EA 026031B1 20170228

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000026031b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение формулы (I) где R ¹ = , где R ^1a = H или -CH ₃ ; или R ¹ = , где D = дейтерий; R ² = H и R ³ = H; R ⁴ = H и R ⁵ = -CH ₃ или -CH ₂ OH или R ⁴ = -CH ₂ OH и R ⁵ = H; или R ² = -CH ₃ , -CH ₂ OH, -CH ₂ OCH ₃ , -CH ₂ CH ₂ OH или -CH ₂ OC(O)H; R ³ = H; R ⁴ = -CH ₃ , -CH ₂ OH, -CH ₂ CH ₂ OH, -CH ₂ CH(OH)CH ₃ или -CH ₂ C(OH)(CH ₃ ) ₂ и R ⁵ = H; или R ⁴ = H и R ⁵ = -CH ₃ , -CH ₂ OH, -CH ₂ CH(OH)CH ₃ или -CH ₂ C(OH)(CH ₃ ) ₂ ; или R ⁴ = H или -CH ₃ и R ⁵ = H или -CH ₃ ; или R ³ = H и R ⁴ = H; R ² и R ⁵ объединены вместе и образуют -(CH ₂ ) ₄ -; или R ⁴ = H и R ⁵ = H; R ² = -CH ₂ OH и R ³ = -CH ₃ или R ² = H или -CH ₃ и R ³ = -CH ₂ OH; или R ² = H и R ⁴ = H; R ³ и R ⁵ объединены вместе и образуют группу или группу ; или R ³ = H и R ⁵ = H; R ² и R ⁴ объединены вместе и образуют группу , или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, где R ² = -CH ₃ , -CH ₂ OH, -CH ₂ OCH ₃ , -CH ₂ CH ₂ OH или -CH ₂ OC(O)H; R ³ = H; R ⁴ = -CH ₃ , -CH ₂ OH или -CH ₂ CH ₂ OH и R ⁵ = H; или R ⁴ = H и R ⁵ = -CH ₃ или -CH ₂ OH; или R ⁴ = H или -CH ₃ и R ⁵ = H или -CH ₃ ; или R ³ = H и R ⁴ = H; R ² и R ⁵ = -(CH ₂ ) ₄ -; или R ⁴ = H и R ⁵ = H; R ² = -CH ₂ OH и R ³ = -CH ₃ или R ² = H или -CH ₃ и R ³ = -CH ₂ OH, или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Соединение по п.1 или 2, где R ² = -CH ₃ , -CH ₂ OH, -CH ₂ OCH ₃ , -CH ₂ CH ₂ OH или -CH ₂ OC(O)H; R ³ = H; R ⁴ = -CH ₃ , -CH ₂ OH или -CH ₂ CH ₂ OH и R ⁵ = H; или R ⁴ = H и R ⁵ = -CH ₃ или -CH ₂ OH; или R ⁴ = H или -CH ₃ и R ⁵ = H или -CH ₃ ; или R ⁴ = H и R ⁵ = H; R ² = -CH ₂ OH и R ³ = -CH ₃ или R ² = H или -CH ₃ и R ³ = -CH ₂ OH, или его фармацевтически приемлемая соль.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где R ² = -CH ₃ , -CH ₂ OH, -CH ₂ OCH ₃ , -CH ₂ CH ₂ OH или -CH ₂ OC(O)H; R ³ = H; R ⁴ = -CH ₃ , -CH ₂ OH или -CH ₂ CH ₂ OH и R ⁵ = H; или R ⁴ = H и R ⁵ = -CH ₃ или -CH ₂ OH; или R ⁴ = H или -CH ₃ и R ⁵ = H или -CH ₃ , или его фармацевтически приемлемая соль.

5. Соединение по любому из пп.1-4 формулы (IA') где R ^1a = H или -CH ₃ , или его фармацевтически приемлемая соль.

6. Соединение по п.1 формулы (IA) где R ² = -CH ₃ , -CH ₂ OH, -CH ₂ OCH ₃ , -CH ₂ CH ₂ OH или -CH ₂ OC(O)H; R ³ = H; R ⁴ = -CH ₃ , -CH ₂ OH или -CH ₂ CH ₂ OH и R ⁵ = H; или R ⁴ = H и R ⁵ = -CH ₃ или -CH ₂ OH; или R ⁴ = H или -CH ₃ и R ⁵ = H или -CH ₃ , или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Соединение по п.6, где R ² = -CH ₃ или -CH ₂ OH; R ³ = H; R ⁴ = -CH ₃ , -CH ₂ OH или -CH ₂ CH ₂ OH и R ⁵ = H; или R ⁴ = H и R ⁵ = -CH ₃ или -CH ₂ OH; или R ⁴ = H или -CH ₃ и R ⁵ = H или -CH ₃ , или его фармацевтически приемлемая соль.

8. Соединение по п.7, где R ² = -CH ₃ или -CH ₂ OH; R ³ = H; R ⁴ = -CH ₃ , -CH ₂ OH или -CH ₂ CH ₂ OH и R ⁵ = H или R ⁴ = H и R ⁵ = CH ₃ или -CH ₂ OH, или его фармацевтически приемлемая соль.

9. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, которое выбрано из (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метилоксазолидин-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5,5-диметилоксазолидин-2-она, рацемического 3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она,(R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-он, (3aS,7aS)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)гексагидробензооксазол-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метоксиметилоксазолидин-2-она, (4S,5S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметилоксазолидин-2-она, (4S,5R)-3-(2'-амино-2-(D8-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-(2-гидроксиэтил)оксазолидин-2-она, (4S,5R)-3-[2'-амино-2-((S)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метил-2-оксо-оксазолидин-4-илметилового эфира муравьиной кислоты, (S)-3-[2'-амино-2-((S)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-метилоксазолидин-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметилоксазолидин-2-она, (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-4-метилоксазолидин-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метилоксазолидин-2-она, (S)-3-(2'-амино-2-D8-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5']-бипиримидин]-6-ил)-4-метилоксазолидин-2-она, (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, (4S,5S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-4-метилоксазолидин-2-она, (R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметилоксазолидин-2-она, (3aR,6aR)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)тетрагидрофуро[3,4-d]оксазол-2(3Н)-она, рацемический (3aR*,6R*,6aR*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-она, (3aR,6R,6aR)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-она, (3aS,6S,6aS)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-она и (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилоксазолидин-2-она.

10. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из (4S,5R)-3-[2'-амино-2-((S)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она или (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилоксазолидин-2-она.

11. Соединение (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']-билиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, имеющее структуру

12. Соединение (4S,5R)-3-[2'-амино-2-((S)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, имеющее структуру

13. Соединение (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилоксазолидин-2-она, имеющее структуру

14. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.

15. Фармацевтическая композиция по п.14 в виде твердой дисперсии указанного соединения.

16. Применение соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли в качестве лекарственного средства для лечения рака.

17. Применение соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака.

18. Применение соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака.

19. Применение по п.17, где рак выбран из солидной опухоли, карциномы головного мозга, карциномы почки, карциномы печени, карциномы надпочечников, карциномы мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы пищевода, карциномы яичников, карциномы толстой кишки, карциномы прямой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, карциномы влагалища, карциномы щитовидной железы, саркомы, глиобластом, множественной миеломы или желудочно-кишечного рака, опухоли шеи, опухоли головы, сквамозно-клеточной карциномы, хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинской лимфомы, плазменно-клеточной миеломы, лимфомы Ходжкина или лейкоза.

20. Применение по п.18, где рак выбран из солидной опухоли, карциномы головного мозга, карциномы почки, карциномы печени, карциномы надпочечников, карциномы мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы пищевода, карциномы яичников, карциномы толстой кишки, карциномы прямой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, карциномы влагалища, карциномы щитовидной железы, саркомы, глиобластом, множественной миеломы или желудочно-кишечного рака, опухоли шеи, опухоли головы, сквамозно-клеточной карциномы, хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинской лимфомы, плазменно-клеточной миеломы, лимфомы Ходжкина или лейкоза.

21. Соединение по любому из пп.1-13 в аморфной форме.

22. Фармацевтическая композиция по п.14 или 15, где указанное соединение находится в аморфной форме.

23. Способ лечения рака, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-13.

24. Способ лечения по п.23, где рак выбран из солидной опухоли, карциномы головного мозга, карциномы почки, карциномы печени, карциномы надпочечников, карциномы мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы пищевода, карциномы яичников, карциномы толстой кишки, карциномы прямой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, карциномы влагалища, карциномы щитовидной железы, саркомы, глиобластом, множественной миеломы или желудочно-кишечного рака, опухоли шеи, опухоли головы, сквамозно-клеточной карциномы, хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинской лимфомы, плазменно-клеточной миеломы, лимфомы Ходжкина или лейкоза.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

5. Соединение по любому из пп.1-4 формулы (IA') где R ^1a = H или -CH ₃ , или его фармацевтически приемлемая соль.

15. Фармацевтическая композиция по п.14 в виде твердой дисперсии указанного соединения.

17. Применение соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака.

21. Соединение по любому из пп.1-13 в аморфной форме.

22. Фармацевтическая композиция по п.14 или 15, где указанное соединение находится в аморфной форме.

Евразийское 026031 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201491579
(22) Дата подачи заявки 2013.02.22
(51) Int. Cl. C07D 413/14 (2006.01) A61K31/5377 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)
(54) СОЕДИНЕНИЯ ОКСАЗОЛИДИН-2-ОНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ PI3K
(31) 61/602,954; 61/736,707 (56) WO-A1-2007084786
(32) 2012.02.24; 2012.12.13 WO-A1-2010049481
(33) US
(43) 2015.06.30
(86) PCT/IB2013/051443
(87) WO 2013/124826 2013.08.29
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
НОВАРТИС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Караватти Джорджо, Фэрхерст Робин Алек, Фюре Паскаль, Штауффер Фредерик, Зайлер Франк Ханс, Рюэгер Хайнрих (CH), МакКарти Клайв (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к оксазолидин-2-он замещенным пиримидиновым соединениям, которые действуют как ингибиторы PI3K (фосфатидилинозит-3-киназы), а также к их фармацевтическим композициям, к способам их получения и к применениям для лечения состояний, заболеваний и расстройств, зависимых от PI3K.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к оксазолидин-2-он замещенным пиримидиновым соединениям, которые действуют как ингибиторы PI3K (фосфатидилинозит-3-киназы), а также к их фармацевтическим композициям, к способам их получения и к применениям для лечения состояний, заболеваний и расстройств, зависимых от PI3K.
Предпосылки изобретения
Фосфатидилинозит 3-киназы (PI3K) представляют собой семейство липидных киназ, которые катализируют перенос фосфата в D-3' положение инозитлипидов с образованием фосфоинозит-3-фосфата (PIP), фосфоинозит-3,4-дифосфата (PIP2) и фосфоинозит-3,4,5-трифосфата (PIP3), которые, в свою очередь, действуют как вторичные мессенджеры в сигнальных каскадах путем объединения белков, содержащих плекстрин-гомологичный, FYVE, Phox и другие фосфолипид-связывающие домены, в различные сигнальные комплексы, часто на плазменной мембране ((Vanhaesebroeck et al., Annu. Rev. Biochem. 70:535 (2001); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615 (2001)). Из двух классов 1 PI3K, класс 1А PI3K включает гетеродимеры, состоящие из каталитической р110 субъединицы (а, р, 5 изоформы), конститутивно связанной с регуляторной субъединицей, которая может представлять собой р85а, р55а, р50а, р85р или р55у. Подкласс класса 1В имеет один член семейства, гетеродимер, состоящий из каталитической р110у субъединицы, связанной с одной из двух регуляторных субъединиц, р101 или р84 (Fruman et al., Annu Rev. Biochem. 67:481 (1998); Suire et al., Curr. Biol. 15:566 (2005)). Модульные домены p85/55/50 субъединиц включают Src гомологичные (SH2) домены, которые связывают фосфотирози-новые остатки в контексте специфической последовательности на активированном рецепторе и цито-плазматические тирозиновые киназы, приводя к активации и локализации PI3K класса 1А. PI3K класса 1В активируется непосредственно связанными с G-белком рецепторами, которые связываются с различными пептидными и непептидными лигандами (Stephens et al., Cell, 89:105 (1997)); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17:615-675 (2001)). Соответственно, образованные фосфолипидные продукты PI3K класса I связывают находящиеся на пути выше рецепторы с нисходящими клеточными активностями, включая пролиферацию, выживание, хемотаксис, клеточный транспорт, подвижность, метаболизм, воспалительные и аллергические реакции, транскрипцию и трансляцию (Cantley et al., Cell, 64:281 (1991); Escobedo and Williams, Nature, 335:85 (1988); Fantl et al., Cell, 69:413 (1992)).
Во многих случаях PIP2 и PIP3 осуществляют рекрутмент Akt, продукта человеческого гомолога вирусного онкогена v-Akt, к плазменной мембране, где он действует как узловая точка для многих внутриклеточных сигнальных путей, важных для роста и выживания (Fantl et al., Cell, 69:413-423(1992); Bader et al., Nature Rev. Cancer, 5:921 (2005); Vivanco and Sawyer, Nature Rev. Cancer, 2:489 (2002)). Аберрантная регуляция PI3K, которая часто повышает выживание через активацию Akt, является одним из наиболее распространенных событий в раке человека, и, как было показано, возникает на нескольких уровнях. Опухоль-супрессорный ген PTEN, который дефосфорилирует фосфоинозитиды в 3'-положении кольца инозита и, таким образом, антагонизирует PI3K активность, функционально элиминирован в некоторых видах опухолей. В других опухолях гены для р110а изоформы, PIK3CA, и для Akt амплифицируются, и повышенная экспрессия белка их генных продуктов была продемонстрирована в некоторых типах рака человека. Кроме того, мутации и транслокация р85а, которые служат для активирующей регуляции р85-р110 комплекса, были описаны в раковых заболеваниях человека. Наконец, соматические миссенс-мутации в PIK3CA, которые активируют нисходящие сигнальные пути, были описаны как часто встречающиеся во множестве различных раковых заболеваний человека (Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:802 (2005); Samuels et al., Science, 304:554 (2004); Samuels et al., Cancer Cell, 7:561-573 (2005)).
В некоторых опухолях имеет место амплификация или чрезмерная экспрессия p110р изоформы, PIK3CB. Кроме того, исследования показали, что опухоли, активируемые утратой PTEN, могут быть чувствительными к p110p, а не к p110a (Jia et al., Nature, 454:776-779 (2008). Wee et al., PNAS, 105 (35), 13057-13062 (2008); Liu et al., Nature Rev. Drug Discovery, 8:627-644 (2009)).
Как p1105, так и p110y экспрессируются преимущественно в гематопоэтической системе и, как оказалось, играют существенную роль в сигнальной активности лейкоцитов (Liu et al. Blood, 110(4), 11911198 (2007)). Однако они также играют роль в некоторых типах рака (Knobbe et al., Brain Pathol. 13, 507518 (2003); Rang et al. PNAS 103(5), 1289-1294 (2006)). Экспрессия p1105 ограничена лейкоцитами, что указывает на его потенциальную роль в лейкоцит-опосредованных заболеваниях (Vanhaesebroeck et al. PNAS, 94(9), 4330-4335 (1997)). p1105 активируется в бластных клетках у пациентов с острым миелоген-ным лейкозом, где он играет ключевую роль в клеточном выживании (Sujobert et al., Blood, 106(3), 10631066 (2005)), указывая на то, что он является потенциальной мишенью в лейкозе и других гематологических злокачественных заболеваниях. Активация р1105 играет важную роль в развитии В-клеточных злокачественных заболеваний, и поэтому ингибирование p1105 можно было бы использовать для лечения В-клеточных злокачественных заболеваний, таких как хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), не-ходжкинская лимфома (NHL), плазменно-клеточная миелома и лимфома Ходжкина (NH)(Castillo et al., Expert Opin. Investig. Drugs 21, 15-22 (2012)).
Эти наблюдения показывают, что нарушение регуляции фосфоинозит-3 киназы и находящихся выше и ниже компонентов этого сигнального пути является одним из наиболее распространенных нарушений регуляции, связанных с раковыми и пролиферативными заболеваниями человека (Parsons et al., Nature, 436:792 (2005); Hennessey at el., Nature Rev. Drug Disc. 4:988-1004 (2005)).
Опубликованная международная патентная заявка WO 2007/084786 описывает замещенные пири-мидиновые молекулы, которые ингибируют PI3K.
Краткое описание изобретения
Существует необходимость в соединениях, которые ингибируют активность более чем одной из изоформ класса I PI3K (а, р, 5 и у), поскольку считают, что такие соединения обладают способностью избегать механизмы адаптации, благодаря изменению пути через другие изоформы, по сравнению с соединениями с уникальной специфичностью, например, специфичностью в отношении одного члена семейства PI3K класса I.
Повышенная активность ингибирования по меньшей мере одной из PI3K изоформ (т.е. ингибирова-ние по меньшей мере одной PI3K изоформы при более низких концентрациях, особенно одной из, или обеих, а и р изоформ) также может быть выгодной. В случае PTEN-нулевых опухолей, например, хотя управляющей изоформой является p110р, для полной эффективности может потребоваться участие других изоформ класса IA. Также существует необходимость в соединениях, которые эффективно ингиби-руют PI3Ka киназу, например, для лечения типов рака, которые преимущественно стимулируются онко-генными формами гена, кодирующего р110а (например, PIK3CA H1047R или E545K), а также опухолей, демонстрирующих повышенное число копий PIK3CA.
Соединения, которые демонстрируют селективное ингибирование в пользу одной или нескольких PI3K изоформ (например, по меньшей мере двух, предпочтительно трех из а, р, 5 и у изоформ, например а, р и 5 изоформ) по сравнению с mTOR, также являются желательными, поскольку эффект ингибирова-ния mTOR, как правило, уменьшает окно безопасности, более конкретно, когда соединение ингибирует mTOR более сильно, чем PI3K (неблагоприятное отношение).
Кроме того, ингибиторы PI3K, которые имеют уменьшенный, в частности, нулевой эффект вне мишени, такой как связывание тубулина, являются желательными, поскольку такой эффект может вызвать токсические эффекты, не связанные с прицельным ингибированием PI3K, и поэтому для таких соединений может потребоваться дополнительный строгий контроль дозирования для обеспечения терапевтического эффекта, который можно контролировать и отнести за счет ингибирования PI3K. Следовательно, существует необходимость в соединениях, которые обладают пониженным или слабым эффектом вне мишени или не обладают эффектом вне мишени.
Желательно найти соединения, демонстрирующие улучшенное ингибирование по меньшей мере одной (например, PI3^), но лучше двух (например, PI3^ и PI3KP) или трех (например, PI3^, PI3KP и PI3K5) или всех четырех PI3K класса 1 (PI3^, PI3KP, PI3K5 и PI3Ky), а также уменьшенный эффект вне мишени (в частности, его отсутствие).
Настоящее изобретение обеспечивает соединения и их фармацевтические композиции, при этом такие соединения являются ингибиторами PI3K. Изобретение также обеспечивает комбинации, включающие такие соединения. Изобретение, кроме того, обеспечивает соединения по настоящему изобретению для применения в способах лечения, профилактики или облегчения PBK-опосредованного заболевания, такого как рак, включающих введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества PI3K ингибирующего соединения по настоящему изобретению. Изобретение также обеспечивает промежуточные соединения, полезные для получения соединений по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение обеспечивает в одном аспекте соединение формулы (I)
где R1 = --L' , где Rla = Н или -СН3; или
D D
R = L , где D = дейтерий; R2 = H и R3 = H;
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)Н;
R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2 и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4-;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH;
или R2 = H и R4 = H;
3 5 V4*^OH V'
R и R объединены вместе и образуют группу V- или группу 4 ;
или R3 = Н и R5 = Н;
"Скн
R2 и R4 объединены вместе и образуют группу ^ он , или его фармацевтически приемлемую соль.
Волнистая линия указывает точку присоединения морфолина, а также, когда присутствует, точку присоединения других показанных групп к остальной части молекулы.
Повсеместно в тексте настоящего изобретения знак " = " имеет стандартное значение "равен" и в определениях в настоящем изобретении может быть заменен на "равен", или "означает", или "представляет собой". В качестве примера фраза "R3 = H" может быть заменена на "R3 означает Н" или "R3 представляет собой Н".
Соединения формулы (I) считаются подходящими, например, для применения в лечении заболеваний, зависимых от PI3 киназы, особенно пролиферативных заболеваний, таких как рак, например опухолевых заболеваний.
Изобретение можно более полно оценить со ссылкой на следующее далее описание, включая определения, о которых говорилось выше, и завершающие описание примеры. Описанные варианты воплощения можно рассматривать по отдельности, все вместе или в любой комбинации, если не указано иное. Как используется в настоящем описании, термины "включая", "содержащий" и "включающий" используются в настоящем описании в их известном, неограничивающем смысле.
Если не указано иное, термин "соединения по настоящему изобретению" или "соединение по настоящему изобретению" и т.п. относится к соединениям формулы (I) и ее подформул (например, формулы (IA) и (IA')) и к солям соединений, а также к изотопно меченым соединениям (включая замещения дейтерием).
Соединения по настоящему изобретению имеют стереохимию, показанную в формуле (I) и ее подформулах, если не указано иное.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 графически представляет данные дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллического вещества примера 10.
Фиг. 2 представляет данные рентгеновской порошковой дифрактометрии кристаллического вещества примера 10.
Фиг. 3 графически представляет данные дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллического вещества примера 18, партия А.
Фиг. 4 представляет данные рентгеновской порошковой дифрактометрии кристаллического вещества примера 18, партия А.
Фиг. 5 графически представляет данные дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллического вещества примера 18, партия В.
Фиг. 6 представляет данные рентгеновской порошковой дифрактометрии кристаллического вещества примера 18, партия В.
Фиг. 7 графически представляет данные дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллического вещества примера 18, партия С.
Фиг. 8 представляет данные рентгеновской порошковой дифрактометрии кристаллического вещества примера 18, партия С.
Фиг. 9 графически представляет данные дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллического вещества примера 18, партия D.
Фиг. 10 представляет данные рентгеновской порошковой дифрактометрии кристаллического вещества примера 18, партия D.
Фиг. 11 графически представляет данные дифференциальной сканирующей калориметрии кристаллического вещества примера 18, партия Е.
где R1 = --L' , где Rla = Н или -СН3; или
D D
R = L , где D = дейтерий;
R2 = H и R3 = H;
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2 и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4-;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH;
или R2 = Н и R4 = Н;
з 5 V*^OH V*
R и R объединены вместе и образуют группу v или группу ^ ;
или R3 = Н и R5 = Н;
R2 и R4 объединены вместе и образуют группу ^ он , или его фармацевтически приемлемую соль.
В предпочтительном варианте воплощения этого аспекта обеспечивается соединение в соответствии с формулой (I), где
^ = "-1^ , гдеР1а = Нили-СН3;или
D D
R = L , где D = дейтерий;
R2= H и R3 = H;
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)Н;
R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2 и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH;
или R2 = Н и R4 = Н;
з 5 V*^OH V*
R и R объединены вместе и образуют группу v или группу ^ ;
или R3 = Н и R5 = Н;
R2 и R4 объединены вместе и образуют группу ^ он , или его фармацевтически приемлемая соль.
В более предпочтительном варианте воплощения этого аспекта, обеспечивается соединение в соответствии с формулой (I), где
R^^L , гдеР1а = Нили-СН3;или
D D
R = L , где D = дейтерий;
R2= H и R3 = H;
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2 и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4-;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH;
или его фармацевтически приемлемая соль.
В еще более предпочтительном варианте воплощения обеспечивается соединение формулы (I)
где R1 = <~-L' , где Rla = Н или -СН3; или
R = /-L , где D = дейтерий; R2 = Н и R3 = Н;
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)^
R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4-;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль.
В следующем альтернативном предпочтительном варианте воплощения обеспечивается соединение в соответствии с формулой (I)
где
где
R1a = H или -CH3; или
где D = дейтерий;
D> kNJ R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -CH^QO)^
R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = R5 = H или -CH3; или R3 = R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4;
или R4 = R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль.
Относительно формулы (I) в любом из указанных выше вариантов воплощения представлено следующее подробное описание.
R1a
В одном варианте воплощения R1a представляет собой Н.
В другом варианте воплощения R1a представляет собой -CH3.
В предпочтительном варианте воплощения R1a представляет собой Н.
Другие варианты воплощения настоящего изобретения описаны ниже.
В одном варианте воплощения
-л,
, где
R1a = H или -CH3; или
R1 =
R2 R3 R4 R4 R4
"> kNA:D
, где D = дейтерий; -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)Н;
-CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или
= H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
= H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3 = H и R4 = H; R2 и R5 = -(CH2)4-; или R4 = H и R5 = H; R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В другом варианте воплощения
, где
R1a = H или -CH3; или
где
R1a = H или -CH3; или
R2 R3 R4 R4 R4
D> kNJ L> , где D = дейтерий; : -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(0)H;
-CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H или H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. Еще в одном варианте воплощения
,гдеК1а = Нили-СН3 -СН3, -СН2ОН, -СН2ОСН3, -СН2СН2ОН или -СН2ОС(0)Н;
-CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или
: H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или : H или -CH3 и R5 = H или -CH3, или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В другом варианте воплощения
R1 = ^-L ,гдеК1а = Нили-СН3;
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В другом варианте воплощения предпочтительно
R1 R2 R3 R4 R4
-r~L ,гдеК1а = Нили-СН3; : -СН3 или -СН2ОН;
-CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5
: H и R5 = CH3 или -CH2OH,
H или
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В другом варианте воплощения предпочтительно
R1 R2 R3 R4 R5
-r~L ,где111а = Нили-СНз; : -СН3 или -СН2ОН;
-CH3 или -CH2CH2OH и
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В одном варианте воплощения
, где
R1a = H или -CH3; или
R1 R2 R3 R4 R4 R4
D> kNJ , где D = дейтерий;
-CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -CH2OC(O)H; H;
-CH3 или -CH2OH и R5 = H; или
¦¦ H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R5 = H или -CH3; или R3 = R4 = H; R2 и R5 = -(CH2)4-; или R4 = R5 = H; R2 = -CH2OH и R3 = -CH; или R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В другом варианте воплощения
, где
R1a = H или -CH3; или
R1 R2 R3 R4 R4 R4
"> kNA:D
, где D = дейтерий;
-CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -CH2OC(O)H; H;
-CH3 или -CH2OH и R5 = H; или
¦¦ H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R5 = H или -CH3; или R4 = R5 = H; R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. Еще в одном варианте воплощения
где
R1a = H или -CH3; или
R = /-L , где D = дейтерий;
R2 = -CH3, -CH2OH, -СН2ОСН3, -СН2СН2ОН, -СН2ОС(0)Н;
R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = R5 = H или -CH3,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. Еще в одном варианте воплощения
сд.
R! = -L
где
R1a = H или -CH3;
R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R4 = R5 = H или -CH3, или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В другом варианте воплощения
R1 = ^b , гдеК1а = Нили-СН3;
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R4 = R5 = H или -CH3, или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В другом варианте воплощения, предпочтительно
R1 = ^L , гдеК1а = Нили-СН3; R2 = -СН3 или -СН2ОН;
R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H или
R4 = H и R5 = CH3 или -CH2OH, или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В другом варианте воплощения предпочтительно
R1 = ^L , гдеК1а = Нили-СН3; R2 = -СН3 или -СН2ОН;
R3 = H; R4 = -CH3 и R5 = H,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения. В другом предпочтительном варианте воплощения
R1 = ^-L , гдеК1а = Нили-СН3;
R2 = -CH2OH; R3 = H; R4 = -CH3 и R5 = H,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
площения.
В одном варианте воплощения R1a может представлять собой водород с обеспечением, таким образом, соединений следующей формулы (IA):
В одном варианте воплощения обеспечиваются соединения следующей формулы (IA1):
где R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или их фармацевтически приемлемых солей.
В одном варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В другом варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = CH3 или -CH2OH,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В другом варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2CH2OH и
R5 = H,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В другом варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH3; R3 = H;
R4 = -CH2CH2OH и
R5 = H,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
Альтернативно, в одном варианте воплощения, где Rla может представлять собой водород, обеспечиваются соединения следующей формулы (IA):
где R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH, -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = R5 = H или -CH3,
или их фармацевтически приемлемые соли.
В одном варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = R5 = H или -CH3,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В другом варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = CH3 или -CH2OH,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В другом варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H; R4 = -CH3 и
R5 = H,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
В предпочтительном варианте воплощения соединений формулы (IA)
R2 = -CH2OH; R3 = H; R4 = -CH3 и R5 = H,
или фармацевтически приемлемая соль такого соединения.
Другие варианты воплощения (пронумерованные) представлены следующим образом. Вариант воплощения 1. Соединение формулы (I)
R1 = , где Rla = Н или -СН3; или
где к = , где
D D
R = L> , где D = дейтерий; R2=H и R3 = H;
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2 и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3= H и R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH;
или R2= Н и R4 = Н;
3 5 V4*^OH V'
R и R объединены вместе и образуют группу V- или группу 4 или
R3 = H и R5 = H;
R2 и R4 объединены вместе и образуют группу
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 2.
Соединение в соответствии с вариантом воплощения 1, где
R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3;
или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 = -(CH2)4-;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 3.
Соединение в соответствии с вариантом воплощения 1 или вариантом воплощения 2, где
R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3;
или R4 = H и R5 = H; и
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 4.
Соединение в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-3, где
R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 5.
(IA*),
где R1a = H или -CH3, или его фармацевтически приемлемая соль.
Соединение в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-4 формулы (ТА1)
(IA)
где R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 7.
Соединение в соответствии с вариантом воплощения 6, где
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 8.
Соединение в соответствии с вариантом воплощения 7, где
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H или R4 = H и R5 = CH3 или -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 9.
Соединение в соответствии с вариантом воплощения 8, где
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3 или -CH2CH2OH и
R5 = H,
или его фармацевтически приемлемая соль. Вариант воплощения 10.
Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантом воплощения 1, которое выбрано из
(8)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метилоксазолидин-2-она,
(8)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5,5-диметилоксазолидин-2-она,
рацемического 3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она,
(8)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она (абсолютная стереохимия не определена),
(R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она (абсолютная стереохимия не определена),
(3aS,7aS)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)гексагидро-бензооксазол-2-она,
(8)-3-(2'-шино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метоксиметилоксазолидин-2-она,
(48,58)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(8)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметилоксазолидин-2-она,
(48,5R)-3-(2'-амино-2-(D8-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(8)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-(2-гидроксиэтил)оксазолидин-2-она,
(48,5R)-3-[2'-амино-2-((8)-3 -метил-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метил-2-оксо-оксазолидин-4-илметилового эфира муравьиной кислоты,
(8)-3-[2'-амино-2-((8)-3-метил-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-метилоксазолидин-2-она,
(8)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметилоксазолидин-2-она,
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-
4- метилоксазолидин-2-она,
(8)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метилоксазолидин-2-она,
(8)-3-(2'-амино-2-D8-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-метилоксазолидин-2-она,
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-
5- метилоксазолидин-2-она,
(48,58)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-4-метилоксазолидин-2-она,
(R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметилоксазолидин-2-она,
(3aR,6aR)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)тетрагидрофуро[3,4-с1]оксазол-2(3Н)-она,
рацемического (3aR*,6R*,6aR*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[1]оксазол-2-она,
(3aR,6R,6aR)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[1]оксазол-2-она,
(3a8,68,6a8)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[1]оксазол-2-она и
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-
4- метилоксазолидин-2-она.
Вариант воплощения 11.
Соединение или его фармацевтически приемлемая соль в соответствии с вариантом воплощения 1, которое выбрано из
(48,5R)-3-[2'-амино-2-((8)-3 -метил-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-
5- метилоксазолидин-2-она и
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-
4- метилоксазолидин-2-она.
Вариант воплощения 12. Соединение, которое выбрано из
(48,5R)-3-[2'-амино-2-((8)-3 -метил-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-
5- метилоксазолидин-2-она и
(48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилоксазолидин-2-она. Вариант воплощения 13.
Соединение (48,5R)-3-[2'-амино-2-((8)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она. Вариант воплощения 14.
Соединение (48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она. Вариант воплощения 15.
Соединение (48,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилоксазолидин-2-она.
Вариант воплощения 16.
Фармацевтически приемлемая соль соединения варианта воплощения 13, варианта воплощения 14 или варианта воплощения 15.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается кристаллическая форма соединения, полученного в примере 10, имеющая рентгеновский дифракционный спектр, по существу, такой же, как рентгеновский дифракционный спектр, представленный на фиг. 2.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается кристаллическая форма соединения, полученного в примере 18, партия А, имеющая рентгеновский дифракционный спектр, по существу, такой же, как рентгеновский дифракционный спектр, представленный на фиг. 4.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения, обеспечивается кристаллическая форма соединения, полученного в примере 18, партия В, имеющая рентгеновский дифракционный спектр, по существу, такой же, как рентгеновский дифракционный спектр, представленный на фиг. 6.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается кристаллическая форма соединения, полученного в примере 18, партия С, имеющая рентгеновский дифракционный спектр, по существу, такой же, как рентгеновский дифракционный спектр, представленный на фиг. 8.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается кристаллическая форма соединения, полученного в примере 18, партия D, имеющая рентгеновский дифракционный спектр, по существу, такой же, как рентгеновский дифракционный спектр, представленный на фиг. 10.
Еще в одном аспекте настоящего изобретения обеспечивается кристаллическая форма соединения, полученного в примере 18, партия Е, имеющая рентгеновский дифракционный спектр, по существу, такой же, как рентгеновский дифракционный спектр, представленный на фиг. 12.
Термин "по существу, такой же", в отношении положений рентгеновских дифракционных пиков, означает, что учитывается типичное положение пика и изменчивость интенсивности. Например, специалистам в данной области должно быть понятно, что положения пиков (20) будут показывать некоторую вариабельность показаний разного используемого оборудования, типично до 0,2°. Кроме того, специалистам в данной области должно быть понятно, что относительные интенсивности пиков будут показывать вариабельность показаний разного используемого оборудования, а также вариабельность из-за степени кристалличности, предпочтительной ориентации, поверхности полученного образца и других факторов, известных специалистам в данной области, и должны рассматриваться только как качественный показатель.
Конкретные варианты воплощения обеспечиваются при помощи конкретных примеров соединений, описанных в настоящем документе.
Настоящее изобретение обеспечивает соединения и их фармацевтические композиции, которые являются полезными для лечения заболеваний, состояний и/или расстройств, в которых PI3K участвует в патогенезе заболевания, описанного в настоящем документе.
Соединения по настоящему изобретению можно синтезировать с использованием путей синтеза, которые включают способы, аналогичные тем, которые хорошо известны в области химии, в частности, в свете описания, содержащегося в настоящем документе. Исходные вещества в основном доступны из коммерческих источников, таких как Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis), или могут быть легко получены с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области (например, получены способами, в общем виде описанными в Louis F. Fieser and Mary Fieser, реагенты for Organic 8ynthesis, volumes 1-19, Wiley, New York (1967-1999 ed) или Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. 8pringer-Verlag, Berlin, включая приложения (также доступные через Beilstein online database)).
Для иллюстративных целей схемы реакций, представленные ниже, показывают потенциальные пути для синтеза соединений по настоящему изобретению, а также ключевых промежуточных соединений. Более подробное описание отдельных реакционных стадий представлено в разделе "Примеры" ниже. Специалистам в данной области должно быть понятно, что можно использовать другие пути синтеза для синтеза соединений по настоящему изобретению. Хотя конкретные исходные вещества и реагенты показаны на схемах и обсуждаются ниже, их легко можно заменить другими исходными веществами и реагентами для получения множества различных производных и/или реакционных условий. Кроме того, многие соединения, полученные способами, описанными ниже, могут быть далее модифицированы в свете настоящего раскрытия с использованием традиционных химических приемов, хорошо известных специалистам в данной области.
При получении соединений по настоящему изобретению может потребоваться защита отдаленной функциональной группы (например, первичных или вторичных амино, гидроксильных или карбоксильных групп) промежуточных соединений. Необходимость в такой защите варьируется в зависимости от природы отдаленной функциональной группы и условий способов получения. Подходящие аминозащит-ные группы (NH-Pg) включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (BOC), бензилоксикарбо-нил (CBz) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Подходящие гидроксилзащитные группы включают триалкилсилиловые эфиры, где одна или две алкильные группы могут быть замещены фенилом. Подходящие карбоксилзащитные группы (C(O)O-Pg) включают сложные алкиловые эфиры (например, метиловый, этиловый или трет-бутиловый), сложные бензиловые эфиры, сложные силиловые эфиры и
т.п. Необходимость в такой защите легко определит специалист в данной области. Общее описание защитных групп и их использование можно найти в T.W. Greene, Protective Groups in Organic 8ynthesis, John Wiley & 8ons, New York, 1991.
Схема 1 (ниже) описывает потенциальный путь получения соединений формулы (IA'), где R1-R5 имеют значения, определенные выше. В случаях, когда присутствует защитная группа, добавляют стадию удаления защиты для преобразования защищенного соединения IA' в соединение IA'.
Схема 1
Альтернативно, соединения формулы (IA') также можно синтезировать путем изменения порядка осуществления стадий, показанного на схеме I, т.е. сначала связывание по методу Сузуки, с последующим осуществлением реакции Бухвальда с соединением 1b.
Для тех оксазолидин-2-онов 1b, которые не являются коммерчески доступными, схема 2 ниже представляет способ для получения тех указанных промежуточных соединений, где R2-R5 имеют значения, определенные выше. Если первичная гидроксильная группа присутствует в любом из R2-R5, предварительно осуществляют стадию селективной защиты, как продемонстрировано на схеме 3. Группу амина можно защитить на следующей предварительной стадии, как показано на схеме 4, где также показана другая гидроксилзащитная группа.
Схема 2
ryr^.R4
но 'RS Id
Трифосген JU*4*3
Et,N, DCM, 25°C Hlvf-N^IM
" o^OR5
Схема 4 Boep, DIEA/ЕЮН
Защищенный продукт схемы 3 подвергают циклизации с использованием трифосгена, как в общем виде показано на схеме 2 и конкретно показано на схеме 5, с получением примера 1b промежуточного соединения.
Схема 5
Дважды защищенный продукт схемы 4 подвергают циклизации с использованием гидрида натрия, как показано на схеме 6, с получением примера 1b промежуточного соединения.
Схема 6
I 0
NaH
4\ <
'Si I
0 "
Схема 7 представляет альтернативный путь к имеющему двойную защиту промежуточному соединению схемы 4, которое затем может быть подвергнуто циклизации, как уже было показано на схеме 6.
Схема 7
Взаимодействие циклизованного продукта схемы 6 с 4,6-дихлорпиримидиновым промежуточным соединением (например, промежуточным соединением А или продуктом со стадии 10.1, оба указаны ниже), как показано на схеме 1, может дать дополнительные промежуточные соединения и конкретные соединения представлены ниже:
где R1a и R4 имеют значения, определенные выше; Hal представляет собой галоген, так как хлор; и
PG представляет собой защитную группу, например силильную защитную группу, образующую, например, триалкилсилиловые эфиры, где одна или две из алкильных групп могут быть замещены фенилом, например алкил-дифенил-силилэфирную защитную группу, в частности диметил-трет-бутилсилил или дифенил-трет-бутилсилил.
Другое промежуточное соединение по настоящему изобретению включает соединение следующих формул:
Могут предусматриваться другие аналогичным образом защищенные промежуточные соединения, показанные в настоящем документе выше, со ссылкой на формулы, представленные в настоящем документе, если первичная гидроксильная группа присутствует в каком-либо из R2-R5. Такие защищенные соединения также включены в настоящее раскрытие. Например, когда R4 представляет собой группу -CH2CH2OH, его можно защитить с получением соединений, где R4 представляет собой -CH2CH2O-PG, где PG имеет значение, определенное выше, например:
Удаление защиты у трет-бутил-дифенил-силил- или трет-бутилдиметилсилилзащищенной гидро-ксильной группы (общая процедура удаления защитных силилэфирных групп) защищенного продукта IA' с получением, например, конечного продукта можно осуществить с использованием HF-пиридина (например, В ТГФ) или HCl.
Соединения по настоящему изобретению или промежуточные соединения, используемые в настоящем изобретении, могут быть выделены и использованы как соединение per se (например, в форме свободного основания) или в виде его соли, если, например, соединение имеет такое pKA значение, которое делает возможным образование соли. Как используется в настоящем документе, термины "соль" или "соли" относятся к кислотно-аддитивной или основно-аддитивной соли соединения по настоящему изобретению. "Соли" включают, в частности, "фармацевтически приемлемые соли". Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений по настоящему изобретению, и которые типично не являются, с биологической или иной точки зрения, нежелательными. Соединения по настоящему изобретению могут быть способны к образованию кислотно-аддитивных солей, благодаря присутствию аминогруппы. Соединения per se по настоящему изобретению являются предпочтительными.
Неорганические кислоты и органические кислоты для образования фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей включают, например, ацетат, аспартат, бензоат, безилат, бромид/гидробромид, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, камфорсульфонат, хлорид/гидрохлорид, хлортеофиллонат, цитрат, этандисульфонат, фумарат, глуцептат, глюконат, глюкуронат, гиппурат, гид-ройодид/йодид, изетионат, лактат, лактобионат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, манделат, мези-лат, метилсульфат, нафтоат, напсилат, никотинат, нитрат, октадеканоат, олеат, оксалат, пальмитат, памо-ат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, полигалактуронат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфосали-цилат, тартрат, тозилат и трифторацетат.
Неорганические кислоты для образования солей включают, например, хлористо-водородную кислоту, бромисто-водородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т.п.
Органические кислоты для образования солей включают, например, уксусную кислоту, пропионо-вую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и т.п.
Фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли могут быть образованы с неорганическими и органическими основаниями.
Неорганические основания для образования солей включают, например, соли аммония и металлов из колонок I-XII Периодической таблицы. В некоторых вариантах воплощения соли могут быть образованы из натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; в частности подходящие соли включают соли аммония, калия, натрия, кальция и магния.
Органические основания для образования солей включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая природные замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и т.п. Некоторые органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглумин, пиперазин и трометамин.
В случаях, когда могут быть образованы фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению, их можно синтезировать из исходного соединения, щелочной или кислотной группы, традиционными химическими способами. Как правило, такие соли можно получить путем взаимодействия форм свободной кислоты этих соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания (такого как Na, Ca, Mg или K гидроксид, карбонат, бикарбонат или т.п) или путем взаимодействия форм свободного основания этих соединений со стехиометрическим количеством подходящей кислоты. Такие взаимодействия типично осуществляют в воде или в органическом растворителе, или в смеси двух таких типов растворителей. Как правило, использование неводной среды, такой как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, является желательным, где это практически возможно. Перечни дополнительных подходящих солей можно найти, например, в "Remington's Pharmaceutical 8ciences", 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985) и в "Handbook of Pharmaceutical 8alts: Properties, 8election, and Use" by 8tahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002).
Если не указано иное, предполагается, что любая формула, представленная в настоящем документе, представляет немеченные формы. Изотопно меченые формы соединений с дейтерием показаны с дейте
рием (D) в качестве заместителя вместо Н. Другие изотопно меченые соединения по настоящему изобретению могут быть получены, и они имеют структуры, показанные формулами, представленными в настоящем документе, за исключением того, что один или несколько атомов замещены атомом, имеющим выбранную атомную массу или массовое число. Примеры изотопов, которые могут быть включены в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, фтора и хлора, такие как 2Н, 3Н, 11С, 13С, 14С, 15N, 18F 31P, 32P, 358 , 36Cl, 125I соответственно. Изобретение может включать различные изотопно меченые соединения, определенные в настоящем описании, например соединения, в которых присутствуют радиоактивные изотопы, такие как 3Н, 13С, и 14С. Такие изотопно меченые соединения являются полезными в метаболических исследованиях (с 14С), исследованиях кинетики реакций (например, с 2Н или 3Н), методах детекции или визуализации, таких как позитрон-эмиссионная томография (PET) или однофотонная эмиссионная компьютерная томография (8PECT), включая анализы распределения лекарственного средства или ткани субстрата, или в радиоактивном лечении пациентов. В частности, 18F или меченое соединение может быть особенно желательным для PET или 8PECT исследований. Изотопно меченые соединения по настоящему изобретению, как правило, можно получить путем осуществления процедур, раскрытых в схемах или в примерах и получениях, описанных ниже, путем замещения не меченного изотопом реагента легко доступным изотопно меченым реагентом, например дейтерий-меченый морфолин ^8-морфолин).
Кроме того, замещение более тяжелыми изотопами, в частности дейтерием (т.е., 2Н или D), может дать некоторые терапевтические преимущества, являющиеся результатом лучшей метаболической стабильности, например больший период полужизни in vivo, более низкие необходимые дозы, меньшее ин-гибирование CYP (конкурентное или зависимое от времени) или улучшение терапевтического индекса. Например, замещение дейтерием может модулировать нежелательные побочные эффекты недейтериро-ванного соединения, такие как конкурентное ингибирование CYP, зависимая от времени инактивация CYP и т.п. Должно быть понятно, что дейтерий в этом контексте рассматривают как заместитель в соединениях по настоящему изобретению. Концентрацию такого более тяжелого изотопа, в частности дейтерия, можно определить при помощи коэффициента изотопного обогащения. Термин "коэффициент изотопного обогащения", как он используется в настоящем документе, означает соотношение между относительным содержанием изотопа и природной распространенностью конкретного изотопа. Когда заместитель в соединении по настоящему изобретению указан как дейтерий, такое соединение имеет коэффициент изотопного обогащения для каждого указанного атома дейтерия по меньшей мере 3500 (включение дейтерия 52,5% по каждому указанному атому дейтерий), по меньшей мере 4000 (включение дейтерия 60%), по меньшей мере 4500 (включение дейтерия 67,5%), по меньшей мере 5000 (включение дейтерия 75%), по меньшей мере 5500 (включение дейтерия 82,5%), по меньшей мере 6000 (включение дейтерия 90%), по меньшей мере 6333,3 (включение дейтерия 95%), по меньшей мере 6466,7 (включение дейтерия 97%), по меньшей мере 6600 (включение дейтерия 99%) или по меньшей мере 6633,3 (включение дейтерия 99,5%).
Кроме того, соединения по настоящему изобретению, включая их соли, также можно получить в форме их гидратов или с включением других растворителей, используемых для их кристаллизации. Соединения по настоящему изобретению согласно присущим им или специально рассчитанным свойствам образуют сольваты с фармацевтически приемлемыми растворителями (включая воду). Такие молекулы растворителей представляют собой молекулы, обычно используемые в фармацевтике, которые известны как безопасные для реципиента, например вода, этанол и т.п. Термин "гидрат" относится к комплексу, где молекула растворителя представляет собой воду. Термин "сольват" относится к молекулярному комплексу соединения по настоящему изобретению (включая его фармацевтически приемлемые соли) с одной или несколькими молекулами растворителя, включенными в структуру кристаллической решетки. Молекулы растворителя в сольвате могут присутствовать в регулярном расположении и/или в неупорядоченном расположении. Сольват может включать либо стехиометрическое, либо нестехиометрическое количество молекул растворителя. Например, сольват с нестехиометрическим количеством молекул растворителя может быть образован в результате частичной потери растворителя из сольвата. Сольваты могут быть образованы в виде димеров или олигомеров, включающих более чем одну молекулу или соединение в соответствии с настоящим изобретением в структуре кристаллической решетки.
Соединения по настоящему изобретению, включая их соли, гидраты и сольваты, согласно присущим им или специально рассчитанным свойствам, образуют полиморфы.
Как используется в настоящем документе, "полиморф" относится к кристаллическим формам, имеющим одинаковый химический состав, но разное пространственное расположение молекул, атомов и/или ионов, образующих кристалл.
Как используется в настоящем документе, "аморфный" относится к твердой форме молекулы, атома и/или ионов, которая не является кристаллической. Аморфное твердое вещество не демонстрирует определенную рентгеновскую дифрактограмму.
Фармацевтически приемлемые сольваты в соответствии с настоящим изобретением включают такие сольваты, где растворитель кристаллизации может быть изотопно замещенным, например D2O, !6-ацетон, d6-DM8O.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что соединения по настоящему изобретению содержат хиральные центры и как таковые существуют в изомерных формах. Как используется в настоящем документе, термин "изомеры" относится к различным соединениям, которые имеют одинаковую молекулярную формулу, но отличаются расположением и конфигурацией атомов. Так же, как используется в настоящем документе, термин "оптический изомер" или "стереоизомер" относится к любой из различных стереоизомерных конфигураций, которые могут существовать для данного соединения по настоящему изобретению. Должно быть понятно, что заместитель может быть присоединен по хираль-ному центру атома углерода. Поэтому соединения по настоящему изобретению включают энантиомеры, показанные путем указания стереоспецифических расположений по хиральным центрам в структурном изображении соединений по настоящему изобретению, где связь, обозначенная в виде штрихового клина, указывает, что присоединенный заместитель или атом находится ниже плоскости, а связь, обозначенная в виде сплошного клина, указывает, что присоединенный заместитель или атом находится выше плоскости.
"Энантиомеры" представляют собой пару стереоизомеров, которые не являются совпадающими при наложении зеркальными отображениями друг друга. 1:1 смесь пары энантиомеров представляет собой "рацемическую" смесь. Этот термин используют для обозначения рацемической смеси, где это является подходящим.
"Диастереоизомеры" представляют собой стереоизомеры, которые содержат по меньшей мере два асимметричных атома, но которые не являются зеркальным отображением друг друга.
Абсолютную стереохимию определяют в соответствии с R-8 системой Кана-Ингольда-Прелога. Когда соединение представляет собой чистый энантиомер, стереохимия по каждому хиральному углероду может быть указана либо как R, либо как 8. Разделенные соединения, абсолютная конфигурация которых неизвестна, могут быть обозначены как (+) или (-), в зависимости от направления (право- или левовра-щающий), в котором они вращают плоскополяризованный свет при длине волны D линии натрия. Некоторые из соединений, описанных в настоящем документе, содержат один или несколько асимметричных центров или осей и, таким образом, могут образовывать энантиомеры, диастереомеры и другие стерео-изомерные формы, которые могут быть определены, с точки зрения абсолютной стереохимии, как
(R)- или (8)-.
Любой асимметричный атом (например, хиральный углерод или т.п) соединения (соединений) по настоящему изобретению может быть энантиомерно обогащенным, например (R)- или (8)-конфигурация. В некоторых вариантах воплощения каждый асимметричный атом имеет по меньшей мере 50% энантио-мерный избыток, по меньшей мере 60% энантиомерный избыток, по меньшей мере 70% энантиомерный избыток, по меньшей мере 80% энантиомерный избыток, по меньшей мере 90% энантиомерный избыток, по меньшей мере 95% энантиомерный избыток или по меньшей мере 99% энантиомерный избыток в (R)-или (8)-конфигурации, описанной для конкретного асимметричного атома (например, хирального углерода).
Соответственно, соединение по настоящему изобретению может быть в форме по существу чистого энантиомера.
Любые полученные смеси изомеров можно разделить на основании физико-химических отличий составляющих их компонентов на чистые или по существу чистые оптические изомеры, например, при помощи хроматографии и/или фракционной кристаллизации.
Оптически активные (R)- и (8)-изомеры можно получить с использованием хиральных синтонов или хиральных реагентов или путем разделения с использованием общепринятых процедур. Любые полученные рацематы конечных продуктов или промежуточных соединений можно разделить на оптические антиподы известными способами. Например, известные способы включают разделение их диасте-реомерных солей, полученных с оптически активной кислотой или основанием, и высвобождение оптически активного кислотного или щелочного соединения. В частности, щелочную группу можно, таким образом, использовать для разделения соединений по настоящему изобретению на их оптические антиподы, например, при помощи фракционной кристаллизации соли, образованной с оптически активной кислотой, например винной кислотой, дибензоилвинной кислотой, диацетилвинной кислотой, ди-O,O'-п-толуоилвинной кислотой, миндальной кислотой, яблочной кислотой или камфор-10-сульфоновой кислотой. Рацемические продукты также можно разделить при помощи хиральной хроматографии, например высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хирального адсорбента.
Когда соединение содержит двойную связь, заместитель может быть в Е- или Z-конфигурации. Когда соединение содержит дизамещенный циклоалкил, циклоалкильный заместитель может иметь цис-или транс-конфигурацию. Также предполагается, что включены все таутомерные формы.
Соединения по настоящему изобретению, которые содержат группы, способные действовать как доноры и/или акцепторы для водородных связей, могут образовывать ко-кристаллы с подходящими образующими ко-кристалл веществами. Такие ко-кристаллы можно получить из соединений по настоящему изобретению с использованием известных процедур образования ко-кристаллов. Такие процедуры включают измельчение, нагревание, ко-сублимацию, ко-плавление или контактирование в растворе соединения по настоящему изобретению с образующим ко-кристалл веществом в условиях кристаллизации
и выделение ко-кристаллов, образованных таким образом. Подходящие вещества, образующие ко-кристаллы, включают вещества, описанные в WO 2004/078163. Следовательно, изобретение также обеспечивает ко-кристаллы, включающие соединение по настоящему изобретению.
Соединения формулы (I) ингибируют PI3 киназы (PI3K) и поэтому могут быть полезными для лечения протеин- или липидкиназа-зависимых заболеваний, особенно заболеваний, зависящих от класса I PI3 киназ, PI3Ka, PI3KP, PI3K5 и PI3Ky, или одного или нескольких их индивидуальных киназных членов, или любой комбинации любых двух или более из указанных киназ.
Соединения, которые ингибируют активность более чем одной из класса I PI3K изоформ (а, р, 5 и у), в частности, по существу, эквипотентные в отношении класса IA членов p110a, p110р и p1105 и, необязательно, также класса IB члена p110у, считаются полезными, поскольку считают, что такие соединения обладают способностью избегать механизмы адаптации благодаря изменению пути через другие изоформы, по сравнению с соединениями с уникальной специфичностью, например специфичностью в отношении одного члена семейства PI3K класса I. Под "эквипотентным" подразумевается, что соединения ингибируют некоторые изоформы до сопоставимой степени, например, измеряемой в ферментном или клеточном анализе, описанном в настоящем документе.
Повышенная сила ингибирования по меньшей мере одной из PI3K изоформ (т.е. ингибирование по меньшей мере одной PI3K изоформы при более низких концентрациях) также может быть выгодной. В случае PTEN-нулевых опухолей, например, хотя управляющей изоформой является p110р, для полной эффективности может потребоваться участие других изоформ класса IA. Например, активность в отношении а и р изоформ может быть выгодной.
Также существует необходимость в соединениях, которые эффективно ингибируют PI3Ka киназу, например, для лечения типов рака, которые преимущественно стимулируются онкогенными формами гена, кодирующего р110а (например, PIK3CA H1047R или E545K), а также опухолей, демонстрирующих повышенное число копий PIK3CA.
Желательно, чтобы соединения по настоящему изобретению обладали активностью в отношении указанной PI3 киназы, не демонстрируя при этом активности в отношении mTOR, или по меньшей мере обладали выгодной селективностью для ингибирования одной или нескольких из класса I PI3 киназ в большей степени, чем mTOR. Например, соединения, которые демонстрируют селективное ингибирова-ние в пользу одной или нескольких PI3K изоформ (например, по меньшей мере двух, предпочтительно трех, например а, р и 5 изоформ) по сравнению с mTOR, также являются желательными, поскольку эффект ингибирования mTOR, как правило, уменьшает окно безопасности, более конкретно, когда соединение ингибирует mTOR более сильно, чем PI3K (неблагоприятное отношение).
Кроме того, ингибиторы PI3K, которые имеют уменьшенный эффект вне мишени, или не имеют никакого эффекта вне мишени, такого как связывание тубулина, являются желательными, поскольку такой эффект может вызвать токсические эффекты, не связанные с прицельным ингибированием PI3K, и поэтому для таких соединений может потребоваться дополнительный строгий контроль дозирования для обеспечения терапевтического эффекта, который можно контролировать и отнести за счет ингибирова-ния PI3K. Соединения по настоящему изобретению, при измерениях с использованием процедур, описанных в настоящем документе, демонстрируют слабый наблюдаемый эффект вне мишени (связывание тубулина) или полное его отсутствие.
Соединения, которые ингибируют активность в отношении более чем одной из класса I PI3K изо-форм (а, р, 5 и у), в частности, по существу, в равной степени эффективные в отношении класса IA членов p110a, p110р и p1105 и, необязательно, также класса IB члена p110у, и в дополнение к этому имеющие уменьшенный эффект вне мишени или не обладающие никаким эффектом вне мишени, например не обладающие эффектом связывания тубулина или обладающие пониженной активностью связывания ту-булина, являются желательными.
Желательно найти соединения, демонстрирующие улучшенное ингибирование по меньшей мере одной (например, PI3Ka), но лучше двух (например, PI3Ka и PI3KP), или трех (например, PI3Ka, PI3KP и PI3K5) или всех четырех PI3K класса 1 (PI3Ka, PI3KP, PI3K5 и PI3Ky), а также уменьшенный эффект (в частности, его отсутствие) вне мишени (например, пониженная активность связывания тубулина или отсутствие такой активности). Желательно, чтобы такие соединения также демонстрировали селективное ингибирование в пользу одной или нескольких PI3K изоформ (например, по меньшей мере двух, предпочтительно трех, например а, р и 5 изоформ) по сравнению с mTOR.
Соответственно, в следующем аспекте соединение по настоящему изобретению можно использовать (например, для получения лекарственного средства) для лечения заболеваний, состояний или расстройств, связанного с ингибированием или антагонизмом PI3 киназ у субъекта (например, млекопитающего, предпочтительно человека). Поскольку они имеют важное значение для ингибирования PI3 киназ, соединения по настоящему изобретению считаются полезными для лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак. Конкретные заболевания/состояния для лечения соединениями по настоящему изобретению включают доброкачественную или особенно злокачественную опухоль, солидные опухоли, карциному головного мозга, почки, печени, надпочечников, мочевого пузыря, молочной железы,
желудка (особенно гастральные опухоли), пищевода, яичников, толстой кишки, прямой кишки, предстательной железы, поджелудочной железы, легкого (например, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого), влагалища, щитовидной железы, саркому, глиобластомы, множественную миелому или желудочно-кишечный рак, в частности карциному толстой кишки или колоректальную аденому, или опухоль головы и шеи, другие заболевания, такие как синдром Cowden, болезнь Lhermitte-Duclos и синдром Bannayan-Zonana (или заболевания, в которых PI3K/PKB путь аберрантно активируется), гиперплазию предстательной железы, неоплазию, особенно эпителиального характера, предпочтительно карциному молочной железы или сквамозно-клеточную карциному, В-клеточные злокачественные заболевания, такие как хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), неходжкинская лимфома (NHL), плазменно-клеточная миелома и лимфома Ходжкина (NH), или лейкоз. Желательно, чтобы соединения обладали способностью обеспечивать регрессию опухолей и препятствовать образованию опухолевых метастаз и росту (также микро) метастаз. Также возможно использование соединений формулы (I) для лечения заболеваний иммунной системы, в которые вовлечены некоторые, или особенно индивидуальные, липид-киназы и/или (также) сериновые/треониновые протеинкиназы.
Как используется в настоящем документе, формы единственного числа, используемые в контексте данного изобретения, следует рассматривать как охватывающие как единственное, так и множественное число, если не указано иное или нет явных противоречий в контексте.
Все способы, описанные в настоящем документе, можно осуществить в любом подходящем порядке, если не указано иное или нет явных противоречий в контексте. Использование любого и всех примеров или служащих для представления в качестве примера фраз (например, "такой как"), представленных в настоящем документе, предназначен исключительно для лучшей иллюстрации изобретения и не налагает ограничения на заявленный объем настоящего изобретения.
Соединения по настоящему изобретению типично используют в виде фармацевтической композиции (например, соединение по настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель).
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.
Соединение по настоящему изобретению может быть представлено в композиции в аморфной форме. Соединение по настоящему изобретению может быть представлено в композиции в его свободной форме, т.е. не в форме соли (форма свободного основания). Соединение по настоящему изобретению может быть представлено в композиции в его свободной форме, т.е. не в форме соли (форма свободного основания), и оно также находится в аморфной форме.
Как используется в настоящем документе, термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает общепризнанные как безопасные (GRA8) растворители, среду для диспергирования, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические вещества, замедлители абсорбции, соли, консерванты, стабилизаторы лекарственного средства, связующие, эксципиенты, дезинтегранты, лубриканты, подсластители, отдушки, красители, буферные вещества (например, малеиновая кислота, винная кислота, молочная кислота, лимонная кислота, уксусная кислота, бикарбонат натрия, фосфат натрия и т.п.) и т.п. и комбинации таких веществ, как должно быть известно специалистам в данной области (см., например, Remington's Pharmeceutical 8ciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, p. 1289-1329). Использование любого традиционного носителя, за исключением тех случаев, когда он несовместим с активным ингредиентом, в терапевтических или фармацевтических композициях предусматривается настоящим изобретением. Для целей настоящего изобретения сольваты и гидраты рассматриваются как фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению и растворитель (т.е. сольват) или воду (т.е. гидрат).
Композиции можно получить с использованием традиционных процедур растворения и смешивания. Например, массу лекарственного вещества (т.е. соединение по настоящему изобретению или стабилизированная форма соединения, например комплекс с производным циклодекстрина или другим известным комплексообразующим агентом) растворяют в подходящем растворителе в присутствии одного или нескольких из эксципиентов, описанных выше. Соединение по настоящему изобретению типично формулируют в фармацевтические дозированные формы для обеспечения легко контролируемого дозирования лекарственного средства и для обеспечения пациенту приятного по форме и легкого в употреблении продукта.
Фармацевтическую композицию можно сформулировать для конкретного пути введения, такого как пероральное введение, парентеральное введение и ректальное введение и т.п. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены в твердой форме (включая, без ограничения, капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории) или в жидкой форме (включая, без ограничения, растворы, суспензии или эмульсии). Фармацевтические композиции можно подвергнуть традиционным фармацевтическим процедурам, таким как стерилизация, и/или они могут содержать традиционные инертные разбавители, лубриканты или буферные вещества, а также адъюван
ты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы и буферы и т.п.
Типично, фармацевтические композиции представляют собой таблетки или желатиновые капсулы, включающие активный ингредиент вместе:
a) с разбавителями, такими как лактоза, декстроза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза и/или глицин;
b) с лубрикантами, такими как диоксид кремния, тальк, стеариновая кислота, ее магниевая или кальциевая соль и/или полиэтиленгликоль; для таблеток также
c) со связующими, такими как алюмосиликат магния, крахмальная паста, желатин, трагакант, ме-тилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон; если желательно
d) с дезинтегрантами, такими как крахмалы, агар, альгиновая кислота или ее натриевая соль, или шипучие смеси; и/или
e) с абсорбентами, красителями, отдушками и подсластителями.
Таблетки могут иметь либо пленочное, либо энтеросолюбильное покрытие, нанесенное в соответствии со способами, известными из уровня техники.
Можно использовать растворы активного ингредиента, а также суспензии, и особенно изотонические водные растворы или суспензии, и, например, в случае лиофилизированных композиций, которые включают активный ингредиент отдельно или вместе с носителем, например маннитом, такие растворы или суспензии можно получить непосредственно перед применением.
Фармацевтические композиции могут быть стерилизованными и/или могут включать адъюванты, например консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества и/или эмульгаторы, солюбилизаторы, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы; и их получают способом, известным per se, например традиционными способами растворения или лиофилизации. Указанные растворы или суспензии могут включать повышающие вязкость вещества, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, декстран, поливинилпирролидон или желатин.
Суспензии в масле включают в качестве масляного компонента растительные, синтетические или полусинтетические масла, обычно для введения путем инъекции. Особенно можно указать жидкие сложные эфиры жирных кислот, которые содержат в качестве кислотного компонента длинноцепочечную жирную кислоту, содержащую 8-22 атомов углерода, особенно 12-22 атомов углерода, например лаури-новую кислоту, тридециловую кислоту, миристиновую кислоту, пентадециловую кислоту, пальмитиновую кислоту, маргариновую кислоту, стеариновую кислоту, арахидиновую кислоту, бегеновую кислоту, или соответствующие ненасыщенные кислоты, например, олеиновую кислоту, элаидиновую кислоту, эруковую кислоту, бразидиновую кислоту или линолевую кислоту, если желательно с добавлением ан-тиоксидантов, например витамина Е, р каротина или 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокситолуола. Спиртовой компонент таких сложных эфиров жирных кислот содержит максимально б атомов углерода и представляет собой моно- или поли-гидрокси, например моно-, ди- или тригидрокси; спирт, например метанол, этанол, пропанол, бутанол или пентанол; или его изомеры, но особенно гликоль и глицерин. Поэтому следует указать следующие примеры сложных эфиров жирных кислот: этилолеат, изопропилмиристат, изопропилпальмитат "Labrafil M 2375" (полиоксиэтиленглицеринтриолеат, Gattefosse, Paris), "Miglyol 812" (триглицерид насыщенных жирных кислот с длиной цепи C8-C12, Huls AG, Germany), но особенно растительные масла, такие как масло семян хлопчатника, миндальное масло, оливковое масло, касторовое масло, кунжутное масло, соевое масло, и особенно арахисовое масло.
Композиции для инъекций получают традиционным способом в стерильных условиях; это также относится к заключению композиций ампулы или флаконы и герметичному закрытию контейнеров.
Фармацевтические композиции для перорального введения можно получить путем объединения активного ингредиента с твердыми носителями, если желательно, гранулирования полученной смеси и переработки смеси, если желательно или необходимо, после добавления подходящих эксципиентов в таблетки, сердцевину драже или капсулы. Также возможно их включение в пластиковые носители, которые обеспечивают диффузию или высвобождение активных ингредиентов в отмеренных количествах.
Подходящие композиции для перорального введения содержат эффективное количество соединения по настоящему изобретению в форме таблеток, лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального применения, получают в соответствии с любым способом, известным из уровня техники для получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или несколько веществ, выбранных из группы, включающей подсластители, отдушки, красители и консерванты, для получения имеющих приятный вид и вкус фармацевтических препаратов. Таблетки могут содержать активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые являются подходящими для получения таблеток. Эти эксципиенты представляют собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие вещества и дезинтегранты, например кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связывающие вещества, например крахмал, желатин или аравийская камедь; и лубриканты, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть
без покрытия или имеют покрытие, нанесенное известными способами, для замедления разложения и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и обеспечения, таким образом, замедленного действия в течение более длительного периода времени. Например, можно использовать вещество, замедляющее по времени действие, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Композиции для перорально-го применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешан с водой или масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.
Фармацевтические композиции для местного введения можно получить путем объединения активного ингредиента с жидким носителем (например, водным жидким носителем) для растворения или диспергирования активного вещества, вместе с дополнительными необязательными ингредиентами для формулирования, такими как растворители/солюбилизаторами, гелеобразующие вещества, масла, стабилизаторы, буферы и консерванты, с получением, например, раствора, лосьона, крема, геля или мази. Фармацевтические композиции для местного введения могут быть предназначены, например, для нанесения на кожу. Фармацевтические композиции для местного введения могут включать приблизительно от 0,1 до приблизительно 2% активного ингредиента, при этом активный ингредиент представляет собой особенно соединение формулы (I), в частности соединение, описанное в индивидуальных примерах в настоящем документе.
Фармацевтическая композиция (или препарат) для применения может быть упакована различными способами в зависимости от способа, используемого для введения лекарственного средства. Как правило, устройство для распределения включает контейнер, содержащий заключенную в нем фармацевтическую композицию в подходящей форме. Подходящие контейнеры хорошо известны специалистам в данной области и включают такие, как бутыли (пластиковые и стеклянные), капсулы, пластиковые пакеты, металлические цилиндры и т.п. Контейнер также может включать защиту от неумелого обращения для предотвращения неосторожного доступа к содержимому упаковки. Кроме того, контейнер имеет нанесенную на него этикетку, которая описывает содержимое контейнера. Этикетка также может включать соответствующие предупреждения.
Фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению, можно сформулировать для применения путем парентерального введения. Фармацевтические композиции (например, внутривенную (в/в) композицию) можно подвергнуть традиционным фармацевтическим процедурам, таким как стерилизация, и/или они могут содержать традиционные инертные разбавители или буферные вещества, а также адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы и буферы, хорошо известные специалистам в данной области.
Настоящее изобретение также обеспечивает безводные фармацевтические композиции и дозированные формы, содержащие соединения по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может способствовать разложению некоторых соединений. Безводные фармацевтические композиции и дозированные формы по настоящему изобретению можно получить с использованием безводных или содержащих небольшое количество влаги ингредиентов и условий низкой влажности. Безводную фармацевтическую композицию можно получить и хранить таким образом, чтобы сохранялась ее безводная природа.
Соответственно, безводные композиции упаковывают с использованием веществ, известных как предотвращающие воздействие воды, так чтобы они могли быть включены в подходящие фармацевтические наборы. Примеры подходящей упаковки включают, но не ограничиваются этим, герметично закрытые упаковки из фольги, пластиков, однодозовые контейнеры (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные упаковки.
Изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции и дозированные формы, которые включают одно или несколько веществ, которые снижают скорость, с которой соединение по настоящему изобретению, используемое в качестве активного ингредиента, будет разлагаться. Такие вещества, в настоящем документе указаны как "стабилизаторы", включают, но не ограничиваются этим, антиокси-данты, такие как аскорбиновая кислота, рН буферы или солевые буферы и т.п.
Соединение по настоящему изобретению, в частности, соединение, описанное в индивидуальных примерах в настоящем документе, может быть представлено в аморфной форме.
Соединение по настоящему изобретению, в частности соединение, описанное в индивидуальных примерах в настоящем документе, можно сформулировать в виде стандартной суспензии, наносуспензии и твердой дисперсии, например, следующим образом.
Стандартная суспензия.
1) Необходимое количество кристаллического вещества примера 18, партия E, отвешивали, чтобы получить концентрацию композиции 3 мг/мл.
2) Кристаллическое вещество примера 18, партия Е, затем диспергировали в 0,5% (мас./мас.) кар-боксиметилцеллюлозы/0,5% (мас./мас.) Tween80/вода.
3) Суспензию подвергали вихревому перемешиванию для гомогенизации.
4) Суспензию обрабатывали ультразвуком с использованием ультразвукового зонда для уменьшения размера частиц (2 мин). Наносуспензия.
1) 32 мг кристаллического вещества примера 18, партия E, точно отвешивали в специально сконструированное мраморное измельчающее устройство.
2) В измельчающее устройство добавляли 2,148 г 0,2 мм циркониевой измельчающей среды.
3) В измельчающее устройство добавляли 0,608 мл 1% (мас./об.) НРМС 603 (гидроксипропилме-тилцеллюлоза сорта 603)/0,05% (мас.) 8D8 (додецилсульфат натрия)/вода.
4) Измельчающие устройства закрывали и помещали в ротационный смеситель.
5) Образец перемалывали в течение 4 ч при 400 об/мин.
6) Наносуспензию собирали с использованием шприца.
Твердая дисперсия.
1) 30 мг кристаллического вещества примера 18, партия E, отвешивали в лиофилизационный сосуд.
2) В этот сосуд добавляли 30 мг НРМС603 (гидроксипропилметилцеллюлоза сорта 603).
3) В сосуд добавляли 5,6 мл диоксана. Сосуд закрывали крышкой.
4) Образец перемешивали в условиях окружающей среды в течение 12 ч.
5) Полученный раствор подвергали сушке замораживанием в соответствии со следующими условиями.
Термообработка
Температура ГС]
Время [мин]
Давление [у бар]
Температура холодильника ГС]
-20
2500
-40
-20
2500
-40
Первичная сушка
Температура [°С]
Время [мин]
Давление [у бар]
Температуре холодильника
Гс]
180
2000
-40
500
-40
120
100
-40
Последующее нагревание
Температура ГС]
Время [мин]
Давление [у бар]
Температура холодильника ГС]
1000
2000
-40
Когда соединение по настоящему изобретению обеспечивают в виде твердой дисперсии, полученной, например, путем объединения соединения с носителем (таким как полимер, например, НРМС) и растворителем и лиофилизационной сушки смеси (специально для получения соединения в аморфной форме, а не в кристаллической форме), по соображениям стабильности, может быть выгодным повышение отношения количества носителя к количеству соединения, чтобы избежать перекристаллизации соединения при выстаивании.
В некоторых случаях может быть выгодным введение соединения по настоящему изобретению в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным фармацевтическим (или терапевтическим) средством (например, антипролиферативным или противораковым средством или вспомогательной терапией, типично используемой в химиотерапии). Соединение по настоящему изобретению можно вводить либо одновременно, либо до или после введения одного или нескольких других терапевтических средств. Альтернативно, соединение по настоящему изобретению можно вводить отдельно, таким же или другим путем введения, или вместе в одной и той же фармацевтической композиции с другим средством (средствами).
Подходящие дополнительные противораковые средства включают, но не ограничиваются этим.
Ингибиторы HER2 и HER3 рецепторов: как было недавно продемонстрировано в моделях ЕПЖ2-положительного рака молочной железы, ингибирование PI3K приводит к реактивации пути, через FoxO зависимую HER2/HER3 транскрипционную индукцию, что предполагает использование ингибиторов HER2 в этих случаях (8erra et al, 2011 Oncogene 30; Chandarlapaty et al., 2011, Cancer Cell, 19; Chakra-barty et al., 2012, PNA8 109). Например, трастузумаб (коммерчески доступный под торговой маркой Her-ceptin(r) от компании Genentech/Roche), пертузумаб (коммерчески доступный под торговой маркой Per
j eta(tm) от компании Genentech/Roche), конъюгат антитело-лекарственное средство трастузумаб Эмтансин (T-DM1) от компании Genentech/Roche, эрлотиниб (коммерчески доступный под торговой маркой Tar-ceva(r), от компании Genentech/Roche, гефитиниб (коммерчески доступный под торговой маркой Iressa(tm) от компании AstraZeneca), MOR10703, нератиниб (также известный как HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-хлор-4-[(пиридин-2-ил)метокси]фенил]амино]-3-циано-7-этоксихинолин-6-ил]-4-(диметиламино)бут-2-енамид и описанный в РСТ WO 05/028443), лапатиниб или лапатиниб дитозилат (коммерчески доступный под торговой маркой Tykerb(r) от компании Glaxo8mithKline). Такая комбинация является полезной, например, для HER2-положительного рака молочной железы и гастрального рака с HER2 амплификацией. В качестве терапевтической мишени HER3 (ErbB3) представляет проблему, так как имеет неактивную ти-розиновую киназу, исключая, таким образом, применение АТР-миметических ингибиторов тирозиновых киназ (TKI). Чтобы обойти эту проблему, существуют антитело-опосредованные стратегии, нацеленные на блокирование связывания лиганда с ErbB3 (например, ММ-121) или блокирование димеризации ErbB3 с ErbB2 в ErbB2-гиперэкспрессирующих клетках (например, пертузумаб).
Даун-регуляторы эстрогеновых рецепторов/ингибиторы ароматазы: например Fulvestrant (коммерчески доступный под торговой маркой Faslodex(r)), летрозол (коммерчески доступный под торговой маркой Femara(r) от компании Novartis) или экземестан (коммерчески доступный под торговой маркой Aromasin(r) от компании Pfizer). Такая комбинация является полезной, например, для лечения ER-положительного рака молочной железы. Обоснованием для использования такой комбинации является то, что она нацелена на связанную с PI3K гормональную резистентность.
Ингибиторы митоген-активированной протеинкиназы (MEK): например, XL-518 (Cas No. 102987229-4, доступный от компании ACC Corp), AZD6244 или селуметиниб (AstraZeneca), G8K1120212 (Glaxo8mithKline), AZD8330 (AstraZeneca) или MEK162. Такая комбинация является полезной, например, для лечения рака легкого с мутантным KRA8, колоректального рака (CRC) и раков поджелудочной железы.
Ингибиторы Bcl2/BclXL: например, АВТ737 (Abbott).
Антиандрогены: например, нилутамид (коммерчески доступный под торговыми марками Nilan-dron(r) и Anandron(r)), бикалутамид (коммерчески доступный под торговой маркой Casodex(r)), флутамид (коммерчески доступный под торговой маркой Fulexin(tm)), MDV3100 (энзалутамид, коммерчески доступный под торговой маркой Xtandi(r) от компании Medivation) и абиратерон (коммерчески доступный под торговой маркой Zytiga(r) от компании Janssen). Такая комбинация является полезной, например, для лечения гормонозависимого рака предстательной железы с PTEN инактивацией. Обоснованием для использования такой комбинации является то, что она нацелена на взаимное влияние между путями PI3K и андрогеновых рецепторов.
Ингибиторы белка 90 теплового шока (H8P90): например, танеспимицин (17-аллиламино-17-деметоксигелданамицин, также известный как KO8-953 и 17-AAG, доступный от компании 8IGMA и описанный в патенте США № 4261989), и этиламид 5-(2,4-дигидрокси-5-изопропилфенил)-4-(4-морфолин-4-илметилфенил)изосзол-3-карбоновой кислоты (также известный как AUY922 и описанный в РСТ WO 2004/072051). Такая комбинация является полезной, например, для лечения EGFR-зависимых раков легкого или для ингибирования EGRmut, который стал резистентным к ингибиторам EGR, или в HER2-положительного рака молочной железы или HER2-положительного гастрального рака.
Таксановые противоопухолевые средства: например, кабазитаксел (1-гидрокси-7р,10р-диметокси-9-оксо-5р,20-эпокситакс-11-ен-2a,4,13a-триил-4-ацетат-2-бензоат-13-[(2R,38)-3-{[(трет-бутокси)карбонил]амино}-2-гидрокси-3-фенилпропаноат), ларотаксел ((2а,3|,4а,5р,7а,10р,13а)-4,10-бис-(aцетилокси)-13-({(2R,38)-3-[(трет-бутоксикaрбонил)aмино]-2-гидрокси-3-фенилпропaноил}окси)-1-гидрокси-9-оксо-5,20-эпокси-7,19-циклотакс-11-ен-2-илбензоат).
Антимитотические средства: например, доцетаксел (коммерчески доступный под торговой маркой Taxotere(r) от компании 8anofi-Aventis), полезный для лечения рака молочной железы.
Растительные алкалоиды: например, паклитаксел (коммерчески доступный под торговыми марками Taxol и Onxal(tm)) и паклитаксел белоксвязанный (коммерчески доступный под торговой маркой Abraxane(r)) и полезный для лечения рака предстательной железы, винбластин (также известный как вин-бластин сульфат, винкалейкобластин и VLB, коммерчески доступный под торговыми марками Alkaban-AQ(r) и Velban(r)), винкристин (также известный как винкристин сульфат, LCR и VCR, коммерчески доступный под торговыми марками Oncovin(r) и Vincasar Pfs(r)) и винорелбин (коммерчески доступный под торговой маркой Navelbine(r)).
Антитела к рецепторам антиинсулинподобного ростового фактора-1 (IGF-1R): например, фигиту-мумаб (также известный как СР-751,871, коммерчески доступный от компании АСС Corp) и робатуму-
маб (CA8 No. 934235-44-6).
Ингибиторы PARP (поли ADP-рибозаполимеразы): например, B8I-201 (инипариб) и олапариб. Такая комбинация является полезной, например, для воздействия на возможную индукцию механизма повреждения ДНК при помощи ингибиторов PI3K.
Подходящие терапевтические средства для вспомогательной терапии включают стероиды, противовоспалительные средства, антигистамины, противорвотные средства и другие средства, хорошо известные специалистам в данной области для применения с целью улучшения качества ухода за пациентами, подлежащими лечению от заболеваний, состояний или расстройств, описанных в настоящем документе.
Поскольку активация PI3K/Akt пути стимулирует клеточное выживание, ингибирование этого пути в сочетании с терапиями, которые стимулируют апоптоз в раковых клетках, включая лучевую терапию и химиотерапию, может привести к улучшенным ответам (Ghobrial et al., СА Cancer J. Clin. 55:178-194 (2005)). В качестве примера комбинация ингибитора PI3 киназы с карбоплатином продемонстрировала синергические эффекты в анализах in vitro пролиферации и апоптоза, а также в in vivo модели эффективности с использованием ксенотрансплантата опухоли яичника (Westfall and 8kinner, Mol. Cancer Ther. 4:1764-1771 (2005)). Соединения по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с лучевой терапией.
Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтическую композицию можно вводить следующими путями: энтеральным, таким как назальный; ректальным или пероральным; парентеральным, таким как внутримышечный или внутривенный; или местным путем, таким как кожное введение. Соединение по настоящему изобретению или его фармацевтическую композицию при применении для человека предпочтительно вводят перорально (например, в форме таблеток).
Фармацевтическая композиция или комбинация по настоящему изобретению может быть представлена в виде единичной дозы от около 1 до около 1000 мг активного ингредиента (ингредиентов) для субъекта с массой тела от около 50 до около 70 кг, или от около 1 до около 500 мг, или от около 1 до около 250 мг, или от около 1 до около 150 мг, или от около 0,5 до около 100 мг, или от около 1 до около 50 мг активных ингредиентов.
Единичная доза также может быть от около 50 до около 1000 мг активного ингредиента(ингредиентов) для субъекта с массой тела от около 50 г до около 70 кг, или от около 50 до около 500 мг, или от около 50 до около 250 мг, или от около 50 до около 150 мг, или от около 50 до около 100 мг активных ингредиентов.
Единичная доза также может быть от около 100 до около 500 мг активного ингредиента (ингредиентов) для субъекта с массой тела от около 50 до около 70 кг, или от около 200 до около 500 мг, или от около 300 до около 500 мг, или от около 300 до около 400 мг активных ингредиентов.
Эти дозы могут обеспечиваться в виде общей суточной дозы и могут обеспечиваться в виде единичной дозы или в виде дробных доз. Доза может зависеть от конкретной дозированной формы, используемой для доставки активного ингредиента (ингредиентов). Как правило, терапевтически эффективная доза соединения, его фармацевтической композиции или комбинаций, зависит от вида, к которому принадлежит субъект, массы тела, возраста и состояния индивидуума, расстройства или заболевания или тяжести расстройства или заболевания, подлежащего лечению. Доза также может зависеть от биодоступности активного ингредиента у видов, подлежащих лечению. Лечащий врач, фармацевт, клиницист или ветеринар со средней квалификацией легко может определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для профилактики, лечения или ингибирования развития расстройства или заболевания.
Указанные выше свойства доз можно продемонстрировать в in vitro и in vivo испытаниях с использованием предпочтительно млекопитающих, например, мышей, крыс, собак, обезьян или их выделенных органов, тканей и препаратов. Соединения по настоящему изобретению можно применять in vitro в форме растворов, например, водных растворов, полученных, например, из 10 мМ DM8O исходного раствора, и in vivo либо энтерально, либо парентерально, предпочтительно внутривенно, например в виде суспензии или в водном растворе. Доза in vitro может находиться в пределах от около 10-3 молярных до около 10-9 молярных концентраций. Терапевтически эффективное количество in vivo может находиться в пределах, в зависимости от пути введения, от около 0,1 до около 500 мг/кг или от около 1 до около 100 мг/кг.
Как правило, терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в лечении. Термин "терапевтически эффективное количество" соединения по настоящему изобретению относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ субъекта, например снижение или ингибиро-вание активности фермента или активности белка или активности белкового комплекса, или облегчать симптомы, облегчать состояния, замедлять или откладывать развитие заболевания или препятствовать возникновению заболевания и т.п.
Еще в одном аспекте обеспечивается способ лечения рака у млекопитающего, который включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по настоящему изобретению.
Как используется в настоящем документе, термин "субъект" относится к животному. Типично, животное представляет собой млекопитающее. Субъект также относится, например, к приматам (например, человеку мужского или женского пола), коровам, овцам, козам, лошадям, собакам, кошкам, кроликам, крысам, мышам, рыбам, птицам и т.п. В некоторых вариантах воплощения субъектом является примат.
Предпочтительно субъектом является человек.
Как используется в настоящем документе, термин "ингибировать", "ингибирование" или "ингиби-рующий" относится к ослаблению или подавлению данного состояния, симптома или расстройства или заболевания или существенному снижению базовой активности биологической активности или процесса.
Как используется в настоящем документе, термин "лечить", "лечение" или "лечащий" любого заболевания или расстройства относится (i) к облегчению заболевания или расстройства (т.е. замедлению или остановке или уменьшению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов); (ii) к уменьшению тяжести или облегчению по меньшей мере одного физического параметра, включая те, которые могут быть неразличимы для пациента; или (iii) к профилактике или замедлению возникновения или развития или прогрессирования заболевания или расстройства. Как правило, термин "лечащий" или "лечение" описывает помощь и уход за пациентом в целях борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, и включает введение соединения по настоящему изобретению для предотвращения возникновения симптомов или осложнений, облегчения симптомов или осложнений или устранения заболевания, состояния или расстройства.
Как используется в настоящем документе, субъект "нуждается в" лечении, если такой субъект может получить пользу, с точки зрения биологической, медицинской или качества жизни, от такого лечения (предпочтительно субъект представляет собой человека).
Другой аспект настоящего изобретения представляет продукт, включающий соединение по настоящему изобретению и по меньшей мере одно другое терапевтическое средство (или фармацевтическое средство) в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии для усиления апоптоза.
В комбинированных терапиях по настоящему изобретению соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство могут быть получены и/или сформулированы одним и тем же или разными изготовителями. Кроме того, соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство (или фармацевтическое средство) могут быть объединены вместе в виде комбинированной терапии: (i) до отпуска комбинированного продукта лечащим врачам (например, в случае набора, включающего соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство); (ii) самими лечащими врачами (или под руководством лечащего врача) непосредственно перед введением; (iii) в организме самих пациентов, например, при последовательном введении соединения по настоящему изобретению и другого терапевтического средства.
Соответственно, изобретение обеспечивает применение соединения по настоящему изобретению для лечения заболевания или состояния путем ингибирования или антагонизирования PI3K, где лекарственное средство получено для введения с другим терапевтическим средством. Изобретение также обеспечивает применение другого терапевтического средства, где лекарственное средство вводят в виде комбинации соединения по настоящему изобретению с другим терапевтическим средством.
Варианты воплощения настоящего изобретения проиллюстрированы следующими примерами. Однако должно быть понятно, что варианты воплощения настоящего изобретения не ограничиваются конкретными деталями этих примеров, поскольку другие их варианты будут известны или очевидны специалистам в данной области в свете настоящего раскрытия.
Примеры
Если не указано иное, исходные вещества, как правило, доступны из коммерческих источников, таких как Aldrich Chemicals Co. (Milwaukee, Wis), Lancaster 8ynthesis, Inc. (Windham, N.H), Acros Organics (Fairlawn, N.J), Maybridge Chemical Company, Ltd. (Cornwall, England), Tyger 8cientific (Princeton, N.J), Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL) и AstraZeneca Pharmaceuticals (London, England).
Аббревиатуры, используемые в следующих далее примерах, имеют соответствующие значения, указанные ниже:
AcOH - уксусная кислота,
AlCl3 - трихлорид алюминия,
API - ионизация при атмосферном давлении,
Boc - трет-бутоксикарбонил,
насыщенный солевой раствор - насыщенный (при комнатной температуре) раствор хлорида натрия,
шир.с - широкий синглет,
nBuOH - н-бутанол,
tBu - трет-бутил,
CDI - карбонилдиимидазол,
целит - торговая марка Celite Corp. (World Minerals Inc), 8anta Barbara, CA, U8A, для фильтрования на основе кизельгура,
CH3CN - ацетонитрил, конц. - концентрированный, д - дублет, DCE - дихлорэтан, DCM - дихлорметан,
DEA - диэтиламин,
DIEA - ^^диэтилизопропиламин,
DMAP - 4-диметиламинопиридин,
DME - диметоксиэтан,
DMF - ^^диметилформамид,
DM8O - диметилсульфоксид,
E8-M8 - масс-спектрометрия с использованием электроспрея, Et - этил,
Et3N - триэтиламин, Et2O - диэтиловый эфир, EtOAc - этилацетат, EtOH - этанол, ч - час (часы),
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,
Hyflo - Hyflo 8uper Cel(r),
iPr - изопропил,
K2CO3 - карбонат калия,
KOH - гидроксид калия,
K3PO4 - фосфат калия,
LAH - литийалюминийгидрид,
ЖХ - жидкостная хроматография,
Me - метил,
MeI - метилйодид,
MeOH - метанол,
Mg8O4 - сульфат магния,
м - мультиплет,
мин - минута (минуты),
мл - миллилитр (миллилитры),
т.пл. - температура плавления,
M8 - масс-спектрометрия,
NaH - гидрид натрия,
NaHCO3 - бикарбонат натрия,
Na2CO3 - карбонат натрия,
NaHMD8 - натрий гексаметилдисаилазан,
NaOH - гидроксид натрия,
Na28O4 - сульфат натрия,
Mg8O4 - сульфат магния,
NaOAc - ацетат натрия,
NB8 - N-бромсукцинимид,
NH4Cl - хлорид аммония,
NH4OH - гидроксид аммония,
ЯМР - ядерный магнитный резонанс,
POCl3 - оксихлорид фосфора(Ш),
RT - комнатная температура,
Rf - коэффициент удерживания ТСХ,
с - синглет,
scCO2 - сверхкритический СО2, т - триплет,
TBAF - тетрабутиламмонийфторид, TBDP8C - трет-бутил-дифенил-силилхлорид, ТВМЕ - трет-бутилметиловый эфир, TEA - триэтиламин,
TEMPO - 2,2,6,6-тетраметилпиперидинилоксил,
TFA - трифторуксусная кислота,
ТГФ - тетрагидрофуран,
ТСХ - тонкослойная хроматография,
TM8 - триметилсилил,
TM8Cl - триметилсилилхлорид,
tR - время удерживания,
TsCl - п-толуолсульфонилхлорид,
TsOH - п-толуолсульфоновая кислота,
УФ - ультрафиолет.
Общий способ.
1Н-ЯМР измерения осуществляли на Bruker Ultrashield(tm) 400 (400 МГц), Bruker Ultrashield(tm) 600 (600 МГц) или 500 МГц DRX Bruker CryoProbe (500 МГц) спектрометре с использованием или без три-метилсилана в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги (5-значения) указаны в м.д. (миллионных долях) в области ниже от тетраметилсилана, константы взаимодействия (J) представлены в герцах (Гц), картины спектрального расщепления указаны как синглет (с), дублет (д), дублет дублетов (дд), триплет (т), квадруплет (кв), мультиплет или более перекрывающиеся сигналы (м), широкий сигнал (шир). Растворители указаны в скобках.
ТСХ осуществляли с использованием предварительно покрытых силикагелем 60 F254 стеклянных пластинах (Merck, Darmstadt, Germany) с использованием соответствующей указанной системы растворителей. Визуализацию обычно осуществляли в УФ-освещении (254 нм).
ВЭЖХ условия. ЖХ-МС 1.
Колонка: Acquity H88 Т3 2,1x50 мм, 1,8 мкм. Скорость потока: 1,2 мл/мин. Температура колонки: 50°C.
Градиент: от 2 до 98% В в течение 1,4 мин, 98% В в течение 0,75 мин, от 98 до 2% В в течение 0,04 мин, 2% В в течение 0,01 мин; А = вода+0,05% муравьиной кислоты+3,75 мМ ацетата аммония, В = ацетонитрил+0,04% муравьиной кислоты.
Детекция, полное сканирование: 215-350 нм.
ЖХ-МС 2.
Колонка: Acquity H88 Т3 2,1x50 мм, 1,8 мкм. Скорость потока: 1,2 мл/мин. Температура колонки: 50°C.
Градиент: от 2 до 98% В в течение 1,4 мин, 98% В в течение 0,75 мин, от 98 до 2% В в течение 0,04 мин, 2% В в течение 0,01 мин; А = вода+0,05% муравьиной кислоты+0,05% ацетата аммония, В = ацетонитрил+0,04% муравьиной кислоты.
Детекция, полное сканирование: 215-350 нм.
ЖХ-МС 3.
Колонка: Acquity H88 Т3 2,1x50 мм, 1,8 мкм.
Скорость потока: 1,0 мл/мин. Температура колонки: 60°C.
Градиент: от 5 до 98% В в течение 1,4 мин, 98% В в течение 0,75 мин, от 98 до 5% В в течение 0,04 мин, 5% В в течение 0,01 мин; А = вода+0,05% муравьиной кислоты+3,75 мМ ацетата аммония, В = ацетонитрил+0,04% муравьиной кислоты.
Детекция, полное сканирование: 215-350 нм.
ВЭЖХ 1.
Колонка: Chromolith performance RP18e 4,6x100 мм. Скорость потока: 2,0 мл/мин.
Градиент: от 2 до 100% В в течение 4,5 мин, 100% В в течение 1 мин, А = вода+0,1% TFA, В = аце-тонитрил+0,1% TFA. Детекция: 215 нм.
UPLC 1.
Колонка: Acquity UPLC H88 Т3 С18, 1,7 мкм 2,1x50 мм. Скорость потока: 1,0 мл/мин.
Градиент: от 5 до 100% В в течение 1,5 мин, 100% В в течение 1 мин, А = вода+0,1% TFA, В = аце-тонитрил + 0,1% TFA. Детекция: 218 нм.
Промежуточное соединение А. 4-(4,6-Дихлорпиримидин-2-ил)морфолин.
К раствору 2,4,6-трихлорпиримидина (5,0 мл, 42,6 ммоль) в мезитилене (80 мл) при 165°C добавляли по каплям раствор морфолина (4,83 мл, 55,4 ммоль) в мезитилене (20 мл) и суспензию перемешивали при 165°C в течение 30 мин. Реакционную смесь обрабатывали при помощи Н2О, EtOAc и NaHCO3. Органический слой промывали Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили (Na28O4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc, 100:0-7:3). Остаток растира-
Промежуточное соединение А является коммерчески доступным или может быть получено с использованием следующей процедуры.
ли в порошок с гексаном и фильтровали с получением указанного в заголовке соединения (3,36 г, 33%). tR: 1,11 мин (ЖХ-МС 1); E8I-M8: 234,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Промежуточное соединение B. 5-(4,4,5,5-Тетраметил[1,3,2]диоксаборолан-2-ил)-4-трифторметилпиримидин-2-иламин
К суспензии продукта со стадии В.1 (16,2 г, 66,3 ммоль), бис-пинаколатодибора (18,5 г, 72,9 ммоль) и KOAc (19,5 г, 199 ммоль) в диоксане (300 мл) в атмосфере аргона добавляли продукт присоединения PdCl2(dppf)-CH2Cl2 (2,4 г, 2,98 ммоль) и смесь перемешивали при 115°C в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждали до 50°C и обрабатывали при помощи EtOAc. Полученную суспензию фильтровали через Hyflo и промывали при помощи EtOAc. Объединенные фильтраты концентрировали. Остаток суспендировали в 2н. растворе NaOH, перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин и затем добавляли Et2O и Н2О и бинарную смесь фильтровали через Hyflo. Фазы фильтрат разделяли. рН полученного водного слоя доводили до 5-6 при помощи 4н. раствора HCl и затем экстрагировали при помощи EtOAc. Органический слой промывали Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили (Na28O4), фильтровали и концентрировали. Остаток растирали в порошок с Et2O и гексаном, фильтровали с получением указанного в заголовке соединения (8,33 г, 42%).
tR: 1,00 мин (ЖХ-МС 1); E8I-M8: 290,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия В1. 5-Бром-4-трифторметилпиримидин-2-иламин
К раствору 2-амино-4-трифторметилпиримидина (25 г, 0,15 моль) в CH3CN (800 мл) добавляли по каплям (в течение 2,5 ч) NB8 (34,8 г, 0,195 моль), растворенный в 200 мл CH3CN, в темноте. Смесь перемешивали в течение 4,5 ч при комнатной температуре в темноте и затем растворитель выпаривали. Остаток растворяли в EtOAc и Н2О и бинарную смесь переносили в делительную воронку. Водный слой отделяли и экстрагировали при помощи EtOAc. Органические слои промывали Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили при помощи Na28O4, фильтровали и упаривали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле с использованием градиента гексан/EtOAc 9:1 до 3:2. Объединенные чистые фракции упаривали и остаток суспендировали в 40 мл гексана, перемешивали в течение 10 мин, фильтровали и промывали при помощи 2x 20 мл гексана с получением указанного в заголовке продукта в виде бежевого твердого вещества (31,2 г, 85%).
tR: 0,82 мин (ЖХ-МС 1).
Пример 1. (8)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метилоксазолидин-2-он
Раствор продукта со стадии 1.1 (350 мг, 1,16 ммоль), промежуточного соединения В (449 мг, 1,51 ммоль), Na2CO3 (2 М, 1,7 мл, 3,48 ммоль) и PdCl2(dppf> CH2Cl2 (95 мг, 0,17 ммоль) в DME (10 мл) в атмосфере аргона перемешивали при 80°C в течение 1 ч. Смесь разбавляли в EtOAc и экстрагировали при помощи насыщенного раствора NaHCO3. Органический слой промывали Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили (Na28O4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (CH2Cl2/EtOH, 99,5:0,5-98:2). Остаток растирали в порошок с гексаном, фильтровали и сушили. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (Waters 8un Fire C18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-100% в течение 20 мин) с получением указанного в заголовке соединения (260 мг, 52%).
tR: 0,93 мин (ЖХ-МС 1); E8I-M8: 426,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
К раствору (8)-4-метил-2-оксазолидинона (432 мг, 4,19 ммоль) в DMF (10 мл) медленно добавляли NaH (60% в минеральном масле, 201 мг, 5,02 ммоль) в атмосфере аргона и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь охлаждали до 0°C и добавляли промежуточное соединение А (1 г, 4,19 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавляли при помощи EtOAc и экстрагировали при помощи Н2О. Органический слой промывали Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили (Na28O4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc, 97:3-1:1) с получением указанного в заголовке соединения (605 мг, 47%).
tR: 1,00 мин (ЖХ-МС 1); E8I-M8: 299,2/301,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 2. (8)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5,5 -диметилоксазо лидин-2 -он
Раствор продукта со стадии 2.1 (28 мг, 0,04 ммоль) и TBAF (2 мл, 2,0 ммоль, 1 М в ТГФ) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали и остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/MeOH, 100:0-95:5) с получением указанного в заголовке продукта.
tR: 0,89 мин (ЖХ-МС 1); E8I-M8: 470,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 2.1. (8)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-(трет-бутилдифенил-силанилоксиметил)-5,5-диметилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной в примере 1, но с использованием продукта со стадии 2.2. Смешивание осуществляли при 100°C в течение 40 мин. После экстракции остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-30:70) с получением указанного в заголовке продукта.
tR: 1,45 мин (ЖХ-МС 1); E8I-M8: 708,4 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 2.2. (8)-4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-3-(6-хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4 -ил) -5,5 -диметилоксазо лидин-2 -о н
Раствор продукт со стадии 2.3 (95 мг, 0,25 ммоль), промежуточного соединения А (58 мг, 0,25 ммоль), xantphos (10 мг, 0,02 ммоль), Pd2dba3 (4,5 мг, 4,95 мкмоль) и Cs2CO3 (121 мг, 0,37 ммоль) в диоксане в атмосфере аргона перемешивали при 100°C в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли при помощи EtOAc и экстрагировали при помощи насыщенного раствора NaHCO3. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, сушили (Na28O4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-0:100) с получением указанного в заголовке продукта (85 мг, 56%).
tR: 1,54 мин (ЖХ-МС 1); E8I-M8: 581,4/583,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 6.2, но с использованием продукта со стадии 2.4 и с использованием Et3N вместо имидазола. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь концентрировали и очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-55:45) с получением указанного в заголовке про-
дукта.
tR: 1,33 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 384,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1). Стадия 2.4. (8)-4-Гидроксиметил-5,5-диметилоксазолидин-2-он
Раствор продукта со стадии 2.5 (110 мг, 0,59 ммоль) и HCl (4 М в диоксане, 5 мл, 20 ммоль) перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакционную смесь концентрировали и остаток использовали без дополнительной очистки.
Стадия 2.5. (8)-1,1,5,5-Тетраметил-дигидрооксазоло[3,4-с]оксазол-3-он
К раствору продукта со стадии 2.6 (190 мг, 0,73 ммоль) в DMF (6 мл) в атмосфере аргона при 0°C добавляли NaH (88 мг, 2,20 ммоль, 60% в масле) и смесь перемешивали при 0°C в течение 6 ч. Реакционную смесь гасили при помощи Н2О и концентрировали. Остаток растирали в порошок с EtOAc и фильтровали. Фильтрованный раствор сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Продукт очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-60:40).
Стадия 2.6. трет-Бутиловый эфир (8)-4-(1-гидрокси-1-метилэтил)-2,2-диметилоксазолидин-3-карбоновой кислоты
К раствору (8)-3-трет-бутил 4-метил 2,2-диметилоксазолидин-3,4-дикарбоксилата (500 мг, 1,93 ммоль) в ТГФ (15 мл) в атмосфере аргона при 0°C добавляли по каплям метилмагнийбромид (1,4 мл, 4,24 ммоль) и смесь перемешивали при 0°C в течение 2 ч. Реакцию гасили насыщенным раствором NH4Cl и экстрагировали при помощи EtOAc. Органический слой промывали насыщенным солевым раствором, сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-65:35).
tR: 1,01 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 260, 3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 3. Рацемический 3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4 -метилоксазо лидин-2 -он
Раствор промежуточного соединения В (68 мг, 0,21 ммоль), продукта со стадии 3.1 (120 мг, 021 ммоль), раствора 2 М Na2CO3 (317 мкл, 0,63 ммоль) и тетракис (15 мг, 0,01 ммоль) в DME (2 мл) перемешивали при 80°C в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавляли в EtOAc и добавляли Na2SO4. Полученную суспензию фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаток растворяли при помощи ТГФ (2 мл) и добавляли TBAF (212 мкл, 0,21 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и концентрировали. Неочищенное вещество очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH, 99:1-96:4). Остаток растирали в порошок с DCM/гексаном с получением указанного в заголовке соеди-
нения.
tR: 0,85 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 456,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 3.1. 4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-3-(6-хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 3.2. После экстракции остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc: 9:1-1:1) с получением указанного в заголовке соединения.
Стадия 3.2. 4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-4-метилоксазолидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 6.4, но с использованием 4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она и с использованием DCM вместо DMF. Реакционную смесь экстрагировали при помощи Et2O. Органический слой промывали Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Полученное твердое вещество растирали в порошок с гексаном и фильтровали с получением указанного в заголовке соединения.
tR: 1,20 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 339,2/341,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 3А. Первый элюирующий энантиомер 3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она Абсолютная стереохимия не определена.
Указанное в заголовке соединение получали после препаративного хирального SFC разделения рацемического продукта примера 3. (Колонка: Chiralpak AD-H, 30x250 мм. Скорость потока 80 мл/мин. scCO2/MeOH 85:15). tR: 3,97 мин (Колонка: Chiralpak AD-H, 4,6x250 мм. Скорость потока 3 мл/мин. scCO2/MeOH 85:15).
Пример 3В. Второй элюирующий энантиомер 3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она Абсолютная стереохимия не определена.
Указанное в заголовке соединение получали после препаративного хирального SFC разделения рацемического продукта примера 3. (Колонка: Chiralpak AD-H, 30x250 мм. Скорость потока 80 мл/мин. scCO2/MeOH 85:15). tR: 4,49 мин (Колонка: Chiralpak AD-H, 4,6x250 мм. Скорость потока 3 мл/мин. scCO2/MeOH 85:15).
Раствор продукта со стадии 4.1 (60 мг, 0,17 ммоль), промежуточного соединения В (54 мг, 0,17 ммоль), Na2CO3 (2 М, 260 мкл, 0,52 ммоль) и тетракис-палладия (10 мг, 8,7 мкмоль) в DME (1,5 мл) в атмосфере аргона перемешивали при 80°C в течение 2 ч в герметично закрытом сосуде. Реакционную смесь концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (CH2Cl2/EtOH, 99,8:0,2-97,5:2,5). Остаток растворяли в DCM (2 мл) и затем обрабатывали в гексане (4 мл). Кристаллы фильтровали и промывали гексаном (3 мл) с получением указанного в заголовке соединения (36 мг, 44%).
tR: 1,10 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 466,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 4.1. (За8,7а8)-3-(6-Хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)гексагидробензооксазол-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 4.2. Реакцию осуществляли при 100°C в течение 1 ч. Реакционную смесь фильтровали через Hyflo и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc: 9:1-1:1) с получением указанного в заголовке соединения.
tR: 1,20 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 339,2/341,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 4.2. (За8,7а8)-Гексагидробензооксазол-2-он
(^^)-2-Аминоциклогексанол (750 мг, 6,51 ммоль) и 2-нитрофенилхлорформиат (1378 мг, 6,84 ммоль) перемешивали в DCE (15 мл) с DIEA (2,39 мл, 13,68 ммоль) в герметично закрытом сосуде при 90°C в течение 1 ч. Реакционную смесь переносили в делительную воронку с 50 мл EtOAc и 50 мл насыщенного раствора NaHCO3. Водный слой промывали при помощи 50 мл EtOAc. Органические слои объединяли и промывали при помощи 50 мл Н2О, 50 мл насыщенного солевого раствора, сушили при помощи Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc: 7:3-3:7) с получением указанного в заголовке соединения (770 мг, 5,13 ммоль).
tR: 0,69 мин (ЖХ-МС 1);
1H ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) 5 м.д. 1,19-1,44 (м, 3Н), 1,45-1,61 (м, 1Н), 1,65 (д, J=9,77 Гц, 1Н), 1,76 (д, J=11,34 Гц, 1Н), 1,82-1,93 (м, 1Н), 1,93-2,10 (м, 1Н), 3,03-3,23 (м, 1Н), 3,74 (тд, J=11,34, 3,52 Гц, 1Н), 7,53 (уш.с, 1Н).
Пример 5. (S)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метоксиметилоксазолидин-2-он
В микроволновом сосуде к раствору продукта со стадии 5.1 (116 мг, 0,28 ммоль) и промежуточного соединения В (90 мг, 0,31 ммоль) в DME (2,1 мл) добавляли насыщенный раствор Na2CO3 (0,7 мл) и PdCl2(dppf)2-CH2Cl2 (23 мг, 0,03 ммоль). Смесь барботировали аргоном в течение 5 мин. Смесь перемешивали при 120°C в течение 15 мин в условиях микроволнового облучения. Осуществляли поглощение реакционной смеси в DCM и воду. Слои разделяли и водный слой экстрагировали еще два раза с использованием небольшого количества DCM. Затем органические слои объединяли, сушили над сульфатом натрия и упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/MeOH: 100-95% DCM). Полученный остаток очищали обращенно-фазовой флэш-хроматографией (MeCN/H2O: 10-100% MeCN) с получением указанного в заголовке соединения (19 мг, 13%).
tR: 0,91 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 456,1 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 5.2. Реакцию осуществляли при 115°C в течение 80 мин. Реакционную смесь концентрировали и осуществляли поглощение в DCM/воду. Слои разделяли и водный слой экстрагировали три раза при помощи DCM. Органические слои объединяли и сушили над сульфатом натрия. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc: 100-60% гептан) с получением указанного в заголовке соединения (116 мг, 22%).
tR: 0,98 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 329,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 5.2. (8)-4-Метоксиметилоксазолидин-2-он
TsOH (800 мг, 4,21 ммоль) добавляли к желтому раствору продукта со стадии 5.3 (1,013 г, 4,13 ммоль) в MeOH (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 90 мин. Затем добавляли TsOH (140 мг, 0,74 ммоль) и смесь перемешивали в течение 70 мин при комнатной температуре. Затем растворитель удаляли и остаток растворяли в DCM (6 мл) с триэтиламином (1,44 мл, 10,32 ммоль). К смеси медленно добавляли раствор трифгосгена (0,613 г, 2,07 ммоль) в DCM (4 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч 30 мин. Реакцию гасили путем добавления нескольких капель воды. Смесь затем подкисляли до pH 4 при добавлении буфера и затем слои разделяли. Водный слой снова экстрагировали с использованием небольшого количества DCM. Органические слои объединяли, сушили над сульфатом натрия и упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/MeOH: 100-90% DCM) с получением указанного в заголовке соединения
(231 мг, 38%).
ESI-MS: 132,1 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 5.3. трет-Бутиловый эфир ^)-4-метоксиметил-2,2-диметилоксазолидин-3-карбоновой ки-
слоты
NaH (265 мг, 6,63 ммоль) добавляли к желтому раствору (S)-1-BOC-2,2-диметил-4-гидроксиметилоксазолидина (AstaTech Inc., Bristol, Pennsylvania)(1 г, 4,19 ммоль) в ТГФ (10 мл). Затем смесь перемешивали в течение 15 мин при температуре окружающей среды. К желтой суспензии добавляли метилйодид (32 3 мкл, 5,19 ммоль) и смесь перемешивали в течение 2 ч 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляли воду для гашения реакции. Растворитель удаляли. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/MeOH: 5-10% MeOH) с получением указанного в заголовке соединения (1,013 г, 94%).
ESI-MS: 246,1 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1);
1Н ЯМР (400 МГц, ) 5 м.д. 1,48 (с, 9Н), 1,53 (уш.с, 6Н), 3,30 (м, 1Н), 3,36 (с, 3Н), 3,41-3,63
(м, 2Н), 3,88-4,00 (м, 2Н).
Пример 6. ^^)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазо лидин-2-он
Раствор продукта со стадии 6.1 (600 мг, 0,82 ммоль) в ТГФ (5 мл) обрабатывали при помощи ОТ.пиридин в ТГФ (7,14 мл, 57,5 ммоль) в течение 4 дней при комнатной температуре в пластиковом сосуде. Затем реакционную смесь добавляли по каплям к перемешиваемой смеси насыщенного раствора NaHCO3 (300 мл) и EtOAc (200 мл). Затем добавляли твердый NaHCO3 до рН~8 и слои разделяли. Водный слой промывали при помощи 100 мл EtOAc. Органические экстракты объединяли и промывали водой и насыщенным солевым раствором. Смесь затем сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали. Неочищенное вещество очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH: 99:1-95:5). Фракции объединяли и
концентрировали. Остаток обрабатывали ультразвуком в DCM и затем добавляли гексан. Полученные кристаллы отфильтровывали и снова очищали 3 раза флэш-хроматографией (DCM/EtAOc: 9:1-3:7, затем гексан/ТГФ: 9:1 -1:1, затем гексан/ТГФ: 7:3-1:1) с получением указанного в заголовке соединения
(243 мг, 64%).
tR: 0,80 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 456,6 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 6.1. (4S,5S)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-(трет-бутил-дифенил-силанилоксиметил)-5-метилоксазолидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной в примере 1, но с использованием продукта со стадии 6.2. Реакцию осуществляли при 80°C в течение 1 ч. После экстракции остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH: 95,5:0,5-97:3) с получением указанного в заголовке соединения.
tR: 1,43 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 694,5 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 6.2. (4S,5S)-4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-3-(6-хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)-5-метилоксазо лидин-2 -он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 6.3. Реакцию осуществляли при 100°C в течение 3 ч 30. Осуществляли поглощение реакционной смеси при помощи EtOAc и промывали насыщенным раствором NaHCO3 и насыщенным солевым раствором. Органический слой и сушили над сульфатом натрия. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc: 100-30% гептан) с получением указанного в заголовке соединения (116 мг, 22%).
tR: 1,51 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 567,4/569,5 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 6.3. (48,58)-4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-5-метилоксазолидин-2-он
Продукт со стадии 6.4 (3,2 г, 9,31 ммоль) растворяли в DCM (32 мл) и обрабатывали при помощи Et3N (3,25 мл, 23,29 ммоль). Раствор продували аргоном и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем смесь обрабатывали трифосгеном (1,382 г, 4,66 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакцию гасили насыщенным раствором NH4Cl (10 мл) и перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Водный слой отделяли и органический слой промывали водой. Объединенные водные слои экстрагировали 3х при помощи DCM. Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc: 100-50% гептана) с получением указанного в заголовке соединения (2,22 г, 61%).
tR: 1,28 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 387,3 [М+18]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 6.4. (28,38)-3-Амино-4-(трет-бутил-дифенил-силанилокси)бутан-2-ол
D-треонинол (2 г, 19,02 ммоль) растворяли в DMF (15 мл), обрабатывали имидазолом (3,89 г, 57,1 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем к реакционному раствору добавляли TBDPS-Cl (5,13 мл, 19,97 ммоль) по каплям в атмосфере аргона. Реакционный раствор перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем смесь разбавляли в EtOAc и промывали два раза насыщенным раствором NaHCO3 и один раз насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией
(гептан/EtOAc: 100-0% гептан) с получением указанного в заголовке соединения (3,21 г, 47%). tR: 0,98 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 344,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 7. ^)-3-(2'-Амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметилоксазо лидин-2-он
Раствор продукта со стадии 7.1 (200 мг, 0,35 ммоль), промежуточного соединения В (131 мг, 0,39 ммоль), Na2CO3 (2 М, 526 мкл, 1,05 ммоль) и тетракис палладия (24 мг, 0,21 ммоль) в DME (4 мл) в атмосфере аргона перемешивали при 80°C в течение 2 ч. Реакционную смесь обрабатывали при помощи Na2SO4, разбавляли в EtOAc и нерастворимые части отфильтровывали. Фильтровальную лепешку промывали три раза при помощи EtOAc и фильтрат упаривали. Затем остаток растворяли в ТГФ и добавляли TBAF раствор (1н., 351 мкл, 0,35 ммоль). Смесь перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли и остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH: 99:1-95:5) с получением указанного в заголовке соединения.
tR: 0,74 мин (ЖХ-МС 1).
Стадия 7.1. ^)-4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-3-(6-хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)оксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 7.2. Реакцию осуществляли при 100°C в течение 3 ч. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc: 9:1-6:4) с получением указанного в заголовке соединения.
tR: 1,53 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 553,4/555,5 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 7.2. (К)-4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)оксазо лидин-2 -он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 6.4, но с использованием ^)-4-(гидроксиметил)оксазолидин-2-она (Speed Chemical Corp. Shanghai) и DCM вместо DMF. Реакцию осуществляли при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали два раза при помощи Et2O. Органические слои объединяли, промывали водой и насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc: 98:2-4:6). Остаток обрабатывали гек-саном и Et2O. Полученные кристаллы отфильтровывали с получением указанного в заголовке соедине-
ния.
tR: 1,26 мин (ЖХ-МС 1),
1H ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) 5 м.д. 0,98 (с, 9Н), 3,51-3,63 (м, 2Н), 3,88 (дд, J=8,60, 4,30 Гц, 1Н), 4,14 (дд, J=8,60, 4,69 Гц, 1Н), 4,30-4,38 (м, 1Н), 7,37-7,50 (м, 6Н), 7,57-7,65 (м, 4Н), 7,71 (с, 1Н).
Пример 8. (4S,5R)-3-(2'-Aмино-2-(D8-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазо лидин-2 -он
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 6, с использованием всей последовательности процедур, но с использованием продукта со стадии 8.1 вместо промежуточного соединения A и D-алло-треонинола вместо D-треонинола.
tR: 0,79 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 464,5 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 8.1. 4-(4,6-Дихлорпиримидин-2-ил)-08-морфолин
2,4,6-Трихлорпиримидин растворяли в EtOH с Et3N и D8-морфолином. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь затем разбавляли при помощи насыщенного раствора NaHCO3 и экстрагировали два раза при помощи EtOAc. Органические экстракты объединяли и промывали насыщенным солевым раствором. Затем смесь сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc: 0% гексан-40%).
tR: 0,94 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 242,3/244,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 9. (S)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-(2-гидроксиэтил)оксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 6, но с использованием продукта со стадии 9.1. Экстракцию осуществляли в DCM. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (H2O/ACN), затем флэш-хроматографии (DCM/MeOH,
100:0-95:5).
tR: 0,78 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 456.2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 9.1. (S)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-(трет-бутил-дифенил-силанилоксиметил)-[1,3]оксазинан-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 1, но с использованием продукта со стадии 9.2. Реакцию осуществляли при 120°C в течение 15 мин. Реакционную смесь растворяли в DCM и экстрагировали при помощи Н2О. Органический слой сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 8:2-4:6).
tR: 1,54 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 694,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 9.2. ^)-4-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-3-(6-хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4 -ил) -[1,3] оксазинан-2 -он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 9.3. Реакцию осуществляли при 115°C в течение 2,5 ч. Смесь концентрировали. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (H2O/ACN), затем флэш-хроматографии (гептан/EtOAc, 9:1-0:100).
tR: 1,49 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 567,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
К раствору продукта со стадии 9.4 (900 мг, 2,03 ммоль) в ТГФ (40 мл) в атмосфере аргона добавляли NaH 60% в масле (160 мг, 4,0 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Смесь разбавляли при помощи EtOAc и экстрагировали при помощи Н2О. Органический слой сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc,
100:0-0:100).
tR: 1,23 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 370,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 9.4. трет-Бутиловый эфир [^)-1-(трет-бутил-дифенил-силанилоксиметил)-3-гидрокси-пропил]карбаминовой кислоты
К раствору продукта со стадии 9.5 (40 г, 7 3 ммоль) в ТВМЕ (400 мл) при 0°C добавляли по каплям LiBH4 (2M в ТГФ, 74 мл, 146 ммоль) и смесь перемешивали при 0°C в течение 10 мин, затем нагревали при комнатной температуре и перемешивали в течение 5 ч. Реакционную смесь гасили при помощи Н2О, затем при помощи раствора 0,5 М лимонной кислоты. Смесь экстрагировали при помощи ТВМЕ. Органический слой сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали. Продукт использовали без дополнительной очистки.
Стадия 9.5. Бензиловый эфир ^)-3-трет-бутоксикарбониламино-4-(трет-бутил-дифенил-силанилокси)масляной кислоты
Указанный в заголовке продукт получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 6.4.
Rf: 0,7 (гексан/EtOAc, 8:2)
Стадия 9.6. Бензиловый эфир (8)-3-трет-бутоксикарбониламино-4-гидроксимасляной кислоты
К раствору 4-бензилового эфира Boc-L-аспарагиновой кислоты (100 г, 309 ммоль) в DME (1,8 L) при -20°C добавляли NMM (34 мл, 309 ммоль), затем добавляли по каплям изобутилхлорформиат (40 мл, 309 ммоль) и смесь перемешивали при -20°C в течение 20 мин. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат охлаждали до -20°C. NaBH4 (17,5 г, 463 ммоль) добавляли по порциям при -20°C. Смеси давали нагреться и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь гасили 20% раствором лимонной кислоты и затем экстрагировали при помощи AcOEt. Органический слой промывали раствором NaHCO3, Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили (MgSO4), фильтровали и концентрировали. Продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Пример 10. (4S,5R)-3-[2'-Aмино-2-((S)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']-
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 6, с использованием всей последовательности процедур, но с использованием продукта со стадии 10.1 вместо промежуточного соединения A и D-алло-треонинола вместо D-треонинола. Смесь по каплям добавляли к
бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазо лидин-2-он
насыщенному раствору Na2CO3. После завершения этого добавления добавляли насыщенный раствор NaHCO3 (конечное значение рН было около 7-8). Смесь разбавляли водой и экстрагировали при помощи EtOAc. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30х 100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-100% в течение 20 мин). Остаток перекри-сталлизовывали в E^O/гексане (3/1). Кристаллы отфильтровывали и промывали гексаном с получением указанного в заголовке соединения.
tR: 2,89 мин (ВЭЖХ 1); ESI-MS: 470,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1); т.пл. 217,7°C (начало).
Стадия 10.1. (8)-4-(4,6-Дихлорпиримидин-2-ил)-3-метилморфолин
2,4,6-Трихлорпиримидин (100 мг, 053 ммоль) растворяли в диоксане (2 мл) с DIPEA (280 мкл, 1,6 ммоль) и ^)-3-метилморфолином (54 мг, 0,53 ммоль). Реакционную смесь нагревали при 130°C в условиях микроволнового облучения в течение 15 мин. Смесь затем разбавляли при помощи EtOAc и промывали насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30х 100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-100% в течение 20 мин) с получением указанного в заголовке соединения (45 мг, 34%).
tR: 3,70 мин (ВЭЖХ 1); ESI-MS: 248,2/250,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 11 (для сравнения purposes). 3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5'] бипиримидинил-6 -ил)оксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали аналогично способу примера 5 (включая стадию 5.1), но с использованием продукта со стадии 11.1. Реакцию осуществляли при 100°C в течение 1 ч. Экстракцию осуществляли в EtOAc. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-0:100).
tR: 0,87 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 412,4 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 11.1. 3-(6-Хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)оксазолидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 2.2 с использованием всей последовательности процедур, но с использованием оксазолидин-2-она. tR: 0,93 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 285,5/287,4 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 12. (4S,5R)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метил-2-оксооксазолидин-4-илметиловый эфир муравьиной кислоты
Соединение примера 18 (47 мг, 0,10 ммоль) растворяли в муравьиной кислоте (80 мкл, 2,09 ммоль) и хранили при 5°C в течение 4 дней. Смеси затем давали нагреться до комнатной температуры и смесь хранили в течение 2 дней. Затем осуществляли поглощение смеси в EtOAc и промывали насыщенным раствором NaHCO3 и насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-70% в течение 20 мин) с получением указанного в заголовке соединения (57 мг, 80%).
tR: 0,88 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 484,4 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 11 с использованием всей последовательности процедур, но с использованием продукта со стадии 10.1 вместо промежуточного соединения A и ^)-4-метил-2-оксазолидинона вместо оксазолидин-2-она. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH: 99,8/0,2-98/2) и затем препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-100% в течение 20 мин) с получением указанного в заголовке соединения (35 мг, 32%).
tR: 0,98 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 440,1 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 14. (S)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 6, но с использованием продукта со стадии 14.1. Остаток очищали флэш-хроматографией
(DCM/MeOH, 100:0-95:5).
tR: 0,77 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 442,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 14.1. (S)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-(трет-бутил-дифенил-силанилоксиметил)оксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 5, но с использованием продукта со стадии 14.2. Реакцию осуществляли при 100°C на масляной бане в течение 1 ч. Экстракцию осуществляли в EtOAc. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-0:100).
tR: 1,40 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 680, 3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 14.2. ^)-5-(трет-Бутил-дифенил-силанилоксиметил)-3 -(6-хлор-2-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)оксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 14.3. После экстракции остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 100:0-40:60).
tR: 1,49 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 553,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
К раствору продукта со стадии 14.4 (2,72 г, 8,27 ммоль) и Et3N (2,88 мл, 20,67 ммоль) в DCM в атмосфере аргона добавляли по каплям трифосген (982 мг, 3,31 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь гасили раствором NH4Cl. Органический слой сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc,
100:0-0:100).
tR: 1,21 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 373,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 14.4. (8)-1-Амино-3-(трет-бутил-дифенил-силанилокси)пропан-2-ол
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 6.4, но с использованием ^)-3-аминопропан-1,2-диола и с использованием Et3N вместо ими-дазола. После экстракции остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/MeOH, 100:0-90/10).
tR: 0,93 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 330,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 15. (4S,5R)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 6, с использованием всей последовательности процедур, но с использованием продукта со стадии 15.1 вместо D-треонинола.
tR: 0,98 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 344,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1). Стадия 15.1. (211,38)-3-Аминобутан-1,2-диол
Указанное в заголовке соединение получали аналогично процедуре стадии 19.1, но с использованием продукта со стадии 15.2. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH: 99,8/0,2-98/2) и затем препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-100% в течение 20 мин) с получением указанного в заголовке соединения (35 мг, 32%).
tR: 0,98 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 440,1 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 15.2. М-Бензил-М-[(8)-1-((К)-2,2-диметил[1,3]диоксолан-4-ил)этил]гидроксиламин
Указанное в заголовке соединение представляет собой второй изомер, образованный на стадии 19.2 (1,07 г, 57%).
tR: 0,91 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 252,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 16. (S)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали аналогично способу примера 11, но с использованием продукта со стадии 16.1 вместо ^)-4-метил-2-оксазолидинона. Реакцию осуществляли при 100°C в течение 1 ч. Осуществляли поглощение реакционной смеси в EtOAc. Смесь промывали два раза насыщенным раствором NaHCO3 и один раз насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над сульфатом натрия. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc: 0-85% EtOAc) с получением указанного в заголовке соединения (9,6 мг, 58%).
tR: 0,94 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 426.2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Стадия 16.1. (8)-5-Метилоксазолидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 6.3, но с использованием ^)-1-аминопропан-2-ола. Реакцию осуществляли при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакцию гасили насыщенным раствором NH4Cl (10 мл) и перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. Водный слой отделяли и органический слой промывали водой. Объединенные водные слои экстрагировали при помощи DCM 3х. Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc: 0-100% EtOAc) с получением указанного в заголовке соединения (38 мг, 9%).
1Н ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) 5 м.д. 1,27 (д, J=6,25 Гц, 3Н), 2,94-3,08 (м, 1Н), 3,48-3,58 (м, 1Н), 4,62 (м, 1Н), 7,37 (уш.с, 1Н).
Пример 17. (S)-3-(2'-Aмино-2-D8-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 4, но с использованием продукта со стадии 17.1. После завершения реакции реакционную смесь фильтровали через целит и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH, 99,5:0,5-98:2). Остаток растирали в порошок с DCM и промывали гексаном с получением указанного в заголовке соединения.
tR: 0,89 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 434,4 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1); Rf: 0,67 (DCM/EtOH, 95:5).
Стадия 17.1. (8)-3-(6-Хлор-2-В8-морфолин-4-илпиримидин-4-ил)-4-метилоксазолидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2.2, но с использованием продукта со стадии 8.1 и ^)-4-метил-2-оксазолидинона. Экстракцию осуществляли в DCM. Остаток очищали флэш-хроматографией (гептан/EtOAc, 9:1-7:3).
tR: 0,97 мин (ЖХ-МС 1); ESI-MS: 307,3/309,3 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 6, с использованием всей последовательности процедур, но с использованием D-алло-треонинола вместо D-треонинола. Реакцию осуществляли при комнатной температуре в течение 33 ч. Смесь добавляли по
Пример 18. (4S,5R)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазо лидин-2-он
каплям к насыщенному раствору Na2CO3. После завершения добавления уровень рН был около 7-8. Смесь разбавляли водой и экстрагировали при помощи EtOAc. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-60% в течение 20 мин). Фракции объединяли и подщелачивали при помощи 5% раствора NaHCO3. Происходило осаждение продукта, и его отфильтровывали. Для удаления остаточного палладия продукт растворяли в DCM/MeOH (4/1) и пропускали через SPE картридж MP-Thiol от polymerlabs и затем растворитель выпаривали. На основании этого способа было получено несколько партий и некоторые обрабатывали с получением кристаллического вещества следующим образом. Партия A.
Для получения этой партии продукт не пропускали через SPE картридж MP-Thiol от polymerlabs. Чистые фракции, полученные после препаративной ВЭЖХ, объединяли и обрабатывали при помощи NaHCO3. CH3CN выпаривали, при этом происходила кристаллизация продукта. Продукт собирали фильтрованием, промывали водой и сушили с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества, т.пл. 221,3°C (начало).
Партия В.
Для получения этой партии продукт не пропускали через SPE картридж MP-Thiol от polymerlabs. Чистые фракции, полученные после препаративной ВЭЖХ, объединяли и обрабатывали твердым NaHCO3. CH3CN выпаривали, при этом происходила кристаллизация продукта. Водную смесь выдерживали в течение 1 ч в холодильнике, фильтровали, промывали водой и сушили в условиях высокого вакуума в течение ночи с получением белого твердого вещества, m=298 мг, т.пл. 249,9°C (начало).
Партия С.
Для получения этой партии продукт не пропускали через SPE картридж MP-Thiol от polymerlabs. Чистые фракции, полученные после препаративной ВЭЖХ, объединяли и упаривали. Осуществляли поглощение остатка в CH3CN и затем добавляли воду, содержащую 0,1% TFA, с последующим добавлением твердого NaHCO3. Раствор концентрировали и осадок фильтровали, промывали водой и сушили с получением указанного в заголовке продукта в виде белого твердого вещества, т.пл. 237,9°C (начало).
Партия D.
После пропускания через SPE картридж MP-Thiol от polymerlabs растворитель выпаривали. Остаток растворяли в CH3CN и затем разбавляли таким же количеством воды. CH3CN выпаривали и непосредственно перед кристаллизацией продукта добавляли несколько кристаллов Партии В. CH3CN затем полностью выпаривали и суспензию охлаждали в холодильнике. Смесь затем фильтровали, собирали и сушили в условиях высокого вакуума в течение ночи с получением указанного в заголовке продукта в виде белого твердого вещества, т.пл. 259,0°C (начало).
Партия Е.
осуществляли такую же процедуру, как описано для Партии С, но добавляли несколько кристаллов Партии D, чтобы индуцировать кристаллизацию. Указанный в заголовке продукт получали в виде белого твердого вещества, т.пл. 258,8°C (начало).
Пример 19. (4S,5S)-3-(2'-Aмино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 6, с использованием всей последовательности процедур, но с использованием продукта со стадии 19.1 вместо D-треонинола. Реакцию осуществляли при комнатной температуре в течение 16,5 ч. Смесь добавляли по каплям к насыщенному раствору Na2CO3. После завершения добавления смесь разбавляли водой и экстрагировали два раза при помощи EtOAc. Органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором, сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-80% в течение 20 мин) с получением указанного в заголовке соединения (16.3 мг, 75%).
tR: 2,79 мин (ВЭЖХ 1); ESI-MS: 456,1 [М+Н]+.
Продукт со стадии 19.2 перемешивали в растворе HCl в EtOH в течение 2 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли с получением указанного в заголовке соединения в виде HCl соли (303 мг, 100%).
1H ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) 8 м.д. 1,08 (д, J=6, 65 Гц, 3Н), 3,18-3,33 (м, 1Н), 3,33-3,45 (м, 1Н), 3,613,72 (м, 1Н), 7,85 (уш.с, 2Н)
Стадия 19.2. (8)-Г((8)-2,2-Диметил[1,3]диоксолан-4-ил)этиламин
Продукт со стадии 19.3 (продукт 2, элюировал последним, 538 мг, 2,14 ммоль) растворяли в AcOH (25 мл) с Pd/C (100 мг) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 11 ч в атмосфере Н2. Смесь затем фильтровали через целит и затем растворитель удаляли с получением указанного в заголовке соединения (311 мг, 100%).
1H ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) 8 м.д. 0,90-1,04 (м, 3Н), 1,16-1,38 (м, 6Н), 2,76-2,90 (м, 1Н), 3,75 (дд, J=13,86, 7,22 Гц, 2Н), 3,90 (уш.с, 1Н);
tR: 3,13 мин (HPLC 1).
Стадия 19.3. N-Бензил-N-[(R)-1-((S)-2,2-диметил[1,3]диоксолан-4-ил)этил]гидроксиламин и К-бензил-К-[(8)-Г((8)-2,2-диметил[1,3]диоксолан-4-ил)этил]гидроксиламин
К тщательно перемешиваемому раствору 1,48 г (6,29 ммоль) продукта со стадии 19,4 в 80 мл Et2O добавляли 6,29 мл (6,29 ммоль) 1 М Et2AlCl в гексане одной порцией и перемешивание продолжали в течение 15 мин. Смесь затем охлаждали до -60°C и обрабатывали при помощи 6,29 мл (18,87 ммоль) раствора 3 М метилмагнийбромида в Et2O. Смесь перемешивали в течение 2 ч при -60°C и затем давали медленно нагреться до комнатной температуры при перемешивании в течение ночи. После этого реакционную смесь обрабатывали при помощи NaOH (2 M, 40 мл). После перемешивания в течение 15 мин при комнатной температуре смесь экстрагировали при помощи 3x120 Et2O. Объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в MeOH и очищали обращенно-фазовой препаративной ВЭЖХ, 8 инжекций (Н2О[+0,1% TFA]/CH3CN 97:3 до 50:50 в течение 20 мин):
фракции 1-3 собирали вместе и подщелачивали при помощи ~2 г NaHCO3, затем концентрировали. Полученный слой экстрагировали при помощи 2x150 мл Et2O и объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали досуха с получением 1,01 г бесцветного масла, которое медленно кристаллизовалось (чистота ~99% по данным 1Н-ЯМР; ВЭЖХ Rt = 2,36; ESI-MS: 252,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1))-продукт 1;
фракции 5-7 собирали вместе и подщелачивали при помощи ~2 г NaHCO3, затем концентрировали. Полученную суспензию экстрагировали при помощи 2x150 мл Et2O и объединенные органические слои сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали досуха с получением 363 мг белого твердого вещества (чистота ~99% по данным ^-ЯМР; ВЭЖХ Rt = 2,44; ESI-MS: 252,3 [М+Н] + (ЖХ-МС 1))-продукт 2.
Стадия 19.4. (8,2)-К-((2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил)метилен)-1-фенилметанамин оксид
1,50 г (11,53 ммоль) да-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксальдегида (Fluorochem, Hadfield, UK) растворяли в 60 мл DCM и обрабатывали при помощи 1,64 г (11,53 ммоль) сульфата натрия. Реакционную смесь продували аргоном и обрабатывали раствором 1,42 г (11,53 ммоль) N-бензилгидроксиламина (получен из коммерчески доступной гидрохлоридной соли) в 20 мл CH2Cl2. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 16,5 ч и затем фильтровали. К фильтрату добавляли силикагель и preaborbed, затем очищали хроматографией на силикагеле (градиент: гептан/EtOAc 0-100% в течение 30 мин). Фракции 20-80 собирали и упаривали досуха и сушили в вакууме в течение ночи с получением 1,48 г белого твердого вещества (чистота ~100% по данным ВЭЖХ, Rt=1,43); ESI-MS: 236,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1)).
Указанное в заголовке соединение получали способом, аналогичным описанному для примера 6, с использованием всей последовательности процедур, но с использованием ^)-3-аминопропан-1,2-диола вместо D-треонинола. Реакцию осуществляли при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем реакционную смесь осторожно гасили при помощи NaHCO3. Затем смесь разбавляли при помощи EtOAc и промывали два раза насыщенным раствором NaHCO3 и один раз насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (DCM/EtOH: 0-10% MeOH) с получением указанного в заголовке соединения (22,8 мг, 38%).
tR: 0,77 мин (ВЭЖХ 1); ESI-MS: 442,2 [М+Н]+ (ЖХ-МС 1).
Пример 21. (3aR,6aR)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин] -6-ил)тетрагидрофуро [3,4-с1]оксазол-2(ЗН)-он
Раствор (3aR,6aR)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)тетрагидрофуро[3,4-d]оксазол-2(3Н)-она (100 мг, 0,306 ммоль), промежуточного соединения В (115 мг, 0,398 ммоль), K3PO4 (195 мг, 0,918 ммоль) и PdCl2(dppf)-CH2Cl2 (25 мг, 0,031 ммоль) в DME/H2O (2,2 мл) в атмосфере аргона перемешивали при 80°C в течение 1,5 ч. Смесь разбавляли в EtOAc и экстрагировали насыщенным раствором NaHCO3. Органический слой промывали Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан-EtOAc 70:30-0:100) с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (88 мг, 62%).
tR: 0,84 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 454 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 21.1. (3aR,6aR)-3-(6-Хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)тетрагидрофуро[3,4-d]оксазол-2(ЗН)-он
К раствору (3aR,6aR)-тетрагидрофуро[3,4-d]оксазол-2(3Н)-она (500 мг, 3,87 ммоль), 4-(4,6-дихлорпиримидин-2-ил)морфолина (1088 мг, 4,65 ммоль) и Cs2CO3 (2,14 г, 6,58 ммоль) в диоксане (20 мл) после дегазирования аргоном добавляли 4,5-бис-(дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен (157 мг, 0,271 ммоль) и Pd2(dba)3 (70,9 мг, 0,077 ммоль) и реакционную смесь нагревали в течение 6 ч при 85°C. Реакционную смесь добавляли к 10% водному раствору NaHCO3 и экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт растирали в порошок с MeOH в течение ночи, отфильтровывали и сушили с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного твердого вещества (1,12 г, 87%).
tR: 0,92 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 327, 329 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3). Стадия 21.2. (ЗаК,6аК)-Тетрагидрофуро[3,4-с1]оксазол-2(ЗН)-он
К раствору (3R,4R)-4-аминотетрагидрофуран-3-ола (1,1 г, 7,88 ммоль) и DIEA (4,54 мл, 26,0 ммоль) в CH2Cl2 (30 мл) добавляли (бис-(трихлорметил)карбонат (1,75 г, 5,91 ммоль), растворенный в CH2Cl2 (5 мл), при комнатной температуре в течение 30 мин. После перемешивания в течение 0,5 ч при 25°C реакционную смесь добавляли к водному раствору K2CO3, перемешивали в течение 1 ч и CH2Cl2 выпаривали. Водную фазу промывали при помощи Et2O и затем упаривали досуха. Остаток растирали в поро
шок с EtOH/ТГФ 1:1, неорганические соли удаляли фильтрованием через пробку силикагеля и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде бежевого твердого вещества (930 мг, 90%).
ESI-MS: 147 [M+NH]+.
Пример 22. (3aR*,6R*,6aR*)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[с1]оксазол-2-он
К раствору (3aR*,6R*,6aR*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-((трет-бутилдиметилсилил)окси)гексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-она (810 мг, 1,253 ммоль) в ТГФ (12 мл) добавляли по каплям раствор 1 М TBAF в ТГФ (1,0 мл, 1,0 ммоль) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°C и в течение 2 ч при комнатной температуре, затем упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан-ТГФ 60:40-0:100). Остаток растирали в порошок с Et2O, фильтровали и сушили. Остаток очищали при помощи препаративной ВЭЖХ (Waters Sun Fire C18, 30x100 мм, 5 мкм; 0,1% TFA-вода/ацетонитрил; градиент ацетонитрил 5-100% в течение 20 мин) с получением указанного в заголовке соединения (430 мг, 72%); tR: 0,93 мин (UPLC 1).
tR: 0,81 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 468 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 22.1. (3aR*,6R*,6aR*)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-((тpeт-бyтилдимeтилcилил)oкcи)гeкcaгидpo-2H-циклoпeнтa[d]oкcaзoл-2-oн
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 21, из (3aR*,6R*,6aR*)-6-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)гексагидро-2Н-циклопентаВДоксазол-2-она и промежуточного соединения В и с использованием Pd(PPh3)4 вместо PdCl2(dppf)-CH2Cl2 и Na2CO3 вместо K3PO4, с получением после кристаллизации из EtOAc/гексана указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.
tR: 1,62 мин (UPLC 1), tR: 1,47 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 582 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 22.2. (3aR*,6R*,6aR*)-6-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)-3-(6-хлор-2-
морфолинопиримидин-4-ил)гексагидро-2Н-циклопентаВДоксазол-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 21.1, из (3aR*,6R*,6aR*)-6-((трет-бутилдиметилсилил)окси)гексагидро-2Н-циклопентаВДоксазол-2-она и промежуточного соединения A.
tR: 1,76 мин (UPLC 1), tR: 1,58 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 455, 457 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 22.3. (3aR*,6R*,6aR*)-6-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)гексагидро-2Н-
циклопентаВДоксазол-2-он
К суспензии (3aR*,6R*,6aR*)-6-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-3-((2-
нитрофенил)сульфонил)гексагидро-2Н-циклопентаВДоксазол-2-она (1,47 г, 3,32 ммоль) и Cs2CO3 (2,164 г, 6,64 ммоль) в DMF (25 мл) добавляли ^ацетил^-цистеин (0,921 г, 5,65 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали и остаток суспендировали в насыщенном растворе NaHCO3 и экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после очистки флэш-хроматографией
(гептан/EtOAc 90:10-50:50) в виде желтого масла (0,84 г, 98%). ТСХ (гептан/EtOAc 1:1) Rf: 0,28.
Стадия 22.4. (3aR*,6R*,6aR*)-6-((трет-Бутилдиметилсилил)окси)-3-((2-
нитрофенил)сульфонил)гексагидро-2Н-циклопента[с1]оксазол-2-он
К раствору (3aR*,6R*,6aR*)-6-гидрокси-3 -((2-нитрофенил)сульфонил)гексагидро-2Н-
циклопента[d]оксазол-2-она (1,2 г, 3,66 ммоль) и 2,6-лутидина (0,8 51 мл, 7,31 ммоль) в CH2Cl2 (25 мл) добавляли по каплям при 0°C трет-бутилдиметилсилил трифторметансульфонат (1,091 мл, 4,75 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 0°C, затем в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли при помощи CH2Cl2 и промывали при помощи 20% водного раствора NaH2PO4 и Н2О, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после кристаллизации из EtOAc/гептана в виде белого твердого вещества (1,5 г, 88%).
ТСХ (гептан/EtOAc 1:1) Rf: 0,54.
tR: 1,58 мин (UPLC 1), tR: 1,43 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 460 [M+NH4]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 22.5. (3aR*,6R*,6aR*)-6-Гидрокси-3-((2-нитрофенил)сульфонил)гексагидро-2Н-
циклопентаВДоксазол-2-он
К раствору трет-бутил (Ж*^*^*)-6-оксабицикло[3,1,0]гексан-2-ил((2-
нитрофенил)сульфонил)карбамата (2,0 г, 5,10 ммоль) в MeOH (40 мл) добавляли Amberlyst 15 (4,0 г) и полученную суспензию перемешивали в течение 1,5 ч при 25°C. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после очистки флэш-хроматографией (геп-тан-EtOAc 90:10-EtOAc) в виде бежевого твердого вещества (1,24 г, 73%).
ТСХ (гептан/EtOAc 1:2),
Rf: 0,36; tR: 0,80 мин (UPLC 1), tR: 0,77 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 346 [M+NH4]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 22. 6. (трет-Бутил (Ж*^*^*)-6-оксабицикло[3,1,0]гексан-2-ил((2-нитрофенил)сульфонил)карбамат
К суспензии трет-бутилциклопент-2-ен-1-ил((2-нитрофенил)сульфонил)карбамата (2,75 г, 7,46 ммоль) и NaHCO3 (1,254 г, 14,93 ммоль) в CH2Cl2 (60 мл) добавляли одной порцией мета-хлорпероксибензойную кислоту (2,58 г, 14,93 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли при помощи CH2Cl2 и промывали 20% водным раствором Na2SO3, насыщенным раствором NaHCO3 и водой. Органическую фазу сушили над MgSO4 и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после кристаллизации из EtOAc в виде белых кристаллов (2,01 г, 68%).
ТСХ (гептан-EtOAc 1:1) Rf: 0,48; tR: 1,20 мин (UPLC 1), tR: 1,12 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 329 [М-изобутилен]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 22.7. (трет-Бутилциклопент-2-ен-1 -ил((2-нитрофенил)сульфонил)карбамат
К суспензии трифенилфосфина (3,09 г, 11,77 ммоль), трет-бутил 2-нитрофенилсульфонил карбамата (3,40 г, 11,23 ммоль) и циклопент-2-енола (0,900 г, 10,70 ммоль) в толуоле (60 мл) добавляли по каплям при -20°C диэтилазодикарбоксилат (1,948 мл, 12,30 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при -20°C в течение 2 ч, затем в течение 3 ч при 0°C. Реакционную смесь концентрировали и указанное в заголовке соединение получали после очистки флэш-хроматографией (гептан/EtOAc 95:5-3:1) в виде белого твердого вещества (2,79 г, 67%).
tR: 1,34 мин (UPLC 1), tR: 1,24 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 386 M+NH4]+ (ЖХ-МС 3). Пример 22А. Первый элюирующий энантиомер на Chiralpak AD.
(3aR,6R,6aR)- и (3aS,6S,6aS)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-он. Абсолютная стереохимия не определена.
Указанное в заголовке соединение получали после разделения рацемического продукта примера 22 при помощи препаративной хиральной ВЭЖХ. (Колонка: Chiralpak AD 20 мкм 5x500 мм. Скорость потока 70 мл/мин гептан/EtOH/DEA 20:80:0,01).
tR: 17,7 мин (Колонка: Chiralpak AD-H, 4,6x250 мм. Скорость потока 1,2 мл/мин гептан/EtOH 70:30).
Пример 22В. Второй элюирующий энантиомер на Chiralpak AD.
(3aR,6R,6aR)- и (3aS,6S,6aS)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-1щклопентаВДоксазол-2-он. Абсолютная стереохимия не определена.
Указанное в заголовке соединение получали после разделения рацемического продукта примера 22 при помощи препаративной хиральной ВЭЖХ. (Колонка: Chiralpak AD 20 мкм 5x500 мм. Скорость потока 70 мл/мин гептан/EtOH/DEA 20:80:0,01).
tR: 23,3 мин (Колонка: Chiralpak AD-H, 4,6x250 мм. Скорость потока 1,2 мл/мин гептан/EtOH 70:30).
Пример 23. (4S,5R)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилоксазо лидин-2-он
К раствору (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)этил)-4-метилоксазолидин-2-она (2,1 г, 3 ммоль) в ТГФ (20 мл) добавляли по каплям 1 М TBAF в ТГФ (3 мл, 3 ммоль) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 0°C, затем упаривали. Остаток очищали флэш-хроматографией (гексан/EtOAc/MeOH 90:10:1-0:100:10). Очищенный продукт перекристаллизовывали из MeOH с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (1,17 г, 83%).
tR: 0,80 мин (UPLC 1), tR: 0,82 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 470 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 23.1. (4S,5R)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)этил)-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 22.1, из 4S,5R)-5-(2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)этил)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения В с получением указанного в заголовке соединения после кристаллизации из MeOH.
tR: 1,72 мин (UPLC 1), tR: 1,55 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 708 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 23.2. (4S,5R)-5-(2-((трет-Бутил-дифенил-силил)окси)этил)-3 -(6-хлор-2-
морфолинопиримидин-4-ил)-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 21.1, из 4:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомера 5-(2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)этил)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения А с получением, после удаления ^^)-диастереоизомера путем двух перекристаллизации из ТГФ/MeOH, только (4S,5R)-диастереоизомера указанного в заголовке соединения.
tR: 1,88 мин (UPLC 1), tR: 1,64 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 581, 583 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3);
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО^6): 8 1,08 (с, 9Н), 1,36 (д, 3Н), 2,02 (м, 2Н), 3,70-3,90 (м, 10Н), 4,82 (м, 2Н), 7,40-7,50 (м, 6Н), 7,51 (с, 1Н), 7, 67 (м, 4Н).
К раствору 4:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомера 5-(2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)этил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она (4,1 г, 7,8 ммоль) в ацетонитриле (40 мл) добавляли раствор (№г[4)2Се(Ж)3)6 (10,71 г, 19,5 ммоль) в Н2О (20 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч при 0-5°C. Смесь добавляли в ледяную воду и продукт экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали насыщенным раствором NaHCO3 раствор и насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после очистки флэш-хроматографией (гептан/EtOAc 10:1-EtOAc) в виде 4:1 смеси диастереомеров (2,2 г, 71%).
ТСХ (гексан-EtOAc 1:1) Rf: 0,23; tR: 1,47 мин (UPLC 1), tR: 1,33 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 401 [M+NH4]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 23.4. (4S,5R)- и ^^)-5-(2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)этил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазо лидин-2-он
К раствору 4:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереомеров 5-(2-гидроксиэтил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она (2,65 г, 10 ммоль) в DMF (30 мл) добавляли имидазол (1,73 г, 25 ммоль) и TBDPSCl (3,57 г, 13 ммоль) при 0-5°C. Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрировали и остаточное масло растворяли в ТВМЕ и промывали 10% водным раствором KHSO4, Н2О, насыщенным раствором NaHCO3 и насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после очистки флэш-хроматографией (гептан/EtOAc 20:1 -2:1) в виде 4:1 смеси диастереомеров (4,18 г, 80%).
ТСХ (гексан/EtOAc 3:1) Rf: 0,27; tR: 1,70 мин (UPLC 1), tR: 1,52 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 526 [M+Na]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 23.5. (4S,5R)- и (48,58)-5-(2-Гидроксиэтил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-он
4:1 смесь (4S,5R)- и ^^)-5-аллил-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она (2,67 г, 10 ммоль) в CH2Cl2-MeOH 2:1 (40 мл) озонировали при -78°C. После завершения образования озонида добавляли NaBH4 (0,57 г, 15 ммоль) и реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь добавляли к 20% водному раствору K2CO3 и продукт экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде светло-желтого масла (2,65 г, 99%).
ТСХ (EtOAc) Rf: 0,28; tR: 0,68 мин (UPLC 1), tR: 0,69 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 266 [М+Н]+
(ЖХ-МС 3).
Стадия 23.6. (4S,5R)- и (48,58)-5-Аллил-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-он
К раствору 4:1 смеси бензил ((2S,3R)-3-гидроксигекс-5-ен-2-ил)(4-метоксибензил)карбамата и бензил (ДО^)-3-гидроксигекс-5-ен-2-ил)(4-метоксибензил)карбамата (3,55 г, 9,5 ммоль) в ТГФ (60 мл) добавляли в атмосфере аргона при -50°C 41 М раствор NaHMDS в ТГФ (10,5 мл). После перемешивания реакционной смеси в течение 0,5 ч при -40°C смесь добавляли к холодному 10% водному раствору KHSO4 и продукт экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 10:1-1:1) в виде бесцветного
масла (2,4 г, 97%).
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,42; tR: 1,03 мин (UPLC 1), tR: 0,99 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 262 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3);
1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-с16): 5 1,06 (д, 2,4Н), 1,13 (д, 0,6Н), 2,30-2,40 (м, 2Н), 3,25 (м, 0,2Н), 3,66 (м, 0,8Н), сильный NOE для сигнала при 4,54), 3,75 (с, 3Н), 4,07 (д, 1Н), 4,10 (м, 0,2Н), 4,48 (д, 1Н), 4,54 (м, 0,8Н), 5,05-5,20 (м, 2Н), 5,23 (м, 0,2Н), 5,78 (м, 0,8Н), 6,92 (д, 2Н), 7,22 (д, 0,4Н), 7,24 (д, 1,6Н).
Стадия 23.7. (2S,3R)- и (2S,3S)-Beromi 4-метоксибензил(1-оксопропан-2-ил)карбамат
К раствору (S)-бензил 4-метоксибензил(1-оксопропан-2-ил)карбамата (3,86 г, 10 ммоль) в ТГФ (30 мл) добавляли цинковую пыль (1,64 г, 25 ммоль), насыщенныый водный раствор NH4Cl (5 мл) и ал-лилбромид (2,2 мл, 25 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 25-30°C. Реакционную смесь разбавляли при помощи Н2О и продукт экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали 10% водным раствором KHSO4, Н2О, NaHCO3 и насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Указанное в заголовке соединение получали после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-2:1) в виде бесцветного масла (3,5 г, 97%):.
tR: 1,25 мин и 1,27 мин (UPLC 1)(4:1 смесь (2S,3R)- и ^^)-диастереоизомеров), ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,51; tR: 1,68 мин и 1,69 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 370 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 23.8. (8)-Бензил 4-метоксибензил(1-оксопропан-2-ил)карбамат
К раствору ^)-бензил (1-гидроксипропан-2-ил)(4-метоксибензил)карбамата (11,8 г, 35,5 ммоль) в CH2Cl2 добавляли NaHCO3 (3,28 г, 39 ммоль), KBr (0,25 г, 2,1 ммоль) и TEMPO 0,168 г, 1,07 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0-5°C и добавляли 5% водный раствор NaClO (85 мл, 71 ммоль) в течение 30 мин. После перемешивания в течение 1 ч при 0-5°C реакционную смесь добавляли к раствору Na2S2O3 и продукт экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали водным раствором NaH2PO4, Н2О и насыщенным солевым раствором, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла (11,2 г, 96%).
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,55; tR: 1,29 мин (UPLC 1), tR: 1,15 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 328 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 23.10. (8)-Бензил (1-гидроксипропан-2-ил)(4-метоксибензил)карбамат
К раствору (S)-2-(((бензилокси)карбонил)(4-метоксибензил)амино)пропановой кислоты [439589-238] (16 г, 41,9 ммоль) в ТГФ (150 мл) медленно добавляли в атмосфере аргона боран диметил-сульфид (8,4 мл, 84 ммоль) при 0-5°C. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 0-5°C, затем в течение 3 ч при 40-45°C. Избыток борана разлагали осторожным добавлением MeOH и реакционную смесь упаривали при помощи 3x200 мл MeOH и при помощи 2xCHCl3. Указанное в заголовке соединение получали после сушки в виде бесцветного масла (13,7 г, 99%).
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,22; tR: 1,06 мин (UPLC l), tR: 1,02 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 330 [М+Н]+
(ЖХ-МС 3).
Пример 24. Первый элюирующий диастереоизомер на ЖХ-МС 3 (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-((R)-2-гидроксипропил)-4-метилоксазолидин-2-она.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 23, из (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-((R)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-она и TBAF с получением, после
Абсолютная стереохимия 2-гидроксипропильной группы не определена, ^-конфигурация приписана произвольно.
очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 5:1-EtOAc/MeOH 10:1) и перекристаллизации из MeOH, указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.
ТСХ (EtOAc) Rf: 0,50; tR: 0,88 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 484 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 24.1. (4S,5R)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-((R)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-он.
Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, (11)-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 22.1, из (4S,5R)-5-((R)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения В с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-EtOAc), указанного в заголовке соединения в виде светло-желтого пенистого вещества.
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,45; tR: 1,57 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 722 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 24.2. (4S,5R)-5-((R)-2-((трет-Бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(6-хлор-2-
морфолинопиримидин-4-ил)-4-метилоксазолидин-2-он.
Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, (ТА)-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 21.1, из (4S,5R)-5-((R)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения А с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-3:1), указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,65; tR: 1,67 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 595, 597 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 24.3. (4S,5R)-5-((R)-2-((трет-Бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-он Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, ^-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 23.3, из (4S,5R)-5-((R)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1 -EtOAc), указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,28; tR: 1,38 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 415 [M+NH4]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 24.4. (4S,5R)-5-((R)-2-((трет-Бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 23.4, из (4S,5R)-5-((R)-2-гидроксипропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она (содержащего в виде примеси 15% первого элюирующего (2S,4S,5R)-диастереоизомера со стадии 24.5) с
Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, (11)-конфигурация приписана произвольно.
получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-EtOAc), указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла.
ТСХ (гексан/EtOAc 3:1) Rf: 0,26; tR: 1,55 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 540 [M+Na]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 24.5. (4S,5R)-5-((S)- и (4S,5R)-5-((R)-2-гидроксипропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-он.
Абсолютная стереохимия 2-гидроксипропильной группы после восстановления кетона не определена, ^-конфигурация была произвольно приписана первому элюирующему продукту ^^^)-диастереоизомеру.
Второй элюирующий продукт, смесь (2R,4S,5R)-диастереоизомера (произвольно приписана (2К)-конфигурация для 2-гидроксипропильной группы):
(85%)
содержащего в виде примеси первый элюирующий (48,5К,58)-диастереоизомер:
Первый элюирующий продукт представлял собой (48,5К,58)-диастереоизомер:
(15%)
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 23.5, из 3:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомеров 3-(4-метоксибензил)-4-метил-5-(2-метилаллил)оксазолидин-2-она с получением, после нескольких разделений 3:3:1:1 смеси изомеров флэш-хроматографией (RediSep Rf Gold силикагель; гексан/EtOAc 1:1-EtOAc и толуол/EtOAc 3:1-EtOAc), двух индивидуальных второстепенных (2S,4S,5S)- и (2R,4S,5S)-диастереоизомеров и двух индивидуальных основных (2S,4S,5R)- и (2R,4S,5R)-диастереоизомеров в виде бесцветных масел.
Первый элюирующий (2S,4S,5R)-диастереоизомер указанного в заголовке соединения (произвольно приписана (2S)-конфигурация для 2-гидроксипропильной группы).
ТСХ (EtOAc) Rf: 0,39; tR: 0,752 мин (UPLC 1); tR: 0,76 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 280 [М+Н]+
(ЖХ-МС 3);
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): 5 1,12 (д, 3Н), 1,28 (д, 3Н), 1,5-1,63 (м, 1Н), 1,81 (м, 1Н), 1,90 (д, 1Н), 3,68 (м, 1Н), 3,82 (с, 3Н), 4,03 (д, 1Н), 4,14 (м, 1Н), 4,60 (ддд, 1Н), 4,79 (д, 1Н), 6,89 (д, 2Н), 7,22 (д, 2Н).
Второй элюирующий (2R,4S,5R)-диастереоизомер указанного в заголовке соединения (произвольно приписана (2R)-конфигурация для 2-гидроксипропильной группы), содержащий в виде примеси 15% первого элюирующего ^^^)-диастереоизомера.
ТСХ (EtOAc) Rf: 0,35; tR: 0,742 и 0,752 мин (UPLC 1); tR: 0,75 и 0,76 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 280 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3);
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): 5 1,12 (д, 3Н), 1,28 (д, 3Н), 1,50-1,64 (м, 1Н), 1,81 (м, 0,15Н), 1,90 (д, 0,15Н), 1,94 (м, 0,85Н), 2,21 (д, 0,85Н), 3,67 (м, 1Н), 3,82 (с, 3Н), 4,01 (м, 1Н), 4,13 (м, 1Н), 4,73 (м, 0,85Н), 4,79 (д, 0,15Н), 4,80 (д, 1Н), 6,90 (д, 2Н), 7,22 (д, 2Н).
Стадия 24.6. (4S,5R)- и ^^)-Диастереоизомер 3-(4-метоксибензил)-4-метил-5-(2-метилаллил)оксазо лидин-2-она
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 23.6, из 3:1 смеси (2S,3R)- и (2S,3S)-диастереоизомеров бензил ((2S)-3-гидрокси-5-метилгекс-5-ен-2-ил)(4-метоксибензил)карбамата с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-1:1), указанного в заголовке соединения в виде 3:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомеров.
tR: 1,112 мин (UPLC 1); tR: 1,05 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 276 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3);
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): 5 1,13 (д, 2,2Н), 1,20 (д, 0,8Н), 1,76 (с, 0,8Н), 1,80 (с, 2,2Н), 2,23 (ддд,
0,25Н), 2,27 (дд, 0,75Н), 2,39 (дд, 0,25Н), 2,46 (м, 0,75Н), 3,28 (м, 0,25Н), 3,68 (м, 0,75), 3,83 (с, 3Н), 3,99
(д, 0,75Н), 4,04 (д, 035Н), 4,14 (м, 0,25Н), 4,62 (м, 0,75Н), 4,70-4,90 (м, 4Н), 6,90 (д, 2Н), 7,25 (д, 2Н).
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 23.7, из ^)-бензил 4-метоксибензил(1-оксопропан-2-ил)карбамата и 3-бром-2-метилпроп-1-ена с получением указанного в заголовке соединения в виде 3:1 смеси (2S,3R)- и (2S,3S)-диастереомеров.
tR: 1,322 мин (основной изомер) и 1,329 мин (второстепенный изомер) (UPLC 1); tR: 1,23 мин (основной изомер) и 1,24 мин (второстепенный изомер)(ЖХ-МС 3); ESI-MS: 384 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Пример 25. Второй элюирующий продукт на LC MS 3, который представлял собой 9:1 смесь (4S,5R)- и (4S,5S)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-((S)-2-гидроксипропил)-4-метилоксазолидин-2-она.
Абсолютная стереохимия 2-гидроксипропильной группы не определена, ^-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для примера 23, из 8:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-((S)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-она и TBAF с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 5:1-EtOAc/MeOH 10:1) и перекристаллизации из MeOH, указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества.
ТСХ (EtOAc) Rf: 0,50; tR: 0,87 мин (второстепенный ^^)-диастереомер) и 0,89 мин (основной ^^)-диастереомер)(ЖХ-МС 3); ESI-MS: 484 [M+H]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 25.1. (4S,5R)- и (4S,5S)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-((S)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-он.
Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, ^-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 22.1, из 7:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((R)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения В с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-EtOAc), указанного в заголовке соединения в виде 8:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-диастереоизомеров.
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,45; tR: 1,58 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 722 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 25.2. (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((S)-2-((трет-Бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(6-хлор-2-морфолино пиримидин-4-ил)-4-метилоксазолидин-2-он.
Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, (8)-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 21.1, из 7:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((S)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения А с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-3:1) и кристаллизации из MeOH/ТГФ, указанного в заголовке со
единения в виде 7:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомеров.
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,65; tR: 1,67 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 595, 597 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 25.3. (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((S)-2-((трет-Бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-он.
Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, ^-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2 3.3, из 7:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((S)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-2:1), указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла в виде 10:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомеров.
ТСХ (гексан/EtOAc 1:1) Rf: 0,30; tR: 1,38 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 415 [M+NH4]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 25.4. (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((S)-2-((трет-Бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-он.
Абсолютная стереохимия защищенной 2-гидроксипропильной группы не определена, (8)-конфигурация приписана произвольно.
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 2 3.4, из 7:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((S)-2-гидроксипропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она, полученного на стадии 2 4.5, с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-EtOAc), указанного в заголовке соединения в виде 7:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомеров.
ТСХ (гексан/EtOAc 3:1) Rf: 0,26; tR: 1,56 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 540 [M+Na]+ (ЖХ-МС 3).
Пример 26. (4S,5R)- и (4S,5S)-3-(2'-Амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидрокси-2-метилпропил)-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 22,1, из 5:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-3-(6-хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-5-(2-гидрокси-2-метилпропил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения В с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc/MeOH 90:10:1-10:100:10) и перекристаллизаци из MeOH, указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества и в виде 7:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5 S)-диастереоизомеров.
ТСХ (EtOAc) Rf: 0,43; tR: 0,93 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 498 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 26.1. (4S,5R)- и ^^)-3-(6-Хлор-2-морфолинопиримидин-4-ил)-5-(2-гидрокси-2-метилпропил)-4-метилоксазо лидин-2-он
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 21.1, из 5:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-5-((S)-2-((трет-бутил-дифенил-силил)окси)пропил)-4-метилоксазолидин-2-она и промежуточного соединения А с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 10:1-EtOAc), указанного в заголовке соединения в виде светло-желтого пенистого вещества и в виде 5:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-диастереоизомеров.
ТСХ (EtOAc/MeOH 10:1) Rf: 0,55; tR: 1,02 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 371, 373 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Указанное в заголовке соединение получали с использованием процедуры, аналогичной описанной для стадии 23,3, из 5:1 смеси (4S,5R)- и (4S,5S)-5-(2-гидрокси-2-метилпропил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазолидин-2-она с получением, после очистки флэш-хроматографией (гексан-EtOAc 1:1-EtOAc-MeOH 5:1), указанного в заголовке соединения в виде бесцветного масла в виде 5:1 смеси (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомеров.
ТСХ (EtOAc/MeOH 10:1) Rf: 0,40; tR: 0,41 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 174 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
Стадия 26.3. (4S,5R)- и ^^)-5-(2-Гидрокси-2-метилггоопил)-3-(4-метоксибензил)-4-метилоксазо лидин-2-он
К раствору 3:1 смеси метил 2-((4S,5R)-3-(4-метоксибензил)-4-метил-2-оксооксазолидин-5-ил)ацетата и метил 2-((4S,5S)-3-(4-метоксибензил)-4-метил-2-оксооксазолидин-5-ил)ацетата (2,0 г, 6,82 ммоль) в ТГФ (50 мл) медленно добавляли в атмосфере аргона раствор 3 М метилмагнийхлорида в ТГФ (6,82 мл, 20,46 ммоль) при -78°C. После завершения добавления реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. После добавления 10% водного раствора NH4Cl продукт экстрагировали при помощи EtOAc. Объединенные экстракты промывали при помощи Н2О, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-EtOAc), в виде бесцветного масла (1,2 г, 59%, 3:1 смесь (4S,5R)- и (4S,5 S)-диастереоизомеров).
ТСХ (CH2Cl2/MeOH 10:1) Rf: 0,4 3; tR: 0,80 мин и 0,81 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 294 [М+Н]+
(ЖХ-МС 3);
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): 5 1,12 (д, 2,25Н), 1,22 (д, 0,75Н), 1,32 (с, 1,5Н), 1,34 (с, 4,5Н), 1,68 (дд, 1Н), 1,86 (дд, 0,25Н), 1,93 (дд, 0,75Н), 3,23 (м, 0,25Н), 3,64 (м, 0,75Н), 3,83 (с, 3Н), 3,99 (д, 0,75Н), 4,04 (д,
0,25Н), 4,26 (д, 0,25Н), 4,72 (д, 0,25Н), 4,73 (м, 0,75Н), 4,80 (д, 0,75Н), 6,89 (д, 0,5Н), 6,90 (д, 1,5Н), 7,23
(д, 0,5Н), 7,24 (1,5Н).
Стадия 26.4. Метил 2-((4S,5R)-3-(4-метоксибензил)-4-метил-2-оксооксазолидин-5-ил)ацетат и метил 2-((48,58)-3-(4-метоксибензил)-4-метил-2-оксооксазолидин-5-ил)ацетат
К суспензии 3:1 смеси (3R,4S)- и (3S,4S)метил 3-гидрокси-4-((4метоксибензил)амино)пентаноата (4,1 г, 10,74 ммоль) в CH2Cl2 (80 мл) добавляли DIEA (8,44 мл, 48,3 ммоль) и при 0°C раствор (бис-(трихлорметил)карбоната (2,389 г, 8,05 ммоль), растворенного в CH2Cl2 (10 мл). После перемешивания в течение 0,5 ч при комнатной температуре реакционную смесь добавляли к насыщенному раствору NaHCO3 и продукт экстрагировали при помощи CH2Cl2. Объединенные экстракты промывали при помощи Н2О, сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, после очистки флэш-хроматографией (гексан/EtOAc 20:1-EtOAc), в виде светло-желтого пенистого вещества (2,02 г, 63%, 3:1 смесь (4S,5R)- и ^^)-диастереоизомеров).
ТСХ (толуол/EtOAc 1:1) Rf: 0,47; tR: 0,84 мин (ЖХ-МС 3); ESI-MS: 294 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3);
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): 5 1,11 (д, 2,25Н), 1,27 (д, 0,75Н), 2,57 (дд, 0,25Н), 2,67 (дд, 0,75Н), 2,75
(дд, 0,25Н), 2,81 (дд, 0,75Н), 3,34 (м, 0,25Н), 3,70 (с, 0,75Н), 3,73 (с, 2,25Н), 3,77 (м, 0,75Н), 3,83 (с, 3Н), 3,99 (д, 0,75Н), 4,04 (д, 0,25Н), 4,44 (м, 0,25Н), 4,75 (д, 0,25Н), 4,78 (д, 0,75Н), 4,88 (м, 0,75Н), 6,90 (д, 2Н),
7,22 (д, 0,5Н), 7,23 (д, 1,5Н).
Стадия 26.5. (3R,4S)- и (3S,4S)-rVfonui 3-гидрокси-4-((4-метоксибензил)амино)пентаноат
К суспензии гидрохлорида (3R,4S)метил 4-амино-3-гидроксипентаноата [111061-25-7] (2,17 г, 11,8 ммоль) в CH2Cl2 (60 мл) и MeOH (60 мл) добавляли NaOAc (1,357 г, 16,54 ммоль) и после 10 мин перемешивания добавляли п-анисальдегид (1,37 мл, 11,2 ммоль) и молекулярные сита (2 г). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при комнатной температуре. После добавления 2 мл AcOH добавляли NaBH3CN (1,11 г, 17,7 ммоль) по порциям в течение 30 мин. После перемешивания еще в течение 30 мин при комнатной температуре реакционную смесь фильтровали, фильтрат подкисляли при помощи
4н. водного раствора HCl и упаривали досуха. Остаток сначала промывали при помощи Et2O, затем суспендировали в CH2Cl2/MeOH 1:1 и неорганическое вещество отфильтровывали. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения, после сушки при 50°C в течение 4 ч, в виде бежевого твердого вещества (2,9 г, 80%, 3:1 смесь (3R,4S)- и ^^)-диастереоизомеров).
tR: 0,46 мин ((3R, 4S)-диастереоизомер) и 0,48 мин ((3S,4S)-диастереоизомер) (ЖХ-МС 3); ESI-MS:
268 [М+Н]+ (ЖХ-МС 3).
:Н ЯМР данные для соединений описанных выше примеров представлены в следующей таблице.
,7=5,67 Гц, 1Н) 7,46 (с, 1Н) 7,59 (с, 2Н) 8,54 (С, 1Н)
Пример
JH ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) 6 м.д. 1,49 (д, J=6,26 Гц, ЗН) 3,67
(ДД, J=ll, 73, 5, 08 Гц, 1Н) 3,98 (дт, J=ll,63, 4,35 Гц, 1Н) 4,64 (дд, J=7,23, 3, 32 Гц, 1Н) 4,85 (м, J=6,84 Гц, 1Н) 4,95 (т, J=4,89 Гц, 1Н) 7,48 (с, 1Н) 7,54-7,65
(м, 2Н) 8,54 (с, 1Н)
Пример 9
ЯМР (400 МГц, ) 5 м.д. 1,862,00 (м, 1Н) 2,18-2,34 (м, 1Н) 3, 65-3, 85 (м, ЮН) 4, 38-4, 46 (м, 1Н) 4, 49-4, 60 (м, 1Н) 4,915,02 (м, 1Н) 7,51 (с, 1Н) 8,53 (с, 1Н)
Пример 10
XH ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) 5 м.д. 1,18 (д, J=6,65 Гц, ЗН) 1,49 (д, J=6,65 Гц, ЗН) 3,13 (тд, J=13,00, 3,71 Гц, 1Н) 3, 33-3, 44 (м, 1Н) 3,51-3,59 (м, 1Н) 3,623,73 (м, 2Н) 3,89 (дд, J=ll,34, 3,13 Гц, 1Н) 4,00 (дт, J=ll,53, 4,59 Гц, 1Н) 4,20 (д,
.7=11,73 Гц, IH) 4,52
(д, J=5, 86 Гц, IH) 4, 62
(дд, ,7=7, 43, 2, 74 Гц,
IH) 4,86 (м, IH) 4,96
(T, J=4, 69 Гц, IH) 7, 47
(с, IH) 7,59 (с, 2H)
8,54 (с, IH)
Пример 11
XH ЯМР (400 МГц,
(Для сравнения)
<ДМС0> ) 5 м.д. 3,563,74 (м, 8Н) 4,08-4,21 (м, 2Н) 4, 36-4, 50 (м, 2Н) 7,42 (с, 1Н) 4,58 (с, 2Н) 8,55 (с, 1Н)
Пример 12
ХН ЯМР (400 МГц,
<ДМС0> ) 5 м.д. 1, 43 (д, 7=6,26 Гц, ЗН) 3,66
(ДД, J=15,84, 3,71 Гц,
8Н) 4,39 (д, 7=12,12
Гц, 1Н) 4,69 (дд, J=12,51, 3,52 Гц, 1Н) 4,91-5,04 (м, 2Н) 7,43 (с, 1Н) 7,60 (с, 2Н) 8,22 (с, 1Н) 8,56 (с, 1Н)
Пример 13
ХН ЯМР (400 МГц,
<ДМС0> ) 5 м.д. 1,12-
1,29 (м, ЗН) 1,42 (д, 7=6,26 Гц, ЗН) 3,15 (тд, J=13, 00, 3,71 Гц, 1Н) 3, 35-3, 47 (м, 1Н)
3,56 (дд, J=ll,53, 2,93 Гц, 1Н) 3,70 (д, J=ll,34 Гц, 1Н) 3,90
7,59 (с, 2Н) 1Н)
3,55 (с,
Пример 2 О
F У
XH ЯМР (400 МГц, <ДМСО> ) б м.д. 3,513,76 (м, ЮН) 3,95 (дд, J=10, 35, 6, 05 Гц, 1Н) 4,16 (т, 7=9,76 Гц, 1Н) 4,66-4,82 (м, 1Н) 5,20 (т, J=5, 66 Гц, 1Н) 7,42 (с, 1Н) 7,59 (с, 2Н) 8,55 (с, 1Н)
Пример 21
:Н ЯМР (600 МГц, дмсо-d6) 6 м.д. 3, 60-3,75 (м, 8Н) , 4,12 (м, 4Н), 5,15 (м, 1Н) , 5,26 (м, 1Н), 7,47 (с, 1Н), 7,62 (с, 2Н), 8,59 (с, 1Н)
Пример 2 2 1:1 смесь (3aR, 6R,6aR)-и
(3aS, 6S,6aS)-диастереоизоме ров
N*4
:Н ЯМР (4 00 МГц, ДМСО-d6) 6 м.д. 1,04 (д, .7=6,3 Гц, ЗН), 1,601,75 (м, 2Н), 1,80-1,95
(м, 1Н), 2,24 (м, 1Н), 3,60-3,80 (м, 8Н), 4,18
(м, 1Н), 4,72 (д, J=7,7 Гц, 1Н) , 5,01 (дт, .7=1,8, 7,3 Гц, 1Н) , 5, 26 (д, J=3,3 Гц, 1Н) , 7,46 (с, 1Н) , 7,62 (с, 2Н), 8,58 (с, 1Н)
Пример 2 3
:Н ЯМР (4 00 МГц, ДМСО-ds) 5 м.д. 1,30 (д, J=6, 3 Гц, ЗН) , 1, 87 (м, 2Н), 3,5-3,75 (м, ЮН), 4,73 (т, J=6, 8 Гц, 1Н) , 4,83 (м, 2Н) , 7,44 (с, 1Н), 7,62 (с, 2Н) , 8,58 (с, 1Н)
Пример 24
первый элюирующий диастереоизоме р на ЖХ-МС 3,
(Реконфигурация
приписана произвольно.
*Н ЯМР (400 МГц, CDC13) 5 м.д. 1,26 (д, <7=6,2 Гц, ЗН) , 1,32 (д, J=6,3 Гц, ЗН) , 1,75 (м, 1Н) , 1,96 (м, 1Н), 3,41 (д, J=6,5 Гц, 1Н) , 3,43
(уш.д, 1Н), 3,69 (м, 8Н) , 4,03 (м, 1Н) , 4,72
(м, 1Н), 4,80 (м, 1Н) , 5,38 (м, 2Н), 7,50 (с, 1Н) , 8,51 (с, 1Н)
Пример 2 5
второй элюирующий продукт на ЖХ-МС 3, (S) -конфигурация
приписана произвольно.
, - N^N
ХЕ ЯМР (400 МГц, CDC13) 9:1 смеси (4S,5R)- и ( (4S,5R)-
диастереоизомеров: 5 м.д. 1,25 (д, J=6,2 Гц, ЗН) , 1,32 (д, J=6,3 Гц, 2,7Н), 1,48 (д, J=6,3 Гц, 0,ЗН), 1,64
(м, 0,9Н), 1,77 (м, 0,1Н), 1,86 (м, 0, 9Н) , 1,93 (м, 0,1Н), 3,70
(м, 8Н), 4,06 (м, 2Н) , 4,37 (м, 0,1Н), 4,46
(м, 0,1Н), 4,77 (м, 0,9Н), 4,84 (м, 0,9Н),
5,38 (м, 2Н) , 7,51 (с,
1Н) , 8,51 (с, 1Н)
Пример 2 6
ХН ЯМР (4 00 МГц, CDC13) 10:1 смеси (4S,5R)- и ( (4S,5R)-
диастереоизомеров: б м. д. 1,30 (уш. с, 8,4Н), 1,33 (с, 0,ЗН)+, 1,56 (0,ЗН)*, 1,79 (д, 1Н), 1,95 (дд, 1Н), 3,70 (уш.с, 8Н) , 4,43 (м, 0,2Н)*, 4,70-4,90 (м, 1,8Н), 5,36 (уш.с, 2Н) , 7,51 (с, 1Н) , 8,51 (с, 1Н)
Другие физические свойства.
Кристаллические вещества, полученные из примеров 10 и 18, партии А-Е, были далее охарактеризованы следующим образом.
Определение температуры плавления.
Температуру плавления определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). DSC измерения осуществляли с использованием ТА Instruments, DSC 2000, Serial No. 100036. Образец 1-5 мг отвешивали в стандартную алюминиевую чашу (чаша+крышка, ТА 900786.901, 900779,901). Работу оборудования осуществляли с использованием программы Thermal Advantage Q-Series V.2.6.0,367 и программы Thermal Advantage V4.6.9. Термические события характеризовали с использованием Universal Analysis V4.3A Build 4.3.0.6. Образцы измеряли против пустой чаши. Образец обрабатывали в соответствии с протоколом, описанным ниже:
Стадия 1. Уравновешивание при -40°C.
Стадия 2. Нагревание 10°C/мин/300°C.
Модуляция: No.
Полученные графики представлены на фиг. 1, 3, 5, 7, 9 и 11. Рентгеновская порошковая дифракция (PXRD).
Образец в количестве ~2-5 мг помещали на предметное стекло и центрировали в рентгеновском луче на устройстве Bruker D8 GADDS Discover с CuKa анодом (Serial No. 002482). Расстояние между образцом и детектором составляло 30 см. Два изображения были зарегистрированы между 5 и 40° 2-тета. Изображения объединяли с использованием GADDS программы 4.1.27. Оценку осуществляли с использованием EVA 10.0.0.
Полученные графики представлены на фиг. 2, 4, 6, 8, 10 и 12.
Репрезентативные 2-тета [°] пики представлены в следующих таблицах.
Фиг. 2 (PXRD пример 10).
2-тета [°]
Интенсивность
9, 9
средняя
14, 2
средняя
20, 1
высокая
23, 2
средняя
29, 7
средняя
Фиг. 4 (PXRD пример 18А).
2-тета [°]
Интенсивность
8,7
средняя
10, 6
высокая
18, 5
низкая
25, 3
средняя
30, 3
средняя
Фиг. 6 (PXRD пример 18В).
2-тета [°]
Интенсивность
10,3
средняя
15, 2
высокая
16, 0
средняя
22, 7
средняя
23, 7
средняя
Фиг. 8 (PXRD пример 18С).
2-тета [°]
Интенсивность
10, 3
средняя
15, 2
высокая
16, 0
средняя
20, 3
средняя
29, 0
низкая
Фиг. 10 (PXRD пример 18D).
Биологическая активность.
Эффективность соединений по настоящему изобретению в качестве ингибиторов PI3 киназ можно продемонстрировать следующим образом.
Получение разведений соединения (в 384-луночном формате).
Испытываемые соединения растворяли в DMSO (10 мМ) и переносили в 1,4 мл плоскодонные или V-образные Matrix пробирки, содержащие 2D матричный чип в соответствии с индивидуальными ключевыми соединениями Novartis. Номера этих чипов были отчетливым образом связаны с номерами Novartis Pharma. Исходные растворы хранили при -20°C, если не использовали сразу. Для процедуры испытания сосуды размораживали и идентифицировали при помощи сканнера, таким образом, был создан "рабочий лист", который руководил последующими рабочими стадиями.
Соединения либо разбавляли вручную в DMSO для отдельных экспериментов (96 лунок, позволяющие использовать 10 соединений при 8 (отдельные точки) концентрациях), как описано ниже, либо были получены, как описано ниже, если их испытывали для профилирования в 384-луночном формате. Этот формат позволяет осуществлять анализ максимально 40 индивидуальных испытываемых соединений при 8 концентрациях (отдельные точки), включая 4 ссылочные соединения. Протокол разведения включал получение "планшетов для предварительного разведения", "эталонных планшетов" и "аналитических планшетов".
Планшеты для предварительного разведения: 96-луночные полипропиленовые планшеты использовали в качестве планшетов для предварительного разведения. Всего было получено 4 планшета для предварительного разведения, включающих 10 испытываемых соединений, в положениях А1-А10 планшета, одно стандартное соединение в положении A11 и один DMSO контроль в положении А12. Схема осуществления стадий разведения представлена в табл. 1. Были написаны программы для осуществления этих стадий пипетирования с использованием роботов HamiltonSTAR.
Таблица 1
Схемы разведений для планшетов предварительного разведения
Ряд Об. Конц. Об.
(мкл) (МКМ) (мкл) DMSO
Об. Конц. Коэфф. Конечн. (мкл) (мкМ) развел конц.
ения (мкМ)
165 1'820 1:5,5
DMSO был насыщен Н2О до концентрации 10%.
Об.: объем.
Конц.: концентрация.
Коэфф. разведения: коэффициент разведения. Конечн. конц.: конечная концентрация. Эталонные планшеты: 100 мкл разведений индивидуальных соединений, включая стандартное соединение и контроли из четырех "планшетов предварительного разведения", переносили в 384 "эталонный планшет", включающий следующие концентрации 1'820, 546, 182, 54,6, 18,2, 5,46, 1,82 и 0,546 мкМ соответственно, в 90% DMSO. Аналитические планшеты.
Затем получали идентичные "аналитические планшеты" путем пипетирования 50 нл каждого из разведений соединения из "эталонных планшетов" в 384-луночные "аналитические планшеты". Соединения смешивали с 4,5 мкл используемых для анализа компонентов плюс 4,5 мкл фермента в соответствии с 1:181 разведением, обеспечивая конечную концентрацию 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 и 0,003 мкМ соответственно. Для получения "эталонных планшетов" использовали Matrix PlareMate Plus робот, а для репликации "аналитических планшетов" использовали HuMMingBird робот.
Способ получения экспрессирующих конструкций.
Каталитически активные человеческие PI3Ka, PI3KP, PI3K5 и mTOR клонировали, экспрессирова-ли и очищали, как описано (Maira S.M., Stauffer F., Brueggen J., Furet P., Schnell C., Fritsch C., Brachmann S., Chene P., de Pover A., Schoemaker K., Fabbro D., Gabriel D., Simonen M., Murphy L., Finan P., Sellers W., Garcia-Echeverria С. (2008), Mol. Cancer Ther. 7:1851-63 и Maira S.M., Pecchi S., Brueggen J., Huh K., Schnell C., Fritsch C., Nagel T., Wiesmann M., Brachmann S., Dorsch M., Chene P., Schoemaker K., De Pover A., Menezes D., Fabbro D., Sellers W., Garcia-Echeverria C., Voliva C.F. (2011), Mol. Cancer Ther. accepted).
Биохимические анализы на PI3Ka, PI3Kp.
основанный на люминесценции реагент для АТР детекции KinaseGlo получали от Promega (каталожный номер V6714, номер партии 236161) через Catalys, Wallisellen, Switzerland. (L-a-фосфатидилинозит (PI), Liver, Bovine) получали от Avanti Polar Lipid (каталожный номер 840042С, номер партии LPI-274), фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат (PIP(4,5)2 (Avanti, каталожный номер 840046Х) или L-a-фосфатидилинозит (PI) получали от Avanti Polar Lipid (каталожный номер 840042С, номер партии LPI-274). L-a-Фосфатидилсерин (PS) получали от Avanti Polar Lipid (каталожный номер 840032С), н-октилглюкозид получали от Avanti Polar Lipid (каталожный номер 10634425001). Люминесценция является общепринятым показателем для определения АТР концентраций, и ее, таким образом, можно использовать для отслеживания активности многих киназ, независимо от их субстрата. Киназный анализ Glo Luminescent Kinase Assay (Promega, Madison/WI, USA) представляет собой гомогенный HTS метод измерения киназной активности путем определения количества АТР, оставшегося в растворе после киназной реакции.
50 нл разведений соединений вносили в 384-луночные малого объема несвязывающие стирольные (NBS) планшеты (Costar каталожный номер NBS#3676), как описано в разделе 8.2. L-a-Фосфатидилинозит (PI), используемый в виде 10 мг/мл раствора в метаноле, переносили в стеклян
ную пробирку и сушили под потоком азота. Смесь затем ресуспендировали в 3% октилглюкозиде (OG) путем вихревого перемешивания и хранили при 4°C. К 5 мкл смеси PI/OG добавляли PI3Ka и PI3KP подтипы. Киназные реакции начинали путем добавления 5 мкл АТР-смеси, содержащей в конечном объеме 10 мкл 10 мМ TRIS-HC1 рН 7,5, 3 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 0,05% CHAPS, 1 мМ DTT и 1 мкМ АТР, и осуществляли при комнатной температуре. Реакции останавливали при помощи 10 мкл KinaseGlo и планшеты считывали спустя 10 мин в Synergy2 считывающем устройстве с использованием времени интеграции 0,1 с/лунку. 2,5 мкМ NVP-BGT226 (стандарт) добавляли в аналитические планшеты для осуществления 100% ингибирования киназной реакции и 0% ингибирование было получено с использованием растворителя в качестве носителя (90% DMSO в воде). NVP-BGT226 использовали в качестве ссылочного соединения и включали во все аналитические планшеты в форме 16 точек разведения в двух повторах.
ИК50 значения на основании процента ингибирования для каждого соединения при 8 концентрациях (обычно 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 и 0,003 мкМ) n=2 получали путем подгонки сигмоидальной кривой доза-ответ к графику считываемых показаний против концентрации ингибитора, как описано. Все подгонки осуществляли с использованием программы XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, UK).
Биохимические анализы на PI3K5, PI3Ky.
Набор для анализа TR-FRET Adapta(tm) Universal Kinase Assay Kit закупали у Invitrogen Corporation (Carlsbad/CA, USA)(каталожный номер PV50 99). Набор содержал следующие реагенты: Adapta Eu-анти-ADP Антитело (европий-меченое анти-ADP антитело в HEPES буферно-солевом растворе, каталожный номер PV5097), Alexa Fluor(r) 647-меченый ADP индикатор (Alexa Fluor(r) 647-меченый ADP индикатор в HEPES буферно-солевом растворе, каталожный номер PV5098), патентованный TR-FRET разбавляющий буфер рН 7,5 (каталожный номер PV3574).
PIK3CD субстрат, фосфатидилинозит, получали от Invitrogen (везикулы, состоящие из 2 мМ PI в 50 мМ HEPES pH7,5; каталожный номер PV5371). PIK3CG субстрат, фосфатидилинозит-4,5-бисфосфат (PIP(4,5)2, получали от Invitrogen (PIP2:PS большие однослойные везикулы, состоящие из 1 мМ PIP2: 19 мМ PS в 50 мМ HEPES pH7,5, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA; каталожный номер PV5100).
Перенос резонансной энергии флуоресценции с разрешением по времени (TR-FRET) представляет собой метод, основанный на переносе энергии между двумя смежными красителями, от возбужденного электрона в одном красителе (донор) к электрону смежного красителя (акцептор) через резонанс, с последующим высвобождением в виде фотона. Этот перенос энергии определяют по усилению эмиссии флуоресценции акцептора и снижению эмиссии флуоресценции донора. В TR-FRET анализах для определения протеинкиназ используют имеющий большой период жизни лантанид, такой как хелатные соединения тербия или европия, в качестве донорных молекул, которые преодолевают помехи от автофлуоресценции соединения или светорассеяния от осажденных соединений, вызывая задержку после возбуждения посредством импульсной лампы, являющейся источником возбуждения. Результаты часто выражают как отношение интенсивностей акцепторного и донорного флуорофоров. Логометрическая природа такого значения вносит поправки на разницу в объемах анализа между лунками, а также вносит поправки на гасящие эффекты из-за окрашенных соединений. Adapta(tm) анализ можно разделить на две фазы: фаза киназной реакции и фаза ADP детекции. В фазе киназной реакции все компоненты киназной реакции добавляют в лунки и реакцию оставляют для инкубации в течение установленного периода времени, специфического для каждой киназы. После реакции раствор для детекции, включающий Eu-меченое анти-ADP антитело, Alexa Fluor(r) 647-меченый ADP индикатор и EDTA (для остановки киназной реакции), добавляют в лунку для анализа. ADP, образовавшийся в результате киназной реакции, будет вытеснять Alexa Fluor(r) 647-меченый ADP индикатор из антитела, приводя к снижению TR-FRET сигнала. В присутствии ингибитора количество ADP, образовавшегося в результате киназной реакции, снижается, и получаемое в результате взаимодействие интактное антитело-индикатор поддерживает высокий TR-FRET сигнал. В Adapta(tm) анализе возбуждение донора (европий-анти-ADP антитело) происходит при 340 нм, и он будет передавать свою энергию акцептору (Alexa Fluor(r) 647-меченый ADP индикатор). Эмиссию от Alexa Fluor(r) 647 можно отслеживать при помощи фильтра, центрированного при 665 нм, поскольку он расположен между эмиссионными пиками донора, которые измеряют при 615/620 нм.
50 нл разведений соединений вносили в белый 384-луночный полистирольный планшет малого объема, как описано в разделе 2.2. Затем 5 мкл PI3Ky и PI3K5 и липидный субстрат (PI или PIP2:PS), затем 5 мкл АТР (конечный объем анализа 10 мкл) инкубировали при комнатной температуре. Стандартный реакционный буфер для Adapta(tm) TR-FRET анализа содержал 10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 3 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,05% CHAPS. Реакции останавливали при помощи 5 мкл смеси EDTA, содержащей Eu-меченое анти-ADP антитело и Alexa Fluor(r) 647-меченый ADP индикатор, в TR-FRET разбавляющем буфере (запатентован IVG). Планшеты считывали через 15-60 мин в Synergy2 считывающем устройстве с использованием времени интеграции 0,4 с и задержки 0,05 с. Контроль для 100% ингибирования киназной реакции осуществляли путем замены PI3K стандартным реакционным буфером. Контроль для 0% ингибирования осуществляли с использованием растворителя в качестве носителя для соединений (90% DMSO в Н2О). Стандартное соединение NVP-BGT226 использовали в качестве ссылоч
ного соединения и включали во все аналитические планшеты в форме 16 точек разведения в двух повторах.
Данные анализировали с использованием программы Excel fit или Graphpad Prism. EC50 значения получали путем подгонки сигмоидальной кривой доза-ответ к графику считываемых показаний против концентрации ингибитора. Все подгонки осуществляли с использованием программы XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, UK). Определение ЕС50 значений на основании процента ингибирования для каждого соединения при 8 концентрациях (обычно 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 и 0,003 мкМ), n=2 получали путем подгонки сигмоидальной кривой доза-ответ к графику считываемых показаний против концентрации ингибитора. Все подгонки осуществляли с использованием программы XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, UK).
Биохимический анализ на mTOR.
В TR-FRET анализах для определения протеинкиназ используют имеющий большой период жизни лантанид, такой как хелатные соединения тербия или европия, в качестве донорных молекул, которые преодолевают помехи от автофлуоресценции соединения или светорассеяния от осажденных соединений, вызывая задержку после возбуждения посредством импульсной лампы, являющейся источником возбуждения. Результаты часто выражают как отношение интенсивностей акцепторного и донорного флуорофоров.
Логометрическая природа такого значения вносит поправки на разницу в объемах анализа между лунками, а также вносит поправки на гасящие эффекты из-за окрашенных соединений. Анализы связывания основаны на связывании и вытеснении Alexa Fluor(r) 647-меченых АТР-конкурентных ингибиторов киназ с представляющей интерес киназой. "Киназные индикаторы" от Invitrogen были разработаны для широкого ряда киназных мишеней, и они основаны на АТР-конкурентных ингибиторах киназ, что делает их подходящими для детекции любых соединений, которые связываются с АТР сайтом или с аллостери-ческим сайтом, изменяя конформацию АТР сайта. Ингибиторы, которые связываются с АТР сайтом, включают как ингибиторы киназ I типа, которые связываются исключительно только с АТР сайтом, так и ингибиторы II типа (например, Gleevec(r)/иматиниб, Sorafenib, BIRB-796), которые связываются с АТР сайтом и с гидрофобным сайтом, экспонированным в DFG-out (неактивной) конформации. Ингибиторы III типа представляют собой соединения, которые не конкурируют с АТР, и их широко определяют как аллостерические ингибиторы. Исследование 15 различных ингибиторов III Типа продемонстрировало, что все, за исключением одного соединения, были определены в анализе связывания с эквивалентной эффективностью, как в анализах активности. Единственным исключением было субстрат-конкурентное соединение, и, таким образом, оно не было истинным аллостерическим ингибитором.
В отличие от большинства основанных на флуоресценции анализов киназной активности, LanthaScreen(r) анализы связывания Eu3+ киназ можно считывать непрерывно, что способствует осуществлению оценки соединений с низкой кинетикой связывания. Также, в отличие от большинства анализов активности, анализы связывания можно осуществить с использованием либо активных, либо неактивированных киназных препаратов, что позволяет осуществлять характеризацию соединений, которые связываются преимущественно с неактивированными киназами, таких как Gleevec(r)/иматиниб и некоторые аллостерические ингибиторы.
В Lanthascreen(tm) анализе связывания киназ, возбуждение донора (Eu3+-анти-GST антитело) происходит при 340 нм, и он будет передавать свою энергию акцептору (Alexa Fluor(r) 647-меченый АТР-конкурентный ингибитор киназы = индикатор-314). Эмиссию от индикатора-314 (Alexa Fluor(r) 647 ингибитор) можно отслеживать при помощи фильтра, центрированного при 665 нм, поскольку он расположен между эмиссионными пиками донора, которые измеряют при 615/620 нм. Связывание обоих, индикатора-314 и Eu3+-анти-GST антитела, с киназой приводит к высокой степени FRET от Eu3+-донорного флуо-рофора к Alexa-Fluor(r) 647-акцепторному флуорофору на индикаторе-314. Связывание ингибитора с киназой конкурирует за связывание с индикатором, приводя к потере FRET.
50 нл разведений соединений вносили в белый 3 8 4-луночный полистирольный планшет малого объема, как описано в разделе 2.2. Затем 5 мкл GST-mTOR и европий-анти-GST антитела, затем 5 мкл индикатора-314 (конечный объем анализа 10 мкл) инкубировали при комнатной температуре. Стандартный реакционный буфер для Lanthascreen(tm) анализа связывания киназы содержал 50 мМ HEPES рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 0,01% Pluronic F-127. Планшеты считывали через 60 мин в Synergy2 считывающем устройстве с использованием времени интеграции 0,2 мкс и задержки 0,1 мкс.
Для расчета отношения эмиссии сигнал, испускаемый при 665 нм от акцептора (Alexa Fluor(r) 647-меченый индикатор-314), делили на сигнал, испускаемый при 620 нм от донора (Eu^nm-GST антитело).
Контроль для 0% ингибирования осуществляли с использованием растворителя в качестве носителя для соединений (90% DMSO в Н2О). Контроль для относительного 100% ингибирования осуществляли путем добавления 10 мкМ в смесь, содержащую GST-mTOR и Европий анти-GST антитело. Дополнительный контроль для абсолютного 0% ингибирования осуществляли с использованием Eu3+ анти-GST антитела без GST-mTOR.
Клеточные анализы для определения PI3Ka, р и 5.
AlphaScreen (амплифицированный люминесцентный гомогенный анализ приближения, ALPHA, Perkin Elmer) представляет собой анализ приближения на основе нерадиоактивных шариков для исследования биомолекулярных взаимодействий в формате гомогенного микротитровального планшета. Торговое наименование SureFire означает AlphaScreen анализы, которые адаптированы для количественного определения фосфорилирования эндогенных клеточных белков в клеточных лизатах с использованием подобранных пар антител, состоящих из антифосфокиназы и антитела против киназы. Анализ позволяет осуществить характеризацию киназной сигнальной активности в клетках, а также измерение ингибитор-ных эффектов в отношении киназ. AlphaScreen метод обеспечивает некоторые преимущества по сравнению со стандартными методами анализа, такими как ELISA, он не предусматривает использование трудоемких процедур промывки и уменьшает оперирование с планшетом. Кроме того, его можно миниатю-ризировать, по меньшей мере, до 384-луночного формата, и он обеспечивает чувствительность вплоть до фемто-молярного диапазона, в зависимости от аффинности антител, включенных в индивидуальный набор для AlphaScreen SureFire анализа. Высокая чувствительность достигается при помощи внутреннего механизма амплификации, который включает продукцию синглетных молекул кислорода. SureFire наборы для анализа являются коммерчески доступными для конкретных мишеней и включают пары утвержденных антител (PerkinElmer). Это сообщение описывает общие процедуры, применяемые для AlphaS-creen SureFire анализов и соответствующих полуавтоматических стадий для рутинного профилирования ингибиторов киназ в клеточных анализах.
Rat-1 клеточные линии, стабильно гиперэкспрессирующие активированные PI3K класса I изоформы Rat-1 pBABEpuro Myr-HA-hp1105 (Rat-1 PI3K5) и Rat-1 pBABEpuro Myr-HA-hp110a (Rat-1 PI3Ka) и Rat-1 pBABEpuro Myr-HA-hp110p (Rat-l PI3P), получали, как описано (Maira S.M., Stauffer F., Brueggen J., Furet P., Schnell C., Fritsch C., Brachmann S., Chene P., de Pover A., Schoemaker K., Fabbro D., Gabriel D., Simonen M., Murphy L., Finan P., Sellers W., Garcia-Echeverria С. (2008), Mol. Cancer Ther. 7:1851-63 и Maira S.M., Pecchi S., Brueggen J., Huh K., Schnell C., Fritsch C., Nagel T., Wiesmann M., Brachmann S., Dorsch M., Chene P., Schoemaker K., De Pover A., Menezes D., Fabbro D., Sellers W., Garcia-Echeverria C., Voliva C.F. (2011), Mol. Cancer Ther., accepted). Все клеточные линии культивировали в полной питательной среде (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, 1% (об./об.) MEM NEAA, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, пуромицина (10 мкг/мл для Rat-1 PI3K5 и Rat-1 PI3Ka, 4 мкг/мл для Rat-1 PI3P), 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина) до 90% конфлюэнтности при 37°C/5% СО2/90% влажности в увлажненном СО2 инкубаторе и расщепляли два раза в неделю.
Следующие вещества использовали для p-AKT (S473) детекции в Rat-1 клеточных лизатах: модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (Gibco Invitrogen, Basel, Switzerland, каталожный номер 41965), термоинактивированная фетальная бычья сыворотка, Qualified (HI FBS; Gibco Invitrogen, Basel, Switzerland, Lot. No. 16140), MEM заменимые аминокислоты (NEAA; Gibco Invitrogen, Basel, Switzerland, каталожный номер 11140), HEPES (Gibco Invitrogen, Basel, Switzerland, каталожный номер 15630), пенициллин/стрептомицин (пенициллин/стрептомицин, 100х; Gibco Invitrogen, Basel, Switzerland, каталожный номер 15140-122), L-Глутамин (Gibco Invitrogen, Basel, Switzerland, каталожный номер 25030), пуромицин (Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland, каталожный номер Р9620), DMSO (MERCK, Dietikon, Switzerland, каталожный номер 8.02912,2500), H2O, MilliQ-H2O, если не указано иное (MILLIPORE QGARDOOR1, Millipore, Zug, Switzerland), бычий сывороточный альбумин (BSA; Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland каталожный номер А8412), SureFire p-Akt 1/2 (Ser473) набор для анализа (PerkinElmer, Schwerzenbach, Switzerland, каталожный номер TGRAS50K).
p-Akt (S473) SureFire анализ использовали для измерения фосфорилирования эндогенного клеточного Akt 1/2 по Ser473 в клеточных лизатах. С использованием Rat-1 клеток, стабильно экспрессирую-щих myr-HA-меченые варианты изоформ человеческих PI3K5, PI3Ka или PI3KP p110 каталитических субъединиц, анализ был разработан в виде двухпланшетного протокола в 384-луночном формате.
Для испытываемого соединения клетки высевали при плотности 4000 (Rat-1 PI3K5), 7500 (Rat-1 PI3Ka) или 6200 (Rat-1 PI3KP) клеток в 20 мкл полной питательной среды в обработанные клеточной культурой 384-луночные планшеты и выращивали при 37°C/5% СО2/90% влажности в течение 24 ч. Непосредственно перед переносом соединения, полную среду удаляли, добавляли 30 мкл буфера для анализа (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 1х MEM NEAA, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 0,1% (мас./об.) BSA) и 10 мкл предварительных разведений соединения переносили в клетки. Для испытаний после февраля 2010 года использовали буфер для анализа вместо полной питательной среды, что давало подобные результаты (данные не показаны). После обработки соединением в течение 1 ч клетки лизиро-вали путем добавления 20 мкл лизисного буфера, дополненного 0,24% (мас./об.) BSA. Детекцию р-AKT (Ser473) осуществляли с использованием набора для анализа SureFire p-Akt 1/2 (Ser473) в соответствии с инструкциями изготовителя, используя 5 мкл клеточного лизата в общем объеме детекции 12 мкл.
ИК50 значения на основании процента ингибирования для каждого соединения при 8 концентрациях (обычно 10, 3,0, 1,0, 0,3, 0,1, 0,030, 0,010 и 0,003 мкМ), n=2 получали путем подгонки сигмоидальной кривой доза-ответ к графику считываемых показаний против концентрации ингибитора, как описано. Все подгонки осуществляли с использованием программы XLfit4 (ID Business Solutions, Guildford, UK).
Клеточный анализ на mTOR.
Клеточный анализ (в 384-луночном формате) был разработан для определения эффектов соединений на клеточную mTOR киназную активность в MEF (мышиные эмбриональные фибробласты) клетках, полученных от мышей, у которых отсутствовал TSC1 (Tuberosclerosis Complex1), являющийся сильным супрессором mTOR киназной активности. Из-за отсутствия TSC1 mTOR киназа конститутивно активируется, приводя к перманентному фосфорилированию Thr 389 S6 киназы 1 (S6K1), который является одной из находящихся ниже мишеней mTOR.
С использованием набора SureFire Kit, который позволяет определять фосфорилирование Thr389 на S6K1, был разработан и утвержден анализ, который был осуществлен в Alpha-Screen формате, что обеспечивает возможность количественного определения фосфо-Т389 S6K1 в клеточных лизатах. Обработка MEF TSC1- - клеток специфическими в отношении mTOR (или в отношении mTOR пути) ингибиторами дозо-зависимым образом снижала уровни фосфо-Т389 на S6K1, что позволяло рассчитать ИК50 значения. Они соответствовали значениям, полученным в биохимическом анализе mTOR АТР-связывания, это позволяло осуществить количественное сравнение эффективности mTOR ингибиторов.
TSC1-/- MEF клетки (Kwiatkowski, D.J., Zhang, H., Bandura, J.L., Heiberger, K.M., Glogauer, M., el-Hashemite, N., and Onda, H. (2002), Hum. Mol. Genet. 11, 525-534) культивировали в DMEM среде с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% FBS (Invitrogen), 2 мМ глутамина и 1% (мас./об.) пенициллина/стрептомицина, при 37°C, 5% СО2.
SureFire набор для определения фосфорилирования.
Р70S6 киназы закупали у компании Perkin Elmer (p70S6K p-T389, #TGR70S50K) и анализ осуществляли в соответствии с инструкциями поставщика и в соответствии с общим способом для SureFire анализов. Вкратце, 5 мкл клеточного лизата на лунку переносили в 384-луночные белые proxy-планшеты (для считывания люминесценции) и смешивали с 7 мкл А и 5 мкл В (конечный объем: 12 мкл). После 3 ч инкубации в темноте при комнатной температуре осуществляли считывание люминесценции при помощи считывающего устройства Envision Reader (Perkin Elmer). Необработанные клетки использовали в качестве контроля (верхний контроль) и клетки, обработанные 3 мкМ BEZ235, использовали в качестве нижнего контроля. Окно оценки между сигналами, полученными для верхнего и нижнего контролей, определяли как 100% и эффекты соединений выражали в виде процента ингибирования. Значения ИК50 рассчитывали из кривых доза-ответ путем графической экстраполяции.
Результаты, полученные с использованием описанных выше анализов, представлены в следующих таблицах, где SEM = стандартная ошибка средней и n = количество измерений.
Пример №
Р13Ка/ИК50 [мкмоль 1-1]
SEM
0, 009
0, 001
0, 026
0, 012
0, 008
0, 001
0,014
0, 008
0, 002
0, 006
0,203
0, 024
0, 003
0, 013
0, 006
0,013
0,011
0, 030
0,010
0, 021
0,030
0, 023
0, 021
0, 384
11 (сравнительный)
0,038
0,013
0, 030
0,017
0, 057
0, 020
0, 031
0, 019
0, 006
0, 001
Пример №
Р13КЬ ИК50 [мкмоль 1-1]
SEM
0, 004
0, 001
0, 021
0, 009
0, 006
0,001
0, 007
0, 038
0, 025
0, 005
0, 146
0, 011
0, 002
0, 007
0,003
0, 004
0, 011
0, 020
0, 009
0, 006
0, 049
0, 020
0, 018
0, 041
11 (сравнительный)
0, 012
0, 002
0, 012
0, 007
0, 018
0, 003
0, 032
0, 035
0, 048
0, 038
22А
0, 086
0, 038
22В
0, 058
0, 011
0, 007
0, 016
0, 011
0, 003
0, 124
0, 067
WO2007/084786 Пример 10
0, 165
0,018
WO2007/084786 Пример 331
2, 747
0,200
WO2007/084786 Пример 17
0, 214
WO2007/084786 Пример 32 4
1,249
0, 468
WO2007/084786 Пример 18
0, 192
WO2007/084786 Пример 34 4
0, 875
0, 321
WO2007/084786 Пример 85
0, 037
0, 023
Пример №
PIK3d ИК50 [мкмоль 1-1]
SEM
0, 008
0, 001
0, 015
0, 003
0, 007
0, 002
0, 004
0, 012
0, 003
0, 009
0, 021
0, 023
0, 007
0,011
0, 001
0, 021
0,004
0, 021
0, 001
0, 017
0, 059
0, 075
0, 012
0, 032
11 (сравнительный)
0, 029
0, 016
0, 041
0, 008
0, 017
0, 002
0, 063
0, 017
0, 006
0,0025
22А
0, 004
0, 0020
22В
0, 005
0, 009
0,0003
0, 009
0,0022
0, 007
0, 0025
0, 012
WO2007/084786 Пример 10
0,236
0, 057
WO2007/084786 Пример 331
2, 316
0,246
WO2007/084786 Пример 17
0, 296
WO2007/084786 Пример 324
0, 692
0, 037
WO2007/084786 Пример 18
0, 153
WO2007/084786 Пример 34 4
1, 039
0, 585
WO2007/084786 Пример 8 5
0, 080
0, 039
Пример №
PIK3g ИК50 [мкмоль 1-1]
SEM
0, 253
0, 070
0, 338
0, 043
0, 276
0, 068
0, 238
0, 158
0,011
0, 184
0, 386
0, 601
0,216
0,258
0, 027
0,237
0, 329
0, 770
0, 319
0, 529
1, 661
0, 348
0, 516
1, 130
11 (сравнительный)
0, 998
0, 350
2, 197
0, 328
1, 232
0, 679
1, 794
0, 370
0, 145
0, 035
22А
0, 110
0, 035
22В
0, 410
0,207
0, 087
0, 540
0, 340
0,205
0, 095
0,290
0, 050
WO2007/084786 Пример 10
1, 898
0, 675
WO2007/084786 Пример 331
4, 62 6
WO2007/084786 Пример 17
5,270
WO2007/084786 Пример 324
4, 322
0, 023
WO2007/084786 Пример 18
8, 789
WO2007/084786 Пример 344
> 9,1
WO2007/084786 Пример 85
0, 464
0, 231
*2 из 3 значений > 9,1. Расчет SEM невозможен. ** Оба значения> 9,1. Расчет SEM невозможен.
Пример №
Ratl-PI3Ka
ИК50 [мкмоль 1-1]
SEM
0, 038
0,011
0,079
0, 026
0, 048
0, 006
0, 031
0, 061
0,013
0, 050
0, 007
0, 058
0,158
0, 033
0, 094
0,015
0, 081
0, 093
0,108
0,120
0, 007
0, 113
0,134
0, 147
0,147
11 (сравнительный)
0,256
0, 076
0,176
0, 178
0,277
0, 075
0,215
0, 085
0, 095
0, 009
22Д
0, 086
0, 009
22В
0, 148
0, 020
0, 007
0,045
0, 045
0, 013
0, 058
0, 031
WO2007/084786 Пример 10
0, 117
0, 012
WO2007/084786 Пример 331
1, 770
0, 080
WO2007/084786 Пример 17
0, 460
WO2007/084786 Пример 324
1, 730
0, 420
WO2007/084786 Пример 18
0, 669
WO2007/084786 Пример 34 4
1,247
0, 035
WO2007/084786 Пример 8 5
0,126
0, 017
Пример №
Ratl-PI3Kd ИК50 [мкмоль 1-1]
SEM
0, 028
0,006
0, 053
0, 020
0, 027
0,005
0,013
0, 052
0,011
0,034
0,010
0, 042
0, 111
0, 017
0, 037
0, 003
0, 054
0, 023
0, 087
0, 070
0, 015
0, 092
0, 081
0, 073
0, 078
11 (сравнительный)
0, 138
0, 050
0, 059
0, 155
0, 101
0, 008
0, 172
0,061
0, 027
22А
0, 027
22В
0, 005
0,016
0, 002
0, 007
0, 013
0, 002
0, 011
0, 004
WO2007/084786 Пример 10
0, 548
0, 034
WO2007/084786
5, 220
Пример 331
WO2007/084786
1, 030
Пример 17
WO2007/084786 Пример 32 4
6, 540
0, 040
ИО2007/084786 Пример 18
1, 290
WO2007/084786 Пример 34 4
2, 768
0, 184
ИО2007/084786 Пример 8 5
0, 238
0, 065
* Второе значение было > 10. Поэтому расчет SEM невозможен.
** 3 из 4 значений были > 2,27. Поэтому расчет SEM невозможен.
*** 3 из 5 значений были > 2,27. Поэтому расчет SEM невозможен.
**** Все значения были > 2,27. Поэтому расчет SEM невозможен. Внемишеневый эффект (доказательства связывания тубулина) измеряли следующим образом. Описание Cytospin анализа.
Cytospin анализ остановки клеточного цикла G2/M для определения активности связывания тубулина (вне мишеневый эффект) МАРР производных: 5х105 клеток А2058 высевали в 6-луночный кластер с 2 мл DMEM (высокое содержание глюкозы с содержанием 1% пирувата натрия, 1% глютамина и 10% FCS). Через 18 ч добавляли испытываемые соединения при концентрации 5 мкМ (добавляя по 1 мкл 10 мМ раствора испытываемого соединения). Через 24 ч клетки трипсинизировали и переносили в 15-мл коническую пробирку. Клетки затем осаждали путем центрифугирования и ресуспендировали с PBS/О (содержащий 10% FCS). Клетки подсчитывали при помощи CASY счетчика и каждый образец уравновешивали до 1х106 клеток/мл. 200 мкл (2х105 клеток) затем переносили в 1,5 мл Cytospin пробирки (Her-aeus Sepatec, Ref 1152) и центрифугировали в течение 5 мин при 50xg при 4°C с использованием системы
Cytospin, включающей Sepatech систему (Heraeus, Ref #3425), наносили на предметное стекло (Thermo-Scientific, Ref: #PH040820. Клетки затем фиксировали в течение 15 мин при комнатной температуре и окрашивали при осуществлении Diff Quick(r) анализа (Medion Diagnostics, Ref: #130832), следуя рекомендациям изготовителя. Конденсированную ДНК, отражающую остановку G2/M, выявляли по прерывистому окрашиванию в клетках при исследовании предметных стекол под микроскопом. Окрашивание оценивали визуально на присутствие конденсированной ДНК и присваивали оценку, где 0 = отсутствие наблюдаемой конденсированной ДНК (указывает на отсутствие активности вне мишени), 1 = указывает на слабую активность вне мишени, 2 = указывает на среднюю активность вне мишени, 3 = большое количество наблюдаемой конденсированной ДНК (указывает на сильную активность вне мишени). Данные, полученные с использованием этого способа, представлены в следующей таблице.
1. Соединение формулы (I)
где R1 = --L' , где Rla = Н или -СН3; или
D D
R = L> , где D = дейтерий; R2 = H и R3 = H;
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH или R4 = -CH2OH и R5 = H;
или R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H;
R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2 и R5 = H; или
R4 = H и R5 = -CH3, -CH2OH, -CH2CH(OH)CH3 или -CH2C(OH)(CH3)2; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3; или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 объединены вместе и образуют -(CH2)4-;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH;
или R2 = Н и R4 = Н;
R3 и R5 объединены вместе и образуют группу Y он или группу ; или R3 = Н и R5 = Н;
R2 и R4 объединены вместе и образуют группу или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п.1, где
R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3;
или R3 = H и R4 = H;
R2 и R5 = -(CH2)4-;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль.
3. Соединение по п.1 или 2, где
R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или
R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или
R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3;
или R4 = H и R5 = H;
R2 = -CH2OH и R3 = -CH3 или
R2 = H или -CH3 и R3 = -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль.
4. Соединение по любому из пп.1-3, где
R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H;
(1А>
где R2 = -CH3, -CH2OH, -CH2OCH3, -CH2CH2OH или -CH2OC(O)H; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или его фармацевтически приемлемая соль.
7. Соединение по п.6, где
R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H; или R4 = H и R5 = -CH3 или -CH2OH; или R4 = H или -CH3 и R5 = H или -CH3,
или его фармацевтически приемлемая соль.
8. Соединение по п.7,
где R2 = -CH3 или -CH2OH; R3 = H;
R4 = -CH3, -CH2OH или -CH2CH2OH и R5 = H или R4 = H и R5 = CH3 или -CH2OH,
или его фармацевтически приемлемая соль.
9. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, которое выбрано из (S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метилоксазолидин-
2-она,
(S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5,5-диметилоксазолидин-2-она,
рацемического 3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она,
(S)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-она,
(R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-4,5'-бипиримидин-6-ил)-4-(гидроксиметил)-4-метилоксазолидин-2-он,
(3aS,7aS)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)гексагидробензооксазол-2-она,
(S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-метоксиметилоксазолидин-2-она,
(4S,5S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметилоксазолидин-2-она,
(4S,5R)-3-(2'-амино-2-(D8-морфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
^)-3-(2'-шино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-(2-гидроксиэтил)оксазолидин-2-она,
(4S,5R)-3-[2'-амино-2-((S)-3 -метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метил-2-оксо-оксазолидин-4-илметилового эфира муравьиной кислоты,
(S)-3-[2'-амино-2-((S)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-метилоксазолидин-2-она,
(S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметилоксазолидин-2-она,
(4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-
4- метилоксазолидин-2-она,
(S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-метилоксазолидин-2-она,
(S)-3-(2'-амино-2-D8-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5']-бипиримидин]-6-ил)-4-метилоксазолидин-2-она,
(4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-
5- метилоксазолидин-2-она,
(4S,5S)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметил-4-метилоксазолидин-2-она,
(R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-5-гидроксиметилоксазолидин-2-она,
(3aR,6aR)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)тетрагидрофуро[3,4-d]оксазол-2(3Н)-она,
рацемический (3aR*,6R*,6aR*)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-она,
(3aR,6R,6aR)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-она,
(3aS,6S,6aS)-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-6-гидроксигексагидро-2Н-циклопента[d]оксазол-2-она и
(4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-
4- метилоксазолидин-2-она.
10. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из
(4S,5R)-3-[2'-амино-2-((S)-3 -метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она,
(4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']бипиримидинил-6-ил)-4-гидроксиметил-
5- метилоксазолидин-2-она или
(4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолино-4'-(трифторметил)-[4,5'-бипиримидин]-6-ил)-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилоксазолидин-2-она.
12. Соединение (4S,5R)-3-[2'-амино-2-((S)-3-метилморфолин-4-ил)-4'-трифторметил[4,5']бипири-мидинил-6-ил]-4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, имеющее структуру
11. Соединение (4S,5R)-3-(2'-амино-2-морфолин-4-ил-4'-трифторметил[4,5']-билиримидинил-6-ил)-
4-гидроксиметил-5-метилоксазолидин-2-она, имеющее структуру
14. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
15. Фармацевтическая композиция по п.14 в виде твердой дисперсии указанного соединения.
16. Применение соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли в качестве лекарственного средства для лечения рака.
17. Применение соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака.
18. Применение соединения по любому из пп.1-13 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака.
19. Применение по п.17, где рак выбран из солидной опухоли, карциномы головного мозга, карциномы почки, карциномы печени, карциномы надпочечников, карциномы мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы пищевода, карциномы яичников, карциномы толстой кишки, карциномы прямой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, карциномы влагалища, карциномы щитовидной железы, саркомы, глиобла-стом, множественной миеломы или желудочно-кишечного рака, опухоли шеи, опухоли головы, сквамоз-но-клеточной карциномы, хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинской лимфомы, плазменно-клеточной миеломы, лимфомы Ходжкина или лейкоза.
20. Применение по п.18, где рак выбран из солидной опухоли, карциномы головного мозга, карциномы почки, карциномы печени, карциномы надпочечников, карциномы мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы пищевода, карциномы яичников, карциномы толстой кишки, карциномы прямой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, карциномы влагалища, карциномы щитовидной железы, саркомы, глиобла-стом, множественной миеломы или желудочно-кишечного рака, опухоли шеи, опухоли головы, сквамоз-но-клеточной карциномы, хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинской лимфомы, плазменно-клеточной миеломы, лимфомы Ходжкина или лейкоза.
21. Соединение по любому из пп.1-13 в аморфной форме.
22. Фармацевтическая композиция по п.14 или 15, где указанное соединение находится в аморфной форме.
23. Способ лечения рака, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-13.
24. Способ лечения по п.23, где рак выбран из солидной опухоли, карциномы головного мозга, карциномы почки, карциномы печени, карциномы надпочечников, карциномы мочевого пузыря, карциномы молочной железы, карциномы желудка, карциномы пищевода, карциномы яичников, карциномы толстой кишки, карциномы прямой кишки, карциномы предстательной железы, карциномы поджелудочной железы, карциномы легкого, карциномы влагалища, карциномы щитовидной железы, саркомы, глиобла-стом, множественной миеломы или желудочно-кишечного рака, опухоли шеи, опухоли головы, сквамоз-но-клеточной карциномы, хронического лимфоцитарного лейкоза, неходжкинской лимфомы, плазменно-клеточной миеломы, лимфомы Ходжкина или лейкоза.
14.
14.
14.
14.
14.
14.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
026031
026031
- 1 -
- 1 -
(19)
026031
026031
- 1 -
- 1 -
(19)
026031
026031
- 4 -
- 3 -
(19)
026031
026031
- 4 -
- 4 -
026031
026031
- 4 -
- 4 -
026031
026031
- 6 -
- 6 -
026031
026031
- 6 -
- 6 -
026031
026031
- 6 -
- 6 -
026031
026031
- 6 -
- 6 -
026031
026031
- 7 -
- 7 -
026031
026031
- 7 -
- 7 -
026031
026031
- 7 -
- 7 -
026031
026031
- 7 -
- 7 -
026031
026031
- 7 -
- 7 -
026031
026031
- 7 -
- 7 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 8 -
- 8 -
026031
026031
- 9 -
- 9 -
026031
026031
- 10 -
- 10 -
026031
026031
- 11 -
- 11 -
026031
026031
- 12 -
- 12 -
026031
026031
- 12 -
- 12 -
026031
026031
- 13 -
- 13 -
026031
026031
- 16 -
- 16 -
026031
026031
- 16 -
- 16 -
026031
026031
- 17 -
- 17 -
026031
026031
- 17 -
- 17 -
026031
026031
- 17 -
- 17 -
026031
026031
- 17 -
- 17 -
026031
026031
- 30 -
- 30 -
026031
026031
- 31 -
- 31 -
026031
026031
- 37 -
026031
026031
- 40 -
- 40 -
026031
026031
- 42 -
026031
026031
- 45 -
- 45 -
026031
026031
- 55 -
026031
026031
- 58 -
- 58 -
026031
026031
- 60 -
- 60 -
026031
026031
- 66 -
- 66 -
026031
026031
- 66 -
- 66 -
026031
026031
- 68 -
- 68 -
026031
026031
- 70 -
- 70 -
026031
026031
- 70 -
- 70 -
026031
026031
- 70 -
- 70 -
026031
Биохимический анализ PI3Ka
026031
Биохимический анализ PI3Ka
- 75 -
- 75 -
026031
Биохимический анализ РВКр
026031
Биохимический анализ РВКр
- 76 -
- 76 -
026031
Биохимический анализ PI3K5
026031
Биохимический анализ PI3K5
- 77 -
- 77 -
026031
Биохимический анализ РВКу
026031
Биохимический анализ РВКу
- 78 -
- 78 -
026031
Клеточный анализ PI3Ka
026031
Клеточный анализ PI3Ka
- 79 -
- 79 -
026031
Клеточный анализ РВКр
026031
Клеточный анализ РВКр
- 80 -
- 80 -
026031
Клеточный анализ PI3K5
026031
Клеточный анализ PI3K5
- 81 -
- 81 -
026031
Клеточный анализ mTOR
026031
Клеточный анализ mTOR
- 82 -
- 82 -
026031
026031
- 83 -
- 83 -
026031
026031
- 84 -
- 84 -
026031
026031
- 85 -
- 85 -
026031
026031
- 89 -
- 89 -
026031
026031
- 90 -
- 90 -
026031
026031
026031
026031
- 93 -
- 93 -