[RU]

1. Препарат, имеющий каталитическую активность АПФ2, содержащий фракцию рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека, где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, где димеры АПФ2 содержат две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, причем димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ , где фракция рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека составляет по меньшей мере 80%.

2. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что фракция рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека составляет по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%.

3. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что фракция полипептидов АПФ2 с трансмембранными доменами составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%, или отсутствует.

4. Препарат по любому из пп.1-3, характеризующийся тем, что фракция мультимеров АПФ2 составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%.

5. Препарат по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что доля мономеров АПФ2 составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%.

6. Препарат по любому из пп.1-5, характеризующийся тем, что димеры АПФ2 представлены в виде гомодимеров.

7. Препарат по любому из пп.1-6, характеризующийся тем, что каждый из димеров АПФ2 содержит 2 иона Zn ²⁺ .

8. Препарат по любому из пп.1-7, характеризующийся тем, что гликозильные группы мономеров полипептида АПФ2 содержат в сумме по меньшей мере 10 остатков сиаловой кислоты.

9. Препарат по любому из пп.1-8, характеризующийся тем, что на долю сахаридов в полипептидах АПФ2 приходится более чем 10 мас.%.

10. Препарат по п.9, характеризующийся тем, что на долю сахаридов в полипептидах АПФ2 приходится более чем 15 или более чем 20 мас.%.

11. Препарат по любому из пп.1-10, характеризующийся тем, что полипептид АПФ2 состоит из аминокислот 18-740 последовательности SEQ ID NO: 1.

12. Препарат по любому из пп.1-11, характеризующийся тем, что фракция полипептидов АПФ2 с определенной гель-электрофорезом молекулярной массой меньшей чем 100 кДа составляет меньше чем 20%.

13. Препарат по любому из пп.1-12, характеризующийся каталитической активностью, равной по меньшей мере 4 с ^-1 , по меньшей мере 5 с ^-1 , по меньшей мере 6 с ^-1 , по меньшей мере 7 с ^-1 , по меньшей мере 7,6 с ^-1 по конверсии Ang II (ангиотензина II) в Ang 1-7 (ангиотензин 1-7).

14. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2, содержащая препарат по любому из пп.1-13.

15. Применение препарата по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2.

16. Применение препарата по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

17. Применение препарата по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

18. Рекомбинантный, гликозилированный, растворимый, димерный, ферментативно активный полипептид АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ и где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2.

19. Полипептид АПФ2 по п.18 для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

20. Применение рекомбинантного, гликозилированного, растворимого, димерного, ферментативно активного полипептида АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ и где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

21. Применение по любому из пп.16, 17 или 20, где сердечная недостаточность представляет собой застойную, острую или хроническую сердечную недостаточность, а заболевание легких представлено хронической обструктивной болезнью легких, пневмонией, астмой, хроническим бронхитом, эмфиземой, муковисцидозом, интерстициальной легочной болезнью, легочной гипертонией, эмболией легких, саркоидозом легких, туберкулезом, отеком легких, острым повреждением легких (ОПЛ), острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) или раком легких.

22. Применение по любому из пп.16, 17, 20 или 21, где заболевание легких представляет собой ОПЛ или ОРДС.

23. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2, содержащая рекомбинантные, гликозилированные, растворимые, димерные, ферментативно активные полипептиды АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ , где фракция димеров АПФ2 среди всех полипептидов АПФ2 составляет по меньшей мере 80%, и фармацевтически приемлемый носитель.

(57) Реферат / Формула:

1. Препарат, имеющий каталитическую активность АПФ2, содержащий фракцию рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека, где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, где димеры АПФ2 содержат две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, причем димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ , где фракция рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека составляет по меньшей мере 80%.

2. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что фракция рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека составляет по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%.

3. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что фракция полипептидов АПФ2 с трансмембранными доменами составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%, или отсутствует.

4. Препарат по любому из пп.1-3, характеризующийся тем, что фракция мультимеров АПФ2 составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%.

5. Препарат по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что доля мономеров АПФ2 составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%.

6. Препарат по любому из пп.1-5, характеризующийся тем, что димеры АПФ2 представлены в виде гомодимеров.

7. Препарат по любому из пп.1-6, характеризующийся тем, что каждый из димеров АПФ2 содержит 2 иона Zn ²⁺ .

8. Препарат по любому из пп.1-7, характеризующийся тем, что гликозильные группы мономеров полипептида АПФ2 содержат в сумме по меньшей мере 10 остатков сиаловой кислоты.

9. Препарат по любому из пп.1-8, характеризующийся тем, что на долю сахаридов в полипептидах АПФ2 приходится более чем 10 мас.%.

10. Препарат по п.9, характеризующийся тем, что на долю сахаридов в полипептидах АПФ2 приходится более чем 15 или более чем 20 мас.%.

11. Препарат по любому из пп.1-10, характеризующийся тем, что полипептид АПФ2 состоит из аминокислот 18-740 последовательности SEQ ID NO: 1.

12. Препарат по любому из пп.1-11, характеризующийся тем, что фракция полипептидов АПФ2 с определенной гель-электрофорезом молекулярной массой меньшей чем 100 кДа составляет меньше чем 20%.

13. Препарат по любому из пп.1-12, характеризующийся каталитической активностью, равной по меньшей мере 4 с ^-1 , по меньшей мере 5 с ^-1 , по меньшей мере 6 с ^-1 , по меньшей мере 7 с ^-1 , по меньшей мере 7,6 с ^-1 по конверсии Ang II (ангиотензина II) в Ang 1-7 (ангиотензин 1-7).

14. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2, содержащая препарат по любому из пп.1-13.

15. Применение препарата по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2.

16. Применение препарата по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

17. Применение препарата по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

18. Рекомбинантный, гликозилированный, растворимый, димерный, ферментативно активный полипептид АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ и где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2.

19. Полипептид АПФ2 по п.18 для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

20. Применение рекомбинантного, гликозилированного, растворимого, димерного, ферментативно активного полипептида АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ и где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.

21. Применение по любому из пп.16, 17 или 20, где сердечная недостаточность представляет собой застойную, острую или хроническую сердечную недостаточность, а заболевание легких представлено хронической обструктивной болезнью легких, пневмонией, астмой, хроническим бронхитом, эмфиземой, муковисцидозом, интерстициальной легочной болезнью, легочной гипертонией, эмболией легких, саркоидозом легких, туберкулезом, отеком легких, острым повреждением легких (ОПЛ), острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) или раком легких.

22. Применение по любому из пп.16, 17, 20 или 21, где заболевание легких представляет собой ОПЛ или ОРДС.

23. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2, содержащая рекомбинантные, гликозилированные, растворимые, димерные, ферментативно активные полипептиды АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn ²⁺ , где фракция димеров АПФ2 среди всех полипептидов АПФ2 составляет по меньшей мере 80%, и фармацевтически приемлемый носитель.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
027399 (13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации
и выдачи патента: 2017.07.31
(51) Int. Cl. C12N 9/64 (2006.01) A61K38/48 (2006.01)
(21) Номер заявки:
(22) Дата подачи:
201000002
2008.06.12
(54) РЕКОМБИНАНТНЫЙ, ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЙ, РАСТВОРИМЫЙ, ДИМЕРНЫЙ, ФЕРМЕНТАТИВНО АКТИВНЫЙ ПОЛИПЕПТИД АПФ2 ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
(31) A913/2007; 08450052.9
(32) 2007.06.12; 2008.04.08
(33) AT; EP
(43) 2010.08.30
(86) PCT/AT2008/000211
(87) WO 2008/151347 2008.12.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
АПЕЙРОН БИОЛОДЖИКС ФОРШУНГС-УНД ЭНТВИКЛУНГСГЕЗЕЛЬШАФТ М.Б.Х. (AT)
(72) Изобретатель:
Шустер Манфред, Лойбнер Ханс, Янцек-Хавлат Эвелин, Пебаль Бернхард, Штраннер Штефан, Вагнер Беттина, Вайк
Роберт (AT)
(74) Представитель:
Фелицына С.Б. (RU)
(56) VINCENT M.J. ET AL.: "Chloroquine is a potent inhibitor
of SARS coronavirus infection and spread" VIROLOGY JOURNAL 20050822 GB, vol. 2, 22 August 2005 (2005-08-22), XP021010915 ISSN: 1743-422X 1743-422X figure 5 page 6 -page 7
WARNER FIONA J. ET AL.: "Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), but not ACE, is preferentially localized to the apical surface of polarized kidney cells". THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 25 NOV. 2005, vol. 280, no. 47, 25 November 2005 (2005-11-25), pages 39353-39362, XP002490917 ISSN: 0021-9258 figure 5 page 39355, left-hand column, page 39358, left-hand column
PEPTIDE AND PROTEIN-BASED THERAPEUTICS Pioneering New Frontiers January 7-9, 2008 - Hotel Del Coronado - San Diego, California Downloaded 30.07.2008 from http://www.infoshop-japan.com/conference/peptalk/pdf/peptideproteinbased.pdf page 11, Development of an ACE2 Enzyme Substitution Therapy XP002490920 abstract
KOST O.A. ET AL.: "New feature of angiotensin-converting enzyme: carbohydrate-recognizing domain". JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION: JMR 2000 NOV-DEC, vol. 13, no. 6, November 2000 (2000-11), pages 360369, XP002490918 ISSN: 0952-3499 table 1
PRABAKARAN P. ET AL.: "A model of the ACE2 structure and function as a SARS-CoV receptor" BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ACADEMIC PRESS INC. ORLANDO, FL, US, vol. 314, no. 1, 30 January 2004 (2004-01-30), pages 235-241, XP004483586 ISSN: 0006-291X figure 1 page 236, right-hand column
VICKERS CHAD ET AL.: "Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM,; US, vol. 277, no. 17, 26 April 2002 (2002-0426), pages 14838-14843, XP002464545 ISSN: 0021-9258 cited in the application the whole document
IMAI Y. ET AL.: "Angiotensin-converting enzyme 2 protects from severe acute lung failure" NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, LONDON, UK, vol. 436, no. 7047, 7 July 2005 (2005-07-07), pages 112-116, XP002349987 ISSN: 0028-0836 the whole document
TIPNIS ET AL.: "A human homolog of Angiotensin-converting enzyme" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM; US, vol. 275, no. 43, 27 October 2000 (2000-10-27), pages 33238-33243, XP002207551 ISSN: 0021-9258 the whole document
GUY J.L. ET AL.: "Membrane-associated zinc peptidase
families: comparing ACE and ACE2" BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA (BBA) - PROTEINS & PROTEOMICS,
ELSEVIER, vol. 1751, no. 1, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 2-8, XP004995171 ISSN: 1570-9639 the whole document
(57) Настоящее изобретение относится к области получения рекомбинантных белков и их использованию в медицине. Предлагается рекомбинантный растворимый полипептид АПФ2 человека, который димеризован. Димер АПФ2 содержит две гликозилированные мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn2+ и где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2. Кроме того, настоящее изобретение относится к препарату, где фракция димеров АПФ2 человека составляет более 80%, к фармацевтической композиции, содержащей данный димер АПФ2 или препарат, а также к их применению для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2. В частности, предлагаемое изобретение может использоваться для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области получения рекомбинантных белков.
Сведения о предшествующем уровне техники
Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ2) является ключевым ферментом ренин-ангеотензиновой системы. Как карбоксипептидаза он заякорен в мембране и экспрессируется как рецептор, главным образом, в клетках легких, почек и сердца, а также в эндотелиальных клетках, где и гидро-лизует различные пептидные субстраты. К основным представителям субстратов относятся ангиотензин II (Ang II), который гидролизуется до ангиотензина 1-7 (Ang 1-7); агиотензин I, который гидролизуется до ангиотензина 1-9; а также апелин и брадикинин. Ang II и Ang 1-7 являются антагонистами в ренин-ангеотензиновой системе. АПФ2, контролирующий соотношения пептидов, несет ответственность за регуляцию толщины сосудов и за проницаемость эндотелия, влияя, таким образом, на гомеостаз организма. Экспрессия АПФ2, в числе прочего, контролируется цитокинами и уменьшается при различных воспалительных заболеваниях, приводящих к патологическому повышению уровня Ang II, одного из наиболее важных субстратов АПФ2.
АПФ2 используется для лечения синдрома острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) или острого повреждения легких (ОПЛ), двух форм острой легочной недостаточности, ассоциирующейся с уменьшением экспрессии АПФ2 в легких. При этой терапии используется растворимый рекомбинантный человеческий АПФ2, который при систематическом введении становится быстро доступным по всему организму, надлежащим образом снижая повышенную концентрацию Ang II и производя, таким образом, Ang 1-7. Это компенсирует негативные эффекты повышенной концентрации Ang II. В этом случае желательно иметь доступный продукт, имеющий подходящий фармакологический профиль: соответственно, подходящая субстанция должна характеризоваться хорошим распространением по организму, фармакологически приемлемым временем полураспада, а также низкой иммуногенностью. В частности, продукт должен быть энзиматически активным, иметь хорошую растворимость, быть стабильным в растворе, воспроизводимо и экономично производиться с высокой степенью чистоты.
В работе Tipnis et al. (J. Biol. Chem. 275, (43) (2000): 33238-43) описывается выделение АПФ2 (который в данном случае упоминается как человеческий гомолог ангиотензин-превращающего фермента) и выделение его кДНК. Гликозилированный белковый мономер с молекулярной массой 120 кДа был получен путем продуцирования в клетках СНО. После дегликозилирования масса белка составляла 85 кДа.
Donoghue (Circ Res 87, (5) (2000): 1-9) описывает экспрессию в клетках СНО растворимого АПФ2; белок не был полностью гликозилирован и характеризовался как имеющий молекулярную массу примерно 90 кДа. Более того, в этом документе описано сравнение последовательностей различных последовательностей АПФ2 и антител против АПФ2.
В WO 2004/023270 А2 описана кристаллизация АПФ2 после экспрессии мономера АПФ2 в клетках насекомых Sf9. Молекулярная масса белка была определена равной 89,6 кДа по масс-спектрометрическому анализу.
Терапевтическому действию эффективной ферментной замещающей терапии требуется производственный процесс, способный экономично и воспроизводимо давать очень чистый, фармакологически эффективный продукт. Растворимая внеклеточная фракция АПФ2 содержит 7 сайтов для N-гликозилирования. Негликозилированный АПФ2 обладает ведущей к агрегации слабой растворимостью, является более иммуногенным и имеет более короткий период полужизни. К тому же он имеет меньший гидродинамический диаметр, что плохо сказывается на его очистке. Таким образом, одной целью настоящего изобретения является получение высокоактивного АПФ2 с хорошим периодом полужизни in vivo. Эта цель достигается объектом формулы изобретения.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному гликозилированному полипептиду АПФ2 человека, сохранившего свою ферментативную активность, который существует в виде растворимого димера. Димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалетно, где ди-меризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn2+, и в котором АПФ2 представлен своей внеклеточной частью. Предпочтительно группы гликозилирования присутствуют в общем количестве по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15 или по меньшей мере 16 остатков сиалиловой кислоты, предпочтительно по меньшей мере 14 остатков сиалиловой кислоты на мономерную единицу димера. Предпочтительно димер является гомодимером, а именно его мономерные единицы имеют идентичные последовательность и гликозилирование. Все предпочтительные типы гликозилирования, процитированные здесь, применимы как к димеру, так и к одному или обоим мономерам димерного комплекса.Термин "остатки сиаловой кислоты" означает, в частности, остатки производных группы N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), особенно N- или О-гликозилирования.
По сути, стабильность средства для лечения больных является очень важным критерием при рассмотрении периода полужизни и, таким образом, эффективности.
Рекомбинантный человеческий АПФ2 до недавних пор идентифицировался исключительно как мономер и как таковой описывался в литературе в отношении его функциональности, кристаллической структуры, а также его взаимодействия с высокоспецифичным ингибитором.
Так, к примеру, Towler et al. (J. Biol. Chem. 279(17), 2004: 17996-18007) ссылаясь на Vickers et al. (J. Biol. Chem. 277 (17), 2002: 14838-14843), описывают экспрессию АПФ2 в клетках насекомых Sf9. Белок был получен в виде мономера после проведенной в качестве последнего этапа очистки гель-фильтрации. Молекулярная масса мономера составляла 89,6 кДа.
Коммерчески доступный АПФ2 (R &D Systems, каталожный номер 933-ZN, номер партии FIU035071) также является мономерной формой и производится способом, упомянутым в работе Tipnis et al. (2000, выше). Отличие состоит в том, что система экспрессии основана на клетках NSO, а не на клетках СНО. Были описаны мономеры, у которых молекулярная масса равна 120 кДа как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях.
Согласно Donoghue et al. (Circ Res 87, 2000: e1-e9) мономеры АПФ2 экспрессировали в клетках СНО мономеры АПФ2, которые после секреции имеют молекулярную массу 90 кДа.
Все процитированные здесь документы и публикации включены посредством отсылки.
В целях стабилизации терапевтического средства по изобретению в соответствии с изобретением был разработан способ, который исключительно производит стабильные димеры АПФ2, обладающие преимуществами по сравнению с мономерами АПФ2 в плане и производственных, и фармакологических достоинств.
Димеризация имеет следующие преимущества:
лучшая растворимость и биодоступность в физиологических растворах: димер имеет высокую растворимость и более длительные периоды полужизни и доступности in vivo;
нет образования агрегатов: димер АПФ2 формирует стабильные комплексы без добавления в димер дополнительных молекул АПФ2;
пониженное повреждение протеазами: поскольку индивидуальные участки белка, а также, скорее всего, и С-концевая часть, ориентированы к внутренней области димера, то С-конец не подвергается деградации;
более длительный период полужизни: пониженная иммуногенность, улучшенная растворимость и уменьшенная восприимчивость к протеолитической деградации увеличивают период полужизни белка;
упрощенная очистка белка: гидродинамический диаметр димера АПФ2 выше ожидаемого из-за его структуры и выраженной сольватной оболочки. Таким образом, с помощью гель-фильтрационных колонок димеры АПФ2 могут быть быстро отделены от обычных, являющихся результатом экспрессии белка, примесей, например от сывороточного альбумина (67 кДа).
Предпочтительно, если рекомбинантный полипептид АПФ2 гликозилируется по меньшей мере в 80% возможных сайтов N-гликозилирования и имеет долю сахаридов больше чем 10% (% от общей массы АПФ2) или 11, 12, 13, 14%, предпочтительно больше чем 15 или 16, 17, 18, 19%, в особенности больше чем 20 или 21, 22, 23, 24 или 25%.
Был разработан способ получения, который позволяет воспроизводимо получать очень чистый, эн-зиматически активный, высококомплексный гликозилированный АПФ2. Продукт характеризуется большой долей сахаридов (> 20 мас.%) и сложными, сильно разветвленными, частично отрицательно заряженными сахаридными структурами. Это оказывает позитивный эффект на растворимость, биодоступность, энзиматическую активность, а также на фармакологические свойства продукта. Подобрав подходящую экспрессирующую конструкцию, подходящего для экспрессии реципиента-хозяина, оптимизированную селекционную стратегию, с помощью специально приспособленной для клеточного метаболизма среды, а также выполнив тщательный сопутствующий анализ клонов и селекцию, становится возможным получить клеточную линию, секретирующую желаемый продукт.
АПФ2 уже был экспрессирован в клетках насекомых Sf9 и мышиных клетках NSO. Прежде всего материал использовался в исследованиях in vitro. Существуют также данные о результатах временной экспрессии АПФ2 в клетках СНО. До сих пор не было получено клеточных линий с подходящей высокой продуктивностью. Кроме того, еще не проводилась соответствующая селекция в отношении свойств продукта, особенно в отношении N-гликозилирования.
Растворимость белка определяется не только аминокислотной последовательностью, но и его укладкой, а также посттрансляционными модификациями. Заряженные сахаридные структуры являются основной причиной улучшения растворимости и оказывают основное влияние на фармакологический профиль. Так, для эритропоэтина было показано, что присутствие сложных, разветвленных гликострук-тур оказывает положительный эффект на период полужизни этого белка.
В принципе, для рекомбинантной экспрессии АПФ2 могут рассматриваться различные экспресси-рующие системы; но в виду отсутствия процессирования сайтов N-гликозилирования прокариотические клетки-хозяева далее не тестировались.
Предпочтительно, если по меньшей мере 70% гликозилированных сайтов N-гликозилирования независимо друг от друга представляют собой структуру, выбранную из формул с 1 по 8
Man " Xyl
Gal О К ; и 5 А с ф
Предпочтительно, если все возможные сайты для N-гликозилирования гликозилированы.
Предпочтительно, если по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, в особенности 100% гликозилированных сайтов для N-гликозилирования имеют структуру по формулам 1-8.
Предпочтительно, если одна мономерная единица димера АПФ2 имеет молекулярную массу равную по меньшей мере 90 кДа, предпочтительно по меньшей мере 92 кДа, в особенности по меньшей мере 96 кДа, крайне предпочтительно по меньшей мере 98 кДа, наиболее предпочтительно по меньшей мере 100, 100,5, 101, 101,5 или по меньшей мере 102 кДа. Абсолютная молекулярная масса (например, пептида в чистом виде без гидратной оболочки) может быть определена пептидным картированием. Более вы-сокогликозилированные формы также могут иметь молекулярные массы равные по меньшей мере 103, 104, 105, 106, 107 или 108 кДа.
Определения молекулярной массы (на которые влияют дополнительные факторы, такие как гидрат-ная оболочка, такие как хроматография или гель-электрофорез в водных системах) могут также дать более высокие результаты. В дальнейших воплощениях мономерная единица димера АПФ2 имеет относительную молекулярную массу, определенную гель-электрофорезом, равную по меньшей мере 101 кДа, или по меньшей мере 102 кДа, предпочтительно по меньшей мере 105 кДа, особенно предпочтительно по меньшей мере 109 кДа, в особенности по меньшей мере 113 кДа и крайне предпочтительно по меньшей мере 117 кДа, наиболее предпочтительно по меньшей мере 119 кДа.
В других воплощениях молекулярная масса мономера (относительная или абсолютная) составляет максимум 102, 103, 104, 108, 110, 112, 116, 120, 125, 130, 135 или 140 кДа. Более высокие молекулярные массы возможны за счет модификации АПФ2, например за счет ковалентного присоединения полиэти-ленгликоля.
Предпочтительно, если мономер (который не формирует димер) имеет молекулярную массу равную по меньшей мере 82 кДа, предпочтительно по меньшей мере 86 кДа, особенно предпочтительно по меньшей мере 98 кДа, наиболее предпочтительно по меньшей мере 101 кДа или максимум 112 кДа. Эти молекулярные массы могут быть определены, например, с помощью метода пептидного картирования.
Предпочтительно, если полипептид АПФ2 не имеет трансмембранных доменов, и является, таким образом, растворимой формой АПФ2. Особенно предпочтительные воплощения, таким образом, содержат полипептиды растворимой формы АПФ2, полипептидные цепи которой состоят из аминокислот 18740 или из ее энзиматически активных фрагментов. Еще один полипептид состоит из аминокислот 18615 последовательности SEQ ID NO: 1.
Хотя предпочтительным для большинства терапевтических применений является человеческий АПФ2 (SEQ ID NO: 1), также может использоваться АПФ2 других млекопитающих, например мыши, крысы, хомяка, свиньи, приматов или крупного рогатого скота. АПФ2 является универсальным ферментом у всех млекопитающих, обладающих субстратом Ang II, который идентичен у различных видов. Следовательно, в принципе, АПФ2 также может использоваться и в чужеродных организмах. Таким образом, по изобретению белок может быть использован вне зависимости от источника АПФ2, например из людей, мышей, крыс, хомяков, свиней, приматов и крупного рогатого скота. Однако в предпочтительных воплощениях источник АПФ2 и подвергающийся лечению организм одинаковы.
Предпочтительно, если серии (или С-концевая аминокислота) полипептида АПФ2, соответствующий Ser740 последовательности SEQ ID NO: 1 (например, С-конец), является О-гликозилированным.
Предпочтительно, если по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, особенно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно 100% гликозилированных сайтов для N
гликозилирования экспонируют сиаловую кислоту; предпочтительно, если сайты для N-гликозилирования, соответствующие Asn53, Asn90, Asn103, Asn322, Asn432, Asn546, Asn690 последовательности SEQ ID NO: 1, являются сиалированными.
В специфических воплощениях аспарагин, соответствующий Asn53 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тетрасиалированы.
В специфических воплощениях аспарагин, соответствующий Asn90 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тетрасиалированы.
В специфических воплощениях аспарагин, соответствующий Asn103 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тетрасиалированы.
В специфических воплощениях аспарагин, соответствующий Asn322 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тетрасиалированы.
В специфических воплощениях аспарагин, соответствующий Asn432 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тетрасиалированы.
В специфических воплощениях аспарагин, соответствующий Asn546 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тетрасиалированы.
В специфических воплощениях аспарагин, соответствующий Asn690 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тетрасиалированы.
В специфических воплощениях серин, соответствующий Ser740 последовательности SEQ ID NO: 1, является моно-, би-, три- или тетрасиалированным. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот моно-, би-, три- или тет-расиалированы.
Предпочтительно, если по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, особенно предпочтительно по меньшей мере 55% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 70% гликозили-рованных сайтов N-гликозилирования имеют по меньшей мере две сиаловых кислоты. Предпочтительно, если в одном препарате АПФ2 по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100% вышеупомянутых аминокислот являются, таким образом, сиалированными.
Предпочтительно, если аспарагин, соответствующий Asn53 последовательности SEQ ID NO: 1, N-гликозилирован предпочтительно гликаном, имеющим структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если аспарагин, соответствующий Asn90 последовательности SEQ ID NO: 1, N-гликозилирован предпочтительно гликаном, имеющим структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если аспарагин, соответствующий Asn103 последовательности SEQ ID NO: 1, N-гликозилирован предпочтительно гликаном, имеющим структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если аспарагин, соответствующий Asn322 последовательности SEQ ID NO: 1, N-гликозилирован предпочтительно гликаном, имеющим структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если аспарагин, соответствующий Asn432 последовательности SEQ ID NO: 1, N-гликозилирован предпочтительно гликаном, имеющим структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если аспарагин, соответствующий Asn546 последовательности SEQ ID NO: 1, N-гликозилирован предпочтительно гликаном, имеющим структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если аспарагин, соответствующий Asn690 последовательности SEQ ID NO: 1, N-гликозилирован предпочтительно гликаном, имеющим структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5,6,1 или 8.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к препарату рекомбинантных полипепти
дов АПФ2, содержащему полипептид, как определено здесь (димеры АПФ2), и в котором доля полипептидов АПФ2 с относительной молекулярной массой, определяемой гель-электрофюрезом, меньшей чем 100 кДа или меньшей чем 101 кДа, предпочтительно меньшей чем 104 кДа, крайне предпочтительно меньшей чем 108кДа, в особенности меньшей чем 112 кДа, особенно предпочтительно меньшей чем 117 кДа, наиболее предпочтительно меньшей чем 119 кДа, является меньшей чем 20%, предпочтительно меньшей чем 10%, особенно предпочтительно меньшей чем 5%, наиболее предпочтительно меньшей чем 1%, особенно 0% и любой их комбинации. Например, полипептиды АПФ2 с молекулярной массой меньшей чем 100 кДа могут присутствовать в количестве 0%, и полипептиды АПФ2 с молекулярной массой меньшей чем 100 кДа могут присутствовать в количестве меньшем чем 20%. Доля фракции берётся по отношению ко всем формам АПФ2 и это определяется, к примеру, нативным гель-электрофорезом.
Подобным образом, молекулярная масса может быть абсолютной молекулярной массой, которая может быть определена пептидным картированием. Таким образом, фракция полипептидов АПФ2 с молекулярной массой меньшей чем 86 кДа или меньшей чем 89 кДа, предпочтительно меньшей чем 92 кДа, крайне предпочтительно меньшей чем 94 кДа, в особенности меньшей чем 97 кДа, особенно предпочтительно меньшей чем 100 кДа и наиболее предпочтительно меньшей чем 101 кДа, составляет меньше чем 20%, предпочтительно меньше чем 10%, особенно предпочтительно меньше чем 5%, наиболее предпочтительно меньше чем 1% и особенно 0% и любой их комбинации. Например, полипептиды АПФ2 с молекулярной массой меньшей чем 86 кДа могут присутствовать в количестве 0%; и полипептиды АПФ2 с молекулярной массой меньшей чем 97 кДа могут присутствовать в количестве, меньшем чем 20%.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ с трансмембранными доменами составляет меньше чем 20%, предпочтительно меньше чем 10%, особенно предпочтительно меньше чем 5%, наиболее предпочтительно меньше чем 1%, особенно 0%.
Предпочтительно, если фракция мультимеров АПФ2 составляет меньше чем 20%, предпочтительно меньше чем 10%, особенно предпочтительно меньше чем 5%, наиболее предпочтительно меньше чем 1%, особенно 0%. Термин "мультимеры АПФ2" означает комплексы из 3 или более полипептидов АПФ2. Кроме того, в препарате димеров АПФ2 предпочтительно, если фракция мономеров АПФ2 составляет меньше чем 20%, предпочтительно меньше чем 10%, особенно предпочтительно меньше чем 5%, наиболее предпочтительно меньше чем 1%, особенно 0%. Кроме того, в препарате мономеров АПФ2 предпочтительно, если фракция димеров АПФ2 составляет меньше чем 20%, предпочтительно меньше чем 10%, особенно предпочтительно меньше чем 5%, наиболее предпочтительно меньше чем 1%, особенно 0%.
Предпочтительно, если фракция димеров АПФ2 среди молекул АПФ2 составляет по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 99%. В дополнительных воплощениях в сочетании с ними или независимо фракция мономеров АПФ2 среди молекул АПФ2 может составлять меньшей мере 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или по меньшей мере 99%.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с N-гликозилированным аспарагином, соответствующим Asn53 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше чем 60%, предпочтительно больше чем 70%, особенно предпочтительно больше чем 80%, крайне предпочтительно больше чем 90%, наиболее предпочтительно больше чем 99% и особенно 100% и предпочтительно содержащую гликан, имеющий структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с N-гликозилированным аспарагином, соответствующим Asn90 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше, чем 60%, предпочтительно, больше, чем 70%, особенно предпочтительно, больше, чем 80%, крайне предпочтительно, больше, чем 90%, наиболее предпочтительно, больше, чем 99%, и особенно 100%, и предпочтительно содержащую гликан, имеющий структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с N-гликозилированным аспарагином, соответствующим Asn103 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше чем 60%, предпочтительно больше чем 70%, особенно предпочтительно больше чем 80%, крайне предпочтительно больше чем 90%, наиболее предпочтительно больше чем 99% и особенно 100%, и предпочтительно содержащую гликан, имеющий структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с N-гликозилированным аспарагином, соответствующим Asn322 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше чем 60%, предпочтительно больше чем 70%, особенно предпочтительно больше чем 80%, крайне предпочтительно больше чем 90%, наиболее предпочтительно больше чем 99% и особенно 100%, и предпочтительно содержащую гликан, имеющий структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с N-гликозилированным аспарагином, соответствующим Asn432 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше чем 60%, предпочтительно больше чем 70%, особенно предпочтительно больше чем 80%, крайне предпочтительно больше чем 90%, наиболее предпочтительно больше чем 99%, и особенно 100%, и предпочтительно содержащую гликан, имеющий структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с N-гликозилированным аспарагином, соответствующим Asn546 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше чем 60%, предпочтительно
больше чем 70%, особенно предпочтительно больше чем 80%, крайне предпочтительно больше чем 90%, наиболее предпочтительно больше чем 99% и особенно 100% и предпочтительно содержащую гликан, имеющий структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с N-гликозилированным аспарагином, соответствующим Asn690 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше чем 60%, предпочтительно больше чем 70%, особенно предпочтительно больше чем 80%, крайне предпочтительно больше чем 90%, наиболее предпочтительно больше чем 99% и особенно 100%, и предпочтительно содержащую гликан, имеющий структуру в соответствии с формулами 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
Предпочтительно, если фракция полипептидов АПФ2 с О-гликозилированным серином, соответствующим Ser740 последовательности SEQ ID NO: 1, составляет больше чем 60%, предпочтительно больше чем 70%, особенно предпочтительно больше чем 80%, крайне предпочтительно больше чем 90%, наиболее предпочтительно больше чем 99% и особенно 100%.
Предпочтительно, если каталитическая активность полипептида или препарата АПФ2, Ccat, составляет по меньшей мере 4 с-1, предпочтительно по меньшей мере 5 с-1, особенно предпочтительно по меньшей мере 6 с-1, крайне предпочтительно по меньшей мере 7 с-1 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 7,6 с-1 по отношению к конверсии Ang 1-7 (ангиотензина 1-7). Ang 1-7 образуется из Ang II (ангиотензина II) посредством АПФ2. Конверсия может быть протестирована простым, описанным в примерах способом. Эта конверсия или каталитическая активность АПФ2 может также быть экстраполирована из данных других анализов. Активность может быть измерена, например, как описано в WO 2008/046125 А.
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу производства рекомбинантных полипептидов АПФ2 или препарата рекомбинантного АПФ2, включающего этапы введения полинуклео-тида, кодирующего АПФ2, предпочтительно полинуклеотида, кодирующего АПФ2 без трансмембранного домена, в эукариотические клетки; экспрессии полипептида АПФ2 и сбора экспрессированного АПФ2, особенно в димерной форме. Клетки могут быть отобраны в целях производства полипептида АПФ2 согласно изобретению, как описано здесь, в частности в целях производства полипептида большой молекулярной массой.
Предпочтительно, если полинуклеотид, кодирующий АПФ2, представлен в форме вектора.
Предпочтительно, если экспрессия АПФ2 отбирается вместе с маркёром, предпочтительно с геном DHFR. Предпочтительно, если маркер содержится в векторе.
Предпочтительно, если вектор имеет последовательность IRES для экспрессируемой мРНК АПФ2 (или кодирует это).
Предпочтительно, если эукариотические клетки являются клетками СНО.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному полипептиду АПФ2 или препарату рекомбинантного полипептида АПФ2, получаемых таким способом.
В дальнейшем аспекте изобретение дает стабильную эукариотическую клеточную линию (или клетку), содержащую трансфецированный, кодирующий АПФ2 полинуклеотид, предпочтительно дает клеточную линию СНО (или клетку), экспрессирующую АПФ2, в частности, как определено выше. Клеточная линия может быть отобрана с желаемыми свойствами, как указано выше, например, для производства димеров из мономерных единиц с молекулярной массой по меньшей мере 102 кДа.
Клетки предпочтительно имеют продуктивность АПФ2, равную по меньшей мере 10 пг/на клетку/в день, предпочтительно по меньшей мере 15 пг на клетку/день, особенно предпочтительно по меньшей мере 20 пг на клетку/день.
Экспрессия АПФ2 предпочтительно происходит в присутствии достаточного количества ионов Zn2+. Предпочтительно используется по меньшей мере 0,5 мкМ/л, в частности вплоть до 5 мкМ/л Zn2+; в частности, ферментация может проводиться при 2,5-3,5 мкМ/л Zn2+. Концентрация Zn2+ в питательной среде для экспрессирующих клеток, например, может быть равна по меньшей мере 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 2,25 или по меньшей мере 2,5 или 3,0 мкМ. Дальнейшие этапы обработки также предпочтительно проводятся в присутствии ионов Zn2+.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к медикаментам или фармацевтическим препаратам продукта АПФ2 в соответствии с изобретением, в частности для лечения или предотвращения высокого кровяного давления; сердечной недостаточности (таких типов как, застойная, острая и хроническая сердечная недостаточность), инфаркта миокарда или атеросклероза, отказа почек или почечной недостаточности, поликистоза почки или заболеваний легких, таких как хроническое обструктивное заболевание легких, пневмония, астма, хронический бронхит, эмфизема, муковисцидоз, интерстициальное заболевание легких, легочная гипертония, легочная эмболия, саркоидоз легких, туберкулез, отек легких, острое повреждение легких (ОПЛ), синдром острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) или рак легких. Общие лечебные указания для АПФ2 процитированы, например, в WO 2004/000367 А; продукт изобретения АПФ2 также подходит в этом случае.
В соответствии с изобретением могут быть предоставлены фармацевтическая композиция или медикамент, содержащий белок АПФ2. Такие композиции сами по себе могут быть фармацевтически допустимыми солями, с дополнительными буферами, тоническими компонентами или фармацевтически
допустимыми носителями. Вещества фармацевтических носителей служат для улучшения совместимости композиции и придают лучшую растворимость, а также лучшую биодоступность активных ингредиентов. Примерами являются эмульсификаторы, загустители, окислительно-восстановительные компоненты, крахмалы, спиртовые растворы, полиэтиленгликоль и жиры. Выбор подходящего фармацевтического носителя сильно зависит от способа введения. Для орального введения могут использоваться жидкие или твердые носители; для инъекций необходимы, в конечном счете, жидкие композиции.
Предпочтительно, если композиция АПФ2 в соответствии с изобретением содержит буферы или тонические вещества. Буфер может доводить рН медикамента до уровня физиологических условий и в дальнейшем может уменьшать или забуферивает вариации в уровне рН. Примером является фосфатный буфер. Тонические вещества могут устанавливать осмолярность и могут включать ионные вещества, такие как неорганические соли, например NaCl и KCl, или неионные вещества, такие как глицерин или углеводы.
Предпочтительно, если композиция или медикамент для использования в соответствии с изобретением соответствующим образом приготовлены для системного, местного, перорального, интраназально-го введения или в виде ингалируемого препарата. Эти формы введения композиции настоящего изобретения приводят к быстрому, несложному всасыванию препарата. Если композиция с АПФ2 предназначается для перорального применения, то она предпочтительно предоставляется в лекарственной форме, устойчивой к кислоте желудка, или предоставляется в инкапсулированном виде. Для перорального применения твердые или жидкие медикаменты могут быть использованы как есть или растворены или разведены, к примеру.
Медикамент для использования в соответствии с изобретением предпочтительно производится для внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрисосудистого, внутрибрюшинного и подкожного применения. Инъекции или внутривенные вливания, например, подходят для этих целей. У введения прямо в кровоток есть преимущество, состоящее в том, что активный ингредиент медикамента может быть доставлен по всему телу и быстро может быть достигнута целевая ткань.
Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано с помощью следующих неограничивающих фигур и примеров.
Перечень чертежей
Фиг. 1 - экспрессия АПФ2 и селекционная кассета;
фиг. 2 - специфичный к АПФ2 вестерн-блот анализ истории получения клонов; фиг. 3 - ДСН-ПААГ-анализ мономера АПФ2; фиг. 4 - отбор клонов;
фиг. 5 - анализ гликозилирования с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ/МС);
фиг. 6 - препаративная сортировка АПФ2 по размеру; фиг. 7 - фармакокинетика АПФ2 в 3 видах;
фиг. 8 - калибровочная кривая для количественной оценки Ang 1-7 и Ang II. Пептиды выделялись в установленном диапазоне концентраций с помощью обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонках Waters C18 ^Bondapak RP, 2.1x300 мм, 1 мкм, 125 А;
фиг. 9 - тандемный МС-спектр N-концевого пептида. Примечание: Q и K имеют одинаковую массу;
фиг. 10 - последовательность АПФ2 и прогнозирование N-гликозилирования;
фиг. 11 - детальный спектр гликозилирования для сайта 103 (А), сайта 432 (В), сайта 546 (С), сайта
690 (D), сайта 90 (Е);
фиг. 12 - спектр С-концевого О-гликозилированного пептида. Структурная интерпретация должна быть классифицирована как предварительная;
фиг. 13 - выделенные с помощью ЖХ/МС гликаны;
фиг. 14 - определение димерной структуры АПФ2 с помощью нативного ПААГ-электрофореза (слева, белковые полоски визуализированы окраской серебром) и с помощью гель-фильтрации (справа, разделение на колонках Zorbax G-450 в присутствии 220 мМ фосфата натрия при рН 7,0 в 10% ацетонит-риле, хроматограмма была зарегистрирована при 214 нм);
фиг. 15 - хроматограмма гель-фильтрации димера АПФ2 (время удерживания 8,55 мин, 8,93 мин). Стандарт: тиреоглобулин (670 кДа, 7,43 мин), гамма-глобулин (158 кДа), овальбумин (43 кДа, 10,08 мин), миоглобулин (17 кДа, 11,08 мин), витамин В12 (1,3 кДа, 12,71 мин);
фиг. 16 - специфичный к АПФ2 вестерн-блот анализ клеточных экстрактов из кортекса (А), мозга (В) и экспрессирующего димер АПФ2 клона (С). В D показан очищенный димер АПФ2;
фиг. 17 - аналитическая хроматограмма мономерной формы АПФ2, полученная с помощью ГФ с ВЭЖХ. Условия прогона: колонка: Zorbax GF250, буфер: 220 мМ Na2HPO4 + 10% CH3CN, рН 8.0 при скорости протекания через колонку 1 мл/мин;
фиг. 18 - ПААГ-анализ димеров АПФ2 (А) и мономеров АПФ2 (В); белки выявлены с помощью окраски серебром (а), и АПФ2-специфичного вестерн-блота (b);
фиг. 19 - определение энзиматической активности мономеров АПФ2 по сравнению с димерами АПФ2. Были использованы постоянная начальная концентрация флюоресцентно-меченого субстрата
кумарин-APK-DNP и четыре различных концентрации фермента. Соответствующие кривые флюоресценции были сравнены;
фиг. 20 - активность АПФ2 в сыворотке, измеренная через 24 и 48 ч после введения димера АПФ2 (2,5 мг/кг, голубые колонки) или после введения мономерной формы АПФ2 (2,5 мг/кг, серые колонки). Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Примеры
Пример 1. Экспрессия высокогликозилированного димера АПФ.
Растворимая фракция последовательности человеческого АПФ2 (SEQ ID NO: 1) была клонирована в экспрессирующий вектор, в который уже был добавлен амплифицированный селекционный маркёр ДГФР для усиленной экспрессии гена АПФ2. С этой целью между генами, кодирующими АПФ2 и ДГФР, был вставлен аттенуированный IRES, позволяющий би-цистронную транскрипцию АПФ2 и ДГФР на одной мРНК. Экспрессия АПФ2 и селекционная кассета показаны графически на фиг. 1. Т.к. оба белка экспрессируются под контролем одного промотора, экспрессия АПФ2 может быть намерено усилена посредством селекции по ДГФР с помощью антагониста МТХ (метотрексата). Эта стратегия может дать особенно стабильные экспрессирующие клеточные линии, которые дают высокий выход продукта с постоянным качеством. Это также означает, что разумные титры продукта могут также быть получены в клеточных линиях, менее приспособленных для рекомбинантной экспрессии специфического целевого белка.
Этот вектор был трансфецирован в клетки CHOdhfr и количество копий АПФ2 было аплифициро-вано под постоянно увеличивающимся давлением МТХ. Несколько циклов отбора и субклонирования были использованы для того, чтобы отобрать наилучшие продукты с оптимизированными свойствами с помощью внутриклеточного КСАФ-анализа (клеточный сортер с активацией флюоресценции, FACS), белково-химического и энзиматического анализов: в частности, для отбора наиболее подходящих клонов были приняты во внимание удельная энзиматическая активность, измеренная с 3 различными субстратами, гомогенность продукта, клеточная продуктивность, а также сложность сахаридов. На фиг. 2 показаны обобщенные результаты вестерн-блот анализа индивидуальных клонов из последовательных культу-ральных этапов, пройденных при получении продуктивной клеточной линии. Свойства продуктов индивидуальных клонов отличаются в том, что пропорция сахаридов в экспрессируемых продуктах увеличивается справа налево, что демонстрируется значительным увеличением массы. Такой результат был получен путем специфического отбора высокогликозилированных клонов. В конечном итоге один клон (клон 5В9), экспрессирующий продукт с наивысшей молекулярной массой, был использован для создания продуцирующей клеточной линии (184).
Было решено продолжить работу с 6 клонами, которые экспрессировали энзиматически высокоактивный и сложный N-гликозилированный АПФ2. Т.к. растворимый АПФ2 имеет молекулярную массу 83 кДа, то были отобраны клоны, которые имели молекулярную массу (зависящую от сахаридной структуры) в диапазоне до 129 кДа по результатам денатурирующего ДСН-ПААГ электрофореза. На фиг. 3 показаны АПФ2 (ряд В), полученный настоящим производственным способом, и для сравнения стандартный АПФ2, произведенный в NS0 (ряд А). Т.к. полипептид АПФ2 в соответствии с изобретением (проанализированный здесь в виде мономера) является гомогенным и высокогликозилированным, то он, таким образом, выявляется в виде одной полосы приблизительно в 120 кДа, тогда как полосы для контрольного материала выявляются в диапазоне от 83 до 120 кДа, демонстрируя крайне гетерогенное гли-козилирование.
Предварительные клоны были затем перенесены в безбелковую ростовую среду (Polumun). Эта коммерчески доступная среда является охарактеризованной по химическому составу, бессывороточной, свободной от животных белков и оптимизированной для рекомбинантной экспрессии гликопротеинов в СНО. Ферментация проводилась при концентрации Zn2+ 2,5-3,5 мкМ. Все 6 клонов содержались в культуре и тестировались на их пригодность к производственному процессу. В частности, были зафиксированы скорости роста и были проверены количества вырабатываемых продуктов и метаболитов (фиг. 4). Далее экспрессирующиеся продукты и клоны были тщательно проанализированы. Все клоны экспресси-ровали высокоактивный АПФ2 и имели продуктивность, равную 20-30 пг на клетку/в день. Далее были проанализированы структуры сахаридов и их гетерогенность. В итоге был отобран клон 1В4. В ходе всего процесса он демонстрировал гомогенную структуру сахаридов. Все 7 сайтов для N-гликозилирования были использованы и имели, по меньшей мере, дважды, но иногда даже трижды разветвленные сложные сахариды с концевыми сиаловыми кислотами.
На основе этого клона был получен и протестирован маточный банк клеток, и были созданы процесс очистки класса GMP и далее производственный процесс класса GMP.
SEQ ID NO: 1 (белковая последовательность АПФ2; аутологичная сигнальная последовательность (подчеркнута) отщепляется клеткой-хозяином для вывода из клетки)
MSSSSWLLLSLVAVTAA QSTtEEQAKTFLDKF^EAEDLFYQSSI^SWYNTNITEENVQNM> MAGDKWSAFLKE QSTbAQMYPLQEIQNLn^QLQALQQNGSSVLSEDKSKKLNTILNTMSTIYSTGKVCN PD№QECLLLEPGLNE1MANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMA RAШYEDYGDYWRGDYEWGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVIШCL MNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTWFGQKPNroVTDAMVDQAWDAQ mFKEAEKFPVSVGLPNMTQGFWENSMLTOPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRJLMCTK VTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGErMSLSAATPKHLKSI GLLSPDFQEDNETEWLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWWMWKGEIPKDQWMKKWW EMKRErVGVVEPWHDETYCDPASLFHVSNDYSFmYYTllTLYQFQFQEALCQAAKHEG PLHKCDISNSTEAGQKLFmiLIU.GKSEPWTLALENWGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWL KDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMR QYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRIND AFR-
LNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS
Димеризация АПФ2 направляет все гидрофобные участки белка во внутрь комплекса, вследствие чего заряженные остатки, такие как N-связанные сахаридные цепи, оказываются снаружи и сольватиру-ют структуру в заряженной физиологической среде. Вышеупомянутая димеризация экспрессией полностью N-гликозилированного АПФ2 наблюдалась в присутствии Zn2+. В этом случае димерный комплекс, состоящий из 2 идентичных субъединиц, электростатически связанных одна с другой, далее не разделялся в физиологических растворах. Это приводит к секреции гликопротеина с 14 сильнозаряженными структурами, содержащими сиаловую кислоту, на каждой молекуле АПФ2, т.е. с 28 содержащими сиало-вую кислоту структурами на димер. Два иона Zn2+ каждый раз встраиваются в комплекс и стабилизируют его структуру. Сильный заряд сахаридных цепей сольватирует молекулу в водных физиологических растворах и усиливает ассоциированные снаружи заряженные белковые домены. Производственный процесс создается так, чтобы в конечном продукте присутствовали только димеры АПФ2.
Это стало возможным в силу того факта, что при генерации АПФ2 присутствовали достаточные количества ионов Zn2+ (предпочтительно используется концентрация 1,5-5 мкМ Zn^/л; в частности ферментация могла проводиться при 2,5-3,5 мкМ Zn2+); последующие этапы обработки проводятся в присутствии ионов Zn2+.
Очистка проводиться с помощью этапов анионного обмена, преципитации с сульфатом аммония, этапа гидрофобной хроматографии, этапа катионного обмена и затем далее этапа анионного обмена с высоким разрешением. Все среды в процессе были забуферены фосфатным буфером и содержали хлорид натрия. Заключительным буфером для образца является физиологический раствор глицина для инъекций.
Пример 2. Свойства продукта.
Сложный высокогликозилированный мономер АПФ2 или мономерные единицы димера по причине ковалентно-связанных сахаридных структур обладают намного более высокой молекулярной массой, чем та, что вытекает из их аминокислотной последовательности. Таким образом, пептидное картирование дает молекулярную массу, равную 102 кДа, в то время как у негликозилированного АПФ2 она равна всего лишь 83 кДа. Доля сахаридов, соответственно, составляет 23% и является существенной для описанных ниже свойств продукта. Из-за сильной гидратации мономерные единицы выявляются на ДСН-ПААГ электрофорезе на уровне 120 кДа (фиг. 3) относительно эталонного образца.
Естественный мембраносвязанный АПФ2 не экспрессируется, экспрессируется только растворимая фракция АПФ2. В связи с потерей мембранного домена, АПФ2 является полностью гликозилированным.
Из-за сложных сильно сиалированных и, таким образом, сильно отрицательно заряженных саха-ридных структур, АПФ2 имеет более высокую растворимость по сравнению с негликозилированным или неполностью гликозилированным АПФ2. Таким образом, можно легко производить физиологически за-буференные, белковые лекарственные формы с концентрацией до 15 мг/мл.
Далее продукт является стабильным в растворе и при долгом хранении не теряет активности, не проявляет тенденцию к деградации или агрегации, за исключением стабильной димеризации. Дегликози-лированный АПФ2, с другой стороны, преципитирует даже в диапазоне низких концентраций. Это может быть продемонстрировано препаративным дегликозилированием с помощью фермента PNGaseF. Теоретический индекс стабильности, подсчитанный для АПФ2, равен 41,2 и классифицирует белок как нестабильный; однако сахаридные структуры при этих расчетах не рассматриваются. Однако поскольку лекарственные формы месяцами остаются стабильными, совершенно ясно, что это происходит из-за большой доли сахаридов. Лучшая сольватация АПФ2 также означает, что эта лекарственная форма со
стоит исключительно из димеров АПФ2 (или после искусственного разделения до мономеров исключительно из мономеров), в то время как негликозилированный АПФ2 имеет тенденцию к образованию мультимеров и агрегации.
Т.к. большая фракция заряженных углеводных остатков увеличивает гидродинамический диаметр, то и сольватационная оболочка настоящего препарата АПФ2 значительно увеличивается. Эта ситуация может быть использована для препаративной очистки АПФ2 колонками гель-фильтрации; т.к. белок, который присутствует исключительно в виде димера и имеет относительную молекулярную массу, равную 250 кДа, сравнивается с рассчитанной молекулярной массой, равной 83 кДа. Хроматограмма препаративной очистки АПФ2 показана на фиг. 6. АПФ2 (первый рисунок) элюируется со временем удержания, равным 69 мин. Это соответствует относительной молекулярной массе между тиреоглобулином (первый рисунок, 58 мин, 670 кДа) и гамма-глобулином (первый рисунок, 74 мин, 158 кДа). В этом высокомолекулярном участке практически нет контаминации культуральными остатками, так что очень чистый продукт может быть отделен с помощью очень простого разделительного этапа.
Пример 3. Фармакологические свойства продукта.
Препарат изобретения АПФ2 существует в физиологических буферах как стабильный, очень чистый и концентрированный раствор белка, который хранится и вводится без дополнительной стабилизации. Может быть использован, например, фосфатный буфер. АПФ2 стабилен в растворах в виде мономера или димера, а из-за большой доли сахаридов не агрегирует. Далее препарат АПФ2 полностью энзима-тически активен. По причине своей растворимости АПФ2 может быть введен внутривенно как болюс. По тем же причинам биодоступность препарата гарантируется немедленно сразу после введения.
Из-за большой доли сильноразветвленных, сложных сахаридов АПФ2 деградирует очень медленно. Это приводит к длительному, равному по меньшей мере 10,5 ч периоду полужизни, который может быть измерен в различных видах животных, в частности в макаке-резус. На фиг. 7 показано периоды полужизни, измеренные для АПФ2, введенного внутривенно животным 3 видов.
Высокое содержание сиаловых кислот также означает, что против АПФ2 не появится никакого нейтрализующего иммунного ответа. Последний был бы не только контрпродуктивен при экзогенном введении АПФ2, но также мог бы нейтрализовать аутологичный АПФ2, присутствующий в клетках.
Описанная лекарственная форма с АПФ2, вместе со всеми ассоциированными свойствами продукта, таким образом, обеспечивает эффективную терапию с помощью рекомбинантного человеческого
АПФ2.
Пример 4. Определение удельной активности АПФ2.
Удельная активность препаратов АПФ2 была определена измерением конверсии Ang II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Все измерения проводились трижды в 100 мкл аликвотах. Энзиматическая реакция начиналась добавлением раствора АПФ2 в концентрации 250 нг/мл к раствору Ang II в концентрации 80 мкМ в 50 мМ MES, 300 мМ NaCl, 10 мкМ ZnCl2, и 0,01% Brij-30 при рН 6.5. Образцы осторожно перемешивались и инкубировались при 37°С ровно 18 мин. Энзиматическая реакция останавливалась добавлением 100 мМ ЭДТА. Для анализа растворы разделялись с помощью обратнофазной ВЭЖХ (Waters C18 ^Bondapak 2.1(300 мм, 10 мкм, 125 А) линейным градиентом от 10 до 60% CH3CN в 0,08% Н3РО4 за 20 мин при скорости протекания через колонку 1 мл/мин. Далее в хроматограмме определялись и интегрировались пики Ang II и Ang 1-7. Концентрации пептидов определялись с помощью относительных калибровочных кривых, показанных на фиг. 8. Далее определялись энзиматическая конверсия и удельная энзиматическая активность.
Активность продукта АПФ2 определялась, как описано выше. В таблице показаны результаты интеграции пиков, а также вычисленные энзиматические показатели.
Энзиматические показатели и условия реакции Приведены средние значения троекратно повторенных измерений
Препарат АПФ2 имел каталитическую активность, Ccat, равную 8,0±0,3 с-1, измеренную по конверсии Ang II, и 8,8±0,2 с-1 по отношению к конверсии Ang 1-7. Оба значения хорошо соответствовали и были намного выше, чем данные, представленные Vickers et al. (J. Biol. Chem. 277, (17) (2002): 14838-43), которые опубликовали данные о каталитической активности, равной 3,5 с-1. Условия реакции были одинаковыми. Причина на 240% более высокой активности нашего препарата должна заключаться в посттрансляционных модификациях, в данном случае в N-гликозилировании, которое было менее выражено в материале, использованном Vickers. Этот материал был экспрессирован в клетках насекомых и хотя имел такую же аминокислотную последовательность, был гликозилирован в гораздо меньшей степени и
с гораздо меньшей степенью разветвленности. Более того, был проверен коммерчески доступный препарат АПФ2 фирмы R &D Systems (кат. номер 933-ZN), который также имел гораздо меньшую активность, Ccat, равную 2,0±0,1 с-1. Важным свойством препарата изобретения является особенно высокая энзима-тическая активность, которая стала возможной, главным образом, благодаря посттрансляционным модификациям.
Пример 5. Гликопротеомный анализ рекомбинантного АПФ2.
Образец очищенного экспрессированного в СНО АПФ2 был проанализирован двумя способами.
Во-первых, с помощью ДСН-ПААГ электрофореза и S-алкилирования были получены триптиче-ские пептиды, которые затем были проанализированы с помощью ЖХ-МС с ионизацией электрораспылением (и тандемной МС). Были обнаружены N-концевой пептид и несколько внутренних пептидов. Пять из семи потенциальных сайтов N-гликозилирования были найдены в гликозилированном виде, с гликановыми структурами, содержащими, главным образом, дважды разветвленные гликаны с фукозой и различными количествами сиаловой кислоты. С-концевой пептид являлся О-гликозилированным.
Во-вторых, свободные восстановленные N-гликаны были проанализированы с помощью углеродной ЖХ-МС с ионизацией электрораспылением. Для дважды разветвленных, бисиалированных гликанов с фукозой было показано, что фукоза имела гликозидные связи а1,6, а сиаловая кислота была а2,3-связанной. В дополнении к моно- и дисиалированным дважды разветвленным гликанам было обнаружено значительное количество трижды разветвленных олигосахаридов. По грубой оценке у гликозилиро-ванного АПФ2 с массой 101-102 кДа углеводы составляют примерно 17%.
Протеолитический гидролиз hBChE, выделенного с помощью ДСН-ПААГ электрофореза.
Аликвоты АПФ2 после ДСН-ПААГ электрофореза были обесцвечены, карбамидометилированы, гидролизованы с помощью трипсина для секвенирования и выделены из кусочков геля, как описано. Экстракты были высушены с помощью концентратора "Speed Vac" и восстановлены в воде, содержащей 0,1% муравьиную кислоту перед последующим ЖХ-МС анализом. Для сахаридного анализа пептиды были обработаны ферментом PNGase F, после чего гликаны были очищены с помощью ТФЭ картриджей
С18.
МС анализ триптических и гликольных пептидов.
Масс-спектрометрический анализ был проведен на приборе Q-TOF Ultima Global Instrument (фирмы Waters Micromass), оснащенном стандартным блоком для ионизации электрораспылением, системой Cap-LC (фирмы Waters Micromass) и 10-портовым модулем обмена сольвентов (фирмы Rheodyne), как описано ранее (Kolarich, 2006).
Образцы были проанализированы с помощью МС, а также тандемной МС. Анализ данных был проведен с помощью программного пакета MassLynx 4.0 SP4 (фирмы Waters Micromass). Анализ полученных из АПФ2 свободных N-гликанов.
Гликаны, восстановленные боргидридом, были разделены на колонке с пористым графитовым углеродом и проверены с помощью масс-спектрометрии. Пример 6. Анализ гликозилирования.
Для белковой последовательности АПФ2 были определены молекулярная масса, расположение всех сайтов гликозилирования, а также структура связанных сахаридов. Образец был проанализирован с помощью трипсинового гидролиза, S-алкилирования и ЖХ-МС с электрораспылением.
Определенная масса белка гликозилированного продукта составляла 102 кДа, а доля сахаридов составляла 23% от общей массы.
Было определено наличие N-концевого фрагмента и всех внутренних пептидов последовательности (см. информацию по последовательности).
Все заявленные сайты N-гликозилирования (позиции 53, 90, 103, 322, 432, 546 и 690) в действительности содержали дважды разветвленные, сложные, содержащие сиаловую кислоту фукозилирован-ные сахаридные структуры (фиг. 13).
С-концевой пептид был О-гликозилирован.
Структура этих углеводных остатков была определена углеродной ЖХ-МС с электрораспылением после гидролиза и восстановления. Каждая из всех дважды разветвленных структур содержала две а2,3-связанных сиаловых кислоты и одну а1,6-связанную фукозу. Также были обнаружены небольшие количества трижды разветвленных структур (фиг. 11). Выбранная стратегия отбора предполагала получение полностью гликозилированного, содержащего сиаловую кислоту, экспрессированного продукта.
Способ.
Приготовление образцов.
АПФ2 был разделен с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, обесцвечен, алкилирован и гидролизо-ван с помощью трипсина (Kolarich at al., Proteomics 6 (2006): 3369-3380). Экстракты из геля были высушены и растворены в 0,1% муравьиной кислоте перед ЖХ-МС анализом. Для анализа сахаридов пептиды были обработаны ферментом PNGase-F и очищены на ТФЭ-колонках С18.
Масс-спектрометрический анализ.
Все масс-спектрометрические анализы были проведены с помощью прибора Q-TOF Ultima Global
Instrument (фирмы Waters Micromass), оснащенном стандартным блоком для ионизации электрораспылением и системой Cap-LC (фирмы Waters Micromass) (Kolarich, 2006).
Образцы были сконцентрированы на предварительных колонках Aquasil C18 (30x0,32 мм, фирмы Thermo Electron) в воде. Была использована разделяющая колонка С18 (100x0,18 мм, фирмы Thermo Electron) с градиентом ацетонитрила. Образцы были проанализированы в режиме МС и тандемной МС.
Анализ свободных N-гликанов.
Восстановленные с помощью боргидрида гликаны были охарактеризованы на пористой графитовой колонке.
Пример 7. Димеризация рекомбинантного человеческого АПФ2.
АПФ2, произведенный в соответствии с примером 1, был получен в виде димера и как таковой анализировался в этом примере без разделения димеров. Нативная обработка означает, что димер остается интактным, в противоположность денатурирующему анализу (фиг. 3). Термин "димеризация АПФ2" означает, что все гидрофобные белковые участки направлены к внутренней части комплекса, вследствие чего заряженные остатки, такие как N-связанные сахаридные цепи, проецируются наружу и сольватиру-ют структуру в физиологической среде, которая также является заряженной. Эта димеризация при экспрессии полностью N-гликозилированного АПФ2 была достигнута в присутствии Zn2+. Димерный комплекс в этом случае содержит две идентичные субъединицы, которые электростатически связаны вместе и не разделяются далее в физиологических растворах. Все это приводит к секреции гликопротеина с 14 содержащими остатки сиаловой кислоты сильно заряженными структурами, на каждую молекулу АПФ2, т.е. с 28 структурами с сиаловой кислотой на димер. Каждый димер имеет два встроенных в комплекс атома Zn2+, которые стабилизируют структуру. Сильный заряд сахаридных цепей сольватирует молекулу в водных физиологических растворах и выталкивает ассоциированные заряженные белковые домены наружу. Производственный процесс спроектирован так, чтобы в конечном продукте присутствовали исключительно димеры АПФ2.
Это стало возможным благодаря тому, что при создании рекомбинантного АПФ2 присутствует достаточное количество ионов Zn2+ (предпочтительно используется 1,5-5 мкМ Zn^/л; в частности ферментация может быть проведена при концентрации 2,5-3,5 мкМ Zn2+) и благодаря тому, что другие этапы обработки также проводились в присутствии ионов Zn2+.
На фиг. 14 и 15 димеризация комплекса АПФ2 определена с помощью различных методов. В на-тивном полиакриламидном гель-электрофорезе, с последующей окраской серебром, белок был выявлен в виде одиночной полосы с массой, равной примерно 250 кДа. Гель-фильтрация на колонках Zorbax G-450 в присутствии 10% ацетонитрила в 220 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 7,0 также дает одиночный пик для продукта со временем удержания соответствующим молекулярной массе, равной примерно 250 кДа. Должно быть отмечено, что в обоих случаях, определялись исключительно димеризованные белки. Не наблюдалось ни мономерных структур, ни высокомолекулярных агрегатов.
Пример 8. Димеры АПФ2 - отличия от мембраносвязанного АПФ2.
У всех высших видов в качестве незаменимого фермента ренин-ангиотензиновой системы АПФ2 экспрессируется в виде трансмембранного белка, главным образом, в клетках почек, сердца, легких и печени. Мембраносвязанный АПФ2 в мембранном липидном бислое окружен в природе другими мембранными белками, которые стабилизируют АПФ2 в активной конформации, а также защищают внеклеточные домены АПФ2 от протеолитической деградации. В целях усиления фармакологических свойств растворимого АПФ2 и особенно в целях повышения активности и стабильности растворимого белка, экспрессионная и производственная стратегии отбирались так, чтобы получать исключительно стабильные димерные структуры АПФ2. Главным образом, за димеризацию фактически ответственны С-концевой домен белка и его пострансляционные модификации. В виду особого значения димерной структуры АПФ2, с помощью нативного ПААГ и специфичного к АПФ2 вестерн-блота была проанализирована структура мембраносвязанного АПФ2 (фиг. 16). На дорожках А и В показаны клеточные экстракты (кортекс и мозг), а на дорожке С показан клеточный экстракт продуцирующего димеры АПФ2 клона, полученного в соответствии с примером 1. В данном случае мембраносвязанный продукт имеет гораздо более низкую молекулярную массу по сравнению с продуктом экспрессии из примера 1 (С и D), хотя первый состоит только из внеклеточного фрагмента. Это говорит о том, что мембраносвязанный АПФ2 присутствует в виде мономера. С другой стороны, продукт экспрессии содержит димеры, которые придают продукту фармакологические преимущества. В дорожке D анализировался очищенный конечный продукт. Он имеет только одну полосу с молекулярной массой, равной примерно 240 кДа.
Пример 9. Улучшенные фармакологические свойства димеров АПФ2.
APN 01 обозначает физиологическую лекарственную форму белка АПФ2, которая состоит исключительно из димерных структур АПФ2. Два мономера АПФ2 в данном случае формируют нековалентно связанные комплексы. Молекулярные биологические конструкции, экспрессирующая клеточная линия, ферментативный процесс, очистка и буфер для хранения и применения выбраны или разработаны так, чтобы конечный продукт содержал только стабильные димеры АПФ2. Димер не агрегирует в большие комплексы, не диссоциирует до мономеров в физиологических условиях.
На фиг. 15 (хроматограмма аналитической гель-фильтрации с ВЭЖХ) APN 01 сравнивается со стандартом разделения по размеру (Bio-RAD GF-Standard, голубая кривая). Условия проведения анализа: колонка: Zorbax GF250, буфер: 220 мМ Na2HPO4 +10% CH3CN, рН 8,0 при скорости протекания через колонку 1 мл/мин). APN 01 элюировался в виде единственного пика через 8,6 мин, со временем удерживания между временем для тиреоглобулина (680 кДа, время удерживания 7,4 мин) и временем для бычьего гамма-глобулина (158 кДа, время удерживания 8,9 мин). Подсчитанная молекулярная масса этого комплекса составляет примерно 214 кДа. Это примерно соответствует ожидаемой молекулярной массе двух единиц АПФ2, по 102 кДа каждая.
Для целей сравнения в качестве стандартного образца в клетках СНО были получены мономеры АПФ2, которые также анализировались с помощью гель-фильтрации с ВЭЖХ. Их хроматограмма показана на фиг. 17. Мономерная форма элюируется со временем удержания, равным 9,0 мин, которое соответствует молекулярной массе, равной примерно 110 кДа. Оба продукта также сравнивались с помощью ПААГ-электрофореза (см. фиг. 18а). Если APN 01 (А) имеет белковую полосу с молекулярной массой примерно 240 кДа, то мономерная форма (В) выявлялась примерно на уровне 100 кДа. АПФ2-специфичный вестерн-блот доказал подлинность обоих продуктов, что можно увидеть на фиг. 1b.
Оба продукта демонстрировали одинаковую удельную ферментативную активность, измеренную с помощью теста активности, использующего флюоресцентномеченый субстрат. Как можно увидеть на фиг. 19, кривые для ферментов одинаковой концентрации в мономерной и димерной формах перекрывают друг друга.
В целях сравнения фармакологических свойств обоих продуктов оба препарата были введены мышам В1-6 внутрибрюшинно в виде болюсной инъекции 2,5 мг/кг и ферментативная активность АПФ2 в образцах сыворотки была измерена по истечении 24 и 48 ч (см. фиг. 20). Концентрация белка была скорректирована так, чтобы каждое животное получило 100 мкл физиологического белкового раствора. Каждый раз 7 животных обрабатывались препаратом APN 01 (димером АПФ2) и 5 животных - мономером АПФ2. Прямо перед введением АПФ2 не было зафиксировано никакой активности АПФ2 в любом из образцов сыворотки, а после введения системная активность АПФ2 была зафиксирована во всех случаях. Точно через 24 ч после введения обе группы значительно различались (t-тест, р <0,001): в то же время у животных, обработанных димером АПФ2, наблюдалась активность, соответствующая концентрации АПФ2, равной 0,9 мкг/мл, а у животных в группе, получавшей мономерный АПФ2, только у одного животного наблюдалась активность, соответствующая концентрации, равной 0,2 мкг/мл. Через 48 ч, если в группе, получавшей гомодимер АПФ2, еще наблюдалась остаточная активность, равная 0,2 мкг/мл, то в группе, получавшей мономер, не было отмечено никакой системной активности АПФ2. Эти данные показывают, что димерная форма АПФ2 обладает весьма значительным фармакологическим преимуществом.
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His lie Gin Tyr Asp Met Ala
370 / 375 380
Tyr Ala Ala Gin Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gxy Glu lie Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
4C'5 410 415
His Leu Lys Ser lie Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gin Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu lie Asn Phe Leu Leu Lys Gin Ala Leu Thr lie Val Gly
435 " 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu lie Pro Lys Asp Gin Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu lie Vr 1 Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
4'5 490 495
Tyr Cys Asp Pro АГа Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500" 505 510
lie Arg Tyr Tyr T^r Arg Thr Leu Tyr Gin Phe Gin Phe Gin Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gin Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp lie
530 535 540
Ser Asn Ser Thr G^.u Ala Gly Gin Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn V^.l Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Arp Gin Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gin Ser lie Lys Val Arg lie Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu GJy Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Srr Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gin Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gin Met lie Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys P::' j Arg 3le Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 ' 680 685
Lys Asn Val Ser As*b lie lie Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala lie
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg lie Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe L§u Gly lie Gin Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gin
7b5 730 735
Pro Pro Val Ser 740
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Препарат, имеющий каталитическую активность АПФ2,
содержащий фракцию рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных фермента-тивно активных полипептидов АПФ2 человека, где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2,
где димеры АПФ2 содержат две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, причем димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn2+,
где фракция рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека составляет по меньшей мере 80%.
2. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что фракция рекомбинантных, гликозилированных, растворимых, димерных ферментативно активных полипептидов АПФ2 человека составляет по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%.
3. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что фракция полипептидов АПФ2 с трансмембранными доменами составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%, или отсутствует.
4. Препарат по любому из пп.1-3, характеризующийся тем, что фракция мультимеров АПФ2 составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%.
5. Препарат по любому из пп.1-4, характеризующийся тем, что доля мономеров АПФ2 составляет меньше чем 10%, или меньше чем 5%, или меньше чем 1%.
6. Препарат по любому из пп.1-5, характеризующийся тем, что димеры АПФ2 представлены в виде гомодимеров.
7. Препарат по любому из пп.1-6, характеризующийся тем, что каждый из димеров АПФ2 содержит 2 иона Zn2+.
8. Препарат по любому из пп.1-7, характеризующийся тем, что гликозильные группы мономеров полипептида АПФ2 содержат в сумме по меньшей мере 10 остатков сиаловой кислоты.
9. Препарат по любому из пп.1-8, характеризующийся тем, что на долю сахаридов в полипептидах АПФ2 приходится более чем 10 мас.%.
10. Препарат по п.9, характеризующийся тем, что на долю сахаридов в полипептидах АПФ2 приходится более чем 15 или более чем 20 мас.%.
11. Препарат по любому из пп.1-10, характеризующийся тем, что полипептид АПФ2 состоит из аминокислот 18-740 последовательности SEQ ID NO: 1.
12. Препарат по любому из пп.1-11, характеризующийся тем, что фракция полипептидов АПФ2 с определенной гель-электрофорезом молекулярной массой меньшей чем 100 кДа составляет меньше чем
20%.
13. Препарат по любому из пп.1-12, характеризующийся каталитической активностью, равной по меньшей мере 4 с-1, по меньшей мере 5 с-1, по меньшей мере 6 с-1, по меньшей мере 7 с-1, по меньшей мере 7,6 с-1 по конверсии Ang II (ангиотензина II) в Ang 1-7 (ангиотензин 1-7).
14. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2, содержащая препарат по любому из пп.1-13.
15. Применение препарата по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2.
16. Применение препарата по любому из пп.1-13 для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.
17. Применение препарата по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.
18. Рекомбинантный, гликозилированный, растворимый, димерный, ферментативно активный полипептид АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn2+ и где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, для лечения или профилактики заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2.
19. Полипептид АПФ2 по п.18 для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистоз-ной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.
20. Применение рекомбинантного, гликозилированного, растворимого, димерного, ферментативно активного полипептида АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn2+ и где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, для получения лекарственного средства для лечения или профилактики высокого кровяного давления, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда или атеросклероза, почечной недостаточности, поликистозной болезни почек (PKD) или заболеваний легких.
21. Применение по любому из пп.16, 17 или 20, где сердечная недостаточность представляет собой застойную, острую или хроническую сердечную недостаточность, а заболевание легких представлено хронической обструктивной болезнью легких, пневмонией, астмой, хроническим бронхитом, эмфиземой, муковисцидозом, интерстициальной легочной болезнью, легочной гипертонией, эмболией легких, сар-коидозом легких, туберкулезом, отеком легких, острым повреждением легких (ОПЛ), острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС) или раком легких.
22. Применение по любому из пп.16, 17, 20 или 21, где заболевание легких представляет собой ОПЛ
или ОРДС.
23. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, связанных со снижением экспрессии АПФ2, содержащая рекомбинантные, гликозилированные, растворимые, димерные, ферментативно ак
23.
тивные полипептиды АПФ2 человека, где димер АПФ2 содержит две мономерные единицы АПФ2, которые связаны нековалентно, где АПФ2 представлен внеклеточной частью АПФ2, где димеризация АПФ2 происходит в присутствии ионов Zn2+, где фракция димеров АПФ2 среди всех полипептидов АПФ2 составляет по меньшей мере 80%, и фармацевтически приемлемый носитель.
Xhol Sail Xbal Not I
1 111
ACE-II IRES'at. DHFR
Фиг. 1
фармакодинамика rtiACE2
время, ч
Фиг. 7
последовательность длина:
EEYWLEMEM CLMBLLGDM KAVCHPTAND IGUSPD;
ASbFHVSHDI VRSUHYFEP CWILFGBEDV
EVGK(!LKPLY AYPSYISPIG SHLTDPGNVQ SAATPKHbKS
VPHDETYCDP EOTVGAKHMH MRQYFLKVKN LSPPNOPPVS
: натают IEEQAKTELD
QMYPLQEIOS LTVKLQLQAL 00HGSSV1SB
RLWAHESHRS
ишш
MIMTOfKM SEAVGEIMSL KBEIVGWEP GKSEPHTLAL YLFRSSVAYA SLEFLGIQPT
740
KFHHEAEDLF _DKSKRLHTIb ШЯПШС WatFKTHbYS LGKGCFRILM BHETEIllFLL SFIRYYTP.IL LFTHLKDQHK P.VAHLKFMS
Sequenz Sequenz
Sequenz Sequenz Sequeaz Sequenz
ПОЗИЦИЯ
потенциал
жюри-определение
H-eiyc результат
53 HITE
0.7657
(9/9)
+++
90 HLTV
0.7079
(9/9)
103 NGSS
0.7036
(9/9)
322 HMTQ
0.6642
(9/9)
43,2 ЫЕ1Е
(.7101
(7/9)
546 HSTE
0.4694
(5/9)
690 HVSD
0.5851
(7/9)
Фиг. 10
GlclMc 1
F if с ~ A
связи:
Man •
Sal 0
Xyl * NenSAc ¦
' 2
Фиг. 12
:20 D ' i" ' 4 ' " ' ' 91" ' ' " is" 14 ' it
минуты
Фиг. 14
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027399
- 1 -
027399
- 1 -
027399
- 1 -
027399
- 1 -
027399
- 2 -
027399
- 4 -
027399
- 14 -
027399
- 15 -
027399
- 18 -
027399
- 19 -
027399
- 20 -
027399
- 21 -
027399
- 22 -
027399
- 22 -
027399
- 23 -
027399
- 24 -