EA 027258B1 20170731

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000027258b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ прогнозирования стиля передвижения у лошади, включая способность использовать альтернативные аллюры, бежать рысью или иноходью с высокой скоростью и осуществлять выездку, включающий стадии: 1) экстрагирование фракции ДНК из образца, полученного у лошади, 2) определение в указанной фракции ДНК наличия или отсутствия нонсенс-мутации в экзоне 2 гена DMRT3 (фактор транскрипции 3, связанный с генами doublesex и mab-3) в нуклеотидном положении 22999655 на хромосоме 23 лошади, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1, приводящей к кодированию усеченной формы белка DMRT3, или по меньшей мере одного ассоциированного с указанной нонсенс-мутацией генетического маркера, который расположен в области между фланкирующими однонуклеотидными полиморфизмами SNP по нуклеотидным положениям 22628976 и 23315071 на 23 хромосоме лошади, где генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 4, 5, 7 и 8, где наличие или отсутствие указанных нонсенс-мутации или по меньшей мере одного генетического маркера означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, либо что лошадь обладает способностью осуществлять выездку.

2. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один генетический маркер расположен в области между фланкирующими SNP по нуклеотидным положениям 22919878 и 23011289 на 23 хромосоме лошади.

3. Способ по п.2, где генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 8.

4. Способ по п.2, включающий идентификацию в указанной фракции ДНК нуклеотида в одном или более чем одном конкретном положении, выбранном из положений 22919878; 22920361; 22920434; 22920646; 22920717; 22921203; 22922079; 22922780; 22923569; 22924120; 22924142; 22924299; 22924380; 22924407; 22926098; 22926188; 22926872; 22927387; 22927607; 22928220; 22928537; 22928587; 22929137; 22930011; 22932024; 22932895; 22933218; 22936034; 22940759; 22942423; 22945643; 22946599; 22948774; 22949055; 22949108; 22949240; 22949710; 22956846; 22960132; 22960528; 22960710; 22964042; 22965059; 22967119; 22967656; 22967915; 22968898; 22973984; 22974589; 22979124; 22980014; 22982879; 22984588; 22985746; 22988210; 22988991; 22993092; 22994591; 22999058; 22999655; 23002606; 23003956; 23008772; 23008789; 23009648; 23010164 и 23011289 на 23 хромосоме лошади.

5. Способ по п.1, включающий определение в указанной фракции ДНК наличия 1) нуклеотида С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 2) нуклеотида А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 3, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, 3) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 5, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 4) нуклеотида А или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 6, где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 5) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 7, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 6) нуклеотида G или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 8, где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, 7) нуклеотида А или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 9, где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 8) нуклеотида Т или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 10, где наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 9) нуклеотида Т или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 11, где наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 10) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 12, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 11) нуклеотида А или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 13, где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 12) нуклеотида А или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 14, где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 13) нуклеотида G или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 15, где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 14) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 16, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 15) нуклеотида G или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 17, где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 16) нуклеотида G или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 18, где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 17) нуклеотида С или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 19, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 18) нуклеотида Т или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 20, где наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 19) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 21, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, 20) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 22, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 21) нуклеотида С или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 23, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, 22) нуклеотида С или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 24, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и/или 23) нуклеотида А или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 25, где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью.

6. Способ по п.4, включающий определение в указанной фракции ДНК наличия или отсутствия 1) нуклеотида С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и/или 2) нуклеотида А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 3, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку.

7. Способ прогнозирования стиля передвижения у лошади, включая способность использовать альтернативные аллюры, бежать рысью или иноходью с высокой скоростью и осуществлять выездку, включающий стадии: 1) экстрагирование фракции белка из образца, полученного у лошади, и 2) определение в указанной фракции белка наличия или отсутствия усеченной формы белка DMRT3, где наличие указанной усеченной формы белка DMRT3 означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и отсутствие указанной усеченной формы белка DMRT3 означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку.

8. Применение способа по любому из пп.1-7 для отбора лошади для разведения.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

3. Способ по п.2, где генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 8.

8. Применение способа по любому из пп.1-7 для отбора лошади для разведения.

Евразийское
патентное
ведомство
027258
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201391408
(22) Дата подачи заявки 2012.05.04
(51) Int. Cl. C12Q1/68 (2006.01)
(54)
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СТИЛЯ ПЕРЕДВИЖЕНИЯ У ЛОШАДИ И ПРИМЕНЕНИЕ УКАЗАННОГО СПОСОБА ДЛЯ ОТБОРА ЛОШАДИ ДЛЯ
РАЗВЕДЕНИЯ
(31) 1130034-0; 61/514,749
(32) 2011.05.05; 2011.08.03
(33) SE; US
(43) 2014.05.30
(86) PCT/SE2012/050473
(87) WO 2012/150905 2012.11.08
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
КАПИЛЕТ ДЖИНЕТИКС АБ (SE)
(72) Изобретатель:
Андерссон Лиса C., Андерссон Лейф, Линдгрен Габриэлла (SE)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(56) WO-A1-2010029527 WO-A2-03046203 WO-A2-02092851 WO-A1-2006003436
SWINBURNE J. et al. "First Comprehensive Low-Density Horse Linkage Map Based on Two 3-Generation Full-Sibling, Cross-Bred Horse Reference Families", 2000, vol. 66, pages 123-134, Genomics; see fig. 2 page 131
(57) В настоящем изобретении предложен способ прогнозирования стиля передвижения у лошади, включая способность лошади использовать альтернативные аллюры, бежать рысью или иноходью с высокой скоростью и осуществлять выездку. Способ включает определение в полученном у лошади образце наличия или отсутствия нонсенс-мутации в экзоне 2 гена DMRT3 на 23 хромосоме лошади или по меньшей мере одного ассоциированного с указанной нонсенс-мутацией генетического маркера на 23 хромосоме лошади, либо усеченной формы белка DMRT3. В изобретении также предложено применение указанного способа для отбора лошади для разведения.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам прогнозирования стиля передвижения у лошадей, включая способность лошади использовать различные аллюры и способность бежать рысью или иноходью на высокой скорости. Способы включают определение в образце ДНК, полученном у лошади, аллель по меньшей мере одного генетического маркера, который расположен на 23 хромосоме лошади, где указанный маркер ассоциирован со способностью использовать различные аллюры.
Предшествующий уровень техники
Лошади демонстрируют значительную вариацию в стиле передвижения как внутри, так и между породами. Три основных аллюра у лошадей представляют собой шаг, рысь и галоп. Лошади используют эти различные аллюры в соответствии со своей скоростью, причем шаг используется при низкой скорости, рысь при более быстром способе передвижения и галоп представляет собой аллюр лошадей, обычно используемый для того, чтобы быстро передвигаться. Тем не менее, некоторые лошади обладают способностью также использовать альтернативные аллюры, например иноходь и рэкинг, и таких лошадей называют лошадьми, дрессируемыми на аллюры. Шагающая лошадь перемещает две ноги с одной стороны при латеральном движении в противоположность рысящей лошади, которая осуществляет диагональное движение, когда расположенные по диагонали передняя и задняя ноги движутся вперед и назад вместе. Кроме того, исландские лошади способны осуществлять пятый аллюр, названный тёльт, который представляет собой четырехтактный аллюр с тем же самым стилем постановки ног, как при ходьбе. Характерная особенность тёльта представляет собой то, что лошадь всегда по меньшей мере одним копытом касается грунта, обеспечивая очень мягкий аллюр. Примеры других похожих альтернативных аллю-ров, также известных как медленная иноходь, представляют собой фокстрот, рэк, трусца и пасо корт.
Альтернативные аллюры отличаются по стилю опускания ноги, времени и частоте и, как правило, могут быть разделены на четыре категории: иноходь, медленная иноходь с регулярным ритмом, латеральная и диагональная медленная иноходь. В табл. 1 предложена классификация пород лошадей, дрессируемых на аллюры или не дрессируемых на аллюры. В действительности большая часть пород лошадей не дрессируется на аллюры, и исключительно иллюстративные примеры таких пород перечислены в таблице. Лошади, демонстрирующие породы, классифицирующиеся как не дрессируемые на аллюры, никогда или редко способны осуществлять альтернативные аллюры, тогда как большая часть или все лошади пород, дрессируемых на аллюры, могут выполнять альтернативные аллюры. В мире существуют другие породы, дрессируемые на аллюры, дополнительно к перечисленным в табл. 1. Иногда существует значительная вариация также внутри пород в отношении стиля передвижения. Например, исландские лошади классифицируются как четырехаллюрные или пятиаллюрные, где первые могут осуществлять шаг, рысь, галоп и тёльт, тогда как последние способны также к иноходи.
Лошадь стандартбред, используемая для рысистых бегов, обладает уникальной способностью бежать рысью или иноходью с очень высокой скоростью, не переходя в галоп, который является нормальным аллюром у лошади при высокой скорости. В Северной Америке выведена субпопуляция лошадей стандартбред, которые шагают с очень высокой скоростью. Другие породы лошадей, используемые для рысистых бегов, включают породы, такие как холоднокровный рысак, финские лошади, французский рысак и орловский рысак.
Стиль передвижения у лошадей находится под строгим отбором при разведении лошадей. Например, способность бежать с использованием галопа, рыси и шага отбирают у чистокровных верховых лошадей, рысаков стандартбред и иноходцев стандартбред соответственно. Лошади, обладающие способностью использовать альтернативные аллюры, также весьма желанны со стороны некоторых наездников и представляют собой характеристику, в соответствии с которой разрабатывалось множество специализированных пород. Способы прогнозирования стиля передвижения у лошади, т.е. ее способности использовать различные аллюры, может обладать существенной важностью в коневодстве.
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы настоящего изобретения идентифицировали генетический локус у лошадей, который определяет способность лошади использовать различные аллюры и способность бежать рысью с высокой скоростью. Преждевременный стоп-кодон в гене фактора транскрипции 3, связанном с генами doublesex и mab-3 (DMRT3), обнаружен у всех протестированных лошадей, обладающих способностью осуществлять альтернативные аллюры. Мутантные лошади экспрессируют усеченный белок DMRT3, лишенный последних 174 аминокислотных остатков, но сохраняющий функциональный ДНК-связывающий домен. DMRT3 экспрессируется в подгруппе нейронов спинного мозга лошади.
Соответственно, в настоящем изобретении предложены способы прогнозирования стиля передвижения у лошадей, включая способность лошади использовать различные аллюры, способность бежать рысью или шагать с высокой скоростью и способность к выездке.
В первом аспекте изобретения предложены способы прогнозирования стиля передвижения у лошадей, включая способность лошади использовать альтернативные аллюры, способность бежать рысью с высокой скоростью и способность к выездке, при которых осуществляют экстрагирование белка из образца, полученного у лошади. Способы дополнительно включают определение в указанном белковом образце наличия или отсутствия усеченной формы белка DMRT3. Белок DMRT3 может представлять
собой белок DMRT3, усеченный по аминокислотному положению 300, соответствуя белку SEQ ID NO: 4. Определение может быть осуществлено путем применения иммунохимического способа, такого как вес-терн-блоттинг, с использованием антитела против DMRT3.
Во втором аспекте изобретения предложены способы прогнозирования стиля передвижения у лошадей, включая способность лошади использовать альтернативные аллюры, способность бежать рысью с высокой скоростью и способность к выездке, при которых осуществляют экстракцию ДНК из образца, отобранного у лошади. Способы дополнительно включают определение в указанной аллели ДНК по меньшей мере одного генетического маркера, который расположен в области между фланкирующими SNP (однонуклеотидный полиморфизм) по положениям нуклеотидов 22628976 (соответствующим положению 51 в SEQ ID NO: 6) и 23315071 (соответствующим положениию 51 в SEQ ID NO: 7) на 23 хромосоме лошади.
Генетический маркер может быть выбран из однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и вста-вок/делеций (INDEL).
Предпочтительно генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 4,
5, 7 и 8.
Предпочтительно генетический маркер расположен в области между фланкирующими SNP по нук-леотидным положениям 22919878 и 23011289 на 23 хромосоме лошади.
Предпочтительно генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 8.
Наиболее предпочтительно генетический маркер расположен в положении 22999655 на 23 хромосоме лошади, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1.
Конкретнее, способы могут включать идентификацию в указанной ДНК нуклеотида в одном или более чем одном конкретном положении, выбранном из положений 22919878; 22920361; 22920434; 22920646;22920717;22921203; 22922079;22922780;22923569; 22924120; 22924142; 22924299; 22924380;
22924407; 22926098; 22926188; 22926872; 22927387; 22927607; 22928220; 22928537; 22928587; 22929137; 22930011; 22932024; 22932895; 22933218; 22936034; 22940759; 22942423; 22945643; 22946599; 22948774; 22949055; 22949108; 22949240; 22949710; 22956846; 22960132; 22960528; 22960710; 22964042; 22965059; 22967119; 22967656; 22967915; 22968898; 22973984; 22974589; 22979124; 22980014; 22982879; 22984588; 22985746; 22988210; 22988991; 22993092; 22994591; 22999058; 22999655; 23002606; 23003956; 23008772;
23008789; 23009648; 23010164 и 23011289 на 23 хромосоме лошади.
Наиболее предпочтительно способы включают идентификацию в указанной ДНК нуклеотида в
конкретном положении 22999655 на 23 хромосоме лошади.
Конкретнее, способы могут включать определение в указанной ДНК наличия или отсутствия: 1) нуклеотида С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1,
2) нуклеотида А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 3,
NO:
3) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
SEQ
NO:
4) нуклеотида А и/или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
SEQ
NO:
5) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
SEQ
NO:
6) нуклеотида G и/или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
SEQ
NO:
7) нуклеотида А и/или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
SEQ
NO:
8) нуклеотида Т и/или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
10,
SEQ
NO:
9) нуклеотида Т и/или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
11,
SEQ
NO:
10) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
12,
SEQ
NO:
11) нуклеотида А и/или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
13,
SEQ
NO:
12) нуклеотида А и/или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
SEQ
NO:
13) нуклеотида G и/или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
15,
SEQ
NO:
14) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
16,
SEQ
NO:
15) нуклеотида G и/или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
17,
SEQ
NO:
16) нуклеотида G и/или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51
18,
SEQ
17) нуклеотида С и/или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 19,
18) нуклеотида Т и/или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 20,
19) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 21,
20) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 22,
21) нуклеотида С и/или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 23,
22) нуклеотида С и/или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 24,
23) нуклеотида А и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 25.
Предпочтительно способы включают определение в указанной ДНК наличия или отсутствия:
1) нуклеотида С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1,
2) нуклеотида А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 3,
3) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 5,
4) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 7,
5) нуклеотида Т и/или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 20,
6) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 21,
7) нуклеотида С и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 22,
8) нуклеотида С и/или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 23,
9) нуклеотида С и/или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 24
10) нуклеотида А и/или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 25.
Наиболее предпочтительно способы включают определение в указанной ДНК наличия или отсутствия:
1) нуклеотида С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1 или
2) нуклеотида А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 3. Лошадь может быть выбрана из любой лошади или породы лошадей, относящихся к видам Equus
caballus. Примеры пород лошадей можно найти в табл. 1.
Классификация пород лошадей как дрессируемых, так и не дрессируемых на аллюры, где дрессируемые на аллюры лошади обладают способностью осуществлять альтернативные аллюры дополнительно к трем
В соответствии с одним из аспектов изобретения способы в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для тестирования лошадей на установление отцовства.
Предполагается, что любой способ или композиция, описанные здесь, могут быть отнесены к любому другому способу или композиции, описанными здесь. Использование какого-либо слова в единственном числе в сочетании с термином "содержащим" в формуле изобретения и/или описании может обозначать "один", но также совместим со значением "один или более чем", "по меньшей мере один" и "один или более чем один". Эти и другие воплощения изобретения будут лучше раскрыты и поняты при рассмотрении в сочетании со следующим описанием и сопровождающими графическими материалами. Тем
не менее, следует понимать, что следующее описание, несмотря на то, что указывает на различные воплощения изобретения и многочисленные конкретные детали, представлено в качестве иллюстрации, не ограничивающей его объем. Множество замен, модификаций, дополнений и/или перестановок могут быть осуществлены в рамках изобретения, не отступая от его сущности, и изобретение включает все такие замены, модификации, дополнения и/или перестановки.
Подписи к графическим материалам
Следующие графические материалы составляют часть настоящего описания и включены для того, чтобы дополнительно продемонстрировать некоторые аспекты настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято со ссылкой на один или более чем один из этих графических материалов в комбинации с подробным описанием представленных здесь конкретных воплощений.
Фиг. 1 - результаты полногеномного анализа 70 исландских лошадей, классифицированных как че-тырехаллюрные или пятиаллюрные. Высокоассоциированный SNP в нуклеотидном положении Chr23:22967656 п.о. (пар оснований) обозначен стрелкой.
Фиг. 2 - геномная область, несущая локус Gait на хромосоме 23, контролирующая стиль передвижения у лошадей. Ген DMRT3 неверно отмечен в этой конструкции, но представлен транскриптом En-sembl ENSECAT00000025062, обозначенным стрелкой на данной фигуре. Фигура взята из внешнего источника UCSC геномного браузера (www.genome.ucsc.edu).
Фиг. 3 - нуклеотидное и аминокислотное выравнивание для кодона 296-306 DMRT3 лошади, включающего кодон 301, в котором нонсенс-мутация происходит в аллели, ассоциированной со способностью к иноходи.
Фиг. 4 - выравнивание аминокислот 249-331 (пронумерованных в соответствии с последовательностью лошади) в белке DMRT3 различных видов позвоночных животных, включающем дикий тип (WT) и мутантную (MUT) форму белка DRMT3 лошади. "." обозначает пропуск в выравнивании; "-" обозначает идентичность используемой референсной последовательности (крупный рогатый скот); * указывает на нонсенс-мутацию в кодоне 301 в мутантной аллели лошади.
Фиг. 5 - схематичное представление прогнозируемой формы дикого типа и мутантной (gait) формы белка DMRT3 у лошадей. DM - ДНК-связывающая молекула типа цинковых пальцев. DMA - белковый домен неизвестной функции, представленный в белках DMRT.
Фиг. 6 - EMSA (анализ изменения электрофоретической подвижности) с использованием олигонук-леотида, демонстрирующего DMRTS-связывающий мотив и транслируемый in vitro меченый myc DMRT3 дикого типа и мутантные белки. Суперсдвиги продемонстрированы с использованием антитела против myc (распознающего обе формы) или антитела против DMRT3, распознающего С-концевую часть белка дикого типа, но не усеченную форму. Также использовали олигонуклеотид, соответствующий сайту связывания DMRT1, и получили похожие результаты (данные не представлены). Имеющий более низкую температуру гибридизации конкурирующий олигонуклеотид добавляли в 150х избытке. GS - сдвиг на геле, демонстрирующий комплекс между белком DMRT3 и олигонуклеотидом; SS - суперсдвиг, демонстрирующий комплекс между антителом, белком DMRT3 и олигонуклеотидом.
Подробное описание изобретения
Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что существует локус, названный здесь Gait, на 23 хромосоме лошади, который оказывает существенное влияние на стиль передвижения у лошадей. Представленные результаты демонстрируют, что гомозиготность по рецессивной аллели в этом локусе требуется для способности лошади идти шагом. Утверждается, что нонсенс-мутация в нуклеотидном положении 22999655 в экзоне 2 гена DMRT3 представляет собой причинную мутацию для аллели Gait. DMRT3 представляет собой высококонсервативный ген, представленный у всех позвоночных животных, исследованных до настоящего времени. Функция белка DMRT3 не установлена в каких-либо предшествующих исследованиях, но факт того, что он экспрессируется в головном мозге и в спинном мозге мыши (MGI, www.informatics.jax.org), согласуется с критической ролью контроля передвижения, что продемонстрировано в настоящем исследовании. Нонсенс-мутация, лежащая в основе аллели gait, может оказывать очень хорошее фенотипическое влияние в гетерозиготном состоянии, поскольку она возникает в последнем экзоне DMRT3 и, как ожидают, приводит к кодированию усеченной формы белка (SEQ ID NO: 4), лишенной последних 174 аминокислот (фиг. 5). ДНК-связывающий домен DM в DMRT3 расположен в N-концевой части, которая поддерживается в усеченной форме (фиг. 5). Таким образом, мутант-ная форма DMRT3 может обладать способностью связываться со своими последовательностями-мишенями ДНК, но может демонстрировать дефекты в отношении взаимодействия с другими белками, необходимыми для ее нормальной функции и поэтому может оказывать доминантно-негативное действие у гетерозигот. Стоит отметить, что только одна из исландских лошадей была гомозиготной в отношении аллели дикого типа (не способной к иноходи) в локусе Gait.
В данном исследовании был установлен генетический маркер, который может быть использован для прогнозирования генетического статуса лошади в отношении ее стиля передвижения. Авторы изобретения предполагают, что аллель gait представлена у большинства, если не всех, дрессируемых на ал-люры пород, некоторые из которых перечислены как дрессируемые на аллюры в табл. 1, и она может обнаруживаться с низкой частотой также у других пород. Этот маркер также позволяет прогнозировать
способность лошади к рыси или иноходи с высокой скоростью, поскольку он обнаруживается с высокой частотой у лошадей, используемых для рысистых бегов. Кроме того, авторы изобретения предполагают, что лошади по меньшей мере с одной аллелью дикого типа лучше проявляют себя в конкуре, традиционной выездке и состязании по бегу галопом.
Стиль передвижения определяет способность лошади использовать альтернативные аллюры, а также способность лошади к рыси или иноходи с высокой скоростью и ее способность к выездке. Альтернативные аллюры включают иноходь и медленную иноходь, примерами которых являются тёльт, трусца, рэк, классический фино, пасо корто, пасо ларго, пасо илано, собреандандо, фокстрот.
Можно прогнозировать, что лошадь, гомозиготная или гетерозиготная по аллели gait, обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью с высокой скоростью. Можно прогнозировать, что лошадь, гомозиготная или гетерозиготная по аллели дикого типа, обладает лучшей способностью к конкуру, выездке и состязаниям по бегу галопом.
Польза от данного изобретения в индустрии коневодства включает определение генотипа потенциальных племенных животных для максимизации возможности получения потомства, обладающего благоприятным стилем передвижения. Информация о генотипе по локусу DMRT3 также может быть использована лицами, продающими и покупающими лошадей, для предсказания способности лошади осуществлять различные аллюры. Кроме того, способы по изобретению могут быть использованы для эффективной интрогрессии аллели gait породам, не дрессируемым на аллюры.
В соответствии с одним из аспектов изобретения способы по настоящему изобретению могут быть использованы для отбора лошадей для разведения.
Соответственно, в одном из аспектов изобретения предложены способы отбора лошади для разведения, где указанные способы включают определение в образце ДНК, полученном у указанной лошади, аллели по меньшей мере одного генетического маркера, который расположен в области между фланкирующими SNP по нуклеотидным положениям 22628976 на 23 хромосоме лошади. Генетический маркер может быть выбран из однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и вставок/делеций (INDEL).
Предпочтительно генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 4,
5, 7 и 8.
Предпочтительно генетический маркер расположен в области между фланкирующими SNP по нуклеотидным положениям 22919878 и 23011289 на 23 хромосоме лошади.
Предпочтительно генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 8.
Наиболее предпочтительно генетический маркер расположен в положении 22999655 на 23 хромосоме лошади, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1.
Наиболее надежный тест для определения генотипа по локусу Gait заключается в определении наличия и/или отсутствия нонсенс-мутации в экзоне 2 DMRT3 (нуклеотидное положение 22999655 на хромосоме 23, соответствующее нуклеотидному положению 939 в SEQ ID NO: 3). Тем не менее, генетические маркеры, расположенные в интервале между фланкирующими маркерами по нуклеотидным положениям 22628976 и 23315071, и конкретнее, генетические маркеры, расположенные в интервале между положениями 22919878 и 23011289, примерами которых являются маркеры, перечисленные в табл. 8, демонстрируют более или менее сильную ассоциацию с генотипом для причинного SNP в нуклеотидном положении 22999655 вследствие наличия дисбаланса связи в этой области. Соответственно, один или более чем один из этих маркеров, сам по себе или в комбинации, может быть использован для определения генотипа по локусу Gait, и, следовательно, также могут быть использованы в способах по настоящему изобретению.
Термин "образец" или "биологический образец" в соответствии с настоящим изобретением относится к любому материалу, включающему ядросодержащие клетки указанной тестируемой лошади. В предпочтительном воплощении биологический образец, используемый в способах по настоящему изобретению, выбран из группы, состоящей из крови, спермы, корней волос, молока, жидкостей организма, а также тканей, включающих ядросодержащие клетки.
Способы экстракции, выделения и очистки ДНК хорошо известны в области техники и могут быть применены в настоящем изобретении. Стандартные протоколы выделения геномной ДНК среди прочего приведены в Sambrook, J., Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, 1.31-1.38, 2001 и Sharma, R.C., et al. "A rapid procedure for isolation of RNA-free genomic DNA from mammalian cells", BioTechniques, 14. 176-178. 1993.
В соответствии с настоящим изобретением термин "SNP" относится к однонуклеотидному полиморфизму в конкретном положении в геноме лошади, которое варьирует в популяции индивидов. SNP могут быть идентифицированы по их расположению в раскрытой конкретной последовательности, т.е. в интервале от 22628976 до 23315071 п.о. на 23 хромосоме лошади или их названию, представленному в табл. 4, 5, 7 и 8. SNP, идентифицированные как полезные для прогнозирования способности лошади использовать различные аллюры в соответствии с настоящим изобретением, представлены в табл. 4, 5, 7 и 8. Например, SNP_BIEC2_620109 в табл. 5 указывает на то, что нуклеотидное основание (или аллель) в нуклеотидном положении 22967656 на 23 хромосоме референсной последовательности, на которую здесь ссылаются, может представлять собой цитозин (С) или тимидин (Т). Аллель, ассоциированная с или ука
зывающая на способность лошади использовать пять аллюров в случае SNP_BIEC2_620109 в табл. 5 представляет собой тимидин (Т).
Термин "определение в указанной ДНК аллели по меньшей мере одного генетического маркера" в соответствии с настоящим изобретением относится к способу определения или идентификации того, представлена ли конкретная нуклеотидная последовательность в образце ДНК.
Термин "идентификация в указанной ДНК нуклеотида в одном или более чем одном конкретном положении на 23 хромосоме лошади" относится к способу определения идентичности нуклеотида в указанном конкретном положении на 23 хромосоме лошади, т.е. определения того, представляет ли собой нуклеотид в указанном конкретном положении аденозин (А), цитозин (С), гуанозин (G) или тимидин (Т).
Существуют несколько способов, известных специалистам в данной области техники для определения того, представлена ли конкретная нуклеотидная последовательность в образце ДНК, и идентификации нуклеотида в конкретном положении в последовательности ДНК. Эти способы включают амплификацию сегмента ДНК, содержащего генетический маркер, при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) или любого другого способа амплификации, интеррогации генетического маркера при помощи аллель-специфической гибридизации, 3'-экзонуклеазного анализа (анализа Taqman), флуоресцентного красителя и анализа путем ПЦР, основанного на агенте-гасителе, путем использования аллель-специфических ферментов рестрикции (способы, основанные на RFLP), путем прямого секвенирования, оценки олигонуклеотидного лигирования (OLA), пиросеквенирования, анализа путем внедрения, мини-секвенирования, способов, основанных на DHPLC (денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография), одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCP), аллель-специфической ПЦР, электрофореза в геле с градиентом денатурирующего агента (DGGE), электрофореза в геле с градиентом температуры (TGGE), химического расщепления по некомплементарным участкам (CMC), системы, основанной на гетеродуплексном анализе, способов, основанных на масс-спектрометрии, анализа путем инвазивного расщепления, путем секвенирования с учетом индекса полиморфизма (PRS), микрочипов, анализа удлинения по механизму катящегося кольца, способов, основанных на HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография), анализов, основанных на удлинении, ARMS (амплификационная система для идентификации мутаций), ALEX (амплификационная система для идентификации мутаций с линейным удлинением), SBCE (однонуклеотидное удлинение цепи), анализов при помощи молекулярного маяка, проникновения (способов на основе трети волны), анализов путем реакции лигирования цепи, способов, основанных на 5'-нуклеазном анализе, электрофореза в капиллярном блоке с гибридизацией (САЕ), анализов путем усечения белка (РТТ), иммуноанализов и твердофазной гибридизации (дот-блот, обратный дот-блот, чипы). Подразумевается, что указанный перечень способов не является исключительным, а всего лишь иллюстрирует разнообразие доступных способов. Некоторые из этих способов могут быть осуществлены в соответствии со способами в настоящем изобретении в микрочиповом формате или на шариках.
Таким образом, изобретение также относится к применению праймеров или пар праймеров, где праймеры или пары праймеров гибридизуются в строгих условиях с ДНК, содержащей промежуток между нуклеотидными положениями 22628976 и 23315071, предпочтительно между положениями 22919878 и 23011289 п.о. на 23 хромосоме лошади, или с ее комплементарной цепью.
Предпочтительно праймеры или пары праймеров гибридизуются в строгих условиях с последовательностями SEQ ID NO: 1, 3 и 5-25.
Предпочтительно праймеры по изобретению имеют длину по меньшей мере 14 нуклеотидов, такую как 17 или 21 нуклеотид.
Конкретнее, праймеры могут быть выбраны из SEQ NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 31.
В одном из воплощений праймеры фактически связываются с положением SNP, как указано в табл. 4, 5, 7 и 8. Такой аллель-специфический олигонуклеотид по настоящему изобретению, как правило, представляет собой олигонуклеотид, имеющий длину по меньшей мере от 14 до 21 пары нуклеотидов, сконструированный для обнаружения различия в одном основании в генетической последовательности мишени тестируемой лошади. В соответствии с настоящим изобретением один или более чем один специфический праймер может быть применен для идентификации более чем одного упомянутого здесь SNP. Как следствие этого, когда связывание проводится в строгих условиях, тогда такой праймер или такие праймеры полезен(ны) для различия между отличающимися полиморфными вариантами, поскольку связывание происходит только тогда, когда последовательности праймера и мишени полностью комплементарны. Кроме того, дополнительно предпочтительно, чтобы праймеры имели максимальную длину 24 нуклеотида. Такие праймеры могут сопровождаться с подходящим способом обнаружения, таким как реакция удлинения или реакция амплификации, которые могут быть использованы для того, чтобы различать полиморфные варианты и затем делать выводы в отношении способности лошади использовать различные аллюры.
Гибридизацию предпочтительно осуществляют в строгих или очень строгих условиях. "Строгие или очень строгие условия" гибридизации хорошо известны специалистам в данной области техники или могут быть определены специалистами в данной области техники в соответствии с обычными протоко
лами. Подходящие строгие условия для каждой последовательности могут быть установлены на основе хорошо известных параметров, таких как температура, состав молекул нуклеиновой кислоты, солевые условия и т.д.; см., например, Sambrook et al. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989 или Higgins and Hames (eds.), "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford 1985, см., в частности, раздел "Hybridization Strategy" by Britten & Davidson. Стандартные (очень строгие) условия включают гибридизацию при 65°С в 0,5xSSC и 0,1% SDS (додецилсульфат натрия) или гибридизацию при 42°С в 50% формамиде, 4xSSC и 0,1% SDS. За гибридизацией обычно следует отмывание для удаления неспецифических сигналов. Условия отмывания включают условия, такие как 65°C, 0,2xSSC и 0,1% SDS, или 2xSSC и 0,1% SDS, или 0,3xSSC и 0,1% SDS при 25-65°С.
Термин "нуклеотидные положения 22628976 и 23315071 п.о. на 23 хромосоме лошади" и другие похожие обозначенные нуклеотидные положения относятся к референсной последовательности лошади в соответствии с Sep. 2007 Equus caballus draft assembly EquCab2 (UCSC version equCab2). EquCab2 получен в The Broad Institute. EquCab2 доступен в геномном браузере www.genome.ucsc.edu.
Примеры
Осуществляли полногеномный скрининг генов, влияющих на стиль передвижения, с использованием чипа SNP лошади, включая анализ 54602 однонуклеотидных полиморфизмов в геноме лошади (Illu-mina EquineSNP50 BeadChip; http://www. illumina.com/products/equine_snp50_whole_genome_genoty-ping_kits.ilm n). В анализе использовали популяционный материал, включающий 70 исландских лошадей, среди которых 30 классифицировали как четырехаллюрные и 40 классифицировали как пятиаллюрные, т.е. только последние обладали документированной возможностью шагать.
Животный материал. Образцы крови отбирали у 70 исландских лошадей из Швеции. Геномную ДНК получали для всех лошадей с использованием QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen). Владельцев лошадей просили классифицировать своих лошадей как четырехаллюрных или пятиаллюрных. Образцы волос собирали у 61 шведской стандартбред лошади и 2 шведских северных рысаков. ДНК из шести корней волос экстрагировали путем добавления 97 мкл раствора Chelex и 7 мкл протеиназы K и инкубировали при 56°С в течение 60 мин с последующей инкубацией при 95°С в течение 10 мин.
Полногеномный анализ (GWA). GWA осуществляли с использованием Illumina EquineSNP50 Bead-Chip (http://www. illumina.com/products/equine_snp50_whole_genome_genotyping_kits.ilmn). Статистический анализ осуществляли с использованием программного обеспечения PLINK (Purcell el al. 2007. PUNK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am. J. Hum. Genet.
81:559-575).
Секвенирование ДНК. Множество кодирующих и некодирующих областей, расположенных между фланкирующими SNP по нуклеотидным положениям 22628976 и 23315071 п.о. на 23 хромосоме лошади, амплифицировали при помощи ПЦР и секвенировали для идентификации полиморфизмов последовательностей. Все праймеры, используемые для этих экспериментов, перечислены в табл. 2. Ампликоны амплифицировали в стандартных условиях ПЦР и (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems, Foster City, CA). Стандартное секвенирование по Сэнгеру осуществляли с использованием капиллярного секвенато-ра АВ3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Праймеры, используемые для амплификации путем ПЦР и секвенирования выбранных областей у лошадей
Ампликон
Амплифицируемая область Нуклеотидные положения
Прямой праймер
Обратный праймер
ANKRD15exon1.1
clir23:22792627-22793280
TCATACCAGCTTGCCACACT
GAGGAGAGAGAGCTC GTGGA
ANKRD15exon1.2
clir23:22793162-22793792
CTAATGGAGACCCGCAGAA G
GCCGGAACTCCTTTA TCCTC
ANKRD15exon1.3
clir23:22793704-22794386
GAGAAGTGGCGGGGAATTA T
GCCCCACGACTTTAT TCTCA
ANKRD15exon1.4
Clir23:22794261-22794946
TGCAGACGAGAGACCAAAT G
AAACCCAGAAGTGCC TGAGA
ANKRD15exon1.5
Chr23:22794844-22795453
GCGGACAGTGGCTATAGGA G
AATACATTGTCCCCAC CCTTC
ANKRD15exon2
Chr23:22807940-22808575
ATGGGATTTGAGCTGAGTGG
AAGCCTGATGCTGAG AAGGA
ANKRD 15exor)3
Clir23:22809005-22809616
TTGCATGCACACAATTTTCC
CTGGGGGTTTCTGAG TTCTG
ANKRD 15exor)4
Clir23:22810246-22810904
GCAACCCAGGTTATCCCTTT
TCACCTTCTGCACTTG CATT
ANKRD15exon5
clir23:22812005-22812621
AAGTCGACTGAGGGGCTCTT
ACCTTGGCCCAGATA GGTTT
ANKRD 15exori6
dir23:22815102-
TCCCCAGGAACATACAGCTC
TGGAAAG
22815741
GATTTGAGGATGC
ANKRD15exon7
ch [23:2281775522818429
GCTTCTGGCCTCACGAAATA
TGGCATGAAGACAC CACAAT
ANKRD15exotl8
ch [23:2281865322819254
AGCCCCAGTACAGACCACA
GGGAAGTCGCCTACA CTGAA
ANKRD15exotl9
ch [23:2282073922821346
GAGGATCCGTGGGATACAG
AGCAAGTCTCCTGAG CAAGC
ANKRD15exon10
ch [23:2282162622822233
CAGAGGACACATCTGCCTGA
CAAAACCATCCTGGA AATGG
ANKRD GAP
Chr23:22836558-22837273
GTCCATCCCCTTCTCTCCTC
TGTCAGCTGCAGAAT GGAAG
PRIMER DS7
Chr23:22851938-22852292
AGACTGGCCCTGAGCTAACA
CTGAAGGTGCCCTCT ACAGC
PRIMER DS5
Chr23:22868140-22868803
TTACCTGCCCCTTTGTTTTG
CATCTTTGCCCCTCA GACTC
PRIMER DS2
Chr23:22869516-22870124
TTACGTGGCACCCCTACTTC
AGCCTGGACTCTGTC CTTGA
PRIMER DS1
ch [23:2287269922873368
TGCTGCCCTCTGTCTATGTG
AAAGTAACGATGCGG TGGAC
PRIMER DS4
ch r23:22874773-22875445
AAATGGCTGTGCCGTTTTAC
CTGTGTGACCAAGCT CTCCA
PRIMER DS3
ch [23:2287608422876784
GAAAATGCTGACGTGCTGAA
CTTGCTGC CTTTTGC CTATC
PRIMER DS6
ch [23:2287656322877255
GCAGAGCGACCTG GAGATAG
GGCCTTAGAGGGACA CATGA
BIETOP-620109B 3
ch [23:2296726922967902
CCTCTCACCCAGACACCATT
AGTTGGCAAACAACA GGACA
BIETQP-620109D2
ch [23:2296752522968019
AAGTCCTTTCTTGGGGGCTA
GGTCCATCGTTGACC AAAAT
BIETOP-620109C2
ch [23:2296752622968041
AGTCCTTTCTTGGGGGCTAA
ACGGCACCACCATCA TCTAT
DMRT3exonO
ch [23:2298588422986463
GCCCCAACTTAAGACCCTCT
CCGCGCTGCTTAGGA GTC
DMRT3exonOB
ch [-23:2298588422987295
GCCCCAACTTAAGACCCTCT
TACCTGGCTTGTCGA GCTG
DMRT3GAP
ch [-23:2298641322987358
GAGCACGCTCAGACCCTATC
AAAGAGCTCCGAAGT TTTTGC
DMRT3exon2.1
Chr23:22999117-22999797
CTCCTTCCAAGAAGCCTGTG
AGAGTCTGCGGAAAA CCTCA
DMRT3exon2.2
DMRT3exon2.3
DMRT2exon2GAP
DMRT2exon4.1
DMRT2exon4.2
DMRT2exon4.3
Chr23:22999709-
23000396 Chr23:23000251-
23001049 Chr23:23009567-
23010210 Chr23:23027620-
23028300 Chr23:23043139-
23048767 Chr23:23055803-
23056469 Chr23:23056534-
23057237 Chr23:23057214-
23057971 Chr23:23057214-
23057971 Chr23:23059113-
23059736 Chr23:23061639-
23062293 Chr23:23062130-
23062788 Chr23:23062686-
23063285 Chr23:23067103-
23067766 Chr23:23069404-
23070095 Chr23:23076510-
23077194 Chr23:23080154-
23030320 Chr23:23085336-
23086005
CCTTGAGCTCATACCCCATC
GAGAGGCCTCGTCCTGTGT 1
ACTAAAG CCGCAGAGCAGAG ' ITCCCACTCACATTTCC CAAT
TCATTCCACCAGCAATGTGT
" CTGTTGTCCCAGCCCTGTAT
GAGCCCGAGCG G ATAATACT " GCGGCTAGGGTGGTACTTC
" GAGGACGACGAGGACGAG
~ GAGGACGACGAGGACGAG
~ CTGGGGTGACTCTAGCAAG
- CCCCCIAGGG
AACTATTTT ~TTCAGGGTCTGGGAATATGG
~ GGCCCCTAAGAAACACAGA
~ GGTCCAAATTGTAGGGCTGA
|CAAGGGCATGAGGAGTGTTTj ACTCCATGATTGCAC AACGA
GGCCACTG CAGAAGAAAGAG AGGTGAGTCCAGGCT
AGCAA IATTAGGACCGCACAG
GACAC CTCGTCCTCGTCCTC GTC
CCACTTTCAAGGCCT
CTCTG CCACTTTCAAGGCCT
CTCTG TCACACCAAGGCAAA
TTTCA IGAACTGAGGTGGTGG
CATTT ITCCAACTTGTTTGGCT
ACGA CCTGTAGACCCCAGA
GACCA TTCCCCAGGAGGTTC TCTTT
ICCAGATCAAGGGGAATGCTAICAAGGCAGACCAATC
CAAAGTAAGCATCCCCAGGA
TGGAAATTTTGGGCTGTTTC
GCAGCACCTCTTTCC
GCTGCTGGAGACCAGAAAA
TCATC ITTTCTCCAGGGAATTT
GTGC CGAAGGGCACCTATT CAAAA
Глубокое геномное ресеквенирование. Образцы ДНК двух исландских лошадей, одной самки, представляющей собой мутантную гомозиготу по DMRT3, и одного самца в качестве контроля (гомозигота дикого типа) готовили для секвенирования. Библиотеки "парных концов" Illumina готовили из этих образцов ДНК (средний размер вставки приблизительно 220 оснований). Секвенировали две библиотеки (2x100 п.о.) на семи и пяти каналах соответственно, с использованием аппарата Illumina HiSeq. Прочтения картировали на геноме лошади (референсная сборка EquCab2) с использованием программы BWA и дубликаты ПЦР удаляли с использованием программы Picard (http://picard.sourceforge.net). Среднее покрытие прочтения, полученное для каждого образца, составляло приблизительно 30x.SNP и небольшие вставки/делеции определяли на основе данных картирования после проведения повторного выравнивания для реконструкции вокруг вставок/делеций и затем вариант определяли с использованием Genome Analysis Toolkit (GATK). Варианты подвергали фильтрации через рекомендуемые фильтры VariantFiltra-tionWalker в отношении SNP, перечисленных в GATK wiki page (http://www.broadinstitute.org/gsa/wiki/in-dex.php/The_Genome_Analysis_Toolkit), и выравнивания прочтений перекрывающихся SNP и встав-ки/делеции, определенные в 438 п.о. локуса Gait, затем вручную просматривали для удаления очевидных артефактов. Покрытия прочтений, обнаруженные для окон в одну тысячу п.о., использовали для определения кандидатов дупликаций в минимальной области IBD (идентичность по происхождению), и картирующие расстояния и ориентации между парными прочтениями использовали для обнаружения структурных вариаций по сравнению с референсной сборкой. Программное обеспечение ANNOVAR использовали для аннотирования SNP в отношении к генам Ensembl.
Анализ SNP с использованием анализа TaqMan assays. Анализы TaqMan разработаны для отбора SNP на хромосоме 23, нуклеотидном положении 22967656 (BIEC2 620109; SNP, включенный в панель Illumina SNP, демонстрирующий самую сильную ассоциацию с фенотипом) и в нуклеотидном положении 22999655 (DMRT3.3; SNP, приводящий к появлению преждевременного стоп-кодон в экзоне 2 DMRT3). Специально адаптированные панели для анализов генотипирования TaqMan SNP (Applied Bio-systems, Foster City, CA), разработанные для этих двух SNP, обобщены в табл. 3. Конструкции зонда и праймера получены с интернет-страницы Applied Biosystems (http://www5.appliedbiosys-tems.com/tools/cadt/) с использованием возможности заказать специально адаптированные панели для генотипирования. Для анализа использовали систему для обнаружения последовательности ABI PRISM 7900 НТ в 384-луночном формате (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Полногеномный анализ выявил локус на 23 хромосоме лошади, контролирующий стиль передвижения. Статистический анализ данных для чипа SNP, полученных для 70 исландских лошадей с феноти-пической классификацией как четырехаллюрные или пятиаллюрные, осуществляли с использованием PLINK; 39695 SNP прошли контроль качества. Тест хи-квадрат осуществляли для каждого маркера по отдельности для определения значимого различия в частотах генотипа между четырехаллюрными и пя-тиаллюрными лошадьми. Использовали генетическую модель, предполагающую рецессивный механизм наследования. Десять тысяч перестановок использовали для корректирования множественного тестирования. Статистический анализ выявил высокозначимую ассоциацию между SNP (BIEC2_620109, SEQ ID NO: 5) в нуклеотидном положении 22967656 п.о. на 23 хромосоме лошади и фенотипом, определяющую способность к аллюру (Р=0,0002, полногеномная значимость; фиг. 1). Два SNP, непосредственно фланкирующих высокоассоциированные SNP, расположены по нуклеотидным положениям 22628976 (BIEC2 619907, SEQ ID NO: 6) и 23315071 (BIEC2-620244, SEQ ID NO: 7), и они продемонстрировали лишь слабые ассоциации с фенотипом (Р=0,01 для SNP в положении 22628976 п.о. и Р=0,32 для SNP в положении 23315071 п.о.). Этот результат продемонстрировал, что один или более чем один полиморфизм последовательности, контролирующий стиль передвижения, расположен по соседству от SNP в положении 22967656 п.о. (в наибольшей степени ассоциированные SNP) и в пределах интервала, определенного фланкирующими маркерами в положениях 22628976 и 23315071 п.о., и демонстрирующих значимо более слабую ассоциацию с фенотипом, определяющим способность к аллюру. Указанная область простирается на 686 тысяч пар оснований и пять генов располагаются в интервале ANKRD15, DMRT1, DMRT3, DMRT2 и GTF2A2 (фиг. 2). Этот локус назван как локус Gait, и результаты согласовывались с рецессивным наследованием аллели, ассоциированной со способностью шагать, тогда как аллель дикого типа (Non-pace) по этому локусу была доминантной.
Ресеквенирование выбранных областей уточняет локализацию локуса Gait. Множество ампликонов (табл. 2) из геномной области, несущей локус Gait, определенных при полногеномном обзоре (с нуклео-тидного положения 22628976 до положения 23315071 на хромосоме 23), ресеквенировали у небольшой группы четырехаллюрных и пятиаллюрных лошадей для уточнения локализации локуса Gait. Все полиморфизмы последовательностей, обнаруженные в этом анализе, обобщены в табл. 4. Результаты демонстрируют, что существует отдельный гаплотип, ассоциированный с рецессивной аллелью gait, и что гап-лотипный блок, демонстрирующий полную ассоциацию с gait в этой породе, прерывается в нуклеотид-ном положении 22877015 непосредственно выше гена DMRT1. Эти результаты уточняют локализацию локуса Gait в интервале от нуклеотидного положения 22877015 п.о. до положения 23315071 п.о.; ANKRD 15 расположен за пределами критического для Gait интервала.
Нонсенс-мутация, располагающаяся в экзоне 2 DMRT3, демонстрирует полную согласованность со способностью к иноходи.
Критический интервал для локуса Gait содержит четыре гена DMRT1, DMRT2, DMRT3 и GTF2A2. Гены DMRT относятся к семейству транскрипционных факторов, которые содержат ДНК-связывающий домен DM типа цинковых пальцев (Murphy el al. 2007. Vertebrate DM domain proteins bind similar DNA sequences and can heterodimerize on DNA. BMC Mol. Biol. 8:58). Авторы изобретения секвенировали большую часть экзонов DMRT в этой области и идентифицировали небольшое количество полиморфизмов последовательностей (табл. 4). Один из них (DMRT3.3), расположенный в экзоне 2 DMRT3 в нук-леотидном положении 22999655, вызывал нонсенс-мутацию в аллели, ассоциированной со способностью к иноходи (фиг. 3). Таким образом, предсказали, что аллель gait кодирует усеченную форму белка DMRT3 (SEQ ID NO: 4), лишенную последних 174 аминокислот, уменьшающую общий размер белка с 474 до 300 аминокислот. Полноразмерный DMRT3 дикого типа лошади представлен как SEQ ID NO: 2. Выравнивание части белка DMRT3, включающей мутантное аминокислотное положение 301 (серии) у лошадей, демонстрирует, что этот белок является высококонсервативным у позвоночных животных, включая виды рыб, птиц и млекопитающих (фиг. 4).
Анализы TaqMan разработаны для полиморфизмов по нуклеотидному положению 22967656 (наиболее значимо ассоциированых SNP в анализе GWA) и по положению 22999655 (мутация в DMRT3 формирует преждевременный стоп-кодон). Их использовали для скрининга всех 70 исландских лошадей, включенных в данное исследование. Оба SNP демонстрировали полную ассоциацию между гомозигот-ностью для нереференсной аллели по обоим локусам и фенотипом (табл. 5), статистическая поддержка для ассоциации преодолена (Р=6,73x10-10 для обоих SNP, точный критерий Фишера). Результаты свидетельствуют о том, что существует очень сильная несбалансированность связи между этими двумя SNP в исследуемой популяции, причем два SNP расположены друг от друга на расстоянии 32 тысячи пар оснований. Девять животных, которых классифицировали как четырехаллюрные, были гомозиготными по гаплотипу, ассоциированному с аллелью gait (табл. 5). Эти животные либо были ошибочно классифицированы своими хозяевами, что вполне возможно, или фенотип Gait демонстрирует неполное проявление вследствие взаимодействия с факторами окружающей среды (например, тренировка) или другими неиз
вестными генетическими факторами.
Авторы изобретения тестировали 2 северошведских рысака и 61 шведскую стандартбред лошадь (обе породы используют для рысистых бегов в Швеции) для изучения того, представлена ли аллель gait у других пород лошадей. Авторы изобретения обнаружили, что 2 северошведских рысака и 59 шведских стандартбред лошадей были гомозиготными в отношении DMRT3 нонсенс-мутации в нуклеотидном положении 22999655 на 23 хромосоме лошади, тогда как оставшиеся 2 стандартбред лошади были гетерозиготными по А/С. Высокая частота указанной аллели у этих пород в значительной степени свидетельствует о том, что мутация обладает благоприятным действием на способность бежать рысью с высокой скоростью. Действительно, две лошади, идентифицированные как гетерозиготные по аллели gait, также рассматривались как плохие рысаки. Авторы изобретения предполагают, что аллель gait присутствует с высокой частотой у большинства, если не всех, дрессируемых на аллюры пород лошадей, а также лошадей, используемых для рысистых бегов.
Таблица 5
Высокозначимая ассоциация между SNP в нуклеотидных положениях 22967656 (BIEC2-620109) и 22999655 (DMRT3.3) на 23 хромосоме лошади относительно фенотипической классификации исландских лошадей как четырехаллюрных или пятиаллюрных. Статистику рассчитывали с использованием точного критерия Фишера, причем аллель Gait была рецессивной. OR - отношение шансов
Таблица 6
Последовательности SNP
SEQ ID NO
Последовательность
SNP
Положение
SEQ ID NO: 5
rTGTTGGGGTCTTATGCAAAGTGCAGAAATAGTCT rTTGGAAAAACGTAC[C/T]GTTTGCACTATTTTCTT ATTTCTATTCACCCTTAATCTGAACCATTCCAA
BIEC2_620109
22 967 656
SEQ ID NO: 6
AGAAATGATATATAAAAATTACGAATGCCTCTTAG ACAGAATCCTTATGT[A/G]TGGCACAGAAGTATTTA GTTCGCTTAACAGATATTGAGTGCTTATATGAG
BIEC2-619907
22 628 976
SEQ ID NO: 7
CTCTTCCTTGCATCCTATCCCCCTAGTGTCGCAAG GGAAGTTGTGAGAGA[C/T1GAGCTTGTAGATCTGC rCTAGAAAATAGGCCTGTTTTCTTAAGAAACCGT
BIEC2-620244
23 315 071
SEQ ID NO: 8
CAGAGTGCCGGTCTGTGGCTGTGGGCGCTGACG AGCACATGGACAACATT[G/C]TCGTGTACCACAGG GGCTCCAGGTCCTGTAAGGATGCTGCTGTGGGG АСА
ANKRD15.1
22 793 939
SEQ ID NO: 9
AGAACTCATTCAAAACCACCAGGCTTACTAGGCTT rTTTAAATAGACTTG[A/G]CTTTGAACTTCTAAGTG CAGGATCTAAAACCACTGGCGAAATTTCTGGAA
ANKRD15.2
22 810 322
SEQ ID N0: 10
rTACCTGCATGCCTCTCCCCCTAAACCATTTCTAG CATGTGTGGGCAGAG[T/G]GGGCATCGTGCTGCC CTGCTCACTGGATCACTCTGGGAACGTTTCCTTCA
ANKRD15.3
22 812 345
SEQ ID NO: 11
AAGGATATGGTGAGTCTGACCTACAGACACTGTC CCCGGTCTGTACAAAG[T/C]GCCCAAGTGGTGACA AAGCATCCCTCGCCTGCCCCCTGAGCTGTTACCT G
ANKRD15.4
22 812 251
SEQ ID NO:
AACGCCAAAGCCAGCCAGGTGACTGCGCTTGCTT CCTGGGCTCATGCTCA[C/T]ACTGCTGTGACCCGC ACAGGTGCCCACGCCACACTTCCCACCGCTCGG CA
ANKRD15.5
22 818 132
SEQ ID NO: 13
GCTTGCTTCCTGGGCTCATGCTCACACTGCTGTG ACCCGCACAGGTGCCC[A/G]CGCCACACTTCCCA CCGCTCGGCACTCACTCATGGCCCAGCCCCGAG ГСС
ANKRD15.6
22 818 158
SEQ ID NO: 14
ACTGAATGTATACATTTTGTGCCTGAACTCACCAG CAAACAGAAGGCAGA[A/C]AACCAAGGGTTGAAG GCTGGAGCTGTCACAGTAGAAGTTGAGCCAGCAG
ANKRD157
22 821 872
SEQ ID NO:
CATTTTGTGCCTGAACTCACCAGCAAACAGAAGG CAGAAAACCAAGGGTT[G/C]AAGGCTGGAGCTGT CACAGTAGAAGTTGAGCCAGCAGGAATTTGCTGG CC
ANKRD15.8
22 821 884
SEQ ID NO:
TCACTCTAATCAAGTTGCTATCACCATTCACACAA TTGTCCAGGATAGTA[C/T1TGGGACCCCAGAAAGA TCACGCCGCTCCATTCCCATTTCCCACTTGTTCC
SNP.1
22 868 190
SEQ ID NO: 17
CTGGGCTGAAACAGGTGGTCCTGCTTTCCCCGCC TGCCTGGTCAGGCTGC[G/A]CTCTTCTCCCCTCCC CAGGCTTAAGTCACTTCATGCAGAACCCTTTATAC
SNP.2
22 868 678
SEQ ID NO: 18
CCAGCATTCTCCGCTTTCAACTTTCTCCCGCTCCT CCAATCCAAACTGGA[G;C]TTAGCATCAGCTACCC ACAATGATCAAGCATTTTCTGTGTGGCAGGCCTG
SNP.3
22 872 820
SEQ ID NO: 19
AGGCAAGAAGCGATAGGCAAAAGGCAGCAAGAG CTGGACCTGCAGATTTG[C/A]AAGTTCTCTGGAGC CAGTAGGTGGAAACCTCATCAGCAAATGAACGCA GG
SNP.4
22 876 848
SEQ ID N0: 20
CCACACTGAGAGTCTTATTTGCTGATAGAAATGCA GAGACTTCTCTTTTC[T/C]GAGGCTTTCAACCTCGT ACTTAATTCTCCTAAGTGAGAAAGAAACCACTC
SNP.5
22 877 015
SEQ ID NO: 21
ACCAGCGGGAGACTGAGGCTGCGAGCGCCGCAA AGACGGGTGCCGCATCT[C/T]TGGCCAGCCCGGA GCGCACGCGGCCGCCGGAGCTGCGGGACCAAG GACCG
DMRT3.1
22 986 593
SEQ ID NO: 22
CCGTCTCAGCCGCCGCCGCCGCAGCGTCCCGCC GCCGAGTTGGCTGCGGC[CrT]GCCGCGCTGCGCT GGGCCACCGAGCCGCAGCCCGGGGCGCTGCAG GCGCA
DMRT3.2
22 987 143
SEQ ID NO:
GGAGGTCCTCCTCTCCAGCCGCTCCTCGGCCTC GGCCGCCGACCGAACTT[C/A]GGCAGAGCCCGAG AGCCTCGTGTTGCCCTCCAACGGGCACATCTTTG AAC
DMRT3.3
22 999 655
SEQ ID NO: 24
CTCTCCAGCCGCTCCTCGGCCTCGGCCGCCGAC CGAACTTCGGCAGAGCC[C/G]GAGAGCCTCGTGT TGCCCTCCAACGGGCACATCTTTGAACACACCTT GAG
DMRT34
22 999 665
SEQ ID NO: 25
GGCCTGGCCCCTAGGGCATTGAAGGGCTGGGGA GAGTCACATGTACTCCC[A/T]CTGTGGCCTGAAGA CCTACCTGGAGGGAAACCAGCTTGCTTAGGGGG OCT
SNP.6
23 009 648
Варианты последовательности на 23 хромосоме лошади, демонстрирующие сильную генетическую ассоциацию с мутацией Gait у лошадей. Мутация Gait возникает на 23 хромосоме лошади в нуклеотидном положении 22999655 п.о. и указана ниже жирным курсивом
Тип
Расп оложение/последов ательность1
Координата (EquCab2)
Реф. аллель2
Бариантн, аллель(и)9
SNP
интронное
22919878
SNP
интронное
22920361
SNP
интронное
22920434
SNP
интронное
22920646
SNP
интронное
22920717
SNP
интронное
22921203
SNP
интронное
22922079
SNP
интронное
22922780
SNP
интронное
22923569
SNP
интронное
22924120
INDEL
интронное
22924142
SNP
интронное
22924299
SNP
интронное
22924380
SNP
интронное
22924407
SNP
интронное
22926098
ENP
интронное
22926188
SNP
интронное
22926872
SNP
интронное
22927387
ENP
интронное
22927607
SNP
интронное
22928220
SNP
интронное
22928537
SNP
интронное
22928587
SNP
интронное
22929137
SNP
интронное
22930011
SNP
интронное
22932024
SNP
интронное
22932695
SNP
интронное
22933218
SNP
интронное
22936034
SNP
интронное
22940759
SNP
интронное
22942423
SNP
интронное
22945643
SNP
интронное
22946599
SNP
интронное
22948774
SNP
интронное
22949055
SNP
интронное
22949108
SNP
интронное
22949240
SNP
интронное
22949710
SNP
интронное
22956848
SNP
интронное
22960132
SNP
интронное
22960528
SNP
интронное
22960710
SNP
интронное
22964042
INDEL
интронное
22965059
SNP
интронное
22967119
SNP
интронное
22967656
SNP
интронное
22967915
SNP
интронное
22968898
SNP
интронное
22973984
SNP
интронное
22974589
SNP
межгенное
22979124
SNP
межгенное
22980014
SNP
межгенное
22982879
IN DELS
межгенное
22984588
INDEL
межгенное
22985746
SNP
интронное
22988210
SNP
интронное
22988991
SNP
интронное
22993092
SNP
интронное
22994591
SNP
интронное
22999058
SNP
stopgain $NP
22999655
SNP
межгенное
23002606
INDEL
межгенное
23003956
SNP
межгенное
23008772
SNP
межгенное
23008789
SNP
межгенное
23009648
SNP
межгенное
23010164
SNP
межгенное
23011289
Расположение: указывает на то, где расположен SNP относительно генов Ensembl. В случаях перекрывания кодирующей последовательности указана предсказанная последовательность белка. Вставку гена осуществляли с использованием программного обеспечения ANNOVAR.
2Реф. аллель. Представляет собой референсную аллель в сборке генома лошади (EquCab2).
3Вариантн. аллель(и). Представляет собой вариант аллели в полиморфном положении, демонстрирующем очень сильную ассоциацию с мутацией Gait. Для полиморфизмов вставки по сравнению с рефе-ренсной сборкой (EquCab2) референсная аллель обозначена "-" и для делеций по сравнению с референс-ной сборкой вариантная аллель обозначена Лошадь с мутантной последовательностью гомозиготна по вариантной аллели по всем сайтам за исключением одного (см. сноску 4), представленного в этой таблице, если не указано иное в столбце "вариант аллель(и)".
4Этот SNP идентифицирован как гетерозиготный (AG) у мутантной лошади и гомозиготный для референсной аллели у контрольной лошади. G-аллель в этом SNP вероятно возникает после нонсенс-мутации DMRT3.
Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). Олигонуклеотид 5'~ggatccTCGAGAA CAATGTAACAATTTCGCCC-3' и его комплементарную последовательность отжигали в 10 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 50 мМ KCl сначала путем нагревания до 95°С в течение 2 мин и затем охлаждения до 25°С (2 мин/°). Дуплекс метили ДНК-полимеразой Кленова и [а-32P]-dCTP и очищали с использованием колонки Bio-Rad Micro Bio-Spin 30. DMRT3 дикого типа и му-тантный белок получали путем трансляции in vitro с использованием TNT Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega). EMSA осуществляли как указано в Culbertson & Leeds, 2003 (Looking at mRNA decay pathways through the window of molecular evolution. Curr. Opin. Genet. Dev. 13, 207-214) со следующими модификациями. Не добавляли плазмидную ДНК и использовали 1,0 мкл транслированного in vitro белка и 150x имеющего более низкую температуру гибридизации конкурента. Реакционную смесь инкубировали на льду в течение 20 мин, а затем добавляли радиоактивно меченый олигонуклеотид и затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Анализ на гелях проводили при 150 В при комнатной температуре. Обнаружено, что полноразмерный белок дикого типа и мутантный белок DMRT3 связываются с ранее определенным DMRT-связывающим мотивом (фиг. 6). Таким образом, мутация DMRT3 не приводит к измененной картине экспрессии и, по-видимому, мутантный белок сохраняет свою клеточную локализацию и профиль связывания ДНК. Таким образом, он может представлять
собой доминантную негативную форму с нормальной ДНК-связывающей функцией, но дефектным в отношении взаимодействия с другими белками. Последнее должно согласовываться с ясными фенотипи-ческими проявлениями, обнаруженными у гетерозигот. Тем не менее, мутация не полностью доминантна, поскольку СА гетерозиготы и АА гомозиготы демонстрируют явные фенотипические различия.
Выводы
Авторы изобретения представили исчерпывающее доказательство того, что мутация DMRT3_Ser301 STOP оказывает значительное действие на аллюры у лошадей. Предложенная авторами изобретения интерпретация фенотипических последствий этой мутации заключается в том, что гомози-готность по мутации требуется, но не достаточна для иноходи, поскольку множество стандартбредных рысаков и некоторые исландские лошади, которые являются гомозиготными мутантами, не демонстрируют иноходь. С другой стороны, гетерозиготность или гомозиготность по мутации дает возможность для осуществления различных четырехтактных вариантов аллюров типа медленной иноходи, причем генетические модификаторы могут быть уникальными для каждой дрессируемой на аллюры породы. Мутация дает возможность для аллюров типа медленная иноходь и иноходь и подавляет переход от рыси или иноходи к галопу, что объясняет ее высокую частоту у иноходцев и рысаков, используемых для рысистых бегов. Остается открытым вопрос о том, изменяет ли мутация судьбу нейронов DMRT3 или изменяет ли их транскрипционную регуляцию, но ясно, что эти нейроны должны играть ключевую роль для контрольного центра в спинном мозге, координирующего движения конечностей.
Все раскрытые и заявленные здесь композиции и/или способы могут быть получены и осуществлены без избыточного экспериментирования в свете настоящего описания изобретения. Хотя композиции и способы по изобретению описаны с точки зрения предпочтительных воплощений, специалисту в данной области техники понятно, что изменения могут быть внесены в отношении композиций и/или способов, и в отношении стадий или последовательности стадий описанного здесь способа, не отходя от концепции, сущности и объема изобретения. Конкретней, понятно, что некоторые агенты, которые близки химически и физиологически, могут быть заменены на описанные здесь агенты при достижении таких же или похожих результатов. Предполагается, что все такие похожие замены и модификации, понятные специалистам в данной области техники, находятся в пределах сущности, объема и концепции изобретения, определенных в формуле изобретения.
Перечень последовательностей
<110> Капилет Джинетикс АБ Андерссон Лиса с Андерссон Лейф Линдгрен Габриэпла
<120> способ прогнозирования стиля передвижения у лошадей
<130> Gate
<150> SE 1130034-0 <151> 2011-05-05
<150> US 61/514,749 <151> 2011-08-03
<160> 33
<170> Patentln версия 3.5
<210> 1
<211> 2196
<212> ДНК
<213> Equus cabal 1 us
<220>
<221> CDS
<222> (39)..(1463)
<400> 1
ccgccgccag cccgccagct cttccgggag ctcagggc atg aac ggc tac ggt tec 56
Met Asn Gly Tyr Gly ser
ccc tac ctg tac atg ggc ggc ccg gtg teg cag ccg ccg egg gcg ccc 104
Pro Tyr Leu Tyr Met GTy GTy Pro VaT ser Gin Pro Pro Arg Ala Pro
10 15 20
ttg cag cgc acg ccc aag tgc gcg cgc tgc cgc aac cac ggg gtg ctg 152
Leu Gin Arg Thr Pro Lys cys Ala Arg cys Arg Asn His GTy VaT Leu
25 30 35
tec tgg etc aag ggt cac aag cgc tac tgc cgc ttc aag gac tgc acc 200
ser Trp Leu Lys GTy His Lys Arg Tyr cys Arg Phe Lys Asp cys Thr
40 45 50
tgc gag aag tgc ate etc ate ate gag egg cag agg gtc atg gcg gcg 248
cys G"lu Lys cys He Leu He He Glu Arg Gin Arg VaT Met Ala Ala
55 60 65 70
cag gtg gcg ctg cgc egg cag caa get aac gag age etc gag age etc 296
Gin VaT Ala Leu Arg Arg Gin Gin Ala Asn Glu ser Leu Glu ser Leu
75 80 85
att ccc gac teg ctg cgt get ctg ccc ggc ccc ccg ccg ccg ggg gac 344
He Pro Asp ser Leu Arg Ala Leu Pro GTy Pro Pro Pro Pro Gly Asp
90 95 100
gec gec get gec gec ccg cag ccg ccg ccc acc teg cag ccg tct cag 392
Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gin Pro Pro Pro Thr ser Gin Pro ser Gin
105 110 115
ccg ccg ccg ccg cag cgt ccc gec gec gag ttg get gcg gec gee gcg 440
Pro Pro Pro Pro Gin Arg Pro Ala Ala Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ala
120 125 130
ctg cgc tgg gec acc gag ccg cag ccc ggg gcg ctg cag gcg cag etc 488
страница 1
Leu Arg Trp Ala Thr Glu Pro Gin Pro Gly Ala Leu Gin Ala Gin Leu
135 140 145 150
gac aag cca gat ttg act gag gag cga ctt ggg gac ggc age tec gca
Asp Lys Pro Asp Leu Thr Glu Glu Arg Leu Gly Asp Gly ser ser Ala
155 160 165
gac aac аса gag acc ttc age gac aaa gac acc gac cag agg age tec
Asp Asn Thr Glu Thr Phe ser Asp Lys Asp Thr Asp Gin Arg ser ser
170 175 180
cca gat gtg gtg aaa agt aag ggc tgc ttc acc ccg gag age ccc gag
Pro Asp VaT VaT Lys ser Lys Gly cys Phe Thr Pro Glu ser Pro Glu
185 190 195
gtc gtg tct gtg gat gaa ggc ggg tat gcg gtc cag aag aac gga ggc
Val VaT ser VaT Asp Glu Gly Gly Tyr Ala Val Gin Lys Asn Gly Gly
200 205 210
acc tec gag age cgc ccc gac agt ccc aag tac cac ggg gaa cag aat
Thr Ser Glu Ser Arg Pro Asp ser Pro Lys Tyr His GTy Glu Gin Asn
215 220 225 230
cac etc ctg ate gag ggc ccc teg ggg acc gtt tct ctg ccc ttc age
His Leu Leu lie Glu Gly Pro ser Gly Thr Val ser Leu Pro Phe ser
235 240 245
ttg aaa gee aac aga ccg ccc ctg gaa gtg tta aaa aaa ate ttc ccc Leu Lys Ala Asn Arg Pro Pro Leu Glu VaT Leu Lys Lys lie Phe Pro
aac cag aag ccc acg gtg ctg gag etc ate ctg aag ggc tgt ggg ggc
Asn Gin Lys Pro Thr VaT Leu Glu Leu He Leu Lys GTy cys GTy GTy
265 270 275
gac ctg gtg age gec gtg gag gtc etc etc tec age cgc tec teg gec
Asp Leu VaT Ser Ala VaT Glu Val Leu Leu ser ser Arg ser ser Ala
teg gec gee gac cga act teg gca gag ccc gag age etc gtg ttg ccc
Ser Ala Ala Asp Arg Thr ser Ala Glu Pro Glu ser Leu VaT Leu Pro
295 300 305 310
tec aac ggg cac ate ttt gaa cac acc ttg age tea tac ccc ate tec
ser Asn GTy His lie Phe Glu His Thr Leu ser ser Tyr Pro lie ser
315 320 325
agg ttt tec gca gac tct agt aac gtt gtc ccc aac ccc ttg gec gtg
Arg Phe ser Ala Asp ser ser Asn Val Val Pro Asn Pro Leu Ala VaT
345 350 355
ccc ctg cag cat cct ttc ccc cag ccg ccc egg tac cct ctg atg ctg
Pro Leu Gin His Pro Phe Pro Gin Pro Pro Arg Tyr Pro Leu Met Leu
360 365 370
agg aat act ttg gca aga aac cag teg age ccc ttc ctg ccc aat gat
Arg Asn Thr Leu Ala Arg Asn Gin ser ser Pro Phe Leu Pro Asn Asp
375 380 385 390
gtc acc ctg tgg aac acc atg acg ctg cag cag cag tac cag ctg agg
Val Thr Leu Trp Asn Thr Met Thr Leu Gin Gin Gin Tyr Gin Leu Arg
395 400 405
tec cag tac gtc age cct ttc ccc ggg age teg ccc age gtc ttc aga Ser Gin Tyr Val Ser Pro Phe Pro GTy Ser Ser Pro Ser Val Phe Arg Страница 2
age teg cct gtc ctt ccc acg cgc gec ccc gaa gac cct egg ate tec
Ser Ser Pro Val Leu Pro Thr Arg Ala Pro Glu Asp Pro Arg lie Ser
425 430 435
ate cct gac gat ggg tgt ccg att gtg tea aag cag tct ctt tac acc
lie Pro Asp Asp GTy Cys Pro lie VaT Ser Lys Gin Ser Leu Tyr Thr
440 445 450
gag gat gac tat gac gag agg tec gac tec tea gac tct aga ata etc
Glu Asp Asp Tyr Asp Glu Arg Ser Asp Ser Ser Asp Ser Arg lie Leu
455 460 465 470
gcatttgaac
tctgaccccc
tgccctcccc
aggagaggee
tcgtcctgtg
tatacccttt
1563
ccttctgttt
gacaaagtga
ctgtgcttga
ttctatacct
tagcaataaa
aacataactt
1623
atttaatttc
ttgeacttea
ctggaaaatg
ccaaatagct
ctgctctgcg
gctttagtgc
1683
tgaatgttta
ttgtaaaaga
gagtctaatg
ctaagaatag
tcttgggaaa
gctgggtcca
1743
eggaagattt
atttggggat
ggaaagctga
aggtcagect
tgctcctaaa
ctcaacctgg
1803
aatgttcaat
aaaatagtat
acttgaatgc
agttttgtaa
aaaaggattc
ctcaggatat
1863
ttgaaaccta
aaggaagtgg
tttggttgca
aatggaccag
aaacagggac
attatattct
1923
taggctaaaa
accttgeatt
taaaagagag
actgeactta
agaatagagt
gaactgetea
1983
catgettatt
taagcttgga
cagttttcag
agacaaattc
cattaagaat
tattcttttc
2043
acatgaccga
atcgaaacat
gtgtaatgtc
aatgtaaaac
caatcacagc
tgtgaactgc
2103
atgaaatgta
ttgtgaaatg
aacacaagat
taagctttgt
caggttaatg
tagcatgeta
2163
aggactctag
aaaaaaataa
actaaggaga
tga
2196
<210> 2 <211> 474 <212> ПРТ
<213> Equus cabal!us <400> 2
Met Asn Gly Tyr Gly ser Pro Tyr Leu Tyr Met Gly Gly Pro Val ser
15 10 15
Gin Pro Pro Arg Ala Pro Leu Gin Arg Thr Pro Lys cys Ala Arg cys
20 25 30
Arg Asn His Gly Val Leu ser Trp Leu Lys Gly His Lys Arg Tyr cys
35 40 45
Arg Phe Lys Asp cys Thr cys Glu Lys cys lie Leu lie He Glu Arg
50 55 60
Gin Arg Val Met Ala Ala Gin Val Ala Leu Arg Arg Gin Gin Ala Asn
65 70 75 80
Страница 3
gec gec get gec gec ccg cag ccg ccg ccc acc teg cag ccg tct cag
Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gin Pro Pro Pro Thr ser Gin Pro ser Gin
105 110 115
ccg ccg ccg ccg cag cgt ccc gec gee gag ttg get gcg gec gee gcg
Pro Pro Pro Pro Gin Arg Pro Ala Ala Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ala
120 125 130
ctg cgc tgg gec acc gag ccg cag ccc ggg gcg ctg cag gcg cag etc
Leu Arg Trp Ala Thr Glu Pro Gin Pro Gly Ala Leu Gin Ala Gin Leu
135 140 145 150
gac aag cca gat ttg act gag gag cga ctt ggg gac ggc age tec gca
Asp Lys Pro Asp Leu Thr Glu Glu Arg Leu Gly Asp Gly ser ser Ala
155 160 165
gac aac аса gag acc ttc age gac aaa gac acc gac cag agg age tec
Asp Asn Thr Glu Thr Phe ser Asp Lys Asp Thr Asp Gin Arg ser ser
170 175 180
gtc gtg tct gtg gat gaa ggc ggg tat gcg gtc cag aag aac gga ggc
Val Val ser Val Asp Glu Gly Gly Tyr Ala Val Gin Lys Asn Gly Gly
200 205 210
acc tec gag age cgc ccc gac agt ccc aag tac cac ggg gaa cag aat
Thr Ser Glu Ser Arg Pro Asp Ser Pro Lys Tyr His Gly Glu Gin Asn
215 220 225 230
cac etc ctg ate gag ggc ccc teg ggg acc gtt tct ctg ccc ttc age
His Leu Leu He Glu Gly Pro ser Gly Thr Val ser Leu Pro Phe ser
235 240 245
ttg aaa gec aac aga ccg ccc ctg gaa gtg tta aaa aaa ate ttc ccc
Leu Lys Ala Asn Arg Pro Pro Leu Glu Val Leu Lys Lys He Phe Pro
250 255 260
aac cag aag ccc acg gtg ctg gag etc ate ctg aag ggc tgt ggg ggc
Asn Gin Lys Pro Thr Val Leu Glu Leu He Leu Lys Gly cys Gly Gly
265 270 275
gac ctg gtg age gec gtg gag gtc etc etc tec age cgc tec teg gee Asp Leu Val ser Ala val Glu Val Leu Leu ser ser Arg ser ser Ala
280 285 290
teg gec gee gac cga act tag gcagagcccg agagectegt gttgccctcc ser Ala Ala Asp Arg Thr 295 300
aacgggcaca tctttgaaca caccttgagc tcatacccca tctcctcttc caaatggtcc
gtgggatcgg ccttcagggt cccagacacg ttgaggtttt ccgcagactc tagtaaegtt
gtccccaacc ccttggccgt gcccctgcag catcctttcc cccagccgcc ccggtaccct
ctgatgctga ggaatacttt ggcaagaaac cagtcgagcc ccttcctgcc caatgatgtc
accctgtgga acaccatgac getgeagcag cagtaccagc tgaggtccca gtaegtcage
cctttccccg ggagctcgcc cagcgtcttc agaagctege ctgtccttcc cacgcgcgcc
cccgaagacc ctcggatctc catccctgac gatgggtgtc cgattgtgtc aaagcagtct
ctttacaccg aggatgacta tgacgagagg tccgactcct cagactctag aatactcaac страница б
acatcatctt
aaagtggtac
cgggtggctg
gtgaccaggt
gacattttct
gtgcatttga
1511
actctgaccc
cctgccctcc
ccaggagagg
cctcgtcctg
tgtataccct
ttccttctgt
1571
ttgacaaagt
gactgtgctt
gattctatac
cttagcaata
aaaacataac
ttatttaatt
1631
tettgeaett
cactggaaaa
tgecaaatag
ctctgctctg
eggctttagt
gctgaatgtt
1691
tattgtaaaa
gagagtctaa
tgctaagaat
agtcttggga
aagctgggtc
caeggaagat
1751
ttatttgggg
atggaaagct
gaaggtсage
cttgctccta
aactcaacct
ggaatgttca
1811
ataaaatagt
atacttgaat
gcagttttgt
aaaaaaggat
tcctcaggat
atttgaaacc
1871
taaaggaagt
ggtttggttg
caaatggacc
agaaacaggg
acattatatt
cttaggctaa
1931
aaaccttgea tttaaaagag
agactgeact
taagaataga
gtgaactget
cacatgetta
1991
tttaagcttg
gacagttttc
agagacaaat
tccattaaga
attattcttt
tcacatgacc
2051
gaatcgaaac
atgtgtaatg
tcaatgtaaa
accaatcaca
gctgtgaact
gcatgaaatg
2111
tattgtgaaa tgaacacaag
attaagcttt
gtcaggttaa tgtagcatgc
taaggactct
2171
agaaaaaaat
aaactaagga
gatga
2196
<210> 4 <211> 300 <212> ПРТ
<213> Equus caballus <400> 4
Met Asn Gly Tyr Gly Ser pro Tyr Leu Tyr Met Gly Gly pro val ser
Gin Pro Pro Arg Ala pro Leu Gin Arg Thr pro Lys cys Ala Arg cys
20 25 30
Arg Asn His Gly val Leu ser Trp Leu Lys Gly His Lys Arg Tyr cys
35 40 45
Arg phe Lys Asp cys Thr cys Glu Lys cys lie Leu lie lie Glu Arg
50 55 60
Gin Arg val Met Ala Ala Gin val Ala Leu Arg Arg Gin Gin Ala Asn
65 70 75 80
Glu Ser Leu Glu ser Leu lie pro Asp ser Leu Arg Ala Leu pro Gly
Leu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Arg Trp Ala Thr Glu pro Gin pro Gly
130 135 140
страница 7
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ прогнозирования стиля передвижения у лошади, включая способность использовать аль
тернативные аллюры, бежать рысью или иноходью с высокой скоростью и осуществлять выездку, включающий стадии:
1) экстрагирование фракции ДНК из образца, полученного у лошади,
2) определение в указанной фракции ДНК наличия или отсутствия нонсенс-мутации в экзоне 2 гена DMRT3 (фактор транскрипции 3, связанный с генами doublesex и mab-3) в нуклеотидном положении 22999655 на хромосоме 23 лошади, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1, приводящей к кодированию усеченной формы белка DMRT3, или по меньшей мере одного ассоциированного с указанной нонсенс-мутацией генетического маркера, который расположен в области между фланкирующими однонуклеотидными полиморфизмами SNP по нуклеотидным положениям 22628976 и 23315071 на 23 хромосоме лошади, где генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 4,
5, 7 и 8,
где наличие или отсутствие указанных нонсенс-мутации или по меньшей мере одного генетического маркера означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, либо что лошадь обладает способностью осуществлять выездку.
2. Способ по п.1, где указанный по меньшей мере один генетический маркер расположен в области между фланкирующими SNP по нуклеотидным положениям 22919878 и 23011289 на 23 хромосоме лошади.
3. Способ по п.2, где генетический маркер выбран из генетических маркеров, перечисленных в табл. 8.
4. Способ по п.2, включающий идентификацию в указанной фракции ДНК нуклеотида в одном или более чем одном конкретном положении, выбранном из положений 22919878; 22920361; 22920434; 22920646;22920717;22921203; 22922079;22922780;22923569; 22924120; 22924142; 22924299; 22924380;
22924407; 22926098; 22926188; 22926872; 22927387; 22927607; 22928220; 22928537; 22928587; 22929137; 22930011; 22932024; 22932895; 22933218; 22936034; 22940759; 22942423; 22945643; 22946599; 22948774; 22949055; 22949108; 22949240; 22949710; 22956846; 22960132; 22960528; 22960710; 22964042; 22965059; 22967119; 22967656; 22967915; 22968898; 22973984; 22974589; 22979124; 22980014; 22982879; 22984588; 22985746; 22988210; 22988991; 22993092; 22994591; 22999058; 22999655; 23002606; 23003956; 23008772;
23008789; 23009648; 23010164 и 23011289 на 23 хромосоме лошади.
5. Способ по п.1, включающий определение в указанной фракции ДНК наличия
1) нуклеотида С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
2) нуклеотида А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 3, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
3) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 5, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
4) нуклеотида А или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 6, где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
5) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 7, где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
6) нуклеотида G или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 8,
где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернатив-
ные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
7) нуклеотида А или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 9, где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
8) нуклеотида Т или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
где наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
9) нуклеотида Т или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
11,
где наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
10) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
12,
где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
11) нуклеотида А или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 13,
где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
12) нуклеотида А или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 14,
где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
13) нуклеотида G или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 15,
где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
14) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
16,
где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
15) нуклеотида G или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 17,
где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
16) нуклеотида G или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 18,
где наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
17) нуклеотида С или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID
NO: 19,
где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
18) нуклеотида Т или С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
20,
где наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
19) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
21,
где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
20) нуклеотида С или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
22,
где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
21) нуклеотида С или А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 23,
где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
22) нуклеотида С или G в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO: 24,
где наличие нуклеотида С означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
и наличие нуклеотида G означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и/или
23) нуклеотида А или Т в нуклеотидном положении, соответствующем положению 51 в SEQ ID NO:
25,
где наличие нуклеотида А означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку, и наличие нуклеотида Т означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью.
6. Способ по п.4, включающий определение в указанной фракции ДНК наличия или отсутствия
1) нуклеотида С в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 1, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку,
и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью, и/или
2) нуклеотида А в нуклеотидном положении, соответствующем положению 939 в SEQ ID NO: 3, где наличие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
и отсутствие указанного нуклеотида означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку.
7. Способ прогнозирования стиля передвижения у лошади, включая способность использовать аль-
тернативные аллюры, бежать рысью или иноходью с высокой скоростью и осуществлять выездку, вклю-
чающий стадии:
1) экстрагирование фракции белка из образца, полученного у лошади, и
2) определение в указанной фракции белка наличия или отсутствия усеченной формы белка DMRT3,
где наличие указанной усеченной формы белка DMRT3 означает, что лошадь обладает способностью использовать альтернативные аллюры и бежать рысью или иноходью с высокой скоростью,
и отсутствие указанной усеченной формы белка DMRT3 означает, что лошадь обладает способностью осуществлять выездку.
8. Применение способа по любому из пп.1-7 для отбора лошади для разведения.
301
AADRTSAEPES GCC GCC GAC CGA ACT TCG GCA GAG CCC GAG AGC
A A D R T Stop
GCC GCC GAC CGA ACT TAG GCA GAG CCC GAG AGC Фиг. 3
Крупный рог. Сит AKRPPLEVLKKIFPHQKPAVLELILKGCGGDLVSATOVLLSSRSSSSM. DRTSAGEPEi3IjVLESNGHLFEHTLSSYPLSSSK5IS
Лошадь дикий тип ' И Т *- ~А . ¦. --S ¦ 1-' 1
Лошадь мутант N Т А . ,J - . S 1 1
Человеи Н-Т VTG-. Е . S-A 1 1
Шимпанзе ?-Т Q G C-VTG-.Е-5С-. - S-L-FR~ I 1
Собака G G АА-SE-А-. -А Р G-G
Мышь К-Т AAGT.E--AE. ..-S S -I G 1
Крыса N Т AAG-.E-АЕ. . .-S S--I G-I
Курица Ы-Т G VAGG.E Е. .SD 1 1
Данио-рерио АН G-I-I TMKPE.KIL-E, SSDA Р V
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027258
027258
- 1 -
- 1 -
027258
027258
- 1 -
- 1 -
027258
027258
- 1 -
- 1 -
027258
027258
- 1 -
- 1 -
027258
027258
- 4 -
- 3 -
027258
027258
Таблица 1
- 3 -
- 4 -
027258
027258
- 6 -
- 6 -
027258
Таблица 2
027258
- 9 -
- 8 -
027258
Таблица 2
027258
- 9 -
- 8 -
027258
Таблица 2
027258
- 9 -
- 10 -
027258
Таблица 2
027258
- 9 -
- 10 -
027258
Таблица 3
027258
Таблица 3
- 11 -
- 11 -
027258
027258
- 12 -
- 12 -
027258
Таблица 7
027258
Таблица 7
- 14 -
- 14 -
027258
Таблица 8
027258
Таблица 8
- 15 -
- 15 -
027258
027258
- 16 -
- 16 -
027258
027258
- 18 -
- 18 -
027258
027258
¦ 24
¦ 24
027258
027258
10,
- 25 -
10,
- 25 -
027258
027258
- 26 -
- 26 -
027258
027258
- 28 -
- 28 -