[RU]

1. Способ определения регенераторного потенциала кожи пациента, включающий: a) отбор образца кожи пациента; b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях; c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток; d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации; e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и протоколов; f) анализ изображений колоний фибробластов с целью получения указанных ниже параметров, характеризующих рост и морфологические особенности клеточных культур, по которым определяют регенераторный потенциал кожи пациента, при этом эффективность колониеобразования рассчитывают как процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток более 20 к общему количеству эксплантированных клеток, плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью ≥46 отн.ед., а диффузные колонии ≤25 отн.ед., причём при значении эффективности колониеобразования ниже 45% для мужчин и ниже 36% для женщин определяют низкий регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразования в интервале 45-49% для мужчин и 36-45% для женщин определяют нормальный регенераторный потенциал, а при значении эффективности колониеобразования выше 49% для мужчин и выше 45% для женщин определяют высокий регенераторный потенциал.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученные на стадии f) значения параметров обрабатывают с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.

3. Способ определения пролиферативного потенциала кожи пациента, включающий: a) отбор образца кожи пациента; b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях; c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток; d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации; e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и f) определение показателя пролиферации по формуле ПП=[1(ДД)+2(ДС)+3(ДП)]/100(%), где ПП - показатель пролиферации; ДД - процентная доля диффузных колоний (%); ДС - процентная доля смешанных колоний (%); ДП - процентная доля плотных колоний (%), причем плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью ≥46 отн.ед., а диффузные колонии ≤25 отн.ед., при значении показателя пролиферации ниже 2,0 для мужчин и ниже 1,8 для женщин определяют низкий пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации в интервале равным 2,0-2,4 для мужчин и 1,8-2,0 для женщин определяют нормальный пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации выше 2,4 для мужчин и выше 2,0 для женщин определяют высокий пролиферативный потенциал.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что полученные на стадии f) значения параметров обрабатывают с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.

5. Компьютерная система, используемая в способе по пп.1-4, включающая блок формирования изображения, обеспечивающий оптическое разрешение не менее 800 dpi, блок центрального процессорного устройства, соединенного с блоком оперативной памяти и способного проводить обработку информации, получаемую либо непосредственно от блока формирования изображения, либо через блок ввода и вывода информации, при этом компьютерная система снабжена: а) программным обеспечением для проведения статистически достоверного анализа колоний, определения параметров, характеризующих регенераторный потенциал и пролиферативный потенциал, обработки полученных параметров, позволяющей оценить регенерационную и пролиферативную способность кожи пациента; b) базой данных с хранящимися в ней нормальными значениями указанных в пп.1 и 3 параметров, характеризующих регенераторный и пролиферативный потенциалы кожи человека.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ определения регенераторного потенциала кожи пациента, включающий: a) отбор образца кожи пациента; b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях; c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток; d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации; e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и протоколов; f) анализ изображений колоний фибробластов с целью получения указанных ниже параметров, характеризующих рост и морфологические особенности клеточных культур, по которым определяют регенераторный потенциал кожи пациента, при этом эффективность колониеобразования рассчитывают как процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток более 20 к общему количеству эксплантированных клеток, плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью ≥46 отн.ед., а диффузные колонии ≤25 отн.ед., причём при значении эффективности колониеобразования ниже 45% для мужчин и ниже 36% для женщин определяют низкий регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразования в интервале 45-49% для мужчин и 36-45% для женщин определяют нормальный регенераторный потенциал, а при значении эффективности колониеобразования выше 49% для мужчин и выше 45% для женщин определяют высокий регенераторный потенциал.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученные на стадии f) значения параметров обрабатывают с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.

3. Способ определения пролиферативного потенциала кожи пациента, включающий: a) отбор образца кожи пациента; b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях; c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток; d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации; e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и f) определение показателя пролиферации по формуле ПП=[1(ДД)+2(ДС)+3(ДП)]/100(%), где ПП - показатель пролиферации; ДД - процентная доля диффузных колоний (%); ДС - процентная доля смешанных колоний (%); ДП - процентная доля плотных колоний (%), причем плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью ≥46 отн.ед., а диффузные колонии ≤25 отн.ед., при значении показателя пролиферации ниже 2,0 для мужчин и ниже 1,8 для женщин определяют низкий пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации в интервале равным 2,0-2,4 для мужчин и 1,8-2,0 для женщин определяют нормальный пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации выше 2,4 для мужчин и выше 2,0 для женщин определяют высокий пролиферативный потенциал.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что полученные на стадии f) значения параметров обрабатывают с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.

5. Компьютерная система, используемая в способе по пп.1-4, включающая блок формирования изображения, обеспечивающий оптическое разрешение не менее 800 dpi, блок центрального процессорного устройства, соединенного с блоком оперативной памяти и способного проводить обработку информации, получаемую либо непосредственно от блока формирования изображения, либо через блок ввода и вывода информации, при этом компьютерная система снабжена: а) программным обеспечением для проведения статистически достоверного анализа колоний, определения параметров, характеризующих регенераторный потенциал и пролиферативный потенциал, обработки полученных параметров, позволяющей оценить регенерационную и пролиферативную способность кожи пациента; b) базой данных с хранящимися в ней нормальными значениями указанных в пп.1 и 3 параметров, характеризующих регенераторный и пролиферативный потенциалы кожи человека.

---

Евразийское 027436 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201300600
(22) Дата подачи заявки 2012.09.06
(51) Int. Cl. A61B10/02 (2006.01) G06F19/12 (2011.01)
(54) СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ РЕГЕНЕРАТОРНОГО И ПРОЛИФЕРАТИВНОГО
ПОТЕНЦИАЛОВ КОЖИ ПАЦИЕНТА, А ТАКЖЕ КОМПЬЮТЕРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТИХ СПОСОБОВ
(31) 2011140055
(32) 2011.10.03
(33) RU
(43) 2013.09.30
(86) PCT/RU2012/000745
(87) WO 2013/051963 2013.04.11
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ
"ВИТАЦЕЛ" (RU)
(72) Изобретатель:
Зорин Вадим Леонидович, Зорина Алла Ивановна, Черкасов Владимир Рюрикович, Копнин Павел Борисович
(RU) (56) A.Yu. Belyaeva. Narusheniya proliferativnogo potentsiala fibroblastov dermy pri starenii kozhi. Sibirsky gosudarstvenny universitet, g. Tomsk, 22.09.2009. Opublikovano v sbornike statei po materialam Mezhdunarodnoi 64-i nauchnoi studencheskoi konferentsii im. N.I Pirogova, g. Tomsk, 2005, pod red. prof. Novitskogo V.V. i d.m.n. Ogorodovoi L.M. Retrieved from the Internet.
L.I. Luzina. Kompiyuternoe modelirovanie. Uchebnoe posobie. Tomsky mezhvuzovy tsentr distantsionnogo obrazovaniya, Tomsk-2001, p. 8, par.
RU-U1-57576
(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки состояния или выявления патологии соединительной ткани (и/или органа). В частности, изобретение может быть применимо в эстетической медицине для коррекции возрастных изменений кожи. Изобретение включает способы диагностики регенеративного и пролиферативного потенциалов фибробластов кожи пациента, что позволяет провести индивидуальную коррекцию возрастных изменений кожи. При этом диагностику регенеративного и пролиферативного потенциалов фибробластов кожи пациента осуществляют с помощью компьютерной системы, что упрощает проведение способов.
Область применения
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки состояния или выявления патологии соединительной ткани (и/или органа) путем проведения клонального анализа входящих в состав данной ткани субстрат-зависимых клеток. В частности, изобретение относится к эстетической медицине и может применяться для оценки состояния дермы и последующей индивидуальной коррекции возрастных и других структурных изменений кожи. Предлагаемый способ оценки клеточной популяции (в частности, популяции фибробластов), входящих в состав соединительных тканей, может быть использован для изучения состояния, патологии или каких-либо изменений, детерминированных, опосредованных или иным образом связанных с особенностями процессов регенерации, происходящих в данных тканях (и/или органах). Также способ применим для прогнозирования эффективности лечения, коррекции изменений и патологии, исход которых зависит от регенерационных процессов, их скорости и длительности.
Предшествующий уровень техники
Известен способ анализа процесса старения клеток путем идентификации изменений биологических параметров клеток, например характеристик клеточного метаболизма под действием факторов старения [патент GB 2395489, МПК 02N 5/06]. Этот способ включает протеомные, геномные или транс-криптомные исследования или их комбинации с последующим сравнением полученных результатов таких исследований для клеток, т.е. взятых у молодого донора с малым числом пассажей культивирования in vitro или клеток, полученных из ткани с минимальной экспозицией УФ-облучения, и клеток, полученных от пожилых доноров или клеток с большим числом пассажей in vitro или клеток из ткани, подвергшейся высокой степени воздействия УФ-облучения и клеточных культур, помещенных в трехмерный матрикс, имитирующих биологическую ткань (соединительную, эпителиальную, эпидермальную и т.д.). Этот способ предлагается использовать для скрининговых исследований по поиску лекарственных средств, способных модулировать метаболические процессы в стареющих клетках.
К недостаткам данного способа относится сложность его выполнения, требующая высокой квалификации персонала и наличие специального дорогостоящего оборудования, что затрудняет рутинное применение метода, особенно в практике врачей-косметологов. Кроме того, данное изобретение ограничивается исследованием клеток только in vitro и не может быть использовано для характеризации состояния клеточной популяции in vivo, т.е. ткани, из которой данные клетки были выделены и, следовательно, не может быть использовано для диагностики этой ткани на клеточном уровне и прогноза последующей терапии.
Известен способ определения колониеобразующих единиц (КОЕ) эндотелиальных прогениторных клеток путем характеризации клеточного препарата для применения в регенеративной медицине или клинической трансплантологии [заявка WO 2008110570, МПК G01N 33/50, C12N 5/06]. В заявке описан метод анализа степени влияния веществ и условий проведения анализа на величину КОЕ эндотелиаль-ных прогениторных клеток для его последующего использования в качестве скринингового теста на выявление позитивного или негативного влияния отдельных веществ на пролиферацию эндотелиальных прогениторных клеток. Этот способ включает эксплантацию исходных клеток в подходящей среде с плотностью, исключающей контактное ингибирование роста клеток, последующее инкубирование клеток в течение нескольких дней и проведение анализа образовавшихся колоний. Анализ колоний проводили путем их окрашивания, подсчета и ранжирования по размеру на две группы - колонии клеток с высоким пролиферативным потенциалом (колонии больше определенного порогового значения, равного, в зависимости от состава среды, 2 или 4 мм) и колонии с нормальным и низким пролиферативным потенциалами (равным или меньше порогового значения).
Недостатком данного способа является то, что способ ограничивается лишь анализом эндотелиальных прогениторных клеток (эндотелиальных клеток пупочного канатика человека (HUVEC); эндотели-альных клеток микрососудов человека). Также это изобретение ограничивается исследованием только клеток in vitro и не может быть использовано для характеризации состояния клеточной популяции ткани in vivo, из которой данные клетки были выделены и, следовательно, не может быть использовано для оценки состояния ткани на клеточном уровне и прогноза последующей терапии.
Известен способ анализа популяции фибробластов из кожно-мышечной ткани 7-8-недельных эмбрионов человека [патент RU 2017818, МПК 02N 5/02], включающий трипсинизацию клеток, их эксплантацию и инкубацию в питательной среде с последующим подсчетом веретеновидных, парусовидных и плеоморфных клеток.
С помощью данного способа исследуют постнатальные культуры дермальных фибробластов на предмет митотической активности клеток путем подсчета колоний с определенным количеством и плотностью клеток.
К недостаткам способа следует отнести его трудоемкость, потребность в использовании специального инструментального обеспечения, субъективный и качественный характер получаемых результатов, затрудняющий их интерпретацию и ограничивающий их практическое применение.
Способ прогнозирования течения дистракционного остеогенеза предложен в патенте RU 2110798 МПК G01N 33/48. Способ заключается в том, что клетки костного мозга, например грудины, экспери
ментального животного или человека культивируют в диффузионных камерах, которые имплантируют мышам внутрибрюшинно. Через 7 сут камеры извлекают и из их содержимого готовят цитологические препараты, в которых подсчитывают число кластеров и колоний моноцитарно-макрофагального и фиб-робластического типов, и по их соотношению рассчитывают прогностический индекс (ПИ) и при ПИ> 1 прогнозируют нарушение процессов костеобразования. Авторы заявляют, что данный способ является малотравматичным и позволяет в ранние сроки более точно выявлять нарушения костеобразования, связанные с расстройством иммунологической регуляции дистракционного остеогенеза.
К недостаткам данного способа следует отнести его узкоспециализированную направленность (прогнозирование течения дистракционного остеогенеза по оценке числа клоногенных клеток костного мозга), что ограничивает возможность применения метода для изучения регенеративных процессов в других тканях и органах. Кроме того, метод предполагает активное использование большого количества лабораторных животных (до 6 мышей на одно исследование), влекущее за собой, наряду с этическими проблемами, необходимость содержания специализированного вивария и наличия обслуживающего квалифицированного персонала, что значительно удорожает и осложняет применение предлагаемого способа.
Известен также способ прогнозирования исхода оперативного лечения хронического остеомиелита [SU 1372216, МПК G01N 1/28], включающий забор материала, получение клеток и их культивирование с последующим определением количества выросших колоний фибробластов костного мозга, в котором для повышения точности способа материал после забора из остеомиелитического очага помещают на 12-24 ч в среду 199 с антибиотиками, а подсчет эффективности клонирования стромальных клеток костного мозга производят по формуле: ЭКф = а-100000/n, где ЭКф = эффективность клонирования; а - количество выросших колоний; n - количество костно-мозговых клеток, и при значениях ЭКф не более 5 прогнозируют неблагоприятный исход послеоперационного периода, а при значениях 5,1-100000 - благоприятный исход.
Как следует из описания, данное изобретение предполагает диагностическое использование только одного параметра - эффективности клонирования клеток, выделенных непосредственно из костной ткани пациента. В частности, в отличие от метода, предлагаемого в настоящем изобретении, данный метод предполагает рассмотрение только хорошо различимых колоний, не принимая во внимание их распределение по плотности клеток и наличие не видимых невооруженным глазом диффузных колоний, что может содержать ценную диагностическую информацию. Описанный выше параметр эффективности клонирования в равной мере зависит от двух дополняющих друг друга показателей: количества клеток, способных при их дальнейшем культивировании образовывать колонии (так называемые Колониеобразую-щие Единицы фибробластов, КОЕф) и от пролиферативной активности этих КОЕф (т.е. скорости образования колоний). Подсчет же только одних хорошо сформировавшихся колоний может привести к занижению результатов и, в конечном счете, к искажению истинной картины. Кроме того, имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о сезонных колебаниях пролиферативной активности клеток костного мозга, что негативно сказывается на воспроизводимости результатов и вынуждает авторов патента использовать дополнительные меры для обеспечения высокой пролиферативной активности клеток, в частности применение фидера на основе клеток животных, что уменьшает технологичность и повышает себестоимость метода.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - принципиальная схема компьютерной системы;
фиг. 2 - электронное изображение типичных колоний пациента (А) и результат их компьютерной обработки для проведения морфометрического анализа (Б);
на фиг. 3-5 представлены результаты клонального анализа. Графики статистически значимых зависимостей, выявленных с помощью корреляционного анализа Пирсона, где R - коэффициент корреляции Пирсона (чем ближе к единице, тем сильнее зависимость исследуемых параметров) при уровне статистической значимости а;
фиг. 3 - зависимость доли диффузных колоний от инструментальной оценки глубины морщин (Visia, Proctor &Gamble Co, США);
фиг. 4 - зависимость доли плотных колоний от эластичности кожи пациента (Cutometer MPA 580, Courage + Khazaka electronic GmbH, Германия);
фиг. 5 - зависимость доли диффузных колоний от эластичности кожи пациента (Cutometer MPA 580, Courage + Khazaka electronic GmbH, Германия);
фиг. 6 - электронное изображение колоний (А) и результат их компьютерной обработки для проведения морфометрического анализа (Б) (пациентка К, 56 лет);
фиг. 7 - электронное изображение колоний (А) и результат их компьютерной обработки для проведения морфометрического анализа (Б) (пациентка Д, 36 лет);
фиг. 8 - схема взаимодействия основных функциональных блоков компьютерной системы;
фиг. 9 - алгоритм работы программного обеспечения.
Раскрытие изобретения
В основе разработанного способа оценки состояния и/или выявления патологии соединительной ткани пациента лежит определение регенераторного и пролиферативного потенциалов входящих в со
став данной ткани клеток - фибробластов, что дает возможность оценить регенераторный потенциал и самой соединительной ткани. Способ диагностики регенераторного потенциала кожи пациента включает
a) отбор образца кожи пациента;
b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях;
c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток;
d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации;
e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и протоколов;
f) анализ изображений колоний фибробластов с целью получения ряда параметров, характеризующих рост и морфологические особенности клеточных культур, по которым впоследствии определяют их регенераторный потенциал,
при этом эффективность колониеобразования рассчитывают как процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток более 20 к общему количеству эксплан тированных клеток, плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью > 46 отн.ед., а диффузные колонии <25 отн.ед., причём при значении эффективности колониеобразования ниже 45% для мужчин и ниже 36% для женщин диагностируют низкий регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразова-ния в интервале 45-49% для мужчин и 36-45% для женщин диагностируют нормальный регенераторный потенциал, а при значении эффективности колониеобразования выше 49% для мужчин и выше 45% для женщин диагностируют высокий регенераторный потенциал, при значении процентной доли плотных колоний ниже 44% и процентной доли диффузных колоний выше 25% для мужчин, процентной доли плотных колоний ниже 40% и процентной доли диффузных колоний выше 40% для женщин диагностируют низкий пролиферативный потенциал, при значении процентной доли плотных колоний в интервале 44-54% и процентной доли диффузных колоний в интервале 20-25% для мужчин, процентной доли плотных колоний в интервале 40-50% и процентной доли диффузных колоний в интервале 30-40% для женщин диагностируют нормальный пролиферативный потенциал, а при значении процентной доли плотных колоний выше 54% и процентной доли диффузных колоний ниже 20% для мужчин, процентной доли плотных колоний выше 50% и процентной доли диффузных колоний ниже 30% для женщин диагностируют высокий пролиферативный потенциал.
Известно, что темп обновления соединительной ткани во взрослом организме осуществляется благодаря функционированию стволовых/прогениторных (предшественников) стромальных клеток, дающих потомство дифференцирующихся/дифференцированных клеток. По содержанию таких предшественников стромальных клеток в соединительной ткани и оценивают ее регенераторный потенциал - способность клеточной популяции данной ткани к восстановлению ее структурных компонентов взамен утраченных (в результате старения и/или повреждений различного генеза). Т.о. регенераторный потенциал может быть интерпретирован как параметр, характеризующий принципиальную способность клеточной популяции к восстановлению ткани. Однако данный параметр не охватывает такой показатель, как скорость регенеративных процессов.
В этой связи вторым немаловажным параметром для общей характеризации эффективности регенеративных процессов в соединительных тканях организма является пролиферативный потенциал - количество делений, которое клетки могут пройти до своей гибели, т.е. другими словами, это способность клеток к многократному делению для сохранения функционально активной клеточной популяции в ткани. Очевидно, чем выше пролиферативный потенциал клеток, составляющих данную ткань или орган, тем больше в них митотически активных клеток и, следовательно, тем быстрее будут осуществляться регенеративные процессы.
Способ диагностики пролиферативного потенциала кожи пациента включает:
a) отбор образца кожи пациента;
b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях;
c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток;
d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации;
e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и
f) определение процентных долей плотных, диффузных и смешанных колоний в культуре фиброб-ластов и показателя пролиферации фибробластов в качестве параметров, определяющих пролифератив
a)
ный потенциал клеток,
при этом эффективность колониеобразования рассчитывают как процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток более 20 к общему количеству эксплантированных клеток, показатель пролиферации определяют по формуле
ПП=[1(ДД)+2(ДС)+3(ДП)]/100(%),
где ПП - показатель пролиферации; ДД - процентная доля диффузных колоний, (%); ДС - процентная доля смешанных колоний, (%); ДП - процентная доля плотных колоний, (%), плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью > 46 отн.ед., а диффузные колонии <25 отн.ед., причём при значении эффективности колониеобразования ниже 45% для мужчин и ниже 36% для женщин диагностируют низкий регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразования в интервале 45-49% для мужчин и 36-45% для женщин диагностируют нормальный регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразования выше 49% для мужчин и выше 45% для женщин диагностируют высокий регенераторный потенциал, при значении показателя пролиферации ниже 2,0 для мужчин и ниже 1.8 для женщин диагностируют низкий пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации в интервале равным 2,0-2,4 для мужчин и 1,8-2,0 для женщин диагностируют нормальный пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации выше 2,4 для мужчин и выше 2,0 для женщин диагностируют высокий пролиферативный потенциал.
Таким образом, оба описанных выше параметра - регенераторный потенциал (наличие и количество "активных центров" регенерации) и пролиферативный потенциал (кинетические особенности регенеративных процессов) - дополняя друг друга, характеризуют эффективность процессов регенерации ткани (способность ткани к восстановлению). В этой связи процесс снижения или утраты функций того или иного органа/ткани может быть рассмотрен с позиции нарушения в них нормального течения регенеративных и, в свою очередь, сведен к снижению их регенераторного и/или пролиферативного потенциалов, а сама задача выявления таких нарушений сводится к определению и интерпретации этих параметров.
Реализация настоящего изобретения позволяет расширить арсенал современных методов оценки состояния соединительных тканей (и/или органов), выявления в них нарушений путем внедрения в широкую клиническую практику простого, доступного и достоверного метода, основанного на клональном анализе субстрат-зависимых клеток, входящих в состав данных тканей, и позволяет разработать способ индивидуальной коррекции возрастных изменений кожи, включающий:
1) диагностику кожи согласно способу по любому из описанных выше способов;
2) коррекцию возрастных изменений кожи с учетом результатов диагностики, включающую терапию кожи аутологичными клетками фибробластов.
Компьютерная система, используемая в спсобах, включает блок формирования изображения, обеспечивающий оптическое разрешение не менее 800dpi, блок центрального процессорного устройства, соединенного с блоком оперативной памяти и способного проводить обработку информации, получаемую либо непосредственно от блока формирования изображения, либо через блок ввода и вывода информации, при этом компьютерная система снабжена:
a) программным обеспечением для проведения статистически достоверного анализа колоний, определения по меньшей мере одного параметра, характеризующего регенераторный потенциал, и по меньшей мере одного параметра, характеризующего пролиферативный потенциал, обработки полученных результатов, позволяющей оценить регенерационную способность ткани (и органа) пациента;
b) базой данных с хранящимися в ней нормальными значениями параметров, характеризующих регенераторный и пролиферативный потенциалы фибробластов кожи человека.
Задачей, которая решается в рамках данного изобретения, является создание универсального способа диагностики тканей и органов живого организма на основании анализа популяции составляющих их клеток (мезенхимных стромальных клеток, фибробластов). Полученные в результате такого исследования показатели регенераторного и пролиферативного потенциалов могут быть использованы с диагностической и/или прогностической целью в дерматологии (например, для оценки состояния дермы при ее возрастных изменениях), стоматологии (например, при пародонтозе) при заболеваниях опорно-двигательного аппарата (например, при хроническом остеомиелите, некрозе головки бедра и др.).
Так, при использовании настоящего изобретения для оценки состояния кожи пациента данные показатели позволяют сделать выводы о морфофункциональном состоянии популяции дермальных фиб-робластов и составить индивидуальную программу коррекции существующих изменений кожи пациента и профилактики ее старения. Такая программа может включать рекомендации по количеству процедур клеточной терапии (в частности, интрадермального введения культивированных аутологичных фиброб-ластов), срокам их проведения, а также использованию косметологических методов с учетом степени их воздействия на все слои кожи с целью достижения стойкого эстетического результата без ущерба для популяции фибробластов.
В основе теоретического обоснования данного изобретения лежит хорошо известный факт, что стромальные клетки-предшественники, являясь субстрат-зависимыми клетками, при культивировании in vitro образуют дискретные колонии, каждая из которых представляет собой потомство одной клетки (клон). Таким образом, путем проведения клоналъного анализа и определения, например, эффективности
колониеобразовапия (ЭКО), которое представляет собой отношение числа выросших колоний фибробла-стов к количеству эксплантированных (посеянных) клеток - возможно определение содержания клеток-предшественников в образце данной ткани или органа. ЭКО является величиной, которая отражает в клеточной культуре долю колониеобразующих (клоногенных) субстрат-зависимых клеток и, при соответствующем пересчете на массу биоптата, содержание прогениторных клеток в ткани. Чем больше величина эффективности колониеобразования, тем больше в ткани клеток-предшественников фибробла-стов, тем, соответственно, больше дифференцированных (зрелых) функционально-активных фибробла-стов, и, следовательно, выше регенераторный потенциал ткани и наоборот.
В результате проведенных исследований нами выявлено, что при соблюдении специальных условий, результат формирования колоний является высоко воспроизводимым (в пределах 5-7% ошибки) как по количеству образовавшихся колоний, так и по их форме и морфологическим особенностям, для всех клеток данной ткани или органа, имеющего сходные функции и местоположение. Это позволяет экстраполировать данные, толученные для колоний и составляющих их клеток, на всю клеточную популяцию ткани, ткань и/или орган с целью оценки их состояния и разработки рекомендаций для коррекции в случае выявления нарушений.
Таким образом, исследование ЭКО-ф является наиболее информативным и точным методом определения регенераторного потенциала популяции мезенхимных стромальных клеток и, соответственно, исследуемой ткани.
Способ диагностики состояния ткани и/или органа предполагает проведение 2 этапов исследования.
1. Этап предварительных исследований. На данном этапе проводят определение параметров соединительной ткани донора, определяющих регенераторный и пролиферативный потенциалы входящих в ее состав субстрат-зависимых клеток в норме. При этом определение указанных параметров проводят в строго контролируемых условиях на большой выборке доноров с заранее известными результатами обследования, подтверждающими отсутствие у них патологии. В результате проведенных исследований получают интервал средних значений параметров, определяющих регенераторный и пролиферативный потенциалы входящих в их состав субстрат-зависимых клеток, отвечающих нормальному состоянию данной ткани.
2. Этап диагностики. На данном этапе проводят определение тех же параметров ткани, характеризующих регенераторный и пролиферативный потенциалы входящих в ее состав клеток, что и на этапе предварительного исследования, но уже у пациента. состояние интересующей ткани (и/или органа) которого необходимо установить. После получения значений указанных параметров их сравнивают с определенным ранее интервалом средних значений и делают вывод о наличии или отсутствии патологии.
Следует отметить, что этап предварительных исследований не всегда является обязательным, поскольку диапазон средних значений параметров может быть известен из литературных данных или иных надежных источников. В некоторых случаях математическая обработка результатов может не проводиться.
Этап диагностики включает:
I. получение пригодных для визуализации колоний субстрат-зависимых клеток анализируемой ткани (и/или органа). Для этого проводят:
1. отбор образца ткани пациента;
2. выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток из образца ткани в стандартных условиях;
3. эксплантацию выделенных клеток с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток;
4. культивирование клеток в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации.
II. Проведение статистически достоверного анализа полученных колоний. При этом проводят:
1. визуализацию образовавшихся колоний с использованием стандартных средств и протоколов;
2. анализ изображений колоний с целью получения ряда параметров, характеризующих рост и морфологические особенности клеточных культур, по которым впоследствии определяют их пролифератив-ный и регенераторный потенциалы.
III. Обработка полученных результатов. Подробное описание каждого из этапов.
I. Получение колоний субстрат-зависимых клеток. 1. Забор образца ткани (биоптата).
Забор биоптата производят в асептических условиях из соединительной ткани органа, исследование которого проводят в рамках данного изобретения. Местоположение и способ забора биоптата должны быть строго стандартизованы в пределах одной группы анализов. Выбор участка биопсии ткани осуществляют исходя из соображения обеспечения репрезентативной выборки клеточного материала, максимально отражающего состояние интересующей ткани (органа), не поврежденное факторами внешней среды.
2. Выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток.
Выделение жизнеспособных клеток из биоптата ткани донора проводят в стерильных условиях по стандартным протоколам при помощи протеолитических ферментов - коллагеназы или либеразы. Целью данного этапа является высвобождение жизнеспособных клеток из межклеточного матрикса ткани путем ферментативного расщепления последнего.
3. Эксплантация клеток.
Точно известная и воспроизводимая плотность эксплантации клеток является одним из важных условий успешного применения предлагаемого изобретения. Плотность эксплантации клеток зависит от ряда факторов, в том числе типа клеток и числа пассажей in vitro, состава культуральной среды, условий и времени культивирования, площади эксплантации, характера субстрата и т.д. и должна быть определена экспериментально перед рутинным применением (на этапе предварительных исследований), исходя из следующего.
Оптимальной плотностью эксплантации клеток можно считать плотность, благодаря которой образуются колонии, размеры которых и количество составляющих их субстрат-зависимых клеток позволяют провести статистически достоверный анализ. При этом количество колоний не должно быть слишком велико, чтобы избежать контактного торможения пролиферации клеток внутри колоний и их слияния, что может приводить к затруднению интерпретации результатов Например, для фибробластов дермы оптимальной плотностью эксплантации является 1-2 клетки на см2.
Точный подсчет количества эксплантируемых клеток проводят посредством стандартных методов, которые могут быть использованы без ограничений в рамках данного изобретения.
Выбор пассажа эксплантируемой клеточной культуры осуществляют согласно конкретной цели: исследования можно проводить как на клетках первичной культуры (в случае исследования популяции фибробластов кожи пациента), так и на клетках более поздних пассажей (в случае характеризации клеточного продукта перед проведением терапии). Очевидно, что оптимальные условия для каждого из приведенных вариантов подбираются индивидуально в ходе проведения контрольных исследований.
Следует отметить, что для получения надежных воспроизводимых результатов важно использовать протоколы эксплантации и культивирования клеток, идентичные протоколам, установленным на этапе предварительных исследований, включая условия культивирования и набор реактивов/материалов. Последнее не всегда технически осуществимо в течение длительного периода времени, например вследствие неизбежного расхода какого-либо реагента из одной партии. В этой связи для обеспечения более полного контроля за указанными условиями, данным изобретением предусматривается введение "внутренних клеточных стандартов" - использование культуры клеток с заранее известными параметрами, определяющими регенераторный и пролиферативный потенциалы клеток. Данный "внутренний клеточный стандарт" проходит все те же этапы обработки и проведения анализа, что и клетки из анализируемого образца ткани. Затем проводят сравнение полученных значений параметров для "внутреннего клеточного стандарта" с ожидаемыми, ранее определенными аналогичными значениями и в случае их расхождения более чем на 10% проводят расчет корректирующего коэффициента, учитывающего изменение условий проведения анализа по сравнению со стандартными. После этого проводят расчет параметров исследуемых клеток с учетом корректирующего коэффициента.
4. Культивирование клеток.
Подход к определению оптимальной продолжительности данной стадии с учетом условий культивирования и типа используемых клеток аналогичен изложенному выше. При этом определение оптимального времени инкубирования клеток в культуральной среде и стандартизация условий является одним из критически важных факторов получения воспроизводимых и статистически достоверных результатов.
II. Проведение статистически достоверного анализа колоний.
1. Визуализация колоний.
Основной целью данного этапа является получение изображения образовавшихся колоний в виде, удобном для анализа, в том числе с применением средств вычислительной техники и морфометрического программного обеспечения. Разрешение получаемого изображения, его формат, а также средства для получения самого изображения выбирают исходя из конкретных задач и параметров, характеризующих клеточную культуру (см. ниже). Примером таких удобных технических решений может быть использование бытовых и профессиональных сканирующих устройств, цифровой фото- и видеотехники, оптической и электронной микроскопии и т.д. с получением электронного изображения колоний высокой четкости с разрешением не менее 800 dpi.
2. Анализ клеточных колоний с целью количественной оценки параметров, характеризующих клеточную культуру.
Целью данной стадии является оценка объективных количественных/полуколичественных параметров, характеризующих свойства клеточной культуры по морфометрическим признакам сформировавшихся колоний и составляющих их клеток. К таким параметрам можно отнести
общее число образовавшихся колоний. Согласно существующей практике [1, 2], следует стандартизовать минимальное количество клеток, составляющих колонию. Такой величиной может быть, в част
ности, значение как 20, так и 50 клеток. Клоны, в состав которых входит меньшее число клеток, колониями не считают и, соответственно, при подсчете не учитывают;
эффективность колониеобразования. Данный параметр характеризует способность субстрат-зависимых клеток образовывать колонии и представляет отношение количества выросших колоний к общему количеству эксплантированных клеток;
любые параметры, описывающие форму и размеры колоний. К таким параметрам, в частности, можно отнести общую площадь всех колоний, среднюю площадь колоний, их линейные размеры, общий или средний периметр колоний, распределение их по размерам, долю колоний, размер которых лежит в определенном диапазоне и т.д. Например, в случае введения условных критических величин для линейного размера колонии, возможно разделение колоний на "большие", "средние", "малые" и вычисление доли каждого типа таких колоний, их соотношение и т.п.;
любые параметры, описывающие структурные и морфологические характеристики колоний. К таким параметрам можно отнести
распределение колонии по количеству составляющих их клеток или плотность, с которой клетки располагаются в колонии. Например, в случае введения условных средних величин для числа составляющих колонии клеток, возможно разделение колоний на "плотные", "диффузные", "смешанные" и вычисление доли колоний различной плотности, их соотношения и т.п.;
доля колоний с количеством клеток лежащим в заданном интервале;
распределение колоний по форме составляющих их клеток. Например, в колониях фибробластов кожи различают следующие клетки: веретенообразные (узкие длинные клетки с отношением длинной и короткой сторон более 5), парусовидные (крупные, размером 40 и более мкм распластанные клетки с отношением длинной и короткой сторон менее 3) и др. Так, колонии, состоящие из более чем 75% веретенообразных клеток, можно обозначить "веретенообразными", соответственно, колонии с более 75% парусовидных клеток - "парусовидными", промежуточные варианты -"смешанными" колониями;
возможно также использование любой комбинации перечисленных выше методов, а также производных величин, полученных с использованием указанных выше параметров.
Следует отметить, что набор возможных параметров не ограничивается приведенным выше списком и может включать любые другие параметры и их комбинации, которые характеризуют форму, размер, количество, плотность расположения и т.д. как самих колоний, так и составляющих их клеток.
III. Обработка полученных результатов.
Данный этап предполагает проведение анализа полученных значений регенераторного и пролифе-ративного потенциалов и их интерпретацию. Целесообразно на данном этапе использовать математические методы, выбор алгоритма которых зависит от исследуемого образца, целей исследования и параметров, полученных с помощью клонального анализа. На данном этапе возможно сопоставление полученных величин, характеризующих колонии, с контрольными (средними) значениями, хранящимися в базе данных или памяти доступных для сравнения.
Целью данного этапа является оценка параметров, характеризующих колонии исследуемых клеток путем сравнения их значений с контрольными (средними) величинами, полученными на этапе предварительных исследований и формирование заключения о состоянии исследуемой клеточной популяции, ткани (органа).
Проведение данной стадии предполагает использование средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования с целью получения объективной, статистически достоверной информации (т.е. с уровнем статистической значимости а меньше 5% ( <0,05)). Количественное определение контрольных (средних) значений величин производят на основании данных, полученных на этапе предварительных исследований, литературных данных или данных из иных надежных источников.
Для простоты и успешности применения изобретения возможно использование специально разработанной компьютерной системы (КС). Компьютерная система для диагностики включает блок формирования изображения, обеспечивающий оптическое разрешение не менее 80 dpi, предпочтительно до 9600 dpi, а более предпочтительно 1200-1800 dpi, блок центрального процессорного устройства, соединенного с блоком сперативной памяти и запрограммированного проводить обработку информации, получаемую или непосредственно от блока формирования изображения, или через блок ввода и вывода информации. При этом компьютерная система снабжена программным обеспечением для проведения статистически достоверного анализа колоний, определения по меньшей мере одного параметра, характеризующего регенераторный потенциал, и по меньшей мере одного параметра, характеризующего проли-феративный потенциал, обработки полученных результатов, позволяющей оценить регенераторный потенциал ткани (и органа) пациента. При этом сравнивают полученные значения со средними (нормальными) значениями, хранящимися в базе данных или ячейке памяти доступные для сравнения с последующим отображением с возможностью указания диагноза для пользователя, например врача, пациента, эстетика и т.д.
Данная система может включать (фиг. 1) блок центрального процессорного устройства (ЦПУ, 1), соединенного с блоком оперативной памяти (ОЗУ, 2) и способного проводить обработку информации,
получаемую или непосредственно от блока формирования изображения (БФИ, 3), или через блок ввода/вывода информации (БВВИ, 4). Параметры, получаемые в результате обработки информации, сравниваются со стандартными (нормальными) значениями, хранящимися в базе данных на устройстве постоянной памяти (5), функционирующей на базе устройства постоянной памяти компьютерной системы или другом типе памяти компьютерной системы. Блок БФИ служит для получения цифрового изображения полученных клеточных колоний в формате, пригодном для его последующей обработки КС и с разрешением не менее 800dpi, обеспечивающем визуализацию отдельных окрашенных клеток, входящих в состав колоний. Такой блок может функционировать на базе электронных сканирующих устройств планшетного типа, цифровой фото- или видеокамеры и других устройств формирования цифрового изображения, обеспечивающих необходимое разрешение.
Варианты применения изобретения
В частности, предлагаемый способ диагностики может быть применен для оценки состояния дермы.
Решение проблемы эффективной и безопасной коррекции возрастных изменений кожи является одной из важных задач современной дерматокосметологии. В настоящее время в практике эстетической медицины используют большой арсенал методов коррекции возрастных изменений кожи лица и тела. Это мезотерапия, биоревитализация, пилинги, фракционный фототермолиз, радиоволновое воздействие, дермаабразия и др. Основная цель применения этих методов - стимуляция функциональной активности фибробластов - главного клеточного компонента дермы, отвечающего за продукцию, организацию и обновление ее межклеточного матрикса.
Известно, что одной из причин старения кожи является уменьшение в ней содержания фибробла-стов и снижение их биосинтетической активности. Очевидно, что целенаправленное воздействие на дерму на клеточном уровне будет способствовать как ремоделированию ее межклеточного матрикса, так и эффективной коррекции визуальных дефектов кожи.
Практика использования современных косметологических процедур и методов, направленных на коррекцию морщин и других возрастных дефектов кожи, показывает, что их применение является эффективным, а в ряде случаев и безопасным, только при учете индивидуальных особенностей кожи пациента. Современные методы оценки состояния кожи, особенно на клеточном уровне, недостаточно эффективны и обладают малой практической значимостью.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое частное применение изобретения, является разработка универсального способа оценки состояния дермы пациента, выявление в ней изменений (возрастных и других структурных) и расширение диагностических возможностей определения состояния кожи для повышения эффективности и безопасности применения последующих косметологических процедур.
Для решения задачи применен предлагаемый способ диагностики и разработано 2 способа оценки состояния дермы человека.
1- й способ включает анализ параметров, характеризующих колонии фибробластов, который заключается в определении эффективности колониеобразования в качестве параметра, определяющего регенераторный потенциал популяции клеток и процентной доли плотных и диффузных колоний в клеточной культуре в качестве параметра, определяющего пролиферативный потенциал клеток. Причём при значении эффективности колониеобразования ниже 45% для мужчин и ниже 36% для женщин диагностируют низкий регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразования в интервале 45 -49% для мужчин и 36-45% для женщин диагностируют нормальный регенераторный потенциал, а при значении эффективности колониеобразования выше 49% для мужчин и выше 45% для женщин диагностируют высокий регенераторный потенциал, и при значении процентной доли плотных колоний ниже 44% и процентной доли диффузных колоний выше 25% для мужчин и процентной доли плотных колоний ниже 40% и процентной доли диффузных колоний выше 40% для женщин диагностируют низкий пролиферативный потенциал, при значении процентной доли плотных колоний в интервале 44-54% и процентной доли диффузных колоний в интервале 20-25% для мужчин и процентной доли плотных колоний в интервале 40-50% и процентной доли диффузных колоний в интервале 30-40% для женщин диагностируют нормальный пролиферативный потенциал, а при значении процентной доли плотных колоний выше 54% и процентной доли диффузных колоний ниже 20% для мужчин и процентной доли плотных колоний выше 50% и процентной доли диффузных колоний ниже 30% для женщин диагностируют высокий пролиферативный потенциал.
Эффективность колониеобразования рассчитывают как процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток больше 20 к общему количеству эксплантированных клеток.
Для получения объективной, статистически значимой информации значения параметров (т.е. а <0,05), характеризующих колонии фибробластов, определяют с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования в соответствии с методами, описанными ниже.
2- й способ включает анализ параметров, характеризующих колонии фибробластов, который заключается в определении эффективности колониеобразования в качестве параметра, определяющего регенераторный потенциал популяции клеток и процентной доли плотных, диффузных, смешанных колоний в
2-
культуре клеток и показателя пролиферации в качестве параметра, определяющего пролиферативный потенциал клеток. Причём при значении эффективности колониеобразования ниже 45% для мужчин и ниже 36% для женщин диагностируют низкий регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразования в интервале 45-49% для мужчин и 36-45% для женщин диагностируют нормальный регенераторный потенциал, а при значении эффективности колониеобразования выше 49% для мужчин и выше 45% для женщин диагностируют высокий регенераторный потенциал, и при значении показателя пролиферации ниже 2,0 для мужчин и ниже 1,8 для женщин диагностируют низкий пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации в интервале равным 2,0-2,4 для мужчин и 1,8-2,0 для женщин диагностируют нормальный пролиферативный потенциал, а при значении показателя пролиферации выше 2,4 для мужчин и выше 2,0 для женщин диагностируют высокий пролиферативный потенциал.
Эффективность колониеобразования рассчитывают как процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток больше 20 к общему количеству эксплантированных клеток.
Показатель пролиферации определяют по формуле
ПП=[ 1 (ДД)+2(ДС)+3(ДП)]/100%,
где ПП - показатель пролиферации;
ДД - процентная доля диффузных колоний, (%);
ДС - процентная доля смешанных колоний, (%);
ДП - процентная доля плотных колоний, (%).
В частном варианте для получения объективной, статистически значимой информации значения параметров, характеризующих колонии фибробластов, определяют с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.
Формирование заключения и рекомендаций.
Полученные показатели регенераторного и пролиферативного потенциалов позволяют сделать выводы о функциональном состоянии популяции дермальных фибробластов и состоянии дермы, в целом, у каждого пациента и составить для него индивидуальную программу коррекции существующих возрастных изменений кожи.
Программа включает рекомендации по количеству процедур клеточной терапии посредством ин-традермального введения культивированных аутологичных фибробластов кожи, срокам их проведения, а также по использованию косметологических методов с учетом степени их воздействия на дерму с целью достижения эстетического результата без ущерба для нее.
В частности, при высоком регенераторном (для мужчин более 49%, а для женщин, 45%) и пролифе-рагивном (ПП для мужчин более 2,4 и для женщин более 2,0) потенциалах пациенту рекомендуется только применение любых косметологических методов воздействия на дерму, стимулирующих пролифе-ративную активность популяции фибробластов кожи, включая агрессивные (к примеру, лазерные аблативные технологии).
При нормальном регенераторном (для мужчин 45-49%, а для женщин 36-45%) и пролиферативном (ПП для мужчин 2,0-2,4 и для женщин 1,8-2,0) потенциалах пациенту рекомендуется применение курса дермальных аутофибробластов для областей кожи, требующих коррекции, с частотой 1 раз в 5 лет (поскольку известно, что синтетическая активность трансплантированных фибробластов сохраняется не менее 12 месяцев), в отношении косметологических процедур - ограничений по их применению нет.
При низких значениях регенераторного (для мужчин менее 45%, а для женщин менее 36%) и про-лиферативного (ПП для мужчин ниже 2,0 и для женщин ниже 1,8) потенциалов пациенту рекомендуется применение курса дермальных аутофибробластов для областей кожи, требующих коррекции, с частотой не реже 1 раза в 3 года и рекомендуется с осторожностью применять агрессивные методы воздействия на дерму. При этом чем больше полученные значения регенераторного и пролиферативного потенциалов отклоняются от нормы, тем более часто следует проводить курсы терапии дермальными аутофибробла-стами, вплоть до 1 раза в год при значениях регенераторного потенциала для мужчин менее 25%, а для женщин менее 20% и пролиферативного потенциала ПП для мужчин ниже 1,6 и для женщин ниже 1,5.
Предложенный способ поясняется следующими примерами.
Пример 1. Этап предварительных исследований.
Для проведения анализа состояния популяции дермальных фибробластов кожи пациента были определены средние значения параметров колоний дермальных фибробластов пациентов.
В исследование была включена группа пациентов с признаками возрастных изменений кожи лица (наличие морщин, снижение упругости кожи), состоящая из 50 человек, из которых 35 женщин и 15 мужчин.
Исследование кожи лица для определения таких характеристик, как текстура кожи, количество и глубина морщин, уровень микрогемоциркуляции, проводили с помощью инструментальных методов исследования кожи:
исследование гемомикроциркуляции кожи посредством лазерной допплеровской флоуметрии (лазерный анализатор кровотока ЛАКК-01, НПО "Лазма", Россия);
исследование механических показателей кожи посредством вакуумного кутометра (Cutometer MPA
580, Courage + Khazaka electronic GmbH, Германия);
общее исследование микрорельефа и визуальных показателей кожи посредством фотометрической системы (VISIA, Proctor &Gamble Co, США).
После применения инструментальных методов исследования кожи определяли параметры, характеризующие колонии дермальных фибробластов.
Для этого проводили забор биоптата и культивирование клеток.
Все процедуры проводили согласно разрешенной к применению Росздравнадзором РФ медицинской технологии "Забор, транспортировка, выделение, культивирование, криоконсервирование, хранение и использование аутологичных фибробластов для коррекции возрастных и рубцовых дефектов кожи" (разрешение ФС № 2009/398).
Биопсию кожи размером 3-5 мм3 проводили при отсутствии у пациентов противопоказаний с помощью хирургического лезвия одноразового использования из-за ушной раковины под местной ин-фильтрационной анестезией 2%-ным раствором лидокаина. Выделенный фрагмент кожи немедленно помещали в промаркированный стерильный контейнер со средой для транспортировки (DMEM/F12).
После доставки биоматериала в лабораторию его стерильно переносили в культуральную чашку Петри, промывали раствором Хенкса с антибиотиком (гентамицин), затем трижды промывали раствором Версена. Материал измельчали с помощью стерильного скальпеля, добавляли дезагрегирующий 0,1% раствор коллагеназы и инкубировали 1-1,5 ч при температуре 37°С.
После инкубирования тканевую взвесь интенсивно пипетировали и центрифугировали в течение 10 мин при 300g, супернатант удаляли, осадок разводили культуральной средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% сыворотки пуповинной крови человека (СПК) и 10% аутологичной сыворотки (АС), либо DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% СПК и 10% сыворотки эмбрионов коров (СЭК) фирмы НПП "ПанЭ-ко", Россия или FBS Defined фирмы HyClone, США, либо DMEM/F12 1:1с добавлением 20% СЭК фирмы НПП "ПанЭко", Россия или FBS Defined фирмы HyClone. США и 40 мкг/мл гентамицина, ресуспендиро-вали и переносили в культуральный флакон. Культуральный флакон помещали в CCb-инкубатор. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Замену культуральной среды осуществляли каждые 3-4 дня.
После образования субконфлюэнтного монослоя клетки отмывали раствором Версена, затем снимали с поверхности культуральной посуды раствором Версена с 0,25% трипсина, ресуспендировали в культуральной среде и эксплантировали в культуральную посуду большего объема для последующего культивирования.
Затем проводили клональный анализ фибробластов.
По достижении клетками 2-го пассажа культуру клеток трехкратно отмывали раствором Версена и трипсинизировали при 37°С, 5% СО2 в течение 10 мин. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 300g об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, клетки ресуспендировали в растворе Хэнкса и производили подсчет клеток в камере Горяева до совпадения результатов не менее 95%.
Путем серии последовательных разбавлений готовили клеточную суспензию в концентрации 100 клеток/мл. В три чашки Петри диаметром 100 мм помещали культуральную среду (DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% СПК и 10% АС, либо DMEM/F12 1:1с добавлением 10% СПК и 10% СЭК фирмы НПП "ПанЭко", Россия или FBS Defined фирмы HyClone, США, либо DMEM/F12 1:1с добавлением 20% эмбриональной сыворотки коров фирмы НПП "ПанЭко", Россия или FBS Defined фирмы HyClone, США, и 40 мкг/мл гентамцина) и эксплантировали по 1 мл разбавленной клеточной суспензии для получения клональной плотности посева 1,5 клеток/см2.
Чашки Петри инкубировали в CCb-инкубаторе в условиях насыщенной влажности при +37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 14 дней. После чего культуральные чашки с образовавшимися колониями трехкратно промывали фосфатно-солевым раствором (рН 7,2-7,4) и фиксировали 70% спиртом при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем остатки спирта удаляли трехкратной промывкой дистиллированной водой и проводили окрашивание колоний красителем KaryoMAX(r) Giemsa Stain Stock Solution фирмы Gibco, США в течение 20 мин при 37°С. Чашки с окрашенными колониями тщательно отмывали от избытка красителя и сушили при комнатной температуре в течение 5-7 ч.
После этого осуществляли морфометрический анализ колоний с определением средней оптической плотности каждой исследуемой колонии.
Культуральные чашки помещали в гель-документирующую систему ChemiDoc(tm) XRS Universal-hood II фирмы BioRad Inc., США и проводили сканирование всей ее поверхности в видимом диапазоне света для получения электронного изображения колоний с разрешением не ниже 800 dpi (фиг. 2)
Полученное электронное изображение колоний обрабатывали при помощи морфометрической программы ImageJ согласно алгоритма, включающего удаление фонового окрашивания чашки Петри, нахождение границ индивидуальных клеточных колоний, удаление артефактов изображения, искажающих подсчет и анализ колоний и вычисление средней (по площади колонии) оптической плотности для каждой исследуемой колонии (фиг. 1Б).
Подсчет колоний проводили следующим образом.
После выполнения морфометрического анализа полученные показатели средней оптической плотности переносили в программу Микрософт Excel, где проводили общий подсчет колоний. Все колонии были проранжированы в зависимости от их средней оптической плотности (СОП) на три группы: плотные колонии (СОП> 46 отн.ед.), диффузные колонии (СОП <25 отн.ед.) и смешанные колонии (25 <СОП <46 отн.ед.).
Исследование этих колоний проводили по следующим параметрам.
Эффективность колониеобразования фибробластов, ЭКО-ф, отражает содержание клеток-предшественников фибробнастов в коже пациента и служит количественным показателем регенераторного потенциала популяции дермальных фибробластов пациента. ЭКО-ф - это процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток больше 20 к общему количеству эксплантированных клеток. Клоны фибробластов, в состав которых входит меньшее количество клеток, колониями не считают и, соответственно, при подсчете не учитывают.
Линейные размеры колоний: диаметр круга (в мкм), включающий всю колонию (выполняется с помощью стандартной операции программы Image J).
Средняя площадь колоний (стандартная операция программы ImageJ) и ее распределение по числу колоний.
Количество плотных колоний и их доля от всех образовавшихся колоний с числом клеток более 20. Количество диффузных колоний и их доля от всех образовавшихся колоний с числом клеток более
20.
Количество смешанных колоний и их доля от всех образовавшихся колоний с числом клеток более
20.
Средняя оптическая плотность колоний (стандартная операция программы ImageJ) и ее распределение по плотным, диффузным и смешанным колониям.
Средняя оптическая плотность плотных колоний, пропорциональная количеству составляющих колонию клеток (стандартная операция программы ImageJ).
Показатель пролиферации, ПП, определяемый по формуле [Владимирская Е.Б., Кошель И.В., Цуря В.М. и др. Стромальные фибробласты нормального костного мозга у детей. Гематология, №1, 1990, стр. 1-4]
ПП=[1(ДД) + 2(ДС)-где ПП - показатель пролиферации; ДД - доля диффузных колоний, (%); ДС - доля смешанных колоний, (%; ДП - доля плотных колоний, (%).
Полученные параметры клеточных клонов, характеризующие популяцию цермальных фибробла-стов пациента, сопоставляли с параметрами инструментального исследования кожи пациента с использованием статистической программы BioStat при помощи корреляционного анализа для нахождения средних значений параметров (уровень статистической значимости а <0,05).
После установления устойчивой, статистически достоверной связи характеристик колоний дер-мальных фибробластов с характеристиками состояния кожи, полеченными с помощью инструментальных методов исследования кожи посредством методов математической статистики, определяли средние значения наиболее статистически значимых параметров (с коэффициентом корреляции Пирсона больше 0,7): эффективность колониеобразования дермальных фибробластов (%), доля плотных колоний (%), доля диффузных колоний (%), показатель пролиферации.
Для получения объективной, статистически значимой информации на данной стадии использовали средства вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.
Результаты клонального анализа представлены на фиг. 3-5, где показаны графики зависимостей параметров, выявленных с помощью корреляционного анализа Пирсона.
В табл. 1 приведены средние значения вышеперечисленных статистически значимых параметров дермальных фибробластов в зависимости от пола пациента.
Таблица 1
культуральной среды и условия культивирования.
В случае, когда полученные сочетания величин ДД и ДП не позволяют сделать однозначный вывод о значении пролиферативного потенциала (например, для мужчин: ДД> 25 и ДП> 54, или ДД <20 и 44 <ДП <54. или ДД <20 и ДП <44; для женщин: ДД> 40 и ДП> 50, или 30 <ДД <40 и ДП <40, или ДД <30 и ДП <40), проводят расчет показателя пролиферации (ПП), который, благодаря учету вклада всех видов колоний, позволяет всегда сделать однозначное заключение о значении пролиферативного потенциала данной клеточной культуры.
Пример 2.
Пациентка К. обратилась в клинику А по поводу коррекции возрастных изменений кожи лица (значительное истончение кожи, наличие множественных мелких статических морщин во всех зонах лица). Пациентке 56 лет, в течение последних 5 лет - менопауза. При менопаузе в значительной степени усугубляются наблюдающиеся с возрастом изменения кожи [Brincat М. Hormone replacement therapy and the skin. Maturitas. - 2000, V.35, N2, p. 107-117]. Для подбора адекватной состоянию кожи пациентки терапии была произведена оценка регенераторного и пролиферативного потенциалов популяции ее дермальных фибробластов. Для этого были проведены биопсия кожи из заушной области и клональный анализ с определением параметров, характеризующих колонии дермальных фибробластов согласно вышеописанной методике.
Полученное электронное изображение колоний представлено на фиг. 6А, и результат их компьютерной обработки для проведения морфометрического анализа представлен на фиг. 6Б.
Результат обсчета размеров и средней оптической плотности колоний посредством программы Im-ageJ представлены в табл. 2.
Таблица 2
№ колонии
Площадь колонии, [отн.ед.площади]
Интегральная оптическая плотность колонии, [отн.оптич.ед]
Средняя оптическая плотность
колонии
Тип колонии (результат компьютерного анализа)
5494
242614
44,2
Смешанная
4519
247278
54,7
Плот ная
4388
233256
53.2
Плотная
4841
235662
48,7
Плотная
5611
120398
21,5
Диффузная
4599
105235
22.9
Диффузная
9000
133398
14.8
Диффузная
17902
325727
18,2
Диффузная
23068
466340
20,2
Диффузная
27136
493624
18.2
Диффузная
8496
130229
15,3
Диффузная
6285
149714
23.8
Диффузная
10026
192911
19,2
Диффузная
21193
429798
20.3
Диффузная
28759
381305
13,3
Диффузная
3230
167485
51,9
Плотная
8949
118966
13,3
Диффузная
8492
165474
19,5
Диффузная
25656
324053
12,6
Диффучная
43501
502749
11,6
Диффузная
3510
179474
51,1
Плотная
11148
712587
63,9
Плотная
4323
244007
56,4
Пло1 ная
10415
196291
18,8
Диффузная
Получены следующие величины: ЭКО-ф = 24/1,5=16,0%, где 24 - количество образованных колоний из 150 эксплантированных клеток,
1,5 - коэффициент пересчета для вычисления % клоногенных клеток с учетом количества эксплантированных клеток (150 клеток/чашку).
Доля плотных колоний: [ДП]=7х100%/24 = 29,2%, где
7 - количество плотных колоний;
24 - общее количество колоний.
Доля диффузных колоний: [ДД]=16х100%/24 = 66,6%, где 16 - количество диффузных колоний; 24 - общее количество колоний.
Сопоставление полученных данных, характеризующих клеточные колонии, с ранее рассчитанными средними значениями (табл. 1) позволили сделать следующие выводы о состоянии популяции фибробла-стов кожи пациентки:
ЭКО-ф - значительно ниже среднего уровня, что свидетельствует о низком регенераторном потенциале фибробластов кожи пациентки.
Доля плотных колоний ниже, а доля диффузных колоний выше нормы, что свидетельствует о низком пролиферативном потенциале популяции фибробластов в коже пациентки.
На основании анализа полученных данных для пациентки К. была разработана индивидуальная программа коррекции возрастных изменений кожи лица, которая включает проведение курса терапии кожи аутологичными дермальными фибробластами, затем через 8 - 12 месяцев проведение поверхностного пилинга или фракционного фототермолиза (на уровне папиллярного слоя, не более 3 процедур) и через 6 месяцев - повторный курс терапии кожи аутологичными дермальными фибробластами. В результате проведенного лечения наблюдалось значительное увеличение толщины кожи, особенно в параорби-тальной области, увеличение эластичности и упругости кожи, уменьшение количества и глубины морщин.
Пример 3.
Пациентка Г. Обратилась в клинику по поводу значительного истончения кожи в параорбитальной области после повторной блефаропластики. При визуальном осмотре: кожа в параорбитальной области истончена, тургор снижен, наличие множественных мелких морщин. Для подбора адекватной состоянию кожи пациентки терапии была проведена оценка регенераторного и пролиферативного потенциалов популяции ее дермальных фибробластов. Для этого были выполнены биопсия кожи из заушной области и клональный анализ с определением параметров, характеризующих колонии дермальных фибробластов согласно вышеописанной методике.
Получены вышеописанным методом параметры, характеризующие колонии фибробластов кожи пациента:
ЭКО-ф - 8,3%;
[ДД]-19%;
[ДП] - 59%. Выводы.
ЭКО-ф - значительно ниже среднего уровня, что свидетельствует о низком регенераторном потенциале фибробластов кожи пациентки;
доля плотных колоний ниже, а доля диффузных колоний выше нормы, что свидетельствует о низком пролиферативном потенциале популяции фибробластов в коже пациентки.
На основании анализа полученных данных пациентке было рекомендовано проведение 2 курсов ау-тологичных дермальных фибробластов. После проведенной терапии в параорбитальной области наблюдалось увеличение толщины кожи, увеличение ее эластичности и упругости, значительное уменьшение количества морщин. Пациентке рекомендовано повторить курс клеточной терапии через 3 года в профилактических целях.
Пример 4.
Пациент Н. обратился в клинику А по поводу коррекции возрастных изменений кожи лица (наличие мимических морщин в области "улыбки", снижение тургора кожи).
Получены вышеописанным методом параметры, характеризующие колонии фибробластов кожи па
циента:
ЭКО-ф - 60%;
[ДЦ]-24%;
[ДП]-46%.
Выводы.
ЭКО-ф - выше среднего уровня, что указывает на высокий регенераторный потенциал фибробла-стов кожи пациента;
доля плотных и доля диффузных колоний находятся в пределах нормы, что свидетельствует о хорошем пролиферативном потенциале фибробластов кожи пациента.
На основании анализа полученных данных пациенту было рекомендовано проведение любых методов эстетической медицины, имеющихся в арсенале клиники, для коррекции возрастных изменений кожи без ограничений согласно инструкции.
Пример 5.
Пациентка Д. обратилась в клинику А по поводу коррекции морщин и дряблости кожи. Пациентка 36 лет с нормальным эндокринным статусом, ухудшение состояния кожи произошло после применения процедуры "Thermage" в одной из московских клиник. Для выяснения причины данных изменений кожи было проведено исследование популяции дермальных фибробластов пациентки. Для этого были проведены биопсия кожи из заушной области и клональный анализ с определением параметров, характеризующих колонии дермальных фибробластов согласно вышеописанной методике.
Полученное электронное изображение колоний представлено на фиг. 7A, а результат их компьютерной обработки для проведения морфометрического анализа представлен на фиг. 7Б. Результат обсчета размеров и средней оптической плотности колоний посредством программы ImageJ представлены в табл. 3.
Таблица 3
№ колонии
Площадь колонии, [отн.ед. площади]
Интегральная оптическая плотность колонии, [отн.оптич.ед]
Средняя оптическая плотность
колонии
Тип колонии (результат компьютерного анализа)
15215
299286
19,7
Диффузная
5695
97193
17,1
Диффузная
14526
98945
6,8
Диффузная
8654
103538
12,0
Диффузная
8524
109276
12.8
Диффузная
8967
159786
17,8
Диффузная
П949
142010
11,9
Диффузная
9429
69282
7,3
Диффузная
9618
49217
5,1
Диффузная
3942
159815
40,5
Смешанная
4597
33656
7,3
Диффузная
И075
480888
43,4
Смешанная
2267
24992
11,0
Диффузная
3609
44234
12,3
Диффузная
19830
1053603
53,1
Плотная
12351
789057
63,9
Плотная
20863
322777
15,5
Диффузная
8015
501089
62,5
Плотная
8185
327993
40,1
Смешанная
8050
355112
44,1
Смешанная
1469
58104
39,6
Смешанная
13037
154874
11,9
Диффузная
2326
83741
36,0
Смешанная
6027
265022
44,0
Смешанная
7617
61955
8,1
Диффузная
7151
54413
7,6
Диффузная
7145
337810
47,3
Плотная
2895
48985
16,9
Диффузная
7674
336033
43,8
Смешанная
1852
65829
35,5
Смешанная
12802
525003
41,0
Смешанная
15872
136871
8,6
Диффузная
4573
186589
40,8
Смешанная
9434
404613
42,9
Смешанная
8320
324331
39,0
Смешанная
12326
247570
20,1
Диффузная
2250
101598
45,2
Смешанная
3729
82953
22,2
Диффузная
14223
100829
7,1
Диффузная
3589
157622
43,9
Смешанная
4412
119878
27.2
Смешанная
4051
43444
10,7
Диффузная
8478
59390
7,0
Диффузная
4837
222351
46,0
Смешанная
11869
60156
5,1
Диффузная
3739
230874
61,7
Плотная
3900
99452
25,5
Смешанная
Получены следующие величины: ЭКО-ф=47/1,5=31,3%, где 47 - количество образованных колоний из 150 эксплантированных клеток,
1,5 - коэффициент пересчета для вычисления % клоногенных клеток с учетом количества эксплан-тированных клеток (150 клеток/чашку).
Доля плотных колоний: [ДП]=5х 100%/47=11%, где
5 - количество плотных колоний;
47 - общее количество колоний.
Доля диффузных колоний: [ДД]=24х100%/47=51%, где 24 - количество диффузных колоний; 47 - общее количество колоний.
Доля смешанных колоний: [ДС]=18х100%/47=38%, где 18 - количество смешанных колоний;
47 - общее количество колоний. Показатель пролиферации
[ПП]=(11х3+38х2+51х1)/100%=1,60. Сопоставление полученных данных, характеризующих клеточные колонии, с ранее рассчитанными средними значениями (табл. 1) позволили сделать следующие выводы о состоянии популяции фибробла-стов кожи пациентки:
ЭКО-ф - ниже среднего уровня, что свидетельствует о низком регенераторном потенциале фиброб-ластов кожи пациентки.
[ПП] - ниже среднего уровня, что свидетельствует о низком пролиферативном потенциалепопуля-ции фибробластов в коже пациентки.
На основании анализа полученных данных пациентке было рекомендовано проведение 2 курсов клеточной терапии кожи (с интервалом 1 месяц) аутологичными дермальными фибробластами. Уже через месяц после проведенной терапии отмечалось увеличение эластичности, упругости и гидратации кожи, улучшение ее текстуры, уменьшение количества и глубины морщин. Эффект имел нарастающий характер и достигал максимума через 8 месяцев после трансплантации проведенной терапии.
Пример 6.
Пациент М. обратился в клинику А по поводу ухудшения состояния кожи лица после проведения в одной из клиник курса процедур фототермического термолиза на аппарате Palomar 1450 для коррекции возрастных изменений кожи лица. Так, после проведения 3 процедур снизился тургор кожи, появились множественные очаги атрофии дермы диаметром до 0,4 мм в области щек, кожа приобрела нездоровый цвет. Получены следующие параметры, характеризующие колонии фибробластов кожи пациента:
ЭКО-ф-10%;
[ПП]-1,49.
Выводы.
ЭКО-ф - значительно ниже среднего уровня, что указывает на низкий регенераторный потенциал фибробластов кожи пациента;
[ПП] - свидетельствует о низком пролиферативном потенциале фибробластов кожи пациента.
На основании анализа полученных данных пациенту было рекомендовано проведение 2 курсов клеточной терапии кожи аутологичными дермальными фибробластами. После проведенной терапии аутоло-гичными фибробластами наблюдалось увеличение упругости и эластичности кожи, улучшение цвета и контуров лица, значительное уменьшение размеров очагов атрофии дермы. В профилактических целях повторение курса клеточной терапии рекомендовано через 3-4 года.
Пример 7.
Пациентка Р. обратилась в клинику А по поводу коррекции возрастных изменений кожи лица (наличие мимических морщин в области глаз, выраженные носогубные складки).
В результате оценки параметров, характеризующих колонии фибробластов кожи пациентки, были получены следующие величины:
ЭКО-ф - 36%; ДП-35%;
ДД - 29%.
Ввиду невозможности сделать однозначный вывод о величине пролиферативного потенциала клеточной культуры данного пациента (хотя доля диффузных колоний (ДД) заметно меньше среднего значения для женщин (30-40%), но доля плотных колоний (ДП) также меньше нормы (40-50%)), дополнительно было проведено измерение доли смешанных колоний (ДС), которое составило 36%, и был рассчитан показатель пролиферации (ПП), равный 2,06.
На основании полученных данных было сделано следующее заключение о состоянии популяции фибробластов в коже пациентки:
ЭКО-ф - практически равен среднему уровню, что указывает на нормальный регенераторный потенциал фибробластов кожи пациентки;
[ПП] - свидетельствует о высоком пролиферативном потенциале популяции дермальных фибробла-
стов.
На основании анализа полученных данных для пациентки была разработана индивидуальная программа коррекции дефектов кожи, включающая применение фракционного фототермолиза кожи всего лица (согласно инструкции), через 6 месяцев - курс аутологичных дермальных фибробластов для коррекции морщин в параорбитальной области и области носогубных складок.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет проводить оценку состояния популяции фиб-робластов дермы пациента путем определения объективных количественных параметров, характеризующих регенераторный и пролиферативный потенциалы данных клеток.
Предлагаемый способ позволяет получить уникальные данные, которые могут быть полезны для определения причины осложнений, вызванных неконтролируемым применением тех или иных космето-логических методов, путем оценки состояния популяции фибробластов кожи пациента. Данный способ может стать незаменимым для прогнозирования потенциальных осложнений при использовании различ
ных косметологических методов и процедур, а также стать полезным инструментом как для понимания процессов, развивающихся в коже при тех или иных осложнениях, так и для разработки индивидуальной программы коррекции возрастных изменений кожи у каждого пациента.
При проведении описанного алгоритма анализа клеточных колоний, учитывая сложность расчетов и необходимость получения объективных параметров оценки состояния ткани (и органа), в рамках данного изобретения предлагается реализация компьютерной системы (КС) по сбору, обработке и анализу информации, полученной в ходе выполнения данного анализа. Для осуществления различных вариантов способов диагностики предусмотрено использование компьютерных систем различной конфигурации. Детальное изображение КС представлено на фиг. 8.
КС включает канал передачи информации (шину) 1202 или иной механизм передачи информации и процессор 1203, соединенный с шиной для обработки информации. КС 1201 также включает блок основной памяти 1204 на базе блоков оперативной памяти типа (RAM) или иных устройств динамического хранение информации (например, DRAM) или блоков статической памяти типа SRAM или блоков синхронной динамической памяти типа SDRAM, соединенных с шиной 1202 для хранения оперативной информации и инструкций для работы ЦПУ 1203. Кроме того, устройство основной памяти может быть использовано для хранения временных значений переменных или иной временной информации во время выполнения инструкций процессором 1203. Далее КС включает постоянное запоминающее устройство (ROM) 1205 или иное устройство постоянного хранения информации (например, программируемое постоянное запоминающее устройство (PROM), стираемое программируемое постоянное запоминающее устройство (EPROM) или электрически стираемое программируемое постоянное запоминающее устройство (EEPROM), соединенные с шиной 1202 для хранения постоянной информации и инструкций для
ЦПУ 1203.
Кроме того, КС 1201 также включает контроллер жесткого диска 1206, соединенный с шиной 1202 для управления одним или несколькими устройствами хранения программ и инструкций для выполнения способа для определения среднего значения. В качестве таких устройств могут быть магнитный жесткий диск 1207 и съемные носители информации 1208 (например, дисковод флоппи-дисков, читающий дисковод CD и DVD дисков, пишущий/читающий дисковод CD и DVD, магнитооптический дисковод и т.д.). Также устройства хранения информации могут быть подсоединены к КС 1201 через соответствующий интерфейс (например, интерфейсы SCSI, IDE, EIDE, SATA, eSATA), устройства прямого доступа к памяти DMA или ultra-DMA.
Таким образом, блок основной памяти 1204 и/или устройства хранения информации могут быть использованы для хранения средних (нормальных) значений или для временного хранения полученных величин, или в качестве средства поиска, запрограммированного на нахождение и извлечение средних величин из базы данных или постоянной памяти с целью проведения их сравнения с полученными величинами.
Кроме того, КС 1201 может также включать специализированные логические устройства (например, специализированные интегральные микросхемы (ASIC) или простейшие (SPLD) или сложные (CPLD) микросхемы программируемой логики или программируемая логическая матрица типа FPGA.
В целях более тесной интеграции всех функций предлагаемого устройства оное также может комплектоваться Блоком Формирования Изображения 1211 (БФИ), управляемого контроллером 1210. Блок БФИ 1211 может функционировать на базе любых устройств получения цифрового изображения, обеспечивающих оптическое разрешение не хуже 800dpi, более предпочтительно - не хуже 1200 dpi. В качестве таких устройств могут выступать, например, электронные устройства для считывания двумерного (плоского) изображения и представления его в растровой электронной форме (сканеры), или цифровые устройства на основе технологии переноса заряда (ПЗС-матрицы - прибора с зарядовой связью), например, цифровые видео- и фотокамеры. Основной функцией блока БФИ 1211 является получение цифрового изображения клеточных колоний, получаемых в соответствии с описанием данного изобретения, и передача его в цифровом виде при помощи контроллера 1210 и шины 1202 для дальнейшей обработки процессором 1203 и/или для хранения в базе данных на жестком диске 1207.
Также КС 1201 может включать контроллер дисплея 1209, соединенный с шиной 1202 и служащий для управления работой дисплея, например, на основе электронно-лучевой трубки (CRT) или светодиодной технологии (LED), для отображения информации для пользователя КС. Также КС включает устройство ввода информации, например клавиатуру, и координатно-указательное устройство для осуществления взаимодействия с пользователем и сообщения информации процессору 1203. Координатно-указательным устройством может быть компьютерная мышь, трек-бол или стилус. Кроме того, КС может комплектоваться печатным устройством для вывода информации и данных, хранящихся и/или получаемых в результате действия КС 1201.
КС 1201 производит часть или все этапы вычислений, предусмотренные данным изобретением при получении и выполнении ЦП 1203 одной или нескольких последовательностей инструкций, содержащихся в памяти, например в основной памяти системы 1204 для оценки параметров, характеризующих по крайней мере одну колонию клеток фибробластов кожи человека. Такие инструкции могут быть считаны в основную память 1204 с другого устройства, такого как жесткий диск 1207 или сменною носителя
информации 1208.
Кроме того, ЦП 1203 может включать
первый вычислительный блок, запрограммированный на определение: (1) эффективности колоние-образования как параметра, характеризующего регенераторный потенциал клеток данного пациента, и (2) доли плотных и диффузных колоний в клеточной культуре как параметр, характеризующий пролифе-ративный потенциал клеток данного пациента;
компаратор (сравнивающее устройство) для проведения сравнения полученных для данного пациента значений эффективности колониеобразования и доли плотных и диффузных колоний со средними значениями величин эффективности колониеобразования и доли плотных и диффузных колоний для всей популяции, и
второй вычислительный блок, запрограммированный определять:
(а) является ли полученное значение регенераторного потенциала данного пациента низким, нор-
мальным или высоким по сравнению со средним значением регенераторного потенциала всей популя-
ции, и
(б) является ли пролиферативный потенциал данного пациента низким, нормальным или высоким в
сравнении с средним значением пролиферативного потенциал для всей популяции.
Кроме того, КС для проведения диагностики состояния кожи пациента может включать
ЦП, запрограммированный проводить оценку параметров, характеризующих по крайней мере одну колонию фибробластов кожи данного пациента, и содержащий
первый вычислительный блок, запрограммированный определять: (1) эффективность колониеобра-зования в качестве параметра, характеризующего регенераторный потенциал клеток данного пациента, и (2) долю плотных и диффузных колоний в культуре клеток в качестве параметра, характеризующего пролиферативный потенциал клеток данного пациента;
компаратор (сравнивающее устройство) для проведения сравнения полученных для данного пациента значений эффективности колониеобразования и доли плотных и диффузных колоний со средними значениями величин эффективности колониеобразования и доли плотных и диффузных колоний для всей популяции, и
второй вычислительный блок, запрограммированный определять:
(а) является ли полученное значение регенераторного потенциала данного пациента низким, нор-
мальным или высоким по сравнению со средним значением регенераторного потенциала всей популя-
ции, и
(б) является ли пролиферативный потенциал данного пациента низким, нормальным или высоким в
сравнении с средним значением пролиферативного потенциал для всей популяции.
Для обработки последовательности инструкций из основной памяти 1204 может быть использован один или несколько процессоров в мультипроцессорной конфигурации КС. Согласно другому варианту изобретения вместо или совместно с программными инструкциями возможно выполнение также инструкций, поступающих по средствам проводной связи. Таким образом, варианты реализации данного изобретения не исчерпываются какой-либо комбинацией аппаратных устройств и программного обеспечения.
КС 1201 также включает коммуникационный интерфейс 1213, соединенный с шиной 1202. Данный интерфейс осуществляет двусторонний обмен данными через сетевое соединение 1214, которое может быть соединено, например, с локальной вычислительной сетью (LAN) 1215 или любой другой коммуникационной сетью 1216, например Интернет.
Примером коммуникационного интерфейса 1212 может выступать сетевая карта для подключения к LAN с пакетной коммуникацией, карта асимметричной цифровой абонентской линии (ADSL), карта цифровой сети с интегрированным обслуживанием (ISDN) или модем для обеспечения коммуникации с соответствующими коммуникационными каналами.
Сетевое соединение 1213 осуществляет передачу данных через одну или несколько коммуникационных сетей к другим устройствам. Например, сетевое соединение 1213 может осуществлять соединение с другим компьютером через локальную сеть 1214 (например, LAN) или через устройство, которым управляет поставщик услуги, обеспечивающий предоставление услуг через коммуникационную сеть 1215. Таким образом, КС 1201 может осуществлять передачу и прием данных через сети 1214 и 1215, сетевое соединение 1213 и сетевой интерфейс 1212. Кроме того, сетевое соединение 2113 может также осуществлять соединение через LAN 1214 с мобильным устройством 1216, например карманным компьютером, ноутбуком или коммуникатором.
Компьютерная система снабжена программным обеспечением (ПО), которое может храниться на одном или нескольких устройствах хранения/передачи информации. Такое ПО осуществляет функции управления КС 1201, другими устройствами, предусмотренными данным изобретением, а также предоставляет возможность взаимодействия КС 1201 с пользователем. Кроме того, ПО может включать, например, драйверы устройств, оперативную систему, средства разработки ПО и специализированные программные продукты.
ПО согласно данному изобретению может включать любые интерпретируемые или исполняемые
машинные коды, включая, например, скрипты, динамически подключаемые библиотеки (DLL), скрипты на языке Java и полные исполняемые программы. В частности, одной из главных функций ПО является управление всеми стадиями проведения клонального анализа и последующего формирования диагноза/заключения, согласно алгоритма, представленного на фиг. 9.
В соответствии с предлагаемым алгоритмом ПО выполняет следующую последовательность действий, которые могут быть выполнены отдельными программными модулями.
1. Формирование цифрового изображения колонии (1). ПО осуществляет контроль над проведением стандартных функций по формированию цифрового изображения колоний, например включающих включение устройства (сканера), прогрев устройства, предварительное сканирование, финальное сканирование выбранного фрагмента, пересылка цифрового изображения для его дальнейшей обработки. В результате выполнения данной операции формируется электронное изображение колоний, которое передается в КС для дальнейшей обработки.
2. Вычитание фонового сигнала (3). Является первой стадией математической обработки изображения с целью удаления фонового сигнала для выравнивания (нормализации) разброса в интенсивности окрашивания колоний, полученных в разное время. Операция может быть выполнена с привлечением различных математических методов, в том числе метода "катящегося шарика" со значением радиуса не менее 50 пикселей или, более предпочтительно, методом "скользящего параболоида" с аналогичными.
3. Нахождение границ колоний (4). Основная цель данного этапа отделить пространство, занимаемое каждой из колоний, от остального не занятого колониями поля цифрового изображения. Такая операция может быть выполнена, например, при помощи известных методов нахождения границы между двумя разноокрашенными зонами и нахождения границ объектов. Хорошие результаты могут дать, например, применение операций фильтрования по методам Собела, Лапласа, Превита, Робертса и др. Для более достоверного и точного определения границ колоний могут быть использованы также специальные математические методы, например на основе фрактальной геометрии.
4. Удаление артефактов изображения (5). На данном этапе обработки изображения из него удаляются все артефакты, которые могут помешать правильному подсчету колоний и внести искажения как по количеству обнаруженных колоний, так и по их морфологическим и метрическим характеристикам. К артефактам такого рода могут относиться пятна высохшего красителя, неровности и знаки технологической маркировки на поверхности культурального пластика, пыль и другие загрязнения. Данная операция может быть выполнена путем удаления любого изображения, лежащего вне границ колоний, найденных на предыдущем этапе.
5. Подсчет колоний и вычисление их морфометрических характеристик (6). Целью данного этапа является получения основных характеристик клеточных колоний, необходимых для оценки пролифера-тивного и регенераторного потенциалов. Количество колоний определяют как число дискретных объектов, выявленных на предыдущих этапах обработки изображения. При этом при необходимости размер таких объектов может быть ограничен по таким параметрам, как площадь, периметр, квадратура и др. для учета только тех колоний, которые удовлетворяют заданному критерию отбора (например, размер, форма, плотность и т.д.).
6. Формирование отчета с результатами измерений (7). На данном этапе проводится формирование стандартного отчета на основании значений первичных параметров, полученных на предыдущем этапе. К числу таких первичных параметров относятся величины, полученные непосредственно в результате измерений, например количество колоний, площадь каждой из колоний, средняя оптическая плотность каждой из колоний и т.д. При необходимости на данном этапе также могут быть проведены необходимые вычисления производных величин, которые могут быть использованы для непосредственного вычисления параметров, характеризующих регенераторный и пролиферативный потенциалы. К числу таких производных параметров могут быть отнесены ЭКОф, удельная оптическая плотность каждой колонии и
т.д.
7. Сравнение полученных параметров с их нормальными значениями (8), хранящимися в БД (9). На данном этапе проводится сравнение полученных параметров с их нормальными значениями, хранящимися в памяти КС.
8. Формирование заключения и рекомендаций по лечению/профилактике (10). На данном этапе программа производит формирование заключения (11) или рекомендаций на основании результатов сравнения вычисленных параметров и их нормальных (средних) значений. Данная операция может быть осуществлена простым сопоставлением набора заранее сформулированных заключений (рекомендаций), хранящихся в постоянной памяти КС, с результатами сравнения параметров, выполненных на предыдущем этапе. Для проведения более гибкой и точной диагностики возможно также использование и более сложных логических операций, в том числе с применением технологий нейральных сетей и искусственного интеллекта.
Предлагаемый способ диагностики универсален и дает возможность оценить регенеративные способности исходной ткани (и органа) без проведения сложных и дорогостоящих инструментальных исследований путем клонального анализа любых субстрат-зависимых клеток организма человека. Способ позволяет получить объективную количественную характеристику как регенераторного, так и пролифе
ративного потенциалов данной ткани (и органа).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ определения регенераторного потенциала кожи пациента, включающий:
a) отбор образца кожи пациента;
b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях;
c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток;
d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации;
e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и протоколов;
f) анализ изображений колоний фибробластов с целью получения указанных ниже параметров, характеризующих рост и морфологические особенности клеточных культур, по которым определяют регенераторный потенциал кожи пациента,
при этом эффективность колониеобразования рассчитывают как процентное отношение образовавшихся колоний с числом клеток более 20 к общему количеству эксплантированных клеток, плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью > 46 отн.ед., а диффузные колонии <25 отн.ед., причём при значении эффективности колониеобразования ниже 45% для мужчин и ниже 36% для женщин определяют низкий регенераторный потенциал, при значении эффективности колониеобразования в интервале 45-49% для мужчин и 36-45% для женщин определяют нормальный регенераторный потенциал, а при значении эффективности колониеобразования выше 49% для мужчин и выше 45% для женщин определяют высокий регенераторный потенциал.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученные на стадии f) значения параметров обрабатывают с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.
3. Способ определения пролиферативного потенциала кожи пациента, включающий:
a) отбор образца кожи пациента;
b) выделение жизнеспособных субстрат-зависимых клеток фибробластов из образца кожи в стандартных условиях;
c) эксплантацию выделенных клеток фибробластов с плотностью, позволяющей получить колонии для статистически достоверного анализа, на поверхность культурального пластика с использованием классических методов культивирования клеток;
d) культивирование клеток фибробластов в стандартных условиях в течение контролируемого времени, достаточного для образования сформировавшихся дискретных клеточных колоний, пригодных для визуализации;
e) визуализацию образовавшихся колоний фибробластов с использованием стандартных средств и
f) определение показателя пролиферации по формуле
ПП=[1(ДД)+2(ДС)+3(ДП)]/100(%),
где ПП - показатель пролиферации; ДД - процентная доля диффузных колоний (%); ДС - процентная доля смешанных колоний (%); ДП - процентная доля плотных колоний (%), причем плотные колонии характеризуются средней оптической плотностью > 46 отн.ед., а диффузные колонии <25 отн.ед., при значении показателя пролиферации ниже 2,0 для мужчин и ниже 1,8 для женщин определяют низкий пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации в интервале равным 2,0-2,4 для мужчин и 1,8-2,0 для женщин определяют нормальный пролиферативный потенциал, при значении показателя пролиферации выше 2,4 для мужчин и выше 2,0 для женщин определяют высокий пролифератив-ный потенциал.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что полученные на стадии f) значения параметров обрабатывают с использованием средств вычислительной техники, статистического анализа и математического моделирования.
5. Компьютерная система, используемая в способе по пп.1-4, включающая блок формирования изображения, обеспечивающий оптическое разрешение не менее 800 dpi, блок центрального процессорного устройства, соединенного с блоком оперативной памяти и способного проводить обработку информации, получаемую либо непосредственно от блока формирования изображения, либо через блок ввода и вывода информации, при этом компьютерная система снабжена:
а) программным обеспечением для проведения статистически достоверного анализа колоний, определения параметров, характеризующих регенераторный потенциал и пролиферативный потенциал, обработки полученных параметров, позволяющей оценить регенерационную и пролиферативную способ
ность кожи пациента;
b) базой данных с хранящимися в ней нормальными значениями указанных в пп. 1 и 3 параметров, характеризующих регенераторный и пролиферативный потенциалы кожи человека.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027436
- 1 -
(19)
027436
- 1 -
(19)
027436
- 1 -
(19)
027436
- 4 -
027436
- 22 -