EA 027259B1 20170731 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/027259 Полный текст описания [**] EA201391608 20120427 Регистрационный номер и дата заявки US61/480,946 20110429 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2012/035555 Номер международной заявки (PCT) WO2012/149393 20121101 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21707 Номер бюллетеня [**] НАНОНОСИТЕЛИ, ВЫРАБАТЫВАЮЩИЕ ИММУННУЮ ТОЛЕРАНТНОСТЬ, ДЛЯ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКОГО УДАЛЕНИЯ Т-ЭФФЕКТОРНЫХ КЛЕТОК Название документа [8] A61K 47/48, [8] A61K 47/30, [8] A61K 9/127, [8] A61K 39/38, [8] A61K 31/445 Индексы МПК [US] Фрейзер Кристофер, [US] Кисимото Такаси Кеи, [US] Мальдонадо Роберто А. Сведения об авторах [US] СЕЛЕКТА БАЙОСАЙЕНСИЗ, ИНК. Сведения о патентообладателях [US] СЕЛЕКТА БАЙОСАЙЕНСИЗ, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000027259b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Применение композиции, содержащей: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; и (ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, в способе, включающем: (a) введение композиции пациенту в соответствии с разработанным ранее протоколом, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; или (b) снижение числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; или (c) снижение числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких пациентов.

2. Применение по п.1, где (а) способ дополнительно включает предоставление или выявление пациента; и/или (b) антиген представляет собой терапевтический белок, аутоантиген или аллерген, или ассоциирован с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплантат против хозяина"; и/или (с) способ дополнительно включает оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения композиции; и/или (d) пациент имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина"; и/или (е) пациенту проделали или будут делать трансплантацию; (f) пациент имеет или существует риск развития у него нежелательного иммунного ответа на терапевтический белок, который вводят или будут вводить пациенту; (g) пациенту вводят одну или несколько поддерживающих доз композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса; и/или (h) введение осуществляют путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения, например, путем ингаляции или внутривенного, подкожного или трансмукозального введения; и/или (i) иммунодепрессанты включают статин, ингибитор mTOR, где ингибитор mTOR является, например, рапамицином, TGF- β сигнальный агент, кортикостероид, ингибитор митохондриальной функции, ингибитор Р38, NF- κ β ингибитор, агонист аденозинового рецептора, агонист простагландина Е2, ингибитор фосфодиэстеразы 4, ингибитор HDAC или ингибитор протеасомы; и/или (j) внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпитопов в среднем в первом множестве синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50% (вес./вес.), например от 0,1 до 10% (вес./вес.), где внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпитопов в среднем в первом множестве синтетических наноносителей необязательно составляет по меньшей мере 2%, но не более 25% (вес./вес.).

3. Применение по п.1 или 2, где синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе поверхностно-активных веществ, дендримеры, бакиболлы, нанонити, вирусоподобные частицы или пептидные или белковые частицы.

4. Применение по п.3, где (а) синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, например синтетические наноносители первого множества включают липосомы; (b) синтетические наноносители первого множества включают металлические наночастицы, например металлические наночастицы включают наночастицы золота; (с) синтетические наноносители первого множества включают полимерные наночастицы, например, такие, где (i) полимерная наночастица содержит полимер, который представляет собой не содержащий концевую метоксигруппу плюрониевый полимер; и/или (ii) полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, полиаминокислоту, поликарбонат, полиацеталь, поликеталь, полисахарид, полиэтилоксазолин или полиэтиленимин, например, сложный полиэфир включает поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот или поликапролактон, и/или полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир и сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, например, где указанный простой полиэфир включает полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.

5. Применение по любому из пп.1-4, где (а) у синтетических наноносителей первого множества среднее значение распределения по размеру частиц, полученного с помощью динамического рассеяния света, представляет собой диаметр, составляющий (i) более 100 нм; (ii) более 150 нм; (iii) более 200 нм; (iv) более 250 нм или (v) более 300 нм; и/или (b) соотношение размеров синтетических наноносителей первого множества составляет более чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.

6. Применение по любому из пп.1-5, где Т-эффекторные клетки представляют собой CD4 + и/или CD8 + Т-клетки.

7. Способ, включающий: (i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) получение эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса; (iii) оценку эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что (а) способ дополнительно включает получение лекарственной формы, содержащей первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса; и/или (b) способ дополнительно включает получение композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, или лекарственной формы, доступной пациенту для введения, при этом способ необязательно дополнительно включает оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения композиции или лекарственной формы; и/или (с) Т-эффекторные клетки представляют собой CD4 + Т-клетки и/или CD8 + Т-клетки; и/или (d) получаемые первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, определены в любом из пп.1-6.

9. Способ получения композиции, включающий стадии: (i) связывания первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами; (ii) предоставления эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса; и (iii) оценки эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток, необязательно включающий стадии, как определено в способе по п.7 или 8.

10. Способ получения лекарственной формы, включающий стадии: (i) связывания первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами; (ii) предоставления эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса; (iii) оценки эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток, необязательно включающий стадии, как определено в способе по п.7 или 8.

11. Композиция, получаемая посредством способа по любому из пп.7-9 или как определено в любом из пп.1-6.

12. Лекарственная форма, получаемая посредством способа по любому из пп.7, 8 или 10 или как определено в любом из пп.1-6.

13. Композиция, содержащая: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса; (iii) фармацевтически приемлемый эксципиент, отличающаяся тем, что композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента.

14. Применение в лечебной терапии или профилактике композиции, включающей: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, где композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента, и необязательно предназначена для применения в способе: (a) лечения, включающем стадию введения указанной композиции пациенту и оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения; (b) лечения, включающем стадию введения указанной композиции пациенту в соответствии с разработанным ранее протоколом, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; (c) лечения или профилактики, как определено в любом одном из пп.1-6; (d) лечения или профилактики воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина", например, путем снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток; (e) лечения пациента, которому проделали или будут делать трансплантацию; (f) лечения пациента, которому вводили или будут вводить терапевтический белок; или (g) лечения в сочетании с пересаживаемым трансплантируемым материалом или терапевтическим белком.

15. Применение по п.14, где: (a) композиция является такой, как определено в любом из пп.1-6; и/или (b) композиция предназначена для применения в способе лечебной терапии или профилактики, включающем введение путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения, например, как определено в п.3.

16. Лекарственная форма, содержащая композицию по любому из пп.1-6 и 11 или 13.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Применение композиции, содержащей: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; и (ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, в способе, включающем: (a) введение композиции пациенту в соответствии с разработанным ранее протоколом, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; или (b) снижение числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; или (c) снижение числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких пациентов.

2. Применение по п.1, где (а) способ дополнительно включает предоставление или выявление пациента; и/или (b) антиген представляет собой терапевтический белок, аутоантиген или аллерген, или ассоциирован с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплантат против хозяина"; и/или (с) способ дополнительно включает оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения композиции; и/или (d) пациент имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина"; и/или (е) пациенту проделали или будут делать трансплантацию; (f) пациент имеет или существует риск развития у него нежелательного иммунного ответа на терапевтический белок, который вводят или будут вводить пациенту; (g) пациенту вводят одну или несколько поддерживающих доз композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса; и/или (h) введение осуществляют путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения, например, путем ингаляции или внутривенного, подкожного или трансмукозального введения; и/или (i) иммунодепрессанты включают статин, ингибитор mTOR, где ингибитор mTOR является, например, рапамицином, TGF- β сигнальный агент, кортикостероид, ингибитор митохондриальной функции, ингибитор Р38, NF- κ β ингибитор, агонист аденозинового рецептора, агонист простагландина Е2, ингибитор фосфодиэстеразы 4, ингибитор HDAC или ингибитор протеасомы; и/или (j) внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпитопов в среднем в первом множестве синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50% (вес./вес.), например от 0,1 до 10% (вес./вес.), где внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпитопов в среднем в первом множестве синтетических наноносителей необязательно составляет по меньшей мере 2%, но не более 25% (вес./вес.).

3. Применение по п.1 или 2, где синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе поверхностно-активных веществ, дендримеры, бакиболлы, нанонити, вирусоподобные частицы или пептидные или белковые частицы.

4. Применение по п.3, где (а) синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, например синтетические наноносители первого множества включают липосомы; (b) синтетические наноносители первого множества включают металлические наночастицы, например металлические наночастицы включают наночастицы золота; (с) синтетические наноносители первого множества включают полимерные наночастицы, например, такие, где (i) полимерная наночастица содержит полимер, который представляет собой не содержащий концевую метоксигруппу плюрониевый полимер; и/или (ii) полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, полиаминокислоту, поликарбонат, полиацеталь, поликеталь, полисахарид, полиэтилоксазолин или полиэтиленимин, например, сложный полиэфир включает поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот или поликапролактон, и/или полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир и сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, например, где указанный простой полиэфир включает полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.

5. Применение по любому из пп.1-4, где (а) у синтетических наноносителей первого множества среднее значение распределения по размеру частиц, полученного с помощью динамического рассеяния света, представляет собой диаметр, составляющий (i) более 100 нм; (ii) более 150 нм; (iii) более 200 нм; (iv) более 250 нм или (v) более 300 нм; и/или (b) соотношение размеров синтетических наноносителей первого множества составляет более чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.

6. Применение по любому из пп.1-5, где Т-эффекторные клетки представляют собой CD4 + и/или CD8 + Т-клетки.

7. Способ, включающий: (i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) получение эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса; (iii) оценку эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что (а) способ дополнительно включает получение лекарственной формы, содержащей первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса; и/или (b) способ дополнительно включает получение композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, или лекарственной формы, доступной пациенту для введения, при этом способ необязательно дополнительно включает оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения композиции или лекарственной формы; и/или (с) Т-эффекторные клетки представляют собой CD4 + Т-клетки и/или CD8 + Т-клетки; и/или (d) получаемые первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, определены в любом из пп.1-6.

9. Способ получения композиции, включающий стадии: (i) связывания первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами; (ii) предоставления эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса; и (iii) оценки эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток, необязательно включающий стадии, как определено в способе по п.7 или 8.

10. Способ получения лекарственной формы, включающий стадии: (i) связывания первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами; (ii) предоставления эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса; (iii) оценки эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток, необязательно включающий стадии, как определено в способе по п.7 или 8.

11. Композиция, получаемая посредством способа по любому из пп.7-9 или как определено в любом из пп.1-6.

12. Лекарственная форма, получаемая посредством способа по любому из пп.7, 8 или 10 или как определено в любом из пп.1-6.

13. Композиция, содержащая: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса; (iii) фармацевтически приемлемый эксципиент, отличающаяся тем, что композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента.

14. Применение в лечебной терапии или профилактике композиции, включающей: (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; (ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, где композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента, и необязательно предназначена для применения в способе: (a) лечения, включающем стадию введения указанной композиции пациенту и оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения; (b) лечения, включающем стадию введения указанной композиции пациенту в соответствии с разработанным ранее протоколом, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; (c) лечения или профилактики, как определено в любом одном из пп.1-6; (d) лечения или профилактики воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина", например, путем снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток; (e) лечения пациента, которому проделали или будут делать трансплантацию; (f) лечения пациента, которому вводили или будут вводить терапевтический белок; или (g) лечения в сочетании с пересаживаемым трансплантируемым материалом или терапевтическим белком.

15. Применение по п.14, где: (a) композиция является такой, как определено в любом из пп.1-6; и/или (b) композиция предназначена для применения в способе лечебной терапии или профилактики, включающем введение путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения, например, как определено в п.3.

16. Лекарственная форма, содержащая композицию по любому из пп.1-6 и 11 или 13.


Евразийское 027259 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201391608
(22) Дата подачи заявки 2012.04.27
(51) Int. Cl.
A61K 47/48 (2006.01) A61K 47/30 (2006.01) A61K 9/127 (2006.01) A61K39/38 (2006.01) A61K31/445 (2006.01)
(54)
НАНОНОСИТЕЛИ, ВЫРАБАТЫВАЮЩИЕ ИММУННУЮ ТОЛЕРАНТНОСТЬ, ДЛЯ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКОГО УДАЛЕНИЯ Т-ЭФФЕКТОРНЫХ КЛЕТОК
(31)
61/480,946; 61/513,514; 61/531,147; 61/531,153; 61/531,164; 61/531,168;
(32)
(33) (43)
(86) (87)
61/531,175; 61/531,180; 61/531,194; 61/531,204; 61/531,209; 61/531,215 2011.04.29; 2011.07.29; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06; 2011.09.06
2014.09.30
PCT/US2012/035555 WO 2012/149393 2012.11.01
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
СЕЛЕКТА БАЙОСАЙЕНСИЗ, ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Фрейзер Кристофер, Кисимото Такаси Кеи, Мальдонадо Роберто А. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20100151000 US-A1-20100129439 WO-A2-2010138192 US-A1-20110070154
(57) Раскрыты способы синтетических наноносителей и относящиеся к ним композиции, включающие введение иммунодепрессантов и эпитопов, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, которые могут вызвать толерантные иммунные ответы (например, удаление антиген-специфических Т-эффекторных клеток).
Родственные заявки
Заявка на данный патент претендует на приоритет в соответствии с 35 U.S.C. §119 предварительной заявки на патент США 61/480946, поданной 29 апреля 2011 г., 61/513514, поданной 29 июля 2011 г., 61/531147, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531153, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531164, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531168, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531175, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531180, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531194, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531204, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531209, поданной 6 сентября 2011 г., 61/531215, поданной 6 сентября 2011 г., полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылок.
Область изобретения
Данное изобретение относится к способам введения композиций синтетических наноносителей с иммунодепрессантами и эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса, и/или эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости II класса, которые при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса или молекулой главного комплекса гистосовместимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам, и относящимся к ним композициям. Способы в некоторых вариантах осуществления делают возможным путем эффективного захвата анти-генпрезентирующими клетками (АРС) сдвигать иммунный ответ в сторону удаления антиген-специфических Т-эффекторных клеток.
Предпосылки изобретения
Традиционные подходы к выработке иммуннодепрессии, связанной с нежелательным иммунным ответом, основаны на иммуноподавляющих препаратах широкого спектра действия. Кроме того, для поддержания иммунодепрессии терапия иммуноподавляющими препаратами обычно является пожизненной. К сожалению, использование иммуноподавляющих препаратов (иммунодепрессантов) широкого спектра действия связано с риском возникновения серьезных побочных явлений, таких как опухоли, инфекции, нефротоксичность и нарушения метаболизма. Соответственно, полезным было бы появление новых видов иммуноподавляющей терапии.
Краткое описание изобретения
В другом аспекте предложен способ, включающий введение композиции субъекту согласно ранее разработанному протоколу, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых субъектов, где композиция содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса или главным комплексом гистосовместимости II класса. В другом аспекте предложен способ, включающий снижение числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых субъектов путем введения композиции одному или нескольким исследуемым субъектам, где композиция содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гисто-совместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса. В другом аспекте предложен способ, включающий введение субъекту композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовме-стимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса.
Предпочтительно эпитопы при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса и/или главного комплекса гистосовместимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам. В одном варианте осуществления Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ или CD8+ Т-клетки.
В одном варианте осуществления первое множество и второе множество являются одним и тем же множеством. В другом варианте осуществления первое множество и второе множество различны.
В другом варианте осуществления способ, кроме того, включает обеспечение и идентификацию субъекта.
В другом варианте осуществления антиген представляет собой терапевтический белок, аутоантиген или аллерген или связан с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплантат против хозяина".
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта до и/или после введения композиции.
В другом варианте осуществления субъект имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина". В другом варианте осуществления субъекту проделали или будут делать трансплантацию. В другом варианте осуществления субъект имеет или существует риск развития у него нежелательного иммунного ответа на терапевтический белок, который вводят или будут вводить субъекту.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает введение пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка. В одном варианте осуществления пациенту вводят одну или больше поддерживающих доз композиции, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей.
В другом варианте осуществления введение проводят путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, орального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения. В другом варианте осуществления введение проводят путем ингаляции или внутривенного, подкожного или трансмукозального введения. В другом варианте осуществления введение пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка, когда терапевтический белок представлен в виде одной или более клеток, можно проводить парентерально, внутриартери-ально, интраназально или внутривенно или путем инъекций в лимфатические узлы или переднюю камеру глаза или путем местного введения в орган или ткань, представляющие интерес.
В другом варианте осуществления иммунодепрессанты содержат статин, ингибитор mTOR, TGF-p сигнальный агент, кортикостероид, ингибитор митохондриальной функции, ингибитор р38, NF-кР ингибитор, агонист рецептора аденозина, агонист простагландина Е2, ингибитор фосфодиэстеразы-4, ингибитор деацетилазы гистонов или ингибитор протеасомы. В другом варианте осуществления ингибитор mTOR является рапамицином или аналогом рапамицина.
В другом варианте осуществления среднее внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпи-топов или белков, полипептидов или пептидов, содержащих эпитопы, которые связаны с синтетическими наноносителями, на первое и/или второе множество синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50% (вес./вес.). В другом варианте осуществления среднее внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпитопов, или белков, полипептидов или пептидов, содержащих эпитопы, которые связаны с синтетическими наноносителями, на первое и/или второе множество синтетических наноносителей составляет от 0,1 до 10% (вес./вес.).
В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат липидные наночастицы, полимерные эмульсии, металлические наночастицы, эмульсии на основе ПАВ, дендримеры, бакиболлы, нанонити, вирусоподобные частицы или пептиды или частицы пептидов. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат липидные наночастицы. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат липосомы. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат металлические наночастицы. В другом варианте осуществления металлические наночастицы включают золотые наночастицы. В другом варианте осуществления синтетические наноносители первого множества и/или второго множества содержат полимерные наночастицы. В другом варианте осуществления полимерные наночастицы содержат полимер без концевой метоксигруппы, плюрониевый полимер. В другом варианте осуществления полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, полиаминокислоту, поликарбонат, полиацеталь, поликеталь, полисахарид, полиэтилоксазолин или полиэтиленимин. В другом варианте осуществления полиэфир включает поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот или поликапролактон. В другом варианте осуществления полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир и сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром. В другом варианте осуществления полиэфир включает полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль.
В другом варианте осуществления в дисперсный состав частиц, измеренный путем динамического рассеяния светом наночастиц первого и/или второго множества, входят частицы диаметром более 100 нм. В другом варианте осуществления диаметр больше чем 150 нм. В другом варианте осуществления диаметр больше чем 200 нм. В другом варианте осуществления диаметр больше чем 250 нм. В другом варианте осуществления диаметр больше чем 300 нм.
В другом дополнительном варианте осуществления соотношение размеров синтетических наноно-сителей первого и/или второго множества больше чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.
В другом аспекте предложен способ, включающий (i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) получение второго множества синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовмести-мости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса; и оценку эффекта от первого и второго множества синтетических наноносителей на число или а активность антиген-специфических Т-эффекторных клеток. В одном варианте осуществления этот эффект оценивают у пациента после введения первого и второго множества синтетических наноносителей субъекту. В другом варианте осуществления эффект оценивают, используя пробу, взятую у субъекта.
В другом варианте осуществления первое множество и второе множества представляют собой одно и то же множество. В другом варианте осуществления первое множество и второе множества представляют собой разные множества.
В другом варианте осуществления способ, помимо того, включает изготовление лекарственной
формы, содержащей первое множество, второе множество синтетических наноносителей. В другом варианте осуществления способ, помимо того, включает изготовление композиции, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей, или ее лекарственной формы, пригодной для введения субъекту. В другом варианте осуществления способ, кроме того, включает оценку количества или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта до и/или после введения композиции или лекарственной формы.
Предпочтительно эпитопы при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса и/или главного комплекса гистосовместимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам. В одном варианте осуществления Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ или CD8+ Т-клетки.
В другом варианте осуществления первое множество и второе множество получаемых синтетических наноносителей определены в любом из способов и композиций, предложенных здесь.
В другом аспекте предложен способ, включающий (i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) получение второго множества синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовмести-мости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса; и (iii) оценку эффекта от первого и второго множества синтетических наноносителей на число или активность антиген-специфических Т-эффекторных клеток. В одном варианте осуществления такой эффект оценивают у пациента после введения первого и второго множества синтетических наноносителей субъекту. В другом варианте осуществления эффект оценивают, используя пробу, взятую у субъекта. В другом варианте осуществления процесс включает стадии, как определено для любого из предложенных в настоящем документе способов.
В другом аспекте предложена композиция или лекарственная форма, полученная при помощи любого из описанных в настоящем документе способов или процессов.
В другом аспекте предложена композиция, содержащая первое множество синтетических наноно-сителей, связанных с иммунодепрессантами, второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, и фармацевтически приемлемый наполнитель. В одном варианте осуществления композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта. Предпочтительно эпитопы при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса и/или главного комплекса гисто-совместимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам. В одном варианте осуществления Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ или CD8+ Т-клетки.
В другом аспекте предложена композиция, содержащая первое множество синтетических наноно-сителей, связанных с иммунодепрессантами, второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, и пересаживаемый трансплантируемый материал или терапевтический белок, а фармацевтически приемлемый наполнитель включен по выбору. В одном варианте осуществления композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта. Предпочтительно эпитопы при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса и/или главного комплекса гистосовме-стимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам. В одном варианте осуществления Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ или CD8+ Т-клетки.
В другом аспекте предложена композиция, содержащая первое множество синтетических наноно-сителей, связанных с иммунодепрессантами, второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, для применения в терапевтическом лечении или профилактике. В одном варианте осуществления композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта. Предпочтительно эпи-топы при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса и/или главного комплекса гистосовместимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам. В одном варианте осуществления Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ или CD8+ Т-клетки.
В другом аспекте предложена композиция, содержащая первое множество синтетических наноно-сителей, связанных с иммунодепрессантами, второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, для применения в способе:
a) лечения, включающем стадию введения указанной композиции субъекту и оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта до и/или после введения;
b) лечения, включающем стадию введения указанной композиции субъекту и оценку удаления ан
тиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта до и/или после введения;
c) лечения, включающем стадию введения указанной композиции субъекту в соответствии с разработанным ранее протоколом, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых субъектов;
d) удаления антиген-специфических Т-эффекторных клеток;
e) лечения или профилактики, как определено в любом из способов, предложенных в данном документе;
f) лечения или профилактики воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина", например, путем снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток;
g) лечения субъекта, которому проделали или будут делать трансплантацию;
h) лечения субъекта, которому вводили или будут вводить терапевтический белок; или L лечения в сочетании с пересаживаемым трансплантируемым материалом или терапевтическим белком.
В одном варианте осуществления композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта. Предпочтительно эпитопы при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса и/или главного комплекса гистосовместимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам. В одном варианте осуществления Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ или CD8+ Т-клетки.
В другом аспекте предложено применение композиции, содержащей (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических нано-носителей, связанных с эпитопами антигена, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, для изготовления лечебного средства для применения в любом из способов, предложенных в данном документе. В одном варианте осуществления композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у субъекта. Предпочтительно эпитопы при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса и/или главного комплекса гистосовместимости II класса, соответственно, представляют собой эпитопы, имеющие сродство к антиген-специфическим Т-эффекторным клеткам. В одном варианте осуществления Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ или CD8+ Т-клетки.
В варианте осуществления любой из композиций или применений, предложенных в данном документе, композиция является такой, как определено в любом из предложенных способов, и/или композиция предназначена для применения в способе или терапевтическом лечении или профилактике, включающем введение путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, орального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения, как определено, например, в любом из предложенных способов.
В другом аспекте предоставлена лекарственная форма, содержащая любые из упомянутых в данном документе композиций.
В варианте осуществления любой из композиций или способов, предложенных в данном документе, антигены в основном не содержат В-клеточных эпитопов.
При исполнении любых из представленных в настоящем документе композиций или вариантов осуществления антигены белковой природы включают вышеупомянутые эпитопы и могут быть связаны с синтетическими наноносителями. В другом варианте осуществления полипептиды или пептиды, которые включают не только один или несколько вышеупомянутых эпитопов, но и дополнительные аминокислоты, которые находятся с одной или обеих сторон эпитопа/ов, могут связываться с синтетическими наноносителями. В другом варианте осуществления эпитопы сами связаны с синтетическими наноноси-телями.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает результаты анализа проточной цитометрии Т-регуляторных клеток.
Фиг. 2 показывает влияние синтетических наноносителей изобретения, содержащих иммунодепрес-сант (рапамицин или симвастатин), на число антиген-специфических эффекторных Т-клеток и процентную долю FoxP3+ клеток (после однократной инъекции).
Фиг. 3 показывает снижение количества клеток в подколенных лимфатических узлах при применении синтетических наноносителей изобретения, содержащих иммунодепрессант (рапамицин или симва-статин) (после многократных инъекций).
Фиг. 5 показывает снижение процентной доли делящихся CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток при введении синтетических наноносителей, содержащих иммунодепрессант и OVA пептид.
Подробное описание изобретения
Прежде чем давать подробное описание настоящего изобретения, следует понимать, что данное изобретение не ограничено исключительно представленными материалами или показателями процесса, так как они, безусловно, могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология используется в настоящем документе в целях описания лишь отдельных вариантов осуществления, и использование альтернативной терминологии для описания настоящего изобретения не ограничено.
Все публикации, патенты и заявки на патенты, цитированные в настоящем документе, а также ранее или позже, включены в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки для всех целей.
При упоминании в этой спецификации и прилагаемых пунктах формулы изобретения единственные формы предполагают множественные определяемые объекты, если только контекст явно не предполагает иное. Например, упоминание "полимер" включает смесь двух или более одинаковых молекул или смесь молекул с разными молекулярными массами одного вида полимера, упоминание "синтетический наноноситель" относится к смеси двух или более таких синтетических наноносителей или совокупности таких синтетических наноносителей, упоминание "молекула ДНК" включает смесь двух или более таких молекул ДНК или совокупность таких молекул ДНК, упоминание "иммунодепрессант" включает смесь двух или более таких веществ или совокупность молекул иммунодепрессантов и т.п.
Применяемое в настоящем документе выражение "содержат" или его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", следует читать, как указывающие на включение любого упомянутого целого (например, признака, элемента, характеристики, свойства, стадии способа/процесса или ограничения) или группы целых чисел (например, признаков, элемента, характеристик, свойств, стадий способа/процесса или ограничений), но не исключение любого другого целого или группы целых чисел. Таким образом, применяемое в настоящем документе выражение "содержащий" является включающим и не исключает дополнительные, неупомянутые целые или стадии способа/процесса.
В вариантах осуществления любых из приведенных в данном документе композиций и способов "содержащий" можно заменить на "по сути состоящий из" или "состоящий из". Фразу "по сути состоящий из" в данном документе применяют как предписывающую указанное(ые) целое(ые) или стадии, а также в существенной степени не влияющие на характер или функцию заявленного изобретения. Применяемое в настоящем документе выражение "состоящий" применяют для указания наличия только упомянутого целого (например, признака, элемента, характеристики, свойства, стадии способа/процесса или ограничения) или группы целых (например, признаков, элемента, характеристик, свойств, стадий способа/процесса или ограничений).
А. Введение
Как указано выше, современные традиционные иммунодепрессанты имеют широкий спектр действия и обычно приводят к общей системной деактивации иммунной системы. Композиции и способы, представленные в настоящем документе, вызывают более направленные иммунные эффекты, например, делая возможной адресную доставку к интересующим иммунным клеткам. Таким образом, композиции и способы помогают достичь иммунодепрессии более направленным способом. Это может быть полезным для снижения явлений, вызванных неэффективностью, и/или токсичности. Обнаружено, что более прямая доставка иммунодепрессантов и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовме-стимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса, к представляющим интерес клеткам, в частности, к АРС, может привести к снижению числа или активности Т-эффекторных клеток (например, CD4+, CD8+ Т-клеток). Уменьшение числа и/или активности Т-эффекторных клеток (т.е. эф-фекторных Т-клеток) может произойти путем удаления Т-эффекторных клеток, иммунологической толерантности, снижения или отсутствия стимуляции Т-эффекторных клеток, сдвига с вызывающему иммунную толерантность фенотипу и т.п. Это уменьшение может быть оценено различными путями, включая описанные здесь, или известными специалистам в данной области. Например, уменьшение числа или активности Т-эффекторных клеток можно измерить путем оценки числа Т-эффекторных клеток, путем оценки увеличения числа Т-эффекторных клеток, путем оценки цитокинов, производимых Т-эффекторными клетками и т.п. Такие оценочные анализы могут быть выполнены in vitro или in vivo. В качестве примера субъекту может быть введена композиция, как приведена в данном документе, и оценка может быть выполнена после введения. Это может быть сделана, используя пробу, взятую у субъекта.
Как было показано в примерах ниже, композиция данного изобретения были успошно применены для уменьшения числа или активности эффекторных Т-клеток in vivo. Примеры показывают уменьшение количества CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток, а также процентной доли делящихся клеток для таких клеток, при введении синтетических наноносителей, содержащих иммунодепрессант и антиген, такой, как OVA пептид. Таким образом, настоящее изобретение полезно, например, для стимулирования толерантного иммунного ответа путем уменьшения числа или активности Т-эффекторных клеток у тех, кто имеет или у кого существует риск развития аллергии, аутоиммунного заболевания, воспалительного заболевания или болезни "трансплантат против хозяина". Настоящее изобретение также полезно для стимулирования толерантного иммунного ответа у субъектов, которым проделали или будут делать трансплантацию. Настоящее изобретение также полезно для стимулирования толерантного иммунного ответа у субъектов, которым проводили, проводят или будут проводить лечение терапевтическим белком, который
вызывает, или предполагается, что будет вызывать нежелательные иммунные ответы. Настоящее изобретение в некоторых своих вариантах осуществления предотвращает или подавляет нежелательные иммунные ответы, которые могут аннулировать положительный эффект от некоторых видов терапевтического лечения.
Изобретатели неожиданно обнаружили, что проблемы и ограничения, упомянутые выше, можно разрешить, применяя изобретение, описанное в настоящем документе. В частности, изобретатели неожиданно обнаружили, что возможно предложить синтетические наноносители и относящиеся к ним методы, которые приводят к толерантному иммунному ответу. В вариантах осуществления способы, предложенные в данном документе, могут быть применены для снижения числа или активности Т-эффекторных клеток либо in vitro (например, в популяции клеток в культуре), либо in vivo (например, у субъекта). Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, считают, что вызывающие иммунную толерантность композиции, предложенные в данном документе, могут влиять на снижение числа или активности Т-эффекторных клеток in vitro и/или in vivo за счет взаимодействия с Т-эффекторными клетками или предшественниками Т-эффекторных клеток, например, нативными Т-клетками, в присутствии иммуно-депрессантов.
Способ, описанный в данном документе, включает введение субъекту композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса. Предпочтительно композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности Т-эффекторных клеток у субъекта. В другом аспекте предложен способ, включающий снижение числа или активности Т-эффекторных клеток у субъекта путем введения композиции, которая содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносителей, связанных с эпитопами, ограниченными главным комплексом гистосов-местимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса. В другом аспекте предложен способ, включающий введение композиции субъекту согласно ранее разработанному протоколу, применение которого способствовало снижению числа или активности Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых субъектов, где композиция содержит (i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) второе множество синтетических наноносите-лей, связанных с эпитопами, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса.
Также могут быть введены пересаживаемые трансплантируемые материалы, терапевтические белки и т.п., как предложено в данном документе. Такие композиции можно вводить пациенту до, в сопровождении или после введения первого и второго множеств синтетических наноносителей. Такие дополнительные агенты могут быть или не быть связанными с первым или вторым множеством синтетических наноносителей или с другим множеством синтетических наноносителей. В вариантах осуществления предложенные композиции могут быть также введены субъекту в виде одной или нескольких поддерживающих доз. В таких вариантах осуществления изобретения предоставленные композиции вводят так, что число или активность Т-эффекторных клеток снижается на определенный период времени. Примеры подобных периодов времени приведены в настоящем документе.
В еще одном аспекте также предложены композиции, содержащие первое множество и второе множество синтетических наноносителей. В другом аспекте предложены лекарственные формы любой из композиций. Такие лекарственные формы могут быть введены субъекту, нуждающемуся в антиген-специфических толерантных иммунных ответах (например, в снижении числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток).
В еще одном аспекте предложен способ получения (i) первого множества синтетических наноноси-телей, связанных с иммунодепрессантами, и (ii) получения второго множества синтетических наноноси-телей, связанных с эпитопами, ограниченными главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса. В одном варианте осуществления способ, помимо того, включает получение лекарственной формы, содержащей первое и второе множества синтетических наноносителей. В другом варианте осуществления способ дополнительно включает обеспечение второго множества синтетических наноносителей, содержащих эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса. В одном варианте осуществления такое обеспечение может быть выполнено путем связывания полноразмерного белка с синтетическими наноносителями. В другом варианте осуществления такое обеспечение может быть выполнено путем связывания полипемтида или пептида, содержащего эпитопы, с синтетическими наноносителями. Способы для испытаний синтетических наноносителей с целью определения возможных получаемых иммунных ответов предоставлены в других разделах данного документа. Предпочтительно композиции являются эффективными для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток. Такие способы вместе с другими способами, известными специалистам в данной области, могут быть применены для обеспечения связывания синтетических наноноси-телей с желаемыми эпитопами.
В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает оценку снижения числа и/или активности Т-эффекторных клеток с помощью композиции или лекарственной формы, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает изготовление композиции, содержащей первое множество и второе множество синтетических наноносителей или ее лекарственной формы, пригодной для введения субъекту.
В другом аспекте также предложены композиции или лекарственные формы, полученные при помощи любого из описанных в настоящем документе способов.
Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.
В. Определения
"Введение" или "лечение" подразумевает предоставление вещества пациенту фармакологически полезным способом.
"Аллергены" представляют собой любые вещества, которые могут вызывать нежелательный (например, гиперчувствительный 1 типа) иммунный ответ (т.е. аллергический ответ или реакцию) у субъекта. Аллергены включают, но не ограничиваются ими, растительные аллергены (например, пыльца, аллерген амброзии), аллергены насекомых, аллергены укусов насекомых (например, аллергены укуса пчелы), животные аллергены (например, аллергены домашних животных, такие, как перхоть животных или кошачий Fel d 1 антиген), латексные аллергены, плесневые аллергены, грибковые аллергены, косметические аллергены, лекарственные аллергены, пищевые аллергены, пыль, яд насекомых, вирусы, бактерии и т.п. Пищевые аллергены включают, но не ограничиваются ими, молочные аллергены, яичные аллергены, ореховые аллергены (например, арахисовый аллерген или аллергены орехов, растущих на деревьях (например, грецкие орехи, кешью и и.п.)), рыбные аллергены, аллергены ракообразных, соевые аллергены, бобовые аллергены, семечковые аллергены или пшеничные аллергены. Аллергены укусов насекомых включают те, которые представляют собой или связаны с укусами пчел, укусами ос, укусами шершней, укусами осоподобных насекомых и т.п. Аллергены насекомых также включают аллергены клещей домашней пыли (например, Der P1 антиген) и аллергены тараканов. Лекарственные аллергены включают те, которые связаны с антибиотиками, НПВП, анастетиками и т.п. Аллергены пыльцы включают аллергены трав, аллергены деревьев, аллергены сорных трав, аллергены цветов, и т.п. Субъектов, у которых развивается нежелательный иммунный ответ или для которых существует риск его развития на любой из аллергенов, приведенных в данном документе, можно лечить, применяя любые предложенные здесь композиции и способы. Субъекты, которых можно лечить, применяя любые предложенные композиции и способы, также включают тех, у кого есть аллергия на любой из приведенных аллергенов или существует риск ее развития.
"Аллергия", на которую в данном документе также ссылаются как на "аллергическое заболевание", представляет собой состояние, при котором наблюдается нежелательная (например, гиперчувствительная 1 типа) иммунная реакция (т.е. аллергическая реакция или ответ) на вещество. Такие вещества в данном документе упоминаются как аллергены. Аллергии или аллергические заболевания включают, но не ограничиваются ими, аллергическую бронхиальную астму, поллиноз, крапивницу, экзему, аллергии на растения, аллергии на укусы пчел, аллергии на домашних животных, аллергии на латекс, аллергии на плесень, аллергии на косметические средства, пищевые аллергии, аллергические риниты или острый насморк, местные аллергические реакции, анафилаксию, атопический дерматит, реакции гиперчувствительности и другие аллергические заболевания. Аллергическая реакция может быть результатом иммунной реакции на любой аллерген. В некоторых вариантах осуществления аллергия представляет собой пищевую аллергию. Пищевые аллергии включают, не не ограничиваются ими, аллергии на молоко, аллергии на яйца, аллергии на орехи, аллергии на рыбу, аллергии на ракообразных, аллергии на сою или аллергии на пшеницу.
"Эффективное количество" в контексте композиции или лекарственной формы или введения субъекту подразумевает такое количество композиции или лекарственной формы, которое вызывает один или несколько желательных иммунных ответов у субъекта, например, вызов толерантного иммунного ответа (например, уменьшение увеличения числа, активации, индукции, рекрутинга CD8+ Т-клеток). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество является любым количеством предложенной в данном документе композиции, которое вызывает один или несколько таких желательных иммунных ответов. Это количество можно применять in vitro или in vivo. При введении in vivo количество может быть таким, что лечащий врач может убедиться в его клиническом преимуществе для субъекта, который нуждается в формировании антиген-специфической толерантности.
Эффективные количества могут включать только снижение уровня нежелательного иммунного ответа, хотя при некоторых способах они включают также и предотвращение нежелательного иммунного ответа. Эффективные количества могут также включать задержку возникновения нежелательного иммунного ответа. Количество, являющееся эффективным, также может являться таким количеством предоставленной в настоящем документе композиции, которое вызывает желательный терапевтический ожидаемый результат или желательный терапевтический результат. Эффективные количества преимущественно в результате вызывают у субъекта толерантную иммунную реакцию на антиген. Получение
любого из вышеупомянутых эффектов может наблюдаться с помощью распространенных методов. Предпочтительно эффективные количества в данном документе представляют собой те, которые приводят к снижению числа и/или активности Т-эффекторных клеток, такому, как удаление Т-эффекторных клеток.
В некоторых вариантах осуществления в любых из предоставленных композиций и способов эффективное количество является таким, при котором желательный иммунный ответ сохраняется у субъекта в течение по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет или дольше. В других вариантах осуществления любой из предоставленных композиций и способов эффективное количество таково, что вызывает измеряемый желательный иммунный ответ, например, измеряемое уменьшение имммунного ответа (например, к специфическому антигену), по меньшей мере на 1 неделю, по меньшей мере на 2 недели, по меньшей мере на 1 месяц, по меньшей мере на 2 месяца, по меньшей мере на 3 месяца, по меньшей мере на 4 месяца, по меньшей мере на 5 месяцев, по меньшей мере на 6 месяцев, по меньшей мере на 9 месяцев, по меньшей мере на 1 год, по меньшей мере на 2 года, по меньшей мере на 5 лет или больше.
Эффективные количества будут зависеть, конечно, от конкретного субъекта, подлежащего лечению; тяжести состояния, заболевания или расстройства; индивидуальных параметров пациента, включающих возраст, физическое состояние, размер и вес; продолжительность лечения; природы сопутствующей терапии (если таковая имеется); специфический путь введения и подобных факторов в пределах знания и практического опыта врача-терапевта. Эти факторы хорошо известны специалистам в настоящей области и могут предусматривать не более чем традиционное проведение исследования. В целом предпочтительно, чтобы применялась максимальная доза, т.е., наивысшая безопасная доза, в соответствии с результатами тщательной медицинской оценки. Специалисты в даннойобласти должны понимать, однако, что пациент может настаивать на применении более низкой или приемлемой дозы по медицинским причинам или практически по любой другой причине.
В общем, дозы иммунодепрессантов и/или антигенов в композициях настоящего изобретения могут составлять от около 10 до около 100000 мкг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозы могут составлять от около 0,1 до около 100 мг/кг. В других вариантах осуществления дозы могут составлять от около 0,1 до около 25 мг/кг, от около 25 до около 50 мг/кг, от около 50 до около 75 мг/кг или от около 75 до около 100 мг/кг. Альтернативно, дозу можно вводить на основе количества синтетических наноноси-телей, которые обеспечивают желаемое количество иммунодепрессантов и/или антигенов. Например, полезные дозы включают количества больше чем 106, 107, 108, 109 или 1010 синтетических наноносителей на одну дозу. Другие примеры полезных доз включают значения от около 1х106 до около 1х1010, от около 1х107 до около 1х109 или от около 1х108 до около 1х109 синтетических наноносителей на одну дозу.
"Антиген" означает В-клеточный антиген или Т-клеточный антиген. "Тип(ы) антигенов" означает молекулы, которые имеют одинаковые или практически одинаковые, антигенные характеристики. В некоторых вариантах осуществления антигены могут представлять собой белки, полипептиды, пептиды, липопротеины, гликолипиды, полинуклеотиды, полисахариды или содержатся в клетках или вырабатываются ими. В некоторых вариантах осуществления, когда, например, антигены определены или охарактеризованы соответствующим образом, антигены могут содержаться в образцах клеток или тканей, обломках клеток, клеточных экзосомах, кондиционированных средах и т.п. Антиген может быть связан с синтетическими наноносителями в той же форме, что и тот, который вызывает при своем наличии у субъекта нежелательную иммунную реакцию, но также может быть его фрагментом или его производным. Однако, если используется фрагмент или производное, желаемая иммунная реакция на форму, с которой сталкивается такой субъект, является предпочтительным результатом при использовании предложенных композиций и способов.
"Антиген-специфический" относится к любому иммунному ответу, возникающему на присутствие антигена, или части его, или вызывающему образование молекул, которые специфическим образом распознают антиген или связываются с ним. Например, если иммунный ответ представляет собой выработку антиген-специфических антител, вырабатываются антитела, которые специфически связываются с антигеном. В качестве другого примера, где иммунный ответ представляет собой увеличение числа и/или активность антиген-специфических CD8+ Т-клеток или CD4+ Т-клеток, увеличение числа и/или активность могут возникать в результате распознавания антигена, или его части, одного или в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости.
"Антигены, ассоциированные" с заболеванием, расстройством или состоянием, описанными в данном документе, представляют собой антигены, которые могут вызывать нежелательный иммунный ответ против, в результате или в связи с заболеванием, расстройством или состоянием; причину заболевания, расстройства или состояния (или симптом или его проявление); и/или могут вызывать нежелательный иммунный ответ, который является симптомом, результатом или проявлением заболевания, расстройства или состояния. Предпочтительно в некоторых вариантах осуществления применение антигенов, ассо
циированных с заболеванием, расстройством или состоянием и т.п., в композициях и способах, предложенных в данном документе, приводит к толерантному иммунному ответу на антиген и/или клеткам, которыми, на которых или в которых экспрессируется антиген. Антигены могут быть в той же форме, в которой они экспрессируются в субъекте, имеющем заболевание, расстройство или состояние, но также могут быть их фрагментом или производным. Однако, в случае их фрагмента или производного, желаемая иммунная реакция на форму, экспрессируемую у такого субъекта, является предпочтительным результатом при использовании предложенных композиций и способов. Антигены, ассоциированные с заболеванием, расстройством или состоянием, в некоторых вариантех осуществления включают эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса. В некоторых вариантах осуществления антигены в основном не содержат В-клеточные эпитопы, поскольку, когда болезнь, расстройство или состояние представляют собой иммунное заболевание или аллергию, то включение В-клеточного эпитопа может приводить к усилению нежелательного иммунного ответа. В других вариантах осуществления антигены включают В-клеточные эпи-топы.
В одном варианте осуществления антиген представляет собой антиген, ассоциированный с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплантат против хозяина". Такие антигены включают аутоантигены, такие, как основные белки миелина, коллаген (например, коллаген 11-го типа), человеческий хрящевой гликопротеин gp39, хромогра-нин А, гликопротеин 130-RAPS, протеолипидный белок, фибрилларин, ядерные белки, ядрышковые белки (например, малый ядрышковый белок), рецептор тиреотропного гормона, гистоны, гликопротеин gp 70, рибосомные белки, дигидролипоамид-ацетилтрансфераза пируватдегидрогеназы, антигены волосяного фолликула, человеческая изоформа тропомиозина 5, митохондриевые белки, белки р-клеток поджелудочной железы, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин, инсулин, декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD), глютен и их фрагменты или производные. Другие аутоантигены представлены в табл. 1 ниже.
Антигены также включают антигены, ассоциированные с отторжением органа или тканей. Примеры таких антигенов включают, но не ограничены ими, антигены аллогенных клеток, например, антигены из экстракта аллогенных клеток, и антигены других клеток, таких, как антигены эндотелиальных клеток.
Антигены также включают антигены, ассоциированные с аллергией. Такие антигены включают антигены, описанные в других частях данного документа.
Антигены также включают антигены, ассоциированные с пересаживаемым тарансплантируемым материалом. Такие антигены ассоциируются с пересаживаемым тарансплантируемым материалом или с нежелательным иммунным ответом у получателя пересаживаемого трансплантируемого материала, который вызван в результате введения пересаживаемого трансплантируемого материала в получателя, который может быть представлен для распознавания клетками иммунной системы и который может вызывать нежелательный иммунный ответ. Антигены также включают антигены, ассоциированные с отторжением органа или тканей или болезнью "трансплантат против хозяина". Антигены трансплантата могут быть получены или произведены из клеток биологического материала или из информации, относящейся к пересаживаемому трансплантируемому материалу. Антигены трансплантата обычно включают белки, полипептиды, пептиды, липопротеины, гликолипиды, полинуклеотиды или содержатся в клетках или вырабатываются ими. Информация, относящаяся к пересаживаемому трансплантируемому материалу, представляет собой любую информацию о пересаживаемом трансплантируемом материале, которую можно использовать для получения или производства антигенов трансплантата. Такая информация включает информацию об антигенах, от которых ожидается, что они будут присутствовать в клетках или на клетках пересаживаемого трансплантируемого материала, такую, как информация о последовательности, типе или классе антигенов и/или главном комплексе гистосовместимости I, главном комплексе гис-тосовместимости II или В-клетке, их презентирующих и ограничивающих. Такая информация может также включать информацию о типе пересаживаемого трансплантируемого материала (например, ауто-трансплантат, аллотрансплантат, ксенотрансплантат), молекулярном или клеточном составе трансплантируемого материала, положения на теле, из которого получен трансплантируемый материал, или на который трансплантируемый материал будет пересажен (например, целый или частичный орган, кожа, кость, нервы, сухожилие, нейроны, кровеносные сосуды, жировая ткань, роговица и т.п.).
Антигены также включают антигены, ассоциированные с терапевтическими белками, которые могут быть представлены для распознавания клетками иммунной системы, и которые могут вызывать нежелательный иммунный ответ на терапевтический белок. Антигены терапевтического белка обычно включают белки, полипептиды, пептиды, липопротеины или содержатся в или на клетках или вырабатываются ими.
Антигены могут быть антигенами, которые полностью определены или охарактеризованы. Однако в некоторых вариантах осуществления антиген не полностью определен или охарактеризован. Антигены, таким образом, также включают антигены, которые содержатся внутри образца клетки или ткани, обломках клеток, клеточных экзосом или кондиционированных средах и могут быть произведены в такой форме в некоторых вариантах осуществления.
"Оценка иммунного ответа" означает любое измерение или определение уровня, присутствия или отсутствия, уменьшения, увеличения и т.д. иммунного ответа in vitro или in vivo. Подобные измерения или определения могут быть произведены на одном или нескольких образцах, полученных от субъекта. Подобные измерения могут быть произведены любым из предоставленных в настоящем документе методов или другими, известными в данной области.
Субъектом с "повышенным риском" является такой пациент, в отношении которого лечащий врач уверен, что есть вероятность заболевания, нарушения или состояния, как описано в настоящем документе, или есть вероятность возникновения нежелательного иммунного ответа, как описано в настоящем документе.
"Аутоиммунное заболевание" представляет собой любое заболевание, при котором иммунная система генерирует повышенный нежелательный иммунный ответ против самой себя (например, один или несколько аутоантигенов). В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание заключается в аномальном разрушении клеток тела, как части направленного против себя иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления самодеструкция проявляется в нарушении работы органа, например, толстой кишки или поджелудочной железы. Примеры аутоиммунных заболеваний описаны в других местах данного документа. Дополнительные аутоиммунные заболевания хорошо известны специалистам в данной области, и изобретение не ограничено в этом отношении.
"В среднем" в контексте настоящего документа относится к среднему арифметическому, если не указано другое.
"В-клеточный антиген" относится к любому антигену, который инициирует иммунный ответ В-клетки (например, антиген, который специфически распознается В-клеткой или ее рецептором). В некоторых вариантах осуществления антиген, который является Т-клеточным антигеном, также является В-клеточным антигеном. В других вариантах осуществления Т-клеточный антиген не является В-клеточным антигеном.
В-клеточные антигены включают белки, пептиды, малые молекулы и углеводороды, но не ограничены ими. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген содержит небелковый антиген (т.е. небелковый и непептидный антиген). В некоторых вариантах осуществления антиген В-клетки включает аутоантиген. В некоторых вариантах осуществления В-клеточный антиген получен из аллергена, аутоантигена, терапевтического белка или трансплантируемого материала или является их производным.
"Одновременно" означает введение пациенту двух или больше веществ способом, который совпадает во времени, предпочтительно в достаточном объеме, чтобы обеспечить модуляцию иммунного ответа. В вариантах осуществления одновременное введение может происходить путем введения двух или более веществ в одной и той же лекарственной форме. В других вариантах осуществления одновременное введение может включать введение двух или больше веществ в различных лекарственных формах в пределах определенного периода времени, предпочтительно в течение 1 месяца, предпочтительнее в течение 1 недели, еще более предпочтительно в 1 день или еще лучше в течение 1 ч.
"Связь", или "связанные", или "связи" (и т.п.) означает химически ассоциированные друг с другом в одну частицу (например, в функциональную группу). В некоторых вариантах осуществления связь является ковалентной, т.е. связывание происходит в присутствии ковалентной связи между частицами. При нековалентном присоединении нековалентное связывание осуществляется посредством нековалентных взаимодействий, которые включают взаимодействия зарядов, взаимодействие между антигеном и антителом, координацию металла, физическую абсорбцию, взаимодействия по типу хозяин-гость, гидрофобные взаимодействия, стэкинг-взаимодействие ТТ, водородные связи, взаимодействия ван дер Ваальса, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия, взаимодействия между диполями и/или их комбинации. В вариантах осуществления инкапсуляция является формой связывания.
"Деривированный" означает приготовленный из вещества или с использованием данных о веществе, но не "полученный" из вещества. Подобные вещества могут являться в значительной степени моди-фицироваными или преобразованными формами веществ, полученных непосредственно из биологического материала. Такие вещества также могут включать вещества, полученные с использованием данных, связанных с биологическим материалом.
"Лекарственная форма" означает фармакологически и/или иммунологически активное вещество в посреднике, носителе, наполнителе или приспособлении, удобном для введения вещества пациенту.
"Инкапсулировать" означает заключать по меньшей мере часть вещества в синтетическом наноно-сителе. В некоторых вариантах осуществления осуществления вещество полностью в синтетическом на-ноносителе. В других способах осуществления большая часть или все вещество, которое инкапсулировано, не подвергается воздействию локального окружения, внешнего по отношению к синтетическому на-ноносителю. В других способах не более 50, 40, 30, 20, 10 или 5% (вес./вес.) выделяется в местную среду. Инкапсуляция отличается от абсорбции, при которой все вещество или его большая часть находится на поверхности синтетического наноносителя и остается снаружи синтетического наноносителя во внешней среде.
"Эпитоп", также известный как антигенная детерминанта, является частью антигена, которая распо
знается иммунной системой специфически, например, антителами, В-клетками или Т-клетками. В контексте настоящего документа, "эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса" являются эпитопами, которые презентируются иммунным клеткам молекулами главного комплекса гистосовместимости I класса, находящимися на клетках с ядрами. "Эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса" являются эпитопами, которые презентируются иммунным клеткам молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, находящимися на антиген-презентирующих клетках (АРС), например, на профессиональных антиген-презентирующих иммунных клетках, таких как макрофаги, В-клетки и дендритные клетки, или на негематопоэтических клетках, таких как гепатоциты. "В-клеточные эпитопы" являются молекулярными структурами, которые распознаются антителами или В-клетками. В некоторых вариантах осуществления сам эпитоп является антигеном. Предпочтительно для получения в результате желаемого иммунного ответа, предложенного в данном документе, эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченными главным комплексом гистосовместимости II класса, представляют собой такие эпитопы, которые при презентации молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса или молекулой главного комплекса гистосовместимости II класса, соответственно, связываются рецепторами Т-клеток и приводят к удалению, ингибированию активности и т.п. Т-эффекторных клеток. Поскольку Т-эффекторные клетки секретируют цитокины и другие молекулы, которые могут приводить к нежелательным иммунным ответам, уменьшение их количества может подавлять другие нежелательные иммунные ответы.
В данной области известны многие эпитопы, и некоторые примеры эпитопов, соответствующих данному изобретению, содержат эпитопы, внесенные в списки Базы данных иммунных эпитопов, но не ограничены ими (www.immuneepitope.org, Vita R., Zarebski L., Greenbaum J.A., Emami H., Hoof I., Salimi N., Damle R., Sette A., Peters B. The immune epitope database 2.0. Nucleic Acids Res. 2010 Jan; 38(Database issue):D854-62; полный перечень которых, а также все статьи базы данных IEDB version 2.4, August 2011, и в особенности все эпитопы, упомянутые в настоящем документе, включены сюда посредством данной ссылки). Эпиопы также могут быть идентифицированы при помощи общедоступных методов, например, описанных у Wang P., Sidney J., Kim Y., Sette A., Lund O., Nielsen M., Peters B. 2010. peptide binding predictions for HLA DR, DP and DQ molecules. BMC Bioinformatics 2010, 11:568; Wang P., Sidney J., Dow C., Mothe B., Sette A., Peters B. 2008. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput Biol. 4(4):e1000048; Nielsen M., Lund O. 2009. NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC class II peptide binding prediction. BMC Bio-informatics. 10:296; Nielsen M., Lundegaard C., Lund O. 2007. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8:238; Bui HH, Sidney J., Peters B., Sathiamurthy M., Sinichi A., Purton K.A., Mothe B.R., Chisari F.V., Watkins D.I., Sette A. 2005. Immunogenetics. 57:304-314; Sturniolo T., Bono E., Ding J., Raddrizzani L., Tuereci O., Sahin U., Braxenthaler M., Gallazzi F., Protti M.P., Sinigaglia F., Hammer J. 1999. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat Biotechnol. 17(6):555-561; Nielsen M., Lundegaard C., Worning P., Lauemoller S.L., Lamberth K., Buus S., Brunak S., Lund O. 2003. Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations. Protein Sci 12:1007-1017; Bui HH, Sidney J., Peters B., Sathiamurthy M., Sinichi A., Purton K.A., Mothe B.R., Chisari F.V., Watkins D.I., Sette A. 2005. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics 57:304-314; Peters В., Sette A. 2005. Generating quantitative models describing the sequence specificity of biological processes with the stabilized matrix method. BMC Bioinformatics 6:132; Chou P.Y., Fasman G.D. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148; Emini E.A., Hughes J.V., Perlow D.S., Boger J. 1985. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J. Virol 55:836-839; Karplus P.A., Schulz G.E. 1985. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften 72:212-213; Kolaskar A.S., Tongaonkar P.C. 1990. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett276:172-174; Parker J.M., Guo D., Hodges R.S. 1986. New hydrophilic-ity scale derived from high-performance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and X-ray-derived accessible sites. Biochemistry 25:5425-5432; Larsen J.E., Lund O., Nielsen M. 2006. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res 2:2; Ponoma-renko J.V., Bourne P.E. 2007. Antibody-protein interactions: benchmark datasets and prediction tools evaluation. BMC Struct Biol 7:64; Haste Andersen P., Nielsen M., Lund O. 2006. Prediction of residues in discontinuous B-cell epitopes using protein 3D structures. Protein Sci 15:2558-2567; Ponomarenko J.V., Bui H., Li W., Fusseder N., Bourne P.E., Sette A., Peters B. 2008. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics 9:514; Nielsen M., Lundegaard C., Blicher T., Peters B., Sette A., Justesen S., Buus S., and Lund O. 2008. PLoS Comput Biol 4(7)e1000107. Количественные предсказания связывания пептидов с любой молекулой HLA-DR известной последовательности: NetMHCIIpan; полное содержание каждого из которых включено сюда посредством данной ссылки для описания способов или алгоритмов идентификации эпитопов.
Другие примеры эпитопов, как приведено в данном документе, включают любые из эпитопов, огра
ниченных главным комплексом гистосовместимости I класса, ограниченных главным комплексом гисто-совместимости II класса, и В-клеточные эпитопы, как приведены в качестве SEQ ID №:1-943. Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, эпитопы, ограниченные главным комплексом гис-тосовместимости I класса, включают те, которые указаны в SEQ ID №: 1-186, эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, включают те, которые указаны в SEQ ID №: 187-537, а В-клеточные эпитопы включают те, которые указаны в SEQ ID №: 538-943. Эти эпитопы включают эпитопы аллергенов, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса, эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, и В-клеточные эпитопы аутоантигенов и аллергенов.
"Вызов" означает стимуляцию действия, такого как иммунный ответ (т.е., толерантный иммунный ответ), либо непосредственную, либо опосредованную, такую как при помощи третьей стороны, которая принимает действия с опорой на слова или поступки другого.
"Идентификация" является любым действием или комплексом действий, которые позволяют врачу-клиницисту определить, что пациент получит пользу от способов и композиций, предоставленных в настоящем документе. Предпочтительно идентифицированным субъектом является тот, кто нуждается в толерантных иммунных ответах, предоставленных в данном документе. Действие или комплекс действий могут являться напрямую или косвенно, такими как, но не ограниченными, независимой третьей стороной, которая принимает действия с опорой на слова или поступки другого.
"Иммунодепрессант" означает соединение, которое вызывает у АРС проявление иммунодепрессив-ного (т.е. толерантного) эффекта. Иммунодепрессивный эффект обычно относится к продуцированию или проявлению цитокинеза или других факторов АРС, которые уменьшают, ингибируют или предотвращают нежелательный иммунный ответ или которые вызывают желательный иммунный ответ. Когда АРС оказывают иммунодепрессивный эффект на иммунные клетки, распознающие антиген, презентиро-ванный АРС, об иммуннодепрессивном эффекте говорят, что он специфический к презентированному антигену. Подобный эффект упоминается в настоящем документе как вызывающий иммунную толерантность эффект. Не ограничиваясь какой-либо определенной теорией, считают, что иммуннодепрессивный или вызывающий иммунную толерантность эффект является результатом доставки иммунодепрессанта к АРС, предпочтительно в присутствии антигена (т.е. вносимого антигена или такого, который уже присутствует in vivo). Соответственно, иммунодепрессант содержит соединения, которые обеспечивают толерантный иммунный ответ на антиген, который может быть предоставлен или не предоставлен в одной и той же или иной композиции. В одном способе иммунодепрессант заставляет АРС запускать регуля-торный фенотип у одной или нескольких иммунных эффекторных клеток. Например, регуляторный фенотип может характеризоваться ингибированием вырабатывания, индукции, стимуляции или рекрутинга антиген-специфических CD4+ Т-клеток или CD8+ Т-клеток, ингибированием вырабатывания антиген-специфических антител, вырабатывания, индукции, стимуляции или рекрутинга регуляторных Т-клеток (например, CD4+CD25highFoxP3+ регуляторных Т-клеток), и т.д. Это может быть результатом конверсии CD4+ Т-клеток, или CD8+ Т-клеток, или В-клеток в регуляторный фенотип. Это также может быть результатом вызова FoxP3 в другие иммунные клетки, такие как CD8+ Т-клетки, макрофаги и iNKT-клетки (нативные киллеры). В одном варианте осуществления иммунодепрессант является таким, который действует на ответ АРС после того, как он обработал антиген. В другом варианте осуществления иммуноде-прессант не влияет на обработку антигена. В последующем варианте осуществления иммунодепрессант не является сигнальной молекулой апоптоза. В другом способе иммунодепрессант не является фосфоли-пидом.
Иммуносупрессоры включают без ограничения статины; ингибиторы mTOR, такие как рапамицин или аналог рапамицина; TGF-р сигнальные средства; агонисты TGF-р рецептора; ингибиторы гистонде-ацетилазы, такие как трихостатин А; кортикостероиды; ингибиторы митохондриальной функции, такие как ротенон; ингибиторы Р38; NF-кР ингибиторы, такие как 6Bio, дексаметазон, ТСРА-1, IKK VII; агонисты рецептора аденозина; агонисты простагландина Е2 (PGE2), такие как мизопростол; ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как ингибитор фосфодиэстеразы 4 (PDE4), такие как ролипрам; ингибиторы протеасомы; ингибиторы киназы; агонисты рецептора, связанного с G-белком; антагонисты рецептора, связанного с G-белком; глюкокортикоиды; ретиноиды; ингибиторы цитокина; ингибиторы рецептора цитокина; активаторы рецептора цитокина; антагонисты рецептора, активируемого пролифератором пе-роксисом; агонисты рецептора, активируемого пролифератором пероксисом; ингибиторы гистондеаце-тилазы; ингибиторы кальциневрина; ингибиторы фосфатазы; ингибиторы PI3KB, такие как TGX-221; ингибиторы аутофагии, такие как 3-метиладенин; ингибиторы арил-углеводородного рецептора; ингибитор протеасомы I (PSI); и окисленные АТФ, такие как блокаторы рецептора Р2Х. Иммуно депрессанты также включают ИДО (изодецилоктилсульфалат), витамин D3, циклоспорины, такие как циклоспорин А, ингибиторы рецептора арилгидрокарбона, ресвератрол, азатиопурин (Aza), 6-меркаптопурин (6-МР), 6-тиогуанин (6-TG), FK506, санглиферин А, сальмерерол, микофенолят мофетил (MMF), аспирин и другие ингибиторы ЦОГ (циклооксигеназы), нифлумовую кислоту, эстриол и триптолид. При различных способах иммунодепрессант может содержать любой из названных агентов.
Иммунодепрессант может быть соединением, которое оказывает иммунодепрессивный (т.е. вызывающий иммунную толерантность) эффект на АРС прямо или соединением, которое оказывает иммуно-депрессивный (т.е. вызывающий иммунную толерантность) эффект опосредованно (т.е. будучи каким-либо образом обработанным после введения). Иммунодепрессанты, таким образом, включают неактивные формы лекарства любого из соединений, предоставленных в настоящем документе.
Иммунодепрессанты также включают нуклеиновые кислоты, которые кодируют пептиды, полипептиды или белки, предоставленные в настоящем документе, вызывающие иммунодепрессивный (т.е. вызывающий иммунную толерантность) иммунный ответ. В вариантах осуществления, таким образом, им-мунодепрессант является нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид, полипептид или белок, который вызывает иммунодепрессивный (т.е. вызывающий иммунную толерантность) иммунный ответ, и эта нуклеиновая кислота связана с синтетическим наноносителем.
Нуклеиновая кислота может являться ДНК или РНК, такой как мРНК. В вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат комплемент, например, первичный комплемент, или вырожденный вариант (из-за вырождения генетического кода) любой из названных нуклеиновых кислот. В вариантах осуществления нуклеиновая кислота является экспрессирующим вектором, который может быть транскрибирован при перенесении в линию клеток. В вариантах осуществления экспрессирующий вектор может включать, кроме прочего, плазмиду, ретровирус или аденовирус. Нуклеиновые кислоты могут быть изолированы или синтезированы стандартными методами молекулярной биологии, методом ПНР (полимеразной цепной реакции) для получения фрагмента нуклеиновой кислоты, который затем очищают и клонируют в экспрессирующий вектор. Дополнительные методы, полезные в применении данного изобретения, можно найти в Current Protocols in Molecular Biology 2007 by John Wiley and Sons, Inc.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Cold Spring Harbor.
При различных способах иммунодепрессанты, предоставленные в настоящем документе, связаны с синтетическими наноносителями. Предпочтительно иммунодепрессант также является составляющей, которая дополняет вещество, составляющее структуру синтетического наноносителя. Например, в одном варианте осуществления, где синтетический наноноситель состоит из одного или нескольких полимеров, иммунодепрессант является соединением, которое дополняет один или несколько полимеров и связывается ими. В качестве другого примера, в одном варианте осуществления, где синтетический наноноси-тель состоит из одного или нескольких липидов, иммунодепрессант также является соединением, которое дополняет один или несколько полимеров и связывается ими. В вариантах осуществления, например, когда вещество синтетического наноносителя также вызывает иммунодепрессивный (т.е. вызывающий иммунную толерантность) эффект, иммунодепрессант является составляющей, дополняющей вещество синтетического наноносителя, что приводит к иммунодепрессивному (т.е. вызывающему иммунную толерантность) эффекту.
Другие примеры иммунодепрессантов включают синтетические препараты, природные вещества, антитела (е.е. антитела против CD20, CD3, CD4), биологические препараты, углеводные препараты, на-ночастицы, липосомы, РИНА, антисмысловые нуклеиновые кислоты, аптамеры, метотрексат, нестероидные противовоспалительные препараты; финголимод; натализумаб; алемтузумаб; анти-CD3; такролимус (FK506) и т.п., но не ограничиваются ими, помимо того, иммунодепрессанты, известные в данной области, и в этом отношении данное изобретение не ограничено.
"Воспалительное заболевание" означает заболевание, расстройство или состояние, при котором происходит нежелательное воспаление.
"Внесенное количество" иммунодепрессанта или антигена является количеством иммунодепрессан-та или антигена, связанным с синтетическим наноносителем, основанным на общей массе веществ на всем синтетическом наноносителе (вес./вес.). Как правило, внесенное количество рассчитывается в среднем на множество синтетического наноносителя. В одном варианте осуществления среднее внесенное количество иммунодепрессанта на первое множество синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50%. В другом варианте осуществления среднее внесенное количество антигена на первое и/или второе множество синтетических наноносителей составляет от 0,0001 до 50%. В другом варианте осуществления внесенное количество иммунодепрессанта и/или антигена составляет от 0,01 до 20%. В последующем варианте осуществления внесенное количество иммунодепрессанта и/или антигена составляет от 0,1 до 10%. В последующем варианте осуществления внесенное количество иммунодепрессанта и/или антигена составляет от 1 до 10%. В другом варианте осуществления среднее внесенное количество иммуно-депрессанта и/или антигена составляет по меньшей мере 0,1%, по меньшей мере 0,2%, по меньшей мере 0,3%, по меньшей мере 0,4%, по меньшей мере 0,5%, по меньшей мере 0,6%, по меньшей мере 0,7%, по меньшей мере 0,8%, по меньшей мере 0,9%, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 13%, по меньшей мере 14%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 16%, по меньшей мере 17%, по меньшей мере 18%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 20% на популяцию синте
тических наноносителей. В последующем варианте осуществления среднее внесенное количество имму-нодепрессанта и/или антигена составляет 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% на популяцию синтетических наноносителей. При некоторых вышеуказанных вариантах осуществления среднее внесенное количество иммунодепрессанта и/или антигена составляет не более 25% на популяцию синтетических наноносителей. В разных вариантах осуществления внесенное количество рассчитывали так, как описано в примерах.
В вариантах осуществления любых из предоставленных здесь композиций и способов внесенное количество может быть рассчитано следующим образом: Приблизительно 3 мг синтетических наноноси-телей центрифугируют, чтобы отделить надосадочную жидкость от осадка синтетического наноносителя. В осадок добавляют ацетонитрил, обрабатывают образец ультразвуком и центрифугируют, чтобы отделить любую нерастворимую фракцию. Надосадочную жидкость и осадок исследуют методом обращен-но-фазовой хроматографии, при этом показатель оптической плотности составляет 278 нм. Микрограмм (мкг), обнаруженный в осадке, используют для подсчета процента захвата (внесенного количества), мкг надосадочной жидкости и осадке используют, чтобы подсчитать общий выделенный мкг.
"Поддерживающая доза" относится к дозе, вводимой пациенту после того, как начальная доза вызвала иммунодепрессивный (например, вызывающий иммунную толерантность) ответ у субъекта, в целях поддержания желательного иммунодепрессивного (например, вызывающий иммунную толерантность) ответа. Поддерживающая доза, например, может быть такой, которая поддерживает вызывающий иммунную толерантность эффект, полученный после начальной дозы, предотвращает нежелательный иммунный ответ у субъекта или предотвращает отнесение субъекта к группе риска возникновения нежелательного иммунного ответа, включая нежелательный уровень иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза является достаточной для поддержания соответственного желательного иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза является такой дозой, которой достаточно для поддержания соответствующего уровня числа или активности CD4+ Т-клеток или CD8+ Т-клеток, или для защиты от заражения агентом, которое может вызвать нежелательный иммунный ответ.
"Максимальный размер синтетического наноносителя" означает наибольший размер наноносителя, измеряемый вдоль любой оси синтетического наноносителя. "Минимальный размер синтетического на-ноносителя" означает наименьший размер синтетического наноносителя, измеряемый вдоль любой оси синтетического наноносителя. Например, для сферического синтетического наноносителя максимальный и минимальный размеры синтетического наноносителя будут практически одинаковыми и будут равны его диаметру. Соответственно, для кубического синтетического наноносителя минимальный размер синтетического наноносителя будет наименьшим из значений его высоты, ширины или длины, а максимальный размер синтетического наноносителя будет наибольшим из значений его высоты, ширины или длины. В варианте осуществления минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительнее по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических наноносителей в образце относительно общего количества синтетических наноносителей в образце равен или больше 100 нм. В варианте осуществления максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических наноносителей в образце относительно общего количества синтетических наноносителей в образце равен или меньше 5 мкм. Предпочтительно минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических наноносителей в образце относительно общего количества синтетических наноносителей в образце, больше чем 110 нм, более предпочтительно больше чем 120 нм, более предпочтительно больше чем 130 нм, и еще более предпочтительно больше чем 150 нм. Соотношение максимального и минимального размеров изобретенных синтетических наноносителей могут отличаться в зависимости от варианта осуществления изобретения. Например, характеристические отношения максимального к минимальному размеров синтетических наноносителей могут варьироваться от 1:1 до 1000000:1, предпочтительно от 1:1 до 100000:1, более предпочтительно от 1:1 до 10000:1, более предпочтительно от 1:1 до 1000:1, также более предпочтительно от 1:1 до 100:1 и еще более предпочтительно от 1:1 до 10:1. Предпочтительно, чтобы максимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических наноносите-лей в образце, на основе общего количества синтетических наноносителей в образце, был равным или менее 3 мкм, более предпочтительно равным или менее 2 мкм, более предпочтительно равным или менее 1 мкм, более предпочтительно равным или менее 800 нм, более предпочтительно равным или менее 600 нм и еще более предпочтительно равным или менее 500 нм. В предпочтительных вариантах осуществления минимальный размер по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90% синтетических наноносителей в образце по отношению к общему количеству синтетических наноносителей в образце равен или больше 100 нм, более предпочтительно равен или больше 120 нм, более предпочтительно равен или больше 130 нм, более предпочтительно равен или больше 140 нм и наиболее предпочтительно равен или больше 150 нм. Измерение размеров синтетического наноносителя (например, диаметра) производят путем суспендирования синтетических наноноси-телей в жидкой (обычно водной) среде с использованием динамического рассеяния света (DLS) (напри
мер, используя аппарат Brookhaven ZetaPALS). Например, суспензию синтетических наноносителей можно разбавить из водного буфера в очищенную воду до достижения конечной концентрации суспензии синтетических наноносителей приблизительно от 0,01 до 0,1 мг/мл. Разбавленную суспензию можно получить непосредственно внутри или перенести в подходящую кювету для DLS-анализа. Кювету затем помещают в DLS, приводят к контролируемой температуре, а затем проверяют на наличие достаточного времени, для приобретения стабильного и воспроизводимого распределения на основе соответствующих введенных данных для вязкости среды и индексов преломления образца. Затем регистрируют эффективный диаметр или среднее распределения. Величина" или "размер" или "диаметр" синтетических наноно-сителей относится к среднему значению дисперсного состава частиц, полученному при динамическом рассеянии света.
"МНС" относится к главному комплексу гистосовместимости, большой области генома или семейству генов, обнаруженных у большинства позвоночных, кодирующим молекулы МНС, которые проявляют фрагменты или эпитопы процессируемых белков на поверхности клетки. Презентация МНС: пептид на поверхности клетки позволяет исследование иммунным клеткам, обычно Т-клеткам. Существуют два общих класса молекул МНС: класс I и класс II. Обычно молекулы МНС класса I находятся на поверхности клеток, содержащих ядра, и презентируют пептиды цитотоксическим Т-клеткам. Молекулы МНС класса II находятся на поверхности определенных иммунных клеток, преимущественно макрофагов, В-клеток и дендритных клеток, совокупность которых известна под названием профессиональные АРС. Наиболее известными генами области МНС являются гены подгруппы, кодирующие антиген-презентирующие белки на поверхности клеток. У человека эти гены называют антигенами лейкоцита человека (HLA).
"Не содержащий концевую метоксигруппу полимер" относится к полимеру, по меньшей мере один конец молекулы которого оканчивается группой, отличной от метоксильной группы. В некоторых вариантах осуществления у полимера есть по меньшей мере два конца молекулы, которые оканчиваются группой, отличной от метоксильной группы. В других вариантах осуществления ни один конец молекулы полимера не оканчивается метоксильной группой. "Не имеющий концевую метоксигруппу плюро-ниевый полимер" относится к любому полимеру, кроме линейного плюрониевого полимера, оба конца молекулы которого оканчиваются метоксильной группой. Полимерные наночастицы, как представлено в настоящем документе, включают не содержащие концевую метоксигруппу полимеры или не содержащие концевую метоксигруппу плюрониевые полимеры.
"Полученный" означает взятый непосредственно из вещества и применяемый практически без модификации и/или обработки.
"Фармацевтически приемлемый наполнитель" означает фармакологически неактивный материал, применяемый вместе с указанными синтетическими наноносителями для составления композиций по настоящему изобретению. Фармацевтически приемлемые наполнители включают ряд материалов, известных в настоящем уровне техники, в том числе без ограничения сахариды (такие как глюкоза, лактоза и т.п.), консерванты, такие как противомикробные средства, восстанавливающие средства, окрашивающие средства, солевой раствор (такой как фосфатно-солевой буфер) и буферы.
"Протокол" относится к любому режиму дозирования одного или нескольких веществ, вводимых пациенту. Режим дозирования может включать количество, частоту и/или способ введения. В некоторых вариантах осуществления такой протокол может быть применен при введении одной или нескольких композиций по настоящему изобретению одному или нескольким испытуемым. Иммунные ответы у этих испытуемых могут в дальнейшем быть измерены, чтобы определить, был ли протокол эффективным для уменьшения нежелательного иммунного ответа или вызова желательного иммунного ответа (т.е. стимуляции вызывающий иммунную толерантность эффекта). Любой другой терапевтический и/или профилактический эффект также может быть измерен вместо упомянутых иммунных ответов или в дополнение к ним. Дал протокол желательный эффект или нет можно определить любыми способами, предоставленными в настоящем документе, или другими, известными в данной области. Например, можно получить популяцию клеток от субъекта, которого лечат предложенной в настоящем документе композицией в соответствии со специфическим протоколом, чтобы определить, произошли ли вызов, активация, уменьшение количества и т.п. специфических иммунных клеток, цитокинов, антител и т.п. Методы, пригодные для определения присутствия и/или количества иммунных клеток, включают проточные цито-метрические методы (например, FACS), и иммуногистохимические методы, но не ограничены ими. Антитела и другие связывающие агенты для специфического окрашивания иммунных клеточных маркеров применяются в промышленных масштабах. Подобные комплекты, как правило, содержат окрашивающие реагенты для множественных антигенов, которые позволяют провести FACS-анализ, сепарацию и/или количественную оценку желательной популяции клеток из их гетерогенной популяции.
"Обеспечение субъекта" является любым действием или комплексом действий, которые позволяют врачу войти в контакт с субъектом и вводить ему композицию, предоставленную выше в настоящем документе, или применять способ, описанный выше в настоящем документе. Предпочтительно субъектом является лицо, которое нуждается в толерантных иммунных ответах, предоставленных в настоящем документе. Действие или комплекс действий могут являться напрямую или косвенно, такими как, но не
ограниченными, независимой третьей стороной, которая принимает действия с опорой на слова или поступки другого.
"Субъект" относится к животным, в том числе теплокровным животным, например человеку и приматам; птицам; домашним или сельскохозяйственным животным, например кошкам, собакам, овцам, козам, крупному рогатому скоту, лошадям и свиньям; лабораторным животным, например, мышам, крысам и морским свинкам; рыбам; рептилиям; диким и живущим в зоопарках животным и т.п.
"Практически не содержит В-клеточных эпитопов" означает отсутствие В-клеточных эпитопов в количестве (самих клеток, в контексте антигена, связанных с носителем или в составе изобретенной композиции), достаточном для существенной активации ответа со стороны В-клеток. В вариантах осуществления композиция, практически не содержащая В-клеточных эпитопов, не содержит заметного количества В-клеточных эпитопов антигена. В других вариантах осуществления такая композиция может содержать заметное количество аллергена В-клеточных эпитопов, однако это количество неэффективно для заметного иммунного ответа со стороны В-клеток (самих клеток, в контексте антигена, связанных с носителем или в составе изобретенной композиции), такого как вырабатывание антиген-специфических антител или увеличение числа и/или активность антиген-специфических В-клеток, и/или неэффективно для вызова заметного измеримого иммунного ответа со стороны В-клеток (самих клеток, в контексте антигена, связанных с носителем или в составе изобретенной композиции). В некоторых вариантах осуществления заметный измеримый имммунный ответ В-клеток является таким, который вызывает или, вероятно, вызовет побочный эффект у субъекта. В других вариантах осуществления заметный измеримый иммунный ответ со стороны В-клеток представляет собой ответ, который имеет более высокий уровень, чем уровень такого же типа иммунного ответа (например, вырабатывание антиген-специфических антител или увеличение числа и/или активность антиген-специфических В-клеток), производимого контрольным антигеном (например, таким, который не содержит В-клеточные эпитопы антигена или не стимулирует иммунные ответы со стороны В-клеток). В некоторых вариантах осуществления заметный измеримый иммунный ответ со стороны В-клеток, например, измерение титра антитела (например, с помощью ELISA) является 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным, 15-кратным, 20-кратным или больше, чем аналогичный тип ответа, полученный в контроле (например, при контрольном антигене). В других вариантах осуществления композиция, практически не содержащая В-клеточных эпитопов, вызывает появление небольшого титра антиген-специфических антител или не вызывает его появление вообще (самих клеток, в контексте антигена, связанных с носителем или в составе изобретенной композиции). Такие композиции включают такие композиции, которые вызывают появление титра антитела (как значение EC50) меньше чем 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20 или 10. В других вариантах осуществления значительный измеримый иммунный ответ со стороны В-клеток, представляет собой измерение числа или увеличение числа В-клеток, которое составляет 10, 25, 50, 100%, или является 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным, 15-кратным, 20-кратным или больше, чем аналогичный тип ответа, полученный в контроле. Другие способы измерения ответов В-клеток известны специалистам в данной области.
В вариантах осуществления, чтобы убедиться в том, что композиция практически не содержит В-клеточных эпитопов, антигены выбирают таким образом, что они не содержат В-клеточных эпитопов, связанных с синтетическими наноносителями, представленными в настоящем документе. В других вариантах осуществления, чтобы убедиться в том, что композиция практически не содержит В-клеточных эпитопов антигена, синтетические наноносители, связанные с эпитопами антигена, производят и тестируют на иммунные ответы со стороны В-клеток (например, выработка антиген-специфических антител, увеличение числа и/или активность В-клеток). Композиции, обладающие желательными свойствами, в дальнейшем могут отбирать.
"Синтетический(ие) наноноситель(и)" относится к отвлеченному объекту, не существующему в природе, который обладает по меньшей мере одним измерением, размер которого меньше или равен 5 микронам. Наночастицы альбумина, как правило, добавляют в качестве синтетического наноносителя, однако при некоторых способах синтетические наноносители не включают наночастицы альбумина. В вариантах осуществления изобретательские синтетические наноносители не включают хитозан. В других вариантах осуществления изобретательские синтетические наноносители не включают липидные нано-частицы. В других вариантах осуществления изобретательские синтетические наноносители не включают фосфолипид.
А синтетический наноноситель может являться одной основанной на липидах наночастицей (также упоминаемой в настоящем документе как липидная наночастица, т.е. большая часть составляющего ее вещества является липидом)или их совокупностью, полимерными наночастами, металлическими наноча-стицами, эмульсиями на основе ПАВ, дендримерами, бакиболлами, нанонитями, вирусоподобными частицами (т.е. частицами, основой строения которых являются вирусные белки, но которые не являются инфекционными или имеют низкую инфекционность), пептидными или основанными на белках частицами (также упоминаемыми в настоящем документе как белковые частицы, т.е. частицы, большая часть составляющего вещества которых является пептидами или белками) (такие как наночастицы альбумина)
и/или наночастицами, разработанными из совокупности наноматериалов, например, липидно-полимерные частицы, но не ограничивается ими. Синтетические наноносители могут иметь различные формы, в том числе сферическую, кубическую, пирамидальную, вытянутую, цилиндрическую, тороидальную и другие, но не ограничены ими. Синтетические наноносители в соответствии с изобретением имеют одну или несколько поверхностей. Например, синтетические наноносители, которые могут быть адаптированы для применения в практике настоящего изобретения, включают: (1) биоразлагаемые нано-частицы, как раскрыто в патенте США 5543158, Gref et al., (2) полимерные наночастицы, как раскрыто в опубликованной заявке на патент США 20060002852, Saltzman et al., (3) наночастицы, конструируемые литографским способом, как раскрыто в опубликованной заявке на патент США 20090028910, DeSimone et al., (4) раскрытие сущности изобретения WO 2009/051837, von Andrian et al., (5) наночастицы, как раскрыто в опубликованной заявке на патент США 2008/0145441, Penades et al., (6) белковые наночастицы, как раскрыто в опубликованной заявке на патент США 20090226525, de los Rios et al., (7) вирусоподобные частицы, как раскрыто в опубликованной заявке на патент США 20060222652, Sebbel et al., (8) связанные с нуклеиновой кислотой вирусоподобные частицы, как раскрыто в опубликованной заявке на патент США 20060251677, Bachmann et al., (9) вирусоподобные частицы, как описано в WO2010047839A1 или WO2009106999А2, (10) наноосажденные наночастицы, как раскрыто в P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedi-cine. 5(6):843-853 (2010), или (11) апоптотические клетки, апоптотические тела или синтетические или полусинтетические имитаторы, раскрытые в публикации США 2002/0086049. При различных способах, синтетические наноносители могут находиться в соотношении, большем чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.
Синтетические наноносители в соответствии с изобретением, имеющие минимальный размер равный или меньший около 100 нм, предпочтительно равный или меньший 100 нм, не содержат поверхности с гидроксильными группами, активирующими комплемент, или альтернативно содержат поверхность, которая состоит в основном из групп, активирующих комплемент, но не являющихся гидроксиль-ными группами. В предпочтительном варианте осуществления синтетические наноносители в соответствии с изобретением, минимальный размер которых равен или меньше около 100 нм, предпочтительно равен или меньше 100 нм, не содержат поверхность, которая в значительной степени активирует комплемент, или альтернативно содержат поверхность, которая состоит преимущественно из групп, которые не активируют комплемент в значительной степени. Более желательно, чтобы синтетические наноноси-тели в соответствии с изобретением, имеющие минимальный размер, равный или меньший около 100 нм, предпочтительно равный или меньший 100 нм, не содержали поверхность, активирующую комплемент, или альтернативно содержали поверхность, состоящую преимущественно из групп, которые не активируют комплемент. В вариантах осуществления синтетические наноносители не включают вирусоподобные частицы. При различных способах, синтетические наноносители могут находиться в соотношении, большем, чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.
"Т-клеточный антиген" означает антиген CD4+ Т-клетки или антиген CD8+ Т-клетки. "Антиген CD4+ Т-клетки" означает любой антиген, который распознается CD4+ Т-клетками и запускает их иммунный ответ, т.е. антиген, который специфически распознается рецептором Т-клетки на поверхности СО4+ Т-клетки путем презентации антигена или его части молекулой главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС). "Антиген CD8+ Т-клетки" означает любой антиген, который распознается CD8+ Т-клетками и запускает их иммунный ответ, т.е. антиген, который специфически распознается рецептором Т-клетки на поверхности CD8+ Т-клетки путем презентации антигена или его части молекулой главного комплекса гистосовместимости I класса (ГКГ). В некоторых вариантах осуществления антиген, который является Т-клеточным антигеном, также является В-клеточным антигеном. В других вариантах осуществления Т-клеточный антиген не является также В-клеточным антигеном. Т-клеточные антигены обычно являются белкам и или пептидами.
"Т-эффекторные клетки" известны в данной области техники, при этом термин относится к Т-клеткам, выполняющим функции Т-клеток, и включающие Т-клетки с цитоксиновой активностью, Т-хелперные клетки, Т-клетки, которые секретируют цитокины и активируют и/или направляют другие иммунные клетки и т.п. Т-эффекторные клетки включают, например, Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, и Т-эффекторные клетки памяти, которые все представляют собой CD4+, а также CD8+ цитоксиновые Т-клетки.
"Терапевтический белок" относится к любому белку или белковой заместительной терапии, применяемой к субъекту и имеющей терапевтический эффект. Такие виды терапии включают белковую заместительную и белковую дополняющую терапии. Такие виды терапии также включают введение экзогенного или чужеродного белка, применение различных видов терапии антителами и клеточной терапии. Терапевтические белки включают ферменты, кофакторы ферментов, гормоны, факторы свертываемости крови, цитокин, факторы роста, моноклональные антитела и поликлональные антитела. Примеры других терапевтических белков приведены в тексте настоящего документа. Терапевтические белки могут быть образованы в клетках, на их поверхности или их посредством и получены из таких клеток и введены в форме таких клеток. В вариантах осуществления терапевтический белок образуется в клетках млекопи
тающих, насекомых, дрожжей, бактерий, растений, трансгенных животных клеток, трансгенных растительных клеток, на их поверхности или их посредством, и т.д. Терапевтический белок может рекомби-нантно образовываться в подобных клетках. Терапевтический белок может образовываться в трансформированной вирусом клетке, на ее поверхности или посредством ее. Терапевтический белок также может образовываться в аутологических клетках, трансфицированных, трансдуцированных или измененных иным способом для его экспрессии. Альтернативно терапевтический белок может быть введен в виде нуклеиновой кислоты или путем внесения нуклеиновой кислоты в вирус, вирусоподобную частицу, ли-посому и т.д. Альтернативно терапевтический белок можно получить из таких форм и ввести как собственно терапевтический белок. Субъекты, таким образом, включают любой субъект, который получал, получает или будет получать что-либо из вышеупомянутого. Такой субъект включает субъекты, которые получали, получают или будут получать генную терапию, аутологические клетки, трансфицированные, трансдуцированные или измененные иным способом, чтобы экспрессировать терапевтический белок, полипептид или пептид; или клетки, экспрессирующие терапевтический белок, полипептид или пептид.
"Антиген терапевтического белка" означает антиген, ассоциированный с терапевтическим белком, который может быть, или его фрагмент может быть представлен для распознавания клетками иммунной системы, и которые могут вызывать нежелательный иммунный ответ (например, вырабатывание антител, специфических к терапевтическому белку) на терапевтический белок. Антигены терапевтического белка обычно включают белки, полипептиды, пептиды, липопротеины или содержатся, или вырабатываются в или на клетках или посредством клеток.
"Толерантный иммунный ответ" означает любой иммунный ответ, ведущий к иммунодепрессии, специфической к антигену или клетке, ткани, органу и другому, экспрессирующему этот антиген. Такие иммунные ответы включают уменьшение, задержку или ингибирование нежелательного иммунного ответа, специфического к антигену или клетке, ткани, органу и другому, экспрессирующему этот антиген. Такие иммунные ответы также включают любую стимуляцию, продукцию, индукцию, стимулирование или рекрутинг желательного иммунного ответа, специфического к антигену или клетке, ткани, органу и другому, экспрессирующему этот антиген. Толерантные иммунные ответы, таким образом, включают отсутствие или уменьшение нежелательного иммунного ответа на антиген, которые могут происходить посредством участия антиген-реактивных клеток, а также в присутствии или стимуляции депрессивных клеток. Толерантные иммунные ответы, как показано в настоящем документе, включают иммунологическую толерантность. "Вызывать толерантный иммунный ответ" относится к вызову любого из вышеупомянутых иммунных ответов, специфических к антигену или клетке, ткани, органу и подобному, экспрес-сирующему такой антиген. Толерантный иммунный ответ может являться результатом презентирования главному комплексу гистосовместимости I класса и/или главному комплексу гистосовместимости II класса и/или презентирования В-клеткам и/или презентирования CD1d и т.д.
Толерантные иммунные ответы включают любое уменьшение, задержку или ингибирование увеличения числа и/или активности CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток или В-клеток. Толерантные иммунные ответы также включают уменьшение выработки антиген-специфических антител. Толерантные иммунные ответы также могут включать любой ответ, ведущий к стимуляции, индуцирования, выработки или рек-рутингу регуляторных клеток, например, CD4+ Т-регуляторных клеток, CD8+ Т-регуляторных клеток, В-регуляторных клеток и т.д. В некоторых вариантах осуществления толерантный иммунный ответ приводит к обращению в регуляторный фенотип, характеризуемый выработкой, индуцированием, стимуляцией или рекрутингом регуляторных клеток.
Толерантные иммунные ответы также включают любой ответ, ведущий к стимуляции, вырабатыванию или рекрутингу CD4+ Т-регуляторных клеток или CD8+ Т-регуляторных клеток. CD4+ Т-регуляторные клетки могут экспрессировать фактор транскрипции FoxP3 и ингибировать воспалительные ответы или аутоиммунные воспалительные заболевания (Human regulatory T cells in autoimmune diseases. Cvetanovich G.L., Hafler D.A. Curr Opin Immunol. 2010 Dec; 22(6):753-60. Regulatory T. cells and autoimmunity. Vila J., Isaacs J.D., Anderson A.E. Curr Opin Hematol. 2009 Jul; 16(4):274-9). Такие клетки также подавляют помощь Т-клеток B-клеткам и индуцируют толерантность как к собственным, так и к чужеродным антигенам (Therapeutic approaches to allergy and autoimmunity based on FoxP3+ regulatory T-cell activation and expansion. Miyara M., Wing K., Sakaguchi S. J. Allergy Clin Immunol. 2009 Apr; 123(4):749-55). CD4+ Т-регуляторные клетки распознают антиген, когда он презентируется белкам и класса II на АРС. CD8+ Т-регуляторные клетки, распознающие антиген, презентируемый классом I (и Qa-1), могут также подавлять помощь Т-клеток В-клеткам и приводить к активации антиген-специфической депрессии, вызывающей толерантность как к собственным, так и к чужеродным антигенам. Нарушение взаимодействия между Qa-1 и CD8+ Т-регуляторными клетками, как было показано, разрегулирует иммунные ответы и приводит к развитию воспаления, обусловленного аутоантителом, и аутоиммунной летальной ситемной красной волчанки (Kim et al., Nature. 2010 Sep 16, 467(7313): 328-32). CD8+ T-регуляторные клетки также, как было показано, ингибируют модели аутоиммунных воспалительных заболеваний, включая ревматоидный артрит и колит (CD4+CD25+ regulatory T cells in autoimmune arthritis. Oh S., Rankin A.L., Caton A.J. Immunol Rev. 2010 Jan; 233(1):97-111. Regulatory T. cells in inflammatory bowel disease. Boden E.K., Snapper S.B. Curr Opin Gastroenterol. 2008 Nov; 24(6):733-41). В некоторых вариантах осуще
ствления предоставленные композиции могут эффективно вызывать оба типа ответов (CD4+ Т-регуляторные клетки и CD8+ Т-регуляторные клетки). В других вариантах осуществления FoxP3 может быть индуцирован в других иммунных клетках, таких как мкрофаги, iNKT и др., и предоставленные композиции также могут вызывать один или несколько подобных ответов.
Толерогенные иммунные ответы также включают без ограничения следующее: индукция регуля-торных цитокинов, таких как Treg цитокины; индукция ингибирующих цитокинов; ингибирование воспалительных цитокинов (например, IL-4, IL-1b, IL-5, TNF-a, IL-6, GM-CSF, IFN-y, IL-2, IL-9, IL-12, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, M-CSF, С реактивного белка, белка острой фазы, хемокинов (например, МСР-1, RANTES, MIP-1a, MIP-p, MIG, IT АС или IP-10), продукции противовоспалительных цитокинов (например, IL-4, IL-13, IL-10 и т.д.), хемокинов (например, CCL-2, CXCL8), портеаз (например, ММР-3, ММР-9), лейкотриенов (например, CysLT-1, CysLT-2), простагландинов (например, PGE2) или гистами-нов; ингибирование ориентирования в отношении Th17, Th1 или Th2 иммунного ответа; ингибирование эффекторных клеточно-специфических цитокинов: Th17 (например, IL-17, IL-25), Th1 (IFN-y), Th2 (например, IL-4, IL-13); ингибирование Th1-, Th2- или ТН17-специфических факторов транскрипции; инги-бирование пролиферации эффекторных Т-клеток; индукцию апоптоза эффекторных Т-клеток; индукцию генов, специфических для толерогенных дендритных клеток, индукцию экспрессии FoxP3, ингибирова-ние индукции IgE или IgE-опосредованных иммунных ответов, ингибирование гуморальных иммунных ответов (например, образование антиген-специфических антител); ингибирование клеточного ответа при участии Т-хелперов; образование TGF-р и/или IL-10; ингибирование эффекторной функции аутоантител (например, ингибирование элиминации клеток, повреждения клетки или ткани или активации комплемента) и т.д.
Любой из вышеперечисленных эффектов может быть измерен in vivo на одной или нескольких животных моделях или может быть измерен in vitro. Специалисту в данной области известны подобные измерения in vivo или in vitro. Нежелательные иммунные ответы или толерантные иммунные ответы могут быть отслежены, например, при помощи методов измерения количества и/или функций иммунных клеток, тетрамерного анализа, ELISPOT, проточного цитометрического анализа экспрессии цитокина, секреции цитокина, анализа сывороточного спектра цитокина, анализа спектра экспрессии гена, анализа спектра белка, анализа маркеров поверхности клетки, ПЦР-определение использования гена рецепторами иммунной клетки (см. Т. Clay et al., "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer", Clinical Cancer Research 7:1127-1135 (2001)) и т.д. Нежелательные иммунные ответы или толерантные иммунные ответы могут также быть обнаружены, например, при помощи методов измерения уровней белка в плазме или сыворотке, увеличения числа иммунных клеток и/или функционального анализа и т.д. В некоторых вариантах осуществления толерантные иммунные ответы могут быть обнаружены при помощи оценки индукции FoxP3. Кроме того, в примерах более детально описаны специфические методы.
Предпочтительно, чтобы толерантные иммунные ответы приводили к ингибированию развития, прогрессирования или патологии болезней, расстройств или состояний, описанных в настоящем документе. Приводят ли или нет изобретательские композиции к ингибированию развития, прогрессирования или патологии болезней, расстройств или состояний, описанных в настоящем документе, можно определить, используя животные модели болезней, расстройств или состояний. В некоторых вариантах осуществления уменьшение нежелательного иммунного ответа или вызова толерантного иммунного ответа могут быть измерены путем определения конечных клинических результатов, клинической эффективности, клинических признаков, биомаркеров заболевания и/или клинических показателей. Нежелательные иммунные ответы или толерантные иммунные ответы могут также быть измерены при помощи диагностических тестов, выявляющих присутствие или отсутствие заболевания, нарушения или состояния, как описано в данном документе. Нежелательные иммунные ответы могут, помимо того, быть измерены методами измерения уровней терапевтических белков и/или их функций у субъекта. В вариантах осуществления способы для наблюдения или оценки нежелательных аллергических ответов включают оценку аллергического ответа у субъекта путем кожных реакций и/или выработкой аллерген-специфических антител.
В некоторых вариантах осуществления наблюдение или оценка вызова нежелательного иммунного ответа или толерантного иммунного ответа у субъекта может быть проведено до введения композиции синтетических наноносителей, предложенных в настоящем документе, и/или до введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В других вариантах осуществления оценка вызова нежелательного иммунного ответа или толерантного иммунного ответа у субъекта может быть проведена после введения композиции синтетических наноносителей, предложенных в настоящем документе, и/или после введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В некоторых вариантах осуществления оценка проводится после введения композиции синтетических наноносителей, но до введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В других вариантах осуществления оценка проводится после введения пересаживаемого трансплантируемого
материала или терапевтического белка или воздействия аллергена, но до до введения композиции. В других вариантах осуществления оценка проводится как до введения синтетических наноносителей, так и до введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена, в то время как в еще одном варианте осуществления оценка проводится как после введения синтетических наноносителей, так и после введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В дополнительных вариантах осуществления оценка проводится как до, так и после введения синтетических наноносителей и/или введения пересаживаемого трансплантируемого материала или терапевтического белка или воздействия аллергена. В других вариантах осуществления у субъекта проводится оценка больше чем один раз, чтобы убедиться, что у субъекта поддерживается желательный иммунный статус, причем субъект имеет воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, аллергию, отторжение органа или тканей или болезнь "трансплантат против хозяина", или существует риск развития у него этих заболеваний. Другие субъекты включают таких субъектов, которым проделали или будут делать трансплантацию, а также тех, которым проводили, проводят или будут проводить лечение терапевтическим белком, который вызывает, или предполагается, что будет вызывать у субъектов нежелательный иммунный ответ.
Ответ антител может быть измерен путем определения титров одного или нескольких антител. "Титр антитела" означает измеримый уровень продукции антител. Методы определения титров антител известны в этой области и включают ферментсвязанный иммуносорбентный метод исследования (ELISA). В вариантах осуществления ответ антитела может быть измерен количественно, например, в виде количества антител, концентрации антител или титра. Показатели могут быть абсолютными или относительными. Методы количественного анализа ответа антитела включают методы захвата антител, методы ELISA, методы ингибирования абсорбции жидкой фазы (ILPAA), методы ракетного иммуноэлек-трофореза (RIE) и методы линейного иммуноэлектрофореза (LIE). Когда ответ антитела сравнивают с ответом другого антитела по такому же количественному показателю (например, титру), предпочтительно использовать метод измерения (например, ELISA) для сравнения.
Метод ELISA для определения титра антитела, например, типичного сэндвичного ELISA, может состоять из таких стадий: (i) приготовление покровного материала для ELISA-планшета, такого, что исследуемое антитело связывается с полимером субстрата или другим подходящим материалом, (ii) приготовление покровного материала в водном растворе (например, PBS) и добавление покровного материала в лунки многолуночного планшета для экспозиции покровного материала в лунках в течение ночи, (iii) тщательная отмывка многолуночного планшета отмывочным буфером (например, 0,05% Tween-20 в PBS) для удаления покровного материала, (iv) блокирование планшета для неспецифического связывания при помощи разведенного раствора (например, 10% зародышевой бычьей сыворотки в PBS), (v) отмывка блокатора/разведенного раствора с планшета отмывочным буфером, (vi) разведение образца(ов) сыворотки, содержащих антитела и соответствующие стандарты (положительные контроли) растворителем, как требуется для получения концентрации, достаточной для получения ответа ELISA, (vii) серийное разведение образцов плазмы в многолуночном планшете, чтобы охватить серию концентраций, подходящих для генерации кривой ответа ELISA, (viii) инкубирование планшета, чтобы обеспечить связывание антитела с мишенью, (ix) отмывка планшета отмывочным буфером, чтобы удалить антитела, не связанные с антигеном, (х) добавление соответствующей концентрации вторичного идентифицирующего антитела в том же растворителе, например биотине, связанном с идентифицирующим антителом, которое способно связывать первичное антитело, (xi) инкубирование планшета с внесенным идентифицирующим антителом с последующей отмывкой отмывочным буфером, (xii) добавление фермента, например, стрептавидина-HRP (пероксидаза хрена), который связывает биотин-связанные антитела, и инкубирование, (xiii) отмывка многолуночного планшета, (xiv) добавление субстрата(ов) (например, раствор ТМВ) в планшет, (xv) применение стоп-раствора (например, 2н. серной кислоты) по завершении проявления цвета, (xvi) определение оптической плотности лунок планшета и специфической длины волн субстрата (450 нм с субстракцией чтения при 570 нм), (xvi) построение соответствующей данным многопа-раметральной кривой и определение половины максимальной эффективной концентрации (EC50) как концентрации на кривой, при которой достигается половина максимального значения OD.
"Пересаживаемый трансплантируемый материал" относится к биологическому материалу, такому, как клетки, ткани и органы (целиком или частично), которые могут быть введены субъекту. Пересаживаемые трансплантируемые материалы могут представлять собой аллотрансплантаты или ксенотранс-плантаты, например, биологического материала, такого, как орган, ткани, кожа, дифференцированные клетки (полученные или произведенные in vivo или in vitro) и т.п. В некоторых вариантах осуществления пересаживаемый трансплантируемый материал сформирован, например, из хряща, кости, внеклеточного матрикса или коллагеновых матриксов. Пересаживаемые трансплантируемые материалы могут также представлять собой клетки, суспензии клеток или клетки в тканях и органах, которые пригодны для пересадки. Трансплантируемые клетки обычно имеют терапевтическую функцию, например, функцию, которая отсутствует или недостаточна у субъекта-реципиента. Некоторые неограничивающие примеры трансплантируемых клеток представляют собой р -клетки, гепатоциты, гематопоэтические стволовые клетки, нейронные стволовые клетки, нейроны, глиальные клетки или миелинезирующие клетки. Транс
плантируемые клетки могут быть немодифицированными клетками, например, клетками, полученными от субъекта-донора, и используемые в пересадке без каких-либо генетических или эпигенетических модификаций. В других вариантах осуществления трансплантируемые клетки могут быть модифицированными клетками, например, клетками, полученными от субъекта, имеющего генетический дефект, в которых генетический дефект был устранен, или клетки, которые произведены от перепрограммированных клеток, например, дифференцированных клеток, произведенных из клеток, полученных от субъекта.
"Трансплантация" относится к процессу пересадки (переноса) трансплантируемой пересаживаемой ткани получающему ее субъекту (например, от донорного субъекта, из in vitro источника (например, дифференцированные аутологичные или гетерологичные родные или индуцированные плюрипотентные клетки)) и/или из одного расположения на теле в другое расположение на теле в одном и том же субъекте.
"Нежелательный иммунный ответ" относится к любому нежелательному иммунному ответу, который вызван воздействием антигена, вызывает или усугубляет заболевание, нарушение или состояние, как описано в настоящем документе, или их симптом, или является признаком заболевания, нарушения или состояния, как описано в настоящем документе. Такие иммунные ответы, как правило, отрицательно влияют на здоровье субъекта или являются симптоматикой негативного влияния на здоровье субъекта. Нежелательные иммунные ответы включают увеличение числа и/или активность антиген-специфической Т-эффекторной клетки (например, CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки). Желательные иммунные ответы, таким образом, включают удаление Т-эффекторных клеток, ингибирование стимуляции или активации таких клеток, ингибирование увеличения числа Т-эффекторных клеток, ингибирование вырабатывания цитокинов Т-эффекторными клетками и т.п. Если происходит ингибирование активности CD4+ Т-клетки, то такое ингибирование может также привести к снижению В-клеточного иммунного ответа. Способы испытаний таких иммунных ответов предоставлены в данном документе или в противном случае известны специалистам в данной области техники.
С. Композиции изобретения
Здесь предложены вызывающие иммунную толерантность способы, которые включают введение композиций синтетических наноносителей, содержащих иммунодепрессанты и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовмести-мости II класса, и относящиеся к ним композиции. Такие способы и композиции полезны для снижения числа и/или действия Т-эффекторных клеток и стимуляции вызова толерантных иммунных ответов, специфических к аллергену, который содержит эпитопы.
Композиции можно вводить субъектам, для которых желателен толерантный иммунный ответ. Такие субъекты представляют собой субъекты, которые имеют или у которых существует риск развития воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии или болезни "трансплантат против хозяина". Такие субъекты также включают субъектов, которым проводили, проводят или будут проводить лечение терапевтическим белком, который вызывает, или предполагается, что будет вызывать у субъектов нежелательный иммунный ответ. Такие субъекты также включают субъектов, которым проделали или будут делать трансплантацию.
Предпочтительно композции данного изобретения приводят к удалению Т-эффекторных клеток и/или снижению их активности. Профили экспрессии поверхностного маркера и профили секреции ци-токинов Т-эффекторными клетками известны в данном уровне техники (например, как описано в Rag, Immunology: a Textbook, Alpha Science Intl Ltd (August 15, 2005), ISBN-10: 1842652559, (например, в главе 13) и могут быть использованы для оценки эффектов от предлагаемых композиций. Иллюстративные популяции Т-эффекторных клеток включают все те, которые вносят вклад, инициируют, усиливают или поддерживают иммунный ответ, как например, с помощью CD4+CD25- клеток и CD8+CD45RA+ клеток, а также клеток памяти (например, CD4+CD25+FoxP3-). Дополнительные поверхностные маркеры, которые могут использоваться для распознавания Т-эффекторных клеток, известны специалистам в данной области, и такие маркеры включают, но не ограничиваются этим, IL-12-рецептор (а и р1 цепочки) и рецепторы хемокинов CXCR3 и CCR5 (^1-^^^); IL-1-рецептор, ST2L/T1 (молекула, подобная IL-1 RI), рецепторы хемокинов CXCR4, CCR3, CCR4, CCR7 и CCR8, и CD30 (^-клетки). Т-эффекторные клетки, кроме того, секретируют цитокины, например, IFN-гамма, IL-2 и/или TNF-бета (^1-^^101); IL-4, IL-5, IL-13 ^112-1^(tm)^), IL-9 (Th9), IL-17 (Th17), IL-22 (Th22) или другие воспалительные цитокины. Профили секреции цитокинов и других Т-эффекторных клеток известны специалистам в данной области. На основании знания о поверхностных маркерах, используемых для идентификации различных популяций Т-эффекторных клеток, специалисты в данной области могут идентифицировать и перечислять Т-эффекторные клетки в гетерогенной популяции клеток, например, в популяции клеток в культуре или в популяции клеток, полученных от субъекта. В других вариантах осуществления специалист в данной области может обратить внимание на апоптоз, потерю специфических Т-клеток, таких, как CD4+ или CD8+ Т-клетки, или на активацию CD69 для оценки действия композиций, предложенных в данном документе.
В соответствии с изобретением может применяться большое разнообразие синтетических наноно-сителей. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители является сферами или сфе
роидами. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители имеют плоскую или пластинчатую форму. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители являются кубами или кубоидами. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители овальные или эллиптические. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители имеют форму цилиндров, конусов или пирамид.
В некоторых вариантах осуществления желательно применять множество синтетических наноноси-телей, относительно однородных по размеру, форме и/или составу, так что каждый синтетический нано-носитель имеет аналогичные свойства. Например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% синтетических наноносителей от их общего числа могут иметь минимальный размер или максимальный размер, находящийся в пределах 5, 10 или 20% среднего диаметра или среднего размера синтетических наноносителей. В некоторых вариантах осуществления множество синтетических наноносителей может быть гетерогенной по размеру, форме и/или составу.
Синтетические наноносители могут быть твердыми, полыми и состоять из одного или нескольких слоев. В некоторых вариантах осуществления каждый слой имеет особенный состав и особенные свойства относительно другого слоя (слоев). В качестве примера, синтетические наноносители могут иметь сердцевинно-оболочное строение, при котором сердцевина является одним слоем (например, полимерной жилой), а оболочка является вторым слоем (например, билипидным слоем или одинарным слоем). Синтетические наноносители могут включать совокупность разных слоев.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут дополнительно включать один или несколько липидов. В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель может включать липосому. В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель может включать билипидный слой. В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель может включать липидный монослой. В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель может включать мицеллу. В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель может включать сердцевину, содержащую полимерную матрицу, окруженную липидным слоем (например, би-липидным слоем, липидным монослоем и т.д.). В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель может включать неполимерную сердцевину (например, частицу металла, квантовую точку, керамическую частицу, костную частицу, вирусную частицу, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д.), окруженную липидным слоем (например, билипидным слоем, липидным монослоем и т.д.).
В других вариантах осуществления синтетические наноносители могут содержать частицы металла, квантовые точки, керамические частицы и т.д. В некоторых вариантах осуществления неполимерный синтетический наноноситель является агрегатом неполимерных компонентов, например, агрегатом атомов металла (например, атомов золота).
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут дополнительно содержать один или несколько амфифильных компонентов. В некоторых вариантах осуществления амфи-фильная составляющая может придавать синтетическим наноносителям повышенную стабильность, улучшенную однородность или повышенную вязкость. В некоторых вариантах осуществления амфи-фильныесоставляющие могут быть связаны с внутренней поверхностью липидной мембраны (например, билипидным слоем, липидным монослоем и т.д.). Многие амфифильные составляющие, известные в данной области, пригодны для применения в создании синтетических наноносителей в соответствии с настоящим изобретением. Такие амфифильные составляющие включают фосфоглицериды; фосфатидил-холины; дипальмитоил фосфатидилхолин (DPPC); диолеил фосфатидилэтаноламин (DOPE); диолеилок-сипропилтриэтиламмоний (DOTMA); диолеилфосфатидилхолин; холестерол; эфир холестерола; диа-цилглицерин; диацилглицеринсукцинат; дифосфатидилглицерин (DPPG); гександеканол; спирты жирного ряда, такие как полиэтиленгликоль (PEG); полиоксиэтилен-9-лаурилэфир; поверхностно активные жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота или олеиновая кислота; жирные кислоты; моногли-цериды жирных кислот; диглицериды жирных кислот; амиды жирных кислот; сорбитан триолеат (Span(r)85) гликохолат; сорбитан монолаурат (Span(r)20); полисорбат 20 (Tween(r)20); полисорбат 60 (Tween(r)60); полисорбат 65 (Tween(r)65); полисорбат 80 (Tween(r)80); полисорбат 85 (Tween(r)85); поли-оксилэтилен моностеарат; сурфактин; полоксамер; сорбитановый эфир жирной кислоты, например сор-битан триолеат; лецитин; лизолецитин; фосфатидилсерин; фосфатидилинозитол; сфингомиелин; фосфа-тидилэтаноламин (цефалин); кардиолипин; фосфатидную кислоту; цереброзиды; дицетилфосфат; ди-пальмитоилфосфатидилглицерин; стеариламин; додециламин; гексадециламин; ацетилпальмитат; глице-ринрицинолеат; гексадецилстерат; изопропилмиристат; тилоксапол; поли(этиленгликоль) 5000-фосфатидилэтаноламин; поли(этиленгликоль) 400-моностеарат; фосфолипиды; синтетические и/или природные детергенты с высокими ПАВ свойствами; деоксихолаты; циклодекстрины; хаотропные соли; агенты для образования пар ионов и комбинации вышеперечисленного, но не ограничены ими. Амфи-фильная составляющая может состоять из смеси различных амфифильных составляющих. Специалисты в данной области поймут, что это примерный, а не исчерпывающий список веществ, проявляющих поверхностную активность. Любая амфифильная составляющая может быть использована в производстве синтетических наноносителей для применения в соответствии с настоящим изобретением.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут дополнительно содержать один или несколько углеводов. Углеводы могут быть природными или синтетическими. Углевод может быть дериватизированным природным углеводом. В некоторых вариантах осуществления углевод содержит моносахарид или дисахарид, например, глюкозу, фруктозу, галактозу, рибозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, маннозу, ксилозу, арабинозу, глуроновую кислоту, галактуроновую кислоту, маннуроновую кислоту, глюкозамин и нейраминовую кислоту, но не ограничен ими. В некоторых вариантах осуществления углевод является полисахаридом, включая пуллунан, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), гидроксицеллюлозу (НС), ме-тилцеллюлозу (МС), декстран, циклодекстран, гликоген, гидроксиэитилкрахмал, каррагенан, гликон, амилозу, хитозан, N,O-карбоксиметилхитозан, альгин и альгиновую кислоту, крахмал, хитин, инулин, конджак, глюкоманнан, пустулан, гепарин, гиалуроновую кислоту, курдлан и ксантан, но не ограничен ими. В различных вариантах осуществления изобретательские синтетические наноносители не включают (или специфически исключают) углеводы, такие как полисахариды. В некоторых вариантах осуществления углевод может содержать производное углевода, например, сахароспирт, включая маннитол, сорби-тол, ксилитол, эритриол, мальтитол и лактиол, но не ограничиваясь ими.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут содержать один или несколько полимеров. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители включают один или несколько полимеров, которые являются не содержащими концевые метоксигруппы плюрониевыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% (вес./вес.) полимеров, составляющих синтетические наноносители, являются не содержащими концевую метоксигруппу плюроновыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления все полимеры, составляющие синтетические наноносители, являются не содержащими концевую метоксигруппу плюроновыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители могут включать один или несколько полимеров, которые представляют собой не содержащий концевую метоксигруппу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% (вес./вес.) полимеров, из которых состоят синтетические наноносители, представляют собой не содержащие концевую метоксигруппу полимеры. В некоторых вариантах осуществления все полимеры, составляющие синтетические наноносители, являются не содержащими концевую метоксигруппу полимерами. В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители содержат один или несколько полимеров, которые не состоят из плюронового полимера. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% (вес./вес.) полимеров, составляющих синтетические наноносители, не включают плюроновый полимер. В некоторых вариантах осуществления все полимеры, составляющие синтетические наноносители, не включают плюроновый полимер. В некоторых вариантах осуществления такой полимер может быть окружен слоем покрытия (например, липосомой, липидным монослоем, мицеллой и т.д.). В некоторых вариантах осуществления различные элементы синтетических наноносителей могут быть связаны с полимером.
Иммунодепрессанты и/или антигены могут быть связаны с синтетическими наноносителями рядом способов. Как правило, соединение может являться результатом образования связи между иммуноде-прессантами и/или антигенами и синтетическим наноносителем. Образование связи может привести к присоединению иммунодепрессантов и/или антигенов к поверхности синтетического наноносителя и/или их заключению в синтетический наноноситель (инкапсуляции). В некоторых вариантах осуществления, однако, иммунодепрессанты и/или антигены инкапсулируются синтетическим наноносителем скорее благодаря структуре синтетического наноносителя, чем путем присоединения к синтетическому наноно-сителю. В предпочтительных вариантах осуществления синтетический наноноситель содержит полимер, как предоставлено в настоящем документе, и иммунодепрессанты и/или антигены, связанные с полимером.
Когда присоединение происходит в результате возникновения связи между иммунодепрессантами и/или антигенами и синтетическими наноносителями, присоединение может происходить за счет соединительной доли. Соединительная доля может являться группой, посредством которой иммунодепрессант и/или антиген соединяется с синтетическим наноносителем. Такие доли включают ковалентные связи, например амидную связь сложноэфирную связь, а также отдельные молекулы, которые связывают (кова-лентно или нековалентно) иммунодепрессант и/или антиген с синтетическим наноносителем. Такие молекулы включают линкеры или полимеры или их элементарное звено. Например, соединительная доля может содержать заряженный полимер, с которым иммунодепрессант и/или антиген связываются электростатически. В качестве другого примера, соединительная доля может содержать полимер или его мономер, к которым происходит ковалентное присоединение.
В предпочтительных вариантах осуществления синтетические наноносители включают полимер, как предоставлено в настоящем документе. Эти синтетические наноносители могут полностью состоять из полимера или могут состоять из смеси полимеров и других веществ.
В некоторых вариантах осуществления полимеры синтетического наноносителя соединяются, обра
зуя полимерную матрицу. В некоторых вариантах осуществления компонент, например, иммунодепрес-сант или антиген может ковалентно присоединяться к одному или нескольким полимерам полимерной матрицы. В некоторых вариантах осуществления ковалентная связь образуется посредством линкера. В некоторых вариантах осуществления компонент может нековалентно присоединяться к одному или нескольким полимерам полимерной матрицы. Например, в некоторых вариантах осуществления компонент может быть инкапсулирован или окружен полимерной матрицей или диспергирован в ней. Альтернативно или дополнительно компонент может быть связан с одним или несколькими полимерами полимерной матрицы гидрофобными взаимодействиями, взаимодействиями зарядов, силами ван дер Ваальса и т.д. Известно большое количество традиционных полимеров и способов образования из них полимерных матриц.
Полимеры могут быть природными или искусственными (синтетическими). Полимеры могут являться гомополимерами или сополимерами, содержащими два или более мономеров. В смысле последовательности сополимеры могут быть случайными, блок-сополимерами или содержать комбинацию случайных или блочных последовательностей. Как правило, полимеры в соответствии с настоящим изобретением являются органическими полимерами.
В некоторых вариантах осуществления полимер содержит полиэфир, поликарбонат, полиамид или полиэстер или их мономер. В других вариантах осуществления полимер содержит поли(этиленгликоль) (PEG), полипропиленгликоль, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот, или поликапролактон, или их мономер. В некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы полимер был биоразлагаемым. Таким образом, в этих вариантах осуществления предпочтительно, чтобы полимер включал а полиэфир, такой как поли(этиленгликоль) или полипропи-ленгликоль или их его мономер, полимер включал а блок-сополимер полиэфира и биоразлагаемый полимер, так чтобы полимер был биоразлагаемым. В других вариантах осуществления полимер не содержит исключительно полиэфир или его мономер, такой как поли(этиленгликоль) или полипропиленгликоль или его мономер.
Другими примерами полимеров, пригодных для применения в настоящем изобретении, являются полиэтилены, поликарбонаты (например, поли(1,3-диоксан-2он)), полиангидриды (например, по-ли(себациновый ангидрид)), полипропилфумераты, полиамиды (например, поликапролактам), полиаце-талы, полиэфиры, полиэстеры (например, полилактид, полигликолид, полилактид-со-гликолид, полика-пролактон, полигидроксикислота (например, полигидроксиалканоат))), поли(ортоэстеры), полицианоак-рилаты, поливиниловые спирты, полиуретаны, полифосфазены, полиакрилаты, полиметакрилаты, полимочевины, полистиролы и полиамины, полилизин, сополимеры полилизин-PEG и сополимеры по-ли(этиленимина) и поли(этиленимин)-PEG, но не ограничиваясь ими.
В некоторых вариантах осуществления полимеры согласно настоящему изобретению включают полимеры, которые были одобрены для применения у людей Правительства США (FDA) согласно 21 C.F.R. § 177.2600, включая без ограничения следующее: сложные полиэфиры (например, полимолочная кислота, сополимер молочной и гликолевой кислот, поликапролактон, поливалеролактон, поли(1,3-диоксан-2он)); полиангидриды (например, поли(себациновый ангидрид)); простые полиэфиры (например, поли-этиленгликоль); полиуретаны; полиметакрилаты; полиакрилаты и полицианоакрилаты.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть гидрофильными. Например, полимеры могут содержать анионные группы (например, фосфатную группу, сульфатную группу, карбоксилат-ную группу); катионные группы (например, четвертичную аминогруппу); или полярные группы (например, гидроксильную группу, тиоловую группу, аминогруппу). В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель, содержащий гидрофильную полимерную матрицу, создает гидрофильную среду в синтетическом наноносителе. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть гидрофобными. В некоторых вариантах осуществления синтетический наноноситель, содержащий гидрофобную полимерную матрицу, создает гидрофобную среду в синтетическом наноносителе. Выбор гидрофобного или гидрофильного полимера может оказывать влияние на природу связываемых синтетическим наноносителем (например, присоединяемых) веществ.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы одной или несколькими соединительными долями и/или функциональными группами. В соответствии с настоящим изобретением могут применяться различные соединительные доли или функциональные группы. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы полиэтиленгликолем (PEG), углеводом и/или ацикличными полиацеталями, полученными из полисахаридов (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). Определенные варианты осуществления могут быть получены с применением общих идей патента США № 5543158, Gref et al., или WO публикации № WO 2009/051837, Von Andrian et al.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть модифицированы липидом или группой жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления группой жирной кислоты может быть одна или несколько из масляной, капроновой, каприловой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, стеариновой, арахиновой, бегеновой или лигноцериновой кислот. В некоторых вариантах осуществления группой жирной кислоты может быть одна или несколько из пальмитолеиновой, олеиновой, вакценовой линолевой, альфа-линолевой, гамма-линолевой, арахидоновой, эйкозапентаеновой, докозагексаеновой
или эруковой кислот.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут представлять собой сложные полиэфиры, включая сополимеры, содержащие элементарные звенья молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как сополимер(молочной кислоты и гликолевой кислоты) и сополимер(лактида и гликолида), обобщенно в настоящем документе имеющие название "PLGA"; и гомополимеры, содержащие элементарные звенья гликолевой кислоты, в настоящем документе имеющие название "PGA," и элементарные звенья молочной кислоты, такие как поли^-молочная кислота, поли^-молочная кислота, поли^^-молочная кислота, поли^-лактид, поли-D-лактид, и поли-D,L-лактид, обобщенно в настоящем документе имеющие название "PLA." В некоторых вариантах осуществления примерами сложных полиэфиров являются, например, полигидроксикислоты; PEG сополимеры и сополимеры лактида и гликолида (например, PLA-PEG сополимеры, PGA-PEG сополимеры, PLGA-PEG сополимеры и их производные. В некоторых вариантах осуществления сложные полиэфиры включают, например, поли(капролактон), поли(капролактон)-PEG сополимеры, поли^-лактид-со^-лизин), полиэстер серина, поли(4-гидрокси^-пролин эстер), поли[а-(4-аминобутил)^-гликолевую кислоту] и их производные.
В некоторых вариантах осуществления полимер может представлять собой PLGA. PLGA является биологически совместимым и биоразлагаемым сополимером молочной и гликолевой кислот, и различные формы PLGA зарактеризуются соотношением молочная кислота:гликолевая кислота. Молочная кислота может являться L-молочной кислотой, D-молочной кислотой или D,L-молочной кислотой. Степень деградации PLGA можно менять, изменяя соотношение молочная кислота:гликолевая кислота. В некоторых вариантах осуществления PLGA, используемые в соответствии с настоящим изобретением, характеризуются отношением молочная кислота:гликолевая кислота, приблизительно 85:15, приблизительно 75:25, приблизительно 60:40, приблизительно 50:50, приблизительно 40:60, приблизительно 25:75 или приблизительно 15:85.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут являться одним или несколькими акриловыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления акриловые полимеры включают, например, сополимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, сополимеры метилметакрилата, этоксиэтилме-такрилат, цианоэтилметакрилат, сополимеры аминоалкилметакрилата, поли(акриловой кислоты), по-ли(метакриловой кислоты), сополимер метакриловой кислоты и алкиламида, поли(метилметакрилата), поли(ангидрида метакриловой кислоты), метилметакрилата, полиметакрилата, сополимер по-ли(метилметакрилата), полиакриламид, сополимер аминоалкилметакрилата, сополимер глицидилметак-рилата, полицианоакрилата и комбинациями, содержащими один или несколько из вышеупомянутых полимеров. Акриловый полимер может содержать полностью полимеризированные сополимеры эстеров акриловой и метакриловой кислот с низким числом четвертичных аммониевых групп.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть катионными. Как правило, катионные полимеры способны конденсировать и/или защищать негативно заряженные нити нуклеиновых кислот (например, ДНК или ее производных). Аминосодержащие полимеры, такие как дендримеры по-ли(лизина) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; и Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7), поли(этиленимина) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297), и по-ли(амидоаминные) дендримеры (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; and Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) являются положительно заряженными при физиологических значениях pH, образуют с нуклеиновыми кислотами ионные пары и проводят трансфекцию во многих линиях клеток. В различных вариантах осуществления изобретательские синтетические наноносители могут не содержать (или могут исключать) катионные полимеры.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут являться способными к разложению сложными полиэфирами, несущими катионные боковые цепи (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; и Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399). Примеры таких сложных полиэфиров включают сополимер (L-лактида и L-лизина) (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010), сложный полиэфир серина (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), сложный полиэфир (4-гидрокси^-пролина) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; and Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633) и сложный полиэфир (4-гидрокси^-пролина) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; and Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633).
Свойства этих и других полимеров и способов их получения хорошо известны в настоящей области
техники (смотрите, например, Патенты США № 6123727; 5804178; 5770417; 5736372; 5716404; 6095148;
5837752; 5902599; 5696175; 5514378; 5512600; 5399665; 5019379; 5010167; 4806621; 4638045 и 4946929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; and Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). В более общем виде разнообразие методов синтеза отдельных подходящих полимеров описано в Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; и в патентах
США 6506577, 6632922, 6686446 и 6818732.
В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть линейными или разветвленными. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут являться дендримерами. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть практически сшитыми друг с другом поперечными мостиками. В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть практически не связанными друг с другом поперечными мостиками. В некоторых вариантах осуществления полимеры можно применять в соответствии с настоящим изобретением, не подвергая их сшиванию поперечными мостиками. Помимо того, следует понимать, что изобретательские синтетические наноносители могут содержать блок-сополимеры, привитые сополимеры, комбинации, смеси и/или продукты присоединения упомянутых или других полимеров. Специалисты в данной области поймут, что приведенный в настоящем документе список полимеров, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, является примерным, но не исчерпывающим.
Композиции в соответствии с изобретением включают синтетические наноносители в комбинации с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как консерванты, буферы, раствор солей или раствор фосфатного буфера. Композиции можно получать, используя традиционные фармацевтические составляющие и технологии для получения полезных лекарственных форм. В варианте осуществления изобретенные синтетические наноносители суспендируют в стерильном растворе соли для инъекций вместе с консервантом.
В различных вариантах осуществления при приготовлении синтетических наноносителей в роли носителей могут быть полезны методы присоединения компонентов к синтетическим наноносителям. Если компонент является малой молекулой, предпочтительно связывать компонент с полимером до присоединения синтетических наноносителей. В различных вариантах осуществления также может быть предпочтительно приготавливать синтетические наноносители с поверхностными группами, которые служат для присоединения компонента к синтетическому наноносителю, а не для присоединения компонента к полимеру в конструкции синтетических наноносителей.
В некоторых вариантах осуществления связующим звеном может являться ковалентный линкер. В различных вариантах осуществления пептиды в соответствии с изобретением могут ковалентно присоединяться к внешней поверхности посредством линкера 1,2,3-триазол, при помощи 1,3-диполярного цик-лоприсоединения азидогрупп на поверхности наноносителя к антигену или иммунодепрессанту, содержащему алкиновую группу, или при помощи 1,3-диполярного циклоприсоединения алкинов на поверхности наноносителя к компонентам, несущим азидогруппу. Такие реакции циклоприсоединения предпочтительнее проводить в присутствии катализатора Cu(I) с Cu(I)-лигандом и восстановителем, который восстанавливает соединение Cu(II) до каталитически активного соединения Cu(I). Такое Cu(I)-катализированное азидо-алкиновое циклоприсоединение (CuAAC) также упоминается как клик-реакция.
Кроме того, ковалентное присоединение может содержать ковалентный линкер, который содержит амидный линкер, дисульфидный линкер, тиоэфирный линкер, гидразоновый линкер, иминовый или ок-симовый линкер, мочевинный или тиомочевинный линкер, имидиновый линкер, аминовый линкер и сульфонамидный линкер.
Амидный линкер образован при помощи амидной связи между амином одного компонента с карбоксильной группой другого компонента, такого, как наноноситель. Амидная связь в линкере может образовываться при помощи любой из конвенционных реакций образования амидной связи с соответственно защищенными аминокислотами или компонентами и активированной карбоксильной кислотой с N-гидроксисукцинимид-активированным сложным эфиром.
Дисульфидный линкер образуется путем образования дисульфидной (S-S) связи между двумя атомами серы в форме, например, R1-S-S-R2. Дисульфидная связь может образовываться посредством ти-ольного обмена у компонента, содержащего тиольную/меркаптановую группу(-SH), с другой активированной тиольной группой на полимере или наноносителе, или наноносителя, содержащего тиоль-ные/меркаптановые группы с компонентом, содержащим активированную тиольную группу.
Триазольный линкер, в частности 1,2,3-триазол в форме
"N -N
где R1 и R2 могут представлять собой любые химические структурные единицы, образуется с помощью реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения азида, прикрепленного к первому компоненту, такому как наноноситель, с концевым алкином, прикрепленным ко второму компоненту, такому как им-мунодепрессант или антиген. 1,3-диполярное циклоприсоединение происходит в присутствии или без присутствия катализатора, предпочтительно Cu(I), который связывает два компонента через 1,2,3-триазол. Это химическое взаимодействие подробно описано в работе Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002) and Meldal, et al., Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015 и обычно упоминается как клик-реакция или CuAAC.
В вариантах осуществления получают полимер, содержащий азидную или алкиновую группу, концевую относительно полимерной цепи. Этот полимер далее применяют для получения синтетического наноносителя таким образом, что большинство алкиновых и азидных групп расположены на поверхности этого наноносителя. Альтернативно синтетический наноноситель получают другим путем и последовательно функционализируют его алкиновыми или азидными группами. Компонент получают в присутствии алкина (если полимер содержит азид) или азида (если полимер содержит алкиновую группу). Затем компонент реагирует с наноносителем через 1,3-диполярное циклоприсоединение с катализатором или без него, что ковалентно связывает компонент к частице при помощи 1,4-распределенного 1,2,3-триазолового линкера.
Тиоэфирный линкер образуется путем образования сульфур-карбоновой (тиоэфирной) связи, например в форме R1-S-R2. Тиоэфир можно получить или посредством алкилирования тиоль-ной/меркаптановой (-SH) группы на одном компоненте, таком, как компонент с алкилирующей группой, такой как галогенид или эпоксид, на втором компоненте, таком, как наноноситель. Тиоэфирные линкеры могут также быть образованы посредством присоединения по Михаэлю тиол/маркаптановой группы одного компонента к электронно-дефицитной алкеновой группе второго компонента, такого, как полимер, содержащего малеимидную или винилсульфоновую группу в роли акцептора Михаэля. По-другому тио-эфирные линкеры можно получить при помощи радикальной тиоленовой реакции между ти-ол/меркаптановой группой одного компонента и алкеновой группой второго компонента, такого, как полимер или наноноситель.
Гидразоновый линкер получают посредством реакции между гидразидной группой одного компонента и альдегидной/кетоновой группой второго компонента, такого, как наноноситель.
Гидразидный линкер образуется при помощи реакции между гидразидной группой одного компонента и карбоксильной группой второго компонента, такого, как наноноситель. Такие реакции, как правило, осуществляют, используя тот же химизм, что и при получении амидной связи, при которой карбо-новая кислота активируется активирующим реагентом.
Иминный или оксимный линкер образуется посредством реакции между аминной или N-алкоксиаминной (или аминоокси) группой одного компонента с альдегидной или кетоновой группой второго компонента, такого, как наноноситель.
Мочевинный или тиомочевинный линкер образуется посредством реакции между аминогруппой одного компонента и изоцианатной или тиоцианатной группой второго компонента, такого, как наноно-ситель.
Амидиновый линкер образуется посредством реакции между аминогруппой одного компонента и амидоэфирной группой второго компонента, такого, как наноноситель.
Аминный линкер получают при помощи реакции алкилирования аминогруппы одного компонента алкилирующей группой, например галидной, эпоксидной или сульфонатэфирной группой, второго компонента, такого, как наноноситель. Альтернативно аминный линкер также можно получить путем восстановительного аминирования аминогруппы одного компонента альдегидной или кетоновой группой второго компонента, такого, как наноноситель, в присутствии приемлемого восстановителя, например, цианоборгидрида натрия или триацетоксиборогидрида натрия.
Сульфонамидный линкер образуется посредством реакции между аминогруппой и сульфонилгалд-ной (например, сульфонилхлоридной) группой второго компонента, такого, как наноноситель.
Сульфоновый линкер получают посредством присоединения по Михаэлю нуклеофила к винил сульфону. На поверхности наноносителя или присоединенным к компоненту может быть как винил сульфон, так и нуклеофил.
Компонент также может быть сопряжен с наноносителем посредством нековалентных способов сопряжения. Например, негативно заряженный антиген или иммунодепрессант может быть сопряжен с позитивно заряженным наноносителем посредством электростатической адсорбции. Компонент, содержащий металлический лиганд, также может быть сопряжен с наноносителем, содержащим металлический комплекс, посредством комплекса металл-лиганд.
В различных вариантах осуществления может быть присоединен к полимеру, полимолочной кисло-те-полиэтиленгликолю, до того, как произойдет агрегация синтетического наноносителя, или до образования синтетического наноносителя с реактивными или активируемыми группами на поверхности. В последнем случае компонент можно получить, используя группу, совместимую с химизмом присоединения, характерным для поверхности. В других вариантах осуществления пептидный компонент может присоединяться к VLP или липосомам посредством приемлемого линкера. Линкер представляет собой соединение или реагент, который способен соединить две молекулы вместе. В варианте осуществления линкер может представлять собой гомобифункциональный или гетеробифункциональный реагент, описываемый в Hermanson 2008. Например, VLP или липосомный синтетический наноноситель, содержащий карбоксильную группу на поверхности, можно обрабатывать гомобифункциональным линкером, дигидразидом адипиновой кислоты (ADH), в присутствии EDC для образования соответствующего синтетического наноносителя с ADH линкером. Полученный при помощи ADH-линкера синтетический на-ноноситель в дальнейшем соединяют с пептидом, содержащим кислотную группу, посредством другого
конца ADH-линкера на NC, чтобы вызвать сопряжение с соответствующими VLP или пептидом липосо-мы.
Для подробных описаний доступных способов конъюгации, см. Hermanson G.T. "Bioconjugate Techniques", 2nd Edition, Published by Academic Press, Inc., 2008. В дополнение к ковалентному присоединению компонент можно присоединять с помощью адсорбции к предварительно сформированному синтетическому наноносителю или его можно присоединять с помощью инкапсуляции во время образования синтетического наноносителя.
Любой иммунодепрессант, как предоставлено в настоящем документе, может быть связан с синтетическим наноносителем. Иммунодепрессанты включают, но не ограничены ими, статины; ингибиторы mTOR, такие как рапамицин или аналог рапамицина; TGF-р сигнальные агенты; агонисты рецептора TGF-Р; ингибиторы деацетилазы гистонов (HDAC); кортикостероиды; ингибиторы митохондриальной функции, такие как ротенон; ингибиторы Р38; агонисты NF-кР; агонисты рецепторов аденозтина; агонисты простагландина Е2; ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как ингибитор фосфодиэстеразы 4; ингибиторы протеасомы; ингибиторы киназы; агонисты рецепторов, связанных с G-белком; антагонисты рецепторов, связанных с G-белком; глюкокортикоиды; ретиноиды; ингибиторы цитокинов; ингибиторы рецепторов цитокинов; активаторы рецепторов цитокинов; антагонисты рецепторов, активируемых пролиферацией пероксисомы; агонисты рецепторов, активируемых пролиферацией пероксисомы; ингибиторы деацетилазы гистонов; ингибиторы кальциневрина; ингибиторы фосфатазы и оксидированных АТФ. Иммунодепрессанты также включают IDO, витамин D3, циклоспорин А, ингибиторы рецептора арил-гидрокарбона, ресвератрол, азатиопурин, 6-меркаптопурин, аспирин, нифлюмовую кислоту, эстриол, триполид, интерлейкины (например, IL-1, IL-10), циклоспорин А, цитокины различных малых интерферирующих РНК или рецепторы цитокинов и подобное.
Примерами статинов могут служить аторвастатин (LIPITOR(r), TORVAST(r)), церивастатин, флува-статин (LESCOL(r), LESCOL(r)XL), ловастатин (MEVACOR(r), ALTOCOR(r), ALTOPREV(r)), мевастатин
(COMPACTIN(r)), питавастатин (LIVALO(r), PIAVA(r)), розувастатин (PRAVACHOL(r), SELEKTINE(r), LIPOSTAT(r)), розувастатин (CRESTOR(r)) и симвастатин (ZOCOR(r), LIPEX(r)).
Примерами ингибиторов mTOR могут служить рапамицин его аналоги (например, CCL-779, RAD001, АР23573, С20-металлилрапамицин (С20-Marap), С16-(S)-бутилсульфонамилорапамицин (C16-BSrap), С16-(S)-3-метилиндолрапамицин (C16-iRap) (Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (NVP-BEZ235), хризофановая кислота (хризофанол), дефоролимус (MK-8669), эверо-лимус (RAD0001), KU-0063794, PI-103, PP242, темзиролимус и WYE-354 (available from Selleck, Houston,
TX, USA).
Примеры сигнальных агентов TGF-р включают лиганды TGF-р (например, активин A, GDF1, GDF11, морфогенные белки кости, узлы TGF-Р) и их рецепторы (например, ACVR1B, ACVR1C,
ACVR2A, ACVR2B, BMPR2, BMPR1A, BMPR1B, TGFpRI, TGFpRII), R-SMADS/co-SMADS (например,
SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD5, SMAD8) и ингибиторы лигандов (например, фоллистатин, ноггин, хордин, DAN, lefty, LTBP1, THBS1, декорин).
Примерами ингибиторов митохондриальной функции могут служить атрактилозид (дикалиевая соль), бонгкрековая кислолта (триаммонийная соль), карбонилцианид m-хлорфенилгидразол, карбокси-атрактилозид (например, полученный из Atractylis gummifera), CGP-37157, (-)-дегуелин (например, полученный из Mundulea sericea), F16, доменный пептид связывания II VDAC гексокиназы, олигомицин, ро-тенон, Ru360, SFK1 и валиномицин (например, полученный из Streptomyces fulvissimus)
(EMD4Biosciences, USA).
Примерами ингибиторов Р38 могут служить SB-203580 (4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5 -(4-пиридил) 1Н-имидазол), SB-239063 (транс-1 -(4-гидроксициклофенил)-4-(фторфенил)-5-(2-метоксипиримидин-4-ил)имидазол), SB-220025 (5-(2амино-4-пиримидинил)-4-(4-фторфенил)-1-(4-пиперидинил) имидазол)) и ARRY-797.
Примерами ингибиторов NF (например, NK-кР) могут служить IFRD1, 2-(1,8-нафтиридин-2-ил)-фенол, 5-аминосалициловая кислота, BAY 11-7082, BAY 11-7085, САРЕ (фенетилэстер кофейной кислоты), диэтилмалеат, ингибитор IV IKK-2, IMD 0354, лактацистин, MG-132 [Z-Leu-Leu-Leu-CHO], ингибитор III активации NFKB, ингибитор II активации NFKB, JSH-23, партенолид, оксид фениларсина (РАО), РРМ-18, аммонийная соль пирролидиндитиокарбаминовой кислоты, QNZ, RO 106-9920, ракагламид, ро-кагламид AL, рокагламид С, рокагламид I, рокагламид J, рокаглаол, (R)-MG-132, салицилат натрия, триптолид (PG490), веделолактон.
Примерами агонистов рецептора аденозина могут служить CGS-21680 и ATL-146е.
Примерами агонистов простагландина Е2 могут служить Е-простаноид 2 и Е-простаноид 4.
Примерами ингибиторов фосфодиэстеразы (неселективных и селективных ингибиторов) могут служить кофеин, аминофиллин, IBMX (3-изобутил-1-метилксантин), параксантин, пентоксифиллин, теобромин, теофиллин, метилированные скантины, винпоцетин, EHNA (эритро-9-(2-гидрокси-3-нонил)аденин), анагрелид, эноксимон (PERFAN(tm)), милринон, левосимендон, мезембрин, ибудиласт, пикламиласт, лютеолин, дротаверин, рофлумиласт (DAXAS(tm), DALIRESP(tm)), силденафил
(REVATION(r), VIAGRA(r)), тадалафил (ADCIRCA(r), CIALIS(r)), варденафил (LEVITRA(r), STAXYN(r)),
уденафил, аванафил, икариин, 4-метилпиперазин и пиразолопиримидин-7-1.
Примерами ингибиторов протеасомы могут служить бортезомиб, дисульфирам, эпигаллокатехин-3-галлат и салиноспорамид А.
Примерами ингибиторов киназы могут служить бевацизумаб, BIBW 2992, цетуксимаб
(ERBITUX(r)), иматиниб (GLEEVEC(r)), трастузумаб (HERCEPTIN(r)), гефитиниб (IRESSA(r)), ранибизу-
маб (LUCENTIS(r)), пегаптиниб, сорафениб, дасатиниб, сунитиниб, эрлотиниб, нилотиниб, лапатиниб, панитумумаб, вандетаниб, Е7080, пазопаниб, мубритиниб.
Примерами глюкокортикоидов могут служить гидрокортизон (кортизол), кортизон ацетат, предни-зон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон, бетаметазон, триамцинолон, беклометазон, флудро-кортизон ацетат (DOCA) и альдостерон.
Примерами ретиноидов могут служить ретинол, ретиналь, третиноин (ретиноевая кислота, RETINA(r)), изотретиноин ACCUTANE(r), AMNESTEEM(r), CLARAVIS(r), SOTRET(r)), алитретиноин (PAN-
RETIN(r)), этретинат (TEGISON(tm)) и его метаболит ацитреин (SORIATANE(r)), тазаротен (TAZORAC(r),
AVAGE(r), ZORAC(r)), бексаротен (TARGRETIN(r)) и адапален (DIFFERIN(r)).
Примерами ингибиторов цитокина могут служить антагонист или рецептор IL1ra, IL1, IGFBP, TNF-BF, уромодулин, альфа-2-макроглобулин, циклоспорин А, пентамидин и пентоксифиллин
(PENTOPAK(r), PENTOXIL(r), TRENTAL(r)).
Примерами рецепторов или антагонистов, активируемых пролиферацией пероксисомы, могут служить GW9662, антагонист III PPARy, G335, Т0070907 (EMD4Biosciences, США).
Примерами рецепторов или агонистов, активируемых пролиферацией пероксисомы, могут служить пиоглитазон, циглитазон, клофибрат, GW1929, GW7647, L-165,041, LY 171883, активатор PPARy, Fmoc-Leu, троглитазон и WY-14643 (EMD4Biosciences, США).
Примерами ингибиторов деацетилазы гистонов могут служить гидроксамовые кислоты (или гидро-ксаматы), такие как трихостатин А, циклические тетрапептиды (такие как трапоксин В) и депсипептиды, бензамиды, электрофильные кетоны, соединения алифатических кислот, такие как фенилбутират и вальпроевая кислота, гидроксамовые кислоты, такие как вориностат (SAHA), белиностат (PXD101), LAQ824 и панобиностат (LBH589), бензамиды, такие как энтиностат (MS-275), CI994 и моцетиностат (MGCD0103), накотинамид, производные НАД, дигидрокумарин, нафтопиранон и 2-гидроксинафальдегиды.
Примерами ингибиторов кальциневрина могут служить циклоспорин, пимекролимус, воклоспорин и такролимус.
Примерами ингибиторов фосфатазы могут служить BN82002 гидрохлорид, СР-91149, каликулин А, кантаридиновая кислота, кантаридин, циперметрин, этил-3,4-дефостатин, натриевая соль фостриецина, MAZ51, метил-3,4-дефостатин, NSC 95397, норкантаридин, аммониевая соль акадаиковой кислоты, полученная из prorocentrum concavum, окадаиковая кислота, калиевая соль акадаиковой кислоты, натриевая соль окадаиковой кислоты, фениларсиноксид, разнообразные смеси ингибиторов фосфатазы, белок фос-фатаза 1С, ингибитор белка фосфатазы 2А, белок фосфатаза 2А1, пртеин фосфатаза 2А2, натрий ортова-надат.
В некоторых вариантах осуществления антигены, как описано в настоящем документе, также связаны с синтетическими наноносителями. В некоторых вариантах осуществления антигены связаны с одними и теми же или с различными синтетическими наноносителями, с которыми связаны иммунодепрес-санты. В других вариантах осуществления антигены не связаны с синтетическими наноносителями. Антигены включают любые из антигенов, предложенных в данном документе, или их фрагментов или производных, такие антигены ассоциированы с воспалительными, аутоиммунными заболеваниями, аллергией, отторжением органа или тканей, болезнью "трансплантат против хозяина", антигенами трансплантата и антигенами терапевтических белков. Эпитопы или белки, полипептиды или пептиды, которые содержат эпитопы, могут быть получены или произведены из любых антигенов, предоставленных или другим образом известных в данной области.
Терапевтические белки включают, но не ограничиваются ими, инфузируемые терапевтические белки, ферменты, кофакторы ферментов, гормоны, факторы свертывания крови, цитокины и интерфероны, факторы роста, моноклональные антитела и поликлональные антитела (например, вводимые субъекту для заместительной терапии) и белки, связанные с болезнью Помпе (например, альглюкозидаза альфа, rhGAA (например, миозим и люмизим (Genzyme)). Терапевтические белки также включают белки, вовлеченные в каскад свертывания крови. Терапевтические белки включают фактор VIII, фактор VII, фактор IX, фактор V, фактор фон Виллебранда, фактор фон Хельдебранта, тканевой активатор плазминоге-на, инсулин, гормон роста, эртроэпоэтин альфа, VEGF, тромбоэпоэтин, лизозим, антитромбин и подобные. Терапевтические белки также включают адипокины, такие как лептин и адипонектин. Другие примеры терапевтических белков описаны ниже и в тексте настоящего документа. Также включены фрагменты или производные любых из терапевтических белков, предложенных в виде эпитопа, или белка, полипептида или пептида, которые содержат эпитоп.
Примерами терапевтических белков, применяемых в ферментной заместительной терапии у субъектов, страдающих от лизосомальной болезни накопления, могут служить, но не ограничиваются ими, имиглюцераза для введения синдрома Гоше (например, церезимТМ), а-галактозидаза A (a-gal А) для введения болезни Фабри (например, альгазидаза бета, фабризимТМ), кислая а-глюкозидаза (GAA) для введения болезни Помпе (например, альглюкозидаза альфа, люмизимТМ, миозимТМ), арилсульфатаза В для введения мукополисахаридозов (например, ларонидаза, альдуразимТМ идурсульфаза, элапразаТМ, арил-сульфатаза В, наглазимТМ).
Примерами ферментов могут служить оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.
Примерами гормонов могут служить мелатонин (№ацетил-5-метокситриптамин), серотонин, тироксин (или тертаиодтиронин) (тиреоидный гормон), трийодтиронин (тиреоидный гормон), эпинефрин (или адреналин), норэпинефрин (или норадреналин), дофамин (или гормон-ингибитор пролактина), антимюл-леров гормон (или фактор или гормон-ингибитор мюллерова гормона), адипонектин, адренокортико-тропный гормон (или кортикотропин), ангиотензиноген и ангиотензин, антидиуретический гормон (или-вазопрессин, вазопрессин аргинин), предсердный натрийуретический пептид (или атриопептин), кальци-тонин, холецистокинин, кортикотропин-высвобождающий гормон, эритроэпоэтин, фолликулостимули-рующий гормон, гастрин, грелин, глюкагон, глюкагоноподобный пептид (GLP-1), GIP, гонадотропин-высвобождающий гормон, гормон, высвобождающий гормон роста, хорионический гонадотропин человека, плацентарный лактоген человека, гормон роста, ингибин, инсулин, инсулиноподобный фактор роста (или соматомедин), лептин, лютеинизирующий гормон, меланоцитстимулирующий гормон, орексин, окситоцин, паратиреоидный гормон, пролактин, релаксин, секретин, соматостатин, тромбоэпоэтин, ти-реостимулирующий гормон (или тиреотропин), тиреотропин-высвобождающий гормон, кортизол, альдо-стерон, тестостерон, дегидроэпиандростерон, андростенедион, дигидротестостерон, эстрадиол, эстрон, эстриол, прогестерон, кальцитриол (1,25-дигидроксивитамин D3), кальцидиол (25-гидроксивитамин D3), простагландины, лейкотриены, простациклин, тромбоксан, пролактин-высвобождающий гормон, липо-тропин, нейропептид Y, гистамин, эндотелин, панкреатический полипептид, натрийуретический пептид головного мозга, ренин и энкефалин.
Примерами крови и свертываемости крови могут служить фактор I (фибриноген), фактор II (протромбин), тканевой фактор, фактор V (проакселерин, лабильный фактор), фактор VII (стабильный фактор, проконвертин), фактор VIII (антигемофилический глобулин), фактор IX (тромбопластин плазмы), фактор X (фактор Стюарта-Прауэра), фактор Ха, фактор XI, фактор XII (фактор Хагемана), фактор XIII (фибрин-стабилизирующий фактор), фактор фон Виллебранда, прекалликреин (фактор Флетчера), высокомолекулярный кининоген (HMWK) (фактор Фитцджеральда), фибронектин, фибрин, тромбин, антитромбин III, кофактор гепарина II, белок С, белок S, белок Z, белок Z-зависимый протеазный ингибитор (ZPI), плазминоген, альфа 2-антиплазмин, тканевой активатор плазминогена (tPA), урокиназа, ингиби-тор-1 активатора плазминогена (РАН), ингибитор-2 активатора плазминогена (PAI2), раковый прокоагу-лянт и эритроэпоэтин альфа (эпоген, прокрит).
Примерами цитокинов могут служить лимфокины, интерлейкины и хемокины, цитокины типа 1, такие как IFN-y, TGF-р, и цитокины типа 2, такие как IL-4, IL-10 и IL-13.
Примерами факторов роста могут служить адреномедуллин (AM), ангиоэпоэтин (Ang), фактор ау-токринной моторики, морфогенетические белки кости (BMP), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), эпидермальный фактор роста(EGF), эритроэпоэтин (ЕРО), фибробластный фактор роста (FGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор стимулирования образования колоний гранулоци-тов (G-CSF), фактор, стимулирующий образование колоний гранулоцитов (GM-CSF), фактор дифференциации и роста д-9 (GDF9), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста производных гепацитов (HDGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор стимуляции миграции, миостатин (GDF-8), фактор роста нервной ткани (NGF) и другие нейротрофины, фактор роста тромбоцитов (PDGF), тромбоэпо-этин (ТРО), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-a), трансформирующий фактор роста бета(TGF-Р), фактор некроза опухолей альфа (TNF-a), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), сигнальный путь Wnt, плацентарный фактор роста (PlGF), [(зародышевый бычий соматотропин)] (FBS), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, и IL-7.
Примеры моноклональных антител влючают абаговомаб, абциксимаб, адалимумаб, адекатумумаб, афелимомаб, афутузумаб, алацизумаб пегол, ALD, алемтузумаб, алтумомаб пентетат, анатумомаб мафе-натокс, анрукинзумаб, антитимоцитарный глобин, аполизумаб, арцитумомаб, азелизумаб, атлизумаб (то-цилизумаб), аторолимумаб, бапинеузумаб, базиликсимаб, бавитуксимаб, бектумомаб, белимумаб, бенра-лизумаб, бертилимумаб, безилезомаб, бевацизумаб, бициромаб, биватузумаб мертанзин, блинатумомаб, брентуксимаб ведотин, бриакинумаб, канакинумаб, кантузумаб мертанзин, капромаб пендетид, катумак-сомаб, цеделизумаб, цертолизумаб пегол, цетуксимаб, цитатузумаб богатокс, циксутумумаб, кленолик-симаб, кливатузумаб тетраксетан, конатумумаб, дацетузумаб, даклизумаб, даратумумаб, денозумаб, де-тумомаб, дорлимомаб аритокс, дорликсизумаб, экромексимаб, экулизумаб, эдобакомаб, эдреколомаб, эфализумаб, эфунгумаб, элотузумаб, элзилимомаб, энлимомаб пегол, эпитумомаб цитуксетан, эпратузу
маб, эрлизумаб, эртумаксомаб, этарацизумаб, эксбивирумаб, фанолезомаб, фаралимомаб, фарлетузумаб, фелвизумаб, фезакинумаб, фигитумумаб, фонтолизумаб, форавирумаб, фрезолимумаб, галиксимаб, ган-тенерумаб, гавилимомаб, гемтузумаб озогамицин, GC1008, гирентуксимаб, глембатумумаб ведотин, го-лимумаб, гомиликсимаб, ибализумаб, ибритумомаб тиуксетан, иговомаб, имциромаб, инфликсимаб, ин-тетумумаб, инолимомаб, инотузумаб озогамицин, ипилимумаб, иратумумаб, келиксимаб, лабетузумаб, лебрикизумаб, лемалезомаб, лерделимумаб, лексатумумаб, либивирумаб, линтузумаб, лорвотузумаб мертанзин, лукатумумаб, лумиликсимаб, мапатумумаб, маслимомаб, матузумаб, меполизумаб, метели-мумаб, милатузумаб, минретумомаб, митумомаб, моролимумаб, мотавизумаб, муромонаб-CD3, наколо-маб тафенатокс, наптумомаб эстафенатокс, натализумаб, небакумаб, нецитумумаб, нерелимомаб, нимо-тузумаб, нофетумомаб мерпентан, окрелизумаб, одулимомаб, офатумумаб, оларатумаб, омализумаб, опортузумаб монатокс, ореговомаб, отеликсизумаб, пагибаксимаб, паливизумаб, панитумумаб, паноба-кумаб, пасколизумаб, пемтумомаб, пертузумаб, пекселизумаб, пинтумомаб, приликсимаб, притумумаб, рафивирумаб, рамуцирумаб, ранибизумаб, раксибакумаб, регавирумаб, резлизумаб, рилотумумаб, ритук-симаб, робатумумаб, ронтализумаб, ровелизумаб, руплизумаб, сатумомаб пендетид, севирумаб, сиброту-зумаб, сифалимумаб, силтуксимаб, сиплизумаб, соланезумаб, сонепцизумаб, сонтузумаб, стамулумаб, сулезомаб, такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, танезумаб, таплитумомаб паптокс, тефиба-зумаб, телимомаб аритокс, тенатумомаб, тенеликсимаб, теплизумаб, тицилимумаб (тремелимумаб), тига-тузумаб, тоцилизумаб (атлизумаб), торализумаб, тозитумомаб, трастузумаб, тремелимумаб, тукотузумаб целмолейкин, Тувирумаб, уртоксазумаб, устекинумаб, вапаликсимаб, ведолизумаб, велтузумаб, вепали-момаб, визилизумаб, волоциксимаб, вотумумаб, залутумумаб, занолимумаб, зиралимумаб и золимомаб аритокс.
Примерами инъекцируемых терапевтических белков или терапевтических белков, предназначенных для инфузионной терапии, являются, например, Тоцилизумаб (Roche/Actemra(r)), альфа-1 антитрипсин (Kamada/AAT), Хематид(r) (Affymax and Takeda, синтетический пептид), альбинтерферон альфа^ (No-vartis/Zalbin(tm)), Руцин(r) (Pharming Group, заместительная терапия ингибитора С1), тезаморелин (Ther-atechnologies/Egrifta, синтетический фактор высвобождения гормона роста), окрелизумаб (Genentech, Roche и Biogen), белимумаб (GlaxoSmithKline/Benlysta(r)), пеглоксиказа (Savient Pharmaceuti-cals/Krystexxa(tm)), талиглюцераза альфа (Protalix/Uplyso), агальсидза (Shire/Replagal(r)), велаглюцераза альфа (Shire).
Дополнительные терапевтические белки, полезные в соответствии с аспектами данного изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области, и изобретение не ограничено в этом отношении.
В некоторых вариантах осуществления компонент, такой как антиген или иммунодепрессант, может быть выделен. "Изолированный" относится к элементу, отделенному от своей естественной среды и присутствующему в эффективном количестве для его идентификации или применения. Это означает, например, что элемент может быть (i) селективно выработан при экспрессии клонирования или (ii) очищен при помощи хроматографии или электрофореза. Выделенные элементы могут быть практически чистыми, но не обязательно. Поскольку выделенный элемент может быть примешан к фармацевтически приемлемому наполнителю в фармацевтическом препарате, элемент может составлять только небольшую долю препарата. Несмотря на это, элемент является выделенным в том смысле, что он отделен от веществ, с которыми он может быть ассоциирован в живых системах, например, изолирован от других липидов или белков. Любые предоставленные в настоящем документе элементы могут быть включены в композиции в выделенном виде.
D. Способы получения и применения композиций по настоящему изобретению и
относящиеся к ним способы
Синтетические наноносители могут быть получены с помощью ряда разнообразных способов, известных в данной области техники. Например, синтетические наноносители могут быть образованы способами, такими как нанопреципитация, потоковая фокусировка с использованием жидкостных каналов, распылительная сушка, испарение растворителя однокомпонентных и двухкомпонентных эмульсий, экстракция растворителем, разделение фаз, размалывание, микроэмульсионные процедуры, микросборка, наносборка, жертвенные слои, простая и комплексная коацервация, и другими способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. В качестве альтернативы или дополнительно, описан синтез в водном и органическом растворителе для монодисперсных полупроводниковых, проводящих, магнитных, органических и других наноматериалов (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; and Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). В литературе описаны дополнительные способы (смотри, например Doubrow, Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; и Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; US Patents 5578325 и 6007845; P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010)).
Разнообразные материалы можно инкапсулировать в синтетические наноносители, если необходи
мо, с помощью ряда способов, включая без ограничения С. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006); K. Avgoustakis "Pegy-lated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004); С. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Другие методы, пригодные для инкапсулирования материалов в синтетические наноносители, могут применяться без ограничения методами, раскрытыми в патенте США 6632671, Unger October 14, 2003.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители получают в процессе нанопре-ципитации или распылительной сушки. Условия получения синтетических наноносителей могут изменяться в целях получения частиц желаемого размера или свойств (например, гидрофобность, гидрофиль-ность, внешняя морфология, "липкость", форма и т.д.). Способ получения синтетических наноносителей и условия получения (например, растворитель, температура, концентрация, скорость потока воздуха и т.д.) могут зависеть от материалов, связываемых с синтетическими наноносителями, и/или состава полимерной матрицы.
Если размер частиц, полученных любым из перечисленных способов, превышает желаемый размер, частицы могут быть калиброваны, например, при помощи фильтра.
Элементы (т.е. компоненты) изобретательских синтетических наноносителей (такие как группы, из которых состоит поверхность иммунофункции, группы-мишени, полимерные матрицы, эпитопы, или белки, полипептиды или пептиды, которые содержат эпитопы, иммунодепрессанты и т.п.) могут быть связаны со всем синтетическим наноносителем, например, одной или несколькими ковалентными связями, или могут быть связаны одним или несколькими линкерами. Дополнительные методы функционали-зирования синтетических наноносителей могут быть адаптированы из опубликованной заявки на патент США 2006/0002852, Saltzman et al., опубликованной заявки на патент США 2009/0028910, DeSimone et al., или опубликованной международной заявке WO 2008/127532 A1, Murthy et al.
Альтернативно или дополнительно синтетические наноносители могут быть связаны с компонентами непосредственно или опосредованно через нековалентные взаимодействия. При нековалентном присоединении нековалентное связывание осуществляется посредством нековалентных взаимодействий, которые включают взаимодействия зарядов, взаимодействие между антигеном и антителом, координацию металла, физическую абсорбцию, взаимодействия по типу хозяин-гость, гидрофобные взаимодействия, стэкинг-взаимодействие ТТ, водородные связи, взаимодействия ван дер Ваальса, магнитные взаимодействия, электростатические взаимодействия, взаимодействия между диполями и/или их комбинации. Такие пары могут располагаться в определенном порядке на внешней поверхности или на внутренней поверхности синтетического наноносителя по настоящему изобретению. В вариантах осуществления инкапсуляция и/или абсорбция является формой связывания. В вариантах осуществления изобретательские синтетические наноносители могут комбинироваться с антигеном при смешивании в одной основе или системе доставки.
Популяции синтетических наноносителей могут комбинироваться в целях получения фармацевтических лекарственных форм в соответствии с настоящим изобретением путем использования традиционных фармацевтических методов. Они включают смешивание жидкостей, при котором одна или несколько суспензий, каждая из которых содержит одно или несколько подмножеств наноносителей, непосредственно смешивают или объединяют в одной или нескольких емкостях, содержащих растворитель. Поскольку синтетические наноносители также могут производиться или храниться в порошкообразной форме, может применяться способ смешивания сухих порошков, как и ресуспензия двух или нескольких порошкообразных веществ в общей среде. В зависимости от свойств наноносителей и их потенциалов взаимодействия, преимущество может отдаваться одному или другому пути смешивания.
Типичные изобретательские композиции, содержащие синтетические наноносители, могут содержать неорганические или органические буферы (например, натриевые или калиевые соли фосфата, ацетата, карбоната или цитрата) и агенты, регулирующие pH (например, соляная кислота, натрий или калий гидроксид, соли цитрата или ацетата, аминокислоты и их соли), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, альфа-токоферол), ПАВ (например, полисорбат 20, полисорбат 80, полиоксэтилен 9-10 но-нилфенол, натрий дезоксихолат), стабилизаторы раствора и/или крио/лио стабилизаторы, (например, сахароза, лактоза, маннитол, трегалоза), агенты регуляции осмотичности (например, соли или сахара), антибактериальные агенты (например, бензойная кислота, фенол, гентамицин), противовспенивающие агенты (например, полидиметилсилозон), консерванты (например, тимерозал, 2-феноксиэтанол, EDTA), стабилизаторы полиполимера и агенты регуляции вязкости (например, поливинилпирролидон, полокса-мер 488, карбоксиметилцеллюлоза) и сорастворители (например, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол).
Композиции в соответствии с изобретением включают изобретательские синтетические наноноси-тели в комбинации с фармацевтически приемлемыми наполнителями. Композиции можно получать, используя традиционные фармацевтические составляющие и технологии для получения полезных лекарственных форм. Методики, подходящие для применения при осуществлении на практике настоящего изо
бретения, можно найти в Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo-Obeng, and Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; и Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, 2-е изд., М. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. В варианте осуществления изобретательские синтетические наноносители суспендируют в стерильном растворе соли для инъекций вместе с консервантом.
Следует понимать, что композиции изобретения можно получать любым удобным способом, и изобретение никоим образом не ограничено композициями, которые получают описанными способами. Выбор соответствующего способа может потребовать внимания к свойствам конкретных связываемых групп.
В некоторых вариантах осуществления синтетические наноносители настоящего изобретения изготовляют в стерильных условиях или стерилизуют в конце. Это позволяет обеспечить то, что конечная композиция стерильна и неинфекционна и, таким образом, является более безопасной по сравнению с нестерильными композициями. Это создает меру безопасности, поддающуюся измерению, особенно когда субъекты, получающие синтетические наноносители, имеют дефекты иммунитета, страдают от инфекции и/или являются чувствительными к инфекции. В некоторых вариантах осуществления изобретательские синтетические наноносители могут быть лиофилизированы и хранятся в виде суспензии или лиофилизированного порошка, в зависимости от стратегии формулировки по отношению к длительному хранению без потери активности.
Композиции изобретения можно вводить разнообразными способами, в том числе подкожно, ин-траназально, орально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, трансмукозально, сублингваль-но, ректально, через глаз, пульмонально, внутрикожно, трансдермально, чрезкожно или используя комбинацию этих путей. Пути введения также включают введение путем ингаляции или пульмонального аэрозоля. Способы приготовления аэрозоля широко известны специалистам в даннойобласти (см., например, Sciarra and Cutie, "Aerosols," in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, pp. 16941712; включено путем ссылки).
Пересаживаемые трансплантируемые материалы или терапевтические белки, предоставленные в качестве клеточной терапии изобретения, можно вводить парентерально, внутриартериально, интрана-зально или внутривенно или путем инъекций в лимфатические узлы или переднюю камеру глаза или путем местного введения в интересующий орган или ткань. Введение может осуществляться путем инъекции подкожно, интратекально, интравентрикулярно, внутримышечно, внутрибрюшинно, интракорональ-но, интрапанкреально, внутрипеченочно или бронхиально.
Композиции изобретения можно вводить в эффективных количествах, как, например, в эффективных количествах, описанных в тексте настоящего документа. Дозировки лекарственных форм содержат различные количества множеств синтетических наноносителей и/или различные количества антигенов и/или иммунодепрессантов в соответствии с изобретением. Количество синтетических наноносителей и/или антигенов и/или иммунодепрессантов, присутствующих в изобретательских лекарственных формах, можно варьировать в зависимости от природы антигенов и/или иммунодепрессантов, ожидаемой терапевтической пользы и других подобных параметров. В вариантах осуществления можно проводить определение оптимальной дозы, чтобы установить оптимальное терапевтическое количество популяции синтетических наноносителей и количество антигенов и/или иммунодепрессантов, присутствующих в лекарственной форме. В вариантах осуществления синтетические наноносители и/или антигены и/или иммунодепрессанты присутствуют в лекарственной форме в эффективном количестве для вызова толерантного иммунного ответа на антигены при введении субъекту. Определить количества антигенов и/или иммунодепрессантов, эффективные для вызова толерантного иммунного ответа можно, применяя для субъектов традиционные методы исследования оптимального терапевтического количества. Лекарственные формы изобретения можно вводить с различной частотой. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одного введения лекарственной формы достаточно для выработки фармакологически значимого ответа. В более предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере двух введений, по меньшей мере трех введений или по меньшей мере четырех введений лекарственной формы достаточно для выработки фармакологически значимого ответа.
Профилактическое введение композиции изобретения может быть назначено до начала болезни, расстройства или состояния, а терапевтическое введение может быть назначено после установления болезни, расстройства или состояния.
В некоторых вариантах осуществления введение синтетических наноносителей предпринимают, например, до введения терапевтического белка, или пересаживаемого трансплантируемого материала или, воздействия аллергена. В некоторых примерах осуществления изобретения синтетические наноно-сители вводят один или несколько раз, включая, но не ограничиваясь этим, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 дней до введения терапевтического белка, или пересаживаемого трансплантируемого материала, или воздействия аллергена. Дополнительно или альтернативно синтетические наноносители можно вводить субъекту после введения терапевтического белка, или пересаживаемого трансплантируемого материала, или воздействия аллергена. В некоторых примерах осуществления изобретения синтетические наноносители вводят один или несколько раз, включая, но не ограничиваясь
этим, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 или 0 дней после воздействия введения терапевтического белка, или пересаживаемого трансплантируемого материала, или воздействия аллергена.
В некоторых вариантах осуществления поддерживающую дозу (например, композиции синтетического наноносителя, как предоставлено в настоящем документе) вводят пациенту после того, как первоначальное введение привело к толерантному ответу у субъекта, например, чтобы поддержать вызывающий иммунную толерантность эффект, полученный после начальной дозы, чтобы предотвратить нежелательную иммунную реакцию у субъекта, или чтобы предотвратить возникновение у субъекта риска нежелательного иммунного ответа или нежелательного уровня иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза является начальной дозой, полученной субъектом. В некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза меньше начальной дозы. Например, в некоторых вариантах осуществления поддерживающая доза составляет примерно 3/4, примерно 2/3, примерно 1/2, примерно 1/3, примерно 1/4, примерно 1/8, примерно 1/10, примерно 1/20, примерно 1/25, примерно 1/50, примерно 1/100, примерно 1/1000, примерно 1/10000, примерно 1/100000 или примерно 1/1000000 (вес./вес.) от начальной дозы.
Композиции и способы, предоставленные в настоящем документе, могут применяться для вызова или увеличения толерантного иммунного ответа и/или для депрессии, модулирования, направления или перенаправления нежелательного иммунного ответа в целях достижения иммунодепрессии. Композиции и способы, описываемые в данном документе, можно применять для диагностики, профилактики и/или лечения заболеваний, расстройств или состояний, при которых подавление иммунитета (например, толерантный иммунный ответ) принесет пользу в лечении. Такие заболевания, расстройства или состояния включают воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, аллергии, отторжение органа или тканей или болезнь "трансплантат против хозяина". Композиции и способы, предложенные в настоящем документе, могут применяться в субъектах, которым проделали или будут делать трансплантацию. Композиции и способы, предложенные в настоящем документе, могут применяться в субъектах, которым проводили, проводят или будут проводить лечение терапевтическим белком, который вызывает, или предполагается, что будет вызывать у субъектов нежелательный иммунный ответ.
Аутоиммунные заболевания включают, но не ограничиваются этим, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, иммуноопосредованный диабет или диабет I типа, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или неспецифический язвенный колит), системную красную волчанку, псориаз, склеродерму, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, очаговую алопецию, базедову болезнь, синдром Гийена-Барре, целиакию, синдром Шегрена, ревматическую лихорадку, гастрит, аутоиммунный атрофический гастрит, аутоиммунный гепатит, инсулит, оофорит, орхит, увеит, вызванный глазными линзами, миастению гравис, первичную микседему, злокачественную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь Аддисона, склеродерму, синдром Гудпасчера, нефрит, например, гломе-рулонефрит, псориаз, пузырчатку обыкновенную, пемфигоид, симпатическую офтальмию, идиопатиче-скую тромбоцитопеническую пурпуру, идиопатическую лекопению, грануломатоз Вегенера и по-ли/дерматомиозит. Некоторые иллюстративные аутоиммунные заболевания, связанные с аутоантигена-ми, и антитела, которые предполагаются для применения в данном изобретении, описаны в табл. 1 ниже.
Анти-
ганглиозидные антитела
ганглиозида GQ1B
Синдром Миллера-Фишера
ганглиозида GD3
Острая моторная аксональная нейропатия (ОМАН)
ганглиозида GM1
Мультифокальная моторная невропатия с блоком проводимости (ММН)
Антиактиновые антитела
актин
Антиактиновые антитела при целиакии коррелировали со степенью повреждения кишечника [6] [7]
Антитела печеночно-почечного микросоматическо го типа 1
Аутоиммунный гепатит [8]
Волчаночный антикоагулянт
Антитромб иновые антитела
тромбин
Системная красная волчанка
Антинейтрофильн ые
цитоплазматическ ие антитела
фосфолипид
Антифосфолипидный синдром
c-ANCA
Белки в
нейтрофильной цитоплазме
Грану лематоз Вегенера
p-ANCA
нейтрофил перину клеарный
Микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросса, системный васкулит (неспецифический)
Ревматоидный фактор
IgG
Ревматоидный артрит
Антитела к гладким мышцам
гладкие мышцы
Хронический аутоиммунный гепатит
Антитела к митохондриям
митохондрия
Первиный билиарный цирроз [9]
Анти-SRP
сигнал-
распознающая
частица
Полимиозит [10]
экзосомный комплекс
Склеромиозит
никотиновый
ацетилколиновый
рецептор
Миастения гравис
Мышечно-специфическая
Миастения гравис
киназа (MUSK)
Анти-VGCC
потенциалзависим ый кальцевый канал (P/Q-тип)
Миастенический синдром Ламберта-Итона
тиропероксидаза (микросомальная)
Тереоидит Хашимото
Рецептор тиреотропного гормона (TSH-рецептор)
Болезнь Грейвса
Паранеопластический мозжечковый синдром
Yo (мозжечковые Клетки Пуркинье)
Паранеопластический мозжечковый синдром
амфифизин
Синдром негибкого человека, паранеопластический мозжечковый синдром
Анти-VGKC
Потенциалзависим ый кальцевый канал (VGKC)
Лимбический энцефалит, Синдром Исаакса (аутоиммунная нейромиотомия)
базальные ганглии нейронов
Хорея Сиденгами, детское аутоиммунное
нейропсихиатрическое заболевание, связанное со Streptococcus (PANDAS)
N-Memn-D-аспартатный рецептор (NMDA)
Энцефалит
декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD)
Сахарный диабет 1 типа, синдром негибкого человека
аквапорин-4
Нейромиелит зрительного нерва (синдром Девика)
Воспалительные заболевания включают, но не ограничиваются ими, болезнь Альцгеймера, анкило-зирующий спондилоартрит, артрит, бронхиальную астму, атеросклероз, болезнь Бехчета, хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию, болезнь Крона, колит, муковисцидоз, дерматит, дивертикулит, гепатит, синдром раздраженного кишечника (СРК), красную волчанку, мышечную дистрофию, нефрит, болезнь Паркинсона, опоясывающий лишай и неспецифический язвенный колит. Воспалительные заболевания также включают, например, сердечно-сосудистые заболевания, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), бронхоэктаз, хронический холецистит, туберкулез, тиреоидит Хашимото, сепсис, саркоидоз, силикоз и другие пневмокониозы, и имплантированное инородное тело в ране, но без ограничения. Как использовано в данном контексте, термин "сепсис" относится к хорошо известному клиническому синдрому, связанному с системной воспалительной реакции на микробное вторжение у хозяина. Термин "сепсис", как он используется в данном документе, относится к состоянию, которое обычно характеризуется жаром или гипотермией и учащенным дыханием, а в тяжелых случаях может привести гипотензии, дисфункции органов и даже к смерти.
В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание представляет собой не аутоиммунное заболевание кишечника, послеоперационные спайки, коронарную артериальную болезнь, фиброз печени, острый респираторный дистресс-синдром, острый воспалительный панкреатит, панкреатит, вызванный эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографией, ожоги, атерогенез коронарных, мозговых и периферических артерий, аппендицит, холецистит, дивертикулит, висцеральные фиброзные заболевания, заживление ран, нарушения рубцевания кожи (келоидные рубцы, гидраденит, гнойные на
рушения), грануломатозные расстройства (саркоидоз, первичный билиарный цирроз), бронхиальная астма, гангренозная пиодермия, синдром Свита, болезнь Бехчета, первичный склерозирующий холангит или абсцесс. В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание является воспалительным заболеванием кишечника (например, болезнь Крона или неспецифический язвенный колит).
В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. Аутоиммунное заболевание в некоторых вариантах осуществления представляет собой ревматоидный артрит, ревматическую лихорадку, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника, инсулин-зависимый сахарный диабет, сахарный диабет, юношеский диабет, спонтанный аутоиммунный диабет, гастрит, аутоиммунный атрофиче-ский гастрит, аутоиммунный гепатит, тереоидит, тереоидит Хашимото, инсулит, оофорит, орхит, увеит, увеит, вызванный глазными линзами, рассеянный склероз, миастению гравис, первичную микседему, тиреотоксикоз, злокачественную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилоартрит, саркоидоз, склеродерму, синдром Гудпасчера, синдром Гийена-Барре, болезнь Грейвса, гломерулонефрит, псориаз, пузырчатку обыкновенную, пемфигоид, экземы, буллезную пузырчатку, симпатическую офтальмию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, идиопатиче-скую лекопению, синдром Шегрена, системный склероз, грануломатоз Вегенера, поли/дерматомиозит, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, волчанку или системную красную волчанку.
Болезнь "трансплантат против хозяина" (БТПХ) является осложнением, которое может наступить после пересадки плюрипотентных клеток (например, стволовых клеток) или костного мозга, при которой трансплантируемый материал приводит к атаке на тело человека, которому была сделана пересадка. В некоторых случаях БТПХ может произойти после переливания крови. Болезнь "трансплантат против хозяина" можно подразделить на острую и хроническую формы. Острая или бурно протекающая форма заболевания (оБТПХ) обычно наблюдается в течение первых 100 дней после пересадки, и является серьезной проблемой для трансплантации вследствие связанных с ней заболеваемостью и смертностью. Хроническая форма болезни "трансплантат против хозяина" (хБТПХ) обычно наблюдается после 100 дней. Появление от умеренных до тяжелых случаев cGVHD отрицательно влияет на продолжительность жизни.
Примеры
Пример 1. Иммунный ответ на синтетические наноносители со связанным рапамицином с пептидом овальбумина или без него (323-339). Материалы.
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т- и В-клеток, куплен у Bachem Americas Inc (3132 Kashiwa Street, Torrance C.A. 90505; Part # 4065609). Рапамицин был куплен у TSZ СНЕМ (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Product Catalogue # R1017). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта
1.41350.1001).
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. Рампамицин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения рапамицина в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8.
Способ получения минтетического наноносителя, содержащего рапамицин и овальбумин (323-339).
Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. W1/O1 была получена объединением раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,2 мл) и раствора 3 (1,0 мл) в в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем формировали вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 4 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ pH 8 раствора фосфатного буфера (30 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 21000xg и 4°С в течение 1 ч, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатном буферном растворе солей. Процедуру отмывки повторяли, а осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе солей, чтобы получить окончательную дисперсию синтетического наноносителя приблизительно 10 мг/мл.
Количества пептида и рапамицина в синтетических наноносителях определяли методом ВЭЖХ-анализа. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом.
Способ получения синтетического наноносителя, содержащего рапамицин.
Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. W1/O1 была получена объединением 0,13 М раствора соляной кислоты (0,2 мл), раствора 2 (0,2 мл) и раствора 3 (1,0 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем формировали вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 4 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ pH 8 раствора фосфатного буфера (30 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 21000x g и 4°С в течение 1 ч, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатном буферном растворе солей. Процедуру отмывки повторяли, а осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе солей, чтобы получить окончательную дисперсию синтетического наноносителя приблизительно 10 мг/мл.
Количество рапамицина в синтетическом наноносителе было определено при помощи ВЭЖХ-анализа. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом.
Способ измерения внесенного количества рапамицина.
Отобрали приблизительно 3 мг синтетических наноносителей и центрифугировали их, чтобы отделить надосадочную жидкость от осадка синтетических наноносителей. В осадок добавили ацетонитрил и обработали образец ультразвуком, чтобы удалить все нерастворимое вещество. Надосадочную жидкость и осадок инжектировали в ОФ-ВЭЖХ, и уровень абсорбции составил 278 нм. Микрограммы (мкг), обнаруженные в осадке, использовали для подсчета % захвата (внесенного количества), мкг в надосадочной жидкости и осадке использовали для подсчета общего количества выделенных мкг.
Способ измерения внесенного количества овальбумина (323-339).
Отобрали приблизительно 3 мг синтетических наноносителей и центрифугировали их, чтобы отделить надосадочную жидкость от осадка синтетических наноносителей. В осадок добавляли трифторэта-нол и обрабатывали образец ультразвуком, чтобы растворить полимер, добавляли 0,2% трифторацетат-ную кислоту и центрифугировали образец, чтобы удалить все нерастворимое вещество. Надосадочную жидкость и осадок инжектировали в ОФ-ВЭЖХ, и уровень абсорбции составил 215 нм. Количество мкг осадка использовали для подсчета % захвата (внесенного количества), количество мкг надосадочной жидкости использовали для подсчета общего количества мкг.
Влияние вызывающих иммунную толерантность антиген-специфических дендритных клеток (Tdc) на развитие Т-регуляторных клеток.
Исследование включало использование мышей линии OTII, у которых есть рецептор трансгенных Т-клеток, специфичный к иммунодоминантному овальбумину (323-339). В целях получения антиген-специфических tDC, изолировали CD11c+ спленоциты и вносили пептид овальбумина (323-339) in vitro в количестве 1 мкг/мл или не вносили антиген. Затем растворимый или инкапсулированный в наноноси-тель рапамицин добавляли к DCs на 2 ч, а затем интенсивно отмывали их, чтобы удалить из культуры свободный рапамицин. Очищенный респондер - CD4+ CD25- клетки изолировали от мышей OTII и вводили в tDC в соотношении Т к DC 10:1. Смесь tDC и OTII Т-клеток затем культивировали в течение 4-5 дней, а затем анализировали встречаемость Т-регуляторных клеток (CD4+CD25highFoxP3+) методом проточной цитометрии, как показано на фиг. 1. Области были выбраны на основе изотопического контроля.
Пример 2. Наночастицы мезпористого диоксида кремния со связанным ибупрофеном (пример возможного использования).
Сердцевины наночастиц мезопористого SiO2 получают при помощи золь-гель процесса. Гексаде-цилтриметил-аммоний бромид (СТАВ) (0,5 г) растворяют в деионизированной воде (500 мл), а затем добавляют 2 М водный раствор NaOH (3,5 мл) к раствору СТАВ. Раствор перемешивают в течение 30 мин, а затем в раствор добавляют тетраэтоксисилан (TEOS) (2,5 мл). Полученный гель перемешивают в течение 3 ч при температуре 80°С. Образованный белый преципитат отделяют фильтрованием, а затем отмывают деионизированной водой и высушивают при комнатной температуре. Оставшееся ПАВ затем экстрагируют из частиц, суспендируя их в этаноловом растворе HCl в течение ночи. Частицы отмывают этанолом, центрифугируют и редисперсируют под действием ультразвука. Такую процедуру отмывки повторяют еще два раза.
Наночастицы SiO2 затем подвергают функционализации аминогруппами с применением (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTMS). Для этого частицы суспендируют в этаноле (30 мл) и добавляют в суспензию APTMS (50 мкл). Суспензию оставляют при комнатной температуре на 2 ч, а затем кипятят в течение 4 ч, поддерживая постоянный объем, периодически добавляя этанол. Оставшиеся реагенты
удаляют, проводя пять циклов отмывки центрифугированием и повторной дисперсией в чистом этаноле.
В отдельной реакции образуются зерна золота диаметром 1-4 нм. Воду, используемую в реакциях, сначала деионизируют, а затем дистиллируют в стеклянном аппарате. Воду (45,5 мл) наливают в 100 мл круглодонную колбу. Перемешивая, добавляют 0,2 М водный NaOH (1,5 мл), затем 1% водный раствор татракис (гидроксиметил)фосфонит хлорида (ТНРС) (1,0 мл). Через 2 мин после введения раствора ТНРС добавляют 10 мг/мл водного раствора золотохлористо-водородной кислоты (2 мл), выдержанного по меньшей мере 15 мин. Зерна золота очищают водным диализом.
Для получения сердцевинно-оболочных наноносителей аминофункционализированные наночасти-цы SiO2, полученные ранее, смешивают с зернами золота в течение 2 ч при комнатной температуре. Частицы SiO2, связанные с золотом, отбирают центрифугированием и смешивают с водным раствором золо-тохлористоводной кислоты и бикарбонатом калия для получения оболочки из золота. Затем частицы отмывают центрифугированием и редисперсией в воде. Ибупрофен присоединяют, суспендируя частицы в растворе ибупрофена натрия (1 мг/л) в течение 72 ч. Затем свободный ибупрофен отмывают от частиц центрифугированием и редисперсией в воде.
Пример 3. Липосомы, содержащие циклоспорин А (пример возможного использования).
Липосомы получают путем гидратации тонкой пленки. 1,2-Дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) (32 мкмоль), холестерин (32 мкмоль) и циклоспорин А (6,4 мкмоль) растворяют в чистом хлороформе (3 мл). Полученный липидный раствор наливают в 50 мл круглодонную колбу и испаряют растворитель на вращающемся испарителе при температуре 60°С. Затем обрабатывают газообразным азотом, чтобы удалить остатки растворителя. Солевой раствор фосфатного буфера (2 мл) и пять полосок стекла добавляют в колбу и гидратируют липидную пленку, встряхивая колбу при 60°С в течение 1 ч до образования суспензии. Суспензию переносят в маленькую напорную трубку и обрабатывают ультразвуком при 60°С в течение четырех циклов из 30 с импульсов с 30 с паузой между импульсами. Затем суспензию оставляют стоять в покое при комнатной температуре в на 2 ч для полной гидратации. Липосомы отмывают центрифугированием с последующим повторным суспендированием в свежем фосфатно-солевом буферном растворе.
Пример 4. Полимерный наноноситель, содержащий конъюгат полимера и рапамицина (пример возможного использования).
Получение PLGA-рапамицин конъюгата.
PLGA полимер с кислой концевой группой (7525 DLG^, кислотное число 0,46 ммоль/г, Lakeshore Biomaterials; 5 г, 2,3 ммоль, 1,0 экв.) растворяют в 30 мл дихлорметана (DCM). N,N-Дициклогексилкарбомид (1,2 экв., 2,8 ммоль, 0,57 г) добавляют к рапамицину (1,0 экв., 2,3 ммоль, 2,1 г) и 4-диметиламинопиридину (DMAP) (2,0 экв., 4,6 ммоль, 0,56 г). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 дней. Затем смесь фильтруют, чтобы отделить нерастворимую дициклогексил-мочевину. Фильтрат концентрируют до объема приблизительно 10 мл и добавляют к 100 мл изопропило-вого спирта (IPA), чтобы осадить PLGA-рапамицин конъюгат. Слой IPA удаляют, а полимер затем отмывают 50 мл IPA и 50 мл метил-Т-бутилового эфира (МТВЕ). Полимер затем высушивают в вакууме при 35С в течение 2 дней, чтобы получить белый твердый PLGA-рапамицин (приблизительно 6,5 г).
Получение наноносителя, содержащего PLGA-рапамицин конъюгат и пептид овальбумина (323339).
Наноноситель, содержащий PLGA-рапамицин, получают способом, описанным в примере 1. Растворы для получения наноносителей готовят следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор получают, растворяя пептид овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре. Раствор 2. PLGA-рампамицин из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор получают, растворяя PLGA-рапамицин в чистом метиленхлориде. Раствор 3. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор получают, растворяя PLA-PEG в чистом метиленхлориде. Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8.
Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. W1/O1 приготовлен комбинированием раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,75 мл) и раствора 3 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем готовят вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 4 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250. Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ pH 8 раствора фосфатного буфера (30 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и образовались наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 75600xg и 4°С в течение 35 мин, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатно-солевом буферном растворе. Процедуру отмывки повторяли, а осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе, чтобы получить окончательную дисперсию синтетического нано-носителя приблизительно 10 мг/мл.
Пример 5. Получение наноносителей с золотом (AuNC), содержащих рапамицин (пример возмож
ного использования).
Получение HS-PEG-рапамицина.
Раствор PEG кислого дисульфида (1,0 экв.), рапамицин (2,0-2,5 экв.), DCC (2,5 экв.) и DMAP (3,0 экв.) в сухом DMF перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Нерастворимую дицикло-гексилмочевину удаляют фильтрованием, а фильтрат добавляют к изопропиловому спирту (IPA), чтобы осадить PEG-дисульфиддирапамицин эстер, отмывают IPA и высушивают. Полимер затем обрабатывают трис-(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлоридом в DMF, чтобы восстановить PEG дисульфид до тиолового эфира PEG рапамицина (HS-PEG-рапамицин). Полученный полимер отделяют путем преципитации из IPA и высушивают, как описано выше, а затем анализируют Н HMR и GPC.
Получение золотых NC (AuNC).
Водн. раствор 500 мл 1 ммоль HAuCl4 нагревают с обратным холодильником в течение 10 мин с энергичным перемешиванием в круглодонной колбе объемом 1л, оборудованной конденсатором. Раствор из 50 мл 40 мМ тринатрий цитрата затем быстро добавляют в перемешиваемый раствор. Полученный густо-винный раствор выдерживают с обратным холодильником в течение 25-30 мин, отключают подогрев и охлаждают раствор до комнатной температуры. Затем раствор фильтруют через 0,8 мкм мембранный фильтр и получают раствор AuNC. AuNC характеризуют при помощи спектроскопии в видимой области и трансмиссионной электронной микроскопии. Эти AuNC имеют диаметр, приблизительно равный 20 нм, и окружены цитратом с пиком поглощения 520 нм.
Конъюгация AuNC с HS-PEG-рапамицином.
Раствор 150 мкл HS-PEG-рапамицина (10 мкмоль в 10 ммоль pH 9,0 карбонатного буфера) добавляют к 1 мл покрытых цитратом золотых наноносителей 20 нм в диаметре (1,16 нмоль), с получением молярного соотношения тиола к золоту 2500:1. Смесь перемешивают при комнатной температуре под аргоном в течение 1 ч, с полным обменом тиола с цитратом на золотых наноносителях. AuNC с PEG-рапамицином на поверхности затем очищают центрифугированием при 12000g в течение 30 мин. Надо-садочнуюжидкость декантируют, а осадок, содержащий AuNC-S-PEG-рапамицин, затем отмывают 1x PBS буфером. Очищенные наноносители, содержащие золото и PEG-рапамицин, затем ресуспендируют в подходящем буфере для анализа и биопроб.
Пример 6. Сердцевинно-оболочные наноносители с золотистым мезопористым диоксидом кремния, содержащие овальбумин (пример возможного использования).
Сердцевины наночастиц мезопористого SiO2 получают при помощи золь-гель процесса. Гексаде-цилтриметил-аммоний бромид (СТАВ) (0,5 г) растворяют в деионизированной воде (500 мл), а затем добавляют 2 М водный раствор NaOH (3,5 мл) к раствору СТАВ. Раствор перемешивают в течение 30 мин, а затем в раствор добавляют тетраэтоксисилан (TEOS) (2,5 мл). Полученный гель перемешивают в течение 3 ч при температуре 80°С. Образованный белый преципитат отделяют фильтрованием, а затем отмывают деионизированной водой и высушивают при комнатной температуре. Оставшееся ПАВ затем экстрагируют из частиц, суспендируя их в этаноловом растворе HCl в течение ночи. Частицы отмывают этанолом, центрифугируют и редисперсируют под действием ультразвука. Такую процедуру отмывки повторяют еще два раза.
Наночастицы SiO2 затем подвергают функционализации аминогруппами с применением (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTMS). Для этого частицы суспендируют в этаноле (30 мл) и добавляют в суспензию APTMS (50 мкл). Суспензию оставляют при комнатной температуре на 2 ч, а затем кипятят в течение 4 ч, поддерживая постоянный объем, периодически добавляя этанол. Оставшиеся реагенты удаляют, проводя пять циклов отмывки центрифугированием и повторной дисперсией в чистом этаноле.
В отдельной реакции образуются зерна золота диаметром 1-4 нм. Воду, используемую в реакциях, сначала деионизируют, а затем дистиллируют в стеклянном аппарате. Воду (45,5 мл) наливают в 100 мл круглодонную колбу. Перемешивая, добавляют 0,2 М водный NaOH (1,5 мл), затем 1% водный раствор татракис (гидроксиметил)фосфонит хлорида (ТНРС) (1,0 мл). Через 2 мин после введения раствора ТНРС добавляют 10 мг/мл водного раствора золотохлористо-водородной кислоты (2 мл), выдержанного по меньшей мере 15 мин. Зерна золота очищают водным диализом.
Для получения сердцевинно-оболочных наноносителей аминофункционализированные наночасти-цы SiO2, полученные ранее, смешивают с зернами золота в течение 2 ч при комнатной температуре. Частицы SiO2, связанные с золотом, отбирают центрифугированием и смешивают с водным раствором золо-тохлористоводной кислоты и бикарбонатом калия для получения оболочки из золота. Затем частицы отмывают центрифугированием и редисперсией в воде. Тиолированный овальбумин (полученный при обработке овальбумина 2-иминотиолан гидрохлоридом) отделяют, суспендируя частицы в растворе тиоли-рованного овальбумина (1 мг/л) в течение 72 ч. Частицы затем отмывают из осадка 1 x PBS (pH 7,4), чтобы удалить чистый белок. Полученные кремний-золотые сердцевинно-оболочные наноносители, содержащие овальбумин, затем ресуспендируют в 1 x PBS для анализа и биопроб.
Пример 7. Липосомы, содержащие рапамицин и овальбумин (пример возможного использования).
Липосомы получают путем гидратации тонкой пленки. 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) (32 мкмоль), холестерин (32 мкмоль) и рапамицин (6,4 мкмоль) растворяют в чистом хлороформе
(3 мл). Этот липидный раствор добавляли в 10-мл стеклянную пробирку и растворитель удаляли в потоке газообразного азота и обезвоживали в течение 6 ч в вакууме. Многослойные везикулы получают путем гидратации пленки 2,0 мл 25 мМ MOPS буфера pH 8,5, содержащего избыток овальбумина. Пробирку вращают на вортексе, пока липидная пленка не отслоится с поверхности пробирки. Чтобы превратить многослойные везикулы в однослойные, проделывают десять циклов замораживания (жидким азотом) и размораживания (30°С водная баня). Затем образец растворяют в 1 мл 25 мМ MOPS буфера pH 8,5. Размер полученной липосомы гомогенизируют, применяя десятикратную экструзию образца через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 200 нм. Полученные липосомы затем используют для анализа и биопроб.
Пример 8. Полимерные наноносители, состоящие из модифицированной полиаминокислоты с поверхностно конъюгированным овальбумином (пример возможного использования).
Стадия 1. Получение поли(у-глутаминовой кислоты) (y-PGA), модифицированной этиловым сложным эфиром L-фенилаланина (L-PAE): 4,7 единицы ммоль y-PGA (Mn= 300 кДа) растворяют в 0,3н. водном растворе NaHCO3 (50 мл). L-РАЕ (4,7 ммоль) и EDC-HCl (4,7 ммоль) добавляют в раствор и перемешивают в течение 30 мин при 4С. Затем раствор выдерживают при комнатной температуре, перемешивая, в течение 24 ч. Низкомолекулярные вещества удаляют диализной мембраной с MWCO 50 кДа. Полученный y-PGA-графт-L-РАЕ получают замораживанием-высушиванием.
Стадия 2. Получение наночастиц из y-PGA-графт-L-РАЕ полимера: наночастицы, состоящие из y-PGA-графт-L-РАЕ, получают методами преципитации и диализа. y-PGA-графт-L-РАЕ (20 мг) растворили в 2 мл DMSO, а затем добавили 2 мл воды для получения полупозрачного раствора. Раствор затем диали-зировали с дистиллированной водой через трубку с целлюлозной мембраной (50000 MWCO) для получения наночастиц и удаления органических растворителей в течение 72 ч при комнатной температуре. Дистиллированную воду меняли каждые 12 ч. Полученный раствор наночастиц (10 мг/мл в воде) затем используют для конъюгации антигена.
Стадия 3. Конъюгация овальбумина с y-PGA наночастицами: поверхностные группы карбоксильной кислоты y-PGA наночастиц (10 мг/мл) сначала активируются EDC и NHS (10 мг/мл каждого в фосфатном буфере, pH 5,8) в течение 2 ч при температуре окружающего воздуха. После отмывки осадка для удаления лишних EDC/NHS, активированные наночастицы смешивают с 1 мл овальбумина (10 мг/мл) в солевом растворе фосфатного буфера (PBS, pH 7,4), и смесь выдерживают при 4-8С в течение 24 ч. Полученный y-PGA наночастицы, конъюгированные с овальбумином, дважды отмывают PBS и ресуспендируют в 5 мг/мл PBS для анализа и биопроб.
Пример 9. Эритроэпоэтин (ЕРО-инкапсулирующие y-PGA наночастицы (пример возможного использования).
Чтобы получить ЕРО-инкапсулирующие y-PGA наночастицы, 0,25-4 мг ЕРО растворяют в 1 мл PBS (pH 7,4) и 1 мл y-PGA-графт-L-РАЕ (10 мг/мл в DMSO) добавляют к раствору ЕРО. Полученный раствор центрифугируют при 14000xg в течение 15 мин и повторно промывают PBS. Полученные ЕРО-инкапсулирующие у-PGA наночастицы затем ресуспендируют в PBS (5 мг/мл) для анализа и биопроб.
Пример 10. Получение золотых наноносителей (AuNC), содержащих овальбумин (пример возможного использования).
Стадия 1. Получение золотых NC (AuNC) водн. раствор 500 мл 1ммоль HAuCl4 нагревают с обратным холодильником в течение 10 мин с энергичным перемешиванием в круглодонной колбе объемом 1 л, оборудованной конденсатором. Раствор из 50 мл 40 мМ тринатрий цитрата затем быстро добавляют в перемешиваемый раствор. Полученный густо-винный раствор выдерживают с обратным холодильником в течение 25-30 мин, отключают подогрев и охлаждают раствор до комнатной температуры. Затем раствор фильтруют через 0,8 мкм мембранный фильтр и получают раствор AuNC. AuNC характеризуют при помощи спектроскопии в видимой области и трансмиссионной электронной микроскопии. Эти AuNC имеют диаметр, приблизительно равный 20 нм, и окружены цитратом с пиком поглощения 520 нм.
Стадия 2. Конъюгация овальбумина с AuNC: раствор 150 мкл тиолированного овальбумина (10 мкмоль в 10 ммоль pH 9,0 карбонатного буфера) добавляют к 1 мл покрытых цитратом золотых наноно-сителей 20 нм в диаметре (1,16 нмоль), с получением молярного соотношения тиола к золоту 2500:1. Смесь перемешивают при комнатной температуре под аргоном в течение 1 ч, с полным обменом тиола с цитратом на золотых наноносителях. AuNC с овальбумином на поверхности затем очищают центрифугированием при 12000 g в течение 30 мин.
Надосадочную жидкость декантируют, а осадок, содержащий AuNC-овальбумин, затем отмывают 1 x PBS буфером. Очищенные золотые наноносители, содержащие овальбумин, затем ресуспендируют в подходящем буфере для анализа и биопроб.
Пример 11. Оценка толерантного иммунного ответа путем фенотипического анализа Т-клеток (пример возможного применения).
Композицию данного изобретения растворяют в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) и вводят путем внутримышечной инъекции самкам крыс Lewis в 0,1-0,2 мл, содержащих 500 мкл данной композиции. Контрольная группа крыс получает 0,1-0,2 мл PBS. Через 9-10-дневный период собирают селезенку и лимфатические узлы крыс и суспензии отдельных клеток, получаемых размалыванием тканей через 40 мкм nyclon клеточный фильтр. Образцы окрашивают в PBS (1% FCS), применяя подходящее разведение соответствующих моноклональных антител. Окрашивающие йодидом пропидия клетки исключают из анализа. Образцы получают на проточном цитометре LSR2 (BD Biosciences, США) и анализируют, используя программное обеспечение FACS Diva. Экспрессию маркеров CD4, CD8 и др. анализируют на клетках. Уменьшение присутствия CD4+ Т-клеток и/или CD8+ Т-клеток, например, предполагает вызов желаемого иммунного ответа.
Пример 12. Оценка толерантного иммунного ответа на аутоантиген in vivo (пример возможного использования).
Мышам линии Balb/c вводят аутоантиген, содержащий эпитопы, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, и оценивают уровень увеличения числа CD8+ Т-клеток и/или CD4+ Т-клеток соответственно. В дальнейшем композицию изобретения, содержащую аутоантиген или его часть, содержащие эпитопы, и им-мунодепрессант, дозозависимым образом вводили подкожно. Снова оценивают уровень увеличения числа CD8+ Т-клеток и/или CD4+ Т-клеток, соответственно, причем уменьшение увеличения числа означает толерантный иммунный ответ.
Пример 13. In vivo уменьшение нежелательного иммунного ответа против пересаживаемых клеток костного мозга (пример возможного использования).
Множество по меньшей мере 106 синтетических наноносителей, содержащих иммунодепрессант и антигены, полученные из или произведенные на основе клеток костного мозга вводят подкожно субъекту за четыре недели до проведения субъекту пересадки костного мозга. После получения трансплантата субъектом возникновение нежелательного иммунного ответа у субъекта оценивают один раз в день в течение первой недели после получения трансплантата, а затем раз в неделю с течение следующих трех недель, а затем раз в месяц в течение следующих 11 месяцев. В качестве части процедуры оценки измеряют количество CD8+ Т-клеток и/или CD4+ Т-клеток В качестве части процедуры оценки измеряют количество CD8+ Т-клеток и/или CD4+ Т-клеток и сравнивают с количеством CD8+ Т-клеток и/или CD4+ Т-клеток до введения транспланта костного мозга или синтетических наноносителей у субъекта, до введения трансплантата костного мозга или синтетических наноносителей субъекту. В течение первого года субъекту раз в два месяца вводят поддерживающую дозу синтетических наноносителей. Ожидается, что у субъекта не будет обнаружено или будет минимальный уровень содержания CD8+ Т-клеток и/или CD4+ Т-клеток, специфических к трансплантату костного мозга.
Пример 14. In vitro оценка снижения количества Т-эффекторных клеток (пример предполагаемого использования).
Клеточную популяцию, содержащую Т-эффекторные клетки или предшественники Т-эффекторных клеток приводят в контакт in vitro с предложенной здесь композицией. После периода времени, достаточного для взаимодействия композиции с Т-эффекторными клетками или предшественниками Т-эффекторных клеток в клеточной популяции, ожидают уменьшения числа Т-эффекторных клеток. Период времени, достаточный для снижения числа Т-эффекторных клеток в популяции, составляет в некоторых вариантах осуществления период, равный примерно 1 день, примерно 2 дня, примерно 3 дня, примерно 4 дня, примерно 5 дней, примерно 6 дней, примерно 1 неделю, примерно 2 недели, примерно 3 недели, примерно 4 недели. В некоторых вариантах осуществления число Т-эффекторных клеток снижается после этого периода времени, например, до менее чем примерно 50%, до менее чем примерно 60%, до менее чем примерно 70%, до менее чем примерно 80%, до менее чем примерно 90%, до менее чем примерно 95%, до менее чем примерно 98%, до менее чем примерно 99% изначального общего или относительного числа Т-эффекторных клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления Т-эффекторные клетки полностью отсутствуют в клеточной популяции после этого периода времени. В некоторых вариантах осуществления общее и/или относительное число Т-эффекторных клеток в популяции определяют до приведения клеточной популяции в контакт с композицией, предложенной в данном документе, чтобы установить исходное число Т-эффекторных клеток в популяции. В некоторых вариантах осуществления клеточную популяцию приводят в контакт с композицией, предложенной в данном документе, однократно. В некоторых вариантах осуществления клеточную популяцию приводят в контакт с композицией, предложенной в данном документе, несколько раз.
Число и/или наличие Т-эффекторных клеток в популяции клеток также определяют после осуществления контакта. В некоторых вариантах осуществления число и/или наличие Т-эффекторных клеток наблюдают в течение периода времени, например, путем выполнения нескольких последовательных количественных определений Т-эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления число и/или наличие Т-эффекторных клеток в популяции клеток определяют путем взятия пробы клеточной популя
ции, которая является характерной для данной клеточной популяции, окрашивания содержащихся в пробе клеток с помощью антител или окрашивающих агентов, которые специфически распознают маркеры Т-эффекторных клеток, и определения клеток, которые экспрессируют маркеры Т-эффекторных клеток в пробе, например, используя FACS или иммуногистохимический анализ. В некоторых вариантах осуществления Т-эффекторные клетки определяют количественно. В некоторых вариантах осуществления число Т-эффекторных клеток, определенные количественно после осуществления контакта, сравнивают с числом Т-эффекторных клеток до осуществления контакта, напрмер, с исходным числом Т-эффекторных клеток, причем, если число Т-эффекторных клеток в популяции клеток меньше после осуществления контакта, чем исходное число, то таким образом заключают, что наблюдается толерантный ответ к композиции.
Пример 15. In vivo оценка снижения количества Т-эффекторных клеток (пример предполагаемого использования).
Клеточную популяцию, содержащую Т-эффекторные клетки или предшественники Т-эффекторных клеток приводят в контакт in vivo с предложенной здесь композицией. В некоторых вариантах осуществления композицию или клеточную популяцию вводят субъекту, имеющему клеточную популяцию, содержащую Т-эффекторные клетки или предшественники Т-эффекторных клеток. После периода времени, достаточного для взаимодействия композиции с Т-эффекторными клетками или предшественниками Т-эффекторных клеток в субъекте, ожидают уменьшения числа Т-эффекторных клеток. Период времени, достаточный для снижения числа Т-эффекторных клеток в популяции, составляет в некоторых вариантах осуществления период, равный примерно 1 день, примерно 2 дня, примерно 3 дня, примерно 4 дня, примерно 5 дней, примерно 6 дней, примерно 1 неделю, примерно 2 недели, примерно 3 недели, примерно 4 недели. В некоторых вариантах осуществления период времени, достаточный для снижения числа Т-эффекторных клеток, составляет более чем 4 недели. В некоторых вариантах осуществления число Т-эффекторных клеток снижается после этого периода времени, например, до менее чем примерно 50%, до менее чем примерно 60%, до менее чем примерно 70%, до менее чем примерно 80%, до менее чем примерно 90%, до менее чем примерно 95%, до менее чем примерно 98%, до менее чем примерно 99% изначального общего или относительного числа Т-эффекторных клеток у субъекта. В некоторых вариантах осуществления Т-эффекторные клетки или специфическая популяция Т-эффекторных клеток (например, Т-эффекторные клетки, направленные на определенный антиген) полностью отсутствуют у субъекта после этого периода времени. В некоторых вариантах осуществления общее и/или относительное число Т-эффекторных клеток у субъекта определяют до введения субъекту композиции, предложенной в данном документе, чтобы установить исходное число Т-эффекторных клеток у субъекта. В некоторых вариантах осуществления композицию, предложенную в данном документе, вводят субъекту однократно. В некоторых вариантах осуществления композицию, предложенную в данном документе, вводят субъекту многократно, например, пока не будет достигнуто желаемое снижение Т-эффекторных клеток, наблюдаемых у субъекта.
Число и/или наличие Т-эффекторных клеток у субъекта определяют после введения. В некоторых вариантах осуществления число и/или наличие Т-эффекторных клеток наблюдают в течение периода времени, например, путем выполнения нескольких последовательных количественных определений Т-эффекторных клеток. В некоторых вариантах осуществления число и/или наличие Т-эффекторных клеток у субъекта определяют путем взятия пробы у субъекта, например, пробы периферической крови или пробы лимфы, которая является характерной для Т-клеточной популяции у субъекта, окрашивания содержащихся в пробе клеток с помощью антител или окрашивающих агентов, которые специфически распознают маркеры Т-эффекторных клеток, и определения клеток, которые экспрессируют маркеры Т-эффекторных клеток в пробе, например, используя FACS или иммуногистохимический анализ. В некоторых вариантах осуществления Т-эффекторные клетки определяют количественно. В некоторых вариантах осуществления число Т-эффекторных клеток, определенные количественно после введения, сравнивают с числом Т-эффекторных клеток до введения, напрмер, с исходным числом Т-эффекторных клеток, причем, если число Т-эффекторных клеток у субъекта меньше после осуществления контакта, чем исходное число, то таким образом заключают, что наблюдается толерантный ответ к композиции.
Пример 16. Измерение толерантных иммунных ответов на синтетические наноносители, содержащие иммунодепрессант и презентирующий антиген АРС in vivo.
Материалы и способы получения синтетического наноносителя.
Наноноситель 1.
Рапамицин был куплен у TSZ СНЕМ (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Product Catalogue # R1017). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Рампамицин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем раство
рения рапамицина в чистом метиленхлориде.
Раствор 2. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8.
Для получения наноносителей использовали эмульсию масло в воде. Эмульсия O/W была получена смешиванием раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,75 мл), раствора 3 (0,25 мл) и раствора 4 (3 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 60 с при амплитуде 30% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Эмульсию O/W добавили в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с pH 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы ме-тиленхлорид испарился, и образовались наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 21000x g и 4°С в течение 45 мин, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторили и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере для окончательной дисперсии наноносителей около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли методом динамического рассеяния света. Количество рапамицина в синтетическом наноносителе было определено при помощи ВЭЖХ-анализа. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 2).
Таблица 2
Идентификация наноносителя
Эффективный диаметр (нм)
Содержание рапамицина (% вес/вес)
Наноноситель 1
215
9,5
Наноноситель 2.
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т- и В-клеток, куплен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8.
Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. W1/O1 была получена объединением раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,75 мл) и раствора 3 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем формировали вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 4 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с pH 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 75600x g и 4°С в течение 35 мин, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторили и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере для окончательной дисперсии наноносителей около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли методом динамического рассеяния света. Количество пептида в наноносителе было определено при помощи ВЭЖХ-анализа. Общую массу сухого синтетического нано-носителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 3).
Наноноситель 3.
Симвастатин был куплен у LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; Product Catalogue # S3449). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Симвастатин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения симвастатина в чистом метиленхлориде.
Раствор 2. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8.
Для получения наноносителей использовали эмульсию масло в воде. Эмульсия O/W была получена смешиванием раствора 1 (0,15 мл), раствора 2 (0,75 мл), раствора 3 (0,25 мл) и раствора 4 (3 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 60 с при амплитуде 30% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Эмульсию O/W добавили в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с pH 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы ме-тиленхлорид испарился, и образовались наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 75600x g и 4°С в течение 35 мин, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторили и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере для окончательной дисперсии наноносителей около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли методом динамического рассеяния света. Количество симвастати-на в наноносителе было определено при помощи ВЭЖХ-анализа. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 4).
Таблица 4
Идентификация наноносителя
Эффективный диаметр (нм)
Количество симвастатина (% вес/вес)
Наноноситель 3
196
8,0
Наноноситель 4.
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т- и В-клеток, куплен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). Рапамицин был куплен у TSZ СНЕМ (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Product Catalogue # R1017). PLGA с соотношением лакид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. Рампамицин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения рапамицина в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 5. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8.
Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. Эмульсия O/W была получена смешиванием раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,2 мл), раствора 3 (0,75 мл) и раствора 4 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем формировали вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 5 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с pH 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 21000х g и 4°С в течение 45 мин, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторили и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере для окончательной дисперсии наноносителей около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли методом динамического рассеяния света. Количества пептида и рапамицина в наноносителе определяли ВЭЖХ-анализом. Общую массу сухого синтетического наноно-сителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 5).
Таблица 5
Идентификация наноносителя
Эффективный диаметр (нм)
Содержание рапамицина (% вес/вес)
Содержание пептида (% вес/вес)
227
9,0
2,5
Наноноситель 5.
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т- и В-клеток, куплен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). Симвастатин был куплен у LKT Laboratories, Inc. (2233 University Avenue West, St. Paul, MN 55114; Product Catalogue # S3449). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001). Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. Симвастатин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения симвастатина в чистом метиленхлориде.
Раствор 3. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде.
Раствор 4. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде.
Раствор 5. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8. Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. Эмульсия O/W была получена смешиванием раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,15 мл), раствора 3 (0,75 мл) и раствора 4 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем формировали вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 5 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с pH 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 75600х g и 4°С в течение 35 мин, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторили и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере для окончательной дисперсии наноносителей около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли методом динамического рассеяния света. Количества пептида и симвастатина в наноносителе определяли ВЭЖХ-анализом. Общую массу сухого синтетического нано-носителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 6).
In vivo введение 1.
Селезенки, полученные от мышей линий B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) и C57BL/6 (В6), механически измельчали и отдельно пропускали через 70 мкМ сито, чтобы получить суспензию из одиночных клеток. Затем путем двухэтапного процесса получали очищенные CD4+CD25- клетки. При помощи магнитного сортировщика клеток Miltenyi Biotec AutoMACS клетки селезенки сначала пометили набором для изоляции CD4+ Т-клеток II, а непомеченную фракцию отделили от CD25+ клеток при помощи набора для элиминации CD25. Очищенные В6 клетки окрашивали внутриклеточным красителем, эфиром карбоксифлуоресцин сукцинимидила (CFSE), а после смешивали в равных концентрациях с очищенными OTII клетками. Затем их вводили внутривенно (i.v.) реципиентным мышам B6.SJL-Ptprca/BoyAi
(CD45.1).
На следующий день реципиентные мыши CD45.1 получили целевые вызывающие иммунную толерантность синтетические частицы вакцины (t SVP). Они имели внесенное количество пептида овальбумина (323-339) (OVA323-339), рапамицина (Rapa) и/или симвастатина (Simva) и вводились подкожно (s.c).
Вызывающее иммунную толерантность лечение заключалось в инъекции и сопровождалось еще 4 инъекциями с промежутком 2 недели между ними. После того как курс лечения был окончен, реципи-ентных животных CD45.1 умертвляли, брали их селезенки и подколенные лимфатические узлы, механически измельчали и отдельно пропускали через 70 мкМ сито, чтобы получить суспензию из одиночных клеток. Клетки селезенки очищали от красных кровяных клеток (RBC) путем инкубации с RBC лизис-ным буфером (Stem Cell Technologies), подсчеты числа клеток проводили как в селезенке, так и в лимфоузлах.
Клетки селезенки или лимфатических узлов культивировали в СМ (полная среда), дополненной 10Е/мл IL-2, повторно стимулировали OPII при 0,3x10 клеток/лунка в 96-луночных круглодонных (RB) планшетах и инкубировали при 37°С, 5% CO2. Клетки разделили на день 2 и собрали на день 5. Надоса-дочные жидкости собирали и замораживали, при этом клетки были окрашены для проведения фенотипи-ческого анализа проточной цитометрией. Клетки анализировали на проточном цитометре Becton Dickinson FacsCanto.
In vivo введение 2.
Селезенки, полученные от мышей линий B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (OTII) и C57BL/6 (В6), механически измельчали и отдельно пропускали через 70 мкМ сито, чтобы получить суспензию из одиночных клеток. Purified CD4+CD25- клетки затем очищали путем двухэтапного процесса, используя магнитный сортировщик клеток Miltenyi Biotec AutoMACS. Клетки селезенки метили набором II Miltenyi для изоляции CD4+ Т-клеток. Непомеченную фракцию CD4+ Т-клеток отделили от CD25+ клеток при помощи набора для элиминации CD25. Очищенные CD4 клетки от мышей В6 затем окрашивали внутриклеточным красителем, сложным карбоксифлуоресцеиновым эфиром сукцинимидила (CFSE), а после смешивали при равных концентрациях с очищенными клетками OTII. Затем их вводили внутривенно (i.v.) реципиентным мышам B6.SJL-Ptprca/BoyAi (CD45.1).
На следующий день реципиентные мыши CD45.1 получили таргетные вызывающие иммунную толерантность синтетические частицы вакцины. Они имели внесенное количество пептида овальбумина (323-339) (OVA323-339), рапамицина (Rapa) и/или симвастатина (Simva) и вводились подкожно (s.c.) или внутривенно (i.v.).
После того как курс лечения был окончен, реципиентных животных CD45.1 умертвляли, брали их селезенки и подколенные лимфатические узлы, механически измельчали и отдельно пропускали через 70 мкМ сито, чтобы получить суспензию из одиночных клеток. Клетки селезенки отделяли от красных кровяных клеток (RBCs) путем смешивания с RBC-лизирующим буфером (Stem Cell Technologies) и проводили подсчет как клеток селезенки, так и клеток лимфатических узлов.
Клетки селезенки или лимфатических узлов культивировали в СМ, дополненной 10Е/мл IL-2, повторно стимулировали 1 мкМ OTII при 0,3x10 клеток/лунка в 96-луночных круглодонных (RB) планшетах и инкубировали при 37°С, 5% CO2. Клетки разделили на день 2 и собрали на день 5. Надосадочные жидкости собирали и замораживали, при этом клетки были окрашены для проведения фенотипического анализа проточной цитометрией. Клетки анализировали на проточном цитометре Becton Dickinson Fac-sCanto.
Результаты.
Результаты показаны на фиг. 2 и 3 (иммуномодулятор 1: рапамицин; иммуномодулятор 2: симвастатин). Фиг. 2 показывает эффекты in vivo и демонстрирует, что уменьшение числа эффекторных иммунных клеток происходит с помощью синтетических наноносителей, содержащих антиген и иммуноде
прессанты, по сравнению только с антигеном или с синтетическими наноносителями, содержащими только антиген без иммуностимулирующей молекулы. Фиг. 3 также демонстрирует повышение процентной доли, которая отражает FoxP3 с синтетическими наноносителями, содержащими антиген и иммуно-депрессант, по сравнению синтетическими наноносителями, содержащими только антиген.
Пример 17. Оценка эффектов от наноносителей с антигенами и иммунодепрессантами.
Наноносители.
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т- и В-клеток, куплен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). PLGA с соотношением лактид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом. Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре. Раствор 2. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде. Раствор 3. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде. Раствор 4. Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8. Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. W1/O1 была получена объединением раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,75 мл) и раствора 3 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Branson Digital Sonifier 250. Затем формировали вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 4 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с pH 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 75600х g и 4°С в течение 35 мин, удаляя надосадочную жидкость и повторно суспендируя осадок в забу-ференном фосфатом физиологическом растворе. Процедуру отмывки повторили и осадок ресуспендиро-вали в забуференном фосфатом физиологическом растворе для окончательной дисперсии наноносителей около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли методом динамического рассеяния света. Количество пептида в наноносителе было определено при помощи ВЭЖХ-анализа. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 7).
Таблица 7
Наноноситель
Эффективный диаметр (нм)
Содержание пептида (% вес/вес)
234
2,1
Пептид овальбумина 323-339, пептид, состоящий из 17 аминокислот, известный как эпитоп белка овальбумина Т- и В-клеток, куплен у Bachem Americas Inc. (3132 Kashiwa Street, Torrance CA 90505; Part # 4065609). Рапамицин был куплен у TSZ СНЕМ (185 Wilson Street, Framingham, MA 01702; Product Catalogue # R1017). PLGA с соотношением лакид:гликолид 3:1 и удельной вязкостью 0,75 дл/г был приобретен у SurModics Pharmaceuticals (756 Tom Martin Drive, Birmingham, AL 35211; Код продукта 7525 DLG 7A). Был синтезирован PLA-PEG блок-сополимер с PEG-блоком приблизительно 5000 Да и PLA-блоком приблизительно 20000 Да. Поливиниловый спирт (85-89% гидролизный) был приобретен у EMD Chemicals (номер продукта 1.41350.1001).
Растворы готовили следующим образом.
Раствор 1. Пептид овальбумина 323-339 из расчета 20 мг/мл в разбавленном водном растворе соляной кислоты. Раствор был получен путем растворения пептида овальбумина в 0,13 М растворе соляной кислоты при комнатной температуре.
Раствор 2. Рампамицин из расчета 50 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения рапамицина в чистом метиленхлориде. Раствор 3. PLGA при 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLGA в чистом метиленхлориде. Раствор 4. PLA-PEG из расчета 100 мг/мл в метиленхлориде. Раствор был получен путем растворения PLA-PEG в чистом метиленхлориде. Раствор 5: Поливиниловый спирт из расчета 50 мг/мл в 100 мМ фосфатном буфере, pH 8.
Сначала приготовили основную водно-масляную эмульсию. Эмульсия O/W была получена смешиванием раствора 1 (0,2 мл), раствора 2 (0,2 мл), раствора 3 (0,75 мл) и раствора 4 (0,25 мл) в маленькой напорной трубке и обработкой ультразвуком в течение 40 с при амплитуде 50% с использованием Bran
son Digital Sonifier 250. Затем формировали вторичную эмульсию (W1/O1/W2), добавляя раствор 5 (3,0 мл) к первичной эмульсии W1/O1, перемешивая на вортексе 10 с и обрабатывая ультразвуком в течение 60 с при 30% амплитуде с использованием Branson Digital Sonifier 250.
Эмульсию W1/O1/W2 добавляли в мерный стакан, содержащий 70 мМ раствора фосфатного буфера (30 мл) с pH 8, и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы метиленхлорид испарился, и сформировались синтетические наноносители. Часть синтетических наноносителей отмывали, поместив суспензию синтетического наноносителя в пробирку для центрифуги и центрифугируя ее при 21000х g и 4°С в течение 45 мин, удаляя надосадочную жидкость и ресуспендируя осадок в фосфатно-солевом буфере. Процедуру отмывки повторили и осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере для окончательной дисперсии наноносителей около 10 мг/мл.
Размер наноносителя определяли методом динамического рассеяния света. Количества пептида и рапамицина в наноносителе определяли ВЭЖХ-анализом. Общую массу сухого синтетического наноносителя на 1 мл суспензии определяли гравиметрическим методом (табл. 8).
Таблица 8
Идентификация наноносителя
Эффективный диаметр (нм)
Содержание рапамицина (% вес/вес)
Содержание пептида (% вес/вес)
227
9,0
2,5
Измерение размеров синтетического наноносителя производили путем динамического рассеяния света (DLS). Суспензию синтетических наноносителей разбавляли очищенной водой до достижения конечной концентрации суспензии синтетических наноносителей приблизительно от 0,01 до 0,1 мг/мл. Разбавленную суспензию получали непосредственно внутри кюветы, пригодной для DLS-анализа. Кювету затем помещают в прибор ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corp., приводят равновесной температуре 25°С, а затем сканируют в течение достаточного времени для получения стабильного и воспроизводимого распределения на основе соответствующих введенных данных для вязкости среды и индексов преломления образца. Затем регистрируют эффективный диаметр или среднее значение распределения.
Иммунизация.
Наноносители размораживали и выдерживали на воздухе. Начальные растворы представляли собой 10х раствор реакционной смеси и затем были разбавлены до концентрации 100 мкг/мл в OVA323-339 или 1х раствор. Этот 1х раствор использовали для инъекций 200 мкл на одно внутривенное введение. Животных иммунизировали белком OVA (OVA) и лечили пептидом OVA323-339. Иммунизацию производили следующим образом: 10 мкг OVA+ 4 мг Alum внутрибрюшинно в 400 мкл каждой иммуно логически ин-тактной самке мыши Balb/C. Экспериментальные группы состояли из 5 животных каждая. Клетки селезенки рестимулировали антигеном, используя CFSE или СТО, чтобы определить количество Ag-специфической пролиферации.
Уровни специфических типов иммунных клеток.
FCS файлы анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. 7AAD положительные клетки (ядерный краситель, окрашивающий мертвые клетки) положительные клетки исключали и подсчитывали морфологические типы клеток, зависящие от экспрессии CD4, CD8, Gr-1, F4/80, В220, TCRb и CD11b. Стратегия гейтирования для подкласса Т-клеток -7AAD-F4/80-GR-1-TCRb+CD4+/-CD8+/-.
Определение % делящихся CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Встречаемость овальбумин-реактивных CD4 Т и CD8 Т-клеток определяли проточной цитометри-ей. Спленоциты, полученные от экспериментальных животных, окрашивали CFSE, тиол-реактивным флуоресцентным красителем, пригодным для долгосрочного окрашивания клеток, и культивировали в полной среде при 37С, 5% CO2 с белком овальбумина в течение 3 дней. На 3 день клетки отмыли, блокировали анти-CD16/32 антителом и затем окрашивали вместе с конъюгированными антителами, специфическими к TCR CD4 и CD8a. Увеличение числа спленоцитов TCR CD4 или TCR CD8a определяли, сравнивая дифференциальное окрашивание CFSE.
Результаты.
Фиг. 4 и 5 демонстрируют эффективность наноносителей у животных моделей. Фиг. 4 демонстрирует снижение числа CD4+ Т и CD8+ Т-клеток в пробах лаважа, полученных от животных объектов после введения синтетических наноносителей, содержащих OVA323-339 и иммунодепрессант. Фиг. 5 показывает снижение процентной доли делящихся CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток при введении синтетических наноносителей, содержащих иммунодепрессант и OVA пептид.
Пример 18. Оценка эффектов от наноносителей с антигенами и иммунодепрессантами (пример возможного использования).
Наноносители.
Наноносители готовили аналогичным образом с примером выше (пример 17), используя пептид, ограниченный главным комплексом гистосовместимости I класса SINFEKL (SEQ ID №: 944) вместо пеп-
тида овальбумин. Иммунизация.
Наноносители размораживают и выдерживают до равновесного состояния. Начальные растворы представляют собой 10х раствор реакционной смеси, а затем их разбавляют до концентрации 100 мкг/мл в пептиде, или 1х раствор. Этот 1х раствор используют для инъекций 200 мкл на одно внутривенное введение. Животных иммунизируют белком, содержащим пептид, и лечат пептидом. Иммунизацию производят следующим образом: 10 мкг пептида+ 4 мг Alum внутрибрюшинно в 400 мкл каждой иммунологи-чески интактной самке мыши Balb/C. Экспериментальные группы состоят из 5 животных каждая. Клетки селезенки рестимулируют антигеном, используя CFSE или СТО, чтобы определить количество Ag-специфической пролиферации.
Уровни специфических типов иммунных клеток.
FCS файлы анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo. 7AAD положительные клетки (ядерный краситель, окрашивающий мертвые клетки) положительные клетки исключают и подсчитывают морфологические типы клеток, зависящие от экспрессии CD4, CD8, Gr-1, F4/80, В220, TCRb и CD11b. Стратегия гейтирования для подкласса Т-клеток - 7AAD-F4/80-GR-1-TCRb+CD4+/-CD8+/-.
Определение % делящихся CD4+ и CD8+ Т-клеток.
Встречаемость овальбумин-реактивных CD4+ Т и CD8+ Т-клеток определяют проточной цитомет-рией. Спленоциты, полученные от экспериментальных животных, окрашивают CFSE, тиол-реактивным флуоресцентным красителем, пригодным для долгосрочного окрашивания клеток, и культивировали в полной среде при 37С, 5% CO2 с белком овальбумина в течение 3 дней. На 3 день клетки отмывают, блокируют анти-CD16/32 антителом и затем окрашивают вместе с конъюгированными антителами, специфическими к TCR CD4 и CD8a. Увеличение числа спленоцитов TCR+CD4 или TCR+CD8a+ оценивают, сравнивая дифференциальное окрашивание CFSE.
<220>
<223> Эпитоп белка XRCC4 Homo sapiens <400> 943
Val Ser Lys Asp Asp Ser lie lie Ser Ser Leu Asp Val Thr Asp
15 10 15
<210> 944 <211> 8 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Эпитоп OVA <400> 944
Ser lie lie Asn Phe Glu Lys Leu 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение композиции, содержащей:
(i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами; и
(ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса,
в способе, включающем:
(a) введение композиции пациенту в соответствии с разработанным ранее протоколом, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; или
(b) снижение числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов; или
(c) снижение числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких пациентов.
2. Применение по п.1, где (а) способ дополнительно включает предоставление или выявление пациента; и/или (b) антиген представляет собой терапевтический белок, аутоантиген или аллерген, или ассоциирован с воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, отторжением органа или тканей или болезнью "трансплантат против хозяина"; и/или (с) способ дополнительно включает оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения композиции; и/или (d) пациент имеет или существует риск развития у него воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина"; и/или (е) пациенту проделали или будут делать трансплантацию; (f) пациент имеет или существует риск развития у него нежелательного иммунного ответа на терапевтический белок, который вводят или будут вводить пациенту; (g) пациенту вводят одну или несколько поддерживающих доз композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или главным комплексом гистосовместимости II класса; и/или (h) введение осуществляют путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения, например, путем ингаляции или внутривенного, подкожного или трансмукозального введения; и/или (i) иммунодепрессанты включают статин, ингибитор mTOR, где ингибитор mTOR является, например, рапамицином, TGF-Р сигнальный агент, кортикостероид, ингибитор митохондриальной функции, ингибитор Р38, NF-кР ингибитор, агонист аденозинового рецептора, агонист простагландина Е2, ингибитор фосфодиэстеразы 4, ингибитор HDAC или ингибитор протеасомы; и/или (j) внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпитопов в среднем в первом множестве синтетических наноносите-лей составляет от 0,0001 до 50% (вес./вес.), например от 0,1 до 10% (вес./вес.), где внесенное количество иммунодепрессантов и/или эпитопов в среднем в первом множестве синтетических наноносителей необязательно составляет по меньшей мере 2%, но не более 25% (вес./вес.).
3. Применение по п. 1 или 2, где синтетические наноносители первого множества включают липид-ные наночастицы, полимерные наночастицы, металлические наночастицы, эмульсии на основе поверхностно-активных веществ, дендримеры, бакиболлы, нанонити, вирусоподобные частицы или пептидные или белковые частицы.
4. Применение по п.3, где (а) синтетические наноносители первого множества включают липидные наночастицы, например синтетические наноносители первого множества включают липосомы; (b) синте
2.
тические наноносители первого множества включают металлические наночастицы, например металлические наночастицы включают наночастицы золота; (с) синтетические наноносители первого множества включают полимерные наночастицы, например, такие, где (i) полимерная наночастица содержит полимер, который представляет собой не содержащий концевую метоксигруппу плюрониевый полимер; и/или (ii) полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир, сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, полиаминокислоту, поликарбонат, полиацеталь, поликеталь, полисахарид, полиэти-локсазолин или полиэтиленимин, например, сложный полиэфир включает поли(молочную кислоту), по-ли(гликолевую кислоту), сополимер молочной и гликолевой кислот или поликапролактон, и/или полимерные наночастицы содержат сложный полиэфир и сложный полиэфир, связанный с простым полиэфиром, например, где указанный простой полиэфир включает полиэтиленгликоль или полипропиленгли-коль.
5. Применение по любому из пп.1-4, где (а) у синтетических наноносителей первого множества среднее значение распределения по размеру частиц, полученного с помощью динамического рассеяния света, представляет собой диаметр, составляющий (i) более 100 нм; (ii) более 150 нм; (iii) более 200 нм; (iv) более 250 нм или (v) более 300 нм; и/или (b) соотношение размеров синтетических наноносителей первого множества составляет более чем 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 или 1:10.
6. Применение по любому из пп.1-5, где Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ и/или CD8+ Т-клетки.
7. Способ, включающий:
(i) получение первого множества синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессанта-
ми;
(ii) получение эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса;
(iii) оценку эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ог-
раниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплек-
сом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что (а) способ дополнительно включает получение лекарственной формы, содержащей первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммуноде-прессантами, и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса; и/или (b) способ дополнительно включает получение композиции, содержащей первое множество синтетических наноносителей и эпито-пы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса, или лекарственной формы, доступной пациенту для введения, при этом способ необязательно дополнительно включает оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения композиции или лекарственной формы; и/или (с) Т-эффекторные клетки представляют собой CD4+ Т-клетки и/или CD8+ Т-клетки; и/или (d) получаемые первое множество синтетических наноносителей и эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гисто-совместимости II класса, определены в любом из пп.1-6.
9. Способ получения композиции, включающий стадии:
(i) связывания первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами;
(ii) предоставления эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса; и
(iii) оценки эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток,
необязательно включающий стадии, как определено в способе по п.7 или 8.
10. Способ получения лекарственной формы, включающий стадии:
(i) связывания первого множества синтетических наноносителей с иммунодепрессантами;
(ii) предоставления эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса;
(iii) оценки эффекта от первого множества синтетических наноносителей и эпитопов антигена, ограниченных главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченных главным комплексом гистосовместимости II класса, на число и/или активность Т-эффекторных клеток,
необязательно включающий стадии, как определено в способе по п.7 или 8.
11. Композиция, получаемая посредством способа по любому из пп.7-9 или как определено в любом из пп.1-6.
12. Лекарственная форма, получаемая посредством способа по любому из пп.7, 8 или 10 или как определено в любом из пп.1-6.
13. Композиция, содержащая:
(i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами;
(ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или огра-
(i)
ниченные главным комплексом гистосовместимости II класса; (iii) фармацевтически приемлемый эксципиент,
отличающаяся тем, что композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента.
14. Применение в лечебной терапии или профилактике композиции, включающей:
(i) первое множество синтетических наноносителей, связанных с иммунодепрессантами;
(ii) эпитопы антигена, ограниченные главным комплексом гистосовместимости I класса и/или ограниченные главным комплексом гистосовместимости II класса,
где композиция присутствует в количестве, эффективном для снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента, и необязательно предназначена для применения в способе:
(a) лечения, включающем стадию введения указанной композиции пациенту и оценку числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у пациента до и/или после введения;
(b) лечения, включающем стадию введения указанной композиции пациенту в соответствии с разработанным ранее протоколом, применение которого способствовало снижению числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток у одного или нескольких исследуемых пациентов;
(c) лечения или профилактики, как определено в любом одном из пп. 1 -6;
(d) лечения или профилактики воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, аллергии, отторжения органа или тканей или болезни "трансплантат против хозяина", например, путем снижения числа или активности антиген-специфических Т-эффекторных клеток;
(e) лечения пациента, которому проделали или будут делать трансплантацию;
(f) лечения пациента, которому вводили или будут вводить терапевтический белок; или
(g) лечения в сочетании с пересаживаемым трансплантируемым материалом или терапевтическим белком.
15. Применение по п.14, где:
(a) композиция является такой, как определено в любом из пп.1-6; и/или
(b) композиция предназначена для применения в способе лечебной терапии или профилактики, включающем введение путем внутривенного, внутрибрюшинного, трансмукозального, перорального, подкожного, пульмонального, интраназального, внутрикожного или внутримышечного введения, например, как определено в п.3.
16. Лекарственная форма, содержащая композицию по любому из пп.1-6 и 11 или 13.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027259
- 1 -
(19)
027259
- 1 -
(19)
027259
- 1 -
(19)
027259
- 4 -
027259
- 52 -
027259
- 288 -
027259
- 291 -