EA 027256B1 20170731

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000027256b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с hOSM (онкостатин М человека) и ингибирующий связывание hOSM с рецептором gp130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II hOSM, который содержит CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO: 77, CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 6.

2. Антигенсвязывающий белок по п.1, в котором каркасная область тяжелой цепи содержит следующие остатки: Val, Ile или Gly в положении 2; Leu или Val в положении 4; Leu, Ile, Met или Val в положении 20; Cys в положении 22; Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24; Gly в положении 26; Ile, Phe, Leu или Ser в положении 29; Trp в положении 36; Trp в положении 47; Ile, Met, Val или Leu в положении 48; Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69; Arg в положении 71; Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Tyr или Phe в положении 90; Cys в положении 92; Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.

3. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1, 2, содержащий вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 74 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 72.

4. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-3, представляющий собой гуманизированное антитело.

5. Антигенсвязывающий белок по п.4, представляющий собой IgG1.

6. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-5, дополнительно связывающийся с OSM примата, не являющегося человеком.

7. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-6, связывающийся с OSM с аффинностью менее 40 пМ.

8. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительного расстройства или заболевания, выбранного из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза, содержащая антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Применение антигенсвязывающего белка по любому из пп.1-7 в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза.

10. Применение композиции по п.8 в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

4. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-3, представляющий собой гуманизированное антитело.

5. Антигенсвязывающий белок по п.4, представляющий собой IgG1.

7. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-6, связывающийся с OSM с аффинностью менее 40 пМ.

Евразийское 027256 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201390537
(22) Дата подачи заявки
2011.11.21 (51) Int. Cl. C07K16/24 (2006.01)
(54) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ОНКОСТАТИНОМ М ЧЕЛОВЕКА (hOSM)
(31) 61/416,495
(32) 2010.11.23
(33) US
(43) 2014.01.30
(86) PCT/EP2011/070604
(87) WO 2012/069433 2012.05.31
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Бембридж Гари Питер, Чун Чунь-ва, Фини Мария, Форд Сюзанна Карен, Керби Айан, Макадам Рут (GB)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(56) WO-A2-2005095457 WO-A2-9948523 US-A-5783672
OLIVIER C. ET AL.: "Identification of a gp130 cytokine receptor critical site involved in oncostatin M response", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 25 FEB 2000, LNKD-PUBMED:10681548, vol. 275, no. 8, 25 February 2000 (2000-02-25), pages 5648-5656, XP002668845, ISSN: 0021-9258, the whole document
OKAMOTO H. ET AL.: "The synovial expression and serum levels of interleukin-6, interleukin-11, leukemia inhibitory factor, and oncostatin M in rheumatoid arthritis", ARTHRITIS
AND RHEUMATISM, JUN 1997, LNKD-PUBMED:9182920, vol. 40, no. 6, June 1997 (1997-06), pages 1096-1105, XP002668846, ISSN:
0004-3591, cited in the application, the whole document
HUI W. ET AL.: "Detection of oncostatin M in synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis",
ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES,
MAR 1997, LNKD- PUBMED:9135222, vol. 56, no. 3, March 1997 (1997-03), pages 184-187,
XP002668847, ISSN: 0003-4967, cited in the
application, the whole document
LOY J.K. ET AL.: "Oncostatin M:
development of a pleiotropic cytokine",
TOXICOLOGIC PATHOLOGY, 1999 MAR-APR LNKD- PUBMED:10207978, vol. 27, no. 2, March
1999 (1999-03), pages 151-155, XP002675320, ISSN: 0192-6233, the whole document
WO-A2-2007137984 WO-A2-2005047326 WO-A1-2004006955 WO-A1-2010056893
QUEEN C. ET AL.: "A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor",
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 86, no. 24, 1 December 1989 (1989-12-01), pages 10029-10033, XP002614478,
ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.86.24.10029, cited in the application, the whole document
(57) Изобретение относится к антигенсвязывающим белкам, специфично связывающимся с онкостатином M человека (hOSM) и ингибирующим связывание hOSM с рецептором gp130, но не взаимодействующим непосредственно с остатками сайта II hOSM. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим заявленные антигенсвязывающие белки, и к их применениям для лечения воспалительного расстройства или заболевания.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к иммуноглобулинам, специфично связывающимся с онкостати-ном М (OSM), в частности человеческим OSM (hOSM).
Настоящее изобретение также относится к способам лечения заболеваний или расстройств указанными иммуноглобулинами, фармацевтическими композициями, содержащими указанные иммуноглобулины, и способам изготовления. Другие воплощения настоящего изобретения будут ясны из приведенного ниже описания.
Предшествующий уровень техники
Онкостатин М представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 28 кДа, принадлежащий цитокиновому семейству интерлейкина-6 (IL-6), включающему IL-6, фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), кардиотропин-1 (СТ-1) и кардиотропин-1-подобный цитокин (см. Kishimoto T. et al. (1995), Blood, 86:1243-1254), имеющие общий трансмембранный сигнальный рецептор gp130 (см. Taga T. and Kishimoto Т. (1997), Annu. Rev. Immunol. 15:797-819). OSM был изначально обнаружен по его способности ингибировать рост клеточной линии меланомы А375 (см. Malik N. (1989), et al. Mol. Cell Biol. 9:2847-2853). Затем были установлены другие эффекты, и было обнаружено, что он является многофункциональным медиатором, аналогично другим представителям семейства IL-6. Образование OSM происходит в клетках множества типов, включая макрофаги, активированные Т-клетки (см. Zarling J.M. (1986), PNAS (USA). 83:9739-9743), полиморфонуклеарные ней-трофилы (см. Grenier A. et al. (1999), Blood. 93:1413-1421), эозинофилы (см. Tamura S. et al. (2002), Dev. Dyn. 225: 327-31), дендритные клетки (см. Suda T. et al. (2002), Cytokine 17:335-340). Он также экспрес-сируется в поджелудочной железе, почках, яичках, селезенке, желудке, головном мозге (см. Znoyko I. et al. (2005), Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 283:182-186) и костном мозге (Psenak О. et al. (2003), Acta Haematol. 109:68-75). Его основные биологические эффекты включают активацию эндотелия (см. Brown T.J. et al. (1993), Blood, 82:33-7), активацию ответа острой фазы (см. Benigni F. et al. (1996), Blood, 87:1851-1854), индукцию пролиферации и дифференцировки клеток, модуляцию высвобождения воспалительных медиаторов и гемопоэза (см. Tanaka M. et al. (2003), 102: 3154-3162), ремоделирование кости (см. de Hooge ASK (2002), Am. J. Pathol. 160:1733-1743) и стимуляцию ангиогенеза (см. Vasse M. et al. (1999), Arterioscler. Thromb. Vase Biol. 19:1835-1842) и заживления ран.
Рецепторы OSM (Р-рецептор OSM "OSMRP") экспрессированы на широком спектре клеток, включая эпителиальные клетки, хондроциты, фибробласты (см. Langdon С. et al. (2003), J. Immunol. 170:548555), нервную ткань, гладкие мышцы, лимфатические узлы, кости, сердце, тонкую кишку, легкие, почки (см. Tamura S. et al. (2002), Mech. Dev. 115:127-131) и эндотелиальные клетки. Определенные данные позволяют предполагать, что эндотелиальные клетки являются первичной мишенью OSM. Экспрессия как высоко-, так и низкоаффинных рецепторов на этих клетках повышена в 10-20 раз, и они демонстрируют выраженные и продолжительные изменения фенотипа после стимуляции OSM (см. Modur V. et al. (1997), J. Clin. Invest. 100:158-168). Кроме того, OSM является сильным аутокринным фактором роста для клеток саркомы Капоши, предположительно имеющих эндотелиальное происхождение (см. Murakami-Mori Ket al. (1995), J. Clin. Invest. 96:1319-1327).
Аналогично другим цитокинам семейства IL-6, OSM связывается с трансмембранным сигнал-трансдуцирующим гликопротеином gp130. Ключевым свойством ^130-цитокинов является образование олигомерных рецепторных комплексов, содержащих gp130 и один или более корецепторов, в зависимости от лиганда (обзор в Heinrich P.C. et al. (2003), Biochem. J. 374:1-20). В результате эти цитокины могут опосредовать как общие, так и уникальные биологические активности in vitro и in vivo, в зависимости от состава образуемого рецепторного комплекса. Человеческий OSM (hOSM) отличается от других IL-6-цитокинов тем, что он может образовывать комплексы с gp130 и любым из двух корецепторов, LIFR или рецептором онкостатина (OSMR). На фиг. 27 показано взаимодействие hOSM с gp130, LIFR и OSMR.
Определена кристаллическая структура hOSM и показано, что она содержит пучок из четырех а-спиралей с двумя потенциальными сайтами гликозилирования. Сайт-направленным мутагенезом в молекуле hOSM обнаружены два отдельных сайта связывания с лигандом (см. Deller MC et al. (2000) Structural Fold Des. 8:863-874). Первый, называемый сайтом II (иногда "сайтом 2"), взаимодействует с gp130, и второй сайт, называемый сайтом III (иногда "сайтом 3"), на противоположном конце молекулы взаимодействует с LIFR или OSMR. Эксперименты с мутагенезом показали, что сайты связывания для LIFR и OSMR почти идентичны, но их можно отличить друг от друга по одной аминокислотной мутации.
Появляется все больше данных, поддерживающих гипотезу о том, что модуляция взаимодействия OSM-gp130 может быть полезной при лечении ревматоидного артрита (RA) и других заболеваний и расстройств, в частности хронических воспалительных заболеваний и расстройств, таких как остеоартрит, идиопатический фиброз легких, боль, воспалительное заболевание легких, сердечно-сосудистое заболевание и псориаз.
OSM обнаружен в синовиальной жидкости (SF) пациентов-людей с RA (см. Hui W. et al. (1997), 56:184-7). Эти уровни коррелируют с числом нейтрофилов в SF, уровнями фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа, иногда "TNF") в SF и маркерами деструкции хряща (Manicourt D.H. et al. (2000), Ar
thritis Rheum, 43:281-288). Кроме того, синовиальная ткань пациентов с RA секретирует OSM спонтанно ex vivo (см. Okamoto H. et al. (1997), Arthritis and Rheumatism, 40:1096-1 105). Также показано, что OSM присутствует в синовиальных макрофагах (Cawston Т.Е. et al. (1998), Arthritis Rheum, 41:1760-1771), и, как обсуждено ранее, рецепторы OSM и gp130 экспрессированы на эндотелиальных клетках, синовиальных фибробластах, хондроцитах и остеобластах. Аденовирусная экспрессия мышиного OSM (mOSM) в суставах нормальных мышей приводит к тяжелому воспалительному и эрозивному артриту (см. Langdon С. et al. (2000), Am. J. Pathol. 157:1187-1196). Сходное агрессивное заболевание наблюдают у мышей-нокаутов по TNF, интерлейкину-1 (IL-1), IL-6 и индуцируемой синтазе оксида азота (iNOS) после аденовирусного введения mOSM (см. de Hooge A.S.K. et al. (2003), Arthritis and Rheumatism 48:1750-1761), демонстрируя, что OSM может опосредовать все формы артрита. Экспрессия мышиного OSM с использованием аденовирусно экспрессированного вектора mOSM приводит к поражению зоны роста, типичному для ювенильного идиопатического артрита (см. de Hooge A.S.K. et al. (2003), Arthritis and Rheumatism, 48:1750-1761). В экспериментальной модели коллаген-индуцированного артрита терапевтическое введение антитела против OSM мышам предотвращало всякое дальнейшее прогрессирование заболевания. Сходные результаты были получены при профилактическом введении антитела против OSM мышам с пристан-индуцированным артритом, рецидивирующе-ремиттирующей модели, похожей на заболевание человека (см. Plater-Zyberk С. et al. (2001), Arthritis and Rheumatism 44).
Остеоартрит представляет собой состояние, поражающее суставы. Существует три признака остео-артрита. Он приводит к повреждению хряща - прочной гладкой поверхности, выстилающей кости и обеспечивающей легкие движения в суставах без трения. Он приводит к разрастаниям костей, развивающимся по краям суставов, и он приводит к умеренному воспалению тканей вокруг суставов (синови-ту). Показано, что OSM играет важную роль в деструкции хряща, воспалении и обновлении кости, и, следовательно, блокада этого цитокина может играть роль в ключевых аспектах патогенеза заболевания. OSM действует синергично с IL-1 или TNF, индуцируя коллагенолиз в носовом хряще человека, включая распад протеогликанов (PG) и коллагена, при этом последнее коррелирует с индукцией матриксной ме-таллопротеиназы-1 (ММР-1) и матриксной металлопротеиназы-13 (ММР-13). OSM с IL-1 также может индуцировать распад PG в человеческом суставном хряще, но усиление распада коллагена было незначительным (Morgan et al. 2006). В ряде исследований с использованием аденовирусных векторов для повышения концентрации цитокинов в суставах показано, что сверхэкспрессия OSM индуцирует воспаление, образование паннуса, деструкцию хряща и эрозию кости (Langdon et al. 2000). В целом, литературные данные позволяют предполагать, что OSM, в частности, в комбинации с другими цитокинами индуцирует протеазы, вовлеченные в распад протеогликанов и коллагена, приводящий к деструкции хряща и эрозии кости.
Литературные данные позволяют предполагать, что молекула OSM может быть некоторым образом вовлечена в воспалительный процесс, связанный с псориазом. В работе Boifati et al. (1998) показано, что спонтанное высвобождение OSM усилено в органных культурах псориатических поражений, по сравнению с непораженной кожей при псориазе и нормальной кожей. (Kunsfeild et al. 2004). Кератиноциты экс-прессируют рецептор данной молекулы, и в ответ на лиганд это приводит к миграции кератиноцитов и увеличивает толщину восстановленного эпидермиса. Микрочиповый анализ по сравнению геномодули-рующих эффектов OSM с 33 различными цитокинами показывает, что он является сильным активатором кератиноцитов и может действовать синергично с провоспалительными цитокинами, индуцируя такие молекулы, как S100A7, и экспрессию Р-дефензина 2, что характерно для кожи при псориазе (Gazel et al.
2006).
Литературные данные также позволяют предполагать, что OSM играет роль при воспалительном заболевании легких, таком как астма или фиброз легких. Для этих заболеваний характерно усиленное образование внеклеточного матрикса (ЕСМ) в сочетании с пролиферацией и активацией подэпителиаль-ных фибробластов. OSM обнаружен в жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов при остром повреждении легких, в частности в случаях пневмонии (Grenier et al. 2001).
OSM обнаружен в головном мозге пациентов с рассеянным склерозом (MS), где он локализован в микроглии, астроцитах и инфильтрирующих лейкоцитах (Ruprecht et al. 2001). Кроме того, мононуклеар-ные клетки периферической крови (РВМС), выделенные от пациентов с MS, спонтанно высвобождают больше цитокинов, включая OSM, чем клетки здоровых контрольных субъектов, и пациенты с MS демонстрируют тенденцию к повышенной концентрации OSM в сыворотке (Ensoli et al. 2002).
Помимо стимуляции воспаления в головном мозге, OSM может непосредственно способствовать нейродегенерации, признаку болезни Альцгеймера, MS и подгруппы пациентов с инфекцией, вызванной вирусом иммунодефицита человека (HIV). Супернатанты моноцитов HIV-инфицированных пациентов приводят к выраженному ингибированию роста нейробластов и гибели нейронов. Эти эффекты были опосредованы онкостатином М в культуральном супернатанте (Ensoli et al. 1999). Поскольку многие HIV-инфицированные пациенты страдают от атрофии головного мозга, обусловленной утратой нейронов, OSM может быть одним из посредников при данной патологии.
В работе Tamura et al. предложено, что OSM может быть вовлечен в развитие и поддержание ней-ропатической боли (2003). В этих исследованиях была обнаружена подгруппа ноцицептивных сенсорных
нейронов, экспрессирующих р-рецептор OSM. Все OSMpR-положительные нейроны также экспрессиро-вали рецепторы VR1 и Р2Х3, которые, как было показано, необходимы для развития как нейропатиче-ской, так и воспалительной боли (Jarvis et al. 2002, Walker et al. 2003). Также было показано, что OSM-/-мыши демонстрировали сниженные болевые ответы на химическую, термическую, висцеральную и механическую боль (Morikawa et al. 2004). Интересно наличие у этих животных дефицита VR1+, Р2Х3+ малых нейронов, притом что в остальном эти животные соответствовали норме.
Литературные данные также позволяют предполагать, что OSM играет роль в модуляции биологии раковых клеток. Сообщено, что OSM обладает как ростостимулирующими, так и ростоингибирующими свойствами в исследованиях с использованием опухолевых клеточных линий (Grant and Begly 1999). Он является сильным митогеном для клеток, имеющих происхождение от саркомы Капоши (Miles et al. 1992), и для миеломных клеточных линий (Zhang et al. 1994). OSM снижает скорость роста и усиливает дифференцировку ряда опухолевых клеточных линий, включая клеточные линии опухолей молочной железы (Douglas et al. 1998) и легкого (McKormick et al. 2000). Тем не менее, несмотря на то, что OSM может ингибировать рост, по меньшей мере, в некоторых клеточных линиях рака молочной железы он усиливает отделение клеток и увеличивает метастатический потенциал (Holzer et al. 2004, Jorcyk et al. 2006). В некоторых опухолевых клеточных линиях OSM также приводит к повышающей регуляции экспрессии и активированному состоянию рецептора гиалуроновой кислоты CD44 (Cichy et al. 2000), связанного с опухолевым ростом и метастазированием (Yu et al. 1997). Кроме того, ангиогенные свойства OSM и его способность индуцировать другие ангиогенные факторы в некоторых опухолевых клетках (Repovic et al. 2003) позволяют предполагать, что он может способствовать опухолевому ангиогенезу в опухолях, экспрессирующих OSM. Данные научной литературы позволяют предполагать, что OSM играет роль в биологии опухолей, но показывают сложность этого вопроса. Возможно, нейтрализация OSM может быть полезной для лечения некоторых опухолей. С другой стороны, аналогично нейтрализации TNF и IL-6, она связана с некоторым потенциальным риском при других опухолях.
Литературные данные позволяют предполагать потенциальную роль OSM при сердечнососудистых заболеваниях. OSM обнаружен в тканевых макрофагах в атеросклеротических поражениях (Modur et al. 1997) и в качестве ангиогенного фактора (Vasse et al. 1999) может стимулировать неоваску-ляризацию, характерную для атеросклеротических бляшек, предположительно способствующую хрупкости стенок сосудов. Тем не менее, OSM также индуцирует экспрессию других ангиогенных факторов в эндотелиальных клетках; фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (Wijelah et al. 1997) и основного фактора роста фибробластов (bFGF) (Bernard et al. 1999). Интересно, что плотность рецепторов OSM на человеческих эндотелиальных клетках приблизительно в 10-20 раз выше, чем на других клетках (Brown et
al. 1991).
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении терапевтического способа лечения RA и других заболеваний и расстройств, в частности хронических воспалительных заболеваний и расстройств, таких как остеоартрит, идиопатический фиброз легких, рак, астма, боль, сердечнососудистое заболевание и псориаз. В частности, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении иммуноглобулинов, особенно антител, специфично связывающихся с OSM (например, hOSM, в частности его сайтом II) и модулирующих (т.е. ингибирующих или блокирующих) взаимодействие между OSM и gp130 при лечении заболеваний и расстройств, чувствительных к модуляции данного взаимодействия.
В WO 99/48523 авторами настоящего изобретения раскрыто применение антагонистов OSM в лечении воспалительных заболеваний и расстройств. В указанной публикации использовано антитело против мышиного OSM в модели артрита на мышах.
Все ссылки на патенты и литературные источники, приведенные в настоящем описании, положительным образом и полностью включены сюда посредством ссылки.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с человеческим gp130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим gp130 посредством 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из четырех повторов анализа.
Фиг. 2. KB-клеточный анализ (анализ, проведенный на клетках линии KB) - ингибирование человеческого OSM посредством 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 3. KB-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ посредством 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 4. Анализ эндогенного OSM с человеческим gp130 -ингибирование связывания эндогенного
человеческого OSM с человеческим gp130 антителами 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (110) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух доноров.
Фиг. 5. KB-клеточный анализ - отсутствие ингибирования человеческого LIF посредством 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Коммерческое моноклональное антитело (mAb) против человеческого LIF (R &D Systems, MAB250) использовали в качестве положительного контроля. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 6. KB-клеточный анализ - ингибирование OSM игрунки посредством 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 7. Сравнение последовательностей вариабельных доменов (вариабельных областей) тяжелой цепи (VH) гибридом 2В7, 3Е3, 9G2 и 10G8. В малых рамках показаны остатки, отличающиеся от большинства ("Majority"). В больших рамках в последовательностях показаны гипервариабельные участки (CDR), "protein" - белок.
Фиг. 8. Сравнение последовательностей вариабельных доменов (вариабельных областей) легкой цепи (VL) гибридом 2В7, 3Е3, 9G2 и 10G8. В малых рамках показаны остатки, отличающиеся от большинства ("Majority"). В больших рамках в последовательностях показаны CDR, "protein" - белок.
Фиг. 9. Анализ последовательности вариабельных доменов легкой цепи 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7 в сравнении с неконкурирующим исходным мышиным антителом против OSM 15E10; сверху на фигуре указано филогенетическое дерево последовательностей VH в сравнении с 15Е10 VL; снизу на рисунке показаны расстояния между парами VH и 15Е10 VL.
Фиг. 10. Анализ последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7 в сравнении с неконкурирующим исходным мышиным антителом против OSM 15E10; сверху на фигуре указано филогенетическое дерево последовательностей VH в сравнении с 15Е10 VH; снизу на рисунке показаны расстояния между парами VH и 15Е10 VH.
Фиг. 11. Прямой ELISA связывания с человеческим OSM - сравнение связывания химерных 10G8 и 9G2 и химерного 15Е10 (15Е10с) с человеческим OSM.
Фиг. 12. ELISA с человеческим gp130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим gp130 посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 13. KB-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 14. KB-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 15. Анализ эндогенного OSM с человеческим gp130 -ингибирование связывания эндогенного человеческого OSM с человеческим gp130 антителами 10G8, химерным 10G8, 9G2 и химерным 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух доноров.
Фиг. 16. KB-клеточный анализ с человеческим LIF - отсутствие ингибирования человеческого LIF посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) было добавлено в целях сравнения. Антитело против человеческого LIF (МАВ250, R &D Systems) использовали в качестве положительного контроля. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 17. KB-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM гуманизированными вариантами 10G8 L1 и L4. 15E10h было добавлено для сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 18. ELISA с человеческим gp130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим gp130 гуманизированными вариантами 10G8 HOL1, H1L1 и H2L1. 15E10h было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 19. Комплекс связывания человеческого OSM с mAb 10G8 -связывание человеческого OSM с легкой цепью и тяжелой цепью mAb 10G8. Показаны сайты связывания OSM с рецепторами (сайт II и сайт III). Для каждого сайта приведены важные аминокислотные остатки областей связывания с рецепторами.
Фиг. 20. KB-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM гуманизированными вариантами антител 10G8 H0L1 CDRH1 (гипервариабельный участок 1 тяжелой цепи) и CDRL2 (гипервариабельный участок 2 легкой цепи). 15E10h было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 21. ELISA с человеческим gp130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим gp130 исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1. 15E10h было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 22. KB-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1. 15E10h было добавлено для сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 23. KB-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и Н0(Н1ДЛ. 15E10h было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 24. Анализ эндогенного OSM с человеческим gp130 -ингибирование связывания эндогенного человеческого OSM с человеческим gp130 исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1. 15E10 было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из четырех доноров.
Фиг. 25. KB-клеточный анализ с человеческим LIF - отсутствие ингибирования человеческого LIF исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1), H0(huCDRH1)L1. 15E10h было добавлено для сравнения. Антитело против человеческого LIF (MAB250, R &D Systems) использовали в качестве положительного контроля. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 26: Анализ с человеческими первичными гепатоцитами -ингибирование высвобождения сывороточного амилоида A (SAA) посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих гепатоцитов, стимулированных (А) 3 нг/мл и (Б) 10 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров гепатоцитов.
Фиг. 27. Анализ с человеческими первичными гепатоцитами -ингибирование высвобождения С-реактивного белка (CRP) посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих гепатоцитов, стимулированных (А) 3 нг/мл и (Б) 10 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров гепа-тоцитов.
Фиг. 28. Анализ с человеческими фибробластоподобными синовиоцитами, характерными для ревматоидного артрита (RA-фибробластоподобными синовиоцитами) - ингибирование высвобождения IL-6 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих RA-фибробластоподобных синовиоцитов (HFLS-RA), стимулированных (А) 0,3 нг/мл и (Б) 3 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров HFLS-RA
Фиг. 29. Анализ с человеческими RA-фибробластоподобными синовиоцитами - ингибирование высвобождения моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих RA-фибробластоподобных синовиоцитов (HFLS-RA), стимулированных (А) 0,3 нг/мл и (Б) 3 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров HFLS-RA.
Фиг. 30. Анализ с человеческими клетками эндотелия пупочной вены - ингибирование высвобождения IL-6 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих клеток эндотелия пупочной вены, стимулированных (А) 30 нг/мл и (Б) 100 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 31. Анализ с человеческими легочными фибробластами - ингибирование высвобождения МСР-1 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих легочных фибробластов, стимулированных человеческим OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат (А) одного здорового донора и (Б) одного донора с идиопа-тическим фиброзом легких (IPF).
Фиг. 32. Анализ с человеческими легочными фибробластами - ингибирование высвобождения IL-6 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих легочных фибробластов, стимулированных человеческим OSM. Гуманизированное 15Е10 (обозначенное как антитело X) было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат (А) одного здорового донора и (Б) одного донора с IPF.
Фиг. 33. Данные о связывании вариантов гипервариабельного участка 3 тяжелой цепи (CDRH3) -проводили аланиновое сканирование остатков, обнаруженных в CDRH3. Представленные данные показывают влияние замены остатков на аффинность связывания.
Фиг. 34.: Иллюстрация взаимодействия hOSM с gp130, LIFR и OSMR.
Номенклатура антител. Во избежание сомнений 15E10h и гуманизированное 15Е10 относятся к одному и тому же антителу и обозначены на некоторых графических материалах как антитело X. Кроме того, 10G8/A9 и 10G8 относятся к одному и тому же антителу.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с hOSM (онкостатин М человека) и ингибирующий связывание hOSM с рецептором gp130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II hOSM, который содержит CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO: 77, CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 6. Антитела против OSM по настоящему изобретению относятся к или имеют происхождение от мышиного mAb 10G8. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного 10G8 приведена как SEQ ID NO: 26, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного 10G8 приведена как SEQ ID NO: 28. Согласно одному воплощению изобретения предложен указанный выше антигенсвязываю-щий белок, где каркасная область тяжелой цепи содержит следующие остатки:
Val, Ile или Gly в положении 2;
Leu или Val в положении 4;
Leu, Ile, Met или Val в положении 20;
Cys в положении 22;
Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24;
Gly в положении 26;
Ile, Phe, Leu или Ser в положении 29;
Trp в положении 36;
Trp в положении 47;
Ile, Met, Val или Leu в положении 48;
Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Tyr или Phe в положении 90; Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
Согласно еще одному воплощению изобретения указанный выше антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 74 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 72. Согласно еще одному воплощению изобретения, указанный выше антигенсвязывающий белок представляет собой гуманизированное антитело. Согласно еще одному воплощению изобретения, указанное выше гуманизированное антитело представляет собой IgG1.
Согласно еще одному воплощению изобретения, указанный выше антигенсвязывающий белок дополнительно связывается с OSM примата, не являющегося человеком. Согласно еще одному воплощению изобретения, указанный выше антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 40 пМ.
Согласно изобретению также предложена фармацевтическая композиция для лечения воспалительного расстройства или заболевания, выбранного из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза, содержащая указанный выше антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с hOSM (онкостатин М человека) и ингибирующий связывание hOSM с рецептором gp130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II hOSM, который содержит CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO: 77, CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 6, и фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно изобретению также предложено применение указанного выше антиген-связывающего белка, специфично связывающегося с hOSM (онкостатин М человека) и ингибирующего связывание hOSM с рецептором gp130, но не взаимодействующего непосредственно с остатками сайта II hOSM, который содержит CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO: 77, CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 6 в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза.
Согласно изобретению также предложено применение указанной выше композиции в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с OSM, например, специфично связывающийся с человеческим OSM (hOSM), и ингибирую-щий связывание OSM с рецептором gp130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II.
В другом аспекте изобретения, как описано здесь, антигенсвязывающий белок не связывается непосредственно с остатками Q20, G120, Q16, N124.
В другом аспекте изобретения, как описано здесь, предложен антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с OSM, например специфично связывающийся с человеческим OSM (hOSM), ин-гибирующий связывание OSM с рецептором gp130 и взаимодействующий с одним или более из остатков 82, 83, 84, 90, 94, 112,115, 122, 123, 152 человеческого OSM.
В одном таком аспекте согласно изобретению предложен антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с OSM, например специфично связывающийся с человеческим OSM (hOSM), и ингиби-рующий связывание OSM с рецептором gp130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II и не конкурирующий с антителом, имеющим тяжелую цепь SEQ ID NO: 79 и легкую цепь SEQ ID NO: 80, в конкурентном ELISA-анализе.
В одном таком аспекте согласно изобретению предложен антигенсвязывающий белок, конкурирующий с антигенсвязывающим белком, как описано здесь, за связывание с OSM, например с человеческим OSM.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с высокой аффинностью, например при измерении посредством Biacore антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с аффинностью 500 пМ или менее, или 400 пМ или менее, или 300 пМ или менее, или 250 пМ или менее, или 200 пМ или менее, или, например, 140 пМ или менее. В другом воплощении ан-тигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM при измерении посредством Biacore с аффинностью от приблизительно 100 до приблизительно 500 пМ, или от приблизительно 100 до приблизительно 300 пМ, или от приблизительно 100 до приблизительно 250 пМ, или от приблизительно 100 до приблизительно 200 пМ. В одном воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 250 пМ. В другом воплощении настоящего изобретения антиген-связывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 140 пМ.
В одном таком воплощении это измерено посредством Biacore, например, как изложено в примере
2.5.1.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с высокой аффинностью, например, при измерении способом Kinexa в растворе антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с аффинностью 200 пМ или менее или аффинностью 150 пМ или менее, или 100 пМ или менее, или 50 пМ или менее, или, например, 40 пМ или менее. В другом воплощении антигенсвязы-вающий белок связывается с человеческим OSM при измерении посредством Kinexa с аффинностью от приблизительно 10 до приблизительно 200 пМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 150 пМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 10 до приблизительно
70 пМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 40 пМ. В одном воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 70 пМ. В другом воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 40 пМ. В одном таком воплощении это измерено посредством Kinexa, например, как изложено в примере
2.5.1.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM и нейтрализует OSM в клеточном анализе нейтрализации со средней ингибирующей концентрацией (IC50) от приблизительно 10 до приблизительно 200 пМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 150 пМ, или от приблизительно 10 до приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 20 до приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 20 до приблизительно 100 пМ. В другом воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM и нейтрализует OSM в клеточном анализе нейтрализации с IC50 приблизительно 20 пМ при аффинности менее 140 пМ.
В одном таком воплощении это измерено клеточным анализом нейтрализации, например, как изложено в примере 2, разделе 2.2.1.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложено, что антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID NO: 3 или вариант SEQ ID NO: 3, где CDRH3 содержит альтернативные аминокислотные замены, как изложено ниже, в одном или более из следующих положений (с использованием нумерации Kabat):
замену на Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gln, Ser, Thr или Val в положении 95;
замену на Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp или Tyr в положении 96;
замену на Ala, Cys, Phe, Met или Ser в положении 97;
замену на Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln или Trp в положении 98;
замену на Ala, Cys, Pro, Ser, Val или Tyr в положении 99;
замену на Glu в положении 100В;
замену на Ala, Glu, Phe, Gly, Val или Trp в положении 100С;
замену на Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в положении 100D; замену на Glu, Gly, Ser, Thr или Val в положении 101;
замену на Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Tyr, His, Ile, Asp или Trp в положении 102. В другом аспекте изобретения антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID NO: 3, или вариант SEQ ID NO: 3, где Val102 заменен на Tyr, His, Ile, Ser, Asp или Gly;
2) CDRH2, как изложено в SEQ ID NO: 2, или вариант SEQ ID NO: 2, где Thr50 заменен на Gly, Tyr,
Phe, Ile, Glu или Val, и/или Ile51 заменен на Leu, Val, Thr, Ser или Asn, и/или Ser52 заменен на Phe, Trp или His, и/или Gly53 заменен на Asp, Ser или Asn, и/или Gly54 заменен на Ser, и/или Phe56 заменен на Ser, Tyr, Thr, Asn, Asp или Arg, и/или Tyr58 заменен на Gly, His, Phe, Asp или Asn;
3) CDRL1, как изложено в SEQ ID NO: 4, или вариант SEQ ID NO: 4, где Ser27A заменен на Asn, Asp, Thr или Glu, и/или Ser27C заменен на Asp, Leu, Tyr, Val, Ile, Asn, Phe, His, Gly или Thr, и/или Asn31 заменен на Ser, Thr, Lys или Gly, и/или Phe32 заменен на Tyr, Asn, Ala, His, Ser или Arg, и/или Met33 заменен на Leu, Val, Ile или Phe;
4) CDRL3, как изложено в SEQ ID NO: 6, или вариант SEQ ID NO: 6, где Leu89 заменен на Gin, Ser, Gly или Phe, и/или His90 заменен на Gln или Asn, Ser91 заменен на Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Tyr или Val, и/или Arg92 заменен на Asn, Tyr, Trp, Thr, Ser, Gin, His, Ala или Asp, и/или Glu93 заменен на Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar или Ala, и/или Phe96 заменен на Pro, Leu, Tyr, Arg, Ile или Trp.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок дополнительно содержит:
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 78.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок дополнительно содержит:
6) CDRH1, как изложено в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 77, или вариант SEQ ID NO: 1 или
SEQ ID NO: 77, где Tyr32 заменен на Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu или Asp, и/или Ala33 заменен на Tyr, Trp, Gly, Thr, Leu или Val, и/или Met34 заменен на Ile, Val или Trp, и/или Ser35 заменен на His, Glu, Asn, Gln, Tyr или Thr.
Последовательности вариантов CDR для CDR L1, L2, L3, Н1 и Н2 определены с применением мутагенеза или канонической технологии. Структура гипервариабельных участков (CDR) L1, L2, L3, Н1 и Н2 обычно имеет одну из конечного числа конформаций главной цепи. Конкретный класс канонической структуры CDR определяют как длина CDR, так и расположение петель, которое определяют остатки, расположенные в ключевых положениях CDR и каркасных областей (остатки, определяющие структуру, или SDR). Martin and Thornton (1996; J. Mol. Biol. 263:800-815) разработали автоматический способ определения канонических матриц "ключевых остатков". Для определения канонических классов групп CDR применяют кластерный анализ и затем определяют канонические матрицы анализом скрытых гидрофобных остатков, остатков, образующих водородные связи и консервативных глицинов и пролинов. Канонические классы CDR последовательностей антител могут быть определены сравнением последовательностей с матрицами ключевых остатков и определением балльного показателя по каждой матрице с применением матриц тождественности или подобия.
В одном аспекте согласно изобретению предложен антигенсвязывающий белок, содержащий
CDRH3 SEQ ID NO: 3, CDRH2 SEQ ID NO: 2, CDRL1 SEQ ID NO: 4 и CDRL3 SEQ ID NO: 6, который может дополнительно содержать CDR H1 SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 77 и CDRL2 SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 78.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID NO: 3, CDRH2 SEQ ID NO: 2, CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID NO: 3, CDRH2 SEQ ID NO: 2, CDR H1 SEQ ID NO: 1, CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3
SEQ ID NO: 6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID NO: 3, CDRH2 SEQ ID NO: 2, CDRH1 SEQ ID NO: 1, CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 78 и CDRL3
SEQ ID NO: 6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID NO: 3, CDRH2
SEQ ID NO: 2, CDRH1 SEQ ID NO: 77, CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 5 и CDRL3 SEQ ID NO: 6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID NO: 3, CDRH2
SEQ ID NO: 2, CDRH1 SEQ ID NO: 77, CDRL1 SEQ ID NO: 4, CDRL2 SEQ ID NO: 78 и CDRL3 SEQ ID NO: 6.
В одном аспекте настоящего изобретения антигенсвязывающий белок не взаимодействует непосредственно через CDRH1 с OSM.
В одном аспекте антигенсвязывающий белок не взаимодействует непосредственно через CDRH1
или CDR L2 с OSM.
Антигенсвязывающие белки по изобретению могут содержать вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи по изобретению, которые могут быть форматированы с получением структуры природного антитела или его функционального фрагмента или эквивалента. Таким образом, антигенсвязывающий белок по изобретению может содержать области VH по изобретению, форматированные таким образом, что при образовании ими пары с подходящей легкой цепью образуется полноразмерное антитело, (Fab'^-фрагмент, Fab-фрагмент или его эквивалент (такой как scFV, би-, три- или тет-ратела, Tandabs и так далее). Антитело может представлять собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4; или IgM, IgA, IgE или IgD; или их модифицированный вариант. Константный домен тяжелой цепи антитела может быть выбран соответствующим образом. Константный домен легкой цепи может представлять собой константный домен каппа или лямбда. Кроме того, антигенсвязывающий белок может содержать модификации всех классов, например, димеры IgG, Fc-мутанты, более не связывающиеся с Fc-рецепторами или не опосредующие связывание с C1q. Антигенсвязывающий белок может также представлять собой химерное антитело описанного в WO 86/01533 типа, содержащее антигенсвязывающую область и область, не являющуюся областью иммуноглобулина.
Константную область выбирают в соответствии с любой желаемой функциональностью. IgG1 может обладать литической способностью посредством связывания с комплементом и/или опосредовать ADCC (антителозависимую клеточную цитотоксичность). IgG4 может быть использован тогда, когда необходимо нецитотоксическое блокирующее антитело. Тем не менее, антитела IgG4 могут быть нестабильны при получении, и поэтому альтернативой является модификация обычно более стабильных IgG1. Предложенные модификации описаны в ЕР 0307434, например мутации в положениях 235 и 237. Таким образом, согласно изобретению предложена литическая или нелитическая форма антигенсвязывающего белка, например, антитела, по изобретению.
В определенных формах антитело по изобретению представляет собой полноразмерное (например, тетрамер H2L2) литическое или нелитическое антитело IgG1, имеющее любые вариабельные области тяжелой цепи, описанные здесь.
Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению имеют происхождение от мышиного антитела, имеющего вариабельные области, как описано в SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 28, или их немышиных эквивалентов, таких как их крысиные, человеческие, химерные или гуманизированные варианты, например, они имеют происхождение от гуманизированного антитела, имеющего тяжелые и легкие цепи,
как описано в SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 62.
В одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID NO: 54,
SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 или SEQ ID NO: 74.
В одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен легкой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64,
SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 68.
В другом аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 или SEQ ID NO: 74; и выделенный вариабельный домен легкой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 или
SEQ ID NO: 68.
В другом воплощении изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 54 и выделенный вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 62. В другом воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 74 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 62.
В одном аспекте антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 53, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 61. В одном аспекте антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 73, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую SEQ ID NO: 61.
В одном аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 53, или SEQ ID NO: 55, или SEQ ID NO: 57, или SEQ ID NO: 73.
В одном аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 61, или SEQ ID NO: 63, или SEQ ID NO: 65, или SEQ ID NO: 67.
В другом аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 73, и полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 61, или SEQ ID NO: 63, или SEQ ID NO: 65, или SEQ ID NO: 67. В еще одном аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 73, и полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область легкой цепи, содержащий SEQ ID NO: 61.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок может содержать любые вариабельные области тяжелой цепи, как описано здесь, в комбинации с любыми легкими цепями, как описано здесь.
В одном аспекте антигенсвязывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязы-вающий фрагмент, содержащий один или более CDR по изобретению, описанных здесь, или один или оба вариабельных домена тяжелой или легкой цепи по изобретению, описанных здесь. В одном воплощении антигенсвязывающий белок связывается с OSM примата. В одном таком воплощении антигенсвя-зывающий белок дополнительно связывается с OSM примата, не являющегося человеком, например, OSM яванского макака. В другом воплощении антигенсвязывающий белок связывается с OSM игрунки.
В одном аспекте предложен антигенсвязывающий белок, связывающийся как с OSM игрунки, так и с OSM человека с аффинностью выше 1 нМ при измерении посредством Biacore или Kinexa.
В качестве дополнительных показаний, способность этих антител нейтрализовать OSM игрунки обеспечивает уникальное средство оценки роли OSM в моделях заболеваний на игрунках, таких как ЕАЕ (экспериментальный острый энцефаломиелит)-модель MS (рассеянный склероз).
В другом аспекте антигенсвязывающий белок выбран из группы, состоящей из однодоменного антитела (dAb), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диатела, триатела, тетратела, мини-антитела и мини-тела.
В одном аспекте настоящего изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой гуманизированное или химерное антитело, в другом аспекте антитело является гуманизированным.
В одном аспекте антитело представляет собой моноклональное антитело.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID NO: 3, или вариант SEQ ID NO: 3, где CDRH3 содержит альтернативные аминокислотные замены, как изложено ниже, в одном или более из следующих положений (с использованием нумерации Kabat):
замену на Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gln, Ser, Thr или Val в положении 95,
замену на Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp или Tyr в положении 96,
замену на Ala, Cys, Phe, Met или Ser в положении 97,
замену на Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln или Trp в положении 98,
замену на Ala, Cys, Pro, Ser, Val или Tyr в положении 99,
замену на Glu в положении 100В,
замену на Ala, Glu, Phe, Gly, Val или Trp в положении 100С,
замену на Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в положении 100D, замену на Glu, Gly, Ser, Thr или Val в положении 101;
замену на Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser Tyr, His, Ile, Asp или Trp в положении 102,
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 77, или вариант SEQ ID NO: 1 или
SEQ ID NO: 77, где Tyr32 заменен на Ile, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu или Asp, и/или Ala33 заменен на Tyr, Trp, Gly, Thr, Leu или Val, и/или Met34 заменен на Ile, Val или Trp, и/или Ser35 заменен на His, Glu, Asn, Gln, Tyr или Thr;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID NO: 2, или вариант SEQ ID NO: 2, где Thr50 заменен на Gly, Tyr, Phe, Ile, Glu или Val, и/или Ile51 заменен на Leu, Val, Thr, Ser или Asn, и/или Ser52 заменен на Phe, Trp или His, и/или Gly53 заменен на Asp, Ser или Asn, и/или Gly54 заменен на Ser, и/или Phe56 заменен на Ser, Tyr, Thr, Asn, Asp или Arg, и/или Tyr58 заменен на Gly, His, Phe, Asp или Asn;
3)
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID NO: 4, или вариант SEQ ID NO: 4, где Ser27A заменен на Asn, Asp, Thr или Glu, и/или Ser27C заменен на Asp, Leu, Tyr, Val, Ile, Asn, Phe, His, Gly или Thr, и/или Asn 31 заменен на Ser, Thr, Lys или Gly, и/или Phe32 заменен на Tyr, Asn, Ala, His, Ser или Arg, и/или Met33 заменен на Leu, Val, Ile или Phe;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID NO: 6, или вариант SEQ ID NO: 6, где Leu89 заменен на Gin, Ser, Gly или Phe, и/или His90 заменен на Gln или Asn, Ser91 заменен на Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Tyr или Val, и/или Arg92 заменен на Asn, Tyr, Trp, Thr, Ser, Gln, His, Ala или Asp, и/или Glu93 заменен на Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar или Ala, и/или Phe96 заменен на Pro, Leu, Tyr, Arg, Ile или Trp;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки:
Val, Ile или Gly в положении 2;
Leu или Val в положении 4;
Leu, Ile, Met или Val в положении 20;
Cys в положении 22;
Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24;
Gly в положении 26;
Ile, Phe, Leu или Ser в положении 29;
Trp в положении 36;
Trp в положении 47;
Ile, Met, Val или Leu в положении 48;
Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Tyr или Phe в положении 90; Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID NO: 3;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 77;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID NO: 2;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID NO: 4;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID NO: 6;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки: Val, Me или Gly в положении 2;
Leu или Val в положении 4;
Leu, Ile, Met или Val в положении 20;
Cys в положении 22;
Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24; Gly в положении 26; Ile, Phe, Leu или Ser в положении 29; Trp в положении 36; Trp в положении 47; Ile, Met, Val или Leu в положении 48; Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69; Arg в положении 71;
Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Tyr или Phe в положении 90; Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID NO: 3;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 77;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID NO: 2;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID NO: 4;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID NO: 6;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки: Val в положении 2;
Leu в положении 4; Leu в положении 20; Cys в положении 22; Ala в положении 24; Gly в положении 26; Phe в положении 29; Trp в положении 36; Trp в положении 47; Val в положении 48; Ile в положении 69; Arg в положении 71; Leu в положении 78; Leu в положении 80; Tyr в положении 90; Cys в положении 92; Arg в положении 94.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID NO: 3;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 77;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID NO: 2;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID NO: 4;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID NO: 6;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки: Val в положении 2;
Leu в положении 4; Leu в положении 20; Cys в положении 22; Ala в положении 24; Gly в положении 26; Phe в положении 29; Trp в положении 36; Trp в положении 47; Leu в положении 48;
Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala в положении 78;
Leu, Met в положении 80;
Tyr или Phe в положении 90;
Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
Антигенсвязывающие белки, например антитела по настоящему изобретению, могут быть получены трансфекцией клетки-хозяина вектором экспрессии, содержащим кодирующую последовательность антигенсвязывающего белка по изобретению. Вектор экспрессии или рекомбинантную плазмиду получают функциональным связыванием этих кодирующих последовательностей антигенсвязывающего белка с обычными регуляторными контрольными последовательностями, способными контролировать репликацию и экспрессию в клетке-хозяине и/или секрецию из клетки-хозяина. Регуляторные последовательности включают промоторные последовательности, например цитомегаловирусный (CMV) промотор, и сигнальные последовательности, которые могут иметь происхождение от других известных антител. Сходным образом, может быть получен второй вектор экспрессии, имеющий последовательность ДНК, кодирующую комплементарную легкую или тяжелую цепь антигенсвязывающего белка. В определенных воплощениях этот второй вектор экспрессии идентичен первому, за исключением кодирующих последовательностей и селектируемых маркеров, таким образом, чтобы обеспечить, по возможности, функциональную экспрессию каждой полипептидной цепи. Альтернативно, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей антигенсвязывающего белка могут быть расположены на одном векторе.
Выбранную клетку-хозяина котрансфицируют обычными методиками первым и вторым векторами (или просто трансфицируют одним вектором) с получением трансфицированной клетки-хозяина по изобретению, содержащей рекомбинантные или синтетические легкие и тяжелые цепи. Трансфицированную клетку-хозяина затем культивируют обычными методиками с получением конструированного антиген-связывающего белка по изобретению. Проводят скрининг антигенсвязывающего белка, содержащего ассоциацию рекомбинантной тяжелой цепи и/или легкой цепи, из культуры подходящим анализом, та
ким как ELISA или радиоиммунный анализ (RIA). Сходные обычные методики могут быть применены для конструирования других антигенсвязывающих белков.
Подходящие векторы для стадий клонирования и субклонирования, используемые в способах и изготовлении композиций по данному изобретению, могут быть выбраны специалистом в данной области техники. Например, можно использовать обычную серию клонирующих векторов pUC. Один вектор, pUC19, имеется в продаже от таких фирм-поставщиков, как Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) или Pharmacia (Uppsala, Sweden). Кроме того, для клонирования может быть использован любой простой в использовании вектор, способный к быстрой репликации и имеющий множество сайтов клонирования и селектируемых генов (например, генов устойчивости к антибиотикам). Таким образом, выбор клонирующего вектора не является ограничивающим фактором в данном изобретении.
Для векторов экспрессии могут также быть характерны гены, подходящие для усиления экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК, например ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) млекопитающих. Другие векторные последовательности включают сигнальную последовательность "поли-А", такую как соответствующая последовательность бычьего гормона роста (BGH) и последовательность промотора бета-глобина (betaglopro). Полезные здесь векторы экспрессии могут быть синтезированы методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Компоненты таких векторов, например репликоны, селектируемые гены, энхансеры, промоторы, сигнальные последовательности и т.п., могут быть получены из коммерческих или природных источников или синтезированы известными способами для использования в управлении экспрессией и/или секрецией продукта рекомбинантной ДНК в выбранном хозяине. Для этой цели могут также быть выбраны другие подходящие векторы экспрессии, многие типы которых известны в данной области техники для экспрессии у млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и грибов.
Настоящее изобретение также включает клеточную линию, трансформированную рекомбинантной плазмидой, содержащей кодирующие последовательности антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению. Клетки-хозяева, полезные для клонирования и других манипуляций с этими клонирующими векторами, также хорошо известны. Однако для репликации клонирующих векторов и других стадий конструирования антигенсвязывающих белков по данному изобретению могут быть использованы клетки различных штаммов B.coli.
Подходящие клетки-хозяева или клеточные линии для экспрессии антигенсвязывающих белков по изобретению включают клетки млекопитающих, такие как NSO (клетки миеломы мыши NSO), Sp2/0 (клетки мышиной миеломы Sp2/0), CHO (клетки яичника китайского хомячка) (например, DG44), COS (клетки африканской зеленой мартышки), HEK (эмбриональные клетки почек), фибробласты (например, 3Т3) и клетки миеломы, например, возможна экспрессия в клетке СНО или клетке миеломы. Могут быть использованы клетки человека, что позволяет модифицировать молекулу человеческими паттернами гликозилирования.
Альтернативно, могут быть использованы другие эукариотические клеточные линии. Выбор подходящих клеток-хозяев, являющихся клетками млекопитающих, и способов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга, а также получения и очистки продукта известны в данной области техники. См., например, Sambrook et al., процитированную выше.
Бактериальные клетки могут быть полезными в качестве клеток-хозяев, подходящих для экспрессии рекомбинантных Fab или для других воплощений настоящего изобретения (см., например, Pluckthun,
A. , Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Тем не менее, ввиду тенденции белков, экспрессированных в бактериальных клетках, к несвернутой, или неправильно свернутой форме, или негликозилированной форме, будет необходимо проводить скрининг любого рекомбинантного Fab, полученного в бактериальной клетке, на предмет сохранения способности связываться с антигеном. Если молекула, экспрессированная бактериальной клеткой, получена в правильно свернутой форме, эта бактериальная клетка является желаемым хозяином, или, в альтернативных воплощениях, возможна экспрессия молекулы в бактериальном хозяине с последующим рефолдингом. Например, различные штаммы E.coli, используемые для экспрессии, хорошо известны в качестве клеток-хозяев в области биотехнологии. Различные штаммы
B. subtilis, Streptomyces, другие бациллы и т.п. могут быть также использованы в данном способе.
Там, где желательно, в качестве клеток-хозяев также доступны штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области техники, а также клетки насекомых, например Drosophila и Lepidop-tera, и вирусные системы экспрессии. См., например, Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) и приведенные там ссылки.
Общие способы конструирования векторов, способы трансфекции, необходимые для получения клеток-хозяев по изобретению, и способы культивирования, необходимые для получения антигенсвязы-вающего белка по изобретению из такой клетки-хозяина, могут представлять собой обычные методики. Обычно способ культивирования по настоящему изобретению представляет собой свободный от сыворотки способ культивирования, обычно свободное от сыворотки культивирование клеток в суспензии. Сходным образом, после получения антигенсвязывающие белки по изобретению могут быть очищены от содержимого клеточной культуры стандартными способами данной области техники, включая преципитацию с сульфатом аммония, аффинные колонки, хроматографию на колонках, электрофорез в геле и т.п.
Такие методики входят в компетенцию специалиста в данной области техники и не ограничивают объем данного изобретения. Например, препараты измененных антител описаны в WO 99/58679 и
WO 96/16990.
В еще одном способе экспрессии антигенсвязывающих белков может быть применена экспрессия в трансгенном животном, например, как описано в патенте США № 4873316. Это относится к системе экспрессии с использованием промотора животного казеина, который при его трансгенном введении млекопитающему позволяет получать желаемый рекомбинантный белок в молоке самки.
В другом воплощении изобретения предложен способ получения антитела по изобретению, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором, кодирующим легкую и/или тяжелую цепь антитела по изобретению, и выделения полученного таким образом антитела.
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения антитела против OSM по настоящему изобретению, связывающегося с человеческим OSM и нейтрализующего его активность, включающий стадии:
а) обеспечение первого вектора, кодирующего тяжелую цепь антитела;
б) обеспечение второго вектора, кодирующего легкую цепь антитела;
в) трансформация клетки-хозяина, являющейся клеткой млекопитающего (например, СНО), указан-
ными первым и вторым векторами;
г) культивирование клетки-хозяина по стадии (в) в условиях, способствующих секреции антитела
из указанной клетки-хозяина в указанную культуральную среду;
д) выделение секретированного антитела по стадии (г).
После экспрессии антитела желаемым способом исследуют его активность in vitro с применением подходящего анализа. В настоящее время для качественной и количественной оценки связывания антитела с OSM применяют обычные форматы ELISA-анализа. Кроме того, другие анализы in vitro могут также быть применены для верификации эффективности нейтрализации перед последующими клиническими исследованиями у людей, проводимыми для оценки сохранения антитела в организме, несмотря на обычные механизмы клиренса.
Доза и продолжительность лечения связаны с относительным сохранением молекул по настоящему изобретению в системе кровообращения у человека и могут быть скорректированы специалистом в данной области техники, в зависимости от состояния, по поводу которого проводят лечение, и общего состояния здоровья пациента. Предполагают, что для достижения максимальной терапевтической эффективности может быть необходимо повторное введение (например, один раз в неделю или один раз в две недели) на протяжении продолжительного периода времени (например, от четырех до шести месяцев).
В одном воплощении настоящего изобретения предложена рекомбинантная трансформированная, трансфицированная или трансдуцированная клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну экспрес-сионную кассету, например экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антигенсвязывающего белка по изобретению, описанного здесь, и дополнительно содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антигенсвязывающего белка по изобретению, описанного здесь, или две экспрессионные кассеты, из которых первая кодирует легкую цепь и вторая кодирует тяжелую цепь. Например, в одном воплощении первая экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антигенсвязывающего белка, содержащую ее константную область или анти-генсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, по изобретению, описанную здесь, и дополнительно содержит вторую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь анти-генсвязывающего белка, содержащую ее константную область или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, по изобретению, описанную здесь, например, первая экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, выбранную из SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 76, и вторую экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, выбранную из SEQ ID NO: 72.
Следует понимать, что последовательности, описанные здесь (SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 83), включают последовательности, по существу идентичные, например последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные, например, по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичные последовательностям, описанным здесь.
Для нуклеиновых кислот термин "по существу идентичный" означает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности, при их оптимальном выравнивании и сравнении, идентичны, с подходящими нуклеотидными вставками или делециями, по меньшей мере в приблизительно 80% нуклеотидов, по меньшей мере от приблизительно 90 до приблизительно 95% или по меньшей мере от приблизительно 98 до приблизительно 99,5% нуклеотидов. Альтернативно, по существу идентичными являются сегменты, гибридизующиеся в условиях селективной гибридизации с последовательностью, комплементарной данной цепи.
Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин "идентичный" обозначает степень идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей при оптимальном выравнивании и сравнении с использованием подходящих вставок или делеций. Альтернативно, по существу идентичными являются сегменты ДНК, гибридизующиеся в условиях селективной гибридизации с последовательностью, комплементарной данной цепи.
В другом воплощении изобретения предложена стабильно трансформированная клетка-хозяин, содержащая вектор, содержащий одну или более экспрессионных кассет, кодирующих тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела, содержащие их константную область или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, как описано здесь. Например, такие клетки-хозяева могут содержать первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий тяжелую цепь, например, первый вектор кодирует тяжелую цепь, выбранную из SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 76, и второй вектор кодирует легкую цепь, например, легкую цепь SEQ ID NO: 72.
В другом воплощении настоящего изобретения предложена клетка-хозяин по изобретению, описанная здесь, представляющая собой эукариотическую клетку, например, представляющая собой клетку млекопитающего. Примеры таких клеточных линий включают СНО или NSO.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ получения антитела, содержащего его константную область или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, по изобретению, описанного здесь, включающий стадию культивирования клетки-хозяина в культуральных средах, например, свободных от сыворотки культуральных средах.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ по изобретению, описанный здесь, где указанное антитело дополнительно очищают до степени очистки по меньшей мере 95% или более (например, 98% или более), по сравнению с указанным антителом, содержащим свободные от сыворотки культуральные среды.
В еще одном воплощении предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязы-вающий белок и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен набор, содержащий композицию по изобретению, описанную здесь, вместе с инструкциями по применению.
Способ введения терапевтического агента по изобретению может представлять собой любой подходящий способ введения, обеспечивающий доставку агента хозяину. Антигенсвязывающие белки и фармацевтические композиции по изобретению особенно полезны для парентерального введения, т.е. подкожного (п/к), интратекального, внутрибрюшинного, внутримышечного (в/м) или внутривенного (в/в).
Терапевтические агенты по изобретению могут быть изготовлены в форме фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антигенсвязывающего белка по изобретению в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. В одном воплощении профилактический агент по изобретению представляет собой водную суспензию или раствор, содержащий антигенсвя-зывающий белок в форме, готовой для инъекции. В одном воплощении суспензия или раствор забуфере-ны при физиологическом рН. В одном воплощении композиции для парентерального введения будут содержать раствор антигенсвязывающего белка по изобретению или их смесь, растворенную в фармацевтически приемлемом носителе. В одном воплощении носитель представляет собой водный носитель. Может быть использовано множество водных носителей, например, 0,9% физиологический раствор, 0,3% глицин и т.п. Эти растворы могут быть стерилизованы и в целом свободны от твердых частиц. Эти растворы могут быть стерилизованы обычными хорошо известными методиками стерилизации (например, фильтрацией). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такого как коррекция рН, буферные агенты и так далее. Концентрация антигенсвязывающего белка по изобретению в такой фармацевтической композиции может варьировать в широких пределах, т.е. от менее чем приблизительно 0,5%, обычно от 1% или по меньшей мере от приблизительно 1 до приблизительно 15 или 20 мас.%, и ее выбор будет основан главным образом на объемах жидкости, вязкости и т.д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Таким образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутримышечной инъекции может быть изготовлена таким образом, что она содержит приблизительно 1 мл стерильной забуферен-ной воды и от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мг, например от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг или от приблизительно 5 до приблизительно 25 мг антигенсвязывающего белка, например антитела по изобретению. Сходным образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутривенной инфузии может быть изготовлена таким образом, что она содержит приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и от приблизительно 1 до приблизительно 30 или от 5 до приблизительно 25 мг антигенсвязывающего белка по изобретению на мл раствора Рингера. Современные способы изготовления композиций для парентерального введения хорошо известны или будут очевидны специалистам в данной области техники и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Относительно изготовления композиций с антигенсвязывающими белками по изобретению для внутривенного введения см. Lasmar U. and Parkins D. "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech. today, page 129-137, Vol. 3 (3rd
April 2000); Wang, W. "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein Pharmaceuticals", Int. J. Pharm. 185 (1999), 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and В ed/ Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992); Akers, M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm. Sci. 91 (2002), 2283-2300; Imamura, K. et al. "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J. Pharm. Sci. 92 (2003), 266-274; Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J. Pharm. Pharmacol., 54 (2002), 1033-1039; Johnson, R., "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci., 91 (2002), 914922 и На, Е. Wang W., Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm. Sci., 91, 2252-2264 (2002), содержание которых полностью включено сюда посредством ссылки и к которым следует обращаться читателю.
В одном воплощении терапевтический агент по изобретению, присутствующий в фармацевтическом препарате, представлен в стандартных лекарственных формах. Подходящая терапевтически эффективная доза будет легко определена специалистами в данной области техники. Подходящие дозы могут быть вычислены для пациентов в соответствии с их массой тела, например, подходящие дозы могут быть в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг, например от приблизительно 1 приблизительно 20 мг/кг, например от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг или, например от приблизительно 1 до приблизительно 15 мг/кг, например от приблизительно 10 до приблизительно 15 мг/кг. Для эффективного лечения таких состояний, как астма или IPF, у человека подходящие дозы могут быть в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мг, например от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 мг, например приблизительно 500 мг, например от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 80 мг, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 60 мг, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 40 мг, или, например, от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг, или от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг антигенсвязы-вающего белка по данному изобретению, который может быть введен парентерально, например подкожно, внутривенно или внутримышечно. По необходимости, такая доза может быть введена повторно через подходящие интервалы времени, подходящим образом выбранные врачом.
Антигенсвязывающие белки, описанные здесь, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Показано, что эта методика эффективна при использовании обычных иммуноглобулинов, и могут быть применены известные в данной области техники методики лиофилизации и восстановления.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительной артропатией, такой как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного заболеванием или расстройством, выбранным из диабета 1 типа, псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки), атопического дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), пневмонии, эозинофильного эзофагита, системного склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена, склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гиган-токлеточный (височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера, болезнь Кавасаки, изолированный васкулит центральной нервной системы (CNS), артериит Чарджа-Стросса, микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит (аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный криоглобулинемический васкулит), недифференцированной спонди-лоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), идиопа-тической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь. Любое одно или более из приведенных выше заболеваний может быть заболеванием-мишенью для способа лечения по изобретению.
В определенном аспекте заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из остеоарт-рита (ОА), псориаза, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза (SS), синдрома Шегре-на, склеродермии или рассеянного склероза (MS).
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой остеоарт-
рит.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой псориаз.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание или расстройство представляет собой фиброзирующее заболевание или расстройство.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой идиопа-тический фиброз легких (IPF).
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой системный склероз (SS).
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой синдром Шегрена.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой склеродермию.
В другом аспекте изобретения предложен способ уменьшения или предотвращения деструкции хряща у пациента-человека, страдающего от такой деструкции (или предрасположенного к ней), включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка указанному пациенту, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ уменьшения образования TNF-альфа у пациента, пораженного заболеванием или расстройством, чувствительным к снижению TNF-альфа, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязы-вающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте изобретения предложен способ лечения внесуставных проявлений артритического заболевания или расстройства, например синдрома Фелти, и/или лечения образования атеросклероти-ческих бляшек, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антигенсвязы-вающего белка, как описано здесь, пациенту-человеку, страдающему от внесуставных проявлений артритического заболевания или расстройства.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного заболеванием, имеющим происхождение от эндотелиальных клеток, включающий стадии введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного фиброзирующими заболеваниями или расстройствами, такими как идиопатический фиброз легких, прогрессирующий системный склероз (склеродермия), фиброз печени, гранулемы печени, шистосомоз и лейшманиоз, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного заболеванием или расстройством центральной нервной системы, таким как рассеянный склероз (MS), болезнь Альцгеймера (AD) и другие деменции, что помимо этого связано с применением в лечении боли, в частности нейропатической и/или воспалительной боли, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
Также предложено применение антигенсвязывающего белка, как описано здесь, в изготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний и расстройств, как описано здесь.
Например, в одном аспекте изобретения предложено применение антигенсвязывающего белка, как описано здесь, для применения в лечении или профилактике заболеваний и расстройств, чувствительных к модуляции взаимодействия между hOSM и gp130.
В другом аспекте изобретения предложено применение антигенсвязывающего белка, как описано здесь, для применения в лечении или профилактике воспалительной артропатии, такой как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение антигенсвязывающего белка, как описано здесь, для применения в лечении или профилактике заболевания или расстройства, выбранного из диабета 1 типа, псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки), атопического дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), пневмонии, эозинофильного эзофаги-та, системного склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена, склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гигантоклеточный (височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера, болезнь Кавасаки, изолированный васкулит CNS, артериит Чарджа-Стросса, микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит (аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный криоглобулинемический васкулит), недифференцированной спондилоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерозирующего холанги-та (PSC), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антиген-связывающего белка, как описано здесь.
Например, в определенном аспекте предложено применение антигенсвязывающего белка для применения в лечении или профилактике остеоартрита (ОА), псориаза, идиопатического фиброза легких (IPF) или рассеянного склероза (MS).
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны далее в подробном описании изобретения и его воплощениях.
В одном аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент и фарма
цевтически приемлемый носитель, для лечения или профилактики воспалительных заболеваний и/или расстройств, например, воспалительной артропатии, такой как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит, или заболеваний и/или расстройств, выбранных из диабета 1 типа, псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки), атопического дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), пневмонии, эо-зинофильного эзофагита, системного склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена, склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гигантоклеточный (височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера, болезнь Кавасаки, изолированный васкулит CNS, артериит Чарджа-Стросса, микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит (аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный криоглобулинемический васкулит), недифференцированной спондилоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерози-рующего холангита (PSC), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка по изобретению, как описано здесь, например, предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, включающий стадию введения фармацевтической композиции, содержащей антигенсвя-зывающий белок по изобретению, как описано здесь, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В другом воплощении предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным, например, из воспалительной артропатии, такой как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит, или выбранным из диабета 1 типа, псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки), атопиче-ского дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), пневмонии, эозинофильного эзофагита, системного склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена, склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гигантоклеточный (височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера, болезнь Кавасаки, изолированный вас-кулит CNS, артериит Чарджа-Стросса, микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит (аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный криоглобулинеми-ческий васкулит), недифференцированной спондилоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы.
В альтернативном аспекте изобретения предложен способ гуманизации антитела, не являющегося человеческим антителом, или его фрагмента, включающий стадии:
а) перенос одного или более CDR, не являющихся человеческими CDR, на человеческую акцептор-
ную каркасную область с получением химерного или гуманизированного антитела;
б) связывание химерного или гуманизированного антитела с его антигеном;
в) определение остатков антитела, непосредственно вовлеченных в связывание с антигеном;
г) мутация одного или более остатков, не вовлеченных в стадию (в), с их заменой остатками чело-
веческой эмбриональной последовательности;
д) выделение указанного антитела.
В другом аспекте остатки антитела, вовлеченные в связывание с антигеном, могут быть определены кристаллографией, гомологичным моделированием, стыковкой белков, мутагенезом или линейным пептидным картированием.
Например, в одном таком аспекте изобретения, как описано здесь, получают кристаллографическую структуру сокристалла "антитело-антиген" и остатки, вовлеченные в связывание, определяют с точностью приблизительно 2-5 А.
Термин "не являющийся человеческим" включает любое антитело, в котором возможны некоторые мутации или замены, приближающие его к человеческой эмбриональной последовательности, снижая, таким образом, вероятность иммуногенности.
В одном аспекте по меньшей мере один CDR заменен эмбриональной последовательностью. В другом аспекте по меньшей мере два CDR заменены эмбриональной последовательностью. В еще одном аспекте по меньшей мере 5 остатков заменены остатками эмбриональной последовательности, например по меньшей мере 7, или по меньшей мере 8, или по меньшей мере 9, или по меньшей мере 10 остатков заменены остатками эмбриональной последовательности.
Перенос моноклональных антител, не являющихся человеческими антителами, или их фрагментов, на человеческие акцепторные последовательности часто связан с внесением дополнительных изменений в каркасные области для восстановления правильного взаимодействия CDR-участков с антигеном; это
часто называют обратными мутациями. В одном воплощении настоящего изобретения для восстановления правильного взаимодействия CDR-участков с антигеном необходимы обратные мутации.
В альтернативном воплощении человеческая акцепторная каркасная область может быть включена в антитело с одним или более CDR, не являющимися человеческими CDR, с получением химерного антитела. В еще одном альтернативном воплощении последовательность может быть получена синтезом олигонуклеотидов.
CDR (или остатки гипервариабельных участков) антитела, не являющегося человеческим антителом, включают в акцепторные каркасные области человеческих VL и/или VH. Например, возможно включение остатков, соответствующих остаткам CDR по Kabat, остаткам гипервариабельных петель по Cho-thia, остатков Abm и/или контактных остатков.
В одном воплощении предложен способ гуманизации антитела, включающий стадии:
а) получение антитела, не являющегося человеческим антителом, связывающегося с целевым анти-
геном;
б) определение кристаллографической структуры сокристалла "антитело-антиген";
в) определение на основании кристаллической структуры с точностью приблизительно 2-5 А (0,2-
0,5 нм) остатков антитела, не являющегося человеческим антителом, непосредственно вовлеченных в
связывание с антигеном;
г) мутация одного или более остатков, не вовлеченных в стадию (в), с их заменой остатками, име-
ющими происхождение от человеческой последовательности;
д) выделение указанного антитела.
В другом воплощении способов, описанных здесь, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном. Например, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном, по сравнению с антителом, не являющимся человеческим антителом. Например, антитело по стадии (д) имеет аффинность связывания (KD) в пределах или лучше 10-кратной аффинности антитела, не являющегося человеческим антителом, по стадии (а), например, антитело по стадии (д) имеет аффинность связывания (KD) в пределах или лучше 3-5-кратной аффинности антитела, не являющегося человеческим антителом, по стадии (а).
Например, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном в пределах 1000 нМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 500 нМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 100 нМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore. Например, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном в пределах 500 пМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 300 пМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 100 пМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore. Например, антитело по стадии (д) связывается с его антигеном с аффинностью (KD), равной или менее 400 пМ, или равной или менее 300 пМ, или равной или менее 200 пМ, или равной или менее 140 пМ.
В другом воплощении способов, описанных здесь, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют те же канонические структуры, что и антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими.
В еще одном воплощении антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими, имеют происхождение от животного, не являющегося человеком, например мыши, крысы, кролика, представителя семейства верблюдовых или акулы.
В другом воплощении антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими, имеют происхождение от мыши.
В еще одном воплощении антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими, представляют собой моноклональное антитело, поликлональное антитело или мультиспецифичное антитело, или они могут представлять собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, например отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представителя семейства верблюдовых или акулы, или они могут представлять собой домен, являющийся производным белкового каркаса, не являющегося человеческим и не являющегося антителом.
В еще одном воплощении антитело, не являющееся человеческим антителом, представляет собой моноклональное антитело.
В одном воплощении способов, описанных здесь, в человеческую акцепторную последовательность включены по меньшей мере 2 CDR, не являющихся человеческими CDR, или в человеческую акцепторную последовательность включены по меньшей мере 3 CDR, или по меньшей мере 4 CDR, или по меньшей мере 5 CDR, или все 6 CDR.
В другом воплощении способов, описанных здесь, остатки, подлежащие мутации с их заменой остатками, имеющими происхождение от человеческой последовательности, непосредственно не вовлеченные в связывание с антигеном и еще не являющиеся человеческими, могут представлять собой остатки CDR, или каркасных областей, или как CDR, так и каркасных областей. В другом воплощении прово
дят мутацию по меньшей мере 1 CDR с его заменой человеческой эмбриональной последовательностью, или проводят мутацию по меньшей мере 2 CDR, или проводят мутацию по меньшей мере 3 CDR, или проводят мутацию по меньшей мере 4 CDR.
В еще одном воплощении проводят мутацию по меньшей мере 5 остатков с их заменой человеческой эмбриональной последовательностью, или проводят мутацию по меньшей мере 7 остатков, или по меньшей мере 10 остатков, или по меньшей мере 15 остатков, или по меньшей мере 20 остатков,
или по меньшей мере 40 остатков, или по меньшей мере 60 остатков с их заменой человеческой эмбриональной последовательностью.
В еще одном воплощении способов, описанных здесь, остатки антитела, непосредственно вовлеченные в связывание с антигеном, определяют с точностью приблизительно 2-5 А, или приблизительно 3-5 А, или приблизительно 3-4 А, или приблизительно 3,5 А.
В еще одном воплощении способов, описанных здесь, предложено антитело, получаемое таким способом.
Определения
При использовании здесь термин "антигенсвязывающий белок" относится к антителам, фрагментам антител и другим белковым конструкциям, способным связываться с человеческим OSM и нейтрализовать его.
Термины Fv, Fc, Fd, Fab или F(ab)2 использованы в их стандартных значениях (см., например, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
Термин "антитело" использован здесь в наиболее широком смысле и, конкретно, включает моно-клональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела).
При использовании здесь термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популяции, по существу, однородной антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных происходящих естественным образом мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены против одного антигенного сайта связывания. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, обычно содержащих разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене.
"Химерное антитело" относится к типу конструированного антитела, где часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющим происхождение от донорного антитела определенного класса или подкласса, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющим происхождение от другого вида или принадлежащим другому классу или подклассу антител, а также к фрагментам таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567 и Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855) (1984)).
"Гуманизированное антитело" относится к типу конструированного антитела, один или более CDR которого имеют происхождение от донорного иммуноглобулина, не являющегося человеческим, а оставшиеся части молекулы, имеющие происхождение от иммуноглобулинов, имеют происхождение от одного (или более) человеческого иммуноглобулина (иммуноглобулинов). Кроме того, поддерживающие остатки каркасной области могут быть изменены для сохранения аффинности связывания (см., например, Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Подходящее человеческое антитело-акцептор может представлять собой антитело, выбранное из обычной базы данных, например базы данных КАВАТ(r), базы данных Los Alamos и базы данных Swiss Protein, по гомологии нуклеотидным и аминокислотным последовательностям донорного антитела. Человеческое антитело, характеризующееся гомологией каркасным областям донорного антитела (на аминокислотной основе), может быть подходящим для обеспечения константной области тяжелой цепи и/или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи для введения донорных CDR. Сходным образом можно выбрать подходящее акцепторное антитело, которое может быть источником константных доменов легкой цепи или каркасных областей вариабельного домена легкой цепи. Следует отметить, что нет необходимости в том, чтобы тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела имели происхождение от одного и того же акцепторного антитела. В предшествующем уровне техники описаны несколько способов получения таких гуманизированных антител, см., например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.
В зависимости от обстоятельств для полинуклеотидов и полипептидов "идентичность" означает сравнение, вычисленное с применением алгоритма, представленного в (1) и (2) ниже.
(1) Идентичность полинуклеотидов вычисляют, умножая общее число нуклеотидов в данной последовательности на целое число, определяющее процент идентичности, разделенное на 100, с последующим вычитанием полученного числа из указанного общего числа нуклеотидов в указанной последовательности:
пп < хп - (хп * у),
где nn представляет собой число нуклеотидных изменений;
xn представляет собой общее число нуклеотидов в данной последовательности; y представляет собой 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%;
• является символом оператора умножения, и
где любое нецелое произведение xn и y округляют в сторону уменьшения до ближайшего целого числа перед его вычитанием из xn.
Изменения полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, могут приводить к появлению нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки считывания в этой кодирующей последовательности и посредством этого изменять полипептид, кодируемый полинуклеотидом после таких изменений.
(2) Идентичность полипептидов вычисляют, умножая общее число аминокислот на целое число, определяющее процент идентичности, разделенный на 100, с последующим вычитанием полученного числа из указанного общего числа аминокислот:
па й ха - (ха • у),
где na представляет собой число аминокислотных изменений;
xa представляет собой общее число аминокислот в последовательности;
y представляет собой 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%;
• является символом оператора умножения, и
где любое нецелое произведение xa и y округляют в сторону уменьшения до ближайшего целого числа перед его вычитанием из xa.
"Выделенный" означает измененный "рукой человека" из его естественного состояния, измененный или извлеченный из его исходной среды, или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественным образом присутствующий в живом организме, не является "выделенным", но тот же поли-нуклеотид или полипептид, отделенный от веществ, с которыми он сосуществует в его естественном состоянии, является "выделенным", включая, без ограничения, случаи, когда такой полинуклеотид или полипептид введен обратно в клетку, даже если эта клетка представляет собой клетку того же вида или типа, что и клетка, из которой был выделен этот полинуклеотид или полипептид.
В настоящем описании и последующей формуле изобретения термины "содержащий/включающий" и "содержит/включает" включают "состоящий из" и "состоит из". То есть, предполагают, что эти слова означают возможное включение других элементов или целых, не указанных конкретно, там, где позволяет контекст.
При использовании в настоящем описании в связи с антигенсвязывающими белками по изобретению термин "специфично связывается" означает, что антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM (hOSM) без связывания с другими человеческими белками или с несущественным связыванием с ними. Тем не менее, термин не исключает того факта, что антигенсвязывающие белки по изобретению могут также быть перекрестно реактивными в отношении других форм OSM, например OSM приматов.
При использовании в данном описании в связи с в связи с антигенсвязывающими белками по изобретению термин "непосредственное взаимодействие" означает, что при связывании антигенсвязываю-щего белка с человеческим OSM (hOSM) определенные остатки антигенсвязывающего белка расположены в пределах 3,5 А (0,35 нм) от определенных остатков hOSM.
При использовании в настоящем описании в связи с в связи с антигенсвязывающими белками по изобретению термин "ингибирование" означает, что биологическая активность OSM снижена в присутствии антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению, по сравнению с активностью OSM в отсутствие таких антигенсвязывающих белков. Ингибирование может быть обусловлено, но не ограничено, связыванием с одним или более блокирующим лигандом, предотвращением активации рецептора лигандом, "даун"-регуляцией OSM или воздействием на эффекторную функцию. Антитела по изобретению могут нейтрализовать OSM. Уровни нейтрализации могут быть измерены несколькими способами, например, с применением анализов, как изложено в примерах ниже, например, в разделе 2.2.1, в KB-клеточном анализе нейтрализации. OSM способен индуцировать высвобождение интерлейкина-6 из клеток KB посредством передачи сигнала через комплекс Gp130/OSMR. Нейтрализацию OSM в этом анализе измеряют, оценивая способность моноклональных антител против OSM ингибировать образование IL-6.
Если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны к нейтрализации, это указывает на ингибирование взаимодействия человеческого OSM с его рецептором gp130. Антитела, рассматриваемые как антитела, обладающие нейтрализующей активностью против человеческого OSM, будут иметь IC50 менее 10 мкг/мл, или менее 5 мкг/мл, или менее 2 мкг/мл, или менее 1 мкг/мл, или менее 0,1 мкг/мл в KB-клеточном анализе нейтрализации, как изложено в примере 2.2.1.
"CDR" определены как области аминокислотных последовательностей антитела, определяющие комплементарность, представляющие собой гипервариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. В вариабельной части иммуноглобулина присутствуют три CDR (или CDR-участка) тяжелой цепи и три CDR (или CDR-области) легкой цепи. Таким образом, при использовании здесь "CDR"
может относиться ко всем трем CDR тяжелой цепи или всем трем CDR легкой цепи (или, если это уместно, всем CDR тяжелой цепи и всем CDR легкой цепи).
CDR обеспечивают большинство контактных остатков для связывания антитела с антигеном или эпитопом. Рассматриваемые в данном изобретении CDR имеют происхождение от последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей донорного антитела и включают аналоги встречающихся в природе CDR, также имеющие или сохраняющие ту же специфичность связывания антигена и/или нейтрализующую способность, что и донорное антитело, от которого они имеют происхождение.
Последовательности CDR антител могут быть определены по системе нумерации Kabat (Kabat et al; (Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)), альтернативно, они могут быть определены с использованием системы нумерации Chothia (Al-Lazikani et al. (1997), JMB, 273, 927-948), способа контактного определения (MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J.M. (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) или любого другого принятого способа нумерации остатков антитела и определения CDR, известного специалисту в данной области техники.
Другие системы нумерации последовательностей CDR, доступные специалисту в данной области техники, включают способ "AbM" (University of Bath) и "контактный" способ (University College London). Для получения "минимальной связывающей единицы" может быть определена минимальная область, общая для по меньшей мере двух способов из способов Kabat, Chothia, AbM и контактного способа. Минимальная связывающая единица может представлять собой небольшую часть CDR.
В табл. 1 представлено одно определение с использованием каждой системы нумерации для каждого CDR или связывающей единицы. В табл. 1 для нумерации аминокислотной последовательности вариабельного домена использована схема нумерации Kabat. Следует отметить, что некоторые определения CDR могут варьировать в зависимости от конкретной используемой публикации.
CDR по Kabat
CDR по Chothia
CDR по AbM
CDR, определенные контактным способом
Минимальная связывающая единица
31-35/35А/35В
2632/33/34
26-35/35А/35В
30-35/35А/35В
31-32
50-65
52-56
50-58
47-58
52-56
95-102
95-102
95-102
93-101
95-101
24-34
24-34
24-34
30-36
30-34
50-56
50-56
50-56
46-55
50-55
89-97
89-97
89-97
89-96
89-96
В данном описании аминокислотные остатки последовательностей антител пронумерованы по схеме Kabat. Сходным образом, термины "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" соответствуют системе нумерации Kabat, как изложено в Kabat et al.; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987.
Термины "VH" и "VL" использованы здесь для обозначения вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи антитела соответственно.
При использовании здесь термин "домен" относится к свернутой белковой структуре, третичная структура которой не зависит от остальной части белка. Обычно домены обеспечивают дискретные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перемещены на другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена.
"Отдельный вариабельный домен антитела" представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Таким образом, он включает полноразмерные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петель были заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые были процессированы или содержат N- или С-концевые удлиняющие сегменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, сохраняющие, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Фраза "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), специфично связывающемуся с антигеном или эпитопом, независимо от других вариабельных области или домена. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимера) с другими отличающимися вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не являются необходимыми для связывания антигена отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина (т.е. где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Однодоменное антитело" или "dAb" представляет собой то же, что "отдельный ва
риабельный домен иммуноглобулина", способный связываться с антигеном, как данный термин использован здесь. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может представлять собой вариабельный домен человеческого антитела, но также включает отдельные вариабельные домены антител других видов, таких как грызуны (например, как раскрыто в WO 00/29004), акулы-няньки и VHH dAb представителей семейства верблюдовых. VHH представителей семейства верблюдовых представляют собой полипептиды отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов, имеющие происхождение от видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, одногорбого верблюда и гуанако, образующих антитела из тяжелых цепей, естественным образом лишенные легких цепей. Такие домены VHH могут быть гуманизированы стандартными методиками, доступными в данной области техники, и такие домены все еще рассматривают как "однодоменные антитела" по изобретению. При использовании здесь "VH" включает домены VHH представителей семейства верблюдовых. NARV являются отдельными вариабельными доменами иммуноглобулинов другого типа, которые были обнаружены у хрящевых рыб, включая акулу-няньку. Эти домены также известны как вариабельные области нового антигенного рецептора (Novel Antigen Receptor) (обычно сокращаемые как V(NAR) или NARV). Более подробно см. Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) и US 20050043519 А.
Термин "эпитопсвязывающий домен" относится к домену, специфично связывающему антиген или эпитоп независимо от других вариабельных области или домена; он может представлять собой однодо-менное антитело (dAb), например, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина человека, представителя семейства верблюдовых или акулы, или он может представлять собой домен, являющийся производным каркаса, выбранного из группы, состоящей из CTLA-4 (эвитело (Evibody)); липокалина; молекул, имеющих происхождение от белка А, таких как Z-домен белка А (аффитело (Affibody), SpA), А-домен (авимер (Avimer)/Maxibody); белков теплового шока, таких как GroEl и GroES; трансферрина (транстело (Trans-body)); белка с анкириновыми повторами (DARPin); пептидного аптамера; домена лектина С-типа (тетранектин (Tetranectin)); человеческого у-кристаллина и человеческого убиквитина (аффилины (affilin)); PDZ-доменов; токсина скорпиона; доменов человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца и фибронектина (аднектин (adnectin)); которые были подвержены конструированию белков для получения связывания с лигандом, отличающимся от природного лиганда.
CTLA-4 (антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами) представляет собой рецептор семейства CD28, экспрессированный, главным образом, на CD4+ Т-клетках. Его внеклеточный домен имеет характерную для иммуноглобулинов структуру, подобную вариабельному домену. Петли, соответствующие CDR антител, могут быть заменены гетерологичной последовательностью для придания различных свойств связывания. Молекулы CTLA-4, конструированные таким образом, чтобы они имели другие специфичности связывания, также известны как эвитела. Более подробно см. Journal of Immunological Methods, 248 (1-2), 31-45 (2001).
Липокалины представляют собой семейство внеклеточных белков, осуществляющих транспорт малых гидрофобных молекул, таких как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Они имеют ригидную р-складчатую вторичную структуру с несколькими петлями на открытом конце конической структуры, которые могут быть конструированы для связывания различных целевых антигенов. Размер антикалинов составляет 160-180 аминокислот, и они имеют происхождение от липокалинов. Более подробно см. Bio-chim Biophys Acta, 1482: 337-350 (2000), US 7250297 B1 и US 20070224633.
Аффитело представляет собой каркас, имеющий происхождение от белка A Staphylococcus aureus, который может быть конструирован для связывания антигена. Домен состоит из трехспирального пучка из приблизительно 58 аминокислот. При рандомизации поверхностных остатков были получены библиотеки. Более подробно см. Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004) и ЕР 1641818 А1.
Авимеры представляют собой многодоменные белки, имеющие происхождение от семейства каркасов А-домена. Нативные домены из приблизительно 35 аминокислот принимают определенную структуру, связанную дисульфидными связями. Появление разнообразия обусловлено перетасовкой природного разнообразия, демонстрируемого семейством А-доменов. Более подробно см. Nature Biotechnology, 23(12), 1556-1561 (2005) и Expert Opinion on Investigational Drugs, 16(6), 909-917 (June 2007).
Трансферрин представляет собой мономерный транспортный гликопротеин сыворотки. Трансфер-рины могут быть конструированы для связывания различных целевых антигенов введением пептидных последовательностей в случайную поверхностную петлю. Примеры конструированных трансферриновых каркасов включают транстело (Trans-body). Более подробно см. J. Biol. Chem. 274, 24066-24073 (1999).
Конструированные белки с анкириновыми повторами (DARPins) имеют происхождение от анкири-на, представляющего собой семейство белков, опосредующих присоединение интегральных мембранных белков к цитоскелету. Один анкириновый повтор представляет собой мотив из 33 остатков, состоящий их двух а-спиралей и одного р-поворота. Они могут быть конструированы для связывания различных целевых антигенов рандомизацией остатков первой а-спирали и р-поворота каждого повтора. Их связывающая поверхность может быть расширена увеличением числа модулей (способ созревания аффинности). Более подробно см. J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003), J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) и US 20040132028А1.
Фибронектин представляет собой каркас, который может быть конструирован для связывания антигена. Аднектины состоят из остова природной аминокислотной последовательности 10 домена из 15 повторяющихся единиц человеческого фибронектина III типа (FN3). Три петли на одном конце р-сэндвича могут быть конструированы для придания аднектину способности специфично распознавать интересующую терапевтическую мишень. Более подробно см. Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US 20080139791, WO 2005/056764 и US 6818418 B1.
Пептидные аптамеры представляют собой комбинаторные молекулы распознавания, состоящие из константного каркасного белка, обычно тиоредоксина (TrxA), содержащие напряженную вариабельную пептидную петлю, введенную в активный сайт. Более подробно см. Expert Opin. Biol. Ther., 5, 783-797
(2005).
Микротела имеют происхождение от встречающихся в природе микробелков длиной 25-50 аминокислот, содержащих 3-4 цистеиновых связи; примеры микробелков включают KalataBI, конотоксин и ноттины. Микробелки имеют петлю, которая может быть конструирована для включения до 25 аминокислот без влияния на общую конформацию микробелка. Более подробно о конструированных ноттино-
вых доменах см. WO 2008/098796.
Другие эпитопсвязывающие домены включают белки, использованные в качестве каркаса для конструирования свойств связывания различных целевых антигенов, включая человеческий у-кристаллин и человеческий убиквитин (аффилины), домены человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца, PDZ-домены Ras-связывающего белка AF-6, токсины скорпиона (харибдотоксин), домен лектина С-типа (тетранектины), обзор которых приведен в Chapter 7 - Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) и Protein Science, 15:14-27 (2006). Эпитопсвязываю-щие домены по настоящему изобретению могут меть происхождение от любого из этих альтернативных белковых доменов.
При использовании здесь термин "антигенсвязывающий сайт" относится к сайту белка, способному специфично связываться с антигеном, он может представлять собой отдельный домен, например, эпи-топсвязывающий домен, или он может представлять собой спаренные домены VH/VL, что можно обнаружить в стандартном антителе. В некоторых воплощениях изобретения антигенсвязывающие сайты могут быть обеспечены одноцепочечными доменами Fv (ScFv).
Термины "mAbdAb" и "dAbmAb" использованы здесь для обозначения антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению. Эти два термина могут быть использованы взаимозаменяемо, и предполагают, что при использовании здесь они имеют одинаковое значение.
При использовании здесь термин "антигенсвязывающий белок" относится к антителам, фрагментам антител, например, однодоменному антителу (dAb), ScFv, FAb, (Fab)2 и другим белковым конструкциям. Антигенсвязывающие молекулы могут содержать по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина, например, антитела, однодоменные антитела (dAb), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv, диатела, mAb-dAb, аффитела, гетероконъюгатные антитела или биспецифичные антитела. В одном воплощении анти-генсвязывающая молекула представляет собой антитело. В другом воплощении антигенсвязывающая молекула представляет собой dAb, т.е. отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, такой как VH, VHH или VL, специфично связывающийся с антигеном или эпитопом, независимо от других вариабельных области или домена. Антигенсвязывающие молекулы могут быть способны связывать две мишени, т.е. они могут представлять собой белки с двумя мишенями. Антигенсвязывающие молекулы могут представлять собой комбинацию антител и антигенсвязывающих фрагментов, такую как, например, одно или более однодоменных антител и/или один или более ScFv, связанные с моноклональным антителом. Ан-тигенсвязывающие молекулы могут также содержать домен, не являющийся доменом иммуноглобулина, например, домен, являющийся производным каркаса, выбранного из группы, состоящей из: CTLA-4 (эвитело); липокалина; молекул, имеющих происхождение от белка А, таких как Z-домен белка А (аффи-тело, SpA); А-домена (авимер/Maxibody); белков теплового шока, таких как GroEI и GroES; трансферри-на (транстело); повторяющегося анкиринового белка (DARPin); пептидного аптамера; домена лектина С-типа (тетранектин); человеческого у-кристаллина и человеческого убиквитина (аффилины); PDZ-доменов; токсина скорпиона; доменов человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца; и фибронектина (аднектина); конструированный для обеспечения связывания с OSM. При использовании здесь "антиген-связывающий белок" будет способен быть антагонистом человеческого OSM и/или нейтрализовать человеческий OSM. Кроме того, антигенсвязывающий белок может ингибировать и/или блокировать активность OSM связыванием с OSM и предотвращением связывания природного лиганда с рецептором gp130 и/или активации рецептора gp130.
При использовании здесь подразумевают, что термин "эффекторная функция" относится к одному или более из ответов, опосредованных антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью (ADCC-активностью) и комплементзависимой цитотоксической активностью (CDC-активностью), Fc-опосредованного фагоцитоза и рециклирования антител через FcRn-рецептор. Эффекторные функции антител IgG, включая ADCC и ADCP, опосредованы взаимодействием константной области тяжелой цепи с семейством Fcy-рецепторов, присутствующих на поверхности иммуноком
петентных клеток. У людей они включают FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). Взаимодействие с антигенсвязывающим белком, связанным с антигеном, и образование комплекса Fc/Fcy приводят к ряду эффектов, включая цитотоксичность, активацию иммунокомпетентных клеток, фагоцитоз и высвобождение воспалительных цитокинов.
Полагают, что эффекторные функции антигенсвязывающего белка опосредованы взаимодействием между константной областью антигенсвязывающего белка и различными Fc-рецепторами (FcR). Эффек-торная функция может приводить к существенным биологическим эффектам, в частности антителозави-симой клеточной цитотоксичности (ADCC), фиксации комплемента (комплементзависимой цитотоксич-ности или CDC) и эффектам на период полувыведения/клиренс антигенсвязывающего белка. Обычно для способности опосредовать эффекторную функцию необходимо связывание антигенсвязывающего белка с антигеном, и не все антигенсвязывающие белки будут опосредовать каждую эффекторную функцию.
Эффекторная функция может быть оценена несколькими способами, включая, например, оценку посредством связывания FcyRIII с натуральными клетками-киллерами или оценку посредством связывания FcyRI моноцитами/макрофагами для оценки эффекторной функции ADCC. Например, эффекторная функция ADCC антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению может быть оценена в анализе с натуральными клетками-киллерами. Примеры таких анализов могут быть обнаружены в Shields et al., 2001, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p. 6591-6604; Chappel et al., 1993, The Journal of Biological. Chemistry, Vol 268, p. 25124-25131; Lazar et al., 2006, PNAS, 103; 4005-4010.
Примеры анализов для определения функции CDC включают анализы, описанные в 1995, J. Imm.
Meth. 184:29-38.
Некоторые изотипы человеческих константных областей, в частности изотипы IgG4 и IgG2, исходно лишены функций (а) активации комплемента по классическому пути и (б) антителозависимой клеточной цитотоксичности. В зависимости от желаемого эффекторного свойства могут быть проведены различные модификации константной области тяжелой цепи антигенсвязывающих белков. Независимо друг от друга несколько авторов сообщили, что для константных областей IgG1, содержащих определенные мутации, характерно уменьшение связывания с Fc-рецепторами и, таким образом, сниженная ADCC и CDC (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS, 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan et al., Immunology, 1995, 86; 319-324; Hezarehetal., J. Virol. 2001, 75(24); 12161-12168).
В одном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий такую константную область, что антигенсвязывающий белок имеет сниженную эффекторную функцию ADCC и/или эффекторную функцию активации комплемента. В одном таком воплощении константная область тяжелой цепи может содержать естественным образом дефектную константную область изотипа IgG2 или IgG4, или мутантную константную область IgG1. Примеры подходящих модификаций описаны в ЕР 0307434. Один пример включает замены остатков аланина в положениях 235 и 237 (нумерация EU).
Также было описано, что человеческие константные области IgG1, содержащие определенные мутации или измененное гликозилирование на остатке Asn297, усиливают связывание с Fc-рецепторами. Также было показано, что в некоторых случаях они усиливают ADCC и CDC (Lazar et al. PNAS, 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J. Biol. Chem. 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol. Immunol., 2007, 44;
1815-1817).
В одном воплощении настоящего изобретения такие мутации расположены в одном или более из положений, выбранных из 239, 332 и 330 (IgG1), или эквивалентных положений других изотипов IgG. Примеры подходящих мутаций представляют собой S239D, I332E и A330L. В одном воплощении анти-генсвязывающий белок по изобретению, описанный здесь, содержит мутации в положениях 239 и 332, например, S239D и I332E, или в другом воплощении он содержит мутации в трех или более положениях, выбранных из 239, 332 и 330, например S239D, I332E и A330L (нумерация EU).
В альтернативном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий константную область тяжелой цепи с таким измененным профилем гликозилирования, что антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию. Например, где антигенсвязываю-щий белок имеет усиленную эффекторную функцию ADCC или усиленную эффекторную функцию CDC, или где он имеет как усиленную эффекторную функцию ADCC, так и усиленную эффекторную функцию CDC. Примеры подходящих способов получения антигенсвязывающих белков с измененным профилем гликозилирования описаны в WO 2003/011878, WO 2006/014679 и ЕР 1229125, все из которых могут быть применены к антигенсвязывающим белкам по настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, включающий стадии:
а) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, содержащий
выделенную нуклеиновую кислоту, как описано здесь, где ген FUT8, кодирующий альфа-1,6-
фукозилтрансферазу, рекомбинантной клетки-хозяина инактивирован; и
б) выделение антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков могут быть проведены, например, с исполь
зованием технологической системы POTELLIGENT(tm), доступной от BioWa, Inc. (Princeton, NJ), в которой клетки CHOK1 SV без функциональной копии гена FUT8 продуцируют моноклональные антитела, обладающие усиленной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической (ADCC) активностью, повышенной по сравнению с идентичным моноклональным антителом, продуцируемым в клетке с функциональным геном FUT8. Аспекты технологической системы POTELLIGENT(tm) описаны в US 7214775, US 6946292, WO 00/61739 и WO 02/31240, все из которых включены сюда посредством ссылки. Специалисты в данной области техники также определят другие подходящие системы.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи, например, антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи с по меньшей мере одним доменом СН2 IgG3, таким образом, что антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, например, где он имеет усиленную функцию ADCC, или усиленную функцию CDC, или усиленные функции ADCC и CDC. В одном таком воплощении антигенсвязывающий белок может содержать один домен СН2 IgG3, или оба
домена СН2 IgG3.
Также предложен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, включающий стадии:
а) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, содержащий
выделенную нуклеиновую кислоту, как описано здесь, содержащий последовательность нуклеиновой
кислоты, кодирующую Fc-домен, имеющий аминокислотные остатки Fc-доменов IgG1 и IgG3; и
б) выделение антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков могут быть проведены, например, с использованием технологической системы COMPLEGENT(tm), доступной от BioWa, Inc. (Princeton, NJ) и Kyowa Hakko Kogyo (в настоящее время, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd., где проводят культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, в котором экспрессирована последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный Fc-домен, имеющий аминокислотные остатки Fc-доменов IgG1 и IgG3, с получением антигенсвязывающего белка, имеющего усиленную комплемен-тзависимую цитотоксическую (CDC) активность, повышенную по сравнению с в остальном идентичным антигенсвязывающим белком без такого химерного Fc-домена. Аспекты технологической системы COMPLEGENT описаны в WO 2007/011041 и US 20070148165, каждая из которых включена сюда посредством ссылки. В альтернативном воплощении CDC-активность может быть повышена введением последовательность-специфичных мутаций в Fc-область цепи IgG. Специалисты в данной области техники также определят другие подходящие системы.
Специалистам в данной области техники будет ясно, что такие модификации могут быть использованы не только по отдельности, но и в комбинации друг с другом для дополнительного усиления эффек-торной функции.
В одном таком воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий константную область тяжелой цепи, содержащую химерную константную область тяжелой цепи, например, антигенсвязывающий белок, содержащий по меньшей мере один домен СН2 IgG3 и один домен СН2 IgG1, имеющий одну или более мутаций в положениях, выбранных из 239, 332 и 330 (например, мутации могут быть выбраны из S239D, I332E и A330L), таким образом, что антигенсвязы-вающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, например, где он имеет одну или более из следующих функций: усиленную ADCC или усиленную CDC, например, где он имеет усиленную ADCC и усиленную CDC. В одном воплощении домен СН2 IgG1 имеет мутации S239D и I332E.
В альтернативном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи, имеющий измененный профиль гликозили-рования. В одном таком воплощении константная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере один домен СН2 IgG3 и один домен СН2 IgG1 и имеет такой измененный профиль гликозилирования, что соотношение фукозы и маннозы составляет 0,8:3 или менее, например, где антигенсвязывающий белок де-фукозилирован, таким образом, что указанный антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффектор-ную функцию, по сравнению с эквивалентным антигенсвязывающим белком с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина без указанных мутаций и измененного профиля гликозилирования, например, где он имеет одну или более из следующих функций: усиленную функцию ADCC или усиленную функцию CDC, например, где он имеет усиленную функцию ADCC и усиленную функцию CDC. В альтернативном воплощении антигенсвязывающий белок имеет по меньшей мере один домен СН2 IgG3 и по меньшей мере один константный домен тяжелой цепи IgG1, где оба домена СН2 IgG содержат мутации в соответствии с описанными здесь ограничениями.
В одном аспекте изобретения предложен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, описанного здесь, включающий стадии:
а) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано здесь, и дополнительно содержащий нуклеотидную последовательность Fc, кодирующую химерный Fc-домен, имеющий аминокислотные остатки Fc-доменов
IgG1 и IgG3, и где ген FUT8, кодирующий альфа-1,6-фукозилтрансферазу, рекомбинантной клетки-хозяина инактивирован; и
б) выделение антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков могут быть проведены, например, с использованием технологической системы ACCRETAMAB(tm), доступной от BioWa, Inc. (Princeton, NJ), сочетающей технологические системы POTELLIGENT(tm) и COMPLEGENT(tm), с получением антигенсвязы-вающего белка, имеющего как усиленную ADCC-активность, так и усиленную CDC-активность, повышенную по сравнению с в остальном идентичным моноклональным антителом без химерного Fc-домена, имеющего фукозу на олигосахариде.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий мутантную и химерную константную область тяжелой цепи и имеющий измененный профиль гликозилирования, таким образом, что антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, например, где он имеет одну или более из следующих функций: усиленную функцию ADCC или усиленную функцию CDC. В одном воплощении мутации выбраны из положений 239, 332 и 330, например, мутации выбраны из S239D, I332E и A330L. В другом воплощении константная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере один домен СН2 IgG3 и один домен СН2 IgG1. В одном воплощении константная область тяжелой цепи имеет такой измененный профиль гликозилирования, что соотношение фукозы и маннозы составляет 0,8:3 или менее, например, антигенсвязывающий белок дефуко-зилирован, таким образом, что указанный антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, по сравнению с эквивалентным нехимерным антигенсвязывающим белком или с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина без указанных мутаций и измененного профиля гликозилиро-вания.
Другой способ модификации антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению включает увеличение периода полувыведения таких белков in vivo модификацией константного домена иммуноглобулина или FcRn (неонатальный Fc-рецептор)-связывающего домена.
У взрослых млекопитающих FcRn, также известный как неонатальный Fc-рецептор, играет ключевую роль в поддержании уровней антител в сыворотке, действуя как защитный рецептор, связывающийся с антителами изотипа IgG и предотвращающий их деградацию. Эндотелиальные клетки поглощают молекулы IgG посредством эндоцитоза, и если они связываются с FcRn, происходит их возвращение в циркуляцию. В отличие от этого, молекулы IgG, не связывающиеся с FcRn, проникают в клетки и направляются по лизосомальному метаболическому пути, где происходит их деградация.
Полагают, что неонатальный FcRn-рецептор вовлечен как в клиренс антител, так и в их трансцитоз через ткани (см. Junghans R.P (1997), Immunol. Res 16. 29-57 и Ghetie et al. (2000), Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Остатки человеческого lgG1, которые, как установлено, взаимодействуют непосредственно с человеческим FcRn, включают Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435. Замены в любом из этих положений, описанных в этом разделе, могут обеспечить увеличенный период полувыведения из сыворотки и/или измененные эффекторные свойства антигенсвязывающих белков по изобретению.
Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут иметь аминокислотные модификации, повышающие аффинность константного домена или его фрагмента в отношении FcRn. Увеличение периода полувыведения терапевтических и диагностических IgG и других биологически активных молекул имеет множество преимуществ, включая уменьшение количества и/или частоты введения этих молекул. Таким образом, в одном воплощении предложен антигенсвязывающий белок по изобретению, предложенный здесь, или слитый белок, содержащий полноразмерный константный домен IgG, или его часть (FcRn-связывающую часть), или константный домен IgG, имеющий одну или более из этих аминокислотных модификаций, и белок, не являющийся IgG, или небелковую молекулу, конъюгированную с таким модифицированным константным доменом IgG, где присутствие модифицированного константного домена IgG увеличивает период полувыведения антигенсвязывающего белка in vivo.
В РСТ публикации WO 00/42072 раскрыт полипептид, содержащий вариант Fc-области с измененной аффинностью связывания с FcRn, содержащий аминокислотные модификации в любом одном или
более из аминокислотных положений: 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309,
311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и 447 Fc-области, где нумерация остатков Fc-области соответствует нумерации EU (Kabat et al).
В РСТ публикации WO 02/060919 А2 раскрыт модифицированный IgG, содержащий константный домен IgG, содержащий одну или более аминокислотных модификаций, по сравнению с константным доменом IgG дикого типа, где модифицированный IgG имеет увеличенный период полувыведения, по сравнению с периодом полувыведения IgG, имеющего константный домен IgG дикого типа, и где одна или более аминокислотных модификаций расположены в одном или более из положений: 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-435.
Shields et al. (2001, J. Biol. Chem. 276:6591-604) применяли мутагенез аланиновым сканированием для изменения остатков Fc-области человеческого антитела IgG1 и затем оценивали связывание с человеческим FcRn. Положения, эффективно изменявшие связывание с FcRn при их замене на аланин, вклю
чают I253, S254, Н435 и Y436. Другие положения, продемонстрировавшие менее выраженное уменьшение связывания, представляют собой следующее: E233-G236, R255, K288, L309, S415 и Н433. Некоторые аминокислотные положения продемонстрировали улучшение связывания с FcRn при их замене на ала-нин; среди них следует отметить Р238, Т256, Е272, V305, Т307, Q311, D312, K317, D376, Е380, Е382, S424 и N434. Многие другие аминокислотные положения продемонстрировали незначительное улучшение (D265, N286, V303, K360, Q362 и А378) или отсутствие изменений (S239, К246, К248, D249, М252, Е258, Т260, S267, Н268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, Е283, Н285, Т289, К290, R292, Е293, Е294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, Е333, K334, Т335, S337, K338, K340, Q342, R344, Е345, Q345, Q347, R356, М358, Т359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, Е388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, Е430, Т437, К439, S440, S442, S444 и К447) связывания с FcRn.
Наиболее выраженный эффект был обнаружен у комбинированных вариантов с улучшенным связыванием с FcRn. При рН 6,0 вариант E380A/N434A продемонстрировал увеличение связывания с FcRn более чем в 8 раз относительно нативного IgG1, по сравнению с 2-кратным увеличением при Е380А и 3,5-кратным - при N434A. Добавление к этому Т307А приводило к 12-кратному улучшению связывания относительно нативного IgG1. В одном воплощении антигенсвязывающий белок по изобретению содержит мутации E380A/N434A и имеет увеличенное связывание с FcRn.
Dall'Acqua et al. (2002, J. Immunol.; 169:5171-80) описали случайный мутагенез и скрининг фаговых дисплейных библиотек фрагмента человеческого IgG1 "шарнирная область-Fc-область" против мышиного FcRn. Они раскрыли случайный мутагенез положений 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385387, 389, 428, 433, 434 и 436. Наибольшие улучшения стабильности комплекса "IgG1 -человеческий FcRn" происходят при замене остатков, расположенных в полосе вдоль области контакта Fc-FcRn (M252, S254, Т256, Н433, N434 и Y436) и, в меньшей степени, при замене периферийных остатков, таких как V308, L309, Q311, G385, Q386, Р387 и N389. Вариант с наиболее высокой аффинностью в отношении человеческого FcRn был получен сочетанием мутаций M252Y/S254T/T256E и H433K/N434F/Y436H и продемонстрировал повышение аффинности в 57 раз, по сравнению с IgG1 дикого типа. In vivo такой мутантный человеческий IgG1 продемонстрировал увеличение периода полувыведения из сыворотки яванского макака приблизительно в 4 раза, по сравнению с IgG1 дикого типа.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен вариант антигенсвязывающего белка с оптимизированным связыванием с FcRn. В предпочтительном воплощении указанный вариант анти-генсвязывающего белка содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию Fc-области указанного антигенсвязывающего белка, выбранную из группы, состоящей из 226, 227, 228, 230, 231,
233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 и 447
Fc-области, по сравнению с указанным исходным полипептидом, где нумерация аминокислот Fc-области соответствует нумерации EU по Kabat.
В другом аспекте изобретения модификации представляют собой M252Y/S254T/T256E.
Кроме того, в различных публикациях описаны способы получения физиологически активных молекул, периоды полувыведения которых модифицированы включением в молекулы FcRn-связывающего полипептида (WO 97/43316; патенты США № 5869046; 5747035; WO 96/32478; WO 91/14438), или слиянием молекул с антителами, аффинности связывания которых с FcRn сохранены, но аффинности в отношении других Fc-рецепторов существенно снижены (WO 99/43713), или слиянием с FcRn-связывающими доменами антител (WO 00/09560; патент США № 4703039).
Кроме того, также предложены способы получения антигенсвязывающего белка с уменьшенным биологическим периодом полувыведения. Вариант IgG, в котором His435 заменен на аланин, приводит к селективному уменьшению связывания с FcRn и значительному уменьшению периода полувыведения из сыворотки (Firan et al. 2001, International immunology 13:993). В патенте США № 6165745 раскрыт способ получения антигенсвязывающего белка с уменьшенным биологическим периодом полувыведения включением мутации в сегмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий белок. Мутация включает аминокислотную замену в положении 253, 310, 311, 433 или 434 Fc-области и шарнирного домена.
При использовании здесь подразумевают, что термин "антитело или его фрагмент, не являющиеся человеческими", относится к антителам или их фрагментам, имеющим происхождение от любого вида, не являющегося человеком, где термин "человеческий" включает химерные антитела.
Термин "донорное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), предоставляющему аминокислотные последовательности его вариабельных доменов, CDR, или его другие функциональные фрагменты или аналоги первому иммуноглобулину-партнеру, обеспечивая измененную область, кодирующую иммуноглобулин, и получаемое в результате измененное экспрессирован-ное антитело с антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, характерной для донорного антитела.
Термин "акцепторное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), гетерологичному по отношению к донорному антителу, предоставляющему все (или любую часть, но предпочтительно все) аминокислотные последовательности, кодирующие его каркасные области тяжелой и/или легкой цепи и/или его константные области тяжелой и/или легкой цепи, первому иммуноглобулину-партнеру. Человеческое антитело представляет собой акцепторное антитело.
При использовании здесь подразумевают, что термин "человеческая акцепторная последовательность" относится к каркасной области антитела или его фрагмента, содержащей аминокислотную последовательность каркасной области VH или VL, имеющей происхождение от человеческого антитела или его фрагмента, или к каркасной области человеческой консенсусной последовательности, в которую могут быть включены CDR вида, не являющегося человеком.
При использовании здесь термин "включение" CDR или гипервариабельных участков включает любой способ расположения CDR, не являющихся человеческими CDR, в человеческой акцепторной каркасной области. Следует понимать, что это может быть осуществлено различными способами, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие желаемую аминокислотную последовательность, могут быть получены мутацией нуклеиновых кислот, кодирующих последовательность вариабельного домена, не являющегося человеческим, таким образом, что остатки его каркасных областей заменены остатками человеческой акцепторной каркасной области, или мутацией нуклеиновых кислот, кодирующих последовательность человеческого вариабельного домена, таким образом, что CDR заменены остатками, не являющимися человеческими, или синтезом нуклеиновых кислот, кодирующих желаемую последовательность. В одном воплощении конечную последовательность получают компьютерным моделированием (in silico).
Далее настоящее изобретение описано только посредством примеров. Приложенная формула изобретения может включать обобщение одного или более из следующих примеров.
Примеры
Пример 1. Получение и селекция моноклональных антител.
1.1. Способ иммунизации.
Было идентифицировано mAb против человеческого OSM S1681 10G08(1)1A09 ("10G8") из гибридом, имеющих происхождение от мышей, иммунизированных рекомбинантным гликозилированным человеческим OSM (K598). Самок мышей SJL (n=2, Harlan, UK, HOST SP06-06031) иммунизировали обычным способом с использованием в общей сложности 10 мкг белка внутрибрюшинно с А802-подбным адъювантом. Повторные иммунизации проводили с использованием 5 мкг белка. После каждой повторной иммунизации проводили пробный забор крови, и мышь с наилучшим ответом (168#4) была выбрана для слияния с получением гибридомы (R16092/177-198). Извлекали селезенку, вскрывали ее и проводили индуцированное PEG1500 слияние соматических клеток с клетками мышиной миеломы Х63 AG 8 653.GFP.Bd-2.11 (BioCat 112754; R17209/58). Полученные в результате слияния клетки высевали на 10 96-луночных планшетов и 5 планшетов Nunc OmniTray с метилцеллюлозой, содержащей полутвердую среду. Колонии из полутвердых сред отбирали в 5 96-луночных планшетов.
1.2. Способ скрининга.
1.2.1. Первичный скрининг.
Первичный скрининг резервных антител против OSM был основан на селекции гибридомного материала, способного связываться с человеческим OSM и, для селекции молекул против сайта II, ингиби-ровать связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором gp130. Положительные гибридомные супернатанты, полученные при этом скрининге, анализировали посредством BIACore-анализа кинетики диссоциации для селекции гибридом с наилучшим связыванием.
При слиянии были получены более 3000 клонов, 86 из которых продемонстрировали существенное связывание с OSM при ELISA связывания.
Анализ активности против сайта II проводили с использованием положительных гибридом посредством ELISA с gp130 с человеческим OSM и OSM яванского макака. Гибридомные клоны, ингибировав-шие связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с человеческим gp13, анализировали посредством BIACore-анализа кинетики диссоциации. Из четырех клонов с наилучшим связыванием с человеческим OSM при анализе диссоциации, 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7, получали моноклональные антитела и проводили их повторный скрининг. Различий между связывающей активностью моноклональ-ных антител от каждой гибридомы, определенной посредством BIACore, ELISA и ингибирования gp130, не было. Дочерние клоны 10G8.A9, 9G2.C1, 2В7.А6 и 3Е3.А1 криоконсервировали и использовали для свободного от сыворотки более крупномасштабного получения и очистки. Эти клоны использовали далее при вторичном скрининге.
1.2.2. Вторичный скрининг.
Вторичный скрининг для ранжирования четырех дочерних клонов, 10G8/A9, 9G2/C1, 2В7/А6 и 3Е3/А1, включал кинетический анализ BIACore против человеческого OSM/OSM яванского макака; ELISA с человеческим gp130 и человеческим OSM/OSM яванского макака; KB-клеточный анализ нейтрализации с человеческим OSM/OSM яванского макака. В дополнение к этому анализировали способность нейтрализовать эндогенный имеющий происхождение от нейтрофилов человеческий OSM, сохра
нять нейтрализующую способность в 25%-ной человеческой сыворотке АВ и реактивность против человеческого LIF.
Анализ BIACore.
Анализ BIACore продемонстрировал, что 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7 имели более высокие аффинности в отношении человеческого OSM, чем альтернативное неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15E10) (табл. 1). 10G8 показало наибольшую активность в отношении как человеческого OSM (приблизительно 550 мП), так и OSM яванского макака (приблизительно 310 пМ). По сравнению с 15Е10, 10G8 имело в 8 раз/0,9 log большую аффинность в отношении человеческого OSM и в 11 раз/1 log большую аффинность в отношении OSM яванского макака. Как 10G8, так и 9G2 демонстрировали большую аффинность в отношении OSM яванского макака, чем в отношении человеческого OSM.
ELISA с человеческим gp130.
В ELISA с человеческим gp130 используют относительно высокие уровни OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела, поскольку лиганд присутствует в избытке. После четырех повторов этого анализа было показано, что 10G8 наиболее активно блокирует связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором gp130 в данном анализе (фиг. 1; табл. 2).
Таблица 2
ELISA с человеческим gp130 - Результаты четырех повторов ELISA с человеческим gp130 для ранжирования активности 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7 против человеческого OSM и OSM яванского макака. Неконкурирующее мышиное антитело 15Е10 и рабочее отрицательное контрольное антитело были добавлены в целях сравнения
Ранжирование
против человеческого OSM
Антитело
Человеческий
OSM Средняя IC50 (мкг/мл, ± SD*)
OSM яванского макака СредняяIC50 (мкг/мл, ±SD*) (ранжирование против OSM яванского макака)
10G8
0,06 ± 0,01 (400 пМ)
0,01 ±0,00(1) (40 пМ)
2В7
0,08 ± 0,02 (533 пМ)
0,14 ±0,04 (6) (993 пМ)
9G2
0,16 ±0,04 (1,1 нМ)
0,03 ±0,04 (4) (200 пМ)
15Е10
0,19 ±0,07 (1,3 нМ)
0,03 ±0,05(3) (200 пМ)
ЗЕЗ
0,19 ±0,04 (1,3 нМ)
0,06 ± 0,07 (5) (400 пМ)
*SD - стандартное отклонение.
Анализ с человеческим gp130 повторяли в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ. Два повтора этого анализа показали, что все четыре наиболее удачных антитела 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7, а также 15Е10, сохраняли свою способность блокировать связывание человеческого OSM и OSM яванского макака с gp130 (данные не показаны).
KB-клеточный анализ нейтрализации.
OSM индуцирует высвобождение IL-6 из клеток KB (человеческой эпителиальной клеточной линии, экспрессирующей матричную РНК (мРНК) рецепторов gp130 и OSM). Кратко, клетки KB стимулировали с использованием 1 нг/мл OSM ± различные концентрации антител в течение 16-18 ч при 37°С и высвобождение IL-6 мониторировали посредством ELISA. В KB-клеточном анализе нейтрализации используют меньшее количество OSM, по сравнению с анализом с gp130 (1 нг/мл против 25 нг/мл). Это повышает разрешение анализа для разделения высокоаффинных и низкоаффинных нейтрализующих агентов. По сравнению с антителом 15Е10, 10G8 было в 15 раз/1,2 log активнее против человеческого OSM в KB-клеточном анализе нейтрализации. На основании трех повторов анализа 10G8 было ранжировано первым во всех повторах с получением среднего значения IC50 8 нг/мл против человеческого OSM и 6 нг/мл против OSM яванского макака (фиг. 2; табл. 3). 9G2 было ранжировано вторым в этом анализе с IC50 18 нг/мл и 15 нг/мл против человеческого OSM и OSM яванского макака, соответственно.
Таблица 3
KB-клеточный анализ нейтрализации -Результаты трех повторов KB-клеточного анализа нейтрализации для ранжирования активности 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7 против человеческого OSM и OSM яванского макака. Антитело 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля
Ранжирование
против человеческого OSM
Антитело
Человеческий OSM Средняя IC50 (мкг/мл, ± SD)
OSM яванского макака Средняя IC50 (мкг/мл, ± SD) (ранжирование против OSM яванского макака)
10G8
0,008 ± 0,003 (53 пМ)
0,006 ±0,002(1) (40 пМ)
9G2
0,018 ±0,008 (120 пМ)
0,015 ± 0,006 (2)(100пМ)
2В7
0,049 ± 0,003 (327 пМ)
0,344 ±0,186 (6) (2,3 нМ)
ЗЕЗ
0,054 ± 0,034 (360 пМ)
0,150 ±0,013 (5) (1 нМ)
15Е10
0,279 ±0,161 (1,9 нМ)
0,035 ±0,013 (4) (233 пМ)
В присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ 10G8, 9G2 и 3E3 сохраняли свою способность нейтрализовать как человеческий OSM, так и OSM яванского макака (фиг. 3). Для 15Е10 и 2В7 не удалось получить выравнивающие кривые достаточного качества для вычисления показателей IC50. Как и в KB-клеточном анализе без человеческой сыворотки, наиболее активным антителом было 10G8, при этом 9G2 было ранжировано вторым. В присутствии 25%-ной сыворотки АВ наблюдали некоторое снижение активности. В некоторой степени это может быть обусловлено тем, что сыворотка АВ препятствует считыванию результатов данного анализа. В этом анализе наблюдали более высокие фоновые уровни IL-6, чем в анализе без человеческой сыворотки.
Эндогенный человеческий OSM (анализ с gp130).
Все четыре наиболее удачных антитела, 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7, а также антитело 15Е10 ингибирова-ли эндогенный человеческий OSM четырех отдельных доноров (фиг. 4). Этот нативный OSM был получен стимуляцией нейтрофилов здоровых людей гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирую-щим фактором (GM-CSF).
Реактивность в отношении человеческого LIF (KB-клеточный анализ нейтрализации).
Человеческий LIF является наиболее близкородственным по отношению к человеческому OSM представителем семейства IL-6. Начальные исследования продемонстрировали отсутствие реактивности 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7 в отношении человеческого LIF, указывая на то, что эти антитела OSM-специфичны (фиг. 5).
Реактивность в отношении OSM игрунки (KB-клеточный анализ нейтрализации).
Было показано, что все четыре наиболее удачные молекулы, 10G8, 9G2, 3Е3 и 2В7, нейтрализовали OSM игрунки в KB-клеточном анализе нейтрализации (фиг. 6). 15Е10 и панель из трех дополнительных антител против человеческого OSM, 10D3DLE, ОМ4.11.17 и ОМ4.11.31, также не приводили к нейтрализации OSM игрунки.
На основании двух повторов анализа 10G8 наиболее активно нейтрализовало OSM игрунки, при этом 9G2 было ранжировано вторым.
1.2.3. Моноклональные антитела, выбранные для продолжения
Из четырех антител 10G8 было выбрано в качестве наиболее удачного антитела для химеризации на основании его ранжирования первым во всех анализах, приведенных выше. 9G2 было также выбрано для химеризации в качестве резервной молекулы на случай трудностей при гуманизации.
1.3. Конструирование антител и селекция группы наиболее удачных антител.
13.2. Последовательности вариабельных областей.
Гены вариабельных областей четырех выбранных моноклональных антител, 2В7, 3Е3, 9G2 и 10G8, выделяли и секвенировали параллельно для получения соответствующих химерных антител. Из гибри-домных клеточных осадков выделяли общую РНК. Кодирующие последовательности генов вариабельных областей (V-генов) тяжелой и легкой цепей амплифицировали полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (RT-PCR) или быстрой амплификацией 5'-концов кДНК (5'-RACE) и затем проводили ТА-клонирование для анализа последовательности. Амплификацию V-генов проводили дважды для каждого антитела для обеспечения верификации правильных последовательностей от двух независимых реакций. Последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи получали для всех 4 гибридомных клонов. Выравнивание белковых последовательностей показало, что антитела имели высокую степень идентичности последовательностей в вариабельных областях как тяжелой, так и легкой цепей (фиг. 7 и 8). Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей этих антител изложены в SEQ ID NO: 26-48. См. табл. А.
Сравнение последовательностей четырех наиболее удачных моноклональных антител с антителом 15Е10 показало лишь 50-60%-ную идентичность в легкой (фиг. 9) или тяжелой (фиг. 10) цепи. Это показывает, что рассматриваемые антитела связываются с эпитопами, отличающимися от эпитопов, распознаваемых антителом 15Е10.
13.3. Клонирование антител.
1.3.3.1. Конструирование химерных антител.
10G8 и 9G2 были получены в форме химерных антител переносом мышиных областей VH и VL, описанных выше, на кодон-оптимизированный человеческий у1 Fc дикого типа и человеческие константные области каппа, соответственно. Химерные антитела использовали для подтверждения функциональности клонированных мышиных вариабельных областей (V-областей), проводили их очистку и использовали в качестве контроля при исследовании гуманизированных конструкций. PCR-праймеры были разработаны на основании 5'- и 3'-последовательностей ДНК, определенных в разделе 2.3.1, с включением сайтов рестрикции, необходимых для клонирования в векторы экспрессии млекопитающих RIx и рТТ5. Также разрабатывали праймеры для замены нативной сигнальной последовательности сигнальной последовательностью кампата (Campath). Сайты Hind III и Spe I были конструированы по краям домена VH, что позволяло проводить клонирование в модифицированный вектор RId или рТТ5, содержащий человеческую константную область (С-область) у1. Включение сайта SpeI в последовательность каркасной области 4 приводило к одной аминокислотной замене в каркасной области 4 (FR4) в положении 108. В области VH 9G2 внутренний сайт SpeI был расположен на 5'-конце последовательности ДНК, PCR-праймер для химерного 9G2 был разработан для удаления этого внутреннего сайта SpeI. Сайты HindII и BsiWI были конструированы по краям домена VL, что позволяло проводить клонирование в модифицированный вектор RIn или рТТ5, содержащий человеческую константную область каппа.
Идентифицировали клоны с правильными последовательностями VH и VL и получали плазмиды для экспрессии в клетках СНО или HEK.
1.3.3.2. Экспрессия химерных антител.
Плазмиды RId и RIn, кодирующие домены VH и VL химерных 10G8 и 9G2 соответственно, использовали для котрансфекции клеток СНОЕ1А электропорацией и экспрессировали их в поликлональной клеточной культуре. Плазмиды рТТ, кодирующие домены VH и VL химерных 10G8 и 9G2, использовали для котрансфекции клеток HEK-293 с применением липидного способа трансфекции для обеспечения транзиторной эписомной экспрессии; при трансфекции в эписомной системе экспрессии возможно получение миллиграммовых количеств антитела. Полученные химерные антитела (10G8c и 9G2c) очищали из супернатантов клеточных культур аффинной хроматографией на сефарозе с белком А. Качество очищенных антител контролировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и гель-хроматографией.
1.3.3.3. Анализ данных связывания ELISA связывания с человеческим OSM
Оба химерных антитела, 10G8 и 9G2, успешно связывались с человеческим OSM, в большей степени, чем химерное 15Е10 (15Е10с) (фиг. 11). Данный анализ представлял собой прямой ELISA, где человеческий OSM сорбировали в концентрации 1 мкг/мл и связанные антитела выявляли с использованием антитела против человеческого IgG.
Анализ BIACore.
Анализ BIACore показал незначительное уменьшение или отсутствие уменьшения связывания химерных молекул 10G8 и 9G2 с человеческим OSM или OSM яванского макака, по сравнению с исходными мышиными антителами (Табл. 4). Химерное 10G8 ранжировано первым (654 пМ), за ним следует химерное 9G2 (1,33 нМ). Все антитела продемонстрировали большую аффинность в отношении OSM яванского макака, чем в отношении человеческого OSM.
1.3.3.4. Данные функционального анализа ELISA с человеческим gp130.
В ELISA с человеческим gp130 используют относительно высокие уровни OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела, поскольку лиганд присутствует в избытке. После трех повторов этого анализа химерное 10G8 было наиболее эффективным антителом при ингибировании связывания как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором gp130. Значения для исходного мышиного 10G8 и химерного 10G8, полученные в данном анализе, были очень близки (фиг. 12; табл. 5). Значимых различий между 9G2 и химерным антителом 9G2 не было.
Таблица 5
ELISA с человеческим gp130 -Результаты трех повторов ELISA с человеческим gp130 для ранжирования активности 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2 против человеческого OSM и OSM яванского макака.
Антитело 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля
Ранжирование
против человеческого OSM
Антитело
Человеческий
OSM Средняя IC50 (мкг/мл, ± SD)
OSM яванского макака Средняя IC50 (мкг/мл, ± SD) (ранжирование против OSM яванского макака)
Химерное 10G8
0,037 ± 0,035 (247 пМ)
0,016 ±0,015(1) (107 пМ)
9G2
0,038 ± 0,004 (253 пМ)
0,049 ±0,059 (5) (327 пМ)
10G8
0,044 ± 0,034 (293 пМ)
0,017 ±0,013 (2) (113 пМ)
Химерное 9G2
0,078 ±0,102 (520 пМ)
0,028 ±0,033(3) (187 пМ)
15Е10
0,250 ± 0,403 (1,7нМ)
0,071 ±0,096(6) (473 пМ)
Анализ с человеческим gp130 повторяли в присутствии человеческой сыворотки АВ как с человеческим OSM, так и с OSM яванского макака. Все молекулы сохраняли свою активность в 25%-ной сыворотке. Против человеческого OSM и OSM яванского макака химерное 10G8 и исходное мышиное 10G8 были ранжированы первым и вторым соответственно. Значения IC50 этих двух молекул были сходны. Значимых различий между химерным 9G2, ранжированным третьим, и исходным мышиным 9G2 не наблюдали (данные не показаны).
KB-клеточный анализ нейтрализации.
Исходное мышиное 10G8 действовало аналогично химерному антителу (фиг. 13; табл. 6). Исходное мышиное 9G2 и химерное 9G2 были ранжированы в данном анализе третьим и четвертым, соответственно.
Таблица 6
KB-клеточный анализ нейтрализации -Результаты трех повторов KB-клеточного анализа нейтрализации для ранжирования активности 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2 против человеческого OSM и OSM яванского макака.
В присутствии 25%-ной человеческой сыворотки AB 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2 сохраняли свою способность нейтрализовать как человеческий OSM, так и OSM яванского макака (фиг. 14). В присутствии 25%-ной сыворотки АВ наблюдали некоторое снижение активности. В то время как при использовании начальной концентрации антител 1 мкг/мл показатели IC50 вычислить не удалось, наблюдали отчетливый эффект титрования на нейтрализацию для всех антител, за исключением неродственного отрицательного контроля. В некоторой степени это снижение активности может быть обусловлено тем, что сыворотка АВ препятствует считыванию результатов анализа. В этом анализе наблюдали более высокие фоновые уровни IL-6, чем в анализе без человеческой сыворотки.
Эндогенный человеческий OSM (анализ с gp130).
10G8, химерное 10G8, 9G2 и химерное 9G2 ингибировали эндогенный человеческий OSM двух отдельных доноров (фиг. 15). По этим двум донорам 10G8 и химерное 10G8 были совместно ранжированы первыми, в то время как 9G2 и химерное 9G2 были ранжированы третьим и четвертым, соответственно (табл. 7). Этот нативный OSM был получен GM-CSF-стимуляцией нейтрофилов здоровых людей.
Таблица 7
Анализ эндогенного OSM с человеческим gp130 -Результаты двух доноров нейтрофилов в ELISA с человеческим gp130 для оценки активности 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2
против эндогенного человеческого OSM. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля
Ранжирование
mAb
IC50 (мкг/мл, ± SD)
1 =
10G8
0,009 ±0,001 (60 пМ)
1 =
Химерное 10G8
0,009 ±0,000 (60 пМ)
Химерное 9G2
0,017 ±0,001 (113пМ)
9G2
0,020 ±0,004 (133 пМ)
Реактивность в отношении человеческого LIF (KB-клеточный анализ нейтрализации) Человеческий LIF является наиболее близкородственным по отношению к человеческому OSM представителем семейства IL-6. Три повтора KB-клеточного анализа с человеческим LIF показали, что 10G8, химерное 10G8, 9G2 и химерное 9G2 не нейтрализовали человеческий LIF. Имеющееся в продаже антитело против человеческого LIF нейтрализовало LIF в данном анализе (фиг. 16). Это доказывает спе-
цифичность этих антител в отношении OSM. Пример 2. Гуманизация.
2.1.1. Способ гуманизации тяжелой цепи.
После BLAST-анализа эмбриональных баз данных человеческих V-генов человеческая эмбриональная IGHV3 7, на 74% идентичная (включая CDR) последовательности вариабельной области тяжелой цепи мышиного 10G8, была выбрана в качестве предпочтительной акцепторной каркасной области для гуманизации. Эмбриональную V-область виртуально (in silico) комбинировали с подходящей FR4, в данном случае мини-геном JH2 (Kabat Vol. II), на основании сходства последовательностей. Первые шесть остатков мини-гена JH2 входят в участок CDR3, замещаемый входящим CDR из донорного антитела. На основании сравнения последовательностей и возможного эффекта на функцию антител были получены три гуманизированных варианта тяжелой цепи. Конструкция Н0 была результатом прямого переноса мышиных CDR из 10G8 (с использованием определения Kabat) в человеческую акцепторную каркасную область, выбранную выше. Конструкции Н1 и Н2 основаны на Н0, и обе содержат одну дополнительную мутацию каркасной области, разную в каждой конструкции; положения 2 и 105, соответственно.
2.1.2. Гуманизация легкой цепи.
После BLAST-анализа эмбриональных баз данных человеческих V-генов человеческая эмбриональная IGKV41, на 64% идентичная (включая CDR) последовательности вариабельной области легкой цепи мышиного 10G8, была выбрана в качестве предпочтительной акцепторной каркасной области для гуманизации. Эмбриональную V-область виртуально (in silico) комбинировали с подходящей FR4, в данном случае мини-геном J-области каппа-4 (Kabat, Vol. II), на основании сходства последовательностей. Первые два остатка мини-гена JK-4 входят в CDR3-участок и идентичны последним двум остаткам CDR3 легкой цепи мышиного 10G8. На основании сравнения последовательностей и возможного эффекта на функцию антител были получены пять гуманизированных вариантов легкой цепи. Конструкция L0 была результатом прямого переноса мышиных CDR из 10G8 (с использованием определения Kabat) в человеческую акцепторную каркасную область, выбранную выше. Конструкции L1, L2 и L3 основаны на L0, и каждая из них содержит одну дополнительную мутацию каркасной области, разную в каждой конструкции; положения 46, 84 и 103, соответственно. Конструкция L4 содержит все три указанные выше обратные мутации.
2.1.3. Конструирование гуманизированных векторов.
Последовательности ДНК гуманизированных вариабельных областей оптимизировали с использованием программного обеспечения LETO 1.0 (Entelechon GmbH) и синтезировали заново наращиванием перекрывающихся олигонуклеотидов и PCR-амплификацией. Праймеры содержали сайты рестрикции для клонирования в векторы экспрессии млекопитающих и сигнальные последовательности человеческих иммуноглобулинов для секреции. Гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи Н0-Н2 клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую константную область гамма-1, с использованием HindIII и SpeI. Параллельно гуманизированные вариабельные области легкой цепи L0-L4 клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую константную область каппа, с использованием HindIII и BsiWI.
2.1.4. Начальный скрининг панели гуманизированных вариантов.
Для скрининга и сокращения панели гуманизированных вариантов (3 тяжелые цепи х 5 легких цепей = 15), антитела экспрессировали в клетках HEK и оценивали посредством BIACore, ELISA и функциональных анализов.
2.2. Биологические анализы гуманизированных антител 10G8: химерные и гуманизированные mAb. 2.2.1. Вторичный скрининг.
Вторичный скрининг для ранжирования гуманизированных антител 10G8, приведенных в табл. 9, включал кинетический анализ BIACore против человеческого OSM; ELISA с человеческим gp130 и человеческим OSM/OSM яванского макака, KB-клеточный анализ нейтрализации с человеческим OSM/OSM яванского макака. В дополнение к этому анализировали способность блокировать связывание с gp130 в 25%-ной человеческой сыворотке АВ.
Анализ BIACore.
Начальный BIACore-анализ трансфекционных супернатантов продемонстрировал, что гуманизированные варианты L1 и L4 имели большие аффинности в отношении человеческого OSM, чем гуманизированные варианты L0, L2 и L3 (табл. 8). Эти мутации легкой цепи улучшали аффинность, по сравнению с прямым переносом самим по себе (H0L0) и химерным 10G8. Варианты тяжелых цепей Н1 и Н2 оказывали незначительный эффект на аффинность антител в сравнении с прямым переносом Н0.
Анализ полученных в большем количестве очищенных вариантов L1 и L4 показал, что аффинности этих mAb в отношении как человеческого OSM, так и и OSM яванского макака отличались крайне незначительно (табл. 9).
Таблица 8
Кинетика BIACore - кинетика связывания 15 трансфекционных
KB-клеточный анализ нейтрализации.
В KB-клеточном анализе нейтрализации используют меньшее количество OSM, по сравнению с анализом с gp130 (1 нг/мл против 25 нг/мл). Это повышает разрешающую способность данного анализа для разделения высокоаффинных и низкоаффинных нейтрализующих агентов. Скрининг конструкций начальных вариантов Н0, Н1, Н2, L0, L1, L2, L3 и L4 KB-клеточным анализом показал превосходство конструкций L1 (данные не показаны). Эти варианты, вместе с вариантами L4, показавшими хорошие результаты в анализе BIACore, получали в более крупных партиях для дальнейших анализов. На основании трех повторов анализа гуманизированные варианты 10G8 L1 были ранжированы первыми с получением среднего значения IC50 14 нг/мл против человеческого OSM и 10 нг/мл против OSM яванского макака (фиг. 17; табл. 10).
Гуманизированные варианты 10G8 L1 были выбраны для дальнейшего исследования, поскольку они показали большую биологическую активность в KB-клеточном анализе, по сравнению с вариантами L4. Варианты L4 имели очень низкий выход при получении в системе СНО-Е1, и это также исключило возможность их дальнейшего использования.
ELISA с человеческим gp130.
В ELISA с человеческим gp130 используют относительно высокие уровни OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела, поскольку лиганд присутствует в избытке. После двух повторов этого анализа с гуманизированными вариантами 10G8 L1 было показано, что все три варианта одинаково блокировали связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором gp130 в данном анализе (фиг. 18).
Анализ с человеческим gp130 также проводили в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ. Два повтора этого анализа показали, что все антитела, а именно гуманизированные варианты 10G8 H0L1, H1L1 и H2L1, сохраняли свою способность блокировать связывание человеческого OSM и OSM яванского макака с gp130 (данные не показаны).
2.3. Выделение Fab-фрагментов и кристаллизация комплекса mAb 10G8-OSM.
2.3.2. Получение Fab-фрагментов.
Fab-фрагменты исходного антитела 10G8 получали расщеплением иммобилизированным на гранулах папаином (Pierce 20341) в течение 20 ч при 37°С в буфере, содержащем 20 мМ фосфатный буфер, рН 7, 10 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и 10 мМ L-цистеин. После расщепления гранулы удаляли с использованием одноразовой пластиковой колонки, затем Fab-фрагменты очищали от конта-минирующих Fc-фрагментов и нерасщепленного антитела с применением хроматографии с белком типа А (MabSelect, GE Healthcare 17-5438-03). Несвязанную фракцию, содержащую Fab-фрагменты, дополнительно очищали с применением гель-хроматографии (SEC) с 200 pg Superdex (GE Healthcare 17-1069-01) с использованием буфера с 25 мМ HEPES, рН 7,7, 150 мМ NaCl в качестве подвижной фазы. Комплекс получали, смешивая 11,5 мг очищенных Fab (GRITS30249) с 5,75 мг рекомбинантного OSM (GRITS23122) в молярном соотношении 1:1 в течение 1,5 ч при 4°С. Затем проводили очистку комплекса от веществ, не вошедших в комплекс, с применением SEC с 200pqSuperdex. Полученный комплекс концентрировали до 44 мг/мл общего белка (выход 9,2 мг) с использованием устройства для центрифужной концентрации, оборудованного мембраной 10kMWCO (Vivaspin VS2002). Компоненты комплекса верифицировали с применением N-концевого секвенирования, масс-спектрометрии и SDS-PAGE. Функциональную связывающую активность Fab-фрагментов в отношении OSM подтверждали с применением анализа ингибирования с gp130 (данные не показаны).
2.3.2. Кристаллизация комплекса 10G8-OSM.
Получали комплекс Fab-фрагментов mAb 10G8 против OSM с OSM и проводили его кристаллизацию при 20°С с использованием PEG3500 как преципитата. Кристаллы оптимизировали, направляли на анализ на Европейскую установку синхротронного излучения (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)) и определяли их структуру с разрешением 3,5 A. mAb 10G8 связывалось с цепями В и С OSM с хорошей поверхностной комплементарностью и блокировало связывание сайта II OSM с рецептором gp130 исключительно ввиду стерического несоответствия, без непосредственного взаимодействия с какими-либо остатками сайта II. Остатки, непосредственно вовлеченные в связывание (расстояние менее
5 A) при разрешении 3,5 A, показаны в табл. 11 и на фиг. 19. Этот блокирующий эффект был обусловлен, главным образом, легкой цепью. Четыре CDR, CDRH2, Н3 и CDRL1 и L3, связывались с цепями В и С OSM, непосредственно или через опосредованные водой взаимодействия. Существенных изменений в молекуле в молекуле OSM при связывании с mAb 10G8 не было. Поскольку два CDR, CDRH1 и L2, не участвовали в связывании, были получены варианты антитела, где один или оба этих CDR были заменены человеческой последовательностью. Это может приводить к уменьшению иммуногенности молекулы, по сравнению с гуманизированным антителом при прямом переносе.
Таблица 11
Остатки OSM
Номер
(тип)
остатка
ATOM
Остатки антитела (L - легкая цепь,
тяжелая цепь)
Номер
(тип)
остатка
Атом
Расстояние в ангстремах
82(LEU)
104(THR)
CG2
3,45
82(LEU)
104(THR)
CG2
3,47
83(HIS)
59(TYR)
3,20
83(HIS)
59(TYR)
3,37
83(HIS)
CE1
103(THR)
CG2
3,43
83(HIS)
NE2
106(TRP)
CH2
3,44
83(HIS)
CD2
59(TYR)
3,30
83(HIS)
59(TYR)
3,26
83(HIS)
59(TYR)
2,62
84(ARG)
NH1
57(PHE)
CE1
3,47
90(GLN)
OE1
60(TYR)
3,30
90(GLN)
NE2
65(ARG)
NH2
3,08
94(LYS)
62(ASP)
OD2
3,38
115(ARG)
104(THR)
OG1
3,19
115(ARG)
NH2
105(PHE)
CD1
3,49
115(ARG)
NH2
105(PHE)
CE1
3,25
115(ARG)
NH2
104(THR)
3,21
122(ARG)
NH2
103(THR)
OG1
3,14
152(THR)
OG1
58(THR)
OG1
3,19
112(GLN)
96(ARG)
NH2
3,08
115(ARG)
NH2
96(ARG)
3,30
123(ASN)
34(TYR)
3,18
123(ASN)
ND2
34(TYR)
2,56
2.3.4. Гуманизированное антитело 10G8: замена человеческими CDR.
При определении кристаллической структуры самостоятельно полученного комплекса mAb 10G8 против OSM и OSM было установлено, что CDRH1 и CDRL2 непосредственно не участвуют в связывании с антигеном. Подходящие человеческие эмбриональные CDR были выбраны для замены этих мышиных эмбриональных CDR. Исследовали эффекты человеческих эмбриональных последовательностей двух CDRH1 и двух CDRL2 на связывание с антигеном. Для CDR как тяжелой, так и легкой цепей исследовали последовательности исходной человеческой эмбриональной акцепторной каркасной области (IGHV3 7 и IGKV4 1 соответственно), и, кроме того, на основании гомологии CDR и расположенных рядом с ними каркасных областей были выбраны две дополнительные человеческие эмбриональные последовательности (IGHV3 23 и IGKV1 5). Соответствующие мышиные CDR в V-областях гуманизированных Н0 и L1 заменяли человеческими эмбриональными последовательностями CDRH1 и CDRL2. Новые V-области синтезировали заново наращиванием перекрывающихся олигонуклеотидов и PCR-амплификацией, как в разделе 1.1.4.
2.4. Биологические анализы гуманизированных антител 10G8: гуманизированное mAb 10G8 H0L1 и гуманизированное mAb 10G8 с гуманизированным несвязывающим CDR. 2.4.1. Вторичный скрининг. Анализ BIACore.
BIACore-анализ трансфекционных супернатантов различных гуманизированных конструкций CDRH1 и CDRL2 10G8 H0L1 продемонстрировал, что единственным антителом, полностью сохранявшим аффинность исходного mAb в отношении человеческого OSM, была молекула H0(IGHV3 23)L1 (табл. 12). Эта конструкция, а также две другие молекулы с ближайшими значениями KD, H0L1(IGKV4 1) и H0(IGHV3 23)L1 (IGK4J), были получены в большем количестве и очищены для дальнейшего исследования.
Таблица 12
Кинетика BIACore -Кинетика связывания трансфекционных супернатантов гуманизированных вариантов 10G8 H0L1 CDRH1 и CDRL2 резервного антитела против OSM с OSM яванского макака и человеческим OSM, по сравнению с химерным 10G8
OSM яванского макака
Чяпочеческл/ OSM
(М-1, с-1)
Kd (с-1)
KD (нМ)
:м 1 с
KD нМ)
НО IGHV3_7+L1
3.37Е+7
0,8146
24,2
9,10Е+4 9.67Е-
10,6
НО IGHV3_23+L1
3.52Е+5
1,09Е-
0,310
3,61 Е+5 1.58Е-
0,437
H0+L1 IGKV41
1.50Е+5
2,12Е-
1,41
1,61 Е+5 2.21 Е-
1,37
H0+L1 IGKV1_5
6.75Е+4
5,57Е-
8,26
6.87Е+4 6.40Е-
9,33
НО IGHV3_7+L1 IGKV4J
5.07Е+4
1,77Е-
34,9
3.68Е+4 1.63Е-
44,4
НО IGHV3_7+L1 IGKV1_5
низкий уровень иммобилизации
низкии уровень иммобилизации
НО IGHV3_23+L1
1.52Е+5
2,23Е-
1,47
1,59Е+5 2.47Е-
1,56
IGKV4J
НО IGHV3_23+L1
6.67Е+4
5.93Е-
8,89
7.11Е+4 6.60Е-
9,27
IGKV1_5
H0+L1
3.45Е+5
1.04Е-4
0,301
3.32Е+5 1.53Е-
0,461
Очищенное H0L1
3.38Е+5
1,15Е-4
0,341
3.40E+S 1.51 Е-
0,445
KB-клеточныи анализ нейтрализации.
KB-клеточный анализ нейтрализации продемонстрировал, что гуманизированная конструкция 10G8 H0(IGHV3 23)L1 (отмеченная как H0('CDRH1)L1) показывает активность, очень сходную с исходным гуманизированным mAb 10G8 H0L1 (отмеченным как H0L1). Любая замена несвязывающего CDRL2 человеческой последовательностью приводила к снижению нейтрализующей активности, как видно из данных по антителам H0L1 (IGKV4 1) (отмеченного H0L (huCDRL2)) и H0(IGHV3 23)L1 (IGK4 1) (отмеченного H0(huCDRH1)L1 (huCDRL2)) (фиг. 20, табл. 13).
На основании этих данных 10G8 H0(huCDRH1)L1 было выбрано в качестве наилучшего промежуточного mAb для полного определения характеристик.
2.5. Биологические анализы гуманизированных антител 10G8: гуманизированное mAb 10G8
H0(IGHV3 23)L1
2.5.1. Вторичный скрининг. Анализ BIACore.
Анализ BIACore проводили с очищенным mAb H0(IGHV3 23)L1 и ранжировали его против химерного 10G8 и исходного гуманизированного mAb 10G8 H0L1. Аффинности mAb H0(IGHV3 23)L1 и исходного mAb H0L1 в отношении как человеческого OSM, так и OSM яванского макака отличались незначительно или не отличались (Табл. 6). mAb H0(IGHV3 23)L1 имело в 6,5 раз (0,8 log) большую аффинность в отношении человеческого OSM, по сравнению с альтернативным неконкурирующим гуманизированным антителом против OSM 15Е1 Oh. В данном исследовании использовали новую партию OSM, что привело к уменьшению значений KD, тем не менее, различия между гуманизированными вариантами и неконкурирующим антителом остались неизменными.
Анализ Kinexa.
Жидкофазный анализ аффинности Kinexa (Sapidyne Instruments 3200) применяли для определения общей аффинности антитела против OSM H0(huCDRH1)L1 и гуманизированного 15Е10 (неродственного антитела против OSM) в отношении человеческого OSM, OSM яванского макака, макака-резуса и игрунки (табл. 15). Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения.
Гранулы с OSM получали адсорбцией (полиметилметакрилатные гранулы - РММА) или аминным сочетанием (NHS-активированные сефарозные гранулы). Спектр изученных молекул OSM приводил к необходимости получения гранул, покрытых OSM в различных концентрациях. Для жидкофазной части анализа антитела в фиксированной концентрации инкубировали с широким спектром концентраций OSM и позволяли им достичь равновесия инкубацией при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч перед продолжением анализа. Гранулы с OSM затем использовали для определения количества свободного антитела, присутствовавшего в жидких образцах, по связыванию свободного антитела с матрицей гранулы с OSM с его последующим выявлением с использованием подходящего вторичного антитела (противочеловеческого или противомышиного, в зависимости от исследуемой конструкции), меченного флуоресцентным красителем. Кривые связывания строили с применением аналитического программного обеспечения Kinexa Pro, включенного в прибор. Затем объединяли результаты нескольких экспериментов с использованием разных начальных концентраций антитела и анализировали их с применением аналитического программного обеспечения n-curve для более точного определения аффинности.
H0(huCDRH1)L1 показывает большую аффинность в отношении человеческого OSM, как было определено ранее анализом Biacore. В отличие от Biacore, где антитело было связано с поверхностью чипа, в Kinexa для оценки аффинности используют свободное антитело и лиганд в жидкой фазе, что в большей степени соответствует естественному состоянию.
Аффинность в отношении OSM игрунки крайне мала, это значит, что в эксперименте с рецептором для использования микрограммовых количеств OSM будет необходимо более 40 нМ антитела.
Общий вывод состоит в том, что связывание гуманизированного 15Е10 с OSM игрунки значительно слабее его связывания с человеческим OSM.
ELISA с человеческим gp130.
В ELISA с человеческим gp130 используют избыток OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела. После трех повторов анализа с gp130 было подтверждено, что все антитела, исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1, активно блокировали связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором gp130 в данном анализе (фиг. 21). Ввиду высоких уровней антигена в этом анализе, провести четкое ранжирование не представлялось возможным.
Анализ с человеческим gp130 повторяли в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ и 25%-ной смешанной человеческой синовиальной жидкости. Три повтора этого анализа для каждой матрицы показали, что все антитела, исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1, а также 15E10h сохраняли свою способность блокировать связывание человеческого OSM и OSM яванского макака с gp130 (данные не показаны).
KB-клеточный анализ нейтрализации.
KB-клеточный анализ нейтрализации позволяет лучше разделить высокоаффинные и низкоаффинные нейтрализующие агенты, чем анализ с gp130, благодаря использованию низких (1 нг/мл) уровней OSM. На основании трех повторов анализа для H0(huCDRH1)L1 было получено среднее значение IC50 30 нг/мл против человеческого OSM, 41 нг/мл против OSM яванского макака и 36 нг/мл против OSM игрунки (фиг. 22; табл. 17).
H0(huCDRH1) L1
0,0030 ± 0,0015 (20 пМ)
0,0041 ±
0,0025 (4) (27 пМ)
0,0036 ± 0,0024 (3) (24 пМ)
Химерное 10G8
0,0052 ± 0,0064 (35 пМ)
0,0011 ± 0,0004 (1)(7пМ)
0,0271 ± 0,0450 (4) (181 пМ)
0,0391 ±
0,0054 ±
Отсутствие
15Е10И
0,0207
0,0020
нейтрализаци
(261 пМ)
(5) (36 пМ)
В присутствии 25%-ной человеческой сыворотки AB или 25%-ной смешанной человеческой синовиальной жидкости (H0(huCDRH1)L1 и 15E10h сохраняли свою способность нейтрализовать как человеческий OSM, так и OSM яванского макака (фиг. 23). В присутствии 25%-ной сыворотки АВ или 25%-ной смешанной синовиальной жидкости наблюдали некоторое снижение активности. Вероятнее всего, это обусловлено тем, что эти матрицы препятствует считыванию результатов данного анализа. В этом анализе наблюдали более высокие фоновые уровни IL-6, чем в нормальном анализе.
Было показано, что, в отличие от 15E10h, H0(huCDRH1)L1 нейтрализовало OSM игрунки в KB-клеточном анализе нейтрализации. Панель из трех дополнительных антител против человеческого OSM, 10D3DLE, ОМ4.11.17 и ОМ4.11.31, также не приводила к нейтрализации OSM игрунки.
Анализ эндогенного человеческого OSM с gp130.
Исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1, а также 15E10h ингибировали эндогенный человеческий OSM от четырех отдельных доноров (фиг. 24). По результатам этих четырех доноров различие между исходным mAb H0L1 и mAb H0(huCDRH1)L1 была крайне незначительной; эти mAb были ранжированы выше исходного мышиного 10G8 и химерного 10G8 (Табл. 18). H0(huCDRH1)L1 было приблизительно в 12 раз (1,09 log) активнее, чем 15E10h. Нативный OSM был получен GM-CSF-стимуляцией нейтрофилов здоровых людей.
Анализ эндогенного OSM с человеческим gp130 -Результаты четырех доноров нейтрофилов в ELISA с gp130 для оценки активности исходного мышиного 10G8, химерного 10G8,
исходного гуманизированного 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1
против эндогенного человеческого OSM. 15E10h было добавлено в целях сравнения. Неродственное антитело использовали в качестве отрицательного контроля
Ранжирование
mAb
IC50 (мкг/мл, ± SD)
H0L1
0,0058 ±0,0019 (39 пМ)
H0(huCDRH1)L1
0,0062 ±0,0023 (41 пМ)
10G8
0,0090 ±0,0020 (60 пМ)
Химерное10G8
0,0091 ±0,0004(61 пМ)
15E10h
0,0760 ±0,0181 (507 пМ)
Реактивность в отношении человеческого LIF (KB-клеточный анализ нейтрализации).
Человеческий LIF является наиболее близкородственным по отношению к человеческому OSM представителем семейства IL-6. Три повтора KB-клеточного анализа с человеческим LIF показали, что исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1 или 15E10h не нейтрализовали человеческий LIF. 15E10h было добавлено в целях сравнения. Имеющееся в продаже антитело против человеческого LIF нейтрализовало LIF в данном анализе (фиг. 25). Это доказывает специфичность этих антител в отношении OSM.
Анализ с человеческими первичными гепатоцитами.
Человеческие первичные гепатоциты чувствительны к OSM и высвобождают белки острой фазы, такие как SAA и CRP, в ответ на стимуляцию OSM. H0(huCDRH1)L1 дозозависимым образом ингибиро-вало индуцированное человеческим OSM высвобождение SAA (фиг. 26) и CRP (фиг. 27) из гепатоцитов трех отдельных доноров. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения.
Эквивалентные анализы проводили с использованием человеческих первичных клеток других типов. Они включали человеческие клетки эндотелия пупочной вены, человеческие фибробластоподобные синовиоциты пациентов с ревматоидным артритом, человеческие легочные фибробласты здоровых людей и пациентов с идиопатическим фиброзом легких (данные не показаны). Как и в предыдущих анализах, H0(huCDRH1)L1 нейтрализует OSM активнее гуманизированного 15Е10. Кратность превышения активности H0(huCDRH1)L1 над активностью гуманизированного 15Е10 варьирует в зависимости от клеточной линии и концентрации OSM.
2.6. Биофизическое описание.
Определяли основные биофизические свойства H0(huCDRH1)L1, а также исходного гуманизированного mAb 10G8 H0L1. На антитела воздействовали стрессовыми условиями внешней среды, такими как
температура, инкубацией в течение 14 суток при 4 или 37°С; пять циклов замерзания-оттаивания;
форсированное дезамидирование инкубацией с 1%-ным бикарбонатом аммония при 37°С в течение
48 ч.
Ни одно антитело не показало уменьшения биофизических изменений или снижения активности после указанных выше стрессовых воздействий.
2.6. Гуманизированные антитела с вариантами CDRH3.
2.6.1. Конструирование гуманизированных антител с вариантами CDRH3.
Замену каждого остатка CDRH3 (SEQ ID NO: 3) альтернативным аминокислотным остатком проводили с использованием полноразмерной последовательности тяжелой цепи НО (IGHV3 23) SEQ ID NO: 75 (последовательность вариабельной области: SEQ ID NO: 74) на плазмиде рТТ (Национальный научно-исследовательский совет, Канада (National Research Council, Canada) с модифицированным множественным сайтом клонирования (MCS)) в качестве исходной молекулы. Применяли методику сайт-направленного мутагенеза (SDM), в соответствии с которой конструируют олигонуклеотиды, содержащие последовательность NNK (N = A/TG/C; K = G или Т) в положении аминокислотной замены. Полимеразную цепную реакцию (PCR) применяли для получения новых плазмид, содержащих замену, и секвенирование ДНК применяли для идентификации клонов с аминокислотными заменами. Таким образом, были выделены варианты, имеющие от 10 до 17 различных аминокислот в каждом из 12 положений CDRH3. Антитела с вариантами CDRH3 получали котрансфекцией векторами рТТ, содержащими вариант НО (IGHV3 23) с легкой цепью L1 (SEQ ID NO: 72), и анализом связывания супернатантов.
Были получены 164 варианта CDRH3, и они были исследованы в последующем анализе (см. разделы 2.6.2 и 2.6.3).
2.6.2. Экспрессия вариантов CDRH3 в клетках HEK-293 6Е
Плазмиды рТТ, кодирующие тяжелую цепь (TO(IGHV3 23)) с вариантами CDRH3 и легкую цепь L1, использовали для транзиторной котрансфекции клеток HEK-293 6Е и экспрессировали их в малом масштабе для получения антитела. Антитела анализировали непосредственно из супернатанта тканевой культуры.
2.6.3. Кинетический анализ супернатантов тканевых культур с вариантами CDRH3.
Начальные кинетические анализы для скрининга CDRH3 проводили на ProteOn XPR36 (Biorad Laboratories) и определенные супернатанты были отобраны для более точного кинетического анализа на
BiaCore T100.
Для анализа ProteOn противочеловеческий IgG (GE Healthcare/Biacore BR-1008-39) сочетали с чипом GLM (Biorad Laboratories 176-5012) первичным аминным сочетанием. Варианты CDRH3 иммобилизовали непосредственно на этой поверхности и рекомбинантный человеческий OSM пропускали над поверхностью с иммобилизованными антителами в концентрации 256, 64, 16, 4 и 1 нМ, инъекцию буфера самого по себе (т.е. 0 нМ) использовали для двойного контроля кривых связывания. После связывания с OSM поверхности с иммобилизованными антителами восстанавливали с использованием 3 М MgCl2, удаляя ранее захваченные антитела и подготавливая поверхность к следующему циклу иммобилизации и анализа связывания. Затем данные адаптировали к модели 1:1 (с переносом массы), включенной в аналитическое программное обеспечение ProteOn. Анализ проводили с использованием HBS-ЕР (Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69) при температуре 25°С.
Похожий способ применяли для анализа конструкций с использованием Biacore T100. Противоче-ловеческий IgG (GE Healthcare/Biacore BR-1008-39) сочетали с чипом СМ5 (GE Healthcare/Biacore BR-1006-68) первичным аминным сочетанием, антитела иммобилизовали на этой поверхности и рекомби-нантный человеческий OSM пропускали над поверхностью с иммобилизованными антителами в концентрации 256, 64, 16, 4 и 1 нМ, инъекцию буфера самого по себе (т.е. 0 нМ) использовали для двойного контроля кривых связывания. Восстановление проводили с применением введений 3 М MgCl2 или 100 мМ фосфорной кислоты или с использованием обоих реагентов. Данные адаптировали к модели 1:1, включенной в аналитическое программное обеспечение Biacore T100. Анализ проводили с использованием HBS-EP (Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69) при температуре 25°С.
Полученные данные о связывании представлены на фиг. 33.
Домен VL ЗЕЗ (мышиный)
SEQ ID N0:32
SEQ ID N0:31
Домен VH 2В7 (мышиный)
SEQ ID N0:34
SEQ ID N0:33
Домен VL 2В7 (мышиный)
SEQ ID N0:36
SEQ ID N0:35
Домен VH 9G2 (мышиный)
SEQ ID N0:38
SEQ ID N0:37
Домен VL 9G2 (мышиный)
SEQ ID N0:40
SEQ ID N0:39
Домен VH 10G8 (химерный)
SEQ ID N0:42
SEQ ID N0:41
Домен VL10G8 (химерный)
SEQ ID N0:44
SEQ ID N0:43
Домен VH 9G2 (химерный)
SEQ ID N0:46
SEQ ID N0:45
Домен VL 9G2 (химерный)
SEQ ID N0:48
SEQ ID N0:47
Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи IGHV3_7
SEQ ID N0:50
SEQ ID N0:49
Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи IGKV4J
SEQ ID N0:52
SEQ ID N0:51
VH гуманизированной НО 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:54
SEQ ID N0:53
VH гуманизированной Н1 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:56
SEQ ID N0:55
VH гуманизированной Н2 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с
SEQ ID N0:58
SEQ ID N0:57
применением программы Leto)
VL гуманизированной LO 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:60
SEQ ID N0:59
VL гуманизированной L1 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:62
SEQ ID N0:61
VL гуманизированной L2 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:64
SEQ ID N0:63
VL гуманизированной L3 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:66
SEQ ID N0:65
VL гуманизированной L4 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:68
SEQ ID N0:67
Зрелая тяжелая цепь НО (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением LETO)
SEQ ID N0:70
SEQ ID N0:69
Зрелая легкая цепь L1 (нуклеотидная
SEQ ID N0:72
SEQ ID N0:71
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
Гуманизированный вариант VH НО (нуклеотидная последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:74
SEQ ID N0:73
Зрелая тяжелая цепь НО (IGHV3_23 CDRH1) (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:76
SEQ ID N0:75
CDRH1 человеческой эмбриональной тяжелой цепи IGHV3_23
SEQ ID N0:77
CDRL2 человеческой эмбриональной легкой цепи IGKV1_5
SEQ ID N0:78
Тяжелая цепь 15Е1 Oh
SEQ ID N0:79
Легкая цепь 15Е10И
SEQ ID N0:80
VH ВЗ гуманизированного 15Е10
SEQ ID N0:81
VL L2 гуманизированного 15Е10
SEQ ID N0:82
Человеческий OSM
SEQ ID N0:84
SEQ ID N0:83
DVGLTTFWYFDV
RASKSVSPSGYDFMH
YASELES
QHSREFPFT
NYAMS
TISDGGGYTYYLDNGQG
DVGLTTFWYFDV
RASKSVSPSSYNFMH
YASNLES
QHSREFPFT
SEQ ID NO:10-CDRL1 3E3
SEQ ID N0:11 - CDRL2 3E3
SEQ ID N0:12 - CDRL3 3E3
SEQ ID N0:13 - CDRH1 2B7
SEQ ID N0:14 - CDRH2 2B7
SEQ ID N0:15 - CDRH3 2B7
SEQ ID N0:16 - CDRL1 2B7
SEQ ID NO:17 - CDRL2 2B7
SEQ ID NO:18 - CDRL3 2B7
SEQ ID N0:19 - CDRH1 9G2
NYAMS
SEQ ID N0:20 - CDRH2 9G2
TISDGGSFTYYLDNVKG
SEQ ID N0:21 - CDRH3 9G2
DVG HTTFWYFD V
SEQ ID N0:22 - CDRL1 9G2
RASKSVSASG YN FMH
SEQ ID N0:23 - CDRL2 9G2
YASNLES
SEQ ID NO:24 - CDRL3 9G2
QHSREFPFT
SEQ ID N0:25 - нуклеотидная последовательность VH 10G8
GAAATGCAACTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
GGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACCTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCTCAGGGACCGCGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:26 - аминокислотная последовательность VH 10G8
EMQLVESGEGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKSLEWVATISDGGSFTYYLDNVRG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTAVTVSS
SEQ ID N0:27 - нуклеотидная последовательность VL 10G8
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGTAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCAGCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAA
CCAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGG ATGCTGTAACATATTACTGTCTGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAA CCTGGAAATAAAA
SEQ ID N0:28 - аминокислотная последовательность VL 10G8
DIVLTQSPVFLVVSLGQRATISCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFS GSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCLHSREFPFTFGGGTNLEIK
SEQ ID N0:29 - нуклеотидная последовательность VH ЗЕЗ
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGTACCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATTTTGCCAATATAC AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAACAACCTATACCTGCAAATGAACCATCTG AAGTCTGAGGACGCAGGCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGCCTTACTACGTTTTGGTATTT CGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N0:30 - аминокислотная последовательность VH ЗЕЗ
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCVPSGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYFANIQG RFTISRDNTKNNLYLQMNHLKSEDAGMYYCARDVGLTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID N0:31 - нуклеотидная последовательность VL ЗЕЗ
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAACTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTCCATCTGGCTATGATTTCATGCACTGGTATCAACAGAAG
CCAGGACAGCCGCCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCGAACTAGAATCTGGGGTCCCTGGCA
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAAGAAGA
TGCTGCAACATATTTCTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAG
CTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:32 - аминокислотная последовательность VL ЗЕЗ
DIVLTQSPASLTISLGQRATISCRASKSVSPSGYDFMHWYQQKPGQPPKLLIKYASELESGVPGRFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQHSREFPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID N0:33 - нуклеотидная последовательность VH 2B7
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATTAGTGATGGTGGTGGTTACACCTACTATTTAGACAATGGA CAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAGATGAGCCATC TGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACTTACTACGTTTTGGTAC TTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N0:34 - аминокислотная последовательность VH 2B7
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGGYTYYLDNGQ GRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCARDVGLTTFVVYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID N0:35 - нуклеотидная последовательность VL 2B7
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTCCATCTAGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAGAC CAGGACAGCCGCCCAAACTCCTCATCACGTATGCTTCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAAGAGGAT GCTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAGGC TGGAAATAAAA
SEQ ID N0:36 - аминокислотная последовательность VL 2B7
DIVLTQSPVSLVISLGQRATISCRASKSVSPSSYNFMHWYQQRPGQPPKLLITYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPFTFGGGTRLEIK
SEQ ID N0:37 - нуклеотидная последовательность VH 9G2
GAAGTACAACTAGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACGTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:38 - аминокислотная последовательность VH 9G2
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYLDNVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID N0:39 - нуклеотидная последовательность VL 9G2
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCATCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAAC CAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGAT GCTGTAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGC TGGAAATAAAA
SEQ ID N0:40 - аминокислотная последовательность VL 9G2
DIVLTQSPVFLVISLGQRATISCRASKSVSASGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSREFPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID N0:41 - нуклеотидная последовательность VH химерного 10G8
GAAATGCAACTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
GGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACCTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCTCAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGT
GTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG
TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCG
TGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCC
TGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCT
GATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA
GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGA
GGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCT
GAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACC
ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG
GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAG
GGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCC
TGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID N0:42 - аминокислотная последовательность VH химерного 10G8
EMQLVESGEGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKSLEWVATISDGGSFTYYLDNVRG
RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTLVTVSSASTKGPSVFPL
APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT
QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:43 - нуклеотидная последовательность VL химерного 10G8
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGTAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCAGCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAA
CCAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCA
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGG
ATGCTGTAACATATTACTGTCTGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAA
CCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAG
CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAG
GTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCA
GGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGA
GAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAG
CTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID N0:44 - аминокислотная последовательность VL химерного 10G8
DIVLTQSPVFLWSLGQRATISCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFS GSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCLHSREFPFTFGGGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:45 - нуклеотидная последовательность VH химерного 9G2
GAAGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGMCAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACGTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGT
GTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG
TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCG
TGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCC
TGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCT
GATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA
GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGA
GGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCT
GAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACC
ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG
GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAG
GGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCC
TGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO:46 - аминокислотная последовательность VH химерного 9G2
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYLDNVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWISISGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:47 - нуклеотидная последовательность VL химерного 9G2
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCATCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAAC
CAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG
GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGAT
GCTGTAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGC
TGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCT
GAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGT
GCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGG
ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGA
AGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCT
TCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID N0:48 - аминокислотная последовательность VL химерного 9G2
DIVLTQSPVFLVISLGQRATISCRASKSVSASGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSREFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:49 - Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная последовательность VH IGHV3_7
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTG TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAG CCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGT ATT ACTGTGC GAGA
SEQ ID N0:50 - Человеческая эмбриональная акцепторная аминокислотная последовательность VH IGHV3_7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
SEQ ID NO: 51 - Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная последовательность VL IGKV4_1
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA
ACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAG
CAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCC
CTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGC
TGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACT
SEQ ID N0:52 - Человеческая эмбриональная акцепторная аминокислотная последовательность VL IGKV4_1
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYST
SEQ ID N0:53 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VH гуманизированной НО 10G8
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:54 - Аминокислотная последовательность VH гуманизированной HO 10G8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID N0:55 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VH гуманизированной Н1 10G8
GAGATGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:56 - Аминокислотная последовательность VH гуманизированной Н1 10G8
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID N0:57 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VH гуманизированной Н2 10G8
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCTCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:58 - Аминокислотная последовательность VH гуманизированной Н2 10G8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTLVTVSS
SEQ ID N0:59 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной LO 10G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA
GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:60 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной LO 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:61 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L1 10G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:62 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L1 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:63 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L210G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGTGGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:64 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L2 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDWVYYC LHSREFPFTFGGGTKVEIК
SEQ ID N0:65 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L310G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG
AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAACGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:66 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L3 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTNVEIK
SEQ ID N0:67 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L410G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGTGGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAACGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:68 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L410G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDWVYYCLHSREFPFTFGGGTNVEIK
SEQ ID N0:69 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность зрелой тяжелой цепи НО
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC
TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG
CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA
CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA
CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT
CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG
CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGA
CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC
GTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT
AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC
GAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACC
AAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC
CAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTA
TCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCC
CTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCC
CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC
CCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC
CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID N0:70 - Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой цепи НО
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:71 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность зрелой легкой цепи L1
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC
AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG
AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA
GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC
GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC
ACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGAT
GAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAG
GCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC
CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGA
CTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGAC
CAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID N0:72 - Аминокислотная последовательность зрелой легкой цепи L1
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRG ЕС
SEQ ID N0:73 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность гуманизированного варианта VH НО
(IGHV3_23CDRH1)
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:74 - Аминокислотная последовательность гуманизированного варианта VH НО (IGHV3_23 CDRH1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID N0:75 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность зрелой тяжелой цепи НО (IGHV3_23
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC
TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG
CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA
CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA
CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT
CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG
CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGA
CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC
GTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT
AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC
GAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACC
AAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC
CAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTA
TCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCC
CTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCC
CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC
CCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC
CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID N0:76 - Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой цепи НО (IGHV3_23 CDRH1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:77 - CDRH1 человеческой эмбриональной тяжелой цепи
IGHV3_23
SYAMS
SEQ ID NO:78 - CDRL2 человеческой эмбриональной легкой цепи IGKV1_5
KASSLES
SEQ ID NO:79 - Аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного 15Е10
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWRGGSTDYNAAFM
SRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPNSNFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL
APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT
QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:80 - Аминокислотная последовательность легкой цепи
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIEDTSNLASGIPARFSGSGSGT DYTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:81 - VH ВЗ гуманизированного 15Е10
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWRGGSTDYNAAFM SRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPNSNFYWYFDVWGRGTLV (TVSS)
SEQ ID N0:82-VL L2 гуманизированного 15E10
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIEDTSNLASGIPARFSGSGSGT DYTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTFGQGTKLEIK
SEQ ID N0:83 - Полинуклеотидная последовательность человеческого OSM
ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC
CTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCGGCTATAGGCAGCTGCTCGAAAGAG
TACCGCGTGCTCCTTGGCCAGCTCCAGAAGCAGACAGATCTCATGCAGGAC
ACCAGCAGACTCCTGGACCCCTATATACGTATCCAAGGCCTGGATGTTCCT
AAACTGAGAGAGCACTGCAGGGAGCGCCCCGGGGCCTTCCCCAGTGAGGAG
ACCCTGAGGGGGCTGGGCAGGCGGGGCTTCCTGCAGACCCTCAATGCCACA
CTGGGCTGCGTCCTGCACAGACTGGCCGACTTAGAGCAGCGCCTCCCCAAG
GCCCAGGATTTGGAGAGGTCTGGGCTGAACATCGAGGACTTGGAGAAGCTG
CAGATGGCGAGGCCGAACATCCTCGGGCTCAGGAACAACATCTACTGCATG
GCCCAGCTGCTGGACAACTCAGACACGGCTGAGCCCACGAAGGCTGGCCGG
GGGGCCTCTCAGCCGCCCACCCCCACCCCTGCCTCGGATGCTTTTCAGCGC
AAGCTGGAGGGCTGCAGGTTCCTGCATGGCTACCATCGCTTCATGCACTCA
GTGGGGCGGGTCTTCAGCAAGTGGGGGGAGAGCCCGAACCGGAGCCGGAGA
CACAGCCCCCACCAGGCCCTGAGGAAGGGGGTGCGCAGGACCAGACCCTCC
AGGAAAGGCAAGAGACTCATGACCAGGGGACAGCTGCCCCGGTAG
SEQ ID N0:84 - Аминокислотная последовательность человеческого OSM
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQD
TSRLLDPYIRIQGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNAT
LGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNILGLRNNIYCM
AQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHS
VGRVFSKWGESPNRSRRHSPHQALRKGVRRTRPSRKGKRLMTRGQLPR.
Перечень последовательностей
<110> Глаксо Груп Лимитед
<120> Антигенсвязывающие белки,связывающиеся с онкостатином М (OSM)
<130> РВ63694 <160> 84
<170> FastSEQ для Windows версия 4.0
<210> 1 <211> 5 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 1
Asn Туг Ala Met Ser 1 5
<210> 2 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 2
Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val Arg
15 10 15
Gly
<210> 3 <211> 12 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 3
Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val 15 10
<210> 4 <211> 15 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 4
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala Gly Tyr Asn Phe Met His
15 10 15
<210> 5 <211> 7
<212> ПРТ <213> Мышь
<400> 5
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 6 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 6
Leu His Ser Arg Glu Phe Pro Phe Thr 1 5
<210> 7 <211> 5 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 7
Ser Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 8 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 8
Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Phe Ala Asn Ile Gin
15 10 15
Gly
<210> 9 <211> 12 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 9
Asp Val Gly Leu Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val 15 10
<210> 10 <211> 15 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 10
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Met His
15 10 15
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Ser His Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 27 <211> 333 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 27
gacattgtgc
atctcctgta
caacagaaac
ggggtccctg
cctgtggagg
acgttcggag
tgacacagtc tcctgttttc ttagttgtat ctctggggca gagggccacc 60
gggccagcaa aagtgtcagt gcagctggct ataatttcat gcactggtac 120
caggacagcc gcccaaagtc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180
ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
aggaggatgc tgtaacatat tactgtctgc acagtaggga gtttccgttc 300
gggggaccaa cctggaaata aaa 333
<210> 28 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Val Phe Leu Val Val Ser Leu Gly
15 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Val Thr Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29 <211> 363 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 29
gaagtgcagc
tcctgtgtac
ccggaaaaga
tttgccaata
ctgcaaatga
ggccttacta
tea tggtggagtc cctctggatt ggctggagtg tacagggecg accatctgaa cgttttggta tgggggagac cactttcagt ggtcgcaacc attcaccatc gtctgaggac tttcgatgtc ttagtgaaac agttatgcca attagtgatg tccagagaca gcaggcatgt tggggcacag ctggagggtc tgtcttgggt gtggtagttt ataccaagaa attactgtgc ggaccacggt cctgaaactc 60 tcgccagact 120 cacctactat 180 caacctatac 240 aagagatgtg 300 caccgtctcc 360 363
<210> 30 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 30 Glu Val Gin 1
Ser Leu Lys
Ala Met Ser 35
Ala Thr Ile 50
Gin Gly Arg 65
Leu Gin Met
Ala Arg Asp
Thr Gly Thr 115
Leu Val 5
Leu Ser 20
Trp Val
Ser Asp
Phe Thr
Asn His 85
Val Gly 100
Thr Val
Gly Gly
55 Ile Ser 70
Leu Lys Leu Thr Thr Val
Pro Ser
25 Thr Pro 40
Ser Phe
Arg Asp
Ser Glu
Thr Phe 105 Ser Ser 120
Asp Leu 10
Gly Phe
Glu Lys
Thr Tyr
Asn Thr 75
Asp Ala 90
Trp Tyr
Val Lys
Thr Phe
Arg Leu 45
Tyr Phe 60
Lys Asn Gly Met Phe Asp
Asn
Leu
Tyr
Tyr
Tyr
Cys
Val
Trp
Gly
110
<210> 31 <211> 333 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 31
gacattgtgc
atctcctgca
caacagaagc
ggggtccctg
cctgtggagg
acgttcggag
<210> 32 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
tgacacagtc gggccagcaa caggacagcc gcaggttcag aagaagatgc gggggaccaa tcctgcttcc aagtgtcagt gcccaaactc tggcagtggg tgcaacatat gctggaaata ttaactatat ccatctggct ctcatcaagt tctgggacag ttctgtcagc aaa ctctggggca atgatttcat atgcatccga atttcaccct acagtaggga gagggccacc 60 gcactggtat 120 actagaatct 180 caacatccat 240 gtttccgttc 300 333
<400> 32
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Thr Ile Ser Leu Gly
15 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Pro Ser
20 25 30
Gly Tyr Asp Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Leu Glu Ser Gly Val Pro Gly
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gin His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33 <211> 364 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 33
gaagtgcagc
tcctgtgcag
ccggaaaaga
ttagacaatg
ctgcagatga
ggacttacta
ctca
tggtggagtc cctctggatt ggctggagtg gacagggccg gccatctgaa cgttttggta tgggggaggc cactttcagt ggtcgcgacc attcaccatc gtctgaggac ccttcgatgt ttagtgaaac aactatgcca attagtgatg tccagagaca acagccatgt ctggggcaca ctggagggtc tgtcttgggt gtggtggtta atgccaagaa attactgtgc gggaccacgg cctgaaactc 60 tcgccagact 120 cacctactat 180 caacctgtac 240 aagagatgtg 300 tcaccgtctc 360 364
<210> 34 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 34 Glu Val Gin Leu 1
Ser Leu Lys Leu 20
Ala Met Ser Trp 35
Ala Thr Ile Ser 50
Gin Gly Arg Phe 65
Leu Gin Met Ser
Ala Arg Asp Val 100
Thr Gly Thr Thr 115
Val Glu
Ser Cys
Val Arg
Asp Gly
Thr Ile
70 His Leu 85
Gly Leu
Gly Leu 10
Gly Phe
Glu Lys
Thr Tyr
Asn Ala 75
Asp Thr 90
Trp Tyr
Val Lys
Thr Phe
Arg Leu 45
Tyr Leu 60
Lys Asn Ala Met Phe Asp
Pro
Gly
Gly
Ser
Asn
Tyr
Glu
Trp
Val
Asp
Asn
Gly
Asn
Leu
Tyr
Tyr
Tyr
Cys
Val
Trp
Gly
110
<210> 35 <211> 333 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 35
gacattgtgc
atctcctgca
caacagagac
ggggtccctg
cctgtggagg
acgttcggag
<210> 36 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
tgacacagtc tcctgtttcc ttagttatat ctctggggca gagggccacc 60
gggccagcaa aagtgtcagt ccatctagct ataatttcat gcactggtac 120
caggacagcc gcccaaactc ctcatcacgt atgcttccaa cctagaatct 180
ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
aagaggatgc tgcaacatat tactgtcagc acagtaggga gtttccgttc 300
gggggaccag gctggaaata aaa 333
<400> 36
Asp Не Val Leu Thr Gin Ser Pro Val Ser Leu Val Ile Ser Leu Gly
15 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Pro Ser
20 25 30
Ser Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Thr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37 <211> 363 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 37
gaagtacaac
tcctgtgcag
ccggaaaaga
ctagacaatg
ttgcaaatga
ggacatacta
tea tagtggagtc cctctggatt ggctggagtg taaagggccg gecatttgaa cgttttggta tgggggaggc cactttcagt ggtcgcaacc attcaccatc gtctgacgac cttcgatgtc ttagtggagc aactatgcca attagtgatg tccagagaca acagccatgt tggggcacag ctggagggtc tgtcttgggt gtggtagttt atgccaagaa attactgtgc ggaccacggt cctgaaactc 60 tcgccagact 120 cacctactat 180 caacctgtat 240 aagagatgtg 300 caccgtctcc 360 363
<210> 38 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 3! Glu Val 1
Ser Leu
Ala Met
Ala Thr
50 Lys Gly 65
Leu Gin Ala Arg Thr Gly
Gin Leu
Lys Leu
20 Ser Trp 35
Ile Ser
Arg Phe
Met Ser
Asp Val 100 Thr Thr 115
Val
5 Ser
Val
Asp
Thr
His
Gly
Val
Glu
Cys
Arg
Gly
Ile
Leu
His
Thr
Ser Gly
Ala Ala
Gin Thr
40 Gly Ser 55
Ser Arg
Lys Ser
Thr Thr
Val Ser 120
Gly Gly
10 Ser Gly 25
Pro Glu
Phe Thr
Asp Asn
Asp Asp
90 Phe Trp 105 Ser
Phe Ser
30 Leu Glu 45
Leu Asp
Leu Val Glu Pro Phe Thr Lys Arg
Tyr Tyr 60
Ala Lys 75
Thr Ala Tyr Phe
Gly Gly 15
Asn Tyr Trp Val Asn Val
<210> 39 <211> 333 <212> ДНК
<213> Мышь <400> 39
gacattgtgc tgacacagtc tcctgttttc ttagttatat ctctggggca gagggccacc 60
atctcctgca gggccagcaa aagtgtcagt gcatctggct ataatttcat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc gcccaaagtc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgtaacatat tactgtcagc acagtaggga gtttccgttc 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 40 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 40
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Val Phe Leu
15 10 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys
20 25 Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys
35 40 Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu
50 55
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Val Thr Tyr Tyr
85 90 Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105
Val Ile Ser Leu Gly 15
Ser Val Ser Ala Ser 30
Pro Gly Gin Pro Pro 45
Ser Gly Val Pro Ala 60
Thr Leu Asn Ile His 80
Cys Gin His Ser Arg 95
Leu Glu Ile Lys 110
<210> 41 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 41
gaaatgcaac
tcctgtgcag
ccggaaaaga
ctagacaatg
ttgcaaatga
ggacatacta
agcgccagca
ggcggcacag
tcctggaaca
agcggcctgt
acctacatct
cccaagagct
ggccccagcg
cccgaggtga
tggtacgtgg
aacagcacct
aaggagtaca
agcaaggcca
gagctgacca
atcgccgtgg tggtggagtc cctctggatt gcctggagtg taaggggccg gccatttgaa ccttttggta ccaagggccc ccgccctggg gcggagccct acagcctgag gtaacgtgaa gtgacaagac tgttcctgtt cctgtgtggt acggcgtgga accgggtggt agtgtaaggt agggccagcc agaaccaggt agtgggagag tggggaaggc cactttcagt ggtcgcaacc attcaccatc gtctgacgac cttcgatgtc cagcgtgttc ctgcctggtg gaccagcggc cagcgtggtg ccacaagccc ccacacctgc cccccccaag ggtggatgtg ggtgcacaat gtccgtgctg gtccaacaag cagagagccc gtccctgacc caacggccag ttagtggagc aactatgcca attagtgatg tccagagaca acagccatgt tggggctcag cccctggccc aaggactact gtgcacacct accgtgccca agcaacacca cccccctgcc cctaaggaca agccacgagg gccaagacca accgtgctgc gccctgcctg caggtgtaca tgcctggtga cccgagaaca ctggagggtc tgtcttgggt gtggtagttt atgccaagaa attactgtgc ggacactagt ccagcagcaa tccccgaacc tccccgccgt gcagcagcct aggtggacaa ctgcccccga ccctgatgat accctgaggt agcccaggga accaggattg cccctatcga ccctgccccc agggcttcta actacaagac cctgaaactc tcgccagact cacctactat caacctgtat aagagatgtg gaccgtgtcc gagcaccagc ggtgaccgtg gctgcagagc gggcacccag gaaggtggag gctgctggga cagcagaacc gaagttcaac ggagcagtac gctgaacggc gaaaaccatc tagcagagat ccccagcgac caccccccct
gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag
<210> 42 <211> 451 <212> ПРТ
<213> Химерная последовательность <400> 42
Glu Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu
15 10 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
20 25 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys
35 40 Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr
50 55
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
65 70 75
Leu Gin Met Ser His Leu Lys Ser Asp Asp Thr
85 90 Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr
100 105 Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile
195 200 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin
290 295
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin
305 310 315
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro
340 345 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375
Val Glu Pro Thr Ser
tgaccgtgga caagagcaga 1260 aggccctgca caatcactac 1320 1353
Phe Ser
30 Leu Glu 45
Leu Asp
Asn Asn
Met Tyr
Asp Val 110 Lys Gly 125
Gly Gly
Pro Val
Thr Phe
Val Val 190 Asn Val 205
Pro Lys
Glu Leu
Asp Thr
Asp Val 270 Gly Val 285
Asn Ser
Trp Leu
Pro Ala
Glu Pro 350 Asn Gin 365
Ile Ala
Gly Gly 15
Asn Tyr
Tyr
Lys
Ala
Phe
Thr
Ser 140 Glu
His
Ser
Cys
Glu 220 Pro
Lys
Val
Asp
Tyr 300 Asp
Leu
Arg
Lys
Asp 380
Trp Val
Asn Val
Leu Tyr
80 Tyr Cys 95
Trp Gly
Pro Ser
Thr Ala
Thr Val 160 Pro Ala 175
Thr Val
Asn His
Ser Cys
Leu Gly 240 Leu Met 255
Ser His
Glu Val
Thr Tyr
Asn Gly
320
Pro Ile
335
Gin Val
Val Ser
Val Glu
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 43 <211> 654 <212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 43
gacattgtgc
atctcctgta
caacagaaac
ggggtccctg
cctgtggagg
acgttcggag
atcttccccc
aacaacttct
ggcaacagcc
agcaccctga
acccaccagg tgacacagtc gggccagcaa caggacagcc ccaggttcag aggaggatgc gggggaccaa ccagcgatga acccccggga aggagagcgt ccctgagcaa gcctgtccag tcctgttttc aagtgtcagt gcccaaagtc tggcagtggg tgtaacatat cctggaaata gcagctgaag ggccaaggtg gaccgagcag ggccgactac ccccgtgacc ttagttgtat gcagctggct ctcatcaagt tctgggacag tactgtctgc aaacgtacgg agcggcaccg cagtggaagg gacagcaagg gagaagcaca aagagcttca ctctggggca ataatttcat atgcatccaa acttcaccct acagtaggga tggccgcccc ccagcgtggt tggacaatgc actccaccta aggtgtacgc accggggcga gagggccacc 60 gcactggtac 120 cctagaatct 180 caacatccat 240 gtttccgttc 300 cagcgtgttc 360 gtgtctgctg 420 cctgcagagc 480 cagcctgagc 540 ctgtgaggtg 600 gtgc 654
<210> 44 <211> 218 <212> ПРТ
<213> Химерная последовательность
<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Val Phe
15 10 Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25 Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin
35 40 Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu
50 55 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Val Thr Tyr
85 90 Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr
100 105 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 145 150
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin 165 170
Val Ser
30 Gly Gin 45
Gly Val
Leu Val Val Ser Lys Ser Lys Pro
Leu Asn
Leu His
Glu Ile 110 Ser Asp 125
Asn Asn Ala Leu Lys Asp
Glu Ser
60 Phe Thr 75
Tyr Cys
Asn Leu
Pro Pro
Leu Leu 140 Asp Asn 155
Asp Ser
Leu Gly 15
Ala Ala
Pro Pro
Pro Ala
Ile His
80 Ser Arg 95
Lys Arg
Glu Gin
Phe Tyr
Gin Ser 160 Ser Thr 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 45 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 45
gaagtacaac
tcctgtgcag
ccggaaaaga
ctagacaatg
ttgcaaatga
ggacatacta
agcgccagca
ggcggcacag
tcctggaaca
agcggcctgt
acctacatct
cccaagagct
ggccccagcg
cccgaggtga
tggtacgtgg
aacagcacct
aaggagtaca
agcaaggcca
gagctgacca
atcgccgtgg
gtgctggaca
tggcagcagg
acccagaaga
tggtggagtc cctctggatt ggctggagtg taaagggccg gccatttgaa cgttttggta ccaagggccc ccgccctggg gcggagccct acagcctgag gtaacgtgaa gtgacaagac tgttcctgtt cctgtgtggt acggcgtgga accgggtggt agtgtaaggt agggccagcc agaaccaggt agtgggagag gcgatggcag gcaacgtgtt gcctgagcct tgggggaggc cactttcagt ggtcgcaacc attcaccatc gtctgacgac cttcgatgtc cagcgtgttc ctgcctggtg gaccagcggc cagcgtggtg ccacaagccc ccacacctgc cccccccaag ggtggatgtg ggtgcacaat gtccgtgctg gtccaacaag cagagagccc gtccctgacc caacggccag cttcttcctg cagctgctcc gtcccctggc ttagtggagc aactatgcca attagtgatg tccagagaca acagccatgt tggggcacag cccctggccc aaggactact gtgcacacct accgtgccca agcaacacca cccccctgcc cctaaggaca agccacgagg gccaagacca accgtgctgc gccctgcctg caggtgtaca tgcctggtga cccgagaaca tacagcaagc gtgatgcacg aag ctggagggtc tgtcttgggt gtggtagttt atgccaagaa attactgtgc ggacactagt ccagcagcaa tccccgaacc tccccgccgt gcagcagcct aggtggacaa ctgcccccga ccctgatgat accctgaggt agcccaggga accaggattg cccctatcga ccctgccccc agggcttcta actacaagac tgaccgtgga aggccctgca cctgaaactc tcgccagact cacctactat caacctgtat aagagatgtg gaccgtgtcc gagcaccagc ggtgaccgtg gctgcagagc gggcacccag gaaggtggag gctgctggga cagcagaacc gaagttcaac ggagcagtac gctgaacggc gaaaaccatc tagcagagat ccccagcgac caccccccct caagagcaga caatcactac
<210> 46 <211> 451 <212> ПРТ
<213> Химерная последовательность
<400> 46
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Ser His Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Glu Tyr Leu
Gly Thr 115 Phe Pro 130
Leu Gly
Trp Asn
Leu Gin
Ser Ser 195 Pro Ser 210
Lys Thr
Glu Tyr
Lys Thr
Thr Leu 355 Thr Cys 370
Glu Ser
Leu Asp
Lys Ser
Glu Ala 435 Gly Lys 450
Pro Ser 135 Val Lys 150
Ala Leu
Leu Val Thr Val Leu Ala Cys Leu
Gly Leu Gly Thr
Ser Gly 165 Ser Ser 180
Lys Gly 375 Gin Pro 390
Gly Ser Gin Gin Asn His
Ser Leu
Glu
Val
Lys
Phe
Lys
Thr
Lys
Pro
295
Ser
Val
Leu
Thr
310
Lys
Cys
Lys
Val
325
Ile
Ser
Lys
Ala
340
Pro
Pro
Ser
Arg
Leu Val
Asn Gly
Ser Asp 405 Arg Trp 420
Leu His
Ser 120 Ser
Asp
Thr
Tyr
Gin 200 Asp
Val
Ser
Lys
Asp 360 Phe
Glu
Phe
Gly
Tyr 440
Ser Gly 170 Ser Leu 185
Thr Tyr
Lys Lys
Cys Pro
Pro Lys 250 Cys Val 265
Trp Tyr
Glu Glu
Leu His
Asn Lys 330 Gly Gin 345
Glu Leu
Tyr Pro
Asn Asn
Phe Leu 410 Asn Val 425
Thr Gin
Thr Ser 140 Pro Glu 155
Val His
Ser Ser
Ile Cys
Val Glu 220 Ala Pro 235
Pro Lys
Val Val
Val Asp
Gin Tyr 300 Gin Asp 315
Ala Leu
Pro Arg
Thr Lys
Ser Asp 380 Tyr Lys 395
Tyr Ser Phe Ser Lys Ser
Lys Gly 125
Gly Gly
Pro Val
Thr Phe
Val Val 190 Asn Val 205
Pro Lys
Glu Leu
Asp Thr
Asp Val 270 Gly Val 285
Asn Ser
Trp Leu
Pro Ala
Glu Pro 350 Asn Gin 365
Ile Ala
Thr Thr
Lys Leu
Cys Ser 430 Leu Ser 445
Pro Ser
Thr Ala
Thr Val 160 Pro Ala 175
Thr Val
Asn His
Ser Cys
Leu Gly 240 Leu Met 255
Ser His
Glu Val
Thr Tyr
Asn Gly 320 Pro Ile 335
Gin Val
Val Ser
Val Glu
Pro Pro 400 Thr Val 415
Val Met Leu Ser
<210> 47 <211> 654 <212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 47
gacattgtgc
atctcctgca
caacagaaac
ggggtccctg
cctgtggagg
acgttcggag tgacacagtc gggccagcaa caggacagcc ccaggttcag aggaggatgc gggggaccaa tcctgttttc aagtgtcagt gcccaaagtc tggcagtggg tgtaacatat gctggaaata ttagttatat gcatctggct ctcatcaagt tctgggacag tactgtcagc aaacgtacgg ctctggggca ataatttcat atgcatccaa acttcaccct acagtaggga tggccgcccc
180 240
gagggccacc 60 gcactggtac 120 cctagaatct caacatccat gtttccgttc 300 cagcgtgttc 360
atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg
aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg
ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg
agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca
acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca
ccagcgtggt gtgtctgctg 420 tggacaatgc cctgcagagc 480 actccaccta cagcctgagc 540 aggtgtacgc ctgtgaggtg 600 accggggcga gtgc 654
<210> 48 <211> 218 <212> ПРТ
<213> Химерная последовательность <400> 48
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Val Phe Leu Val Ile Ser Leu Gly
15 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ser
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Val Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 49 <211> 294 <212> ДНК
<213> Homo Sapiens <400> 49
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 50 <211> 98 <212> ПРТ <213> Человек
<400> 50
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gin Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 51
<211> 300
<212> ДНК
<213> Homo Sapiens
<400> 51
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagtact 300
<210> 52 <211> 100 <212> ПРТ
<213> Homo Sapiens <400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr 100
<210> 53 <211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo Sapiens и Mus musculus <400> 53
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc aactacgcca cccggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atcagcgacg ctggacaacg tgaggggcag gttcaccatc agcagggaca ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt ggccacacca ccttctggta cttcgacgtc tggggcaggg age
<210> 54 <211> 121 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
ceggegggag tgagctgggt geggcagett acgccaagaa actactgcgc gcacactagt cctgagactc 60 gaggcaggee 120 cacctactat 180 cagcctgtac 240 cagggaegtc 300 gaccgtgtcc 360 363
<220>
<223> Homo Sapiens и Mus musculus <400> 54
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 55 <211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 55
gagatgeage
tcttgcgccg
cccggcaagg
ctggacaacg
ctgcagatga
ggccacacca
age
<210> 56 <211> 121
tggtggaaag ctagcggctt gcctggagtg tgaggggcag acagcctgag ccttctggta cggcggcggc caccttcagc ggtggccacc gttcaccatc ggccgaggat cttcgacgtc ctggtccagc aactacgcca atcagcgacg agcagggaca accgccgtgt tggggcaggg ceggegggag tgagctgggt geggcagett acgccaagaa actactgcgc gcacactagt cctgagactc 60 gaggcaggee 120 cacctactat 180 cagcctgtac 240 cagggaegtc 300 gaccgtgtcc 360 363
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 56
Glu Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 57 <211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo Sapiens и Mus musculus
<400> 57
gaggtgcagc
tcttgcgccg
cccggcaagg
ctggacaacg
ctgcagatga
ggccacacca
age tggtggaaag ctagcggctt gcctggagtg tgaggggcag acagcctgag ccttctggta cggcggcggc caccttcagc ggtggccacc gttcaccatc ggccgaggat cttcgacgtc ctggtccagc aactacgcca atcagcgacg agcagggaca accgccgtgt tggggctccg ceggegggag tgagctgggt geggcagett acgccaagaa actactgcgc gcacactagt cctgagactc 60 gaggcaggee 120 cacctactat 180 cagcctgtac 240 cagggaegtc 300 gaccgtgtcc 360 363
<210> 58 <211> 121 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 58
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 59 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 59
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctact ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg agcctgcagg ccgaggacgt cgccgtgtac tactgcctgc acctttggcg gcggcaccaa ggtggagatc aag
gcctgggcga aagggccacc 60 acaacttcat gcactggtac 120 acgcctccaa cctggagagc 180 acttcaccct gaccatctca 240 acagcaggga gttccccttc 300 333
<210> 60 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu
15 10 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys
20 25 Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys
35 40 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu
50 55
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
85 90 Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105
Ala Val Ser Leu Gly 15
Ser Val Ser Ala Ala 30
Pro Gly Gin Pro Pro 45
Ser Gly Val Pro Asp 60
Thr Leu Thr Ile Ser 80
Cys Leu His Ser Arg 95
Val Glu Ile Lys 110
<210> 61 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 61
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct cagcagaagc ccggccagcc ccccaaggtg ctgatctact ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg agcctgcagg ccgaggacgt cgccgtgtac tactgcctgc acctttggcg gcggcaccaa ggtggagatc aag
gcctgggcga aagggccacc 60 acaacttcat gcactggtac 120 acgcctccaa cctggagagc 180 acttcaccct gaccatctca 240 acagcaggga gttccccttc 300 333
<210> 62 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 62
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 63 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 63
gacatcgtga
atcaactgca
cagcagaagc
ggcgtgccag
agcctgcagg
acctttggcg
tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60
gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct acaacttcat gcactggtac 120
ccggccagcc ccccaagctg ctgatctact acgcctccaa cctggagagc 180
acaggttcag cggatctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctca 240
ccgaggacgt cgtggtgtac tactgcctgc acagcaggga gttccccttc 300
gcggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 64 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 64
Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Val Val Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 65
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctact ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg agcctgcagg ccgaggacgt cgccgtgtac tactgcctgc acctttggcg gcggcaccaa cgtggagatc aag
gcctgggcga aagggccacc 60 acaacttcat gcactggtac 120 acgcctccaa cctggagagc 180 acttcaccct gaccatctca 240 acagcaggga gttccccttc 300 333
<210> 66 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 66
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu
15 10 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys
20 25 Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys
35 40 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu
50 55
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
85 90 Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn 100 105
Ala Val Ser Leu Gly 15
Ser Val Ser Ala Ala 30
Pro Gly Gin Pro Pro 45
Ser Gly Val Pro Asp 60
Thr Leu Thr Ile Ser 80
Cys Leu His Ser Arg 95
Val Glu Ile Lys 110
<210> 67 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 67
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct cagcagaagc ccggccagcc ccccaaggtg ctgatctact ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg agcctgcagg ccgaggacgt cgtggtgtac tactgcctgc acctttggcg gcggcaccaa cgtggagatc aag
<210> 68 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
gcctgggcga aagggccacc 60 acaacttcat gcactggtac 120 acgcctccaa cctggagagc 180 acttcaccct gaccatctca 240 acagcaggga gttccccttc 300 333
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu
15 10 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys
20 25 Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys
35 40 Lys Val Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu
50 55
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75
Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Val Val Tyr Tyr
85 90 Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn 100 105
Ala Val Ser Leu Gly 15
Ser Val Ser Ala Ala 30
Pro Gly Gin Pro Pro 45
Ser Gly Val Pro Asp 60
Thr Leu Thr Ile Ser 80
Cys Leu His Ser Arg 95
Val Glu Ile Lys 110
<210> 69 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 69
gaggtgcagc
tcttgcgccg
cccggcaagg
ctggacaacg
ctgcagatga
ggccacacca
agcgccagca
tggtggaaag ctagcggctt gcctggagtg tgaggggcag acagcctgag ccttctggta ccaagggccc cggcggcggc caccttcagc ggtggccacc gttcaccatc ggccgaggat cttcgacgtc cagcgtgttc ctggtccagc aactacgcca atcagcgacg agcagggaca accgccgtgt tggggcaggg cccctggccc ceggegggag tgagctgggt geggcagett acgccaagaa actactgcgc gcacactagt ccagcagcaa cctgagactc 60 gaggcaggee 120 cacctactat 180 cagcctgtac 240 cagggaegtc 300 gaccgtgtcc 360 gagcaccagc 420
ggcggcacag tcctggaaca agcggcctgt acctacatct cccaagagct ggccccagcg cccgaggtga tggtacgtgg aacagcacct aaggagtaca agcaaggcca gagctgacca atcgccgtgg gtgctggaca tggcagcagg acccagaaga ccgccctggg gcggagccct acagcctgag gtaacgtgaa gtgacaagac tgttcctgtt cctgtgtggt acggcgtgga accgggtggt agtgtaaggt agggccagcc agaaccaggt agtgggagag gcgatggcag gcaacgtgtt gcctgagcct ctgcctggtg gaccagcggc cagcgtggtg ccacaagccc ccacacctgc cccccccaag ggtggatgtg ggtgcacaat gtccgtgctg gtccaacaag cagagagccc gtccctgacc caacggccag cttcttcctg cagctgctcc gtcccctggc aaggactact gtgcacacct accgtgccca agcaacacca cccccctgcc cctaaggaca agccacgagg gccaagacca accgtgctgc gccctgcctg caggtgtaca tgcctggtga cccgagaaca tacagcaagc gtgatgcacg aag tccccgaacc tccccgccgt gcagcagcct aggtggacaa ctgcccccga ccctgatgat accctgaggt agcccaggga accaggattg cccctatcga ccctgccccc agggcttcta actacaagac tgaccgtgga aggccctgca ggtgaccgtg gctgcagagc gggcacccag gaaggtggag gctgctggga cagcagaacc gaagttcaac ggagcagtac gctgaacggc gaaaaccatc tagcagagat ccccagcgac caccccccct caagagcaga caatcactac
<210> 70 <211> 451 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 70
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Asp Lys Ser
His Glu Ala 435
Pro Gly Lys 450
Leu Pro
Arg Glu
Lys Asn 365 Asp Ile 380
Lys Thr
Ser Lys
Ser Cys
Ser Leu 445
Val Ser His 270
Val Glu Val
Ser Thr Tyr
Leu Asn Gly 320
Ala Pro Ile
335 Pro Gin Val 350
Gin Val Ser
Ala Val Glu
Thr Pro Pro 400
Leu Thr Val
415 Ser Val Met 430
Ser Leu Ser
<210> 71 <211> 654 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 71
gacatcgtga
atcaactgca
cagcagaagc
ggcgtgccag
agcctgcagg
acctttggcg
atcttccccc
aacaacttct
ggcaacagcc
agcaccctga
acccaccagg
tgactcagag gggccagcaa ccggccagcc acaggttcag ccgaggacgt gcggcaccaa ccagcgatga acccccggga aggagagcgt ccctgagcaa gcctgtccag ccccgatagc gagcgtgagc ccccaaggtg cggatctggc cgccgtgtac ggtggagatc gcagctgaag ggccaaggtg gaccgagcag ggccgactac ccccgtgacc ctggccgtga gctgccggct ctgatctact agcggcaccg tactgcctgc aagcgtacgg agcggcaccg cagtggaagg gacagcaagg gagaagcaca aagagcttca gcctgggcga acaacttcat acgcctccaa acttcaccct acagcaggga tggccgcccc ccagcgtggt tggacaatgc actccaccta aggtgtacgc accggggcga aagggccacc 60 gcactggtac 120 cctggagagc 180 gaccatctca 240 gttccccttc 300 cagcgtgttc 360 gtgtctgctg 420 cctgcagagc 480 cagcctgagc 540 ctgtgaggtg 600 gtgc 654
<210> 72 <211> 218 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 72
Asp Ile Val 1
Glu Arg Ala
Gly Tyr Asn 35
Lys Val Leu 50
Arg Phe Ser 65
Ser Leu Gin
Glu Phe Pro
Thr Val Ala 115
Leu Lys Ser
130 Pro Arg Glu 145
Gly Asn Ser
Tyr Ser Leu
His Lys Val 195
Val Thr Lys 210
Met Thr 5
Thr Ile 20
Phe Met
Ile Tyr
Gly Ser
Ala Glu
85 Phe Thr 100
Ala Pro
Gly Thr
Ala Lys
Gin Glu 165 Ser Ser 180
Tyr Ala Ser Phe
Tyr Ala
55 Gly Ser 70
Asp Val
Phe Gly
Ser Val
Ala Ser 135 Val Gin 150
Ser Val
Thr Leu
Cys Glu
Asn Arg 215
Arg Ala
25 Tyr Gin 40
Ser Asn
Gly Thr
Ala Val
Gly Gly 105 Phe Ile 120
Val Val
Trp Lys
Thr Glu
Thr Leu 185 Val Thr 200
Gly Glu
Ser Leu 10
Ser Lys
Gin Lys
Leu Glu
Asp Phe
75 Tyr Tyr 90
Thr Lys
Phe Pro
Cys Leu
Val Asp 155 Gin Asp 170
Ser Lys His Gin Cys
Ala Val
Ser Val
Pro Gly 45
Ser Gly 60
Thr Leu
Cys Leu
Val Glu
Pro Ser 125 Leu Asn 140
Asn Ala
Ser Lys
Ala Asp
Gly Leu 205
Ser Leu Gly 15
Ser Ala Ala 30
Gin Pro Pro
Val Pro Asp
Thr Ile Ser 80
His Ser Arg 95
Ile Lys Arg 110
Asp Glu Gin
Asn Phe Tyr
Leu Gin Ser 160
Asp Ser Thr
175 Tyr Glu Lys 190
Ser Ser Pro
<210> 73 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 73
gaggtgcagc
tcttgcgccg
ggcaagggcc
gacaacgtga
cagatgaaca
cacaccacct
tggtggaaag ctagcggctt tggagtgggt ggggcaggtt gcctgagggc tctggtactt cggcggcggc caccttcagc ggccaccatc caccatcagc cgaggatacc cgacgtctgg ctggtccagc tacgccatga agcgacggcg agggacaacg gccgtgtact ggcaggggca ceggegggag gctgggtgag gcagcttcac ccaagaacag actgcgccag cactagtgac cctgagactc 60 gcaggccccc 120 ctactatctg 180 cctgtacctg 240 ggaegtegge 300 cgtgtccagc 360
<210> 74 <211> 121 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 74
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser
Leu
Arg
Leu 20
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Gly
Phe
Thr
Phe
Ser 30
Ser
Tyr
Ala
Met
Ser 35
Trp
Val
Arg
Gin
Ala 40
Pro
Gly
Lys
Gly
Leu 45
Glu
Trp
Val
Ala
Thr 50
Ile
Ser
Asp
Gly
Gly 55
Ser
Phe
Thr
Tyr
Tyr 60
Leu
Asp
Asn
Val
Arg
Gly
Arg
Phe
Thr
Ile
Ser
Arg
Asp
Asn
Ala
Lys
Asn
Ser
Leu
Tyr
Leu
Gin
Met
Asn
Ser 85
Leu
Arg
Ala
Glu
Asp 90
Thr
Ala
Val
Tyr
Tyr 95
Cys
Ala
Arg
Asp
Val 100
Gly
His
Thr
Thr
Phe 105
Trp
Tyr
Phe
Asp
Val 110
Trp
Gly
Arg
Gly
Thr 115
Leu
Val
Thr
Val
Ser 120
Ser
<210> 75 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 75
gaggtgcagc
tcttgcgccg
cccggcaagg
ctggacaacg
ctgcagatga
ggccacacca
agcgccagca
ggcggcacag
tcctggaaca
agcggcctgt
acctacatct
cccaagagct
ggccccagcg
cccgaggtga
tggtacgtgg
aacagcacct
aaggagtaca
agcaaggcca
gagctgacca
atcgccgtgg
gtgctggaca
tggcagcagg
acccagaaga
tggtggaaag ctagcggctt gcctggagtg tgaggggcag acagcctgag ccttctggta ccaagggccc ccgccctggg gcggagccct acagcctgag gtaacgtgaa gtgacaagac tgttcctgtt cctgtgtggt acggcgtgga accgggtggt agtgtaaggt agggccagcc agaaccaggt agtgggagag gcgatggcag gcaacgtgtt gcctgagcct cggcggcggc caccttcagc ggtggccacc gttcaccatc ggccgaggat cttcgacgtc cagcgtgttc ctgcctggtg gaccagcggc cagcgtggtg ccacaagccc ccacacctgc cccccccaag ggtggatgtg ggtgcacaat gtccgtgctg gtccaacaag cagagagccc gtccctgacc caacggccag cttcttcctg cagctgctcc gtcccctggc ctggtccagc agctacgcca atcagcgacg agcagggaca accgccgtgt tggggcaggg cccctggccc aaggactact gtgcacacct accgtgccca agcaacacca cccccctgcc cctaaggaca agccacgagg gccaagacca accgtgctgc gccctgcctg caggtgtaca tgcctggtga cccgagaaca tacagcaagc gtgatgcacg aag ceggegggag tgagctgggt geggcagett acgccaagaa actactgcgc gcacactagt ccagcagcaa tccccgaacc tccccgccgt gcagcagcct aggtggacaa ctgcccccga ccctgatgat accctgaggt ageccaggga accaggattg cccctatcga ccctgccccc agggcttcta actacaagac tgaccgtgga aggccctgca cctgagactc gaggcaggee cacctactat cagcctgtac cagggaegtc gaccgtgtcc gagcaccagc ggtgaccgtg getgeagage gggcacccag gaaggtggag gctgctggga cagcagaacc gaagttcaac ggagcagtac getgaaegge gaaaaccatc tagcagagat ccccagcgac caccccccct caagagcaga caatcactac
<210> 76 <211> 451 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 76
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
250
255
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
Pro Gly 450
<210> 77 <211> 5 <212> ПРТ
<213> Homo sapiens <400> 77
Ser Туг Ala Met Ser 1 5
<210> 78 <211> 7 <212> ПРТ
<213> Homo sapiens <400> 78
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5
<210> 79 <211> 450 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 79
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Ser Pro Asn Ser Asn Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
<210> 80 <211> 213 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 80
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Glu
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 81 <211> 120 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 81
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Ser Pro Asn Ser Asn Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 82 <211> 106 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile Glu
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 83 <211> 759 <212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 83
atgggggtac
agcatggcga
cagctccaga
cgtatccaag
ttccccagtg
gccacactgg
caggatttgg
ccgaacatcc
gacacggctg
gcctcggatg
ttcatgcact
agacacagcc
ggcaagagac tgctcacaca gcatggcggc agcagacaga gcctggatgt aggagaccct gctgcgtcct agaggtctgg tcgggctcag agcccacgaa cttttcagcg cagtggggcg cccaccaggc tcatgaccag gaggacgctg tataggcagc tctcatgcag tcctaaactg gagggggctg gcacagactg gctgaacatc gaacaacatc ggctggccgg caagctggag ggtcttcagc cctgaggaag gggacagctg ctcagtctgg tgctcgaaag gacaccagca agagagcact ggcaggcggg gccgacttag gaggacttgg tactgcatgg ggggcctctc ggctgcaggt aagtgggggg ggggtgcgca ccccggtag tccttgcact agtaccgcgt gactcctgga gcagggagcg gcttcctgca agcagcgcct agaagctgca cccagctgct agccgcccac tcctgcatgg agagcccgaa ggaccagacc cctgtttcca gctccttggc cccctatata ccccggggcc gaccctcaat ccccaaggcc gatggcgagg ggacaactca ccccacccct ctaccatcgc ccggagccgg ctccaggaaa
<210> 84 <211> 252 <212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 84
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
15 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser
20 25 30
Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gin Leu Gin Lys Gin Thr Asp Leu
35 40 45
Met Gin Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gin Gly
50 55 60
Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala
65 70 75 80
Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu
85 90 95
Gin Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp
100 105 110
Leu Glu Gin Arg Leu Pro Lys Ala Gin Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu
115 120 125
Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gin Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu
130 135 140
Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met Ala Gin Leu Leu Asp Asn Ser
145 150 155 160
Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly Arg Gly Ala Ser Gin Pro Pro
165 170 175
Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gin Arg Lys Leu Glu Gly Cys
180 185 190
Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe Met His Ser Val Gly Arg Val
195 200 205
Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn Arg Ser Arg Arg His Ser Pro
210 215 220
His Gin Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys
225 230 235 240
Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gin Leu Pro Arg 245 250
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с hOSM (онкостатин М человека) и ингибирующий связывание hOSM с рецептором gp130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II hOSM, который содержит CDRH3 с последовательностью SEQ ID NO: 3, CDRH2 с последовательностью SEQ ID NO: 2, CDRH1 с последовательностью SEQ ID NO: 77, CDRL1 с последовательностью SEQ ID NO: 4, CDRL2 с последовательностью SEQ ID NO: 5 и CDRL3 с последовательностью SEQ ID NO: 6.
2. Антигенсвязывающий белок по п.1, в котором каркасная область тяжелой цепи содержит следующие остатки:
Val, Ile или Gly в положении 2; Leu или Val в положении 4; Leu, Ile, Met или Val в положении 20; Cys в положении 22;
Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24;
Gly в положении 26;
Ile, Phe, Leu или Ser в положении 29;
Trp в положении 36;
Trp в положении 47;
Ile, Met, Val или Leu в положении 48;
Ile, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala, Leu, Val, Tyr или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Tyr или Phe в положении 90; Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
3. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1, 2, содержащий вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 74 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью
SEQ ID NO: 72.
4. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-3, представляющий собой гуманизированное антитело.
5. Антигенсвязывающий белок по п.4, представляющий собой IgG1.
6. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-5, дополнительно связывающийся с OSM примата, не являющегося человеком.
7. Антигенсвязывающий белок по любому из пп.1-6, связывающийся с OSM с аффинностью менее
40 пМ.
8. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительного расстройства или заболевания, выбранного из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза, содержащая ан-тигенсвязывающий белок по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.
9. Применение антигенсвязывающего белка по любому из пп.1-7 в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным из воспалительной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза.
10. Применение композиции по п.8 в изготовлении лекарственного средства для лечения пациента-
человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным из воспалитель-
ной артропатии, ревматоидного артрита, остеоартрита, идиопатического фиброза легких (IPF), системно-
го склероза, синдрома Шегрена, склеродермии и/или псориаза.
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл) Фиг. 6
EVOLVE
ТТТ
L V
Е V С2 Е V Q Е [FTJ Q
-иг
е & ? L
G G [IT] L G G G L G [FT] G L
V Е Р G
1Г-
L S
с пг-
СААЗ
7Г-Т
3 s
Е Т F 5 БОЛЬШИНСТВО
t з 2B7 VH белок
F з 3E3 VH белок
f 5 9G2 VH белок
F з 1QG8 VH белок
31 31 31 31
Большинство
2B7 VH белок ЗЕЗ VH бедок 9G2 VH белок 10G8 VH белок
61 61 61 61
T D~"
ТГТПТТГ
N I I I Q
L D N V ГКП G D N V R G
К f T
R F T
R F T I S R D
R F T I ,3 R D
i L 0 M 3 H L
L Q M [FTJ H L
NAKNNLYLQ NAKNNLYLQ
ТТЛ"
з |_EJ D
3 D D S D D
2B7 VH белок
ЗЕЗ VH белок 9G2 VH белок 10G8 VH белок
TAMYYCAR
DVGLTTFWYFDV
WGTGTTVTVS
10*0
Т A M V V С A ft
|AG|MYYCAR TAMYYCAR TAMYYCAR
ь J a L 'i' 'r t1 u v F ь J
DVGLTTFWYFDV D V G ГТГ1 TTFWYFDV DVG H TT FWY F DV
"{'18 '1' '1' V 'Г V j
WGTGTTVTVS WGTGTTVTVS W G Г5-! G T [7Г] V T V S
2B7VH белок ЗЕЗ VH белок 9G2 VH белок 10G8VH белок
Большинство
121 ^
121 S 121 S 121 S
Обозначение "Обозначение последовательности
": остатки в рамках, отличающиеся от консенсуснои
2В7 VH белок ЗЕЗ VH белок 9G2 VH белок 10G8VH белок
Фиг. 7
Концентрация антитела (мкг/мл) Фиг. 12
0,001 0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 13
0,001 0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл) Фиг. 15
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл) Фиг. 16
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 25
Концентрация mAb (нМ) Концентрация mAb (нМ)
Фиг. 27
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027256
027256
- 1 -
- 1 -
(19)
027256
027256
- 1 -
- 1 -
(19)
027256
027256
- 1 -
- 1 -
(19)
027256
027256
- 4 -
- 3 -
027256
Таблица 4
027256
- 33 -
- 32 -
027256
027256
- 35 -
- 35 -
027256
Таблица 10
027256
- 37 -
- 36 -
027256
027256
- 39 -
- 39 -
027256
Таблица 13
027256
Таблица 13
- 40 -
- 40 -
027256
Таблица 14
027256
Таблица 14
- 41 -
- 41 -
027256
Таблица 15
027256
Таблица 15
- 42 -
- 42 -
027256
Таблица 17
027256
Таблица 17
- 43 -
- 43 -
027256
Таблица 18
027256
Таблица 18
- 44 -
- 44 -
027256
027256
Таблица А
- 45 -
- 46 -
027256
027256
Таблица А
- 45 -
- 46 -
027256
027256
- 48 -
- 48 -
027256
027256
- 50 -
- 50 -
027256
027256
- 53 -
- 53 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 92 -
- 92 -
027256
027256
- 93 -
- 93 -
027256
- 97 -
- 98 -
027256
- 97 -
- 98 -
027256
- 99 -
- 98 -
027256
- 99 -
- 98 -
027256
- 99 -
- 98 -
027256
027256
- 100 -
- 100 -
027256
027256
- 101 -
- 101 -
027256
027256
- 102 -
- 102 -
027256
027256
- 105 -
- 105 -
027256
027256
- 105 -
- 105 -
027256
027256
- 107 -
- 107 -