит большое количество примесей.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения, предпочтительно селективно, алкилового эфира жирной кислоты, включающему обеспечение жидкой среды, содержащей одну или более С4-С26 жирных кислот, один или более C1 -С3 спиртов и нативный пататин и обеспечение реакции одной или более жирных кислот с одним или более спиртами с получением алкилового эфира жирной кислоты.
В способе в соответствии с настоящим изобретением жирные кислоты представляют собой С4-С26 жирные кислоты, предпочтительно С4-С12 жирные кислоты, более предпочтительно С6-С10 жирные кислоты, наиболее предпочтительно Q-Qo жирные кислоты.
Один или более Q-С спиртов содержат предпочтительно один или более одноатомных спиртов, среди которых применяют н-пропанол, изопропанол, этанол и/или метанол и более предпочтительно метанол и/или этанол.
В гораздо более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения спирт представляет собой метанол и/или этанол, жирная кислота представляет собой С4-С12 жирную кислоту и алкило-вый эфир жирной кислоты представляет собой метиловый или этиловый эфир С4-С12 жирной кислоты. Цепи жирных кислот классифицируют по длине цепи, от коротких до очень длинных: короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) представляют собой жирные кислоты с цепями короче чем С6;
среднецепочечные жирные кислоты (СЦЖК) представляют собой С6-С12 жирные кислоты; длинноцепочечные жирные кислоты(ЖЦЖК) представляют собой С13-С21 жирные кислоты; жирные кислоты с очень длинной цепью (ЖКОДЦ) представляют собой жирные кислоты с цепями длиннее, чем С22.
Как правило, липазы чувствительны к примесям, присутствующим в этерификационной смеси. С другой стороны, пататин значительно менее чувствителен к примесям, в частности к фосфолипидам. Таким образом, преимуществом способа согласно настоящему изобретению является то, что исходное сырье, содержащее жирные кислоты, может содержать более высокое количество примесей, в частности фосфолипидов, чем в случае применения других липаз.
В других ферментативных реакциях этерификации присутствие фосфолипидов часто ингибирует реакцию этерификации. По этой причине фосфолипиды необходимо удалять из исходного сырья, содержащего жирные кислоты. Это приводит к удорожанию сырья, а, следовательно, и к удорожанию продукта. Таким образом, сложноэфирные продукты с применением пататина можно получать значительно дешевле по сравнению с другими способами этерификации на основе липаз.
Жирные кислоты в способе согласно настоящему изобретению можно обеспечить в виде исходного сырья, содержащего жирные кислоты. Такое исходное сырье представляет собой твердую или жидкую среду, содержащую, помимо прочего, жирные кислоты для применения в настоящем изобретении. Предпочтительно, исходное сырье представляет собой жидкую среду. Жидкая среда может содержать растворитель, но также возможно осуществить способ согласно изобретению без применения растворителя, например в условиях, когда среда находится в расплавленном состоянии.
Исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит по меньшей мере одну из С4-С26 жирных кислот или любую смесь С4-С26 жирных кислот для получения сложных эфиров С4-С26 жирных кислот. В частности, исходное сырье для реакции со спиртом в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере одну коротко- или среднецепочечную жирную кислоту или любую их смесь, т.е. С4-С12 жирные кислоты. Более предпочтительно исходное сырье содержит по меньшей мере одну С6-С10 жирную кислоту или любую смесь С6-С10 жирных кислот, наиболее предпочтительно Q-Qo жирные кислоты. Это приводит к получению сложных эфиров С4-С12 жирных кислот, предпочтительно С6-С10 жирных кислот, наиболее предпочтительно Q-Qo жирных кислот.
Жирные кислоты в исходном сырье могут быть представлены в любой форме, такой как связанные с глицерином в виде моно-, ди- и/или триглицеридов, но исходное сырье также может содержать фосфо-липиды или частично гидролизованные фосфолипиды. Кроме того, жирные кислоты могут присутствовать в исходном сырье в виде свободных жирных кислот. Кроме того, может присутствовать смесь любых или всех этих компонентов, а также другие компоненты, не связанные с жирными кислотами. Однако предпочтительно жирные кислоты присутствуют в исходном сырье, по крайней мере, в значительном количестве, в качестве свободных жирных кислот. Значительное количество в контексте настоящего изобретения представляет собой 6 г/л, предпочтительно выше 90 г/л.
Преимуществом способа согласно настоящему изобретению является то, что свободные жирные кислоты могут присутствовать в относительно больших количествах. Наиболее предпочтительно количество свободных жирных кислот, выраженное в процентах от общего количества жирных кислот, присутствующих в исходном сырье, содержащем жирные кислоты, составляет по меньшей мере 25 мас.%,
предпочтительно более чем 40 мас.% в расчете на массу исходного сырья.
Примерами подходящего исходного сырья, содержащего жирные кислоты, являются животные жиры или масла, растительные масла, среди которых гидролизованные и/или окисленные растительные масла, такие как, например, масло для жарки, испорченный жир сливочного масла и талловый жир низкого качества.
Однако в альтернативном варианте реализации настоящего изобретения исходное сырье, содержащее жирные кислоты, представляет собой ферментационный осадок. Поскольку применение пататина в соответствии с настоящим способом увеличивает толерантность к примесям, исходное сырье ферментационного осадка хорошо подходит для этерификации жирных кислот, которые он содержит, спиртами. Явным преимуществом настоящего изобретения является то, что примеси, среди которых, что важно, присутствуют фосфолипиды, могут присутствовать в реакционной среде в больших количествах, не препятствуя реакции этерификации.
Спирты для применения согласно настоящему изобретению представляют собой по меньшей мере один Q-С спирт, предпочтительно одноатомный спирт и более предпочтительно метанол и/или этанол. Сложные эфиры этих спиртов с короткоцепочечными жирными кислотами обычно обладают весьма сильным запахом, в то время как сложные эфиры со средне- или длинноцепочечными жирными кислотами могут выгодно функционировать в качестве биодизельного топлива. Предпочтительно Q-С одноатомные спирты представляют собой концевые спирты, например метанол, этанол и 1-пропанол. Однако более предпочтительно спирт представляет собой С1-С2 спирт, например метанол или этанол. Однако наиболее предпочтительным является применение метанола в качестве акцептора жирных кислот. Спирты с более короткой цепью являются предпочтительными из-за их более высокой реакционной способности по отношению к жирным кислотам в присутствии пататина.
В способе в соответствии с настоящим изобретением пататин может в иммобилизованном виде присутствовать на носителе, но предпочтительно его используют без носителя. Носители для иммобилизации липаз хорошо известны в данной области техники. В качестве примера можно привести целит. Таким образом, он может присутствовать в растворенной или молекулярно диспергированной форме, в зависимости от природы реакционной среды. Предпочтительно пататин свободно взвешен в реакционной среде.
Недостатком липаз является то, что они обычно требуют большого количества солей, такого как до 50% солей калия, для стабилизации их в свободном растворе.
Соли, однако, служат препятствием по отношению к реакции этерификации жирных кислот, так как она вызывает кристаллизацию. По этой причине в известном уровне техники липазы обычно применяют на носителе в иммобилизованной форме. Пататин не требует стабилизации солью, когда его применяют без носителя, т.е. в свободно взвешенном состоянии в среде, и по этой причине он особенно подходит для этерификации жирных кислот с низкомолекулярными спиртами в соответствии с настоящим изобретением.
Как уже упоминалось, реакционная среда, в которой выполняют способ согласно изобретению, предпочтительно жидкая и содержит, по меньшей мере, исходное сырье, содержащее жирные кислоты, и один или более спиртов согласно изобретению. Кроме того, среда может содержать растворитель, такой как вода и/или органическое соединение, такое как растворитель, например алифатическое соединение, простой эфир, сложный эфир или ароматическое соединение.
Преимуществом применения пататина является то, что в реакции этерификации может присутствовать значительное количество воды. Таким образом, изобретение может работать при содержании воды в реакционной среде до 91 об.% в расчете на объем реакционной среды. Однако предпочтительно содержание воды составляет менее чем 73 об.%, еще более предпочтительно менее чем 40 об.%, более предпочтительно менее 19 об.% в расчете на объем реакционной среды. В случае, если содержание воды в реакционной среде превышает 50 об.% в расчете на объем реакционной среды, ее называют водной.
Однако способ согласно изобретению также можно выполнять, по существу, в органической среде, при содержании воды менее 50 об.% в расчете на объем реакционной среды. В этом случае, содержание воды в реакционном сосуде может достигать 5 об.% или достигать 2 об.% в расчете на объем реакционной среды. Предпочтительно, чтобы присутствовало, по меньшей мере, некоторое количество воды, например, по меньшей мере 2 об.% в расчете на объем реакционной среды, даже если способ применяют, по существу, в органической среде.
В случае если среда представляет собой, по существу, органическую среду, исходное сырье, содержащее жирные кислоты, разбавляют, по крайней мере, спиртом согласно настоящему изобретению, который может функционировать в качестве растворителя, а также в качестве реагента в этом варианте реализации настоящего изобретения. Кроме того, можно применять другой растворитель, который можно соответствующим образом выбрать для достижения финального растворения всех компонентов реакции. Подходящие примеры включают октан, изооктан, пентан, гексан, гептан, петролейный эфир и бута-нол. Предпочтительные растворители представляют собой октан и изооктан. Следует иметь в виду, что также можно применять комбинацию растворителей, в том числе комбинацию с одним или более растворителями и спиртом, действующим в качестве растворителя.
Концентрация жирных кислот в реакционной среде предпочтительно составляет от 12 до 84 мас.% в расчете на массу реакционной среды. Предпочтительно эти жирные кислоты присутствуют в виде свободных жирных кислот.
Концентрация спирта в реакционной среде предпочтительно в небольшом мольном избытке по отношению к свободным жирным кислотам. В расплавленной среде свободная жирная кислота предпочтительно присутствует в концентрации выше 80 мас.%, более предпочтительно выше 84 мас.% в расчете на массу реакционной среды. В органическом растворителе свободная жирная кислота присутствует в концентрации выше 10 мас.%, более предпочтительно 12 мас.% в расчете на массу реакционной среды.
Как правило, пататин присутствует в концентрации 1 мас.%, более предпочтительно 10 мас.% в расчете на количество жирной кислоты.
Таким образом, изобретение также раскрывает способ получения, предпочтительно избирательного, алкилового эфира жирной кислоты, включающий смешение в любом порядке нативного пататина с жирными кислотами, одним или более спиртами и необязательными другими компонентами, при этом смесь содержит значительное количество фосфолипидов, и проведение этерификации, при этом жирные кислоты предпочтительно представляют собой коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, спирты представляют собой Q-С одноатомные спирты, предпочтительно метанол и/или этанол, а алкильный сложный эфир жирной кислоты представляет собой Q-С сложный эфир С4-С12 жирной кислоты, предпочтительно метиловый или этиловый эфир. Если пататин применяют без иммобилизации на носителе, что является предпочтительным, смешивание предпочтительно проводят таким образом, что пататин будет свободно взвешен в реакционной среде. В альтернативном варианте реализации настоящего изобретения спирт можно предпочтительно добавлять в аликвоты с различными интервалами или непрерывно в течение всей реакции для того, чтобы контролировать скорость реакции и избежать денатурации фермента. Конечно, для достижения хорошего выхода реакции общее количество спирта должны быть достаточными для достижения желаемого превращения.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения способ согласно изобретению применяют в отсутствие дополнительного растворителя. В этом случае реакционная смесь содержит исходное сырье, содержащее жирные кислоты, которое содержит коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, и спирт, предпочтительно метанол или этанол. В соответствии с этим вариантом реализации настоящего изобретения способ предпочтительно осуществляют в условиях, когда среда является расплавленной.
Условия реакции могут быть оптимизированы специалистом в данной области техники на основании его общих знаний. Например, температура реакции не является критической, пока она не влияет на стабильность и активность пататина. Предпочтительно реакцию проводят в условиях окружающей среды или при температуре выше точки плавления исходного сырья, содержащего жирные кислоты. Подходящие температуры реакции обычно находятся в диапазоне от 10 до 75°С, предпочтительно от 15 до 60°С, более предпочтительно от 20 до 45°С.
Предпочтительно полученные алкильные эфиры жирных кислот выделяют из реакционной смеси и необязательно дополнительно очищают, например, путем перегонки, жидкость-жидкостной экстракции или сверхкритической СО2-экстракции.
Способ согласно настоящему изобретению можно удобно применять для получения биодизельного топлива. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает способ получения биодизельного топлива, включающий смешивание пататина с исходным сырьем, содержащим жирные кислоты, и с одним или более Q-С спиртами, где исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит одну или более С4-С26 жирных кислот, и проведение реакции одной или более жирных кислот с одним или более спиртом. В этом способе предпочтительно пататин свободно взвешен в исходном сырье.
Особенно выгодно применять в этом способе пататин, поскольку пататин легко доступен из обычных растений, и может быть выделен в больших количествах. Кроме того, с пататином можно производить биодизельное топливо из исходного сырья, содержащего относительно большие количества примесей, таких как фосфолипиды. И, наконец, присутствие соли повышает температуру плавления жирных кислот, подлежащих преобразованию в биодизельное топливо. Поскольку, в отличие от других липаз, свободно суспендированному пататину не требуется солевая стабилизация, при использовании пататина можно избежать негативного эффекта, обусловленного присутствием соли, при производстве биодизельного топлива. В результате получают алкильные эфиры жирных кислот в соответствии с настоящим изобретением, которые можно применять в качестве биодизельного топлива.
Ниже изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Активность липазы в органическом растворителе.
Множество липолитических процессов проводят в органических растворителях или в водных смесях таких растворителей. Ярким примером является производство биодизельного топлива из триглице-ридов или свободных жирных кислот. В этих случаях НММ спирты применяют в качестве ацильных акцепторов для получения алкильных эфиров жирных кислот (АЭЖК). Спирты представляют собой и реагент, и растворитель. Метанол представляет собой предпочтительный спирт из-за цены и качества полу
чаемого биодизельного топлива.
Такой подход может допускать наличие воды в реакционной смеси, но требует ферментов, которые выдерживают высокие концентрации спирта, чтобы обеспечить движущую силу для протекания реакции.
Пататин (Solanic 206P) приводили в контакт с 1 мМ хромогенного паранитрофенил бутирата в 10 мМ буфере, рН 6,5, при различных концентрациях метанола. Активности пататина в этих системах определяли с помощью измерения увеличения поглощающей способности при 405 нм на планшет-ридере BioRad Model 680 и выражали в mOD/мин. Результаты показывают, что пататин без потери активности толерантен к содержанию метанола до 20% метанола, а также то, что может присутствовать более 40% метанола, прежде чем теряется вся активность.
Пример 2. Синтез алкильных эфиров жирных кислот с пататином в расплавленном субстрате.
10 мг пататина (Solanic 206P) в 100 мкл деминерализованной воды приводили в контакт с 5 ммоль (1,0 г) лауриновой кислоты (Merck 8.05333) и эквимолярным количеством метанола (Merck 1,06007), этанола (Prolabo 83804.360), н-пропанола (Alfa Aesar A19902), изопропанола (Prolabo 437423R) или н-бутанола (Merck 1.01990). Добавляли деминерализованную воду с получением 20% (об./об.) спиртового раствора в воде. Смеси инкубировали в течение ночи при 45°С при интенсивном перемешивании.
Сравнительный метиловый эфир жирной кислоты (МЭЖК) получали с помощью растворения 1 г кокосового жира (SigmaAldrich С1758) в 100 мл метанола, содержащем 1,85% концентрированной соляной кислоты (Merck 1.00317), смесь нагревали с обратным холодильником в течение 4 часов. Продукт реакции выпаривали с получением прозрачного желтого масла.
Продукты реакции анализировали с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах силика-геля (Uniplate Z26529-2), которые были предварительно обработаны 2,4% борной кислотой (Fluka 15663) в 50% водным этаноле.
Все образцы разводили в 20 раз в элюентах ТСХ, состоящих из н-гексана (Merck 1.04367), эфира (Merck 1.00921) и уксусной кислоты (Prolabo 20104.334) в соотношении 80:20:2, и один капиллярный объем наносили на пластину. Пластину погружали в элюент и сушили на воздухе. Пластину опрыскивали концентрированной серной кислотой (Merck 1.00371). В результате такой обработки лауриновая кислота и ее эфиры выглядели как белые пятна на синем фоне (фиг. 10).
Проявленные пластины ТСХ показывает свободную лауриновую кислоту на дорожке 1 примерно на середине высоты и МЭЖК, находящиеся близко к верху на дорожке 2.
Лауриновая кислота, инкубированная с пататином и спиртами, показывает остаточные количества свободных жирных кислот на полпути со дна и алкильных эфиров жирных кислот сверху, в верхней части пластины. Пататин катализирует образование АЭЖК из свободных жирных кислот и небольших спиртов, при этом наибольшая степень превращения происходит в случае метанола, этанола и н-пропанола, в указанном порядке.
Пример 3. Синтез алкильных эфиров жирных кислот с пататином в органическом растворителе.
Октановую кислоту (Merck 8.00192.1000) и 20% метанол (Merck liChrosolv 1.06007.1000) смешивали в изооктане (SigmaAldrich 360597) таким образом, что октановая кислота и метанол находились в примерно эквимолярных количествах (11,0 мл октановой кислоты и 16,8 мл 20% метанола в изооктане). Добавляли 500 мг пататина (Solanic 206P) и 40 мг воды. Пустой образец подготовливали таким же образом, но без пататина. Реакцию проводили в закрытых пробирках, которые нагревали на водяной бане с закрытой крышкой. Растворы инкубировали в течение четырех часов при температуре 50°С. Аликвоты брали из реакционных сосудов и разводили в 10 раз в чистом ацетонитриле (Merck LiChrosolv 1.00030.25007) и анализировали с помощью ВЭЖХ. ВЭЖХ оборудовали колонкой с силикагелем с обращенной фазой (С18-сефароза), УФ-детектором, работающим на 202 нм (Knauer Smartline UV Detector 2600) и градиентным смесителем (Smartline Manager 5000 eluent mixer). Градиент ацетонитрила применяли для экспериментов ВЭЖХ.
Элюенты 50% ацетонитрила готовили с помощью смешивания с водой MilliQ и 0,5 мкм фильтрации. Колонку предварительно обрабатывали элюентами. Образцы инъецировали непосредственно в аце-тонитрил и элюировали градиентом ацетонитрила от 50 до 100% на протяжении 20 мин. Количественное определение метилового эфира жирной кислоты проводили по калибровочной кривой, полученной при помощи чистого метилового октаноата (SigmaAldrich 260673-23G).
Образец пататина показал 12% конверсию октановой кислоты в соответствующий метиловый эфир, что указывало на успешную этерификацию.
Пример 4. Фосфолипазная активность пататина.
Фосфолипиды с ациловыми цепями различной длины диспергировали в водных растворах, содержащих 0,5% гуммиарабика и 100 мм Triton X100 с помощью обработки ультразвуком в течение 30 мин. Пататин добавляли в количестве до 100 мг и потребление гидроксида натрия контролировали с помощью установки рН-стат, работающей при рН 7,5.
Диацилглицерофосфохолины с длиной цепи до 9 восприимчивы к гидролизу пататином.
Активность пататина по отношению к различным субстратам в ммоль/мин/г пататина при комнатной температуре Длина 1,2-диацил-кп-3-цепи ппицерофосфохолин
6 оЗ
7 5,6
8 20,7
9 40,7
10 0,6
Этот эксперимент показал, что пататин способен гидролизовать фосфолипиды, и ожидается, что по этой причине он не будет деактивирован в присутствии фосфолипидов в среде этерификации. Пример 5. Влияние соли на свободные жирные кислоты.
1 мл аликвоты октановой кислоты (Merck 8.00192.1000) смешивали с деминерализованной водой или с насыщенным раствором хлорида калия (SigmaAldrich P9311) и кратковременно нагревали до 50°С. При охлаждении смесь раствора октановой кислоты-соли демонстрировала мутность в органической фазе и мыльный осадок на границе раздела, в то время как смесь октановая кислота - вода осталась прозрачной и не содержала мыла. Мутность указывает на частичное осаждение. Результаты показывали, что присутствие соли делает операции со свободными жирными кислотами более затруднительными.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ селективного получения алкилового эфира жирной кислоты, включающий обеспечение жидкой среды, содержащей одну или более С4-С26 жирных кислот, один или более спиртов и нативный пататин, и обеспечение реакции указанной одной или более жирных кислот с указанным одним или более спиртами с получением алкилового эфира жирной кислоты, при этом указанный пататин присутствует в иммобилизованной форме, а спирт представляет собой метанол и/или этанол.
2. Способ селективного получения алкилового эфира жирной кислоты, включающий обеспечение жидкой среды, содержащей одну или более С4-С26 жирных кислот, один или более спиртов и нативный пататин, и обеспечение реакции указанной одной или более жирных кислот с указанным одним или более спиртами с получением алкилового эфира жирной кислоты, при этом указанный пататин присутствует в растворенной или молекулярно диспергированной форме, а спирт представляет собой по меньшей мере один C1 -С3 одноатомный спирт.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что жирная кислота представляет собой С4-С12 жирную кислоту, при этом алкиловый эфир жирной кислоты представляет собой метиловый или этиловый эфир С4-С12 жирной кислоты.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная среда содержит, по существу, только содержащее жирные кислоты исходное сырье, содержащее коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, и метанол или этанол.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная среда не содержит растворитель.
6. Способ получения биодизельного топлива, включающий смешивание пататина с исходным сырьем, содержащим жирные кислоты, и с одним или более спиртами, при этом исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит одну или более С4-С26 жирных кислот, и обеспечение реакции указанных одной или более жирных кислот с указанными одним или более спиртами, при этом указанный пататин присутствует в иммобилизованной форме, а спирт представляет собой метанол и/или этанол.
7. Способ получения биодизельного топлива, включающий смешивание пататина с исходным сырьем, содержащим жирные кислоты, и с одним или более спиртами, при этом исходное сырье, содержащее жирные кислоты, содержит одну или более С4-С26 жирных кислот, и обеспечение реакции указанных одной или более жирных кислот с указанными одним или более спиртами, при этом указанный пататин присутствует в растворенной или молекулярно диспергированной форме, а спирт представляет собой по меньшей мере один С1 -С3 одноатомный спирт.
8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что жирная кислота представляет собой С4-С12 жирную кислоту, при этом алкиловый эфир жирной кислоты представляет собой метиловый или этиловый эфир С4-С12 жирной кислоты.
9. Способ по любому из пп.6-8, отличающийся тем, что исходное сырье содержит, по существу, только содержащее жирные кислоты исходное сырье, содержащее коротко- или среднецепочечные жирные кислоты, и метанол или этанол.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что исходное сырье не содержит растворителя.
Демин, воли IIасыщ. рлствор КС1
Фиг. 3
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027459
- 1 -
(19)
027459
- 1 -
(19)
027459
- 1 -
(19)
027459
- 4 -
(19)
027459
- 8 -
|
