EA 026079B1 20170228

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000026079b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Пероральная композиция для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии, содержащая водно-этанольный экстракт Olea europaea, или олеуропеин, и композицию, содержащую в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, где указанная композиция получена нагреванием растительного материала, являющегося экстрактом, полученным из комбинации плодов Lychi chinensis и зеленых листьев Camellia sinensis в кислотном водном растворе.

2. Композиция по п.1, содержащая 10-5000 мг водно-этанольного экстракта Olea europaea и 10-5000 мг композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру.

3. Композиция по п.2, где количество водно-этанольного экстракта Olea europaea составляет 50-2500 мг.

4. Композиция по п.2, где количество водно-этанольного экстракта Olea europaea составляет 100-300 мг.

5. Композиция по п.2, где количество композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, составляет 50-2500 мг.

6. Композиция по п.2, где количество композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, составляет 100-300 мг.

7. Композиция по любому из пп.1-6, где массовое отношение водно-этанольного экстракта Olea europaea к композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, составляет от 10:1 до 1000:1.

8. Композиция по п.7, где указанное массовое отношение составляет от 10:1 до 100:1.

9. Композиция по п.1, где указанная композиция, полученная нагреванием растительного материала, являющегося экстрактом, полученным из комбинации плодов Lychi chinensis и зеленых листьев Camellia sinensis в кислотном водном растворе, представляет собой Oligonol ™.

10. Способ предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека, включающий стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, композиции по любому из пп. 1-9.

11. Применение композиции по любому из пп.1-9 для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.

12. Применение композиции по любому из пп.1-9 для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

3. Композиция по п.2, где количество водно-этанольного экстракта Olea europaea составляет 50-2500 мг.

4. Композиция по п.2, где количество водно-этанольного экстракта Olea europaea составляет 100-300 мг.

8. Композиция по п.7, где указанное массовое отношение составляет от 10:1 до 100:1.

Евразийское 026079 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201391804
(22) Дата подачи заявки
2012.04.17
(51) Int. Cl.
A61K 45/06 (2006.01) A61K31/353 (2006.01) A61K31/7048 (2006.01)
(54) ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
(31) 11167804.1
(32) 2011.05.27
(33) EP
(43) 2014.03.31
(86) PCT/EP2012/056981
(87) WO 2012/163590 2012.12.06
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
УНИЛЕВЕР Н.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Барретт Карен Элизабет, Дженкинс Гейл, Лотито Сильвина Беатрис, Уэйнрайт Линда Джейн (GB)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(56) EP-A1-1852430
WO-A1-2006087748 WO-A1-9732947 WO-A1-2010070183 WO-A1-2005072726
MANNA C., MIGLIARDI V, GOLINO P., SCOGNAMIGLIO A., GALLETTI P., CHIARIELLO M., ZAPPIA V. "Oleuropein prevents oxidative myocardial injury induced by ischemia and reperfusion", THE JOURNAL OF NUTRITIONAL BIOCHEMISTRY AUG 2004 LNKD- PUBMED:15302080, vol. 15, no. 8, August 2004 (2004-08), pages 461-466, XP002654432, ISSN: 0955-2863 the whole document
BAGCHI D., SEN O.K., RAY S.D., DAS
D.K., BAGCHI M., PREUSS H.G., VINSON
J.A. "Molecular mechanisms of cardioprotection by a novel grape seed proanthocyanidin extract",
MUTATION RESEARCH, vol. 523-524, no. Special Issue, February 2003 (2003-02), pages 87-97,
XP002654433, ISSN: 0027-5107 the whole document
(57) Изобретение относится к обеспечению пероральной противовоспалительной композиции, в частности пероральной композиции для лечения или предотвращения сердечно-сосудистого заболевания и осложнений гипертензии, посредством идентификации активных веществ, которые понижающим образом регулируют воспалительные маркеры, такие как интерлейкин 6 (IL-6). Таким образом, изобретение предоставляет пероральную композицию для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии, содержащую водно-этанольный экстракт Olea europaea или олеуропеин и композицию, содержащую в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их водного экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе. Изобретение также предоставляет способ предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека, включающий стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, композиции по изобретению.
Данное изобретение относится к обеспечению пероральной противовоспалительной композиции, в частности к пероральной композиции для лечения или предотвращения сердечно-сосудистого заболевания и осложнений гипертензии.
Сердечно-сосудистые заболевания (класс заболеваний, которые затрагивают сердце или кровеносные сосуды) вносят вклад в более чем треть смертей по всему миру и в настоящее время являются основной причиной смерти в развивающихся странах. Риск заболевания сердца увеличивается с возрастом, и технически этот термин относится к любому заболеванию, которое воздействует на сердечнососудистую систему. Он обычно применяется для обозначения заболевания, связанного с атеросклерозом (артериальное заболевание).
Libby (American J. Clinical Nutrition, 83(2), 456S-460S (2006)) раскрывает то, что некоторые провос-палительные маркеры, такие как IL-6, связаны с сердечно-сосудистым заболеванием. IL-6 является цито-кином или клеточным сигнальным белком, кодируемым у людей геном IL-6, который является как про-воспалительным, так и противовоспалительным, и который стимулирует иммунный ответ на травму, приводя к воспалению. Libby et al. (Circulation, 105, 1135-1143 (2002)) раскрывает, то, что в эпидемиологических исследованиях был обнаружен повышенный сосудистый риск в связи с повышенными базаль-ными уровнями цитокинов, таких как IL-6. Он дополнительно раскрывает то, что жировая ткань может синтезировать цитокины, такие как IL-6, так что ожирение, как оказалось, само по себе стимулирует воспаление. Libby et al. также указывает на то, что воспаление может участвовать в гипертензии, обеспечивая патофизиологическую связь с атеросклерозом. Таким образом, идентификация активных веществ, которые понижающим образом регулируют воспалительные маркеры, такие как IL-6, может предоставлять путь для удовлетворения постоянной потребности в эффективных пероральных композициях для лечения или предотвращения сердечно-сосудистых заболеваний и осложнений гипертензии.
Структура (I)
где n является 0 или целым числом 1 или 2, и/или структуры (II)
В ЕР 1852430 А раскрыта композиция, содержащая в качестве главного компонента проантоциани-диновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который может быть получен нагреванием, например, при 90-100°С в течение 1-4 ч растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их водных экстрактов, содержащих проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюци-новую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе. Полученная в результате смесь затем может быть отфильтрована, концентрирована, разделена на фракции или высушена с использованием стандартных технологий, известных специалисту в данной области. Лучший вариант получения композиции раскрыт в абзацах [0015]-[ 0023] ЕР 1852430 А и включен в настоящее описание посредством ссылки. Молекулярная масса такой композиции была уменьшена по сравнению с исходным проантоцианидиновым полимером до такого уровня, что олигомер может быть более легко абсорбирован живым организмом. Композиция содержит соединения структуры (I)
где n является 0 или целым числом 1 или 2.
Олигомеры структуры (I) и (II) получены фракционированием указанной выше композиции ЕР 1852430 А с использованием стандартных способов фракционирования, известных специалисту в данной области.
Растительный материал, содержащий проантоцианидиновый полимер или его экстракт, содержащий проантоцианидиновый полимер, может быть выбран из группы, состоящей из винограда, сосны, Chamaecyparis obtuse, камфарного дерева, восковника восконосного, какао, хурмы обыкновенной, банана, хеномелесы китайской, яблока, боярышника, Lychi chinensis, Myrica rubra и Cinnamomi cortex. Вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, может быть выбрано из группы, состоящей из ресвератрола, флороглюцина, флавоноида и флаваноида. Вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, может также быть выбрано из группы, состоящей из зеленого чая, свежих листьев чая, виноградных семечек, оболочки виноградных семечек, кубического гамбира, красных водорослей и их экстрактов.
В ЕР 1852430 А дополнительно раскрыто, что такая композиция проявляет существенную антиок-сидантную активность в анализе активности захвата радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH) и анализе тролокс-эквивалента антиоксидантной способности (ТЕАС). Также раскрыто, что применение таких композиций приводит к улучшенной жизнеспособности клеток под ультрафиолетовым излучением, значительной антиоксидантной активности в сыворотке крови и липидных пероксидах печени (у мыши) и уменьшению в сыворотке крови уровней ферментов печени глутамин-щавелево-уксусной тран-саминазы (GOT) и аланинтрансаминазы (GPT). GOT и GPT вовлечены в перенос аминогруппы аминокислот от альфа-аминокислот к альфа-кетокислотам. Трансаминазы накапливаются в печени и обычно представлены только в низких концентрациях в сыворотке крови. Они высвобождаются в кровь, когда клетки печени разрушены; таким образом обнаружение высоких уровней трансаминаз в сыворотке крови является свидетельством повреждения клеток печени.
Композиция по ЕР 1852430 А коммерчески доступна под названием Oligonol(tm) (Cognis/BASF) и содержит проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюцино-вую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе, при этом растительный материал является экстрактом, полученным из комбинации плодов Lychi chinensis и зеленого листа Camellia sinen-sis.
Aquasol(tm)(Sabinsa) представляет собой экстракт листьев Olea europaea смесью 90:10 об./об. эта-нол:деминерализованная вода, при этом экстракт содержит 2,5% мас./об. олеуропеина, 1,9% мас./об. гид-рокситирозола. Тирозол, по-видимому, не представлен. Структуры приведены ниже
Еленолевая кислота
Гидрокситирозол является одним из главных фенольных соединений в Olea europaea, оливковом масле первого отжима и сточной воде, полученной в производстве оливкового масла первого отжима. В свежеприготовленном оливковом масле первого отжима гидрокситирозол в основном обнаруживается в форме сложного еленолевого эфира (известного как олеуропеин), которая со временем гидролизуется в неэтерифицированную форму.
Aquasol(tm) получают из указанного выше экстракта, который затем концентрируют в вакууме до 30% общего сухого твердого вещества и затем подвергают распылительной сушке.
Авторы изобретения наблюдали, что комбинация Oligonol(tm) и Aquasol(tm) проявляет синергический противовоспалительный эффект.
Сущность изобретения
Таким образом, в первом аспекте изобретения предоставлена пероральная композиция для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии, содержащая водно-этанольный экстракт Olea europaea или олеуропеина и композицию, содержащую в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их водного экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе.
Композиция может содержать 10-5000, предпочтительно 50-2500, наиболее предпочтительно 100300 мг Olea europaea и 10-5000, предпочтительно 50-2500, наиболее предпочтительно 100-300 мг композиции, содержащей в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их водного экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе.
Массовое отношение водно-этанольного экстракта Olea europaea к композиции, содержащей в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их водного экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе, может составлять от 10:1 до 1000:1, предпочтительно от 10:1 до 100:1.
Проантоцианидиновый олигомер может иметь степень полимеризации от 2 до 4.
Растительный материал, содержащий проантоцианидиновый полимер, или его водный экстракт, со
держащий проантоцианидиновый полимер, может быть выбран из группы, состоящей из винограда, сосны, Chamaecyparis obtuse, камфарного дерева, восковника восконосного, какао, хурмы обыкновенной, банана, хеномелеса китайского, яблока, боярышника, Lychi chinensis, Myrica rubra и Cinnamomi cortex.
Вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, может быть выбрано из группы, состоящей из ресвератрола, флороглюцина, флавоноида и флава-ноида.
Вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, может быть выбрано из группы, состоящей из зеленого чая, свежих листьев чая, виноградных семечек, виноградной семенной оболочки, кубического гамбира, красных водорослей и их экстрактов.
Композиция, содержащая в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проанто-цианидиновый полимер, или их водного экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе, необязательно может быть получена нагреванием растительного материала, являющегося экстрактом, полученным из комбинации плодов Lychi chinensis и зеленого листа Camellia sinensis, в кислотном водном растворе.
В частности, композиция, содержащая в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их водного экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе, необязательно может быть получена нагреванием растительного материала, являющегося экстрактом, полученным из комбинации плодов Lychi chinensis и зеленого листа Camellia sinensis, в кислотном водном растворе, представляет собой Oligonol(tm).
Во втором аспекте изобретения предоставлена пероральная композиция для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии, содержащая 10-5000, предпочтительно 50-2500, наиболее предпочтительно 100-300 мг Olea europaea и 10-5000, предпочтительно 502500, наиболее предпочтительно 100-300 мг композиции, содержащей в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, представленный структурой (I)
где n является 0 или целым числом 1 или 2.
В третьем аспекте изобретения предоставлена пероральная композиция для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии, содержащая 10-5000, предпочтительно 50-2500, наиболее предпочтительно 100-300 мг Olea europaea и 10-5000, предпочтительно 502500, наиболее предпочтительно 100-300 мг композиции, содержащей в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олигомер, представленный структурой (II)
где n является 0 или целым числом 1 или 2.
Водно-этанольный экстракт Olea europaea может представлять собой Aquasol(tm).
В четвертом аспекте изобретения предоставлен способ предотвращения или лечения сердечнососудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека, включающий стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, композиции согласно любому из первого, второго или третьего аспектов изобретения.
В пятом аспекте изобретения предоставлена композиция согласно любому из первого, второго или третьего аспектов изобретения для применения в качестве лекарственного средства для человека.
В шестом аспекте изобретения предоставлена композиция согласно любому из первого, второго или третьего аспектов изобретения для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
В седьмом аспекте изобретения предоставлено применение композиции согласно любому из первого, второго или третьего аспектов изобретения для производства лекарственного средства для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
Краткое описание графических материалов
Изобретение проиллюстрировано с помощью следующих фигур:
на фиг. 1 показан ответ посредством интерлейкина 6 (IL-6) (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 10 мкг/мл Oligonol(tm), 100 мкг/мл Aquasol(tm) (обозначен "Olive" на фигуре) или обоими;
на фиг. 2 показан ответ посредством интерлейкина 6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 0,1, 1 и 10 мкг/мл Oligonol(tm), 100 мкг/мл Aquasol(tm) (обозначен "Olive" на фигуре) или их комбинациями;
на фиг. 3 показан ответ посредством интерлейкина 6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 0,1, 1 и 10 мкг/мл Oligonol(tm), 100 мкМ олеуропеина или их комбинациями;
на фиг. 4 показан ответ посредством интерлейкина 6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 10 мкг/мл Oligonol(tm) и 1 и 10 мкМ тирозола или их комбинациями;
на фиг. 5 показан ответ посредством интерлейкина 6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 10 мкг/мл Oligonol(tm) и 0,1, 1 и 10 мкМ гидрокситирозола или их комбинациями; и
на фиг. 6 показана гемоксигеназа 1 (НО-1) (пг в расчете на мкг белка) в качестве контроля (необработанные человеческие эндотелиальные клетки пуповинной вены); 2 и 4 мкг/мл Oligonol(tm); 5, 10 и 20 мкг/мл Aquasol(tm) (обозначен "Olive" на фигуре) и их комбинации.
Подробное описание изобретения
Пероральные композиции по изобретению могут быть в форме капсул, пилюль, таблеток, гранул, растворов, суспензий или эмульсий. Количество водно-этанольного экстракта Olea europaea, или олеуро-пеина, или композиции, содержащей в качестве ее главного компонента проантоцианидиновый олиго-мер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резор
циновую кольцевую структуру, который получен нагреванием растительных материалов, содержащих проантоцианидиновый полимер, или их экстракта, содержащего проантоцианидиновый полимер, с веществом, имеющим флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, в кислотном водном растворе, в капсуле, пилюле или таблетке не будет превышать рекомендуемый суточный предел для взрослого индивидуума. Получение композиций по изобретению в указанных выше пе-роральных формах хорошо известно специалисту в данной области. Пример 1. Схема экспериментального подхода.
Была разработана in-vitro модель для исследования вклада окислительного стресса в воспалительный статус клеток фибробластов кожи, в которой:
a) клетки выращивают в 6-луночных (9,5 см2) планшетах;
b) клетки подвергают окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА);
c) супернатант клеточной культуры и осадки клеток собирают через 24 ч (t24) после РМА-обработки;
d) весь супернатант клеточной культуры анализируют на лактатдегидрогеназу (LDH) в качестве меры цитотоксичности и синтеза интерлейкина 6 (IL-6).
Культивирование дермальных клеток.
Первичные человеческие клетки фибробластов кожи культивировали и пересеивали в модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM) (Gibco), дополненную 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки стандартным образом адсорбировали на 6-луночных чашках для тканевой культуры с плотностью засева ~5000 клеток/см2 в 2 мл полной среды/лунка в течение 24 ч и инкубировали при 37°С в 5% СО2. Среды удаляли, и клетки выращивали в DMEM и 1% FBS 24 ч перед обработками.
Добавление тестируемых растворов.
Тестируемые растворы готовили в DMEM, содержащей 1% FBS. Фибробласты кожи подвергали окислительному стрессу в течение 24 ч 1 мкМ РМА (Sigma P8139) в присутствии тестируемых растворов. Обработанный супернатант (супернатант клеточной культуры) удаляли и хранили при -20°С перед анализом IL-6 и LDH.
Фибробласты кожи промывали 500 мкл забуференного фосфатом раствора Дульбекко (PBS) и добавляли 1 мл раствора трипсин/EDTA (Invitrogen), и планшет инкубировали при 37°С пока клетки не откреплялись. Клетки затем немедленно центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин, и суперна-тант сливали. Полученный в результате осадок клеток промывали 500 мкл PBS и центрифугировали, как указано выше. Затем супернатант сливали, и осадок клеток хранили при -20°С перед клеточным лизисом (для количественного определения белка).
Все осадки клеток лизировали на льду в 1 мл буфера для клеточного лизиса в расчете на 2,5х106 клеток. Буфер для лизиса содержал 1% нонилфеноксиполиэтоксилэтанола (Tergitol-type NP-40), 0,1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 6 мМ хлорида натрия и 0,05М трисгидрок-симетиламинометана при рН 7,6. Коктейль ингибиторов протеаз (1000Х; Sigma P8340) добавляли перед применением при концентрации 10 мкл/мл буфера для лизиса. Частично лизированные осадки клеток полностью гомогенизировали с помощью пестика для растирания, и ненужный клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 20 мин при 20000g при 4°С. Осветленный клеточный лизат замораживали при -80°С до его применения.
Супернатант клеточной культуры проверяли на цитотоксичность с использованием нерадиоактивного набора для анализа цитотоксичности Promega CytoTox 96. Этот анализ количественно измеряет лак-татдегидрогеназу (LDH), высвободившуюся при клеточном лизисе, и является подходящим для индикации жизнеспособности клетки. 50 мкл супернатанта клеточной культуры или контрольной среды добавляли в дублирующие лунки 96-луночного планшета. Добавляли 50 мкл реагента CytoTox и тщательно перемешивали. Планшет инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин, затем добавляли 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку, и поглощение планшета считывали при 492 нм. Любые тестируемые образцы, демонстрирующие значение поглощения, более чем в два раза большее, чем у контрольной среды, считались цитотоксичными. Не включены какие-либо из результатов для образцов, которые демонстрировали любые признаки цитотоксичности.
Общую концентрацию белка каждого осветленного клеточного лизата измеряли с использованием набора для белкового анализа Pierce BCA так, что ответ на эффект тестируемых веществ мог быть нормализован к мкг белка. Готовили набор из восьми стандартных растворов, варьировавших от 0 до 1200 мкг/мл белка из входящего в комплект стокового раствора 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA). 10 мкл стандарта или клеточного лизата добавляли в дублирующие лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Раствор реагента готовили в соответствии с инструкциями к набору из 50 частей реагента А и 1 части реагента В. 200 мкл полученного в результате реагента добавляли в каждую лунку. Планшет перемешивали, закрывали и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, и считывали поглощение при 562 нм. Строили калибровочную кривую белка и использовали ее для определения концентрации белка в каждом клеточном лизате.
Концентрацию IL-6 в каждом супернатанте клеточной культуры анализировали с использованием набора для анализа человеческого IL-6 QuantiGlo Q6000 (R &D Systems) в соответствии с инструкциями
производителя. Шесть стандартов IL-6 готовили в калибровочном разбавителе с концентрациями, варьирующими от 0 до 3000 пг/мл. 50 мкл разбавителя для анализа и 150 мкл супернатанта клеточной культуры или стандарта добавляли в дублирующие лунки. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч на горизонтальном орбитальном планшетном встряхивателе (около 500 об/мин) перед четырехкратным промыванием промывочным буфером. 200 мкл коньюгата IL-6 добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч на горизонтальном орбитальном планшетном встряхивателе (около 500 об/мин). Планшет промывали, как указано выше. В каждую лунку вносили 200 мкл субстратного раствора, и планшет инкубировали при комнатной температуре 40 мин. Относительную световую единицу (ОСЕ) каждой лунки определяли с использованием набора с люмино-метром со временем задержки 1 мин, временем считывания 1 с/лунка, режимом суммирования и автоматическим усилением. Строили калибровочную кривую средней ОСЕ в зависимости от концентрации IL-6 и линию наилучшего соответствия, рассчитанную регрессионным анализом, и исходя из этого оценивали неизвестную концентрацию белка IL-6 во всех образцах.
На фиг. 1 показан ответ посредством IL-6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 10 мкг/мл Oligonol(tm), 100 мкг/мл Aquasol(tm) или обоими. Таким образом, когда первичные фибробласты кожи обрабатывали РМА, известным провоспалительным средством, уровень экспрессиро-ванного IL-6 являлся значительным. При последующей обработке Oligonol(tm) или Aquasol(tm) отмечали значительное снижение экспрессии IL-6. Однако когда первичные фибробласты кожи последовательно обрабатывали комбинацией Oligonol(tm) и Aquasol(tm), наблюдали значительное (р=0,006) синергическое снижение экспрессии IL-6. Таким образом, можно предположить, что такая комбинация будет пригодна для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
Как указано выше, IL-6 является провоспалительным цитокином и характерным маркером воспаления при сердечно-сосудистом заболевании. Считается, что как Oligonol(tm), так и Aquasol(tm) активирует ряд различных рецепторов и воспалительные метаболические пути синергическим образом и можно ожидать, что такая комбинация будет пригодна для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
Пример 2.
На фиг. 2 показан ответ посредством П^-6(пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 0,1, 1 и 10 мкг/мл Oligonol(tm), 100 мкг/мл Aquasol(tm) или их комбинациями. Таким образом, когда первичные фибробласты кожи обрабатывали РМА, известным провоспалительным средством, имел место значительный уровень экспрессированного IL-6. При последующей обработке Oligonol(tm) или Aquasol(tm) отмечалось небольшое снижение экспрессии IL-6. Однако когда первичные фибробласты кожи последовательно обрабатывали комбинациями Oligonol(tm) и Aquasol(tm), наблюдались значительные (р=0,16, 0,35 и 0,015) синергические уменьшения экспрессии IL-6. Таким образом, можно ожидать, что такая комбинация будет пригодна для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
Как указано выше, IL-6 является провоспалительным цитокином и характерным маркером воспаления при сердечно-сосудистом заболевании. Считается, что как Oligonol(tm), так и Aquasol(tm) активирует ряд различных рецепторов и воспалительные метаболические пути синергическим образом, и можно ожидать, что такая комбинация будет пригодна для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
Пример 3.
На фиг. 3 показан ответ посредством IL-6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 0,1, 1 и 10 мкг/мл Oligonol(tm), 10 мкМ олеуропеина или их комбинации. Таким образом, когда первичные фибробласты кожи обрабатывали РМА, известным провоспалительным средством, имел место значительный уровень экспрессированного IL-6. При последующей обработке Oligonol(tm) или олеуропеином отмечалось небольшое снижение экспрессии IL-6. Однако когда первичные фибробласты кожи последовательно обрабатывали комбинациями Oligonol(tm) и олеуропеина, наблюдалось значительное (р=0,025) синергическое снижение экспрессии IL-6 для комбинации 0,1 мкг/мл Oligonol(tm) и 10 мкМ олеуропеина, хотя уменьшения также были видны с комбинацией 1 мкг/мл Oligonol(tm) и 10 мкМ олеуро-пеина и 10 мкг/мл Oligonol(tm) и 10 мкМ олеуропеина. Таким образом, можно ожидать, что такая комбинация будет пригодна для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
Как указано выше, IL-6 является провоспалительным цитокином и характерным маркером воспаления при сердечно-сосудистом заболевании. Считается, что как Oligonol(tm), так и Aquasol(tm) активирует ряд различных рецепторов и воспалительные метаболические пути синергическим образом и можно ожидать, что такая комбинация будет пригодна для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого
заболевания или осложнений гипертензии у человека. Как указано выше, олеуропеин является важным составляющим Aquasol(tm) и к настоящему времени идентифицирован как, по меньшей мере, частично ответственный за синергическую понижающую регуляцию IL-6, обнаруживаемую при комбинировании
Oligonol(tm) и Aquasol(tm).
Пример 4.
Так как гидроксилтирозол является важным компонентом Aquasol(tm), тирозол также тестировали с Oligonol(tm). На фиг. 4 показан ответ посредством IL-6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фиброб-ластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 10 мкг/мл Oligonol(tm) и 1 и 10 мкМ тирозола или их комбинациями. Таким образом, когда первичные фибробласты кожи обрабатывали РМА, известным провоспалительным средством, имел место значительный уровень экспрессированного IL-6. При последующей обработке Oligonol(tm) отмечалось снижение экспрессии IL-6. Однако когда первичные фибробласты кожи последовательно обрабатывали комбинациями Oligonol(tm) и тирозола, не наблюдалось какого-либо значительного синер-гического снижения экспрессии IL-6 для любой комбинации.
Пример 5.
На фиг. 5 показан ответ посредством IL-6 (пг в расчете на мкг белка) для первичных фибробластов кожи, подвергнутых окислительному стрессу 1 мкМ форболмиристатацетата (РМА), последовательно обработанных 10 мкг/мл Oligonol(tm) и 0,1, 1 и 10 мкМ гидрокситирозола или их комбинациями. Таким образом, когда первичные фибробласты кожи обрабатывали РМА, известным провоспалительным средством, имел место значительный уровень экспрессированного IL-6. При последующей обработке Oli-gonol(tm) отмечалось снижение экспрессии IL-6. Однако когда первичные фибробласты кожи последовательно обрабатывали комбинациями Oligonol(tm) и гидрокситирозола, не наблюдалось значительного си-нергического снижения экспрессии IL-6 для какой-либо комбинации.
Как указано выше, IL-6 является провоспалительным цитокином и характерным маркером воспаления при сердечно-сосудистом заболевании. Считается, что как Oligonol(tm), так и Aquasol(tm) активируют ряд различных рецепторов и воспалительные метаболические пути синергическим образом, и можно ожидать, что такая комбинация будет пригодна для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека. Как указано выше, гидрокситирозол является важным компонентом Aquasol(tm) и к настоящему времени был идентифицирован как не ответственный, по меньшей мере, сам по себе за синергическую понижающую регуляцию IL-6, обнаруживаемую при смешивании Oligonol(tm) и Aquasol(tm).
Пример 6.
Клетки Huvec, также известные как человеческие эндотелиальные клетки пуповинной вены (TCS Biologicals), культивировали и пересеивали в эндотелиальную среду для роста (EGM-2) (Biowhittaker), дополненную гепарином, фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), сульфатом гентамицина, аскорбиновой кислотой, человеческим эндотелиальным фактором роста (HEGF), гидрокортизоном (человеческий фактор роста фибробластов В (HFGF-B)), длинным R инсулиноподобным фактором роста 1 (R3-IGF-1) и фетальной бычьей сывороткой (FBS). Клетки стандартным образом адсорбировали на 6-луночных чашках для тканевой культуры с плотностью посева ~5000 клеток/см2 в 2 мл полной среды в расчете на лунку за 24 ч перед началом эксперимента и инкубировали при 37°С в 5% СО2.
Сосудистый эндотелий, который покрывает внутреннюю сторону кровеносных сосудов, является одной из самых больших секреторных тканей организма. Клетки Huvec, также известные как человеческие эндотелиальные клетки пуповинной вены, применяются в качестве in-vitro модели, как описано Bachettia et al. (Pharmacological Research, 42, 1 (2000)), для исследования потенциала различных ингредиентов для содействия предотвращению и/или терапии сердечно-сосудистых заболеваний.
Клетки обрабатывали 5 мкМ 4-гидроксиноненалем и водными растворами тестируемых веществ в течение 24 ч, и затем измеряли уровень гемоксигеназы 1.
Клетки собирали добавлением 1 мл раствора трипсин/EDTA (Invitrogen) и инкубировали при 37°С до открепления. Затем клетки немедленно центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин, и су-пернатант сливали. Полученный в результате осадок клеток промывали 500 мкл раствора фосфатного буфера Дульбекко (PBS) и центрифугировали, как указано выше. Супернатант сливали, как указано выше, и осадок клеток хранили при -20°С перед клеточным лизисом.
Все осадки клеток лизировали на льду в течение 30 мин в 1 мл буфера для клеточного лизиса в расчете на 2,5х106 клеток. Буфер для лизиса содержал 1% нонилфеноксиполиэтоксилэтанола (Tergitol-type NP-40), 0,1% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 6 мМ хлорида натрия и 0,05М трисгидроксиметиламинометана при рН 7,6. Коктейль ингибиторов протеаз (1000Х; Sigma P8340) добавляли перед применением при концентрации 10 мкл/мл буфера для лизиса. Частично лизированные осадки клеток полностью гомогенизировали пестиком для растирания, и ненужный клеточный дебрис удаляли центрифугированием в течение 20 мин при 20000g при 4°С. Осветленный клеточный лизат замораживали при -80°С до его применения.
Клеточный лизат проверяли на цитотоксичность, и общую концентрацию белка для каждого кле
точного лизата измеряли, как описано выше в примере 1.
Клеточный лизат Huvec разводили разбавителем для образцов, и 100 мкл переносили на предварительно покрытый антителом против человеческой гемоксигеназы 1 планшет для иммуноанализа (Анализ assay Designs). 7-точечную стандартную кривую рекомбинантной гемоксигеназы 1, варьирующую от 25 до 0,39 нг/мл, также готовили в разбавителе для образцов. Планшет для иммуноанализа инкубировали при комнатной температуре 30 мин, промывали шесть раз промывочным буфером и инкубировали в течение дополнительных 60 мин при комнатной температуре с 100 мкл/лунка раствора антитела против гемоксигеназы 1. Планшет промывали, как указано выше, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 100 мкл/лунка раствора конъюгата с пероксидазой хрена. Планшет снова промывали, как указано выше, и 100 мкл/лунка субстрата тетраметилбензидина добавляли в каждую лунку и выдерживали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. После добавления 100 мкл/лунка стоп-реагента считывали поглощение при 450 нм, и неизвестные из биопсии уровни гемоксигеназы 1 экстраполировали из калибровочной кривой.
На фиг. 6 показана гемоксигеназа 1 (НО-1) (пг в расчете на мкг белка) в качестве контроля (необработанные человеческие эндотелиальные клетки пуповинной вены); 2 и 4 мкг/мл Oligonol(tm); 5, 10 и 20 мкг/мл Aquasol(tm) (обозначен "Olive" на фигуре) и их комбинации. Комбинация Oligonol(tm) и Aquasol(tm), как оказалось, значительно и синергически увеличивает уровни гемоксигеназы 1.
Murashima et al. (Biofactors, 22, 1-4, 271-5 (2004)) описывают, что полученные из эритроидного ядерного фактора 2 (Nrf2) факторы транскрипции опосредуют окисление липопротеина низкой плотности (ЛПНП). Marco et al. (N. Engl. J. Med., 337, 408-416 (1997)) описывают, как атеросклероз развивается от того, что ЛПНП становятся окисленными свободными радикалами, чрезвычайно активными формами кислорода. Следовательно, активация Nrf2 факторов транскрипции должна привести к ингибированию окисления ЛПНП. Lee et al. (Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 37, 2, 139-143 (2004)) описывает ферменты, индуцируемые Nrf2 факторами транскрипции, включая гемоксигеназу-1 (НО-1). Таким образом, гемоксигеназа-1 (НО-1) является индикатором или конечным маркером Nrf2 активации и, следовательно, можно ожидать, что синергическая повышающая регуляция НО-1 на Oligonol(tm) и Aquasol(tm) приведет к синергическому снижению ЛПНП окисления, опосредованно снижая начало атеросклероза.
Гемоксигеназа 1 может быть активирована с использованием ряда различных путей (посредством индукции экспрессии гена Nrf2 и ядерной транслокации). Nrf2 факторы транскрипции повышающим образом регулируют матричную рибонуклеиновую кислоту (мРНК), белок и активность для НО-1, и полагают, что как Oligonol(tm), так и Aquasol(tm) направляет и активирует различные части метаболического пути Nrf2. Результаты в настоящее время демонстрируют, что такая повышающая регуляция происходит синергическим образом, например посредством конформационных изменений или увеличений фосфори-лирования, что может привести к увеличению ядерной транслокации Nrf2.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пероральная композиция для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии, содержащая
водно-этанольный экстракт Olea europaea, или олеуропеин, и
композицию, содержащую в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, где указанная композиция получена нагреванием растительного материала, являющегося экстрактом, полученным из комбинации плодов Lychi chinensis и зеленых листьев Camellia sinensis в кислотном водном растворе.
2. Композиция по п.1, содержащая 10-5000 мг водно-этанольного экстракта Olea europaea и 10-5000 мг композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру.
3. Композиция по п.2, где количество водно-этанольного экстракта Olea europaea составляет 502500 мг.
4. Композиция по п.2, где количество водно-этанольного экстракта Olea europaea составляет 100300 мг.
5. Композиция по п.2, где количество композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, составляет 50-2500 мг.
6. Композиция по п.2, где количество композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую кольцевую структуру, составляет 100-300 мг.
7. Композиция по любому из пп.1-6, где массовое отношение водно-этанольного экстракта Olea eu-ropaea к композиции, содержащей в качестве основного компонента проантоцианидиновый олигомер, к которому присоединено вещество, имеющее флороглюциновую кольцевую структуру или резорциновую
2.
кольцевую структуру, составляет от 10:1 до 1000:1.
8. Композиция по п.7, где указанное массовое отношение составляет от 10:1 до 100:1.
9. Композиция по п.1, где указанная композиция, полученная нагреванием растительного материала, являющегося экстрактом, полученным из комбинации плодов Lychi chinensis и зеленых листьев Camellia sinensis в кислотном водном растворе, представляет собой Oligonol(tm).
10. Способ предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипер-тензии у человека, включающий стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, композиции по любому из пп. 1-9.
11. Применение композиции по любому из пп.1-9 для предотвращения или лечения сердечнососудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
12. Применение композиции по любому из пп.1-9 для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения сердечно-сосудистого заболевания или осложнений гипертензии у человека.
Первичные дермальные фибробласты • изменения IL-6
Олигонол+гидрокситирозол
О с; s
О ц. s
s о
> p = о
О с;
о ^
о к
° 1
с; о un 2
<и о
?i Si
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
026079
- 1 -
(19)
026079
- 1 -
(19)
026079
- 1 -
(19)
026079
- 4 -
(19)
026079
- 11 -
026079
- 12 -
026079
- 12 -