|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Клетка-хозяин для рекомбинантной экспрессии белка интерферона млекопитающего, причем упомянутая клетка содержит: (a) функциональный эндогенный trxB ген, (b) инактивированный эндогенный gor ген, (c) полинуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный белок интерферон, (d) ген полимеразы Т7 РНК. 2. Клетка-хозяин по п.1, отличающаяся тем, что упомянутая полинуклеотидная последовательность включена в экспрессирующий вектор. 3. Клетка-хозяин по п.1 или 2, отличающаяся тем, что упомянутый интерферон выбирают из группы, состоящей из интерферона- α, интерферона- β и интерферона- γ или их активного фрагмента. 4. Клетка-хозяин по п.3, отличающаяся тем, что упомянутый белок интерферон является человеческим белком интерфероном или его биологически активным фрагментом. 5. Клетка-хозяин по п.4, отличающаяся тем, что упомянутый белок интерферон является человеческим интерфероном α2а или его биологически активным фрагментом. 6. Клетка-хозяин по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что упомянутая клетка-хозяин является бактериальной клеткой. 7. Клетка-хозяин по п.6, отличающаяся тем, что упомянутая бактериальная клетка является клеткой Escherichia coli. 8. Клетка-хозяин по п.7, отличающаяся тем, что упомянутая клетка Escherichia coli получена из штамма BL21 Escherichia coli. 9. Клетка-хозяин по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что упомянутый ген полимеразы Т7 РНК вставлен в геном клетки-хозяина. 10. Способ рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона в клетке-хозяине, включающий: (a) предоставление клетки-хозяина по любому из пп.2-10; (b) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые позволяют экспрессировать белок интерферон, (c) получение растворимого белка интерферона из клетки-хозяина. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что этап (с) включает разрушение клеток. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что этап (с), кроме того, включает очистку белка хроматографией. 13. Использование клетки-хозяина по любому из пп.1-9 для рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Клетка-хозяин для рекомбинантной экспрессии белка интерферона млекопитающего, причем упомянутая клетка содержит: (a) функциональный эндогенный trxB ген, (b) инактивированный эндогенный gor ген, (c) полинуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный белок интерферон, (d) ген полимеразы Т7 РНК. 2. Клетка-хозяин по п.1, отличающаяся тем, что упомянутая полинуклеотидная последовательность включена в экспрессирующий вектор. 3. Клетка-хозяин по п.1 или 2, отличающаяся тем, что упомянутый интерферон выбирают из группы, состоящей из интерферона- α, интерферона- β и интерферона- γ или их активного фрагмента. 4. Клетка-хозяин по п.3, отличающаяся тем, что упомянутый белок интерферон является человеческим белком интерфероном или его биологически активным фрагментом. 5. Клетка-хозяин по п.4, отличающаяся тем, что упомянутый белок интерферон является человеческим интерфероном α2а или его биологически активным фрагментом. 6. Клетка-хозяин по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что упомянутая клетка-хозяин является бактериальной клеткой. 7. Клетка-хозяин по п.6, отличающаяся тем, что упомянутая бактериальная клетка является клеткой Escherichia coli. 8. Клетка-хозяин по п.7, отличающаяся тем, что упомянутая клетка Escherichia coli получена из штамма BL21 Escherichia coli. 9. Клетка-хозяин по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что упомянутый ген полимеразы Т7 РНК вставлен в геном клетки-хозяина. 10. Способ рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона в клетке-хозяине, включающий: (a) предоставление клетки-хозяина по любому из пп.2-10; (b) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые позволяют экспрессировать белок интерферон, (c) получение растворимого белка интерферона из клетки-хозяина. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что этап (с) включает разрушение клеток. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что этап (с), кроме того, включает очистку белка хроматографией. 13. Использование клетки-хозяина по любому из пп.1-9 для рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона.
Евразийское 027218 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.07.31
(21) Номер заявки 201391666
(22) Дата подачи заявки 2012.05.21
(51) Int. Cl.
C12N1/21 (2006.01) C07K14/555 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12N 9/00 (2006.01)
(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ РАСТВОРИМОГО ИНТЕРФЕРОНА
(31) 11167761.3
(32) 2011.05.26
(33) EP
(43) 2014.03.31
(86) PCT/EP2012/059373
(87) WO 2012/160027 2012.11.29
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
РИХТЕР-ХЕЛЬМ БИОТЕК ГМБХ УНД КО. КГ (DE)
(72) Изобретатель:
Шиллинг Ральф, Дидерих Беттина
(DE)
(74) Представитель:
Попова А.О. (RU) (56) BECKER-HAPAK M. ET AL.: "Role of rpoS in the regulation of glutathione oxidoreductase (gor) in Escherichia coli", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 134, no. 1, 1 December 1995 (1995-12-01), pages 39-44, XP055009670, ISSN: 0378-1097, DOI: 10.1016/0378-1097 (95) 00378-I. Whole document, especially table 1
SMIRNOVA G.V. ET AL.: "Effects of Cystine and Hydrogen Peroxide on Glutathione Status and Expression of Antioxidant Genes in
Escherichia coli", BIOCHEMISTRY (MOSCOW),
KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-PLENUM PUBLISHERS, NE, vol. 70, no. 8, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 926-934, XP019294660, ISSN: 1608-3040. Whole document, especially table 1
EP-A1-2000480 US-A1-2006246541
HATAHET FERAS ET AL.: "Disruption of
reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli",
MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. 9, 67, 13
September 2010 (2010-09-13), XP002679010, ISSN: 1475-2859 abstract
BESSETTE P.H. ET AL.: "Efficient folding
of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, US, vol.
96, no. 24, 23 November 1999 (1999-11-23), pages 13703-13708, XP002233564, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/PNAS.96.24.13703 abstract
(57) Настоящее изобретение относится в общем к области рекомбинантной экспрессии генов в клетках-хозяевах. В частности, изобретение относится к клетке-хозяину для рекомбинантной экспрессии белка интерферона млекопитающего, причем упомянутая клетка включает: (а) функциональный эндогенный trxB ген и (b) инактивированный эндогенный gor ген. Изобретение, кроме того, относится к использованию таких клеток-хозяев для рекомбинантной экспрессии белка интерферона. Изобретение также предлагает способ рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона в клетке-хозяине.
Настоящее изобретение относится в общем к области рекомбинантной экспрессии генов в клетках-хозяевах. В частности, изобретение относится к клетке-хозяину для рекомбинантной экспрессии белка интерферона млекопитающего, причем упомянутая клетка включает: (а) функциональный эндогенный trxB ген и (b) инактивированный эндогенный gor ген. Изобретение, кроме того, относится к использованию таких клеток-хозяев для рекомбинантной экспрессии белка интерферона. Изобретение также предлагает способ для рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона в клетке-хозяине.
Предпосылки для создания изобретения
Интерфероны - это группа гликопротеинов, которые секретируются клетками млекопитающих в ответ на различные раздражители, например вирусную или бактериальную инфекцию. Интерфероны обладают разными терапевтически полезными характеристиками, такими как иммуностимулирующая, анти-пролиферативная и противовирусная активность. Соответственно, эти белки широко применяются для лечения ряда заболеваний и нарушений, включая вирусные инфекции и некоторые виды рака, такие как множественная миелома, лейкемия, рак почки и т.д. На основе их клеточного происхождения и антиген-ности человеческие интерфероны делят на три группы. У людей а-интерфероны продуцируются лейкоцитами, р-интерфероны продуцируются фибробластами, и у-интерфероны продуцируются В-клетками.
Первоначально интерфероны были получены путем очистки белков из природных источников, например из лейкоцитов и фибробластов крови. Появление технологии рекомбинантных ДНК дало возможность продуцировать интерфероны в промышленном масштабе, например, путем рекомбинантной экспрессии белков интерферонов в клетках-хозяевах бактерий. Escherichia coli является одним из наиболее часто используемых бактериальных организмов-хозяев для рекомбинантной экспрессии гетерологич-ных белков из-за способности быстро расти до высоких плотностей клеток, наличия огромного числа клонирующих векторов и легкости введения таких векторов в клетки для последующей экспрессии. Большинство интерферонов, которые доступны сегодня для использования в медицине человека, продуцированы в системах экспрессии Е. coli. С другой стороны, экспрессия гетерологичных белков в Е. coli, как известно, связана с определенными ограничениями, которые создают проблемы для продуцирования больших количеств фармацевтически активных белков. Проблемой, часто встречающейся в системах экспрессии Е. coli, является неспособность клетки-хозяина продуцировать значительные количества ре-комбинантных белков в растворимой и активной форме. Вместо этого большинство белка хранится в форме телец включений, т.е. в агрегатах денатурированных белков. Основная причина неспособности создавать растворимые рекомбинантные белки заключается в том, что цитоплазма Е. coli является восстановительной средой, которая препятствует формированию дисульфидных связей. Для выделения активного белка из телец включения требуется повторная укладка белков с использованием восстанавливающих агентов, таких как дитиотреитол и р-меркаптоэтанол, или денатурирующих агентов, таких как гуанидин-HCl и мочевина, которая часто недостаточная и связана с неприемлемыми потерями продукта.
Для преодоления этих недостатков разработаны клетки-хозяева, в которых определенные гены ре-дуктазы инактивированы, чтобы создать более окислительную среду, которая делает возможным формирование дисульфидных связей. Эти модифицированные клетки-хозяева имеют мутации в генах, кодирующих тиоредоксин редуктазу (trxB) и глутатион оксидоредуктазу (gor). Посредством этих мутаций становится возможным формирование дисульфидных связей в цитоплазме, и выход растворимого продукта увеличивается. Клетки-хозяева, испытывающие дефицит в trxB и gor генах, доступны, например, под фирменными наименованиями Origami(tm) (Novagen) или SHuffle(tm) (NEB). Доказано, что клетки trxB-/gor- Origami(tm) В (DE3) (именуемые ниже Origami (DE3); Novagen) можно успешно использовать для экспрессии рекомбинантного интерферона a2b, что описано в опубликованной заявке США № 2009/0258394.
Несмотря на эти усовершенствования, все же существует потребность в более эффективных системах экспрессии, которые могут быть использованы для надежного продуцирования белков интерферо-нов, в частности белков интерферонов человека. Новые системы экспрессии должны давать возможность продуцировать большие количества растворимых белков интерферонов, в то же время минимизируя долю денатурированного белка. В идеале, системы экспрессии не должны представлять трудностей в работе и позволять продуцировать цитокины, такие как интерфероны, по низкой себестоимости.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение предлагает новые клетки-хозяева, которые, в частности, подходят для ре-комбинантной экспрессии белков интерферонов млекопитающих. Установлено, что усовершенствованные клетки-хозяева для экспрессии белков интерферонов могут быть созданы путем инактивации эндогенного gor гена клетки-хозяина с одновременным сохранением функционального эндогенного trxB гена. Сохранение функционального эндогенного trxB гена в клетке-хозяине неожиданно привело к значительному увеличению выхода рекомбинантных белков интерферонов. Можно предположить, что продукт trxB ген участвует в разных регуляторных путях, которые оказывают влияние на выход продукта экспрессии.
Путем использования новых клеток-хозяев для рекомбинантного получения интерферона можно получать большие количества растворимых белков без значительного формирования телец включения.
Как показано в нижеприведенных примерах, клетки-хозяева изобретения продуцируют значительно большие количества растворимого интерферона, чем соответствующие клетки, имеющие мутации в gor и trxB генах.
Таким образом, новые клетки-хозяева составляют значительное усовершенствование известного уровня техники, поскольку они упрощают получение белков интерферонов и в то же время снижают производственные издержки.
В первом аспекте настоящее изобретение, таким образом, относится к клетке-хозяину, которая подходит для рекомбинантной экспрессии белка интерферона, причем эта клетка-хозяин включает: (а) функциональный эндогенный trxB ген и (b) инактивированный эндогенный gor ген. Рекомбинантная экспрессия означает, что экспрессия желательного белка осуществляется нуклеиновой кислотой, полученной способом генной инженерии. Предпочтительно клетку-хозяина, которая снабжена экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотидную последовательность, которая кодирует белок интерферона, культивируют в условиях, подходящих для экспрессии интерферона.
Изобретение, кроме того, относится к использованию таких клеток-хозяев для рекомбинантной экспрессии белка интерферона.
Согласно изобретению может быть использована любая клетка, которая известна в данной области как подходящая в качестве хозяина для экспрессии гетерологичных белков и которая была модифицирована путем инактивации эндогенного gor гена. Клетка может быть эукаритического или прокариотиче-ского происхождения. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является клеткой млекопитающего, например зародышевой клеткой или клеточной линией, полученной от мыши, крысы, хомяка, собаки или примата, кроме человека. Клетки млекопитающих, которые оказались подходящими для гетероло-гичной экспрессии белков, включают как зародышевые клетки (например, клетки костного мозга мышей, гемопоэтические стволовые клетки, мышиные лимфоциты, мышечные клетки, гепатоциты и т.д.), так и развитые клеточные линии (например, клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки почки обезьяны (COS), клетки почки детеныша хомяка (BHK), клетки почки зеленой африканской обезьяны (Vero), клетки Мадин Дарби почки собак (MDCK) и т.д.).
В еще одном варианте осуществления клеткой-хозяином изобретения является клетка дрожжей. Например, клетки дрожжей, которые получены из видов Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis и Pichia pastoris, оказались подходящими для экспрессии белков интерферонов (Скоко и др. (Skoko et al.) (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38 (Pt3): 257-65). В еще одном варианте осуществления клетка-хозяин изобретения также может быть получена из клеток насекомых, таких как клетки насекомых видов Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Spodoptera frugiperda или Trichoplusia ni.
В настоящем изобретении особо предпочтительно использование бактериальных клеток-хозяев ввиду легкости обращения с ними и быстрого роста. Бактериальные клетки от многих видов используются в данной области техники для экспрессии гетерологичных белков. Обычно используемые клетки-хозяева включают штаммы Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum и Bacillus subtilis. В одном предпочтительном варианте осуществления бактериальной клеткой-хозяином является клетка Е. coli, такая как клетка, полученная из штамма BL21 Е. coli.
Согласно изобретению клетка-хозяин, рассматриваемая здесь для экспрессии белков интерферонов, прошла генетическую манипуляцию для инактивации эндогенного gor гена, т.е. гена, кодирующего глу-татион оксидоредуктазу, родную для клетки-хозяина. Ген, кодирующий глутатион оксидоредуктазу, описан в литературе в нескольких разных организмах. В качестве примера нуклеотидная последовательность гена gor штамма K12 Е. coli представлена здесь как SEQ ID NO: 5. На основе нуклеотидной последовательности gor гена специалист легко сможет инактивировать этот ген стандартными генетическими способами, такими как сайт-направленный мутагенез. Инактивация gor гена будет такой, чтобы в клетке-хозяине не было или, по существу, не было экспрессии биологически активного фермента глутатион ок-сидоредуктазы. Для этой цели настоящего изобретения gor ген будет считаться инактивированным, если генетическая манипуляция уменьшала количество функционального фермента глутатион оксидоредукта-зы по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95% или больше по сравнению с немодифицированной клеткой-хозяином.
Инактивация может быть выполнена путем делеции части или всей кодирующей последовательности gor гена в клетке-хозяине. Альтернативно, также можно ввести замену одного нуклеотида в кодирующую последовательность гена при условии, что эта замена происходит в триплете, который кодирует существенный остаток фермента оксиредуктазы. Также можно вставить один или несколько нуклеотидов в участок кодирования, чтобы изменить рамку считывания gor гена. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения gor ген инактивирован путем вставки и эксцизии еще одного поли-нуклеотида, например гена, придающего устойчивость к антибиотику, который может быть использован для выбора. Способы, которые могут быть использованы для инактивации генов в клетках бактерий, млекопитающих и дрожжей, хорошо известны специалисту в данной области. Например, в литературе описаны многие способы инактивации бактериального гена. Помимо этого, наборы для сайт-направленного мутагенеза имеются в продаже, например набор для мутагенеза Quick-Change компании
Stratagene, набор для мутагенеза Transformer компании Clontech, система мутагенеза GenTaylor компании Invitrogen, набор для мутагенеза in vitro Altered Sites II компании Promega и набор для рекомбинации Red/ET компании Gene Bridges.
Авторы изобретения выяснили, что инактивация эндогенного gor гена клетки-хозяина предпочтительна для получения больших количеств рекомбинантно экспрессированных растворимых интерферо-нов. Что удивительно, клетки-хозяева, в которых инактивирован только эндогенный gor ген, продуцируют значительно большие количества белков интерферонов по сравнению с соответствующими клетками, имеющими генотип trxB-/gor- (см. пример 6 ниже). Поэтому клетки-хозяева, предполагаемые в настоящем изобретении, включают функциональный эндогенный trxB ген, т.е. trxB ген, который родной для клетки-хозяина и дает ферментативно активную тиоредоксин редуктазу. В результате, клетка-хозяин изобретения способна продуцировать родной функциональный фермент тиоредоксин редуктазу.
Следует сказать, что штаммы с двойным выключением (knock-out) trxB-/gor- жизнеспособны только в случае, если они также имеют мутацию в гене, кодирующем алкилгидропероксид редуктазу (ahpC*). См. Faulkner et al. (2008), PNAS, 105(18):6735-40. Как описанный здесь штамм RHB-T7Agor/trx, так и штамм Origami (DE3), таким образом, содержали мутацию супрессора ahpC*. Напротив, штаммы, содержащие только инактивирующую gor мутацию, жизнеспособны без мутации ahpC*, поскольку инактивация gor гена как таковая не имеет летального эффекта. Таким образом, штамм RHB-T7Agor, подготовленный в примере 2 ниже, не содержал ahpC* мутацию супрессора.
Соответственно, здесь предпочтительно, чтобы клетки-хозяева, предполагаемые настоящим изобретением, включали эндогенный, немодифицированный, функциональный ahpC ген, т.е. ahpC ген, который нативный для клетки-хозяина, не содержит мутации супрессора и способен продуцировать фермен-тативно активную алкилгидропероксид редуктазу.
Для повышения уровня экспрессии экспрессируемого белка интерферона клетка-хозяин изобретения может включать РНК-полимеразу из бактериофага, такую как Т7 РНК-полимераза. Т7 РНК-полимераза обеспечивает сильную и контролируемую экспрессию полинуклеотидной последовательности, которая содержится в экспрессирующем векторе и которой предшествует Т7 промотор. Ген Т7 РНК-полимеразы может быть помещен в клетку-хозяин в форме экспрессирующего вектора. Экспрессирую-щий вектор, который содержит ген Т7 РНК-полимеразы, может быть идентичен вектору или отличен от вектора, который включает последовательность интерферона для экспрессии. Предпочтительно, однако, чтобы последовательность, содержащая ген Т7 РНК-полимеразы, была вставлена в геном клетки-хозяина, например в бактериальную хромосому. Например, ген Т7 РНК-полимеразы может быть вставлен в геном клетки-хозяина Е. coli, и полинуклеотид, кодирующий белок интерферон, такой как IFN-a2a, экспрессируется из экспрессирующего вектора, который позволяет экспрессию в клетки Е. coli. Соответствующая генная кассета, которая включает ген Т7 РНК-полимеразы, может быть введена в геном бактериальной клетки-хозяина, например, путем гомологичной рекомбинации, как сказано в примерах, приведенных ниже. Помимо этого, клетки-хозяева Е. coli, которые включают ген Т7 РНК-полимеразы, также имеются в продаже, например, от компании New England Biolabs (Франкфурт, Германия), см., например, NEB Cat# C2566, С3016, С3010, С3013 и векторы серии SHUffle, такие как С3026, С3027, С3029 и С3030. Предпочтительно ген Т7 РНК-полимеразы используют в сочетании с полинуклеотидом интерферона, который был кодон-оптимизирован для экспрессии в прокариотическом микроорганизме, таком как клетка Е. coli.
Клетка-хозяин, прошедшая манипуляцию, которая описана выше, затем будет снабжена полинук-леотидной последовательностью, кодирующей экзогенный белок интерферон, предпочтительно ген человеческого интерферона. Термин "экзогенный" относится к тому факту, что клетка-хозяин, которая выбрана для экспрессии интерферона, в природе не содержит полинуклеотида, который кодирует интерферон. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяин, например, путем трансформации или транс-фекции. Предпочтительно, чтобы полинуклеотидная последовательность, кодирующая экс-прессируемый белок интерферон, была включена в экспрессирующий вектор. Выбор экспрессирующего вектора в основном будет зависеть от характера клетки-хозяина.
Например, если клетка-хозяин является клеткой млекопитающего, такой как клетка СНО или Vero, экспрессирующим вектором может быть, например, вирусный или невирусный экспрессирующий вектор, подходящий для введения кодирующего интерферон полинуклеотида в клетку для последующей экспрессии белка интерферона, кодируемого этим полинуклеотидом. Экспрессирующим вектором может быть эписомальный вектор, т.е. вектор, который способен автономно самореплицироваться в клетке-хозяине, или интегрирующийся вектор, т.е. вектор, который стабильно внедряется в геном клетки млекопитающего.
Экспрессирующий вектор млекопитающего обычно будет содержать промотор, который функционально связан с полинуклеотидом, кодирующим интерферон. Подходящие промоторы включают, но без ограничения, предранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE), U3 промотор вируса некроза селезенки (SFFV) и аденовирусный основной поздний промотор (Ad MLP). В качестве дополнительного компонента экспрессирующий вектор млекопитающего может включать подходящий энхансер для повышения
уровня экспрессии. Примеры включают SV40 ранний энхансер генов (Дийкема и др. (Dijkema et al.) (1985) EMBO J. 4: 761) и энхансер длинного терминального повторения (LTR) вируса саркомы Рауса (Горман и др. (Gorman et al.) (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777). Экспрессирующий вектор также по выбору включает последовательности, терминирующие транскрипцию, и последовательности полиаде-нилирования для улучшения экспрессии белка интерферона. Подходящие сигналы терминатора транскрипции и полиаденилирования могут быть взяты, например, из SV40 (Сэмбрук и др. (Sambrook et al.) (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Любой другой элемент, который известен в данной области как поддерживающий эффективную экспрессию, может быть добавлен к экспрессирующему вектору, например, посттранскрипционный регуляторный элемент гепатита сурка (wPRE).
В особо предпочтительном аспекте экспрессирующим вектором является вирусный экспрессирую-щий вектор. Вирусные векторы, подходящие для использования в настоящем изобретении, обычно включают вирусный геном, в котором часть нативной последовательности удалена, чтобы ввести гетерогенный полинуклеотид без разрушения инфективности вируса. Из-за специфического взаимодействия между компонентами вируса и рецепторами клетки-хозяина вирусные векторы очень подходят для эффективного переноса генов в клетки-мишени. Подходящие вирусные векторы для облегчения переноса генов в клетку млекопитающего хорошо известны в данной области и могут быть получены из разных типов вируса, например из ретровируса, аденовируса и аденоассоциированного вируса (AAV), ортомик-совируса, парамиксовируса, паповавируса, пикорнавируса или альфавируса. Обзор разных вирусных векторных систем см. у Ниенхуса и др. (Nienhuis et al.), Hematology, Vol. 16: Viruses and Bone Marrow, N.S. Young (ed.), 353-414 (1993).
С другой стороны, если клеткой-хозяином является бактериальная клетка, такая как клетка Е. coli, экспрессирующий вектор будет адаптирован к экспрессии белка в среде прокариотической клетки. Большое число экспрессирующих векторов описано для Е. coli и других бактериальных клеток-хозяев. Примеры векторов, подходящих для экспрессии белка в клетках Е. coli, включают, например, векторы серии pBluescript, векторы серии pUC, например pUC18, pUC19, pBR322, pBR329, pQE70, pQE60, pQE-9, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK233-3, pDR540, pRIT5, pLG338, pKC30, pHSG299, pHSG399, pACYC177, pACYC184, pRSF1010, pBW22 и т.д. Предпочтительным вектором является тот, который относится к группе векторов рЕТ. Векторы рЕТ обычно содержат lacI ген, который несет информацию о репрессорном белке lac, Т7 промотор, который специфичен для Т7 РНК-полимеразы, последовательность, терминирующую транскрипцию, оператор lac, который может блокировать транскрипцию, полилинкер для клонирования, источник репликации f1, ген устойчивости к ампициллину или ка-намицину и источник репликации ColE1. Векторы рЕТ, подходящие для использования в способах настоящего изобретения, включают, но без ограничения, рЕТ-21а(+), рЕТ-24а(+), рЕТ-28а(+), рЕТ-29а(+), рЕТ-30а(+), рЕТ-41а(+), рЕТ-44а(+), pET-21b(+), pET-24b(+), pET-26b(+), pET-28b(+), pET-29b(+), pET-30b(+), РЕТ-42Ь(+), pET-44b(+). Особенно предпочтительны векторы, которые основаны на остове рЕТ-26b(+). Другие примеры подходящих векторов описаны, например, в публикации "Клонирующие векторы" (Паувелс и др. (Pouwels et al.) (eds.) Elsevier, Amsterdam New York Oxford, 1985).
Экспрессирующий вектор для использования в бактериальных клетках может быть трансформирован в клетку-хозяин любым подходящим способом. Например, экспрессирующий вектор для использования в Е. coli может быть введен в клетку-хозяин, например, путем электропорации или химическими способами, такими как трансформация, опосредованная фосфатом кальция, как сказано у Маниатиса и др. (Maniatis et al.) 1982, "Молекулярное клонирование, Лабораторное руководство", Cold Spring Harbor Laboratory.
Клетки-хозяева и способы изобретения подходят для рекомбинантной экспрессии больших количеств растворимых белков интерферонов. Тип интерферона конкретно не ограничен. Обычно белки интерферо-ны, выбранные для экспрессии в клетках-хозяевах изобретения, могут быть человеческого или не человеческого происхождения. Полипептиды интерферонов не человеческого происхождения включают, например, бычий, конский, свиной и мышиный интерфероны, а также соответствующие белки от собак, кошек, кроликов и овец. Другие типы не человеческих интерферонов включают те, которые можно найти у приматов, таких как шимпанзе и гориллы. В одном предпочтительном варианте осуществления белки интерфероны, выбранные для экспрессии в клетках-хозяевах изобретения, являются человеческими интерферонами, т.е. интерферонами, которые встречаются в природе у людей, включая аллельные варианты.
Белок интерферон может принадлежать к любому подклассу интерферонов, который известен в данной области. В частности, белок интерферон для экспрессии в клетке-хозяине изобретения может быть а-интерфероном (IFN-а), р-интерфероном (IFN-P) или у-интерфероном (IFN-у). В одном особо предпочтительном варианте осуществления белок интерферон для экспрессии является человеческим IFN-а, IFN-р или IFN-у или его биологически активным фрагментом. Способы изобретения также могут подходить для экспрессии биологически активных вариантов или фрагментов белков IFN-a, IFN-р или IFN-у, как сказано ниже.
В одном варианте осуществления изобретения IFN, экспрессируемый в клетках-хозяевах изобретения, является зрелым нативным человеческим белком IFN-a. Однако настоящее изобретение также охва
тывает экспрессию биологически активных вариантов и фрагментов IFN-a, которые описаны в настоящем документе. Человеческий IFN-a встречается как семейство по меньшей мере из 25 высокогомологичных белков из 166 аминокислот, которые кодированы разными генами. Белки IFN-a ингибируют репликацию вирусов и пролиферацию клеток и модулируют определенные иммунные ответы. Рекомбинант-ный IFN-a в настоящее время используется для лечения гепатита В и гепатита С, а также для лечения лейкемии, злокачественной меланомы и связанной со СПИД саркомой Капоши. Предпочтительные IFN-a для экспрессии согласно способу изобретения включают IFN-a2a, IFN-a2b и IFN-a2c. Аминокислотная последовательность зрелого нативного человеческого IFN-a2a отражена в SEQ ID NO: 1.
В еще одном варианте осуществления IFN, экспрессируемый в клетках-хозяевах изобретения, является зрелым нативным человеческим белком IFN-р или биологически активным вариантом или фрагментом IFN-р, как сказано ниже. Человеческий IFN-р является гликопротеином, имеющим молекулярную массу приблизительно 20 кДа. Как IFN-a он показывает сильную антивирусную активность и, как известно, ингибирует пролиферацию клеток. Зрелая форма человеческого IFN-р имеет 166 аминокислот. Зрелый человеческий IFN-р показан в SEQ ID NO: 2. Установлено, что IFN-р связывается с теми же рецепторами, что и IFN-a.
В еще одном варианте осуществления изобретения IFN, экспрессируемый в клетках-хозяевах изобретения, является зрелым нативным человеческим белком IFN-у. Однако настоящее изобретение также охватывает экспрессию биологически активных вариантов и фрагментов IFN-у, которые упомянуты в настоящем документе. IFN-у является гликопротеином, который выполняет несколько регуляторных функций в иммунной системе. Например, высвобождение IFN-у промотирует дифференциацию В-клеток и стимулирует продуцирование TNF-a. Кроме того, установлено, что IFN-у активирует эпителиальные и эндотелиальные клетки, фибробласты и макрофаги, чтобы устранить внутриклеточные патогены. Эффекты IFN-у опосредованы связыванием регуляторного белка с разными формами рецепторов на поверхности клеток, чувствительных к IFN-у. В зрелой форме мономерный человеческий IFN-у включает 143 аминокислоты и имеет молекулярную массу приблизительно 17 кДа. Аминокислотная последовательность зрелого нативного человеческого IFN-у отражена в SEQ ID NO: 3.
Конечно, также можно использовать клетки-хозяева и способы изобретения для продуцирования вариантов интерферонов, которые в некоторой степени отличаются от вышеупомянутых белков интер-феронов и, в частности тех, которые показаны в SEQ ID NO: 1-3. Эти варианты обычно будут биологически активными вариантами, т.е. они сохраняют по меньшей мере часть биологической активности встречающегося в природе интерферона, например способность связываться с соответствующими молекулами рецепторов. Подходящие анализы для определения связывания варианта с рецептором типа I интерферона описаны, например, в патенте США № 5766864. Альтернативно, биологическая активность интерферона может быть определена путем измерения его антипролиферативных или противовирусных активностей, как сказано, например, в патентах США №№ 5770191 и 5690925. Предпочтительно вариантный интерферон сохраняет значительную часть биологической активности белка интерферона, из которого он получен, например по меньшей мере приблизительно 50% активности, более предпочтительно 60, 70, 80, 90, 95% или больше.
Варианты включают встречающиеся в природе и полученные рекомбинантно белки, которые отличаются от исходной опорной аминокислотной последовательности одной или несколькими заменами, делециями или добавлениями аминокислот. Например, вариант человеческого интерферона a2а может иметь аминокислотную последовательность, которая отличается в 2, 3, 4, 5, 6 или до 10, 20, 30 или больше положениях от последовательностей нативного человеческого интерферона a2а, отраженного в SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, чтобы замены были консервативными заменами, т.е. заменами одного или нескольких аминокислотных остатков одинаковой полярности, которые действуют как функциональный эквивалент. Предпочтительно аминокислотный остаток, используемый в качестве замены, выбирают из той же группы аминокислот, что и заменяемый аминокислотный остаток. Например, гидрофобный остаток может быть заменен другим гидрофобным остатком, или полярный остаток может быть заменен другим полярным остатком, имеющим такой же заряд. Функционально гомологичные аминокислоты, которые могут быть использованы для консервативной замены, включают, например, неполярные аминокислоты, такие как глицин, валин, аланин, изолейцин, лейцин, метионин, пролин, фенилаланин и триптофан. Примеры незаряженных полярных аминокислот включают серин, треонин, глутамин, аспарагин, тирозин и цистеин. Примеры заряженных полярных (основных) аминокислот включают гистидин, аргинин и лизин. Примеры заряженных полярных (кислых) аминокислот включают аспарагиновую кислоту и глута-миновую кислоту.
Также рассматриваемыми в качестве вариантов интерферона являются белки, которые отличаются от исходного интерферона одной или несколькими (например, 2, 3, 4, 5, 10 или 15) дополнительными аминокислотами. Эти дополнительные аминокислоты могут присутствовать в аминокислотной последовательности исходных белков интерферонов (т.е. как вставка), или они могут быть добавлены к одному или обоим концам белка. В основном, вставки могут быть в любом положении при условии, что добав
ление аминокислот не ухудшает способность белка проявлять по меньшей мере часть биологической активности, которую проявляет встречающийся в природе белок интерферон. Более того, варианты также включают те белки, в которых, по сравнению с исходным белком, отсутствуют одна или несколько аминокислот. Такие делеции могут быть сделаны в отношении любого положения аминокислот при условии, что они не ухудшают способность такого варианта проявлять по меньшей мере часть биологической активности, которую проявляет встречающийся в природе белок интерферон.
Варианты белков интерферонов также включают белки со структурными модификациями относительно встречающихся в природе белков, такие как модифицированные аминокислоты. Согласно изобретению модифицированными аминокислотами являются аминокислоты, которые модифицированы либо естественными способами, такими как процессинговые или посттрансляционные модификации, или способами химической модификации. Модификации аминокислот, которые могут встречаться в вариантах интерферона, полученных согласно изобретению, могут включать фосфорилирование, гликозилирова-ние, ацетилирование, ацилирование, ветвление, АДФ-рибозилирование, сшивание, формирование ди-сульфидного моста, формилирование, гидроксилирование, карбоксилирование, метилирование, демети-лирование, амидирование, кольцевание и/или формирование ковалентных или не ковалентных связей с фосфатидилинозитолом, производными флавина, липотейхоевыми кислотами, жирными кислотами или липидами. Такие модификации широко описаны в литературе, например в публикации "Белки: структура и молекулярные свойства", Т. Creighton, 2nd edition, W.H. Freeman and Company, New York (1993).
Упоминаемые здесь варианты интерферона предпочтительно представляют значительную идентичность аминокислотной последовательности по сравнению с исходным белком интерфероном. Предпочтительно аминокислотная идентичность составляет приблизительно 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% и более, предпочтительно больше чем 96, 97, 98 или 99%. Способы и компьютерные программы для определения аминокислотной гомологии хорошо известны в данной области. Для цели настоящего изобретения идентичность последовательности определяют, используя алгоритм Смита-Ватермана по поиску гомологии (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981), 2:482-489).
Биологически активные варианты человеческих белков интерферонов описаны в литературе в данной области. Варианты человеческого IFN-a можно найти, например, в патенте США № 5676942, который также содержит информацию по остаткам и участкам белка IFN-a, которые могут быть изменены без потери биологической активности. Варианты человеческого IFN-у описаны, например, в патентах
США №№ 5690925 и 6046034.
Клетки-хозяева и способы, предложенные настоящим изобретением, также могут подходить для экспрессии биологически активных фрагментов непроцессированных белков интерферонов или их вариантов, которые определены выше. В используемом здесь смысле фрагментом белка интерферона является белок, полипептид или пептид, который отличается от соответствующего белка интерферона отсутствием одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или С-конце, причем по меньшей мере часть биологической активности молекулы опорного интерферона, например ее свойства связываться с рецепторами или ее противовирусная или антипролиферативная активность, сохраняются. Предпочтительно, чтобы биологически активные фрагменты встречающихся в природе белков интерферонов или фрагменты соответствующих вариантов интерферонов сохраняли по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% или даже по меньшей мере приблизительно до 99% биологической активности опорного интерферона.
Биологически активные фрагменты человеческих интерферонов были описаны раньше. Например, фрагменты IFN-у известны из патента США № 5770191, который раскрывает фрагменты, содержащие аминокислоты 95-134 зрелого непроцессированного человеческого IFN-у. Эти фрагменты проявляют биологическую активность зрелого IFN-у. В документе ЕР 0306870 раскрыты фрагменты человеческого IFN-у, имеющего делецию аминокислот 7-11 на С-конце. Эти фрагменты проявляют значительно повышенную активность по сравнению с непроцессированным человеческим IFN-у.
При клонировании полинуклеотидной последовательности, которая кодирует один из вышеупомянутых белков интерферонов или его биологически активный вариант или фрагмент в бактериальный экспрессирующий вектор, необходимо учитывать, что может быть полезным модифицировать кодирующую интерферон полинуклеотидную последовательность, чтобы адаптировать ее к прокариотической экспрессии. Способы оптимизации кодон-использования экспрессируемой полинуклеотидной последовательности, чтобы сделать ее подходящей для экспрессии в бактериальных клетках-хозяевах, таких как клетки Е. coli, хорошо известны в данной области и описаны, например, у Мартенса и др. (Maertens et al.) (2010), Protein Science, 19: 1312-1326.
Вкратце, полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует белок интерферон, экспресси-руемый в клетках-хозяевах, манипулируют путем адаптации кодон-использования к кодон-смещению Е. coli. Участки с очень высоким (> 80%) и очень низким ( <30%) GC-содержанием по возможности не использовались. Также не использовались фрагменты cis-действующей последовательности, такие как внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты и сайты входа рибосом, повторяющиеся последовательности, вто
ричные последовательности РНК и АТ-богатые или GC-богатые участки последовательности. Оптимизация генных последовательностей, таких как человеческие генные последовательности, для экспрессии в бактериальных клетках-хозяевах, таких как клетки Е. coli, также осуществлена такими провайдерами, как Geneart (Регенсбург, Германия).
Полинуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий IFN-a2a, которая оптимизирована для экспрессии в Е. coli, представлена в SEQ ID NO: 4.
Изобретение также относится к способу рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона, в котором используется клетка-хозяин, более подробно описанная выше. Способ включает следующие этапы:
(a) предоставление клетки-хозяина, которая включает функциональный эндогенный trxB ген, инак-тивированный эндогенный gor ген и полинуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный белок интерферон;
(b) культивирование клетки-хозяина при условиях, которые позволяют экспрессировать белок интерферон; и
(c) получение растворимого белка интерферона из клетки-хозяина.
Клетка-хозяин предпочтительно содержит копию РНК-полимеразы бактериофага, интегрированную в ее геном, например Т7 РНК-полимеразу, и трансформирована эписомальным экспрессирующим конструктом, например экспрессирующим вектором, включающим полинуклеотидную последовательность, которая несет информации по экзогенному белку интерферону. Хозяин, используемый в этом способе для рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона, может, в общем, быть эукариотиче-ской или прокариотической клеткой любого типа, как сказано в настоящем документе.
Предпочтительно клеткой-хозяином является бактериальная клетка, более предпочтительно клетка Е. coli.
Согласно способу, предложенному настоящим изобретением, клетки-хозяева культивируют в условиях, которые позволяют экспрессировать белок интерферон. Конкретные условия будут зависеть от выбора специфической экспрессирующей системы, а также от факторов, таких как природа клетки-хозяина, природа индуцибельного промотора и т.д. Специалист легко сможет выбрать и оптимизировать условия, которые требуются для эффективной экспрессии белка интерферона в клеточной культуре без изобретательских усилий.
Например, культивирование клеток-хозяев Е. coli, экспрессирующих белок интерферон, может быть выполнено в соответствии со стандартными способами ферментации. Обычно клетки Е. coli могут быть культивированы способом периодической или подпитываемой культуры. Способы культивирования бактериальных клеток-хозяев описаны в общем в публикации "Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bio-separation", Volumes 1-5, Flickinger, M.C., Drew, S.W. (eds.), 1999 John Wiley & Sons. Типичные температурные условия могут быть в диапазоне от 20 до 42°С, более обычно от 30 до 40°С и предпочтительно от 35 до 38°С. Питательная среда обычно будет иметь рН в интервале 6,5-9,0, более типично 7,0-8,0, например 7,5. Ферментация культуры будет продолжаться в течение времени от нескольких часов до нескольких суток. В частности, если культивирование выполняют как периодический процесс, время культивирования обычно составляет приблизительно от 12 до 36 ч. При использовании непрерывного процесса время ферментации может составлять до 21 дня и больше.
На последнем этапе способа растворимый белок интерферон получают из клетки-хозяина. Обычно белок выделяют из цитозоли клеток-хозяев. Клетки могут быть разрушены, например, френч-прессом, повторными циклами замораживания и оттаивания или обработкой ультразвуком. Клеточный мусор может быть легко удален из белковой фракции путем центрифугирования. Растворимые белки интерферо-ны затем могут быть очищены от других белковых и небелковых компонентов стандартными способами хроматографии, включая, например, эксклюзионной хроматографией и/или ионообменной хроматографией. Также можно использовать другие способы, которые обычно применяют для очистки белков, такие как осаждение сульфатом аммония и фильтрация и/или диализ. Белок интерферон, экспрессирован-ный клеткой-хозяином изобретения, также может быть очищен аффинной очисткой с использованием, например, моноклональных или поликлональных антител к интерферону.
Для упрощения очистки интерферон, полученный способом изобретения, может быть экспрессиро-ван как гибридный белок, который включает аффинную метку, которая облегчает связывание гибридного белка через соединение, проявляющее аффинность связывания с меткой. Например, аффинная метка может быть полигистидиновой меткой, включающей 6-12 гистидиновых остатков, которая специфически взаимодействует с никельионным хелатным матриксом. Альтернативно, меткой может быть глутатион-S-трансфераза, позволяющая выполнять очистку на глутатионовом матриксе. Другие аффинные метки хорошо известны в данной области. Неограничивающие примеры пар из аффинной метки и аффинного лиганда включают следующие: мальтоза-связывающий белок (МБР) и мальтоза; авидин и биотин; метка Streptag и стрептавидин; эпитоп myc и антитело. Если аффинной меткой является пептид или полипептид, такая метка может быть легко экспрессирована вместе с белком интерфероном как единый продукт экспрессии. Если аффинная метка не имеет белкового происхождения, она может быть прикреплена химическими реакциями связывания. Например, биотин может быть химически связан с гибридным бел
ком.
Предпочтительно по меньшей мере 50% интерферона, полученного способом изобретения является активным интерфероном. Более предпочтительно по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% интерферона, полученного способом изобретения, является активным интерфероном.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано сравнение уровней белка IFNa2a в RHB-T7/pET26b(+). IFNa2a и RHB-T7Agor/pET26b(+). IFNa2a согласно определению с помощью денатурирующего электрофореза в поли-акриламидном геле (SDS-PAGE) до (t0) и через 3 ч после индукции с помощью IPTG (t3). Можно видеть, что оба клона экспрессируют IFNa2a в сходных количествах.
На фиг. 2 показаны результаты анализа SDS-PAGE растворимой и нерастворимой фракций белков RHB-T7/pET26b(+).IFNa2a и RHB-T7Agor/pET26b(+).IFNa2a через 3 ч после индукции с помощью IPTG (t3). Хотя культура RHB-T7/pET26b(+).IFNa2a продуцировала в основном нерастворимый интерферон (третья полоса в левой панели), RHB-T7Agor/pET26b(+).IFNa2a дала главным образом растворимый белковый продукт (вторая полоса в правой панели).
На фиг. 3 показано сравнение экспрессии IFNa2a в штаммах RHB-T7Agor, RHB-T7Agor/trx и Ori-gami(DE3), которые все были ранее трансформированы экспрессирующим вектором pET26b(+).IFNa2a. Панель А показывает результаты после анализа SDS-PAGE и окраски кумасси. Панель В показывает результаты иммуноблоттинга и обнаружения с помощью хемолюминисценции. t0: не индуцирована; t4: индуцирована на 4 ч с помощью IPTG; I: тельце включения или нерастворимая фракция; С: цитозоль или растворимая фракция; Ctrl: рекомбинантный IFNa2a (Roferon(r)); LM: маркер молекулярной массы Invi-trogen).
На фиг. 4 показана нуклеотидная последовательность, несущая информацию по человеческому IFNa2a, которая была оптимизирована по кодон-использованию для рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине Е. coli.
Примеры
Изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, которые даны только для примера. Более конкретно, примеры описывают подготовку клетки-хозяина Е. coli с помощью экзогенного гена Т7 РНК-полимеразы и эндогенного gor гена, который был инактивирован путем гомологичной рекомбинации. Примеры, кроме того, описывают рекомбинантную экспрессию человеческого интерферона a, р и у в упомянутой клетке-хозяине Е. coli.
Пример 1. Подготовка Т7-контролируемого штамма Е. coli.
Штамм-продуцент Е. coli, содержащий геномный ген Т7 РНК-полимеразы под контролем репрессо-ра lacI, был приготовлен с использованием технологии Red/ET для гомологичной рекомбинации (Gene Bridges, Хайдельберг, Германия), начиная с штамма BL21. Подготовка штамма-продуцента включала следующие этапы:
а) амплификация и клонирование генной кассеты Т7.
Геномная ДНК BL21-DE3 Е. coli (Novagen) была приготовлена с помощью стандартного набора (Qiagen, Хильден, Германия). Генная кассета 4.44 kb 1a-CUV5-T7 BL21-DE3 была амплифицирована реакцией ПЦР. Кассета ДНК содержала lacI ген, регуляторные домены lac оперона, частичный lacZ ген и ген 1 фага Т7 Е. coli, который кодирует Т7 РНК-полимеразу. Смеси для реакции ПЦР содержали буфер ДНК-полимеразы KOD Hot Start, 2 ммоль MgSO4, 200 пмоль dNTPs, ДНК-полимеразу 1 Е KOD Hot Start (Novagen), 10 пмоль прямого праймера (?dnt1), 10 мкмоль обратного праймера (?dnt2) и 50 нг ДНК-матрицы. Амплификатор Mastercycler gradient (Eppendorf) использовали со следующими настройками: денатурация в течение 2 мин при 98°С, затем 34 цикла по 30 с при 98°С, 30 с отжига при температуре 60,5°С и 2 мин элонгации при 72°С. Конечная элонгация была выполнена в течение 7 мин при 72°С. Использовали следующие праймеры:
Aintl: GTCCGACTTATGCCCGAGAAGATGTTGAGCAAACTTATCGCTTATC (SEQ
ID N0:6) ;
ХЫ2: TGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCG (SEQ ID N0:7);
Полученный продукт ПЦР впоследствии использовали в качестве матрицы для повторной амплификации при тех же условиях ПЦР для создания сайтов рестрикции для PstI и SalI для кассеты Т7. Для повторной амплификации ПЦР использовали следующие праймеры:
РМ-прямой: GGAAGCGGGCCTGCAGCGGACACCATCGAATGGCGC (SEQ ID N0:8); и
&гД-обратный: GGGGGGGGGGGTCGACGGAGTCGTATTGATTTGGCG (SEQ ID N0:9).
После анализа рестрикции и элюирования полученного фрагмента из агарозного геля с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen, Хильден, Германия) выполнили реакцию лигирова-ния (набор для быстрого лигирования ДНК, Roche) с использованием расщепленной с помощью PstI/SalI плазмиды pIBD5 (которая включает Т5 промотор индуцибельный IPTG). 100 мкл клеток K12 DH10B Е. coli трансформировали электропорацией, как сказано в настоящем документе, поместили на LB-агаровых пластинках, содержащих канамицин (Kan) и культивировали при 37°C в течение ночи. Один клон на пластинках культивировали для подготовки плазмиды ДНК (набор Qiaprep Spin Miniprep; Qiagen), расщепили с помощью PstI и SalI и правильность вставки кассеты Т7 РНК-полимеразы (RNAP) проверили электрофорезом на агарозном геле. Заново упакованный вектор получил название pSI. T7 RNAP ген в pSI был подтвержден секвенированием (GATC Biotech AG). Одобренную плазмиду pSI использовали в качестве матрицы для создания линейной ДНК для этапа рекомбинации согласно техническому протоколу изготовителя (Gene Bridges).
b) Подготовка линейной ДНК для гомологичной рекомбинации.
Для создания линейной ДНК для рекомбинации кассету Т7 и ген устойчивости к канамицину из pSI амплифицировали с помощью ПНР, добавив плечи гомологии на каждой стороне, которые являются фрагментами секвенирования ДНК, гомологичными к ДНК желательного локуса геномной интеграции, т.е. локуса recA E. coli. Смеси для реакции ПНР содержали буфер ДНК-полимеразы KOD Hot Start, 2 ммоль MgSO4, 200 мкмоль dNTPs, 1 Е ДНК-полимеразы KOD Hot Start (Novagen), 10 пмоль прямого праймера (5'harecA), 10 мкмоль обратного праймера (3'harecA) и 50 нг ДНК-матрицы. Амплификатор Mastercycler gradient (Eppendorf) использовали со следующими настройками: денатурация в течение 2 мин при 98°C, затем 35 циклов по 30 с при 98°C, 30 с отжига при 65,5°C и 2 мин элонгации при 72°C. Конечная элонгация была выполнена в течение 7 мин при 72°С. Использовали следующие праймеры:
5'harecA:
TCGCTATCATCTACAGAGAAATCCGGCGTTGAGTTCGGGTTGCTCAGCAGCTAGA TGCATGC TCGAGCGG (SEQ ID NO:10);
3'harecA:
GTAAAGGCTCCATCATGCGCCTGGGTGAAGACCGTTCCATGGATGTGGAACTCTG CTGAAGC CAGTTACC (SEQ ID NO: 11).
Продукты ПЦР были очищены с помощью набора QIAquick (Qiagen) и расщеплены с помощью 10 единиц DpnI в течение 30 мин при 37°C.
c) Трансформация компетентных клеток Е. coli.
Клетки Е. coli трансформировали с помощью плазмиды pRed/ET путем электропорации клеток BL21 (Novagen). Вкратце, 1 мкл ДНК плазмиды pRed/ET добавили к аликвоте 50 мкл электрокомпетентных клеток, перенесли на 1 мм кювету для электропорации и электропорировали при напряжении 1350 В, используя электропоратор #2510 (Eppendorf). Постоянная времени должна быть между 5,0 и 5,4 мс. Добавили 1 мл предварительно охлажденной LB-среды (1% соевого пептона, 0,5% экстракта дрожжей, 1% NaCl, pH 7,0), пробу перенесли в пробирку 1,5 мл и инкубировали в термоамплификаторе в течение 1 ч при 30°C и 800 об/мин. 100 мкл суспензии клеток поместили на LB-агар плюс тетрациклин (3 пг/мл) и пластинки инкубировали в течение ночи при 30°C. Одну колонию взяли с пластинок электропорации pRed/ET и инкубировали в течение ночи в 1 мл LB-среды плюс тетрациклин при 30°C, встряхивая при 800 об/мин. 30 мкл этой культуры перенесли в две пробирки, содержащие 1,4 мл LB-среды плюс антибиотик. Клетки росли в течение приблизительно 2 ч при 30°C, пока они не достигли оптической плотности (OD) 0,3. Одну культуру индуцировали путем добавления 50 мкл 10% L-арабинозы, в другую оставили неиндуцированной для использования в качестве отрицательного контроля. Обе культуры инкубировали при 37°C, 800 об/мин в течение приблизительно 1 ч. Для получения компетентных клеток обе культуры центрифугировали при 4°C, 13 000 об/мин, дважды промыли 1 мл предварительно охлажденного 10% глицерина и повторно суспендировали приблизительно в 50 мкл 10% глицерина.
Эти культуры затем трансформировали с помощью линейной ДНК (см. выше), которая содержала Т7 и ген устойчивости к канамицину из pSI, а также плечи гомологии для рекомбинации. 400-800 нг линейного фрагмента ПЦР добавили к индуцированным и неиндуцированным клеткам, и эту суспензию электропорировали при напряжении 1350 В. Уделили внимание тому, чтобы объем пробы ДНК не превысил 4 мкл. Добавили 1 мл ледяной LB-среды и клетки инкубировали в течение 3 ч при 37°C, 800 об/мин. После центрифугирования клетки повторно суспендировали в 100 мкл LB-среды, поместили на
LB-агар плюс выбранный антибиотик в рекомендованной концентрации и инкубировали в течение ночи при 37°C. Идентифицировали два клона. Успешная рекомбинация кассеты в локус recA в BL21 в этих клонах была подтверждена ПЦР колонии. Анализ всей интегрированной последовательности (lacI, AlacZ и ген Т7 РНК-полимеразы) показали абсолютную идентичность с исходной последовательностью этого участка в BL21-DE3. Новый штамм получил обозначение RHB-T7 Kanr. d) Удаление гена устойчивости к канамицину.
Как сказано выше, новый штамм RHB-T7 Kanr содержит ген устойчивости к канамицину в бактериальном геноме. Поскольку клетки, созданные при событиях рекомбинации, предназначены для использования с векторами рЕТ, потребовалась дальнейшая оптимизация, чтобы избежать двойной устойчивости (геномной и эписомальной). Таким образом, геномный ген устойчивости к канамицину был разрушен путем вставки в локус канамицина FRT-фланкированной кассеты устойчивости к хлорамфениколу посредством гомологичной рекомбинации. Затем еще одно событие рекомбинации, контролируемое белком flp, привело к делеции приблизительно 60% гена устойчивости к канамицину. Этот выключенный (knockout) мутант позволяет выбирать трансформанты рЕТ из-за эписомального гена (Kan) устойчивости к канамицину.
Ген устойчивости к канамицину был удален из генома следующим образом.
Линейный продукт ПЦР FRT-фланкированной кассеты устойчивости к хлорамфениколу с фрагментами 5' и 3' секвенирования ДНК, гомологичными к частям гена устойчивости к канамицину, был интегрирован в геномный локус канамицина в штамме RHB-T7 Kanr путем гомологичной рекомбинации. Для этой цели использовали технологию Red/ET для гомологичной рекомбинации (Gene Bridges, Хайдельберг, Германия). Вкратце, электрокомпетентные клетки RHB-T7 Kanr были трансформированы в плазми-ду pRed/ET согласно протоколу изготовителя (см. выше). Выбор был сделан на тетрациклиновых пластинках, и положительные клоны были трансформированы с помощью линейного фрагмента ПЦР, содержащего плечи гомологии 5' и 3' генной последовательности Kanr, и FRT-фланкированного гена устойчивости к Cm. Трансформанты были проверены анализом ПЦР, чтобы подтвердить модифицированный геном. Семь отдельных клонов были взяты и проанализированы способом ПЦР колонии на правильность вставки в локус канамицина в RHB-T7 Kanr. Все семь проанализированных клонов оказались положительными. Один из этих клонов был трансформирован с помощью плазмиды pFLP707, поставленной компанией Gene Bridges. Эта плазмида несет ген flp рекомбиназы под транскрипционным контролем термочувствительного промотора, термочувствительного источника репликации и гена устойчивости к тетрациклину для выбора трансформантов.
Один клон этой трансформации культивировали при 30°C. Сдвиг в температуре до 37°C индуцировал как экспрессию белка flp рекомбиназы, так и потерю плазмиды pFLP707, включая устойчивость к тетрациклину. Клетки были помещены на LB-агар, и отдельные клоны были проанализированы ПЦР колоний на события положительной flp рекомбинации.
Три колонии, несущие FRT-фланкированную кассету устойчивости к хлорамфениколу, культивировали в пробирке микроцентрифуги, содержащей 1,0 мл LB-среды и 15 мкг/мл хлорамфеникола. В крышке было пробито отверстие для подачи воздуха. Культуру инкубировали в течение ночи при 37°C с встряхиванием при 800 об/мин. Пробирку микроцентрифуги с 1,4 мл LB-среды и 15 мкг хлорамфеникола инокулировали 30 мкл свежей ночной культуры, инкубировали в течение 2-3 ч при 37°C с встряхиванием при 900 об/мин. Клетки центрифугировали в течение 30 с при 11000 об/мин в охлаждаемой центрифуге и супернатант удаляли путем опрокидывания. Осадок повторно суспендировали в 1 мл охлажденной ddH2O. Центрифугирование и повторное суспендирование повторили один раз. После центрифугирования супернатант удалили еще один раз путем опрокидывания, и 20-30 мкл обычно оставались в пробирке вместе с осадком. Клетки повторно суспендировали и постоянно держали на льду. Электропорацию выполнили с 1 мкл ДНК pFLP707. После ночной инкубации на тетрациклиновых пластинках при 30°C 1 мл LB-среды инокулировали одной колонией и инкубировали при 30°C в течение 2-3 ч. Температуру изменили на 37°C и культуру инкубировали в течение ночи. Одну каплю клеточной суспензии поместили на LB-агар.
После инкубации в течение ночи при 37°C отдельные колонии анализировали путем ПЦР на успешное удаление выбранного маркера хлорамфеникола. Дополнительно колонии были перепечатаны на LB-агари LB-агар, кондиционированный 15 мкг/мл хлорамфеникола для выбора положительных клонов. Два положительных клона были идентифицированы по потере устойчивости к хлорамфениколу. Эти клоны были подтверждены анализом последовательности соответствующего геномного участка. Новый штамм получил название RHB-T7.
Пример 2. Разрушение gor гена.
Для подготовки электрокомпетентных клеток 20 мл LB-среды инокулировали ночной культурой RHB-T7, чтобы достигнуть стартовой оптической плотности OD600 приблизительно 0,1. Клетки выращивали при 37°C до оптической плотности OD600 приблизительно 0,6. Культуру центрифугировали при 4°C в течение 10 мин и 4600 об/мин. Супернатант удалили, а осадок повторно суспендировали в 14 мл ледяного 10% глицерина. После центрифугирования (условия такие, как сказано выше) этап промывки повторили. В заключение осадок повторно суспендировали в 700 мкл 10% глицерина, и 50 мкл аликвоты
суспензии клеток были немедленно заморожены в жидком азоте.
1 мкл ДНК плазмиды pRed/ET добавили к 50 мкл аликвоты электрокомпетентных клеток. После перемешивания пробу хранили на льду. Пробу для трансформации перенесли на 1 мм кювету для электро-порации и электропорировали при 1350 В, используя электропоратор #2510 от компании Eppendorf с постоянной времени между 5,0 и 5,4 мс. Добавили 1 мл предварительно охлажденной LB-среды, пробу перенесли в пробирку 1,5 мл и инкубировали в термоамплификаторе в течение 1 ч при 30°C и 800 об/мин. 100 мкл суспензии клеток поместили на LB-агар плюс тетрациклин (3 мкг/мл) и пластинки инкубировали в течение ночи при 30°C.
Одну колонию взяли с пластинок для электропорации плазмиды pRed/ET и инкубировали в течение ночи в 1 мл LB-среды плюс тетрациклин при 30°C, встряхивая при 800 об/мин. 30 мкл этой культуры перенесли в две пробирки, содержащие 1,4 мл LB-среды плюс антибиотик. Клетки выращивали в течение приблизительно 2 ч при 30°C до достижения оптической плотности приблизительно 0,3. Одну культуру индуцировали путем добавления 50 мкл 10% L-арабинозы, а другую оставили неиндуцированной и использовали в качестве отрицательного контроля. Обе культуры инкубировали при 37°C, 800 об/мин в течение приблизительно 1 ч. Для того чтобы получить компетентные клетки, обе культуры центрифугировали при 4°C, 13000 об/мин, дважды промыли 1 мл предварительно охлажденного 10% глицерина и повторно суспендировали приблизительно в 50 мкл 10% глицерина. Эти клетки использовали для трансформации с линейным фрагментом ПЦР, содержащим 5' и 3' плечи гомологии последовательности gor гена.
Кассету устойчивости FRT-Cm-FRT от компании Gene Bridges (Хайдельберг, Германия) использовали в качестве матрицы для разрушения хромосомного gor гена в RHB^7 из примера 1. Реакции ПЦР выполняли, используя амплификатор Mastercycler gradient от компании Eppendorf со следующими настройками: начальная денатурация в течение 2 мин при 98°C, затем 34 цикла по 30 с при 98°C, отжиг в течение 30 с при 60°C и элонгация в течение 1,5 мин при 72°C. Конечную элонгацию выполнили в течение 7 мин при 72°C, хранение происходило при 4°C. Использовали ДНК-полимеразу KOD Hot Start (Novagen) и следующие праймеры:
5'hagor:
AACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTAATTA АСССТСА CTAAAGGGCGG (SEQ ID NO: 12);
3'hagor:
GATCGGCCGTGATGGTTTCGCCGTTTACCTCCAGCGTTTTGGCATCAACGTAATA CGACTCA CTATAGGGCTCG (SEQ ID N0:13);
Таким образом было получено 1,5 кб продукта ПЦР, содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу, фланкированный FRT-сайтами, и 50 пар оснований (п.о.) плечей гомологии gor. Продукты ПЦР были очищены с помощью набора QIAquick (Qiagen). От 400 до 800 нг линейного фрагмента ПЦР, содержащего плечи гомологии 5' и 3' последовательности gor гена и FRT-фланкированного гена устойчивости к Cm были добавлены к индуцированным и неиндуцированным клеткам, приготовленным, как сказано выше, и суспензию электропорировали при 1350 В.
Очищенный продукт ПЦР использовали для электропорации RHB-T7, трансформированного вектором pRed/ET (Gene-Bridges) и таким образом подготовленного для гомологичной рекомбинации. Событие рекомбинации привело к точной интеграции кассеты маркера устойчивости в локус gor гена в геноме RHB-T7. Успешное разрушение gor гена было подтверждено ПЦР. Внимание уделяли тому, чтобы объем пробы ДНК не превысил 4 мкл. Добавили 1 мл ледяной LB-среды и клетки инкубировали в течение 3 ч при 37°C, 800 об/мин. После центрифугирования клетки повторно суспендировали в 100 мкл LB-среды, поместили на LB-агар с хлорамфениколом и инкубировали в течение ночи при 37°C. Успешная рекомбинация в геном была проверена ПЦР колонии. Эти реакции ПЦР, а также результаты экспериментов по перепечатыванию колоний продемонстрировали, что кассета маркера устойчивости была успешно интегрирована. Положительные клоны были трансформированы плазмидой pFLP707 (Gene Bridges), как сказано в примере 1, чтобы инициировать устранение маркера устойчивости. Потеря маркера устойчивости была подтверждена ПЦР и перепечатыванием колоний.
Интеграция и флиппинг привели к разрушению открытой рамки считывания gor и этим создали му-тантный штамм с отсутствием gor. Это было подтверждено анализом секвенирования. Открытая рамка считывания gor в RHB-T7 gor- дает усеченный белок с остановкой трансляции в ТАА в положении 364366 (триплет 116 белка дикого типа). Последовательность промотора Т3, сайт мишени рекомбинации флипазы (FRT) и последовательность промотора Т7 остаются в хромосоме после события флиппинга и этим вызывают разрушение рамки считывания. Новый штамм получил название RHB-T7Agor.
Пример 3. Конструкция pET26b(+).IFNa2a.
Конструкция экспрессирующего вектора pET26b(+)IFNa2a была выполнена после электрофореза на
агарозном геле и элюирования геля Nde/Sal-расщепленного РЕТ26Ь(+) фрагмента плазмиды (Invitrogen), а также Nde/Sal-расщепленного и кодон-оптимизированного фрагмента вставки IFNa2a (pMA0813119, GeneArt). На основе этих двух выделенных фрагментов ДНК (набор Qiagen minelute для экстракции геля) была выполнена реакция лигирования с использованием набора Roche Rapid для лигирования ДНК. После трансформации химически компетентных клеток DH10B Е. coli аликвотой смеси для лигирования отдельные колонии взяли с LB-пластинок, содержащих канамицин, и культивировали их в течение ночи при 37°C в жидкой LB-среде, содержащей 50 мкг/мл выбранного маркера. После этого ДНК плазмида была выделена из каждого клона и расщеплена с использованием рестрикционных ферментов Nde/Sal. Расщепление дало фрагмент Nde/Sal приблизительно 550 п.о. в двух клонах с фрагментом вектора правильного размера > 5000 п.о. Для того чтобы подтвердить, что клоны включают правильный экспресси-рующий вектор pET26b(+)IFNa2a, клон 1 был подвергнут более специфическому расщеплению с использованием других рестрикционных ферментов, таких как PstI, BglII, BspHI и SspI. Результат рестрик-ционного расщепления и электрофореза на агарозном геле подтвердил правильность количества и размеров фрагментов ДНК. Таким образом, экспрессирующий вектор pET26b(+)IFNa2a был трансформирован в компетентные клетки RHB-T7Agor и дал устойчивые к канамицину колонии, пять из которых были произвольно выбраны для инокуляции 3 мл канамицинсодержащих жидких культур и хранения соответствующих криоматериалов при -80°C.
Пример 4. Анализ экспрессии IFNa2a.
Клетки Е. coli из штаммов RHB-T7 и RHB-T7Agor, описанных выше, культивировали до фазы середины логарифмического роста. Клетки центрифугировали (1 мин/16100 х T/0°C) и повторно суспендировали в ледяном 10% глицерине, затем снова центрифугировали (1 мин/16100 х T/0°C). Этот этап промывки повторили один раз. После второй промывки клетки повторно суспендировали в 50 мкл ледяного 10% глицерина и суспензию перенесли в предварительно охлажденную кювету для электропорации (зазор: 2 мм). Аликвоту экспрессирующего вектора РЕТ26Ь(+). IFNa2a добавили в кювету и выполнили электро-порацию с помощью электропоратора 2510 (Eppendorf AG, Германия) при напряжении 1350 В. После электропорации добавили 1 мл предварительно охлажденной LB-среды и суспензию клеток перенесли в свежую пробирку. После инкубации в течение 1 ч при 37°C с перемешиванием (250 об/мин) аликвоту 50 мкл нанесли на пластинку с LB-агаром, дополненным 50 мкг/мл канамицина, и инкубировали в течение ночи при 37°C. Взяли одиночные колонии с пластинок для трансформации и использовали их для инокуляции 3 мл культур (LB-среда, дополненная 50 мкг/мл канамицина). После инкубации в течение ночи (37°C/250 об/мин) первичные материалы для криохранения были приготовлены следующим образом: 1 мл пробы культуры смешали с 0,5 мл стерильного 30% ледяного глицерина в криопробирке (конечная концентрация глицерина 10%). После замораживания материала в жидком азоте пробирки хранили при
-80°C.
Клоны, полученные трансформацией RHB-T7 и RHB-T7Agor с помощью экспрессирующего вектора рЕТ26b(+).IFNa2a, обозначили как RHB-T7/pET26b(+).IFNa2a и RHB-T7Agor/pET26b(+).IFNa2a соответственно. Идентичность и целостность экспрессирующего вектора РЕТ26Ь(+). IFNa2a в разных клонах, полученных трансформацией, была подтверждена анализом фрагментации ДНК с использованием рестрикционных ферментов BglII, BspHI, NdeI, PstI, SalI и SspI.
Культивирование RHB-T7/pET26b(+).IFNa2a и RHB-T7Agor/pET-26b(+).IFNa2a для получения IFN было начато с инокуляции 3 мл комплексной среды [раст.] (27,0 г/л растительного пептона, 14,0 г/л экстракта дрожжей, 5,0 г/л NaCl, 0,5 г/л MnSO4xH2O, 25,0 г/л (массообъем) глицерина, 8,65 г/л K2HPO4, 6,85 г/л KH2PO4; рН 7,0±0,1) из криоматериалов. Среду дополнили 50 мкг/мл канамицина. Культуры инкубировали при 37°C, 250 об/мин в течение ночи. 15 мл культур экспрессии инициировали путем использования аликвот 3 мл ночных культур для достижения стартовой оптической плотности OD600 0,1 в 15 мл комплексной среды [раст.] без антибиотиков в перегородчатой встряхиваемой колбе при 37°C, 250 об/мин. После достижения фазы середины логарифмического роста с оптической плотностью OD600 0,50,8, добавили IPTG (конечная концентрация 1 ммоль), и культуры культивировали еще 3 ч. Взяли 1 мл проб культур сразу же до (t0) и через 3 ч после (t3) IPTG-индукции.
Пробы культур 1 мл центрифугировали (1 мин/16100 х T/0°C). Клеточные осадки повторно суспендировали в 4 мл буфера Tris-EDTA (рН 7,4), перенесли в стеклянную пробирку (внутренний диаметр 22 мм) и поместили в ледяную ванну. Клетки фракционировали с помощью ультразвукового устройства UP 400S (Hielscher Ultrasonic GmbH; характеристики: 400 Вт, 24 кГц), оснащенного зондом Н3. Технические настройки: глубина погружения: приблизительно 15 мм; производительность: 75%; цикл: 30 с обработка -30 с отключение; совокупное время обработки: 10 мин. Затем пробу перенесли в пробирку на 15 мл типа Falcon и центрифугировали (30 мин/4080 х T/4°C). Фракция нерастворимого белка формировала осадок. Супернатант, содержащий растворимые белки, был перенесен в свежую пробирку на 15 мл типа Falcon, дополнен 600 мкл 100% трихлоруксусной кислоты (конечная концентрация: 15%) и инкубирован в течение 1 ч при 4°C перед центрифугированием (30 мин/4080 хг/4°0). Осадок с этого этапа представляет собой фракцию растворимого белка. Оба осадка солюбилизировали и регулировали до OD600 =10 путем
добавления буфера IB (8 моль мочевины, 50 ммоль DTT, 100 ммоль Tris-HCl; pH 8,0). Этап стандартизации до OD600 = 10 позволил прямо сравнивать относительные количества белков в разных полосах прогона геля. Для оценки показателей получения белков пришлось принимать во внимание эффективно измеренную OD600 анализируемой культуры.
Совокупный клеточный белок (TCP) и фракции растворимых и нерастворимых белков были подвергнуты денатурирующему электрофорезу на агарозном геле (SDS-PAGE) с окраской кумасси. Для всех прогонов геля для SDS-PAGE использовали предварительно залитые гели NuPAGE(r) Novex(r) 12% Bis-Tris (Invitrogen, Карлсруэ, Германия) в сочетании с соответствующей системой XCell SureLock Mini-Cells (Invitrogen). Согласно размеру рекомбинантного INFa2a (19 кДа) была применена буферная система MES (Invitrogen), чтобы достигнуть наилучшей разрешающей способности. Все пробы растворили в 0,25 об. буфера LDS (Invitrogen), добавили 0,1 об. восстанавливающего агента Sample Reducing Agent (Invitrogen) и нагревали в течение 10 мин до 95°C перед загрузкой на гель. Для окраски кумасси использовали систему Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-Rad, Мюнхен, Германия) согласно рекомендациям поставщика. Пробы для анализа на станции для электрофореза (Experion, Bio-Rad Laboratories, Геркулес, США) были обработаны согласно инструкции изготовителя для условий восстановления (Руководство к набору Experion Pro260 для анализа) и загружены на чип Experion Pro260 (Bio-Rad). Регистрация и дальнейший анализ данных осуществляли с помощью средства для работы с системой ПО Experion и анализа данных (Bio-Rad, Версия 3.0.226.0).
Результаты: через 3 ч после индукции RHB-T7/pET26b(+).IFNa2a и RHB-T7Agor/pET26b'(+). IFNa2a показали четкие полосы белка приблизительно на 19 кДа при анализе SDS-PAGE (ожидаемая молекулярная масса человеческого IFNa2a составляет приблизительно 18,8 кДа). Полоса белка была детектирована исключительно в IPTG-индуцированных культурах, что говорит о том, что экспрессия в обоих клонах плотно контролируется (см. фиг. 1). Иммуноблоттинг с использованием антитела к IFNa2a подтвердил, что полоса белка, наблюдавшаяся при SDS-PAGE, была IFNa2a (данные не показаны). Сравнение интенсивностей полос белка в SDS-PAGE RHB-T7/pET26b(+).IFNa2a и RHB-T7Agor/pET26b(+).IFNa2a показало, что оба клона экспрессируют белок интерферон в сходных количествах (см. фиг. 1).
При анализе фракций растворимого и нерастворимого белков клонов, было установлено, что в RHB-T7/pET26b (+).IFNa2a рекомбинантный IFNa2a почти полностью присутствует в тельцах включения. Наоборот, в RHB-T7Agor/pET26b(+).IFNa2a продуцированный IFNa2a был почти полностью растворимым (см. фиг. 2).
Пример 5. Анализ экспрессии IFN-р и IFN-у.
В соответствии со способами, описанными в примерах 3-4, человеческий IFN-р и человеческий IFN-у были клонированы в экспрессирующий вектор РЕТ26Ь(+). Полученные плазмиды pET26b(+).IFN-P и pET26b(+).IFN-у были трансформированы в штаммы RHB-T7Agor и RHB-T7.
Результаты: подобно результатам, наблюдавшимся выше с IFN-a2a, можно показать, что в RHB-T7 как человеческий IFN-р, так и человеческий IFN-у были продуцированы в основном в форме телец включения, тогда как в RHB-T7Agor по меньшей мере приблизительно 90% рекомбинантного белка было экс-прессировано в растворимой форме (данные не показаны).
Пример 6. Сравнительный анализ экспрессии IFNa2a.
Штамм RHB-T7Agor, подготовленный в соответствии с примером 2, затем использовали для создания штамма с двойным выключением trxB-/gor-. Инактивирующая мутация в trxB гене была получена по существу так, как сказано выше в примере 2 в отношении gor гена. Для инактивации trxB гена были использованы следующие прайм еры:
5'hatrx:
CCCTCACTAAAGGGCGG-31 (SEQ ID N0:14); 3'hatrx:
5'-GCAAGTGTATTCGCCGTTATCGCCATTCAGACGGAACGGACGGTTTTGCATAATACGA CTCACTATAGGGCTCG-31 (SEQ ID N0:15);
Полученный штамм был обозначен как RHB-T7Agor/trx. Как сказано выше, штаммы trxB-gor- с двойным выключением (knock-out) могут расти только в случае, если они показывают мутацию в ahpC*. Поэтому в описанном здесь RHB-T7Agor/trx мутация супрессора ahpC* была достигнута путем гомологичной рекомбинации. В штамме RHB-T7Agor такой мутации не требуется.
RHB-T7Agor и RHB-T7Agor/trx были трансформированы с использованием 100 нг ДНК pET26b(+)IFNa2a, что дало штаммы RHB-T7Agor/pET26b(+).IFNa2a и RHB-T7Agor/trx-рЕТ26b(+).IFNa2a соответственно.
Подобно этому компетентные клетки Origami(DE3) (Novagen) были трансформированы с использованием 100 нг ДНК pET26b(+)IFNa2a и инкубированы в течение ночи при 37°C на селективных LB-агаровых пластинках или с 50 мкг/мл, или с 150 мкг/мл канамицина. На пластинке 150 мкг/мл были выявлены 20 колоний, тогда как на пластинке 50 мкг/мл выросли > 500 колоний. Приготовление ДНК плазмиды (набор Qiagen miniprep) и последующее рестрикционное расщепление трех независимых клонов, взятых с пластинки 150 мкг/мл, показало, что все три клона несли экспрессирующий вектор pET26b(+).IFNa2a. Один клон был выбран для последующих экспериментов с экспрессией (Origami(DE3)/pET26b(+)IFNa2a.
Анализ экспрессии и дальнейшие этапы фракционирования SDS-PAGE рекомбинантного белка IFN-a2a и иммуноблоттинга были выполнены в соответствии со способами, описанными в примерах 3-4.
Результаты: наблюдали, что во всех испытанных штаммах большинство рекомбинантно экспресси-рованного белка IFN-a2a было продуцировано как растворимая фракция. Только небольшие количества белка были обнаружены в тельцах включения. Что интересно, количество растворимого белка IFN-a2a были значительно больше в RHB-T7Agor-pET26b(+).IFNa2a чем в RHB-T7Agor/trx-pET26b(+).IFNa2a или Origami(DE3)/pET26b(+).IFNa2a. Количества, детектированные в RHB-T7Agor/trx-pET26b(+). IFNa2a были больше чем количества в Origami(DE3)/pET26b(+).IFNa2a (см. фиг. 3).
Перечень последовательностей
<110> РИХТЕР-ХЕЛЬМ БИОТЕК ГМБХ УНД КО. КГ
<120> РЕКОМБИНАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ РАСТВОРИМОГО ИНТЕРФЕРОНА
<130> P 87785
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu
1 5 10 15
Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys
20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210> 2
<211> 187
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 185
<210> 3
<211> 166
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu
1 5 10 15
Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu
20 25 30
Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp
50 55 60
Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
65 70 75 80
Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile
85 90 95
Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg
100 105 110
Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val
115 120 125
Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser
130 135 140
Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg
145 150 155 160
Gly Arg Arg Ala Ser Gln
165
<210> 4
<211> 504
<212> DNA
<213> Homo sapiens
ttcgcccttc
ctgctttgcc
agagcgcgtg
gcggttgttg
gcgcgggtta
catcgccgtt
540
gagctggcgg
gcgtgattaa
cggcctcggc
gcgaaaacgc
atctgtttgt
gcgtaaacat
600
gcgccgctgc
gcagcttcga
cccgatgatt
tccgaaacgc
tggtcgaagt
gatgaacgcc
660
gaaggcccgc
agctgcacac
caacgccatc
ccgaaagcgg tagtgaaaaa
taccgatggt
720
agcctgacgc
tggagctgga
agatggtcgc
agtgaaacgg tggattgcct
gatttgggcg
780
attggtcgcg
agcctgccaa
tgacaacatc
aacctggaag
ccgctggcgt
taaaactaac
840
gaaaaaggct
atatcgtcgt
cgataaatat
caaaacacca
atattgaagg tatttacgcg
900
gtgggcgata
acacgggtgc
agtggagctg
acaccggtgg
cagttgcagc
gggtcgccgt
960
ctctctgaac
gcctgtttaa
taacaagccg
gatgagcatc
tggattacag
caacattccg
1020
accgtggtct
tcagccatcc
gccgattggt
actgttggtt
taacggaacc
gcaggcgcgc
1080
gagcagtatg
gcgacgatca
ggtgaaagtg
tataaatcct
ctttcaccgc
gatgtatacc
1140
gccgtcacca
ctcaccgcca
gccgtgccgc
atgaagctgg tgtgcgttgg
atcggaagag
1200
aagattgtcg
gtattcacgg
cattggcttt
ggtatggacg
aaatgttgca
gggcttcgcg
1260
gtggcgctga
agatgggggc
aaccaaaaaa
gacttcgaca
ataccgtcgc
cattcaccca
1320
acggcggcag
aagagttcgt
gacaatgcgt
taa
1353
<210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 6 gtccgactta
tgcccgagaa
gatgttgagc
aaacttatcg
cttatc
<210> 7
<211> 44 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 7 tgcaaagaga
ttcttggcgg
agaaaccata
attgcatcta
ctcg
<210> 8 <211> 36
<212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> primer <400> 8
ggaagcgggc ctgcagcgga caccatcgaa tggcgc 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 9
gggggggggg gtcgacggag tcgtattgat ttggcg 36
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer <400> 10
tcgctatcat ctacagagaa atccggcgtt gagttcgggt tgctcagcag ctagatgcat 60 gctcgagcgg 70
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer <400> 11
gtaaaggctc catcatgcgc ctgggtgaag accgttccat ggatgtggaa ctctgctgaa 60
gccagttacc 70
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 12
aacgtgctcg gtaaaaataa cgttgatgta atcaaaggct ttgcccgctt aattaaccct 60 cactaaaggg cgg 73
<210> 13 <211> 74
<212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 13
gatcggccgt gatggtttcg ccgtttacct ccagcgtttt ggcatcaacg taatacgact 60
cactataggg ctcg 74
<210> 14
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer <400> 14
caccaagttt gaaactgaga tcatttttga tcatatcaac aaggtggatc aattaaccct 60
cactaaaggg cgg 73
<210> 15
<211> 74 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> primer <400> 15
gcaagtgtat tcgccgttat cgccattcag acggaacgga cggttttgca taatacgact 60
cactataggg ctcg 74
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Клетка-хозяин для рекомбинантной экспрессии белка интерферона млекопитающего, причем упомянутая клетка содержит:
(a) функциональный эндогенный trxB ген,
(b) инактивированный эндогенный gor ген,
(c) полинуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенный белок интерферон,
(d) ген полимеразы Т7 РНК.
2. Клетка-хозяин по п.1, отличающаяся тем, что упомянутая полинуклеотидная последовательность включена в экспрессирующий вектор.
3. Клетка-хозяин по п.1 или 2, отличающаяся тем, что упомянутый интерферон выбирают из груп
пы, состоящей из интерферона-а, интерферона-Р и интерферона-у или их активного фрагмента.
4. Клетка-хозяин по п.3, отличающаяся тем, что упомянутый белок интерферон является человеческим белком интерфероном или его биологически активным фрагментом.
5. Клетка-хозяин по п.4, отличающаяся тем, что упомянутый белок интерферон является человеческим интерфероном а2а или его биологически активным фрагментом.
6. Клетка-хозяин по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что упомянутая клетка-хозяин является бактериальной клеткой.
7. Клетка-хозяин по п.6, отличающаяся тем, что упомянутая бактериальная клетка является клеткой Escherichia coli.
8. Клетка-хозяин по п.7, отличающаяся тем, что упомянутая клетка Escherichia coli получена из штамма BL21 Escherichia coli.
9. Клетка-хозяин по любому из пп.1-8, отличающаяся тем, что упомянутый ген полимеразы Т7 РНК
вставлен в геном клетки-хозяина.
10. Способ рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона в клетке-хозяине, включающий: (a) предоставление клетки-хозяина по любому из пп.2-10;
(b) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые позволяют экспрессировать белок интер-
ферон,
(c) получение растворимого белка интерферона из клетки-хозяина.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что этап (с) включает разрушение клеток.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что этап (с), кроме того, включает очистку белка хроматографией.
13. Использование клетки-хозяина по любому из пп.1-9 для рекомбинантной экспрессии растворимого интерферона.
11.
atgtgcgatc cagatgcgta caggaagaat attcagcaga ctgctggata attcagggcg cgtaaatatt tgggaagtgg agcctgcgta tgccgcagac aaattagcct ttggcaacca tcttcaacct aattctatac tgggcgtgac ttcagcgcat tgcgtgcgga gcaaagaata ccatagcctg gtttagctgc gtttcagaaa gtttagcacc cgaactgtat cgaaaccccg caccctgtat aattatgcgt ataa ggcagccgtc ctgaaagatc gcggaaacca aaagatagca cagcagctga ctgatgaaag ctgaaagaaa agctttagcc
Фиг. 4 gtaccctgat gtcatgattt ttccggtgct gcgcggcgtg acgatctgga aagatagcat aaaaatatag tgagcaccaa gctgctggcc tggctttccg gcatgaaatg ggatgaaacc agcgtgcgtg tctggccgtg cccgtgcgcg cctgcaggaa
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
027218
027218
- 1 -
- 1 -
(19)
027218
027218
- 1 -
- 1 -
(19)
027218
027218
- 1 -
- 1 -
(19)
027218
027218
- 4 -
- 3 -
(19)
027218
027218
- 15 -
- 15 -
027218
027218
- 16 -
027218
027218
- 18 -
027218
027218
- 19 -
- 19 -
027218
027218
- 20 -
- 20 -
027218
027218
- 22 -
- 22 -
|
