EA 025990B1 20170228 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/025990 Полный текст описания [**] EA201200398 20100902 Регистрационный номер и дата заявки EP09169227.7 20090902 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2010/062896 Номер международной заявки (PCT) WO2011/026913 20110310 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21702 Номер бюллетеня [**] ПОЛИПЕПТИДЫ С ОКСИДОРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Название документа [8] C07D307/50, [8] C11D 3/386, [8] C12N 9/02, [8] C12P 7/44 Индексы МПК [NL] Реёссенарс Хералд Йохан, [NL] Виркс Ник Йоханнес Петрус, [NL] Копман Франк Ваутер, [NL] Стратхоф Адрианус Йоханнес Йозеф, [NL] Винде де Йоханнес Хендрик Сведения об авторах [NL] ПЮРАК БИОХЕМ Б.В. Сведения о патентообладателях [NL] ПЮРАК БИОХЕМ Б.В. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000025990b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Полипептид с оксидоредуктазной активностью класса EC1.1 и ЕС1.2 в отношении как спиртовой, так и альдегидной группы, находящихся в положении С2 или С5 фуранового цикла, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.

2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1.

3. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1 и выбранную из группы, включающей: (a) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4; (b) нуклеотидную последовательность, которая избирательно гибридизируется с полинуклеотидом, который комплементарен SEQ ID NO: 4; (c) нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 66% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4; (d) последовательность, которая является вырожденной вследствие избыточности генетического кода по отношению к последовательности, определенной в любом из (а), (b) или (с); или (e) нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (b), (с) или (d).

4. Конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1, где нуклеотидная последовательность функционально соединена с регуляторной последовательностью.

5. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3 или конструкцию по п.4.

6. Клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3, конструкцию по п.4 или вектор по п.5.

7. Клетка по п.6, представляющая собой бактерию, выбранную из группы, состоящей из родов Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus или Streptomyces; или видов В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. licheniformis, В. puntis, В. megaterium, В. halodurans, В. pumilus, G. oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas putida, Paracoccus zeaxanthinifaciens, Paracoccus denitrificans, E.coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti и Rhizobium radiobacter.

8. Клетка по п.6, представляющая собой дрожжевую клетку, выбранную из группы, состоящей из родов Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или видов Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica и Pichia pastoris, или клетку мицелиального гриба, выбранную из группы родов Aspergillus, Chrysosporium, Penicillium, Talaromyces или Trichoderma; или видов Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei или Penicillium chrysogenum.

9. Способ получения полипептида по п.1, включающий культивирование клетки по любому из пп.6-8 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.

10. Полипептид по п.1, полученный способом по п.9.

11. Способ получения 2,5-фурандикарбоновой кислоты (FDCA), согласно которому один или несколько фурановых предшественников FDCA превращают в FDCA взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.

12. Способ по п.11, где фурановый предшественник FDCA выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF), 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирта) и 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), предпочтительно фурановый предшественник представляет собой HMF.

13. Способ по п.11 или 12, где фурановым предшественником FDCA является HMF, который получают из одного или нескольких сахаров-гексоз путем нагревания в присутствии кислоты.

14. Способ по п.13, где один или несколько сахаров-гексоз получают из лигноцеллюлозной биомассы.

15. Способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), согласно которому один или несколько фурановых предшественников HMF-кислоты превращают в HMF-кислоту взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.

16. Способ по п.15, где фурановый предшественник HMF-кислоты выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF) и 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирта).

17. Способ по любому из пп.11-16, где фурановый предшественник FDCA превращают в FDCA или фурановый предшественник HMF-кислоты превращают в HMF-кислоту в присутствии одного или нескольких коферментов, представляющих собой никотинамидадениндинуклеотид (NAD+), и/или пирролохинолинхинолон (PQQ), и/или флавинадениндинуклеотид (FAD).

18. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор представляет собой бесклеточный экстракт клетки, содержащий полипептид по п.1 или 10.

19. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор является цельноклеточным биокатализатором, представляющим собой клетку, содержащую полипептид по п.1 или 10.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Полипептид с оксидоредуктазной активностью класса EC1.1 и ЕС1.2 в отношении как спиртовой, так и альдегидной группы, находящихся в положении С2 или С5 фуранового цикла, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.

2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1.

3. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1 и выбранную из группы, включающей: (a) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4; (b) нуклеотидную последовательность, которая избирательно гибридизируется с полинуклеотидом, который комплементарен SEQ ID NO: 4; (c) нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 66% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4; (d) последовательность, которая является вырожденной вследствие избыточности генетического кода по отношению к последовательности, определенной в любом из (а), (b) или (с); или (e) нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (b), (с) или (d).

4. Конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1, где нуклеотидная последовательность функционально соединена с регуляторной последовательностью.

5. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3 или конструкцию по п.4.

6. Клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3, конструкцию по п.4 или вектор по п.5.

7. Клетка по п.6, представляющая собой бактерию, выбранную из группы, состоящей из родов Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus или Streptomyces; или видов В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. licheniformis, В. puntis, В. megaterium, В. halodurans, В. pumilus, G. oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas putida, Paracoccus zeaxanthinifaciens, Paracoccus denitrificans, E.coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti и Rhizobium radiobacter.

8. Клетка по п.6, представляющая собой дрожжевую клетку, выбранную из группы, состоящей из родов Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или видов Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica и Pichia pastoris, или клетку мицелиального гриба, выбранную из группы родов Aspergillus, Chrysosporium, Penicillium, Talaromyces или Trichoderma; или видов Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei или Penicillium chrysogenum.

9. Способ получения полипептида по п.1, включающий культивирование клетки по любому из пп.6-8 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.

10. Полипептид по п.1, полученный способом по п.9.

11. Способ получения 2,5-фурандикарбоновой кислоты (FDCA), согласно которому один или несколько фурановых предшественников FDCA превращают в FDCA взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.

12. Способ по п.11, где фурановый предшественник FDCA выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF), 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирта) и 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), предпочтительно фурановый предшественник представляет собой HMF.

13. Способ по п.11 или 12, где фурановым предшественником FDCA является HMF, который получают из одного или нескольких сахаров-гексоз путем нагревания в присутствии кислоты.

14. Способ по п.13, где один или несколько сахаров-гексоз получают из лигноцеллюлозной биомассы.

15. Способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), согласно которому один или несколько фурановых предшественников HMF-кислоты превращают в HMF-кислоту взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.

16. Способ по п.15, где фурановый предшественник HMF-кислоты выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF) и 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирта).

17. Способ по любому из пп.11-16, где фурановый предшественник FDCA превращают в FDCA или фурановый предшественник HMF-кислоты превращают в HMF-кислоту в присутствии одного или нескольких коферментов, представляющих собой никотинамидадениндинуклеотид (NAD+), и/или пирролохинолинхинолон (PQQ), и/или флавинадениндинуклеотид (FAD).

18. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор представляет собой бесклеточный экстракт клетки, содержащий полипептид по п.1 или 10.

19. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор является цельноклеточным биокатализатором, представляющим собой клетку, содержащую полипептид по п.1 или 10.


Евразийское 025990 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201200398
(22) Дата подачи заявки
2010.09.02
(51) Int. Cl.
C07D 307/50 (2006.01) C11D 3/386 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12P 7/44 (2006.01)
(54) ПОЛИПЕПТИДЫ С ОКСИДОРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 09169227.7; 09172555.6
(32) 2009.09.02; 2009.10.08
(33) EP
(43) 2012.09.28
(86) PCT/EP2010/062896
(87) WO 2011/026913 2011.03.10
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ПЮРАК БИОХЕМ Б.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Реёссенарс Хералд Йохан, Виркс Ник Йоханнес Петрус, Копман Франк Ваутер, Стратхоф Адрианус Йоханнес Йозеф, Винде де Йоханнес Хендрик (NL)
(74) Представитель:
Воробьева Е.В. (RU)
(56) DATABASE UniProt [Online], 1 July 2008 (2008-07-01), "SubName: Full=G1ucose-methanol-choline oxidoreductase"; XP002559847, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:B2T4R9, Database accession no. B2T4R9, cited in the application, the whole document
DATABASE UniProt [Online], 10 June 2008 (2008-06-10), "SubName: Full=Glucose-methanolcholine oxidoreductase"; XP002559848, retrieved from EBI accession no. UNIPROT:B2JSZ0, Database accession no. B2JSZ0, cited in the application, the whole document
WO-A-2009023174
DEURZEN VAN M.P.J. ET AL.: "CHLOROPEROXIDASE-CATALYZED OXIDATION OF 5-HYDROXYMETHYLFURAL",
JOURNAL OF CARBOHYDRATE CHEMISTRY,
NEW YORK, NY, US, vol. 16, no. 3, 1 January 1997 (1997-01-01), pages 299-309, XP009002072, ISSN: 0732-8303, cited in the application, page 302-303, page 305
KROGER M. ET AL.: "A new approach for the production of 2,5-furandicarboxylic acid by in situ oxidation of 5-hydroxymethylfurfural
starting from fructose", TOPICS IN CATALYSIS,
BALTZER SCIENCE PUBLISHERS, BUSSUM, NL, vol. 13, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 237-242, XP002519332, ISSN: 1022-5528, page 237, paragraph
MITSUKURA KOICHI ET AL.: "Oxidation
of heterocyclic and aromatic aldehydes to the corresponding carboxylic acids by Acetobacter and
Serratia strains", BIOTECHNOLOGY LETTERS,
KEW, SURREY, GB, vol. 26, no. 21, 1 November 2004 (2004-11-01), pages 1643-1648, XP002510697, ISSN: 0141-5492, page 1644, the whole document
US-A1-2007243594
(57) Изобретение относится к полипептиду с оксидоредуктазной активностью класса ЕС1.1 и ЕС1.2 в отношении как спиртовой, так и альдегидной группы, находящихся в положении С2 или С5 фуранового цикла, содержащему аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей заявленный полипептид; конструкции, содержащей данную нуклеиновую кислоту; вектору, включающему данную конструкцию; клетке, содержащей указанную нуклеиновую кислоту, конструкцию или вектор; способу получения заявленного полипептида посредством культивирования указанной клетки, а также к различным способам, основанным на использовании заявленного полипептида.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к полипептиду, обладающему оксидоредуктазной активностью, и к нуклео-тидным последовательностям, включающим ген, который кодирует полипептид. Изобретение также относится к получению 2,5-фурандикарбоновой кислоты (FDCA). В изобретение также включаются все клетки, трансформированные полинуклеотидом по изобретению, подходящим для получения таких полипептидов, который также можно использовать для биотрансформации гидроксиметилфурфураля (HMF) в FDCA.
Предпосылки создания изобретения
2,5-Фурандикарбоновая кислота (FDCA) имеет большой потенциал для того, чтобы стать биологической альтернативой терефталата при получении сложных полиэфиров, таких как ПЭТФ (PET). По указанной и по другим причинам FDCA идентифицирована как один из 12 самых приоритетных химических продуктов в сообщении DOE на Top Value-Added Chemicals from Biomass (Top Value-Added Chemicals from Biomass, Volume I - Results of screening for potential Candidates from Sugars and Syhthesis gas, Department of Energy (USA), 2004). Такое соединение можно получить окислением 5-гидроксиметилфурфураля (HMF), который можно получить нагреванием сахаров-гексоз в кислой среде. В сообщении DOE на с. 27 раскрываются некоторые возможные использования FDCA. К ним относится ее роль как субстрата для получения янтарной кислоты, 2,5-бис-(аминометил)тетрагидрофурана, 2,5-дигидроксиметилтетрагидро-фурана, 2,5-дигидроксиметилфурана и 2,5-фурандикарбальдегида. Хотя получение FDCA окислительной дегидратацией С6-сахаров и использование FDCA хорошо известны и имеют некоторые технические препятствия, указанные в табл. 13 на с. 26, для биотрансформации - возможной ферментативной конверсии - таких данных нет.
Способ ферментативного получения FDCA приводится в WO 2009/023174. В данном раскрытии образец гидроксиметилфурфураля окисляют хлорпероксидоредуктазой и пероксидом водорода, причем окисленные продукты имеют карбоксильную группу в положении C1 гидроксиметилфурфураля, в частности формилфуранкарбоновая кислота или FDCA. Результаты приводятся, например, на фиг. 1. В другом воплощении HMF вводят в контакт с оксидоредуктазой в присутствии окисляющего субстрата, посредством чего HMF окисляется по меньшей мере до одной из кислот - диформилфуран- или формилфу-ранкарбоновой кислоты.
Недостатками известного способа по WO 2009/023174 является то, что для реакции требуется пе-роксид водорода, и что полученный продукт представляет собой смесь FDCA с двумя загрязняющими побочными продуктами гидроксиметилфуранкарбоновой кислотой (HmFCA) и формилфуранкарбоновой кислотой (FFCA). В результате образование FDCA из HMF снижается, и требуются дополнительные стадии извлечения для получения FDCA, по существу, в очищенной форме.
В базе данных EBI, Uniport B2T4R9, идентифицирована последовательность из 577 аминокислот, которая на основе анализа гомологии была определена как глюкоза-метанол-холин-оксидоредутаза в "полной последовательности хромосомы 1 Burkholderia phytofirmans PsJN".
В базе данных EBI, Uniport B2JSZ0, идентифицирована последовательность из 576 аминокислот, которая на основе анализа гомологии была определена как глюкоза-метанол-холин-оксидоредутаза в "полной последовательности плазмиды 1 Burkholderia phymatum STM815".
В Deurzen M.P.J. et al., J. Carbohydrate Chemistry, 16(3), 299-309 (1997), раскрывается катализируемое хлорпероксидазой окисление 5-гидроксиметилфурфураля. Реакция протекает с 60-74% селективностью в отношении фуран-2,5-дикарбоксальдегида (FDC). Побочными продуктами являются гидроксиме-тил-2-фуранкарбоновая кислота (HFCA) и 5-формилфуран-2-карбоновая кислота (FFCA).
Сущность изобретения
Целью изобретения является оксидоредуктаза, которая может использовать для окислительно-восстановительных реакций молекулярный кислород. Другой целью является оксидоредуктаза, которая имеет широкий спектр реакций. Другой целью является оксидоредуктаза, которая имеет высокую региоспецифичность. Другой целью изобретения является способ получения FDCA, при котором можно избежать образования значительного количества побочных продуктов. Другой целью изобретения является способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), при котором можно избежать образования значительного количества побочных продуктов. Одна или несколько указанных целей достигаются согласно изобретению.
Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды с оксидоредук-тазной активностью. Полинуклеотиды по изобретению типично кодируют полипептид с оксидоредук-тазной активностью, в частности HmfH-оксидоредуктазной активностью.
Согласно изобретению, таким образом, предлагается полипептид с оксидоредуктазной активностью, который включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, кодированную нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, или вариант такого полипептида, имеющего 45% или большую идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 3.
Такие полипептиды-оксидоредуктазы представляют ферментную альтернативу химических путей окисления для получения ценного соединения FDCA, допускающую умеренные условия реакции (30°С,
рН 7) и образование меньшего количества отходов. Оксидоредуктаза является истинной оксидазой, т.е. для реакции окисления требуется только молекулярный кислород, причем снимается требование регенерации дорогостоящих кофакторов. Фермент предоставляет широкую реакционную специфичность и ре-гиоспецифичность, окисляя как спиртовые, так и альдегидные группы в итоге до карбоновой кислоты, безотносительно, находятся эти группы в положении С2 или С5 фуранового цикла.
Изобретение также относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, включающему нук-леотидную последовательность по изобретению, и клетке, включающей полипептид, полинуклеотид или вектор по изобретению.
Изобретение также относится к способу получения полипептида с оксидоредуктазной активностью, включающему культивирование клетки по изобретению в условиях, которые допускают экспрессию указанного полипептида, и, необязательно, извлечение экспрессированного полипептида, и полипептиду, который может быть получен таким способом.
Другое воплощение изобретения относится к комплексному способу получения FDCA из сырьевого потока, богатого (обогащенного) фруктозой, с использованием устойчивого биокатализатора на основе целых клеток.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Схема реакций окисления, катализируемых оксидоредуктазой HmfH.
Фиг. 2. Плазмидная карта экспрессирующего вектора HmfH pJT'hmfH. Ptac' - промотор tac; rep - ген, кодирующий белок репликации pRO1600; gmR - ген устойчивости к гентамицину; bla - бета-лактамаза; pRO1600-ori - область начала репликации для Р. putida; pUC ori - область начала репликации для B.coli.
Фиг. 3. Схематическое представление генетической организации генов метаболизма фурфураля и HMF в С. basilensis HMF14 (верхняя строка на фиг. 3а и 3c) и других видах (оставшиеся строки на фиг. 3а с продолжением на фиг. 3c).
Фиг. 4. Образование FDCA, HMF-спирта (HMF-oh) и HMF-кислоты (Н-кислота) из HMF в неочищенном клеточном экстракте P. putida S12 pJT'hmfH.
Фиг. 5. Образование HMF-кислоты и FDCA в культуре с подпиткой Р. putida_pJT'hmfH. Стрелка слева показывает начало подпитки HMF; стрелка справа показывает добавление глицерина к подпитке.
Фиг. 6. Образование HMF-кислоты и FDCA в культуре с подпиткой Р. putida_pJT'hmfH.
Фиг. 7А. Концентрации HMF-кислоты, FDCA и биомассы при ферментации с подпиткой в примере
VIII.
Фиг. 7B. Скорости подачи глицерина и HMF при ферментации с подпиткой в примере VIII. Краткое описание перечня последовательностей
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность ДНК праймера FN23: 5'-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3'. Подчеркнутая последовательность показывает сайт рестрикции EcoRI.
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность ДНК праймера FN24; 5'-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3'. Подчеркнутая последовательность показывает сайт рестрикции EcoRI.
SEQ ID NO: 3 представляет аминокислотную последовательность f HmfH.
SEQ ID NO: 4 представляет кодирующую последовательность hmfH.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения слова "заключать в себе" и "включать" и такие вариации, как "заключает в себе", "заключающий в себе", "включает" и "включающий" следует интерпретировать как включительно. Иными словами, указанные слова предназначены для выражения возможного включения, где это допускает контекст, других не перечисленных конкретно элементов или целых чисел.
Единственное число, используемое в данном описании, относится к одному или больше, чем одному (т.е. по меньшей мере одному) объекту. Например, "элемент" может означать один элемент или больше одного элемента.
Широкий спектр реакций в данном описании означает, что оксидоредуктаза может действовать как катализатор для нескольких различных субстратов, например HMF, HMF-кислоты, HMF-спирта, фурфу-раля, фурфурилового спирта. Региоспецифичность означает, что она окисляет только определенные атомы С.
Полипептид-оксидоредуктаза.
Полипептид по изобретению, обладающий оксидоредуктазной активностью, включает аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 4, или его вариант, имеющий по меньшей мере 45% идентичность с последовательностью, представленной SEQ ID NO: 3.
В одном воплощении вариант молекулы нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, включающую, по существу, гомологичную нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 66, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологичную нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 4. В другом воплощении вари
ант белка включает, по существу, гомологичную аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше гомологичную аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 3.
Воплощением изобретения является полинуклеотид, который включает (а) нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4; (b) нуклеотидную последовательность, которая селективно гибридизируется с полинуклеотидом, который обратно комплементарен SEQ ID NO: 4; (с) нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 66% или большую идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4; (d) фрагмент нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (b) или (с), который имеет по меньшей мере примерно 100 нуклеотидов в длину; (е) вырожденная последовательность, как результат вырожденности генетического кода до последовательности, определенной в любом из (а), (b), (с) или (d); (f) нуклеотидная последовательность, обратно комплементарная нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (b), (с), (d) или (е), или кодирует полипептид; и родственные полипептиды.
Одним воплощением является конструкция нуклеиновой кислоты, включающая полинуклеотид, при этом содержание GC может составлять 56% или больше, 58% или больше или 58-65%. Другим воплощением является вектор, включающий нуклеотидную последовательность или конструкцию нуклеиновой кислоты.
Термины "гомология", "идентичность последовательности" и т.п. используются в данном описании как взаимозаменяемые. Для цели данного изобретения в данном описании определяется, что для того, чтобы определить степень идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклео-тидных последовательностей, последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, в последовательность первой аминокислоты или нуклеотидной последовательности могут быть введены гэпы (пробелы) для оптимального выравнивания со второй нуклеотидной последовательностью). Такое выравнивание можно осуществить по всей длине сравниваемых последовательностей. С другой стороны, выравнивание можно осуществить для сравнения по меньшей длине, например, по примерно 20, примерно 50, примерно 100 или больше нуклеиновым кислотам/основаниям или аминокислотам.
Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих позициях аминокислот или нуклеотидных позициях. Когда позиция в первой последовательности занята таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом как и в соответствующей позиции во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в указанной позиции. Степень идентичности между двумя последовательностями типично выражается в процентах идентичности между двумя последовательностями и является функцией числа идентичных позиций, у последовательностей (т.е. % идентичности = число идентичных позиций/общее число позиций (т.е. перекрывающихся позиций) х 100). Предпочтительно две сравниваемые последовательности имеют одинаковую или по существу одинаковую длину.
Специалисту будет известен тот факт, что для определения гомологии между двумя последовательностями доступно несколько различных компьютерных программ. Например, сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма. В предпочтительном воплощении идентичность в процентах между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), который включен в программу GAP в программном обеспечении Accelrys GCG (доступно на http://www.accelrys.com/products/gcg/), с использованием или матрицы Biossom 62 или матрицы РАМ250 и штраф за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штраф за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту следует иметь в виду, что все указанные различные параметры будут давать несколько различные результаты, но что общая идентичность двух последовательностей, выраженная в процентах, существенно не изменяется с использованием различных алгоритмов.
В еще одном воплощении идентичность в процентах между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в программном обеспечении Accelrys GCG (доступно на http://www.accelrys.com/products/gcg/), с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и штрафа за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и штрафа за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом воплощении идентичность двух аминокислотных последовательностей, выраженную в процентах, определяют с использованием алгоритма Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989), который включен в программу ALIGN (версия 2.0) (доступна на ALIGN Query с использованием данных о последовательностях сервера Genestream IGH Montpeller France http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) с использованием таблицы веса замен аминокислотных остатков РАМ120, штрафа за продолжение гэпа 12 и штрафа за открытие гэпа 4.
Нуклеотидные и белковые последовательности по настоящему изобретению также можно использовать в качестве "запросной (query) последовательности" для осуществления поиска в базах данных общего пользования для, например, идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такой поиск можно выполнять с использованием программ BLASTn и BLASTx (версия 2.0) Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215: 403-10. Поиск нуклеотидов по BLAST можно выполнять с помо
щью программы NBLAST, количество = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты кодирующим оксидоредуктазу по изобретению. Поиск белков по BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTx, количество = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка окси-доредуктазы по изобретению. Для того чтобы получить выравнивания с гэпами для целей сравнения, можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25(17): 33893402. Когда используют программы BLAST и Gapped BLAST, можно использовать принимающие значение по умолчанию параметры соответствующих программ (например, BLASTx и BLASTn). См. собственную страницу National Center for Biotechnology Information на http://www.ncbi.nim.nih.gov/.
Используемый в данном описании термин "селективная гибридизация", "гибридизуется селективно" и подобные термины предназначены для описания условий гибридизации и отмывки, при которых нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, предпочтительнее по меньшей мере на 85%, даже предпочтительнее по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительнее по меньшей мере на 98% или предпочтительнее по меньшей мере на 99% гомологичные друг другу, типично остаются гибри-дизированными друг с другом. Иначе говоря, такие гибридизирующие последовательности могут иметь последовательности, идентичные по меньшей мере на 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, предпочтительнее по меньшей мере 85%, даже предпочтительнее по меньшей мере 90%, предпочтительнее по меньшей мере 95%, предпочтительнее по меньшей мере 98% или предпочтительнее по меньшей мере 99%.
Предпочтительным неограничительным примером таких условий гибридизации является гибридизация в 6Х буфере хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при примерно 45°С с последующей одной или несколькими отмывками 1 X SSC, 0,1% SDS при примерно 50°С, предпочтительно SDS при примерно 55°С, предпочтительно при примерно 60°С и даже предпочтительнее при примерно 65°С.
Особенно жесткие условия включают, например, гибридизацию при примерно 68°С в 5х SSC/5x раствор Денхардта/0,1% SDS и отмывку в 0,2 SSC/0,1% SDS при комнатной температуре. С другой стороны, промывку можно осуществлять при 42°С.
Специалистам в данной области техники будет известно, какие условия применяются для гибридизации в жестких и особенно жестких условиях. Дополнительные указания, касающиеся таких условий, легко доступны в уровне техники, например, из Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; и Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, N.Y.).
Конечно, полинуклеотид, который гибридизирует только с последовательностью поли-А (такой как 3'-концевой участок поли(А) мРНК) или с комплементарным участком остатков Т (или U), не включается в полинуклеотид по изобретению, используемый для специфической гибридизации с частью нуклеиновой кислоты по изобретению, так как такой полинуклеотид может гибридизировать с любой молекулой нуклеиновой кислоты, включающей участок поли(А) или его комплемент (например, практически любым клоном двухцепочечной кДНК).
При типичном подходе можно скринировать библиотеки генов, сконструированные из других организмов, например, бактерии, в частности, из микроорганизма семейства Trichomaceae, например, из рода Burkholderia, такго как Burkholderia phytofirmans.
Например, штаммы Burkholderia можно скринировать на гомологичные полинуклеотиды оксидоре-дуктазы анализом методом саузерн-блоттинга. После детекции гомологичных фрагментов рестрициро-ванной ДНК по изобретению библиотеки генов можно сконструировать из хромомосомных фрагментов такого же размера из соответствующего штамма с использованием стандартных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. С другой стороны, если микроорганизм является эука-риотом, можно идентифицировать транскрипт мРНК HmfH оксидоредуктазы норзерн-гибридизаций, и после идентификации транскрипта можно получить библиотеки кДНК с использованием РНК, выделенной из эукариотического микроорганизма.
Гомологичные последовательности генов можно выделить, например, осуществляя ПЦР с использованием двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, созданных на основе нуклеотидных последовательностей по данному описанию.
Матрица для реакции может представлять собой тотальную хромосомную ДНК из штамма, о котором известно или предполагается, что он экспрессирует полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать для того, чтобы гарантировать, что амплифицированные последовательности представляют последовательности нуклеотидной последовательности новой оксидоредук-тазы или их функциональный эквивалент.
С другой стороны, матрица для реакции может представлять собой кДНК, полученную обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или предполагается, что они экс-прессируют полинуклеотид по изобретению. Продукт ПЦР можно субклонировать и секвенировать для того, чтобы гарантировать, что амплифицированные последовательности представляют собой последо
вательности нуклеотидной последовательности новой оксидоредуктазы или их функциональный эквивалент.
Затем можно использовать фрагмент ПЦР для выделения полноразмерного клона ДНК различными известными методами. Например, амплифицированный фрагмент можно пометить и использовать для скрининга бактериофаговой или космидной библиотеки кДНК. С другой стороны, меченный фрагмент можно использовать для скрининга геномной библиотеки.
Технологию ПЦР также можно использовать для выделения полноразмерных последовательностей кДНК из других организмов. Например, следуя стандартным процедурам можно выделить РНК из соответствующего клеточного или тканевого источника. Реакцию обратной транскрипции можно выполнить на РНК с использованием олигонуклеотидного праймера, специфичного для большей части 5'-конца ам-плифицированного фрагмента, для затравки синтеза первой цепи.
Затем полученный гибрид РНК/ДНК можно "нарастить" (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции с концевой трансферазой, гибрид можно гидролизовать РНКазой Н, и затем можно начать синтез второй цепи (например, с помощью праймера поли-С). Таким образом, можно легко выделить последовательности кДНК, локализованные выше (up-stream) амплифицированного фрагмента. Обзор по применимым стратегиям клонирования см., например, в Sambrook et al., цитировано выше, и Au-subel et al., цитировано выше.
Другой аспект изобретения относится к векторам, включая клонирующие и экспрессирующие векторы, включающие полинуклеотид по изобретению, кодирующий белок оксидоредуктазы, или его функциональный эквивалент, и способам наращивания, трансформации или трансфекции таких векторов в подходящей клетке-хозяине, например, в условиях, в которых происходит экспрессия полипептида по изобретению. Используемый в данном описании термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена.
Полинуклеотиды по изобретению могут быть введены в рекомбинантный реплицирующийся вектор, например, клонирующий и экспрессирующий вектор. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в совместимой клетке-хозяине. Таким образом, в другом воплощении изобретение относится к способу получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинуклеотида по изобретению в реплицирующийся вектор, введения вектора в совместимую клетку-хозяина и выращивания клетки-хозяина в условиях, которые вызывают репликацию вектора. Вектор можно извлечь из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева описываются ниже.
Вектор, в который встраивают экспрессирующую кассету или полинуклеотид по изобретению, может представлять собой любой вектор, с которым можно работать методами работы с рекомбинантной ДНК, и выбор вектора обычно будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его вводят.
Вектор по изобретению может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный объект, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например плазмиду. С другой стороны, вектор может представлять собой вектор, который, когда введен в клетку-хозяина, интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицирует вместе с хромосо-мой(ами), в которую(ые) он интегрирован.
Одним типом вектора является "плазмида", которая относится к кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы с бактериальной областью начала репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) после введения в клетку-хозяина интегрируются в геном клетки-хозяина и в связи с этим реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном описании отнесены к "экспрессирующим векторам". Вообще, экспресси-рующие векторы, применимые в методах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" в данном описании могут использоваться как взаимозаменяемые, так как плазмида является наиболее традиционно используемой формой вектора. Однако предполагается, что изобретение включает все другие формы экспрессирующих векторов, такие как космида, вирусные векторы (например, реплицирующие дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы) и фаговые векторы, которые обслуживают эквивалентные функции.
Векторы по изобретению могут использоваться in vitro, например, для получения РНК, или использоваться для трансфекции или трансформации клетки-хозяина.
Вектор по изобретению может включать два или больше, например, три, четыре или пять, полинук-леотидов по изобретению, например, для сверхэкспрессии.
Рекомбинантные экспрессирующие векторы включают нуклеиновую кислоту по изобретению в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомби-нантный экспрессирующий вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных с учетом клеток-хозяев, используемых для экспрессии, которые функционально соединены с экспрессируемой нуклеотидной последовательностью.
Для вектора, такого как экспрессирующий вектор, термин "функционально соединенный" предназначен для обозначения того, что нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, соединена с регуляторной(ыми) последовательностью(ями) способом, который допускает экспрессию нуклеотид-ной последовательности (например, в системе транскрипция/трансляция in vitro или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина), т.е. термин "функционально соединенный" относится к непосредственному соседству, при этом описанные компоненты находятся в соотношении, позволяющем им функционировать предназначенным для них образом. Регуляторная последовательность, такая как промотор, энхансер или другой фактор, регулирующий экспрессию, функционально соединенный с кодирующей последовательностью, размещается таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условии совместимости с регулярными последовательностями, или последовательности располагаются так, что они функционируют вместе для цели, для которой предназначены, например, транскрипция инициируется в промоторе и протекает через последовательность ДНК, кодирующую полипептид.
Термин "регуляторная последовательность" или "управляющая последовательность" предназначен для включения промоторов, энхансеров и других регулирующих экспрессию элементов (например, сигнала полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Термин "регуляторные или управляющие последовательности" включает такие последовательности, которые управляют конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и такие, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в некоторых клетках-хозяевах (например, тканеспецифические регуляторные последовательности).
Вектор или экспрессирующая конструкция для данной клетки-хозяина может включать, таким образом, следующие элементы, функционально соединенные друг с другом в последовательном порядке от 5'-конца к 3'-концу относительно кодирующей цепи, кодирующей полипептид по изобретению: (1) про-моторную последовательность, способную управлять транскрипцией нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в данной клетке-хозяине; (2) необязательно, сигнальную последовательность, способную управлять секрецией полипептида из данной клетки-хозяина в культуральную среду; (3) последовательность ДНК по изобретению, кодирующую зрелую и предпочтительно активную форму полипептида, имеющего активность целлобиогидролазы; и предпочтительно также (4) участок терминации транскрипции (терминатор), способный терминировать транскрипцию расположенный ниже (down stream) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.
После нуклеотидной последовательности по изобретению может быть расположен 3'-нетранслируемый участок, содержащий один или несколько сайтов терминации транскрипции (например, терминатор). Источник терминатора является менее критическим. Терминатор може, например, являться нативным для последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Однако предпочтительно используют терминатор дрожжей в дрожжевых клетках-хозяевах, и терминатор мицелиальных грибов используют в клетках-хозяевах мицелиальных грибов. Предпочтительнее, терминатор является эндогенным для клетки-хозяина (в которой должна экспрессироваться нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид). В транскрибированном участке для трансляции может присутствовать сайт связывания рибосом. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, будет включать инициирующий трансляцию AUG в начале и терминирующий кодон, соответственно расположенный в конце транслированного полипептида.
Усиленной экспрессии полинуклеотида по изобретению также можно достичь путем отбора гетеро-логичных регуляторных участков, например, промотора, лидерной последовательности секреции и/или участков терминации, которые могут служить для усиления экспрессии и, если желательно, уровней секреции белка, представляющего интерес, из экспрессирующего хозяина и/или для обеспечения индуци-бельного управления экспрессией полипептида по изобретению.
Специалистам в данной области техники следует иметь в виду, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии нужного белка и т.д. Векторы по изобретению, такие как экспрессирующие векторы, могут быть введены в клетки-хозяев для того, чтобы посредством этого получать белки или пептиды, кодированные нуклеиновыми кислотами, как описано в данном описании (например, белки-оксидоредуктазы, мутант-ные формы белков-оксидоредуктаз, их фрагменты, варианты или функциональные эквиваленты, слитые белки и т.д.).
Векторы по изобретению, такие как рекомбинантные экспрессирующие векторы, могут быть сконструированы для экспрессии белков-оксидоредуктаз в клетках прокариот или эукариот. Например, бел-ки-оксидоредуктазы могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, таких как клетки Е.аэИ, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), клетках мицели-альных грибов, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева также обсуждаются в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Репрезентативные примеры соответствующих хозяев описываются в данном описании далее.
Соответствующие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в технике.
Как указано выше, термин "управляющие последовательности" или "регуляторные последовательности" определяется в данном описании как включающий, по меньшей мере, любой компонент, который может быть необходим и/или выгоден для экспрессии полинуклеотида. Любая управляющая последовательность может быть нативной или чужеродной для нуклеотидной последовательности по изобретению, кодирующей полипептид. Такие управляющие последовательности могут включать, но не ограничиваются указанным, промотор, лидерную последовательность, оптимальные последовательности инициации трансляции (как описано в Kozak, 1991, J. Biol. Chem., 266: 19867-19870), сигнальную последовательность секреции, пропептидную последовательность, последовательность полиаденилирования, терминатор транскрипции.
Как минимум, управляющая последовательность типично включает промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции.
Устойчиво трансформировнный микроорганизм представляет собой микроорганизм, который имеет один или больше фрагментов ДНК, введенных таким образом, что введенные молекулы сохраняются, реплицируются и сегрегируются в растущей культуре. Устойчивая трансформация может иметь место из-за нескольких или одной хромосомной интеграции или за счет внехромосомного(ых) элемента(ов), такого(их) как плазмидный(е) вектор(ы). Плазмидный вектор способен управлять экспрессией полипептида, кодировнного определенными фрагментами ДНК.
Экспрессия может быть конститутивной или регулируемой индуцируемыми (или репрессируемыми) промоторами, что делает возможным достичь высоких уровней транскрипции функционально ассоциированных фрагментов ДНК, кодирующих специфические полипептиды.
Выделение оксидоредуктазы.
Оксидоредуктазу или материал ДНК, экспрессирующий оксидоредуктазу, можно выделить из организма, предпочтительно микроорганизма, который экспрессирует оксидоредуктазу. Предпочтительно микроорганизм способен использовать HMF, но это не является необходимостью. Микроорганизм предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Cupriavidus, Burkholderia, Bradyhrizobium, Methylobacte-rium; Cupriavidus basisliensis, Burkholderia phytofirmans, Bradyhrizobium japonicum, Methylobacterium ra-diotolerans, Cupriavidus basisliensis HMF14, Burkholderia phytofirmans PsJN, Bradyhrizobium japonicum USDA110, Methylobacterium radiotolerans JCM2831.
Наиболее предпочтительной оксидоредуктазой, применимой в настоящем изобретении, является оксидоредуктаза, использующая HMF, и оксидоредуктаза, выделенная в данном случае из Cupriavidus basisliensis HMF14, депонированного согласно Будапештскому соглашению о международном признании депозитов микроорганизмов для цели патентных процедур при DSMZ: Cupriavidus basisliensis HMF14 = DSM 22875, дата депонирования 19 августа 2009 г., депозитор TNO, Schoemakerstraat 97, 2628VK Delft, Нидерланды.
Таким образом, авторы изобретения выделил использующую HMF бактерию штамм Cupriavidus ba-sisliensis HMF14 и идентифицировали гены, вовлеченные в путь разрушения HMF. Один из генов (в данном описании определенный как hmfH) кодирует FAD-зависимую оксидоредуктазу из 579 аминокислот в 62 кД, которая, как обнаружено, окисляет фурфуриловый спирт, фурфураль, HMF и 5-гидроксиметилфуроиновую кислоту.
Спиртовые/альдегидные группы при С2 и С5 в таких молекулах окисляются, не требуя дополнительной полинуклеотидной конструкции, кодирующей редуктазу, хотя присутствие таких активностей может быть выгодным (см. фиг. 1).
Таким образом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, например, ферментам с оксидоредуктазной активностью (активности ЕС 1.1 + ЕС 1.2). В данном случае ферменты являются подклассом полипептидов.
Реакция окисления.
Реакция окисления в данном случае представляет собой одно или несколько взаимодействий окислителя с производным фурана в присутствии оксидоредуктазы по изобретению и одного или нескольких коферментов (описанных в данном описании ниже). Реакция окисления может включать стадию реакции окисления, приводящую к продукту (например, окисление HMF-кислоты до FDCA). С другой стороны, она может включать более одной стадии реакции окисления, причем каждая стадия приводит к промежуточному соединению, где последнее промежуточное соединение представляет собой конечный продукт (например, окисление HMF до FDCA). Примеры реакций окисления приводятся на фиг. 1.
Одна стадия реакции окисления представляет собой получение 2,5-фурандикарбоновой кислоты (FDCA), при этом один или несколько фурановых предшественников FDCA превращаются в FDCA путем взаимодействия с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора и одного или нескольких коферментов, при этом оксидоредуктазный катализатор включает полипептид по изобретению. Фурановый предшественник FDCA можно выбрать из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF), 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирт) и 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислота), предпочтительно фурановый предшественник представляет собой HMF. HMF можно
получить из одного или нескольких сахаров-гексоз путем нагревания в присутствии кислоты обычным путем. Сахара-гексозы можно получить из биомассы. Реакция окисления также может представлять собой способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), при этом один или несколько фурановых предшественников HMF-кислоты превращаются в HMF-кислоту путем взаимодействия с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора и одного или нескольких кофер-ментов, при этом оксидоредуктазный катализатор включает полипептид по изобретению. В одном воплощении фурановый предшественник HMF-кислоты выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF) и 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирта). Возможны другие способы окисления.
Реакции окисления предпочтительно проводят при относительно умеренной температуре, т.е. 10-80°С, предпочтительнее 20-45°С, наиболее предпочтительно около 25-45°С. Во время реакции рН предпочтительно составляет 3-8, предпочтительнее, рН составляет примерно 7. Время реакции составляет 618 час с использованием атмосферного кислорода или чистого кислорода, и предпочтительно фермент является реакционноспособным в течение более длительного времени.
Реактор может представлять собой подходящий (продуваемый воздухом) биореактор. Он может работать периодически, непрерывно или предпочтительно с периодической подпиткой.
Продукты окисления, такие как FDCA, HMF-кислота и т.д. можно извлечь из реакционной смеси путем охлаждения/перекристаллизации и отделения кристаллизованного продукта окисления, например, кристаллизованной FDCA. Однако подходящими являются и другие способы извлечения, известные в технике, такие как, но без ограничения, осаждение кислотой и экстракция растворителем.
Необязательно реакция происходит в присутствии кофермента. Кофермент может представлять собой никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) и/или флавинадениндинуклеотид (FAD) и/или пирролохи-нолинхинолон (PQQ). В реакции окисления по изобретению обнаружен синергический эффект с дегид-рогеназной активностью, например, обнаружена эндогенная активность дегидрирования в клетке, в которой происходит реакция окисления, или присутствует в клеточном экстракте таких клеток. Способ получения полимера из одного или нескольких мономеров, при этом один из мономеров представляет
собой FDCA.
Окислитель.
Окислитель в реакциях по изобретению может представлять собой любой окислитель, предпочтительно кислород. Наиболее экономичным источником кислорода является воздух. Это выгодно в том отношении, что воздух легко получить из атмосферы бесплатно, он нетоксичен и нет необходимости удалять его после реакции. С другой стороны, можно использовать систему, высвобождающую молекулярный кислород. Систему, генерирующую кислород, в основном можно выбрать из различных генерирующих кислород систем, которые раскрыты в технике. Например, для генерации кислорода из перокси-да водорода можно использовать ферменты каталазы, уже присутствующие в реакционной смеси.
Производные фурана.
Производные фурана, как понимается в данном описании, представляют собой любые соединения, имеющие фурановую группу, которые могут окисляться до 2,5-фурандикарбоновой кислоты или ее предшественника. Предпочтительные производные фурана включают гидроксиметилфурфураль (HMF), гидроксиметилфуранкарбоновую кислоту (HMF-кислоту), 2,5-дигидроксиметилфуран (HMF-спирт). Фу-рановый цикл или его любая способная замещаться подгруппа могут быть замещены, например, ОН, (О-СЮ)-алкилом, алкилом, аллилом, арилом или простой эфирной RO-группой, включая циклические группы, в любом подходящем положении фуранового цикла.
Экспрессия оксидоредуктазы.
Независимо от точного механизма, используемого для экспрессии фермента, предполагается, что такая экспрессия может быть передана путем введения генов, кодирующих эти ферменты в другой клетке-хозяине, что может быть осуществлено способами, известными из уровня техники. Генетические элементы по определению в данном описании включают нуклеиновые кислоты (как правило, ДНК или РНК), имеющие экспрессируемые кодирующие последовательности для продуктов, таких как белки, специфические ферменты, апопротеины или антисмысловые РНК, которые экспрессируются или регулируют экспрессию релевантных ферментов. Экспрессированные белки могут функционировать как ферменты, репрессировать или дерепрессировать ферментативную активность или регулировать экспрессию ферментов. Рекомбинантные ДНК, кодирующие такие экспрессирующие последовательности, могут быть или хромосомными (интегрированными в хромосому клетки-хозяина, например, путем гомологичной рекомбинации) или внехромосомными (например, находящимися на одной или нескольких плазми-дах, космидах и других векторах, способных к саморепликации). Понятно, что рекомбинантные ДНК, используемые для трансформации клетки-хозяина согласно изобретению, могут включать, кроме структурных генов и факторов транскрипции, последовательности, регулирующие экспрессию, включая промоторы, репрессоры и энхансеры, которые действуют, регулируя экспрессию или дерепрессию кодирующих последовательностей для белков, апопротеинов или антисмысловой РНК. Например, такие управляющие последовательности можно встроить в клетки-хозяев дикого типа для промотирования сверхэкспрессии выбранных ферментов, уже кодированных в геноме клетки-хозяина, или, с другой сто
роны, их можно использовать для регулируемого синтеза кодированных ферментов вне хромосом.
Рекомбинантную ДНК можно ввести в клетку-хозяина с помощью любых средств, включая, но не ограничиваясь указанным, плазмиды, космиды, фаги, искусственные дрожжевые хромосомы или другие векторы, которые опосредуют перенос генетических элементов в клетку-хозяина. Такие векторы могут включать область начала репликации вместе с цис-действующими управляющими элементами, которые регулируют репликацию вектора, и генетические элементы, которые несет вектор. На векторе могут иметься селективные маркеры для облегчения идентификации тех клеток-хозяев, в которые введены генетические элементы.
Способы введения генетических элементов в клетку-хозяина (например, клонирование) хорошо известны специалистам в данной области техники. Можно использовать внехромосомный многокопийный плазмидный вектор для встраивания генетических элементов по настоящему изобретению. Вызванное плазмидой введение генетического элемента в клетки-хозяев включает начальное расщепление плазмид-ного вектора рестриктазой с последующим лигированием плазмиды и генетических элементов, кодирующих ферменты-мишени по изобретению. После рециркуляризации лигированной рекомбинантной плазмиды используют инфекцию (например, упаковку в фаге-лямбда) или другой механизм переноса плазмиды (например, электропорацию, микроинъекцию и т.д.) для переноса плазмиды в клетку-хозяина. Плазмиды, подходящие для встраивания генетических элементов в клетку-хозяина, хорошо известны специалистам в данной области техники.
Другие методы клонирования генов включают, но не ограничиваются указанным, прямую интеграцию генетического материала в хромосому. Это можно осуществить различными способами, включая клонирование генетических элементов, описанных в данном описании, в нереплицирующиеся плазмиды, фланкированные последовательностями, гомологичными ДНК хозяйской хромосомы; после трансформации указанной рекомбинантной плазмиды в хозяина генетические элементы можно ввести в хромосому рекомбинацией ДНК. Такие рекомбинантные штаммы можно извлечь, если интегрирующиеся фрагменты ДНК содержат селектируемый маркер, такой как устойчивость к антибиотику. С другой стороны, генетические элементы можно непосредственно ввести в хромосому клетки-хозяина без использования нереплицирующейся плазмиды. Это можно осуществить путем синтетического получения фрагментов ДНК генетических элементов согласно настоящему изобретению, которые также содержат последовательность, гомологичную ДНК хозяйской хромосомы. Снова, если такие синтетические фрагменты ДНК также содержат селектируемый маркер, генетические элементы можно встроить в хозяйскую хромосому.
Клетка-хозяин.
Другим воплощением изобретения является клетка, включающая полипептид, полинуклеотид, по-линуклеотидную конструкцию или вектор по изобретению. Клетка-хозяин представляет собой клетку, в которой соответственно могут быть экспрессированы полипептид, полинуклеотид, полинуклеотидная конструкция или вектор по изобретению.
В клетке-хозяине может быть благоприятно экспрессирована оксидоредуктаза. Клетка-хозяин по изобретению может представлять собой любую клетку-хозяина. Клетка может представлять собой клетку прокариот, клетку эукариот, клетку растения или клетку животного. В такой клетке один или несколько генов могут быть делетированы, нокаутированы или разрушены полностью или частично, при этом необязательно эти один или несколько генов кодируют протеазу. Согласно воплощению клетка-хозяин по изобретению представляет собой эукариотическую клетку-хозяина. Предпочтительно эукарио-тическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, насекомого, растения, гриба или водоросли. Предпочтительные клетки млекопитающих включают, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки COS, клетки 293, клетки PerC6 и гибридомы. Предпочтительные клетки насекомых включают, например, клетки Sf9 и Sf21 и их производные. Предпочтительнее, эукариотическая клетка представляет собой клетку гриба, например, дрожжевую клетку, такую как клетка Candida, Hansenula, Kluy-veromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или штамма Yarrowia. Предпочтительнее, клетка представляет собой клетку Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica и Pichia pastoris или клетку мицелиального гриба. Предпочтительнее эукариотическая клетка представляет собой клетку мицелиального гриба.
"Мицелиальный гриб" включает мицелиальные формы подотдела Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth et al. в Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Мицелиальные грибы характеризуются стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит путем удлинения гифов, и углеродный катаболизм обязательно аэробный. Штаммы мицелиальных грибов включают, но не ограничиваются указанным, штаммы Acremonium, Aga-ricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium и Trichoderma.
Предпочтительные клетки мицелиальных грибов принадлежат видам Aspergillus, Chrysosporium, Penicillium, Talaromyces или роду Trichoderma и наиболее предпочтительно видам Aspergillus niger, As-pergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, As
pergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei или Penicillium chrysogenum. Когда клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку-хозяина Aspergillus, клетка-хозяин предпочтительно представляет собой CBS 513.88, CBS124.903 или их производные.
Некоторые штаммы мицелиальных грибов легко общедоступны в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), например, штаммы Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chry-sogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 124.902, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 или ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 или ATCC 56765 или ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chryso-sporium lucknowense ATCC44006. Также можно использовать их производные.
Согласно другому воплощению клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку прокариот. Предпочтительно прокариотическая клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку. Термин "бактериальная клетка" включает как грамотрицательные, так и грамположительные микроорганизмы. Подходящие бактериальные клетки можно выбрать, например, из Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizo-bium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobac-terium, Staphylococcus или Streptomyces. Предпочтительно бактериальную клетку выбирают из группы, состоящей из В. subtilis, В. amyloliquefaciens, В. licheniformis, В. puntis, В. megaterium, В. halodurans, В. pumilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida S12, Paracoccus deni-trificans, E.coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti и Rhi-zobium radiobacter.
Для специфического использования соединения, полученного в клетке-хозяине по изобретению, можно осуществить отбор клетки-хозяина для такого использования. Когда, например, соединение, полученное в клетке-хозяине по изобретению, следует использовать в применениях к пищевым продуктам, клетку-хозяина можно выбрать из пищевых микроорганизмов, таких как Saccharomyces cerevisiae. Специфическое использование включает, но не ограничивается указанным, применения в пищевых продуктах, кормах (для животных), в фармации, сельском хозяйстве, например, для защиты посевов, и/или для личной гигиены.
Изобретение также относится к способу получения полипептида с оксидоредуктазной активностью, который включает культивирование клетки по изобретению в условиях, в которых возможна экспрессия указанного полипептида, и, необязательно, извлечение экспрессированного полипептида, и к полипептиду, который можно получить таким способом.
Исходный материал.
Сельскохозяйственные культуры, по природе богатые фруктанами (например, корни топинамбура или цикория), можно превратить в богатый HMF исходный материал обычным (комбинированным) гидролизом и термохимической обработкой. Технология получения HMF из фруктозы хорошо отработана и является надежной. Также можно использовать исходный материал, богатый глюкозой, но термохимическое получение HMF проходит более эффективно из фруктозы. Поэтому может быть включена дополнительная ферментативная стадия для превращения глюкозы во фруктозу с использованием глюкозоизоме-разы. Последний процесс хорошо отработан в пищевой промышленности для получения кукурузной патоки с высоким содержанием фруктозы (HFCS) из гидролизованного крахмала. Для того чтобы избежать конкуренции с применениями в пищевых продуктах, для получения HMF/FDCA предпочтительным исходным материалом может быть гидролизат лигноцеллюлозы.
Биотрансформация.
Для биотрансформации HMF в FDCA используют надежный биокатализатор на основе целых клеток (свободные или иммобилизованные клетки), который экспрессирует HMF-оксидоредуктазу Cupria-vidus basilensis, описанную в данном описании ранее. Цельноклеточный биокатализатор имеет некоторые преимущества перед ферментным катализатором в данном способе: HMF-оксидоредуктаза защищена от химической инактивации высоко реакционноспособным субстратом и собственные дегидрогеназы хозяина могут помогать HMF-оксидоредуктазе на первых двух стадиях окисления, ведущих от HMF до (возможно) соответствующей монокислоты, которая затем превращается в дикислоту с помощью HmfH. Предпочтительно могут потребоваться дополнительные меры для обеспечения регенерации кофакторов. Цельноклеточный биокатализатор должен делать возможной минимальную переработку потока сырья HMF, т.е. предпочтительно он устойчив к низкому рН, высокой Т и токсичным соединениям (среди которых субстрат), которые образуются при гидролизе/термохимической конверсии исходного материала.
Pseudomonas putida S12 можно квалифицировать как подходящий организм-хозяин с точки зрения его устойчивости к различным химических стрессорам, его относительно широкого интервала рН и наличия собственных дегидрогеназ, которые помогают HMF-оксидоредуктазе, что приводит к более эффективной биотрансформации HMF в FDCA.
Как альтернативу цельноклеточному катализатору, таким же путем как цельноклеточный катализатор можно использовать клеточный лизат, очищенный фермент или иммобилизованный фермент один или в виде смеси ферментов.
Продукт и извлечение биомассы.
После биотрансформации клетки можно отделить от питательной среды известными способами и использовать повторно. FDCA, в том случае, если это желательно, можно извлечь с высокой чистотой в форме дикислоты осаждением кислотой и экстракцией растворителем или другими способами очистки, известными в технике.
Использование FDCA.
FDCA можно использовать в качестве альтернативы терефталату при получении сложных полиэфиров. Ее также можно использовать в качестве субстрата для самых разных ценных соединений. Например, она является известным субстратом для получения янтарной кислоты, 2,5-бис-(аминометил)тетрагидрофурана, 2,5-дигидроксиметилтетрагидрофурана, 2,5-дигидроксиметилфурана и 2,5-фурандикарбальдегида. FDCA можно использовать при получении покрытий, например, в покрытиях на основе алкидных смол и термопластичных покрытиях. Ее также можно использовать в качестве эквивалента ксилола в биотопливе и в качестве растворителя.
FDCA можно этерифицировать, и эфиры можно использовать в качестве пластификаторов. Ее можно превратить в диамин, диамин можно использовать в качестве удлинителя цепи, и диамин можно превратить в диизоцианат, который можно использовать при получении полиуретанов. Благодаря способу по изобретению, FDCA и продукты, получаемые из FDCA, можно получить через биотрансформацию из биомассы, в том числе, лигноцеллюлозной биомассы.
Примеры
Общая методология.
Штаммы и плазмиды. Cupriaviavidus basilensis HMF14, депонированный в DSMZ: Cupriaviavidus ba-silensis HMF14 = DSM 22875, дата депонирования 19 августа 2009, является почвенным изолятом, который способен использовать фураны в качестве единственного источника углерода. Pseudomonas putida S12 используют в качестве хозяина для экспрессии HMF-оксидоредуктазы. Escherichia coli DH5a (Invi-trogen) используют для общих целей клонирования. Челночную плазмиду pJT'mcs pUCP22, полученную из Е.coli-P. putida (не опубликовано), используют для экспрессии HMF-оксидоредуктазы под контролем конститутивного промотора tac. Для репликации в Е.^И используют область начала репликации pUC; для репликации в P. putida используют область начала репликации pRO1600. Экспрессия гена hmfH идет от конститутивного промотора tac. Маркерный ген р-лактамазы (bla) используют для отбора по антибиотику (устойчивость к ампициллину) в Е.аэИ. Для отбора по антибиотику в P. putida используют маркерный ген гентамецин-ацетилтрансферазы (gmR).
Плазмидная карта HmfH экспрессирующего вектора pJT'hmfH приводится на фиг. 2. Ptac' - промотор tac; rep - область начала репликации от плазмиды с широким кругом хозяев; gmR - ген устойчивости к гентамицину; bla - бета-лактамаза; pUC ori - область начала репликации для Е.ои.
Среды и условия культивирования. Среду с минеральными солями (ММ) используют как среду определенного состава. ММ содержит следующее (на литр деминерализованной воды): 3,88 г K2HPO4, 1,63 г NaH2PO4, 2,0 г (NH4)2SO4, 0,1 г MgCl2-6H2O, 10 мг ЭДТК, 2 мг ZnSO4-7H2O, 1 мг Cad^A 5 мг FeSO4-7H2O, 0,2 мг Na2MoO4-2H2O, 0,2 мг CuSO4-5H2O, 0,4 мг CoCl2•6Н2О и 1 мг MnCl2•2Н2О, с добавлением определенного источника углерода. Среду Луреа (L-среда: 10 г/л триптона Bacto (Difco), 5 г/л дрожжевого экстракта (Difco), 5 г/л NaCl) используют в качестве полной среды для размножения P. putida S12 и производных штаммов, С. basilensis HMF14 и Е.coli DH5a и производных. Твердая L-среда отверждается 2% (мас./об.) агаром (Difco).
В случае экспериментов с подпиткой начальную фазу загрузки осуществляют в 1 л адаптированной среды с минеральными солями следующего состава: 3,88 г K2HPO4, 1,63 г NaH2PO4, 2,0 г (NH4)2SO4, 0,2 г MgCl2-6H2O, 20 мг ЭДТК, 4 мг ZnSOr7H2O, 2 мг CaCb^A 10 мг FeSO4-7H2O, 0,4 мг Na2MoO4^2H2O, 0,4 мг CuSO4^5H2O, 0,8 мг CoCl2^6H2O, 2 мг MnCl2•2Н2О, 10 мг/л гентамицина и 100 мМ глицерина. После исчерпывания исходного глицерина начинают подпитку и регулируют для возможности максимального роста, в то же время сохраняя глицерин в культуре как лимитирующий субстрат. Подпитывающий раствор содержит (на л) 368,4 г глицерина, 10 г/л MgCl2-6H2O и 12,6 г/Л HMF.
Антибиотики. Ампициллин добавляют для Е.аэИ до 100 мкг/мл. Гентамицин (gm) добавляют до 30 мкг/мл к среде Луриа и 10 мкг/мл к среде с минеральными солями для Р. putida S12. Антибиотики закупают у Sigma-Aldrich.
Культивирование. P. putida и С. Basilensis культивируют при 30°С. Е.оИ культивируют при 37°С. Эксперименты в MM во встряхиваемой колбе выполняют в склянках Boston (Allteah applied sciences BV; Breda, Нидерланды) в термостате с горизонтальным перемешиванием. Эксперименты в L-среде во встряхиваемой колбе выполняют в колбах Эрленмейера с ватными пробками в термостате с горизонтальным перемешиванием. Эксперименты с подпиткой выполняют в 1-л ферментерах (New Brunswick Scientific) с использованием контроллера BioFlol 10. Начальную периодическую ферментацию начинают с промы
тыми клетками от предварительного культивирования в течение ночи в 100 мл ММ с добавлением 40 мМ глицерина и 2 мМ глюкозы. Начальную скорость перемешивания устанавливают в 200 об/мин, и воздух подают в пространство над смесью при 1 л-мин-1 с использованием регулятора массового расхода D-5111, приборы M+W. Давление растворенного кислорода (DO) непрерывно контролируют зондом InPro, модель 6900 (Mettler Toledo BV; Tiel, Нидерланды) и поддерживают при 30% насыщения воздуха путем автоматического регулирования скорости перемешивания до максимального значения 1000 об/мин. Когда достигается максимальная скорость перемешивания, воздух заменяют очищенным кислородом с расходом 0,2 л-мин-1, и устанавливают максимальную скорость перемешивания 800 об/мин. Величину рН 7,0 поддерживают путем автоматического добавления 25% раствора NaOH во время фазы начальной загрузки, во время фазы подпитки рН поддерживают постоянным путем автоматического добавления 10 мМ раствора NaOH. Температуру поддерживают на уровне 30°С.
Анализы и аналитические методы. Содержание клеточной сухой массы (CDW) в бактериальных культурах определяют путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD600) с использованием измерителя плотности клеток Biowave (WPA Ltd) или универсального спектрофотометра для прочтения микропланшетов ^Quant MQX200 (Biotek). Для P. putida OD600 1,0 соответствует 0,56 г CDW/л (Biowave) или 1,4 г CDW/л (|aQuant).
Анализы ВЭЖХ. FDCA, HMF, HMF-спирт и HMF-кислоту анализируют ОФ-ВЭЖХ (система Agilent 1100) с использованием детектора с диодной матрицей, установленного на 230 нм. Используемая колонка представляет собой колонку Zorbax Eclipce XDB-C8 (размер пор 80А, площадь поверхности 180 м2/г, Agilent), работающую при 25°С. В качестве элюента используют градиент ацетонитрила в 20 мМ растворе KH2PO4 (рН 2 или рН 6) с 1% ацетонитрила при скорости потока 1,2 мл/мин, с возрастанием от 0 до 5% за 3,5 мин и от 5 до 40% за 2,5 мин.
Получение клеточных экстрактов. Клеточные экстракты С. basilensis HMF14 дикого типа или трансформантов P. putida S12, экспрессирующих HMF-оксидоредуктазу, получают из 50-мл культур поздней экспоненциальной фазы роста с использованием ММ с добавлением или 12 мМ сукцината (С. basilensis HMF14, OD600 "1,5) или 20 мМ глюкозы (P. putida S12, OD600 "4). Культуры собирают центрифугированием и ресуспендируют в 3 мл буфера для анализа. Клетки разрушают ультразвуковой обработкой с использованием или ультразвуковой установки Branson (микронаконечник в импульсном режиме, установка выходной мощности 3, и установка процента рабочего цикла 40%; 3 цикла ультразвуковой обработки: 45 с импульс и 15 с пауза) или Sonics Vibra-Cell (Sonics & Materials, США) (5 мм суженый микронаконечник; установка импульсного режима до 1 мин (импульс 5 с, 2 с пауза). После ультразвуковой обработки дебрис удаляют центрифугированием при 8228 х g в течение 3 мин при 4°С. Супернатант обессоливают с использованием колонки для гель-фильтрации PD 10 (GE healthcare) и используют в качестве клеточного экстракта для анализов HMF-оксидоредуктазы. Концентрацию белка измеряют с использованием реагента Брэдфорда (Sigma-Aldrich).
Анализ HMF-оксидоредуктазы. Анализы HMF-оксидоредуктазы выполняют в клеточных экстрактах С. basilensis HMF14 дикого типа или трансформантов P. putida S12, экспрессирующих HMF-оксидоредуктазу. В качестве отрицательного контроля используют P. putida S12 дикого типа или мутана-та С. basilensis HMF14, которые содержат транспозонную вставку в гене hmfH. Клеточный экстракт инкубируют с фурафуралем, фурфуриловым спиртом, HMF или HMF-кислотой при 30°С в условиях насыщения кислородом. Реакционная смесь содержит 1 мл клеточного экстракта, 976 мкл насыщенной кислородом MM, 20 мкл 2 мМ раствора флавинадениндинуклеотида (FAD) и 4 мкл 0,5 М исходного субстрата (фурфураль, фурфуриловый спирт, HMF или HMF-кислота). Образцы отбирают с установленными интервалами, и реакцию сразу же останавливают путем добавления HCl до конечной концентрации 1 М. Концентрации субстрата и продукта в образцах определяют ВЭЖХ. Для контроля за исчерпыванием кислорода различные компоненты реакционной смеси очищают от кислорода с помощью непрерывного потока газа азота, и ту же самую реакционную смесь инкубируют в сосудах с резиновыми пробками с азотом в пространстве над смесью.
Химикаты. Аналитический стандарт FDCA закупают у Immunosource B.V. (Halle-Zoersel, Бельгия). 5-Гидроксиметилфуроиновую кислоту (HMF-кислоту) закупают у Matrix Scientific (Columbia SC, Соединенные Штаты). Обнаружено, что указанное соединение является высоко этерифицированным. Непосредственно перед использованием 10 мМ раствор этерифицированной HMF-кислоты кипятят в течение 2 ч с 2 М H2SO4, охлаждают и доводят до рН 7,0 NaOH после добавления 50 мМ фосфатного буфера. Все другие химикаты закупают у Sigma-Aldrich Chemie B.V. (Zwijndrecht, Нидерланды).
Молекулярные и генетические методы. Геномную ДНК выделяют с использованием набора Dneasy tissue (QIAGEN). Плазмидную ДНК выделяют с помощью набора QIAlprep spin miniprep (QIAGEN). Фрагменты ДНК из агарозы выделяют с помощью набора для гель-экстракции QIAEXII (QIAGEN).
Реакции ПЦР осуществляют с полимеразой Accuprime Pfx (Invitrogen) согласно инструкциям изготовителя. Праймерами, используемыми для амплификации HMF-оксидоредуктазы из геномной ДНК С. basilensis HMF14, являются FN23: 5'-CGGAATTCCACATGACAAGGGGAGACCG-3' (SEQ ID NO: 1) и FN24: 5'-CGGAATTCGCTTCGGTCTTCAACTCGGATG-3' (SEQ ID NO: 2). Подчеркнутые последова
тельности показывают сайт рестрикции EcoRI.
Плазмидную ДНК вводят в электрокомпетентные клетки с использованием устройства для электро-порации Gene Pulser (BioRad).
Хромосомную ДНК, фланкирующую транспозон, идентифицируют стандартными методами, известными в технике {Ausubel, F.M. et al. Current protocols in molecular biology (Green publishing association, New York; 1987)}, и последовательность полных генных локусов получают праймер-опосредованной прогулкой. Синтез олигонуклеотидов и секвенирование ДНК выполнены MWG Biotech AG (Германия).
Другие стандартные методы молекулярной биологии выполняют согласно Sambrook and Russell {Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular cloning; a laboratory manual (Cold spring Harbor Laboratoy Press, New
York: 2001)}.
Пример I. Продуцирование FDCA в клеточном экстракте С. basilensis HMF14.
Когда клеточный экстракт С. basilensis из прекультуры поздней логарифмической фазы (OD600 "1,5), выращенной в MM с добавлением 12 мМ сукцината и 3 мМ HMF, инкубируют или с HMF или с HMF-кислотой, наблюдают образование FDCA.
Когда в качестве субстрата используют HMF, наблюдают быстрое временное накопление HMF-кислоты и HMF-спирта, конкурирующее с образованием FDCA. В обессоленном клеточном экстракте концентрация HMF-кислоты уменьшается с меньшей скоростью, и получение FDCA замедляется по сравнению с неочищенным клеточным экстрактом. Так как FDCA получают в обессоленном клеточном экстракте, а также в неочищенном клеточным экстракте, оказывается, что конверсия HMF в FDCA не включает кофакторы. Тем не менее, оказывается, что кофакторы или другие низкомолекулярные компоненты из неочищенного клеточного экстракта оказывают синергическое действие на образование FDCA. Когда в качестве субстрата добавляют HMF-кислоту, сразу же наблюдают образование FDCA как в неочищенном, так и в обессоленном клеточном экстракте. Кроме того, показано, что для образования FDCA требуется присутствие кислорода, так как FDCA не вырабатывается в анаэробных условиях. Наблюдают стехиометрическую конверсию HMF-кислоты в FDCA.
Пример II. Выделение и характеризация гена hmfH, кодирующего HMF-оксидоредуктазу.
Обнаружено, что ген hmfH кодирует белок в 62317 Д, принадлежащий к семейству FAD-зависимых глюкозо-метанол-холин-оксидоредуктаз (GMC). Показано, что такой фермент имеет способность окислять HMF-кислоту до фурандикарбоновой кислоты (FDCA). Кроме того, фермент также принимает HMF как субстрат, который окисляется через HMF-кислоту до FDCA. Самая высокая гомология с hmfH в нерезервированной базе данных NCBI обнаружена с GMC-оксидоредуктазой Burkholderia phytofirmans PsJN (локус tag Bphyt_2180; 68 % идентичность по отрезку из 562 аминокислот). На основании данных о последовательности HMF/фурфураль-оперон С. basilensis HMF14 идентифицируют другие возможные вещества, разлагающие HMF/фурфураль (degraders). Отобранные штаммы проверяют на рост в среде с минеральными солями или с HMF или с фурфуралем как единственным источником углерода. Штаммы, которые способны расти на HMF, имеют ортолог hmfH, кодирующий оксидоредуктазы, которые имеют идентичность с HmfH между 45 и 68%. Один штамм (Burkholderia xenovorans LB400) неспособен использовать HMF, хотя его оксидоредуктаза имеет 44% идентичность с HmfH.
Фиг. 3 дает схематическое представление о генетической организации генов метаболизма фурфура-ля и HMF в С. basilensis HMF14 (А) и других видах (В), которые идентифицированы как возможные утилизаторы фурфураля и/или HMF. Цвета соответствуют активностям фермента на фиг. 1. Числа под стрелками, изображенные жирным шрифтом (х/у), показывают процент идентичности (х) к соответствующему белку С. basilensis HMF14 в аминокислотном отрезке y. Ортологичные гены идентифицируют поиском по гомологии в BLAST в базе данных о структуре белков "non-redundant protein sequences" Национального центра биотехнологической информации. Хиты фурфуральных кластеров определяют как релевантные, когда ортологичные гены для hmfA, В, С, D и Е присутствуют в одном геноме, причем ор-толог hmfHA кодирует фермент, который имеет, по меньшей мере, 50% идентичность с HmfA. Такой же критерий используют для определения ортологов HmfF и HmfG, в то время как для ортологов hmfH в качестве критерия используют 40% идентичность с HmfH. Числами, изображенными курсивом, отмечены геномные локусы указанного штамма. Незаштрихованные стрелки отображают гены с отсутствием функции метаболизма. С. Общий вид роста фенотипа испытываемых штаммов не среде с минеральными солями или с фурфуралем или с HMF (3 мМ) как единственным источником углерода. ND - не определено.
На фигурах приводятся нуклеотидные последовательности открытой рамки считывания, кодирующей HmfH HMF-оксидоредуктазы (фиг. 4), и установленные аминокислотные последовательности (фиг.
3).
Пример III. Клонирование hmfH в P. putida S12 и экспрессия кодированной оксидоредуктазы.
Ген hmfH, кодирующий HMF-оксидоредуктазу, клонируют в экспрессирующий вектор pJT'mcs. ПЦР-фрагмент, полученный с праймерами FN23 и FN24 на геномной ДНК С. basilensis HMF14, гидроли-зуют с EcoRI (Fermentas). Гидролизованный фрагмент лигируют в гидролизованный EcoRI и обработанный FastAP (Fermentas) вектор pJT'mcs, получая экспрессирующую HmfH плазмиду pJT'hmfH. Правиль
ную ориентацию вставки hmfH проверяют контрольным гидролизом и секвенированием нуклеиновой кислоты, известными в технике. Экспрессию HMF-оксидоредуктазы показывают в клеточном экстракте P. putida_pJT'hmfH, выращенного в MM + 20 мМ глюкозы и 10 мг/л гентамицина (OD600 "4) путем образования FDCA с использованием HMF или HMF-кислоты в качестве субстрата (табл. 1).
Таблица 1
Образование FDCA из HMF или HMF-кислоты в клеточном экстракте Р. putida_pJT'hmfH. В качестве контроля используют клеточный экстракт P. putida S12, содержащего пустой вектор pJT'mcs
Кислород
Клеточный экстракт
Нет
Обессоленный
Необессоленный
Контроль, обессоленный
Контроль, необессоленный
Полученные результаты подтверждают, что образование FDCA происходит только в присутствии кислорода и катализируется кодированной hmfH оксидоредуктазой. Когда в качестве субстрата используют HMF, наблюдают временное накопление HMF-кислоты как в обессоленном, так и в неочищенном клеточном экстракте. Образование HMF-кислоты в обессоленном клеточном экстракте (низкомолекулярные кофакторы удалены) показывает, что HmfH не только окисляет HMF-кислоту до FDCA, но также может окислять HMF до формы его монокарбоновой кислоты.
Кроме HmfH образовывать HMF-кислоту из HMF очевидно также могут неспецифические дегидро-геназы, свойственные для P. putida S12 (табл. 2), при условии, что восстанавливающие эквиваленты не удалены обессоливанием. Альдегидредуктазная/Алкогольдегидрогеназная активность является NaDH/NAD+-зависимой, в то время как альдегидредуктазная активность может быть поддержана сочетанием двух искусственных носителей электронов - PMS и DCPIP, в котором PMS является первичным носителем электронов и DCPIP является финальным акцептором электронов. Подобные активности также наблюдают в клеточном экстракте С. basilensis HMF14.
Таблица 2
Неспецифические HMF-дегидрогеназные активности, измеренные в клеточном экстракте P. putida S12
Ферментная активность
Субстрат
Продукт
Кофактор
P. putida S12
Альдегид
HMF
HMF-
NADH
1106
редуктаза
спирт
Алкоголь
HMF-
HMF
NAD"
дегидрогеназа
спирт
Альдегид
HMF
HMF-
PMS/DCPIP
дегидрогеназа
кислота
ND: не определено в случае отсутствия коммерчески доступного субстрата. Активности выражены в Е г-1 белка. PMS/DCPIP: мето-сульфат феназина/2,6-дихлорфенолиндофенол. Образование FDCA, HMF-спирта (H-oh) и HMF-кислоты (Н-кислота) из HMF в неочищенном клеточном экстракте P. putida S12 pJT'hmfH показано на фиг. 4. Фиг. 4 иллюстрирует синергическое действие эндогенных дегидрогеназ и HmfH в клеточном экстракте P. putida S12 pJT'hmfH. Сначала наблюдают быстрое убавление HMF, сопутствующее образованию HMF-спирта, которое вероятно катализируется альдегидредуктазой. В то же время также начинают накапливаться HMF-кислота (вероятно, благодаря альдегиддегидрогеназе) и FDCA (благодаря HmfH). Сразу же после образования HMF-спирт исчезает, вероятно, через повторное окисление до HMF, HMF-кислоты и FDCA. Только HMF-кислота показывает существенное накопление за промежуток времени 25 час. Такие результаты предполагают, что окисление HMF-кислоты до FDCA является стадией, ограничивающей скорость реакции в бесклеточной системе.
Пример IV. Превращение HMF в FDCA целыми клетками P. putida S12, экспрессирующего HmfH.
Поскольку эндогенные дегидрогеназы P. putida S12 могут действовать синергично с HmfH при окислении HMF до FDCA путем обеспечения дополнительных средств генерации HMF-кислоты из HMF, способ биотрансформации целыми клетками HMF в FDCA может иметь преимущества перед ферментативным способом. Для того чтобы исследовать такую возможность, покоящиеся клетки, растущие клетки и разрушенные клетки испытывают на продуцирование FDCA из HMF.
Культуры, выращиваемые во встряхиваемых колбах, выращивают в 150 мл MM + 40 мМ глицерина и 2 мМ глюкозы с добавлением 10 мг/л гентамицина в 1-л колбах Эрленмейера. Клетки собирают в конце логарифмической фазы (OD600 "4), промывают и концентрируют в ММ с добавлением 19,4 г/л K2HPO4, 8,15 г/л NaH2PO4, 40 мМ глицерина и 10 мг/л гентамицина. Аликвоты (10 мл) концентрированных клеточных суспензий (соответствующие CDW 1,65 г) инкубируют с HMF в 250-мл колбах Эрленмейера, и отбирают образцы с равномерными интервалами для анализа на FDCA. В случае покоящихся клеток в ресуспензионную среду не включают глицерин, и разрушенные клетки получают обработкой ультразвуком.
Как отмечалось ранее, HMF быстро превращается в HMF-спирт и HMF-кислоту с последующей убылью HMF-кислоты и конкурентным образованием FDCA. Как скорости продуцирования FDCA, так и скорости убыли HMF-кислоты представлены в табл. IV-a для двух испытываемых концентраций HMF.
Таблица 3
Продуцирование FDCA из HMF и скорость убыли HMF-кислоты при использовании растущих клеток, покоящихся клеток и обработанных ультразвуком клеток P. putida S12 pJT'hmfH при различных началь-
клонение от среднего для двух независимых экспериментов. c ND = не определено
Табл. 3 показывает, что продуцирование FDCA проходит более эффективно растущими клетками P. putida S12, экспрессирующими HmfH. Общая скорость продуцирования FDCA, эффективность конверсии, а также скорость убыли HMF-кислоты выше в случае инкубации растущих клеток. Кроме того, скорость продуцирования FDCA зависит от начальной концентрации HMF, что приводит к предположению, что система не является насыщенной.
Пример V. Продуцирование FDCA из HMF P. putida S12, экспрессирующим HmfH, в способе с подпиткой.
Обнаружено, что продуцирование FDCA наиболее эффективно растущими клетками P. putida S12, экспрессирующим HmfH. Поэтому выполняют эксперименты с подпиткой для демонстрации продуцирования FDCA целыми клетками P. putida S12 pJT'hmfH.
В начальной фазе P. putida_pJT'hmfH культивируют в MM с подпиткой глицерином до плотности клеток 13 г CDW/л. По окончании такой фазы начинают подпитку HMF, причем HMF вводят со скоростью 0,8 ммоль/л/ч. Без соподпитки глицерином HMF-кислота и FDCA образуются при равномерной скорости 0,41 ммоль/л/ч (см. фиг. 5). Затем подпитку заменяют раствором, содержащим 0,21 М HMF и 4 М глицерина, которые подают при приблизительно 5 мл/ч. С такой соподпиткой глицерином концентрация HMF-кислоты быстро падает, в то время как образование FDCA продолжается приблизительно с той же скоростью (фиг. 5). Эксперимент прекращают, когда с подпиткой добавлен HMF в общем количестве 44,6 ммоль. Результаты показывают почти полную конверсию в FDCA (т.е. эффективность 96,5%).
В подобном эксперименте глицерин подают со средней скоростью 0,7 ммоль/л/ч совместно с HMF. В такой культуре с подпиткой накапливания промежуточного соединения HMF-кислоты не наблюдают, и весь HMF превращается непосредственно в FDCA (фиг. 6).
Пример VI. Очистка FDCA от среды для ферментации.
Обнаружено, что растворимость FDCA в воде при рН 1,0 составляет примерно 1,5 г/л. Данное свойство выгодно используют для извлечения продукта FDCA из среды для ферментации. После удаления клеток центрифугированием (9500 х g в течение 5 мин) к 100 мл очищенной среды, для того, чтобы осадить FDCA, при комнатной температуре при непрерывном перемешивании добавляют приблизительно 10 мл 96% H2SO4 до рН 1. Осадок извлекают центрифугированием при 8228 х g в течение 10 мин, и высушенный на воздухе осадок снова растворяют в метаноле при 60°С. После удаления нерастворившегося дебриса фильтрацией через предварительно нагретый 0,22-мкм фильтр фильтрат анализируют ВЭЖХ на чистоту. Чистота FDCA, извлеченной из среды для ферментации описанной выше процедурой, составляет приблизительно 65%. Дополнительной очистки FDCA можно добиться с использованием способов, хорошо известных в технике.
Пример VII. Продуцирование FDCA из HMF P. putida S12, экспрессирующим HmfH, в способе с подпиткой.
Выполняют второй эксперимент по продуцированию FDCA в способе с подпиткой с целыми клетками P. putida S12 pJT'hmfH для того, чтобы повысить титр FDCA и производительность.
В начальной периодической фазе P. putida_pJT'hmfH культивируют на ММ до тех пор, пока после 23,2-часовой ферментации не будет исчерпан начальный глицерин (OD600 "8). В данный момент начинают подпитку глицерином со скоростью, которая допускает возрастание биомассы в приблизительно 0,45 г CDW/л/ч. После 50,7-часовой ферментации подпитку глицерином уменьшают до скорости, которая допускает возрастание биомассы в приблизительно 0,045 г CDW/л/ч. После 123,4-часовой ферментации подпитку глицерином повышают до скорости, которая допускает возрастание биомассы в приблизитель
но 0,25 г CDW/л/ч, до завершения ферментации. В течение указанного периода применяют подпитку HMF. Подпитку HMF начинают при скорости 0,65 ммоль/ч/г CDW после 26,7 ч ферментации, что приводит к накоплению как HMF-кислоты, так и FDCA. Скорость подпитки HMF снижают до 0,28 ммоль/ч/г CDW после 72,8 ч ферментации, и подпитку прекращают после 117,4 ч ферментации. Уменьшение подпитки HMF ведет к постепенному снижению концентрации HMF-кислоты в ферментере, в то время как концентрация FDCA продолжает возрастать. Ферментацию прекращают, когда HMF более нельзя детектировать. В этот момент в ферментер добавляют 188 ммоль HMF, что ведет к продуцированию приблизительно 182 ммоль FDCA (т.е. 97% эффективности) при концентрации 30,8 г/л. Фиг. 7А показывает образование биомассы, HMF-кислоты и FDCA в культуре Р. putida_pJT'hmfH с подпиткой. Фиг. 7B показывает скорости подпитки глицерином и HMF для той же культуры. Пример VIII. Очистка FDCA от среды для ферментации.
Обнаружено, что растворимость FDCA в воде при рН 0,5 составляет примерно 0,4 г/л. Так как такая концентрация остается в растворе после осаждения, возросший титр, полученный в примере VII, ведет к значительно меньшей потере продукта при очистке осаждением.
После удаления клеток центрифугированием (9500 х g в течение 15 мин) очищенную среду кипятят в течение 3 минут для осждения белков и центрифугируют в течение 20 мин при 9500 х g. К супернатан-ту, для того чтобы осадить FDCA, при 4°С при непрерывном перемешивании добавляют приблизительно 50 мл 96% H2SO4 до рН 0,5. Осадок извлекают центрифугированием при 8228 х g в течение 20 мин, промывают один раз 250 мл воды и снова центрифугируют при 8228 х g в течение 20 мин. Полученный осадок сушат на воздухе и затем растворяют в приблизительно 1200 мл тетрагидрофурана (ТГФ) при 30°С. После удаления нерастворимого дебриса фильтрацией очищенный раствор в ТГФ упаривают в вакууме при 50°С до тех пор, пока не останется 11,8 г порошка сухой FDCA высокой чистоты (> 99%), что составляет 78% FDCA, изначально присутствовавшей в среде для ферментации. При необходимости очистку FDCA можно дополнительно оптимизировать с использованием способов, хорошо известных в технике.
tccaaggtct
acgagcaagg
gcgcgtcatg
ggcggcggct
ccagcatcaa
cgtgcaggcg
300
gcaaaccgcg
ggctgccgcg
cgactacgat
gagtgggccg
cgtcgggcgc
gtccggatgg
360
tcgtggcagg
atgtgctgcc
gtatttccgc
caccttgagc
gcgatgtgga
ttacggcaac
420
agcccgctgc
acggcagcca
cggaccggtg
ccgatccgcc
gcatcctgcc
gcaggcttgg
480
ccgccgttct
gcacggagtt
tgcgcacgcg
atgggccgca
gcggcttgtc
cgcgctggcc
540
gaccagaacg
cggagttcgg
cgatggctgg
tttccggccg
ccttctcgaa
cctggatgac
600
aagcgggttt
cgaccgccat
cgcctatctc
gacgcggata
cgcgccggcg
ggccaatxtg
660
cggatctatg
ccgagacaac
ggtgcgcaag
ctcgtcgtat
ccggccggga
agcgcgtggg
720
gtgatcgcca
tgcgggccga
tgggtcgcgg
ctggcgctgg
acgccgggga
ggtcatcgtg
780
tccgcgggcg
ccttgcagtc
gcccgccatc
ctgatgcgcg
cggggatcgg
cgacgccggc
840
gcgctgcagg
ccctxggcat
cgaggtcgta
gccgaccgac
ccggcgttgg
ccgcaatctc
900
caggatcatc
ccgcgctgac
gttctgccag
ttcctcgcgc
cccagtaccg
catgccgctc
960
tcgcgccggc
gcgctagcat
gacggcggcg
cggttctcat
cgggggtgcc
aggtggcgag
1020
gcgtcggaca
tgtacctgtc
cagttccaca
cgggcaggct
ggcatgcact
cggtaatcgg
1080
ctcggcctct
tcttcctgtg
gtgcaatcgg
ccattctcgc
gcgggcaggt
gagccttgcg
1140
ggagcccagc
cggatgtgcc
gcccatggtg
gagctcaacc
tgctcgacga
cgagcgggat
1200
ctgcggcgca
tggtggccgg
cgtacgcaag
ttggtgcaga
tcgtgggtgc
gtcggccttg
1260
catcagcatc
ccggtgattt
cttccccgct
acgttttcgc
cgcgcgtcaa
ggcgctgagc
1320
cgcgtgagcc
gcggcaatgt
gttgctcacg
gagttgctgg
gggcagtgct
tgatgtctcg
1380
gggccgctgc
gcagaagcct
gatcgcgcgc
tttgtcacgg
gcggcgcaaa
cctggccagc
1440
ctgctgacgg
atgagtccgc
gctagagggc
ttcgtgcgcc
agagcgtctt
cggggtctgg
1500
catgccagcg
gcacttgccg
gatgggcgcg
catgcggacc
ggagcgcggt
gacggatgcg
1560
gcgggccgcg
ttcacgatgt
tggcaggctg
cgcgttattg
acgcctctct
gatgccgcgg
1620
ctgccgacgg
ccaataccaa
catccccacc
atcatgctcg
cggaaaagat
tgccgacacc
1680
atgcaagccg
agcgccgcgc
ggtccggccg
gcatcgagcg
aagttgccca
tccgagttga
1740
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид с оксидоредуктазной активностью класса EC1.1 и ЕС1.2 в отношении как спиртовой, так и альдегидной группы, находящихся в положении С2 или С5 фуранового цикла, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID
NO: 4.
2. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1.
3. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1 и выбранную из группы, включающей:
(a) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4;
(b) нуклеотидную последовательность, которая избирательно гибридизируется с полинуклеотидом, который комплементарен SEQ ID NO: 4;
(c) нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 66% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4;
(d) последовательность, которая является вырожденной вследствие избыточности генетического кода по отношению к последовательности, определенной в любом из (а), (b) или (с); или
(e) нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, определенной в (а), (b), (с) или (d).
4. Конструкция, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по п.1, где нуклеотидная последовательность функционально соединена с регуляторной последовательностью.
5. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3 или конструкцию по
п.4.
6. Клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.2, 3, конструкцию по п.4 или вектор по п.5.
7. Клетка по п.6, представляющая собой бактерию, выбранную из группы, состоящей из родов Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibac-terium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus или Streptomyces; или видов В. subtilis, В. amylolique
6.
faciens, В. licheniformis, В. puntis, В. megaterium, В. halodurans, В. pumilus, G. oxydans, Caulobacter crescen-tus CB 15, Methylobacterium extorquens, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas putida, Paracoccus zeaxan-thinifaciens, Paracoccus denitrificans, E.coli, C. glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium melioti и Rhizobium radiobacter.
8. Клетка по п.6, представляющая собой дрожжевую клетку, выбранную из группы, состоящей из родов Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или видов Kluyveromyces lactis, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica и Pichia pastoris, или клетку мицелиального гриба, выбранную из группы родов Aspergillus, Chrysosporium, Penicillium, Tala-romyces или Trichoderma; или видов Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Tricho-derma reesei или Penicillium chrysogenum.
9. Способ получения полипептида по п.1, включающий культивирование клетки по любому из пп.6-8 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного полипептида.
10. Полипептид по п.1, полученный способом по п.9.
11. Способ получения 2,5-фурандикарбоновой кислоты (FDCA), согласно которому один или несколько фурановых предшественников FDCA превращают в FDCA взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.
12. Способ по п.11, где фурановый предшественник FDCA выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF), 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирта) и 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), предпочтительно фурановый предшественник представляет собой HMF.
13. Способ по п.11 или 12, где фурановым предшественником FDCA является HMF, который получают из одного или нескольких сахаров-гексоз путем нагревания в присутствии кислоты.
14. Способ по п.13, где один или несколько сахаров-гексоз получают из лигноцеллюлозной биомассы.
15. Способ получения 5-гидроксиметил-2-фуранкарбоновой кислоты (HMF-кислоты), согласно которому один или несколько фурановых предшественников HMF-кислоты превращают в HMF-кислоту взаимодействием с окислителем в присутствии оксидоредуктазного катализатора, содержащего полипептид по п.1 или 10.
16. Способ по п.15, где фурановый предшественник HMF-кислоты выбирают из группы, состоящей из 5-гидроксиметилфурфураля (HMF) и 2,5-дигидроксиметилфурана (HMF-спирта).
17. Способ по любому из пп.11-16, где фурановый предшественник FDCA превращают в FDCA или фурановый предшественник HMF-кислоты превращают в HMF-кислоту в присутствии одного или нескольких коферментов, представляющих собой никотинамидадениндинуклеотид (NAD+), и/или пирро-лохинолинхинолон (PQQ), и/или флавинадениндинуклеотид (FAD).
18. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор представляет собой бесклеточный экстракт клетки, содержащий полипептид по п.1 или 10.
19. Способ по любому из пп.11-17, где оксидоредуктазный катализатор является цельноклеточным биокатализатором, представляющим собой клетку, содержащую полипептид по п.1 или 10.
8.
Фиг. 3А
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025990
- 1 -
(19)
025990
- 1 -
(19)
025990
- 1 -
(19)
025990
- 4 -
(19)
025990
- 17 -
025990
- 20 -
025990
- 22 -
025990
- 23 -