EA 026058B1 20170228

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000026058b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ получения жидкой вакцинной композиции, содержащей, по меньшей мере: оксигидроксид алюминия (AlOOH); один поверхностный антиген гепатита В (HBsAg); один антиген Haemophilus influenzae типа b (Hib), состоящий из полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (PRP-T); в которой поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, тогда как антиген Hib сохраняется неадсорбированным, согласно которому поверхностный антиген гепатита В адсорбируют на AlOOH для получения комплекса AlOOH/HBsAg; указанный комплекс AlOOH/HBsAg смешивают с антигеном Hib в присутствии аминокислот, которые находятся в вакцинной композиции в катионной форме, в концентрации от 100 до 2 мг/мл и фосфатных ионов в концентрации от 35 до 45 ммоль/л.

2. Способ по п.1, где антиген HBsAg адсорбируют на алюминии смешиванием суспензии AlOOH с суспензией HBsAg при перемешивании в течение по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, предпочтительно от 20 до 24 ч.

3. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что катионные аминокислоты добавляют к указанному комплексу AlOOH/HBsAg до смешивания с антигеном Hib.

4. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что катионные аминокислоты добавляют к указанному антигену Hib до смешивания с комплексом AlOOH/HBsAg.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фосфатные ионы добавляют к указанному комплексу AlOOH/HBsAg до смешивания с антигеном Hib.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что рН препарата, содержащего комплекс AlOOH/HBsAg, доводят до 7,1+0,1 до смешивания с антигеном Hib.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что он также включает получение композиции, содержащей по меньшей мере один антиген, выбранный из антигенов дифтерии, столбняка, полиомиелита и коклюша, а также оксигидроксид алюминия; смешивание указанного комплекса AlOOH/HBsAg с указанной композицией до проведения смешивания с антигеном Hib.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что он включает получение указанной композиции путем последовательного добавления каждого из антигенов к суспензии оксигидроксида алюминия и перемешивания после добавления каждого антигена.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что HBsAg адсорбируют на частичном количестве AlOOH, представляющем одну треть от общего AlOOH, содержащегося в конечной композиции, в течение периода от 20 до 24 ч для получения комплекса AlOOH/HBsAg; параллельно на дополнительном количестве AlOOH последовательно адсорбируют дифтерийный токсин D, столбнячный токсин Т, очищенный токсин PTxd Bordetella pertuss, в свою очередь, предварительно адсорбированный на AlOOH, и фимбриальный гемагглютинин FHA Bordetella pertussis, в свою очередь, предварительно адсорбированный на AlOOH, затем к ним добавляют фосфатные ионы, затем к ним добавляют комплекс AlOOH/HBsAg; снова добавляют фосфатные ионы в количестве, обеспечивающем получение концентрации в конечной композиции 40 ммоль/л; добавляют по меньшей мере одну катионную аминокислоту в количестве, обеспечивающем получение концентрации в конечной композиции по меньшей мере 100 мг/л; рН доводят до 7,1 ±0,1; добавляют антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов 1 типа 1 и/или 2 типа, и/или 3 типа; добавляют антиген Hib; рН доводят до 7,1+0,1; получаемую композицию распределяют в шприцы или во флаконы.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что в промышленном масштабе получают по меньшей мере 250 л вакцинной композиции.

11. Вакцинная композиция, полученная способом по любому из пп.1-10 и содержащая, по меньшей мере, оксигидроксид алюминия (AlOOH), поверхностный антиген гепатита В (HBsAg) и антиген Hib, который состоит из полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (PRP-T).

12. Вакцинная композиция по п.11, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антигены дифтерии, столбняка, полиомиелита и коклюша.

13. Вакцинная композиция по любому из пп.11 или 12, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере: поверхностный антиген гепатита В, HBsAg; антиген дифтерии в форме дифтерийного токсина D; антиген столбняка в форме столбнячного токсина Т; антигены коклюша в форме очищенного токсина (PTxd) и фимбриального гемагглютинина (FHA); антиген Haemophilus influenzae типа b в форме полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (FRP-T); антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов, выбираемых из типов 1, 2 и 3.

14. Вакцинная композиция по п.13, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере: от 10 до 30 мкг HBsAg/мл, предпочтительно 20 мкг/мл; от 40 до 80 Lf D/мл, предпочтительно от 50 до 70 Lf/мл; от 10 до 50 Lf Т/мл, предпочтительно от 10 до 30 Lf/мл; от 40 до 60 мкг FHA/мл, предпочтительно 50 мкг/мл; от 40 до 60 мкг PTxd/мл, предпочтительно 50 мкг/мл; от 2 до 60 мкг PRP/мл, предпочтительно 20-24 мкг/мл в форме конъюгата PRP-T; от 1 до 2 мг AlOOH/мл, предпочтительно 1,2 мг AlOOH/мл; от 35 до 45 ммоль/л, предпочтительно от 38 до 42 ммоль/л фосфатных ионов; от 100 до 1000 мг/л катионных аминокислот, предпочтительно от 400 до 800 мг/л; 1, 2 и 3 типы поливируса в инактивированной форме в соответствующем количестве 80, 16 и 64 DU/мл, где Lf обозначает предел флокуляции.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское 026058 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201491387
(22) Дата подачи заявки
2013.01.17
(51) Int. Cl.
A61K39/295 (2006.01) A61P31/04 (2006.01) A61P31/12 (2006.01)
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИННОЙ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА B И АНТИГЕН HAEMOPHILUS INFLUENZAE ТИПА B
(31) 1250464
(32) 2012.01.17
(33) FR
(43) 2014.12.30
(86) PCT/FR2013/050106
(87) WO 2013/107988 2013.07.25
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
САНОФИ ПАСТЕР (FR)
(72) Изобретатель:
Берто Ландри, Шакорнак Изабелль, Франсон Ален, О Жан-Франсуа, Лентш Граф Cандрин (FR)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-9913906 WO-A1-03009869 EP-A1-1416958
STURGESS A.W. ET AL.: "Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine stability: catalytic depolymerization of PRP in the presence of aluminum hydroxide", VACCINE, ELSEVIER LTD., GB, vol. 17, no. 9-10, 5 March 1999 (1999-03-05), pages 1169-1178, XP004158240, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/S0264-410X(98)00337-5, the whole document
(57) Объектом изобретения является способ получения вакцинной композиции, содержащей, по меньшей мере, оксигидроксид алюминия (AlOOH), по меньшей мере, поверхностный антиген гепатита В и антиген Haemophilus influenzae типа b. В соответствии с изобретением поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, тогда как антиген Hib сохраняется неадсорбированным. С этой целью поверхностный антиген гепатита В адсорбируют на AlOOH для получения комплекса AlOOH/HBsAg, затем указанный комплекс AlOOH/HBsAg смешивают с антигеном Hib в присутствии катионных аминокислот в концентрации по меньшей мере 100 мг/л и фосфатных ионов в концентрации от 35 до 45 ммоль/л.
Изобретение относится к области комбинаций вакцин, содержащих одновременно валентность гепатита В, состоящую из поверхностного антигена (HBsAg) вируса гепатита В и валентности Haemophilus influenzae типа b, состоящей из ее капсулярного полисахарида, называемого полирибозилрибитолфосфат (PRP), который, для того чтобы он являлся эффективным у детей в возрасте менее двух лет, конъюгиру-ют с белком-носителем, например столбнячным белком.
Такие композиции, которые предназначены для введения детям раннего возраста, как правило, содержат другие антигены, обеспечивающие возможность вакцинации за одну операцию против нескольких заболеваний, а также адъювант на основе алюминия.
Таким образом, в патентной заявке WO 99/13906 описана вакцинная композиция, содержащая, как описано на с. 13, антигены против дифтерии, столбняка, полиомиелита, коклюша, гепатита В и инфекций Haemophilus influenzae типа b. Для того чтобы некоторые из этих антигенов являлись иммуногенными, их необходимо адсорбировать на соли алюминия. В частности, это является случаем поверхностного антигена гепатита В или HBsAg.
Однако, как указано на с. 12 заявки WO 99/13906, валентность Hib, состоящая из капсулярного полисахарида, конъюгированного со столбнячным белком, как правило, теряет свою иммуногенность в течение периода времени, когда ее адсорбируют на солях алюминия. Во избежание этого недостатка решение, предлагаемое в этом известном уровне техники, которое уже рекомендовали в предшествующей заявке PCT/FR96/00791, заключается в добавлении анионов и, в частности, фосфатных, карбонатных или цитратных ионов.
Однако авторы настоящего изобретения отметили, что в то время как добавление ионов, в частности фосфатов или карбонатов, позволяет эффективно предотвращать адсорбцию PRP-T на оксигидрокси-де алюминия (AlOOH) и, таким образом, сохранять его иммуногенность в течение длительного периода времени, такое добавление также имеет недостаток, заключающийся в десорбции поверхностного антигена гепатита В, когда последний также адсорбировали на оксигидроксиде алюминия.
Таким образом, необходимо найти способ получения комбинации вакцин, содержащей оксигидрок-сид алюминия, в которой поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, тогда как антиген Hib сохраняется в неадсорбированном состоянии.
С этой целью объектом настоящего изобретения является способ получения жидкой комбинации вакцин, содержащей по меньшей мере
один поверхностный антиген гепатита В (HBsAg);
один антиген Haemophilus influenzae типа b (Hib), состоящий из капсулярного полисахарида, конъ-югированного с белком-носителем;
оксигидроксида алюминия (AlOOH);
в которой поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, тогда как антиген Hib сохраняется в неадсорбированном состоянии;
где антиген гепатита В адсорбируют на AlOOH для получения комплекса поверхностный
AlOOH/HBsAg;
указанный комплекс AlOOH/HBsAg смешивают с антигеном Hib в присутствии катионных аминокислот в концентрации по меньшей мере 100 мг/л и фосфатных ионов в концентрации от 35 до 45 ммоль/л.
Благодаря способу по изобретению возможно получать желаемое равновесие между поддержанием адсорбции поверхностного антигена гепатита В на оксигидроксиде алюминия и сохранения в неадсорби-рованном состоянии антигена Hib.
Согласно одному конкретному варианту осуществления изобретения антиген HBsAg адсорбируют алюминий, смешивая суспензию AlOOH с суспензией HBsAg при перемешивании в течение по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, предпочтительно от 20 до 24 ч.
Согласно одному частному варианту осуществления изобретения перед смешиванием с антигеном Hib к указанному комплексу AlOOH/HBsAg добавляют катионные аминокислоты.
Согласно альтернативному варианту осуществления изобретения перед смешиванием с комплексом AlOOH/HBsAg к указанному антигену Hib добавляют катионные аминокислоты.
По одному из вариантов осуществления изобретения перед смешиванием с антигеном Hib к указанному комплексу AlOOH/HBsAg добавляют фосфатные ионы.
По одному из вариантов осуществления изобретения перед смешиванием с антигеном Hib регулируют рН препарата, содержащего комплекс AlOOH/HBsAg, до 7,1±0,1.
Объектом изобретения также является вакцинная комбинация, получаемая заявленным в формуле изобретения способом и содержащая по меньшей мере:
поверхностный антиген гепатита В;
антиген дифтерии в форме дифтерийного токсина D;
антиген столбняка в форме столбнячного токсина Т;
антигены коклюша в форме очищенного токсина (PTxd) и фимбриального гемагглютинина (FHA); антиген Haemophilus influenzae типа b в форме полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (PRP-T);
антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов типа 1, 2 и 3.
Такая вакцинная композиция обладает преимуществом, которое заключается в том, что она находится в жидкой форме, что позволяет избегать операции получения лиофилизата, было доказано, что она является достаточно стабильной, чтобы оставаться иммуногенной до суток ее использования, и даже через 36 месяцев после даты ее производства.
По изобретению вакцинная композиция содержит поверхностный антиген гепатита В (HBsAg). В частности, этот антиген может представлять собой поверхностный антиген гепатита В, такой как антиген, содержащийся в вакцине Recombivax HB(tm), или в любой другой вакцине против гепатита В. В частности, он может представлять собой рекомбинантый антиген, получаемый ферментацией дрожжей Han-senula polymorpha, модифицированных способом, разработанным Crucell, такой как антиген, содержащийся в вакцине Hepavax-Gene(tm). Для целей изобретения количество HBsAg, содержащегося в 0,5-мл дозе, преимущественно составляет от 5 до 15 мкг и, в частности, 10 мкг.
По изобретению вакцинная композиция содержит антиген Haemophilus influenzae типа b (Hib). Этот антиген состоит из капсулярного полисахарида бактерии или полирибозилрибитолфосфата (PRP), который конъюгирован с белком-носителем. Белок-носитель может представлять собой любой белок, используемый в этом отношении в области вакцин. Он может представлять собой, например, дифтерийный токсин D, столбнячный токсин Т, липопротеин D Haemophilus influenzae, CRM197 или белок наружной мембраны N. meningitidis (OMP). Для получения PRP-T конъюгата предпочтительно используют столбнячный белок. Для целей настоящего изобретения конъюгат PRP-T может содержаться в пропорции от 1 до 30 мкг PRP в 0,5-мл дозе, преимущественно от 5 до 25 мкг PRP в дозе, предпочтительно от 10 до 15 мкг PRP в дозе, наиболее предпочтительно от 10 до 12 мкг PRP в дозе и более конкретно 12 мкг PRP, конъюгированного с 22-36 мкг столбнячного белка.
По изобретению вакцинная композиция содержит оксигидроксид алюминия AlOOH. Эту соль алюминия очень часто неправильно называют гидроксидом алюминия. AlOOH, который можно использовать для целей настоящего изобретения, может представлять собой, например, соль AlOOH, поставляемую Brenntag AG, или Rehydragel HPA от Reheis Corp. (Berkeley Heights, NJ), несмотря на то, что способ получения каждого из двух адъювантов различается. Количество используемого AlOOH рассчитывают таким образом, чтобы обеспечивать получение достаточного иммунного ответа, в частности он зависит от числа и природы антигенов, содержащихся в композиции, а также от количества каждого из этих антигенов.
Только в качестве информации максимальная адсорбция HBsAg на AlOOH составляет приблизительно 780 мкг белка на 1 мг алюминия (общепринято количество AlOOH выражают как количество алюминия Al3+). Для дозы вакцины, содержащей 10 мкг HBsAg без других дополнительных антигенов, таким образом, будет достаточно 13 мкг алюминия, количество, которое, тем не менее, является недостаточным для получения желаемой эффективности, когда добавляют другие антигены. Таким образом, в зависимости от добавления одного или более дополнительных антигенов 10 мкг HBsAg можно приводить в контакт с от 0,01 до 1,25 мг алюминия, что является максимальным количеством, рекомендуемым европейской фармакопеей.
Например, 0,5-мл доза вакцины для детей, содержащей антигены дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В, может общепринято содержать от 0,5 до 0,7 мг алюминия, предпочтительно приблизительно 0,6 мг алюминия.
По изобретению поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, что означает, что по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% от общего количества такого антигена, содержащегося в композиции, находится в адсорбированной форме.
По изобретению антиген Hib сохраняется неадсорбированным на AlOOH, что означает, что по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75% от общего количества этого антигена, содержащегося в композиции, содержится в неадсорбированной форме.
По изобретению период времени, во время которого поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, и антиген Hib сохраняется неадсорбированным, составляет по меньшей мере 3 месяца, предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 12 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 18 месяцев, предпочтительно по меньшей мере 24 емсяца, более предпочтительно по меньшей мере 36 месяцев, начиная от даты производства композиции, когда температура хранения составляет 5±3°С. Предпочтительно количество адсорбированных или неадсорби-рованных антигенов является стабильным в течение длительного периода времени, но оно также может изменяться, при условии, что оно остается в приемлемых пределах. Таким образом, когда по меньшей мере 85% от общего количества HBsAg, содержащегося в композиции, адсорбировано на AlOOH в течение 3 месяцев, начиная с даты производства композиции, хранимой при температуре 5±3°С, также воз
можным является то, что после одного года и также при аналогичных условиях хранения 8 0% от общего количества HBsAg, содержащегося в композиции, сохраняется адсорбированным.
Для оценки количество адсорбированного антигена специалисты в данной области могут использовать любой известный способ.
Касательно определения процента адсорбции HBsAg можно использовать способ сэндвич-ELISA в соответствии с правилами, установленными European pharmacopeia 2.7.1. В кратком изложении HBsAg захватывается первичным моноклональным антителом против HBsAg типа IgM в лунках 96-луночного планшета. Связанный таким образом HBsAg покрывают вторичным моноклональным антителом против HBsAg типа IgG, которое в свою очередь детектируют посредством связанного с пероксидазой поликло-нального антитела против IgG. Хромогенный субстрат для пероксидазы тетраметилбензидин (ТМВ) служит в качестве проявляющего средства. При его добавлении проявляется окраска, интенсивность которой является пропорциональной количеству HBsAg, захваченного в лунке. Результаты анализируют способом параллельных линий, описанным в European pharmacopeia 5.3.3. Процент адсорбции получают на основании определения общего содержания HBsAg и содержания неадсорбированного HBsAg.
Касательно количества неадсорбированного PRP-T можно проводить оценку посредством HPAEC-PAD (высокоэффективной ионообменной хроматографией - импульсной амперометрической детекцией).
В соответствии со способом по изобретению поверхностный антиген гепатита В адсорбируется на AlOOH. Этот этап можно проводить, приводя поверхностный антиген гепатита В и AlOOH в контакт при отсутствии любого другого антигена и оставляя поверхностный антиген гепатита В адсорбироваться на AlOOH в течение по меньшей мере 4 ч, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, более предпочтительно от 20 до 24 ч, таким образом, чтобы получать препарат, содержащий комплекс AlOOH/HBsAg. По изобретению такую адсорбцию можно проводить при отсутствии фосфатных ионов. Цель, преследуемая путем увеличенного времени контактирования поверхностного антигена гепатита В и AlOOH, заключается в максимальном увеличении электростатических взаимодействий и в обеспечении стабильных взаимодействий, которые могут, таким образом, приводить к адсорбции путем замещения лиганда. Это контактирование преимущественно проводят при перемешивании.
В соответствии со способом по изобретению комплекс AlOOH/HBsAg смешивают с антигеном Hib в присутствии катионных аминокислот и фосфатных ионов.
Для целей изобретения термин "катионные аминокислоты" предназначен для обозначения аминокислот, рН которых является выше чем рН вакцинной композиции и которые, таким образом, находятся в катионной форме при рН вакцины, в частности они представляют собой лизин (Lys), аргинин (Arg) или гистидин (His); каждую из этих аминокислот можно использовать отдельно, в виде смеси по 2 (Lys+Arg; Lys+His; Arg+His) или все 3 вместе (Lys+Arg+His). В одном конкретном варианте осуществления кати-онные аминокислоты могут быть ассоциированы в форме дипептида. В частности, можно указать дипеп-тиды Lys-Lys, Lys-Arg, Lys-His, Arg-Arg, Arg-Lys, Arg-His, His-His, His-Lys и His-Arg. Альтернативно, дипептид, пригодный для целей настоящего изобретения, может состоять из катионной аминокислоты и незаряженной аминокислоты, выбранной из Ala, Val, Leu, Iso, Pro, Met, Phe, Trp, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp и Gin. Таким образом, на практике можно использовать препарат, содержащий одну или более кати-онных аминокислот в свободной форме и/или форме дипептида. Также возможно использовать препараты аминокислот, содержащие катионные аминокислоты в желаемом количестве, в виде смеси с другими аминокислотами. Для того, чтобы не получать слишком большое падение рН во время добавления аминокислот, можно предусматривать повышение рН препарата, содержащего аминокислоты, перед их добавлением к комплексу AlOOH/HBsAg, посредством основания, в частности гидроксида натрия.
По изобретению количество катионных аминокислот, содержащихся в конечном итоге в вакцинной композиции, должно составлять по меньшей мере 100 мг/л, преимущественно по меньшей мере 300 мг/л, преимущественно по меньшей мере 400 мг/л, более предпочтительно по меньшей мере 500 мг/л. Не существует критической максимальной дозы. Однако предпочтительно, чтобы максимальное количество составляло не более 2 мг/мл, более предпочтительно не более 1 мг/мл, более предпочтительно не более 800 мкг/мл, более предпочтительно не более 700 мкг/мл. Когда добавляют рассчитанное количество ка-тионных аминокислот, необходимо учитывать катионные аминокислоты, которые могут вводиться со средой, в которой содержатся антигены, отличные от HBsAg и антигена Hib.
В соответствии с одним из альтернативных способов можно определять количество катионных аминокислот относительно массы капсулярного полисахарида Hib и обеспечивать массовое отношение полисахарид Hib/катионная аминокислота от 1:4 до 1:100, преимущественно от 1:10 до 1:80, предпочтительно от 1:15 до 1:60 или особенно предпочтительно от 1:20 до 1:30 или 40.
В соответствии со способом по изобретению комплекс AlOOH/HBsAg смешивают с антигеном Hib в присутствии катионных аминокислот, а также в присутствии фосфатных ионов. По одному из вариантов осуществления изобретения фосфатные ионы добавляют к комплексу AlOOH/HBsAg перед тем, как их приводят в контакт с антигеном Hib. Введение фосфатных ионов можно, например, проводить путем добавления вторичного кислого фосфата натрия или вторичного кислого фосфата калия, или же в виде смеси двух. Количество фосфатных ионов рассчитывают таким образом, чтобы адсорбированным AlOOH оставалось максимальное количество поверхностных антигенов гепатита В, при этом одновре
менно предотвращая адсорбцию антигена Hib. Это количество изменяется в зависимости от природы и числа содержащихся антигенов и, в частности, в зависимости от антигенов, отличных от антигенов
HBsAg и Hib.
Таким образом, для вакцинной комбинации, содержащей антигены, обычно используемые в вакцинах для детей, которые являются в дополнение к HBsAg и антигену Hib, антигенам дифтерии, столбняка и коклюша, предпочтительным может являться добавление фосфатных ионов таким образом, что получаемая концентрация фосфатных ионов в вакцинной композиции в конечном итоге является по меньшей мере равной 35 ммоль/л и более конкретно составляет от 35 до 45 ммоль/л, включая границы, предпочтительно от 38 до 44 ммоль/л, включая границы, более предпочтительно от 38 до 42 ммоль/л, включая границы. По одному предпочтительному варианту осуществления получаемая конечная концентрация фосфатных ионов в вакцинной композиции составляет 40 ммоль/л.
По одному альтернативному варианту осуществления фосфатные ионы добавляют в таком количестве, чтобы они содержались в вакцинной композиции в конечной концентрации от 35 до 38 ммоль/л, включая границы. Это получают также добавлением карбонатных ионов, но, тем не менее, в ограниченном количестве, т.к. фактически отмечали, что избыточное количество карбонатных ионов является неблагоприятным. Преимущественно их можно добавлять в таком количестве, чтобы они содержались в вакцинной композиции в конечной концентрации, меньшей или равной 10 ммоль/л.
Во избежание избыточного ионного воздействия, которое может дестабилизировать HBsAg и способствовать его десорбции, рекомендуют добавлять фосфатные ионы несколькими (пример 2) отдельными операциями (этапами). Таким образом, фосфатные ионы можно добавлять при первой операции в количестве, которое позволяет получать конечную концентрацию от 20 до 30 ммоль/л, включая границы, затем при второй операции в количестве, которое позволяет получать конечную концентрацию, как конкретно указано выше.
По одному предпочтительному варианту осуществления способа по изобретению, кроме того, перед смешиванием антигена Hib с комплексом AlOOH/HBsAg pH получаемого препарата доводят до 7,1±0,1. Фактически отмечали, что такое значение рН оказывает положительное действие на сохранение антигена Hib в неадсорбированном состоянии.
По одному конкретному варианту осуществления, кроме того, после смешивания фаз рН доводят до 7,1+0,1.
Таким образом, способом по изобретению можно получать вакцинную композицию, в которой:
(i) по меньшей мере 60 или 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% от общего количества поверхностного антигена гепатита В, содержащегося в композиции, является адсорбированным на AlOOH в течение по меньшей мере 3 месяцев, начиная с даты производства композиции, хранящейся при температуре 5+3°С; и
(ii) по меньшей мере 65, 70 или 75% от общего количества антигена Hib, содержащегося в композиции, не является адсорбированным на AlOOH.
Выражение "комплекс AlOOH/HBsAg" следует интерпретировать, как означающее, что комплекс содержит, по меньшей мере, антиген HBsAg, адсорбированный на AlOOH. Комплекс может содержать другие антигены, несмотря на то, указаны они или не указаны.
Кроме того, один или более дополнительных антигенов могут образовывать комплекс. В частности, они могут представлять собой дифтерийный анатоксин (D), столбнячный токсин (Т), бесклеточные антигены коклюша, такие как обезвреженный токсин Bordetella pertussis (PTxd), фимбриальный гемагглюти-нин (FHA), петрактин (антиген 69 кДа) и агглютиногены (фимбрии) некоторых таких бактерий. В соответствии с одним особенно эффективным вариантом осуществления для образования комплекса можно добавлять антигены D, T, PTxd и FHA.
Дополнительные антигены можно добавлять различными способами. Их можно добавлять последовательно после поверхностного антигена гепатита В, предварительно адсорбированного (i) на общем количестве AlOOH, которое должно содержаться в вакцинной композиции, (ii) или на частичном количестве, затем добавляемом для получения общего количества. Альтернативно, дополнительные антигены можно адсорбировать раздельно, каждый на частичном количестве AlOOH, также как HBsAg. Также можно обеспечивать способ смешанной адсорбции, где некоторые антигены адсорбируют раздельно, другие адсорбируют последовательно.
По одному конкретному варианту осуществления способа по изобретению после добавления каждого антигена получаемую композицию перемешивают.
По одному предпочтительному варианту осуществления, приводимому только в качестве примера, HBsAg адсорбируют раздельно на частичном количестве AlOOH, соответствующем приблизительно 30% (одной трети) от общего количества AlOOH, содержащегося в конечной композиции. Параллельно антигены D и Т последовательно адсорбируют на дополнительной части AlOOH. Затем к препарату, содержащему комплекс A1OOH-D-T, добавляют антигены коклюша PTxd и FHA, где каждый из этих двух антигенов коклюша в свою очередь предварительно адсорбировали на AlOOH. В заключении объединяют два препарата (комплекс AlOOH-HBsAg и комплекс AlOOH-D-T-PTxd-FHA) таким образом, чтобы
получать препарат, содержащий AlOOH-HBsAg-D-T-PTxd-FHA, в котором количества каждого из элементов выбирали, чтобы получать дозы вакцин 0,5 мл, общепринято содержащие от 5 до 15 мкг HBsAg/доза, предпочтительно 10 мкг/доза;
от 20 до 40 Lf D/доза, предпочтительно от 25 до 35 Lf/доза, более предпочтительно 30 Lf/доза (Lf -предел флокуляции) (выражаемая другим образом, количество D является большим или равным 20 МЕд/доза);
от 5 до 25 Lf Т/доза, предпочтительно от 10 до 15 Lf/доза, более предпочтительно 10 Lf/доза (выражаемая другим образом, количество Т является большим или равным 40 МЕд/доза); от 20 до 30 мкг FHA/доза, предпочтительно 25 мкг/доза; от 20 до 30 мкг PTxd/доза, предпочтительно 25 мкг/доза.
В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления изобретения также добавляют антигены полиомиелита, который общепринято состоят из инактивированных вирусов. Можно предусматривать добавление 3 типов, как правило, содержащихся в вакцинах для детей, т.е. типы 1, 2 или 3, или также в случае, когда нет необходимости вакцинировать против 3 типов, вводить только типы, от которых предполагают обеспечивать защиту. Количества полиовируса в дозе, в частности, могут составлять
от 20 до 43 DU (единиц антигена D), в частности 40 для 1 типа;
от 5 до 9 DU, в частности 8 для 2 типа;
от 17 до 36 DU, в частности 32, для 3 типа.
Эти антигены необязательно предварительно адсорбируют на соли алюминия перед добавлением в вакцинный препарат.
В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления способ по изобретению представляет собой способ, где:
(i) (a) HBsAg и AlOOH приводят в контакт в отсутствие любого другого антигена и оставляют HBsAg адсорбироваться на AlOOH в течение по меньшей мере 4 ч, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, более предпочтительно приблизительно 24 ч, таким образом, чтобы получать препарат, содержащий комплекс AlOOH/HBsAg;
(i) (b) к препарату, получаемому в пункте (i) (a), добавляют препарат, содержащий антигены D, T, PTxd и FHA, предварительно адсорбированные на AlOOH, и необязательно дополнительные антигены Bordetella pertussis, такие как петрактин и агглютиногены;
(ii) к препарату, получаемому в пункте (i) (b), добавляют фосфатные ионы, чтобы получать конечную концентрацию в вакцине 40 ммоль/л;
(iii) к препарату, получаемому в пункте (ii), необязательно добавляют антигены полиомиелита;
(iv) к препарату, получаемому в пункте (ii) или (iii), добавляют препарат, содержащий антиген Hib;
(v) pH доводят до 7,1+0,1 и
(vi) (а) перед добавлением антигена Hib добавляют по меньшей мере одну катионную аминокислоту
таким образом, чтобы дополнять препарат, получаемый в пункте (ii) или (iii); или
(b) к антигену Hib добавляют по меньшей мере одну катионную аминокислоту;
где указанную катионную аминокислоту добавляют в количестве, достаточном для получения конечной концентрации в вакцине по меньшей мере 100 мг/л.
В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления вакцинная композиция по изобретению представляет собой композицию, содержащую HBsAg, дифтерийный токсин D, столбнячный токсин Т, антигены коклюша PTxd и FHA, предварительно адсорбированные на AlOOH, антиген Hib и необязательно валентность полиомиелита, в которой:
(i) по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90% от общего количества HBsAg, содержащегося в композиции, сохраняется адсорбированным на AlOOH в течение по меньшей мере 3 месяцев, начиная с даты производства композиции, хранящейся при температуре 5+3°С; и
(ii) по меньшей мере 65, 70 или предпочтительно 75% от общего количества антигена Hib, содержащегося в композиции, не является адсорбированным на AlOOH, где это количество остается относительно стабильным в течение длительного периода времени.
Кроме того, способом по изобретению также обеспечивают сохранение в адсорбированном состоянии отличных от HBsAg антигенов, для которых продемонстрировано, что преимуществом является то, что они должны быть адсорбированы на оксигидроксиде алюминия, чтобы являться иммуногенными.
Таким образом, в качестве примера указывают, что композиция по изобретению может содержать
от 10 до 30 мкг HBsAg/мл, предпочтительно 20 мкг/мл;
от 40 до 80 Lf D/мл, предпочтительно от 50 до 70 Lf/мл;
от 10 до 50 Lf Т/мл, предпочтительно от 10 до 30 Lf/мл;
от 4 0 до 60 мкг FHA/мл, предпочтительно 50 мкг/мл;
от 40 до 60 мкг PTxd/мл, предпочтительно 50 мкг/мл;
от 2 до 60 мкг PRP/мл, предпочтительно 20-24 мкг/мл;
от 1 до 2 мг AlOOH/мл, предпочтительно 1,2 мг AlOOH/мл;
фосфатные ионы в концентрации от 35 до 45 ммоль/л, предпочтительно от 38 до 42 ммоль/л фос
фатных ионов;
от 100 до 1000 мкг/мл катионных аминокислот, предпочтительно от 400 до 800 мкг/мл, и необязательно
1, 2 и 3 типа полиовируса в неактивированной форме в соответствующем количестве 80, 16 и 64 DU/мл.
Как указано выше, композиция по изобретению также может содержать дополнительные антигены Bordetella pertussis, такие как петрактин (69 кДа) или агглютиногены.
Описание чертежа
Чертеж представляет собой схему способа известного уровня техники, где смешивание проводят после добавления каждого компонента.
Пример. Получение в промышленном масштабе нефасованной (250 л) шестивалентной вакцины HepB -Dt-Tt-Pertussis-полиомиелит-HiB.
Такое получение проводят в стерильных условиях и при постоянном перемешивании.
A. Получение HBsAg, адсорбированного на AlOOH.
Гомогенную суспензию геля оксигидроксида алюминия (AlOOH), поставляемую Brenntag AG, при 8 г алюминия/л в стерильных условиях вводили в 50-л резервуар.
После фильтрования через 0,22-мкм фильтр в резервуар, уже содержащий AlOOH, непрерывно добавляли объем HBsAg, необходимый для получения концентрации в конечной вакцине 20 мкг/мл.
Смесь оставляли при перемешивании в течение 20-24 ч при температуре окружающей среды таким образом, чтобы получать гомогенную суспензию.
B. Получение D+T+PTxd+FHA, адсорбированных на геле алюминия.
Параллельно получают смесь геля алюминия, дифтерийного анатоксина (D), столбнячного токсина (Т), анатоксина Bordetella pertussis (PTxd) и фимбриального гемагглютинина (FHA) Bordetella pertussis следующим ниже способом.
В 250-л резервуар вносят в стерильных условиях гомогенную суспензию геля AlOOH, поставляемую Brenntag AG, при 8 г алюминия/л.
В 250-л резервуар, уже содержащий AlOOH, после фильтрования через 0,22-мкм фильтр последовательно вводят растворы D, а затем после гомогенизации Т, для получения соответствующих концентраций D и Т в конечной вакцине 60 Lf (предел флокуляции)/мл и 20 Lf/мл.
После получения гомогенной смеси в этот резервуар последовательно вводят в стерильных условиях суспензию PTxd, предварительно адсорбированного на AlOOH, а затем суспензию FHA, предварительно адсорбированного на AlOOH, для получения концентраций PTxd и FHA в конечной вакцине 25 мкг/мл.
В заключение после фильтрования через 0,22-мкм фильтр добавляют объем 500 мМ фосфатного буфера, необходимый для получения концентрации фосфатных ионов от 20 до 30 ммоль/л.
Получаемую суспензию D-T-PTxd-FHA-AlOOH оставляют перемешиваться в течение по меньшей мере 14 ч при температуре 5+3°С.
C. Получение смеси HBsAg+D+T+PTxd+FHA, адсорбированных на геле алюминия. Препарат, полученный в п.А, добавляют в стерильных условиях к препарату, полученному в п.В. Эту смесь оставляют перемешиваться таким образом, чтобы получать гомогенную суспензию. Затем объем добавляют 500 мМ фосфатного буфера, необходимый для получения концентрации
фосфатных ионов 40 ммоль/л в конечной композиции, после фильтрования через 0,22-мкм фильтр.
D. Насыщение электростатических участков комплекса геля алюминия/HBsAg+D+T+PTxd+FHA
раствором аминокислот.
Получают раствор аминокислот, содержащий 12 незаменимых аминокислот, обладающий следующей ниже композицией:
гидрохлорид аргинина 2,1 г/л, т.е. 1,7 3 г/л аргинина; цистин 1,2 г/л; гистидин 0,8 г/л; изолейцин 2,6 г/л; лейцин 2,6 г/л;
гидрохлорид лизина 3,65 г/л, т.е. 2,91 г/л лизина;
метионин 0,75 г/л;
фенилаланин 1,65 г/л;
треонин 2,4 г/л;
триптофан 0,4 г/л;
тирозин 1,8 г/л;
валин 2,35 г/л.
Таким образом получают 21,2 г/л аминокислот, включая 5,44 г/л катионных аминокислот (His-Arg-
Lys).
Добавляют 450 мл 2,5н. гидроксида натрия (NaOH) (0,5 л/мин). Продолжают проводить гомогенизацию при перемешивании в течение 10 мин.
Этот раствор аминокислот, профильтрованный через 0,22-мкм фильтр, непрерывно добавляют в смесь, полученную в п.С, таким образом, чтобы получать концентрацию 572 мкг/мл катионных аминокислот в конечной композиции.
E. Доведение рН.
рН суспензии, полученной в пЛ, регулируют до рН 7,1 (7,0-7,2) с использованием профильтрованного исходного 2,5н. раствора гидроксида натрия.
F. Добавление антигенов полиомиелита.
Затем в резервуар, содержащий суспензию, полученную в п.Е, вводят препарат, содержащий 1, 2 и 3 серотипы полиовируса в неактивированной форме (штаммы Mahoney, MEF-1 и Saukett соответственно), профильтрованный через 0,22-мкм фильтр.
G. Добавление PRP-T.
Сначала получают промежуточный раствор PRP-T следующим образом: к препарату PRP-T, профильтрованному через 0,22-мкм фильтр, добавляют Tris-сахарозный буфер, предварительно профильтрованный через 0,22-мкм фильтр, чтобы получить промежуточную смесь.
Эту смесь вводят в стерильных условиях в смесь, полученную в п^.
H. Конечная фаза регуляции.
После гомогенизации суспензии, полученной в ^G, добавляют достаточное количество предварительно профильтрованной воды PPI для получения целевого объема 250 л. Затем при необходимости доводят рН смеси до рН 7,1 +0,1, добавляя предварительно профильтрованный 2,5н. раствор гидроксида натрия или 10% раствор уксусной кислоты.
Смесь хранят при 5+3°С, затем распределяют в шприцы или флаконы в пропорции 0,5 мл/доза.
Таким образом, одна 0,5-мл доза содержит 600 мкг Al3+, 10 мкг HBsAg, не менее 20 МЕд D, не менее 40 МЕд Т, 25 мкг Pt, 25 мкг FHA, от 20 до 43 DU (антигенных единиц D) полиомиелита 1 типа, от 5 до 9 DU полиомиелита 2 типа, от 17 до 36 DU полиомиелита 3 типа, 12 мкг PRP (в форме PRP-T), фосфатные ионы в концентрации 40 ммоль/л, Tris-сахарозный буфер в концентрации 2,5 ммоль/л Tris и 2,125% сахарозы, а также 286 мкг катионных аминокислот (His-Arg-Lys).
Клиническое испытание.
В клиническом испытании тестировали вакцинную композицию, полученную в соответствии с указанным выше примером, в сравнении с шестивалентной вакциной Infanrix Hexa(tm), уже представленной на рынке, которая обеспечивает возможность вакцинации детей от таких же заболеваний, как вакцина, получаемая по изобретению (от дифтерии, столбняка, коклюша, полиомиелита, инфекций Hib и гепатита В), но которая, в частности, обладает недостатком, заключающимся в том, что она содержит лиофилизи-рованную часть, и, таким образом, перед процедурой введения необходимой является операция восстановления лиофилизата.
Во время клинического испытания детям вводили 2 типа вакцинных композиций по схеме вакцинации, включающей 3 дозы, вводимые в 2, 4 и 6 месяцев. Продемонстрировано, что жидкая вакцина, получаемая способом по изобретению, является осень хорошо переносимой и такой же иммуногенной, как вакцина, представленная на рынке.
Экспериментальные данные
Процент адсорбции HBsAg/количество неабсорбированного PRP-Т.
Три серии конечного нефасованного продукта (PFV39-41-42), а также три серии распределенного по флаконам (S12-13-14) - все серии получали в соответствии с предоставленным примером - хранили при +5°С и анализировали в различные моменты времени в течение периода 9 и 22 месяца соответственно. Анализ касался процента адсорбции HBsAg и количества неабсорбированного PRP-T.
Определение процента адсорбции HBsAg проводили, как указано выше, начиная определения общего содержания HBsAg и содержания неадсорбированного HBsAg, где определение HBsAg проводили с использованием способа сэндвич-ELISA в соответствии с правилами, определяемыми European pharmacopeia 2.7.1. В кратком изложении, HBsAg захватывался первичным моноклональным антителом против HBsAg типа IgM в лунках 96-луночного планшета. Связанный таким образом HBsAg покрывали вторичным моноклональным антителом против HBsAg типа IgG, которое в свою очередь детектировали посредством связанного с пероксидазой IgG поликлонального антитела против IgG. Хромогенный субстрат для пероксидазы тетраметилбензидин (ТМВ) служил в качестве проявляющего средства. При его добавлении проявляется окраска, интенсивность которой являлась пропорциональной количеству HBsAg, захваченного в лунке. Результаты анализировали способом параллельных линий, описанным в European pharmacopeia 5.3.3.
Для определения процента адсорбции HBsAg вакцину подвергали центрифугированию (8800 g 5 мин, 20°С), что позволяло собирать супернатант, содержащий неадсорбированный BsAg. Образцы су-пернатантов, которые необходимо тестировать, разбавляли буфером для ELISA, содержащим десорбци-онный буфер, в 2-кратных серийных разведениях в диапазоне, например, от 1/400 до 1/12800.
Образцы общей вакцины и стандартного диапазона разбавляли буфером ELISA, содержащим де-сорбционный буфер, в 2-кратных серийных разведениях в диапазоне, например, от 1/8 до 1/25600.
96-луночный планшет, покрытый первичным моноклональным антителом, инкубировали в течение 12 ч при 5°С, а затем промывали раствором PBS-Tween 20. Разбавления супернатантов общей вакцины и стандартного диапазона распределяли по лункам. Затем добавляли вторичное антитело и проводили проявление с использованием связанного с пероксидазой антитела и ТМВ (тетраметилбензидина). Реакцию останавливали добавлением 1н. HCl. После каждого этапа планшет инкубировали в течение 30 мин при 25°С, а затем последовательно промывали раствором PBS-Tween 20. Холостую пробу (буфер для разведения) добавляли в доступные лунки и подвергали аналогичным обработкам. Планшет считывали при
OD 450 и 630 нм.
Количество неадсорбированного PRP-T оценивали HPAEC-PAD (высокоэффективной анионооб-менной хроматографией - импульсной амперометрической детекцией) следующим ниже способом.
Сначала получали стандартный диапазон PRP-T эталона от 0,5 до 12,5 мкг/мл.
Образцы, которые необходимо тестировать, а также образцы стандартного диапазона центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин при температуре окружающей среды. Собирали супернатанты, а затем подвергали гидролизу 1,5н. раствором NaCl, содержащим глюкозамин-1-фосфат в качестве внутреннего стандарта. Добавляли холостую пробу (0,9% NaCl, 1,5н. NaOH+внутренний стандарт).
Проводили хроматографию с подвижной фазой, состоящей из 35 мМ NaOH и 114 мМ ацетата натрия, впрыскиваемых в колонку со скоростью 1,2 мл/мин.
Концентрацию неадсорбированного PRP (мкг/мл) рассчитывали с использованием следующего уравнения:
(площадь поверхности пика PRP/площадь поверхности пика внутреннего стандарта)=ах [концентрация PRP]+b, в котором а представляет собой наклон и b представляет собой отрезок на оси у, где а и b определяют на основании линии регрессии.
Результаты приведены в 4 таблицах ниже.
Процент адсорбции HBsAg в составе конченого нефасованного продукта (PVF 39-41-42) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования
PFV39
PFV41
PFV42
1 месяц
2 месяца
3 месяца
4 месяца
5 месяцев
6 месяцев
9 месяцев
Процент адсорбции HBsAg в составе, хранящемся во флаконах (серии S12-S13-S14) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования
S12
S13
S14
4 месяца
5 месяцев
7 месяцев
10 месяцев
13 месяцев
16 месяцев
22 месяца
НеадсорОированный PRP-T (мкг/мл) в составе конечного нефасованного продукта (PVF 39-41-42) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования
PFV39
PFV41
PFV42
22, 6
20, 0
21, 0
1 месяц
23, 1
19, 5
20, 4
2 месяца
23, 3
21, 6
22, 0
3 месяца
24, 9
22, 6
23, 1
4 месяца
24,2
22, 0
20, 7
5 месяцев
22,2
22,7
24, 5
6 месяцев
27,7
22, 9
21, 6
9 месяцев
27, 0
24, 8
Неадсорбированный PRP-T (мкг/мл) в составе, хранящемся во флаконах (серии S12-S13-S14) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования
S12
S13
S14
22, 6
20, 0
21, 0
4 месяца
21, 1
21, 1
19, 8
5 месяцев
23, 0
19, 6
18, 6
7 месяцев
23, 1
21, 0
19, 5
10 месяцев
25, 0
23, 4
21, 8
13 месяцев
24, 6
22, 6
20, 8
16 месяцев
23, 5
22,3
20, 8
22 месяца
23, 9
22, 0
19, 9
Для сравнения также в течение определенного периода времени тестировали адсорбцию HBsAg, содержащегося в трех сериях конечного нефасованного продукта (FDN5-6-7), а также в трех сериях распределенного по флаконам (S 44-45-46), жидкого препарата, состоящего из аналогичных антигенов, но получаемого способом линейного формулирования, описанного на фиг. 1, и таким образом отличающегося от способа, описанного в примере выше. Этот препарат содержал в 0,5 мл: 10 мкг HBsAg, 30 Lf Dt, 10 Lf Tt, 25 мкг Pt, 25 мкг FHA, 40 DU поливируса 1 типа, 8 DU поливируса 2 типа, 32 DU поливируса 3 типа, 12 мкг PRP (в форме PRP-T), 0,6 мг Al, фосфатные ионы в концентрации 55 ммоль/л, карбонатные ионы в концентрации 20 ммоль/л, Tris-сахарозный буфер в концентрации 2,5 ммоль/л относительно Tris и 2,125% относительно сахарозы и 14 мкг катионных аминокислот (His-Arg-Lys), получаемых из среды М199 (валентность полиомиелита), рН 6,8-7,2.
Получаемые результаты были такими, как указано ниже.
Процент адсорбции HBsAg в составе конечного нефасованного продукта (FDN5-6-7) при + 5°С
Время, прошедшее после операции формулирования
FDN5
FDN6
FDN7
1 месяц
2 месяца
3 месяца
6 месяцев
Процент адсорбции HBsAg в составе, хранящемся во флаконах
(серии S44-S45-S46) при +5°С
Время, прошедшее после операции формулирования
S44
S45
S46
7 месяцев
10 месяцев
13 месяцев
16 месяцев
22 месяца
28 месяцев
34 месяца
40 месяцев
Количества неадсорбированного PRP-T, измеряемого в течение аналогичного периода времени, демонстрировали, что существовало небольшое изменение по сравнению с моментом времени 0 и, таким образом, являлось удовлетворительным. Однако эти результаты демонстрируют, что в этом случае, который не относится к составу, получаемому способом по изобретению, поверхностный антиген гепатита В не сохранялся адсорбированным на оксигидроксиде алюминия.
Экспериментальные данные, относящиеся к катионным аминокислотам.
Сравнивали композицию по изобретению, получаемую непосредственно по экспериментальному протоколу, проводимому в предоставленном примере, и композицию, получаемую по протоколу, модифицированному таким образом, что композицию, содержащую только три катионные аминокислоты (Arg-Lys-His), заменяли на композицию из 12 незаменимых аминокислот в отношении неадсорбирован-ного количества PRP-T в конце. Не наблюдали какого-либо различия количества неадсорбированного PRP-T, таким образом демонстрируя, что важными являются только катионные аминокислоты.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения жидкой вакцинной композиции, содержащей, по меньшей мере:
оксигидроксид алюминия (AlOOH);
один поверхностный антиген гепатита В (HBsAg);
один антиген Haemophilus influenzae типа b (Hib), состоящий из полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (PRP-T);
в которой поверхностный антиген гепатита В сохраняется адсорбированным на AlOOH, тогда как антиген Hib сохраняется неадсорбированным,
согласно которому
поверхностный антиген гепатита В адсорбируют на AlOOH для получения комплекса
AlOOH/HBsAg;
указанный комплекс AlOOH/HBsAg смешивают с антигеном Hib в присутствии аминокислот, которые находятся в вакцинной композиции в катионной форме, в концентрации от 100 до 2 мг/мл и фосфатных ионов в концентрации от 35 до 45 ммоль/л.
2. Способ по п.1, где антиген HBsAg адсорбируют на алюминии смешиванием суспензии AlOOH с суспензией HBsAg при перемешивании в течение по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, предпочтительно от 20 до 24 ч.
3. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что катионные аминокислоты добавляют к указанному комплексу AlOOH/HBsAg до смешивания с антигеном Hib.
4. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что катионные аминокислоты добавляют к указанному антигену Hib до смешивания с комплексом AlOOH/HBsAg.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фосфатные ионы добавляют к указанному комплексу AlOOH/HBsAg до смешивания с антигеном Hib.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что рН препарата, содержащего комплекс AlOOH/HBsAg, доводят до 7,1+0,1 до смешивания с антигеном Hib.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что он также включает
получение композиции, содержащей по меньшей мере один антиген, выбранный из антигенов дифтерии, столбняка, полиомиелита и коклюша, а также оксигидроксид алюминия;
смешивание указанного комплекса AlOOH/HBsAg с указанной композицией до проведения смешивания с антигеном Hib.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что он включает получение указанной композиции путем последовательного добавления каждого из антигенов к суспензии оксигидроксида алюминия и перемешивания после добавления каждого антигена.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что
HBsAg адсорбируют на частичном количестве AlOOH, представляющем одну треть от общего AlOOH, содержащегося в конечной композиции, в течение периода от 20 до 24 ч для получения комплекса AlOOH/HBsAg;
параллельно на дополнительном количестве AlOOH последовательно адсорбируют дифтерийный
токсин D, столбнячный токсин Т, очищенный токсин PTxd Bordetella pertuss, в свою очередь, предварительно адсорбированный на AlOOH, и фимбриальный гемагглютинин FHA Bordetella pertussis, в свою очередь, предварительно адсорбированный на AlOOH, затем к ним добавляют фосфатные ионы, затем к ним добавляют комплекс AlOOH/HBsAg;
снова добавляют фосфатные ионы в количестве, обеспечивающем получение концентрации в конечной композиции 40 ммоль/л;
добавляют по меньшей мере одну катионную аминокислоту в количестве, обеспечивающем получение концентрации в конечной композиции по меньшей мере 100 мг/л;
рН доводят до 7,1±0,1;
добавляют антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов 1 типа 1 и/или 2 типа, и/или 3 типа;
добавляют антиген Hib; рН доводят до 7,1+0,1;
получаемую композицию распределяют в шприцы или во флаконы.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что в промышленном масштабе получают по меньшей мере 250 л вакцинной композиции.
11. Вакцинная композиция, полученная способом по любому из пп.1-10 и содержащая, по меньшей мере, оксигидроксид алюминия (AlOOH), поверхностный антиген гепатита В (HBsAg) и антиген Hib, который состоит из полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (PRP-T).
12. Вакцинная композиция по п.11, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антигены дифтерии, столбняка, полиомиелита и коклюша.
13. Вакцинная композиция по любому из пп.11 или 12, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере:
поверхностный антиген гепатита В, HBsAg; антиген дифтерии в форме дифтерийного токсина D; антиген столбняка в форме столбнячного токсина Т;
антигены коклюша в форме очищенного токсина (PTxd) и фимбриального гемагглютинина (FHA); антиген Haemophilus influenzae типа b в форме полирибозилрибитолфосфата, конъюгированного со столбнячным белком (FRP-T);
антигены полиомиелита в форме инактивированных вирусов, выбираемых из типов 1, 2 и 3.
14. Вакцинная композиция по п.13, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере:
от 10 до 30 мкг HBsAg/мл, предпочтительно 20 мкг/мл;
от 40 до 80 Lf D/мл, предпочтительно от 50 до 70 Lf/мл; от 10 до 50 Lf Т/мл, предпочтительно от 10 до 30 Lf/мл; от 40 до 60 мкг FHA/мл, предпочтительно 50 мкг/мл; от 40 до 60 мкг PTxd/мл, предпочтительно 50 мкг/мл;
от 2 до 60 мкг PRP/мл, предпочтительно 20-24 мкг/мл в форме конъюгата PRP-T; от 1 до 2 мг AlOOH/мл, предпочтительно 1,2 мг AlOOH/мл; от 35 до 45 ммоль/л, предпочтительно от 38 до 42 ммоль/л фосфатных ионов; от 100 до 1000 мг/л катионных аминокислот, предпочтительно от 400 до 800 мг/л; 1, 2 и 3 типы поливируса в инактивированной форме в соответствующем количестве 80, 16 и 64 DU/мл,
где Lf обозначает предел флокуляции.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
026058
- 1 -
(19)
026058
- 1 -
(19)
026058
- 1 -
(19)
026058
- 4 -
026058
- 12 -