|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Соединение формулы I  в котором R представляет собой H или F; А представляет собой  или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение или соль по п.1, которое представляет собой  3. Соединение по п.2, которое представляет собой  4. Способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли. 5. Способ предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента с риском развития болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли. 6. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 в терапии заболеваний и расстройств, связанных с β-амилоидным (Abeta) пептидом. 7. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 для лечения болезни Альцгеймера. 8. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Соединение формулы I в котором R представляет собой H или F; А представляет собой или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Соединение или соль по п.1, которое представляет собой 3. Соединение по п.2, которое представляет собой 4. Способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли. 5. Способ предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента с риском развития болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп.1-3 или его фармацевтически приемлемой соли. 6. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 в терапии заболеваний и расстройств, связанных с β-амилоидным (Abeta) пептидом. 7. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 для лечения болезни Альцгеймера. 8. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.
Евразийское 026006 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201591491
(22) Дата подачи заявки 2014.03.04
(51) Int. Cl.
C07D 513/04 (2006.01) A61K31/547 (2006.01) A61P25/28 (2006.01)
(54) СОЕДИНЕНИЯ ТЕТРАГИДРОПИРРОЛОТИАЗИНА
(31) 61/776,819 (56) US-A1-2009209755
(32) 2013.03.12 WO-A1-2012098213
(33) US
(43) 2016.01.29
(86) PCT/US2014/020070
(87) WO 2014/143579 2014.09.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US)
(72) Изобретатель:
Грин Стивен Джеймс, Мерготт Дастин Джеймс, Уотсон Брайан Морган, Виннероски Дж. Леонард Ларри (US)
(74) Представитель:
Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Дементьев В.Н., Глухарёва А.О., Карпенко О.Ю., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(57) В изобретении предложено соединение формулы I
где R представляет собой Н или F и А представляет собой
Изобретение относится к новым соединениям тетрагидропирролотиазина, к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, к способам применения указанных соединений для лечения физиологических расстройств и к промежуточным соединениям и способам, пригодным для синтеза указанных соединений.
Изобретение относится к области лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний и расстройств, связанных с р-амилоидным (Abeta) пептидом, нейротоксическим и высоко агрегированным пептидным сегментом белка-предшественника амилоида (АРР). Болезнь Альцгеймера представляет собой тяжелое нейродегенеративное расстройство, которое поражает миллионы пациентов во всем мире. Принимая во внимание утвержденные в настоящее время агенты на рынке, которые обеспечивают только временный симптоматический благоприятный эффект для пациента, существует значительная нереализованная потребность в лечении болезни Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера характеризуется образованием, агрегацией и отложением Abeta в головном мозге. Было показано, что полное или частичное ингибирование р-секретазы (Р-участка фермента, расщепляющего белок-предшественник амилоида; ВАСЕ) оказывает существенное влияние на патологии, связанные с бляшками и зависимые от бляшек, в моделях мышей, на основании чего можно предположить, что даже незначительное снижение уровня Ар-пептида может привести к долговременному значительному снижению объема бляшек и синаптической недостаточности, обеспечивая тем самым значительные терапевтические преимущества, в частности, при лечении болезни Альцгеймера.
В US 2009/0209755 раскрыты конденсированные производные аминодигидротиазина, которые обладают ВАСЕ-ингибирующей активностью и также описаны в качестве подходящих терапевтических агентов для нейродегенеративных заболеваний, вызванных Ар-пептидом, таких как деменция по типу Альцгеймера. Кроме того, в J. Neuroscience, 31(46), cc. 16507-16516 (2011), раскрыт ^)-4-(2,4-дифтор-5-пиримидин-5-илфенил)-4-метил-5,6-дигидро-4И-[1,3]тиазин-2-иламин, ЦНС-активный ингибитор ВАСЕ, вводимый перорально.
Для обеспечения лечения расстройств, опосредованных Abeta-пептидом, таких как болезнь Альц-геймера, желательны ингибиторы ВАСЕ, которые являются эффективными и имеют достаточную проникающую способность в ЦНС. В настоящем изобретении предложены некоторые новые соединения, которые являются эффективными ингибиторами ВАСЕ. Кроме того, в настоящем изобретении предложены некоторые новые соединения с проникающей способностью в ЦНС.
Таким образом, в настоящем изобретении предложено соединение формулы I
или его фармацевтически приемлемая соль.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
В настоящем изобретении также предложен способ предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования ВАСЕ у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования ВАСЕ-опосредованного расщепления белка-предшественника амилоида, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
В настоящем изобретении также предложен способ ингибирования продуцирования Abeta-пептида, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.
Кроме того, в настоящем изобретении предложено соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль для применения в терапии, в частности для лечения болезни Альцгеймера или для предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера. Даже более того, в настоящем изобретении предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера. В
настоящем изобретении также предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера. В настоящем изобретении также предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования ВАСЕ. Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования продуцирования Abeta-пептида.
Кроме того, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения композиция дополнительно содержит один или более других терапевтических агентов. Настоящее изобретение также охватывает новые промежуточные соединения и способы синтеза соединений формулы I.
Умеренное когнитивное нарушение было определено как потенциальная продромальная фаза де-менции, связанной с болезнью Альцгеймера, на основании клинических проявлений и прогрессирования у пациентов, у которых наблюдается умеренное когнитивное нарушение, до деменции Альцгеймера с течением времени. (Morris et al., Arch. Neurol, 58, 397-405 (2001); Petersen et al., Arch. Neurol, 56, 303-308 (1999)). Термин "предотвращение прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера" включает замедление, задержку или обращение прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента.
Предпочтительное соединение представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль, особенно предпочтительно в форме свободного основания.
В настоящем документе термины "лечение" или "лечить" включают подавление, замедление, прекращение или обращение прогрессирования или тяжести существующего симптома или расстройства. В настоящем документе термин "пациент" относится к человеку.
Термин "ингибирование продуцирования Abeta-пептида" обозначает снижение уровней Abeta-пептида у пациента in vivo.
В настоящем документе термин "эффективное количество" относится к количеству или дозе соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, которое при единичном или многократном введении дозы пациенту обеспечивает необходимый эффект у пациента при диагностике или лечении.
Эффективное количество может быть легко определено штатным диагностом, как специалистом в данной области, с применением известных методик и путем наблюдения результатов, полученных в аналогичных условиях. При определении эффективного количества для пациента штатный диагност рассматривает ряд факторов, включая, но не ограничиваясь ими, вид пациента; его размер, возраст и общее состояние здоровья; поражение конкретным заболеванием или расстройством; степень или поражение или тяжесть заболевания или расстройства; ответ индивидуального пациента; конкретное вводимое соединение; способ введения; характеристики биодоступности вводимого препарата; выбранную схему приема; применение сопутствующих лекарственных средств и другие существенные обстоятельства.
Соединения согласно настоящему изобретению в целом эффективны в широком диапазоне доз. Например, дозы в день обычно находятся в диапазоне от примерно 0,01 до примерно 20 мг/кг массы тела. В некоторых случаях уровни дозы ниже нижнего предела вышеуказанного диапазона могут быть более чем достаточными, тогда как в других случаях можно применять еще более высокие дозы с приемлемыми побочными эффектами, и, следовательно, вышеуказанный диапазон доз не предназначен для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно изготавливают в форме фармацевтических композиций, вводимых любым путем, который делает данное соединение биологически доступным, включая пероральный и парентеральный пути. Наиболее предпочтительно такие композиции предназначены для перорального введения. Такие фармацевтические композиции и способы их получения хорошо известны в данной области. (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).
Специалисту в данной области будет понятно, что соединения согласно настоящему изобретению могут существовать в таутомерных формах, как показано на схеме А. В случае, когда в данной заявке приведена любая ссылка на один из конкретных таутомеров соединений согласно настоящему изобретению, следует понимать, что охвачены обе таутомерные формы и все их смеси.
Соединения согласно настоящему изобретению или их соли могут быть получены различными методиками, известными в данной области, некоторые из которых проиллюстрированы ниже на схемах, в способах получения и примерах. Для получения соединений формулы I или их солей конкретные стадии синтеза для каждого из описанных путей могут быть объединены различными способами или в сочетании со стадиями из разных схем. Продукты каждой стадии в приведенных ниже схемах могут быть выделены с помощью традиционных способов, включая экстракцию, выпаривание, осаждение, хроматографию, фильтрование, растирание и кристаллизацию.
Некоторые стереохимические центры не определены, и некоторые заместители на следующих схемах были исключены для целей ясности и не предназначены для ограничения схем каким-либо образом. Более того, отдельные изомеры, энантиомеры или диастереомеры могут быть выделены или разделены любым специалистом в данной области в любой удобной точке в синтезе соединений формулы I такими способами, как селективные методики кристаллизации или хиральной хроматографии (см., например, J. Jacques et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Обозначения "изомер 1" и "изомер 2" относятся к соединениям, которые элюируются посредством хиральной хроматографии в первую и вторую очередь, соответственно, и если хиральную хроматографию проводят в начале синтеза, то же самое обозначение применяют к последующим промежуточным соединениям и примерам. Кроме того, промежуточные соединения, описанные в следующих схемах, содержат ряд защитных групп азота. Переменная защитная группа может быть одинаковой или различной в каждом случае в зависимости от конкретных условий реакции и конкретных преобразований, которые должны быть проведены. Условия для введения защиты и снятия защиты хорошо известны специалистам в данной области и описаны в литературе (см., например, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007).
Специалисту в данной области будет понятно, что соединения согласно настоящему изобретению состоят из ядра, содержащего по меньшей мере два хиральных центра.
Схема В
Несмотря на то что настоящее изобретение предусматривает все индивидуальные энантиомеры, а также смеси энантиомеров указанных соединений, включая рацематы, соединения с абсолютной конфигурацией при атомах углерода, отмеченных 1 и 2, как показано на схеме В, являются предпочтительными соединениями согласно настоящему изобретению.
Аббревиатуры, используемые в настоящем документе, определены согласно Aldrichimica Acta, Vol. 17, No. 1, 1984. Другие аббревиатуры определены следующим образом: "АРР" относится к белку-предшественнику амилоида; "ВОС" относится к трет-бутилоксикарбонилу; "CSF" относится к спинномозговой жидкости; "DCC" относится к 1,3-дициклогексилкарбодиимиду; "DIC" относится к диизопро-пилкарбодиимиду; "DMEM" относится к среде игла, модифицированной по способу Дульбекко; "ДМСО" относится к диметилсульфоксиду; "EDCI" относится к 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлориду; "ее" относится к энантиомерной чистоте; "EtOAc" относится к этилацетату; "Ех" относится к примеру; "F12" относится к среде Хама F12; "FBS" относится к фетальной бычьей сыворотке; "FRET" относится к резонансному переносу энергии флуоресценции; "HEK" относится к эмбриональной почке человека; "НОАс" относится к уксусной кислоте; "HOAt" относится к 1-гидрокси-7-азобензотриазолу; "HOBt" относится к 1-гидроксилбензотриазола гидрату; "HPLC" относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии; "ч" относится к часу или часам; "IC50" относится к концентрации агента, которая вызывает 50% от максимального ингибирующего ответа, возможного для данного агента; "мин" относится к минуте или минутам; "МТВЕ" относится к метил-трет-бутиловому эфиру; "PDAPP" относится к белку-предшественнику амилоида, полученному из тромбоцитов; "Prep" относится к способу получения; "RFU" относится к относительной единице флуоресценции; "R" относится к времени удерживания; "RT" относится к комнатной температуре; "SCX" относится к обмену сильными катионами; "SFC" относится к сверхкритической жидкостной хроматографии; и "ТГФ" относится к тетра-гидрофурану.
В приведенных ниже схемах все заместители, если не указано иное, являются такими, как определено ранее. Реагенты и исходные материалы в целом легко доступны специалисту в данной области. Другие могут быть получены с помощью стандартных методик химии органических и гетероцикличе
ских соединений, которые аналогичны синтезу известных соединений с аналогичной структурой, и методик, описанных в способах получения и примерах, которые следуют далее, включая любые новые процедуры.
Схема 1
На схеме 1 показано образование оксимов (4) и (8). Каждый из оксимов может быть использован для образования бициклического изоксазола (5). Замещенная ароматическая группа может быть введена в любых точках синтеза, как показано на схеме 1, стадия 1 и стадия 7. "PG" представляет собой защитную группу, разработанную для аминогруппы, такую как карбаматы и аллил. Такие группы хорошо известны и приняты в данной области.
В реакции на стадии 2 кетон с бета галогеном (1) может быть алкилирован (3, стадия 1) запщщенньгм аллиламином (2) с применением неорганического основания, такого как карбонат калия, и затем обработан гидроксиламина гидрохлоридом и органическим основанием, таким как пиридин в полярном протонном растворителе, таком как этанол, с получением оксима (4, стадия 2). Данный оксим (4) может затем быть превращен в бициклический изоксазол (5) с 3+2 циклизацией посредством некоторых способов, таких как нагревание оксима (4) в неполярном растворителе, таком как толуол или ксилены, с получением бицикли-ческого изоксазола (5, стадия 3). Кроме того, оксим может быть получен из диметилацеталя (6), который обрабатывают кислотой, такой как муравьиная кислота, с получением альдегида (7, стадия 4). На стадии 5 альдегид (7) может быть превращен в оксим (8) с помощью гидроксиламина гидрохлорида и основания, такого как натрия ацетата тригидрат. Бициклический изоксазол (9) может быть получен из оксима (8), как показано на стадии 6, с применением водного раствора натрия гипохлорита. На стадии 7 защищенный би-циклический изоксазол (9) затем вступает в реакцию с ароматическим литийорганическим реагентом или реактивом Гриньяра с получением защищенного бициклического изоксазола (5).
Схема 2
Схема 2 иллюстрирует различные пути получения защищенного пирролотиазина (12). Защищенный бициклический изоксазол (5) может быть обработан порошкообразным Zn в уксусной кислоте или никелем Ренея в полярном растворителе, таком как этанол, при условиях гидрирования под давлением с получением аминопирролидинметанола (13, стадия 11). Аминопирролидинметанол (13) затем вступает в реакцию с бензоилизотиоцианатом в полярном растворителе, таком как ТГФ, после чего следует добавление 1,1-карбонилдиимидазола (CDI) с получением конденсированного защищенного пирролидинтиа-зина (12, стадия 12). Кроме того, амин бициклического изоксазола (5) может вступать в реакцию с бен-зоилизотиоцианатом с получением тиомочевины (10, стадия 8), и затем, на стадии 9, изоксазольное кольцо может быть раскрыто под действием порошкообразного цинка в уксусной кислоте с получением
гидроксильного соединения (11). Гидроксильное соединение (11) может затем быть обработано CDI в полярном апротонном растворителе, таком как ТГФ или 1-хлор-^^2-триметилпропениламин в DCM, с получением конденсированного защищенного пирролидинтиазина (12, стадия 10). Конденсированный пирролидинтиазин (12) может также быть получен посредством реакции Мицунобу, такой как с применением трифенилфосфина и диизопропилазодикарбоксилата (DIAD).
Схема 3
На схеме 3 показано превращение пирролотиазина (12) в анилин (14, стадия 13), который затем может быть алкилирован, после чего следует снятие защиты и гетероарилирование пирролидина. Снятие защиты тиазинамина приводит к образованию соединений формулы I.
Азидо-дегалогенирование проводят для подходящего пирролотиазина (12) в присутствии источника азида, такого как азид натрия. Такие реакции азидо-дегалогенирования хорошо известны и приняты в данной области. Восстановление полученного азидного промежуточного соединения до анилина (14, стадия 13) может быть осуществлено при условиях гидрирования, которые хорошо известны и описаны в данной области, или посредством восстанавливающих агентов, хорошо известных в данной области, таких как LiAlH4, NaBH4, PPh3.
С пирролидина, защищенного ВОС, защита может быть снята в условиях кислой среды, хорошо известных в данной области (стадия 1 стадии 14). Пирролидин со снятой защитой затем может быть гете-роарилирован посредством нуклеофильного ароматического замещения (SNAr) замещенным ароматическим пиримидином с применением органического основания, такого как диизопропилэтиламин, триэти-ламин или N,N,N,N'-тетраметилгуанидин с получением соединения 15 (стадия 2 стадии 14). Анилин (15) может быть соединен с гетероароматическими карбоновыми кислотами (16) в условиях присоединения (стадия 1 стадии 15). Специалистам в данной области техники очевидно, что существует ряд способов и реагентов для получения амида в результате реакции карбоновых кислот и аминов. Например, реакция подходящего анилина (15) с подходящей кислотой соединения 16 в присутствии реагента сочетания и аминного основания, такого как DIPEA или триэтиламин, дает соединение формулы I, после чего следует снятие защиты тиазинамина. Реагенты сочетания включают карбодиимиды, такие как DCC, DIC, EDCI, и ароматические оксимы, такие как HOBt и HOAt. Кроме того, соли урония или фосфония ненуклеофиль-ных анионов, такие как HBTU, HATU, РуВОР и PyBrOP, можно применять вместо более традиционных реагентов сочетания. Добавки, такие как DMAP, можно применять для усиления реакции. Кроме того, защищенный анилиновый амин (15) может быть ацилирован с применением замещенных бензоилхлори-дов в присутствии основания, такого как триэтиламин или пиридин. С защищенного тиазинамина затем можно снять защиту посредством органического основания, такого как пиридин и метилгидроксиламина гидрохлорид, в полярном апротонном растворителе, таком как этанол, или неогранического основания, такого как гидроксид лития в метаноле, с получением соединений формулы I.
На необязательной стадии может быть получена фармацевтически приемлемая соль соединения формулы I посредством реакции соответствующего свободного основания формулы I с соответствующей фармацевтически приемлемой кислотой в подходящем растворителе при стандартных условиях. Кроме того, образование таких солей может происходить одновременно при снятии защиты с азотной защитной группы. Получение таких солей хорошо известно и признано в данной области. См., например, Gould
P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin R.J. et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); и Berge S.M. et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Специалисту в данной области будет понятно, что соединение формулы I легко преобразуется и может быть выделено в виде фармацевтически приемлемой соли, такой как соль хлористоводородной кислоты.
Способы получения и примеры
Следующие способы получения и примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Если не указано иное, соединения, проиллюстрированные в настоящем документе, названы и пронумерованы с применением Symyx(r) Draw версии 3.2 или версии 4.0 (Symyx Solutions, Inc.) или IUPACNAME
ACDLABS.
Способ получения 1. 1-(3-Бромфенил)-2-(диаллиламино)этанон
Карбонат калия (38,8 г, 281 ммоль) добавляли к 3-бромфенацил бромиду (60 г 216 ммоль) в ацето-нитриле (430 мл) и смесь охлаждали в токе азота до 0°С. Диаллиламин (34,6 мл, 280,63 ммоль) по каплям добавляли в течение 1 ч и оставляли реакцию нагреваться до 22°С в течение ночи. Неочищенную реакционную смесь концентрировали и остаток разделяли в воде (300 мл) и МТВЕ (300 мл). Удаляли водный слой и органический слой промывали водой (100 мл, 2х)и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и растворитель выпаривали до постоянной массы с получением титульного соединения (62 г, 98%). ES/MS (m/e): 294 (М+1).
Способ получения 2. Бензил-М-(2,2-диметоксиэтил)карбамат
Раствор аминоацетальдегида диметилацеталя (25 мл, 229 ммоль) в толуоле (120 мл) обрабатывали при 0°С 4,85М раствором гидроксида натрия (70,8 мл, 343,5 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин и добавляли бензилхлорформиат (33,8 мл, 229 ммоль), поддерживая в процессе добавления внутреннюю температуру ниже 20°С. Смесь нагревали до комнатной температуры более 4 ч. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом натрия и концентрировали досуха с получением титульного соединения (54 г, 98%). ES/MS (m/e): 240 (М+Н).
Способ получения 3. Бензил-М-аллил-М-(2,2-диметоксиэтил)карбамат
Раствор бензил^-(2,2-диметоксиэтил)карбамата (50 г, 208,9 ммоль) в толуоле (180 мл) обрабатывали твердым гидроксидом натрия (51,6 г, 919,69 ммоль) в токе азота. Через 10 мин добавляли бензилтри-этиламмония хлорид (0,8 г, 3,1 ммоль). Еще через 10 мин по каплям добавляли раствор аллилбромида (33 г, 272,8 ммоль) в толуоле (50 мл) в течение 10 мин. Полученную смесь перемешивали при 50°С в течение 48 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры и гасили водой. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором, высушивали над сульфатом магния и концентрировали досуха с получением
титульного соединения (44 г, 75%). ES/MS (m/e): 280 (М+Н).
Способ получения 4. Бензил-М-аллил-1Ч-(2-оксоэтил)карбамат
Раствор бензил^-аллил^-(2,2-диметоксиэтил)карбамата (30 г, 107 ммоль) в муравьиной кислоте (36,8 мл, 860 ммоль) и воде (4,84 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрировали и разбавляли гексаном/этилацетатом (1:2) и водой. Отделяли органический слой, промывали солевым раствором до рН 6 и высушивали над сульфатом натрия. Растворитель выпаривали с получением титульного соединения (25 г, 99%). ES/MS (m/e): 234 (М+Н).
Способ получения 5. 1-(3-Бромфенил)-2-(диаллиламино)этанон оксим
Раствор 1-(3-бромфенил)-2-(диаллиламино)этанона (60 г, 204,7 ммоль) в этаноле (720 мл) и пиридине (24,8 мл, 307 ммоль) перемешивали 15 мин при 22°С. Гидроксиламина гидрохлорид (17 г, 246 ммоль) по порциям добавляли к раствору в течение 1 ч. Реакцию нагревали до 50°С в течение 2 ч и затем нагревали до 70°С в течение 16 ч. Растворитель выпаривали и остаток разделяли в воде (300 мл) и метил-трет-бутиловом эфире (300 мл). Отделяли органический слой и промывали водой (100 мл, 2х) и солевым раствором (100 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и выпаривали досуха с получением титульного соединения (75,5 г, 79%). ES/MS (m/e): 309 (М+1).
Способ получения 6. Бензил-М-аллил-М-[2-гидроксииминоэтил]карбамат
Раствор бензил-№аллил-^(2-оксоэтил)карбамата (25 г, 107 ммоль) в ацетонитриле (150 мл) обрабатывали гидроксиламина гидрохлоридом (9,68 г, 139 ммоль) и раствором натрия ацетата тригидрата (16 г, 117,9 ммоль) в воде (75 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Ацето-нитрил выпаривали и водный раствор экстрагировали этилацетатом. Отделяли органический слой, высушивали над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом с получением титульного соединения
(24 г, 90%). ES/MS (m/e): 249 (М+Н).
Способ получения 7. 5-Аллил-6а-(3-бромфенил)-3,За,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазол
Неочищенный 1-(3-бромфенил)-2-(диаллиламино)этанон оксим (75,5 г, 195,34 ммоль) растворяли в толуоле (600 мл) и нагревали с обратным холодильником в течение 12 ч. Растворитель выпаривали под вакуумом и остаток растворяли в смеси водного 1н. HCl (1 л) и метил-трет-бутилового эфира (300 мл). Смесь перемешивали в течение 15 мин и добавляли кизельгур (10 г). Смесь перемешивали в течение дополнительных 20 мин и фильтровали через кизельгур. Осадок на фильтре промывали дополнительным водным 1н. HCl (200 мл) и метил-трет-бутиловым эфиром (200 мл). Отделяли органический слой и промывали 1н. HCl (2x100 мл). Водные слои объединяли и доводили рН до 9 с помощью NaOH 50% мас./мас. Водную смесь экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром (3х250 мл). Органические слои объединяли, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали и сушили под вакуумом с получением красного твердого вещества (60 г). Красное твердое вещество растворяли в гептане (600 мл) и смесь нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 20 мин. Добавляли активированный уголь (2 г) и смесь фильтровали через кизельгур. Фильтрат концентрировали при атмосферном давлении до получения конечного объема 300 мл. Раствор охлаждали до 22°С и перемешивали в течение 3 ч. Твердое вещество бледно-желтого цвета собирали посредством фильтрации и сушили под вакуумом до постоянной массы с получением титульного соединения (40 г, 60%). ES/MS (m/e): 309 (М+1).
Способ получения 8. Бензил-3,За,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат
Раствор бензил^-аллил^-[2-гидроксииминоэтил]карбамата (24 г, 96,6 ммоль) в дихлорметане (338 мл) по каплям обрабатывали более 10 мин 5% мас./мас. водным раствором гипохлорита натрия (106,08 ммоль, 143,06 мл). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили 40% водным раствором бисульфита натрия (7 г). Отделяли органический слой, высушивали над сульфатом магния и концентрировали под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле, проводя элюирование 5% этилацетатом в гексане с получением титульного соединения (18 г, 75%).
ES/MS (m/e): 247 (М+Н).
1,6М раствор н-бутил-лития в гексане (25,4 мл, 40,6 ммоль) по каплям добавляли к -78°С раствору 4-бром-1-фтор-2-йодобензола (12,22 г, 40,6 ммоль) в тетрагидрофуране (60 мл) с получением желтого раствора, который перемешивали при -78°С в течение 15 мин.
Трифторид бора эфират (5,14 мл, 40,6 ммоль) добавляли к отдельному -78°С раствору бензил-
Способ получения 9. Бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-Ш-пирроло[3,4-с]изо-ксазо л-5 -карбоксилат
3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата (5 г, 20,3 ммоль) в тетрагидрофуране (60 мл), и смесь перемешивали при -78°С в течение 5 мин. Данный раствор добавляли к ранее полученной -78°С литийорганической смеси через канюлю. Объединенную смесь перемешивали в течение 30 мин при -78°С. Смесь гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония и нагревали до комнатной температуры. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х) и объединяли органические экстракты, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 35 мин с получением титульного соединения (2,27 г, 27%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br) 421/423 (М+Н).
Способ получения 10. Бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетра-гидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилат
Бензоилизотиоцианат (2,87 мл, 21,28 ммоль) по каплям добавляли к раствору бензил-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-1Н-пирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата (5,977 г, 14,2 ммоль) в тет-рагидрофуране (95 мл) и перемешивали в течение ночи в токе азота. Растворитель удаляли под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% EtOAc в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (6,05 г, 73%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br) 584/586
(М+Н).
Способ получения 11. [1-Аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол
22°С раствор 5-аллил-6а-(3-бромфенил)-3,3а,4,6-тетрагидро-Ш-пирроло[3,4-с]изоксазола (40 г, 129,4 ммоль) в уксусной кислоте (400 мл) обрабатывали цинковой пылью (42,3 г, 646,8 ммоль) одной порцией. Реакцию интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавляли этил-ацетат (400 мл) и смесь фильтровали через кизельгур. Фильтрат упаривали и остаток сушили под вакуумом. Остаток разделяли в воде (300 мл) и МТВЕ (300 мл). Доводили рН до 8 гидроксидом натрия 50% мас./мас. и отделяли органический слой, высушивали над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат упаривали и остаток сушили под вакуумом с получением титульного соединения (41 г, 97%). ES/MS (m/e): 311 (М+1).
Способ получения 12. Бензил-3-(бензоилкарбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидрокси-метил)пирролидин-1 -карбоксилат
Смесь бензил-1-(бензоилкарбамотиоил)-6а-(5-бром-2-фторфенил)-3,3а,4,6-тетрагидропирроло[3,4-с]изоксазол-5-карбоксилата (6,05 г 10,4 ммоль) и цинка (пыль, <10 мкм) (6,77 г, 103,5 ммоль) перемешивали в уксусной кислоте (52 мл) при комнатной температуре в течение ночи в токе азота. Реакцию разбавляли этилацетатом и фильтровали через кизельгур. Растворитель удаляли под вакуумом и остаток разбавляли этилацетатом, водой и насыщенным водным раствором бикарбоната. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х), объединенные органические слои объединяли и высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% EtOAc в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (5,222 г, 86%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br) 586/588 (М+Н).
Способ получения 13. [(3R,4S)-1-Аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол; (2К,ЗК)-2,3-бис[(4-метилбензоил)окси]бутандиовая кислота
Раствор [1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанола (77 г, 235 ммоль) в изопро-пиловом спирте (914 мл) нагревали до 70°С. Добавляли ди-п-толуоил^-тартаровую кислоту (86,2 г, 223 ммоль) и смесь охлаждали до 22°С более 2 ч и перемешивали в течение ночи. Суспензию фильтровали, чтобы собрать бледно-желтое твердое вещество, и промывали изопропиловым спиртом. Твердое вещест
во сушили под вакуумом с получением титульного соединения (63 г, 36%). ES/MS (m/e): 311 (М+1). Продукт анализировали посредством обращенно-фазной хиральной хроматографии: анализ первого элю-ируемого изомера (колонка: Chiralpak ID-3 4,6x50 мм; элюент: 70:30, водный раствор 20 мМ аммония бикарбоната: ацетонитрил; скорость потока: 1,5 мл/мин при UV 215 нм) подтвердил энантиомерно обогащенный (96% ее) энантиомер с Rt = 1,26 мин.
Способ получения 14. [(ЗК,48)-1-Аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол
[(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил]метанол; (2R,3R)-2,3-бис[(4-метилбен-зоил)окси]бутандиовую кислоту (63 г 85,8 ммоль) объединяли с водным раствором 1н. HCl (800 мл) и этилацетатом (400 мл) и смесь перемешивали в течение 15 мин при 22°С. Слои разделяли и рН водного слоя доводили до 10 гидроксидом натрия 50% мас./мас. Водную смесь экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром (3х250 мл). Объединенные органические слои высушивали над сульфатом магния, фильтровали и упаривали досуха с получением титульного соединения (27 г, 99%). ES/MS (m/e): 311
(М+1).
Способ получения 15. N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d] [1,3]тиазин-2-ил]бензамид
Раствор [(3R,4S)-1-аллил-4-амино-4-(3-бромфенил)пирролидин-3-ил] метанола (27 г; 86,7 ммоль) в тетрагидрофуране (270 мл) охлаждали до -5°С в атмосфере азота. Бензоилизотиоцианат (12,3 мл, 91 ммоль) добавляли по каплям, поддерживая температуру ниже 0°С. Реакцию оставляли нагреваться 22°С более 1 ч. 1,1'-карбонилдиимидазол (28,1 г, 173,5 ммоль) добавляли одной порцией и реакцию перемешивали в течение 1 ч при 22°С, и затем нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 16 ч. Растворитель удаляли под вакуумом и остаток сушили под вакуумом. Неочищенный материал разделяли в метил-трет-бутиловом эфире (500 мл) и воде (250 мл). Отделяли органический слой, высушивали над сульфатом магния, фильтровали и выпаривали досуха. Неочищенный материал очищали на силикагеле с помощью градиента от 90/10 до 60/40 метиленхлорид/этилацетат с получением титульного соединения
(27 г, 68%). ES/MS (m/e): 456 (М+1).
Способ получения 16. Бензил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропир-роло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат
1,1'-карбонилдиимидазол (2,87 г, 17,7 ммоль) добавляли к раствору бензил-3-(бензоил-карбамотиоиламино)-3-(5-бром-2-фторфенил)-4-(гидроксиметил)пирролидин-1-карбоксилата (5,198 г, 8,86 ммоль) в тетрагидрофуране (52 мл). Смесь перемешивали в течение 1,5 ч при комнатной температуре и затем реакцию нагревали с обратным холодильником в течение ночи в токе азота. Реакцию охлаждали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с помощью градиента от 5 до 100% EtOAc в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (2,93 г, 58%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br). 568/570 (М+Н).
Способ получения 17. N-[(4aR,7aS)-7а-(3-бромфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d] [1,3]тиазин-2-ил]бензамид
Смесь N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (1 г, 2,19 ммоль) и ^^диметилбарбитуровой кислоты (0,868 г, 5,48 ммоль) в хлороформе (22 мл) комнатной температуры дегазировали посредством барботажа азота через полученную эмульсию при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (0,261 г, 219 мкмоль) и перемешивали в течение 1,5 ч в токе азота.
В отдельной колбе смесь N-[(4aR,7aS)-6-аллил-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (22,2 г, 48,6 ммоль) и ^^диметилбарбитуровой кислоты (19,28 г, 121,6
ммоль) в хлороформе (486 мл) дегазировали посредством барботажа азота через полученную эмульсию при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь обрабатывали тетракис(трифенилфосфин)палладием (5,79 г, 4,86 ммоль) и перемешивали в течение 2 ч в токе азота.
Две реакции объединяли и растворитель удаляли под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный материал очищали на силикагеле с помощью градиента от 0,5 до 10% метанола в дихлорметане в течение 30 мин с получением титульного соединения (22,4 г, 100%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br) 416/418 (М+Н).
Способ получения 18. N-[7а-(5-бром-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][1,3]тиа-зин-2-ил] бензамид
Йодотриметилсилан (2,21 мл, 15,46 ммоль) по каплям добавляли к раствору бензил 2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,93 г, 5,15 ммоль) в ацетонитриле (44 мл) комнатной температуры. Реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов и растворитель удаляли под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле с получением титульного соединения (2,098 г, 94%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br) 434/436 (М+Н).
Способ получения 19. трет-Бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропир-роло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат
Раствор N-[(4aR,7aS)-7а-(3-бромфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (22,4 г, 36,69 ммоль) в дихлорметане (367 мл) комнатной температуры обрабатывали ди-трет-бутилдикарбонатом (8,81 г, 40,36 ммоль), после чего обрабатывали триэтиламином (7,67 мл, 55,04 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч в токе азота. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 25 мин с получением титульного соединения (20,22 г, 100%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br) 516/518 (М+Н).
Способ получения 20. трет-Бутил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропир-роло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат
Ди-трет-бутилдикарбонат (1,16 г, 5,31 ммоль) и триэтиламин (1,01 мл, 7,25 ммоль) добавляли к раствору N-[7а-(5-бром-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (2,098 г, 4,83 ммоль) в дихлорметане (48 мл). Реакцию перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре в токе азота. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силика-геле с помощью градиента от 5 до 100% EtOAc в гексане в течение 30 мин с получением титульного соединения (2,556 г, 99%). ES/MS (m/e): (79Br/81Br) 534/536 (М+Н).
Способ получения 21. трет-Бутил-(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидро-пирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат
Раствор трет-бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7а-(3-бромфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (5 г, 9,7 ммоль) и транс-^№-диметил-1,2-циклогександиамина (220,3 мг, 1,5 ммоль) в этаноле (100 мл) обрабатывали азидом натрия (1,30 г, 19,4 ммоль). Добавляли водный раствор натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (0,66М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) и воды (10 мл) и верхнюю часть колбы продували азотом. Смесь обрабатывали водным раствором сульфата меди(П) пентагидрата (0,33М, 3,2 мл, 1,1 ммоль) и смесь немедленно нагревали на предварительно нагретой горячей плите при 80°С в течение 1,5 ч в токе азота. При нагревании получали гомогенную смесь. Реакцию охлаждали и добавляли ледяную воду. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли и высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и растворитель удаляли под вакуумом с получением
неочищенного продукта азида. Неочищенный продукт азида объединяли с 10% палладием на угле (2 г) в холодном этаноле (150 мл) и смесь продували с применением вакуума/азота и затем вакуума/водорода. Смесь перемешивали при комнатной температуре при 30 psi водорода в течение 2 ч. Из реакции удаляли газ, и смесь фильтровали через кизельгур, применяя дихлорметан для промывки остатка на фильтре. Растворитель удаляли из фильтрата под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силикагеле 50% эти-лацетатом в дихлорметане с получением титульного соединения (4 г, 91%). ES/MS (m/e): 453 (М+Н).
Способ получения 22. трет-Бутил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропир-роло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат
Раствор трет-бутил-2-бензамидо-7а-(5-бром-2-фторфенил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,556 г, 4,8 ммоль) и транс-^№-диметил-1,2-циклогександиамина (150 мг, 1,1 ммоль) в этаноле (50 мл) обрабатывали азидом натрия (933 мг, 14,3 ммоль). Добавляли водный раствор натриевой соли L-аскорбиновой кислоты (0,66М, 3,2 мл, 2,1 ммоль) и воду (1 мл) и верхнюю часть колбы продували азотом. Смесь обрабатывали водным раствором сульфата меди (II) пентагидрата (0,33М, 3,2 мл, 1,1 ммоль) и смесь немедленно нагревали на предварительно нагретой горячей плите при 80°С в течение 1,5 ч в токе азота. При нагревании получали гомогенную смесь. Реакцию охлаждали, разбавляли ледяной водой и смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли и высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного продукта азида. Неочищенный продукт азида объединяли с 10% палладием на угле (1 г) в холодном этаноле (150 мл) и смесь продували с применением вакуума/азота и затем вакуума/водорода. Смесь перемешивали при комнатной температуре при 30 psi водорода в течение 5 ч. Из реакции удаляли газ, фильтровали через кизельгур и остаток на фильтре промывали дихлорметаном. Растворитель удаляли из фильтрата под вакуумом и неочищенный продукт очищали на силикагеле 50% этилацетатом в ди-хлорметане с получением титульного соединения (2,014 г, 89%). ES/MS (m/e): 471 (М+Н).
Способ получения 23. трет-Бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7а-[3-[(5-фторпиридин-2-карбонил)ами-но] фенил] -4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-6-карбоксилат
Суспензию трет-бутил-(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (93 мг, 0,21 ммоль), 5-фторпиридин-2-карбоновой кислоты (31,9 мг, 0,23 ммоль), 1-гидроксибензотриазол гидрата (56,7 мг, 0,41 ммоль) и 1-(2-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорида (40 мг, 0,21 ммоль) в дихлорметане (4 мл), содержащем диметилформа-мид (1 мл), обрабатывали диизопропилэтиламином (179,2 мкл, 1,03 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разбавляли дихлорметаном (5 мл) и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (15 мл). Отделяли органический слой и промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия (10 мл), высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного титульного соединения (105 мг, 89%). ES/MS (m/e): 576 (М+Н).
Способ получения 24. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][l,3]тиaзин-7a-ил]фeнил]-5-фтopпиpидин-2-кapбoкcaмид; 2,2,2-трифторуксусная кислота
трет-Бутил-(4aR,7aS)-2-бензамидо-7а-[3-[(5-фторпиридин-2-карбонил)амино]фенил]-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4ч1][1,3]тиазин-6-карбоксилат (105 мг, 0,18 ммоль) растворяли в дихлорметане (2 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (500 мкл, 6,6 ммоль). Полученный желтый раствор перемешивали в течение 4 ч при комнатной температуре и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного титульного продукта (190 мг, 100%). ES/MS (m/e): 476 (М+Н).
Способ получения 25. N-[(4aR,7aS)-7а-(3-Аминофенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид
Трифторуксусную кислоту (25 мл) добавляли к раствору трет-бутил-(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (4 г, 8,84 ммоль) в дихлорме-тане (100 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в токе азота в течение 4 ч. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 ди-хлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле с получением титульного соединения
(2,49 г, 80%). ES/MS (m/e): 353 (М+Н).
Способ получения 26. №[7а-(5-Амино-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d] [1,3]тиазин-2-ил]бензамид
Трифторуксусную кислоту (10 мл) добавляли к раствору трет-бутил-7а-(5-амино-2-фторфенил)-2-бензамидо-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-6-карбоксилата (2,013 г, 4,28 ммоль) в дихлор-метане (30 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в токе азота в течение 4 ч. Растворитель удаляли под вакуумом и неочищенный продукт очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7 н аммиак в метаноле с получением титульного соединения (1,555 г, 98%). ES/MS (m/e): 371 (М+Н).
Способ получения 27. N-[(4aR,7aS)-7а-(3-Аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетра-гидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-2-ил]бензамид
Раствор N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамида (2,49 г, 7,06 ммоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (3,74 г, 28,26 ммоль) и диизопропилэтила-мина (6,16 мл, 35,32 ммоль) в 1,4-диоксане (60 мл) нагревали до кипения в течение 4 ч в токе азота. Реакцию охлаждали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (3х). Объединенные органические экстракты высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и растворитель удаляли под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 25 мин с получением титульного соединения (2,51 г,
79%). ES/MS (m/e): 449 (М+Н).
Способ получения 28. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидро-пирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -5-фторпиридин-2-карбоксамид
Раствор N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]фе-нил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида; 2,2,2-трифторуксусной кислоты (150 мг, 254 мкмоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (68 мг, 51 мкмоль) и диизопропилэтиламина (98 мкл, 56 мкмоль) нагревали в диметил-сульфоксиде (5 мл) в течение ночи при 40°С. Добавляли дополнительный 5-фтор-2-хлорпиримидин (68 мг, 51 мкмоль) и диизопропилэтиламин (98 мкл, 56 мкмоль) и смесь нагревали в течение ночи при 50°С. Добавляли дополнительный 5-фтор-2-хлорпиримидин (68 мг, 51 мкмоль) и диизопропилэтиламин (98 мкл, 56 мкмоль) и смесь нагревали в течение ночи при 50°С в течение третьей ночи. Реакцию охлаждали, разбавляли насыщенным водным раствором карбоната натрия (50 мл) с получением суспензии, которую фильтровали и сушили в вакуумном шкафу при 50°С в течение 4 ч с получением титульного соединения (60 мг, 41%). ES/MS (m/e): 449 (М+Н).
Альтернативный вариант примера получения 28.
N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (282 мг, 628,73 мкмоль) и 5-фторпиридин-2-карбоновую кислоту (106,46 мг, 754,47 мкмоль) объединяли в дихлорметане (3 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли 1-гидроксибензотриазол (112,70 мг, 817,35 мкмоль) и затем 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (159,07 мг, 817,35 мкмоль) и полученную смесь перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре в токе азота. Реакционную смесь разбавляли водой и рН доводили 1н.
NaOH до ~12. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Органические экстракты объединяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 20 мин с получением титульного соединения (327 мг, 91%). ES/MS
(m/e): 571 (М+Н).
Способ получения 29. №[7а-(5-Амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-2-ил]бензамид
Раствор N-[7а-(5-амино-2-фторфенил)-4а,5,6,7-тетрагидро-4Н-пирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бен-замида (705 мг, 1,90 ммоль), 5-фтор-2-хлорпиримидина (1,01 г, 7,61 ммоль) и диизопропилэтиламина (1,66 мл, 9,52 ммоль) нагревали в 1,4-диоксане (20 мл) до кипения с обратным холодильником в течение 4 ч в токе азота. Реакцию охлаждали, разбавляли водой и экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли, высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 25 мин с получением титульного соединения (590 мг, 66%). ES/MS (m/e): 467 (М+Н).
Способ получения 30. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -5-метоксипиразин-2-карбоксамид
N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (400 мг, 891,81 мкмоль) и 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (165 мг, 1,07 ммоль) объединяли в дихлорметане (4 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли 1-гидроксибензотриазол (160 мг, 1,16 ммоль) и затем 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (226 мг, 1,16 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 5 ч при комнатной температуре в токе азота. Реакционную смесь разбавляли водой и рН доводили до ~12 с помощью 1н. NaOH. Смесь экстрагировали этилацетатом (3х). Объединенные органические экстракты высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этилацетата в гексане в течение 20 мин с получением
титульного соединения (482 мг, 92%). ES/MS (m/e): 585 (М+Н).
Способ получения 31. №[3-[2-Бензшидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропир-роло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] -4-фторфенил] -5-фторпиридин-2-карбоксамид
N-[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]ти-азин-2-ил]бензамид (302 мг, 647 мкмоль) и 5-фторпиридин-2-карбоновую кислоту (110 мг, 777 мкмоль) объединяли в дихлорметане (3 мл) и диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли 1-гидроксибензотриазол (116 мг, 842 мкмоль) и затем 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (164 мг, 842 мкмоль) и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в токе азота. Реакционную смесь разбавляли водой и рН доводили 1н. NaOH до ~12 и затем экстрагировали этилацетатом (3х). Органические слои объединяли и фильтровали, чтобы собрать нерастворимый материал. Твердое вещество промывали водой и этилацетатом и сушили под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения. Органические слои из фильтрата высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Остаток очищали на силикагеле с применением градиента от 5 до 100% этил-ацетата в гексане в течение 20 мин с получением дополнительного количества титульного соединения с
общим выходом (275 мг, 72%). ES/MS (m/e): 590 (М+Н).
Способ получения 32. N-[(4aR,7aS)-7а-(5-Амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил]бензамид, (изомер 1)
Рацемический N-[7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропир-роло[3,4^][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (1,694 г, 3,63 ммоль) хирально очищали посредством ВЭЖХ (колонка: Chiralcel OJ, 8х35 см; элюент: 90% метанол (0,2% диметилэтиламин) и 10% ацетонитрил; скорость потока 400 мл/мин при UV 280 нм). Анализ первого элюируемого изомера (колонка: Chiralcel OJ-H 0,46x15 см; элюент: 10:90 ацетонитрил:метанол (с 0,2% диметилэтиламина); скорость потока: 0,6 мл/мин при UV 280 нм) подтвердил наличие энантиомерно обогащенного (99% ее) энантиомера с Rt = 6,70 мин,
(723 мг, 43%). ES/MS (m/e): 467 (М+Н).
Способ получения 33. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидро-пирроло[3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид, (изомер 1)
N-[(4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,361 г, 0,77 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси дихлорметана (4 мл) и ДМФА (0,5 мл). К смеси добавляли 5-метоксипиразин-2-карбоновую кислоту (240 мг, 1,55 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (210 мг, 1,55 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (300 мг, 1,55 ммоль) и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционный раствор помещали непосредственно в колонку с силикагелем с загрузкой 12 г и очищали с применением колонки с 40 г силикагеля и элюировали с помощью градиента 0-100% этилацетат/гексан. Продукт растворяли в этилацетате (200 мл), промывали 1н. NaOH (2x50 мл) и солевым раствором (1x50 мл). Очистку силикагелем повторяли, как описано выше, с получением титульного соединения (350 мг, 74%).
ES/MS (m/e): 603 (М+Н).
Способ получения 34. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетра-гидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -5-цианопиридин-2-карбоксамид
N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,30 г, 0,67 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл) и добавляли 5-цианопиридин-2-карбоновую кислоту (129 мг, 0,87 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (185 мг, 1,34 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (169 мг, 0,87 ммоль). Добавляли диизо-пропилэтиламин (0,35 мл, 2 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Материал очищали непосредственно хроматографией на силикагеле, проводя элюирование градиентом 0-100% этилацетат/гексан, с получением титульного соединения (360 мг, 88%). ES/MS (m/e): 579
(М+Н).
Способ получения 35. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетра-гидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид
N-[(4aR,7aS)-7а-(3-аминофенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,30 г, 0,67 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл) и добавляли 3,5-дифторпиридин-2-карбоновую кислоту (138 мг, 0,87 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (185 мг, 1,34 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (169 мг, 0,87 ммоль). Добавляли диизопропилэтиламин (0,35 мл, 2 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в тече
ние ночи. Реакцию очищали непосредственно хроматографией на силикагеле, проводя элюирование градиентом 0-100% этилацетат/гексан, с получением титульного соединения (330 мг, 84%). ES/MS (m/e): 590 (М+Н).
Способ получения 36. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетра-гидропирроло[3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид, (изомер 1)
N-[(4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,180 г, 0,39 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси дихлорметана (2 мл) и ДМФА (0,25 мл). Добавляли 5-цианопиридин-2-карбоновую кислоту (114 мг, 0,77 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (106 мг, 0,77 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (150 мг, 0,77 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли водой (10 мл), этилацетатом (10 мл) и добавляли к раствору 1н. NaOH (100 мл). Смесь экстрагировали EtOAc (2x100 мл) и органические слои объединяли и промывали солевым раствором. Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле с применением градиента 0-100% этилацетат/гексан с получением титульного соединения (133 мг, 57%). ES/MS (m/e): 597 (М+Н).
Способ получения 37. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагид-ponnppoflo[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид, (изомер 1)
N-[(4aR,7aS)-7а-(5-амино-2-фторфенил)-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-2-ил]бензамид (0,180 г, 0,39 ммоль, изомер 1) растворяли в смеси дихлорметана (2 мл) и ДМФА (0,25 мл). Добавляли 5-цианопиридин-2-карбоновую кислоту (114 мг, 0,77 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (106 мг, 0,77 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (150 мг, 0,77 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Смесь разбавляли водой (10 мл) и этилацетатом (10 мл) и затем выливали в раствор 1н. NaOH (100 мл). Смесь экстрагировали EtOAc (2х 100 мл), органические экстракты объединяли и промывали солевым раствором. Органические слои сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле с применением градиента 0-100% этилацетат/гексан с получением титульного соединения (190 мг, 80%). ES/MS (m/e): 608 (М+Н).
Пример А. N-[3-[2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид
Смесь N-[3-[2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (293 мг, 497 мкмоль), О-метилгидроксиламина гидрохлорида (430 мг, 4,97 ммоль) и пиридина (402 мкл, 4,97 ммоль) нагревали в этаноле (13 мл) до 70°С в закупоренной колбе в течение 2,5 ч. Добавляли диметилсульфоксид (3 мл) и смесь нагревали при 70°С в течение ночи. Добавляли дополнительный диметилсульфоксид (10 мл) и продолжали нагревание при 70°С в течение 4 ч. Добавляли дополнительный О-метилгидроксиламин гидрохлорид (208 мг, 2,48 ммоль) и пиридин (201 мкл, 2,48 ммоль) и смесь нагревали до 60°С в течение 3 ч и смесь перемешивали в течение 3 дней при комнатной температуре. В отдельной колбе смесь ^[3-[2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] -4-фторфенил] -5 -фторпири-дин-2-карбоксамида (276 мг, 468 мкмоль), О-метилгидроксиламина гидрохлорида (405 мг, 4,68 ммоль) и пиридина (478 мкл, 4,68 ммоль) нагревали в этаноле (15 мл) и диметилсульфоксиде (4 мл) при 70°С в закупоренной колбе в течение ночи. Добавляли дополнительный диметилсульфоксид (10 мл) и продолжали нагревание при 70°С в течение 4 ч. Добавляли дополнительный О-метилгидроксиламина гидрохло
рид (195 мг, 2,34 ммоль) и пиридин (189 мкл, 2,34 ммоль) и продолжали нагревание при 70°С в течение 3 ч, после чего проводили перемешивание смеси в течение 3 дней при комнатной температуре. Две реакционные смеси объединяли и большую часть растворителя удаляли под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорме-тан:7н. аммиак в метаноле. Неочищенный продукт далее очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле:дихлорметан в течение 20 мин с получением титульного соединения (451 мг, 96%). ES/MS (m/e): 486 (М+Н).
Пример 1. N-{3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-с1][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]фенил}-5-фторпиридин-2-карбоксамида гидрохлорид
Смесь N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид (320 мг, 560 мкмоль), О-метилгидроксиламин гидрохлорид (485 мг, 5,60 ммоль) и пиридин (453 мкл, 5,60 ммоль) в этаноле (15 мл) нагревали при 65°С в закупоренной колбе в течение пяти часов. Реакцию охлаждали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане в течение 30 мин с получением N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамида (219 мг, 84%). Данный материал растворяли в дихлорметане (1 мл) и метаноле (0,5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,47 мл, 470 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения (228 мг, 81%). ES/MS (m/e): 468 (М+Н).
Пример 2. N-{3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4а,5,6,7-тетрагидропирроло[3,4-с1][1,3]тиазин-7а(4Н)-ил]фенил}-5-метоксипиразин-2-карбоксамида гидрохлорид
Смесь N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиазин-7а-ил]фенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид (479 мг, 819 мкмоль), О-метилгидроксиламина гидрохлорида (709 мг, 8,19 ммоль) и пиридина (663 мкл, 8,19 ммоль) в этаноле (20 мл) нагревали при 50°С в закупоренной колбе в течение ночи. Добавляли диметилсульфоксид (4 мл) и смесь нагревали до 70°С в течение 4 ч с получением раствора. Реакцию охлаждали и большую часть растворителя удаляли под вакуумом. Добавляли воду и доводили рН до ~12 с помощью 1н. гидроксида натрия. Смесь экстрагировали этилацетатом (5х). Объединенные органические экстракты высушивали над сульфатом натрия, фильтровали и удаляли растворитель под вакуумом. Неочищенный продукт очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле:дихлорметан в течение 30 мин. Смесь снова очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле для удаления остаточного диметилсульфоксида. Смесь в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0,5 до 10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане в течение 20 мин с получением N-[3-[(4aR,7aS)-2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло [3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -5-метоксипиразин-2-карбоксамида. Данный материал растворяли в дихлорметане (1 мл) и добавляли метанол (0,5 мл) и 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,66 мл, 660 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения
(329 мг, 78%). ES/MS (m/e): 481 (М+Н).
Рацемический N-[3-[2-амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиа-зин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-фторпиридин-2-карбоксамид (451 мг, 929 мкмоль) хирально очищали посредством SFC (колонка: Chiralcel OD-H (5 мкм), 2,1x25 см; элюент: 40% метанол (0,2% изопропиламина) в CO2; скорость потока 70 мл/мин при UV 225 нм). Хиральный анализ первого элюируемого изомера: ко-
Пример 3. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d] [ 1,3 ]тиазин-7а-ил] -4 -фторфенил] -5 -фторпиридин-2 -карбоксамида гидрохлорид
лонка: Chiralcel OD-H (5 мкм), 4,6x150 мм; элюент: 40% метанол (0,2% изопропиламина) в CO2; скорость потока 5 мл/мин при UV 225 нм подтвердил наличие энантиомерно обогащенного (> 99% ее) энантиоме-ра с Rt = 1,01 мин (175 мг, 360 мкмоль). Данный материал (свободное основание, изомер 1) растворяли в дихлорметане (1 мл) и метаноле (0,5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,36 мл, 360 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения (183 мг,
38%). ES/MS (m/e): 486 (М+Н).
Пример 4. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] -4-фторфенил] -5 -метоксипиразин-2-карбоксамида гидрохлорид
N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиа-зин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-метоксипиразин-2-карбоксамид (0,350 г, 0,58 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (2 мл) и затем добавляли метанол (4 мл) и этанол (4 мл). К смеси добавляли О-метилгидроксиламин гидрохлорид (495 мг, 5,81 ммоль) и пиридин (470 мкл, 5,81 ммоль) и реакцию нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи. К реакции добавляли силикагель (~10 г) и смесь концентрировали. Образец, высушенный на силикагеле, помещали в пустой картридж и очищали, проводя элюирование градиентом 0-10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане. Продукт второй раз очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлорметан:7 н. аммиак в метаноле. Продукт в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0 до 10% 7н. аммиак в метаноле в ди-хлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,20 мл, 660 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением титульного соединения (71 мг, 23%). ES/MS
(m/e): 498 (М+Н).
Пример 5. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][l,3]THa3HH-7a-ra^eHHfl]-5-uHaHonHpHflHH-2-Kap6oKcaMjm,a гидрохлорид
N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиа-зин-7а-ил]фенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид (360 мг, 0,59 ммоль) растворяли в этаноле (10 мл) и дихлорметане (2 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (504 мг, 5,91 ммоль) и пиридин (478 мкл, 5,91 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение выходных (70 ч). Реакцию нагревали до 60°С и перемешивали в течение 24 ч. Реакцию концентрировали с получением неочищенного продукта и очищали посредством хроматографии на силикагеле с применением градиента 0-10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,54 мл, 540 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного
в заголовке соединения (240 мг, 75%). ES/MS (m/e): 475 (М+Н).
Пример 6. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d] [ 1,3]тиазин-7а-ил] фенил] -3,5-дифторпиридин-2-карбоксамида гидрохлорид
N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиа-зин-7а-ил]фенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид (330 мг, 0,53 ммоль) растворяли в ТГФ (10 мл) и разбавляли этанолом (10 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (453 мг, 5,32 ммоль) и пиридин (430 мкл, 5,91 ммоль) и реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение выходных (70 ч). Реакцию нагревали до 60°С и перемешивали в течение 24 ч. Смесь концентрировали на сили-кагеле (~10 г) и очищали посредством хроматографии на силикагеле с применением градиента 0-10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтило-вом эфире (0,49 мл, 490 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного в заго-
N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиа-зин-7а-ил]-4-фторфенил]-5-цианопиридин-2-карбоксамид (133 мг, 0,22 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (1 мл) и разбавляли метанолом (3 мл) и этанолом (3 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (190 мг, 2,2 ммоль) и пиридин (180 мкл, 2,2 ммоль). Реакцию нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи. Смесь концентрировали на силикагеле (~10 г) и очищали посредством хроматографии на силикагеле, проводя элюирование градиентом 0-10% 7 н. аммиак в метаноле:дихлорметан. Материал второй раз очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан:метанол и затем 2:1 дихлор-метан:7н. аммиак в метаноле. Смесь в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0 до 10% 7н. аммиак в метаноле в дихлорметане с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,27 мл, 270 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения (114 мг, 97%). ES/MS (m/e): 493 (М+Н).
Пример 8. N-[3-[(4aR,7aS)-2-Амино-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d] [ 1,3 ]тиазин-7а-ил] -4 -фторфенил] -3,5 -дифторпиридин-2-карбоксамида гидрохлорид
N-[3-[(4aR,7aS)-2-бензамидо-6-(5-фторпиримидин-2-ил)-4,4а,5,7-тетрагидропирроло[3,4-d][1,3]тиа-зин-7а-ил]-4-фторфенил]-3,5-дифторпиридин-2-карбоксамид (190 мг, 0,31 ммоль, изомер 1) растворяли в ТГФ (1 мл) и разбавляли метанолом (3 мл) и этанолом (3 мл). Добавляли О-метилгидроксиламина гидрохлорид (267 мг, 3,1 ммоль) и пиридин (253 мкл, 3,1 ммоль) и реакцию нагревали до 50°С и перемешивали в течение ночи. Реакцию очищали на SCX колонке с применением смеси 3:1 дихлорметан: метанол и затем 2:1 дихлорметан:7н. аммиак в метаноле. Материал в последний раз очищали на силикагеле с применением градиента от 0 до 10% 7н. аммиак в метаноле:дихлорметан с получением свободного основания указанного в заголовке соединения. Данный материал растворяли в дихлорметане (5 мл) и добавляли 1М хлористый водород в диэтиловом эфире (0,20 мл, 200 мкмоль). Растворитель удаляли под вакуумом с получением указанного в заголовке соединения (101 мг, 60%). ES/MS (m/e): 504 (М+Н).
Методики анализов in vitro.
Для ферментных и клеточных анализов in vitro тестируемые соединения готовили в ДМСО с получением 10 мМ исходного раствора. Исходный раствор серийно разводили в ДМСО для получения десятиточечной кривой разведения с конечными концентрациями соединения в диапазоне от 10 мМ до 0,05 нМ в 96-луночном круглодонном планшете до проведения ферментного анализа и анализа на целых клетках in vitro.
Анализы ингибирования протеазы in vitro.
Экспрессия человеческой ВАСЕ1.
Человеческую ВАСЕ1 (учетный номер: AF190725) клонировали из общей кДНК головного мозга посредством ПЦР в реальном времени. Нуклеотидные последовательности, соответствующие последовательностям аминокислот #1 до 460, вставляли в кДНК, кодирующую полипептид IgG1 (Fc) человека (Vassar et al. 1999). Данный гибридный белок ВАСЕ1(1-460) и человеческий Fc, названный huBACE1:Fc, встраивали в вектор pJB02. Клетки HEK293 временно экспрессировали человеческую BACE1(1-460):Fc (huBACE1:Fc). 250 мкг кДНК каждой конструкции перемешивали с Fugene 6 и добавляли к 1 л HEK293 клеток. Через четыре дня после трансфекции кондиционированные среды собирали для очистки.
Очистка huBACE1 :Fc.
huBACE1:Fc очищали с помощью хроматографии с применением протеина А. Ферменты хранили при -80°С в виде маленьких аликвот.
Анализ резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) BACE1.
Серийные разведения тестируемых соединений получали, как описано выше. Соединения далее разбавляли 20x в KH2PO4 буфере. Десять мкл каждого разведения добавляли в каждую лунку в рядах от А до Н соответствующего черного планшета с низким связыванием белков, содержащего реакционную
смесь (25 мкл 50 мМ KH2PO4, рН 4,6, 1 мМ TRITON(r) Х-100, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 15 мкМ FRET-субстрата) (см. Yang et. al., J. Neurochemistry, 91(6) 1249-59 (2004)). Содержимое хорошо перемешивали на шейкере для планшетов в течение 10 мин. Пятнадцать мкл 200 пкМ человеческой BACE1(l-460):Fc (см. Vasser et al., Science, 286, 735-741 (1999)) в KH2PO4 буфере добавляли в планшет, содержащий субстрат и тестируемые соединения для инициирования реакции. RFU (относительные единицы флуоресценции) смеси в момент времени 0 записывали при длине волны возбуждения 355 нм и длине волны излучения 460 нм после кратковременного перемешивания на шейкере для планшетов. Реакционный планшет накрывали алюминиевой фольгой и выдерживали в темной влажной печи при комнатной температуре в течение от 16 до 24 ч. RFU в конце инкубирования записывали с теми же настройками возбуждения и излучения, которые применяли для момента времени 0. Различие в RFU в момент времени 0 и в конце инкубирования является показателем активности ВАСЕ1 при обработке соединением. Различия RFU нанесены в зависимости от концентрации ингибитора, и для получения значений ЕС50 и IC50 кривая приведена к четырехпараметрическому логистическому уравнению. (См. Sinha et al.,
Nature, 402, 537-540 (2000)).
Следующие примеры соединений были протестированы, по существу, как описано выше, и для них наблюдали следующую активность в отношении ВАСЕ1.
Таблица 1
Пример #
ВАСЕ1 1С!0(нМ)
0,610 (+ 0,0948, п=8/9)
0,482 (±0,0580, п=6/7)
0,554 (+ 0,0674, п=3)
0,569 (+ 0,0796, п=2)
0,450 (±0,0911,п=4)
0,739 (+0,181,11=7)
0,358 (п=1/3)
0,730 (+0,0951, п=3)
Среднее значение ±SEM; SEM - стандартная ошибка среднего значения.
Эти данные показывают, что соединения из табл. 1 эффективно ингибируют активность очищенного рекомбинантного фермента ВАСЕ1 in vitro.
Анализ на целых клетках для определения ингибирования активности Бета-секретазы HEK293Swe в анализе на целых клетках.
В стандартном анализе на целых клетках для определения ингибирования активности бета-секретазы применяли клеточную линию эмбриональных клеток человека HEK293р (АТСС Accession No. CRL-1573), стабильно экспрессирующих человеческую АРР751 кДНК, содержащую двойную мутацию, возникшую естественным путем, Lys651Met652 в Asn651Leu652, обычно называемую Шведской мутацией (обозначено HEK293Swe), и проявляющих избыточную продукцию Abeta (Citron et al., Nature, 360, 672-674 (1992)). In vitro анализ снижения уровня Abeta описан в литературе (см. Dovey et al., Journal of Neurochemistry, 76, 173-181 (2001); Seubert et al., Nature, 361, 260 (1993); и Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1550-1555 (1997)).
Клетки (HEK293Swe при 3,5x104 клеток/лунка, содержащих 200 мкл культуральной среды, DMEM, содержащей 10% FBS) инкубировали при 37°С в течение от 4 до 24 ч в присутствии/отсутствие ингибиторов (разведенных в ДМСО) в необходимой концентрации. В конце инкубирования кондиционированную среду анализировали на наличие бета-секретазной активности, например, посредством анализа Abeta пептидов. Общие Abeta пептиды (Abeta 1-х) определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ELISA) с применением моноклональных 266 в качестве иммобилизованного антитела и биотинилированных 3D6 в качестве визуализирующих антител. Кроме того, пептиды Abeta 1-40 и Abeta 1-42 определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ELISA) с применением моно-клональных 2G3 в качестве иммобилизованного антитела для Abeta 1-40 и моноклональных 21F12 в качестве иммобилизованного антитела для Abeta 1-42. Как для Abeta 1-40, так и для Abeta 1-42 в иммуно-ферментных анализах ELISA применяли биотинилированные 3D6 в качестве визуализирующих антител. Концентрация Abeta, высвобожденного в кондиционированную среду после обработки соединением, соответствует активности ВАСЕ1 при таких условиях. 10-точечная кривая ингибирования построена и приведена к четырехпараметрическому логистическому уравнению для получения значений ЕС50 и IC50 для эффекта снижения Abeta. Следующие примеры соединений были протестированы, по существу, как описано выше, и для них наблюдали следующую активность в отношении эффекта снижения Abeta.
Таблица 2
Пример
Имму ноферментный анализ ELISA НЕК
Иммуноферментный анализ ELISA НЕК
293 Svve A-beta (140)
1С!0 (нМ)
293 Swe A-beta (142)
ICso (нМ)
0,619
0,437
0,324
0,289
1,26
0,299
0,0887
0,0785
0,220
0,211
Среднее значение ±SEM; SEM - стандартная ошибка среднего значения Эти данные показывают, что соединения из табл. 2 эффективно ингибируют естественное продуцирование Abeta в целых клетках. Анализ белка-предшественника амилоида (PDAPP) первичных нейронов.
Подтверждающий анализ на целых клетках также проводили на первичных культурах нейронов, полученных из эмбрионов PDAPP-трансгенных мышей. Первичные кортикальные нейроны получали из PDAPP-эмбрионов на 16-й эмбриональный день и культивировали в 96 луночных планшетах (15x104 клеток/лунка в DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% FBS). Через 2 дня in vitro культуральную среду замещали DMEM/F12 (1:1), свободной от сыворотки, содержащей добавку В27 и 2 мкМ (конечная) Ara-C (Sigma, С1768). На день 5 in vitro нейроны инкубировали при 37°С в течение 24 ч в присутствии/отсутствие ингибиторов (разбавленных в ДМСО) в необходимой концентрации. По окончании инкубирования, кондиционированную среду анализировали на наличие бета-секретазной активности, например, посредством анализа Abeta пептидов. Общее количество Abeta пептидов (Abeta 1-х) определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ELISA) с применением моноклональных 266 в качестве иммобилизованного антитела и биотинилированных 3D6 в качестве визуализирующих антител. Кроме того, пептиды Abeta 1-40 и Abeta 1-42 определяли посредством иммуноферментного анализа сэндвич-типа (ELISA) с применением моноклональных 2G3 в качестве иммобилизованного антитела для Abeta 1-40 и моноклональных 21F12 в качестве иммобилизованного антитела для Abeta 1-42. Как для Abeta 1-40, так и для Abeta 1-42 в иммуноферментных анализах (ELISA) применяли биотинилированные 3D6 в качестве визуализирующих антител. Концентрация Abeta, высвобожденного в кондиционированную среду после обработки соединением, соответствует активности ВАСЕ1 при таких условиях. 10-точечная кривая ингибирования построена и приведена к четырехпараметрическому логистическому уравнению для получения значений ЕС50 и IC50 для эффекта снижения Abeta. Следующие примеры соединений были протестированы, по существу, как описано выше, и для них наблюдали следующую активность в отношении эффекта снижения Abeta.
Таблица 3
Пример
Иммуноферментный анализ ELISA A-beta PDAPP-нейронов (140) IC50 (нМ)
Иммуноферментный анализ ELISA A-beta PDAPP-нейронов (142) ICS0 (нМ)
0,487 (+ 0,0946, n=2)
0,591 (+ 0,268, n=2)
0,244 (n=l/2)
1,22 (+0,967, n=2)
0,309 (+ 0,0478, n=2)
0,184 (+0,0234, n=2)
0,134
0,131
0,132 (+ 0,0717,n=2)
0,0813
0,279 (+ 0,0607, n=2)
0,308 (+ 0,115, n=2)
0,0873
0,0649
0,285
0,29
Среднее значение ±SEM; SEM - стандартная ошибка среднего значения Эти данные демонстрируют, что соединения из табл. 3 эффективно ингибируют продуцирование Abeta в целых клетках. Ингибирование Бета-секретазы in vivo.
Некоторые модели животных, включая мышей, морских свинок, собак и обезьян, можно применять для оценки ингибирования активности бета-секретазы in vivo после обработки соединениями. В настоящем изобретении можно использовать животных дикого типа, трансгенных или животных с нокаутом генов. Например, PDAPP-модель мышей, полученная как описано в Games et al., Nature 373, 523-527 (1995), и другие нетрансгенные или с нокаутом генов животные подходят для анализа in vivo ингибиро
вания Abeta и продукции sAPPbeta в присутствии ингибирующих соединений. В целом, PDAPP-мышам возраста от 2 до 12 месяцев, мышам с нокаутом генов или нетрансгенным животным вводили соединения, приготовленные в носителях, таких как кукурузное масло, циклодекстран, фосфатные буферы, PHARMASOLVE(r) или других подходящих носителях. Животных умерщвляли через период от одного до двадцати четырех часов после введения соединения и для анализа фрагментов Abetas, С99 и sAPP удаляли головной мозг, а также спинномозговую жидкость и плазму (см. May et al., Journal of Neurosci-ence, 31, 16507-16516 (2011)).
В качестве стандарта в фармакологических исследованиях in vivo животным вводили различные концентрации соединения и сравнивали с контрольной группой, обработанной носителем в то же время. Через некоторое время исследований для установления базового уровня из выбранных животных получали ткани головного мозга, плазму или спинномозговую жидкость, начиная с момента времени 0. Другим группам вводили соединение или подходящий носитель и умерщвляли животных в различные моменты времени после введения дозы. Из выбранных животных получали ткани головного мозга, плазму или спинномозговую жидкость и анализировали на наличие продуктов расщепления АРР, включая пептиды Abeta, sAPPbeta и другие фрагменты АРР, например, посредством специфического иммунофер-ментного анализа сэндвич-типа (ELISA). По окончании периода анализа животных умерщвляли, и ткани головного мозга, плазму и спинномозговую жидкость анализировали на наличие пептидов Abeta, C99 и sAPPbeta, в соответствующих случаях. Ткани головного мозга АРР-трансгенных животных также могут быть проанализированы на количество бета-амилоидных бляшек после обработки соединением. "Abeta 1-х пептид" в настоящем документе обозначает сумму видов Abeta, которые начинаются с остатка 1 и заканчиваются С-концом более, чем остаток 28. Это обнаруживает большинство видов Abeta и их часто называют "общий Abeta".
Животные (PDAPP или другие АРР-трансгенные или нетрансгенные мыши), которым вводили ин-гибирующее соединение, могут демонстрировать снижение Abeta или sAPPbeta в тканях головного мозга, плазме или спинномозговой жидкости и уменьшение бета-амилоидных бляшек в тканях головного мозга в сравнении с контролем, обработанным носителем, или контролем в нулевой момент времени. Например, через 3 ч после введения пероральной дозы соединения примера 1, составляющей 1, 3 или 10 мг/кг, молодым самкам PDAPP-мышей, уровни пептида Abeta 1-х снизились приблизительно на 34, 48 и 53% в гиппокампе головного мозга и приблизительно на 43, 59 и 66% в коре головного мозга, соответственно, в сравнении с мышами, обработанными носителем.
Например, через 3 ч после введения пероральной дозы соединения примера 3, составляющей 1 или 3 мг/кг, уровни пептида Abeta 1-х снизились приблизительно на 38 и 50% в гиппокампе головного мозга и приблизительно на 34 и 53% в коре головного мозга, соответственно, в сравнении с мышами, обработанными носителем.
Учитывая активность примеров 1 и 3 против фермента ВАСЕ in vitro, данные эффекты снижения Abeta согласуются с ингибированием ВАСЕ in vivo и далее демонстрируют проникновение примеров 1 и 3 в ЦНС.
Данные исследования показывают, что соединения согласно настоящему изобретению ингибируют ВАСЕ и, следовательно, подходят для снижения уровней Abeta.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
4. Способ лечения болезни Альцгеймера у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп. 1 -3 или его фармацевтически приемлемой соли.
5. Способ предотвращения прогрессирования умеренного когнитивного нарушения до болезни Альцгеймера у пациента с риском развития болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения по любому из пп. 1 -3 или его фармацевтически приемлемой соли.
6. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 в терапии заболеваний и расстройств, связанных с Р-амилоидным (Abeta) пептидом.
7. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-3 для лечения болезни Альцгеймера.
8. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль по любому из пп.1-3 с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или вспомогательными веществами.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
026006
- 1 -
(19)
026006
- 1 -
(19)
026006
- 1 -
(19)
026006
- 1 -
(19)
026006
- 4 -
(19)
|
