|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Неинвазивный способ сбора образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки, включающий взятие на сваб образца, содержащего клетки слоя слизи, происходящего из указанного кишечника или кишки, с поверхности анальной области вблизи от наружного отверстия заднего прохода, когда указанный образец берется после дефекации и прежде очищения анальной области. 2. Способ по п.1, когда образец собирается в течение 5 мин после дефекации и прежде очищения анальной области. 3. Способ по п.1 или 2, также включающий помещение указанного образца, содержащего клетки слоя слизи на свабе, в среду для хранения или в среду для лизиса. 4. Способ по п.3, в котором среда для хранения содержит концентрированный раствор соли. 5. Способ по п.3, в котором среда для хранения является жидкостью или гелем. 6. Способ диагностирования заболевания кишечника, включающий сбор образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки с использованием способов, указанных в любом из предыдущих пунктов, а также анализ указанного образца на присутствие одного или более маркеров, специфичных для заболеваний кишечника. 7. Способ по п.6, в котором указанный анализ включает анализ морфологии клеток и/или количественное или полу-количественное определение одного или более молекулярных маркеров, специфичных для заболеваний. 8. Способ скрининга заболеваний кишечника, использующий любой из способов, указанных в п.6 или 7. 9. Способ мониторинга заболеваний кишечника, использующий любой из способов, указанных в п.6 или 7. 10. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является колоректальный рак. 11. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является воспалительное заболевание кишечника. 12. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является анальный рак. 13. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника являются предраковые колоректальные полипы. 14. Устройство для применения в способах по любому из предшествующих пунктов, где данное устройство включает сваб в сочетании со средой для хранения, где указанная среда для хранения представляет собой концентрированный раствор соли и где указанная соль представляет собой сульфат аммония. 15. Устройство по п.14, в котором указанная среда для хранения является жидкостью и содержит концентрированный раствор соли. 16. Устройство по п.14, в котором указанная среда для хранения является гелем и содержит концентрированный раствор соли, при этом указанный раствор соли не является насыщенным раствором. 17. Устройство по любому из пп.14-16, также включающее гелевую пробку. 18. Способ оценки эффективности лечения заболевания кишечника, включающий способы, указанные в любом из пп.1-13. 19. Способ по п.18, который также включает оценку уровня активности воспаления кишечника.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Неинвазивный способ сбора образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки, включающий взятие на сваб образца, содержащего клетки слоя слизи, происходящего из указанного кишечника или кишки, с поверхности анальной области вблизи от наружного отверстия заднего прохода, когда указанный образец берется после дефекации и прежде очищения анальной области. 2. Способ по п.1, когда образец собирается в течение 5 мин после дефекации и прежде очищения анальной области. 3. Способ по п.1 или 2, также включающий помещение указанного образца, содержащего клетки слоя слизи на свабе, в среду для хранения или в среду для лизиса. 4. Способ по п.3, в котором среда для хранения содержит концентрированный раствор соли. 5. Способ по п.3, в котором среда для хранения является жидкостью или гелем. 6. Способ диагностирования заболевания кишечника, включающий сбор образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки с использованием способов, указанных в любом из предыдущих пунктов, а также анализ указанного образца на присутствие одного или более маркеров, специфичных для заболеваний кишечника. 7. Способ по п.6, в котором указанный анализ включает анализ морфологии клеток и/или количественное или полу-количественное определение одного или более молекулярных маркеров, специфичных для заболеваний. 8. Способ скрининга заболеваний кишечника, использующий любой из способов, указанных в п.6 или 7. 9. Способ мониторинга заболеваний кишечника, использующий любой из способов, указанных в п.6 или 7. 10. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является колоректальный рак. 11. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является воспалительное заболевание кишечника. 12. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является анальный рак. 13. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника являются предраковые колоректальные полипы. 14. Устройство для применения в способах по любому из предшествующих пунктов, где данное устройство включает сваб в сочетании со средой для хранения, где указанная среда для хранения представляет собой концентрированный раствор соли и где указанная соль представляет собой сульфат аммония. 15. Устройство по п.14, в котором указанная среда для хранения является жидкостью и содержит концентрированный раствор соли. 16. Устройство по п.14, в котором указанная среда для хранения является гелем и содержит концентрированный раствор соли, при этом указанный раствор соли не является насыщенным раствором. 17. Устройство по любому из пп.14-16, также включающее гелевую пробку. 18. Способ оценки эффективности лечения заболевания кишечника, включающий способы, указанные в любом из пп.1-13. 19. Способ по п.18, который также включает оценку уровня активности воспаления кишечника.
Евразийское
патентное
ведомство
026049
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201391634
(22) Дата подачи заявки 2012.05.03
(51) Int. Cl.
G01N 33/50 (2006.01) G01N 33/574 (2006.01)
(54) НЕИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ СБОРА ОБРАЗЦА, СОДЕРЖАЩЕГО КЛЕТКИ
КОЛОРЕКТАЛЬНОЙ СЛИЗИ, И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
(31) 1107466.3
(32) 2011.05.05
(33) GB
(43) 2016.01.29
(86) PCT/GB2012/050964
(87) WO 2012/150453 2012.11.08
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ДИАГНОДУС ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Локтионов Александр, Бандалетова Татьяна, Андерсон Нил (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-2005136553 WO-A2-2006039405 WO-A1-2004086979
ABU-DIAB AFAF ET Al.: "Comparison between pernasal flocked swabs and nasopharyngeal aspirates for detection of common respiratory viruses in samples from children". JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY JUL 2008. LNKD-PUBMED:18480225, vol. 46, no. 7, July 2008 (2008-07), pages 2414-2417, XP002681545, ISSN: 1098-660X, page 2414, column 2, lines 6-8, page 2414, column 1, lines 16-21, page 2416, column 2,
lines 30-40
EP-A1-0022377
WO-A2-2008150962
LOKTIONOV ALEXANDRE: "Cell exfoliation in the human colon: myth, reality and implications for colorectal cancer screening",
INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER. JOURNAL INTERNATIONAL DU CANCER. 1
JUN 2007. LNKD-PUBMED:17351899, vol. 120, no. 11, 1 June 2007 (2007-06-01), pages 2281-2289, XP002681546, ISSN: 0020-7136, the whole document
EP-A2-0643131
(57) Настоящее изобретение относится к неинвазивному способу сбора образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки, включающему взятие на сваб образца, содержащего клетки слоя слизи, происходящего из указанного кишечника или кишки, с поверхности анальной области вблизи от наружного отверстия заднего прохода, когда указанный образец берется после дефекации и прежде очищения анальной области, а также к устройству для осуществления данного способа.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к приспособлению и методу для сбора образцов содержащего клетки слоя колоректальной слизи, экскретированного во время естественного акта дефекации, с поверхности анальной области человеческого индивида, а также к сохранению и анализу собранных образцов для выявления диагностически информативных биомаркеров заболеваний.
Предпосылки изобретения
Заболевания толстой и прямой кишки (колоректальные заболевания) представляют собой многочисленную группу патологических состояний поражающих кишечник человека. Важность раннего выявления и лечения колоректальных заболеваний несомненна, однако выбор существующих неинвазивных тестов для диагностики и скрининга этих болезней остается весьма ограниченным. Колоректальный рак (КРР) и хронические воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) представляют собой две крайне важных группы заболеваний, которые заслуживают особого внимания.
Колоректальный рак (КРР) является одной из самых частых злокачественных опухолей: более 1300000 новых случаев диагностируется в мире ежегодно. Эта болезнь преимущественно поражает людей в возрасте более 50 лет, в особенности в развитых странах Запада (Ferlay et al., 2010). Хотя КРР является второй по значимости причиной онкологической смертности, это заболевание может быть излечимо при раннем выявлении. К сожалению, КРР очень часто диагностируется слишком поздно (Richards, 2009), поскольку во многих случаях клинические проявления болезни отсутствуют до поздних стадий рака. В связи с этим внедрение активного скрининга бессимптомного населения старших (возраст более 50 лет) возрастных групп рассматривается в качестве единственного возможного способа радикального улучшения как раннего выявление КРР, так и выживаемости больных.
Идеальный тест для скрининга рака должен быть эффективным для выявления болезни (обладать высокой чувствительностью и специфичностью), неинвазивным, хорошо переносимым, простым, недорогим, легко повторимым и предпочтительно приспособленным для самоприменения.
Гибкая колоноскопия в настоящее время считается наиболее чувствительной и специфичной диагностической процедурой для выявления колоректальных опухолей, но она является инвазивным исследованием, требующим подготовки кишечника и в некоторых случаях вызывающим серьезные осложнения (Ransohoff, 2009). Кроме того, важно отметить, что колоноскопия является дорогостоящей процедурой, которая должна выполняться только высококвалифицированными и специально обученными медицинскими профессионалами. Хотя гибкая колоноскопия правильно определяется как общий конечный этап любой программы колоректального скрининга (Lieberman, 2009), идея внедрения ее в качестве единственного приемлемого подхода к скринингу КРР, поддерживаемая рядом экспертов в США, не представляет реалистичного варианта для большинства стран (Hoff et al., 2010).
Необходимость простого, неинвазивного и недорогого теста, который можно было бы использовать в качестве "первой линии" скрининга КРР давно существует как проблема в клинической медицине. В течение последних нескольких десятилетий это место занимал Тест на Скрытую Кровь в Кале (ТСКК), впервые предложенный для выявления КРР Григором (Greegor, 1969). Этот тест основан на предположении, что опухоли часто кровоточат; в связи с этим присутствие крови в стуле может указывать на кровотечение из колоректальной опухоли.
Ряд патентов США (U.S. Pat. Nos. 3252762; 3996006; 4092120; 4199550; 4333734; 4562043; 4939097; 5391498; 5563071) описывают различные версии первоначального гваякового теста, определяющего присутствие гемоглобина в кале, однако эти тесты могут давать ложно-положительные результаты в результате присутствия резидуального гемоглобина в остатках пищи. Более точная современная версия этого теста, которая специфична к гемоглобину человека за счет иммунохимического определения белкового (глобинового) компонента гемоглобина человека называется Иммунохимическим Тестом на Скрытую Кровь в Кале (иТСКК) или Иммунохимическим Тестом Кала (ИТК). Примеры тестов этого типа описаны в U.S. Pat. Nos. 4427769; 5198365; 7288413.
Хотя ТСКК и иТСКК имеют ряд привлекательных черт, включая неинвазивность, простоту, дешевизну и легкость повторного тестирования, применение этих тестов часто приводит к ложно-положительным и, в особенности, ложно-отрицательным результатам (Allison et al., 1996; 2007; Collins et al., 2005; Burch et al., 2007; Duffy et al., 2011), отражающим тот фант, что присутствие или отсутствие крови в кале часто не связано с присутствием КРР (Itzkowitz, 2009). Действительно, ЕЮ многих случаях колоректальные опухоли не кровоточат, в то время как кровотечения, связанные с неопухолевыми заболеваниями, в частности с геморроем встречаются очень часто. Еще один небольшой недостаток этих тестов заключается в необходимости временного сохранения экскретированного стула с целью сбора образцов для анализа.
Идея использовать эпителиальные клетки толстой кишки (колоноциты), эксфолиирующиеся с поверхности слизистой толстой кишки и колоректальных опухолей, привлекала исследователей со времени раннего сообщения Бадер и Папаниколау о цитологических различиях материала, полученного от больных с КРР и здоровых людей путем ректальных промываний (Bader et al., 1952). Рассмотрение возможного клинического применения этого подхода отражено в U.S. Pat. No. 3735751. Данный патент описывает устройство для ректосигмоидального лаважа и сбора жидкого материала для цитологического иссле
дования. Тем не менее, основанный на лаваже способ сбора материала был инвазивен, ненадежен и никогда не был внедрен в клиническую практику.
Интерес к использованию эксфолиированных колоноцитов возобновился в связи с исследованиями П.П. Наира и его группы, которые утверждали, что центрифугирование диспергированных образцов человеческого стула в градиенте плотности позволяло изолировать "тысячи жизнеспособных эксфолииро-ванных колоноцитов" (Iyengar et al., 1991). Это недостаточно обоснованное утверждение составило основу ряда патентов, полученных П.П. Наиром, включая U.S. Pat. Nos. 6355193; 6534280; 6630314; 6645729; 6645730; 6881574. Вместе с тем, авторы не представили цитологических доказательств присутствия ко-лоноцитов в препаратах, которые были получены в соответствии со способами этих патентов. По этой причине достоверность их основного заключения, касающегося выделения значительных количеств жизнеспособных колоноцитов из кала, подвергалось резкой критике (Loktionov et al., 1998; Loktionov, 2007). В конечном итоге, этот подход никогда не был применен для клинических целей.
Применение специфичных к эпителию иммуномагнитных частиц для выделения колоректального эпителия из маленьких образцов стула предлагалось в U.S. Pat. No. 5981651, однако предложенный способ выглядел сложным. Кроме того, выделенные клетки были пригодны только для качественного молекулярного анализа, который еще не признан надежным подходом к решению клинических проблем (см. ниже).
Эксфолиация клеток является важным механизмом обновления эпителиальной ткани, который относительно неактивен в колоректальном эпителии в нормальных физиологических условиях, но резко активируется в случае опухолевого роста (Loktionov, 2007). Спущенные с поверхности нормального или опухолевого эпителия клетки сначала присоединяются к хорошо оксигенированному слою слизи, покрывающему поверхность слизистой (Matsuo et al., 1997). Этот содержащий клетки слой слизи, защищающий эксфолиированные клетки, постепенно движется дистально параллельно движению кала (Loktionov, 2007; Loktionov et al., 2009). Фрагменты содержащего клетки слоя слизи неизбежно экскретируются с калом во время дефекации, но эти фрагменты должны присутствовать, в основном, на поверхности стула. Верность этого предположения была успешно доказана как экспериментально (Loktionov et al., 1995), так и на человеческом материале (Loktionov et al., 1998), что составило основу U.S. Pat. No. 6187546. Способ выделения эксфолиированных клеток, описанный в указанном патенте, убедительно доказал присутствие хорошо сохранившихся и легко морфологически идентифицируемых колоноцитов в собранном материале (Bandaletova et al., 2002). Предлагавшееся клиническое применение этого подхода было основано на выявлении повышенного общего количества ДНК в образцах кала, полученных от больных КРР по сравнению с индивидами не имеющими опухолей. Локтионов и соавт. подтвердили, что использование смывов с поверхности стула позволяет намного лучше различать указанные группы (Loktionov et al., 1998), однако этот способ, описанный в U.S. Pat. No. 6187546, требовал сбора и обработки всего стула. Это условие воспрепятствовало широкому применению способа в клинике.
Другие методологические подходы, использующие выделенную из стула ДНК для выявления молекулярных биомаркеров рака, преимущественно основаны на определении генных мутаций, начавшемся с выявления мутаций гена k-ras в образцах стула полученных от больных с КРР. Способы этой группы предполагают ПЦР-амплификацию избранных генетических последовательностей человеческой ДНК, изолированной из образцов стула. Ряд способов такого типа описаны в U.S. Pat. Nos. 5741650; 5910407;
6149529; 6177251; 6203993; 6280947; 6300077; 6406857; 6440661; 6440706; 6448002; 6475738; 6482595;
6498012; 6503718; 6586177; 6919174; 6964846; 7811757; 7833757; 7915015. Тем не менее, нет сведений ни об одном генетическом изменении, которое бы всегда присутствовало во всех колоректальных опухолях; поэтому стало очевидно, что только сложные и дорогие способы, одновременно анализирующие панели множественных мутационных маркеров в образцах стула, способны выявлять КРР со специфичностью, приближающейся к 95%. Однако чувствительность мутационной панели лишь немного превосходила 50% (Imperiale et al., 2004).
Гиперметилирование регуляторных последовательностей нескольких генов также было предложено в качестве альтернативного или дополнительного маркера КРР (Jones et al., 2007; Wong et al., 2007). Определение гиперметилирования ДНК в образцах стула описано в недавних U. S. Pat. Nos 7432050; 7485420; 7749702; 7785772, а также в WO 2010/061023 и WO 2010/089538. Хотя предварительная оценка некоторых подходов, основанных на анализе метилирования, выглядит многообещающей, (Glockner et al., 2009; Hellebrekers et al., 2009; Nagasaka et al., 2009), способы определения метилирования ДНК остаются относительно сложными и дорогостоящими.
Определение изменений генной экспрессии, связанных с КРР, путем анализа выделенной из стула РНК может рассматриваться как еще один новый подход к проблеме (Yu et al., 2008; Hamaya et al., 2010; Link et al., 2010). Способы такого типа уже описаны в U.S. Pat. Nos. 6258541 и 7816077, но их приемлемость для клинического использования остается под вопросом.
Несмотря на растущий интерес к способам выявления маркеров опухолей, связанных с ДНК, выделяемой из стула, кал остается сложным материалом для определения изменений в присутствующей в нем ДНК человека. Обилие чужеродной ДНК, бактериальной или происходящей из остатков пищи, а также присутствие веществ, препятствующих амплификации путем ПЦР, хорошо известны как проблемы, свя
занные с анализом образцов кала (Nechvatal et al., 2008). Важность тщательной оптимизации процедуры выделения ДНК из образцов кала для достижения надежной амплификации ДНК-матрицы также неоднократно подчеркивалась (Whitney et al., 2004; Zou et al., 2007).
Кроме того, ряд методик, основанных на иммунохимическом определении белков-биомаркеров были описаны в патентах U. S. Pat. Nos. 5380647; 5552292; 5695945; 206531319; 6703206; 7226751; 7252955,
7601348. Эти способы недостаточно разработаны и не могут применяться для клинической диагностики или скрининга КРР.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) - это группа часто встречающихся хронических патологических состояний, связанных с воспалительными процессами в кишечнике. Ульцеративный колит и болезнь Крона являются наиболее важными заболеваниями этой группы. ВЗК обычно диагностируются у молодых людей В большинстве случаев эти заболевания характеризуется длительными периодами ремиссии и происходящими время от времени обострениями, которые обычно требуют лечения. В настоящее время самые высокие показатели болезненности ВЗК наблюдаются в Европе (827 больных на 100000 населения) и Северной Америке (568 больных на 100000 населения) (Molodecky et al., 2012). Все эти больные должны находиться под постоянным наблюдением для своевременного выявления возможных обострений. Все больные с обострениями нуждаются в лечении, и оценка эффективности лечения является важной задачей, требующей серьезного улучшения. Помимо этого, часто возникает необходимость дифференциального диагноза между ВЗК и крайне частыми функциональными расстройствами желудочно-кишечного тракта, например синдромом раздраженного кишечника. К сожалению, повторные диагностические колоноскопии могут быть опасны у больных с ВЗК, а выбор доступных неинвазивных тестов крайне ограничен и включает только использование биомаркеров, определимых в сыворотке крови или в кале. Определение этих биомаркеров требует взятия на анализ крови или стула с последующим лабораторным анализом (Foell et al., 2009). Наиболее надежный способ среди применяемых для исследования кала - это определение белка, специфичного для нейтрофилов, кальпротектина, с помощью имму-ноферментного анализа, списанного Фагерхолем и соавт. в U. S. Pat. No. 5455160.
Кроме того, несколькими исследованиями было установлено, что у больных ВЗК клетки воспаления присутствуют в большом количестве в содержащем клетки слое слизи, покрывающем слизистую толстой и прямой кишки (Loktionov, 2007; Loktionov et al., 2009; Loktionov et al., 2010; Anderson et al., 2011), и экскретируются во время дефекации.
Информация, представленная выше, показывает, что эксфолиированные клетки, клетки воспаления и клеточные фрагменты, находящиеся в содержащем клетки слое слизи толстой кишки, представляют собой инормативный элемент содержимого кишечника в контексте выявления КРР и ВЗК, в то время как присутствие веществ, связанных со стулом, осложняет проведение аналитических процедур. В связи с этим попытки получить материал с меньшей степенью фекального загрязнения предпринимались путем применения минимально инвазивных способов сбора материала предполагающих прямой контакт между собирающей материал поверхностью и ректальной слизистой оболочкой, которая представляет собой внутреннюю выстилку прямой кишки.
Традиционное пальцевое ректальное исследование, применяемое в практической медицине тысячелетиями, представляет собой простейший способ достижения контакта между покрытым перчаткой пальцем исследователя и ректальной слизистой больного. Патенты U. S. Pat. Nos. 4857457; 5416025; 6187591 предлагали использовать этот простой способ для получения ректальной слизи, которая затем анализировалась на присутствие ряда веществ, рассматривавшихся как биомаркеры заболеваний.
Более современный Европейский патент No. EP 1776048 описывает устройство, оборудованное надувной эластичной сферой, которая вводится в прямую кишку через проктоскоп. Образец содержащего клетки слоя слизи собирается из прямой кишки путем надувания сферы, приходящей в контакт с поверхностью ректальной слизистой. Получение хорошо сохранившихся клеток толстой кишки посредством этого способа исчерпывающе отражено в нескольких публикациях (Loktionov, 2007; Loktionov et al., 2009; Loktionov et al., 2010). Количественное определение ДНК в собранном таким образом материале успешно применялось для выявления КРР (Loktionov et al., 2009; Loktionov et al., 2010; Wallin et al., 2010), однако этот способ едва ли можно использовать для скрининга КРР, поскольку необходимость проктоскопии делает его инвазивным.
Принимая во внимание сомнения в теоретическом обосновании ТСКК, полагающегося исключительно на выявление присутствия крови (Itzkowitz, 2009), количественное определение биомаркеров, присутствующих в клетках, находящихся в содержащем клетки слое слизи толстой кишки, кажется наиболее перспективным аналитическим направлением, ведущим к созданию действительно эффективного неинвазивного подхода к скринингу КРР и выявлению ВЗК. К сожалению, усилия исследователей, работавших в этом направлении, были преимущественно сконцентрированы на способах, связанных с использованием стула, в то время как недостаточно внимания уделялось разработке простых способов сбора материала, которые могли бы применяться самими тестируемыми индивидами, а также созданию тестов, обеспечивающих экспресс-анализ "у постели больного", и систем самотестирования для скрининга КРР и выявления и мониторинга ВЗК.
Сбор материала самими тестируемыми и самотестирование для выявления КРР рассматривались
рядом авторов в контексте ТСКК. Общепринятый способ взятия образцов стула для ТСКК обычно предполагает кратковременное сохранение всего экскретированного стула для переноса небольшой его части на специально обработанную химически карточку с помощью шпателя, ложечки или щеточки (см. U.S. Pat. Nos. 3252762; 3996006; 4092120; 4199550; 4333734; 4939097; 4562043; 5391498; 5563071). Ряд альтернативных модификаций ТСКК, основанных на использовании фекального материала, полученного путем его стирания с поверхности анальной области с помощью многослойных комбинаций нескольких материалов, представленных в форме мягких листков, предлагался несколькими авторами. Такие варианты ТСКК описаны в U. S. Pat. Nos. 4259964; 4273741; 4367750; 4420353; 4559949; 4578358; 4578359; 4645743; 4808379; 5840584, а также в Европейском Патенте No. EP 2108314. Все эти модификации, обеспечивающие сбор материала самими тестируемыми, были предложены исключительно с целью получения фекального материала и выявления присутствия в нем скрытой крови. Среди них только устройство, описанное Вальденбургом в U. S. Pat. No. 5840584, потенциально могло бы использоваться в качестве варианта ТСКК для самотестирования. Другие ранние версии ТСКК, изобретенные для само-тестирования, были основаны на применении индикаторных приспособлений, помещавшихся в чашу унитаза (U.S. Pat. Nos. 4175923; 4521520). Ни вышеупомянутые приспособления, ни предложенный в качестве теста "у постели больного" вариант ТСКК на перчатке для пальцевого ректального исследования (U.S. Pat. No. 4473079) никогда не применялись в клинической практике.
Представленный обзор существующей информации показывает, что ТСКК в различных вариантах в настоящее время является единственным доступным способом для неинвазивного скрининга КРР. Чувствительность и специфичность ТСКК недостаточны, поэтому существуют предпосылки для замены ТСКК на альтернативный тест, который использовал бы более надежные биомаркеры КРР, чем присутствие крови в стуле. Такой тест мог бы заменить ТСКК в том случае, если бы он был более чувствителен и специфичен, чем ТСКК, недорог, прост и применим как для тестирования "у постели больного", так и для самотестирования. Анализ содержащего клетки слоя слизи, в котором находятся эксфолиированные клетки, фрагменты клеток и биомолекулы, отражающие состояние колоректальной слизистой, несомненно представляет наилучшую возможность для выявления КРР. Кроме того, использование данного подхода может значительно облегчить выявление ВЗК и оценку интенсивности воспаления. К сожалению, как было показано выше, в настоящее время не существует надежных способов неинвазивного сбора образцов содержащего клетки слоя слизи. В связи с этим изобретение неинвазивного, простого и недорогого способа для сбора и анализа этого материала является наиболее сложной задачей. Настоящее изобретение направлено на решение этой проблемы.
Для удобства, список цитированной литературы приведен ниже.
ПАТЕНТЫ США (U.S. PATENT DOCUMENTS):
3.252,762
05/1966
Adams et al.
3.674,007
07/1972
Freis
3.735,751
05/1973
Katz
3,996,006
12/1976
Pagano
4,092,120
05/1978
Suovaniemi et al.
4,175,923
11/1979
Friend
4,199,550
04/1980
Wielinger et al.
4.259,964
04/1981
Levine
4,273,741
06/1981
Levine
4,333,734
06/1982
Fleisher
4,367,750
01/1983
Levine
4,420,353
12/1983
Levine
4,427,769
01/1984
Adlercreutz et al.
4,473,079
09/1984
Jasper et al.
4,521,520
06/1985
Jacke
4.529,702
07/1985
Bryan
4,569,949
12/1985
Levine
4,562,043
12/1985
Mennen et al.
4,578,358
03/1986
Oksman et al.
4,578,359
03/1986
Oksman et al.
4,645,743
02/1987
Baker et al.
4,808,379
02/1989
Wardlaw et al.
4,857,457
08/1989
Shamsuddin etal.
4,879,283
11/1989
Belzer et al
4,939,097
07/1990
Lawrence
5,096,062
03/1992
Burkhardt et al.
5,094,956
03/1992
Grow et al.
5,198,365
03/1993
Grow et al.
5,256,571
10/1993
Hurley et al.
6,380,647
01/1995
Bahar
5,391,498
02/1995
Baker et al.
5,416,025
05/1995
Krepinsky et al
5,432,053
07/1995
Berdyaev et al.
5,455,160
10/1995
Fagerhol et al.
5,552,292
09/1996
Uchida et al.
6,563,071
10/1996
Augurt
5,565,317
10/1996
Dohi et al.
5,695,945
12/1997
Tsuji
5,741,650
04/1998
Lapidus et al.
5,840,584
11/1998
Waldenburg
5,891,651
04/1999
Roche et al
6.910,407
06/1999
Vogelstein et al
6,143,529
11/2000
Lapidus et al.
6,187,546
02/2001
O'Neill etal.
6,187,591
02/2001
Krepinsky et al
6,177,251
01/2001
Vogelstein et al.
6,203,993
03/2001
Shuber et at
6,204,375
03/2001
Lader
6,258,541
07/2001
Chapkinetal.
6,268,136
07/2001
Shuber et al.
6,280,947
08/2001
Shuber et al.
6,300,077
10/2001
Shuber et al.
6,335.193
01/2002
Nair
6,406,857
06/2002
Shuber et al.
6,440,661
08/2002
0greid et al.
6,440,706
08/2002
Vogelstein et al.
6,448.002
09/2002
Hillebrand et al.
6,475,738
11/2002
Shuber et al.
6,482,595
11/2002
Shuber et al.
6,498,012
12/2002
Laken
6,503,718
01/2003
Shuber et al.
6,531,319
03/2003
Pant et al.
6,534,280
03/2003
Nair
6,5Е6,177
07/2003
Shuber
6,620,314
10/2003
Nair
6.615,729
11/2003
Nair
6,645,730
11/2003
Nair
6,703,206
03/2004
Pant et al.
6,881,574
04/2005
Nair
6,919,174
07/2005
Shuber
6,964,846
11/2005
Shuber
7,220,538
05/2007
Fischer et al.
7,226,751
06/2007
Erich et al.
7,252,955
08/2007
Pant et al.
7,288,413
10/2007
Goulden
7,432,050
10/2008
Markowitz
7,485,420
02/2009
Markowitz
7,601,348
10/2009
Kannagl et al.
7,749,702
07/2010
Lofton-Day et al.
7,785,772
08/2010
Ahlquist et al.
7,8-1,757
10/2010
Shuber
7,8-6,077
10/2010
Kanaoka
7,833,757 11/2010 Steinberg et al.
7,915.015 03/2011 Vogelstein et al.
8,114.027 02/2012 Triva
ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТЫ США (US PATENT APPLICATIONS):
LS2001/024801
01/2001
Nair
US2004/267181
06/2004
Tuiteetal.
US2006/216830
03/2005
Alfresa Pharrna Corp.
LS2005/155440
06/2005
Kanjilal et al.
LS2008/034899
06/2005
Alfresa Pharrna Corp.
LS2008/097238
07/2005
Loktionov et al.
US2006/088862
09/2005
Lee
US2006/188939
02/2006
Gao
US2010/000341
12/2006
Nipro Corp.
US2008/199851
02/2007
Egan et al.
US2009/171245
05/2007
Uhlet al.
US2009/197283
09/2008
Gold et al.
US2010/121046
09/2009
Mayo Foundation
US2011/087133
04/2010
Chingetal.
US2011/189673
02/2011
Olympus Corp.
ДРУГИЕ ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ:
JP2004251851
02/2003
Japan Clinical Lab Inc.
EP1366715
05/2003
Sentinel CHS.R.L
EP1776048
04/2007
Loktionov et al.
WO08/152980
06/2OO7
Olympus Corp.
JP2009115658
11/2007
Olympus Corp.
EP2108314
10/2009
LaStella
WO2010/061023
06/2010
Capella
VVO2010/089538
08/2010
Joost
W011/064423
09/2010
Durvizetal
ДРУГИЕ ПУБЛИКАЦИИ:
Allison etal. (1996) N Engl J Med 334: 155-159
Allison et al. (2007) J Natl Cancer Inst 99: 1462-1470.
Anderson et al. (2011) Int J Colorectal Dis26 :1287-1297.
Baderetal. (1952) Cancer 5: 307-314.
Bandaletova et al. (2002)APMIS 110:239-246.
Elurch et al. (2007) J Med Screen 14: 132-137.
Collins et al. (2005) Ann Intern Med 142: 81-85.
Duffy etal. (2011) Int J Cancer 128: 3-11.
Ferlay et al. (2010) Int. J. Cancer 127: 2893-2917.
Foell et al. (2009) Gut 58: 859-868.
Glockner et al (2009) Cancer Res 69:4691-4699.
Greegor (1969) CA Cancer J Clin 19: 330-337.
Haeberle et al (2007) Lab Chip 7: 1094-1110.
Hamaya etal. (2010) Br J Cancer 5 102: 916-921.
Hellebrekers et al. (2009) Clin Cancer Res 15: 3990-3997.
Hoff et al, (2010) Gut 59: 407-414.
Imperiale et al. (2004) N Engl J Med 351: 2704-2714.
Itzkowte (2009) Gastroenterology 101: 1225-1227.
Iyengar et al. (1992) FASEB J 5: 2856-2859.
Jones et al. (2007) Cell 128: 683-692.
Lieberman. (2009) Curr Opin Gastroenterol 25: 422-427.
Link etal. (2010) Cancer Epid Biomarkers Prev 19: 1766-1774.
Lokt onov (2007) Int J Cancer 120: 2281-2289.
Loktionov et al., (1995) Int J Oncol 6: 437-445.
Loktionov et al. (1998) Clin Cancer Res 4: 337-342.
Loktionov et al. (2009) Int J Oncol 34: 301-311.
Loktionov etal. (2010) Int J Cancer 126:1910-1919.
Mao et al. (2009) Anal Chem 15: 1660-1668.
Matsuo et al. (1997) Gut 40: 782-789.
Molodecky etal. (2012) Gastroenterology 142 : 46-54.
Nagasaka et al- (2009) J Natl Cancer Inst 101: 1244-1258.
Nechvataletal. (2008) J Microbiol Methods 72: 124-132.
Ransohoff (2009) Ann Intern Med 150: 50-52.
Richards (2009) Br J Cancer 101: S125-S129.
Wallin et al. (2010) Int J Colorectal Dis 25: 1071-1078.
Whnney et al. (2004) J Mol Diagn 6: 386-395.
Wong et al. (2007) Gut 56: 140-148.
Yu et al. (2008) Cancer Epid Biomarkers Prev 17: 455-458.
Zou et al. (2007) Clin Chem 53: 1646-1651.
Краткое изложение изобретения
В качестве первого объекта настоящего изобретения представлен неинвазивный способ сбора образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки, включающий взятие на сваб образца содержащего клетки слоя слизи, происходящего из указанного кишечника или кишки, с поверхности анальной области вблизи от наружного отверстия заднего прохода, когда указанный образец берется после дефекации. Предпочтительнее клетки кишечника или кишки происходят из внутренней стенки нижних отделов кишечника или толстой кишки. Еще более предпочтительно содержащий клетки слой слизи происходит из нижних отделов кишечника.
В одном варианте осуществления данного изобретения образец берется на сваб в течение 5 мин с момента дефекации и до очищения анальной области. Предпочтительнее образец берется на сваб в течение 4, 3, 2 мин или 1 мин с момента дефекации.
Данный способ может также включать помещение упомянутого образца содержащего клетки слоя слизи на свабе в сохраняющую или лизирующую среду. Сохраняющая среда может содержать концентрированный раствор соли. Растворенная соль может быть сульфатом аммония. Альтернативно может использоваться высококонцентрированный раствор цитрата натрия, бисульфата аммония, ацетата аммония или хлористого натрия. Сохраняющая среда может быть жидкостью (например, раствором, суспензией, эмульсией) или гелем.
Следующий объект данного изобретения представлен способом диагноза заболеваний кишечника, включающим в себя сбор образца клеток кишечника или клеток кишки или фрагментов клеток, используя любой способ, сформулированный выше, и анализ вышеупомянутого образца на присутствие одного или нескольких (более чем одного) маркеров, специфичных для заболеваний кишечника (биомаркеров).
Анализ специфичных для заболевания кишечника маркеров может включать анализ морфологии интактных клеток (например, типа клеток, их формы, размера, количества и/или присутствия in situ специфичных для заболевания последовательностей ДНК, РНК или белков) и/или выявления и количественного определения одного или нескольких (более чем одного) специфичных для заболевания биомаркеров, освобожденных из клеток при их лизисе. Специфичные для заболеваний кишечника биомаркеры могут включать общее количество ДНК, а также ряд специфичных молекулярных маркеров, в том числе: относящихся к ДНК генетических маркеров, связанных либо с мутациями, либо с эпигенетическими изменениями (например, с метилированием ДНК); относящихся к РНК генетических маркеров, отражающих уровни экспрессии определенных генов; белковых маркеров, которые указывают на присутствие определенных ферментов или регуляторных белков.
Относящиеся к ДНК генетические маркеры, связанные с мутациями, могут быть выявлены и определены количественно для таких генов как АРС, AXIN2, KRAS, ТР53 (р53), STK11, PTEN, BRCA1, BRCA2, СНЕК2 BMPR1A, PIC3CA, SMAD4 (DPC4), MLH1, TACSTD1, MYH (MutYH), MSH2, MSH6, PMS2, BLM, KIT, PDGFRA, NOD2 (CARD15), ATG16L1, IL-23, IL12B, STAT3, NKX2-3, TGFBR2, IGF2R, BAX, ACVR2, SEC63, AIM2, KIAA0977, PA2G4/EBP1, hBUB1, ATM, ATR, STK15, PLK1, CDC.
Относящиеся к ДНК генетические маркеры, связанные с нарушенным метилированием определенных последовательностей генов, могут быть выявлены и определены количественно для таких генов, как SFRP1, SFRP2, GATA4, GATA5, TFPI2, ген специфического рецептора p онкостатина М, RASSF2,
CDKN2, NDGR4, MAL, ген О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы, ген интегрина а4, ген септина 9, ген виментина, CDX1, TIMP3. Относящихся к РНК генетические маркеры, отражающие уровни экспрессии генов, могут быть выявлены и определены количественно для таких генов как HMGIV, с-Мус, ген СТР-синтетазы, ген сурвивина, VEGF, В-myb, ATDC, EB1, BRCA2, МАРК3, ген карбоангидразы II, ген связанной с раковоэмбриональным антигеном молекулы клеточной адгезии 1, TRAIL, ADAMTS1. Белковые маркеры могут включать такие белки как М2-пируваткиназа, кальпротектин, лактоферрин, белок S100A12, миелопероксидаза, эластаза полиморфонуклеарных гранулоцитов, катионный протеин эозино-филов, нейротоксин эозинофилов (EDN), лизоцим, цитокератин 18, фактор роста эндотелия сосудов, фактор некроза опухолей - а, интерлейкины 6, 1 и 8, Д-димер. Выявление и количественное определение одного или нескольких (более чем одного) специфичных для заболеваний кишечника биомаркеров может включать выявление и количественное определение ДНК, РНК или белка, соответствующих маркерам, специфичным для заболевания, в частности одного из вышеупомянутых молекулярных маркеров. Ряд количественных способов, включая гибридизацию нуклеиновых кислот, различные варианты ПЦР в реальном времени (для анализа нуклеиновых кислот), иммунохимические подходы (для белков) и способы, основанные на применении биосенсоров, могут использоваться для количественного определения биомаркеров.
Дополнительный объект данного изобретения представлен способом скрининга заболеваний кишечника, предполагающим применение вышеописанного способа. Способ скрининга включает скрининг индивидов, не имеющих симптомов заболевания.
Следующий объект данного изобретения представлен способом мониторинга заболеваний кишечника, предполагающим применение вышеописанного способа. В частности, способ мониторинга включает мониторинг течения заболевания кишечника.
Следующий объект данного изобретения представлен способом проверки эффективности лечения болезни кишечника, предполагающим применение вышеописанного способа. В частности, способ проверки эффективности лечения болезни включает оценку уровня активности воспаления кишечника. Для этого необходимо применение количественных или полу-количественных способов, обеспечивающих количественное определение биомаркеров.
Заболевания кишечника могут включать колоректальные заболевания, в том числе колоректальный рак, анальный рак и воспалительные заболевания кишечника. Воспалительные заболевания кишечника могут включать болезнь Крона и ульцеративный колит (УК). К воспалительным заболеваниям кишечника также могут быть отнесены микроскопический колит (включает коллагеновый колит и лимфоцитар-ный колит), ишемический колит, диверсионный колит, аллергический колит и болезнь Бехчета. Заболевания кишечника могут также включать колоректальные полипы, целиакию и синдром раздраженного кишечника.
Еще один объект данного изобретения представлен устройством для применения вышеописанного способа, которое включает сваб (тампон на стержне или зонд-тампон), а также сохраняющую или лизи-рующую среду.
Сваб может также включать пористый материал для сбора образцов, соединенный с экспресс-тестом.
В качестве материала для сбора образцов может быть применен ворсинчатый ("бархатный") нейлон.
Устройство может также включать гелевую пробку. Предпочтительно гелевая пробка используется в комбинации с жидкой сохраняющей средой или жидкой лизирующей средой.
Еще один объект данного изобретения представлен устройством для применения вышеописанного способа, которое включает пористый материал для сбора образцов, соединенный с экспресс-тестом (тестом-полоской или струйным тестом). Устройство может также иметь держатель образца, снабженный крышкой: при этом система вышеупомянутого экспресс-теста включает тестовую полоску, соединяющую вышеупомянутые крышку и материал для сбора образцов, и вышеупомянутая крышка содержит систему, обеспечивающую капиллярный эффект.
Экспресс тест (lateral flow test, тест-полоска или струйный тест) может представлять собой иммуно-химический тест или тест, основанный на гибридизации нуклеиновых кислот. В случае использования иммунохимического теста тестовая полоска содержит антитела, специфичные для молекулярных маркеров заболевания кишечника. В случае использования экспресс-теста для количественного определения нуклеиновых кислот, тестовая полоска может содержать олигонуклеотидные пробы, специфичные для генетических маркеров заболевания кишечника. В другом варианте пробы, включающие олигонуклеоти-ды или трифосфаты нуклеотидов, меченые, например, биотином или дигоксигенином, могут добавляться в среду и определяться с помощью меченых стрептавидином микрочастиц золота или латекса или антител, которые могут быть либо инкорпорированы в абсорбирующий элемент, соединенный с тестовой полоской, либо иммобилизованы на самой тестовой полоске. В еще одном варианте пептидные нуклеиновые кислоты, специфичные к последовательностям или рандомные, могут использоваться в качестве выявляющего компонента тестовой полоски. Вышеописанные маркеры могут быть маркерами заболеваний кишечника.
В варианте осуществления данного изобретения, в котором собранный образец сохраняется для последующего лабораторного анализа, сохраняющая среда является средой, пригодной для сохранения образца клеток кишечника или кишки. Сохраняющая среда может содержать концентрированный раствор соли. Растворенная соль может быть солью аммония. Альтернативно может использоваться концентрированный раствор цитрата натрия, бисульфата аммония, ацетата аммония или хлористого натрия. Сохраняющая среда может быть жидкостью (например, раствором, суспензией, эмульсией) или гелем.
Лизирующий буферный раствор является любым буферным раствором, обеспечивающим лизис клеток. В частности, лизирующий буферный раствор может содержать буферный раствор, сурфактант и/или детергент и хелирующий агент.
Лизирующий буферный раствор может также включать олигонуклеотидные праймеры, специфичные для выявления генетических маркеров заболеваний кишечника, вместе с реагентами для проведения изотермальной ПЦР (полимеразной цепной реакции). В частности, олигонуклеотидные праймеры могут быть специфичны для выявления генов, специфичных для заболеваний кишечника и описанных выше.
В другом объекте данного изобретения, когда необходимо сохранение образца для доставки в лабораторию, а не немедленный анализ, представлена жидкая или гелевая среда для применения в вышеописанном способе, где среда представляет собой концентрированный раствор соли.
Раствор соли может быть раствором соли аммония. Альтернативно может использоваться концентрированный раствор цитрата натрия, бисульфата аммония, ацетата аммония или хлористого натрия.
Гелевая среда может, кроме того, содержать желирующий агент. Желирующий агент может быть агарозой, акриламидом, желатином или пектином. Предпочтительно желирующим агентом является ага-роза. Более предпочтительно желирующим агентом является 0,25% агароза.
В предпочтительном варианте осуществления гель содержит не более 25% сульфата аммония (в объемных процентах) и не более 0,25% агарозы (в весообъемных процентах). Альтернативно, гель содержит 25% сульфата аммония (в объемных процентах) и 0,25% агарозы (в весообъемных процентах).
Предпочтительно гель содержит раствор соли, причем раствор соли не является насыщенным.
Дополнительные цели настоящего изобретения
Целью настоящего изобретения является представить устройство и способ для сбора образца, содержащего клетки слоя колоректальной слизи, с поверхности анальной области человеческого индивида и тестирования вышеупомянутого образца на присутствие биомаркеров колоректальных заболеваний, которые также упоминаются в этом документе как маркеры, специфичные для заболевания.
Изобретение представляет приспособления для сбора образцов, способ сбора образцов, способы сохранения образцов, способы определения биомаркеров, а также способы выявления заболеваний, скрининга, диагностики и мониторинга, сформулированные в прилагаемых независимых пунктах формулы изобретения. Предпочтительные, обеспечивающие преимущества, и дополнительные черты изобретения описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.
Варианты осуществления настоящего изобретения удовлетворяют потребности, объясненные в представляющем существующую информацию (предпосылки изобретения) разделе этого документа. Например, в соответствии с первым вариантом осуществления данного изобретения, устройство для сбора фрагментов содержащего клетки слоя колоректальной слизи с поверхности анальной области может быть свабом, состоящим из стержня и головки, сделанной из абсорбирующего материала (также упомянутой в этом документе как элемент для сбора образца или пористый материал для сбора образцов), присоединенной к дистальному концу стержня.
Такое устройство может использоваться для неинвазивного сбора (производимого самим тестируемым индивидом) богатого фрагментами содержащего клетки слоя колоректальной слизи материала, экс-кретированного во время естественного акта дефекации и остающегося на поверхности анальной области сразу после упомянутого акта. Сбор материала может быть осуществлен путем быстрого прикосновения элемента для сбора образца приспособления к поверхности анальной области, до гигиенического очищения упомянутой области.
В следующем объекте данного изобретения проксимальный конец стержня приспособления для сбора образца присоединен к внутренней поверхности крышки, соответствующей лабораторной пробирке.
В следующем объекте данного изобретения крышка, прикрепленная к проксимальному концу стержня приспособления для сбора образца, является закручивающейся (винтовой) крышкой.
Во втором варианте осуществления данного изобретения стержень сваба заменен на тестовую полоску экспресс-теста (тест-полоски или струйного теста), формируя устройство для экспресс-теста.
В следующем объекте данного изобретения закручивающаяся крышка, прикрепленная к концу тестовой полоски, содержит систему, обеспечивающую капиллярный эффект (wicking pad).
В следующем объекте данного изобретения устройство для экспресс-теста поставляется внутри лабораторной пробирки, обеспечивающей защиту элемента для сбора образца от внешних загрязнений.
В следующем объекте данного изобретения устройство для экспресс-теста является одноразовым.
В третьем варианте осуществления данного изобретения пробирка, содержащая сваб или устройство для экспресс-теста, является частью комплекта.
В следующем объекте данного изобретения комплект включает пробирку, содержащую сваб или устройство для экспресс-теста, а также подобную пробирку, содержащую буферный раствор или среду.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор или среда является сохраняющей клетки или фиксирующей средой, обеспечивающей сохранение структур клеток для последующего цитологического и/или иммуноцитохимического анализа. Такой буферный раствор или среда упоминается в данном документе как сохраняющая среда или среда для хранения.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор является лизирующим буферным раствором или средой, обеспечивающим лизис клеток и освобождение биомолекул для дальнейшего анализа.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор является стабилизирующей средой, обеспечивающей стабилизацию белков и нуклеиновых кислот для дальнейшего анализа белков и/или нуклеиновых кислот. Такой буферный раствор может также рассматриваться как среда для хранения.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор или среда для хранения содержит высокую концентрацию соли, вызывающую преципитацию белков, предотвращающую аутолиз и разложение и ингибирующую деятельность микроорганизмов.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор или среда для хранения или стабилизации является жидкостью.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор или среда для хранения или стабилизации является жидкостью, изолированной под пробкой геля.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор или среда для хранения или стабилизации является гелем.
В следующем объекте данного изобретения буферный раствор или среда для хранения или стабилизации пропитывает губку.
В следующем объекте данного изобретения тестовая полоска приспособления для экспресс-теста содержит иммунохимический тест для количественного определения белков.
В следующем объекте данного изобретения тестовая полоска приспособления для экспресс-теста содержит компоненты реакций для качественного и количественного определения ДНК.
В следующем объекте данного изобретения комплект включает реагенты для проведения полиме-разной цепной реакции (ПЦР), включая олигонуклеотидные праймеры, ферменты, дезоксирибонуклео-зидтрифосфаты и соответствующие буферные растворы.
Любое из приспособлений или комплектов, описанных выше, применимо для сбора биологических образцов из естественных отверстий тела, включая уретру, влагалище, носовую полость, наружный слуховой проход и ротовую полость, а в особенности из ануса.
Любое из приспособлений или комплектов, описанных выше, приемлемо для использования на животных, а в частности, на людях.
Любое из приспособлений или комплектов, описанных выше, применимо для сбора образцов фрагментов содержащего клетки слоя колоректальной слизи, который содержит эксфолиированные клетки, происходящие из кишечника (например, колоноциты и свободные клетки, в том числе клетки воспаления).
В четвертом варианте осуществления данного изобретения представлен способ сбора образцов фрагментов содержащего клетки слоя колоректальной слизи с поверхности анальной области сразу после естественного акта дефекации. Данный способ включает следующие элементы:
после естественного акта дефекации поднести элемент для сбора образца приспособления для сбора образцов к анальной области;
прикоснуться поверхностью элемента для сбора образца к поверхности слизистой/кожи, покрытой остатками экскретированного материала, богатыми фрагментами содержащего клетки слоя колоректаль-ной слизи;
убрать устройство для сбора образцов от анальной области, избегая контакта с любой другой поверхностью;
в следующем объекте данного изобретения способ включает следующие элементы: поместить устройство для сбора образцов в пробирку, содержащую среду или буферный раствор; погрузить элемент для сбора образца в среду или буферный раствор; герметически закрыть пробирку.
Любой из способов, описанных выше, применим для сбора экскретов/биологических образцов из естественных отверстий тела, включая уретру, влагалище, носовую полость, наружный слуховой проход и ротовую полость, а в особенности из ануса.
Обор образцов фрагментов содержащего клетки слоя колоректальной слизи с поверхности аналь-ной/перианальной области в общем возможен только сразу после естественного акта дефекации.
Сбор образцов фрагментов содержащего клетки слоя колоректальной слизи с поверхности аналь-ной/перианальной области после естественного акта дефекации лучше всего производится самим тестируемым индивидом.
В пятом варианте осуществления данного изобретения представлен способ анализа образцов. Дан
ный способ включает любой из способов, описанных выше, а также включает отделение образца от приспособления для сбора образцов и использование образца в аналитической процедуре.
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца выбирается из следующих способов прямое количественное определение ДНК, выделение ДНК с последующим количественным определением и молекулярным анализом, выделение РНК с последующим молекулярным анализом, количественное определение белков иммунохимическими способами и цитологическое исследование.
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца включает применение приспособления, работающего по принципу экспресс-теста (тест-полоски или струйного теста).
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца с помощью приспособления, содержащего экспресс-тест, представляет собой иммунохимический тест для количественного определения специфического белка.
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца с помощью приспособления, содержащего экспресс-тест, представляет собой количественное определение специфических последовательностей ДНК или общей концентрации ДНК человека с помощью гибридизации ДНК.
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца с помощью приспособления, содержащего экспресс-тест, представляет собой селективное количественное определение ДНК человека в присутствии загрязняющих молекул чужеродной ДНК (ДНК других видов).
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца включает амплификацию ДНК с помощью ПЦР.
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца ПЦР может быть петлевой изо-термальной амплификацией (LAMP).
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца может выполняться как тест "у постели больного".
В следующем объекте данного изобретения способ анализа образца может выполняться как самотестирование.
В шестом варианте осуществления данного изобретения представлен способ выявления заболевания у больных, имеющих симптомы. Данный способ включает любой из способов, описанных выше, а также включает выработку заключения о наличии или отсутствии заболевания.
В следующем объекте данного изобретения способ выявления заболевания представлен как способ выявления колоректальных заболеваний.
В следующем объекте данного изобретения способ выявления заболевания представлен как способ выявления колоректального рака (КРР).
В следующем объекте данного изобретения способ выявления заболевания представлен как способ выявления анального рака.
В следующем объекте данного изобретения способ выявления заболевания представлен как способ выявления воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК).
В следующем объекте данного изобретения способ выявления заболевания представлен как способ выявления предраковых колоректальных полипов.
В седьмом варианте осуществления данного изобретения представлен способ мониторинга заболеваний. Данный способ включает любой из способов, описанных выше, а также включает выработку заключения о течении заболевания.
В следующем объекте данного изобретения способ мониторинга заболевания представлен для оценки течения колоректальных заболеваний.
В следующем объекте данного изобретения способ мониторинга заболевания представлен для оценки пост-операционных рецидивов колоректального рака (КРР).
В следующем объекте данного изобретения способ мониторинга заболевания представлен как мониторинг активности воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК).
В следующем объекте данного изобретения способ мониторинга заболевания представлен как сценка эффективности консервативной терапии у больных с воспалительными заболеваниями кишечника
(ВЗК).
В восьмом варианте осуществления данного изобретения представлен способ скрининга колорек-тального рака (КРР). Данный способ включает любой из способов, описанных выше, а также включает выработку заключения о наличии или отсутствии колоректального рака у индивида, не имеющего симптомов.
В следующем объекте данного изобретения способ скрининга колоректального рака (КРР) представлен для использования в качестве самооценки (самотестирования).
В следующем объекте данное изобретение представляет способ для сохранения медицинских или биологических образцов, собранных с помощью сваба, обеспечивающий их временное хранение или транспортировку при температуре окружающей среды при минимальном уровне деградации.
Данное изобретение включает стандартную систему сваба, которую после взятия образца можно поместить в герметически закрывающуюся пробирку. Предпочтительно сваб состоит из стержня с головкой (т.е. элементом для сбора образца или материалом для сбора образца), сделанной из натуральных
волокон (хлопок или целлюлоза) на дистальном конце и закручивающейся (винтовой) крышкой на проксимальном конце, позволяющей герметически закрывать сваб в пробирке. Пробирка содержит стабилизирующую среду или среду для хранения, тип которой зависит от целей, для которых система применяется. Когда сваб помещается в пробирку, головка сваба погружается в среду.
Образцы, собранные для последующего молекулярно-диагностического анализа, например ПЦР, генетической дактилоскопии или иммунохимического определения белков, должны быть защищены от деградации макромолекул. В этом варианте осуществления данного изобретения, высококонцентрированный раствор соли должен использоваться в качестве стабилизирующей среды или среды для хранения. Такой раствор вызывает преципитацию белков в образце, предотвращая аутолиз. Он также ингиби-рует действие микроорганизмов, предотвращая разложение образца. Образец в таком растворе в основном остается на головке сваба, не переходя в раствор. Первая стадия последующего анализа требует вновь суспендировать образец в буферном растворе, способном растворить молекулярные компоненты образца.
Вариант осуществления данного изобретения, в котором концентрированный раствор соли применяется как стабилизирующая среда или среда для хранения, может существовать в ряде форматов. Раствор может находиться в пробирке, как простая жидкость, но для удобства манипуляций в "полевых" условиях может быть предпочтительно представить его в виде геля, пропитанной губки или жидкой среды, находящейся под пробкой геля.
Растворы, вызывающие преципитацию, можно также использовать для комбинированного цитологического и молекулярного анализа образцов, поскольку клетки эукариот и прокариот также сохраняются в таких концентрированных растворах солей. Однако, при очень высоких концентрациях солей морфология клеток может страдать. В связи с этим, менее концентрированные солевые растворы, фиксаторы или коммерческие смеси, например PreservCyt, используемый в ПАП-тестах, являются оптимальными, если образцы сохраняются специально для цитологического анализа. Эти растворы также совместимы с форматами, приведенными выше (жидкая среда, гель, пропитанная губка или среда, находящаяся под пробкой геля).
Среды, применяемые для микробиологических образцов, также могут применяться, как дополнительный вариант осуществления данного изобретения. Тогда как гели, приготовленные на основе среды Стюарта (например, поставляемой BD Biosciences), в настоящее время широко используются в больницах для транспортировки тампонов на стержне, подобные среды можно использовать как в виде жидкостей, так и для пропитки губки или как жидкие среды под пробкой геля, если жидкая среда предпочтительнее, чем гель, для некоторых типов микроорганизмов.
Краткое описание фигур
Настоящее изобретение теперь будет описано, исключительно в порядке приведения примеров, со ссылкой на приведенные рисунки, в которых:
фиг. 1 показывает первичную эволюцию простейшей версии приспособления для сбора фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки с поверхности анальной/перианальной области. Эта версия может быть представлена как сваб (А), состоящий из стержня (1) и головки, сделанной из абсорбирующего материала (элемента для сбора образца или материала для сбора образца) (2), присоединенной к дистальному концу стержня. В более развитой базисной версии приспособления для сбора образцов (В) стержень сваба присоединен к внутренней поверхности крышки (3), совместимой с лабораторной пробиркой.
Лабораторная пробирка с устройством для сбора образцов внутри, как она должна быть представлена для сбора образцов, показана как (С).
Другая лабораторная пробирка (5), содержащая буферный раствор или среду (6) и герметически закрытая крышкой (7), показана как (D). Взятые вместе С и D составляют простейший комплект, выдаваемый для сбора образца.
Базисная версия приспособления для сбора образцов с уже собранным образцом фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки (8) показана как (Е)
Образец, полученный с помощью базисной версии приспособления для сбора образцов, погруженный в буферный раствор или среду и подготовленный к отправке в лабораторию, показан как (F).
Фиг. 2 показывает вариант базисной версии приспособления (А) и ряд вариантов осуществления, относящихся к формату среды для хранения в герметически закрытой пробирке: простая жидкая среда (В), гель (С), пропитанная средой губка (D) и среда под пробкой геля (Е). Для каждого случая пробирки показаны без приспособления и с устройством внутри. После сбора образца крышка пробирки, содержащей среду (7), выбрасывается, устройство переносится в пробирку со средой, и крышка, соединенная со стержнем приспособления, закручивается. Пластиковая пробирка (5) может либо иметь форму песочных часов, для облегчения прохождения элемента для сбора образца сквозь гель, либо быть обычной формы в вариантах, не предполагающих применения геля. Жидкая среда (6) или гель (9) могут использоваться для сохранения и хранения образца. В другом варианте пропитанная средой губка используется для сохранения образца (10). В губке есть цилиндрическая выемка, обеспечивающая контакт элемента для сбора образца с поверхностью губки. В другом варианте среда для сохранения/хранения (12) находится под проб
кой геля (11).
Фиг. 3 показывает базисную версию приспособления для сбора образцов (А) и усовершенствованную версию, включающую тестовую полоску (lateral flow strip) и формирующую устройство, содержащее экспресс-тест (В), а также устройство, содержащее экспресс-тест, после сбора образца, когда элемент для сбора образца уже погружен в буферный раствор (С). Показаны следующие элементы приспособления, содержащего экспресс-тест (lateral flow strip device) (В):
13 - зона для нанесения образца (sample pad), функция которой отчасти выполняется элементом для сбора образца (2). Эта зона, за счет своих абсорбирующих свойств и пористости, обеспечивает первоначальную доставку и фильтрацию образца;
14 - зона конъюгата (conjugate pad). В одном варианте осуществления эта зона содержит наночасти-цы коллоидального золота, или латекса, или углерода и т.д.;
15 - линия теста (test line). В одном варианте осуществления, линия теста содержит антитела, специфичные к избранной цели (например, к молекулярному маркеру, специфичному для заболевания кишечника), продуцирующие результат теста, который может быть количественным (дополнительные линии теста, содержащие специфически подобранные концентрации выявляющего агента могут быть использованы для отработки количественного способа или выявления множественных биомаркеров);
16 - контрольная линия (control line), обеспечивающая подтверждение успешного завершения теста;
17 - нитроцеллюлозная мембрана, поддерживающая капиллярный ток жидкости по тестовой полоске;
18 - модифицированная крышка пробирки, содержащая абсорбирующее устройство для создания капиллярного эффекта (wicking pad или absorbing pad), обеспечивающего капиллярный ток жидкости через устройство.
19 - пластиковый корпус, защищающий тестовую полоску (может быть непрозрачным, только с окошечками, соответствующими линии теста (15) и контрольной линии (16)).
Фиг. 4 показывает продольный разрез прямой кишки, ануса и соседних органов человека. А - Прямая кишка пуста между двумя нормальными актами дефекации. Происходит постепенное накопление содержащего клетки слоя слизи на поверхности слизистой прямой кишки.
20 - прямая кишка; 21 - анус; 22 - содержащий клетки слой слизи, покрывающий слизистую прямой кишки.
В - Стул (23) начинает поступать в прямую кишку. На этой стадии еще нет значительного контакта между стулом и содержащим клетки слоем слизи прямой кишки.
С - Прямая кишка заполнена стулом (каловыми массами), который вступает в тесный контакт с содержащим клетки слоем слизи прямой кишки. Мышечные сокращения прямой кишки, предшествующие дефекации, усиливают этот контакт.
D - Дефекация. Стул эвакуируется из прямой кишки за счет координированных сокращений прямой кишки и открытия заднего прохода. Значительная часть содержащего клетки слоя слизи прямой кишки эвакуируется вместе со стулом, преимущественно находясь на поверхности стула и на стенках заднего прохода (как дополнительная смазка). Фрагменты содержащего клетки слоя слизи прямой кишки (24) остаются на поверхности наружной анальной/перианальной области, часто смешанные с фрагментами стула.
Е - Непосредственно после дефекации. Количество содержащего клетки слоя слизи прямой кишки значительно уменьшилось после дефекации. Экскретированные фрагменты этого слоя остаются на поверхности наружной анальной/перианальной области (и удаляются при гигиеническом очищении, если не планируется сбор образца).
F - Сбор экскретированных фрагментов содержащего клетки слоя слизи прямой кишки с помощью базисной версии приспособления для сбора образцов, описанного в настоящем изобретении.
Фиг. 5 показывает микрофотографию одиночного эксфолиированного колоноцита, полученного здоровым волонтером путем сбора образца фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки с поверхности анальной/перианальной области сразу после дефекации у себя самого. Типичная продолговатая форма клетки не оставляет сомнений при ее классификация. (Гематоксилин и эозин, х400). Низкий уровень фекального загрязнения. Присутствует слизь.
Фиг. 6 показывает микрофотографию группы эксфолиированных колоноцитов, полученных здоровым волонтером путем сбора образца фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки с поверхности анальной/перианальной области сразу после дефекации у себя самого. Все клетки имеют типичную продолговатую форму; они очень хорошо сохранились. (Гематоксилин и эозин, х400). Низкий уровень фекального загрязнения.
Фиг. 7 показывает микрофотографию погруженной в слизь большой группы эксфолиированных ко-лоноцитов, полученных здоровым волонтером путем сбора образца фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки с поверхности анальной/перианальной области сразу после дефекации у себя самого. Все клетки имеют типичную продолговатую форму. Присутствие слизи (остатков содержащего клетки слоя слизи) несколько искажает видимые контуры некоторых клеток. (Гематоксилин и эозин,
х 400). Низкий уровень фекального загрязнения.
Фиг. 8 показывает микрофотографию, демонстрирующую обильное присутствие нейтрофильных лейкоцитов в слизи, полученной при сборе образца фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки с поверхности анальной/перианальной области сразу после дефекации у маленького ребенка, страдающего воспалительным заболеванием кишечника (сбор образца произведен родителем). Все ней-трофилы имеют типичные сегментированные ядра. (Гематоксилин и эозин, х400). Низкий уровень фекального загрязнения.
Детальное описание изобретения
Как было отмечено выше, существует насущная необходимость разработки неинвазивного, простого и недорогого способа получения образцов содержащего клетки слоя слизи, в особенности содержащего клетки слоя слизи кишечника и прямой кишки. Нам удалось установить, что значительная доля содержащего клетки слоя слизи прямой кишки эвакуируется совместно со стулом и, что особенно важно, после дефекации фрагменты содержащего клетки слоя слизи остаются на поверхности внешней аналь-ной/перианальной области. Эти фрагменты обычно удаляются при гигиеническом очищении после дефекации. Однако, было установлено, что эти фрагменты могут быть успешно собраны, а потом подвергнуты анализу, если применить устройство для сбора образцов, описанное в настоящем документе.
Базисная и усовершенствованная версии приспособления для неинвазивного сбора фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки
Различные версии приспособления для сбора образцов, описанного выше, представлены на рисунках 1, 2 и 3.
Первый вариант осуществления данного изобретения представляет собой базисную версию приспособления для сбора образцов, которую можно описать как сваб, состоящий из тонкого пластмассового (например, полипропиленового) стержня (1) и элемента для сбора образца или головки (2), который должен быть сделан из пористого материала, такого как целлюлоза, хлопковая вата, нейлон, синтетическая губка, ворсинчатый ("бархатный") нейлон и т.п. Комбинированная длина стержня и элемента для сбора образца (см. фиг. 1А) должна составлять около 100мм, что обеспечит идеальную совместимость с полипропиленовой лабораторной пробиркой, например, Falcon(tm) (BD Biosciences).
Материал элемента для сбора образца может быть избран в соответствии со специфическими целями сбора образцов (например, преследуя цели сбора интактных клеток для цитологического или in situ анализа, сохранения белков и РНК, последующего анализа ДНК). Форма элемента для сбора образца может быть овальной или округлой (предпочтительно предотвращающей введение элемента для сбора образца в задний проход во время сбора образца). Ширина элемента для сбора образца должна быть в пределах 10 мм, что обеспечивает совместимость с лабораторной пробиркой.
В базисной версии приспособления для сбора образцов, пластмассовый стержень (1) надежно прикреплен к внутренней поверхности крышки лабораторной пробирки (3), как показано на фиг. 1В и 2А. Базисная версия приспособления должна храниться до использования в герметически закрытой пробирке, как показано на фиг. 1С.
Второй вариант осуществления данного изобретения предполагает включение экспресс-теста вместо стержня, как показано на фиг. 3В. Эта модификация позволяет объединить функции сбора и анализа образцов в одном приспособлении, называемом здесь устройством, содержащим экспресс-тест.
Экспресс-тесты данного типа (известные как lateral flow assays, а также тест-полоски или струйные тесты) представляют собой новые тесты, основанные на пассивном транспорте жидкостей под влиянием капиллярных сил (Haeberle et al., 2007). Такие тесты, представленные в формате микрофлюидных платформ получают распространение как удобные решения в ситуациях, требующих тестирования "у постели больного" или само-тестирования. Обычно они производятся как недорогие одноразовые тестирующие приспособления и могут быть адаптированы для применения различных технологий, в особенности основанных на иммунохимическом тестировании, хотя гибридизационные способы количественного анализа ДНК также начинают применяться (Мао et al., 2009).
Фиг. 3В показывает предлагаемую усовершенствованную версию приспособления для сбора образцов, включающую тестовую полоску часто используемого типа. В то время, как точные спецификации такие аналитических компонентов теста как зона конъюгата (14), линия или линии теста (15) и контрольная линия (16) должны быть определены в соответствии со специфическими целями тестирования (например, количественное определение человеческой ДНК или выявление определенных белков), оригинальные элементы представленного дизайна включают объединение зоны для нанесения образца (13) экспресс-теста с элементом для сбора образца (2) приспособления, а также введение модифицированной крышки пробирки, содержащей абсорбирующее устройство для создания капиллярного эффекта (18). Объединение зоны для нанесения образца экспресс-теста с элементом для сбора образца может предоставлять дополнительную защиту собранных образцов от фекального загрязнения, которое может быть значительным в некоторых случаях.
Устройство, содержащее экспресс-тест, описанное выше, будет одноразовым.
Базисная и усовершенствованная версии комплекта для неинвазивного сбора фрагментов содержа
щего клетки слоя слизи толстой кишки
Третий вариант осуществления данного изобретения вводит понятие комплекта, либо для сбора образцов, либо для сбора и анализа образцов. Базисная версия комплекта показана на фиг. 1С и 1D, где к приспособлению для сбора материала добавлена пробирка, содержащая буферный раствор или среду. Буферный раствор должен быть избран в соответствии с целями тестирования, поскольку различные буферные растворы или среды потребуются для сохранения клеток, анализа белков или нуклеиновых кислот. Базисная версия комплекта предназначена для первоначальной обработки образца (фиксация, сохранение/преципитация или лизис) для его надежного хранения и транспортировки в лабораторию для анализа. Ряд примеров сохраняющих буферных растворов или сред показан на фиг. 2.
Аналогично, буферные растворы должны быть специально приготовлены для любых специфических экспресс-тестов, которые могут проводиться немедленно, как показано на фиг. 3С. Это может обеспечить возможность само-тестирования, если добиться, чтобы полученные результаты легко и однозначно интерпретировались визуально. В другом варианте, устройство можно отправлять в лабораторию, где результат может быть квалифицированно оценен и интерпретирован по принципу теста "у постели больного". Еще один возможный вариант может предполагать сбор материала с помощью базисной версии комплекта и применение усовершенствованного приспособления, содержащего экспресс-тест, в лаборатории, по принципу теста "у постели больного". Анализ ДНК может быть очень важным вариантом тестирования образцов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки, в связи с чем возможность амплификации специфических последовательностей, в особенности в варианте петлевой изотермальной амплификации (LAMP), может быть желательным добавлением к рассматриваемому комплекту.
Способ неинвазивного сбора фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки
Четвертый вариант осуществления данного изобретения определяет способ сбора образцов фрагментов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки с поверхности анальной/перианальной области сразу после естественного акта дефекации. Физиологические механизмы, обосновывающие применение этого способа представлены на фиг. 4.
Представляется очевидным, что в настоящее время как существованию, так и роли содержащего клетки слоя слизи толстой кишки человека не уделяется большого внимания, и количество публикаций на эту тему невелико (Loktionov, 2007; Loktionov et al., 2009; Loktionov et al., 2010).
Фиг. 4А и 4В показывают, что в периоды, когда прямая кишка пуста между двумя актами дефекации, содержащий клетки слой слизи прямой кишки не подвергается влиянию каловых масс, как было установлено при его внутриректальном сборе (Loktionov et al., 2009; Loktionov et al., 2010). Когда прямая кишка заполняется стулом (см. фиг. 4С), содержащий клетки слой слизи вступает в тесный контакт со стулом, усиливающийся при мышечном сокращении прямой кишки, предшествующем дефекации. Это приводит к переносу части содержащего клетки слоя слизи на поверхность экскретируемого стула. Эта часть содержащего клетки слоя слизи затем эвакуируется вместе со стулом (фиг. 4D). Легко выявляемое присутствие элементов содержащего клетки слоя слизи на поверхности экскретированного стула (Lok-tionov et al., 1998; Bandaletova et al., 2002) отражает этот феномен. В то же время, было установлено, что положение содержащего клетки слоя слизи между стенкой кишки и экскретируемыми каловыми массами приводит к тому, что значительная часть содержащей клетки слизи оказывается на поверхности заднего прохода и, в конце концов, на поверхности анальной и перианальной области (см. фиг. 4D и 4Е). Хотя фекальное загрязнение различной степени также обычно в этой области после дефекации, присутствие клеточного материала, происходящего из кишки, весьма значительно (см. фиг. 5-8). Данные условия создают прекрасную возможность для неинвазивного сбора фрагментов содержащего клетки слоя слизи с поверхности анальной/перианальной области, как показано на фиг. 4F. Сбор фрагментов содержащего клетки слоя слизи из этой области никогда не предпринимался раньше.
Следует также отметить, что после дефекации количество содержащего клетки слоя слизи прямой кишки должно уменьшаться. Это мнение подтверждают ранее опубликованные наблюдения, свидетельствующие о том, что тест, основанный на интраректальном сборе эксфолиированных клеток работал значительно хуже, если образцы содержащего клетки слоя слизи собирались после подготовки кишечника (Loktionov et al., 2009). В связи с этим, необходимость определенного физиологического акта дефекации, как предпосылки сбора материала способом, описанным в настоящем изобретении, составляет важный естественный стандартизирующий фактор. Помимо этого, необходимость сбора образцов сразу после дефекации приводит к тому, что сбор образцов самим тестируемым индивидом становится предпочтительным способом применения приспособления для сбора образцов. Кроме того, абсолютная неинвазив-ность способа сбора образцов делает повторный сбор образцов чрезвычайно легким (сбор образцов можно повторить без малейшего вреда после следующей дефекации).
После того как образец содержащего клетки слоя слизи прямой кишки собран, он помещается в пробирку с буферным раствором или средой, как показано на фиг. 4F, 2 и 3 для базисной и усовершенствованной версий приспособления для сбора образцов. Затем, образец может быть либо отправлен для анализа в лабораторию, либо подвергнут анализу немедленно путем применения экспресс-теста. Последний вариант возможен только для усовершенствованной версии приспособления.
Хотя устройство, описанное в настоящем изобретении, первично предназначено для сбора фраг
ментов содержащего клетки слоя слизи с поверхности анальной области, оно может также применяться для сбора экскретов/биологических образцов из других естественных отверстий тела, включая уретру, влагалище, носовую полость, наружный слуховой проход и ротовую полость. Кроме того, очевидно, что сбор образцов из уретры может производиться сразу после физиологического акта мочеиспускания. Способы анализа образцов
Пятый вариант осуществления данного изобретения вводит широкий круг способов анализа образцов, которые могут применяться к собранным образцам. Основные способы, рассматриваемые в контексте потенциального клинического применения, включают: прямое количественное определение ДНК, выделение ДНК с последующим количественным определением и молекулярным анализом, выделение РНК с последующим молекулярным анализом или количественным анализом экспрессии генов, количественное определение белков иммунохимическими способами, а также цитологическое и иммуноцито-химическое исследование.
Все перечисленные способы, за исключением цитологических и иммуноцитохимических исследований, могут применяться на основе использования соответственно оборудованных версий приспособления, содержащего экспресс-тест. Это, вдобавок, позволяет тестирование крайне широкого круга диагностически важных биомаркеров.
Присутствие различных уровней фекального загрязнения в образцах содержащего клетки слоя слизи прямой кишки является потенциальной проблемой. Известно, что фекальное загрязнение представляло собой нежелательный фоновый фактор для ранее предложенных тестов для выявления КРР, основанных на количественном определении ДНК в собранных интраректально образцах эксфолиированных клеток кишки (Loktionov et al., 2009; Loktionov et al., 2010). Эта проблема может быть решена либо применением избирательного количественного определения ДНК, специфичной для человека, в присутствии чужеродной ДНК, в формате экспресс-теста (Мао et al., 2009), либо путем использования недавно появившихся основанных на ПЦР систем для избирательного количественного определения ДНК человека, таких как Quantifier Human DNA Quantification kit (Applied Biosystems) или AluQuant Human DNA Quantitation System (Promega).
Способы анализа образцов могут иметь различную степень сложности, но использование усовершенствованной версии настоящего приспособления (приспособления, содержащего экспресс-тест) должно позволить быстрое тестирование образцов в формате теста "у постели больного". Разработка одноразовых комплектов для само-тестирования (например, основанных на прямом количественном определении ДНК путем экспресс-теста), пригодных для выявления КРР, также может рассматриваться в данном контексте.
Применения для выявления заболеваний
Шестой вариант осуществления данного изобретения относится к выявлению заболеваний у больных, имеющих симптомы. Сбор и анализ образцов, относящийся к данному изобретению, преимущественно связан с колоректальными заболеваниями, в особенности КРР и ВЗК. Существующая информация (см. Предпосылки Изобретения) указывает, что использование клеточных элементов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки может быть намного информативнее для выявления КРР, чем ТСКК. С этой точки зрения биомаркеры КРР, связанные с ДНК, представляются наиболее адекватными. Использование количественного определения ДНК, специфичной для человека, может считаться самым перспективным среди существующих способов, в связи с чем этот подход нужно считать приоритетным. Другие способы, в частности выявление ген-специфичного гиперметилирования и анализ мутаций, также заслуживают рассмотрения, как и способы, основанные на выявлении белков, таких как М2-пируваткиназа.
Аналогичный подход может быть применен к выявлению предраковых полипов.
Способ сбора образцов, составляющий сущность данного изобретения, также позволяет диагностировать рак ануса, который можно выявить, применяя способы, приведенные для выявления КРР, или путем цитологического анализа собранных образцов.
Воспалительные заболевания кишечника представляют собой другую важную область применения данного изобретения. Хотя эти заболевания также приводят к резко увеличенному количеству ДНК в собранных образцах, использование белковых маркеров, таких как кальпротектин, нейротоксин эозино-филов, растворимый цитокератин 18 и т.д., может оказаться более информативным как для выявления, так и для дифференциальной диагностики разных заболеваний, относящихся к этой группе.
Применения для мониторинга заболеваний
Седьмой вариант осуществления данного изобретения предназначен для мониторинга болезней, в частности для мониторинга хронических колоректальных заболеваний. Наблюдение за больными КРР после удаления опухолей является важной задачей, и подход, представленный настоящим изобретением, может оказаться чрезвычайно полезен для выявления локальных рецидивов КРР. Способологическая стратегия в этом случае должна быть подобна таковой, описанной выше для выявления КРР.
Мониторинг больных с хроническими ВЗК может найти еще более широкий круг применений. Повторный сбор образцов с последующим анализом белковых маркеров (например, простой тест на кальп-ротектин) может оказать значительную помощь в раннем выявлении рецидивов у таких больных, а это может повлечь за собой неотложную терапевтическую помощь. Кроме того, повторное тестирование
может позволить оценку эффективности терапии у таких больных. Использование полу-количественного экспресс-теста, позволяющего количественно оценить активность воспаления, существенно для этой цели.
Скрининг КРР
Восьмой вариант осуществления данного изобретения направлен на скрининг КРР. Предложенный способ обладает свойствами идеального теста для скрининга рака, являясь абсолютно неинвазивным, безопасным, простым, недорогим, легко повторимым и приемлемым для применения самим тестируемым индивидом. Используя усовершенствованную версию приспособления, содержащую экспресс-тест, можно использовать способ в формате теста "у постели больного", представляющегося чрезвычайно удобным для программ скрининга населения. Окончательный вариант способа скрининга КРР может быть достигнут с внедрением версии теста, предполагающей самооценку (самотестирование).
Первоначальное применение базисной версии приспособления для сбора образцов иллюстрируется примером 1.
Пример 1
Группа из четырех здоровых волонтеров повторно производила сбор образцов содержащего клетки слоя слизи толстой кишки с поверхности анальной/перианальной области сразу после дефекации. Применялась базисная версия приспособления для сбора образцов. Собранные образцы были немедленно использованы для приготовления мазков на микроскопных стеклах. Мазки были зафиксированы с помощью цитологического фиксатора Surgipath (Leica Microsystems) и окрашены гематоксилином и эозином. Микрофотографии были приготовлены с помощью камеры Olympus D72.
Фиг. 5, 6 и 7 показывают присутствие легко идентифицируемых колоноцитов, которые нетрудно было обнаружить в каждом из приготовленных мазков. Принимая во внимание тот факт, что никто из волонтеров не предъявлял жалоб в отношении колоректальных симптомов, результаты, полученные при использовании нового способа сбора образцов, оказались вполне сопоставимы с таковыми, ранее описанными для здоровых волонтеров, когда эксфолиированный материал собирали интраректально с помощью приспособления, вводившегося через проктоскоп и оборудованного надувной мембраной (Lok-tionov et al., 2009; Loktionov et al., 2010).
Кроме того, материал был собран с поверхности анальной/перианальной области маленького ребенка, страдавшего острым воспалительным заболеванием кишечника. Сбор материала в этом случае был произведен матерью ребенка. Фиг. 8 демонстрирует обильное присутствие в образце нейтрофильных лейкоцитов, которые типичны для активного воспалительного процесса.
Способ и устройство для сохранения медицинских и биологических образцов
Свабы широко используются в клиническом и диагностическом анализе, биологических исследованиях и криминалистике с целью сбора образцов биологического материала для последующего анализа в соответствующим образом оборудованной лаборатории. Транспортировка в лабораторию образцов высокого качества, не подвергшихся деградации, является критическим фактором, определяющим качество результатов в различных вариантах тестирования.
Используемые в настоящее время свабы обычно имеют головку, покрытую естественным волокнистым материалом (часто хлопком или целлюлозой) и находящуюся на конце цилиндрического пластмассового или деревянного стержня. В некоторых модификациях верхний конец стержня присоединен к крышки пробирки, что позволяет закрыть сваб в пробирке после сбора образца. Идеальное устройство такого рода должно обеспечивать эффективный сбор (и последующее отделение) бактерий, вирусов, спор, клеток эукариот, белков, нуклеиновых кислот и ряда других биологических субстанций. US Pat. App. No. 2004/0267181 и US Pat. No. 8114027 предлагают варианты дизайна для систем сбора материала, основанных на применении свабов. Использование волокон с гидрофильными свойствами, как ворсинчатый ("бархатный") нейлон, списанный Тривой в US Pat. No. 8114027, может быть очень эффективным для сбора клеток эукариот.
Сбор микробиологических образцов, возможно, является основной областью применения приспособлений этого типа. US Pat. Nos. 4529702 и 5096062 описывают устройство и среды, используемые для этой цели. При сборе микробиологических образцов сваб помещается для транспортировки в пробирку, содержащую среду или гель, приготовленные с целью поддержания образца для последующего культивирования. Такие среды содержат забуферивающие соли, но не содержат питательных источников углерода и азота, поскольку целью является поддержание жизнеспособности микроорганизмов, но не их размножение. Среда Стюарта, приготовленная на основе агара, является общепринятой средой для транспорта микроорганизмов.
Подход, применяемый микробиологами, однако, имеет ограниченное применение для образцов, используемых для диагностических целей, поскольку он не защищает менее устойчивые клетки и легко лизируемые молекулы от повреждения в течение времени между сбором образца и анализом. В этом случае повреждение может происходить путем аутолиза (распад молекул под действием переваривания ферментами, присутствующими в образце) или разложения (за счет агрессивного действия микробных факторов, присутствующих в образце или занесенных извне). Как правило, для образцов, используемых в диагностических целях, для предотвращения деградации применяется быстрое замораживание (во из
бежание формирования в образце кристаллов) или добавление ингибиторов ферментов. Тем не менее, замораживание образцов при низких температурах не всегда возможно, а эффективность ингибиторов ферментов часто ограничена.
Определенная информация по поводу сохранения клеток и диагностически важных молекул в биологических образцах существует. Например, US Pat. No. 5256571 предлагает для сохранения клеток за-буференный водно-спиртовой раствор с добавкой предотвращающего аггрегацию агента. PreservCyt(tm) (Cytyc Corp.) является коммерчески доступной системой для сохранения клеток, основанной на смеси метанола с водой, которая широко применяется в подготовке материала для ПАП-теста. Вместе с тем, хотя водно-спиртовые среды пригодны для фиксации клеток для последующего цитологического анализа, они не оказываются эффективны для сохранения РНК и белков при температуре окружающей среды.
Сложные буферные системы также применяются для сохранения физиологической активности тканей при отсутствии нормального кровообращения. Эти системы обычно основаны на изотонических растворах, содержащих дополнительные соли, сахара, местные анестетики и прочие агенты, которые скомбинированы для поддержания жизнеспособности ткани или органа при температурах ниже физиологических, при которых активность метаболизма значительно снижена. Примеры можно найти в US Pat. Nos. 5432053; 4879283 и 5565317. US Pat. No. 7220538 описывает систему для поддержания жизнедеятельности тканей и органов, основанный на буферных растворах, включающих липосомы и различные наноча-стицы, которые могут обеспечить поддержку и питание в течение длительного времени без необходимости хранения при пониженной температуре. Хотя предполагается, что упомянутые системы обеспечивают сохранение клеточных структур и нуклеотидов, маловероятно, чтобы какой-либо из этих растворов мог эффективно предотвратить аутолиз в образцах, не состоящих их целых органов и тканей, а также в случаях, когда имеет место частичная деградация или загрязнение образца.
US Pat. No. 6204375 предлагает применение растворов, содержащих высокие концентрации сульфата аммония, для сохранения РНК в образцах клеток и тканей.
Настоящее изобретение также относится к способам и приспособлениям для сохранения медицинских и биологических образцов, собранных с помощью сваба. Способ изобретения позволяет значительно увеличить период сохранности образцов при хранении при температуре окружающей среды. Наиболее вероятным применением этого изобретения является его использование для транспортировки и временного хранения образцов, в случае, когда образцы сохраняются в течение периода между сбором образца и прибытием в соответствующим образом оборудованную лабораторию.
В соответствии с настоящим изобретением, требуется, чтобы сбор образца осуществлялся на элемент для сбора образца, который затем помещается в пробирку, где вступает в контакт со средой для сохранения или хранения. Используемая среда может быть в форме простой жидкости, но может быть предпочтительно представлена в виде геля, пропитанной губки или жидкой среды, находящейся под пробкой геля, удерживающего жидкость на дне пробирки. Основное преимущество геля, губки и среды под пробкой геля заключается в устранении риска потери среды при сборе образца в "полевых условиях" (например, при сборе образца во время операции, на месте преступления или в случае сбора образца у себя самого в домашних условиях). Кроме того, при использовании этих вариантов образцы сохраняются на дне пробирки и, в случае геля или губки, преимущественно остаются на поверхности элемента для сбора образца, не диффундируя в среду для сохранения или хранения.
В для сохранения образца поливиниловый спирт (PVA) представляется предпочтительным материалом для изготовления губки в связи с его высокой абсорбирующей способностью для водных растворов. В губке должна быть предусмотрена цилиндрическая выемка, в которой должен находиться элемент для сбора образца, когда он находится в пробирке. Это значит, что элемент для сбора образца будет в постоянном контакте со средой, находящейся в губке.
В варианте осуществления данного изобретения, в котором жидкая среда находится под пробкой геля, помещаемая в пробирку после взятия образца головка сваба проходит гель, внося образец в находящуюся под гелем среду. Дополнительное преимущество этой модификации заключается в том, что даже после того, как целостность геля нарушена прохождением элемента для сбора образца, лишь очень малое количество среды окажется над гелем. Это значит, что элемент для сбора образца останется в контакте со средой даже если количество среды в пробирке мало. Кроме того, контакт образца со средой не нарушится при перемене положения пробирки.
В то время как способы приготовления сред и гелей, описанных в данном патентном документе, должны быть известны лицу, опытному в данной области, способ приготовления пробки геля может быть менее ясен. Гель может быть сделан с помощью любого желирующего агента, например (но не только) агара, желатина, полиакриламида, пектина, полиэтиленгликоля, гуаровой камеди или камеди рожкового дерева. Концентрация геля должна быть достаточной для формирования плотной пробки, но не настолько высокой, чтобы помешать легкому прохождению головки сваба. В случае агара, можно использовать гели в диапазоне концентраций 0,25-3,0%, однако концентрации между 0,5 и 1,0% представляются оптимальными, в зависимости от размера гелевой пробки. Разогретый раствор геля наслаивается на избранную следу, находящуюся на дне пробирки. Гель в жидком состоянии не смешивается с большинством других жидких растворов. При использовании в качестве сред водных растворов солей, плот
ность геля, также приготовленного на воде, обычно будет ниже таковой раствора среды, поэтому по мере охлаждения гель образует плотный слой над средой. При использовании жидкостей с низкой плотностью (например, спиртов) или формул гелей с высокой плотностью, пробка геля может сформироваться ниже среды Эту сложность потенциально можно преодолеть путем изменения концентрации (и плотности) геля, применяя формулу геля, соответствующую меньшей плотности, или осуществляя охлаждение геля, держа пробирки в перевернутом положении.
Оптимальная среда для сохранения или хранения, используемая в данном изобретении, зависит как от типа образца, так и от типа планируемых аналитических процедур. В случае молекулярного анализа или когда комбинированный цитологический и молекулярный анализ планируется для одного и того же образца, оптимальной средой может быть концентрированный раствор соли, применение которого приводит к частичной или полной преципитации образца, таким образом вызывающей торможение или предотвращение лизиса. Предпочтительной солью, вызывающей преципитацию образца, является сульфат аммония, однако другие соли также могут использоваться. Сравнительные свойства ионов выражаются последовательностью, известной как ряд Гофмейстера, которая помещает их способность преципитиро-вать (высаливать) белки на одном конце шкалы и растворять и денатурировать (всаливать) - на другом. Ионы как аммония так и сульфата обладают большой способностью к вмешательству во взаимодействие молекул белков и воды, что приводит к меньшей растворимости белков в растворах сульфата аммония. Сам сульфат аммония обладает высокой растворимостью в воде, что позволяет приготовление растворов очень высокой концентрации. Другие высокорастворимые соли, имеющие способность высаливать белки, также могут быть использованы, например (но не только) цитрат натрия, бисульфат аммония, ацетат аммония или хлористый натрий. При преципитации лизирующие ферменты, такие как нуклеазы и про-теазы, теряют ферментативную активность и, соответственно, способность вызывать деградацию других компонентов образца. Авторы данного изобретения считают, что среды (жидкость или гель), содержащие высокие концентрации солей (25% сульфата аммония или выше), также будут тормозить развитие микроорганизмов, обеспечивая лучшее сохранение образцов. Это свойство особенно полезно при использовании загрязненных образцов, таких как инфицированный или некротический материал или образцы кала.
По окончании периода транспортировки или хранения, элемент для сбора образца с образцом может быть извлечен из среды хранения с высокой концентрацией соли и перенесен в буферный раствор, предназначенный для растворения белков. Это может быть, например, забуференный физиологический раствор для цитологического анализа или содержащий детергент литический буфер для молекулярного анализа. Если способ используется для сохранения нуклеиновых кислот, вероятно, что высокая концентрация соли вызывает преципитацию нуклеиновых кислот вместе с белками, в связи с чем применение буферного раствора, предназначенного для растворения белков, приведет к растворению как белков, так и нуклеиновых кислот.
Растворимость разных белков в растворах высокой ионной силы значительно варьирует. В целом, растворы с более высокой концентрацией соли преципитируют больше белков и более эффективно предохраняют образцы. Таким образом, наиболее эффективным способом предотвращения лизиса информативных молекул может быть вариант осуществления данного изобретения, в котором насыщенный раствор сульфата аммония используется как жидкость или пропитывает губку, окружающую элемент для сбора образца, когда он помещен в пробирку. Исследования показывают, что в более жестких условиях более высокая (желательно насыщающая) концентрация сульфата аммония требуется для сохранения целостности молекул -более низкие концентрации замедляют деградацию образца, но не предотвращают ее. Однако крайне высокие концентрации сульфата аммония могут вызывать необратимые изменения клеточной структуры. Поэтому, если цитологический анализ также должен проводиться, более низкие концентрации соли оказываются предпочтительнее. Таким образом, точный формат, в котором данная система должна применяться, зависит от целей ее применения. Помимо сульфата аммония, дополнительные забуферивающие соли могут также добавляться к сохраняющему раствору, если требуется стабилизация специфических молекул в образце.
Дополнительным преимуществом использования буферных растворов, содержащих высокие концентрации солей, препятствующих растворению образцов, является тот факт, что образец, будучи погруженным в такой буферный раствор на свабе, не растворится и не будет диспергирован в среде. Наоборот, он остается на свабе в основном интактным во время транспортировки и может быть снова растворен путем переноса сваба в другой буферный раствор.
В варианте осуществления данного изобретения, где раствор соли представлен в форме геля, концентрация соли ограничивается необходимостью растворения желирующего агента. Если в качестве пре-ципитирующей соли применяется сульфат аммония, основными составляющими геля являются раствор сульфата аммония в концентрации не выше 25% (объемных процентов, т.е. приблизительно 15-17 г на 100 мл) и агароза в концентрации не выше 0,25% (весообъемных процентов). Акриламид, желатин или пектин также могут быть использованы в качестве желирующего агента. Дополнительные стабилизирующие соли могут быть добавлены, однако в этом случае может потребоваться снижение концентрации сульфата аммония; иначе присутствие дополнительного растворенного компонента уменьшит раствори
мость агарозы, делая гель более жидким. Приведенный состав содержит минимальное количество агара, необходимое для желификации раствора, которая означает, что гель способен более эффективно обеспечивать контакт головки сваба со средой.
В варианте осуществления данного изобретения, где применяется гелевая пробка, находящаяся над образцом, могут применяться различные среды, соответствующие транспортировке образцов, предназначенных для разных видов исследования. Возможные среды могут включать, например (но не только), среды с высокой концентрацией солей, предназначенные для преципитации в целях сохранения молекулярных структур (как описано выше в данном патентном документе), гистологические фиксаторы (спирты или растворы на основе альдегидов), цитологические транспортные среды для сохранения целостности клеток эукариот, такие, как доступные из коммерческих источников PreservCyt(tm) (Cytyc Corp.) или Cytoport Gentaur), а также жидкие среды для транспортировки микроорганизмов.
Использование агаровых пробок ("печатей") известно в микробиологии, где оно часто применяется для предотвращения оксигенации анаэробных сред или для предотвращения перемешивания среды для роста микроорганизмов или для улавливания газов, продуцируемых культурой. Способ настоящего изобретении также предложен как удобный способ сбора образцов микроорганизмов и их транспортировки в жидкой фазе. Присутствие гелевой пробки ("печати") может быть полезным для предотвращения контакта среды с воздухом, а наличие мягкого геля значительного размера может способствовать уменьшению вероятности экспозиции находящегося в среде образца к действию воздуха.
В случае применения микробиологических или цитологических сред под пробкой геля, не исключено растворение образца в среде и отделение его от головки сваба со временем. В такой ситуации образец может быть получен пипетированием среды из пробирки. Эта манипуляция может быть легко проведена после проведения наконечника пипетки через слой геля. Изобретение потенциально применимо для сохранения целостности любого медицинского или биологического образца, который может быть собран на головку сваба. Такими образцами могут быть, например (но не только), кровь, слюна, моча, слущи-вающиеся клетки кожи или любой вид слизи или экссудата (например, из желудочно-кишечного, респираторного или генитального тракта), происходящие из организма любого вида. Варианты способа, описанные в настоящем документе, могут сохранять структуру и молекулярную целостность клеток прокариот и эукариот, а также как внутриклеточные, так и внеклеточные сложные молекулы. Это включает клетки млекопитающих, а также белки и нуклеиновые кислоты.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Неинвазивный способ сбора образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки, включающий взятие на сваб образца, содержащего клетки слоя слизи, происходящего из указанного кишечника или кишки, с поверхности анальной области вблизи от наружного отверстия заднего прохода, когда указанный образец берется после дефекации и прежде очищения анальной области.
2. Способ по п.1, когда образец собирается в течение 5 мин после дефекации и прежде очищения анальной области.
3. Способ по п.1 или 2, также включающий помещение указанного образца, содержащего клетки слоя слизи на свабе, в среду для хранения или в среду для лизиса.
4. Способ по п.3, в котором среда для хранения содержит концентрированный раствор соли.
5. Способ по п.3, в котором среда для хранения является жидкостью или гелем.
6. Способ диагностирования заболевания кишечника, включающий сбор образца клеток или фрагментов клеток кишечника или кишки с использованием способов, указанных в любом из предыдущих пунктов, а также анализ указанного образца на присутствие одного или более маркеров, специфичных для заболеваний кишечника.
7. Способ по п.6, в котором указанный анализ включает анализ морфологии клеток и/или количественное или полу-количественное определение одного или более молекулярных маркеров, специфичных для заболеваний.
8. Способ скрининга заболеваний кишечника, использующий любой из способов, указанных в п.6 или 7.
9. Способ мониторинга заболеваний кишечника, использующий любой из способов, указанных в п.6 или 7.
10. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является колоректальный рак.
11. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является воспалительное заболевание кишечника.
12. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника является анальный рак.
13. Способ по любому из пп.6-9, когда заболеванием кишечника являются предраковые колорек-тальные полипы.
14. Устройство для применения в способах по любому из предшествующих пунктов, где данное устройство включает сваб в сочетании со средой для хранения, где указанная среда для хранения представляет собой концентрированный раствор соли и где указанная соль представляет собой сульфат ам
10.
мония.
15. Устройство по п.14, в котором указанная среда для хранения является жидкостью и содержит концентрированный раствор соли.
16. Устройство по п.14, в котором указанная среда для хранения является гелем и содержит концентрированный раствор соли, при этом указанный раствор соли не является насыщенным раствором.
17. Устройство по любому из пп.14-16, также включающее гелевую пробку.
18. Способ оценки эффективности лечения заболевания кишечника, включающий способы, указанные в любом из пп.1-13.
19. Способ по п. 18, который также включает оценку уровня активности воспаления кишечника.
15.
15.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
026049
- 1 -
026049
- 1 -
026049
- 1 -
026049
- 1 -
026049
- 2 -
026049
- 1 -
026049
- 4 -
026049
- 5 -
026049
- 6 -
026049
- 21 -
026049
- 22 -
|
