EA 027379B1 20170731

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000027379b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Композиция, содержащая: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, для применения в способе, включающем: (a) введение композиции в количестве, эффективном для обеспечения образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента; и/или (b) обеспечение образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента; и/или (c) введение пациенту композиции согласно протоколу, который, как было показано ранее, обеспечивает образование антиген-специфических регуляторных В-клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов.

2. Композиция по п.1, в которой (а) способ дополнительно включает предоставление или выявление пациента; и/или (b) антиген представляет собой терапевтический белок, аутоантиген или аллерген или ассоциирован с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплант против хозяина"; и/или (с) способ дополнительно включает оценку образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента перед и/или после введения композиции; и/или (d) пациент имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплант против хозяина"; и/или (е) пациенту проделали или будут делать трансплантацию; и/или (f) пациент имеет или существует риск развития у него нежелательного иммунного ответа против терапевтического белка, который вводят или будут вводить пациенту; и/или (g) одну или несколько поддерживающих доз композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, вводят пациенту; и/или (h) введение осуществляют путем внутривенного, интраперитонеального, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонарного, интраназального, интрадермального или внутримышечного введения, например путем ингаляции или внутривенного, подкожного или трансмукозального введения; и/или (i) иммунодепрессанты содержат статин, ингибитор mTOR, например, ингибитор mTOR является рапамицином, TGF- β сигнальный агент, кортикостероид, ингибитор митохондриальной функции, ингибитор Р38, NF- κ β ингибитор, агонист рецептора аденозина, агонист простагландина Е2, ингибитор фосфодиэстеразы-4, ингибитор HDAC или ингибитор протеасомы; и/или (j) нагрузка иммунодепрессантами и/или эпитопами в среднем во всем первом множестве синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50% (вес./вес.), например от 0,1 до 10% (вес./вес.), где нагрузка иммунодепрессантами и/или эпитопами в среднем во всем первом множестве синтетических наноносителей необязательно составляет по меньшей мере 2%, но не более 25% (вес./вес.).

3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе поверхностно-активных веществ, дендримеры, бакиболлы, нанонити, вирусоподобные частицы или пептидные или белковые частицы.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что (а) синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, например, синтетические наноносители первого множества включают липосомы; (b) синтетические наноносители первого множества включают металлические наночастицы, например, металлические наночастицы включают наночастицы золота; (с) синтетические наноносители первого множества включают полимерные наночастицы, например, такие, где (i) полимерная наночастица содержит полимер, который представляет собой не содержащий концевую метоксигруппу блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена; и/или (ii) полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, полиаминокислоту, поликарбонат, полиацеталь, поликеталь, полисахарид, полиэтилоксазолин или полиэтиленимин, например, сложный полиэфир включает поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот или поликапролактон, и/или полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, например, где указанный простой полиэфир включает полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.

5. Композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что (а) среднее распределение по размеру частиц, полученное с применением динамического рассеяния света, синтетических наноносителей первого множества, представляет собой диаметр, составляющий (i) более 100 нм; (ii) более 150 нм; (iii) более 200 нм; (iv) более 250 нм или (v) более 300 нм; и/или (b) соотношение размеров синтетических наноносителей первого множества составляет более 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.

6. Композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что способ дополнительно включает сбор образованных антиген-специфических регуляторных В-клеток и необязательно дополнительно включает (а) получение лекарственной формы, содержащей собранные антиген-специфические регуляторные В-клетки; и/или (b) обеспечение доступности собранных антиген-специфических регуляторных В-клеток или лекарственной формы для введения пациенту.

7. Композиция, содержащая (а) выделенные антиген-специфические регуляторные В-клетки, полученные согласно способу по любому из пп.1-6; или (b) композицию, полученную согласно способу по любому из пп.1-6, необязательно дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый наполнитель.

8. Лекарственная форма, содержащая композицию по п.7.

9. Композиция, содержащая выделенные антиген-специфические регуляторные В-клетки для применения в терапии или профилактике, причем указанные выделенные антиген-специфические регуляторные В-клетки могут быть получены способом, включающим следующие стадии: (а) обеспечение образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента путем введения композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) B-клеточные эпитопы и/или ограниченными классом II МНС эпитопы антигена; и (b) сбор образованных антиген-специфических регуляторных В-клеток, необязательно представляющих собой такие, как определено в п.7.

10. Композиция, содержащая (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; и (ii) В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, для применения в терапии или профилактике, необязательно являющиеся такими, как определено в пп.1-6.

11. Применение композиции по п.7 или по любому из пп.1-6 или 9 в терапии или профилактике, например, для применения при стимуляции толерогенного иммунного ответа или обеспечении образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента.

12. Применение лекарственной формы по п.8 в терапии или профилактике, например, для применения при стимуляции толерогенного иммунного ответа или обеспечении образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента.

13. Лекарственная форма, содержащая композицию по любому из пп.9-10.

14. Способ, включающий: (i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) получение В-клеточных эпитопов и/или ограниченных классом II МНС эпитопов антигена, отличающийся тем, что композиция находится в количестве, эффективном для обеспечения образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента, при этом необязательно: (а) способ дополнительно включает получение лекарственной формы, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена; и/или (b) способ дополнительно включает получение композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, или лекарственной формы, доступной пациенту для введения; и/или (c) способ дополнительно включает оценку образования антиген-специфических регуляторных В-клеток с помощью композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена; и/или (е) первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена получены, как определено в любом из пп.1-6.

15. Способ получения композиции, включающий следующие стадии: (i) связывание первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами; (ii) предоставление В-клеточных эпитопов и/или ограниченных классом II МНС эпитопов антигена, отличающийся тем, что композиция находится в количестве, эффективном для обеспечения образования регуляторных В-клеток у пациента, где способ необязательно включает стадии, определенные в способе по п.14.

16. Способ получения лекарственной формы, включающий следующие стадии: (i) связывание первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами; (ii) предоставление В-клеточных эпитопов и/или ограниченных классом II МНС эпитопов антигена, отличающийся тем, что лекарственная форма находится в количестве, эффективном для обеспечения образования регуляторных В-клеток у пациента, где способ необязательно включает стадии, определенные в способе по п.14.

17. Композиция, которая может быть получена с помощью способов по п.14 или 15.

18. Лекарственная форма, которая может быть получена с помощью способов по п.14 или 15.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

8. Лекарственная форма, содержащая композицию по п.7.

13. Лекарственная форма, содержащая композицию по любому из пп.9-10.

17. Композиция, которая может быть получена с помощью способов по п.14 или 15.

18. Лекарственная форма, которая может быть получена с помощью способов по п.14 или 15.

Евразийское 027379 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201391609
(22) Дата подачи заявки 2012.04.27
(51) Int. Cl.
A61K39/38 (2006.01) A61K31/445 (2006.01)
A61K 9/16 (2006.01) A61K 9/14 (2006.01)
A61K 47/48 (2006.01) A61K 47/30 (2006.01)
(54)
ТОЛЕРОГЕННЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ НАНОНОСИТЕЛИ ДЛЯ ИНДУКЦИИ РЕГУЛЯТОРНЫХ B-КЛЕТОК
(31) 61/480,946; 61/513,514; 61/531,147; 61/531,153; 61/531,164; 61/531,168;
(32)
(33) (43)
(86) (87)
61/531,175; 61/531,180; 61/531,194; 61/531,204; 61/531,209; 61/531,215 2011.04.29; 2011.07.29; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06
2014.09.30
PCT/US2012/035431 WO 2012/149301 2012.11.01
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
СЕЛЕКТА БАЙОСАЙЕНСИЗ, ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Мальдонадо Роберто А. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A2-2009131712 US-A1-20100183727 US-A1-20100151000
M. GRAY et al.: "Apoptotic cells protect mice from autoimmune inflammation by the induction of regulatory B cells", PNAS, 2007, vol. 104, No. 35, p. 14080-14085, ISSN 0027-8424, see abstract; discussion
(57) Раскрыты способы, относящиеся к синтетическим наноносителям, и связанные композиции, содержащие В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы и иммунодепрессанты, для обеспечения образования толерогенных иммунных ответов, например образования антиген-специфических регуляторньгх В-клеток.
Родственные заявки
В соответствии с § 119 Патентного закона США раздела 35 заявка на настоящий патент испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/480946, поданной 29 апреля 2011 г., № 61/513514, поданной 29 июля 2011 г., № 61/531147, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531153, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531164, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531168, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531175, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531180, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531194, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531204, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531209, поданной 6 сентября 2011 г., № 61/531215, поданной 6 сентября 2011 г., полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам введения композиций на основе синтетических нано-носителей с иммунодепрессантами и В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена, где данные композиции могут обеспечивать образование регуляторных В-клеток, и связанным композициям. Способы предусматривают эффективный захват АРС для сдвига иммунного ответа в сторону развития регуляторных В-клеток, специфических к антигенам.
Предпосылки изобретения
Традиционные подходы к выработке иммунодепрессии, связанной с нежелательным иммунным ответом, основаны на иммуноподавляющих препаратах широкого спектра действия. Кроме того, для поддержания иммунодепрессии терапия иммуноподавляющими препаратами обычно является пожизненной. К сожалению, использование иммуноподавляющих препаратов (иммунодепрессантов) широкого спектра действия связано с риском возникновения серьезных побочных явлений, таких как опухоли, инфекции, нефротоксичность и нарушения метаболизма. Соответственно, полезным было бы появление новых видов иммуноподавляющей терапии.
В одном аспекте представлен способ, включающий введение субъекту композиции, которая содержит следующее: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных так, что они содержат В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена. В другом аспекте представлен способ, включающий обеспечение образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта путем введения композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена. В другом аспекте представлен способ, включающий введение субъекту композиции согласно протоколу, который, как было показано ранее, обеспечивает образование антиген-специфических регуляторных В-клеток у одного или нескольких исследуемых субъектов; где композиция содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносите-лей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена. В одном варианте осуществления композиция находится в количестве, эффективном для обеспечения образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта. В другом варианте осуществления композицию вводят в количестве, эффективном для обеспечения образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта.
В одном варианте осуществления первое множество и второе множество представляют собой одинаковое множество. В другом варианте осуществления первое множество и второе множества представляют собой разные множества.
В другом варианте осуществления способ, кроме того, включает предоставление и выявление субъекта.
В другом варианте осуществления антиген представляет собой терапевтический белок, аутоантиген или аллерген, или связан с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплант против хозяина".
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает оценку образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта перед и/или после введения композиции.
В другом варианте осуществления субъект имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплант против хозяина". В другом варианте осуществления субъекту проделали или будут делать трансплантацию. В другом варианте осуществления субъект имеет или существует риск развития у него нежелательного иммунного ответа на терапевтический белок, который вводят или будут вводить субъекту.
В одном варианте осуществления пациенту вводят одну или больше поддерживающих доз композиции, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей.
В другом варианте осуществления введение осуществляют путем внутривенного, интраперитоне-ального, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонарного, интраназального, интрадер-мального или внутримышечного введения. В другом варианте осуществления введение проводят путем ингаляции или внутривенного, подкожного или трансмукозального введения.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка. В другом варианте осуществления введение пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка, когда терапевтический белок представлен в виде одной или более клеток, можно проводить парентерально, внутриартериально, интраназально или внутривенно или путем инъекций в лимфатические узлы или переднюю камеру глаза или путем местного введения в орган или ткань, представляющие интерес.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает получение образованных антиген-специфических регуляторных В-клеток.
В другом варианте осуществления иммунодепрессанты содержат статин, ингибитор mTOR, TGF-p сигнальный агент, кортикостероид, ингибитор митохондриальной функции, ингибитор Р38, NF-кР ингибитор, агонист рецептора аденозина, агонист простагландина Е2, ингибитор фосфодиэстеразы-4, ингибитор деацетилазы гистонов или ингибитор протеасомы. В другом варианте осуществления ингибитор mTOR является рапамицином или аналогом рапамицина.
В другом варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантами и/или антигенами в среднем во всем первом и/или втором множестве синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50% (вес./вес.). В другом варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантами и/или антигенами в среднем во всем первом и/или втором множестве синтетических наноносителей составляет от 0,1 до 10% (вес./вес.).
В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат липидные наночастицы, полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе поверхностно-активных веществ, дендримеры, бакиболлы, нанонити, вирусоподобные частицы или пептидные или белковые частицы. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат липидные наночастицы. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат липосомы. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат металлические наночастицы. В другом варианте осуществления металлические наночастицы содержат золотые наночастицы. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат полимерные наночастицы. В другом варианте осуществления полимерная наночастица содержит полимер, который представляет собой не содержащий концевую метоксигруппу блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена. В другом варианте осуществления полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, полиаминокислоту, поликарбонат, полиацеталь, поликеталь, полисахарид, полиэтилоксазолин или полиэтиленимин. В другом варианте осуществления сложный полиэфир содержит поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликоле-вой кислот или поликапролактон. В другом варианте осуществления полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир и сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром. В другом варианте осуществления полиэфир включает полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.
В другом варианте осуществления среднее распределения по размеру частиц, полученного с применением динамического рассеяния света, синтетических наноносителей первого и/или второго множества представляет собой диаметр более чем 100 нм. В другом варианте осуществления диаметр составляет более чем 150 нм. В другом варианте осуществления диаметр составляет более чем 200 нм. В другом варианте осуществления диаметр составляет более чем 250 нм. В другом варианте осуществления диаметр составляет более чем 300 нм. В другом варианте осуществления коэффициент пропорциональности синтетических наноносителей первого множества и/или второго множества составляет более чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает получение лекарственной формы, содержащей полученные антиген-специфические регуляторные В-клетки. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает обеспечение доступности полученных антиген-специфических регуляторных В-клеток или лекарственной формы для введения субъекту.
В другом варианте осуществления второе множество синтетических наноносителей также связано с антигенами, которые содержат ограниченные классом I МНС эпитопы.
В другом аспекте представлена композиция, содержащая выделенные антиген-специфические регу-ляторные В-клетки, полученные согласно любому из способов, представленных в настоящем документе.
В другом варианте осуществления композиция содержит фармацевтически приемлемый наполнитель.
В другом аспекте обеспечивается лекарственная форма, содержащая любую из композиций, представленных в настоящем документе.
В другом аспекте представлена композиция, содержащая выделенные антиген-специфические регу-ляторные В-клетки для применения при терапии или профилактике, причем указанные выделенные антиген-специфические регуляторные В-клетки получают с помощью способа, включающего следующие этапы: (а) обеспечение образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта путем
введения композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена; и (b) получение образованных антиген-специфических регуляторных В-клеток. В одном варианте осуществления композиция представляет собой любую из композиций, представленных в настоящем документе или применяемых в любом из представленных способов.
В другом аспекте представлена композиция, содержащая (i) первое множество синтетических нано-носителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена, для применения при терапии или профилактике. В одном варианте осуществления композиция представляет собой любую из композиций, представленных в настоящем документе или применяемых в любом из представленных способов.
В другом аспекте любая из представленных композиций может применяться при терапии или профилактике.
В другом аспекте любая из представленных композиций может применяться при стимуляции толе-рогенного иммунного ответа или обеспечении образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта.
В другом аспекте обеспечивается применение любой из представленных композиций или лекарственных форм для получения лекарственного препарата для применения при стимуляции толерогенного иммунного ответа или обеспечении образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта.
В другом варианте осуществления композиция дополнительно содержит пересаживаемый трансплантируемый материал или терапевтический белок.
В другом аспекте обеспечивается лекарственная форма, содержащая любую из представленных композиций.
В другом аспекте представлен способ, включающий (i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) получение второго множества синтетических наноносителей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпи-топами антигена. В одном варианте осуществления композиция находится в количестве, эффективном для обеспечения образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта. В другом варианте осуществления первое множество и второе множества представляют собой одно и то же множество. В другом варианте осуществления первое множество и второе множества представляют собой разные множества.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает получение лекарственной формы, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей.
В другом варианте осуществления способ, помимо того, включает изготовление композиции, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей, или лекарственной формы, доступной субъекту для введения.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает оценку образования антиген-специфических регуляторных В-клеток с помощью композиции, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей.
В другом варианте осуществления первое множество и второе множество синтетических наноноси-телей, которые получают, являются такими, как определено в любой из композиций и в любом из способов, представленных в настоящем документе.
В другом аспекте представлен способ получения композиции или лекарственной формы, включающий следующие этапы: (i) связывание первого множества синтетических наноносителей с иммуноде-прессантами и (ii) связывание второго множества синтетических наноносителей с В-клеточными эпито-пами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена. В одном варианте осуществления композиция или лекарственная форма находится в количестве, эффективном для обеспечения образования регуляторных В-клеток у субъекта. В одном варианте осуществления этапы являются такими, как определено в любом из способов, представленных в настоящем документе.
В другом аспекте представлена композиция или лекарственная форма, получаемая при помощи любого из способов или процессов, представленных в настоящем документе.
В другом варианте осуществления способы дополнительно включают включение пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка в полученные антиген-специфические регу-ляторные В-клетки или лекарственную форму.
В другом варианте осуществления первое и/или второе множество синтетических наноносителей любой из представленных композиций или способов также связано с ограниченными классом I МНС эпитопами. В варианте осуществления любой из композиций и способов, представленных в настоящем документе, антигены фактически не содержат ограниченные классом I МНС эпитопы.
В варианте осуществления любой из композиций и способов, представленных в настоящем документе, антигены, которые являются белками, которые содержат вышеупомянутые эпитопы, могут быть
связаны с синтетическими наноносителями. В другом варианте осуществления полипептиды или пептиды, которые содержат вышеупомянутые эпитопы, а также дополнительные аминокислоты, которые фланкируют один или оба конца эпитопа(ов), могут быть связаны с синтетическими наноносителями. В другом варианте осуществления эпитопы сами по себе связаны с синтетическими наноносителями.
Краткое описание фигур На фиг. 1 представлен репрезентативный пример анализа Treg-клеток при помощи проточной ци-тометрии.
На фиг. 2 показано, что синтетические наноносители по настоящему изобретению приводят к высоким пропорциям антиген-специфических Breg.
На фиг. 3 показано снижение продукции IgE с помощью синтетических наноносителей по настоящему изобретению.
Подробное описание изобретения
Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными иллюстративными материалами или технологическими параметрами, поскольку, безусловно, таковые могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, применяемая в настоящем документе, предусмотрена исключительно для цели описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предусмотрена для ограничения применения альтернативной терминологии для описания настоящего изобретения.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем документе, либо выше, либо ниже, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.
Применяемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если содержание ясно не предписывает иное. Например, ссылка на "полимер" предусматривает смесь двух или более таких молекул или смесь одного вида полимера с различающимися молекулярными массами, ссылка на "синтетический наноноси-тель" включает смесь двух или более таких синтетических наноносителей или множество таких синтетических наноносителей, ссылка на "молекулу ДНК" включает смесь двух или более таких молекул ДНК или множество таких молекул ДНК, ссылка на "иммунодепрессант" включает смесь двух или более таких материалов или множество молекул иммунодепрессанта и подобное.
Применяемое в настоящем документе выражение "содержат" или его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", следует читать, как указывающие на включение любого упомянутого целого (например, признака, элемента, характеристики, свойства, этап способа/процесса или ограничение) или группы целых чисел (например, признаков, элемента, характеристик, свойств, этапов способа/процесса или ограничений), но не исключение любого другого целого или группы целых чисел. Таким образом, применяемое в настоящем документе выражение "содержащий" является включающим и не исключает дополнительные, неупомянутые единицы или этапы способа/процесса.
В вариантах осуществления любых из приведенных в данном документе композиций и способов "содержащий" можно заменить на "по сути состоящий из" или "состоящий из". Фразу "по сути состоящий из" в данном документе применяют как предписывающую указанное(ые) целое(ые) или этапы, а также в существенной степени не влияющие на характер или функцию заявленного изобретения. Применяемое в настоящем документе выражение "состоящий" применяют для указания наличия только упомянутого целого (например, признака, элемента, характеристики, свойства, этапа способа/процесса или ограничения) или группы целых (например, признаков, элемента, характеристик, свойств, этапов способа/процесса или ограничений).
А. Введение
Доставка иммунодепрессантов и антигенов посредством композиций на основе синтетических на-ноносителей, которые содержат В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы, более направленно к местам действия в клетках, представляющих интерес, в частности АРС, может стимулировать регуляторные В-клетки и приводить к благоприятным толерогенным иммунным ответам, специфическим по отношению к антигенам. Как показано в примерах, было обнаружено, что композиции на основе синтетических наноносителей являются эффективными при обеспечении образования CD24+ В-клеток, которые продуцируют IL-10 и TGF-р, а также распознают антиген, что подтверждает антиген-специфическую природу ответа. Кроме того, было обнаружено, что эти же композиции синтетических наноносителей снижают продукцию IgE, что указывает на последующий результат продукции регуляторных В-клеток. Без связи с какой-либо конкретной теорией представленные композиции могут обеспечивать толерогенные иммунные эффекты напрямую как результат распознавания эпитопов, что может приводить к образованию регуляторных клеток, переключению В-клеток на регуляторный фенотип и т.д. Толерогенные иммунные ответы могут также быть результатом продукции цитокинов и/или продукции других регуляторных иммунных клеток, стимулированных такими цитокинами. Образование регуляторных В-клеток может также приводить к последующим толерогенным эффектам. Например, регуляторные В-клетки могут снижать пролиферативную способность эффекторных Т-клеток, таких как CD4+ Т клетки, и/или усиливать экспрессию FoxP3 и CTLA-4 в регуляторных Т-клетках. Регуляторные В-клетки могут также продуцировать регуляторный цитокин IL-10. В вариантах осуществления антиген
специфические itDC, представленные в настоящем документе, могут иметь эти эффекты, например, по отношению к субъекту.
Образование таких регуляторных В-клеток служит доказательством способности композиций по настоящему изобретению обеспечивать образование антиген-специфических толерогенных иммунных ответов, которые могут иметь применение при лечении или профилактике разнообразных заболеваний, расстройств или состояний. Следовательно, настоящее изобретение является применимым, например, для стимуляции толерогенных иммунных ответов у субъектов, которые имеют или у них существует риск развития аллергии, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания, отторжения органа или тканей или болезни "трансплант против хозяина". Настоящее изобретение также является применимым для стимуляции толерогенных иммунных ответов у субъектов, которым проделали или будут делать трансплантацию. Настоящее изобретение также является применимым для стимуляции толероген-ных иммунных ответов у субъектов, которые получили, получают или будут получать терапевтический белок, против которого образуются нежелательные иммунные ответы или предполагается, что они образуются. Настоящее изобретение в некоторых своих вариантах осуществления предотвращает или подавляет нежелательные иммунные ответы, которые могут аннулировать положительный эффект от некоторых видов терапевтического лечения.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что проблемы и ограничения, указанные выше, можно преодолеть путем практического осуществления настоящего изобретения, раскрытого в настоящем документе. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что возможно обеспечить композиции на основе синтетических наноносителей и связанные с ними способы, которые индуцируют толе-рогенный иммунный ответ посредством увеличения числа и/или активности регуляторных В-клеток. Способ, описанный в настоящем документе, включает введение субъекту композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена. Предпочтительно композиция находится в количестве, эффективном, чтобы вызвать пролиферацию и/или активность антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта. В другом аспекте представлен способ, включающий обеспечение образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у субъекта путем введения композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена. В другом аспекте представлен способ, включающий введение субъекту композиции согласно протоколу, который, как было показано ранее, обеспечивает образование антиген-специфических регуляторных В-клеток у одного или нескольких исследуемых субъектов, где композиция содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрес-сантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена.
Также могут быть введены пересаживаемые трансплантируемые материалы, терапевтические белки и т.п., как предложено в данном документе. Такие композиции могут быть введены субъекту перед введением, одновременно с ним или после введения первого и второго множеств синтетических наноноси-телей. Такие дополнительные средства могут быть или могут не быть связанными с первым или вторым множеством синтетических наноносителей или другим множеством синтетических наноносителей. В вариантах осуществления представленные композиции могут также быть введены субъекту в виде одной или нескольких поддерживающих доз. В таких вариантах осуществления представленные композиции вводят так, чтобы поддерживать образование необходимого иммунного ответа, или снижать нежелательный иммунный ответ в течение определенного промежутка времени. Примеры таких промежутков времени представлены в других местах в настоящем документе.
В другом аспекте представлена композиция, содержащая выделенные антиген-специфические регу-ляторные В-клетки, полученные согласно любому из представленных способов. В еще одном аспекте также предложены композиции, содержащие первое множество и второе множество синтетических на-ноносителей. В вариантах осуществления композиции дополнительно содержат пересаживаемый трансплантируемый материал или терапевтический белок, которые могут быть или могут не быть связанными с первым или вторым множеством синтетических наноносителей или другим множеством синтетических наноносителей.
В другом аспекте представлены лекарственные формы любой из композиций в настоящем документе. Такие лекарственные формы могут быть введены субъекту, например, субъекту, нуждающемуся в образовании антиген-специфических регуляторных В-клеток.
В другом аспекте представлен способ (i) получения первого множества синтетических наноносите-лей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) получения второго множества синтетических наноносите-лей, связанных с В-клеточными эпитопами и/или ограниченными классом II МНС эпитопами антигена. В одном варианте осуществления способ, помимо того, включает получение лекарственной формы, содержащей первое и второе множества синтетических наноносителей. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает подтверждение того, что второе множество синтетических наноносите
лей содержит В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена. В одном варианте осуществления присутствие В-клеточного эпитопа и/или ограниченного классом II МНС может быть подтверждено способностью такого эпитопа стимулировать иммунные ответы, такие как продукция антител или пролиферация и/или активность В-клеток по отношению к В-клеточным эпитопам и CD4+ Т-клеточные иммунные ответы по отношению к ограниченным классом II МНС эпитопам. Способы определения этой активности хорошо известны специалистам в данной области техники или представлены в других местах в настоящем документе. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает оценку образования регуляторных В-клеток с помощью композиции или лекарственной формы, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей. В одном варианте осуществления эту оценку проводят in vitro. В другом варианте осуществления эту оценку проводят in vivo, например, с помощью образца, полученного от субъекта. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает изготовление композиции, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей или ее лекарственной формы, пригодной для введения субъекту.
В другом аспекте также предложены композиции или лекарственные формы, полученные при помощи любого из описанных в настоящем документе способов.
Настоящее изобретение теперь будет подробнее описано ниже.
В. Определения
"Проведение введения" или "введение" означает предоставление материала субъекту способом, который является фармакологически применимым.
"Аллергены" представляют собой любые вещества, которые могут вызывать нежелательный (например, гиперчувствительность 1 типа) иммунный ответ (т.е. аллергический ответ или реакцию) у субъекта. Аллергены включают без ограничения растительные аллергены (например, аллерген пыльцы, амброзии), аллергены насекомых, аллергены укуса насекомых (например, аллергены пчелиного укуса), аллергены животных (например, аллергены домашних животных, такие как антиген шерсти животных или кошачий антиген Fel d 1), аллергены латекса, плесневые аллергены, грибковые аллергены, косметические аллергены, аллергены лекарственных средств, пищевые аллергены, пыль, яд насекомых, вирусы, бактерии и т.д. Пищевые аллергены включают без ограничения аллергены молока, аллергены яиц, аллергены орехов (например, аллергены арахиса или лесного ореха и т.д. (например, грецкие орехи, кешью и т.д.)), аллергены рыб, аллергены моллюсков, аллергены сои, аллергены бобовых, аллергены семян и аллергены пшеницы. Аллергены укуса насекомых включают аллергены, которые представляют собой или связаны с укусами пчел, укусами ос, укусами шершней, укусами скадчатокрылых ос и т.д. Аллергены насекомых также включают аллергены клеща домашней пыли (например, антиген Der P1) и аллергены тараканов. Аллергены лекарственных средств включают аллергены, которые представляют собой или связаны с антибиотиками, NSAID, анестетиками и т.д. Аллергены пыльцы включают аллергены трав, аллергены деревьев, аллергены сорняков, аллергены цветов и т.д. Субъекты, у которых развивается или которые подвержены риску развития нежелательного иммунного ответа на любой из аллергенов, представленных в настоящем документе, могут получать лечение с помощью любой из композиций и любого из способов, представленных в настоящем документе. Субъекты, которые могут получать лечение с помощью любой из представленных композиций и любого из способов, также включают субъектов, которые имеют или подвержены риску возникновения аллергии на любой из представленных аллергенов.
"Аллергия", которая также называется в настоящем документе "аллергическим состоянием", представляет собой любое состояние, при котором имеет место нежелательный (например, гиперчувствительность 1 типа) иммунный ответ (т.е. аллергический ответ или реакция) по отношению к веществу. Такие вещества называются в настоящем документе аллергенами. Аллергии или аллергические состояния включают без ограничений аллергическую астму, сенную лихорадку, крапивницу, экзему, аллергии на растения, аллергии на пчелиный укус, аллергии на домашних животных, аллергии на латекс, аллергии на плесень, аллергии на косметику, пищевые аллергии, аллергический ринит или насморк, местные аллергические реакции, анафилаксию, атопический дерматит, реакции гиперчувствительности и другие аллергические состояния. Аллергическая реакция может являться результатом иммунной реакции в отношении какого-либо аллергена. В некоторых вариантах осуществления аллергия представляет собой пищевую аллергию. Пищевые аллергии без ограничения включают аллергии на молоко, аллергии на яйца, аллергии на орехи, аллергии на рыбу, аллергии на моллюсков, аллергии на сою или аллергии на пшеницу.
"Эффективное количество" в контексте композиции или лекарственной формы для введения субъекту относится к количеству композиции или лекарственной формы, которое производит у субъекта один или несколько необходимых иммунных ответов, например, образование регуляторных В-клеток. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество представляет собой любое количество композиции, представленной в настоящем документе, которое производит такой необходимый иммунный ответ. Это количество может быть применимым для in vitro или in vivo целей. При введении in vivo количество может быть таким, что врач-клиницист может убедиться в его клиническом преимуществе для субъекта, который нуждается в формировании антиген-специфической толерантности.
Такие субъекты включают тех, которые имеют или существует риск развития у них воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "транс-плант против хозяина". Такие субъекты также включают субъектов, которым проделали или будут делать трансплантацию. Такие субъекты дополнительно включают субъектов, которые испытали, испытывают или, предполагается, что испытывают нежелательный иммунный ответ против терапевтического белка. Другие субъекты включают субъектов, описанных в других местах в настоящем документе.
Эффективные количества могут охватывать только снижение уровня нежелательного иммунного ответа, хотя в некоторых вариантах осуществления оно охватывает предупреждение нежелательного иммунного ответа в целом. Эффективные количества могут также охватывать задержку возникновения нежелательного иммунного ответа. Эффективные количества могут также охватывать образование необходимого иммунного ответа. Количество, которое является эффективным, может также являться количеством композиции, представленной в настоящем документе, которое производит необходимый терапевтический эффект или необходимый терапевтический результат. Эффективные количества преимущественно в результате вызывают у субъекта толерантный иммунный ответ на антиген. Предпочтительно эффективные количества в результате вызывают повышенную пролиферацию и/или активность регуляторных В-клеток. Достижение любого из указанного выше может подвергаться мониторингу с помощью обычных способов.
В некоторых вариантах осуществления любой из предоставленных композиций и способов эффективное количество является таким, при котором необходимый иммунный ответ длится у субъекта в течение по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет или больше. В других вариантах осуществления любой из предоставленных композиций и способов эффективное количество таково, что вызывает измеряемый желательный иммунный ответ, например, измеряемое уменьшение иммунного ответа (например, к специфическому антигену), по меньшей мере на 1 неделю, по меньшей мере на 2 недели, по меньшей мере на 1 месяц, по меньшей мере на 2 месяца, по меньшей мере на 3 месяца, по меньшей мере на 4 месяца, по меньшей мере на 5 месяцев, по меньшей мере на 6 месяцев, по меньшей мере на 9 месяцев, по меньшей мере на 1 год, по меньшей мере на 2 года, по меньшей мере на 5 лет или больше.
Эффективные количества будут зависеть, конечно, от конкретного субъекта, подлежащего лечению; тяжести состояния, заболевания или расстройства; индивидуальных параметров пациента, включающих возраст, физическое состояние, размер и вес; продолжительность лечения; природы сопутствующей терапии (если таковая имеется); специфический путь введения и подобных факторов в пределах знания и практического опыта врача-терапевта. Эти факторы хорошо известны специалистам в настоящей области и могут предусматривать не более чем традиционное проведение исследования. В целом предпочтительно, чтобы применялась максимальная доза, т.е. наивысшая безопасная доза, в соответствии с результатами тщательной медицинской оценки. Специалистам в данной области техники будет понятно, тем не менее, что пациент может настаивать на более низкой дозе или переносимой дозе по медицинским показаниям, физиологическим показаниям или, фактически, по любой другой причине.
В общем, дозы иммунодепрессантов и/или антигенов в композициях настоящего изобретения могут находиться в диапазоне от около 10 до около 100000 мкг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозы могут находиться в диапазоне от около 0,1 до около 100 мг/кг. В других вариантах осуществления дозы могут находиться в диапазоне от около 0,1 до около 25 мг/кг, от около 25 до около 50 мг/кг, от около 50 до около 75 мг/кг или от около 75 до около 100 мг/кг. Альтернативно, дозу можно вводить на основе количества синтетических наноносителей, которые обеспечивают желаемое количество иммунодепрессан-тов и/или антигенов. Например, применимые дозы включают более чем 106, 107, 108, 109 или 10 синтетических наноносителей на дозу. Другие примеры применимых доз включают от около 1х106 до около 1х1010, от около 1х107 до около 1х109 или от около 1х 10 до около 1х 10 синтетических наноносителей на дозу.
"Антиген" означает В-клеточный антиген или Т-клеточный антиген. ''Тип(ы) антигенов" означает молекулы, которые имеют одинаковые или практически одинаковые антигенные характеристики. В некоторых вариантах осуществления антигены могут представлять собой белки, полипептиды, пептиды, липопротеины, гликолипиды, полинуклеотиды, полисахариды или содержатся в клетках или экспресси-руются в них. В некоторых вариантах осуществления когда, например, антигены не четко определены или охарактеризованы соответствующим образом, антигены могут содержаться в образцах клеток или тканей, обломках клеток, клеточных экзосомах, кондиционированных средах и т.п. Антиген может быть связан с синтетическими наноносителями в той же форме, что и тот, который вызывает при своем наличии у субъекта нежелательную иммунную реакцию, но также может быть его фрагментом или его производным. В случае фрагмента или производного, тем не менее, необходимый иммунный ответ в отношении формы, с которой сталкивается такой субъект, является предпочтительным результатом, достигнутым с помощью представленных композиций и способов. Предпочтительно антигены содержат такие
эпитопы, что образование, рекрутинг или активация регуляторных В-клеток обеспечиваются с помощью композиций, представленных в настоящем документе. Происходит ли это или нет, может быть установлено посредством измерения продукции цитокинов (например, IL-10) и/или пролиферации регуляторных В-клеток с применением общепринятых методик.
"Антиген-специфический" относится к любому иммунному ответу, возникающему на присутствие антигена, или части его, или вызывающему образование молекул, которые специфическим образом распознают антиген или связываются с ним. Например, если иммунный ответ представляет собой выработку антиген-специфических антител, вырабатываются антитела, которые специфически связываются с антигеном. В качестве другого примера, если иммунный ответ представляет собой пролиферацию и/или активность антиген-специфических регуляторных В-клеток, то пролиферация и/или активность является результатом распознавания антигена или его части, отдельно или в комплексе с молекулами МНС, В-клетками и т.д.
"Антигены, ассоциированные" с заболеванием, расстройством или состоянием, описанными в данном документе, представляют собой антигены, которые могут вызывать нежелательный иммунный ответ против, в результате или в связи с заболеванием, расстройством или состоянием; причину заболевания, расстройства или состояния (или симптом или его проявление); и/или могут вызывать нежелательный иммунный ответ, который является симптомом, результатом или проявлением заболевания, расстройства или состояния. Предпочтительно в некоторых вариантах осуществления применение антигенов, ассоциированных с заболеванием, расстройством или состоянием и т.п., в композициях и способах, предложенных в данном документе, приводит к толерантному иммунному ответу на антиген и/или клеткам, которыми, на которых или в которых экспрессируется антиген. Антигены могут быть в той же форме, в которой они экспрессируются в субъекте, имеющем заболевание, расстройство или состояние, но также могут быть их фрагментом или производным. Однако, в случае их фрагмента или производного, желаемая иммунная реакция на форму, экспрессируемую у такого субъекта, является предпочтительным результатом при использовании предложенных композиций и способов.
В одном варианте осуществления антиген представляет собой антиген, ассоциированный с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплант против хозяина". Такие антигены включают аутоантигены, такие как основной белок миелина, коллаген (например, коллаген 11 типа), хрящевой gp 39 человека, хромогранин A, gp130-RAPS, протеолипидный белок, фибрилларин, ядерные белки, ядрышковые белки (например, малый ядрышко-вый белок), рецептор стимулирующего фактора щитовидной железы, гистоны, гликопротеин gp 70, ри-босомные белки, пируватдегидрогеназа дегидролипоамид-ацетилтрансфераза, антигены волосяного фолликула, изоформа 5 тропомиозина человека, митохондриальные белки, белки клеток поджелудочной железы р, гликопротеин олигодендроцитов миелина, инсулин, декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD), глютен и их фрагменты или производные. Другие аутоантигены представлены в табл. 1 ниже.
Антигены также включают антигены, ассоциированные с отторжением органа или тканей. Примеры таких антигенов включают, но не ограничены ими, антигены аллогенных клеток, например, антигены из экстракта аллогенных клеток, и антигены других клеток, таких, как антигены эндотелиальных клеток.
Антигены также включают антигены, ассоциированные с аллергией. Такие антигены включают антигены, описанные в других частях данного документа.
Антигены также включают антигены, ассоциированные с пересаживаемым трансплантируемым материалом. Такие антигены ассоциируются с пересаживаемым тарансплантируемым материалом или с нежелательным иммунным ответом у получателя пересаживаемого трансплантируемого материала, который вызван в результате введения пересаживаемого трансплантируемого материала в получателя, который может быть представлен для распознавания клетками иммунной системы и который может вызывать нежелательный иммунный ответ. Антигены также включают антигены, ассоциированные с отторжением органа или тканей или болезнью "трансплант против хозяина". Антигены трансплантата могут быть получены или произведены из клеток биологического материала или из информации, относящейся к пересаживаемому трансплантируемому материалу. Антигены трансплантата обычно включают белки, полипептиды, пептиды, липопротеины, гликолипиды, полинуклеотиды или содержатся в клетках или вырабатываются ими. Информация, относящаяся к пересаживаемому трансплантируемому материалу, представляет собой любую информацию о пересаживаемом трансплантируемом материале, которую можно использовать для получения или производства антигенов трансплантата. Такая информация включает информацию об антигенах, от которых ожидается, что они будут присутствовать в клетках или на клетках пересаживаемого трансплантируемого материала, такую, как информация о последовательности, типе или классе антигенов и/или главном комплексе гистосовместимости I класса, главном комплексе гистосовместимости II класса или В-клетке, их представляющих и ограничивающих. Такая информация может также включать информацию о типе пересаживаемого трансплантируемого материала (например, аутотрансплантат, аллотрансплантат, ксенотрансплантат), молекулярном или клеточном составе трансплантируемого материала, положения на теле, из которого получен трансплантируемый материал, или на который трансплантируемый материал будет пересажен (например, целый или частичный орган, кожа, кость, нервы, сухожилие, нейроны, кровеносные сосуды, жировая ткань, роговица и т.п.).
Антигены также включают антигены, ассоциированные с терапевтическими белками, которые могут быть представлены для распознавания клетками иммунной системы, и которые могут вызывать нежелательный иммунный ответ на терапевтический белок. Антигены терапевтического белка обычно включают белки, полипептиды, пептиды, липопротеины или содержатся в или на клетках или вырабатываются ими.
Антигены могут быть антигенами, которые полностью определены или охарактеризованы. Однако в некоторых вариантах осуществления антиген не полностью определен или охарактеризован. Антигены, таким образом, также включают антигены, которые содержатся внутри образца клетки или ткани, обломках клеток, клеточных экзосом или кондиционированных средах и могут быть произведены в такой форме в некоторых вариантах осуществления.
"Оценка иммунного ответа" относится к любому измерению или определению уровня, присутствия или отсутствия, снижения, увеличения и т.д. иммунного ответа in vitro или in vivo. Такие измерения или определения могут быть проведены на одном или нескольких образцах, полученных от субъекта. Такая оценка могут быть проведена с помощью любого из способов, представленных в настоящем документе, или иным образом известных в данной области техники.
"Подверженный риску" субъект представляет собой субъекта, у которого, как считает лечащий врач, имеется вероятность развития заболевания, расстройства или состояния, представленного в настоящем документе, или представляет собой субъекта, у которого, как считает лечащий врач, имеется вероятность испытать нежелательный иммунный ответ, как представлено в настоящем документе.
"Аутоиммунное заболевание" представляет собой любое заболевание, при котором иммунная система генерирует повышенный нежелательный иммунный ответ против самой себя (например, один или несколько аутоантигенов). В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание заключается в аномальном разрушении клеток тела, как части направленного против себя иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления разрушение собственного организма проявляется в дисфункции органа, например, толстого кишечника или поджелудочной железы. Примеры аутоиммунных заболеваний описаны в других местах данного документа. Дополнительные аутоиммунные заболевания хорошо известны специалистам в данной области, и изобретение не ограничено в этом отношении.
"Среднее", применяемое в настоящем документе, относится к арифметическому среднему, если не указано иное.
"В-клеточный антиген" означает любой антиген, который запускает иммунный ответ в В-клетке (например, антиген, который специфически распознается В-клеткой или рецептором на ней). В некоторых вариантах осуществления антиген, который представляет собой Т-клеточный антиген, также представляет собой В-клеточный антиген. В других вариантах осуществления Т-клеточный антиген не является также В-клеточным антигеном. В-клеточные антигены включают, но без ограничений, белки, пептиды, малые молекулы и углеводы. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген содержит небелковый антиген (т.е. не является белковым или пептидным антигеном). В некоторых вариантах осуществления антиген В-клетки включает аутоантиген. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген получен из аллергена, аутоантигена, терапевтического белка или пересаживаемого трансплантируемого материала или является их производным.
"Совместно" означает введение двух или более веществ субъекту способом, который согласован по времени, предпочтительно достаточно согласован по времени так, чтобы обеспечить модуляцию иммунного ответа. В вариантах осуществления совместное введение может осуществляться посредством введения двух или более веществ в одной лекарственной форме. В других вариантах осуществления совместное введение может включать введение двух или более веществ в различных лекарственных формах, но в пределах определенного периода времени, предпочтительно в пределах 1 месяца, более предпочтительно в пределах 1 недели, еще более предпочтительно в пределах 1 дня и даже более предпочтительно в пределах 1 ч.
"Связывать", или "связанный", или "связывает" (и подобное) означает химически ассоциировать один объект (например, фрагмент) с другим. В некоторых вариантах осуществления связывание является ковалентным, означая, что связывание происходит в контексте присутствия ковалентной связи между двумя соединениями. В вариантах осуществления с нековалентным связыванием нековалентное связывание опосредуется нековалентными взаимодействиями, без ограничения включающими взаимодействия зарядов, аффинные взаимодействия, координацию с металлом, физическую адсорбцию, взаимодействия хозяин-гость, гидрофобные взаимодействия, ТТ стекинговые взаимодействия, взаимодействия при помощи водородных связей, вандерваальсовы взаимодействия, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия, диполь-дипольные взаимодействия и/или их комбинации. В вариантах осуществления инкапсулирование представляет собой форму связывания.
"Происходящий" означает приготовленный из материала или при помощи информации, связанной с материалом, но не "полученный" из материала. Такие материалы могут представлять собой, по сути, модифицированные или обработанные формы материалов, взятых непосредственно из биологического материала. Такие материалы также включают материалы, произведенные из информации, связанной с биологическим материалом.
"Лекарственная форма" означает фармакологически и/или иммунологически активный материал в среде, носителе, наполнителе или устройстве, подходящих для введения субъекту.
"Инкапсулировать" означает заключать по меньшей мере часть вещества в синтетическом наноно-сителе. В некоторых вариантах осуществления вещество полностью в синтетическом наноносителе. В других вариантах осуществления большая часть или все вещество, которое инкапсулировано, не подвергается воздействию локального окружения, внешнего по отношению к синтетическому наноносителю. В других вариантах осуществления не более 50, 40, 30, 20, 10 или 5% (вес./вес.) подвергается воздействию локального окружения. Инкапсулирование отличается от абсорбции, которая помещает основную часть или все вещество на поверхности синтетического наноносителя, и оставляет вещество подвергаться воздействию локального окружения, внешнего по отношению к синтетическому наноносителю.
"Эпитоп", также известный как антигенная детерминанта, является частью антигена, которая распознается иммунной системой специфически, например, антителами, В-клетками или Т-клетками. Применяемое в настоящем документе выражение "ограниченные классом I MHC эпитопы" представляют собой эпитопы, которые представляются иммунным клеткам молекулами МНС I класса, обнаруженными на клетках, содержащих ядро. "Ограниченные классом II МНС эпитопы" представляют собой эпитопы, которые представляются иммунным клеткам молекулами МНС II класса, обнаруженными на антиген-представляющих клетках (АРС), например, на профессиональных антиген-представляющих иммунных клетках, таких как макрофаги, В-клетки и дендритные клетки, или на клетках, не относящихся к гемато-поэтическим, таких как гепатоциты. "В-клеточные эпитопы" представляют собой молекулярные структуры, которые распознаются антителами или В-клетками. В некоторых вариантах осуществления эпитоп сам по себе представляет собой антиген.
Ряд эпитопов известен специалистам в данной области техники, и иллюстративные эпитопы, подходящие согласно некоторым аспектам настоящего изобретения, включают без ограничения перечисленные в Immune Epitope Database (www.immuneepitope.org, Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, Emami H, Hoof I, Salimi N, Damle R, Sette A, Peters B. The immune epitope database 2.0. Nucleic Acids Res. 2010 Jan; 38(редакция базы данных): D854-62; полное содержание которой, а также все значения в базе данных IEDB версии 2.4, август 2011 года, и особенно все эпитопы, раскрытые в них, включены в настоящий документ посредством ссылки). Эпитопы также могут быть выявлены с помощью общедоступных алгоритмов, например алгоритмов, описанных в
Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B.
2010. peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 2010, 11:568; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothe B, Sette A, Peters B. 2008. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4):el000048; Nielsen M, Lund O. 2009. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bioinformatics. 10:296; Nielsen M, Lundegaard C, Lund O. 2007. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8:238; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Immunogenetics. 57:304-314; Sturniolo T, Bono E, Ding J, Raddrizzani L, Tuereci O, Sahin U, Braxenthaler M, Gallazzi F, Protti MP, Sinigaglia F, Hammer J. 1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat Biotechnol. 17(6):555-561; Nielsen M, Lundegaard C, Worning P, Lauemoller SL, Lamberth K, Buus S, Brunak S, Lund O. 2003. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Sci 12:10071017; Bui HH, Sidney J, Peters B, Sathiamurthy M, Sinichi A, Purton KA, Mothe BR, Chisari FV, Watkins DI, Sette A. 2005. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics 57:304-314; Peters B, Sette A. 2005. Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method. BMC Bioinformatics 6:132; Chou PY, Fasman GD. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148; Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol 55:836-839; Karplus PA, Schulz GE. 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften 72:212-213; Kolaskar AS, Tongaonkar PC. 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett276:172-174; Parker JM, Guo D, Hodges RS. 1986. New hydrophilicity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry 25:5425-5432; Larsen JE, Lund O, Nielsen M. 2006. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res 2:2; Ponomarenko JV, Bourne PE. 2007. Antibody-protein interactions: benchmark datasets and prediction tools evaluation. BMC Struct Biol 7:64; Haste Andersen P, Nielsen M, Lund O. 2006. Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15:2558-2567; Ponomarenko JV, Bui H, Li W, Fusseder N, Bourne PE, Sette A, Peters B. 2008. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics 9:514; Nielsen M, Lundegaard C, Blicher T, Peters B, Sette A, Justesen S, Buus S, and Lund O. 2008. PLoS Comput Biol 4(7)e 1000107. Quantitative predictions of peptide binding to any HLA-DR molecule of
known sequence: NetMHCIIpan; полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки для раскрытия способов и алгоритмов выявления эпитопов.
Другие примеры эпитопов включают любой из ограниченных классом I MHC, ограниченных классом II МНС и В-клеточных эпитопов, как представлено в виде SEQ ID NO: 1-943. Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовмести-мости I класса, включают те, которые указаны в SEQ ID NO: 1-186, эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса эпитопы, включают те, которые указаны в SEQ III NO: 187- 11
537, а В-клеточные эпитопы включают те, которые указаны в SEQ III NO: 538-943. Эти эпитопы включают ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса аутоантигены, ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса эпитопы и В-клеточные эпитопы аутоантигенов и аллергенов.
"Обеспечение образования" означает заставить происходить действие, такое как иммунный ответ (например, толерогенный иммунный ответ), либо непосредственно само по себе, либо опосредовано, например, без ограничения через несвязанную третью сторону, которая предпринимает действие посредством уверенности в чьих-то словах или делах.
"Выявление" представляет собой любое действие или набор действий, который позволяет врачу распознать субъекта в качестве субъекта, который может получить положительный результат от способов и композиций, представленных в настоящем документе. Предпочтительно выявленный субъект представляет собой субъекта, который нуждается в толерогенном иммунном ответе, как представлено в настоящем документе. Действие или набор действий могут быть осуществлены либо непосредственно сами по себе, либо опосредовано, например, без ограничения через несвязанную третью сторону, которая предпринимает действие посредством уверенности в чьих-то словах или делах.
"Иммунодепрессант" означает соединение, которое заставляет АРС оказывать иммуноподавляю-щий (например, толерогенный эффект). Иммуноподавляющий эффект, как правило, относится к продукции или экспрессии цитокинов или других факторов с помощью АРС, которая снижает, ингибирует или предотвращает нежелательный иммунный ответ, но может также включать продукцию или экспрессию цитокинов или других факторов с помощью АРС, которая увеличивает, стимулирует или активирует необходимый иммунный ответ. Когда АРС приводит к иммуноподавляющему эффекту на иммунные клетки, которые распознают антиген, представленный АРС, то говорят, что иммуноподавляющий эффект является специфическим по отношению к представленному антигену. Такой эффект также называется в настоящем документе толерогенным эффектом. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, считается, что иммуноподавляющий или толерогенный эффект представляет собой результат доставки иммунодепрессанта к АРС, предпочтительно в присутствии антигена (например, введенного антигена или антигена, который уже присутствует in vivo). Соответственно, иммунодепрессант включает соединения, которые обеспечивают толерогенный иммунный ответ по отношению к антигену, который может быть предоставлен или не предоставлен в той же композиции или другой композиции. В одном варианте осуществления иммунодепрессант представляет собой таковой, который заставляет АРС стимулировать регуляторный фенотип в одной или нескольких иммунных эффекторных клетках. Например, регуляторный фенотип может характеризоваться продукцией, индукцией, стимуляцией или рекрутингом Treg-клеток и т.д. Это может быть результатом перехода В-клеток к регуляторному фенотипу. Также это может быть результатом стимуляции, рекрутинга и т.д. регуляторных В-клеток. Также это может быть результатом индукции FoxP3 в других иммунных клетках, таких как макрофаги и iNKT-клетки. В одном варианте осуществления иммунодепрессант является таким, который оказывает воздействие на ответ АРС после того, как она процессирует антиген. В другом варианте осуществления иммунодепрессант является таким, который препятствует процессингу антигена. В дополнительном варианте осуществления иммунодепрессант не является сигнальной молекулой апоптоза. В другом варианте осуществления иммунодепрессант не является фосфолипидом.
Иммунодепрессанты включают без ограничения статины; ингибиторы mTOR, такие как рапамицин или аналог рапамицина; TGF-13 сигнальные средства; агонисты TGF-р рецептора; ингибиторы гистонде-ацетилазы, такие как трихостатин А; кортикостероиды; ингибиторы митохондриальной функции, такие как ротенон; ингибиторы Р38; NF- кр ингибиторы, такие как 6Bio, дексаметазон, ТСРА-1, IKK VII; агонисты рецептора аденозина; агонисты простагландина Е2 (PGE2), такие как мизопростол; ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как ингибитор фосфодиэстеразы 4 (PDE4), такие как ролипрам; ингибиторы протеасомы; ингибиторы киназы; агонисты рецептора, связанного с G-белком; антагонисты рецептора, связанного с G-белком; глюкокортикоиды; ретиноиды; ингибиторы цитокина; ингибиторы рецептора цитокина; активаторы рецептора цитокина; антагонисты рецептора, активируемого пролифератором пе-роксисом; агонисты рецептора, активируемого пролифератором пероксисом; ингибиторы гистондеаце-тилазы; ингибиторы кальциневрина; ингибиторы фосфатазы; ингибиторы PI3KB, такие как TGX-221; ингибиторы аутофагии, такие как 3-метиладенин; ингибиторы арил-углеводородного рецептора; ингибитор протеасомы I (PSI); и окисленные АТФ, такие как блокаторы рецептора Р2Х. Иммуно депрессанты также включают IDO, витамин D3, циклоспорины, такие как циклоспорин А, ингибиторы арил-углеводородного рецептора, ресвератрол, азатиопурин (Aza), 6-меркаптопурин (6-МР), 6-тиогуанин (6-TG), FK506, санглиферин А, салметерол, микофенолатмофетил (MMF), аспирин и другие ингибиторы СОХ, нифлумовая кислота, эстриол и триптолид. В вариантах осуществления иммунодепрессант может содержать любое из средств, представленных в настоящем документе.
Иммунодепрессант может представлять собой соединение, которое непосредственно обеспечивает иммуноподавляющий (например, толерогенный) эффект на АРС или может представлять собой соединение, которое обеспечивает иммуноподавляющий (например, толерогенный) эффект опосредовано (т.е.
после процессирования некоторым образом после введения). Иммунодепрессанты, следовательно, включают пролекарственные формы любого из соединений, представленных в настоящем документе.
Иммунодепрессанты также включают нуклеиновые кислоты, которые кодируют пептиды, полипептиды или белки, представленные в настоящем документе, которые приводят к иммуноподавляющему (например, толерогенному) иммунному ответу. В вариантах осуществления следовательно, иммуноде-прессант представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует пептид, полипептид или белок, который приводит к иммуноподавляющему (например, толерогенному) иммунному ответу, и он представляет собой нуклеиновую кислоту, которая связана с синтетическим наноносителем.
Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК, такую как мРНК. В вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат комплементарную последовательность, такую как комплементарную последовательность полной длины, или вырожденную последовательность (вследствие вырожденности генетического кода) любой из нуклеиновых кислот, представленных в настоящем документе. В вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой вектор экспрессии, который может транскрибироваться, когда он трансфицирован в клеточную линию. В вариантах осуществления вектор экспрессии может содержать плазмиду, ретровирус или аденовирус среди прочего. Нуклеиновые кислоты могут быть выделены или синтезированы с применением стандартных подходов молекулярной биологии, например, путем применения полимеразной цепной реакции для получения фрагмента нуклеиновой кислоты, который потом очищают и клонируют в вектор экспрессии. Дополнительные методики, применимые в практическом осуществлении настоящего изобретения, можно найти в Current Protocols in Molecular Biology 2007 John Wiley and Sons, Inc.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Cold Spring Harbor.
В вариантах осуществления иммунодепрессанты, представленные в настоящем документе, связаны с синтетическими наноносителями. В предпочтительных вариантах осуществления иммунодепрессант представляет собой элемент, который является дополнением к материалу, который образует структуру синтетического наноносителя. Например, в одном варианте осуществления, где синтетический наноно-ситель образован одним или несколькими полимерами, иммунодепрессант представляет собой соединение, которое является дополнительным и связано с одним или несколькими полимерами. В качестве другого примера, в одном варианте осуществления, где синтетический наноноситель образован одним или несколькими липидами, иммунодепрессант снова является дополнительным и связан с одним или несколькими липидами. В вариантах осуществления, таких как те, где материал синтетического наноноси-теля также приводит в результате к иммуноподавляющему (например, толерогенному) эффекту, имму-нодепрессант представляет собой элемент, присутствующий в дополнение к материалу синтетического наноносителя, который приводит в результате к иммуноподавляющему (например, толерогенному) эффекту.
Другие иллюстративные иммунодепрессанты без ограничения включают низкомолекулярные лекарственные средства, естественные продукты, антитела (например, антитела к CD20, CD3, CD4), биологические лекарственные средства, лекарственные средства на основе углеводов, наночастицы, липосомы, RNAi, антисмысловые нуклеиновые кислоты, аптамеры, метотрексат, NSAID; финголимод; натализумаб; алемтузумаб; антитела к CD3; такролимус (FK506) и т.д. Дополнительные иммунодепрессанты являются известными специалистам в данной области техники, и настоящее изобретение не ограничено в этом отношении.
"Воспалительное заболевание" означает заболевание, расстройство или состояние, при котором происходит нежелательное воспаление.
"Нагрузка" иммунодепрессантом или антигеном представляет собой количество иммунодепрессан-та или антигена, связанного с синтетическим наноносителем на основе общего веса материалов в целом синтетическом наноносителе (вес./вес.). Как правило, нагрузка рассчитывается как среднее во всем множестве синтетических наноносителей. В одном варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантом в среднем во всем первом множестве синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50%. В другом варианте осуществления нагрузка антигеном в среднем во всем первом и/или втором множестве синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50%. В еще одном варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантом и/или антигеном составляет от 0,01 до 20%. В дополнительном варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантом и/или антигеном составляет от 0,1 до 10%. В еще одном дополнительном варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантом и/или антигеном составляет от 1 до 10%. В еще одном варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантом и/или антигеном составляет по меньшей мере 0,1%, по меньшей мере 0,2%, по меньшей мере 0,3%, по меньшей мере 0,4%, по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 0,6%, по меньшей мере 0,7%, по меньшей мере 0,8%, по меньшей мере 0,9%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 20% в среднем во всем множестве синтетических наноноси
телей. В еще одном дополнительном варианте осуществления нагрузка иммунодепрессантом и/или антигеном составляет 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19 или 20% в среднем во всем множестве синтетических наноносителей. В некоторых вариантах осуществления указанных выше вариантов осуществления нагрузка иммунодепрессантом и/или антигеном составляет не более 25% в среднем во всем множестве синтетических наноносителей. В вариантах осуществления нагрузка рассчитывается, как описано в примерах.
В вариантах осуществления любой из представленных композиций и способов нагрузка может быть рассчитана следующим образом. Приблизительно 3 мг синтетических наноносителей получают и центрифугируют, чтобы отделить супернатант от осадка синтетических наноносителей. К осадку добавляют ацетонитрил и образец обрабатывают ультразвуком и центрифугируют, чтобы удалить какой-либо нерастворимый материал. Супернатант и осадок впрыскивают на RP-HPLC и регистрируют поглощение при 278 нм. Количество в мкг, обнаруженное в осадке, используют для расчета % захваченного количества (нагрузка), количество мкг в супернатанте и осадке используют для расчета полученного общего количества в мкг.
"Поддерживающая доза" относится к дозе, которую вводят субъекту после того, как начальная доза привела в результате к иммуноподавляющему (например, толерогенному) ответу у субъекта, для поддержания необходимого иммуноподавляющего (например, толерогенного) ответа. Поддерживающая доза, например, может являться дозой, которая поддерживает толерогенный эффект, достигнутый после начальной дозы, предупреждает нежелательный иммунный ответ у субъекта или предупреждает то, что субъект становится субъектом, подверженным риску возникновения нежелательного иммунного ответа, включая нежелательный уровень иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза является дозой, которая достаточна для поддержания соответствующего уровня необходимого иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза является дозой, которая достаточная для поддержания соответствующего титра антител или уровня количества и/или активности регуляторных В-клеток, необходимых для поддержания толерогенного иммунного ответа или защиты от индукции при помощи средства, которое приводит к нежелательному иммунному ответу.
"Максимальный размер синтетического наноносителя" означает самый большой размер наноноси-теля, измеренный вдоль любой оси синтетического наноносителя. "Минимальный размер синтетического наноносителя" означает самый маленький размер синтетического наноносителя, измеренный вдоль любой оси синтетического наноносителя. Например, для сфероидального синтетического наноносителя максимальный и минимальный размер синтетического наноносителя будет, по сути, идентичным, и будет являться размером его диаметра. Аналогично, для кубовидного синтетического наноносителя минимальный размер синтетического наноносителя будет являться наименьшим из его высоты, ширины или длины, тогда как максимальный размер синтетического наноносителя будет являться наибольшим из его высоты, ширины и длины. В варианте осуществления минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических нано-носителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце, равен или превышает 100 нм. В варианте осуществления максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, синтетических наноносителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце, равен или составляет менее 5 мкм. Предпочтительно минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, синтетических наноносителей в образце, на основе общего числа синтетических наноносителей в образце, составляет более 110 нм, более предпочтительно более 120 нм, более предпочтительно более 130 нм и еще более предпочтительно более 150 нм. Коэффициенты пропорциональности максимальных и минимальных размеров синтетических наноносителей по настоящему изобретению могут варьировать в зависимости от варианта осуществления. Например, характеристические отношения максимального к минимальному размеров синтетических наноносителей могут варьироваться от 1:1 до 1000000:1, предпочтительно от 1:1 до 100000:1, более предпочтительно от 1:1 до 10000:1, более предпочтительно от 1:1 до 1000:1, также более предпочтительно от 1:1 до 100:1 и еще более предпочтительно от 1:1 до 10:1. Предпочтительно чтобы максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических наноносителей в образце, на основе общего количества синтетических наноносителей в образце, был равным или менее 3 мкм, более предпочтительно равным или менее 2 мкм, более предпочтительно равным или менее 1 мкм, более предпочтительно равным или менее 800 нм, более предпочтительно равным или менее 600 нм и еще более предпочтительно равным или менее 500 нм. В предпочтительных вариантах осуществления минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, синтетических наноносителей в образце, на основе общего количества синтетических наноносителей в образце, равен или составляет более 100 нм, более предпочтительно равен или составляет более 120 нм, более предпочтительно равен или составляет более 130 нм, более предпочтительно равен или составляет более 140 нм и еще более предпочтительно равен или составляет более 150 нм. Измерение размеров синтетического наноносителя (например, диаметра) получают путем суспендирования синтетических наноносителей в жидких (обычно водных) сре
дах и с применением динамического рассеяния света (DLS) (например, с применением устройства Brookhaven ZetaPALS). Например, суспензию синтетических наноносителей можно разбавить из водного буфера в очищенную воду до достижения конечной концентрации суспензии синтетических наноносите-лей примерно от 0,01 до 0,1 мг/мл. Разбавленную суспензию можно получить непосредственно внутри или перенести в подходящую кювету для DLS-анализа. Кювету можно затем поместить в DLS, обеспечить уравновешивание до контролируемой температуры, и затем сканировать в течение достаточного периода времени для достижения стабильного и воспроизводимого рассеяния на основании соответствующих исходных параметров вязкости среды и рефракционных индексов образца. Затем регистрируют эффективный диаметр или среднее распределения. "Размер", или "величина", или "диаметр" синтетических наноносителей означает среднее распределения по размеру частиц, полученного с применением динамического рассеяния света.
"МНС" относится к главному комплексу гистосовместимости, большому геномному участку или семейству генов, обнаруженому у большинства позвоночных, который кодирует молекулы МНС, которые демонстрируют фрагменты или эпитопы процессированных белков на клеточной поверхности. Представление МНС:пептид на клеточных поверхностях обеспечивает надзор с помощью иммунных клеток, обычно Т-клетки. Существует два основных класса молекул МНС: I класс и II класс. Как правило, молекулы МНС I класса обнаруживаются на клетках, содержащих ядро, и представляют пептиды ци-тотоксическим Т-клеткам. Молекулы МНС II класса обнаруживаются на определенных иммунных клетках, главным образом, макрофагах, В-клетках и дендритных клетках, в совокупности известных как профессиональные АРС. Наиболее хорошо известные гены в участке МНС представляют собой подкласс, который кодирует антиген-представляющие белки на клеточной поверхности. У людей эти гены называются гены антигена лейкоцитов человека (HLA).
"Не содержащий концевую метоксигруппу полимер" означает полимер, который содержит по меньшей мере один конец, который заканчивается фрагментом, отличным от метоксигруппы. В некоторых вариантах осуществления полимер содержит по меньшей мере два конца, которые заканчиваются фрагментом, отличным от метоксигруппы. В других вариантах осуществления полимер не содержит концов, которые заканчиваются метоксигруппой. "Не содержащий концевую метоксигруппу блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена" означает полимер, отличающийся от линейного блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена метоксигруппой на обоих концах. Полимерные наночастицы, как представлено в настоящем документе, могут содержать не содержащие концевую ме-токсигруппу полимеры или не содержащие концевую метоксигруппу блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена.
"Полученный" означает взятый непосредственно из материала и применяемый, по сути, без модификации и/или обработки.
"Фармацевтически приемлемый наполнитель" означает фармакологически неактивный материал, применяемый вместе с указанными синтетическими наноносителями для составления композиций по настоящему изобретению. Фармацевтически приемлемые наполнители включают ряд материалов, известных в настоящем уровне техники, в том числе без ограничения сахариды (такие как глюкоза, лактоза и т.п.), консерванты, такие как противомикробные средства, восстанавливающие средства, окрашивающие средства, солевой раствор (такой как фосфатно-солевой буфер) и буферы.
"Протокол" относится к любому режиму дозирования одного или нескольких веществ субъекту. Режим дозирования может включать количество, частоту и/или способ введения. В некоторых вариантах осуществления такой протокол может применяться для введения одной или нескольких композиций по настоящему изобретению одному или нескольким исследуемым субъектам. Иммунные ответы у этих исследуемых субъектов затем можно оценивать для определения того, был ли протокол эффективным или нет при снижении нежелательного иммунного ответа или обеспечении образования необходимого иммунного ответа (например, стимуляции толерогенного эффекта). Любой другой терапевтический и/или профилактический эффект также можно оценивать вместо или в дополнение к указанным выше иммунным ответам. Имел ли протокол необходимый эффект или нет, может быть определено с применением любого из способов, представленных в настоящем документе или иным образом известных в данной области техники. Например, популяция клеток может быть получена из субъекта, которому композиция, представленная в настоящем документе, была введена согласно специфическому протоколу для того, чтобы определить снижалось ли количество, образовывались ли, активировались ли и т.д. или нет специфические иммунные клетки, цитокины, антитела и т.д. Применимые способы для обнаружения присутствия и/или числа иммунных клеток включают без ограничения способы с использованием проточной цитометрии (например, FACS) и иммуногистохимические способы. Антитела и другие связывающие средства для специфического окрашивания маркеров иммунных клеток являются коммерчески доступными. Такие наборы типично включают окрашивающие реагенты для множественных антигенов, которые обеспечивают основанное на FACS обнаружение, разделение и/или количественное определение необходимой клеточной популяции из гетерогенной популяции клеток.
"Обеспечение субъекта" представляет собой любое действие или набор действий, которое приводит к тому, что врач контактирует с субъектом и вводит ему композицию, представленную в настоящем до
кументе, или осуществлять по отношению к нему способ, представленный в настоящем документе. Предпочтительно субъект является субъектом, который нуждается в толерогенном иммунном ответе, как представлено в настоящем документе. Действие или набор действий может осуществляться либо непосредственно сам по себе, либо опосредовано, например, без ограничения, посредством несвязанной третьей стороны, которая предпринимает действие посредством уверенности в чьих-то словах или делах.
"Регуляторные В-клетки" являются общепринятыми в данной области техники и относятся к типу толерогенных В-клеток или клеток, которые имеют подавляющую регуляторную функцию. Характеристика поверхностных маркеров и хемокиновых профилей регуляторных В-клеток, а также подклассы регуляторных В-клеток (например, продуцирующие IL-10 Breg) являются известными специалистам в данной области техники (например, как описано в DiLillo et al., B10 cells and regulatory В cells balance immune response during inflammation, autoimmunity, and cancer, Ann N. Y. Acad. Sci. 1183 (2010) 38-57, ISSN 0077-8923; полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки). Присутствие регуляторных В-клеток может быть определено путем внутриклеточного окрашивания в отношении IL- 10 с помощью проточной цитометрии. Например, после обработки В-клетки могут быть окрашены в отношении поверхностных маркеров, затем зафиксированы, и пермеабилизированы, и окрашены в отношении внутриклеточного IL-10, и проанализированы с помощью проточной цитометрии.
"Субъект" означает животных, включая теплокровных млекопитающих, таких как люди и приматы; птиц; прирученных, домашних или сельскохозяйственных животных, таких как кошки, собаки, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади и свиньи; лабораторных животных, таких как мыши, крысы и морские свинки; рыб; рептилий; животных зоопарков и диких животных, и подобное.
"По сути, нет ограниченных классом I MHC эпитопов" относится к отсутствию ограниченных классом I MHC эпитопов в количестве, которое само по себе, в контексте антигена, в соединении с носителем или в соединении с композицией по настоящему изобретению стимулирует активацию иммунного ответа, специфического по отношению к эпитопу, присутствующему в контексте I класса. В вариантах осуществления композиция, по сути, без ограниченных классом I MHC эпитопов не содержит измеряемое количество ограниченных классом I MHC эпитопов антигена. В других вариантах осуществления такая композиция может содержать измеряемое количество ограниченных классом I MHC эпитопов антигена, но указанное количество не является эффективным для образования измеряемого цитотоксического Т-клеточного иммунного ответа (само по себе, в контексте антигена, в соединении с носителем или в соединении с композицией по настоящему изобретению) или не является эффективным для образования значительного измеряемого цитотоксического Т-клеточного иммунного ответа (само по себе, в контексте антигена, в соединении с носителем или в соединении с композицией по настоящему изобретению). В некоторых вариантах осуществления значительный измеряемый цитотоксический Т-клеточный иммунный ответ представляет собой таковой, который производит или, как предполагается, будет производить неблагоприятный клинический результат у субъекта. В других вариантах осуществления значительный измеряемый цитотоксический Т-клеточный иммунный ответ представляет собой таковой, который больше, чем уровень того же типа иммунного ответа, произведенного контрольным антигеном (например, таким, который, как известно, не содержит ограниченные классом I MHC эпитопы или не стимулирует цитотоксические Т-клеточные иммунные ответы).
В вариантах осуществления композиции не содержат ограниченные классом I МНС эпитопы (сами по себе, в контексте антигена, в соединении с носителем или в соединении с композицией по настоящему изобретению), которые образуют антиген-специфические цитотоксические Т-клеточные иммунные ответы или их нежелательный уровень. В некоторых вариантах осуществления для подтверждения того, что композиция не содержит такие эпитопы, антигены выбирают так, чтобы они не содержали ограниченные классом I МНС эпитопы для связывания с синтетическими наноносителями, как представлено в настоящем документе. В других вариантах осуществления для подтверждения того, что композиция не содержит такие эпитопы, синтетические наноносители, связанные с антигеном, получают и исследуют в отношении цитотоксических Т-клеточных иммунных ответов. Подходящие синтетические наноносители затем могут быть выбраны.
"Синтетический(е) наноноситель(и)" означает отдельный объект, который не встречается в природе и который обладает по меньшей мере одним размером, который составляет менее 5 микрон или равен 5 микрон по размеру. Альбуминовые наночастицы, как правило, включены в качестве синтетических на-ноносителей, тем не менее, в определенных вариантах осуществления синтетические наноносители не содержат альбуминовые наночастицы. В вариантах осуществления изобретательские синтетические на-ноносители не включают хитозан. В других вариантах осуществления синтетические наноносители по настоящему изобретению не являются наночастицами на основе липидов. В дополнительных вариантах осуществления синтетические наноносители по настоящему изобретению не содержат фосфолипид.
Синтетический наноноситель может представлять собой без ограничения одну или множество на-ночастиц на основе липидов (также в настоящем документе имеющих название липидные наночастицы, т.е. наночастицы, где большую часть материала, который образует их структуру, представляют собой липиды), полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе поверхностно-активных веществ, дендримеры, бакиболы, нанонити, вирусоподобные частицы (т.е. частицы, которые, в
первую очередь, образованы вирусными структурными белками, но которые не являются инфекционными или имеют низкую инфекционность), частицы на основе пептидов или белков (также в настоящем документе имеющие название белковые частицы, т.е. частицы, где большую часть материала, который образует их структуру, представляют собой пептиды или белки) (такие как альбуминовые наночастицы), и/или наночастицы, которые разработаны с применением комбинации наноматериалов, такие как липид-полимерные наночастицы. Синтетические наноносители могут иметь различные формы, включая без ограничения сфероидальную, кубовидную, пирамидальную, продолговатую, цилиндрическую, тороидальную и подобное. Синтетические наноносители согласно настоящему изобретению содержат одну или несколько поверхностей. Иллюстративные синтетические наноносители, которые могут быть адаптированы для применения в практическом осуществлении настоящего изобретения, содержат (1) биораз-лагаемые наночастицы, раскрытые в патенте США № 5543158, выданном Gref et al., (2) полимерные на-ночастицы из опубликованной заявки на патент США № 20060002852, поданной Saltzman et al., (3) литографически сконструированные наночастицы из опубликованной заявки на патент США № 20090028910, поданной DeSimone et al., (4) раскрытие публикации международной заявки WO 2009/051837, поданной von Andrian et al., (5) наночастицы, раскрытые в опубликованной заявке на патент США № 2008/0145441, поданной Penades et al., (6) белковые наночастицы, раскрытые в опубликованной заявке на патент США № 20090226525, поданной de los Rios et al., (7) вирусоподобные частицы, раскрытые в опубликованной заявке на патент США № 20060222652, поданной Sebbel et al., (8) связанные с нуклеиновыми кислотами вирусоподобные частицы, раскрытые в опубликованной заявке на патент США № 20060251677, поданной Bachmann et al., (9) вирусоподобные частицы, раскрытые в
публикации международной заявки WO 2010047839A1 или WO 2009106999А2, (10) наноосажден-ные наночастицы, раскрытые в P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010), или (11) апоптотиче-ские клетки, апоптотические тела или синтетические или полусинтетические имитаторы, раскрытые в публикации США 2002/0086049. В вариантах осуществления синтетические наноносители могут обладать соотношением сторон более 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, или более 1:10.
Синтетические наноносители согласно настоящему изобретению, которые имеют минимальный размер, который равен или составляет менее чем около 100 нм, предпочтительно равен или составляет менее чем около 100 нм, не содержат поверхность с гидроксильными группами, которые активируют комплемент или альтернативно содержат поверхность, которая состоит, по существу, из фрагментов, которые не являются гидроксильными группами, которые активируют комплемент. В предпочтительном варианте осуществления синтетические наноносители согласно настоящему изобретению, которые имеют минимальный размер, который равен или составляет менее чем около 100 нм, предпочтительно равен или составляет менее чем 100 нм, не содержат поверхность, которая, по сути, активирует комплемент или, в альтернативном случае, содержат поверхность, которая состоит, по существу, из фрагментов, которые, по сути, не активируют комплемент. В более предпочтительном варианте осуществления синтетические наноносители согласно настоящему изобретению, которые имеют минимальный размер, который равен или составляет менее чем около 100 нм, предпочтительно равен или составляет менее чем 100 нм, не содержат поверхность, которая активирует комплемент или, в альтернативном случае, содержат поверхность, которая состоит, по существу, из фрагментов, которые не активируют комплемент. В вариантах осуществления синтетические наноносители не включают вирусоподобные частицы. В вариантах осуществления синтетические наноносители могут обладать коэффициентом пропорциональности, более 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или более 1:10.
"Т-клеточный антиген" означает CD4+ Т-клеточный антиген или CD8+-клеточный антиген. "CD4+ Т-клеточный антиген" означает любой антиген, который распознается с помощью CD4+ Т-клетки и запускает иммунный ответ в CD4+ Т-клетке, например, антиген, который специфически распознается Т-клеточным рецептором на CD4+ Т-клетке посредством представления антигена или его части, связанной с молекулой главного комплекса гистосовместимости II класса (МНС). "CD8+ Т-клеточный антиген" означает любой антиген, который распознается с помощью CD8+ Т-клетки и запускает иммунный ответ в CD8+ Т-клетке, например, антиген, который специфически распознается Т-клеточным рецептором на CD8+ T-клетке посредством представления антигена или его части, связанной с молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса (МНС). В некоторых вариантах осуществления антиген, который является Т-клеточным антигеном, также является В-клеточным антигеном. В других вариантах осуществления Т-клеточный антиген не является также В-клеточным антигеном. Т-клеточные антигены, как правило, представляют собой белки или пептиды.
"Терапевтический белок " относится к любому белку или белковой заместительной терапии, применяемой к субъекту и имеющей терапевтический эффект. Такие виды терапии включают белковую заместительную и белковую дополняющую терапии. Такие виды терапии также включают введение экзогенного или чужеродного белка, применение различных видов терапии антителами и клеточной терапии. Терапевтические белки включают ферменты, кофакторы ферментов, гормоны, факторы свертываемости крови, цитокин, факторы роста, моноклональные антитела и поликлональные антитела. Примеры других терапевтических белков приведены в тексте настоящего документа. Терапевтические белки могут быть
образованы в клетках, на их поверхности или их посредством и получены из таких клеток и введены в форме таких клеток. В вариантах осуществления терапевтический белок образуется в клетках млекопитающих, насекомых, дрожжей, бактерий, растений, трансгенных животных клеток, трансгенных растительных клеток, на их поверхности или их посредством, и т.д. Терапевтический белок может рекомби-нантно образовываться в подобных клетках. Терапевтический белок может образовываться в трансформированной вирусом клетке, на ее поверхности или посредством ее. Терапевтический белок также может образовываться в аутологических клетках, трансфицированных, трансдуцированных или измененных иным способом для его экспрессии. В альтернативном случае, терапевтический белок может быть введен в виде нуклеиновой кислоты или путем встраивания нуклеиновой кислоты в вирус, VLP, липосому и т.д. Альтернативно терапевтический белок можно получить из таких форм и ввести как собственно терапевтический белок. Субъекты, таким образом, включают любой субъект, который получал, получает или будет получать что-либо из вышеупомянутого. Такой субъект включает субъекты, которые получали, получают или будут получать генную терапию, аутологические клетки, трансфицированные, трансдуци-рованные или измененные иным способом, чтобы экспрессировать терапевтический белок, полипептид или пептид; или клетки, экспрессирующие терапевтический белок, полипептид или пептид.
"Антиген терапевтического белка" означает антиген, ассоциированный с терапевтическим белком, который может быть или его часть может быть представлена для распознавания клетками иммунной системы и может обеспечивать образование нежелательного иммунного ответа (например, продукцию терапевтических белок-специфических антител) против терапевтического белка. Антигены терапевтического белка обычно включают белки, полипептиды, пептиды, липопротеины, или содержатся или вырабатываются в или на клетках или посредством клеток.
"Толерогенные иммунный ответ" означает любой иммунный ответ, который может привести к подавлению иммунитета, специфическому по отношению к антигену или клетке, ткани, органу и т.д., который экспрессирует такой антиген. Такие иммунные ответы включают любое снижение, задержку или ингибирование нежелательного иммунного ответа, специфического по отношению к антигену или клетке, ткани, органу и т.д., который экспрессирует такой антиген. Такие иммунные ответы также включают любую стимуляцию, продукцию, индукцию, активацию или рекрутинг в необходимом иммунном ответе, специфическом к антигену или клетке, ткани, органу и т.д. который экспрессирует такой антиген. Толе-рогенные иммунные ответы, следовательно, включают отсутствие или снижение нежелательного иммунного ответа к антигену, что может быть опосредовано антиген-реактивными клетками, а также присутствие или стимуляцию супрессорных клеток. Толерогенные иммунные ответы, как представлено в настоящем документе, включают иммунологическую толерантность. "Обеспечивать образование толерогенного иммунного ответа" относится к образованию любого из перечисленных выше иммунных ответов, специфических по отношению к антигену или клетке, ткани, органу и т.д., который экпрессирует такой антиген. Толерогенный иммунный ответ могут быть результатом ограниченного классом I MHC представления и/или ограниченного классом II МНС представления и/или В-клеточного представления и/или представления с помощью CD1d и т.д. В вариантах осуществления для подтверждения того, что композиция содержит необходимые эпитопы, антигены выбирают так, чтобы они содержали такие эпитопы для связывания с синтетическими наноносителями, как представлено в настоящем документе. В других вариантах осуществления для подтверждения того, что композиция содержит такие эпитопы, синтетические наноносители, связанные с антигеном, получают и исследуют в отношении регуляторных В-клеточных иммунных ответов, например, активация или образование. Затем могут быть выбраны подходящие синтетические наноносители.
Толерогенные иммунные ответы включают любое снижение, задержку или ингибирование пролиферации и/или активности CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток или В-клеток. Толерогенные иммунные ответы также включают снижение продукции антиген-специфических антител. Толерогенные иммунные ответы могут также включать любой ответ, который приводит к стимуляции, индукции, продукции или рекру-тингу регуляторных клеток, таких как CD4+ Treg клетки, CD8+ Treg клетки, Breg клетки и т.д. В некоторых вариантах осуществления толерогенный иммунный ответ представляет собой такой, который приводит к переходу на регуляторный фенотип, характеризующийся продукцией, индукцией, стимуляцией или рекрутингом регуляторных клеток.
Толерантные иммунные ответы также включают любой ответ, ведущий к стимуляции, вырабатыванию или рекрутингу CD4+ Т-регуляторных клеток или CD8+ Т-регуляторных клеток. CD4+ Т-регуляторные клетки могут экспрессировать фактор транскрипции FoxP3 и ингибировать воспалительные ответы или аутоиммунные воспалительные заболевания (Human regulatory T cells in autoimmune diseases. Cvetanovich GL, Hafler DA. Curr Opin Immunol. 2010 Dec; 22(6):753-60. Regulatory T cells and auto-immunity. Vila J, Isaacs JD, Anderson AE.Curr Opin Hematol. 2009 Jul; 16(4):274-9). Такие клетки также подавляют Т-клеточный хелперный сигнал В-клеткам и индуцируют толерантность как в своим, так и чужеродным антигенам (Therapeutic approaches to allergy and autoimmunity based on FoxP3+ regulatory T-cell activation and expansion. Miyara M, Wing K, Sakaguchi S. J Allergy Clin Immunol. 2009 Apr; 123(4):749-55). CD4+ Treg клетки распознают антиген, когда он представлен белками II класса на АРС. CD8+ Treg клетки, которые распознают антиген, представленный I классом (и Qa-1), могут также подавлять Т
клеточный хелперный сигнал В-клеткам и приводить к активации антиген-специфического подавления, индуцируя толерантность как к своим, так и чужеродным антигенам. Было показано, что нарушение взаимодействия Qa-1 с клетками CD8+ Treg вызывает нарушение регуляции иммунных ответов и развитие образования ауто-антител и аутоиммунной смертельной системной красной волчанки (Kim et al., Nature. 2010 Sep 16, 467 (7313): 328-32). Также было показано, что CD8+ Treg клетки ингибируют модели аутоиммунных воспалительных заболеваний, включая ревматоидный артрит и колит (CD4+ CD25+ regulatory T cells in autoimmune arthritis. Oh S, Rankin AL, Caton A J. Immunol Rev. 2010 Jan; 233(1):97-111. Regulatory T cells in inflammatory bowel disease. Boden EK, Snapper SB. Curr Opin Gastroenterol. 2008 Nov; 24(6):733-41). В некоторых вариантах осуществления представленные композиции могут эффективно приводить к обоим типам ответов (CD4+ Treg и CD8+ Treg). В других вариантах осуществления FoxP3 может индуцироваться в других иммунных клетках, таких как макрофаги, iNKT-клетки и т.д., и композиции, представленные в настоящем документе, могут также приводить к одному или нескольким из этих ответов.
Толерогенные иммунные ответы также включают, но без ограничения, индуцирование регулятор-ных цитокинов, таких как цитокины Treg; индуцирование ингибирующих цитокинов; ингибирование воспалительных цитокинов (например, IL-4, IL-1b, IL-5, TNF-a, IL-6, GM-CSF, IFN-y, IL-2, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, M-CSF, С-реактивного белка, белка острой фазы, хемокинов (например, МСР-1, RANTES, MIP-1a, MIP-1P, MIG, ITAC или IP-10), продуцирование противовоспалительных цитокинов (например, IL-4, IL-13, IL-10 и т.д.), хемокинов (например, CCL-2, CXCL8), протеаз (например, ММР-3, ММР-9), лейкотриенов (например, CysLT-1, CysLT-2), простагландинов (например, PGE2) или гистаминов; ингибирование ориентирования в отношении Th17, Th1 или Th2 иммунного ответа; ингиби-рование эффекторных клеточно-специфических цитокинов: Th17 (например, IL-17, IL-25), Th1 (IFN-y), Th2 (например, IL-4, IL-13); ингибирование Th1-, Th2- или ТН17-специфических факторов транскрипции; ингибирование пролиферации эффекторных Т-клеток; индукцию апоптоза эффекторных Т-клеток; индукцию генов, специфических для толерогенных дендритных клеток, индукцию экспрессии FoxP3, ингибирование индукции IgE или IgE-опосредованных иммунных ответов, ингибирование гуморальных иммунных ответов (например, образование антиген-специфических антител); ингибирование клеточного ответа при участии Т-хелперов; образование TGF-р и/или IL-10; ингибирование эффекторной функции аутоантител (например, ингибирование элиминации клеток, повреждения клетки или ткани или активации комплемента) и т.д.
Любое из перечисленного выше может быть измерено in vivo в одной или нескольких животных моделях или может быть измерено in vitro. Специалист в данной области техники знаком с такими измерениями in vivo или in vitro. Нежелательные иммунные ответы или толерогенные иммунные ответы могут быть подвергнуты мониторингу с применением, например, способов оценки числа и/или функции иммунных клеток, тетрамерного анализа ELISPOT, анализа экспрессии цитокинов на основании проточной цитометрии, секреции цитокинов, анализа профиля экспрессии цитокинов, анализа профиля генной экспрессии, анализа маркеров клеточной поверхности, обнаружение на основе ПЦР частоты использования гена рецептора иммунной клетки (смотрите Т. Clay et al., "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer" Clinical Cancer Research 7:1127-1135 (2001)) и т.д. Нежелательные иммунные ответы или толерогенные иммунные ответы могут также быть подвергнуты мониторингу с применением, например, способов оценки уровней белка в плазме или сыворотке, анализов пролиферации и/или функционирования иммунных клеток и т.д. В некоторых вариантах осуществления толероген-ные иммунные ответы быть подвергнуты мониторингу путем оценки индукции FoxP3. Кроме того, специфические способы описаны более подробно в примерах.
Предпочтительно толерогенные иммунные ответы приводят к ингибированию развития, прогресси-рования или патологии заболеваний, расстройств или состояний, описанных в настоящем документе. Могут ли композиции по настоящему изобретению привести к ингибированию развития, прогрессирова-ния или патологии заболеваний, расстройств или состояний, описанных в настоящем документе, может быть измерено с помощью животных моделей таких заболеваний, расстройств или состояний. В некоторых вариантах осуществления снижение нежелательного иммунного ответа или образование толероген-ного иммунного ответа могут быть оценены путем определения клинических результатов, клинической эффективности, клинических симптомов, биомаркеров заболевания и/или клинических параметров. Нежелательные иммунные ответы или толерогенные иммунные ответы могут также быть оценены с помощью диагностических исследований для оценки присутствия или отсутствия заболевания, расстройства или состояния, как представлено в настоящем документе. Нежелательные или необходимые иммунные ответы могут, кроме того, быть оценены с помощью способов измерения уровней и/или функции терапевтических белков у субъекта. В вариантах осуществления способы для наблюдения или оценки нежелательных аллергических ответов включают оценку аллергического ответа у субъекта путем кожных реакций и/или выработкой аллерген-специфических антител.
В некоторых вариантах осуществления мониторинг или оценка образования нежелательного иммунного ответа или толерогенного иммунного ответа у субъекта может иметь место перед введением
композиции синтетических наноносителей, представленной в настоящем документе и/или перед введением пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В других вариантах осуществления оценка образования нежелательного иммунного ответа или толерогенного иммунного ответа может иметь место после введения композиции синтетических наноно-сителей, представленной в настоящем документе и/или после введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В некоторых вариантах осуществления оценку проводят после введения композиции синтетических наноносителей, но перед введением пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В других вариантах осуществления оценку проводят после введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена, но перед введением композиции. В других вариантах осуществления оценку проводят как перед введением синтетических наноносителей, так и перед введением пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена, тогда как в других вариантах осуществления оценку проводят как после введения синтетических наноносителей, так и введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В дополнительных вариантах осуществления оценку проводят как перед, так и после введения синтетических наноносителей и/или введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В других вариантах осуществления оценку проводят более одного раза на субъекте для определения того, что необходимое иммунное состояние поддерживается у субъекта, например, у субъекта, который имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплант против хозяина". Другие субъекты включают тех, которым проделали или будут делать трансплантацию, а также те, которые получили, получают или будут получать терапевтический белок, против которого они испытали, испытывают или, предполагается, что испытывают нежелательный иммунный ответ.
Ответ антител может быть оценен путем определения титра одного или нескольких антител. "Титр антител" означает измеряемый уровень продукции антитела. Способы измерения титров антител известны в данной области техники и включают ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA). В вариантах осуществления ответ антител может быть измерен количественно, например, в виде количества антител, концентрации антител или титра. Значения могут быть абсолютными или они могут быть относительными. Анализы для количественного определения ответа антитела включают анализы захвата антител, ферментные иммуносорбентные анализы (ELISA), анализы ингибирования абсорбции в жидкой фазе (ILPAA), анализы ракетного иммуноэлектрофореза (RIE) и анализы линейного иммуноэлектрофореза (LIE). Когда ответ антитела сравнивается с другим ответом антитела, то тот же тип количественной характеристики (например, титра) и способ измерения (например, ELISA) предпочтительно применяют, чтобы произвести такое сравнение.
Способ ELISA для измерения титра антитела, например, типичный сэндвич-ELISA, может состоять из следующих этапов (i) получение материала для покрытия планшета для ELISA, так чтобы целевое антитело интереса было связано с полимером субстрата или другим подходящим материалом (ii) получение материала покрытия в водном растворе (таком как PBS) и доставка раствора материала покрытия к лункам многолуночного планшета для осаждения в течение ночи покрытия на многолуночном планшете (iii) тщательная отмывка многолуночного планшета буфером отмывки (таким как 0,05% Tween-20 в PBS) для удаления избытка материала покрытия (iv) блокирование планшета для неспецифического связывания путем нанесения раствора разбавителя (такого как 10% фетальной бычьей сыворотки в PBS), (v) отмывка блокирующего/разбавляющего раствора из планшета буфером отмывки (vi) разведение образ-ца(ов) сыворотки, содержащего(их) антитела и соответствующие стандарты (положительные контроли) с разбавителей, что требуется для получения концентрации, которая надлежащим образом насыщает ответ ELISA (vii) серийное разведение образцов плазмы на многолуночном планшете, для того чтобы охватить диапазон концентраций, подходящих для создания кривой ответов ELISA (viii) инкубация планшета для обеспечения нацеленного на антитело связывания (ix) отмывка планшета буфером отмывки для удаления антител, не связанных с антигеном (х) добавление соответствующей концентрации вторичного детекторного антитела в том же разбавителе, такого как связанное с биотином детекторное антитело, способное связывать первичное антитело (xi) инкубация планшета с нанесенным детекторным антителом, с последующей отмывкой буфером отмывки (xii) добавление фермента, такого как стрептавидин-HRP (перокси-даза хрена), который будет связываться с биотином, находящимся на биотинилированными антителами и инкубация (xiii) отмывка многолуночного планшета (xiv) добавление субстрата(ов), (такого как раствор ТМВ) к планшету (xv) нанесение стоп-раствора (такого как 2N серная кислота), когда завершается развитие цвета (xvi) регистрация оптической плотности лунок планшета при специфической длине волны для субстрата (450 нм с вычитанием данных при 570 нм) (xvi) применение подходящей многопараметрической кривой, подходящей к данным, и определение полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС50) в виде концентрации на кривой, при которой достигается половина максимального значения ОП для стандартов планшета.
"Пересаживаемый трансплантируемый материал" относится к биологическому материалу, такому,
как клетки, ткани и органы (целиком или частично), которые могут быть введены субъекту. Пересаживаемые трансплантируемые материалы могут представлять собой аутотрансплантаты, аллотранспланта-ты или ксенотрансплантаты, например, биологического материала, такого как орган, ткань, кожа, кость, нервы, сухожилье, нейроны, кровеносные сосуды, жир, роговица, плюрипотентные клетки, дифференцированные клетки (полученные или имеющих происхождение in vivo или in vitro) и т.д. В некоторых вариантах осуществления пересаживаемый трансплантируемый материал образован, например, из хряща, кости, внеклеточного матрикса или коллагеновых матриц. Пересаживаемые трансплантируемые материалы могут также представлять собой клетки, суспензии клеток или клетки в тканях и органах, которые пригодны для пересадки. Трансплантируемые клетки обычно имеют терапевтическую функцию, например, функцию, которая отсутствует или недостаточна у субъекта-реципиента. Некоторые не ограничивающие примеры трансплантируемых клеток представляют собой р-клетки, гепатоциты, гематопоэтиче-ские стволовые клетки, нейронные стволовые клетки, нейроны, глиальные клетки или миелинезирующие клетки. Трансплантируемые клетки могут быть немодифицированными клетками, например, клетками, полученными от субъекта-донора, и используемые в пересадке без каких-либо генетических или эпигенетических модификаций. В других вариантах осуществления трансплантируемые клетки могут быть модифицированными клетками, например, клетками, полученными от субъекта, имеющего генетический дефект, в которых генетический дефект был устранен, или клетки, которые произведены от перепрограммированных клеток, например, дифференцированных клеток, произведенных из клеток, полученных от субъекта.
"Трансплантация" относится к процессу пересадки (переноса) трансплантируемой пересаживаемой ткани получающему ее субъекту (например, от донорного субъекта, из in vitro источника (например, дифференцированные аутологичные или гетерологичные нативные или индуцированные плюрипотент-ные клетки)) и/или из одного расположения на теле в другое расположение на теле в одном и том же субъекте.
"Нежелательный иммунный ответ" относится к любому нежелательному иммунному ответу, который является результатом воздействия антигена, стимулирует или обостряет заболевание, расстройство или состояние, представленное в настоящем документе (или его симптом), или является симптоматическим в отношении заболевания, расстройства или состояния, представленного в настоящем документе. Такие иммунные ответы, как правило, имеют отрицательное воздействие на здоровье субъекта или являются симптоматическими в отношении отрицательного воздействия на здоровье субъекта.
С. Композиции изобретения
В настоящем документе представлены способы и композиции для образования регуляторных В-клеток. Считается, что регуляторные В-клетки модулируют иммунные ответы, например, в которых IL-10, высвобожденный из регуляторных В-клеток, проявляет противовоспалительные и иммуноподавляю-щие эффекты на большинство гематопоэтических клеток. IL-10 также подавляет продукцию провоспали-тельных цитокинов моноцитами и макрофагами и пролиферацию антиген-специфических CD4+ Т-клеток. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что композиции, представленные в настоящем документе, могут воздействовать на количество и/или активность регуляторных В-клеток in vitro и/или in vivo, например, путем взаимодействия с нативными В-клетками или предшественниками регуляторных В-клеток, приводя к индукции созревания регуляторных В-клеток или увеличению пролиферации и/или активности регуляторных В-клеток. Влияние на количество и/или активность регулятор-ных В-клеток может также быть результатом образования других регуляторных клеточных или толеро-генных иммунных ответов, таких как посредством продукции и/или активации регуляторных Т-клеток.
В настоящем документе представлены толерогенные способы, которые включают введение композиций синтетических наноносителей, содержащих иммунодепрессанты и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, и композиций. Такие способы и композиции применимы для образования, стимуляции или рекрутинга регуляторных В-клеток и стимуляции образования то-лерогенных иммунных ответов. Представленные способы могут также включать введение терапевтических белков и/или пересаживаемых трансплантируемых материалов. Представленные композиции, следовательно, могут также включать терапевтические белки и/или пересаживаемые трансплантируемые материалы. Композиции могут быть введены субъектам, для которых толерогенный иммунный ответ является необходимым. Такие субъекты включают тех, которые имеют или существует риск развития у них воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплант против хозяина". Такие субъекты также включают тех, которым ввели, вводят или будут вводить терапевтический белок, против которого субъект испытал или предполагается, что испытывает нежелательный иммунный ответ. Такие субъекты также включают субъектов, которым проделали или будут делать трансплантацию.
Предпочтительно композиции по настоящему изобретению приводят к образования, рекрутингу или активации регуляторных В-клеток. Одним отличительным признаком регуляторных В-клеток является способность продуцировать и секретировать IL-10. Некоторые регуляторные В-клетки являются CD1d+ или CD1dhigh. Некоторые регуляторные В-клетки являются CD5+ и/или CD19+. Например, некоторые регуляторные В-клетки являются CD1dhighCD5+CD19+. Некоторые регуляторные В-клетки явля
ются CD24+ или CD24high; и/или CD38+ или CD38high. Например, некоторые регуляторные В-клетки являются CD19+CD24highCD38high. Некоторые регуляторные В-клетки продуцируют и секретируют IL-10. Дополнительные поверхностные маркеры и профили секреции хемокинов, которые могут применяться для выявления регуляторных В-клеток, известны специалистам в данной области техники, основываясь на знании о поверхностных маркерах, применимых для выявления различных регуляторных В-клеточных популяций, специалисты в данной области техники способны выявить и подсчитать регуля-торные В-клетки в гетерогенной популяции клеток, например, в популяции клеток в культуре или в популяции клеток, полученных от субъекта.
Как упоминалось выше, синтетические наноносители разработаны так, что они содержат В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы и/или иммунодепрессанты. Широкое разнообразие синтетических наноносителей может применяться согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители представляют собой сферы или сфероиды. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители являются плоскими или имеют пластинчатую форму. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители представляют собой кубы или являются кубическими. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители представляют собой овалы или эллипсы. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители представляют собой цилиндры, конусы или пирамиды.
В некоторых вариантах осуществления желательным является применение множества синтетических наноносителей, которое является относительно однородным в отношении размера, формы и/или состава так, чтобы каждый синтетический наноноситель имел аналогичные свойства. Например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% синтетических наноносителей, на основе общего числа синтетических наноносителей, могут иметь минимальный размер или максимальный размер, который попадает в пределы 5%, 10%, или 20% среднего диаметра или среднего размера синтетических наноносителей. В некоторых вариантах осуществления множество синтетических нано-носителей может быть гетерогенным в отношении размера, формы и/или состава.
Синтетические наноносители могут быть плотными или полыми и могут содержать один или несколько слоев. В некоторых вариантах осуществления каждый слой имеет уникальный состав и уникальные свойства относительно другого слоя(ев). Для предоставления только одного примера, синтетические наноносители могут иметь структуру ядро/оболочка, в которой один слой (например, полимерное ядро) и оболочка представляет собой второй слой (например, липидный бислой или монослой). Синтетические наноносители могут содержать множество различных слоев.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут необязательно содержать один или несколько липидов. В некоторых вариантах осуществления а синтетические наноноситель могут содержать липосому. В некоторых вариантах осуществления а синтетические наноноситель может содержать липидный бислой. В некоторых вариантах осуществления а синтетические наноноситель может содержать липидный монослой. В некоторых вариантах осуществления а синтетические наноноси-тель может содержать мицеллу. В некоторых вариантах осуществления а синтетические наноноситель может содержать ядро, содержащее полимерную матрицу, окруженную липидным слоем (например, ли-пидным бислоем, липидным монослоем и т.д.). В некоторых вариантах осуществления синтетические наноноситель может содержать неполимерное ядро (например, частицу металла, квантовую точку, керамическую частицу, частицу кости, вирусную частицу, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д.), окруженное липидным слоем (например, липидным бислоем, липидным монослоем и т.д.).
В других вариантах осуществления синтетические наноносители могут содержать частицы металла, квантовые точки, керамические частицы и т.д. В некоторых вариантах осуществления неполимерный синтетический наноноситель является агрегатом неполимерных компонентов, например, агрегатом атомов металла (например, атомов золота).
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут необязательно содержать один или несколько амфифильных соединений. В некоторых вариантах осуществления амфифиль-ное соединение может стимулировать продукцию синтетических наноносителей с повышенной растворимостью, улучшенной однородностью или увеличенной вязкостью. В некоторых вариантах осуществления амфифильные соединения могут быть ассоциированы с внутренней поверхностью липидной мембраны (например, липидным бислоем, липидным монослоем и т.д.). Многие амфифильные соединения, известные в данной области техники, являются подходящими для применения в получении синтетических наноносителей согласно настоящему изобретению. Такие амфифильные соединения включают без ограничения фосфоглицериды; фосфатидилхолины; дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC); диолеил-фосфатидилэтаноламин (DOPE); диолеилоксипропилтриэтиламмоний (DOTMA); диолеоилфосфатидил-холин; холестерол; сложный эфир холестерола; диацилглицерол; диацилглицеролсукцинат; дифосфати-дилглицерол (DPPG); гександеканол; жирные спирты, такие как полиэтиленгликоль (PEG); полиоксиэти-лен-9-лауриловый эфир; поверхностно-активная жирная кислота, такая как пальмитиновая кислота или олеиновая кислота; жирные кислоты; моноглицериды жирных кислот; диглицериды жирных кислот; амиды жирных кислот; сорбитантриолеат (Span(r)85) гликохолат; сорбитанмонолаурат (Span(r)20); поли
сорбат 20 (Tween(r)20); полисорбат 60 (Tween(r)60); полисорбат 65 (Tween(r)65); полисорбат 80 (Tween(r)80); полисорбат 85 (Tween(r)85); полиоксиэтиленмоностеарат; сурфактин; полоксомер; сложный эфир сорбитана и жирной кислоты, такой как сорбитантриолеат; лецитин; лизолецитин; фосфатидилсе-рин; фосфатидилинозитол; сфингомиелин; фосфатидилэтаноламин (цефалин); кардиолипин; фосфатид-ная кислота; цереброзиды; дицетилфосфат; дипальмитоилфосфатидилглицерол; стеариламин; додецила-мин; гексадецил-амин; ацетилпальмитат; глицеролрицинолеат; гексадецилстеарат; изопропил миристат; тилоксапол; поли(этиленгликоль)5000-фосфатидилэтаноламин; поли(этиленгликоль)400-моностеарат; фосфолипиды; синтетические и/или натуральные детергенты, имеющие высокие поверхностно-активные свойства; дезоксихолаты; циклодекстрины; хаотропные соли; средства образования пары ионов; и их комбинации. Компонент - амфифильное соединение может являться смесью различных амфифильных соединений. Специалистам в данной области техники будет понятно, что это иллюстративный, не исчерпывающий перечень веществ с поверхностно-активной активностью. Любое амфифильное соединение может применяться в получении синтетических наноносителей, подлежащих применению согласно настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут необязательно содержать один или несколько углеводов. Углеводы могут быть натуральными или синтетическими. Углевод может быть дериватизированным натуральным углеводом. В определенных вариантах осуществления углевод содержит моносахарид или дисахарид, включая без ограничения следующее: глюкоза, фруктоза, галактоза, рибоза, лактоза, сахароза, мальтоза, трегалоза, целлобиоза, манноза, ксилоза, арабиноза, глю-куроновая кислота, галактуроновая кислота, маннуроновая кислота, глюкозамин, галактозамин и нейра-миновая кислота. В определенных вариантах осуществления углевод представляет собой полисахарид, включая без ограничения следующее: пуллулан, целлюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидро-ксипропилметилцеллюлоза (НРМС), гидроксицеллюлоза (НС), метилцеллюлоза (МС), декстран, цикло-декстран, гликоген, гидроксиэтилкрахмал, карагинан, гликон, амилоза, хитозан, ^О-карбоксилметилхитозан, альгин и альгиновая кислота, крахмал, хитин, инсулин, коньяк маннан, глюко-маннан, пустулан, гепарин, гиалуроновая кислота, курдлан и ксантан. В вариантах осуществления синтетические наноносители по настоящему изобретению не содержат (или специфически исключают) углеводы, такие как полисахарид. В определенных вариантах осуществления углевод может содержать производное углевода, такое как сахарный спирт, включая, но без ограничения маннитол, сорбитол, ксили-тол, эритритол, мальтитол и лактитол.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут содержать один или несколько полимеров. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители содержат один или несколько полимеров, которые представляют собой не содержащий концевую метоксигруппу блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% (вес./вес.) полимеров, из которых состоят синтетические наноносители, представляют собой не содержащий концевую метоксигруппу блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена. В некоторых вариантах осуществления все полимеры, из которых состоят синтетические наноносители, представляют собой не содержащие концевую метоксигруппу блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут содержать один или несколько полимеров, которые представляют собой не содержащий концевую метоксигруппу полимер. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% (вес./вес.) полимеров, из которых состоят синтетические наноносители, представляют собой не содержащие концевую метоксигруппу полимеры. В некоторых вариантах осуществления все полимеры, из которых состоят синтетические наноносители, представляют собой не содержащий концевую метоксигруппу блок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители содержат один или несколько полимеров, которые не состоят из плюронового полимера. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% (вес./вес.) полимеров, из которых состоят синтетические наноносители, не содержат блок-сополимер полиоксиэтилена и поли-оксипропилена. В некоторых вариантах осуществления все полимеры, из которых состоят синтетические наноносители, не содержат блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена. В некоторых вариантах осуществления такой полимер может быть окружен слоем покрытия (например, липосомой, ли-пидным монослоем, мицеллой и т.д.). В некоторых вариантах осуществления различные элементы синтетических наноносителей могут быть связаны с полимером.
Иммунодепрессанты и/или антигены могут быть связаны с синтетическими наноносителями любым из ряда способов. Как правило, связывание может быть результатом соединения между иммунодепрес-сантами и/или антигенами и синтетическими наноносителями. Данное соединение может приводить в результате к тому, что иммунодепрессанты и/или антигены прикрепляются к поверхности синтетических наноносителей и/или содержатся внутри (инкапсулированы) синтетических наноносителей. В некоторых вариантах осуществления, тем не менее, иммунодепрессанты и/или антигены инкапсулированы синтети
ческими наноносителями благодаря структуре синтетических наноносителей, а не соединения с синтетическими наноносителями. В предпочтительных вариантах осуществления синтетические наноносители содержат полимер, как представлено в настоящем документе, и иммунодепрессанты и/или антигены связаны с полимером.
Когда связывание происходит как результат соединения между иммунодепрессантами и/или антигенами и синтетическими наноносителями, то связывание может происходить посредством связывающего фрагмента. Связывающий фрагмент может представлять собой любой фрагмент, посредством которого иммунодепрессант и/или антиген соединяется с синтетическим наноносителем. Такие фрагменты включают ковалентные связи, такие как амидная связь или сложноэфирная связь, а также отдельные молекулы, которые соединяют (ковалентно или нековалентно) иммунодепрессант и/или антиген с синтетическим наноносителем. Такие молекулы включают линкеры или полимеры или их элементарное звено. Например, связывающий фрагмент может содержать заряженный полимер, с которым электростатически соединяется иммунодепрессант и/или антиген. В качестве другого примера связывающий фрагмент может содержать полимер или его элементарное звено, с которым он ковалентно соединяется.
В предпочтительных вариантах осуществления синтетические наноносители содержат полимер, как представлено в настоящем документе. Данные синтетические наноносители могут быть полностью полимерными или они могут быть смесью полимеров и других материалов.
В некоторых вариантах осуществления полимеры синтетического наноносителя соединяются для образования полимерной матрицы. В некоторых вариантах осуществления компонент, например, имму-нодепрессант или антиген может ковалентно присоединяться к одному или нескольким полимерам полимерной матрицы. В некоторых вариантах осуществления ковалентное присоединение опосредовано линкером. В некоторых вариантах осуществления компонент может быть нековалентно присоединен к одному или нескольким полимерам полимерной матрицы. Например, в некоторых вариантах осуществления компонент может быть инкапсулирован или окружен полимерной матрицей или диспергирован в ней. Альтернативно или дополнительно, компонент может быть присоединен к одному или нескольким полимерам полимерной матрицы с помощью гидрофобных взаимодействий, взаимодействия зарядов, вандерваальсовых сил и т.д. Широкое разнообразие полимеров и способов образования полимерных матриц из них являются общеизвестными.
Полимеры могут являться натуральными или ненатуральными (синтетическими) полимерами. Полимеры могут являться гомополимерами или сополимерами, содержащими два или более мономеров. В отношении последовательности сополимеры могут являться неупорядоченными, блок-сополимерами или содержать комбинацию неупорядоченных и блок-последовательностей. Типично, полимеры согласно настоящему изобретению являются органическими полимерами.
В некоторых вариантах осуществления полимер содержит сложный полиэфир, поликарбонат, полиамид, или простой полиэфир или их элементарное звено. В других вариантах осуществления полимер содержит поли(этиленгликоль) (PEG), полипропиленгликоль, поли(молочную кислоту), по-ли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот или поликапролактон или их элементарное звено. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы полимер был биоразлагае-мым. Следовательно, в этих вариантах осуществления, предпочтительно, чтобы в случае, когда полимер содержит простой полиэфир, такой как поли(этиленгликоль) или полипропиленгликоль или их элементарное звено, полимер содержал блок-сополимер простого полиэфира и биоразлагаемый полимер, так чтобы полимер был биоразлагаемым. В других вариантах осуществления полимер не содержит исключительно простой полиэфир или его элементарное звено, такой как поли(этиленгликоль) или полипропи-ленгликоль или их элементарное звено.
Другие примеры полимеров, подходящих для использования в настоящем изобретении, включают, но без ограничений, полиэтилены, поликарбонаты (например, поли-(1,3-диоксан-2-он)), полиангидриды (например, полиангидрид себациновой кислоты), полипропилфумераты, полиамиды (например, полика-пролактам), полиацетали, полиэфиры, сложные полиэфиры (например, полилактид, полигликолид, сополимер (лактида и гликолида), поликапролактон, полигидроксикислоту (например, поли-(р-гидроксиалканоат)), сложные полиортоэфиры, полицианоакрилаты, поливиниловые спирты, полиуретаны, полифосфазены, полиакрилаты, полиметакрилаты, полимочевины, полистиролы и полиамины, полилизин, сополимеры (PEG и полилизина), полиэтиленимин и сополимеры (полиэтиленимина и PEG).
В некоторых вариантах осуществления полимеры согласно настоящему изобретению включают полимеры, которые были одобрены для применения у людей Правительства США (FDA) согласно 21 C.F.R. § 1772600, включая без ограничения следующее: сложные полиэфиры (например, полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислот, поликапролактон, поливалеролактон, поли(1,3-диоксан-2он)); полиангидриды (например, поли(себациновый ангидрид)); простые полиэфиры (например, полиэтиленг-ликоль); полиуретаны; полиметакрилаты; полиакрилаты и полицианоакрилаты.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть гидрофильными. Например, полимеры могут содержать анионные группы (например, фосфатную группу, сульфатную группу, карбоксилат-ную группу); катионные группы (например, группу четвертичного амина); или полярные группы (например, гидроксильную группу, тиольную группу, аминную группу). В некоторых вариантах осуществ
ления синтетический наноноситель, содержащий гидрофильную полимерную матрицу, создает гидрофильное окружение в синтетическом наноносителе. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть гидрофобными. В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель, содержащий гидрофобную полимерную матрицу, создает гидрофобное окружение в синтетическом наноноси-теле. Выбор гидрофильности или гидрофобности полимера может оказать влияние на характер материалов, которые заключены (например, связаны) в синтетическом в синтетическом наноносителе.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы с помощью одного или нескольких фрагментов и/или функциональных групп. Разнообразие фрагментов или функциональных групп может применяться согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы с помощью полиэтиленгликоля (PEG), углевода и/или нециклических полиацеталей, полученных из полисахаридов (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). Определенные варианты осуществления могут быть получены с применением общих идей Патента США № 5543158 Gref et al. или WO публикации № WO 2009/051837 Von Andrian et al.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы с помощью липид-ной или жирнокислотной группы. В некоторых вариантах осуществления жирнокислотная группа может быть представлять собой одну или несколько из следующего: масляная, капроновая, каприловая, капри-новая, лауриновая, миристиновая, пальмитиновая, стеариновая, арахидиновая, бегеновая или лигноцери-новая кислота. В некоторых вариантах осуществления жирнокислотная группа может представлять собой одну или несколько из следующего: пальмитолеиновая, олеиновая, вакценовая, линолевая, альфа-линолевая, гамма-линолевая, арахидоновая, гадолеиновая, арахидоновая, эйкозапентаеновая, докозагек-саеновая или эруковая кислота.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут представлять собой сложные полиэфиры, включая сополимеры, содержащие элементарные звенья молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как сополимер(молочной кислоты и гликолевой кислоты) и сополимер(лактида и гликолида)), обобщенно в настоящем документе имеющие название "PLGA"; и гомополимеры, содержащие элементарные звенья гликолевой кислоты, в настоящем документе имеющие название "PGA," и элементарные звенья молочной кислоты, такие как поли^-молочная кислота, поли^-молочная кислота, поли^и-молочная кислота, поли^-лактид, поли^-лактид, и поли-D,L-лактид, обобщенно в настоящем документе имеющие название "PLA". В некоторых вариантах осуществления иллюстративные сложные полиэфиры включают, например, полигидроксикислоты; сополимеры PEG и сополимеры лактида и гликолида (например, сополимеры PLA-PEG, сополимеры PGA-PEG, сополимеры PLGA-PEG и их производные). В некоторых вариантах осуществления сложные полиэфиры включают, например, поли(капролактон), сополимеры поли(капролактона) и PEG, сополимер (L-лактида и L-лизина), поли(сериновый сложный эфир), поли(4-гидрокси-L-пролиновый сложный эфир), поли[а-(4-аминобутил)^-гликолевая кислота], и их производные.
В некоторых вариантах осуществления полимер может представлять собой PLGA. PLGA представляет собой биосовместимый и биоразлагаемый сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, и различные формы PLGA характеризуются соотношением молочная кислота:гликолевая кислота. Молочная кислота может представлять собой L-молочную кислоту, D-молочную кислоту или D,L-молочную кислоту. Скорость распада PLGA может быть отрегулирована путем изменения соотношения молочная кислота:гликолевая кислота. В некоторых вариантах осуществления PLGA, подлежащий применению согласно настоящему изобретению характеризуется соотношением молочная кислота:гликолевая кислота, составляющим приблизительно 85:15, приблизительно 75:25, приблизительно 60:40, приблизительно 50:50, приблизительно 40:60, приблизительно 25:75 или приблизительно 15:85.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут представлять собой один или несколько акриловых полимеров. В определенных вариантах осуществления акриловые полимеры включают, например, следующее: акриловая кислота и сополимеры метакриловой кислоты, сополимеры метилметак-рилата, этоксиэтилметакрилаты, цианоэтилметакрилат, сополимер аминоалкилметакрилата, по-ли(акриловая кислота), поли(метакриловая кислота), сополимер метакриловой кислоты и алкиламида, поли(метилметакрилат), поли(ангидрид метакриловой кислоты), метилметакрилат, полиметакрилат, сополимер поли(метилметакрилата), полиакриламид, сополимер аминоалкила и метакрилата, сополимеры глицидила и метакрилата, полицианоакрилаты и комбинации, содержащие один или несколько из перечисленных выше полимеров. Акриловый полимер может содержать полностью полимеризованные сополимеры сложных эфиров акриловой и метакриловой кислоты с низким содержанием групп четвертичного аммония.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут являться катионными полимерами. В общем, катионные полимеры способны конденсировать и/или защищать отрицательно заряженные цепи нуклеиновых кислот (например, ДНК или ее производных). Амин-содержащие полимеры, такие как ден-дримеры поли(лизина) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; и Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), поли(этиленимина) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297), и по-ли(амидоаминные) дендримеры (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; и Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) являются поло
жительно заряженными при физиологических значениях рН, образуют с нуклеиновыми кислотами ионные пары и опосредуют трансфекцию во многих линиях клеток. В вариантах осуществления синтетические наноносители по настоящему изобретению могут не содержать (или могут исключать) катионные полимеры.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут являться способными к разложению сложными полиэфирами, несущими катионные боковые цепи (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633; и Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). Примеры таких сложных полиэфиров включают сополимер (L-лактида и L-лизина) (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010), сложный полиэфир серина (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), сложный полиэфир (4-гидрокси^-пролина) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; и Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633) и сложный полиэфир (4-гидрокси^-пролина) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; и Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633).
Свойства этих и других полимеров и способов их получения хорошо известны в данной области
техники (см., например, патенты США № 6123727; 5804178; 5770417; 5736372; 5716404; 6095148;
5837752; 5902599; 5696175; 5514378; 5512600; 5399665; 5019379; 5010167; 4806621; 4638045 и 4946929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc, 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc, 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; и Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). Более в общем, разнообразные способы синтезирования определенных подходящих полимеров описаны в Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; и в патентах США № 6506577, 6632922, 6686446 и 6818732.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут являться линейными или разветвленными полимерами. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут представлять собой дендримеры. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть, по сути, перекрестно сшитыми друг с другом. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут, по сути, не содержать перекрестных сшивок. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут применяться согласно настоящему изобретению, не подвергаясь этапу перекрестного сшивания. Следует дополнительно понимать, что синтетические наноносители по настоящему изобретению могут содержать блок-сополимеры, привитые сополимеры, комбинации, смеси и/или аддукты любого из вышеизложенных и других полимеров. Специалистам в данной области техники будет понятно, что полимеры, перечисленные в настоящем документе, представляют иллюстративный, не исчерпывающий список полимеров, которые могут применяться согласно настоящему изобретению.
Композиции согласно настоящему изобретению содержат синтетические наноносители в комбинации с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как консерванты, буферы, солевой раствор или фосфатно-солевой буфер. Композиции могут быть получены с применением общепринятых фармацевтических методик производства и получения составов для получения применимых лекарственных форм. В варианте осуществления изобретенные синтетические наноносители суспендируют в стерильном растворе соли для инъекций вместе с консервантом.
В вариантах осуществления при получении синтетических наноносителей в качестве носителей, могут быть применимы способы связывания компонентов с синтетическими наноносителями. Если компонент представляет собой малую молекулу, то может быть предпочтительным прикрепить компонент к полимеру перед сборкой синтетических наноносителей. В различных вариантах осуществления также может быть предпочтительно приготавливать синтетические наноносители с поверхностными группами, которые служат для присоединения компонента к синтетическому наноносителю, а не для присоединения компонента к полимеру в конструкции синтетических наноносителей.
В определенных вариантах осуществления связывание может представлять собой ковалентный линкер. В вариантах осуществления пептиды согласно настоящему изобретению могут быть ковалентно связаны с внешней поверхностью посредством 1,2,3-триазольного линкера, образованного с помощью реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения азидогрупп на поверхности наноносителя с антигеном или иммунодепрессантом, содержащим алкиновую группу или с помощью реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения алкинов на поверхности наноносителя с компонентами, содержащими азидогруппу. Такие реакции циклоприсоединения предпочтительно проводят в присутствии Cu(I) катализатора вместе с подходящим Cu(I)-лигандом и восстанавливающим средством для восстановления Cu(II) соединения до каталитически активного Cu(I) соединения. Это катализируемое Cu(I) азид-алкиновое циклоприсоедине-ние (CuAAC) может также иметь название клик-реакция.
Кроме того, ковалентное связывание может содержать ковалентный линкер, который содержит амидный линкер, дисульфидный линкер, тиоэфирный линкер, гидразоновый линкер, гидразидный линкер, иминный или оксимный линкер, линкер мочевины или тиомочевины, амидиновый линкер, аминный линкер и сульфонамидный линкер.
Амидный линкер образован при помощи амидной связи между амином одного компонента с кар
боксильной группой другого компонента, такого, как наноноситель. Амидная связь в линкере может быть образована с применением любой из общепринятых образующих амидную связь реакций с надлежащим образом защищенными аминокислотами или компонентами и активированной карбоновой кислотой, такой N-гидроксисукцинимид-активированный сложный эфир.
Дисульфидный линкер образуется через образование дисульфидной (S-S) связи между двумя атомами серы в форме, например, R1-S-S-R2. Дисульфидная связь может образовываться посредством ти-ольного обмена у компонента, содержащего тиольную/меркаптановую группу(-SH), с другой активированной тиольной группой на полимере или наноносителе, или наноносителя, содержащего тиоль-ные/меркаптановые группы с компонентом, содержащим активированную тиольную группу.
Kl -N
Триазольный линкер, в частности, 1,2,3-триазол формы R: , где Рч и R2 могут представлять собой любые химические соединения, получают путем реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения азида, прикрепленного к первому компоненту, такому как наноноситель с концевым алкином, прикрепленным ко второму компоненту, такому как иммунодепрессант или антиген. Реакцию 1,3-диполярного цик-лоприсоединения проводят с катализатором или без него, предпочтительно с О^Ц-катализатором, который соединяет два компонента через 1,2,3-триазольную функциональную группу. Это химическое взаимодействие подробно описано в работе Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002) и Meldal, et al., Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015 и часто имеет название "клик" реакция или CuAAC.
В вариантах осуществления получают полимер, содержащий азидную или алкиновую группу, концевую относительно полимерной цепи. Этот полимер затем применяют для получения синтетического наноносителя таким образом, чтобы множество алкиновых или азидных групп располагалось на поверхности данного наноносителя. Альтернативно, синтетический наноноситель может быть получен другим путем, и впоследствии функционализирован с помощью алкиновых или азидных групп. Компонент получают с присутствием любой алкиновой (если полимер содержит азид) или азидной (если полимер содержит алкин) группы. Компонент затем подвергают реакции с наноносителем посредством реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения с катализатором или без него, который ковалентно связывает компонент с частицей через 1,4-двузамещенный 1,2,3-триазольный линкер.
Тиоэфирный линкер получают путем образования серо-углеродной (тиоэфирной) связи в форме, например, R1-S-R2. Тиоэфир может быть получен путем любого алкилирования тиоль-ной/меркаптановой (-SH) группы на одном компоненте, таком как компонент с алкилирующей группой, такой как галид или эпоксид на втором компоненте, таком как наноноситель. Тиоэфирные линкеры могут также быть образованы с помощью присоединения Михаэля тиольной/меркаптановой группы на одном компоненте к электрондефицитной алкеновой группе на втором компоненте, таком как полимер, содержащий малеимидную группу или винилсульфоновую группу в качестве акцептора Михаэля. В другом пути тиоэфирные линкеры могут быть получены путем реакции с участием тиоленового радикала тиольной/меркаптановой группы на одном компоненте с алкеновой группой на втором компоненте, таком как полимер или наноноситель.
Гидразоновый линкер получают путем реакции гиразидной группы на одном компоненте с альде-гидной/кетонной группой на втором компоненте, таком как наноноситель.
Гидразидный линкер образуется путем реакции гидразиновой группы на одном компоненте с группой карбоновой кислоты на втором компоненте, таком как наноноситель. Такую реакцию, как правило, проводят с применением химических взаимодействий, аналогичных таковым при образовании амидной связи, где карбоновая кислота активируется с помощью активирующего реагента.
Иминный или оксимный линкер образован путем реакции аминной или N-алкоксиаминной (или аминоокси) группы на одном компоненте с альдегидной или кетонной группой на втором компоненте, таком как наноноситель.
Линкер мочевины или тиомочевины получают с помощью реакции аминной группы на одном компоненте с изоцианатной или тиоцианатной группой на втором компоненте, таком как наноноситель.
Амидиновый линкер получают с помощью реакции аминной группы на одном компоненте с имидо-эфирной группой на втором компоненте, таком как наноноситель.
Аминный линкер получают путем реакции алкилирования аминной группы на одном компоненте с алкилирующей группой, такой как группа галида, эпоксида или сульфонатного сложного эфира на втором компоненте, таком как наноноситель. Альтернативно, аминный линкер может также быть получен путем восстановительного аминирования аминной группы на одном компоненте с альдегидной или ке-тонной группой на втором компоненте, таком как наноноситель, с подходящим восстанавливающим реагентом, таким как цианоборогидрид натрия или триацетоксиборогидрид натрия.
Сульфонамидный линкер получают путем реакции аминной группы на одном компоненте с суль-фонилгалидной (такой как сульфонилхлоридная) группой на втором компоненте, таком как наноноси-тель.
Сульфоновый линкер получают с помощью присоединения Михаэля нуклеофила к винилсульфону. Или винилсульфон, или нуклеофил может находиться на поверхности наноносителя или быть прикрепленным к компоненту.
Компонент может также быть конъюгирован с наноносителем посредством способов нековалент-ной конъюгации. Например, отрицательно-заряженный антиген или иммунодепрессант может быть конъюгирован с положительно-заряженным наноносителем посредством электростатической адсорбции. Компонент, содержащий металлический лиганд, может также быть конъюгирован с наноносителем, содержащим металлокомплекс, посредством комплекса металл-лиганд.
Компонент может быть прикреплен к полимеру, например, блок-сополимеру молочной кислоты и полиэтиленгликоля, перед сборкой синтетического наноносителя или синтетический наноноситель может быть образован с реакционными или активируемыми группами на его поверхности. В последнем случае компонент может быть получен с группой, которая является совместимой с химическим взаимодействием прикрепления, которое представлено поверхностью синтетических наноносителей. В других вариантах осуществления пептидный компонент может быть прикреплен к VLP или липосомам с применением подходящего линкера. Линкер представляет собой соединение или реагент, который способен связать две молекулы вместе. В варианте осуществления линкер может быть гомобифункциональным или гетеробифункциональным реагентом, как описано в Hermanson 2008. Например, VLP или липосом-ный синтетический наноноситель, содержащий карбоксильную группу на поверхности, можно обрабатывать гомобифункциональным линкером, дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), в присутствии EDC для образования соответствующего синтетического наноносителя с ADH линкером. Полученный в результате соединенный через ADH синтетический наноноситель затем конъюгируют с пептидным компонентом, содержащим кислотную группу, посредством другого конца ADH-линкера на NC для получения соответствующей VLP или липосомного пептидного конъюгата.
Для подробных описаний доступных способов конъюгации, см. Hermanson G Т "Bioconjugate Techniques", 2nd Edition, Published by Academic Press, Inc., 2008. В дополнение к ковалентному присоединению компонент можно присоединять с помощью адсорбции к предварительно сформированному синтетическому наноносителю или его можно присоединять с помощью инкапсуляции во время образования синтетического наноносителя.
Любой иммунодепрессант, представленный в данном документе, можно связывать с синтетическим наноносителем. Иммунодепрессанты включают, но не ограничены ими, статины; ингибиторы mTOR, такие как рапамицин или аналог рапамицина; TGF-р сигнальные агенты; агонисты рецептора TGF-P; ингибиторы деацетилазы гистонов (HDAC); кортикостероиды; ингибиторы митохондриальной функции, такие как ротенон; ингибиторы Р38; агонисты NF-кР; агонисты рецепторов аденозтина; агонисты про-стагландина Е2; ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как ингибитор фосфодиэстеразы 4; ингибиторы протеасомы; ингибиторы киназы; агонисты рецепторов, связанных с G-белком; антагонисты рецепторов, связанных с G-белком; глюкокортикоиды; ретиноиды; ингибиторы цитокинов; ингибиторы рецепторов цитокинов; активаторы рецепторов цитокинов; антагонисты рецепторов, активируемых пролиферацией пероксисомы; агонисты рецепторов, активируемых пролиферацией пероксисомы; ингибиторы деацети-лазы гистонов; ингибиторы кальциневрина; ингибиторы фосфатазы и оксидированных АТФ. Иммуноде-прессанты также включают IDO, витамин D3, циклоспорин А, ингибиторы арил-гидрокарбонового рецептора, ресвератрол, азатиопурин, 6-меркаптопурин, аспирин, нифлумовую кислоту, эстриол, триполид, интерлейкины (например, IL-1, IL-10), циклоспорин А, миРНК, направленные на цитокины или рецепторы цитокинов, и тому подобное.
Примеры статинов включают аторвастатин (LIPITOR(r), TORVAST(r)), церивастатин, флювастатин (LESCOL(r), LESCOL(r) XL), ловастатин (MEVACOR(r), ALTOCOR(r), ALTOPREV(r)), мевастатин (COM-
PACTIN(r)), питавастатин (LIVALO(r), PIAVA(r)), розувастатин (PRAVACHOL(r), SELEKTINE(r), LIPOS-TAT(r)), розувастатин (CRESTOR(r)), и симвастатин (ZOCOR(r), LIPEX(r)).
Примеры ингибиторов mTOR включают рапамицин и его аналоги (например, CCL-779, RAD001, АР23573, С20-металлилрапамицин (C20-Marap), C16-(S)-бутилсульфонамидрапамицин (C16-BSrap), С16-(S)-3-метилиндолрапамицин (d6-iRap) (Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (NVP-BEZ235), хризофановую кислоту (хризофанол), дефоролимус (МК-8669), эверолимус (RAD0001), KU-0063794, PI-103, PP242, темсиролимус и WYE-354 (производства Selleck, Houston, Texas,
США).
Примеры сигнальных агентов TGF-Р включают лиганды TGF-Р (например, активин A, GDF1, GDF11, морфогенные белки кости, узлы TGF-Р) и их рецепторы (например, ACVR1B, ACVR1C, ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, BMPR1A, BMPR1B, TGFpRI, TGFpRII), R-SMADS/co-SMADS (например, SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD8) и ингибиторы лигандов (например, фоллистатин, ноггин, хордин, DAN, lefty, LTBP1, THBS1, декорин).
Примеры ингибиторов митохондриальной функции включают атрактилозид (дикалиевую соль), бонгкрековую кислоту (триаммонийную соль), карбонилцианид m-хлорфенилгидразон, карбоксиатрак-тилозид (например, из Atractylis gummifera), CGP-37157, (-)-дегуелин (например, из Mundulea
sericea),F16, пептид связывающегося с VDAC домена гексокиназы II, олигомицин, ротенон, Ru360, SFK1 и валиномицин (например, из HOStreptomyces Mvissimus) (EMD4Biosciences, США).
Примеры ингибиторов Р38 включают SB-203580 (4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5-
(4-пиридил)Ш-имидазол), SB-239063 (транс-1-(4-гидроксициклогексил)-4-(фторфенил)-5-(2-метокси-
пиримидин-4-ил)имидазол), SB-220025 (5-(2-амино-4-пиримидинил)-4-(4-фторфенил)-1-(4-
пиперидинил)имидазол)) и ARRY-797.
Примерами ингибиторов NF (например, NK-кР) могут служить IFRD1, 2-(1,8-нафтиридин-2-ил)-фенол, 5-аминосалициловая кислота, BAY 11-7082, BAY 11-7085, САРЕ (фенетилэстер кофейной кислоты), диэтилмалеат, ингибитор IV IKK-2, IMD 0354, лактацистин, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], ингибитор III активации NF-KB, ингибитор II активации NF-KB, JSH-23, партенолид, оксид фениларсина (РАО), РРМ-18, аммонийная соль пирролидиндитиокарбаминовой кислоты, QNZ, RO 106-9920, ракагламид, ро-кагламид AL, рокагламид С, рокагламид I, рокагламид J, рокаглаол, (R)-MG-132, салицилат натрия, триптолид (PG490), веделолактон.
Примеры агонистов аденозиновых рецепторов включают CGS-21680 и ATL-146е.
Примеры агонистов простагландина Е2 включают Е-простаноид 2 и Е-простаноид 4.
Примеры ингибиторов фосфодиэстераз (неселективных и селективных ингибиторов) включают кофеин, аминофиллин, IBMX (3-изобутил-1-метилксантин), параксантин, пентоксифиллин, теобромин, теофиллин, метилированные ксантины, винпоцетин, EHNA (эритро-9-(2-гидрокси-3-нонил)аденин),анагрелид, эноксимон (PERFAN(tm)), милринон, левосимендан, мезембрин, ибудиласт, пи-кламиласт, лютеолин, дротаверин, рофлумиласт (DAXAS(tm), DALIRESP(tm)), силденафил (REVATION(r),
VIAGRA(r)), тадалафил (ADCIRCA(r), CIALIS(r)), варденафил (LEVITRA(r), STAXYN(r)), уденафил, ава-
нафил, икариин, 4-метилпиперазин и пиразолопиримидин-7-1.
Примеры ингибиторов протеасом включают бортезомиб, дисульфирам, эпигаллокатехин-3-галлат и салиноспорамид А.
Примеры ингибиторов киназ включают бевацизумаб, BIBW 2992, цетуксимаб (ERBITUX(r)), има-
тиниб (GLEEVEC(r)), трастузумаб (HERCEPTIN(r)), гефитиниб (IRESSA(r)), ранибизумаб (LUCENTIS(r)),
пегаптаниб, сорафениб, дазатиниб, сунитиниб, эрлотиниб, нилотиниб, лапатиниб, панитумумаб, ванде-таниб, Е7080, пазопаниб, мубритиниб.
Примеры глюкокортикоидов включают гидрокортизон (кортизол), кортизона ацетат, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон, бетаметазон, триамцинолон, беклометазон, флудрокор-тизона ацетат, дезоксикортикостерона ацетат (DOCA) и альдостерон.
Примеры ретиноидов включают ретинол, ретиналь, третиноин (ретиноевая кислота, RETIN-A(r)),
изотретиноин (ACCUTANE(r), AMNESTEEM(r), CLARAVIS(r), SOTRET(r)), алитретиноин (PANRETIN(r)), этретинат (TEGISON(tm)) и его метаболит ацитретин (SORIATANE(r)), тазаротен (TAZORAC(r), AVAGE(r), ZORAC(r)), бексаротен (TARGRETIN(r)) и адапален (DIFFERIN(r)).
Примеры ингибиторов цитокинов включают IL 1ra, антагонист рецепторов IL1, IGFBP, TNF-BF, уромодулин, альфа-2-макроглобулин, циклоспорин А, пентамидин и петоксифиллин (PENTOPAK(r),
PENTOXIL(r), TRENTAL(r)).
Примеры антагонистов рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами, включают
GW9662, PPARy антагонист III, G335, Т0070907 (EMD4Biosciences, США).
Примеры агонистов рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами, включают пи-оглитазон, циглитазон, клофибрат, GW1929, GW7647, L-165,041, LY 171883, активатор PPARy, Fmoc-Leu, троглитазон и WY-14643 (EMD4Biosciences, США).
Примеры ингибиторов гистоновых деацетилаз включают гидроксамовые кислоты (или гидроксама-ты), такие как трихостатин А, циклические тетрапептиды (такие, как трапоксин В) и депсипептиды, бен-замиды, электрофильные кетоны, соединения алифатических кислот, такие как фенилбутират и вальп-роевая кислота, гидроксамовые кислоты, такие как вориностат (SAHA), белиностат (PXD101), LAQ824, и панобиностат (LBH589), бензамиды, такие как энтиностат (MS-275), CI994 и моцетиностат (MGCD0103), никотинамид, производные NAD, дигидрокумарин, нафтопиранон и 2-гидроксинафальдегиды.
Примеры ингибиторов кальциневрина включают циклоспорин, пимекролимус, воклоспорин и так-ролимус.
Примеры ингибиторов фосфатаз включают BN82002 гидрохлорид, СР-91149, каликулин А, канта-ридиновую кислоту, кантаридин, циперметрин, этил-3,4-дефостатин, натриевую соль фостриецина, MAZ51, метил-3,4-дефостатин, NSC 95397, норкантаридин, аммонийную соль окадаиковой кислоты из Prorocentrum concavum, окадаиковую кислоту, калиевую соль окадаиковой кислоты, натриевую соль ока-даиковой кислоты, фениларсина оксид, различные коктейли ингибиторов фосфатаз, протеинфосфатазу 1С, ингибиторный белок протеинфосфатазы 2А, протеинфосфатазу 2А1, протеинфосфатазу 2А2, ортова-надат натрия.
В некоторых вариантах осуществления антигены, описанные в данном документе, также связаны с синтетическими наноносителями. В некоторых вариантах осуществления антигены связаны с теми же или другими синтетическими наноносителями, как и те, с которыми связаны иммунодепрессанты. В дру
гих вариантах осуществления антигены не связаны с синтетическими наноносителями. Антигены включают любые из антигенов, представленных в данном документе, или их фрагменты или производные, при этом такие антигены ассоциированы с воспалительными, аутоиммунными заболеваниями, аллергией, отторжением органов или тканей, болезнью "трансплант против хозяина", антигены трансплантата и антигены терапевтических белков. Эпитопы или белки, полипептиды или пептиды, которые содержат эпитопы, могут быть получены или произведены из любых антигенов, предоставленных или другим образом известных в данной области.
Терапевтические белки включают, но не ограничиваются ими, инфузируемые терапевтические белки, ферменты, кофакторы ферментов, гормоны, факторы свертывания крови, цитокины и интерфероны, факторы роста, моноклональные антитела и поликлональные антитела (например, вводимые субъекту для заместительной терапии) и белки, связанные с болезнью Помпе (например, альглюкозидаза альфа, rhGAA (например, миозим и люмизим (Genzyme)). Терапевтические белки также включают белки, вовлеченные в каскад свертывания крови. Терапевтические белки включают фактор VIII, фактор VII, фактор IX, фактор V, фактор фон Виллебранда, фактор фон Хельдебранта, тканевой активатор плазминоге-на, инсулин, гормон роста, эртроэпоэтин альфа, VEGF, тромбоэпоэтин, лизозим, антитромбин и подобные. Терапевтические белки также включают адипокины, такие как лептин и адипонектин. Другие примеры терапевтических белков описаны ниже и в тексте настоящего документа. Также включены фрагменты или производные любого из терапевтических белков, предоставленного как антиген.
Примерами терапевтических белков, применяемых в ферментной заместительной терапии у субъектов, стардающих от лизосомальной болезни накопления, могут служить, но не ограничиваются ими, имиглюцераза для лечения синдрома Гоше (например, церезим(tm)), а-галактозидаза A (a-gal А) для лечения болезни Фабри (например, альгазидаза бета, фабризим(tm)), кислая а-глюкозидаза (GAA) для лечения болезни Помпе (например, альглюкозидаза альфа, люмизим(tm), миозим(tm)), арилсульфатаза В для лечения мукополисахаридозов (например, ларонидаза, альдуразим идурсульфаза, элапраза(tm), арилсульфатаза В, наглазим(tm)).
Примерами ферментов могут служить оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.
Примерами гормонов могут служить мелатонин (№ацетил-5-метокситриптамин), серотонин, тироксин (или тертаиодтиронин) (тиреоидный гормон), трийодтиронин (тиреоидный гормон), эпинефрин (или адреналин), норэпинефрин (или норадреналин), дофамин (или гормон-ингибитор пролактина), антимюл-леров гормон (или фактор или гормон-ингибитор мюллерова гормона), адипонектин, адренокортико-тропный гормон (или кортикотропин), ангиотензиноген и ангиотензин, антидиуретический гормон (или-вазопрессин, вазопрессин аргинин), предсердный натрийуретический пептид (или атриопептин), кальци-тонин, холецистокинин, кортикотропин-высвобождающий гормон, эритроэпоэтин, фолликулостимули-рующий гормон, гастрин, грелин, глюкагон, глюкагоноподобный пептид (GLP-1), GIP, гонадотропин-высвобождающий гормон, гормон, высвобождающий гормон роста, хорионический гонадотропин человека, плацентарный лактоген человека, гормон роста, ингибин, инсулин, инсулиноподобный фактор роста (или соматомедин), лептин, лютеинизирующий гормон, меланоцитстимулирующий гормон, орексин, окситоцин, паратиреоидный гормон, пролактин, релаксин, секретин, соматостатин, тромбоэпоэтин, ти-реостимулирующий гормон (или тиреотропин), тиреотропин-высвобождающий гормон, кортизол, альдо-стерон, тестостерон, дегидроэпиандростерон, андростенедион, дигидротестостерон, эстрадиол, эстрон, эстриол, прогестерон, кальцитриол (1,25-дигидроксивитамин D3), кальцидиол (25-гидроксивитамин D3), простагландины, лейкотриены, простациклин, тромбоксан, пролактин-высвобождающий гормон, липо-тропин, нейропептид Y, гистамин, эндотелии, панкреатический полипептид, натрийуретический пептид головного мозга, ренин и энкефалин.
Примерами крови и свертываемости крови могут служить Фактор I (фибриноген), фактор II (протромбин), тканевой фактор, фактор V (проакселерин, лабильный фактор), фактор VII (стабильный фактор, проконвертин), фактор VIII (антигемофилический глобулин), фактор IX (тромбопластин плазмы), фактор X (фактор Стюарта-Прауэра), фактор Ха, фактор XI, фактор XII (фактор Хагемана), фактор XIII (фибрин-стабилизирующий фактор), фактор фон Виллебранда, прекалликреин (фактор Флетчера), высокомолекулярный кининоген (HMWK) (фактор Фитцджеральда), фибронектин, фибрин, тромбин, антитромбин III, кофактор гепарина II, белок С, белок S, белок Z, белок Z-зависимый протеазный ингибитор (ZPI), плазминоген, альфа 2-антиплазмин, тканевой активатор плазминогена (tPA), урокиназа, ингиби-тор-1 активатора плазминогена (РАН), ингибитор-2 активатора плазминогена (РАЕ), раковый прокоагу-лянт и эритроэпоэтин альфа (эпоген, прокрит).
Примерами цитокинов могут служить лимфокины, интерлейкины и хемокины, цитокины типа 1, такие как IFN-y, TGF-Р, и цитокины типа 2, такие как IL-4, IL-10 и IL-13.
Примерами факторов роста могут служить адреномедуллин (AM), ангиоэпоэтин (Ang), фактор ау-токринной моторики, морфогенетические белки кости (BMP), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), эпидермальный фактор роста(EGF), эритроэпоэтин (ЕРО), фибробластный фактор роста (FGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор стимулирования образования колоний гранулоци
тов (G-CSF), фактор, стимулирующий образование колоний гранулоцитов (GM-CSF), фактор дифференциации и роста д-9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста производных гепацитов (HDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор стимуляции миграции, миостатин (GDF-8), фактор роста нервной ткани (NGF) и другие нейротрофины, фактор роста тромбоцитов (PDGF), тромбоэпо-этин (ТРО), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-a), трансформирующий фактор роста бета(TGF-Р), фактор некроза опухолей альфа (TNF-a), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), сигнальный путь Wnt, плацентарный фактор роста (P1GF), [(зародышевый бычий соматотропин)] (FBS), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-7.
Примеры моноклональных антител влючают абаговомаб, абциксимаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб пегол, ALD, алемтузумаб, алтумомаб пентетат, анатумомаб мафе-натокс, анрукинзумаб, антитимоцитарный глобин, аполизумаб, арцитумомаб, азелизумаб, атлизумаб (то-цилизумаб), аторолимумаб, бапинеузумаб, базиликсимаб, бавитуксимаб, бектумомаб, белимумаб, бенра-лизумаб, бертилимумаб, безилезомаб, бевацизумаб, бициромаб, биватузумаб мертанзин, блинатумомаб, брентуксимаб ведотин, бриакинумаб, канакинумаб, кантузумаб мертанзин, капромаб пендетид, катумак-сомаб, цеделизумаб, цертолизумаб пегол, цетуксимаб, цитатузумаб богатокс, циксутумумаб, кленолик-симаб, кливатузумаб тетраксетан, конатумумаб, дацетузумаб, даклизумаб, даратумумаб, денозумаб, де-тумомаб, дорлимомаб аритокс, дорликсизумаб, экромексимаб, экулизумаб, эдобакомаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, элотузумаб, элзилимомаб, энлимомаб пегол, эпитумомаб цитуксетан, эпратузу-маб, эрлизумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, эксбивирумаб, фанолезомаб, фаралимомаб, фарлетузумаб, фелвизумаб, фезакинумаб, фигитумумаб, фонтолизумаб, форавирумаб, фрезолимумаб, галиксимаб, ган-тенерумаб, гавилимомаб, гемтузумаб озогамицин, GC1008, гирентуксимаб, глембатумумаб ведотин, го-лимумаб, гомиликсимаб, ибализумаб, ибритумомаб тиуксетан, иговомаб, имциромаб, инфликсимаб, ин-тетумумаб, инолимомаб, инотузумаб озогамицин, ипилимумаб, иратумумаб, келиксимаб, лабетузумаб, лебрикизумаб, лемалезомаб, лерделимумаб, лексатумумаб, либивирумаб, линтузумаб, лорвотузумаб мертанзин, лукатумумаб, лумиликсимаб, мапатумумаб, маслимомаб, матузумаб, меполизумаб, метели-мумаб, милатузумаб, минретумомаб, митумомаб, моролимумаб, мотавизумаб, муромонаб-CD3, наколо-маб тафенатокс, наптумомаб эстафенатокс, натализумаб, небакумаб, нецитумумаб, нерелимомаб, нимо-тузумаб, нофетумомаб мерпентан, окрелизумаб, одулимомаб, офатумумаб, оларатумаб, омализумаб, опортузумаб монатокс, ореговомаб, отеликсизумаб, пагибаксимаб, паливизумаб, панитумумаб, паноба-кумаб, пасколизумаб, пемтумомаб, пертузумаб, пекселизумаб, пинтумомаб, приликсимаб, притумумаб, рафивирумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб, раксибакумаб, регавирумаб, резлизумаб, рилотумумаб, ритук-симаб, робатумумаб, ронтализумаб, ровелизумаб, руплизумаб, сатумомаб пендетид, севирумаб, сиброту-зумаб, сифалимумаб, силтуксимаб, сиплизумаб, соланезумаб, сонепцизумаб, сонтузумаб, стамулумаб, сулезомаб, такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, танезумаб, таплитумомаб паптокс, тефиба-зумаб, телимомаб аритокс, тенатумомаб, тенеликсимаб, теплизумаб, тицилимумаб (тремелимумаб), тига-тузумаб, тоцилизумаб (атлизумаб), торализумаб, тозитумомаб, трастузумаб, тремелимумаб, тукотузумаб целмолейкин, тувирумаб, уртоксазумаб, устекинумаб, вапаликсимаб, ведолизумаб, велтузумаб, вепали-момаб, визилизумаб, волоциксимаб, вотумумаб, залутумумаб, занолимумаб, зиралимумаб и золимомаб аритокс.
Примеры терапевтических белков для инфузионной терапии или инъекционных терапевтических белков включают, например, тоцилизумаб (Roche/Actemra(r)), альфа-1 антитрипсин (Kamada/AAT), He-matide(r) (Affymax и Takeda, синтетический пептид), альбинтерферон альфа-2Ь (Novartis/Zalbin(tm)), Rhucin(r) (Pharming Group, C1 ингибитор для заместительной терапии), тесаморелин (Theratechnolo-gies/Egrifta, синтетический рилизинг фактор гормона роста), окрелизумаб (Genentech, Roche и Biogen), белимумаб (GlaxoSmithKline/Benlysta(r)), пеглотиказу (Savient Pharmaceuticals/Krystexxa(tm)), талиглюцера-зу альфа (Protalix/Uplyso), агалсидазу альфа (Shire/Replagal(r)), велаглюцеразу альфа (Shire).
Дополнительные терапевтические белки, полезные в соответствии с аспектами данного изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области, и изобретение не ограничено в этом отношении.
В некоторых вариантах осуществления компонент, такой как антиген или иммунодепрессант, может быть выделенным. Термин "выделенный" относится к элементу, отделенному от его природной среды и присутствующему в количествах, достаточных, чтобы обеспечить его определение или применение. Это означает, например, что элемент может быть (i) избирательно произведенным путем экспрессионно-го клонирования или (ii) очищенным с помощью хроматографии или электрофореза. Выделенные элементы могут быть, но не обязательно, практически чистыми. Поскольку выделенный элемент можно смешивать с фармацевтически приемлемым наполнителем в фармацевтическом препарате, элемент может составлять только небольшой процент от веса препарата. Элемент, тем не менее, является выделенным, поскольку его отделили от веществ, с которыми он мог быть связан в живых системах, то есть выделенным из других липидов или белков. Любой из элементов, представленные в данном документе, может быть включен в композиции в выделенной форме.
D. Способы получения и применения композиций по настоящему изобретению и
относящиеся к ним способы
Синтетические наноносители могут быть получены с помощью ряда разнообразных способов, известных в данной области техники. Например, синтетические наноносители могут быть образованы способами, такими как нанопреципитация, потоковая фокусировка с использованием жидкостных каналов, распылительная сушка, испарение растворителя однокомпонентных и двухкомпонентных эмульсий, экстракция растворителем, разделение фаз, размалывание, микроэмульсионные процедуры, микросборка, наносборка, жертвенные слои, простая и комплексная коацервация, и другими способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. В качестве альтернативы или дополнительно, описан синтез в водном и органическом растворителе для монодисперсных полупроводниковых, проводящих, магнитных, органических и других наноматериалов (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; and Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). В литературе описаны дополнительные способы (смотри, например Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; и Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; US Patents 5578325 и 6007845; P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).
Разнообразные материалы можно инкапсулировать в синтетические наноносители, если необходимо, с помощью ряда способов, включая без ограничения С. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles", J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pe-gylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); С. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Можно применять другие способы, подходящие для инкапсулирования таких материалов, как олигонуклеотиды в синтетические наноносители, в том числе, без ограничения, способы, раскрытые в патенте Соединенных Штатов № 6632671, Unger, от 14 октября 2003 г.
В определенных вариантах осуществления синтетические наноносители получают с помощью способа нанопреципитации или распылительной сушки. Условия, используемые при получении синтетических наноносителей, можно изменять с получением частиц желаемого размера или свойства (например, гидрофобности, гидрофильности, внешней морфологии, "липкости", формы и т.д.). Способ получения синтетических наноносителей и используемые условия (например, растворитель, температура, концентрация, скорость потока воздуха и т.д.), могут зависеть от материалов, которые будут связывать с синтетическими наноносителями, и/или композиции полимерной матрицы.
Если диапазон размеров частиц, полученных любым из вышеуказанных способов, выходит за пределы требуемого диапазона, частицы можно сортировать, например, с использованием сита.
Элементы (например, компоненты) синтетических наноносителей по настоящему изобретению (такие, как фрагменты, из которых состоит иммунозначимая поверхность, целевые фрагменты, полимерные матрицы, антигены, иммунодепрессанты и т.п.) можно связывать с общим синтетическим наноносите-лем, например, с помощью одной или нескольких ковалентных связей, или можно связывать посредством одного или нескольких линкеров. Можно применять дополнительные способы функционализации синтетических наноносителей из опубликованной заявки на патент США 2006/0002852, Saltzman et al., опубликованной заявки на патент США 2009/0028910, DeSimone et al. или опубликованной международной заявки на патент WO/2008/127532 A1, Murthy et al.
Альтернативно или дополнительно синтетические наноносители могут быть непосредственно или косвенно связанными с компонентами посредством нековалентных взаимодействий. В вариантах осуществления с нековалентными взаимодействиями нековалентное связывание опосредовано нековалентны-ми взаимодействиями, включая, но без ограничений, взаимодействия зарядов, аффинные взаимодействия, координацию металлами, физическую адсорбцию, взаимодействия "гость-хозяин", гидрофобные взаимодействия, взаимодействия ТТ-стэкинга, взаимодействия водородных связей, ван-дер-ваальсовы взаимодействия, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия, диполь-дипольные взаимодействия и/или сочетания таковых. Такие связывания можно располагать так, что бы они находились на внешней поверхности или внутренней поверхности синтетического наноносителя по настоящему изобретению. В вариантах осуществления формой связывания является инкапсуляция и/или абсорбция. В вариантах осуществления синтетические наноносители по настоящему изобретению можно комбинировать с антигеном путем смешивания в той же основе лекарственной формы или системе доставки.
Множества синтетических наноносителей можно комбинировать с образованием фармацевтических лекарственных форм согласно настоящему изобретению с помощью традиционных фармацевтических способов смешивания. Они включают смешивание жидкости с жидкостью, при котором две или более суспензии, каждая из которых содержит одну или несколько подгрупп наноносителей, непосредственно комбинируют или объединяют с помощью одного или нескольких сосудов, содержащих разбавитель. Поскольку синтетические наноносители можно также производить или хранить в форме порошка, можно
выполнять сухое смешивание порошка с порошком, так же как и ресуспендирование из двух или более порошков в общей среде. В зависимости от свойств наноносителей и их потенциалов взаимодействия, преимущество может отдаваться одному или другому пути смешивания.
Типичные композиции по настоящему изобретению, которые содержат синтетические наноносите-ли, могут содержать неорганические или органические буферы (например, натриевые или калиевые соли фосфата, карбоната, ацетата или цитрата) и средства для регуляции рН (например, соляная кислота, гид-роксид натрия или калия, соли цитрата или ацетата, аминокислоты и их соли), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол), поверхностно-активные вещества (например, полисорбат 20, полисорбат 80, полиоксиэтилен-9-10-нонилфенол, дезоксихолат натрия), стабилизаторы раствора и/или крио/лио стабилизаторы (например, сахароза, лактоза, маннит, трегалоза), средства для регуляции осмотического давления (например, соли или сахара), антибактериальные средства (например, бензойная кислота, фенол, гентамицин), противопенные средства (например, полидиметилсилозон), консерванты (например, тимеросал, 2-феноксиэтанол, EDTA), полимерные стабилизаторы и средства регуляции вязкости (например, поливинилпирролидон, полоксамер 488, карбоксиметилцеллюлоза) и сорастворители (например, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол).
Композиции согласно настоящему изобретению включают синтетические наноносители по настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемыми наполнителями. Композиции можно изготовлять с помощью общепринятых методик фармацевтического изготовления и составления с достижением пригодных лекарственных форм. Методики, пригодные для применения в практическом осуществлении данного изобретения, можно найти в Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; и Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. В варианте осуществления изобретенные синтетические наноносители суспендируют в стерильном растворе соли для инъекций вместе с консервантом.
Следует понимать, что композиции по настоящему изобретению можно создавать любым подходящим способом, и настоящее изобретение никак не ограничено композициями, которые можно производить с помощью способов, описанных в данном документе. Выбор соответствующего способа может требовать обращения внимания на свойства конкретных связываемых фрагментов.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители настоящего изобретения изготовляют в стерильных условиях или стерилизуют в конце. Это может гарантировать, что полученные в результате композиции являются стерильными и неконтагиозными, тем самым улучшая безопасность по сравнению с нестерильными композициями. Это обеспечивает значимую меру безопасности, особенно если субъекты, получающие синтетические наноносители, имеют иммунные дефекты, страдают от инфекции и/или восприимчивы к инфекции. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноно-сители по настоящему изобретению можно лиофилизировать и хранить в суспензии или в виде лиофили-зированного порошка в зависимости от стратегии составления в течение длительных периодов времени без потери активности.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить посредством ряда путей, включая, но без ограничений подкожный, интраназальный, пероральный, внутривенный, интраперитонеальный, внутримышечный, чресслизистый, чресслизистый, подъязычный, ректальный, глазной, легочной, внутрикож-ный, чрескожный, транскутанный или внутрикожный или посредством комбинации этих путей. Пути введения также включают введение с помощью ингаляции или аэрозоля для внутрилегочного введения. Способы приготовления аэрозоля широко известны специалистам в даннойобласти (см., например, Sci-arra and Curie, "Aerosols", in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, p. 1694-1712; включено путем ссылки).
Пересаживаемый трансплантируемый материал или терапевтические белки, представленные в качестве клеточной терапии по настоящему изобретению, можно вводить посредством парентерального, внутриартериального, интраназального или внутривенного введения, или путем инъекции в лимфатические узлы или переднюю камеру глаза, или путем местного введения в интересующий орган или ткань. Введение может осуществляться путем инъекции подкожно, интратекально, интравентрикулярно, внутримышечно, интраперитонеально, интракоронально, интрапанкреально, внутрипеченочно или бронхи-ально.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить в эффективных количествах, таких как эффективные количества, описанные в других местах данного документа. Дозы лекарственных форм содержат различные количества множеств синтетических наноносителей и/или различные количества иммунодепрессантов и/или антигенов согласно настоящему изобретению. Количество синтетических наноносителей, и/или иммунодепрессантов, и/или антигенов, присутствующих в лекарственных формах по настоящему изобретению, можно варьировать в зависимости от природы антигенов, терапевтической пользы, которую необходимо достигнуть, и других подобных параметров. В вариантах осуществления могут быть проведены исследования с целью определения оптимальной дозы для установления оптимального терапевтического количества множества синтетических наноносителей и количества иммуно-депрессантов и/или антигенов, которые должны присутствовать в лекарственной форме. В вариантах
осуществления синтетические наноносители, и/или иммунодепрессанты, и/или антигены присутствуют в лекарственной форме в количестве, эффективном для образования толерогенного иммунного ответа на антигены при введении субъекту. Может быть возможным определение количеств иммунодепрессантов и/или антигенов, эффективных для образования толерогенного иммунного ответа, с помощью общепринятых методик и исследований с целью определения оптимальной дозы у субъектов. Лекарственные формы по настоящему изобретению можно вводить с различной частотой. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одного введения лекарственной формы достаточно для выработки фармакологически значимого ответа. В более предпочтительных вариантах осуществления используют по меньшей мере два введения, по меньшей мере три введения или по меньшей мере четыре введения лекарственной формы для обеспечения фармакологически значимого ответа.
Профилактическое введение композиций по настоящему изобретению можно начинать до начала заболевания, расстройства или состояния, или терапевтическое введение можно начинать после того, как заболевание, расстройство или состояние возникло.
В некоторых вариантах осуществления введение синтетических наноносителей производят, например, до введения терапевтического белка или пересаживаемого трансплантируемого материала или воздействия аллергена. В приведенных в качестве примера вариантах осуществления синтетические нано-носители вводят один или несколько раз, включая, но без ограничений, за 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 суток до введения терапевтического белка или пересаживаемого трансплантируемого материала или воздействия аллергена. В дополнение или альтернативно, синтетические наноно-сители можно вводить субъекту после введения терапевтического белка или пересаживаемого трансплантируемого материала или воздействия аллергена. В вариантах осуществления, приведенных в качестве примера, синтетические наноносители вводят один или несколько раз включая, но без ограничений, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 и т.д. суток после введения терапевтического белка или пересаживаемого трансплантируемого материала или воздействия аллергена.
В некоторых вариантах осуществления поддерживающую дозу (например, композицию синтетического наноносителя, представленную в данном документе) вводят субъекту после того, как начальное введение приведет к толерогенному ответу у субъекта, например, для поддержания толерогенного эффекта, достигаемого после начальной дозы, для предупреждения нежелательной иммунной реакции у субъекта, или для предупреждения того, чтобы субъект стал субъектом, подверженным риску возникновения нежелательного иммунного ответа или нежелательного уровня иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза является такой же дозой, как начальная доза, полученная субъектом. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза является более низкой дозой, чем начальная доза. Например, в некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза составляет примерно 3/4, примерно 2/3, примерно 1/2, примерно 1/3, примерно 1/4, примерно 1/8, примерно 1/10, примерно 1/20, примерно 1/25, примерно 1/50, примерно 1/100, примерно 1/1000, примерно 1/10000, примерно 1/100000 или примерно 1/1000000 (вес./вес.) от начальной дозы.
Композиции и способы, предложенные в настоящем документе, могут применяться для вызова или увеличения толерантного иммунного ответа и/или для депрессии, модулирования, направления или перенаправления нежелательного иммунного ответа в целях достижения иммунодепрессии. Композиции и способы, описанные в данном документе, можно применять в диагностике, профилактике и/или лечении заболеваний, расстройств или состояний, при которых подавление иммунитета (например, толерогенного иммунного ответа) будет приность пользу в лечении. Такие заболевания, расстройства или состояния включают воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, аллергии, отторжение органа или тканей или болезнь "трансплант против хозяина". Композиции и способы, описанные в данном документе, также можно использовать для субъектов, у которых осуществлялась или будет осуществляться трансплантация. Композиции и способы, описанные в данном документе, также можно использовать для субъектов, которые получили, получают или будут получать терапевтический белок, против которого у них образовался или, как ожидается, будет образовываться нежелательный иммунный ответ.
Аутоимунные заболевания включают, но не ограничиваются этим, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, иммуноопосредованный диабет или диабет I типа, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или неспецифический язвенный колит), системную красную волчанку, псориаз, склеродерму, аутоимунные заболевания щитовидной железы, очаговую алопецию, базедову болезнь, синдром Гийена-Барре, целиакию, синдром Шегрена, ревматическую лихорадку, гастрит, аутоиммунный атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, инсулит, оофорит, орхит, увеит, вызванный глазными линзами, миастению гравис, первичную микседему, злокачественную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь Аддисона, склеродерму, синдром Гудпасчера, нефрит, например, гломеруло-нефрит, псориаз, пузырчатку обыкновенную, пемфигоид, симпатическую офтальмию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, идеопатическую лекопению, грануломатоз Вегенера и по-ли/дерматомиозит. Некоторые иллюстративные аутоиммунные заболевания, связанные с аутоантигена-ми, и антитела, которые предполагаются для применения в данном изобретении, описаны в табл. 1 ниже.
антитела
нейропатия (ОМАН)
ганглиозида GM1
Мультифокальная моторная невропатия с блоком проводимости (ММН)
Антиактиновые антитела
Актин
Антиактиновые антитела при целиакии коррелировали со степенью повреждения кишечника [6] [7]
Антитела печеночно-почечного микросоматическо го типа 1
Аутоимунный гепатит [8]
Волчаночный антико ату лянт
Антитромб иновые антитела
Тромбин
Системная красная волчанка
Антинейтрофильн ые
цитоплазматическ ие антитела
Фосфолипид
Антифосфолипидный синдром
c-ANCA
Белки в
нейтрофильной цитоплазме
Грану лематоз Вегенера
p-ANCA
нейтрофил перину клеарный
Микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросса, системный васкулит (неспецифический)
Ревматоидный фактор
IgG
Ревматоидный артрит
Антитела к гладким мышцам
гладкие мышцы
Хронический аутоиммунный гепатит
Антитела к митохондриям
Митохондрия
Первиный билиарный цирроз [9]
Анти-SRP
сигнал-
распознающая
частица
Полимиозит [10]
экзосомный комплекс
Склеромиозит
никотиновый
ацетилколиновый
рецептор
Миастения гравис
Мышечно-специфическая киназа (MUSK)
Миастения гравис
Анти-VGCC
потенциалзависим
Миастенический синдром Ламберта-
ый кальцевый канал (P/Q-тип)
Итона
тиропероксидаза (микросомальная)
Тереоидит Хашимото
Рецептор тиреотропного гормона (TSH-рецептор)
Болезнь Грейвса
Паранеопластический мозжечковый синдром
Yo (мозжечковые Клетки Пуркинье)
Паранеопластический мозжечковый синдром
Амфифизин
Синдром негибкого человека, паранеопластический мозжечковый синдром
Анти-VGKC
Потенциалзависим ый кальцевый канал (VGKC)
Лимбический энцефалит, Синдром Исаакса (аутоиммунная нейромиотомия)
базальные ганглии нейронов
Хорея Сиденгами, детское аутоиммунное
нейропсихиатрическое заболевание, связанное со Streptococcus (PANDAS)
N-метил-Б-аспартатный рецептор (NMDA)
Энцефалит
декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD)
Сахарный диабет 1 типа, синдром негибкого человека
аквапорин-4
Нейромиелит зрительного нерва (синдром Девика)
Воспалительные заболевания включают, но без ограничений, болезнь Альцгеймера, анкилозирую-щий спондилит, артрит, астму, атеросклероз, болезнь Бехчета, хроническую воспалительную демиелини-зирующую полирадикулонейропатию, болезнь Крона, колит, муковисцидоз, дерматит, дивертикулит, гепатит, синдром раздраженного кишечника (IBS), красную волчанку, мышечную дистрофию, нефрит, болезнь Паркинсона, опоясывающий лишай и язвенный колит. Воспалительные заболевания также включают, но не ограничиваются ими, например, сердечно-сосудистое заболевание, хроническую об-структивную болезнь легких (ХОБЛ), бронхоэктазию, хронический холецистит, туберкулез, тереоидит Хашимото, сепсис, саркоидоз, силикоз и другие пневмокониозы и имплантированное в ране инородное тело. Как использовано в данном контексте, термин "сепсис" относится к хорошо известному клиническому синдрому, связанному с системной воспалительной реакции на микробное вторжение у хозяина. Термин "сепсис", как он используется в данном документе, относится к состоянию, которое обычно характеризуется жаром или гипотермией и учащенным дыханием, а в тяжелых случаях может привести гипотензии, дисфункции органов и даже к смерти.
В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание представляет собой не аутоиммунное заболевание кишечника, послеоперационные спайки, коронарную артериальную болезнь, фиброз печени, острый респираторный дистресс-синдром, острый воспалительный панкреатит, панкреатит, вызванный эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографией, ожоги, атерогенез коронарных, мозговых и периферических артерий, аппендицит, холецистит, дивертикулит, висцеральные фиброзные заболевания, заживление ран, нарушения рубцевания кожи (келоидные рубцы, гидраденит, гнойные нарушения), грануломатозные расстройства (саркоидоз, первичный билиарный цирроз), бронхиальная астма, гангренозная пиодермия, синдром Свита, болезнь Бехчета, первичный склерозирующий холангит или абсцесс. В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание является воспалительным
заболеванием кишечника (например, болезнь Крона или неспецифический язвенный колит).
В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. Аутоиммунное заболевание в некоторых вариантах осуществления представляет собой ревматоидный артрит, ревматическую лихорадку, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника, инсулин-зависимый сахарный диабет, сахарный диабет, юношеский диабет, спонтанный аутоиммунный диабет, гастрит, аутоиммунный атрофиче-ский гастрит, аутоиммунный гепатит, тереоидит, тереоидит Хашимото, инсулит, оофорит, орхит, увеит, увеит, вызванный глазными линзами, рассеянный склероз, миастению гравис, первичную микседему, тиреотоксикоз, злокачественную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилоартрит, саркоидоз, склеродерму, синдром Гудпасчера, синдром Гийена-Барре, болезнь Грейвса, гломерулонефрит, псориаз, пузырчатку обыкновенную, пемфигоид, экземы, буллезную пузырчатку, симпатическую офтальмию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, идеопатиче-скую лекопению, синдром Шегрена, системный склероз, грануломатоз Вегенера, поли/дерматомиозит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, волчанку или системную красную волчанку.
Болезнь "трансплант против хозяина" (БТПХ) является осложнением, которое может возникать после трансплантации плюрипотентной клетки (например, стволовой клетки) или костного мозга, при котором недавно пересаженный материал приводит к атаке трансплантата организма реципиента. В некоторых случаях БТПХ может произойти после переливания крови. Болезнь "трансплант против хозяина" можно подразделить на острую и хроническую формы. Острая или бурно протекающая форма заболевания (оБТПХ) обычно наблюдается в течение первых 100 дней после пересадки, и является серьезной проблемой для трансплантации вследствие связанных с ней заболеваемостью и смертностью. Хроническая форма болезни "трансплант против хозяина" (хБТПХ) обычно наблюдается после 100 дней. Появление умеренных до тяжелых случаев хБТПХ отрицательно влияет на продолжительность долгосрочного выживания.
Примеры
Пример 1. Иммунный ответ при использовании синтетических наноносителей со связанным рапа-мицином с пептидом овальбумина или без него (323-339). Материалы.
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т и В-клеток, приобретен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). Рапамицин был приобретен у TSZ СНЕМ (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Product Catalogue # R1017). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и характеристической вязкостью 0,75 дл/г приобрели у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; код продукта 7525 DLG 7A). Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. Рампамицин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения рапамицина в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLGA из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, рН 8.
Способ получения синтетического наноносителя, содержащего рапамицин и овальбумин (323-339).
Сначала получали первичную эмульсию "вода в масле". W1/O1 получали путем объединения раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,2 мл) и раствора 3 (1,0 мл) в небольшой напорной трубке и обработки ультразвуком в течение 40 с при амплитудой 50% с помощью Branson Digital Sonifier 250. Затем получали вторичную эмульсию (W1/O1/W2) путем объединения раствора 4 (3,0 мл) с первичной эмульсией W1/O1, перемешивания на вортексе в течение 10 с и обработки ультразвуком в течение 60 с при амплитуде 30% с помощью Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ рН 8 раствора фосфатного буфера (30 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали путем переноса суспензии синтетического наноносителя в центрифужную пробирку и центрифугирования при 21000xg и 4°С в течение 1 ч, удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования осадка в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторяли, а осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с получением конечной дисперсии синтетического наноносителя при около 10 мг/мл.
Количества пептида и рапамицина в синтетических наноносителях определяли с помощью HPLC-анализа. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим способом.
Способ получения синтетического наноносителя, содержащего рапамицин.
Сначала получали первичную эмульсию "вода в масле". W1/O1 была получена объединением 0,13 М раствора соляной кислоты (0,2 мл), раствора 2 (0,2 мл) и раствора 3 (1,0 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Вторичную эмульсию (W1/O1/W2) затем получали путем объединения раствора 4 (3,0 мл) с первичной эмульсией W1/O1, перемешивания на вортексе в течение 10 с и обработки ультразвуком в течение 60 с при амплитуде 30% с помощью Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ рН 8 раствора фосфатного буфера (30 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали путем переноса суспензии синтетического наноносителя в центрифужную пробирку и центрифугирования при 21000x g и 4°С в течение 1 ч, удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования осадка в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторяли, а осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с получением конечной дисперсии синтетического наноносителя при около 10 мг/мл.
Количество рапамицина в синтетическом наноносителе определяли путем HPLC-анализа. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим способом.
Способ измерения внесенного количества рапамицина.
Приблизительно 3 мг синтетических наноносителей собирали и центрифугировали с отделением надосадочной жидкости от осадка синтетического наноносителя. К осадку добавляли ацетонитрил и образец обрабатывали ультразвуком и центрифугировали, чтобы удалить любой нерастворимый материал. Надосадочную жидкость и осадок вводили в RP-HPLC и абсорбцию считывали при 278 нм. мкг осадка использовали для подсчета % захвата (внесенного количества), мкг надосадочной жидкости использовали для подсчета общего количества мкг.
Способ измерения внесенного количества овальбумина (323-339).
Приблизительно 3 мг синтетических наноносителей собирали и центрифугировали с отделением надосадочной жидкости от осадка синтетического наноносителя. К осадку добавляли трифторэтанол и образец обрабатывали ультразвуком для растворения полимера, добавляли 0,2% трифторуксусную кислоту и образец обрабатывали ультразвуком, а затем центрифугировали, чтобы удалить любой нерастворимый материал. Надосадочную жидкость и осадок вводили в RP-HPLC и абсорбцию считывали при 215 нм. мкг осадка использовали для подсчета % захвата (внесенного количества), мкг надосадочной жидкости использовали для подсчета общего количества мкг.
Действие антиген-специфических толерогенных дендритных клеток (Tdc) на развитие Treg клеток.
Анализ включал применение мышей ОТП, имеющих трансгенный Т-клеточный рецептор, специфический для иммунодоминантного овальбумина (323-339). В целях получения антиген-специфических tDC, изолировали CD11 c+ спленоциты и вносили пептид овальбумина (323-339) in vitro в количестве 1 мкг/мл или не вносили антиген. Растворимый или инкапсулированный на наноносителе рапамицин затем добавляли к DC на 2 ч, затем их тщательно отмывали для удаления свободного рапамицина из культуры. Очищенный респондер - CD4+CD25- клетки изолировали от мышей ОТП и вводили в tDC в соотношении Т к DC 10:1. Смесь tDC и OTII Т-клеток затем культивировали в течение 4-5 дней, а затем анализировали встречаемость Т-регуляторных клеток (CD4+CD25highFoxP3+) методом проточной цито-метрии, как показано на фиг. 1. Области были выбраны на основе изотопического контроля.
Пример 2. Мезопористые силикатные наночастицы со связанным ибупрофеном (возможный вариант).
Ядра мезопористых наночастиц SiO2 создают с помощью золь-гелевого способа. Гексадецилтриме-тил-аммоний бромид (СТАВ) (0,5 г) растворяют в деионизированной воде (500 мл), а затем добавляют 2 М водный раствор NaOH (3,5 мл) к раствору СТАВ. Раствор перемешивают в течение 30 мин, а затем в раствор добавляют тетраэтоксисилан (TEOS) (2,5 мл). Полученный гель перемешивают в течение 3 ч при температуре 80°С. Образованный белый преципитат отделяют фильтрованием, а затем отмывают деио-низированной водой и высушивают при комнатной температуре. Остальное поверхностно-активное вещество затем экстрагируют из частиц путем суспендирования в этанольном растворе HCl в течение ночи. Частицы отмывают этанолом, центрифугируют и редиспергируют под ультразвуком. Данную процедуру отмывки повторяют дополнительно два раза.
Наночастицы SiO2 затем функционализируют аминогруппами с помощью (3-аминопропил)-триэтоксисилана (APTMS). Для этого частицы суспендируют в этаноле (30 мл) и добавляют в суспензию APTMS (50 мкл). Суспензию оставляют при комнатной температуре на 2 ч, а затем кипятят в течение 4 ч, поддерживая постоянный объем, периодически добавляя этанол. Оставшиеся реагенты удаляют, проводя пять циклов отмывки центрифугированием и повторной дисперсией в чистом этаноле.
В отдельной реакции образуются зерна золота диаметром 1-4 нм. Воду, используемую в реакциях, сначала деионизируют, а затем дистиллируют в стеклянном аппарате. Воду (45,5 мл) добавляют в круг-лодонную колбу объемом 100 мл. Во время перемешивания добавляют 0,2 М водный NaOH (1,5 мл) с последующим добавлением 1% водного раствора хлорида тетракис-(гидроксиметил)фосфония (ТНРС) (1,0 мл). Через 2 мин после добавления раствора ТНРС добавляют водный раствор хлорзолотой кислоты
(2 мл) при 10 мг/мл, который выдерживали по меньшей мере 15 мин. Зерна золота очищают диализом против воды.
Для формирования наноносителей типа "ядро-оболочка", амино-функционализированные наноча-стицы SiO2, сформированные выше, сначала смешивают с зернами золота в течение 2 ч при комнатной температуре. Частицы SiO2 с включенным золотом собирают путем центрифугирования и смешивают с водным раствором хлорзолотой кислоты и бикарбоната калия для формирования золотой оболочки. Частицы затем отмывают центрифугированием и редиспергируют в воде. Ибупрофен вносят путем суспен-дирования частиц в растворе ибупрофена натрия (1 мг/л) в течение 72 ч. Свободный ибупрофен затем отмывают из частиц центрифугированием и редиспергированием в воде.
Пример 3. Липосомы, содержащие циклоспорин А (возможный вариант).
Липосомы формируют с помощью пленочной гидратации. 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) (32 мкмоль), холестерин (32 мкмоль) и циклоспорин А (6,4 мкмоль) растворяют в чистом хлороформе (3 мл). Этот липидный раствор добавляют в круглодонную колбу объемом 50 мл и растворитель выпаривают на роторном испарителе при температуре 60°С. Затем колбу продувают газообразным азотом для удаления оставшегося растворителя. Фосфатно-солевой буфер (2 мл) и пять стеклянных гранул добавляют в колбу и липидную пленку гидратируют путем встряхивания при 60°С в течение 1 ч с формированием суспензии. Суспензию переносят в небольшую толстостенную пробирку и обрабатывают ультразвуком при 60°С в течение четырех циклов 30 с импульсов с задержкой 30 с между каждым импульсом. Затем суспензию оставляют без вмешательства при комнатной температуре в течение 2 ч для того, чтобы обеспечить полную гидратацию. Липосомы отмывают центрифугированием с последующим ресуспендированием в свежем фосфатно-солевом буфере.
Пример 4. Полимерный наноноситель, содержащий конъюгат полимер-рапамицин (возможный вариант).
Получение конъюгата PLGA-рапамицин.
Полимер PLGA с концевой кислотной группой (7525 DLG1 А, кислотное число 0,46 ммоль/г, Lake-shore Biomaterials; 5 г, 2,3 ммоль, 1,0 экв) растворяют в 30 мл дихлорметана (DCM). Добавляют N,N-дициклогексилкарбодиимид (1,2 экв., 2,8 ммоль, 0,57 г) с последующим добавлением рапамицина (1,0 экв., 2,3 ммоль, 2,1 г) и 4-диметиламинопиридина (DMAP) (2,0 экв., 4,6 ммоль, 0,56 г). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем смесь фильтруют, чтобы удалить нерастворимую дициклогексилмочевину. Фильтрат концентрируют до около 10 мл в объеме и добавляют к 100 мл изопропилового спирта (IPA) для осаждения конъюгата PLGA-рапамицин. Слой IPA удаляют, а полимер затем отмывают с помощью 50 мл IPA и 50 мл метил-трет-бутилового эфира (МТВЕ). Затем полимер сушат под вакуумом при 35°С в течение 2 суток с получением PLGA-рапамицина в виде белого твердого вещества (около 6,5 г).
Получение наносителя, содержащего конъюгат PLGA-рапамицин и пептид овальбумин (323-339). Наноноситель, содержащий PLGA-рапамицин, получают согласно процедуре, описанной в примере 1, следующим образом:
Растворы для формирования наноносителя получают следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор получают путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. PLGA-рампамицин из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор получают путем растворения PLGA-рапамицина в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор получают путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, рН 8.
Сначала готовят основную водно-масляную эмульсию. W1/O1 приготовлен комбинированием раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,75 мл) и раствора 3 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем готовят вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 4 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250. Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ рН 8 раствора фосфатного буфера (30 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и образовались наноносители. Часть наноносителей отмывают путем переноса суспензии наноносителей в центрифужную пробирку и центрифугирования при 75600xg и 4°С в течение 35 мин, удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования осадка в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторяют и осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере до получения конечной дисперсии наноносителя при около 10 мг/мл.
Пример 5. Получение золотых наноносителей (AuNC), содержащих рапамицин (возможный вариант).
Получение HS-PEG-рапамицина.
Раствор кислого дисульфида PEG (1,0 экв), рапамицина (2,0-2,5 экв), DCC (2,5 экв) и DMAP (3,0 экв) в сухом DMF перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Нерастворимую дицикло-гексилмочевину удаляют фильтрованием, а фильтрат добавляют к изопропиловому спирту (IPA), чтобы преципитировать PEG-дисульфид-ди-рапамицин эстер, отмывают IPA и высушивают. Полимер затем обрабатывают трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлоридом в DMF, чтобы восстановить PEG дисульфид до тиолового эфира PEG рапамицина (HS-PEG-рапамицин). Полученный в результате полимер извлекают осаждением из IPA и сушат, как описано ранее, и анализируют с помощью Н ЯМР и GPC.
Формирование золотых NC (AuNC).
Водный раствор 500 мл 1 ммоль HAuCl4 нагревают с обратным холодильником в течение 10 мин с интенсивным перемешиванием в круглодонной колбе объемом 1 л, оснащенной конденсатором. Раствор из 50 мл 40 ммоль тринатрий цитрата затем быстро добавляют в перемешиваемый раствор. Полученный густо-винный раствор выдерживают до возврата флегмы в течение 25-30 мин, отключают подогрев и охлаждают раствор до комнатной температуры. Затем раствор фильтруют через 0,8 мкм мембранный фильтр с получением раствора AuNC. Получают характеристики AuNC с помощью спектроскопии в видимой области и трансмиссионной электронной микроскопии. AuNC имеют диаметр около 20 нм, покрыты цитратом с пиком поглощения при 520 нм.
AuNC конъюгируют с HS-PEG-рапамицином.
Раствор 150 мкл HS-PEG-рапамицина (10 мкмоль в 10 ммоль рН 9,0 карбонатного буфера) добавляют к 1 мл покрытых цитратом золотых наноносителей 20 нм в диаметре (1,16 нмоль), с получением молярного соотношения тиола к золоту 2500:1. Смесь перемешивают при комнатной температуре под аргоном в течение 1 ч, с полным обменом тиола с цитратом на золотых наноносителях. AuNC с PEG-рапамицином на поверхности затем очищают центрифугированием при 12000 g в течение 30 мин. Надо-садочную жидкость сливают, а осадок, содержащий AuNC-S-PEG-рапамицин, затем отмывают с помощью 1xPBS буфера. Очищенные наноносители золото-PEG-рапамицин затем ресуспендируют в подходящем буфере для дальнейшего анализа и биотестов.
Пример 6. Мезопористые силикатно-золотые наноносители типа "ядро-оболочка", содержащие овальбумин (возможный вариант).
Ядра мезопористых наночастиц SiO2 создают с помощью золь-гелевого способа. Гексадецилтриме-тил-аммоний бромид (СТАВ) (0,5 г) растворяют в деионизированной воде (500 мл), а затем добавляют 2 М водный раствор NaOH (3,5 мл) к раствору СТАВ. Раствор перемешивают в течение 30 мин, а затем в раствор добавляют тетраэтоксисилан (TEOS) (2,5 мл). Полученный гель перемешивают в течение 3 ч при температуре 80°С. Образованный белый преципитат отделяют фильтрованием, а затем отмывают деио-низированной водой и высушивают при комнатной температуре. Оставшееся поверхностно-активное вещество затем экстрагируют из частиц путем суспендирования в этанольном растворе HCl в течение ночи. Частицы отмывают этанолом, центрифугируют и редиспергируют под ультразвуком. Данную процедуру отмывки повторяют дополнительно два раза.
Наночастицы SiO2 затем функционализируют аминогруппами с помощью (3-аминопропил)-триэтоксисилана (APTMS). Для этого частицы суспендируют в этаноле (30 мл) и добавляют в суспензию APTMS (50 мкл). Суспензию оставляют при комнатной температуре на 2 ч, а затем кипятят в течение 4 ч, поддерживая постоянный объем, периодически добавляя этанол. Оставшиеся реагенты удаляют, проводя пять циклов отмывки центрифугированием и повторной дисперсией в чистом этаноле.
В отдельной реакции образуются зерна золота диаметром 1-4 нм. Воду, используемую в реакциях, сначала деионизируют, а затем дистиллируют в стеклянном аппарате. Воду (45,5 мл) добавляют в круг-лодонную колбу объемом 100 мл. Во время перемешивания добавляют 0,2 М водный NaOH (1,5 мл) с последующим добавлением 1% водного раствора хлорида тетракис-(гидроксиметил)фосфония (ТНРС) (1,0 мл). Через 2 мин после добавления раствора ТНРС добавляют водный раствор хлорзолотой кислоты при 10 мг/мл (2 мл), который выдерживали по меньшей мере 15 мин. Зерна золота очищают диализом против воды.
Для формирования наноносителей типа "ядро-оболочка" функционализированные аминогруппами наночастицы SiO2, сформированные как описано выше, сначала смешивают с зернами золота в течение 2 ч при комнатной температуре. Частицы SiO2 с включенным золотом собирают путем центрифугирования и смешивают с водным раствором хлорзолотой кислоты и бикарбоната калия для формирования золотой оболочки. Частицы затем отмывают путем центрифугирования и редиспергируют в воде. Тиолирован-ный овальбумин (изготовленный путем обработки овальбумина 2-иминотиолангидрохлоридом) вносят путем суспендирования частиц в растворе тиолированного овальбумина (1 мг/л) в течение 72 ч. Частицы затем отмывают от осадка с помощью 1 x PBS (рН 7,4) для удаления свободного белка. Полученные в результате силикатно-золотые наноносители типа "ядро-оболочка", содержащие овальбумин, затем ресус-пендируют в 1 x PBS для дальнейшего анализа и тестов.
Пример 7. Липосомы, содержащие рапамицин и овальбумин (возможный вариант).
Липосомы формируют путем тонкопленочной гидратации. 1,2-Дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) (32 мкмоль), холестерин (32 мкмоль) и рапамицин (6,4 мкмоль) растворяют в чистом хлороформе (3 мл). Этот липидный раствор добавляют в 10 мл стеклянную пробирку, и удаляют растворитель под потоком газообразного азота, и высушивают в течение 6 ч под вакуумом. Мультиламел-лярные везикулы получают гидратацией пленки с помощью 2,0 мл 25 мМ буфера MOPS с рН 8,5, содержащего избыточное количество овальбумина. Содержимое пробирки перемешивают на вортексе, пока липидная пленка не отойдет от поверхности пробирки. Для того чтобы разбить мультиламеллярные везикулы до моноламеллярных, применяют десять циклов замораживания (жидкий азот) и оттаивания (30°С водяная баня). Затем образец растворяют с получением объема 1 мл в 25 ммоль буфера MOPS с рН 8,5. Размер полученных в результате липосом гомогенизируют продавливанием путем десятикратного пропускания образца через поликарбонатные фильтры с порами 200 нм. Полученные в результате липо-сомы затем используют для дальнейших анализов и биотестов.
Пример 8. Полимерные наноносители, состоящие из модифицированной полиаминокислоты с поверхностно конъюгированным овальбумином (возможный вариант).
Стадия 1. Получение поли(у-глутаминовой кислоты) (y-PGA), модифицированной сложным этиловым эфиром L-фенилаланина (L-PAE): 4,7 единиц моль y-PGA (Mn=300 кДа) растворяют в 0,3 N-NaHCO3 водном растворе (50 мл). L-РАЕ (4,7 ммоль) и EDC.HCl (4,7 ммоль) добавляют в раствор и перемешивают в течение 30 мин при 4°С. Затем раствор выдерживают при комнатной температуре, перемешивая, в течение 24 ч. Низкомолекулярные вещества удаляют диализной мембраной с MWCO 50 кДа. Полученный y-PGA-графт-L-РАЕ получают замораживанием-высушиванием.
Стадия 2. Получение наночастиц из y-PGA-графт-L-РАЕ полимера: наночастицы, состоящие из y-PGA-графт-L-РАЕ, получают методами преципитации и диализа. y-PGA-графт-L-РАЕ (20 мг) растворили в 2 мл DMSO, а затем добавили 2 мл воды для получения полупозрачного раствора. Затем раствор диали-зируют против дистиллированной воды с помощью пропускания по трубке из целлюлозной мембраны (50000 MWCO), чтобы сформировать наночастицы и удалить органические растворители, в течение 72 ч при комнатной температуре. Дистиллированную воду заменяют с интервалом в 12 ч. Полученный в результате раствор наночастиц (10 мг/мл в воде) затем применяют для конъюгации антигена.
Стадия 3. Конъюгация овальбумина с y-PGA наночастицами: поверхностные группы карбоксильной кислоты y-PGA наночастиц (10 мг/мл) сначала активируются EDC и NHS (10 мг/мл каждого в фосфатном буфере, рН 5,8) в течение 2 ч при температуре окружающего воздуха. После отмывания осадка для удаления избыточного EDC/NHS активированные наночастицы смешивают с 1 мл овальбумина (10 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4) и смесь инкубируют при температуре 4-8°С в течение 24 ч. Полученные в результате наночастицы yPGA, конъюгированные с овальбумином, отмывают дважды с помощью PBS и ресуспендируют при 5 мг/мл в PBS для дальнейшего анализа и тестов.
Пример 9. Эритроэпоэтин (ЕРО)-инкапсулирующие y-PGA наночастицы (пример возможного использования).
Чтобы получить ЕРО-инкапсулирующие y-PGA наночастицы, 0,25-4 мг ЕРО растворяют в 1 мл PBS (рН 7,4) и 1 мл y-PGA-графт-L-РАЕ (10 мг/мл в DMSO) добавляют к раствору ЕРО. Полученный в результате раствор центрифугируют при 14000x g в течение 15 мин и многократно орошают PBS. Полученные в результате у-PGA наночастицы с инкапсулированным ЕРО затем ресуспендируют в PBS (5 мг/мл) для дальнейшего анализа и биотеста.
Пример 10. Получение золотых наноносителей (AuNC), содержащих овальбумин (возможный вариант).
Стадия 1. Формирование золотых NC (AuNC): водный раствор 500 мл 1 ммоль HAuCl4 нагревают с обратным холодильником в течение 10 мин с интенсивным перемешиванием в круглодонной колбе объемом 1 л, оснащенной конденсатором. Раствор из 50 мл 40 ммоль тринатрий цитрата затем быстро добавляют в перемешиваемый раствор. Полученный густо-винный раствор выдерживают до возврата флегмы в течение 25-30 мин, отключают подогрев и охлаждают раствор до комнатной температуры. Затем раствор фильтруют через 0,8 мкм мембранный фильтр с получением раствора AuNC. Получают характеристики AuNC с помощью спектроскопии в видимой области и трансмиссионной электронной микроскопии. AuNC имеют диаметр около 20 нм, покрыты цитратом с пиком поглощения при 520 нм.
Стадия 2. Конъюгация овальбумина с AuNC: раствор 150 мкл тиолированного овальбумина (10 мкмоль в 10 ммоль рН 9,0 карбонатного буфера) добавляют к 1 мл покрытых цитратом золотых наноно-сителей 20 нм в диаметре (1,16 нмоль), с получением молярного соотношения тиола к золоту 2500:1. Смесь перемешивают при комнатной температуре под аргоном в течение 1 ч, с полным обменом тиола с цитратом на золотых наноносителях. AuNC с овальбумином на поверхности затем очищают путем центрифугирования при 12000 g в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают и осадок, содержащий AuNC-овальбумин, затем отмывают 1xPBS буфером. Очищенные наноносители золото-овальбумин затем ресуспендируют в подходящем буфере для дальнейшего анализа и биотестов.
Пример 11. Оценка толерогенного иммунного ответа на антиген in vivo (возможный вариант).
Мышей Balb/c иммунизируют антигеном в неполном адъюванте Фрейнда и оценивают уровень пролиферации регуляторных В-клеток. Затем композицию по настоящему изобретению вводят дозозави-симым образом. Тех же мышей затем снова подвергают воздействию антигена и снова оценивают уровень пролиферации регуляторных В-клеток. Затем отслеживают изменения в пролиферации регулятор-ных В-клеток, которая повышается при последующем контрольном введении антигена, что указывает на толерогенный иммунный ответ.
Пример 12. Оценка индукции регуляторных В-клеток in vitro (возможный вариант).
Клеточную популяцию, включающую регуляторные В-клетки или предшественники регуляторных В-клеток, приводят в контакт in vitro с композицией, представленной в данном документе. После периода времени, достаточного для взаимодействия композиции с регуляторными В-клеками или предшественниками регуляторных В-клеток в клеточной популяции, ожидается увеличение числа регуляторных В-клеток. Время, достаточное для увеличения числа регуляторных В-клеток в популяции, составляет в некотором варианте осуществления период около 1 суток, около 2 суток, около 3 суток, около 4 суток, около 5 суток, около 6 суток, около 1 недели, около 2 недель, около 3 недель или около 4 недель. В некоторых вариантах осуществления количество регуляторных В-клеток увеличивается по прошествии этого времени, например, в по меньшей мере около 5 раз, в по меньшей мере около 10 раз, в по меньшей мере около 20 раз, в по меньшей мере около 50 раз, в по меньшей мере около 100 раз, в по меньшей мере около 1000 раз, в по меньшей мере около 10000 раз, в по меньшей мере около 100000 раз или в по меньшей мере около 1000000 раз по сравнению с исходным общим или относительным количеством регулятор-ных В-клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления количество регуляторных В-клеток увеличивается по прошествии этого времени, например, на около 1%, около 5%, около 10%, около 15%, около 20%, около 25%, около 30%, около 40 %, около 50%, около 75%, около 90% или около 95% от общего количества клеток у субъекта, или от популяции лимфоцитов у субъекта. В некоторых вариантах осуществления регуляторные В-клетки отсутствуют в клеточной популяции до контакта, но присутствуют после контакта.
В некоторых вариантах осуществления общее и/или относительное количество регуляторных В-клеток в популяции определяют прежде, чем популяция клеток проконтактирует с композицией, представленной в данном документе, для определения базового количества регуляторных В-клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток однократно приводят в контакт с композицией, представленной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток неоднократно приводят в контакт с композицией, представленной в данном документе.
Количество и/или наличие регуляторных В-клеток в популяции клеток также определяют после контакта. В некоторых вариантах осуществления количество и/или наличие регуляторных В-клеток отслеживают в течение определенного периода времени, например, путем осуществления множества последующих тестов для обнаружения регуляторных В-клеток. В некоторых вариантах осуществления количество и/или наличие регуляторных В-клеток в популяции клеток определяют путем отбора образца из клеточной популяции, который является репрезентативным для клеточной популяции, окрашивания клеток, содержащихся в этом образце, антителами или окрашивающими средствами, которые специфически обнаруживают маркеры регуляторных В-клеток, и обнаружения клеток, которые экспрессируют маркеры регуляторных В-клеток в образце, например, с помощью FACS или иммуногистохимии. В некоторых вариантах осуществления определяют количество регуляторных В-клеток. В некоторых вариантах осуществления количество регуляторных В-клеток, определенное после контакта, сравнивают с количеством регуляторных В-клеток до контакта, например, с базовым количеством регуляторных В-клеток, причем, если количество регуляторных В-клеток в популяции клеток после контакта выше, чем базовое количество, то приходят к заключению, что имел место толерогенный ответ на композицию.
Пример 13. Оценка индукции регуляторных В-клеток in vivo (возможный вариант).
Клеточную популяцию, включающую регуляторные В-клетки или предшественники регуляторных В-клеток, приводят в контакт in vivo с композицией, представленной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту, в организме которого содержится клеточная популяция, включающая регуляторные В-клетки или предшественники регуляторных В-клеток. После периода времени, достаточного для взаимодействия композиции с регуляторными В-клетками или предшественниками регуляторных В-клеток в организме субъекта, ожидается увеличение числа регулятор-ных В-клеток. Время, достаточное для увеличения количества регуляторных В-клеток в популяции, составляет в некоторых вариантах осуществления период около 1 суток, около 2 суток, около 3 суток, около 4 суток, около 5 суток, около 6 суток, около 1 недели, около 2 недель, около 3 недель или около 4 недель. В некоторых вариантах осуществления период времени, достаточный, чтобы вызвать увеличение количества регуляторных В-клеток, составляет более 4 недель. В некоторых вариантах осуществления количество регуляторных В-клеток увеличивается по прошествии этого времени в по меньшей мере около 5 раз, в по меньшей мере около 10 раз, в по меньшей мере около 20 раз, в по меньшей мере около 50 раз, в по меньшей мере около 100 раз, в по меньшей мере около 1000 раз, в по меньшей мере около 10000 раз, в по меньшей мере около 100000 раз или в по меньшей мере около 1000000 раз по сравнению с ис
ходным общим или относительным количеством регуляторных В-клеток у субъекта. В некоторых вариантах осуществления количество регуляторных В-клеток увеличивается по прошествии этого времени, например, на около 1, около 5, около 10, около 15, около 20, около 25, около 30, около 40, около 50, около 75, около 90 или около 95% от общего количества клеток у субъекта или от популяции лимфоцитов у субъекта. В некоторых вариантах осуществления регуляторные В-клетки отсутствуют у субъекта до введения, но присутствуют после введения.
В некоторых вариантах осуществления общее и/или относительное количество регуляторных В-клеток у субъекта определяют до введения субъекту композиции, представленной в данном документе, для определения базового количества регуляторных В-клеток у субъекта. В некоторых вариантах осуществления композицию, представленную в данном документе, вводят субъекту однократно. В некоторых вариантах осуществления композицию, приведенную в данном документе, вводят субъекту несколько раз, например, до тех пор, пока не будет наблюдаться желательное увеличение или численность регуля-торных В-клеток у субъекта.
Количество и/или наличие регуляторных В-клеток у субъекта определяют после введения. В некоторых вариантах осуществления количество и/или наличие регуляторных В-клеток отслеживают в течение определенного периода времени, например, путем осуществления множества последующих тестов для обнаружения регуляторных В-клеток. В некоторых вариантах осуществления количество и/или наличие регуляторных В-клеток у субъекта определяют путем отбора образца у субъекта, например, образца периферической крови, или образца лимфы, который является репрезентативным для популяции лимфоцитов у субъекта, окрашивания клеток, содержащихся в этом образце, антителами или окрашивающими средствами, которые специфически обнаруживают маркеры регуляторных В-клеток, и обнаружения клеток, которые экспрессируют маркеры регуляторных В-клеток в образце, например, с помощью FACS или иммуногистохимии. В некоторых вариантах осуществления определяют количество регуляторных В-клеток. В некоторых вариантах осуществления количество регуляторных В-клеток, определенное после введения, сравнивают с количеством регуляторных В-клеток до введения, например, с базовым количеством регуляторных В-клеток, причем, если количество регуляторных В-клеток у субъекта после введения выше, чем базовое количество, приходят к заключению, что имел место толерогенный ответ на композицию.
Пример 14. Индукция желательного иммунного ответа на трансплантируемые клетки костного мозга in vivo (возможный вариант).
Множество по меньшей мере 10 синтетических наноносителей, содержащих иммунодепрессант и антигены, полученные из или произведенные на основе клеток костного мозга вводят подкожно субъекту за четыре недели до проведения субъекту пересадки костного мозга. После помещения трансплантата в организм субъекта образование желательного иммунного ответа оценивают один раз в день ежедневно в течение первой недели после помещения трансплантата, а затем еженедельно в течение следующих трех недель, а затем ежемесячно в течение следующих 11 месяцев. В качестве части оценивания подсчитывают количество регуляторных В-клеток и сравнивают с количеством регуляторных В-клеток, подсчитанным до введения трансплантата костного мозга или синтетических наноносителей субъекту. В течение первого года субъекту раз в два месяца вводят поддерживающую дозу синтетических наноносителей. Ожидается, что у субъекта будут обнаруживаться более высокие или желательные уровни регуляторных В-клеток, специфических для трансплантата костного мозга.
Пример 15. Оценка воздействий наноносителей с антигенами и иммунодепрессантами.
Наноносители.
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т и В-клеток, приобретен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). PLGA с соотношением лактид.гликолид 3:1 и характеристической вязкостью 0,75 дл/г приобрели у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. PLGA из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, рН 8. Сначала получали первичную эмульсию "вода в масле". W1/O1 получали путем объединения раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,75 мл) и раствора 3 (0,25 мл) в небольшой напорной трубке и обработки ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с помощью Branson Digital Sonifier 250. Вторичную эмульсию
(W1/O1/W2) затем получали путем объединения раствора 4 (3,0 мл) с первичной эмульсией W1/O1, перемешивания на вортексе в течение 10 с и обработки ультразвуком в течение 60 с при амплитуде 30% с помощью Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с рН 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть наноносителей отмывали путем переноса суспензии наноносителей в центрифужную пробирку и центрифугирования при 75600xg и 4°С в течение 35 мин, удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования осадка в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторяли и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере до получения конечной дисперсии наноносителей при около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли с помощью динамического рассеяния света. Количество пептида в наноносителе было определено при помощи HPLC-анализа. Общую массу сухого синтетического нано-носителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 2).
Таблица 2
Наноноситель
Эффективный диаметр (нм)
Содержание пептидов (вес/вес %)
234
2,1
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т и В-клеток, приобретен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). Рапамицин был приобретен у TSZ СНЕМ (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Product Catalogue # R1017). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и характеристической вязкостью 0,75 дл/г приобрели у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. Рампамицин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения рапамицина в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLGA из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 5. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, рН 8.
Сначала получали первичную эмульсию "вода в масле". Эмульсия W1/O1 была получена смешиванием раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,2 мл), раствора 3 (0,75 мл) и раствора 4 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем получали вторичную эмульсию (W1/O1/W2) путем объединения раствора 5 (3,0 мл) с первичной эмульсией W1/O1, перемешивания на вортексе в течение 10 с и обработки ультразвуком в течение 60 с при амплитуде 30% с помощью Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с рН 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Порцию наноносителей отмывали путем переноса суспензии наноносителей в центрифужную пробирку и центрифугирования при 21000xg и 4°С в течение 45 мин, удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования осадка в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторяли и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере до получения конечной дисперсии наноносителя при около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли с помощью динамического рассеяния света. Количества пептида и рапамицина в наноносителе определяли HPLC (ВЭЖХ)-анализом. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 3).
Таблица 3
нечной концентрации суспензии синтетических наноносителей приблизительно от 0,01 до 0,1 мг/мл. Разбавленную суспензию получали непосредственно внутри кюветы, пригодной для DLS-анализа. Кювету затем помещают в прибор ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corp., приводят равновесной температуре 25°С, а затем сканируют в течение достаточного времени для получения стабильного и воспроизводимого распределения на основе соответствующих введенных данных для вязкости среды и индексов преломления образца. Затем регистрируют эффективный диаметр или среднее значение распределения. Иммунизация.
Осуществляли оттаивание и уравновешивание наноносителей. Начальные растворы представляли собой 10x раствор реакционной смеси и затем были разбавлены до концентрации 100 мкг/мл в OVA323-339 или 1x раствор. Этот 1x раствор использовали для инъекций в объеме 200 мкл на внутривенную инъекцию. Животных иммунизировали белком OVA (OVA) и обрабатывали OVA323-339 пептидом. Методы иммунизации были следующими: 10 мкг OVA+ 4 мг Alum внутрибрюшинно в объеме 400 мкл на каждую интактную в иммунологическом отношении самку мыши Balb/C. Экспериментальные группы состояли из 5 животных каждая. Клетки селезенки повторно стимулировали антигеном с помощью CFSE или СТО с определением количества Ag-специфической пролиферации.
Измерение количества регуляторных В-клеток.
Частоту реактивных в отношении овальбумина В-клеток, секретирующих IL-10, подсчитывали методом проточной цитометрии. Спленоциты, полученные от экспериментальных животных, окрашивали CFSE, тиол-реактивным флуоресцентным красителем, пригодным для долгосрочного окрашивания клеток, и культивировали в полной среде при 37°С, 5% СО2 с белком овальбумина в течение 3 дней. На день 3 анализировали потенциал клеток к секреции различных цитокинов с помощью внутриклеточного окрашивания с помощью стандартных способов и наборов. Вкратце, клетки повторно стимулировали фор-болмиристатацетатом (РМА) и иономицином в течение 2 ч и блокировали транспорт белков в течение еще 4 ч. Неспецифическое связывание антител блокировали антителом к CD 16/32, а затем клетки окрашивали конъюгированными антителами, специфически распознающими исключительно В-клетки (CD45R (В220) и CD19). После фиксации параформальдегидом клетки становились проницаемыми для обеспечения проникновения моноклональных антител в клетки и маркировки внутриклеточных эпитопов (цитокинов). Спленоциты, которые являются B220+CD19+ клетками, оценивали на пролиферацию путем сравнения дифференциального окрашивания с помощью CFSE и определения доли IL-10-секретирующих клеток.
Измерение количества антител IgE.
Количество антител IgE измеряли с помощью набора Mouse OVA-IgE ELISA, производства MDBioproducts (Cat# M036005) согласно инструкциям производителя. Результаты.
На фиг. 2 показана эффективность наноносителей в образовании регуляторных В-клеток в образцах лаважа от животных субъектов, обработанных синтетическими наноносителями, включающими OVA323-339 и иммунодепрессант. На фигуре показано, что синтетические наноносители по настоящему изобретению приводили к производству IL-10 и TGF-р антиген-специфическими CD24+ В-клетками. На фиг. 3 показано снижение производства IgE с помощью синтетических наноносителей настоящего изобретения.
Пример 16. Выделение регуляторных В-клеток (Breg) от субъекта после введения синтетических наноносителей по настоящему изобретению (возможный вариант).
Breg выделяют из биологических образцов, например, из периферической крови, полученной от субъекта, после того, как субъекту вводили композицию синтетического наноносителя, описанного в данном документе. Как правило, биологический образец получают от субъекта после периода времени, достаточного для индукции Breg вводимыми itDC. Breg выделяют из биологического образца, например, из цельной крови, с помощью отрицательной и/или положительной селекции.
Например, клеточную фракцию цельной крови получают центрифугированием, а эритроциты лизи-руют с помощью лизирующего буфера для эритроцитов. После лизиса мононуклеарные клетки периферической крови очищают от CD4+ клеток и CD8+ Т-клеток. Впоследствии Breg обогащают с помощью положительной селекции по маркерам, представленным в других частях данного документа или иначе известным в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления выделение регуляторных В-клеток осуществляют с помощью коктейля биотинилированных антител и магнитных гранул с антителами к биотину для распознавания одного или нескольких из этих маркеров.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция, содержащая:
(i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами;
(ii) В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, для применения в способе, включающем:
(a) введение композиции в количестве, эффективном для обеспечения образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента; и/или
(b) обеспечение образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента; и/или
(c) введение пациенту композиции согласно протоколу, который, как было показано ранее, обеспечивает образование антиген-специфических регуляторных В-клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов.
2. Композиция по п.1, в которой (а) способ дополнительно включает предоставление или выявление пациента; и/или (b) антиген представляет собой терапевтический белок, аутоантиген или аллерген или ассоциирован с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплант против хозяина"; и/или (с) способ дополнительно включает оценку образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента перед и/или после введения композиции; и/или (d) пациент имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплант против хозяина"; и/или (е) пациенту проделали или будут делать трансплантацию; и/или (f) пациент имеет или
2.
существует риск развития у него нежелательного иммунного ответа против терапевтического белка, который вводят или будут вводить пациенту; и/или (g) одну или несколько поддерживающих доз композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, вводят пациенту; и/или (h) введение осуществляют путем внутривенного, интраперитонеального, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонарного, интраназального, интрадермального или внутримышечного введения, например путем ингаляции или внутривенного, подкожного или трансмукозального введения; и/или (i) иммунодепрессанты содержат статин, ингибитор mTOR, например, ингибитор mTOR является рапамицином, TGF-р сигнальный агент, кортикостероид, ингибитор митохондриальной функции, ингибитор Р38, NF-кР ингибитор, агонист рецептора аденозина, агонист простагландина Е2, ингибитор фосфодиэстеразы-4, ингибитор HDAC или ингибитор протеасомы; и/или (j) нагрузка иммунодепрессантами и/или эпитопами в среднем во всем первом множестве синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50% (вес./вес.), например от 0,1 до 10% (вес./вес.), где нагрузка иммунодепрессантами и/или эпитопами в среднем во всем первом множестве синтетических наноносителей необязательно составляет по меньшей мере 2%, но не более 25% (вес./вес.).
3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе поверхностно-активных веществ, дендримеры, бакиболлы, нанонити, вирусоподобные частицы или пептидные или белковые частицы.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что (а) синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, например, синтетические наноносители первого множества включают ли-посомы; (b) синтетические наноносители первого множества включают металлические наночастицы, например, металлические наночастицы включают наночастицы золота; (с) синтетические наноносители первого множества включают полимерные наночастицы, например, такие, где (i) полимерная наночасти-ца содержит полимер, который представляет собой не содержащий концевую метоксигруппу блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена; и/или (ii) полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, полиаминокислоту, поликарбонат, полиацеталь, поликеталь, полисахарид, полиэтилоксазолин или полиэтиленимин, например, сложный полиэфир включает поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот или поликапролактон, и/или полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, например, где указанный простой полиэфир включает полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.
5. Композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что (а) среднее распределение по размеру частиц, полученное с применением динамического рассеяния света, синтетических наноносителей первого множества, представляет собой диаметр, составляющий (i) более 100 нм; (ii) более 150 нм; (iii) более 200 нм; (iv) более 250 нм или (v) более 300 нм; и/или (b) соотношение размеров синтетических наноносителей первого множества составляет более 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.
6. Композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что способ дополнительно включает сбор образованных антиген-специфических регуляторных В-клеток и необязательно дополнительно включает (а) получение лекарственной формы, содержащей собранные антиген-специфические регуляторные В-клетки; и/или (b) обеспечение доступности собранных антиген-специфических регуляторных В-клеток или лекарственной формы для введения пациенту.
7. Композиция, содержащая (а) выделенные антиген-специфические регуляторные В-клетки, полученные согласно способу по любому из пп.1-6; или (b) композицию, полученную согласно способу по любому из пп.1-6, необязательно дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый наполнитель.
8. Лекарственная форма, содержащая композицию по п.7.
9. Композиция, содержащая выделенные антиген-специфические регуляторные В-клетки для применения в терапии или профилактике, причем указанные выделенные антиген-специфические регуля-торные В-клетки могут быть получены способом, включающим следующие стадии: (а) обеспечение образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента путем введения композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) B-клеточные эпитопы и/или ограниченными классом II МНС эпитопы антигена; и (b) сбор образованных антиген-специфических регуляторных В-клеток, необязательно представляющих собой такие, как определено в п.7.
10. Композиция, содержащая (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с им-мунодепрессантами; и (ii) В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, для применения в терапии или профилактике, необязательно являющиеся такими, как определено в пп.1-6.
11. Применение композиции по п.7 или по любому из пп.1-6 или 9 в терапии или профилактике, например, для применения при стимуляции толерогенного иммунного ответа или обеспечении образования
10.
антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента.
12. Применение лекарственной формы по п.8 в терапии или профилактике, например, для применения при стимуляции толерогенного иммунного ответа или обеспечении образования антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента.
13. Лекарственная форма, содержащая композицию по любому из пп.9-10.
14. Способ, включающий:
(i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессанта-
ми;
(ii) получение В-клеточных эпитопов и/или ограниченных классом II МНС эпитопов антигена,
отличающийся тем, что композиция находится в количестве, эффективном для обеспечения образо-
вания антиген-специфических регуляторных В-клеток у пациента, при этом необязательно:
(a) способ дополнительно включает получение лекарственной формы, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпито-пы антигена; и/или
(b) способ дополнительно включает получение композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена, или лекарственной формы, доступной пациенту для введения; и/или
(c) способ дополнительно включает оценку образования антиген-специфических регуляторных В-клеток с помощью композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена; и/или
(е) первое множество синтетических наноносителей и В-клеточные эпитопы и/или ограниченные классом II МНС эпитопы антигена получены, как определено в любом из пп.1-6.
15. Способ получения композиции, включающий следующие стадии:
(i) связывание первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами;
(ii) предоставление В-клеточных эпитопов и/или ограниченных классом II МНС эпитопов антигена,
отличающийся тем, что композиция находится в количестве, эффективном для обеспечения образо-
вания регуляторных В-клеток у пациента, где способ необязательно включает стадии, определенные в
способе по п.14.
16. Способ получения лекарственной формы, включающий следующие стадии:
(i) связывание первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами;
(ii) предоставление В-клеточных эпитопов и/или ограниченных классом II МНС эпитопов антигена,
отличающийся тем, что лекарственная форма находится в количестве, эффективном для обеспече-
ния образования регуляторных В-клеток у пациента, где способ необязательно включает стадии, опреде-
ленные в способе по п.14.
17. Композиция, которая может быть получена с помощью способов по п.14 или 15.
18. Лекарственная форма, которая может быть получена с помощью способов по п.14 или 15.
17.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027379
027379
- 1 -
- 1 -
(19)
027379
027379
- 1 -
- 1 -
(19)
027379
027379
- 1 -
- 1 -
(19)
027379
027379
- 4 -
- 3 -
027379
027379
- 10 -
027379
027379
- 13 -
- 13 -
027379
027379
- 35 -
- 35 -
027379
027379
- 37 -
- 37 -
027379
027379
- 47 -
- 47 -
027379
027379
- 286 -
- 286 -
027379
027379
- 287 -
288
027379
027379
- 289 -
288