|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении, причем указанный антимикробный агент включает полипептид, включающий Blad последовательность SEQ ID NO: 4, или его активный вариант, который имеет антимикробную активность и который включает последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична или SEQ ID NO: 4, или фрагменту SEQ ID NO: 4, длина которого составляет по меньшей мере 60 аминокислот. 2. Применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, причем антимикробный агент определен в п.1. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат наносятся на нуждающееся в этом растение. 4. Применение по п.3, в котором указанный антимикробный агент и указанный хелатирующий агент наносятся: a) на указанное растение в составе одной композиции или b) на одну и ту же часть растения по отдельности, в частности каждый последовательно или одновременно. 5. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА. 6. Применение по любому из пп.1-5, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения. 7. Применение по п.6, в котором бактерия является патогенным видом одного из следующих родов: Pseudomonas, Erwinia и Streptomyces. 8. Способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, раскрытых в п.1. 9. Способ по п.8, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения. 10. Способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом, где антимикробный препарат определен в п.1.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении, причем указанный антимикробный агент включает полипептид, включающий Blad последовательность SEQ ID NO: 4, или его активный вариант, который имеет антимикробную активность и который включает последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична или SEQ ID NO: 4, или фрагменту SEQ ID NO: 4, длина которого составляет по меньшей мере 60 аминокислот. 2. Применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, причем антимикробный агент определен в п.1. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат наносятся на нуждающееся в этом растение. 4. Применение по п.3, в котором указанный антимикробный агент и указанный хелатирующий агент наносятся: a) на указанное растение в составе одной композиции или b) на одну и ту же часть растения по отдельности, в частности каждый последовательно или одновременно. 5. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА. 6. Применение по любому из пп.1-5, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения. 7. Применение по п.6, в котором бактерия является патогенным видом одного из следующих родов: Pseudomonas, Erwinia и Streptomyces. 8. Способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, раскрытых в п.1. 9. Способ по п.8, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения. 10. Способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом, где антимикробный препарат определен в п.1.
(19)
Евразийское
патентное
ведомство
027441 (13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации
и выдачи патента: 2017.07.31
(21) Номер заявки:
(22) Дата подачи:
(51) Int. Cl.
A01N37/44 (2006.01) A01N37/46 (2006.01) A01N 65/20 (2009.01) A01P1/00 (2006.01) A01P3/00 (2006.01)
(54) ПРИМЕНЕНИЕ ХЕЛАТИРУЮЩЕГО АГЕНТА И АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
(31) 105332; 1017282.3
(32) 2010.10.12; 2010.10.13
(33) PT; GB
(43) 2013.08.30
(86) PCT/EP2011/067828
(87) WO 2012/049217 2012.04.19
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КОНСУМУ ЭМ ВЕРДИ -БИОТЕКНОЛОЖИЯ ДАШ ПЛАНТАШ, С.А. (PT)
(72) Изобретатель:
Каррейра Алезандра Мануэла Лоуренку, Валадаш Да Силва Монтейру Сара Алезандра, Ди Сейшаш Боавида Феррейра Рикардо Мануэль (PT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) John M. Wells ET AL.: "In vitro Inhibition of Soft-Rotting
Bacteria by EDTA and Nisin and in vivo Response on Inoculated Fresh Cut Carrots", Plant Disease, 1 January 1998 (1998-01-01), pages 491-495, XP55014413, Retrieved from the Internet: URL:http://apsjournals.apsnet.org/doi/pdf/10.1094/PDIS.1998.82. 5.491 [retrieved on 2011-12-09], page 492, column 3, line 67-page 493, column 2, line 35, tab. 1
FERREIRA ET AL.: "The structure of Lupinus seed storage proteins. Recent developments", CURRENT TOPICS IN PLANT BIOLOGY, TRIVANDRUM: RESEARCH TRENDS, INDIA, vol. 4, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 139-150, XP009147433, ISSN: 0972-4575, abstract, page 147, column 1, line 18-column 2, line 10
WO-A2-2007010459
MONTEIRO ET AL.: "Chapter 29: Testing Blad, a potent antifungal protein", 30 November 2007 (2007-11-30), PLANT
PATHOLOGY CONCEPTS AND LABORATORY EXERCISES. 2ND EDITION, CRC PRESS, BOCA RATON, TAYLOR & FRANICS, PAGE(S) 323-328, XP009154758, procedures 29.1, 29.2, 29.3
Willy J. Peumans ET AL.: "Lectins as Plant Defense Proteins", Plant Physiology, 1 January 1995 (1995-01-01), pages 347-352, XP55014530, Retrieved from the Internet: URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC157596/pdf/ 1090347.pdf [retrieved on 2011-12-12], the whole document
M.D.L. OLIVEIRA ET AL.: "Purification of a lectin from Eugenia uniflora L. seeds and its potential antibacterial activity", LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 46, no. 3, 1 March 2008 (2008-03-01), pages 371-376, XP55014526, ISSN: 0266-8254, DOI: 10.1111/j.1472-765X.2007.02319.x, tab. 2
Arun K. Chatterjee ET AL.: "Unusual Susceptibility of Erwinia amylovora to Antibacterial Agents in Relation to the Barrier Function of its Cell Envelope", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, 1 May 1977 (1977-05-01), pages 897-905, XP55014414, Retrieved from the Internet: URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC352093/pdf/ aac00299-0135.pdf [retrieved on 2011-12-09], page 897, column 1, line 14-19
HAQUE H. ET AL.: "CELL ENVELOPES OF GRAM NEGATIVE BACTERIA: COMPOSITION, RESPONSE TO CHELATING AGENTS AND SUSCEPTIBILITY OF WHOLE CELLS TO ANTIBACTERIAL AGENTS", JOURNAL OF APPLIED BACTERIOLOGY, BLACKWELL PUBLISHING LTD., OXFORD, GB, vol. 40, no. 1, 1 January 1976 (1976-0101), pages 89-99, XP009048176, ISSN: 0021-8847, page 89, line 1-6
US-A1-2004138176
R.J.W. LAMBERT ET AL.: "The synergistic effect of EDTA/antimicrobial combinations on Pseudomonas aeruginosa", JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 96, no. 2, 1 February 2004 (2004-02-01), pages 44-253, XP55014452, ISSN: 1364-5072, DOI: 10.1046/j.1365-2672.2004.02135.x, page 244, column 1, line 1-column 2, line 16, tab. 3, 4
WO-A1-9311783
(57) Авторами изобретения предложены применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении; применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма; способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма; и способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом. Также предложены композиция, содержащая хелатирующий агент и антимикробный агент, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма; применение указанной композиции для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении и способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение указанной композиции. Дополнительно предложены применение композиции, содержащей антимикробный полипептид, включающий Blad или его активный вариант, для уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении и способ уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении, указанный способ включает нанесение на указанное растение композиции, содержащей эффективное количество антимикробного полипептида, включающего в себя Blad или его активный вариант.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области антимикробных агентов, которые воздействуют на патогены растений. Введение.
Борьба с патогенами растений и защита сельскохозяйственных культур являются серьезными общемировыми проблемами, которые вызывают все большую обеспокоенность по мере роста мировой численности населения и связанной с этим нехваткой продовольствия. Кроме того, современные методы ведения сельского хозяйства в части сбора и хранения урожая, как правило, обеспечивают хорошие условия для роста патогенов.
Использование химических пестицидов является стандартным подходом в борьбе с вредителями сельского хозяйства. Однако многие используемые в настоящее время пестициды имеют некоторые существенные недостатки. Например, многие из них оказывают отрицательное влияние на окружающую среду, а многие имеют низкую или снижающуюся эффективность. Особую озабоченность вызывают низкая активность и/или узкий спектр действия некоторых химических соединений, вместе с развитием устойчивости у патогенов.
Одна из целей настоящего изобретения состоит в попытке решения этих проблем и, в частности, например, в разработке средств улучшения активности антимикробных агентов, которые являются эффективными против патогенных для растений микроорганизмов.
Сущность изобретения
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что хелатирующий агент может синергетически усиливать эффективность антимикробных агентов, которые являются эффективными против патогенных для растений микроорганизмов.
Таким образом, авторами настоящего изобретения предложено:
(i) применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении;
(ii) применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат наносятся на нуждающееся в этом растение, при этом предпочтительно указанный антимикробный агент и указанный хелатирующий агент наносятся на указанное растение:
a) в составе одной композиции или
b) по отдельности или последовательно или одновременно.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антимикробный агент является эффективным против патогенных для растений бактерии или грибка. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антимикробный агент включает в себя полипептид, при этом предпочтительно указанный полипептид включает Blad или его активный вариант. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА.
Авторами настоящего изобретения также предложены
способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма;
способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом.
Кроме того, авторами настоящего изобретения предложена композиция, содержащая хелатирую-щий агент и антимикробный агент, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма. Предпочтительно антимикробный агент является эффективным против патогенных для растений бактерии или грибка, предпочтительно грибка. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антимикробный агент включает в себя полипептид, при этом предпочтительно указанный полипептид включает Blad или его активный вариант. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА.
Авторами настоящего изобретения дополнительно предложены применение композиции настоящего изобретения для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении и способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение композиции настоящего изобретения.
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что полипептид Blad из Lupinus обладает мощным антимикробным действием в отношении большого числа разнообразных бактериальных организмов, которые являются патогенными для растений.
Таким образом, авторами настоящего изобретения предложено применение композиции, содержащей антимикробный полипептид, включающий Blad или его активный вариант, для уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении. Предпочтительно указанная компози
ция дополнительно содержит хелатирующий агент. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная бактерия является патогенным видом одного из следующих родов: Pseudomonas, Er-winia и Streptomyces. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция наносится на нуждающееся в этом растение.
Авторами настоящего изобретения также предложен способ уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении, указанный способ включает нанесение на указанное растение композиции, содержащей эффективное количество антимикробного полипептида, включающего Blad или его активный вариант.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана кодирующая последовательность предшественника р-конглютина Lupinus albus (SEQ ID NO: 1);
на фиг. 2 показан внутренний фрагмент кодирующей последовательности предшественника Р-конглютина, соответствующий Blad (SEQ ID NO: 3).
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что при использовании сочетания хелати-рующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, указанное сочетание особенно эффективно для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма. Таким образом, в одном аспекте авторами настоящего изобретения предложена композиция, содержащая или в основном состоящая из хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма. Композиция, содержащая хелатирующий агент и антимикробный агент, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, может также представлять собой препарат, содержащий другое химическое соединение(я), добавленное в эту композицию специалистом в данной области техники.
Антимикробные агенты.
Антимикробным агентом является любой агент, который уменьшает рост или уничтожает микроорганизм, являющийся патогенным для растения. Указанный микроорганизм предпочтительно является бактерией (грамположительной и грамотрицательной) или грибком, предпочтительно грибком (который может быть дрожжевым или плесневым грибком). Предпочтительно антимикробный агент содержит (или в основном состоит из) полипептид, такой как антигрибковый белок. Подходящие примеры антигрибковых белков включают хитиназы, хитинсвязывающие белки, хитозаназы, р-1,3-глюканазы и р-N-ацетил^-глюкозаминидазы. Конкретные примеры микроорганизмов, на которые может воздействовать антимикробный агент, приведены ниже.
Полипептитд Blad.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, в которых антимикробный агент содержит (или в основном состоит из) полипептид, указанный полипептид включает (или в основном состоит из) Blad или его активный вариант.
Blad ("banda de Lupinus albus doce" - полоса из сладкого L. albus) - это название, данное стабильному промежуточному продукту распада р-конглютина, основного запасного белка, содержащегося в семенах растений рода Lupinus. Он представляет собой полипептид с массой 20 кДа, состоящий из 173 аминокислотных остатков, который кодируется внутренним фрагментом (519 нуклеотидов, зарегистрирован в GenBank под номером доступа АВВ13526) гена, кодирующего предшественник р-конглютина из Lupinus (1791 нуклеотидов, зарегистрирован в GenBank под номером доступа AAS97865). Когда прайме-ры, кодирующие концевые последовательности Blad, были использованы для амплификации последовательности из геномной ДНК Lupinus, был получен продукт размером ~620 п.н., что указывает на наличие интрона в фрагменте, кодирующем Blad. Существующий в природе Blad является основным компонентом гликоолигомера массой 210 кДа, который накапливается (после интенсивного ограниченного проте-олиза р-конглютина) исключительно в семядолях растений из рода Lupinus между 4 и 12 днями после начала прорастания. В то время как указанный олигомер является гликозилированным, существующий в природе Blad является негликозилированным. Содержащий Blad гликоолигомер состоит из нескольких полипептидов, основные из которых имеют молекулярную массу 14, 17, 20, 32, 36, 48 и 50 кДа. Полипептид массой 20 кДа Blad несомненно является наиболее распространенным полипептидом этого олигоме-ра, и по всей видимости только он один обладает лектиновой активностью. Существующий в природе Blad содержит приблизительно 80% от всех семядольных белков у 8-дневных проростков.
Кодирующая последовательность предшественника р-конглютина L. albus (SEQ ID NO: 1) приведена на фиг. 1. Кодирующая последовательность исходной субъединицы р-конглютина соответствует остаткам с 70 по 1668. Кодируемые ею 533 аминокислотных остатка исходной субъединицы р-конглютина (SEQ ID NO: 2) представляют собой:
MGKMRWFPTLVLVLGIVFLMAVSIGIAYGEKDVLKSHERPEEREQEEWQPRRQR PQSRREEREQEQEQGSPSYPRRQSGYERRQYHERSEQREEREQEQQQGSPSYSRR QRNPYHFSSQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNTLI LPKHSDAD YVLWLNGRATITIVNPDRRQAYNLEYGDALRIPAGS TSYILNPDDN QKLRVVKLAIPINNPGYFYDFYPSSTKDQQSYFSGFSRNTLEATFNTRYEEIQRI ILGNEDEQEYEEQRRGQEQSDQDEGVIVIVSKKQIQKLTKHAQSSSGKDKPSDSG P FNLRSNE PIYSNKYGNFYEITPDRNPQVQDLNISLTYIКINEGALLLPHYNSKA IYWWDEGEGNYELVGIRDQQRQQDEQEEKEEEVIRYSARLSEGDIFVIPAGYP ISINASSNLRLLGFGINADENQRNFLAGSKDNVIRQLDRAVNELTFPGSAEDIER LIKNQQQSYFANGQPQQQQQQQSEKEGRRGRRGSSLPF
Внутренний фрагмент кодирующей последовательности предшественника р-конглютина, соответствующий Blad (SEQ ID NO: 3), приведен на фиг. 2. Полипептид Blad (SEQ ID NO: 4) представляет собой:
RRQRNPYHFS SQRFQTLYKNRNGKIRVLERFDQRTNRLENLQNYRIVEFQSKPNT LIL PKH S DAD YVLWLNGRAT ITI VNPDRRQAYNLE YGDALR I PAGS T S YILNPD DNQKLRWKLAIPINNPGYFYDFYPSSTKDQQSYFSGFSRNTLEATFNTRYEEIQ RIILGNED
Таким образом, когда антимикробный агент содержит (или в основном состоит из) полипептид, включающий в себя (или в основном состоящий из) Blad или его активный вариант, указанный агент содержит (или в основном состоит из) полипептидную последовательность, включающую в себя (или в основном состоящую из) последовательность SEQ ID NO: 4 или ее активный вариант.
Активным вариантом Blad является вариант Blad, который сохраняет способность действовать в качестве антимикробного агента (т.е. обладает антимикробной активностью - описание уровня такой активности и способа ее измерения см. ниже). Термин "активный вариант Blad" включает в свой объем фрагмент последовательности SEQ ID NO: 4. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент последовательности SEQ ID NO: 4 выбран таким образом, что он составляет по меньшей мере 10% длины SEQ ID NO: 4, предпочтительно по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% длины SEQ ID NO: 4. Таким образом, Blad или его вариант, как правило, имеет длину по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, например по меньшей мере 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 или 173 аминокислотных остатка.
Термин "активный вариант Blad" также включает в свой объем полипептидную последовательность, которая обладает гомологией с SEQ ID NO: 4, например по меньшей мере 40% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности, например, по всей последовательности или на участке из по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 40, предпочтительно по меньшей мере 50, предпочтительно по меньшей мере 60, предпочтительно по меньшей мере 80, предпочтительно по меньшей мере 100, предпочтительно по меньшей мере 120, предпочтительно по меньшей мере 140 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 160 или более соседних аминокислотных остатков. Способы измерения гомологии белков хорошо известны из уровня техники, и специалистам в данной области техники будет понятно, что в данном контексте гомология рассчитывается на основе идентичности аминокислот (иногда обозначается как "строгая гомология").
Гомологичный активный вариант Blad, как правило, отличается от полипептидной последовательности SEQ ID NO: 4 заменами, инсерциями или делениями, например имеет от 1, 2, 3, 4, 5 до 8 или более замен, инсерций или делеций. Замены являются предпочтительно "консервативными", то есть другими словами, аминокислота может быть заменена аналогичной аминокислотой, где аналогичные аминокислоты имеют одинаковой с заменяемой аминокислотой одну из следующих групп: ароматические остатки (F/H/W/Y), неполярные алифатические остатки (G/A/P/I/L/V), полярные незаряженные алифатические остатки (C/S/T/M/N/Q) и полярные заряженные алифатические остатки (D/E/K/R). Предпочтительные подгруппы включают в себя: G/A/P; I/L/V; C/S/T/M; N/Q; D/E и K/R.
Полипептид, включающий в себя Blad или его активный вариант (как описано выше), может состоять из Blad или его активного варианта с любым количеством аминокислотных остатков, добавленных к N-концу и/или C-концу, при условии, что полипептид сохраняет антимикробную активностью (описание уровня такой активности и способа ее измерения опять см. ниже). Предпочтительно, чтобы к одному или обоим концам Blad или его активного варианта было добавлено не более 300 аминокислотных остатков, более предпочтительно не более 200 аминокислотных остатков, предпочтительно не более 150 аминокислотных остатков, предпочтительно не более 100 аминокислотных остатков, предпочтительно не более 80, 60 или 40 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно не более 20 аминокислотных остатков.
Полипептид, включающий в себя (или в основном состоящий из) Blad или его активный вариант (как описано выше), может быть использован в настоящем изобретении в очищенном виде (например, выделен из растительного, животного или микробного источника) и/или в виде рекомбинантного белка. Получение рекомбинантной формы позволяет получать активные варианты Blad. Способы очистки существующего в природе Blad уже описаны в литературе (например, Ramos et al. (1997) Planta 203(1): 2634 и Monteiro et al. (2010) PLoS ONE 5(1): e8542). Подходящим источником существующего в природе Blad является растение рода Lupinus, такое как Lupinus albus, предпочтительно семядоли указанного растения, предпочтительно собранные между примерно 4 и примерно 14 днем после начала прорастания, более предпочтительно собранные с 6 по 12 день после начала прорастания (например, на 8 день после начала прорастания). В уровне техники раскрыты способы экстрагирования общего белка, приводящие к получению неочищенного экстракта, содержащего Blad, и способы выделения белков из такого экстракта, приводящие к получению частично очищенного экстракта, например, включающего Blad-содержащий гликоолигомер, который включает в себя Blad.
Для того чтобы выделить собственно Blad, можно затем использовать ДСН-ПААГ и/или предпочтительно обращенно-фазную ВЭЖХ на колонке C-18.
Альтернативным способом получения частично очищенного экстракта, содержащего гликоолиго-мер, который включает Blad, является использование хитинсвязывающей активности Blad. Этот глико-олигомер очень эффективно связывается с хитиновой колонкой, в способе очистки при помощи хитиновой аффинной хроматографии, и элюируется 0,05 Н раствором HCl. Подробное описание примера этого способа очистки приводится ниже.
Семядоли восьмидневных растений люпина собирают и гомогенизируют в воде, очищенной при помощи системы Milli-Q plus (значение pH доведено до 8,0), содержащей 10 мМ CaCl2 и 10 мМ MgCl2. Гомогенат фильтруют через марлю и центрифугируют при 30000 g в течение 1 ч при температуре 4°C. Затем осадок ресуспендируют в 100 мМ Tris-HCl буфере с pH 7,5, содержащем 10% (мас./об.) NaCl, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ ЭГТА, перемешивают в течение 1 ч при температуре 4°C и центрифугируют при 30000 g в течение 1 ч при температуре 4°C. Общую глобулиновую фракцию, содержащуюся в надоса-дочной жидкости, осаждают сульфатом аммония (561 г/л), перемешивают на холоде в течение 1 ч и центрифугируют при 30000 g в течение 30 мин при температуре 4°C. Полученный осадок растворяют в 50 мМ Tris-HCl буфере с pH 7,5, обессоливают на колонке PD-10, уравновешенной тем же буфером, и пропускают через колонку для хитиновой аффинной хроматографии, предварительно уравновешенную тем же буфером. Эту колонку промывают 50 мМ Tris-HCl буфером с pH 7,5, и связавшиеся белки элюируют 0,05 Н раствором HCl. Элюированные фракции сразу нейтрализуют 2 М раствором Tris, и пиковые фракции объединяют, лиофилизируют и анализируют при помощи ДСН-ПААГ.
Для изготовления хитиновой колонки хитиновое сырье было получено от компании Sigma и обработано следующим образом: образец хитина обильно промывали водой, очищенной при помощи системы Milli-Q plus, а затем 0,05 Н раствором HCl. Затем его промывали 1% (мас./об.) раствором карбоната натрия и затем этанолом до тех пор, пока поглощение промывочной жидкости не становилось меньше 0,05. После этого хитин помещали в наконечник для пипетки и уравновешивали 50 мМ Tris-HCl буфером
с pH 7,5.
Способы получения рекомбинантных белков хорошо известны из уровня техники. Такие способы, какие применяются здесь, будут включать вставку полинуклеотида, кодирующего полипептид, включающий в себя Blad или его активный вариант, в подходящий экспрессионный вектор, позволяющий совмещать указанный полинуклеотид с одним или несколькими промоторами (например, с индуцибельным промотором, таким как Т7Ыс промотор) и с другими целевыми полинуклеотидами или генами, введение данного экспрессионного вектора в подходящую клетку или организм (например, Escherichia coli), экспрессию полипептида в трансформированной клетке или организме и удаление экспрессированного ре-комбинантного полипептида из этой клетки или организма. Для облегчения такой очистки экспрессион-ный вектор может быть сконструирован так, чтобы полинуклеотид дополнительно кодировал, например, концевую метку, которая может способствовать очистке, например метку из гистидиновых остатков для аффинной очистки. После того как рекомбинантный полипептид был очищен, метка очистки может быть удалена из полипептида, например, путем протеолитического расщепления.
В композиции настоящего изобретения, содержащей антимикробный агент, включающий в себя (или в основном состоящий из) полипептид, указанный полипептид предпочтительно находится в частично очищенном виде, более предпочтительно в очищенном виде. Указанный полипептид является частично очищенным, если он находится в среде, в которой отсутствуют один или несколько других полипептидов, с которыми он связан в естественных условиях, и/или составляет по меньшей мере 10% от всех присутствующих белков. Указанный полипептид является очищенным, если он находится в среде, в которой отсутствуют все или большинство других полипептидов, с которыми он связан в естественных условиях. Например, термин "очищенный Blad" означает, что Blad составляет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% от всех белков в композиции.
В композиции настоящего изобретения, содержащей антимикробный агент, набор белков Lupinus может состоять в основном из Blad-содержащего гликоолигомера, который включает в себя полипептид, который включает в себя (или в основном состоит из) Blad или его активный вариант.
Патогенные для растений микроорганизмы.
Патогенным для растения микроорганизмом, против которого антимикробный агент является эффективным, является любой микроорганизм, способный вызывать заболевание снаружи или внутри растения. Особенно предпочтительные целевые бактериальные микроорганизмы включают в себя патогенные виды Pseudomonas, такие как Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tolaasii и Pseudomonas agarici (предпочтительно Р. syringae); патогенные виды Erwinia, такие как Erwinia persicina, Pectobacterium carotovorum, Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Erwinia psidii и Erwinia tracheiphila; и патогенные виды Streptomyces, такие как Streptomyces griseus.
Особенно предпочтительные целевые грибковые микроорганизмы включают в себя патогенные виды Altemaria, такие как Altemaria alternata, Altemaria arborescens, Altemaria arbusti, Altemaria brassicae, Altemaria brassicicola, Altemaria carotiincultae, Altemaria conjuncta, Altemaria dauci, Altemaria euphorbiicola, Altemaria gaisen, Altemaria infectoria, Altemaria j aponica, Altemaria petroselini, Altemaria selini, Altemaria solani и Altemaria smyrnii; патогенные виды Fusarium, такие как Fusarium oxysporum и Fusarium graminea-rum (предпочтительно F. oxysporum); патогенные виды Botrytis, такие как Botrytis cinerea; и патогенные виды Colletotrichum, такие как Colletotrichum actuatum, Colletotrichum coccodes, Colletotrichum capsici, Colletotrichum crassipes, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum graminicola, Colletotrichum kahawae, Colletotrichum lindemuthianum, Colletotrichum musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum orbiculare, Col-letotrichum pisi и Colletotrichum sublineolum.
Хелатирующие агенты.
Хелатирующий агент (также известный как хелант, хелатор или комплексообразующий агент) представляет собой любое химическое соединение, которое связывает ион металла с образованием неко-валентного комплекса и уменьшает активность иона. Подходящие хелатирующие агенты включают в себя полиаминокарбоксилаты, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и ЭГТА (этиленг-ликоль-бис-(р-аминоэтиловый эфир)-^^№,№-тетрауксусная кислота). Предпочтительно в качестве хе-латирующего агента используется ЭДТА, предпочтительно в концентрации по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл или по меньшей мере 100 и до 500 мкг/мл, до 1, до 5, до 10 или до 20 мг/мл. Предпочтительно ЭДТА используется в концентрации от 0,1 до 20 мг/мл, более предпочтительно от 1 до 20 мг/мл.
Результаты.
Антимикробный агент в сочетании с хелатирующим агентом может применяться для подавления роста патогенного для растения микроорганизма (означает, что он обладает микробостатическим действием) или уничтожения указанного микроорганизма (означает, что он обладает микробицидным действием). Специалист в данной области техники при помощи стандартных методов будет способен определить подходящую дозу и/или концентрацию антимикробного агента при конкретной концентрации хела-тирующего агента для достижения желаемого подавления роста или уничтожения микроорганизма в каждом конкретном случае. Предпочтительно сочетание антимикробного агента и хелатирующего агента является нетоксичным для людей или животных.
Предпочтительно при использовании сочетания антимикробного агента и хелатирующего агента (например, композиции настоящего изобретения) в качестве микробостатического агента это сочетание уменьшает скорость роста на 10%, более предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 90%, более предпочтительно на 95%, более предпочтительно на 98%, более предпочтительно на 99% и еще более предпочтительно на 99,9% по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного сочетания. Наиболее предпочтительно данное сочетание предотвращает любой рост микроорганизма.
Предпочтительно при использовании сочетания антимикробного агента и хелатирующего агента (например, композиции настоящего изобретения) в качестве микробицидного агента это сочетание уничтожает 10% популяции микроорганизмов, более предпочтительно 50% указанной популяции, более предпочтительно 75% указанной популяции, более предпочтительно 90% указанной популяции, более предпочтительно 95% указанной популяции, более предпочтительно 98% указанной популяции, более предпочтительно 99% указанной популяции и еще более предпочтительно 99,9% указанной популяции по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного сочетания. Наиболее предпочтительно данное сочетание уничтожает всю популяцию микроорганизма.
При применении для предотвращения или подавления заражения растения микроорганизмом указанное сочетание предпочтительно используется в эффективном количестве, то есть, другими словами, количестве, которое обеспечивает такой уровень подавления роста и/или уничтожения микроорганизма, при котором достигается определяемый уровень предотвращения или подавления заражения (например, достигается определяемый уровень предотвращения или подавления повреждения растительной ткани), предпочтительно по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного сочетания.
Если выбранный антимикробный препарат содержит полипептид, включающий в себя Blad или его
активный вариант, в сочетании с хелатирующим агентом (например, ЭДТА в любой из вышеописанных концентраций), то подходящие концентрации, в которых используется указанный полипептид, включают по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 20 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл, по меньшей мере 100 мкг/мл или по меньшей мере 500 мкг/мл и до 1, до 2,5, до 5 или до 10 мг/мл. Предпочтительно выбранная концентрация указанного пептитда составляет от 50 мкг/мл до 10 мг/мл, более предпочтительно от 500 мкг/мл до 5 мг/мл и еще более предпочтительно от 1 до 5 мг/мл (например, около 2,5 мг/мл).
Например, при концентрации ЭДТА 50 мМ (т.е. примерно 15,8 мг/мл) концентрация Blad 1 или 2,5 мг/мл может быть использована, например, для подавления роста B. cinerea или F. oxysporum соответственно. Это является неожиданным результатом, учитывая, что сам по себе Blad необходимо применять в концентрациях примерно 5 или 10 мг/мл (соответственно) для подавления роста этих патогенов. Открытия, сделанные авторами настоящего изобретения, позволяют a) эффективно использовать антимикробные агенты (которые эффективны против патогенов растений) в более низких концентрациях, благодаря применению хелатирующего агента, или b) повысить эффективность антимикробных агентов (которые эффективны против патогенов растений) при стандартных концентрациях, благодаря применению хелатирующего агента. Это обеспечивает более экономичное/эффективное использование таких антимикробных препаратов для предотвращения или лечения инфекции растения (или его части), вызываемой микроорганизмом.
Применение и способы.
Авторами настоящего изобретения предложено применение композиции настоящего изобретения для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении. В связи с этим, авторами также предложен способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий в себя нанесение на нуждающееся в этом растение композиции настоящего изобретения (например, эффективного количества указанной композиции).
Авторами настоящего изобретения также предложено применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении. Ими также предложено применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма. В связи с этим, авторами также предложены:
a) способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма (например, эффективного количества сочетания указанных агентов);
b) способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом.
В этих вариантах осуществления изобретения указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат могут быть нанесены на указанное растение в составе одной композиции или по отдельности. Если эти два агента наносятся по отдельности, то это нанесение может быть последовательным (где каждый агент может быть нанесен первым) или одновременным. Нанесение на растение может осуществляться, например, путем наложения (например, распыления) агентов (или композиции, содержащей указанные агенты) на растение (или на любую его часть) или путем погружения растения или его части (например, семян) в соответствующий раствор(ы).
Когда хелатирующий агент используется для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, указанный хелати-рующий агент (и его концентрация) предпочтительно выбирается таким образом, чтобы сочетание указанного антимикробного агента и указанного хелатирующего агента обеспечивало повышенный уровень подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма (например, такой, при котором достигается повышенный уровень предотвращения или подавления заражения растения, например, достигается повышенный уровень предотвращения или подавления повреждения растительной ткани) предпочтительно по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного хелати-рующего агента.
В вариантах осуществления настоящего изобретения, относящихся к применению/способу, антимикробный агент и хелатирующий агент являются такими, как подробно описано выше.
Растением, нуждающимся в сочетании антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, и хелатирующего агента, может быть любое растение, подверженное риску заражения или уже являющееся зараженным, где указанное заражение вызвано патогенным для растений микроорганизмом. Предпочтительно растение является культурным растением (например, любым растением, которое выращивается, чтобы быть собранным с целью получения пищи, корма для скота, топлива, волокна или любого другого коммерчески ценного продукта). Предпочтительно указанное культурное растение является продовольственным культурным растением, таким как рас
тение, являющееся источником сахара (например, сахарная свекла, сахарный тростник), фруктом (включая орех), овощем или зерном. Конкретные растения, дающие зерно, включают в себя злаки (например, кукуруза, пшеница, ячмень, сорго, просо, рис, овес и рожь) и бобовые (например, фасоль, горох и чечевица).
Авторами настоящего изобретения также предложено применение композиции, содержащей (или в основном состоящей из) антимикробный полипептид, включающий (или в основном состоящий из) Blad или его активный вариант, для уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении. В связи с этим, авторами также предложен способ уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении, указанный способ включает в себя нанесение на указанное растение композиции, содержащей (или в основном состоящей из) эффективное количество антимикробного полипептида, включающего (или в основном состоящего из) Blad или его активный вариант. При необходимости антимикробный полипептид, включающий (или в основном состоящий из) Blad или его активный вариант, может быть использован в изолированном виде.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная композиция наносится на нуждающееся в этом растение. Растением, нуждающимся в указанной композиции, может быть любое растение, подверженное риску заражения или уже являющееся зараженным, где указанное заражение вызвано патогенной для растения бактерией. Предпочтительные растения описаны выше. Значения терминов "уничтожение/подавление роста бактерии" и "эффективное количество" являются такими же, как описано выше для сочетания антимикробного агента и хелатирующего агента.
Примеры
В следующих примерах BLAD обозначает существующий в природе Blad-содержащий гликооли-гомер, включающий в себя полипептид Blad массой 20 кДа, очищенный по методике, описанной в Ramos et al. (1997) Planta 203(1): 26-34: см. разделы "Растительный материал и условия выращивания" и "Очистка белков" в параграфе "Материалы и методы" этого документа.
Определения:
МИК - минимальная ингибирующая концентрация: наименьшая концентрация антимикробного препарата, которая подавляет видимый рост микроорганизма.
МФК/МБК - минимальная фунгицидная/бактерицидная концентрация (или минимальная летальная концентрация): наименьшая концентрация антимикробного агента, необходимая для уничтожения 99,9% первичного инокулума после 24 ч при стандартизированном наборе условий.
Пример 1. Бактерицидное действие BLAD и синергическое влияние на него ЭДТА.
A. Было установлено, что для P. aeruginosa бактериостатическая концентрация BLAD составляет 100 мкг/мл, а бактерицидная - 250 мкг/мл. BLAD в концентрации 50 мкг/мл или ЭДТА в концентрации 1 мг/мл подавляют рост P. aeruginosa (т.е. обе концентрации являются бактериостатическими), но сочетание этих двух веществ в данных концентрациях является бактерицидным.
B. Для Erwinia pirsicina МИК BLAD составляет 32 мкг/мл и МИК ЭДТА составляет 15 мМ. Однако в присутствии субподавляющего количества ЭДТА (0,75 мМ) МИК BLAD снижалась до 16 мкг/мл.
C. В случае Streptomyces griseus МИК BLAD составляет 1024 мкг/мл и МИК ЭДТА составляет 16 мМ. Однако в присутствии субподавляющего количества ЭДТА (8 мМ) МИК BLAD снижалась до 256 мкг/мл.
Пример 2. Синергическое влияние ЭДТА на фунгицидное действие BLAD.
Зона подавления BLAD совместно и без ЭДТА в отношении Botrytis cinerea на 1,2% (мае./об.) картофельно-декстрозном агаре (PDA) (3 суток инкубации при 25°С)
Агент (ы)
Диаметр зоны
Средний
подавления
(мм)
диаметр зоны
подавления
(мм)
Blad
(20
0 мкг)
Blad
(10
0 мкг)
Blad
(50
мкг)
0 0 0
Blad
(20
мкг)
0 0 0
ЭДТА
(50
тМ)
0 0 0
Blad
(20
0 мкг)+ЭДТА
(5(
Э тМ)
Blad
(10
0 мкг)+ЭДТА
(5(
D тМ)
Blad
(50
мкг)+ЭДТА
тМ)
Blad
(20
мкг)+ЭДТА
тМ)
Рост B. cinera подавлялся при количестве BLAD 200 и 100 мкг. Это подавление усиливалось при добавлении 50 мМ (приблизительно 15,8 мг/мл) ЭДТА.
Отсутствие подавления роста наблюдалось при использовании только BLAD в количестве 20 или 50 мкг или использовании только 50 мМ ЭДТА. Однако подавление имело место, когда каждая из этих двух концентраций BLAD использовалась в сочетании с 50 мМ ЭДТА.
Рост F. oxysporum подавлялся при количестве BLAD 200 мкг. Это подавление усиливалось при добавлении 50 мМ (приблизительно 15,8 мг/мл) ЭДТА.
Отсутствие подавления роста наблюдалось при использовании только BLAD в количестве 20, 50 или 100 мкг или использовании только 50 мМ ЭДТА. Однако подавление имело место, когда 50 или 100 мкг BLAD использовалось в сочетании с 50 мМ ЭДТА.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении, причем указанный антимикробный агент включает полипептид, включающий Blad последовательность SEQ ID NO: 4, или его активный вариант, который имеет антимикробную активность и который включает последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична или SEQ ID NO: 4, или фрагменту SEQ ID NO: 4, длина которого составляет по меньшей мере 60 аминокислот.
2. Применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, причем антимикробный агент определен в п.1.
3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат наносятся на нуждающееся в этом растение.
4. Применение по п.3, в котором указанный антимикробный агент и указанный хелатирующий агент наносятся:
a) на указанное растение в составе одной композиции или
b) на одну и ту же часть растения по отдельности, в частности каждый последовательно или одновременно.
5. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА.
6. Применение по любому из пп.1-5, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения.
7. Применение по п.6, в котором бактерия является патогенным видом одного из следующих родов: Pseudomonas, Erwinia и Streptomyces.
8. Способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, раскрытых в п.1.
9. Способ по п.8, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения.
10. Способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным
против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробно-
го препарата с хелатирующим агентом, где антимикробный препарат определен в п.1.
1 gatggcgatg aatgaacact 61 taatcaaata tgggtaagat 121 gtattcctca tggcagtgtc 181 catgagaggc ctgaggaaag 241 agtagaaggg aagagagaga
3 01 cagagtggtt atgagaggag 361 caagaacaac aacaaggttc 421 agctctcaaa gattccaaac
4 81 aggtttgacc aaagaaccaa 541 caatcaaaac ctaacactct 601 gtactcaatg gtagagccac 661 cttgagtatg gcgatgctct 721 gatgacaacc agaagcttag 781 ttttatgatt tctatccatc 841 aggaacactt tagaggccac 901 gggaatgagg atgagcaaga 961 gacgaggggg tgatagtgat
1021 caatcttcat caggaaaaga 1081 gagcccatat attcaaacaa 1141 caagttcagg atttgaatat
12 01 ttgccacact ataactcaaa 1261 tatgaactgg taggtattcg 1321 gaagaagtga taaggtatag
13 81 ggttatccaa tttccatcaa 1441 gctgatgaaa accagaggaa 15 01 gatagagcag tgaatgagct 1561 aaaaaccaac aacagtctta 1621 agtgagaagg agggaaggcg 1681 actaagctgt tttaaaagct 1741 ataaaactaa agttggacct
l cgtagacaaa ggaaccctta
61 aggaatggca aaatccgtgt
121 ctccaaaact accgcattgt
181 cactctgatg ctgactacgt
241 aaccctgata gaagacaagc
3 01 ggctcaactt catatatcct
361 gcaataccca tcaacaatcc
421 caacaatcct acttcagtgg
481 tatgaagaga tacaaaggat
gcgtttgctg gctttgatga gagagtgagg tttccaacgt aattggtatt gcttatggag agaacaagag gagtggcaac gcaagagcaa gagcagggtt acaataccat gagaggagtg tccctcatac tcacgtagac tctttacaaa aataggaatg tagacttgag aatctccaaa cattctccct aaacactctg aatcacgata gtaaaccctg cagaatccca gctggctcaa agtagtcaag ctcgcaatac gagtactaaa gaccaacaat cttcaatact cgttatgaag atatgaggaa caaaggcgtg agtttcaaag aaacagatcc caaaccctct gattctggcc gtatgggaac ttctatgaaa ctctctcacc tatataaaaa ggccatatat gtagtcgtgg agatcaacaa cgacaacaag tgctagatta tcagaaggtg tgcttcctca aatcttcgct tttcctcgca ggttctaaag cacattccct ggttctgctg ctttgcaaat ggtcagcctc tggaagaagg ggttcatctc actatcatgt aagagctcat ttgtactaat aatgttaata
Фиг. 1
tcacttcagc tctcaaagat gctcgagagg tttgaccaaa tgagttccaa tcaaaaccta cctcgttgta ctcaatggta atataacctt gagtatggcg taacccggat gacaaccaga tggctacttt tatgatttct cttcagcagg aacactttag tattttaggg aatgaggat
Фиг. 2
aaatcgagtg caacctaata tagtgttggt actaggaata aaaaagatgt gctaaagagt ctaggagaca acgacctcaa ctccctcata cccacgcagg agcagaggga agagagagag aaaggaaccc ttatcacttc gcaaaatccg tgtgctcgag actaccgcat tgttgagttc atgctgacta cgtcctcgtt atagaagaca agcatataac cttcatatat ccttaacccg ccatcaacaa tcctggctac cctacttcag tggcttcagc agatacaaag gattatttta ggcaagagca gagcgaccaa aaaaattgac aaaacacgct ccttcaactt gagaagcaat tcactccaga tagaaaccct ttaacgaggg agctttgttg ttgatgaagg agaaggaaat atgagcaaga agagaaagag acatttttgt aattccagca tgcttggatt tggcatcaat acaatgtgat aaggcagtta aagatattga gagattaatc aacaacaaca acaacaacaa ttccattttg agcacttttt agtgagctac tgagagaata aaaaaaaaaa a
tccaaactct ttacaaaaat gaaccaatag acttgagaat acactctcat tctccctaaa gagccacaat cacgatagta atgctctcag aatcccagct agcttagagt agtcaagctc atccatcgag tactaaagac aggccacctt caatactcgt
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027441
- 1 -
027441
- 1 -
027441
- 1 -
027441
- 1 -
027441
- 4 -
027441
- 9 -
|
