EA 027314B1 20170731 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/027314 Полный текст описания [**] EA201390638 20111109 Регистрационный номер и дата заявки DKPA 2010 01018 20101109 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок DK2011/050423 Номер международной заявки (PCT) WO2012/062325 20120518 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21707 Номер бюллетеня [**] СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕТАЛЬНОЙ КЛЕТКИ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ И НАБОР ДЛЯ ИХ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Название документа [8] C12Q 1/68, [8] G01N 33/569, [8] G01N 33/68 Индексы МПК [DK] Эккельт Андреас, [DK] Кристенсен Бритта, [DK] Кельро Стен, [DK] Бринч Мари, [DK] Сингх Рипудаман, [DK] Хатт Лотте Сведения об авторах [DK] АРСЕДИ БАЙОТЕК АПС Сведения о патентообладателях [DK] АРСЕДИ БАЙОТЕК АПС Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000027314b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии: a) получение пробы материнской крови или ее фракции; b) пермеабилизация клеток материнской крови; c) контактирование пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и d) отбор клеток, которые связываются с указанным зондом или лигандом эндотелиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками с эндотелиальным фенотипом; e) контактирование клеток, выбранных на стадии d), проявляющих эндотелиальный фенотип, с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер; f) обнаружение клеток с эндотелиальным фенотипом, которые также связываются с указанным зондом или лигандом указанного эпителиального клеточного маркера со стадии е), где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.

2. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии: a) получение пробы материнской крови или ее фракции; b) пермеабилизация клеток материнской крови; c) контактирование пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер; d) отбор клеток, которые связываются с указанным зондом или лигандом эпителиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками с эпителиальным фенотипом; e) контактирование клеток, выбранных на стадии d), проявляющих эпителиальный фенотип, с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и f) обнаружение клеток с эпителиальным фенотипом, которые также связываются с указанным зондом или лигандом указанного эндотелиального клеточного маркера со стадии е), где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.

3. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии: a) получение пробы материнской крови или ее фракции; b) пермеабилизация клеток материнской крови; c) контактирование пробы с: i) с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и ii) с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер; и d) отбор клеток, которые связываются с: i) указанным зондом или лигандом эндотелиального клеточного маркера и ii) указанным зондом или лигандом указанного эпителиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками, как с эндотелиальным, так и с эпителиальным фенотипом, где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором мишень эндотелиального маркера располагается на поверхности идентифицируемой клетки.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором мишень эпителиального маркера располагается внутри идентифицируемой клетки.

6. Способ по любому из пп.1-2, который дополнительно включает стадию диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии f).

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором проба материнской крови представляет собой цельную кровь.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клетки в пробе подвергают стадии фиксирования после стадии d).

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эндотелиальный клеточный маркер представляет собой CD105.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK8, CK18, CK19 или CK7.

12. Набор для выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, где указанный набор включает: а) i) гибридизационный зонд, включающий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или ii) лиганд, направленный на эпителиальный клеточный маркер; b) i) гибридизационный зонд, включающий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или ii) лиганд, направленный на эндотелиальный клеточный маркер; и с) инструкции по применению, где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии: a) получение пробы материнской крови или ее фракции; b) пермеабилизация клеток материнской крови; c) контактирование пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и d) отбор клеток, которые связываются с указанным зондом или лигандом эндотелиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками с эндотелиальным фенотипом; e) контактирование клеток, выбранных на стадии d), проявляющих эндотелиальный фенотип, с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер; f) обнаружение клеток с эндотелиальным фенотипом, которые также связываются с указанным зондом или лигандом указанного эпителиального клеточного маркера со стадии е), где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.

2. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии: a) получение пробы материнской крови или ее фракции; b) пермеабилизация клеток материнской крови; c) контактирование пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер; d) отбор клеток, которые связываются с указанным зондом или лигандом эпителиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками с эпителиальным фенотипом; e) контактирование клеток, выбранных на стадии d), проявляющих эпителиальный фенотип, с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и f) обнаружение клеток с эпителиальным фенотипом, которые также связываются с указанным зондом или лигандом указанного эндотелиального клеточного маркера со стадии е), где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.

3. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии: a) получение пробы материнской крови или ее фракции; b) пермеабилизация клеток материнской крови; c) контактирование пробы с: i) с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и ii) с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер; и d) отбор клеток, которые связываются с: i) указанным зондом или лигандом эндотелиального клеточного маркера и ii) указанным зондом или лигандом указанного эпителиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками, как с эндотелиальным, так и с эпителиальным фенотипом, где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором мишень эндотелиального маркера располагается на поверхности идентифицируемой клетки.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором мишень эпителиального маркера располагается внутри идентифицируемой клетки.

6. Способ по любому из пп.1-2, который дополнительно включает стадию диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии f).

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором проба материнской крови представляет собой цельную кровь.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клетки в пробе подвергают стадии фиксирования после стадии d).

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эндотелиальный клеточный маркер представляет собой CD105.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK8, CK18, CK19 или CK7.

12. Набор для выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, где указанный набор включает: а) i) гибридизационный зонд, включающий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или ii) лиганд, направленный на эпителиальный клеточный маркер; b) i) гибридизационный зонд, включающий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или ii) лиганд, направленный на эндотелиальный клеточный маркер; и с) инструкции по применению, где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.


Евразийское 027314 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201390638
(22) Дата подачи заявки
2011.11.09
(51) Int. Cl.
C12Q1/68 (2006.01) G01N 33/569 (2006.01) G01N 33/68 (2006.01)
(54) СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕТАЛЬНОЙ КЛЕТКИ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ И ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ И НАБОР ДЛЯ ИХ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
(31) PA 2010 01018
(32) 2010.11.09
(33) DK
(43) 2013.09.30
(86) PCT/DK2011/050423
(87) WO 2012/062325 2012.05.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
АРСЕДИ БАЙОТЕК АПС (DK)
(72) Изобретатель:
Эккельт Андреас, Кристенсен Бритта, Кельро Стен, Бринч Мари, Сингх Рипудаман, Хатт Лотте (DK)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A2-2010078872
VICOVAC L. ET AL.: "Epithelial-mesenchymal transition during trophoblast differentiation", ACTA ANATOMICA, vol. 156, no. 3, 1996, pages 202-216, XP009156130, ISSN: 0001-5180, abstract
HUIE M.A. ET AL.: "Antibodies to human fetal erythroid cells from a nonimmune phage antibody library", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC; US, vol. 98, no. 5, 27 February 2001 (2001-02-27), pages 2682-2687, XP002974719, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.051631798, abstract
MICROSATELLITE ANALYSIS PROVIDES EFFICIENT CONFIRMATION OF FETAL
TROPHOBLAST ISOLATION FROM MATERNAL
CIRCULATION: "MICROSATELLITE ANALYSIS PROVIDES EFFICIENT CONFIRMATION OF FETAL TROPHOBLAST ISOLATION FROM
MATERNAL CIRCULATION", PRENATAL DIAGNOSIS,
CHICHESTER, SUSSEX, GB, vol. 21, 1 January
2001 (2001-01-01), pages 566-570, XP008072425, ISSN:
0197-3851, DOI: 10.1002/PD.103, abstract
WO-A1-0179851
Yan Zhou ET AL.: "Human Cytotrophoblasts Adopt a Vascular Phenotype as They Differentiate", J.Clin.Invest., 1 January 1997 (1997-01-01), pages 2139-2151, XP055018236, DOI: 10.1172/JCI119387. Retrieved from the Internet: URL:http://www.jci.org/articles/view/119387/ files/pdf?disposition=attachment [retrieved on 2012-02-02],
MADDALENA SONCINI ET AL.: "Isolation and characterization of mesenchymal cells from human fetal
membranes", JOURNAL OF TISSUE ENGINEERING
AND REGENERATIVE MEDICINE, JOHN WILEY & SONS, US, vol. 1, 13 June 2007 (2007-06-13), pages 296-305, XP008137640, ISSN: 1932-6254, DOI: 10.1002/ TERM.40, page 297, left-hand column, lines 22-25
DELSOL G. ET AL.: "ANTIBODY BNH9
DETECTS RED BLOOD CELL-RELATED ANTIGENS ON ANAPLASTIC LARGE CELL CD30 POSITIVE
LYMPHOMAS", BRITISH JOURNAL OF CANCER, vol. 64, no. 2, 1991, pages 321-326, XP055018379, ISSN: 0007-0920, DOI: 10.1038/bjc.1991.299, abstract
DATABASE GEO [Online]. 19 April 2010 (2010-04-19), "Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array", XP002668741, retrieved from NCBI. Database accession no. GPL9987, abstract
KUNISAKI SHAUN M. ET AL.: "Fetal cartilage engineering from amniotic mesenchymal progenitor cells",
STEM CELLS AND DEVELOPMENT, ELSEVIER, NL,
vol. 15, no. 2, 1 April 2006 (2006-04-01), pages 245-253, XP008100090, ISSN: 1547-3287, DOI: 10.1089/ SCD.2006.15.245, abstract
DAVYDOVA D.A. ET AL.: "Culture of human amniotic fluid stem cells in 3D collagen matrix",
CELL AND TISSUE BIOLOGY, SP MAIK NAUKA/
INTERPERIODICA, DORDRECHT, vol. 5, no. 4, 22 August 2011 (2011-08-22), pages 339-345, XP019942742, ISSN: 1990-5203, DOI: 10.1134/S1990519X11040031, abstract
маркер, и f) обнаружение клеток с эндотелиальным фенотипом, которые также связываются с указанным зондом или лигандом эпителиального клеточного маркера со стадии е). Кроме того, представлен набор выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий: а) гибридизационный зонд и лиганд, направленный на эпителиальный клеточный маркер, b) гибридизационный зонд и лиганд, направленный на эндотелиальный клеточный маркер, и с) инструкции по применению.
Уровень техники
Анализ фетальных клеток для раннего обнаружения заболеваний и генетических аномалий эмбриона выполняется в случае неоднократных беременностей, в особенности, когда материнский возраст достаточно высок (35 лет или более) или когда в семье известны генетические заболевания. Фетальные клетки могут быть получены амниоцентезом, отбором амниотической жидкости из амниотической полости в пределах амниотической сумки или биопсией хориона, когда биопсийные пробы берутся из плаценты, т.е. так называемым инвазивным отбором пробы.
Для пренатального анеуплоидного скринирования используется традиционный хромосомный анализ или используются хромосомно-специфичные ДНК-зонды для выявления количественных показателей аберраций наиболее часто встречающихся аномальных хромосом, в частности хромосом 13, 18, 21, X и Y, у эмбриона.
Из-за инвазивности методов отбора проб, описанных выше, и риска аборта, было бы предпочтительно выполнять диагноз в отношении плода путем неинвазивной процедуры, такой как, например, путем анализа пробы материнской крови.
Во время беременности различные типы клеток фетального происхождения пересекают плаценту и циркулируют в пределах материнской периферической крови. Возможности использования фетальных клеток, циркулирующих в материнской крови, для диагностических целей препятствовал тот факт, что фетальные клетки присутствуют в материнской крови только в очень ограниченном количестве, и при этом было известно, что на одну фетальную клетку приходится от 105 до 108 материнских клеток, содержащих ядро, и что в одном миллилитре материнской крови находится от 1 до 10 фетальных клеток. Кроме того, большинство фетальных клеток нельзя отличить от материнских клеток на основе только одной морфологии, поэтому были исследованы альтернативные способы идентификации фетальных клеток.
Заявка US 2007/0015171 описывает неинвазивный способ выделения и обнаружения фетальной ДНК. Способ включает обогащение пробы материнской крови за счет применения антител, которые специфично связываются с материнскими клетками, и/или антител, которые специфично связываются с фе-тальными клетками. Авторы указанного изобретения предлагают применение некоторых конкретных антител, в частности, HLe-1 - антитело, которые распознает антигены, представленные на зрелых человеческих лейкоцитах и на очень незрелых предшественниках эритроцитов, но не на зрелых, содержащих ядро, эритроцитах. Таким образом, предлагается, что это антитело может быть использовано для распознавания материнских лейкоцитов, но не фетальных эритроцитов, содержащих ядро. Антитело против моноцита (М3) и антитело против лимфоцита (L4) также предлагаются для удаления материнских клеток из пробы. Наконец, авторы этого изобретения предлагают применение моноклонального антитела, которые распознает рецептор трансферрина (TfR) на фетальных клетках. ДНК из выделенных фетальных клеток впоследствии становится доступной для обнаружения и диагностики.
WO 2008/132753 описывает способ идентификации трофобласта путем обнаружения в клетках биологической пробы экспрессии маркера трофобласта, выбранного из группы, состоящей из аннексина IV, цитокератина 7, цитокератина 8 и цитокератина 19. Трофобласт указан как эпителиальная клетка, которая происходит из плаценты эмбриона или плода, относящегося к млекопитающим; трофобласт, как правило, связан со стенкой матки. Упомянуты три типа трофобластов: ворсинчатый цитотрофобласт, синци-тиальный трофобласт и вневорсинчатый трофобласт. Важно, что авторы этого изобретения используют моноклональные антитела против виментина для того, чтобы оценить степень контаминации трофобла-стов фибробластами, где трофобласты выделены из плаценты на первом триместре беременности. Таким образом, трофобласты, выделенные авторами указанного изобретения, не включают виментин.
Gussin и др., 2004, выдвинули гипотезу, что фетальные клетки в материнской крови, которые не отвечают на гематопоэтические условия культивирования, представляют собой эндотелиальные клетки. Они исследовали, могут ли эндотелиальные клетки-предшественники фетального происхождения быть выбраны из материнской крови на основе экспрессии ими CD133 или CD105, и могут ли они быть размножены в культуре. Эти авторы пришли к выводу, что CD133+ и CD105+ клетки, выделенные от материнской крови, могут быть размножены in vitro в условиях роста для эндотелиальных клеток. Однако эти клетки, скорее всего, являются материнскими, а не являются клетками фетального происхождения.
Таким образом, остается потребность в улучшенных способах выделения фетальных клеток из проб материнской крови, например, для того, чтобы облегчить пренатальное обнаружение и диагностику.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на идентификации антигенов, которые могут быть использованы для идентификации и/или обогащения фетальных клеток в пробе материнской крови. В частности, настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении факта, что фетальные клетки в пробе материнской крови проявляют как эндотелиальные, так и эпителиальные свойства. Авторы настоящего изобретения, за счет использования этого перехода свойств, предоставляют новый способ обогащения и идентификации фетальных клеток в пробе материнской крови и также раскрывают новые антигены с этой целью.
В первом, предпочтительном варианте выполнения изобретения проба материнской крови приводят в контакт с эндотелиальным клеточным маркером и, таким образом, клетки с эндотелиальным феноти
пом обогащаются при отборе клеток, специфичных в отношении указанного эндотелиального клеточного маркера. Такой способ выделения фетальной клетки из пробы материнской крови включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с ли-гандом, связывающимся с эндотелиальным клеточным маркером; и
c) обогащения клеток, специфичных для указанного эндотелиального клеточного маркера;
d) контактирования клеток, выбранных на стадии b), проявляющих эндотелиальный фенотип, с ги-бридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер
e) обнаружения клеток с эндотелиальным фенотипом со стадии с), которые также связываются с эпителиальным клеточным маркером;
f) необязательного диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии
d);
где стадии (Ъ)-(е) могут быть выполнены в любом порядке.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Мужская фетальная клетка, идентифицированная специфичными X и Y зондами. Стрелка указывает на фетальную клетку.
Фиг. 2. Частота присутствия фетальной клетки в миллилитре материнской крови.
Фиг. 3. Фетальная клетка, показывающая окрашивание цитокератина в кювете. Стрелка указывает на фетальную клетку.
Фиг. 4. Фетальная клетка, показывающая окрашивание цитокератина 7. Стрелка указывает на фе-тальную клетку.
Фиг. 5. Фетальная клетка, показывающая окрашивание виментина. Стрелка указывает на феталь-ную клетку.
Фиг. 6. Фетальная клетка, окрашенная цитокератиновым и FISH зондами для хромосомы 21 и хромосомы X. Стрелки указывают на три копии хромосомы 21 в фетальной клетке. Фоновые материнские клетки содержат две копии каждой хромосомы 21.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение основано на идентификации антигенов, которые могут быть использованы для идентификации и/или обогащения фетальных клеток пробы материнской крови. В частности, изобретение основано на неожиданном открытии, что фетальные клетки в пробе материнской крови проявляют как эндотелиальные, так и эпителиальные свойства. Настоящее изобретение впервые раскрывает, что фетальная клетка, представленная в пробе материнской крови, демонстрирует уникальный переход, который не делает ни одна из нормальных клеток в материнской крови. Клетки эмбриона, начиная со стадии ранней бластоцисты, дифференцируются в три слоя эмбриона, а именно эндодерму, мезодерму и эктодерму. Мезодерма представляет клетки мягких тканей, таких как мускулы, жир и кровеносные сосуды. Эктодерма и эндодерма представляют эпителиальные клетки, охватывающие внешние и внутренние поверхности. У мезодермальных и эктодермальных клеток имеются принципиальные различия в паттерне экспрессии маркеров.
Эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ) является процессом, в котором эпителиальные клетки теряют свои эпителиальные свойства и приобретают мезенхимально-подобный фенотип. ЕМТ был описан для раннего эмбриогенеза, когда переход и транзиентная дедиференциация эмбриональных эпителиальных клеток необходимы, например, для формирования нервной трубки.
ЕМТ был также описан в связи с раком, когда несколько онкогенных путей индуцируют ЕМТ. В последние годы ЕМТ был особенно изучен в связи с метастатическим процессом.
Настоящее изобретение касается технического решения, сделанного авторами настоящего изобретения, что фетальная клетка, представленная в материнской крови, подвергается ЕМТ, и настоящее изобретение, за счет реализации этого свойства, предоставляет новый способ выделения и идентификации фетальной клетки, находящейся в пробе материнской крови. При использовании мезодермального маркера (то есть эндотелиального маркера) в качестве положительный маркера селекции фетальной клетки, присутствующей в очень низком количестве в пробе материнской крови, фетальные клетки обогащаются вместе с некоторыми материнскими клетками. Затем выполняется положительная идентификация фе-тальных клеток путем контактирования остающихся клеток с эпителиальным маркером, используя, таким образом, явление ЕМТ. Ни одна из нормальных материнских клеток, находящихся в образце крови, не экспрессирует эпителиальных маркеров.
За счет использования этого перехода, авторы настоящего изобретения предоставляют новый способ обогащения и идентификации фетальных клеток в пробе материнской крови, а также раскрывают новые антигены для этой цели.
Таким образом, способы изобретения включают выделение клеток, экспрессирующих эндотелиаль-ные клеточные маркеры, с последующим обнаружением клеток, которые, помимо этого, экспрессируют
эпителиальные клеточные маркеры.
Идентифицированные антигены могут быть использованы для идентификации фетальных клеток в пробе материнской крови при обнаружении или при определении количества мРНК или белка (антигена), кодируемого мРНК. Условия обнаружения, раскрытые здесь, используются как при обнаружении, так и при количественном анализе. Однако в двух отдельных вариантах выполнения условия обнаружения используются или для обнаружения, или для количественного анализа. В целом, специалист способен различить, когда обнаружение также охватывает и количественный анализ, т.е. когда это относится к случаю количественного определения уровней мРНК или уровней белка, закодированного мРНК. Это может быть необходимо, например, для обнаружения данной мРНК, которая экспрессируется на низком уровне в материнских клетках (но не является отсутствующей), и когда эта же самая мРНК экспрессиру-ется в фетальных клетках, например, на уровне в 3 раза выше, чем в материнских клетках.
Когда применяются описанные здесь условия обогащения, то это охватывает отделение одной или более клеток от любой другой клетки, представленной в пробе. В одном варианте выполнения изобретения обогащенная клетка(и) не выделяются из пробы, и диагностирование выполняется на клетке(ах), все из которых присутствуют в пробе. В этом случае проба может быть представлена на предметном стекле, и диагностирование может быть выполнено с применением микроскопии, и клетки, в этом варианте выполнения, скорее являются обнаруживаемыми, а не выделяемыми.
Другое открытие, которое сделали авторы настоящего изобретения, состоит в том, что стадия фиксирования клеток материнской пробы значительно помогает идентификации и обогащению фетальных клеток из пробы. Эта стадия фиксирования может быть выполнена вместе со способами обогащения и/или идентификации фетальных клеток, описанных здесь, или может быть выполнена вместе со способами обогащения и/или идентификации фетальных клеток, которые были описаны в уровне техники (см., например, US 2007/0015171, как указано в разделе "уровень техники" настоящего изобретения).
Фиксирование клеток пробы материнской крови
В одном варианте выполнения изобретения используется открытие, что фиксирование клеток пробы материнской крови значительно увеличивает стабильность фетальных клеток в пробе материнской крови, при выполнении обогащения и идентификации фетальных клеток, например, так, как дополнительно описано здесь выше. В одном варианте выполнения изобретения процедура фиксирования может быть выполнена в отношении необогащенного образца крови немедленно после отбора пробы (т.е. как стадия способа, описанного в первом варианте выполнения), приводя, в итоге, к фиксированию компонентов клеток пробы материнской крови. В то же время фиксирование является настолько умеренным, что материнские эритроциты могут быть выборочно растворены на последующей стадии лизиса. В одном варианте выполнения изобретения фиксирование может быть выполнено в любое соответствующее время, между стадиями (a)-(d) способа, как описано для первого варианта выполнения. В одном варианте выполнения изобретения фиксирование выполняется после стадии (а) способа, как описано в первом варианте выполнения. В другом варианте выполнения фиксирование выполняется после стадии (b) способа, описанного в первом варианте выполнения. В другом варианте выполнения фиксирование выполняется после стадии (с) способа, описанного в первом варианте выполнения. В еще одном варианте выполнения фиксирование выполняется после стадии (d) способа, описанного в первом варианте выполнения.
В предпочтительном варианте выполнения способ по первому варианту выполнения изобретения, как описано в разделе "сущность изобретения", включает следующие стадии:
a) получение пробы материнской крови или ее фракции;
b) фиксирования клеток указанной пробы материнской крови;
c) контактирования пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с ли-гандом, связывающимся с эндотелиальным клеточным маркером; и
d) обогащения клеток, специфичных для указанного эндотелиального клеточного маркера.
e) контактирования клеток, выбранных на стадии b), проявляющих эндотелиальный фенотип, с гиб-ридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, связывающимся с эпителиальным клеточным маркером;
f) обнаружения клеток с эндотелиальным фенотипом со стадии с), которые также связываются с эпителиальным клеточным маркером;
g) необязательного диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии
d);
где стадии (с)-(е) могут быть выполнены в любом порядке.
Таким образом, один вариант выполнения изобретения предоставляет способ, включающий стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с раствором для фиксирования.
Предпочтительно пробу материнской крови приводят в контакт с раствором для фиксирования сразу после того, как была получена проба. Термин "сразу" или "немедленно", как используется в контексте настоящего описания, означает, что проба не подвергается никаким манипуляциям до того, как ее приво
дят в контакт с раствором для фиксирования.
Предпочтительно пробу приводят в контакт с раствором для фиксирования не позднее 24 ч после получения пробы. Более предпочтительно пробу приводят в контакт с раствором для фиксирования не позднее 12 ч, например, через 8, 4, 2, 1 ч, 30, 15 мин после получения пробы. Наиболее предпочтительно пробу приводят в контакт с раствором для фиксирования не позднее 1 ч от момента получения пробы.
В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения раствор для фиксирования прибавляют к цельной крови и предпочтительно до необязательной стадии осаждения, такой как, например, осаждение под силой тяжести или осаждение центрифугированием.
Фиксирование предпочтительно выполняется между 1 и 60 мин. Более предпочтительно фиксирование выполняется между 5 и 30 мин и наиболее предпочтительно фиксирование выполняется между 5 и 15 мин, например на 10 мин.
Раствор для фиксирования предпочтительно включает параформальдегид от 7,5 до 2,5%, более предпочтительно от 3 до 6% и наиболее предпочтительно от 4 до 5%.
Раствор для фиксирования, в дополнение к параформальдегиду, предпочтительно включает соль в концентрации от 0,05 до 0,3М. Более предпочтительно концентрация составляет от 0,1 до 0,2М и наиболее предпочтительная концентрация составляет от 0,125 до 0,175М. Соль предпочтительно представляет собой LiCl, KCl, NaCl или PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), при этом наиболее предпочтительным является PBS.
Когда используются вышеуказанные концентрации раствора для фиксирования, то предпочтительно, когда к пробе материнской крови для фиксирования добавляется от 0,2 до 10 объемов раствора для фиксирования, более предпочтительно от 0,5 до 5 объемов и наиболее предпочтительно, когда добавляется от 1 до 3 объемов. Как правило, раствор для фиксирования добавляется в соотношении объемов 2/3. В еще одном варианте выполнения изобретения является предпочтительным, когда раствор для фиксирования добавляется в соотношении объемов, равном от 1/3 до 3/3, например, в соотношении объемов
2/3.
Специалисту ясно, что могут быть использованы различные концентрации раствора для фиксирования и степени разбавления, например, так, чтобы получить желаемые конечные концентрации после добавления раствора для фиксирования к пробе материнской крови. Предпочтительно конечная концентрация параформальдегида составляет от 2 до 6%, более предпочтительно от 3 до 5% и наиболее предпочтительно от 3,5 до 4,5%. Типичная конечная концентрация составляет 4%.
Предпочтительно после стадии фиксирования выполняется стадия лизиса, которая включает: c) контактирование фиксированной пробы со стадии (а) с буфером для лизиса.
Буфер для лизиса, как правило, включает неионный детергент, предпочтительно Triton X-100. Предпочтительные концентрации детергента составляют от 0,01 до 0,5%, более предпочтительно от 0,05 до 0,3% и наиболее предпочтительно 0,1% (мас./мас.).
В предпочтительном варианте выполнения изобретения стадия лизиса выполняется немедленно после стадии фиксирования. В частности, фиксирование и лизис выполняются после стадии (а) и перед стадией (b) способа, описанного в первом варианте выполнения. То есть раствор для лизиса добавляется непосредственно к пробе, например, через 10 мин после фиксирования. Лизис, как правило, выполняется в течение от 15 до 120 мин, более предпочтительно от 30 до 60 мин и наиболее предпочтительно от 40 до 45 мин.
Как указывалось выше, стадия лизиса неожиданно обеспечивает селективный лизис материнских эритроцитов.
Другой вариант выполнения изобретения состоит в применение буфера для лизиса для селективного лизиса материнских эритроцитов в пробе материнской крови или ее фракции, как описано здесь выше. В предпочтительном варианте выполнения буфер для лизиса предназначен для применения в способе настоящего изобретения, и буфер для лизиса может быть добавлен к пробе материнской крови или ее фракции после стадии (а) способа, описанного в первом варианте выполнения.
Контактирование пробы материнской крови с лигандом или зондом
Один вариант выполнения настоящего изобретения предоставляет способ отбора фетальной клетки в пробе материнской крови, где указанный способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с:
i) гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или
ii) лигандом, направленным на эндотелиальный маркер клетки;
c) отбора клеток, которые связываются с гибридизационным зондом или с лигандом на предыдущей стадии, обогащая таким образом пробу клетками, которые связываются с зондом гибридизации или с лигандом на предыдущей стадии;
d) контактирования (обогащенной) пробы со стадии (с) с:
i) зондом гибридизации, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или
ii) лигандом, связывающимся с эпителиальный клеточным маркером.
Предпочтительно способ дополнительно включает стадию идентификации фетальных клеток пробы. Ясно, что идентификация предпочтительно включает обнаружение наличия лиганда, направленного на эпителиальный клеточный маркер на или в фетальной клетке, или обнаружение наличия гибридиза-ционного зонда, включающего по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер на или в фетальной клетке.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения проба материнской крови связывается с ли-гандом или гибридизационным зондом, связывающим эндотелиальный клеточный маркер или ген, кодирующий указанный маркер, и клетки с эндотелиальным фенотипом, таким образом, обогащаются за счет отбора клеток, специфичных в отношение указанного эндотелиального клеточного маркера. Такой способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с ли-гандом, направленным на эндотелиальный маркер клетки; и
c) отбора клеток, специфичных для указанного эндотелиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками с эндотелиальным фенотипом;
d) контактирования клеток, отобранных на стадии (с), проявляющих эндотелиальный фенотип, с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, связывающимся с эпителиальным клеточным маркером;
e) обнаружения клеток с эндотелиальным фенотипом, которые также связываются с эпителиальным клеточным маркером на стадии (d);
f) необязательного диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии
(е);
где стадии (Ъ)-(е) могут быть выполнены в любом порядке.
Квалифицированный специалист понимает, что в одном варианте выполнения изобретения стадии (b), (с), (d), (е) и (f), описанные выше, могут быть выполнены в любом порядке, предпочтительно в порядке, описанном выше, или в порядке (b), (d), (с), (е) и (f), а более предпочтительно в порядке, описанном выше. Таким образом, в одном варианте выполнения изобретения проба связывается с гибридизаци-онным зондом или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер, с последующим контактированием той же самой пробы с гибридизационным зондом или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер до выполнения стадии отбора.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящий из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 и CDH3. Эндотелиальный маркер настоящего изобретения представляет собой маркер, который экспрессируется прежде всего в или на эндотелиальных клетках. В частности, указанный эндотелиальный маркер не экспрессируется в или на каком-либо другом типе клеток. Наиболее предпочтительным является CD105 (SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2).
В предпочтительном варианте выполнения эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящий из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 и CK19. Эпителиальный маркер настоящего изобретения представляет собой маркер, который экспрессируется прежде всего в или на эпителиальных клетках. В частности, указанный эпителиальный маркер не экспрессируется в или на каком-либо другом типе клеток.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения способ дополнительно включает контактирование пробы с антителом М30 (или с другим лигандом, направленным на апоптотический CK18). В предпочтительном варианте выполнения изобретения эпителиальный маркер выбран из группы, состоящий из: CK4, CK5, ОС6А, ОС6В, CK7, CK8, CK10, CK13 и CK18. Наиболее предпочтительным является CK18 (SEQ ID No: 12 и SEQ ID No: 13).
Антигены для применения в настоящем изобретении и кодирующие гены приведены в табл. 1.
Таблица 1
Название доступа в NCBI
Краткое обозначение
Номер доступа
Эндотелии человека
CD105
AF035753
Виментин человека
Vim
NM_003380
Цитокератин 1 человека
KRT1
Х69725
Цитокератин 2 человека
KRT2
NM_000423
Цитокератин 3 человека
KRT3
NM_057088
Цитокератин 4 человека
KRT4
NM_002272
Цитокератин 5 человека
KRT5
NM_000424
Цитокератин б человека
KRT6
NM_08 0 74 7
Цитокератин 7 человека
KRT7
NM 005556
Цитокератин 8 человека
KRT8
NM_002273
Цитокератин 10 человека
KRT10
NM_000421
Цитокератин 13 человека
KRT13
NM 153490
Цитокератин 14 человека
KRT14
NM_000526
Цитокератин 15 человека
KRT15
NM 002275
Цитокератин 16 человека
KRT16
NM_005557
Цитокератин 17 человека
KRT17
NM 000422
Цитокератин 18 человека
KRT18
NM_199187
Цитокератин 19 человека
KRT19
NM 002276
Молекула адгезии сосудистого эндотелия
VCAM
P19320
Молекула 1 межклеточной адгезии
ICAM
NP 000192
Молекула CD9
CD9
NP_001760
Рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (Fit-1)
VEGFR-1
P17948
Рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста
VEGFR-2
P35968
Рецептор 3 сосудистого эндотелиального фактора роста
VEGFR-3
P35916
Альфа интегрин V
ITGA5
AAI36443
Бета интегрин V
ITGB5
ABY87537
Кадгерин 11
CDH11
EAW8 3 0 02
Кадгерин 3
CDH3
P22223
Карбоксипептидаза М
СРМ
AAH22276
/Антиген активации лимфоидных клеток
CD39
AAB32152
Ингибитор 1 активатора плазминогена
PAI-1
P05121
Молекула CD2 0 0
CD200
AAH31103
Рецептор ЕРН В4
ЕРНВ4
EAL23820
Рецептор эндотелиального белка С
EPCR
AAH14451
Протеиназный активированный рецептор 1
PAR-1
P25116
Антигены для применения на стадии (b) способа, описанного в первом варианте выполнения, и кодирующие гены предпочтительно выбираются из числа представленных в табл. 2. Таким образом, эндо-телиальный клеточный маркер для стадии (b) способа по первому варианту выполнения изобретения, описанного в разделе "Сущность изобретения", предпочтительно выбирается из числа маркеров, кодируемых генами, представленными в табл. 2.
Таблица 2
Название доступа в NCBI
Краткое обозначение
Номер доступа
Эндотелии человека
CD105
AF035753
Виментин человека
Vim
NM 003380
Молекула адгезии сосудистого эндотелия
VCAM
P19320
Молекула 1 межклеточной адгезии
ICAM
NP_000192
Рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (Fit-1)
VEGFR-1
P17948
Рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста
VEGFR-2
P35968
Рецептор 3 сосудистого эндотелиального фактора роста
VEGFR-3
P35916
Ингибитор 1 активатора плазминогена
PAI-1
P05121
Рецептор эндотелиального белка С
EPCR
AAH14451
Антигены для применения на стадии (d) способа, описанного в первом варианте выполнения, и кодирующие гены предпочтительно выбираются из числа представленных в табл. 3. Таким образом, эпителиальный клеточный маркер для стадии (d) способа по первому варианту выполнения изобретения, описанного в разделе "Сущность изобретения", предпочтительно выбирается из числа маркеров, кодируемых генами, представленными в табл. 3.
Таблица 3
Название доступа в NCBI
Краткое обозначение
Номер доступа
Цитокератин 1 человека
KRT1
Х69725
Цитокератин 2 человека
KRT2
NM_000423
Цитокератин 3 человека
KRT3
NM_057 08 8
Цитокератин 4 человека
KRT4
NM 002272
Цитокератин 5 человека
KRT5
NM 000424
Цитокератин б человека
KRT6
NM 080747
Цитокератин 7 человека
KRT7
NM_005556
Цитокератин 8 человека
KRT8
NM_002273
Цитокератин 10 человека
KRT10
NM_000421
Цитокератин 13 человека
KRT13
NM_153490
Цитокератин 14 человека
KRT14
NM_0 0 0 52 6
Цитокератин 15 человека
KRT15
NM_002275
Цитокератин. 16 человека
KRT16
NM_005557
Цитокератин 17 человека
KRT17
NM_000422
Цитокератин. 18 человека
KRT18
NM_19 9187
Цитокератин 19 человека
KRT19
NM__002276
Следует заметить, что гибридизационный зонд для стадий (b) и (d) способа, описанного в первом варианте выполнения (см. раздел "Сущность изобретения"), может быть комплементарным к кодирующей цепи или к некодирующей цепи гена. Предпочтительно, когда зонд комплементарен к кодирующей цепи (к нематричной цепи). В связанном варианте выполнения изобретения зонд направлен на мРНК. Если зонд направлен на мРНК, то он может быть направлен на области сплайсинга, что означает, что последовательности в ДНК могут быть разделены.
Термин "фракции" используется для указания, что проба материнской крови может непосредственно контактировать с лигандом или с гибридизационным зондом, или что проба материнской крови может быть подвергнута предварительной обработке, так, чтобы включать только фракцию первоначальной пробы материнской крови, которая будут связываться с лигандом или с гибридизационным зондом. Проба материнской крови может быть подвергнута, например, концентрированию клеток, которые присутствуют в ней, а также до контактирования пробы с лигандом или с гибридизационным зондом может быть выполнена стадия коагуляции или стадии обогащения.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с:
i) гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему виментин человека; и/или
ii) лигандом, направленным на виментин человека.
В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с:
i) гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему цитокератин 7 человека; и/или
ii) лигандом, направленным на цитокератин 7 человека.
В более предпочтительном варианте выполнения изобретения способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с:
i) гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему CD105, и/или
ii) лигандом, направленным на CD105 (SEQ ID No: 1 или SEQ ID No: 2); и
c) контактирования пробы с:
i) гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему цитокератин 7 (SEQ ID No: 7); и/или
ii) лигандом, направленным на цитокератин 7 человека, которое выполняется после контактирования пробы материнской крови с эндотелиальным маркером, который в предпочтительном варианте выполнения изобретения представляет собой CD105.
В еще одном предпочтительном варианте выполнения изобретения способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с:
i) кроссреактивным зондом гибридизации, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеоти-дов, комплементарных генам из группы, состоящей из гена кодирующего цитокератин 1-6, 8, 10 и 13-19 человека; и/или
ii) кроссреактивным лигандом, направленным на цитокератины 1-6, 8, 10 и 13-19 человека.
В этом варианте выполнения изобретения лиганд может связываться с множеством цитокератинов, то есть с цитокератинами 1-6, 8, 10 и 13-19. Эта кроссреактивная способность может быть достигнута за счет направленности лиганда на консервативные (идентичные) области цитокератина. Аналогично, крос-среактивные зонды гибридизации могут быть сконструированы так, чтобы направить зонд на консервативные (идентичные) области генов, кодирующих указанные цитокератины.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения; способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с:
i) гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему CD105; и/или
ii) лигандом, направленным на CD105; и
c) контактирования пробы с:
i) кроссреактивным гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нук-леотидов, комплементарных генам из группы, состоящей из гена, кодирующего цитокератин 1-6, 8, 10 и 13-19 человека; и/или
ii) кроссреактивным лигандом, направленным на цитокератины человека 1-6, 8, 10 и 13-19.
Еще в другом варианте выполнения изобретения смесь гибридизационных зондов или лигандов (один для каждого антигена или гена) используется как альтернатива кроссреактивному зонду гибридизации или кроссреактивному лиганду.
В одном таком варианте выполнения изобретения способ включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) контактирования пробы с:
i) зондом гибридизации, включающим по меньшей мере 10 нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему CD105; и/или
ii) лигандом, направленным на CD105, и
c) контактирования пробы с:
i) смесью из зондов гибридизации, включающей зонды гибридизации, включающих по меньшей
мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных генам группы, состоящей из гена, кодирующего цито-
кератины 1-6, 8, 10 и 13-19 человека, зонда гибридизации, включающего по меньшей мере 10 смежных
нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему цитокератин 7 человека, и зонда гибридизации,
включающего по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему вимен-
тин человека; и/или
ii) смесью лигандов, включающих кроссреактивный лиганд, направленный на цитокератины 1-6, 8,
10 и 13-19 человека, лиганд, направленный на цитокератин 7 человека, и лиганд, направленный на ви-ментин человека.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения клетки, взаимодействующие с эндотели-альным маркером (т.е. CD105), и эпителиальным маркером (т.е. цитокератин 7) впоследствии идентифицируются и выбираются для дальнейшего анализа.
В предпочтительном варианта выполнения изобретения на стадии (b) способа предпочтительно используется гибридизационный зонд, как описано здесь ниже, и на стадии (d) способа используется ли-ганд, как описано здесь ниже.
Отбор цельной крови
В одном варианте выполнения изобретения проба материнской крови на стадии (а) способа, описанного в первом варианте выполнения, является цельной кровью, т.е. кровь не подвергается каким-либо фракционированиям до того, как она подвергается контактированию с лигандом, направленному на эн-дотелиальный клеточный маркер, или с гибридизационным зондом, направленным на ген, кодирующий эндотелиальный клеточный маркер.
Фиксирование и селективный лизис
В предпочтительном варианте выполнения изобретения клетки пробы материнской крови фиксируются, как описано в одном варианте выполнения изобретения. Количество материнских клеток в значительной степени превышает количество фетальных клеток, представленных в пробе материнской крови, и поэтому может быть полезным включение стадии обогащения, за счет которой материнские клетки удаляются из пробы, которая будет далее анализироваться. Стадия обогащения может быть выполнена в любой соответствующей точке времени в ходе процедуры, при этом наиболее подходящей является стадия обогащения, которая выполняется после стадии (а) способа, описанного в первом варианте выполнения. Чтобы не удалить какие-либо фетальные клетки, предпочтительно, когда на стадии обогащения не проводится различия между различными типами фетальных клеток, содержащих ядро. Наибольшая фракция материнских клеток в образце крови состоит из эритроцитов. Известны несколько способов удаления эритроцитов, и самым удобным является лизис эритроцитов, который может быть достигнут за счет лизиса при помощи NH4Cl. Таким образом, в предпочтительном варианте выполнения изобретения материнские эритроциты селективно лизируются после фиксирования. Соответственно, способ идентификации фетальной клетки в пробе материнской крови включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) обогащения фетальных клеток путем лизиса эритроцитов указанной пробы материнской крови;
c) фиксирования оставшихся клеток;
d) контактирования пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с ли-гандом, связывающимся с эндотелиальным клеточным маркером; и
e) обогащения клеток, специфичных в отношении указанного эндотелиального клеточного маркера;
f) контактирования клеток, собранных на стадии (b), проявляющих эндотелиальный фенотип, с гиб-ридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, связывающимся с эпителиальным клеточным маркером;
g) обнаружения клеток с эндотелиальным фенотипом со стадии (с), которые также связываются с эпителиальным клеточным маркером;
h) необязательного диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии
(d);
где стадии (Ъ)-(е) могут быть выполнены в любом порядке, предпочтительно в порядке, указанном выше.
Пермеабилизация
В еще одном варианте выполнения изобретения клетки пробы материнской крови подвергаются стадии пермеабилизации (изменение проницаемости клеточной мембраны) до того, как они подвергаются контактированию с лигандами или с зондами гибридизации, как описано выше. То есть стадия пер-меабилизации выполняется перед стадией (b) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения. Эта стадия предпочтительно включает контактирование пробы с метанолом, ацетоном или сапонином. Предпочтительно пермеабилизирующий агент представляет собой метанол. Соответственно способ идентификации фетальной клетки в пробе материнской крови включает стадии:
a) получения пробы материнской крови или ее фракции;
b) пермеабилизации клеток указанной пробы материнской крови;
c) контактирования пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с ли-гандом, связывающимся с эндотелиальным клеточным маркером; и
d) обогащения клеток, специфичных для указанного эндотелиального клеточного маркера;
e) контактирования клеток, собранными на стадии (b), проявляющих эндотелиальный фенотип, с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных
a)
гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, связывающимся с эпителиальным клеточным маркером;
f) обнаружения клеток с эндотелиальным фенотипом со стадии (c), которые также связываются с эпителиальным клеточным маркером;
g) необязательного диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии
(d);
где стадии (Ъ)-(е) могут быть выполнены в любом порядке. Положительный отбор
Антигензависимое обогащение предпочтительно включает контактирование пробы материнской крови с антителами, направленными на CD105, как описано в разделе "Примеры" и в одном варианте выполнения изобретения. То есть в одном варианте выполнения изобретения стадия (b) способа, описанного в первом варианте выполнения, является антигензависимой стадией.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения проба материнской крови фиксируется, ли-зируется и обогащается с использованием антител, направленных на CD105, до того, как выполняется контактирование с лигандами или с гибридизационными зондами, направленными на эпителиальные клетки (т.е. до стадии (d) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения).
Эффективность
Предпочтительный вариант выполнения настоящего изобретения делает фетальную идентификацию клетки коммерчески выгодной, поскольку он существенно снижает количество индивидуальных клеток, которое должно быть проанализировано для идентификации фетальных клеток. Настоящее изобретение сокращает количество клеток в пробе в 10-20 раз, так что они могут быть проанализированы посредством автоматизированного сканирования приблизительно 20-30 предметных стекол. Таким образом, изобретение предоставляет не только специфические антигены фетальных клеток для применения их при идентификации фетальных клеток. Изобретение также предоставляет способы обогащения, которые существенно снижают количество клеток, которые должны быть проанализированы для идентификации фетальных клеток. Способы обеспечивают адекватную идентификацию от 0,1 до 1,1 фетальных клеток в миллилитре пробы материнской крови, и требуют для анализа общего количества 106-107 клеток только 20-30 предметных стекол.
Область предметных стекол, которые покрыты клетками, имеет размер, как правило, 15x15 мм, что дополнительно подчеркивает эффективность способа.
Гибридизационнык зонды
Гибридизационные зонды, используемые на стадии (b) и (d) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения в разделе "Сущность изобретения", используются, как принято в целом в уровне техники, и являются, как правило, ДНК или РНК, предпочтительно ДНК. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения зонды являются модифицированными неприродными нуклеотидами, которые улучшают аффинность связывания и/или специфичность связывания. Предпочтительные примеры таких неприродных нуклеотидов представляют собой LNA (запертые нуклеиновые кислоты), TINA (скрученные интеркалирующие нуклеиновые кислоты), PNA (пептидная нуклеиновая кислота), INA (ин-теркалирующие нуклеиновые кислоты), морфолино- и 2'Э-замещенные мономерные РНК, такие как 2'О-метилированные мономерные РНК и 2'О-(2-метоксиэтилированные) РНК.
Длина зондов может быть любой приемлемой длиной, например, в диапазоне от 10 до 200 нуклео-тидов, предпочтительно от 10 до 30 нуклеотидов, более предпочтительно от 15 до 25 нуклеотидов, и предпочтительно, когда зонд полностью комплементарен гену, кодирующему человеческий цитокератин
1, 2, 3, 4 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No: 4), 6A (SEQ ID No: 5), 6B (SEQ ID No: 6), 7 (SEQ ID No: 7), 8
(SEQ ID No: 8), 10 (SEQ ID No: 9), 13 (SEQ ID No: 10 и SEQ ID No: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID No: 12 и SEQ ID No: 13) и 19, CD105 (SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2), и/или человеческий виментин, по всей длине зонда.
В одном варианте выполнения изобретения зонд по меньшей мере на 85% комплементарен по отношению к гену, кодирующему любой из белков, описанных в табл. 1-3, предпочтительно в табл. 2, например, зонд может быть комплементарен по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95%, по всей длине зонда. Зонд может быть комплементарным к ДНК или к мРНК, кодирующей указанный белок. В одном варианте выполнения изобретения зонд по меньшей мере на 85% комплементарен гену, кодирующему человеческий цитокератин 1, 2, 3, 4 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No: 4), 6A (SEQ ID No: 5), 6B (SEQ ID No: 6), 7 (SEQ ID No: 7), 8 (SEQ ID No: 8), 10 (SEQ ID No: 9), 13 (SEQ ID No: 10 и SEQ ID No: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID No: 12 и SEQ ID No: 13) и 19, CD105 (SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2), и/или человеческий виментин, например, зонд может быть комплементарен по меньшей мере на 90%, в частности, по меньшей мере на 95%, по всей длине зонда. Зонд может быть комплементарным к ДНК, или мРНК, кодирующий указанный белок.
В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения зонд полностью комплементарен гену, кодирующему CD105 (SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2), по всей длине зонда. В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения зонд полностью комплементарен гену, кодирующему CK18 (SEQ ID No: 12 и SEQ ID No: 13), по всей длине зонда.
В одном варианте выполнения изобретения гибридизационные зонды, используемые на стадии (b) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения в разделе "Сущность изобретения", могут быть выбраны из гибридизационных зондов, гибридизующихся с нуклеотидом, кодирующим белок, выбранный из группы, состоящей из CD105, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1 и EPCR.
Наиболее предпочтительным является CD105 (SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2).
В одном варианте выполнения изобретения гибридизационные зонды, используемые на стадии (d) способа, описанного в первом варианте выполнения, могут быть выбраны из гибридизационных зондов гибидизации, гибридизующихся с нуклеотидом, кодирующим белок, выбранный из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 и CK19.
Наиболее предпочтительным является CK18 (SEQ ID No: 12 и SEQ ID No: 13).
Репортерные красители
Зонды гибридизации и лиганды, используемые на стадии (b) и (d) способа по изобретению, по первому варианту выполнения изобретения, описанного в разделе "Сущность изобретения", могут включать или предпочтительно могут быть связаны с репортерным красителем (также называемым здесь "метка"). Указанные гибридизационные зонды или лиганд предпочтительно соединены ковалентной связью с ре-портерным красителем. Репортерный краситель предпочтительно представляет собой флуоресцентный репортерный краситель. Репортерный краситель предпочтительно выбирается из группы, состоящий из FAM(tm), ТЕТ(tm), JOE(tm), VIC(tm), SYBR(r) зеленого, 6 FAM, HEX, ТЕТ, TAMRA, JOE, ROX, флуоресцеина, Су3, Су5, Су5.5, техаса красного, родамина, родамина зеленого, родамина красного, 6-карбоксиродамина 6G, Alexa Fluor, орегонский зеленый 488, орегонский зеленый 500 и орегонский зеленый 514.
В одном варианте выполнения изобретения гибридизационные зонды также включают гасящий краситель (гаситель). В предпочтительном варианте выполнения гаситель выбирается из группы, состоящий из TAMRA(tm), Black Hole Quencher(tm), DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, DDQ I, DDQ II и Eclipse Dark Quencher.
Применение репортерного красителя и гасителя является желательным, поскольку это позволяет, в дополнение к идентификации, выполнять различные виды количественных анализов.
Как правило, репортерный краситель и гаситель располагаются в гибридизационном зонде вблизи друг друга, позволяя, за счет гасителя, подавлять флюоресценцию, излучаемую репортерным красителем, которая индуцирована светом или лазером. Когда олигонуклеотид связывается с комплементарной матричной цепью, репортерный краситель и гаситель отделяются друг от друга таким образом, что гаситель не подавляет сигнал от репортерного красителя, обеспечивая тем самым обнаружение факта гибридизации.
Таким образом, в одном варианте выполнения изобретения гибридизационный зонд способен к формированию структуры стебель-петля, где гаситель и репортерный краситель находятся в непосредственной близости друг к другу в стебле. В одном варианте выполнения изобретения олигонуклеотид представляет собой так называемый "молекулярный маяк". Гаситель и репортерный краситель перестают находиться в непосредственной близости друг к другу, когда основания молекулярного маяка связываются с матричной цепью. Поэтому сигнал репортерного красителя, индуцированный лазером, в этом случае не подавляется.
Вместо применения репортерного красителя и гасителя может быть использована так называемая пара FRET (флуоресцентного резонансного переноса энергии), включающая донорный флуорофор и акцепторный флуорофор. Когда донорный флуорофор возбуждается внешним источником света, он испускает свет с длиной волны, возбуждающей акцепторный флуорофор, который, в свою очередь, испускает свет с другой длиной волны, и этот свет может быть обнаружен и измерен. Энергия переносится от донора к акцептору только когда донорный флуорофор и акцепторный флуорофор находятся в непосредственной близости.
Предпочтительные пары FRET включают BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP^3, GFP-mOrange, YFP-RFP, FAM-ROX, FAM-Cy5, FAM-Hex, FAM-TAMRA и Су3-Су5.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения гибридизационные зонды и лиганды, которые используются на стадии (b) способа, описанного в первом варианте выполнения, предпочтительно связаны с репортерным красителем, где указанный репортерный краситель отличается от репортерного красителя, связанного с гибридизационными зондами и лигандами, которые используются на стадии (d) этого способа.
Лиганды
Лиганд, который используется на стадии (b) и (d) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения, является предпочтительно антителом, пептидом или аптамером. Лиганд, используемый в способе изобретения, связывается прежде всего с интересующей клеткой(ами), предпочтительно с более высокой аффинностью, чем он связывается с другими клетками. Таким образом, предпочтительно, когда лиганд связывается прежде всего с указанным эндотелиальным клеточным маркером или с указанным эпителиальным клеточным маркером.
Лиганд может быть аптамером. Аптамеры представляют собой лиганды высокой аффинности на основе нуклеиновой кислоты, которые связывают с антигенами, такими как белки. Они, как правило, применяются in vitro в качестве идентификаторов в эволюционных методиках, например, SELEX (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением). В SELEX возобновляемые раунды отбора и амплификации нуклеиновых кислот из исходной библиотеки используются для идентификации аптамеров, имеющих высокую аффинность. Поскольку исходная библиотека является очень большой (например, она может содержать 1014 различных последовательностей), и последовательности могут быть видоизменены во время возобновляемых раундов, идентификация аптамеров, имеющих высокую аффинность, может быть выполнена на обычной основе, и такие методики являются известными для специалистов. Предпочтительные аптамеры имеют размер менее 50 нуклеотидов.
Пептиды, имеющие высокую аффинность, могут быть получены с применением метода фагового дисплея. В методе фагового дисплея, библиотека фагов, представляющих пептиды, выбирается против целевого соединения, и затем эволюционно амплифицируется, аналогично процессу SELEX. Существуют различные системы фагового дисплея, и размер пептида может быть выбран так, чтобы удовлетворить конкретные потребности. В одном варианте выполнения изобретения пептиды, которые используются в способе по изобретению, имеют размер менее 50 нуклеотидов.
Часто библиотека представляется в каркасе, например, в каркасе из антител. Таким образом, фаговый дисплей может быть использован для идентифицирования антител, имеющих высокую аффинность. Другие эволюционные методики in vitro, предназначенные для генерирования антител, включают мРНК-дисплей, рибосомный дисплей и ковалентный ДНК-дисплей.
Лиганд также может быть антителом. Антитело, согласно изобретению, представляет собой полипептид или белок, способный к распознанию и связыванию антигена, включающего по меньшей мере один антиген-связывающий сайт. Указанный антиген-связывающий сайт предпочтительно включает по меньшей мере одну CDR. Антитело может быть природного происхождения, фрагментом природного антитела, или синтетическим антителом.
Термин "природное антитело" относится к гетеротетрамерным гликопротеинам, способным к распознанию и связыванию антигена, и они включают две идентичные тяжелые (Н) цепи и две идентичные легкие (L) цепи, связанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (обозначаемая здесь как VH) и константную область тяжелой цепи (обозначаемая здесь как СН). Каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи (обозначаемая здесь как VL) и константную область легкой цепи (обозначаемая здесь как CL). VH и VL области могут быть дополнительно разделены на области с гипервариабельностью, обозначаемые как область, определяющая комплементарность (CDR), которая содержит чередующиеся встроенные области, которые являются более консервативными, и эти консервативные области называются каркасными областями (FR). Антитела могут включать несколько идентичных гетеротетрамеров.
Антитела также могут быть получены путем иммунизации с применением соответствующих животных, таких как мыши, крысы, козы, кролики, лошади и т.п.
Антитела, используемые для целей настоящего изобретения, могут быть моноклональными или по-ликлональными. Способы получения этих типов антител известны квалифицированном специалистам. В дополнение к эволюционным способам in vitro, указанным выше, моноклональные антитела, как правило, получают с применением технологии гибридом.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения лиганд представляет собой антитело или аптамер, который распознает и связывает антиген, который выбирается из группы, состоящей из: CK1, CK2, CK3; CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18, CK19, CD105, ви-ментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1, EPCR, CD9, ITGA5, ITGB5, CDH11, CDH3, СРМ, CD39, CD200, ЕРНВ4 и PAR-1.
В предпочтительном варианте выполнения лиганд, применяемый на стадии (b) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения в разделе "Сущность изобретения", выбирается из группы состоящий из: CD105, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1 и EPCR.
Наиболее предпочтительным лигандом является CD105 (SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2).
В предпочтительном варианте выполнения лиганд, применяемый на стадии (d) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения в разделе "Сущность изобретения", выбирается из состоящий из группы: CK1; CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8; CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17; CK18 и CK19.
Наиболее предпочтительным лигандом является CK18 (SEQ ID No: 12 и SEQ ID No: 13). Специфичность лигандов
Предпочтительно, когда лиганды, применяемые на стадиях (b) и (d) способа, описанного в первом варианте выполнения, специфично связываются с фетальными клетками. Когда указывается термин "специфичность", то это подразумевает, что лиганды имеют более высокую аффинность связывания в отношении фетальных клеток, по сравнению с материнскими клетками. Аффинность связывания может быть выражена через константу диссоциации (kd), а специфичность - как отношение между значением kd для данного лиганда в отношении материнских клеток, и значением kd для этого лиганда в отношении
фетальных клеток. Т.е. лиганд может иметь значение kd, равное 10-5М, для материнских клеток, и 10-9М -для фетальных клеток. В этом случае, специфичность составляет 10000. Однако поскольку и фетальные клетки, и материнские клетки представляют собой не обязательно однородную совокупность, специфичность может быть также выражена через показатель кратности обогащения, которое может быть достигнуто с данным лигандом (как дополнительно описано ниже).
В предпочтительном варианте выполнения лиганды могут быть получены способом настоящего изобретения, описанного здесь ниже. Таким образом, специфичность лигандов является оптимизированной.
Предпочтительно, когда способ по изобретению дополнительно включает стадию идентификации фетальных клеток пробы и/или стадию обогащения фетальных клеток пробы. В предпочтительном варианте выполнения изобретения стадия обогащения выполняется перед стадией идентификации.
После обогащения и/или идентификации, часто выполняется стадия обнаружения и стадия прогнозирования и/или диагностирования.
Идентификация
Когда способ включает стадию идентификации, один вариант выполнения изобретения включает обнаружение наличия лиганда или гибридизационного зонда на поверхности или внутри фетальных клеток (стадия (е) способа, описанного в первом варианте выполнения).
Обнаружение может быть выполнено за счет мечения лиганда или гибридизационного зонда флуоресцентными красителями или другими красителями, подходящими для обнаружения. Способ, например, может быть таким, как флуоресценция при гибридизации in situ (FISH). Зонд может включить гаситель, так же как и флуорофор, или пару FRET, как описано выше, что позволяет выполнить обнаружение гибридизационных зондов, связанных с их целевыми последовательностями (мишенями). Альтернативно или дополнительно, зонды, связанные с их мишенями, могут отделяться от зондов, которые находятся в не связанном состоянии, одной или несколькими стадиями отмывки.
Идентификация также может быть выполнена с использованием иммуноокрашивания, в случае применения лиганда, такого как антитело.
Идентификация может быть выполнена с использованием многоцветного способа FISH или многоцветного иммуноокрашивания. В частности, могут быть одновременно использованы различные гибри-дизационные зонды с различными флуоресцентными метками, или могут быть одновременно использованы два (или более) различных антитела с различными флуоресцентными метками. Они все могут быть специфичными для фетальных клеток, или один из них может быть специфичным для фетальных клеток, а другой может быть специфичным для материнских клеток.
В одном варианте выполнения изобретения идентифицированная фетальная клетка может быть подвергнута микродиссекции с лазерным захватом (LCM).
Обогащение
В предпочтительном варианте выполнения изобретения стадия обогащения, зависимая от лиганда или от гибридизационного зонда, выполняется после того, как проба материнской крови подверглась контактированию с лигандом или с гибридизационным зондом, т.е. после стадии (с) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения в разделе "Сущность изобретения". В одном варианте выполнения изобретения обогащение также может быть выполнено после стадии (d) способа, описанного в первом варианте выполнения. Для обогащения предпочтительнее использовать лиганд, а не гибридиза-ционный зонд.
Лиганд, используемый на стадии (с) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения, предпочтительно связан с молекулой металла, например, он может быть связан с магнитными гранулами.
Когда используется термин "обогащение", то подразумевается, что отношение фетальных клеток к материнским клеткам в пробы увеличивается. Кратность обогащения предпочтительно равна более 1000, еще предпочтительнее более 10000 и наиболее предпочтительно более 100000.
В другом варианте выполнения изобретения кратность обогащения выбирается из группы, состоящий из значений: более 10, более 100, более 1000, более 10000, более 100000 и более 1000000.
Обогащение основано на применении идентифицированных мРНК, которые предпочтительно экс-прессируются в фетальных клетках, и на применении белков, кодируемых такими мРНК.
Специалисту ясно, как может быть выполнена дополнительная стадия антигензависимого обогащения, которая основана на лигандах (или антигенах), известных из уровня техники. Примерами таких антигенов, известных из уровня техники, являются CD34, Tra, Oct1, Crypto1, SSEA1, CD29, CD33, CD146 и
CD166.
Как описано выше, например, относительно CD105, стадия обогащения также может быть выполнена до того, как проба материнской крови подвергается связыванию с лигандом или с гибридизацион-ным зондом, т.е. перед стадией (b) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения.
Сортировка проточными методами
В предпочтительном варианте выполнения изобретения обогащение выполняется с использованием метода флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS). В частности, лиганд метится флуо
ресцентной меткой, что обеспечивает возможность проведения FACS. Анализ FACS и соответствующие метки известны квалифицированному специалисту, а примеры были приведены выше.
В качестве альтернативы FACS, может быть использовано микропроточное устройство для сортировки клеток.
Иммобилизация
В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения используется иммобилизация ли-гандов. Лиганды, применяемые на стадиях (b) и/или (d) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения в разделе "Сущность изобретения", могут быть, например, иммобилизированы на частицах, таких как магнитные частицы, частицы сефарозы, частицы агарозы и т.п. Когда лиганды и клетки, связанные с ними, иммобилизованы, несвязанные клетки могут быть отмыты от частиц. Такой процесс отмывки может быть выполнен в объеме или на колонке. После обогащения (фракционирования) связанные клетки могут быть элюированы путем использования высокой или низкой концентрации соли, линкеров, которые легко расщепляются, низкого или высокого значения величины рН, денатурирующих агентов и т.п. Более предпочтительно, когда связанные клетки элюируются за счет применения конкурентного элюирования с растворимыми антигенами или с вторичными лигандами, которые связываются с лигандами, специфичными для фетальной клетки, например, с антителами, направленными на фиксированную часть лиганда, используемого для иммобилизации.
Предпочтительным способом обогащения является MACS (способ иммуномагнитной сортировки клеток), в котором лиганды иммобилизированы на магнитных частицах. Таким образом, клетки, связанные с лигандами, могут быть отделены от не связанных клеток за счет отбора частиц с применением магнитного поля.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения обогащение на стадии (b) способа, описанного в первом варианте выполнения, осуществляется с применением CD105, иммобилизированного на магнитных частицах.
Негативный отбор с использованием антигенов
Лиганды, которые специфически связывается с материнскими клетками, в одном варианте выполнения изобретения также могут использоваться для обогащения. В частности, в предпочтительном варианте выполнения изобретения способ дополнительно включает стадию контактирования пробы материнских клеток со специфичным лигандом, направленным на материнский антиген. Эта стадия может быть выполнена в любое соответствующее время, например, перед стадией (b) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения. После контактирования пробы с лигандом, специфичном для материнских клеток, обогащение может быть, например, выполнено с применением FACS, MACS, микропроточных методов или с помощью иммобилизации, как описано выше.
Лиганд предпочтительно выбирается из группы, состоящей из лигандов, которые связываются с антигенами, кодируемыми мРНК, которые предпочтительно экспрессируются в клетках материнской крови, но не экспрессируются в фетальных клетках, как определено в настоящем изобретении.
Специалисту ясно, что могут быть использованы известные из уровня техники дополнительные ан-тигензависимые стадии обогащения (негативные отборы), основанные на использовании лигандов (или антигенов). Например, в одном варианте выполнения изобретения, где выполняется дополнительная ан-тигензависимая стадия обогащения, лиганд выбирается из группы, состоящей из лигандов, которые связывают с материнскими специфичными антигенами, известными из уровня техники, такими как CD45, HLA-А и HLA-B, или используется антитело, которое выбираются из группы, состоящей из HLe-1, М3 и
L4.
Предпочтительный маркер типа клетки для негативного отбора представляет собой CD45, также известный как общий лейкоцитарный антиген. CD45 представляет собой трансмембранный белок, экс-прессируемый всеми дифференцированными гематопоэтическими клетками, кроме эритроцитов и плаз-мацитов. Белок CD45 существует в различных формах, все из которых происходят из единственного комплексного гена, дающего начало восьми различным зрелым мРНК, с получением восьми различных белковым продуктам. Экспрессия имеет место во всех лейкоцитах, но не в других клетках, и таким образом он действует как маркер, общий для всех лейкоцитов, включая различные и разнотипные лейкоциты (или белые клетки крови), такие как нейтрофилы, ацидофильные гранулоциты, базофилы, лимфоциты (В- и Т-клетки), моноциты и макрофаги.
Из-за экспрессии CD45 в значительном большинстве клеток, содержащих ядро, которые представлены в материнской крови, предпочтительным является негативный отбор с использованием в качестве маркера CD45. После истощения пробы в отношении клеток, положительных по CD45, собираются клетки, негативные по CD45. Такое истощение пробы и сбор клеток могут быть выполнены любым соответствующим способом, известным в уровне техники.
В одном варианте выполнения изобретения клетка, представленная в пробе материнской крови, или ее фрагмент, дополнительно метятся с использованием маркера CD45 в любой соответствующей точке времени, приводя к идентификации материнских клеток, представленных в пробе. Затем клетки пробы, негативные по CD45, могут быть собраны. Такое дополнительное мечение и сбор клеток могут быть выполнены с применением любого соответствующего способа, известного в уровне техники.
HLA
Человеческие лейкоцитарные антигены, которые являются частью человеческого главного комплекса гистосовместимости (МНС), ответственны за поверхностные антигенпрезентирующие белки клеток и многие другие гены.
Имеются два класса человеческих лейкоцитарных антигенов: антигены класса I (А, В и С) и антигены класса II (DR, DP и DQ), которые обладают различными функциями. Оба класса включают значительное количество вариабельных аллелей.
Гены HLA, которые не экспрессируются фетальными клетками, могут быть использованы для истощения материнских клеток в пробе. Например, проба материнской крови или ее фракции, используемая на стадии (а) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения, может быть подвергнута воздействию антигенами, направленным на гены HLA.
Другие методы обогащения
Дополнительные методы обогащения, в которых не применяются антиген-специфические лиганды, также могут быть использованы. Предпочтительный дополнительный способ обогащения представляет собой лизирование эритроцитов, например такой, как лизис, опосредованный NH4Cl, в рамках которого происходит селективный лизис эритроцитов, оставляя неповрежденными клетки, которые содержат ядро. Этот способ уровня техники известен специалистам. В предпочтительном варианте выполнения изобретения лизис эритроцитов выполняется перед стадией (b) способа, описанного в первом варианте выполнения. В случае лизиса, опосредованного NH4Cl, предпочтительно использование концентрации NH4Cl, равной 0,1-0,2 мМ, такой как 0,14-0,18 мМ NH4Cl и более предпочтительно 0,15-0,17 мМ NH4Cl.
Для обогащения также могут быть использованы способы фиксирования и селективного лизиса, описанные здесь выше.
Проба может также быть подвергнута предварительному разделению, основанному на размере или плотности, в частности, центрифугированию в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Это приводит к получению слоя супернатанта, который содержит тромбоциты; слоя мононуклеарных клеток; и агглютинированного осадка, который содержит безъядерные эритроциты и гранулоциты. Слой мононуклеарных клеток отделяется от других слоев, чтобы получить пробу материнской крови, обогащенную фетальными клетками.
Также для обогащения могут быть использованы различные физические свойства клеток, например, но без ограничения, заряд клетки. Седиментация
Клетки, присутствующие в образце крови, могут быть обогащены седиментацией, когда большая часть клеток, представленные в пробе, допускают их осаждение. Образец крови перед седиментацией может быть разбавлен соответствующим раствором, таким как 0,15М NaCl. Седиментация может продолжиться до тех пор, пока не будет достигнута полная седиментация, например, седиментация может продолжаться в течение по меньшей мере 5 ч или предпочтительно в течение ночи.
Предпочтительно, когда проба подвергается седиментации при температуре ниже комнатной, например, при температуре менее 15°С, менее 10°С, менее 8°С или менее 6°С, предпочтительно при температуре от 2 до 8°С или приблизительно при 4°С.
Незначительная часть клеток с низкой плотностью не может образовывать осадок, но она может быть отделена умеренным предварительным фиксированием, как описано, например в 0,5% парафор-мальдегиде, с последующим центрифугированием.
Комбинирование лигандов и методов обогащения
Ясно, что может быть использована комбинация различных лиганды и методов обогащения. Например, 1, 2, 3 или более лигандов, специфичных в отношении фетальных клеток, направленных на клетки с эндотелиальным фенотипом (т.е. на клетки с эндотелиальными маркерами), могут быть использованы одновременно или последовательно. Аналогично, может быть применено последовательное обогащение с использованием соответственно лигандов, специфичных в отношении фетальных клеток, и лиган-дов, специфичных в отношении материнских клеток.
Проба
С целью увеличения общего количества фетальных клеток желательно получить пробу материнской крови достаточно большую, насколько это возможно. Соответственно, размер пробы материнской крови на стадии (а) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения, находится в интервале предпочтительно от 0,5 до 50 мл, например, в интервале от 1 до 40 мл, в частности от 5 до 35 мл или от 10 до 30 мл.
Представленная проба материнской крови предпочтительно получают от беременной женщины в период между 5-24 или 6-20 неделями беременности, более предпочтительно между 7-16 или 8-12 неделями беременности.
Разбавление и концентрирование
Согласно изобретению проба также может быть разбавлена или сконцентрирована в любое время в ходе выполнения способа. Проба может быть разбавлена по меньшей мере в 1,5 раза, в частности в два раза, более предпочтительно по меньшей мере в три раза, например, в пять раз, путем добавления изото
нических буферов, таких как солевые растворы, забуференные фосфатом солевые растворы, PBS и/или путем добавления соответствующих сред для выращивания, таких как базальные среды и среды для выращивания тканей. Любая стадия способа может включать разбавление пробы путем добавления различных ингредиентов, в зависимости от специфики стадии способа.
Для выполнения способа, может быть выгодным осуществлять различные стадии способа так, чтобы сконцентрировать пробу, например, путем снижения объема, без извлечения клеток. Объем пробы может быть снижен до величины менее 80%, например, 70%, 60% или 50% от первоначального объема пробы или даже предпочтительно менее 40%, в частности 25% от первоначального объема пробы.
Стадия концентрирования может представлять собой центрифугирование. Способ по изобретению может включать одну или несколько стадий концентрирования. Центрифугирование представляет собой предпочтительный способ концентрирования клеток. Чтобы избежать повреждений клеток, предпочтительным является умеренное центрифугирование, например в режиме 300 g в течение 10 мин.
Обнаружение и диагностирование
Предпочтительно способ по изобретению может использоваться для пренатального обнаружения и прогнозирования и/или диагностирования (т.е. стадии (е) и (f) способа, описанного в первом варианте выполнения). Таким образом, объектом для обнаружения и прогнозирования и/или диагностирования может быть идентифицированная клетка, или проба материнской крови, обогащенная в отношении фе-тальных клеток, может быть подвергнута операциям по обнаружению и прогнозированию и/или диагностирования.
В одном варианте выполнения изобретения фетальные белки становятся доступными для обнаружения, например, посредством иммуноблоттинга, секвенирования белка или масс-спектрометрии.
В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения, обнаружении и/или диагностирование включает стадию получения фетальной ДНК или РНК, доступной для обнаружения.
На стадии (е) способа, описанного в первом варианте выполнения изобретения, предпочтительными способами обнаружения являются метод FISH (флуоресценция при гибридизации in situ), нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, секвенирование ДНК/РНК, анализ на микроматрице и амплификация. Такие способы могут быть использованы, чтобы обнаружить присутствие специфичных последовательностей, которые характерны для некоторых патологических состояний, например, для пренатального заболевания или для предрасположения к нему. Способы также могут использоваться для обнаружения хромосомной анеуплоидии, такой как трисомия 13, трисомия 18 или трисомия 21 хромосомы. Способы обнаружения также могут использоваться для определения пола эмбриона путем обнаружения специфических последовательностей Y хромосомы.
В альтернативном варианте выполнения изобретения количество фетальных клеток в пробе сравнивается со стандартным количеством. Увеличение числа фетальных клеток в пробе может указать, что беременность находится в состоянии риска. Число фетальных клеток в пробе (так же как в эталонном образце) может быть оценено применением, например, FACS.
Идентификация специфичных лигандов
Один вариант выполнения изобретения представляет собой способ идентификации лиганда, специфичного для фетальной клетки, который включает стадии:
a) получения библиотеки лигандов-кандидатов, специфичных для фетальных клеток;
b) получения пула материнских клеток;
c) контактирования библиотеки со стадии (а) с материнскими клетками со стадии (b);
d) отбора лигандов, которые не связывают с материнскими клетками, с получением библиотеки, обедненной по лигандам, которые связываются с материнскими клетками.
В предпочтительном варианте выполнения способ дополнительно включает стадии:
e) контактирования библиотеки со стадии (а) или библиотеки со стадии (d) с фетальной клеткой;
f) отбора лигандов, которые связываются с фетальной клеткой, с получением библиотеки, которая обогащена по лигандам, которые связываются с фетальными клетками, но не связываются с материнскими клетками.
Должно быть ясно, что применение одной клетки достаточно для отбора лигандов на стадии (f), но очевидно, что может использоваться большее количество фетальных клеток.
В одном варианте выполнения изобретения конкретные специфичные лиганды выбираются так, чтобы лиганды были направлены на эпителиальные клетки плацентарного происхождения.
Стадии (b)-(f) могут быть выполнены посредством стадий:
g) получения пробы материнской крови;
h) контактирования библиотеки с пробой материнской крови;
i) отбора лигандов, которые связываются с фетальными клетками путем извлечения индивидуаль-
ных фетальных клеток, которые были идентифицированы с помощью метода FISH как имеющие хромо-
сому Y и/или которые были идентифицированы способом по пятому аспекта изобретения, и сбора ли-
гандов исключительно их этих клеток.
Проба материнской крови может быть обогащена в отношении фетальных клеток. В предпочтительном варианте выполнения способ дополнительно включает стадию:
j) мультиплицирования/амплификации собранных лигандов, например, получением амплифициро-ванной библиотеки для дополнительного отбора против фетальных клеток и/или против материнских клеток.
Ясно, что для идентификации наиболее лучших лигандов могут быть выполнены множественные раунды отбора и амплификации.
В другом варианте выполнения изобретения способ идентификации лиганда, специфичного для фе-тальной клетки, выполняется, как описано в примере 1 заявки PCT/DK 2010/050002.
Библиотека лигандов-кандидатов, специфичных для фетальной клетки, может быть библиотекой антител или пептидов, представленной на фагах (метод фагового дисплея), на мРНК (рибосомный дисплей или мРНК-дисплей) или на ДНК (ковалентный дисплей или плазмидный пэннинг).
Для идентификации аптамеров библиотека также может быть библиотекой ДНК- или РНК-олигонуклеотидов.
Термин "кандидаты" используется для того, чтобы подчеркнуть, что соединения библиотеки не обязательно связываются с фетальными клетками. Они должны быть проверены на связывание для идентификации лигандов, специфичных в отношении фетальной клетки.
В одном варианте выполнения изобретения библиотека лигандов-кандидатов, специфичных в отношении фетальной клетки, является полностью рандомизированной библиотекой. В этом случае, библиотека может быть сначала подвергнута итеративной селекции против фетальных клеток и амплифици-рована до того, как будет выполнен обратный отбор (негативный отбор) в отношении материнских клеток.
В другом варианте выполнения изобретения библиотека лигандов-кандидатов, специфичных в отношении фетальной клетки, основана на известных лигандах фетальных клеток. Такая библиотека может быть, например, создана представлением антитела, которое связывается с фетальными клетками, на фаге и мутагенезе гена, кодирующего антитело, для того, чтобы создать библиотеку. В таком случае, мутагенез может улучшить специфику при сохранении или даже при улучшении аффинности в отношении фе-тальных клеток.
В одном варианте выполнения изобретения лиганд связывается с антигеном, кодируемым геном, выбранным из группы, состоящей из генов человеческого цитокератина 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 и 19, человеческого цитокератина 7 и виментина человека. Таким образом, аффинность и/или специфичность лиган-дов оптимизируются за счет применения способа, указанного выше.
Лиганды, специфичные для фетальной клетки, и гибридизационные зонды
В одном варианте выполнения изобретения лиганд, специфичный в отношении эндотелиальной клетки, и гибридизационные зонды, используемые на стадии (b) способа, описанного в первом варианте выполнения настоящего изобретения, могут быть выбраны из группы, состоящей из:
i) лиганда, направленного на антиген, выбранный из группы, состоящей из CD105, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1, EPCR, и
ii) гибридизационного зонда, направленного на нуклеиновую кислоту, включающую по меньшей мере 10 нуклеотидов гена, выбранного из группы, состоящей из гена, кодирующего CD105, виментин, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, PAI-1 и EPCR.
В одном варианте выполнения изобретения лиганд, специфичный в отношении эпителиальной клетки, и гибридизационные зонды, используемые на стадии (d) способа, описанного в первом варианте выполнения настоящего изобретения, могут быть выбраны из группы, состоящей из:
i) лиганда, направленного на антиген, выбранный из группы, состоящей из CK1 CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 и CK19, и
ii) гибридизационного зонда, направленного на нуклеиновую кислоту, включающую по меньшей мере 10 нуклеотидов гена, выбранного из группы, состоящей из гена, кодирующего CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 и CK19.
В одном варианте выполнения изобретения лиганд, специфичный в отношении фетальной клетки, и гибридизационный зонд выбираются из группы, состоящий из CD105 и CK18.
В одном варианте выполнения изобретения лиганд или гибридизационный зонд характеризуется тем, что он обеспечивает возможность 90% правильного отбора клеток в образце для испытаний, который содержит 99,9% материнских клеток и 0,1% фетальных клеток. Т.е. когда указывается 90% правильной идентификации клеток, это подразумевает здесь, что при выполнении отбора с лигандом из образца для испытаний будут выделены 90 фетальных клеток на каждые 10 материнских клеток и, по аналогии, для случая лучшей/худшей правильности. Предпочтительный способ отбора представляет собой MACS. Более предпочтительный лиганд представляет собой лиганд, который обеспечивает 95% правильного отбора, 98% правильного отбора, и наиболее предпочтительным является лиганд, который обеспечивает 99% правильного отбора клеток. Поскольку в пробе материнской крови имеется очень низкий уровень фетальных клеток, еще более предпочтительно, когда лиганд обеспечивает 99,9%, 99,99% или 99,999% правильного отбора клеток из образца для испытаний, как описано выше.
Предпочтительно, когда лиганды представляют собой аптамеры, пептиды или антитела. Наиболее предпочтительными являются антитела.
Предпочтительно, когда лиганды представляют собой лиганды, идентифицированные с применением способа, описанного здесь выше, или способа, описанного в заявке PCT/DK 2010/050002, для того, чтобы они имели улучшенную специфичность.
В одном варианте выполнения изобретения лиганды или гибридизационные зонды, идентифицированные способом, описанным здесь выше, или способом, описанным в PCT/DK 2010/050002, используются для обогащения пробы материнской крови фетальными клетками или для идентификации феталь-ных клеток в пробе материнской крови. Применение лигандов или гибридизационных зондов, как описывается здесь выше, является предпочтительным.
Изобретение также предоставляет набор, включающий лиганд или гибридизационный зонд, как описано здесь выше, и инструкции по применению.
Предпочтительно, когда набор включает первый лиганд для обогащения и второй лиганд и/или ги-бридизационный зонд для идентификации. Более предпочтительно, когда набор включает первый ли-ганд, который является эндотелиальным клеточным маркером, и второй лиганд и/или гибридизационный зонд, который является эпителиальным маркером. Эндотелиальный клеточный маркер используется для обогащения фетальных клеток, а эпителиальный маркер используется для идентификации фетальных клеток, представленных в пробе, которая содержит клетки с эндотелиальным и эпителиальным фенотипами.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения набор также включает буферы для фиксирования и буферы для лизиса, как описано здесь выше в подразделе "Фиксирование и селективный лизис".
В одном варианте выполнения изобретения лиганды или зонды гибридизации используются для идентификации дополнительных лигандов, специфичных для фетальных клеток. В предпочтительном варианте выполнения изобретения для этого применения, лиганды и/или гибридизационные зонды используются способом, описанном здесь выше, или способом, описанном в PCT/DK 2010/050002.
Один аспект изобретения касается фетальной клетки, идентифицированной способом, описанным здесь выше. Указанная клетка характеризуется экспрессией маркера, выбранного из группы человеческих цитокератинов 1, 2, 3, 4 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No: 4), 6A (SEQ ID No: 5), 6B (SEQ ID No: 6), 7 (SEQ ID No: 7), 8 (SEQ ID No: 8), 10 (SEQ ID No: 9), 13 (SEQ ID No: 10 и SEQ ID No: 11), 14, 15, 16, 17, 18 (SEQ ID No: 12 и SEQ ID No: 13) и 19, виментина человека и CD105 (SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2), а также может отличаться от других клеток наличием экспрессии CD105 или виментина и/или коэкспрес-сии CD105 или виментина и цитокератинов. Предпочтительно, когда фетальная клетка выделена или идентифицирована так, как, например, описано в других аспектах этого изобретения, и она не присутствует в организме человека.
Один аспект изобретения касается применения фетальной клетки, идентифицированной способом, описанным здесь выше, для обнаружения и диагностики, как описано выше, или для получения дополнительных лигандов, специфичных для фетальных клеток, например, как описано в подразделе "Идентификация специфичных лигандов".
Еще один аспект изобретения касается набора, включающего:
a) :
i) гибридизационный зонд, который включает по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или
ii) лиганд, направленный на эпителиальный клеточный маркер;
b) :
i) гибридизационным зонд, включающий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплемен-
тарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или
ii) лиганд, направленный на эндотелиальный клеточный маркер; и
инструкции по применению.
Пренатальное определение пола
Выделенная фетальная клетка по настоящему изобретению может дополнительно использоваться для определения пола эмбриона при помощи мужских специфичных зондов или путем использования антигенсвязывающих соединений, идентифицированных способом, описанным здесь для обнаружения фетальных клеток, с последующим выполнением соответствующих способов определения пола, известных специалистам в данной области.
Пренатальный диагноз хромосомной аномалии
Параллельно определению пола, изобретение дополнительно касается способов определения хромосомных аномалий, путем обнаружения фетальных клеток, основанного на антигенах или связывающих соединений, распознающих указанные антигены фетальной клетки, выделенной или идентифицированной способами, основанными на настоящем изобретении. Такие способы определения хромосомных аномалий касаются обнаружения, таких явлений, как анеуплоидия, транслокация, несбалансированная транслокация, хромосомная перестройка, субтеломерная перестройка, несбалансированная хромосомная перестройка, делеция, инверсии, несбалансированные инверсии, дублирование и теломерная неустойчивость и/или укорачивание хромосом. Кроме того, хромосомная аномалия может дополнительно быть
такой, как единичная нуклеотидная замена, микроделеция, микроинсерция, короткие делеции, короткая инсерция, мультинуклеотидные замены, метилирование ДНК и/или утрата импринтинга (LOI). В предпочтительном варианте выполнения изобретения хромосомная анеуплоидия является полной и/или частичной трисомией, такой как трисомия 21, трисомия 18, трисомия 13, трисомия 16 хромосомы и/или аномалией XXX и другой половой хромосомы. Альтернативно, анеуплоидия представляет собой полную и/или частичную моносомию, такую как моносомию X, моносомию 21, моносомию 22, моносомию 16 и/или моносомию 15 хромосомы.
Для определения пола или определения хромосомных аномалий могут быть использованы методики гибридизации ДНК. Методики, известные в уровне техники, включают способы, такие как флуоресценция при гибридизации in situ (FISH), примирование меток in situ (PRINS), количественный метод FISH (Q-FISH) и многоцветный бэндинг хромосом (МСВ). В способе флуоресценции при гибридизации in situ (FISH) используются молекулярные зонды, маркированные, как описано выше, например флуоресцентной меткой. Используют зонд, соответствующий гену или последовательности ДНК, и под микроскопом наблюдают сигнал в специфичном локусе ядра. Методика FISH может быть применена к межфазным клеткам, и она может подтвердить присутствие эуплоида или анеуплоида у хромосом X, Y, 13, 15, 18 и 21. Методика FISH полезна для идентификации многих аномалий хромосом, таких как трисомии и моносомии, и, когда зонды доступны для специфических областей хромосом, она может быть использована для определения присутствия делеций, транслокаций или дублирований.
Как альтернатива вышеупомянутым методикам гибридизации, для определения хромосомных аномалий могут использоваться способы ПЦР. Применение этого способа требует начального выделения нескольких фетальных клеток. Способы ПЦР в рамках изобретения включают соответствующий способ, известный в уровне техники, способный обнаружить аномалии, такие как трисомии и т.п., как описано выше. Способы ПЦР могут дополнительно использоваться для определения незначительных аномалий, таких как малые делеционные мутации в специфичных генах. Количественная флуоресцентная ПЦР (QF-PCR) является примером таких способов, подходящих для обнаружения, например, трисомии 13, 18, 21 хромосомы, триплоидностей, двойных трисомий, так же как X и Y анеуплоидий (V. Cirigliano, 2004). С построением соответствующих праймеров для минорных, но тем не менее серьезных хромосомных аномалий, способы ПЦР могут быть использованы для определения заболевания, такого как, например, кис-тозный фиброз, который часто вызывается делециями трех пар оснований в гене кистозного фиброза, что ведет к отсутствию в белке критической аминокислоты фенилаланина.
Фетальные клетки, как описано выше, могут быть стволовыми клетками. Стволовые клетки входят в различные разновидности, в зависимости от того, когда и где они продуцируются во время развития, и от того, насколько они универсальны. Обнаруживаемые фетальные стволовые клетки могут быть любого типа, такими как эмбриональными или соматическими, являясь при этом плюрипотентными или мульти-потентными.
Применение стволовых клеток
При применении технологии, описанной здесь, фетальные стволовые клетки могут быть выделены из проб материнской крови с использованием связывающего соединения, антитела или фрагмента антитела, распознающих указанный антиген фетальной клетки, согласно изобретению. Стволовые клетки могут продуцировать большее число стволовых клеток, и они могут быть использованы для того, чтобы продуцировать специализированный тип клеток, такой как нервные, кровяные клетки или клетки печени. В зависимости от типа выделенных стволовых клеток, клетки могут иметь различное применение при развитии специфического типа клеток или ткани. Стволовые плюрипотентные клетки могут дать начало любому типу клеток, тогда как стволовые мультипотентные клетки могут дать начало более ограниченному количеству типов клеток. Например, кроветворные (гемопоэтические) стволовые клетки могут быть способными к формованию всех типов клеток крови, тогда как мезенхимальные стволовые клетки способны к формированию только мезенхимальных клеток.
Стволовые клетки, особенно плюрипотентные стволовые клетки, могут использоваться для лечения различных заболеваний. Плюрипотентные стволовые клетки традиционно представляют собой эмбриональные стволовые клетки, доступность которых, по этическим соображениям, ограничена. Возможность применения стволовых клеток, выделенных из пробы материнской крови, является привлекательным вариантом. Плюрипотентные стволовые клетки могут использоваться для лечения множества заболеваний, для которых традиционные способы не предоставляют соответствующее эффективное лечение.
Ссылки
Gussin X.A., Sharma АХ., Elias S. "Culture of endothelial cells isolated from maternal blood using anti-CD105 and CD133." Prenat Diagn, 2004:Mar; 24 (3):189-193.
Примеры
Пример 1
Получение образцов крови
Пробы периферической крови объемом 24 мл были получены от беременных женщин в гестацион-ном возрасте от 11 до 14 недель. Образцы крови были взяты до инвазивной процедуры и после согласия на основе полного информирования. Все образцы крови были собраны в гепаринизированные пробирки
и были немедленно обработаны после их сбора.
В дополнение к гепаринизированной крови, 5 мл крови были взяты в пробирки с EDTA. Эта кровь использовалась для анализа пола эмбриона. Пол плода был определен при помощи ПЦР в реальном масштабе времени анализом свободных ДНК эмбриона, с использованием специфичных Y-хромосомных генов. Дальнейшему анализу подвергали только те пробы образцов крови, где был установлен мужской пол эмбриона.
Фиксирование
От каждой пробы цельной крови были отобраны аликвоты объемом 3 мл в предварительно покрытые пробирки для центрифугирования объемом 50 мл (8 пробирок на пробу), с применением предварительно покрытых пипеток (буфер для предварительного покрытия состоял из 2% BSA в PBS (не содержащего Ca2+ и Mg2+). В каждую пробирку, с помощью предварительно покрытых пипеток, было добавлено по два мл 10%-ого формальдегида в PBS. После осторожного смешивания кровь была оставлена для фиксирования на 10 мин в комнатной температуре.
Селективный лизис
После фиксирования, к каждой пробирке было добавлено по 30 мл 0,12% Triton Х-100 в PBS (не содержащего Ca2+ и Mg2+). Пробирки были перевернуты по 3 раза, и красные кровяные клетки подверглись лизису в течение 45 мин при комнатной температуре. После лизиса, к каждой пробирке был добавлен по 15 мл холодного (4°С) 2% BSA в PBS (не содержащего Са2+ и Mg2+). После перемешивания двухкратным переворачиванием пробирок, нерастворенные клетки были осаждены центрифугированием при 500 g в течение 15 мин при 4°С. После удаление супернатанта, клетки повторно суспендировали в 10 мл холодного (4°С) PBS (не содержащего Ca2+ и Mg2+), и их сохраняли в течение ночи при 4°С.
Пермеабилизация
Пробы подвергали пермеабилизации путем добавления 10 мл холодного (-20°С) метанола, с последующим инкубированием при 4°С в течение 10 мин. После центрифугирования при 500 g в течение 10 мин, осадок клеток был объединен и помещен в 2 пробирки с применением предварительно покрытых пипеток. Пустые пробирки были промыты с использованием 1 мл холодного буфера MASC (PBS, 0,5% BSA, 2 мМ EDTA). Объединенные клетки были перенесены в две предварительно покрытые пробирки на 15 мл и их центрифугировали при 500 g в течение 10 мин. После удаления супернатанта, клетки в каждой пробирке повторно суспендировали в 500 мкл буфера MACS на положительный отбор с использованием микрочастиц с CD105 и MACS.
К 500 мкл суспензии клеток было добавлено 130 мкл микрочастиц с CD105 (Miltenyi), и суспензия клеток была инкубирована в течение 60 мин при 4°С. Затем клетки были отмыты путем добавления 6 мл холодного буфера MACS, с последующим центрифугированием в течение 10 мин при 500 g. Супернатант был удален, и клетки повторно суспендировали в 2 мл холодного буфера MACS.
Суспензию клеток, меченую CD105, вносили в предварительно промытую колонку LD (Miltenyi) со стороны магнита, при этом колонка была расположена на верхней части предварительно промытой колонки MS (Miltenyi). Когда клетки прошли через колонку LD, она была дважды промыта 2 мл холодного буфера MACS. Колонка MS была промыта 1 мл холодного буфера MACS. Затем колонка LD была отсоединена от магнита и помещена на предварительно покрытую пробирку на 15 мл, после чего клетки дважды подвергли элюированию с использованием 5 мл холодного буфера MACS. Первые 5 мл буфера пропускали через колонку без использования плунжера. Вторые 5 мл буфера продавливали через колонку с применением плунжера. Затем колонка MS была отсоединена от магнита и размещена на пробирке для сбора. Клетки элюировали таким же образом, что и в случае колонки LD, используя двойное элюирова-ние по 1 мл холодного буфера MACS, вместо двойного элюирования с 5 мл буфера. Пробирку с элюатом центрифугировали при 500 g в течение 10 мин. Супернатант удаляли, и осадок клеток повторно суспендировали в холодном буфере MACS. Затем суспензия клетки была помещена на предметные стекла, покрытые полилизином, и предметное стекла были высушены на открытом воздухе (в течение ночи) перед дальнейшим анализом.
Идентификация мужских фетальных клеток Х- и Y-хромосомно-специфичным анализом FISH и автоматизированное сканирование
Перед гибридизацией предметное стекла были промыты в PBS в течение 5 мин и обезвожены в 60%, 80% и 99,9% этиловом спирте в течение 3 мин для каждого случая. Для этого анализа использовали специфичный к хромосомному повтору в ДНК зонд DXZ1, СЕР X alpha satellite, меченный спектральным зеленым, и зонд DYZ1, СЕР Y satellite III, меченный спектральным оранжевым (Abbott Molecular). Смеси для гибридизации, содержащие оба зонда, готовили путем смешивании 1 части Х-зонда, 1 части Y-зонда, 1 части дистиллированной воды и 7 частей буфера для гибридизации. Добавляли пятнадцать микролитров смеси для гибридизации, и все накрывали покровным стеклом размером 24x24 мм. Покровное стекло герметизировали каучуковым клеем, и ДНК денатурировали на нагревательной плите при 83,5°С в течение 7 мин, а затем подвергали гибридизации в течение ночи в увлажненной атмосфере при 42°С. Предметные стекла после гибридизации отмывали в течение 2 мин при 73°С в 0,4xSSC с 0,3% Tween 20, и в течение 1 мин при комнатной температуре в 2xSSC с 0,1% Tween 20. Затем предметные стекла помещали
в прибор Vectashield с DAPI.
Клетки, содержащие красный сигнал FISH, расположенный в ядре, окрашенном DAPI, были идентифицированы автоматическим сканированием с использованием двух сканирующих устройств различных типов: система сканирования предметных стекол MDS (вариант 5.8.0), первоначально разработанная Applied Imaging, и система сканирования MetaCyte, разработанная Metasystems. Предметные стекла в системе сканирования MDS были отсканированы с 20-кратным увеличением, в режиме сканировании "Функция 5". В системе сканирования MetaCyte, предметные стекла были отсканированы при 10-кратном увеличении, с использованием разработанного классификатора и метода FISH, оптимизированного в лаборатории для обнаружения сигналов спектрального оранжевого. После сканирования, клетки, идентифицированные сканирующим устройством, были автоматически представлены для визуального осмотра. Клетки, у которых имелся один зеленый X-сигнал и один оранжевый Y-сигнал, который был значительно более интенсивным, чем Х-сигнал, были классифицированы как мужские фетальные клетки.
Окрашивание антителами мужских фетальных клеток Фетальные клетки были окрашены индивидуально следующими антителами: пан-цитокератин (продукт номер С2562, Sigma-Aldrich), цитокератин 7 (продукт номер М7018, DAKO Cytomation) и виментин (продукт номер V2258, Sigma-Aldrich). Антитело против пан-цитокератина распознает человеческие цитокератины 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 и 19. Антитело против цитокератина 7 распознает цитокератин 7 человека, и антитело против виментина распознает эпитоп виментина человека, который не обнаруживается в лимфоидных клетках человека. Все три антитела представляют собой мышиные моноклональные антитела изотипа IgG1, IgG2 (цитокератины) или изотипа IgM (виментин).
После сушки на воздухе, предметные стекла были повторно гидратированы в 4x SSC в течение 10 мин, и затем они были подвергнуты предварительному инкубированию в течение 30 мин при комнатной температуре со 100 мкл блокирующего буфера, состоящего из 4xSSC, содержащего 10% нормальной козьей сыворотки, 1% BSA и 0,5% блокирующий) реагента (Roche), или со 100 мкл энхансера отображения (Imaging Enhancer от Molecular Probes). Затем предметные стекла были инкубированы в течение 60 мин при комнатной температуре со 100 мкл первичного антитела, разбавленного в блокирующем буфере в соотношении 1:50. После инкубации с антителом, предметные стекла были промыты 3 раза по 5 мин в 4x SSC. Для обнаружения предметные стекла инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 100 мкл AlexaFluor-488, конъюгированного с кроличьим антителом против мышиного IgG (цитокера-тины) или мышиного IgM (виментин) (от Molecular Probes), разбавленных в блокирующем буфере в соотношении 1:200, отмывали 3 раза по 5 мин в 4x SSC, а затем инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 100 мкл AlexaFluor-488, конъюгированного с козьим антителом против Ig колика (Molecular Probes), разбавленного в блокирующем буфере в соотношении 1:200. После двухкратной промывки в течение 5 мин в 4xSSC и однократной промывки в течение 5 мин в 2xSSC, предметные стекла были помещены в прибор Vectashield с DAPI (Vector Laboratories).
Окрашивание антителами против виментина с последующим окрашиванием антителами против пан-цитокератина
Покровные стекла были удалены при промывке в 4xSSC в течение 10 мин. Затем предметные стекла были промыты в 4xSSC в течение 5 мин и их инкубировали в течение 30 мин с 100 мкл блокирующего буфера или энхансера отображения, как описано выше. Затем предметные стекла были инкубированы в течение 60 мин при комнатной температуре с 100 мкл антитела против виментина, разбавленного блокирующим буфером в соотношении 1:50. После инкубирования с антителами, стекла были отмыты 3 раза по 5 мин в 4x SSC. Для обнаружения стекла инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре со 100 мкл AlexaFluor-555, конъюгированного с кроличьим антителом против мышиного IgM, разбавленного в соотношении 1:200 блокирующим буфером. После двухкратной промывки по 5 мин в 4x SSC и однократной промывки в течение 5 мин в 2x SSC, стекла были помещены в прибор Vectashield с DAPI.
Стекла, окрашенные антителами, были помещены в сканирующий микроскоп, и фетальные клетки были визуально проконтролированы на наличие положительного или отрицательного окрашивания, с их автоматическим перемещением.
Экспериментальные результаты примера 1
Фетальное происхождение клеток, обогащенных магнитной сортировкой клеток (MACS) по протоколу CD105, было проверено на 32 образцах крови беременных женщин, у которых установлено наличие эмбриона мужского пола. Анализ FISH был выполнен с использованием зондов, специфичных к Х- и Y-хромосомам, и клетки, которые показали один сигнал X и один сигнал Y, который был значительно больше, чем сигнал X, считали фетальными клетками (фиг. 1). В образцах материнской крови были обнаружены от 0,1 до 1,1 фетальных клеток на миллилитр крови (фиг. 2). 97% проб показали положительную реакцию для фетальных клеток. В одном образце крови фетальные клетки не были обнаружены.
Двадцать одна фетальная клетка эмбриона мужского пола была охарактеризована окрашиванием антителами против цитокератина 7, против пан-цитокератина и против виментина, используя протокол, описанный выше. Три из 21 фетальной клетки показали положительное окрашивание антителом против цитокератина 7, 10 из 14 клеток, которые не окрашивались антителом против цитокератина 7, показали
положительное окрашивание антителом против пан-цитокератина, при этом 3 клетки из 4 фетальных клеток, которые не окрашивались антителом против цитокератина, показали положительное окрашивание антителом против виментина. Кроме того, 4 из 4 клеток, положительных по окрашиванию антителом против пан-цитокератина, показали положительное окрашивание антителом против виментина. Эти результаты показывают, что магнитная клеточная сортировка (MACS) с использованием CD105, проведенная в отношение образцов материнской крови, выявила новый фетальный тип клеток в материнской крови, которые экспрессируют цитокератины и/или виментин, отличая, таким образом, этот тип клетки от фетальных трофобластов. Пример 2
Отбор цельной крови и окрашивание внутри колонки Отбор крови
Пробы периферической крови объемом 30 мл были получены от беременных женщин в гестацион-ном возрасте от 11 до 14 недель.
Образцы крови были взяты до инвазивной процедуры и после согласия на основе полного информирования. Все образцы крови были собраны в гепаринизированные пробирки или пробирки с EDTA, и они были обработаны в пределах 4 ч после их сбора.
В дополнение к гепаринизированной крови, 5 мл крови были взяты в пробирки с EDTA. Эта кровь использовалась для анализа пола эмбриона. Пол эмбриона был определен при помощи ПЦР в реальном масштабе времени анализом свободных ДНК эмбриона, с использованием специфичных Y-хромосомных генов.
Получение образцов крови - отбор с помощью CD105
На один миллилитр крови были добавлены микрогранулы CD105 (Miltenyi) объемом 20-50 мкл, и после смешивания пробу инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубирования, были отобраны аликвоты в б предварительно покрытых пробирок на 50 мл (буфер для предварительного покрытия: 2% BSA в PBS, не содержащего Ca2+ и Mg2+), и в каждую пробирку было добавлено 20 мл MACS-буфер перед центрифугированием, которое выполняли при 445 g в течение 12 мин при 4°С. Супернатанты были удалены, и был добавлен MACS-буфер до конечного объема 7,5 мл. После осторожного перемешивания с использованием предварительно покрытой пипетки, аликвота цельной крови, меченной CD105, в объеме 3 мл, была помещена в 2 колонки, предварительно промытые цельной кровью. После прохождения крови через колонки, колонки были дважды промыты MACS-буфером объемом 4 мл, отсоединены от магнита и их поместили в предварительно покрытые пробирки на 15 мл, после чего клетки элюировали из колонок путем прокачки с плунжером 5 мл буфера для элюирования цельной крови из колонки (Miltenyi). После центрифугирования при 445 g в течение 12 мин при 4°С, супернатант был удален, и осадок клеток повторно суспендировали в 500 мкл PBS с использованием пипетки с предварительно покрытым наконечником.
Фиксирование и пермеабилизация
Клетки были подвергнуты фиксированию в течение 20 мин после добавления 500 мкл фиксатора Inside Fix (Miltenyi). После фиксирования в пробирки добавили по 10 мл MACS-буфера, и пробирки подвергли центрифугированию при 500 g в течение 10 мин при 4°С. Супернатант был удален, и осадок клеток повторно суспендировали в 500 мкл MACS-буфера. Клетки были пермеабилизированы с помощью 500 мкл МеОН, охлажденного на льду, и их инкубировали в течение 10 мин при 4°С. Затем клетки были помещены в предварительно промытую колонку MS (Miltenyi), размещенную в магните. После того, как суспензия клеток полностью прошла через колонку, клетки были промыты MACS-буфером из расчета 500 мкл на колонку.
Окрашивание клеток в колонках MS
Фетальные клетки были окрашены коктейлем следующих антител: пан-цитокератин (продукт номер С2562, Sigma-Aldrich), цитокератин 7 (продукт номер М7018, DAKO Cytomation) и цитокератин 8/18 (продукт 18.0213, Invitrogen). Антитело против пан-цитокератина распознает человеческий цитокератин 1, 4-6, 8, 10, 13, 18 и 19. Антитело против цитокератина 7 антител распознает человеческий цитокератин 7, и антитело против цитокератина 8/18, распознает цитокератин 8/18. Все три антитела представляют собой моноклональное мышиное антитело изотипа IgG1, IgG2.
Перед окрашиванием антителами, колонки были подвергнуты предварительному инкубированию в течение 10 мин при комнатной температуре, с нанесением 500 мкл энхансера отображения (Imaging Enhancer от Molecular Probes), и после этого их однократно промывали с помощью 500 мкл MACS-буфера. Затем колонки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с нанесением 200 мкл цито-кератинового коктейля, разбавленного в соотношении 1:50 в блокирующем буфере, состоящим из 4xSSC, содержащего 10% нормальной козьей сыворотки, 1% BSA и 0,5% блокирующего реактива (Roche). После инкубации с антителами, колонки были промыты 3 раза с использованием 500 мкл MACS-буфера. Для обнаружения колонки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 200 мкл AlexaFluor-488, конъюгированного с фрагментами F(ab)2 козьего антитела против мышиного IgG (Invitrogen), разбавленного в соотношении 1:50 в блокирующем буфере, промывали 3 раза с использованием 500 мкл MACS-буфера, и затем инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 200
мкл AlexaFluor-488, конъюгированного с фрагментами F(ab)2 кроличьего антитела против козьего IgG (Invitrogen), разбавленного в соотношении 1:50 в блокирующем буфере. После инкубации колонки были однократно промыты с использованием 500 мкл MACS-буфера и дважды промыты с использованием 500 мкл PBS, не содержащего Ca2+ и Mg2+. Затем колонки были перенесены с магнита в пробирки на 15 мл, и клетки извлекали двухкратным применением 500 мкл MACS-буфера с использованием во второй раз плунжера. После того, как клетки были осаждены центрифугированием при 500 g в течение 10 мин при 4°С, клеточный осадок повторно суспендировали PBS, не содержащем Ca2+ и Mg2+, затем клетки наносили мазком на предметные стекла, и стекла высушивали на открытом воздухе в течение ночи в темноте и затем их помещали в прибор Vectashield с DAPI (Vector Laboratories).
Анализ предметных стекол, окрашенных антителами против цитокератинов
Идентификация клеток, окрашенных антителами против цитокератинов
Фетальные клетки, окрашенные коктейлем антител против цитокератинов, были идентифицированы автоматическим сканированием с использованием сканирующей системы MetaCyte, разработанной Metasystems. Предметные стекла сканировались при 10-кратном увеличении, с использованием классификатора, разработанного и оптимизированного в лаборатории для обнаружения клеток, окрашенных антителами против цитокератинов. После просмотра, клетки, идентифицированные сканнером, были автоматически представлены для визуального осмотра.
Идентификация/подтверждение (мужских) фетальных клеток при помощи FISH
В случае беременностей, когда эмбрион является мужским, специфичность окрашивания антителами была подтверждена с помощью XY-FISH. Перед гибридизацией покровные стекла удаляли, и предметные стекла промывали в PBS в течение 5 мин, а затем их последовательно обезвоживали в 60%, 80% и 99,9% этиловом спирте в течение 3 мин для каждого случая. Для этого анализа использовали специфичный к хромосомному повтору в ДНК зонд DXZ1, СЕР X alpha satellite, меченный спектральным зеленым, и зонд DYZ1, СЕР Y satellite III, меченный спектральным оранжевым (Abbott Molecular). Смеси для гибридизации, содержащие оба зонда, готовили путем смешивании 1 части Х-зонда, 1 части Y-зонда, 1 части дистиллированной воды и 7 частей буфера для гибридизации. Добавляли пятнадцать микролитров смеси для гибридизации, и все накрывали покровным стеклом размером 24x24 мм. Покровное стекло герметизировали каучуковым клеем, и ДНК денатурировали на нагревательной плите при 83,5°С в течение 7 мин, а затем подвергали гибридизации в течение ночи в увлажненной атмосфере при 42°С. Предметные стекла после гибридизации отмывали в течение 2 мин при 73°С в 0,4xSSC с 0,3% Tween 20 и в течение 1 мин при комнатной температуре в 2x SSC с 0,1% Tween 20. Затем предметные стекла помещали в прибор Vectashield с DAPI.
Анализ трисомии 21 хромосомы
В случае беременностей с высоким риском (1:50 или выше), фетальные клетки, окрашенные антителами против цитокератинов, были проанализированы на наличие или отсутствие трисомии 21 хромосомы (синдром Дауна), используя зонд LSI 21, специфичный в отношении 21 хромосомы, меченный спектральным оранжевым (Abbott Molecular). Зонд СЕР X, меченный аква спектральным, использовался вместе зондом LSI 21 в качестве внутреннего контроля. Смеси для гибридизации, содержащие оба зонда, готовили смешиванием 1 части Х-зонда, 1 части зонда LSI 21, 1 части дистиллированной воды и 7 частей буфера для гибридизации.
Перед проведением анализа FISH, покровные стекла удаляли при промывке в течение 10 мин в 2%-ом параформальдегиде (PFA) в PBS. Затем предметные стекла подвергли постфиксированию путем инкубирования в течение 10 мин в 4% PFA, после чего их промывали в PBS в течение 2 мин и обезвоживали в 60%, 80% и 99,9% EtOH в течение 3 мин для каждого случая. После высушивания на открытом воздухе, предметные стекла подвергали предварительной денатурации смесью для гибридизации, которая не содержала зондов, следующим образом. Добавляли смесь для гибридизации в объеме 18 мкл и предметное стекло накрывали покровным стеклом размером 24x24 мм. Стекла помещали на 10 мин на нагревательную плиту с температурой 90°С. Покровные стекла удаляли, предметные стекла отмывали в PBS в течение 5 мин и в 99,9% EtOH на холоду в течение 10 мин. После сушки на открытом воздухе добавляли 18 мкл смеси для гибридизации, содержащей зонд LSI 21 и зонд СЕР X, и предметные стекла накрывали покровным стеклом размером 24x 24 мм. Покровные стекла герметизировали каучуковым клеем, и ДНК денатурировали на нагревательной плите при 90°С в течение 10 мин, а затем подвергали гибридизации в течение ночи в увлажненной атмосфере при 42°С. Предметные стекла после гибридизации отмывали в течение 2 мин при 73°С в 0,4xSSC с 0,3% Tween 20 и в течение 1 мин при комнатной температуре в 2xSSC с 0,1% Tween 20. Затем предметные стекла помещали в прибор Vectashield с DAPI. Оцифровка сигналов FISH в отношение 21 хромосомы 21 в окрашенных фетальных клетках была выполнена с использованием наложения первоначального файла с результатами сканирования. Фиг. 6 показывает случай неинвазивного пренатального диагноза трисомии 21 хромосомы (синдром Дауна).
<120> Обогащение и идентификация фетальных клеток в лиганды
для такого применения
<130> P2746PC00
<150> PA 2010 01018 <151> 2010-11-09
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 3072
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctctacccgg ttggcaggcg gcctggccca gccccttctc taaggaagcg ctccctgggc cggccgggct ggatgagccg ggagctccct gctgccggtc cttcatctgc gccctggggc caggactgct gctgtcactg ccatccattg ccccctcccc gcccatcctt cggacagcaa ctccagccca gccccgcgtc cttctcctga cccctcggcc gccaccccag aaggctggag cagggacgcc ccgcctgctc ccctcgggtc cccgtgcgag cccacgccgg ccccggtgcc cctgccactg gacacaggat aaggcccagc gcacaggccc ccacgtggac gcggcacgct ccctctggct gttgccctgc tgctggccag ctgcagcctc gtcttgcaga aacagtccat tgtgaccttc agcctgtggg ccccgagagg catataccac tagccaggtc tcgaagggct gcgtggctca ggcccccaat aagtccatgt cctcttcctg gagttcccaa cgggcccgtc acagctggag aggcatccaa gcaaaatggc acctggcccc gagaggtgct tctggtcctc gcagtgtctt cctgcatctc caggccctgg gaatcccact gcacttggcc gcctggtcac cttccaagag cccccggggg tcaacaccac agagctgcca agacccagat ccttgagtgg gcagctgaga ggggccccat cacctctgct atgaccccca gagcatcctc ctccgactgg gccaagccca ggggtcactg tgctggaagc cagccaggac atgggccgca cgctcgagtg gcggccgcgt tggtccgggg ctgccacttg gaaggcgtgg ccggccacaa ggaggcgcac tcctgccggg ccactcggcc gggccccgga cggtgacggt gaaggtggaa cacccgggga tctcgatgcc gtcctcatcc tgcagggtcc cccctacgtg
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200
материнской крови и
catttcctgc ataccacagc gagcccagca cctgtgtcca gtcgctccgg cgcccgcagc agcatggacc agccccacaa ggcgaggtga gccatccttg ctgactctcc agtgtaaaca tacaattcca tccttcccca gctgagctga tccttctgca actccagcct atcctgaggg ctgagctgcg tcctggctca
tcgacgccaa ccacaacatg cagatctgga ccactggaga atactccttc aagatctttc 1260
cagagaaaaa cattcgtggc ttcaagctcc cagacacacc tcaaggcctc ctgggggagg 1320
cccggatgct caatgccagc attgtggcat ccttcgtgga gctaccgctg gccagcattg 1380
tctcacttca tgcctccagc tgcggtggta ggctgcagac ctcacccgca ccgatccaga 1440
ccactcctcc caaggacact tgtagcccgg agctgctcat gtccttgatc cagacaaagt 1500
gtgccgacga cgccatgacc ctggtactaa agaaagagct tgttgcgcat ttgaagtgca 1560
ccatcacggg cctgaccttc tgggacccca gctgtgaggc agaggacagg ggtgacaagt 1620
ttgtcttgcg cagtgcttac tccagctgtg gcatgcaggt gtcagcaagt atgatcagca 1680
atgaggcggt ggtcaatatc ctgtcgagct catcaccaca gcggaaaaag gtgcactgcc 1740
tcaacatgga cagcctctct ttccagctgg gcctctacct cagcccacac ttcctccagg 1800
cctccaacac catcgagccg gggcagcaga gctttgtgca ggtcagagtg tccccatccg 1860
tctccgagtt cctgctccag ttagacagct gccacctgga cttggggcct gagggaggca 1920
ccgtggaact catccagggc cgggcggcca agggcaactg tgtgagcctg ctgtccccaa 1980
gccccgaggg tgacccgcgc ttcagcttcc tcctccactt ctacacagta cccataccca 2040
aaaccggcac cctcagctgc acggtagccc tgcgtcccaa gaccgggtct caagaccagg 2100
aagtccatag gactgtcttc atgcgcttga acatcatcag ccctgacctg tctggttgca 2160
caagcaaagg cctcgtcctg cccgccgtgc tgggcatcac ctttggtgcc ttcctcatcg 2220
gggccctgct cactgctgca ctctggtaca tctactcgca cacgcgttcc cccagcaagc 2280
gggagcccgt ggtggcggtg gctgccccgg cctcctcgga gagcagcagc accaaccaca 2340
gcatcgggag cacccagagc accccctgct ccaccagcag catggcatag ccccggcccc 2400
ccgcgctcgc ccagcaggag agactgagca gccgccagct gggagcactg gtgtgaactc 2460
accctgggag ccagtcctcc actcgaccca gaatggagcc tgctctccgc gcctaccctt 2520
cccgcctccc tctcagaggc ctgctgccag tgcagccact ggcttggaac accttggggt 2580
ccctccaccc cacagaacct tcaacccagt gggtctggga tatggctgcc caggagacag 2640
accacttgcc acgctgttgt aaaaacccaa gtccctgtca tttgaacctg gatccagcac 2700
tggtgaactg agctgggcag gaagggagaa cttgaaacag attcaggcca gcccagccag 2760
gccaacagca cctccccgct gggaagagaa gagggcccag cccagagcca cctggatcta 2820
tccctgcggc ctccacacct gaacttgcct aactaactgg caggggagac aggagcctag 2880
cggagcccag cctgggagcc cagagggtgg caagaacagt gggcgttggg agcctagctc 2940
ctgccacatg gagccccctc tgccggtcgg gcagccagca gagggggagt agccaagctg 3000
cttgtcctgg gcctgcccct gtgtattcac caccaataaa tcagaccatg aaaccagtga 3060
aaaaaaaaaa aa 3072
<210> 2 <211> 3196 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 2
ctctacccgg ttggcaggcg gcctggccca gccccttctc taaggaagcg catttcctgc 60
ctccctgggc cggccgggct ggatgagccg ggagctccct gctgccggtc ataccacagc 120
cttcatctgc gccctggggc caggactgct gctgtcactg ccatccattg gagcccagca 180
ccccctcccc gcccatcctt cggacagcaa ctccagccca gccccgcgtc cctgtgtcca 240
cttctcctga cccctcggcc gccaccccag aaggctggag cagggacgcc gtcgctccgg 300
ccgcctgctc ccctcgggtc cccgtgcgag cccacgccgg ccccggtgcc cgcccgcagc 360
cctgccactg gacacaggat aaggcccagc gcacaggccc ccacgtggac agcatggacc 420
gcggcacgct ccctctggct gttgccctgc tgctggccag ctgcagcctc agccccacaa 480
gtcttgcaga aacagtccat tgtgaccttc agcctgtggg ccccgagagg ggcgaggtga 540
catataccac tagccaggtc tcgaagggct gcgtggctca ggcccccaat gccatccttg 600
aagtccatgt cctcttcctg gagttcccaa cgggcccgtc acagctggag ctgactctcc 660
aggcatccaa gcaaaatggc acctggcccc gagaggtgct tctggtcctc agtgtaaaca 720
gcagtgtctt cctgcatctc caggccctgg gaatcccact gcacttggcc tacaattcca 780
gcctggtcac cttccaagag cccccggggg tcaacaccac agagctgcca tccttcccca 840
agacccagat ccttgagtgg gcagctgaga ggggccccat cacctctgct gctgagctga 900
atgaccccca gagcatcctc ctccgactgg gccaagccca ggggtcactg tccttctgca 960
tgctggaagc cagccaggac atgggccgca cgctcgagtg gcggccgcgt actccagcct 1020
tggtccgggg ctgccacttg gaaggcgtgg ccggccacaa ggaggcgcac atcctgaggg 1080
tcctgccggg ccactcggcc gggccccgga cggtgacggt gaaggtggaa ctgagctgcg 1140
cacccgggga tctcgatgcc gtcctcatcc tgcagggtcc cccctacgtg tcctggctca 1200
tcgacgccaa ccacaacatg cagatctgga ccactggaga atactccttc aagatctttc 1260
cagagaaaaa cattcgtggc ttcaagctcc cagacacacc tcaaggcctc ctgggggagg 1320
cccggatgct caatgccagc attgtggcat ccttcgtgga gctaccgctg gccagcattg 1380
tctcacttca tgcctccagc tgcggtggta ggctgcagac ctcacccgca ccgatccaga 1440
ccactcctcc caaggacact tgtagcccgg agctgctcat gtccttgatc cagacaaagt 1500
gtgccgacga cgccatgacc ctggtactaa agaaagagct tgttgcgcat ttgaagtgca 1560
ccatcacggg cctgaccttc tgggacccca gctgtgaggc agaggacagg ggtgacaagt 1620
ttgtcttgcg cagtgcttac tccagctgtg gcatgcaggt gtcagcaagt atgatcagca 1680
atgaggcggt ggtcaatatc ctgtcgagct catcaccaca gcggaaaaag gtgcactgcc 1740
tcaacatgga cagcctctct ttccagctgg gcctctacct cagcccacac ttcctccagg 1800
cctccaacac catcgagccg gggcagcaga gctttgtgca ggtcagagtg tccccatccg 1860
tctccgagtt cctgctccag ttagacagct gccacctgga cttggggcct gagggaggca 1920
ccgtggaact catccagggc cgggcggcca agggcaactg tgtgagcctg ctgtccccaa 1980
gccccgaggg tgacccgcgc ttcagcttcc tcctccactt ctacacagta cccataccca 2040
aaaccggcac cctcagctgc acggtagccc tgcgtcccaa gaccgggtct caagaccagg 2100
aagtccatag gactgtcttc atgcgcttga acatcatcag ccctgacctg tctggttgca 2160
caagcaaagg cctcgtcctg cccgccgtgc tgggcatcac ctttggtgcc ttcctcatcg 2220
gggccctgct cactgctgca ctctggtaca tctactcgca cacgcgtgag taccccaggc 2280
ccccacagtg agcatgccgg gcccctccat ccacccgggg gagcccagtg aagcctctga 2340
gggattgagg ggccctggcc aggaccctga cctccgcccc tgcccccgct cccgctccca 2400
ggttccccca gcaagcggga gcccgtggtg gcggtggctg ccccggcctc ctcggagagc 2460
agcagcacca accacagcat cgggagcacc cagagcaccc cctgctccac cagcagcatg 2520
gcatagcccc ggccccccgc gctcgcccag caggagagac tgagcagccg ccagctggga 2580
gcactggtgt gaactcaccc tgggagccag tcctccactc gacccagaat ggagcctgct 2640
ctccgcgcct acccttcccg cctccctctc agaggcctgc tgccagtgca gccactggct 2700
tggaacacct tggggtccct ccaccccaca gaaccttcaa cccagtgggt ctgggatatg 2760
gctgcccagg agacagacca cttgccacgc tgttgtaaaa acccaagtcc ctgtcatttg 2820
aacctggatc cagcactggt gaactgagct gggcaggaag ggagaacttg aaacagattc 2880
aggccagccc agccaggcca acagcacctc cccgctggga agagaagagg gcccagccca 2940
gagccacctg gatctatccc tgcggcctcc acacctgaac ttgcctaact aactggcagg 3000
ggagacagga gcctagcgga gcccagcctg ggagcccaga gggtggcaag aacagtgggc 3060
gttgggagcc tagctcctgc cacatggagc cccctctgcc ggtcgggcag ccagcagagg 3120
gggagtagcc aagctgcttg tcctgggcct gcccctgtgt attcaccacc aataaatcag 3180
accatgaaac cagtga 3196
<210> 3 <211> 2147 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
actcaccggc ctgggccctg tcacttctct gatagctccc agctcgctct ctgcagccat 60
gattgccaga cagcagtgtg tccgaggcgg gccccggggc ttcagctgtg gctcggccat 120
tgtaggcggt ggcaagagag gtgccttcag ctcagtctcc atgtctggag gtgctggccg 180
atgctcttct gggggatttg gcagcagaag cctctacaac ctcaggggga acaaaagcat 240
ctccatgagt gtggctgggt cacgacaagg tgcctgcttt gggggtgctg gaggctttgg 300
cactggtggc tttggtggtg gatttggggg ctccttcagt ggtaagggtg gccctggctt 360
ccccgtctgc cccgctgggg gaattcagga ggtcaccatc aaccagagct tgctcacccc 420
cctccacgtg gagattgacc ctgagatcca gaaagtccgg acggaagagc gcgaacagat 480
caagctcctc aacaacaagt ttgcctcctt catcgacaag gtgcagttct tagagcaaca 540
gaataaggtc ctggagacca aatggaacct gctccagcag cagacgacca ccacctccag 600
caaaaacctt gagcccctct ttgagaccta cctcagtgtc ctgaggaagc agctagatac 660
cttgggcaat gacaaagggc gcctgcagtc tgagctgaag accatgcagg acagcgtgga 720
ggacttcaag actaagtatg aagaggagat caacaaacgc acagcagccg agaatgactt 780
tgtggtccta aagaaggacg tggatgctgc ctacctgaac aaggtggagt tggaggccaa 840
ggtggacagt cttaatgacg agatcaactt cctgaaggtc ctctatgatg cggagctgtc 900
ccagatgcag acccatgtca gcgacacgtc cgtggtcctt tccatggaca acaaccgcaa 960
cctggacctg gacagcatta ttgccgaggt ccgtgcccag tacgaggaga ttgcccagag 1020
gagcaaggct gaggctgaag ccctgtacca gaccaaggtc cagcagctcc agatctcggt 1080
tgaccaacat ggtgacaacc tgaagaacac caagagtgaa attgcagagc tcaacaggat 1140
gatccagagg ctgcgggcag agatcgagaa catcaagaag cagtgccaga ctcttcaggt 1200
atccgtggct gatgcagagc agcgaggtga gaatgccctt aaagatgccc acagcaagcg 1260
cgtagagctg gaggctgccc tgcagcaggc caaggaggag ctggcacgaa tgctgcgtga 1320
gtaccaggag ctcatgagtg tgaagctggc cttggacatc gagatcgcca cctaccgcaa 1380
actgctggag ggcgaggagt acagaatgtc tggagaatgc cagagtgccg tgagcatctc 1440
tgtggtcagc ggtagcacca gcactggagg catcagcgga ggattaggaa gtggctccgg 1500
gtttggcctg agtagtggct ttggctccgg ctctggaagt ggctttgggt ttggtggcag 1560
tgtctctggc agttccagca gcaagatcat ctctaccacc accctgaaca agagacgata 1620
gaggagacga ggtccctgca gctcactgtg tccagctggg cccagcactg gtgtctctgt 1680
gcttccttca cttcacctcc atcctctgtc tctggggctc atcttactag tatcccctcc 1740
actatcccat gggctctctc tgccccagga tgatcttctg tgctgggaca gggactctgc 1800
ctcttggagt ttggtagcta cttcttgatt tgggcctggt gacccacctg gaatgggaag 1860
gatgtcagct gacctctcac ctcccatgga cagagaagaa aatgaccagg agtgtcatct 1920
ccagaattat tggggtcaca tatgtccctt cccagtccaa tgccatctcc cactagatcc 1980
tgtattatcc atctacatca gaaccaaact acttctccaa cacccggcag cacttggccc
2040
tgcaagctta ggatgagaac cacttagtgt cccattctac tcctctcatt ccctcttatc
2100
catctgcagg tgaatcttca ataaaatgct tttgtcattc attctga
2147
<210> 4 <211> 2320 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
tcgacagctc tctcgcccag cccagttctg gaagggataa aaagggggca tcaccgttcc 60
tgggtaacag agccaccttc tgcgtcctgc tgagctctgt tctctccagc acctcccaac 120
ccactagtgc ctggttctct tgctccacca ggaacaagcc accatgtctc gccagtcaag 180
tgtgtccttc cggagcgggg gcagtcgtag cttcagcacc gcctctgcca tcaccccgtc 240
tgtctcccgc accagcttca cctccgtgtc ccggtccggg ggtggcggtg gtggtggctt 300
cggcagggtc agccttgcgg gtgcttgtgg agtgggtggc tatggcagcc ggagcctcta 360
caacctgggg ggctccaaga ggatatccat cagcactagt ggtggcagct tcaggaaccg 420
gtttggtgct ggtgctggag gcggctatgg ctttggaggt ggtgccggta gtggatttgg 480
tttcggcggt ggagctggtg gtggctttgg gctcggtggc ggagctggct ttggaggtgg 540
cttcggtggc cctggctttc ctgtctgccc tcctggaggt atccaagagg tcactgtcaa 600
ccagagtctc ctgactcccc tcaacctgca aatcgacccc agcatccaga gggtgaggac 660
cgaggagcgc gagcagatca agaccctcaa caataagttt gcctccttca tcgacaaggt 720
gcggttcctg gagcagcaga acaaggttct ggacaccaag tggaccctgc tgcaggagca 780
gggcaccaag actgtgaggc agaacctgga gccgttgttc gagcagtaca tcaacaacct 840
caggaggcag ctggacagca tcgtggggga acggggccgc ctggactcag agctgagaaa 900
catgcaggac ctggtggaag acttcaagaa caagtatgag gatgaaatca acaagcgtac 960
cactgctgag aatgagtttg tgatgctgaa gaaggatgta gatgctgcct acatgaacaa 1020
ggtggagctg gaggccaagg ttgatgcact gatggatgag attaacttca tgaagatgtt 1080
ctttgatgcg gagctgtccc agatgcagac gcatgtctct gacacctcag tggtcctctc 1140
catggacaac aaccgcaacc tggacctgga tagcatcatc gctgaggtca aggcccagta 1200
tgaggagatt gccaaccgca gccggacaga agccgagtcc tggtatcaga ccaagtatga 1260
ggagctgcag cagacagctg gccggcatgg cgatgacctc cgcaacacca agcatgagat 1320
ctctgagatg aaccggatga tccagaggct gagagccgag attgacaatg tcaagaaaca 1380
gtgcgccaat ctgcagaacg ccattgcgga tgccgagcag cgtggggagc tggccctcaa 1440
ggatgccagg aacaagctgg ccgagctgga ggaggccctg cagaaggcca agcaggacat 1500
ggcccggctg ctgcgtgagt accaggagct catgaacacc aagctggccc tggacgtgga 1560
gatcgccact taccgcaagc tgctggaggg cgaggaatgc agactcagtg gagaaggagt 1620
tggaccagtc aacatctctg ttgtcacaag cagtgtttcc tctggatatg gcagtggcag 1680
tggctatggc ggtggcctcg gtggaggtct tggcggcggc ctcggtggag gtcttgccgg 1740
aggtagcagt ggaagctact actccagcag cagtgggggt gtcggcctag gtggtgggct 1800
cagtgtgggg ggctctggct tcagtgcaag cagtggccga gggctggggg tgggctttgg 1860
cagtggcggg ggtagcagct ccagcgtcaa atttgtctcc accacctcct cctcccggaa 1920
gagcttcaag agctaagaac ctgctgcaag tcactgcctt ccaagtgcag caacccagcc 1980
catggagatt gcctcttcta ggcagttgct caagccatgt tttatccttt tctggagagt 2040
agtctagacc aagccaattg cagaaccaca ttctttggtt cccaggagag ccccattccc 2100
agcccctggt ctcccgtgcc gcagttctat attctgcttc aaatcagcct tcaggtttcc 2160
cacagcatgg cccctgctga cacgagaacc caaagttttc ccaaatctaa atcatcaaaa 2220
cagaatcccc accccaatcc caaattttgt tttggttcta actacctcca gaatgtgttc 2280
aataaaatgc ttttataata taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2320
<210> 5 <211> 2450 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 5
atatttcata cctttctaga aactgggtgt gatctcactg ttggtaaagc ccagcccttc 60
ccaacctgca agctcacctt ccaggactgg gcccagccca tgctctccat atataagctg 120
ctgccccgag cctgattcct agtcctgctt ctcttccctc tctcctccag cctctcacac 180
tctcctcagc tctctcatct cctggaacca tggccagcac atccaccacc atcaggagcc 240
acagcagcag ccgccggggt ttcagtgcca actcagccag gctccctggg gtcagccgct 300
ctggcttcag cagcgtctcc gtgtcccgct ccaggggcag tggtggcctg ggtggtgcat 360
gtggaggagc tggctttggc agccgcagtc tgtatggcct ggggggctcc aagaggatct 420
ccattggagg gggcagctgt gccatcagtg gcggctatgg cagcagagcc ggaggcagct 480
atggctttgg tggcgccggg agtggatttg gtttcggtgg tggagccggc attggctttg 540
gtctgggtgg tggagccggc cttgctggtg gctttggggg ccctggcttc cctgtgtgcc 600
cccctggagg catccaagag gtcaccgtca accagagtct cctgactccc ctcaacctgc 660
aaatcgatcc caccatccag cgggtgcggg ctgaggagcg tgaacagatc aagaccctca 720
acaacaagtt tgcctccttc atcgacaagg tgcggttcct ggagcagcag aacaaggttc 780
tggaaacaaa gtggaccctg ctgcaggagc agggcaccaa gactgtgagg cagaacctgg 840
agccgttgtt cgagcagtac atcaacaacc tcaggaggca gctggacagc attgtcgggg 900
aacggggccg cctggactca gagctcagag gcatgcagga cctggtggag gacttcaaga 960
acaaatatga ggatgaaatc aacaagcgca cagcagcaga gaatgaattt gtgactctga 1020
agaaggatgt ggatgctgcc tacatgaaca aggttgaact gcaagccaag gcagacactc 1080
tcacagacga gatcaacttc ctgagagcct tgtatgatgc agagctgtcc cagatgcaga 1140
cccacatctc agacacatct gtggtgctgt ccatggacaa caaccgcaac ctggacctgg 1200
acagcatcat cgctgaggtc aaggcccaat atgaggagat tgctcagaga agccgggctg 1260
aggctgagtc ctggtaccag accaagtacg aggagctgca ggtcacagca ggcagacatg 1320
gggacgacct gcgcaacacc aagcaggaga ttgctgagat caaccgcatg atccagaggc 1380
tgagatctga gatcgaccac gtcaagaagc agtgcgccaa cctgcaggcc gccattgctg 1440
atgctgagca gcgtggggag atggccctca aggatgccaa gaacaagctg gaagggctgg 1500
aggatgccct gcagaaggcc aagcaggacc tggcccggct gctgaaggag taccaggagc 1560
tgatgaatgt caagctggcc ctggacgtgg agatcgccac ctaccgcaag ctgctggagg 1620
gtgaggagtg caggctgaat ggcgaaggcg ttggacaagt caacatctct gtggtgcagt 1680
ccaccgtctc cagtggctat ggcggtgcca gtggtgtcgg cagtggctta ggcctgggtg 174 0
gaggaagcag ctactcctat ggcagtggtc ttggcgttgg aggtggcttc agttccagca 1800
gtggcagagc cattgggggt ggcctcagct ctgttggagg cggcagttcc accatcaagt 1860
acaccaccac ctcctcctcc agcaggaaga gctataagca ctaaagtgcg tctgctagct 1920
ctcggtccca cagtcctcag gcccctctct ggctgcagag ccctctcctc aggttgcctt 1980
tcctctcctg gcctccagtc tcccctgctg tcccaggtag agctgggtat ggatgcttag 2040
tgccctcact tcttctctct ctctctatac catctgagca cccattgctc accatcagat 2100
caacctctga ttttacatca tgatgtaatc accactggag cttcactgtt actaaattat 2160
taatttcttg cctccagtgt tctatctctg aggctgagca ttataagaaa atgacctctg 2220
ctccttttca ttgcagaaaa ttgccagggg cttatttcag aacaacttcc acttactttc 2280
cactggctct caaactctct aacttataag tgttgtgaac ccccacccag gcagtatcca 2340
tgaaagcaca agtgactagt cctatgatgt acaaagcctg tatctctgtg atgatttctg 2400
tgctcttcgc tgtttgcaat tgctaaataa agcagattta taatacaata 2450
<210> 6
<211> 2331
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 6
cgcctccagc ctctcacact ctcctaagcc ctctcatctc ctggaaccat ggccagcaca 60
tccaccacca tcaggagcca cagcagcagc cgccggggtt tcagtgccaa ctcagccagg 120
ctccctgggg tcagccgctc tggcttcagc agcatctccg tgtcccgctc caggggcagt 180
ggtggcctgg gtggcgcatg tggaggagct ggctttggca gccgcagtct gtatggcctg 240
gggggctcca agaggatctc cattggaggg ggcagctgtg ccatcagtgg cggctatggc 300
agcagagccg gaggcagcta tggctttggt ggcgccggga gtggatttgg tttcggtggt 360
ggagccggca ttggctttgg tctgggtggt ggagccggcc ttgctggtgg ctttgggggc 420
cctggcttcc ctgtgtgccc ccctggaggc atccaagagg tcactgtcaa ccagagtctc 480
ctgactcccc tcaacctgca aattgacccc gccatccagc gggtgcgggc cgaggagcgt 540
gagcagatca agaccctcaa caacaagttt gcctccttca tcgacaaggt gcggttccta 600
gagcagcaga acaaggttct ggacaccaag tggaccctgc tgcaggagca gggcaccaag 660
actgtgaggc agaacctgga gccgttgttc gagcagtaca tcaacaacct caggaggcag 720
ctggacaaca tcgtggggga acggggtcgt ctggactcgg agctgagaaa catgcaggac 780
ctggtggagg acctcaagaa caaatatgag gatgaaatca acaagcgcac agcagcagag 840
aatgaatttg tgactctgaa gaaggatgtg gatgctgcct acatgaacaa ggttgaactg 900
caagccaagg cagacactct tacagatgag atcaacttcc tgagagcctt gtatgatgca 960
gagctgtccc agatgcagac ccacatctca gacacatccg tggtgctatc catggacaac 1020
aaccgcaacc tggacctgga cagcatcatc gctgaggtca aggcccaata tgaggagatt 1080
gctcagagga gcagggctga ggctgagtcc tggtaccaga caaagtacga ggagctgcag 1140
atcacagcag gcagacatgg ggacgacctg cgcaacacca agcaggagat tgctgagatc 1200
aaccgcatga tccagaggct gagatctgag atcgaccacg tcaagaagca gtgtgccaac 1260
ctacaggccg ccattgctga tgctgagcag cgtggggaga tggccctcaa ggatgctaag 1320
aacaagctgg aagggctgga ggatgccctg cagaaggcca agcaggacct ggcccggctg 1380
ctgaaggagt accaggagct gatgaacgtc aagctggccc tggatgtgga gatcgccacc 1440
taccgcaagc tgctggaggg cgaggagtgc aggctgaatg gcgaaggcgt tggacaagtc 1500
aacatctctg tagtgcagtc caccgtctcc agtggctatg gcggtgccag cggtgtcggc 1560
agtggcttag gcctgggtgg aggaagcagc tactcctatg gcagtggtct tggcgttgga 1620
ggcggcttta gttccagcag cggcagagcc actgggggtg gcctcagctc tgttggaggc 1680
ggcagttcca ccatcaagta caccaccacc tcctcctcca gcaggaagag ctacaagcac 1740
tgaagtgctg ccgccagctc tcagtcccac agctctcagg cccctctctg gcagcagagc 1800
cctctcctca ggttgcttgt cctcccctgg cctccagtct cccctgccct cccgggtaga 1860
gctgggatgc cctcactttt cttctcatca atacctgttc cactgagctc ctgttgctta 1920
ccatcaagtc aacagttatc agcactcaga catgcgaatg tcctttttag ttcccgtatt 1980
attacaggta tctgagtctg ccataattct gagaagaaaa tgacctatat ccccataaga
2040
actgaaactc agtctaggtc cagctgcaga tgaggagtcc tctctttaat tgctaaccat
2100
cctgcccatt atagctacac tcaggagttc tcatctgaca agtcagttgt cctgatcttc
2160
tcttgcagtg tccctgaatg gcaagtgatg taccttctga tgcagtctgc attcctgcac
2220
tgctttctct gctctctttg ccttcttttg ttctgttgaa taaagcatat tgagaatgtg
2280
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
2331
<210> 7 <211> 1753 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 7
cagccccgcc cctacctgtg gaagcccagc cgcccgctcc cgcggataaa aggcgcggag 60
tgtccccgag gtcagcgagt gcgcgctcct cctcgcccgc cgctaggtcc atcccggccc 120
agccaccatg tccatccact tcagctcccc ggtattcacc tcgcgctcag ccgccttctc 180
gggccgcggc gcccaggtgc gcctgagctc cgctcgcccc ggcggccttg gcagcagcag 240
cctctacggc ctcggcgcct cacggccgcg cgtggccgtg cgctctgcct atgggggccc 300
ggtgggcgcc ggcatccgcg aggtcaccat taaccagagc ctgctggccc cgctgcggct 360
ggacgccgac ccctccctcc agcgggtgcg ccaggaggag agcgagcaga tcaagaccct 420
caacaacaag tttgcctcct tcatcgacaa ggtgcggttt ctggagcagc agaacaagct 480
gctggagacc aagtggacgc tgctgcagga gcagaagtcg gccaagagca gccgcctccc 540
agacatcttt gaggcccaga ttgctggcct tcggggtcag cttgaggcac tgcaggtgga 600
tgggggccgc ctggaggcgg agctgcggag catgcaggat gtggtggagg acttcaagaa 660
taagtacgaa gatgaaatta accaccgcac agctgctgag aatgagtttg tggtgctgaa 720
gaaggatgtg gatgctgcct acatgagcaa ggtggagctg gaggccaagg tggatgccct 780
gaatgatgag atcaacttcc tcaggaccct caatgagacg gagttgacag agctgcagtc 840
ccagatctcc gacacatctg tggtgctgtc catggacaac agtcgctccc tggacctgga 900
cggcatcatc gctgaggtca aggcgcagta tgaggagatg gccaaatgca gccgggctga 960
ggctgaagcc tggtaccaga ccaagtttga gaccctccag gcccaggctg ggaagcatgg 1020
ggacgacctc cggaataccc ggaatgagat ttcagagatg aaccgggcca tccagaggct 1080
gcaggctgag atcgacaaca tcaagaacca gcgtgccaag ttggaggccg ccattgccga 1140
ggctgaggag cgtggggagc tggcgctcaa ggatgctcgt gccaagcagg aggagctgga 1200
agccgccctg cagcggggca agcaggatat ggcacggcag ctgcgtgagt accaggaact 1260
catgagcgtg aagctggccc tggacatcga gatcgccacc taccgcaagc tgctggaggg 1320
cgaggagagc cggttggctg gagatggagt gggagccgtg aatatctctg tgatgaattc
1380
cactggtggc agtagcagtg gcggtggcat tgggctgacc ctcgggggaa ccatgggcag
1440
caatgccctg agcttctcca gcagtgcggg tcctgggctc ctgaaggctt attccatccg
1500
gaccgcatcc gccagtcgca ggagtgcccg cgactgagcc gcctcccacc actccactcc
1560
tccagccacc acccacaatc acaagaagat tcccacccct gcctcccatg cctggtccca
1620
agacagtgag acagtctgga aagtgatgtc agaatagctt ccaataaagc agcctcattc
1680
tgaggcctga gtgatccacg tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
1740
aaaaaaaaaa aaa
1753
<210> 8 <211> 1802 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 8
aaaaggccat tcctgagagc tctcctcacc aagaagcagc ttctccgctc cttctaggat 60
ctccgcctgg ttcggcccgc ctgcctccac tcctgcctct accatgtcca tcagggtgac 120
ccagaagtcc tacaaggtgt ccacctctgg cccccgggcc ttcagcagcc gctcctacac 180
gagtgggccc ggttcccgca tcagctcctc gagcttctcc cgagtgggca gcagcaactt 240
tcgcggtggc ctgggcggcg gctatggtgg ggccagcggc atgggaggca tcaccgcagt 300
tacggtcaac cagagcctgc tgagccccct tgtcctggag gtggacccca acatccaggc 360
cgtgcgcacc caggagaagg agcagatcaa gaccctcaac aacaagtttg cctccttcat 420
agacaaggta cggttcctgg agcagcagaa caagatgctg gagaccaagt ggagcctcct 480
gcagcagcag aagacggctc gaagcaacat ggacaacatg ttcgagagct acatcaacaa 540
ccttaggcgg cagctggaga ctctgggcca ggagaagctg aagctggagg cggagcttgg 600
caacatgcag gggctggtgg aggacttcaa gaacaagtat gaggatgaga tcaataagcg 660
tacagagatg gagaacgaat ttgtcctcat caagaaggat gtggatgaag cttacatgaa 720
caaggtagag ctggagtctc gcctggaagg gctgaccgac gagatcaact tcctcaggca 780
gctatatgaa gaggagatcc gggagctgca gtcccagatc tcggacacat ctgtggtgct 840
gtccatggac aacagccgct ccctggacat ggacagcatc attgctgagg tcaaggcaca 900
gtacgaggat attgccaacc gcagccgggc tgaggctgag agcatgtacc agatcaagta 960
tgaggagctg cagagcctgg ctgggaagca cggggatgac ctgcggcgca caaagactga 1020
gatctctgag atgaaccgga acatcagccg gctccaggct gagattgagg gcctcaaagg 1080
ccagagggct tccctggagg ccgccattgc agatgccgag cagcgtggag agctggccat 1140
taaggatgcc aacgccaagt tgtccgagct ggaggccgcc ctgcagcggg ccaagcagga 1200
catggcgcgg cagctgcgtg agtaccagga gctgatgaac gtcaagctgg ccctggacat 1260
cgagatcgcc acctacagga agctgctgga gggcgaggag agccggctgg agtctgggat 1320
gcagaacatg agtattcata cgaagaccac cagcggctat gcaggtggtc tgagctcggc 1380
ctatgggggc ctcacaagcc ccggcctcag ctacagcctg ggctccagct ttggctctgg 1440
cgcgggctcc agctccttca gccgcaccag ctcctccagg gccgtggttg tgaagaagat 1500
cgagacacgt gatgggaagc tggtgtctga gtcctctgac gtcctgccca agtgaacagc 1560
tgcggcagcc cctcccagcc tacccctcct gcgctgcccc agagcctggg aaggaggccg 1620
ctatgcaggg tagcactggg aacaggagac ccacctgagg ctcagcccta gccctcagcc 1680
cacctgggga gtttactacc tggggacccc ccttgcccat gcctccagct acaaaacaat 1740
tcaattgctt tttttttttg gtccaaaata aaacctcagc tagctctgcc aatgtcaaaa 1800
aa 1802
<210> 9 <211> 2162 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 9
cactccctgg gctaaacagc atcaccatgt ctgttcgata cagctcaagc aagcactact 60
cttcctcccg cagtggagga ggaggaggag gaggaggatg tggaggagga ggaggagtgt 120
catccctaag aatttctagc agcaaaggct cccttggtgg aggatttagc tcaggggggt 180
tcagtggtgg ctcttttagc cgtgggagct ctggtggggg ctgctttggg ggctcatcag 240
gtggctatgg aggattagga ggttttggtg gaggtagctt tcgtggaagc tatggaagta 300
gcagctttgg tgggagttat ggaggcagct ttggaggggg cagtttcgga ggtggcagct 360
ttggtggggg cagctttggt ggaggcggct ttggtggagg cggctttgga ggaggctttg 420
gtggtggatt tggaggagat ggtggccttc tctctggaaa tgaaaaagta accatgcaga 480
atctgaatga ccgcctggct tcctacttgg acaaagttcg ggctctggaa gaatcaaact 540
atgagctgga aggcaaaatc aaggagtggt atgaaaagca tggcaactca catcaggggg 600
agcctcgtga ctacagcaaa tactacaaaa ccatcgatga ccttaaaaat cagattctca 660
acctaacaac tgataatgcc aacatcctgc ttcagatcga caatgccagg ctggcagctg 720
atgacttcag gctgaagtat gagaatgagg tagctctgcg ccagagcgtg gaggctgaca 780
tcaacggcct gcgtagggtg ctggatgagc tgaccctgac caaggctgac ctggagatgc 840
aaattgagag cctgactgaa gagctggcct atctgaagaa gaaccacgag gaggaaatga 900
aagaccttcg aaatgtgtcc actggtgatg tgaatgtgga aatgaatgct gccccgggtg 960
ttgatctgac tcaacttctg aataacatga gaagccaata tgaacaactt gctgaacaaa 1020
accgcaaaga tgctgaagcc tggttcaatg aaaagagcaa ggaactgact acagaaattg 1080
ataataacat tgaacagata tccagctata aatctgagat tactgaattg agacgtaatg 1140
tacaagctct ggagatagaa ctacagtccc aactggcctt gaaacaatcc ctggaagcct 1200
ccttggcaga aacagaaggt cgctactgtg tgcagctctc acagattcag gcccagatat 1260
ccgctctgga agaacagttg caacagattc gagctgaaac cgagtgccag aatactgaat 1320
accaacaact cctggatatt aagatccgac tggagaatga aattcaaacc taccgcagcc 1380
tgctagaagg agagggaagt tccggaggcg gcggacgcgg cggcggaagt ttcggcggcg 1440
gctacggcgg cggaagctcc ggcggcggaa gctccggcgg cggccacggc ggcggccacg 1500
gcggcagttc cggcggcggc tacggaggcg gaagctccgg cggcggaagc tccggcggcg 1560
gctacggggg cggaagctcc agcggcggcc acggcggcag ttccagcggc ggctacggtg 1620
gtggcagttc cggcggcggc ggcggcggct acgggggcgg cagctccggc ggcggcagca 1680
gctccggcgg cggatacggc ggcggcagct ccagcggagg ccacaagtcc tcctcttccg 1740
ggtccgtggg cgagtcttca tctaagggac caagatacta acaaaaccag agtaatcaag 1800
acaattattg aagaggtggc gcccgacggt agagttcttt catctatggt tgaatcagaa 1860
accaagaaac actactatta aactgcatca agaggaaaga gtctcccttc acacagacca 1920
ttatttacag atgcatggaa aacaaagtct ccaagaaaac acttctgtct tgatggtcta 1980
tggaaataga ccttgaaaat aaggtgtcta caaggtgttt tgtggtttct gtatttcttc 2040
ttttcacttt accagaaagt gttctttaat ggaaagaaaa acaactttct gttctcattt 2100
actaatgaat ttcaataaac tttcttactg atgcaaacta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160
aa 2162
<210> 10 <211> 1719 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 10
cacagtcctc ggcccaggcc aagcaagctt ctatctgcac ctgctctcaa tcctgctctc 60
accatgagcc tccgcctgca gagctcctct gccagctatg gaggtggttt cgggggtggc 120
tcttgccagc tgggaggagg ccgtggtgtc tctacctgtt caactcggtt tgtgtctggg 180
ggatcagctg ggggctatgg aggcggcgtg agctgtggtt ttggtggagg ggctggtagt 240
ggctttggag gtggctatgg aggtggcctt ggaggtggct atggaggtgg ccttggaggt 300
ggctttggtg ggggttttgc tggtggcttt gttgactttg gtgcttgtga tggcggcctc 360
ctcactggca atgagaagat caccatgcag aacctcaacg accgcctggc ttcctacctg 420
gagaaggtgc gcgccctgga ggaggccaac gctgacctgg aggtgaagat ccgtgactgg 480
cacctgaagc agagcccagc tagccctgag cgggactaca gcccctacta caagaccatt 540
gaagagctcc gggacaagat cctgaccgcc accattgaaa acaaccgggt catcctggag 600
attgacaatg ccaggctggc tgcggacgac ttcaggctca agtatgagaa tgagctggcc 660
ctgcgccaga gcgtggaggc cgacatcaac ggcctgcgcc gggtgctgga tgagctcact 720
ctgtctaaga ctgacctgga gatgcagatc gagagcctga atgaagagct agcctacatg 780
aagaagaacc atgaagagga gatgaaggaa tttagcaacc aggtggtcgg ccaggtcaac 84 0
gtggagatgg atgccacccc aggcattgac ctgacccgcg tgctggcaga gatgagggag 900
cagtacgagg ccatggcaga gaggaaccgc cgggatgctg aggaatggtt ccacgccaag 960
agtgcagagc tgaacaagga ggtgtctacc aacactgcca tgattcagac cagcaagaca 1020
gagatcacgg agctcaggcg cacgctccaa ggcctggaga ttgagctgca gtcccagctg 1080
agcatgaaag cggggctgga gaacacggtg gcagagacgg agtgccgcta tgccctgcag 1140
ctgcagcaga tccagggact catcagcagc atcgaggccc agctgagcga gctccgcagt 1200
gagatggagt gccagaacca agagtacaag atgctgctgg acatcaagac acgtctggag 1260
caggagatcg ccacctaccg cagcctgctc gagggccagg acgccaagat gattggtttc 1320
ccttcctcag caggaagcgt cagcccccgt agcacctctg ttaccacgac ttctagtgcc 1380
tctgttacca ccacctctaa tgcctctggt cgccgcactt ctgatgtccg taggccttaa 1440
atctgcctgg cgtcccctcc ctctgtcttc agcacccaga ggaggagaga gccggcagtt 1500
ccctgcagga gagaggaggg gctgctggac ccaaggctca gtccctctgc tctcaggacc 1560
ccctgtcctg actctctcct gatggtgggc cctctgtgct cttctcttcc ggtcggatct 1620
ctctcctctc tgacctggat acgctttggt ttctcaactt ctctacccca aagaaaagat 1680
tattcaataa agtttcctgc ctttctgcaa acataaaaa 1719
<210> 11 <211> 1693
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 11
cacagtcctc ggcccaggcc aagcaagctt ctatctgcac ctgctctcaa tcctgctctc 60
accatgagcc tccgcctgca gagctcctct gccagctatg gaggtggttt cgggggtggc 120
tcttgccagc tgggaggagg ccgtggtgtc tctacctgtt caactcggtt tgtgtctggg 180
ggatcagctg ggggctatgg aggcggcgtg agctgtggtt ttggtggagg ggctggtagt 240
ggctttggag gtggctatgg aggtggcctt ggaggtggct atggaggtgg ccttggaggt 300
ggctttggtg ggggttttgc tggtggcttt gttgactttg gtgcttgtga tggcggcctc 360
ctcactggca atgagaagat caccatgcag aacctcaacg accgcctggc ttcctacctg 420
gagaaggtgc gcgccctgga ggaggccaac gctgacctgg aggtgaagat ccgtgactgg 480
cacctgaagc agagcccagc tagccctgag cgggactaca gcccctacta caagaccatt 540
gaagagctcc gggacaagat cctgaccgcc accattgaaa acaaccgggt catcctggag 600
attgacaatg ccaggctggc tgcggacgac ttcaggctca agtatgagaa tgagctggcc 660
ctgcgccaga gcgtggaggc cgacatcaac ggcctgcgcc gggtgctgga tgagctcact 720
ctgtctaaga ctgacctgga gatgcagatc gagagcctga atgaagagct agcctacatg 780
aagaagaacc atgaagagga gatgaaggaa tttagcaacc aggtggtcgg ccaggtcaac 840
gtggagatgg atgccacccc aggcattgac ctgacccgcg tgctggcaga gatgagggag 900
cagtacgagg ccatggcaga gaggaaccgc cgggatgctg aggaatggtt ccacgccaag 960
agtgcagagc tgaacaagga ggtgtctacc aacactgcca tgattcagac cagcaagaca 1020
gagatcacgg agctcaggcg cacgctccaa ggcctggaga ttgagctgca gtcccagctg 1080
agcatgaaag cggggctgga gaacacggtg gcagagacgg agtgccgcta tgccctgcag 1140
ctgcagcaga tccagggact catcagcagc atcgaggccc agctgagcga gctccgcagt 1200
gagatggagt gccagaacca agagtacaag atgctgctgg acatcaagac acgtctggag 1260
caggagatcg ccacctaccg cagcctgctc gagggccagg acgccaagaa gcgtcagccc 1320
ccgtagcacc tctgttacca cgacttctag tgcctctgtt accaccacct ctaatgcctc 1380
tggtcgccgc acttctgatg tccgtaggcc ttaaatctgc ctggcgtccc ctccctctgt 1440
cttcagcacc cagaggagga gagagccggc agttccctgc aggagagagg aggggctgct 1500
ggacccaagg ctcagtccct ctgctctcag gaccccctgt cctgactctc tcctgatggt 1560
gggccctctg tgctcttctc ttccggtcgg atctctctcc tctctgacct ggatacgctt 1620
tggtttctca acttctctac cccaaagaaa agattattca ataaagtttc ctgcctttct 1680
gcaaacataa aaa 1693
<210> 12 <211> 1485 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 12
tccggggcgg gggcggggcc tcactctgcg atataactcg ggtcgcgcgg ctcgcgcagg 60
ccgccaccgt cgtccgcaaa gcctgagtcc tgtcctttct ctctccccgg acagcatgag 120
cttcaccact cgctccacct tctccaccaa ctaccggtcc ctgggctctg tccaggcgcc 180
cagctacggc gcccggccgg tcagcagcgc ggccagcgtc tatgcaggcg ctgggggctc 240
tggttcccgg atctccgtgt cccgctccac cagcttcagg ggcggcatgg ggtccggggg 300
cctggccacc gggatagccg ggggtctggc aggaatggga ggcatccaga acgagaagga 360
gaccatgcaa agcctgaacg accgcctggc ctcttacctg gacagagtga ggagcctgga 420
gaccgagaac cggaggctgg agagcaaaat ccgggagcac ttggagaaga agggacccca 480
ggtcagagac tggagccatt acttcaagat catcgaggac ctgagggctc agatcttcgc 540
aaatactgtg gacaatgccc gcatcgttct gcagattgac aatgcccgtc ttgctgctga 600
tgactttaga gtcaagtatg agacagagct ggccatgcgc cagtctgtgg agaacgacat 660
ccatgggctc cgcaaggtca ttgatgacac caatatcaca cgactgcagc tggagacaga 720
gatcgaggct ctcaaggagg agctgctctt catgaagaag aaccacgaag aggaagtaaa 780
aggcctacaa gcccagattg ccagctctgg gttgaccgtg gaggtagatg cccccaaatc 840
tcaggacctc gccaagatca tggcagacat ccgggcccaa tatgacgagc tggctcggaa 900
gaaccgagag gagctagaca agtactggtc tcagcagatt gaggagagca ccacagtggt 960
caccacacag tctgctgagg ttggagctgc tgagacgacg ctcacagagc tgagacgtac 1020
agtccagtcc ttggagatcg acctggactc catgagaaat ctgaaggcca gcttggagaa 1080
cagcctgagg gaggtggagg cccgctacgc cctacagatg gagcagctca acgggatcct 1140
gctgcacctt gagtcagagc tggcacagac ccgggcagag ggacagcgcc aggcccagga 1200
gtatgaggcc ctgctgaaca tcaaggtcaa gctggaggct gagatcgcca cctaccgccg 1260
cctgctggaa gatggcgagg actttaatct tggtgatgcc ttggacagca gcaactccat 1320
gcaaaccatc caaaagacca ccacccgccg gatagtggat ggcaaagtgg tgtctgagac 1380
caatgacacc aaagttctga ggcattaagc cagcagaagc agggtaccct ttggggagca 1440
ggaggccaat aaaaagttca gagttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1485
<210> 13 <211> 1439 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 13
gcagcctcga gggccaacaa cacctgctgt ccgtgtccat gcccggttgg ccaccccgtt 60
tctgggggca tgagcttcac cactcgctcc accttctcca ccaactaccg gtccctgggc 120
tctgtccagg cgcccagcta cggcgcccgg ccggtcagca gcgcggccag cgtctatgca 180
ggcgctgggg gctctggttc ccggatctcc gtgtcccgct ccaccagctt caggggcggc 240
atggggtccg ggggcctggc caccgggata gccgggggtc tggcaggaat gggaggcatc 300
cagaacgaga aggagaccat gcaaagcctg aacgaccgcc tggcctctta cctggacaga 360
gtgaggagcc tggagaccga gaaccggagg ctggagagca aaatccggga gcacttggag 420
aagaagggac cccaggtcag agactggagc cattacttca agatcatcga ggacctgagg 480
gctcagatct tcgcaaatac tgtggacaat gcccgcatcg ttctgcagat tgacaatgcc 540
cgtcttgctg
ctgatgactt
tagagtcaag
tatgagacag
agctggccat
gcgccagtct
600
gtggagaacg
acatccatgg
gctccgcaag
gtcattgatg
acaccaatat
cacacgactg
660
cagctggaga
cagagatcga
ggctctcaag
gaggagctgc
tcttcatgaa
gaagaaccac
720
gaagaggaag
taaaaggcct
acaagcccag
attgccagct
ctgggttgac
cgtggaggta
780
gatgccccca
aatctcagga
cctcgccaag
atcatggcag
acatccgggc
ccaatatgac
840
gagctggctc
ggaagaaccg
agaggagcta
gacaagtact
ggtctcagca
gattgaggag
900
agcaccacag
tggtcaccac
acagtctgct
gaggttggag
ctgctgagac
gacgctcaca
960
gagctgagac
gtacagtcca
gtccttggag
atcgacctgg
actccatgag
aaatctgaag
1020
gccagcttgg
agaacagcct
gagggaggtg
gaggcccgct
acgccctaca
gatggagcag
1080
ctcaacggga
tcctgctgca
ccttgagtca
gagctggcac
agacccgggc
agagggacag
1140
cgccaggccc
aggagtatga
ggccctgctg
aacatcaagg
tcaagctgga
ggctgagatc
1200
gccacctacc
gccgcctgct
ggaagatggc
gaggacttta
atcttggtga
tgccttggac
1260
agcagcaact
ccatgcaaac
catccaaaag
accaccaccc
gccggatagt
ggatggcaaa
1320
gtggtgtctg
agaccaatga
caccaaagtt
ctgaggcatt
aagccagcag
aagcagggta
1380
ccctttgggg
agcaggaggc
caataaaaag
ttcagagttc
aaaaaaaaaa
aaaaaaaaa
1439
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии:
a) получение пробы материнской крови или ее фракции;
b) пермеабилизация клеток материнской крови;
c) контактирование пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с ли-гандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и
d) отбор клеток, которые связываются с указанным зондом или лигандом эндотелиального клеточного маркера, обогащая таким образом пробу клетками с эндотелиальным фенотипом;
e) контактирование клеток, выбранных на стадии d), проявляющих эндотелиальный фенотип, с гиб-ридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер;
f) обнаружение клеток с эндотелиальным фенотипом, которые также связываются с указанным зондом или лигандом указанного эпителиального клеточного маркера со стадии е),
где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.
2. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии:
a) получение пробы материнской крови или ее фракции;
b) пермеабилизация клеток материнской крови;
c) контактирование пробы с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лиган-дом, направленным на эпителиальный клеточный маркер;
d) отбор клеток, которые связываются с указанным зондом или лигандом эпителиального клеточно-
го маркера, обогащая таким образом пробу клетками с эпителиальным фенотипом;
e) контактирование клеток, выбранных на стадии d), проявляющих эпителиальный фенотип, с гиб-ридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиаль-ный клеточный маркер; и
f) обнаружение клеток с эпителиальным фенотипом, которые также связываются с указанным зондом или лигандом указанного эндотелиального клеточного маркера со стадии е), где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный
маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13,
CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.
3. Способ выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, включающий следующие стадии:
a) получение пробы материнской крови или ее фракции;
b) пермеабилизация клеток материнской крови;
c) контактирование пробы с:
i) с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эндотелиальный клеточный маркер; и
ii) с гибридизационным зондом, включающим по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или с лигандом, направленным на эпителиальный клеточный маркер;
d) отбор клеток, которые связываются с:
i) указанным зондом или лигандом эндотелиального клеточного маркера и
ii) указанным зондом или лигандом указанного эпителиального клеточного маркера,
обогащая таким образом пробу клетками, как с эндотелиальным, так и с эпителиальным фенотипом, где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором мишень эндотелиального маркера располагается на поверхности идентифицируемой клетки.
5. Способ по любому из пп.1-3, в котором мишень эпителиального маркера располагается внутри идентифицируемой клетки.
6. Способ по любому из пп.1-2, который дополнительно включает стадию диагностирования генетического содержания клеток, обнаруженных на стадии f).
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором проба материнской крови представляет собой цельную кровь.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клетки в пробе подвергают стадии фиксирования после стадии d).
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эндотелиальный клеточный маркер представляет собой CD105.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK8, CK18, CK19 или CK7.
12. Набор для выделения фетальной клетки с эндотелиальными и эпителиальными свойствами из пробы материнской крови, где указанный набор включает:
i) гибридизационный зонд, включающий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эпителиальный клеточный маркер, или
ii) лиганд, направленный на эпителиальный клеточный маркер;
i) гибридизационный зонд, включающий по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов, комплементарных гену, кодирующему эндотелиальный клеточный маркер, или
ii) лиганд, направленный на эндотелиальный клеточный маркер; и
с) инструкции по применению, где эндотелиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CD105, CD146 или CD141, виментина, VCAM, ICAM, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, ITGA5, ITGB5, CDH11 или CDH3, эпителиальный клеточный маркер выбран из группы, состоящей из CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7, CK8, CK9, CK10, CK13, CK14, CK15, CK16, CK17, CK18 или CK19.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
(19)
(19)
(19)
027314
027314
- 4 -
- 1 -
027314
027314
- 23 -
027314
027314
- 26 -
- 26 -
027314
027314
- 28 -
027314
027314
027314
027314
- 35 -
- 35 -
027314
027314
- 42 -
- 42 -
027314
027314
- 44 -
- 44 -