|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Соединение формулы  где R представляет собой H или F; или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение или соль по п.1, представляющее собой  3. Соединение или соль по любому из пп.1 или 2, представляющее собой  4. Соединение по п.3, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензойную кислоту  или ее фармацевтически приемлемую соль. 5. Соединение по п.4, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензойную кислоту  6. Соединение по п.3, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-фторфенокси)этил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензойную кислоту  или ее фармацевтически приемлемую соль. 7. Способ лечения остеоартрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1. 8. Способ лечения ревматоидного артрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1. 9. Способ лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1. 10. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 в терапии воспалительных заболеваний. 11. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения остеоартрита. 12. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения ревматоидного артрита. 13. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом. 14. Фармацевтическая композиция, имеющая активность селективного антагониста EP4, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по пп.1-6 с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Соединение формулы где R представляет собой H или F; или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение или соль по п.1, представляющее собой 3. Соединение или соль по любому из пп.1 или 2, представляющее собой 4. Соединение по п.3, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензойную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль. 5. Соединение по п.4, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензойную кислоту 6. Соединение по п.3, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-фторфенокси)этил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензойную кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль. 7. Способ лечения остеоартрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1. 8. Способ лечения ревматоидного артрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1. 9. Способ лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1. 10. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 в терапии воспалительных заболеваний. 11. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения остеоартрита. 12. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения ревматоидного артрита. 13. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом. 14. Фармацевтическая композиция, имеющая активность селективного антагониста EP4, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по пп.1-6 с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.
Евразийское 027306 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201591915
(22) Дата подачи заявки 2014.05.09
(51) Int. Cl.
C07D 217/26 (2006.01) A61K31/472 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01)
(54) СОЕДИНЕНИЯ ФЕНОКСИЭТИЛ ДИГИДРО-1И-ИЗОХИНОЛИНА В КАЧЕСТВЕ СЕЛЕКТИВНЫХ АНТАГОНИСТОВ ЕР4
(31) 61/824,436
(32) 2013.05.17
(33) US
(43) 2016.04.29
(86) PCT/US2014/037416
(87) WO 2014/186218 2014.11.20
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US)
(72) Изобретатель:
Йорк Джереми Шуленбург (US)
(74) Представитель:
Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Дементьев В.Н., Глухарёва А.О., Карпенко О.Ю., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(56) WO-A1-2013004290 WO-A2-03041641 WO-A1-2014004229
(57) В изобретении предложено соединение формулы I
где R представляет собой H или F; или его фармацевтически приемлемая соль.
Настоящее изобретение относится к новым соединениям феноксиэтил дигидро-Ш-изохинолина, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, к способам применения указанных соединений для лечения физиологических нарушений и к промежуточным веществам и процессам, полезным при синтезе указанных соединений.
Настоящее изобретение относится к области лечения воспалительных заболеваний, таких как артрит, включая остеоартрит и ревматоидный артрит, и дополнительно включает боль, связанную с указанными состояниями. Артрит поражает миллионы людей только в США, и он является главной причиной нарушения здоровья. Кроме того, было признано, что артрит является значимой причиной нарушения здоровья у домашних животных. Методы лечения часто включают НПВС (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства) или ингибиторы ЦОГ-2, которые могут вызвать у пациентов нежелательные побочные эффекты со стороны сердечно-сосудистой системы и/или желудочно-кишечного тракта. В связи с этим, некоторым пациентам может быть противопоказано применение НПВС или ингибиторов ЦОГ-2. Таким образом, существует потребность в альтернативном лечении остеоартрита и ревматоидного артрита предпочтительно без побочных эффектов существующих методов лечения.
Четыре подтипа рецепторов простагландина E2 (ПГЕ2) были обозначены следующим образом: EP1, EP2, EP3 и EP4. Было обнаружено, что EP4 является главным рецептором, задействованным в возникновении боли воспалительного характера в суставах в моделях ревматоидного артрита и остеоартрита у грызунов. Следовательно, для лечения артрита, включая боль при артрите, может быть полезен селективный антагонист EP4. Кроме того, было высказано предположение, что, поскольку антагонизм EP4 не влияет на биосинтез простаноидов, таких как PGI2 и TxA2, для селективного антагониста EP4 могут быть не характерны возможные побочные эффекты со стороны сердечно-сосудистой системы, наблюдаемые при применении НПВС и ингибиторов ЦОГ-2.
В WO 2013/004290 раскрыты производные циклических аминов в качестве антагонистов рецепторов EP4. В US 2005/0250818 описаны определенные орто-замещенные арил- и гетероариламидные соединения, которые являются селективными антагонистами рецепторов EP4, обладающие анальгетиче-ским действием. Кроме того, в WO 2011/102149 описаны определенные соединения, являющиеся селективными антагонистами EP4, которые пригодны для лечения заболеваний, опосредованных IL-23.
В настоящем изобретении предложены определенные новые соединения, которые являются селективными ингибиторами EP4 относительно EP1, EP2 и EP3. Кроме того, в настоящем изобретении предложены определенные новые соединения, которые могут снизить интенсивность побочных эффектов со стороны желудочно-кишечного тракта в сравнении с традиционными НПВС.
Соответственно в настоящем изобретении предложено соединение формулы I
где R представляет собой H или F;
или его фармацевтически приемлемая соль.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения артрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения остеоартрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения ревматоидного артрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении также предложен способ лечения боли, связанной с артритом, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
Кроме того, в настоящем изобретении предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии, в частности для лечения остеоартрита. Кроме того, в настоящем изобретении предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения ревматоидного артрита. В настоящем изобретении также предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения для лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом. Кроме того, в настоящем изобретении предложено приме
нение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для производства медикамента для лечения остеоартрита. В настоящем изобретении предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для производства медикамента для лечения ревматоидного артрита. В настоящем изобретении также предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для производства медикамента для лечения боли, связанной с остеоартри-том или ревматоидным артритом.
В настоящем изобретении дополнительно предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. Согласно конкретному варианту реализации композиция дополнительно содержит один или более терапевтических агентов. В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция для лечения артрита, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль. Настоящее изобретение также охватывает новые промежуточные вещества и способы синтеза соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
В тексте настоящего документа термины "лечение" и "лечить" включают ограничение, замедление, остановку или прекращение прогрессирования или уменьшение тяжести существующего симптома или нарушения.
В тексте настоящего документа термин "пациент" обозначает млекопитающее, включая человека, домашнее животное, такое как кошка или собака, или домашний скот, такой как лошадь, корова или свинья. Человек и домашние животные являются предпочтительными пациентами.
В тексте настоящего документа термин "эффективное количество" обозначает количество или дозу соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, которое при однократном или многократном введении пациенту дает желаемый эффект у пациента, проходящего диагностику или получающего лечение.
Эффективное количество может легко быть определено лечащим диагностом в качестве специалиста в данной области техники с применением известных методов и путем учета результатов, полученных в аналогичных обстоятельствах. При определении эффективного количества для пациента лечащий диагност принимает во внимание ряд факторов, включая в качестве неограничивающих примеров: вид млекопитающего, его размер, возраст и общее состояние здоровья; наблюдаемое конкретное заболевание или нарушение; степень или распространенность или тяжесть заболевания или нарушения; реакцию отдельного пациента; конкретное вводимое соединение; способ введения; показатели биодоступности вводимого препарата; избранную схему лечения; одновременное применение других препаратов и другие актуальные обстоятельства.
Соединения согласно настоящему изобретению обычно эффективны в широком диапазоне доз. Например, диапазон ежедневных доз обычно составляет от примерно 0,01 до примерно 50 мг/кг массы тела. В некоторых случаях дозы ниже нижней границы вышеназванного диапазона могут быть более чем адекватными, тогда как в других случаях могут применяться еще большие дозы, что будет сопровождаться приемлемыми побочными эффектами, и, таким образом, не предполагается, что представленный выше диапазон доз ограничивает каким-либо образом объем настоящего изобретения.
Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой фармацевтические композиции для введения любым способом, при котором соединение будет обладать биодоступностью. Наиболее предпочтительно, чтобы такие композиции предназначались для приема внутрь. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области техники (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).
Соединения согласно настоящему изобретению особенно полезны в способах лечения согласно настоящему изобретению, но определенные группы, заместители и конфигурации являются предпочтительными. В нижеследующих абзацах описаны такие предпочтительные группы, заместители и конфигурации. Следует понимать, что данные предпочтения применимы как к способам лечения, так и к новым соединениям согласно настоящему изобретению.
или его фармацевтически приемлемая соль.
Предпочтительным является соединение формулы Ia
или ее фармацевтически приемлемая соль.
4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-Феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензойная кислота наиболее предпочтительна.
На следующих схемах не были указаны некоторые стереохимические центры и были опущены некоторые заместители для повышения ясности изложения, однако не предполагается, что этот факт будет ограничивать информацию, передаваемую данными схемами, каким-либо образом. Кроме того, отдельные изомеры, энантиомеры или диастереомеры могут быть отделены или разделены специалистом в данной области техники в любой удобный момент в ходе синтеза соединений формулы I такими способами, как метод селективной кристаллизации или хиральная хроматография (см., например, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, и E.L. Eliel и S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). В качестве альтернативы могут также применяться обладающие хиральными свойствами исходные материалы, что понятно специалисту в данной области техники. Кроме того, промежуточные вещества, приведенные в нижеследующих схемах, содержат азотзащитные группы. Условия защиты и снятия защиты хорошо известны специалисту в данной области техники и описаны в литературе (см., например, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).
В тексте настоящего документа "кПа изб." обозначает килопаскаль избыточного давления; "ЗГ" обозначает подходящую защитную группу; "СИМД" называет среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко; "Boc" обозначает терт-бутокси карбонильную защитную группу; "ДМСО" обозначает ди-метилсульфоксид; "ТГФ" обозначает тетрагидрофуран; "EtAc" обозначает этилацетат; "Et2O" обозначает диэтиловый эфир; "ТБМЭ" называет терт-бутилметиловый эфир; "БОФ" обозначает бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония гексафторфосфат; "ПГЕ2" обозначает простагландин Е2; "ФБС" обозначает фетальную бычью сыворотку; "ИБМК" обозначает (3-изобутил-1-метилксантин); "МЭС" обозначает (2-(К-морфолино)этансульфоновую кислоту; "ГЭПЭС" обозначает (2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил-этансульфоновую кислоту); "ГФВР" обозначает гомогенную флуоресценцию с временным разрешением; "ЭПЧ" обозначает эмбриональную почку человека; "ССРХ" обозначает сбалансированный солевой раствор Хэнкса; "EC80" обозначает концентрацию агента, которая дает 80% максимально возможной эффективности для данного агента; и "IC50" обозначает концентрацию агента, которая дает 50% максимально возможного ингибирующего ответа для данного агента.
Соединения согласно настоящему изобретению или их фармацевтически приемлемые соли могут быть получены различными способами, известными специалисту в данной области техники, некоторые из которых проиллюстрированы нижеследующими схемами, приготовлениями и примерами. Конкретные этапы синтеза для каждого из описанных путей могут комбинироваться различными способами или сочетаться с этапами из других схем для получения соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. Продукты каждого из этапов в нижеприведенных схемах могут быть восстановлены традиционными способами, включая экстрагирование, выпаривание, осаждение, хроматографию, фильтрацию, измельчение и кристаллизацию. Реагенты и исходные материалы легко доступны специалисту в данной области техники. Все заместители, если не указано иное, определены заранее. Следует понимать,
что не предполагается как-либо ограничить область настоящего изобретения приготовлений и примеров.
Схема 1
с помощью данных схем,
На схеме 1, на этапе А, защищенная 3,4-дигидро-Ш-изохинолин-3-карбоксильная кислота, в которой ЗГ представляет собой подходящую азотзащитную группу, такую как трет-бутокси карбонильная защитная группа (Boc), соединяется с метил 4-(1-аминоэтил)бензоатом в стандартных условиях с получением защищенного изохинолин амида со структурой (1). Например, защищенную 3,4-дигидро-Ш-изохинолин-3-карбоксильную кислоту растворяли в подходящем органическом растворителе, таком как дихлорметан, охлаждали до температуры примерно 0°C и обрабатывали примерно 1,1 экв. подходящего органического основания, такого как триэтиламин. Затем добавляли по капле, перемешивая, примерно 1,1 экв. изобутила хлорформиата. Смеси давали перемешаться примерно 20 мин при температуре 0°C, затем добавляли примерно 1,1 экв. метил 4-(1-аминоэтил)бензоат. Затем реакционную смесь перемешивали в течение примерно 1 ч при комнатной температуре. Защищенный изохинолин амид (1) изолируют, используя методы, хорошо известные специалисту в данной области техники, такие как методы экстрагирования. Например, в смесь добавляют воду, разделяют слои, и происходит мытье органической фазы водным бисульфатом калия, а затем - бикарбонатом натрия. Органическую фазу затем высушивают над безводным сульфатом магния, фильтруют и концентрируют при сниженном давлении с получением защищенного изохинолин амида (1).
Схема 2
На схеме 2, на этапе А, снимается защита с защищенного изохинолин амида (1) в условиях, хорошо известных специалисту в данной области техники, с получением изохинолин амида со снятой защитой (2). Например, примерно 10 экв. ацетилхлорида добавляли по капле к примерно 11 экв. этанола, растворенного в подходящем органическом растворителе, таком как этилацетат, при температуре примерно 0°C. Смесь перемешивали в течение примерно 30 мин, нагревали до комнатной температуры, а затем раствор примерно 1 экв. защищенного изохинолин амида (1) в этилацетате добавляли, перемешивая, к реакционной смеси. Затем реакционную смесь перемешивали при температуре примерно 40°C в течение 12 ч. Затем ее охлаждали до комнатной температуры и изолировали изохинолин со снятой защитой с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Например, собирали твердое вещество путем фильтрации и высушивали его при сниженном давлении. К твердому веществу добавляли воду, а затем добавляли 32% водного аммиака до тех пор, пока pH смеси не достиг примерно 10. Твердые вещества вновь собирали с помощью фильтрации и высушивали при сниженном давлении при температуре примерно 45°C с получением изохинолин амида со снятой защитой (2).
В качестве альтернативы, на схеме 2, на этапе А, защита защищенного изохинолин амида (1) может быть снята в условиях, хорошо известных специалисту в данной области техники с получением соли HCl изохинолин амида со снятой защитой (2). Например, защищенный изохинолин амид (1) растворяли в 4 М раствора хлороводорода в 1,4-диоксане. Реакционную смесь перемешивали в течение примерно 12 ч при
комнатной температуре. Затем изолировали соль HCl изохинолин амида со снятой защитой (2) путем концентрирования реакционной смеси при сниженном давлении.
На схеме 2, на этапе В, изохинолин амид со снятой защитой (2) комбинировали с феноксильным соединением с подходящим заместителем с получением феноксиэтил изохинолина (3). Например, силика-гель комбинировали с подходящим органическим растворителем, таким как дихлорметан, при температуре примерно 22°C, и раствор примерно 2 экв. периодата натрия в воде добавляли по капле в смесь си-ликагеля, перемешивая последнюю. Смесь перемешивали в течение примерно 30 мин и добавляли примерно 1,5 экв. 3-фенокси-1,2-пропандиола. Смесь перемешивали в течение еще примерно 30 мин, затем фильтровали для удаления твердых веществ, отделяли слои и сушили органический слой над сульфатом магния. Органический слой вновь фильтровали и добавляли примерно 1 экв. изохинолин амида со снятой защитой (2), а затем примерно 2 экв. частями подходящего восстановителя, такого как триацетоксиборо-гидрид. Реакционную смесь затем оставляли для перемешивания в течение примерно 1 ч, после чего добавляли избыточную воду. Водный раствор 32% аммиака добавляли в смесь до тех пор, пока pH водного слоя не достиг примерно 10.
Феноксиэтил изохинолин (3) затем изолировали и очищали способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Например, слои реакционной смеси разделяли, органический слой сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при сниженном давлении. Неочищенную нефть растворяли в подходящем органическом растворителе, таком как ТБМЭ, добавляли воду, а затем 1 М водного HCl. Полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин, а затем концентрировали при сниженном давлении для удаления органического растворителя. Осадок затем собирали путем фильтрации и добавляли в смесь воды и ТБМЭ. Смесь обрабатывали 32% водным аммиаком до тех пор, пока pH водного слоя не достигал примерно 10, слои разделяли, и органический слой мыли насыщенным водным хлоридом натрия, сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при сниженном давлении. Полученное сырье очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле с подходящим элю-ентом, таким как этилацетат/гексаны, с получением очищенного феноксиэтил изохинолина (3).
В качестве альтернативы, на схеме 2, на этапе В, соль HCl изохинолин амида со снятой зашитой (2) комбинировали с феноксильным соединением с подходящим замещением с получением феноксиэтил изохинолина (3). Например, примерно 1,5 экв. 2-феноксиацетальдегида, такого как 2(4-фторфенокси)ацетальдегид, комбинировали с примерно 1 экв. соли HCl изохинолин амида со снятой защитой (2) в подходящем органическом растворителе, таком как 1,2-дихлорэтан. К этой смеси добавляли примерно 1,4 экв. подходящего восстановителя, такого как триацетоксиборогидрид натрия, и перемешивали реакционную смесь в течение примерно 12 ч при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляли насыщенный водный бикарбонат натрия и изолировали и очищали феноксиэтил изохино-лин (3) с помощью методов, известных специалисту в данной области техники. Например, реакционную смесь экстрагировали с помощью подходящего органического растворителя, такого как этилацетат, комбинировали органические экстракты, мыли их насыщенным водным хлоридом натрия, сушили над сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при сниженном давлении. Данное сырье затем очищали с помощью флэш-хроматографии на силикагеле с подходящим элюентом, таким как этилацетат/гексаны, с получением очищенного феноксиэтил изохинолина (3).
Схема 3
На схеме 3, этап А, феноксиэтил изохинолин (3) гидролизовали в условиях, хорошо известных специалисту в данной области техники, с получением соединения формулы I. Например, феноксиэтил изохинолин (3) растворяли в подходящем органическом растворителе, таком как ТГФ, или смеси мета-нол/ТГФ, а затем обрабатывали, используя от примерно 2 до 4 экв. подходящего водного основания, такого как водный гидроксид натрия. Реакционную смесь затем перемешивали при температуре от примерно 20°C до примерно 40°C в течение примерно 12 ч. Затем соединение формулы I изолировали и очищали в условиях, хорошо известных в данной области техники. Например, реакционную смесь концентрировали при сниженном давлении для удаления органического растворителя. Добавляли воду, и мыли водный слой подходящим органическим растворителем, таким как ТБМЭ. Водный слой затем охлаждали до температуры примерно 5°C и обрабатывали подходящей водной кислотой, такой как соляная кислота, перемешивая, до тех пор, пока pH не достигал примерно 2. Затем реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и собирали твердые вещества методом фильтрации. Затем твердые вещества добавляли в воду, нагревали до примерно 80°C в течение примерно 1 ч, охлаждали до комнатной темпе
ратуры, собирали методом фильтрации и сушили при сниженном давлении при температуре примерно 45°C в течение примерно 12 ч. Высушенное твердое вещество затем добавляли к подходящему органическому растворителю, такому как изопропилацетат, и перемешивали в течение примерно 5 ч. Твердые вещества собирали методом фильтрации и сушили при сниженном давлении с получением очищенного соединения формулы I.
Фармацевтически приемлемые соли и традиционные методы их получения хорошо известны специалисту в данной области техники; см., например, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); и Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Специалисту в области синтеза известно, что соединения согласно настоящему изобретению можно преобразовать в фармацевтически приемлемую соль и можно изолировать в виде такой соли с помощью методов и условий, известных специалисту в данной области техники. Приготовления и примеры Нижеследующие приготовления и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Если не указано иное, соединения, проиллюстрированные в тексте данного документа, названы и пронумерованы с использованием программы Accelrys Draw (названия ИЮПАК).
Пример получения 1. Синтез терт-бутил(3R)-3-[[(1S)-1-(4-метоксикарбонилфенил)этил]карбамоил]-3,4-дигидро-1Н-изохинолин-2-карбоксилата.
Схема 1, этап А.
К смеси (3R)-2-терт-бутоксикарбонил-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбоксильной кислоты (40,0 г, 141,4 ммоль) и дихлорметана (784 мл) с температурой 0°C добавляли триэтиламин (21,7 мл, 155,5 ммоль). Затем добавляли по капле изобутила хлороформиат (20,3 мл, 155,5 ммоль). По окончании добавления перемешивали смесь при температуре 0°C в течение 20 мин. Затем добавляли метил^)-4-(1-аминоэтил)бензоат (27,9 г, 155,5 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли воду (400 мл), разделяли слои и мыли органический слой с помощью 1 М водного KHSO4 (500 мл), затем насыщенным водным NaHCO3 (500 мкл). Органическую фазу сушили над MgSO4, фильтровали для удаления твердых веществ и концентрировали фильтрат при сниженном давлении с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (60 г, выход 97%). Масс-спектр (m/z): 339 ([М + H - Вос]+), 383 ([М + H - гп-Бу]+), 439 ([М + Н]+).
Пример получения 2. Синтез метил 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензоата.
со2сНз
Схема 2, этап А.
Охлаждали смесь этилацетата (214 мл) и этанола (87,6 мл, 1,51 моль) до температуры 0°C, а затем добавляли по капле ацетилхлорид (97,4 мл, 1,37 моль). Смесь перемешивали в течение 30 мин, при этом давая ей нагреться до комнатной температуры. Добавляли раствор трет-бутшл^)-3-[[(^)-1-(4-метоксикарбонилфенил)этил]карбамоил]-3,4-дигидро-Ш-изохи нолин-2-карбоксилата (60 г, 137 ммоль) в этилацетате (480 мл), а затем перемешивали полученную смесь при температуре 40°C в течение ночи. Смесь охлаждали до комнатной температуры, затем изолировали полученный осадок методом фильтрации и сушили его при сниженном давлении. К твердому веществу добавляли воду (300 мл), а затем добавляли 32% водный раствор аммиака до тех пор, пока pH смеси не достиг 10. Изолировали суспендированные твердые вещества методом фильтрации, затем сушили их в вакуумном сушильном шкафу при температуре 45°C в течение ночи для получения титульного соединения в виде белого твердого вещества (44 г, выход 95%). Масс-спектр (m/z): 339 ([М + Н]+), 677 ([2М + Н]+), 699 ([2М + Na]+).
Схема 2, этап В.
К перемешиваемой смеси силикагеля (200 г, 3,33 моль) и дихлорметана (1100 мл) при температуре 22°C добавляли по капле раствор периодата натрия (56,2 г, 260 ммоль) в воде (352 мл). По окончании добавления смесь перемешивали в течение дополнительных 30 мин, затем добавляли 3-феноксил-1,2-пропандиол (34,5 г, 195 ммоль) с получением слабого экзотермического эффекта. Смесь перемешивали в течение дополнительных 30 мин, затем фильтровали для удаления твердых веществ, отбрасывали водный слой и сушили органический слой над MgSO4, фильтровали для удаления твердых веществ и обрабатывали фильтрат метил 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбонил]ами-но]этил]бензоатом (44 г, 130 ммоль). Затем добавляли триацетоксиборогидрид натрия (57,4 г, 260 ммоль) малыми частями. По завершении добавления перемешивали смесь в течение одного дополнительного часа, затем добавляли воду (200 мл). Добавляли 32% водный раствор аммиака до тех пор, пока pH водного слоя не достиг 10. Слои разделяли, сушили органический слой над MgSO4, фильтровали для удаления твердых веществ и концентрировали фильтрат при сниженном давлении. Растворяли полученную неочищенную нефть в ТБМЭ (300 мл), затем добавляли воду (250 мл) и 1 М водной хлористоводородной кислоты (200 мл). Полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин, концентрировали при сниженном давлении для удаления ТБМЭ и изолировали полученный белый осадок методом фильтрации. Данный осадок наливали в перемешиваемую смесь воды (400 мл) и ТБМЭ (400 мл) и добавляли 32% водный раствор аммиака до тех пор, пока pH водного слоя не достигал 10. Удаляли водный слой и мыли органический слой насыщенным водным раствором хлорида натрия (200 мл). Изолировали органический слой, сушили его над полученным в результате сырьем, выполняли флэш-хроматографию на силикагеле с использованием от 30 до 70% MgSO4, фильтровали для удаления твердых веществ и концентрировали при сниженном давлении. Полученное сырье подвергали флэш-хроматографии на силикагеле, применяя 30-70% градиента EtAc/гексана. Объединяли фракции, содержавшие продукт, и концентрировали их при сниженном давлении с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (44 г, выход 74%). Масс-спектр (m/z): 459 ([М + Н]+).
Пример получения 4. Синтез метил 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензоат гидрохлорида.
Схема 2, этап А.
Растворяли трет-бутил (3R)-3-[[(1S)-1-(4-метоксикарбонилфенил)этил]карбамоил]-3,4-дигидро-1H-изохинолин-2-карбоксилат (5,5 г в 12,5 ммоль) в 4 М раствора хлористого водорода в 1,4-диоксане (30 мл 120 ммоль). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре, а затем концентрировали смесь при сниженном давлении с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (4,70 г, выход 100%). Масс-спектр (m/z): 339 ([М + Н]+), 677 ([2М + Н]+), 699 ([2М + Na]+).
Пример получения 5. Синтез метил 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-фторфенокси)этил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензоата.
Схема 2. Этап В.
К смеси метил 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензоат гидрохлорида (800 мг, 2,13 ммоль) и 2-(4-фторфенокси)ацетальдегида (493 мг, 3,2 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (10,7 мл) добавляли триацетоксиборогидрид натрия (633 мг, 2,99 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Добавляли насыщенный водный NaHCO3 (25 мл) и экстрагировали водный слой этилацетатом (2x25 мл). Комбинированные органические слои мыли насыщенным водным NaCl (25 мл), сушили органическую фазу MgSO4, фильтровали и концентрировали фильтрат при сниженном давлении. Полученное сырье подвергали флэш-хроматографии на силикагеле с использованием от 0 до 60% градиента EtAc/гексан. Объединяли фракции, содержавшие продукт, и концентрировали их при сниженном давлении с получением титульного соединения в виде бесцветной пены (550 мг, выход 54%). Масс-спектр (m/z): 477 ([М + Н]+).
Пример 1. Синтез 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензо иной кислоты.
Схема 3. Этап А.
Смесь метил 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]ами-но]этил]бензоата (41,5 г, 90,5 ммоль), ТГФ (291 мл) и 2 М водного гидроксида натрия (181 мл, 360 ммоль) перемешивали при температуре 40°C в течение ночи. Концентрировали при сниженном давлении для удаления ТГФ. Добавляли воду (200 мл), затем мыли водный слой ТБМЭ (2x200 мл). Охлаждали водный слой до температуры 5°C и добавляли концентрированную соляную кислоту, перемешивая, до тех пор, пока pH не достиг 2 (согласно анализу с помощью индикаторной бумаги для определения pH). Перемешивая, давали смеси нагреться до комнатной температуры в течение 30 мин, затем изолировали твердые вещества методом фильтрации. Добавляли твердые вещества в воду (500 мл) и нагревали до 80°C в течение 1 ч. Охлаждали смесь до комнатной температуры, изолировали твердые вещества методом фильтрации и сушили твердые вещества в вакуумном сушильном шкафу при температуре 45°C в течение ночи. Добавляли твердые вещества к изопропилацетату (300 мл) и перемешивали интенсивно в течение 5 ч. Изолировали твердые вещества методом фильтрации при сниженном давлении с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (26 г, выход 60%). Масс-спектр (m/z): 445 ([М + Н]+).
Пример 2. Синтез 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-фторфенокси)этил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]эт ил] бензойной кислоты гидрохлорида.
Схема 3. Этап А.
Растворяли метил 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-фторфенокси)этил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил]бензоат (550 мг, 1,15 ммоль) в смеси метанола (10 мл) и тетрагидрофурана (10 мл). Добавляли 5н. водный раствор гидроксида натрия (0,462 мл, 2,31 ммоль), затем перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи. Концентрировали указанную смесь при сниженном давлении с получением белого твердого вещества. Добавляли 4 М раствора хлороводорода в 1,4-диоксане (10 мл, 40 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 10 мин. Удаляли суспендированные твердые вещества методом фильтрации, ополаскивая указанные твердые вещества ТГФ (5 мл). Концентрировали объединенный фильтрат при сниженном давлении с получением белого твердого вещества. Материал растирали в порошок в горячем диэтиловом эфире (10 мл) и фильтровали с получением титульного соединения в виде белого твердого вещества (535 мг, выход 93%). Масс-спектр (m/z): 463 ([М + Н]+), 485 ([М + Na]+).
Связывание in vitro с EP1, EP2, EP3 и EP4 человека.
Мембраны hEP1 и hEP4 получают из рекомбинантных клеток HEK293, стабильно экспрессирую-щих рецепторы EP1 человека (учетный номер в ГенБанке AY275470), или EP4 (учетный номер в ГенБан
ке AY429109). Мембраны hEP2 и hEP3 получают из клеток HEK293, транзиторно трансфицированных плазмидами рецептора EP2 (учетный номер в ГенБанке AY275471), или EP3 (изоформа VI: учетный номер в ГенБанке AY429108). Замороженную клеточную массу гомогенизировали в гомогенизирующем буфере, используя тефлоновый/ стеклянный гомогенизатор. Готовили аликвоты мембранных белков и быстро замораживали, поместив на сухой лед, перед хранением при температуре -80°C. Гомогенизирующий буфер (см., например, Mauback, K.A., British Journal of Pharmacology, 156: 316-327 (2009)), содержал 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 0,3 мМ индометацина, плюс Complete(tm), содержащий ЭДТА, полученный от компании Roche Molecular Biochemicals (номер в каталоге 1697498).
Значения Kd для связывания [3Щ-ПГЕ2 с каждым рецептором определяли путем исследования насыщения связывания или гомологического соревнования. Соединения испытывали в формате 96 лунок, с применением серий трехкратного разбавления для создания 10-точечной кривой. Разбавленное соединение инкубировали с мембраной EP1 в количестве 20 мкг/лунка, EP2 в количестве 10 мкг/лунка, EP3 в количестве 1 мкг/лунка или EP4 в количестве от 10 до 20 мкг/лунка в течение 90 мин при температуре 25°C в присутствии [3Н]-ПГЕ2 (компания PerkinElmer, от 118 до 180 Ки/ммоль) в количестве от 0,3 до 0,5 нМ. Реакцию связывания проводили в буферном растворе MES в количестве 200 мкл (10 мМ MES, pH 6,0, с KOH, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ЭДТА), используя 96-луночные планшеты из полистирола с глубокими лунками объемом 0,5 мл. Неспецифическое связывание рассчитывали путем сравнения связывания в присутствии и в отсутствие ПГЕ2 в количестве 2 мкм. Мембраны собирали методом фильтрации (коллектор TomTek), мыли 4 раза холодным буферным раствором (10 мМ MES, pH 6,0, с KOH, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ ЭДТА), сушили в печи при температуре 60°C и рассчитывали радиоактивность, выражая ее как число импульсов в минуту (ЧИМ), используя детектор TopCount(r). Процент-специфическое связывание рассчитывали как процентную долю связывания в отсутствие какого-либо ингибитора, скорректированную по неспецифическому связыванию в присутствии ПГЕ2 в количестве 2 мкМ. При анализе данных использовали нелинейное логистическое уравнение с 4 параметрами (уравнение ABase 205) следующего вида: у=(A+((B-A)/(1+((C/x)ЛD)))), причем у=% специфического ингибирования, А=низшая точка кривой; В=высшая точка кривой; С=относительная ГС^концентрация, вызывающая ингибирование на 50% на основании диапазона данных от верхней точки до нижней точки; D=наклон Хилла=наклон кривой. Конверсия Ki по значениям IC50 (Ki=IC50/(1+[L]/Kd), где [L] обозначает концентрацию лиганда).
Таблица 1
Связывание in vitro в примерах 1 и 2 с ЕР1, ЕР2, ЕРЗ и ЕР4 человека Исследуемое hEPl, Kt (нМ) hEP2, Kt (нМ) hEP3, Kt (нМ) hEP4, Kt (нМ)
соединение
Прим. 1 7920±5810(n=3) 1320±1780(n=4) > 14800 (n=3) 0,403±0,247(n=9)
Прим. 2 4650 (n=l) 331±72(n=2) > 14600 (n=l) 0,380±0,142(n=4)
Соединения испытывали в соответствии с процедурами, по существу описанными выше. Данные в табл. 1 показывают, что соединения по примеру 1 и примеру 2 связываются с hEP4 в субнаномолярных концентрациях. Данные в табл. 1 также показывают, что соединения по примеру 1 и примеру 2 связываются с hEP4 крепче, чем с hEP1, hEP2 и hEP3, что свидетельствует о селективности в отношении рецептора hEP4.
Функционально-антагонистическая активность in vitro EP4 у человека.
Анализ проводили на рекомбинантных клетках HEK293 со стабильной экспрессией рецептора EP4 человека. Культуры клеток поддерживали путем культивирования в СИМД с высоким содержанием глюкозы и пиридоксина гидрохлорида (Invitrogen) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ ГЭПЭС, 500 мкг/мл генетицина и 2 мМ L-глютамина. Конфлюэнт-ные культуры выращивали при температуре 37°C при содержании в атмосфере 5% СО2. Клетки собирали, используя 0,25% Трипсина-ЭДТА, суспендированного в замороженной среде (ФБС с 6% ДМСО), при 10 клеток/мл, и аликвоты хранили в жидком азоте. Непосредственно перед анализом клеткам давали оттаять в ДМСО, центрифугировали их и ресуспендировали в буферном растворе цАМФ.
Ингибирование выработки цАМФ, стимулированной ПГЕ2, антагонистами EP4 измеряли с помощью ГФВР (в каталоге Cisbio № 62АМ4РЕВ). Аликвотный эквивалент 4000 клеток инкубировали с аналитическим буферным раствором цАМФ в количестве 50 мкл, содержащим ПГЕ2 в такой концентрации, чтобы получить концентрацию EC80 (0,188 нМ ПГЕ2, получено от компании Sigma, номер в каталоге Р5640-10мг), и антагонисты EP4, при комнатной температуре в течение 20 мин. Аналитический буферный раствор цАМФ содержал 500 мл ССРХ, 0,1% БСА, 20 мМ ГЭПЭС и 200 мкМ ИБМК (Sigma I5879). В качестве положительного контроля использовали CJ-042794 (см. WO 2005/021508, пример 68, 4-{(1S)-1-[({5-хлор-2-[(4-фторфенил)окси]фенил}карбонил)амино]этил}бензойная кислота; см. также Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226-232 (2008)). Для измерения уровней цАМФ конъюгат цАМФ^2 и конъюгат анти-цАМФ-криптата в лизирующем буфере инкубировали с обработанными клетками при комнатной температуре в течение 1 ч. Сигнал ГФВР детектировали с помощью планшет-ридера EnVision(r) (компания Perkin-Elmer) для расчета отношения флуоресценции при 665 нм к флуоресценции при 620 нм. Пер
воначальные данные конвертировали в количество цАМФ (пмоль/лунка) с помощью стандартной кривой цАМФ, создаваемой для каждого эксперимента. Данные анализировали с помощью нелинейного логистического уравнения с 4 параметрами (уравнение ABase 205), имевшего следующий вид: у=(A+((B-A)/(1+((C/x^D)))), причем у=% специфического ингибирования, А=низшая точка кривой, В=высшая точка кривой , С=относительная Ю5о=относительная IC50=концентрация, вызывающая ингибирование на 50% на основании диапазона данных от верхней точки до нижней точки; D=наклон Хилла=наклон кривой.
Соединения были испытаны в соответствии с процедурами, по существу описанными выше. Для соединения по примеру 1 IC50 составляла 0,752+0,538 нМ (n=12), а для соединения по примеру 2 IC50 составляла 0,450+0,256 нМ (n=4) при измерении для EP4 человека. Это свидетельствует о том, что соединения по примеру 1 и примеру 2 являются антагонистами EP4 у человека in vitro.
Функционально-антагонистическая активность in vitro EP4 у крысы EP4 кДНК крысы (учетный номер в ГенБанке NM03276) клонировали в вектор 3.1 пкДНК, а затем трансфицировали в клетки HEK293 для экспрессии рецептора. Стабильный клон EP4 крысы масштабировали, а затем замораживали в качестве клеточного банка для последующего скрининга соединений. Для испытания соединений - антагонистов EP4 в клетках rEP4 давали оттаять замороженным клеткам, а затем ресуспендировали клетки в аналитическом буферном растворе цАМФ. Буферный раствор цАМФ готовили из ССРХ без фенолового красного (Hyclone, SH30268) с добавлением 20 мМ ГЭПЭС (Hyclone, SH30237), 0,1% БСА (Gibco, 15260) и 125 мкМ ИБМК (Sigma, I5879) (см., например, Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226-232 (2008)). Клетки помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты с половинным объемом лунок из полистирола черного цвета (Costar 3694). Проводили серию разбавлений соединений ДМСО для получения 10-точечных кривых концентрация-ответ. Затем разбавленные соединения добавляли в аналитический буферный раствор цАМФ, содержавший ПГЕ2 (Cayman 14010, в такой концентрации, чтобы получить EC80), при этом отношение ДМСО/буфер составляло 1/100. Клетки обрабатывали соединениями в присутствии ПГЕ2 (концентрация EC80) в течение 30 мин при комнатной температуре. Количественное выражение уровней цАМФ, выработанного в клетках, находили с помощью набора реактивов ГФВР для цАМФ (Cisbio 62AM4PEC). Планшеты читали на планшет-ридере EnVision, используя оптимизированный протокол ГФВР (PerkinElmer). IC50 рассчитывали с помощью программы Graphpad Prism (v. 4) с нелинейной регрессией, сигмоидальное проведение кривой доза-ответ.
Соединения были испытаны в соответствии с процедурами, по существу описанными выше. Для соединения по примеру 1 IC50 составила 2,0 нМ (n=1), а для соединения по примеру 2 IC50 составила 6,7 нМ (n=1), согласно измерениям для EP4 у крысы. Это свидетельствует о том, что соединения по примеру 1 и примеру 2 являются антагонистами EP4 in vitro у крысы.
Антагонистическая активность in vitro в цельной крови человека.
Считается, что ингибирующее воздействие ПГЕ2 на ЛПС-индуцированный синтез ФНОа из макрофагов/моноцитов опосредовано рецепторами EP4 (см. Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226-232 (2008)). Способность соединения по примеру 1 нейтрализовывать ингибирующее воздействие ПГЕ2 на ЛПС-индуцированный синтез ФНОа в цельной крови человека является свидетельством функциональной активности.
Кровь собирали у здоровых добровольцев в вакуумные пробирки с гепарином натрия. Доноры не принимали НПВС или целекоксиб за 48 ч или глюкокортикоиды за две недели до сдачи крови. Кровь из всех пробирок/от всех доноров сливали в конические центрифужные пробирки типа "Falcon" емкостью 50 мл, а 98 мкл/лунка распределяли в 96-луночный планшет с культурами тканей (Falcon 3072). Соединения разбавляли в ДМСО до 100X окончательный результат, а 1 мкл/лунка в трех параллельных испытаниях добавляли в кровь для получения 7-точечных кривых концентрация-ответ. Кровь предварительно обрабатывали соединениями при температуре 37°C, в увлажненной атмосфере с содержанием CO2 5%, в течение 30 мин, после чего добавляли 1 мкл/лунка раствора 1 мг/мл липополисахарида (ЛПС) (Sigma 0111 :В4) в 0,2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)/ФСБ, как с 1 мМ ПГЕ2 (Cayman 14010), так и без него, для получения окончательной концентрации ЛПС 10 мкг/мл как при наличии 10 нМ ПГЕ2, так и при его отсутствии. Планшеты были инкубированы в течение 20-24 ч при температуре 37°C в увлажненной атмосфере с содержанием СО2 5%. Планшеты центрифугировали при 1800x г в течение 10 мин при температуре 22°C в центрифуге Eppendorf 5810R. Плазму крови извлекали и клеточного слоя и переносили на полипропиленовые планшеты с v-образным дном. Уровни ФНОа в 2 мкл плазмы крови определяли с помощью коммерчески доступного иммуноферментного анализа (R &D Systems DY210), используя планшеты Immulon 4 НВХ (Thermo 3855) и 3,3',5,5' тетраметилбифенил-4,4'-диамин субстрат (KPL 50-76-03). Планшеты читали при А450-А650 на планшет-ридере (Molecular Devices Versamax) с помощью программного обеспечения SOFTmaxPRO (v. 4.3.1). IC50 рассчитывали с помощью программы Graphpad Prism (v. 4) с нелинейной регрессией, сигмоидальное проведение кривой доза-ответ. Результаты выражали как геометрическое среднее + стандартное отклонение; ^количество независимых определений.
Соединения были испытаны в соответствии с процедурами, по существу описанными выше. Для соединения согласно примеру 1 IC50 составила 39+21 нМ (n=8), а для соединения по примеру 2 IC50 составила 61+55 нМ (n=5) при измерении для EP4 человека. Это свидетельствует о том, что соединения согласно примеру 1 и примеру 2 являются антагонистами EP4 в анализе индукции ФНОа в крови человека.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
4. Соединение по п.3, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил] бензойную кислоту
или ее фармацевтически приемлемую соль.
5. Соединение по п.4, представляющее собой 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-феноксиэтил)-3,4-дигидро-1H-изохинолин-3-карбонил]амино]этил] бензойную кислоту
или ее фармацевтически приемлемую соль.
7. Способ лечения остеоартрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1.
8. Способ лечения ревматоидного артрита у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1.
9. Способ лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1.
10. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 в терапии воспалительных заболеваний.
11. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения ос-теоартрита.
12. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения ревматоидного артрита.
13. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по пп.1-6 для лечения боли, связанной с остеоартритом или ревматоидным артритом.
14. Фармацевтическая композиция, имеющая активность селективного антагониста EP4, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по пп.1-6 с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027306
- 1 -
(19)
027306
- 1 -
(19)
027306
- 1 -
(19)
027306
- 1 -
(19)
027306
- 4 -
(19)
|
