EA 026022B1 20170228 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/026022 Полный текст описания [**] EA201390681 20111110 Регистрационный номер и дата заявки CUP/2010/216 20101112 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок CU2011/000007 Номер международной заявки (PCT) WO2012/062228 20120518 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21702 Номер бюллетеня [**] ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ IL-2 С АГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Название документа [8] C07K 14/55, [8] A61K 38/20 Индексы МПК [CU] Леон Монсон Калет, [CU] Карменате Портилла Таня, [CU] Перес Родригес Саумель, [CU] Энаморадо Эскалона Нерис Мичель, [CU] Лахе Давила Агустин Бьенвенидо Сведения об авторах [CU] СЕНТРО ДЕ ИНМУНОЛОГИА МОЛЕКУЛАР Сведения о патентообладателях [CU] СЕНТРО ДЕ ИНМУНОЛОГИА МОЛЕКУЛАР Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000026022b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Выделенный полипептид, являющийся агонистом по отношению к IL-2, проявляющий повышенное иммуностимулирующее и противоопухолевое действие по сравнению с нативным IL-2 и имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична на 95% последовательности нативного IL-2 и которая выбрана из SEQ ID NO. 1 (содержит мутации R38K, F42I, Y45N, E62L и E68V); SEQ ID NO. 2 (содержит мутации R38K, F42Q, Y45E и E68V); SEQ ID NO. 3 (содержит мутации R38A, F42I, Y45N, E62L и E68V); SEQ ID NO. 4 (содержит мутации R38K, F42K, Y45R, E62L и E68V); SEQ ID NO. 5 (содержит мутации R38K, F42I, Y45E и E68V); SEQ ID NO. 6 (содержит мутации R38A, F42A, Y45A и Е62А).

2. Слитый белок, содержащий полипептид по п.1, соединенный с белком-носителем.

3. Слитый белок по п.2, где белок-носитель представляет собой альбумин.

4. Слитый белок по п.2, где белок-носитель представляет собой Fc-область иммуноглобулинов человека.

5. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая полипептид по п.1 в качестве активного ингредиента.

6. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая слитый белок по любому из пп.2-4 в качестве активной основы.

7. Применение полипептида по п.1 для лечения рака.

8. Применение слитого белка по любому из пп.2-4 для лечения рака.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Выделенный полипептид, являющийся агонистом по отношению к IL-2, проявляющий повышенное иммуностимулирующее и противоопухолевое действие по сравнению с нативным IL-2 и имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична на 95% последовательности нативного IL-2 и которая выбрана из SEQ ID NO. 1 (содержит мутации R38K, F42I, Y45N, E62L и E68V); SEQ ID NO. 2 (содержит мутации R38K, F42Q, Y45E и E68V); SEQ ID NO. 3 (содержит мутации R38A, F42I, Y45N, E62L и E68V); SEQ ID NO. 4 (содержит мутации R38K, F42K, Y45R, E62L и E68V); SEQ ID NO. 5 (содержит мутации R38K, F42I, Y45E и E68V); SEQ ID NO. 6 (содержит мутации R38A, F42A, Y45A и Е62А).

2. Слитый белок, содержащий полипептид по п.1, соединенный с белком-носителем.

3. Слитый белок по п.2, где белок-носитель представляет собой альбумин.

4. Слитый белок по п.2, где белок-носитель представляет собой Fc-область иммуноглобулинов человека.

5. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая полипептид по п.1 в качестве активного ингредиента.

6. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая слитый белок по любому из пп.2-4 в качестве активной основы.

7. Применение полипептида по п.1 для лечения рака.

8. Применение слитого белка по любому из пп.2-4 для лечения рака.


Евразийское 026022 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201390681
(22) Дата подачи заявки
2011.11.10
(51) Int. Cl. C07K14/55 (2006.01) A61K38/20 (2006.01)
(54) ПРОИЗВОДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ IL-2 С АГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
(31) P/2010/216
(32) 2010.11.12
(33) CU
(43) 2013.08.30
(86) PCT/CU2011/000007
(87) WO 2012/062228 2012.05.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
СЕНТРО ДЕ ИНМУНОЛОГИА МОЛЕКУЛАР (CU)
(72) Изобретатель:
Леон Монсон Калет, Карменате Портилла Таня, Перес Родригес Саумель, Энаморадо Эскалона Нерис Мичель, Лахе Давила Агустин Бьенвенидо (CU)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A2-2008003473 WO-A2-2005007121 US-A1-2004175357 WO-A2-2009061853
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к иммунологии. Оно относится, в частности, к терапевтической модуляции иммунной системы посредством аналогов натуральной молекулы, которые производят агони-стическое действие на исходную молекулу, но неожиданно проявляют превосходную терапевтическую эффективность.
Уровень техники
Интерлейкин 2 (IL-2) стал первым фактором роста, описанным для Т-клеток. После его открытия исследовали его способность активировать пролиферацию и жизнеспособность Т-клеток in vitro (K.A. Smith, Science, 1988 г., т. 240, с. 1169-76), а также усиливать иммунный ответ по отношению к Т-вирусным инфекциям (J.N. Blattman, и др., Nat. Med., 2003 г., т. 9, с. 540-7) или вакцинам (М. Fishman и др., J. Immunother., 2008 г., т. 31, с. 72-80; С. Kudo-Saito и др., Cancer Immunol. Immunother., 2007 г., т. 56, с. 1897-910; С.Т. Lin и др., Immunol. Lett., 2007 г., т. 114, с. 86-93). Однако эту классическую роль IL-2 в качестве активатора Т-иммунного ответа поставили под вопрос многочисленные экспериментальные данные (A.R. Almeida и др., J. Immunol., 2002 г., т. 169, с. 4850-60; М. de la Rosa и др., Eur. J. Immunol., 2004 г., т. 34, с. 2480-8; Т^. Malek и др., Nat. Rev. Immunol., 2004 г., т. 4, с. 665-74), показывающие, что этот цитокин представляет собой гомеостатический фактор роста для натуральных регуляторных Т-клеток CD4+CD25+FoxP3+(Treg). Кроме того, интерлейкин 2 предложен в качестве основного участника механизма, посредством которого регуляторные Т-клетки подавляют активность и размножение других эффекторных клеток, таких как хелперные Т-клетки CD4, цитотоксичные Т-клетки CD8 и натуральные киллерные клетки (NK). В частности, недавно сделано предположение, что регуляторные Т-клетки подавляют другие Т-клетки, вызывая местное снижение уровней IL-2 (P. Pandiyan и др., Nat. Immunol., 2007 г., т. 8, с. 1353-1362). Основу этого эффекта подавления представляют собой: а) их способность непосредственно ингибировать эффекторные Т-клеток в производстве нового IL-2 (A.R. Almeida и др., J. Immunol., 2002 г., т. 169, с. 4850-60; Т. Takahashi и др., Int. Immunol., 1998 г., т. 10, с. 1969-80; А.М. Thornton и др., J. Exp. Med., 1998 г., т. 188, с. 287-96; М. Wolf и др., Eur. J. Immunol., 2001 г., т. 31, с. 1637-45); b) их способность быстро улавливать, интернализировать и разлагать IL-2, присутствующий в их микросреде (P. Pandiyan и др., Nat. Immunol., 2007 г., т. 8, с. 1353-62) и с) их способность к чрезмерной экспрессии альфа-цепи рецептора IL-2 (Y. Kuniyasu и др., Int. Immunol., 2000 г., т. 12, с. 1145-1155), что обеспечивает более эффективное использование IL-2, когда его концентрации являются низкими.
Таким образом, IL-2 представляет собой высокоплейотропный цитокин, который имеет очень большое значение в биологической активности различных клеточных популяций. Данное свойство превращает IL-2 в важный центр регуляции иммунного ответа, делая его привлекательной целью для лечения и комплексной иммуномодуляции.
В течение ряда лет IL-2 использовали в лечении рака. В частности, его использование в высоких дозах представляет собой разрешенное в нескольких странах лечение метастатической меланомы и карциномы клеток почек. Однако непосредственное использование IL-2 пациентами серьезно ограничено его токсичным действием и низкой эффективностью. Поэтому только 20% соответствующих пациентов получают лечение на основе IL-2, и только 17% из подвергнутых этому лечению пациентов показывают объективный ответ. Вероятное объяснение такой выраженной неудачи в клиническом исследовании заключается в том, что лечение нативным IL-2 также стимулирует популяции регуляторных Т-клеток (М. Ahmadzadeh и др., Blood, 2006 г., т. 107, с. 2409-14), что ослабляет желательную иммуностимуляцию. В настоящее время многочисленные данные доклинических исследований подтверждают эту идею. В частности, эксперименты на мышиных моделях показывают, что первичная активность введенного IL-2 in vivo представляет собой гомеостатическое размножение натуральных регуляторных Т-клеток.
Разработано несколько стратегий для ослабления токсических эффектов лечения IL-2. Некоторые из этих стратегий основаны на использовании мутированных вариантов IL-2, предназначенных для увеличения способности этой молекулы передавать сигнал, главным образом, через имеющий высокое сродство рецептор (альфа-, бета-и гамма-цепи), а не через имеющий промежуточное сродство рецептор (бета- и гамма-цепи). Основная идея заключается в том, чтобы активировать передачу сигнала в Т-клетках вместо передачи сигналов в NK-клетках, которые считаются ответственными за наблюдаемые токсические эффекты. Этому направлению работы соответствуют следующие изобретения: патенты США №№ 7186804, 7105653, 6955807, 5229109 и патентная заявка США № 20050142106. Важно отметить, что ни одно из данных изобретений не относится к мутеинам IL-2, которые проявляют более высокую терапевтическую эффективность, чем нативный IL-2 in vivo, на основании своей пониженной способности стимулировать натуральные регуляторные Т-клетки.
Другие мутированные варианты IL-2 созданы с целью увеличения их фармакологической активности, например, путем улучшения укладки или увеличения продолжительности существования в крови. Помимо прочих этому направлению работы соответствуют следующие изобретения: патенты США №№ 4959314, 5116943 и 4853332. Снова ни одни из этих мутеинов не проявляет уменьшения способности активировать регуляторные Т-клетки и не проявляет более высокую терапевтическую эффективность.
Наконец, следует упомянуть, что в литературе опубликованы многочисленные предложения лекарственных средств (R.J. Kreitman, Curr. Pharm. Des., 2009 г., т. 15, с. 2652-64; М^. Litzinger, R. Fernando,
ТХ Curiel, Т.J. Grosenbach, J. Schlom и С. Palena, Blood, 2007 г., т. 110, с. 3192-201; М.А. Morse, А.С. Hobeika, Т. Osada, D. Serra, D. Niedzwiecki, H.K.Lyerly и Т.М. Clay, Blood, 2008 г., т. 112, с. 610-8; S. Oni-zuka, I. Tawara, J. Shimizu, S. Sakaguchi, T. Fujita и Е. Nakayama, Cancer Res. 1999 г., т. 59, с. 3128-33; S.A. Quezada, K.S. Peggs, M.A. Curran и J.P. Allison, J. Clin. Invest., 2006 г., т. 116, с. 1935-45), которые должны модулировать или уменьшать активность регуляторных Т-клеток in vivo. Эти лекарственные средства были исследованы на подопытных животных или даже на пациентах в целях непосредственного лечения рака или усиления эффекта вакцин. Кроме того, опубликованы некоторые сообщения, в которых предложено модулировать активность IL-2 в определенных моноклональных антителах (О. Boyman, M. Kovar, M.P. Rubinstein, CD. Surh и J. Sprent, Science, 2006 г., т. 311, с. 1924-1927; О. Boyman и др., Expert Opin. Biol. Ther., 2006 г., т. 6, с. 1323-31; D. Kamimura и др., J. Immunol., 2006 г., т. 177, с. 306-14; М. Murakami, A. Sakamoto, J. Bender, J. Kappler и Р. Marrack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2002 г., т. 99, с. 8832-7; JX Tomala, H. Chmelova, Т. Mrkvan, В. Rihova и М. Kovar, J. Immunol., 2009 г., т. 183, с. 4904-4912), чтобы активировать лучшие или более эффективные иммунные ответы. Насколько известно авторам настоящего изобретения, однако, в литературе отсутствуют основанные на мутированных вариантах IL-2 сообщения, показывающие возможность получения более высокой терапевтической эффективности за счет уменьшения способности стимулировать натуральные регуляторные Т-клетки.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к получению мутированных вариантов IL-2, которые проявляют более высокую терапевтическую эффективность, чем нативный IL-2, в моделях, пригодных для трансплантации мышиных опухолей.
Эти мутеины отличаются тем, что они являются частичными агонистами активности IL-2 и выбраны вследствие своей особенно низкой способности стимулировать натуральные регуляторные Т-клетки (Т CD4+CD25+FoxP3+) in vitro и/или in vivo. Терапевтическая эффективность этих мутеинов in vivo обеспечивает практическое решение задачи улучшения лечения злокачественных опухолей с помощью IL-2. В частности, эти мутеины открывают путь к преодолению ограничений, наблюдаемых в лечении нативным IL-2, которые возникают в результате того, что они способствуют размножению натуральных регуляторных Т-клеток in vivo. Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые имеют общую первичную последовательность с IL-2 человека, за исключением нескольких аминокислот, которые подверглись мутациям. Эти мутации приводят к существенному уменьшению способности данных полипептидов стимулировать in vitro и in vivo регуляторные Т-клетки (Т CD4+CD25+FoxP3+) и придают IL-2 более высокую эффективность в лечении пригодных для трансплантации опухолей мышей. Настоящее изобретение также включает терапевтические применения этих мутированных вариантов индивидуально или в сочетании с вакцинами для лечения заболеваний, таких как рак или инфекции, где имеет значение активность регуляторных Т-клеток (Treg).
В частности, изобретение включает выделенный полипептид, являющийся агонистом по отношению к IL-2, проявляющий повышенное иммуностимулирующее и противоопухолевое действие по сравнению с нативным IL-2 и имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична на 95% последовательности нативного IL-2 и которая выбрана из
SEQ ID NO. 1 (содержит мутации R38K, F42I, Y45N, E62L и E68V);
SEQ ID NO. 2 (содержит мутации R38K, F42Q, Y45E и E68V);
SEQ ID NO. 3 (содержит мутации R38A, F42I, Y45N, E62L и E68V);
SEQ ID NO. 4 (содержит мутации R38K, F42K, Y45R, E62L и E68V);
SEQ ID NO. 5 (содержит мутации R38K, F42I, Y45E и E68V);
SEQ ID NO. 6 (содержит мутации R38A, F42A, Y45A и Е62А).
Изобретение также относится к слитому белку, содержащему данный полипептид, соединенный с белком-носителем.
Предпочтительно белок-носитель представляет собой альбумин.
В другом варианте осуществления белок-носитель может представлять собой Fc-область иммуноглобулинов человека.
Далее, изобретение относится к фармацевтической композиции для применения для лечения рака, содержащей вышеприведенный полипептид в качестве активного ингредиента.
Дополнительно, изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей слитый белок по изобретению в качестве активной основы.
Кроме того, изобретение включает применение полипептида по изобретению для лечения рака.
Далее, изобретение включает применение слитого белка по изобретению для лечения рака.
Настоящее изобретение обеспечивает существенное улучшение современных стратегий иммуномо-дуляции на основе IL-2, в том числе в непосредственном лечении рака и в сочетании с различными вакцинами. В частности, замена нативного IL-2 мутированными вариантами, описанными в настоящем документе, предотвращает размножение регуляторных Т-клеток, которые заметно уменьшают желательные терапевтические эффекты.
Подробное описание изобретения
Получение полипептидных аналогов IL-2.
Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим в цепи от 100 до 500 аминокислотных остатков, предпочтительно 140 аминокислотных остатков, и их эффективная молекулярная масса составляет по меньшей мере 15000. Эти полипептиды сохраняют высокую степень идентичности последовательности с нативным IL-2, которая составляет более чем 90%. В отношении своей последовательности они содержат от 3 до 6 мутаций по сравнению с нативным IL-2. В данных положениях эти полипептиды являются мутированными, включая аминокислотные остатки, отличающиеся от аминокислотных остатков, занимающих соответствующие положения в нативном IL-2. Аминокислоты, которые замещают исходные аминокислотные остатки, выбирают таким образом, что они имеют физико-химические свойства, значительно отличающиеся от свойств исходных аминокислот, заменяя полярные остатки неполярными, незаряженные остатки заряженными, большие остатки малыми, кислотные остатки основными, помимо других изменений.
Полипептиды согласно настоящему изобретению могут называться, помимо прочего, терминами "иммуномодулирующие полипептиды", "аналоги IL-2" или "мутеины IL-2". Эти полипептиды построены на основе трехмерной структуры рецепторного комплекса IL-2 (имеется в общественной базе данных PDB), и содержат мутации, главным образом, в положениях IL-2, соответствующих аминокислотам, на которые в значительной степени воздействует растворитель и которые являются в высокой степени устойчивыми в IL-2 различных видов (последовательности получены из швейцарской базы данных белков Swissprot). Находящиеся под воздействием растворителя аминокислоты вышеупомянутого типа определяют, используя биоинформационное программное обеспечение для визуализации белковых структур, такое как RASMOL, SwissPDBviewer или другое. Сохраненные положения в последовательности IL-2 определяли, используя биоинформационное программное обеспечение для множественной модификации последовательности, например Fasta, ClusterW или другое.
Полипептиды согласно настоящему изобретению можно получать, используя разнообразные стратегии, в том числе путем синтеза белка. Их можно также получать, используя генно-инженерные технологии, например, путем их экспрессии в бактериях, таких как кишечные палочки (Е. coli) или другие бактерии, а также в клетках млекопитающих, таких как клетки NS0 или другие клетки млекопитающих. Точечные мутации в определенных положениях можно также получать, используя методы точечно-направленного мутагенеза посредством анализа с полимеразной цепной реакцией (PCR).
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили существенное преимущество этих му-теинов по сравнению с традиционным использованием нативного IL-2. Данное преимущество представляет собой их повышенная эффективность в лечении опухолей, обусловленная их способностью препятствовать размножению регуляторных Т-клеток.
Выбор полипептидных аналогов IL-2 с точки зрения биологической активности.
Полипептиды согласно настоящему изобретению выбирают, учитывая следующие свойства:
1) Агонистическое действие нативного IL-2. Данное свойство можно оценивать непосредственно путем исследования in vitro пролиферации линий клеток, зависимых от IL-2, таких как CTLL2 или Kitt225, или путем исследования смесей Т-лимфоцитов мыши и/или человека. Эти мутеины должны обладать удельной стимулирующей активностью, являющейся в 5-50 раз меньше, чем активность нативно-го IL-2 в данных исследованиях.
2) Потеря способности по сравнению с нативным IL-2 стимулировать in vitro и/или in vivo популяции регуляторных Т-клеток. Данное свойство можно оценивать, например, исследуя способность мутеи-нов согласно настоящему изобретению, по сравнению со способностью нативного IL-2 непосредственно индуцировать размножение Т-клеток CD4+CD25+, выделенных у не подвергнутых экспериментам мышей, используя in vitro антитело анти-CD3. Его можно также исследовать, вводя мышам внутриперито-неально или подкожно эти мутеины или нативный IL-2 в течение пяти суток и оценивая воздействие на размножение или увеличение скорости пролиферации популяций регуляторных Т-клеток (TCD4+CD25+FoxP3+). Активность мутированного IL-2 по отношениям к клеткам Treg должна быть по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем у нативного IL-2 в этих исследованиях.
3) Увеличение терапевтического эффекта на подопытных животных по сравнению с нативным IL2. Данное свойство можно оценивать, например, сравнивая противоопухолевый или противометастатиче-ский эффект мутеинов и нативного IL-2 в качестве монотерапии на моделях пригодных для трансплантации опухолей (например, меланомы В16). Его можно также оценивать через потенцирующий эффект клеточного и/или гуморального ответа на исследуемую вакцину. Мутеины должны проявлять более высокую терапевтическую эффективность, чем нативный IL-2, в дозах, содержащих равную суммарную массу белков IL-2 и мутеина.
Настоящее изобретение относится, в частности, к мутеинам, представленным в табл. 1. Эти мутеины содержат множество замещений аминокислот, которые придают им вышеупомянутые свойства.
Таблица 1
Модифицированные мутеины, имеющие три основных свойства, описанных в настоящем патенте. Мутации представлены согласно нумерации IL-2 человека
Мутации
R38K, F42I, Y45N, E62L, E68V
R38K, F42Q, У45Е, E68V
R38A, F42I, Y45N, E62L, E88V
R38K, F42K, Y45R, E62L, E68V R38K, F42I, Y45E, E68V
|R38A, F42A, Y45A, Е62А |
Настоящее изобретение также включает дополнительные модификации по отношению к классу вышеупомянутых мутеинов IL-2 и, в частности, по отношению к тем, которые описаны в табл. 1. Они сделаны, чтобы усилить их сродство к определенным компонентам рецептора IL-2, но без влияния или даже улучшения его агонистической природы, которая не стимулирует регуляторные Т-клетки, или чтобы улучшить их фармакодинамику in vivo: увеличение периода полувыведения или уменьшение их ин-тернализации Т-клетками. Эти дополнительные мутации можно получать путем рационального проектирования, используя биоинформационные средства или применяя комбинаторные молекулярные библиотеки различного характера (библиотеки фагов, библиотеки экспрессии генов в дрожжах или бактериях). В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему какие-либо из описанных выше иммуномодулирующих полипептидов в сочетании с белком-носителем. Белок-носитель может представлять собой альбумин или Fc-область иммуноглобулинов человека.
Терапевтическое применение полипептидного аналога IL-2.
Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента мутеины IL-2 и его аналоги, описанные средствами настоящего изобретения, и их потенциальные терапевтические применения для усиления натурального или индуцированного вакцинами иммунного ответа в случае заболеваний, таких как рак или хронические инфекции, где регуляторные Т-клетки имеют особое значение.
Для его терапевтического применения полипептид согласно настоящему изобретению следует вводить страдающему заболеванием пациенту независимо или в сочетании с другими полипептидами или другими веществами, которые способствуют его терапевтическому действию или усиливаю его. Способ данного введения может представлять собой любой способ введения, описанный на современном уровне техники для парентерального применения лекарственных средств. Предпочтительно введение следует осуществлять внутривенно, внутримышечно, подкожно или непосредственно в опухоль.
Полипептиды, описанные в настоящем документе, можно также вводить как часть фармацевтической композиции, которую используют для лечения рака и хронических инфекционных заболеваний или для усиления клеточного и/или гуморального ответа на вакцины, в качестве замены нативного IL2. Полипептиды согласно настоящему изобретению можно использовать в сочетании с вакцинами для лечения рака или с вакцинами для профилактики инфекционных заболеваний, где имеют значение регуляторные Т-клетки.
Для получения желательного терапевтического эффекта полипептид согласно настоящему изобретению следует вводить в достаточно высоких дозах, чтобы обеспечивать его концентрацию в периферическом лимфатическом узле или в периферической области, имеющей отношение к исследуемому заболеванию в интервале концентраций, при которых мутеин проявляет иммуностимулирующий эффект. Таким образом, рассматриваемую дозу следует регулировать в зависимости от исследуемого типа заболевания и способа введения. Например, в случае лечения опухоли дозу следует устанавливать для создания концентрации мутеина внутри опухоли и/или в локорегионарном лимфатическом узле на таком уровне, чтобы обеспечивать стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа. Интервал доз для исследования может составлять от сотен микрограммов до сотен миллиграммов на дозу. Для применений, в которых мутеин заменяет традиционное лечение нативным IL-2, используемая доза мутеина должна иметь меньшую или эквивалентную активность (определяемую в ходе анализа с использованием линии клеток CTLL2) по сравнению с активностью традиционно используемого нативного IL-2.
Используемое число введений также следует устанавливать в соответствии с биологическим распределением исследуемого мутеина. Как правило, вышеупомянутые эффективные уровни следует поддерживать в течение от 2 до 30 суток подряд. Следует отметить, например, что если мутеин сочетается с белком-носителем, то частоту его введения необходимо устанавливать соответствующим образом. Для применений, в которых заменяют нативный IL-2, схема введения мутеина может быть аналогичной схеме, которую используют в традиционном лечении.
Терапевтическое действие следует понимать как полное или частичное прекращение симптомов заболевания. В случае рака критерий прекращения (ремиссии) заболевания представляет собой, помимо прочих, уменьшение объема опухоли или увеличение времени до рецидива.
Полипептиды согласно настоящему изобретению являются особенно полезными для лечения опухолей, таких как меланомы и почечные опухоли.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Получение мутеина.
a) Экспрессия мутеина в штамме BL21DE3 Е. coli, определяемая методом электрофореза в содержащем додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE): полоса 1 представляет сумму белков штамма BL21DE3, отрицательный контроль экспрессии; полосы 2 и 3 представляют два примера уровней экспрессии, достигаемых в данном штамме; стрелка показывает линию, соответствующую му-теину.
b) Обращенно-фазная хроматограмма, представляющая основную заключительную стадию очистки белка, стрелка показывает пик, соответствующий рассматриваемому белку.
c) Очистка мутеина, определяемая хроматографией в SDS-PAGE: полоса 1 представляет результаты процесса выделения внутриклеточного тельца; полоса 2 представляет мутеин, полученный после очистки методом обращенно-фазной хроматографии.
Фиг. 2. Исследование агонистической природы мутеина IL-2.
a) Измерение методом проточной цитометрии способности мутеина прикрепляться к поверхности клеток линии CTLL2. Как IL-2, так и мутеин определяли, используя антителомаскирующий иммунофер-ментный анализ с анти-6His.
b) График представляет способность мутеина индуцировать пролиферацию зависимой от IL-2 линии Т-клеток CTLL2 по сравнению с нативным IL-2. Пролиферацию измеряли путем введения МТТ.
Фиг. 3. Мутеин не индуцирует in vitro пролиферацию регуляторных Т-клеток.
a) График проточной цитометрии, показывающий чистоту популяции клеток CD3+CD4+CD25+, выделенной из лимфатических узлов мыши линии C57BL/6.
b) Регуляторные Т-клетки стимулировали in vitro маскирующее антитело анти-CD3, и в них вводили нативный IL-2 в концентрации 0,5 нг/мл или мутеин в концентрации 32 нг/мл в течение 72 ч; график представляет число живых клеток, обнаруженных после каждой обработки, по сравнению с контрольным исследованием, в котором цитокин не вводили. Выбранные концентрации соответствуют концентрации, в которой каждая молекула индуцирует одинаковую пролиферацию клеток линии CTLL2.
Фиг. 4. Оценка эффекта лечения мутеином на пролиферацию клеточных популяций.
a) Количественное определение относительной массы селезенки мышей, которым вводили мутеин в
течение пяти суток. Масса селезенки получавших лечение мышей статистически превышала массу селе-
зенки мышей контрольной группы. Использовали непараметрический анализ Краскела-Уоллиса (Kruskal-
Wallis) и множественное сравнение Данна (Dunn).
b) Измерение популяции Т-клеток CD8+; график представляет процентные доли данной популяции.
Фиг. 5. Мутеин является более эффективным, чем нативный IL-2, для сокращения метастаз в экспе-
риментальной метастатической модели меланомы линии MB16F0.
a) Представительные фотографии легких для каждого вида лечения.
b) Количественное определение легочных метастаз в каждой группе.
Фиг. 6. Лечение сочетанием мутеина и вакцины OVA/VSSP потенцирует противоопухолевый эффект вакцины. Имеющим опухоли мышам вводили вакцину OVA/VSSP индивидуально или в сочетании с мутеином. График представляет кривые роста опухолей, причем группа, которой вводили указанное сочетание, показывает статистически более значительное уменьшение опухолей по сравнению с контрольной группой.
Примеры
Пример 1. Проектирование мутеинов IL-2.
Мутеины проектировали вычислительным путем, используя биоинформационные методы, на основе структуры IL-2 человека, описанной в банке данных белков PDB (Protein Data Bank), и аминокислотных последовательностей IL-2 разнообразных видов, которые представлены в базе данных Swissprot. Некоторые мутеины проектировали, включая от 3 до 6 мутаций (вводя неконсервативные аминокислотные замещения) в открытых для растворителя высококонсервативных остатках. Эти мутеины подвергали экспрессии в Е. coli из конструкции на основе плазмидного вектора рЕТ28а, включающей целевую последовательность из шести гистидиновых остатков на аминном конце. Мутеины очищали обращенно-фазной хроматографией (фиг. 1), и получали высокую чистоту (более 95%). Полученные мутеины выбирали согласно их свойствам в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать три основных свойства, представленные в описании настоящего изобретения. Из всех спроектированных мутеинов табл.1 описывает набор определенных мутаций, которые обеспечивают желательное свойство для агонистов активности IL-2 без ощутимой стимуляции регуляторных Т-клеток и демонстрируют более высокую терапевтическую эффективность по сравнению с IL-2 в лечении пригодных для трансплантации мышиных опухолей. Табл.2 представляет другие спроектированные мутеины, которые
не проявляли желательных свойств.
Таблица 2
Спроектированные мутеины, не обладающие основными свойствами, описанными в настоящем патенте. Мутации представлены согласно нумерации IL-2 человека
Мутации
Q22V, Q126A, I129D, S130G
L18N, Q126Y, S130R Q13Y, Q126Y, I129D, S130R
L18N, Q22V, Т123А, I129D, S130R
R38A, F42A.Q126Y, I129D
[Q126Y, I129D, E62L, E68V
Пример 2. Демонстрация агонистического характера спроектированных мутеинов IL-2.
Фиг. 2 иллюстрирует, как представленные в табл.1 мутеины прикрепляются к компонентам рецептора IL-2 на поверхности клеток линии CTLL2 (фиг. 2а). Спроектированные мутеины прикрепляются к клеткам линии CTLL2, которые, как известно, содержат на своей поверхности имеющие как высокое сродство, так и промежуточное сродство рецепторы для IL-2. Связывание, обнаруженное в данных исследованиях, оказывается аналогичным связыванию, полученному с нативным IL-2. Фиг. 2b иллюстрирует способность представленных в табл.1 мутеинов стимулировать рост клеток линии CTLL2 (фиг. 2b). Эти мутеины ведут себя как частичные агонисты активности IL-2 в данном исследовании. Их удельная активность ниже от 5 до 50 раз, чем активность нативного IL-2.
Пример 3. Воздействие мутеинов IL-2 на регуляторные Т-клетки.
Описанные в табл.1 мутеины проявляют очень низкую способность стимулировать регуляторные Т-клетки in vitro (фиг. 3). Как представлено на данном чертеже, нативный IL-2 при этом способен индуцировать сильную пролиферацию регуляторных Т-клеток (Т CD4+CD25+FoxP3+), стимулированных прикрепленным к чашке антителом анти-CD3. Описанные в табл.1 мутеины в массовых концентрациях, значительно превышающих концентрации нативного IL-2, не стимулировали регуляторные Т-клетки. Кроме того, необходимо отметить, что описанные выше результаты являются действительными, даже если количество используемого мутеина увеличивают в такой степени, чтобы использовать количество, эквивалентное по активности нативному IL-2, в исследовании пролиферации клеток линии CTLL2. Описанные в табл.1 мутеины, как правило, проявляют способность стимулировать регуляторные Т-клетки, которая по меньшей мере в 1000 раз ниже, чем способность нативного IL-2.
Пример 4. Исследование иммуностимулирующей активности спроектированных мутеинов in vivo.
Описанные в табл.1 мутеины проявляют повышенную иммуностимулирующую активность in vivo. Фиг. 4а и b представляют, что мутеины индуцируют увеличение селезенки в большей степени, чем на-тивный IL2, при исследовании не бывших в эксперименте мышей после внутриперитонеального введения двух доз в сутки, содержащих 20 мкг мутеина, в течение пяти суток. Эта стимуляция соответствует чистому увеличению популяции эффекторных клеток, таких как Т-лимфоциты CD8+. На основании данных наблюдений можно сделать вывод, что введение этих мутеинов не стимулирует размножение регу-ляторных Т-клеток (Т CD4+CD25+FoxP3+) в отличие от стимуляции, наблюдаемой в случае нативного
IL2 (фиг. 4с и d).
Пример 5. Измерение терапевтической эффективности мутеинов в случае мышиной модели пригодных для трансплантации опухолей.
Доказана повышенная терапевтическая эффективность спроектированных мутеинов в случае мышиной модели пригодных для трансплантации опухолей. Описанные в табл.1 мутеины проявляют повышенную эффективность для лечения легочных метастаз меланомы МВ16 в мышиной модели. Фиг. 5 представляет, что после внутриперитонеального введения двух доз в сутки, содержащих 20 мкг описанных в табл.1 мутеинов, в течение пяти суток наблюдался сильный противометастатический эффект, который отсутствовал в группах, получавших эквивалентные дозы нативного IL-2.
Пример 6. Измерение способности мутеина потенцировать действие противоопухолевой вакцины.
Доказана способность спроектированных мутеинов потенцировать действие противоопухолевой вакцины. Использовали модель первичной опухоли с клетками линии EG7, причем линия опухолевых клеток была генетически модифицирована для экспрессии антигена OVA. Имеющих опухоли мышей иммунизировали антигеном OVA, активированным VSSP, использованным индивидуально или в сочетании с мутеином. Фиг. 6 представляет, что уменьшение роста опухолей происходило в большей степени в случае мышей, которым вводили данное сочетание, чем в случае мышей, которым вводили только вакцину.
1. Выделенный полипептид, являющийся агонистом по отношению к IL-2, проявляющий повышенное иммуностимулирующее и противоопухолевое действие по сравнению с нативным IL-2 и имеющий аминокислотную последовательность, которая идентична на 95% последовательности нативного IL-2 и которая выбрана из
SEQ ID NO. 1 (содержит мутации R38K, F42I, Y45N, E62L и E68V); SEQ ID NO. 2 (содержит мутации R38K, F42Q, Y45E и E68V); SEQ ID NO. 3 (содержит мутации R38A, F42I, Y45N, E62L и E68V); SEQ ID NO. 4 (содержит мутации R38K, F42K, Y45R, E62L и E68V); SEQ ID NO. 5 (содержит мутации R38K, F42I, Y45E и E68V); SEQ ID NO. 6 (содержит мутации R38A, F42A, Y45A и Е62А).
2. Слитый белок, содержащий полипептид по п.1, соединенный с белком-носителем.
3. Слитый белок по п.2, где белок-носитель представляет собой альбумин.
4. Слитый белок по п.2, где белок-носитель представляет собой Fc-область иммуноглобулинов че-
ловека.
5. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая полипептид по п.1 в качестве ак-
тивного ингредиента.
6. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая слитый белок по любому из пп.2-4 в качестве активной основы.
7. Применение полипептида по п.1 для лечения рака.
8. Применение слитого белка по любому из пп.2-4 для лечения рака.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
026022
- 1 -
(19)
026022
- 1 -
(19)
026022
- 1 -
(19)
026022
- 1 -
(19)
026022
- 4 -
(19)
026022
- 7 -
026022
- 11 -
026022
- 12 -