[RU]

1. Способ прогнозирования восприимчивости субъекта к агенту антиангиогенной терапии, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии; классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к антиангиогенному терапевтическому агенту на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.

2. Способ по п.1, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому, рак простаты, колоректальный рак или рак молочной железы.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.

4. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, и где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.

5. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.

6. Способ по любому из пп.1, 3-5, в котором антиангиогенный терапевтический агент представляет собой терапевтический агент, нацеленный на путь VEGF, ингибитор пути ангиопоэтина-TIE2, эндогенные ангиогенные ингибиторы и иммуномодулирующие агенты.

7. Способ по п.6, в котором терапевтический агент, нацеленный на путь VEGF, выбран из бевацизумаба (авастин), афиберцепта (ловушка VEGF), IMC-1121B (рамуцирумаб), иматиниба (гливек), сорафениба (нексавар), гефитиниба (иресса), сунитиниба (сутент), эрлотиниба, тивозиниба, цедираниба (рецентин), пазопаниба (вотриент), BIBF 1120 (варгатеф), довитиниба, семаксаниба (суген), акситиниба (AG013736), вандетаниба (зактима), нилотиниба (тасигна), дасатиниба (спрайсел), ваталаниба, мотесаниба, АВТ-869, TKI-258 и их комбинации.

8. Способ по п.6, в котором ингибитор пути ангиопоэтина-TIE2 выбран из AMG-386, PF-4856884 CVX-060, СЕР-11981, СЕ-245677, MEDI-3617, CVX-241, трастузумаба (герцептин) или их комбинации.

9. Способ по п.6, в котором эндогенные ангиогенные ингибиторы выбраны из тромбоспондина, эндостатина, тумстатина, канстатина, аррестина, ангиостатина, вазостатина, интерферона-альфа или их комбинации.

10. Способ по п.6, в котором иммуномодулирующий агент выбран из талидомида, леналидомида и их комбинации.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором прогнозирование выполнено в контексте стандартной терапии и/или терапии антиангиогенным терапевтическим агентом, где антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и субъект был ранее подвергнут цитотоксической химиотерапии на основе платины и таксана или в котором антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.

13. Способ определения прогноза для субъекта, больного раком, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии; классификацию субъекта как имеющего плохой или хороший прогноз на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже пороговой оценки экспрессии соответственно.

14. Способ по п.13, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.

15. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где каждый вес для каждого биомаркера соответствует указанному в табл. 2А и 2В.

16. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.

17. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.

18. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут стандартной химиотерапии.

19. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут хирургической резекции рака.

20. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой глиобластому.

21. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором мерой прогноза является выживание.

22. Способ прогнозирования отклика субъекта на стандартную терапию рака, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии; классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к стандартной терапии рака, на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.

23. Способ по п.22, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.

24. Способ по любому из пп.22 и 23, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.

25. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.

26. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.

27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и стандартная терапия представляет собой стандартную цитотоксическую химиотерапию на основе платины и таксана.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ прогнозирования восприимчивости субъекта к агенту антиангиогенной терапии, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии; классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к антиангиогенному терапевтическому агенту на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.

2. Способ по п.1, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому, рак простаты, колоректальный рак или рак молочной железы.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.

4. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, и где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.

5. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.

6. Способ по любому из пп.1, 3-5, в котором антиангиогенный терапевтический агент представляет собой терапевтический агент, нацеленный на путь VEGF, ингибитор пути ангиопоэтина-TIE2, эндогенные ангиогенные ингибиторы и иммуномодулирующие агенты.

7. Способ по п.6, в котором терапевтический агент, нацеленный на путь VEGF, выбран из бевацизумаба (авастин), афиберцепта (ловушка VEGF), IMC-1121B (рамуцирумаб), иматиниба (гливек), сорафениба (нексавар), гефитиниба (иресса), сунитиниба (сутент), эрлотиниба, тивозиниба, цедираниба (рецентин), пазопаниба (вотриент), BIBF 1120 (варгатеф), довитиниба, семаксаниба (суген), акситиниба (AG013736), вандетаниба (зактима), нилотиниба (тасигна), дасатиниба (спрайсел), ваталаниба, мотесаниба, АВТ-869, TKI-258 и их комбинации.

8. Способ по п.6, в котором ингибитор пути ангиопоэтина-TIE2 выбран из AMG-386, PF-4856884 CVX-060, СЕР-11981, СЕ-245677, MEDI-3617, CVX-241, трастузумаба (герцептин) или их комбинации.

9. Способ по п.6, в котором эндогенные ангиогенные ингибиторы выбраны из тромбоспондина, эндостатина, тумстатина, канстатина, аррестина, ангиостатина, вазостатина, интерферона-альфа или их комбинации.

10. Способ по п.6, в котором иммуномодулирующий агент выбран из талидомида, леналидомида и их комбинации.

11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором прогнозирование выполнено в контексте стандартной терапии и/или терапии антиангиогенным терапевтическим агентом, где антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и субъект был ранее подвергнут цитотоксической химиотерапии на основе платины и таксана или в котором антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.

13. Способ определения прогноза для субъекта, больного раком, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии; классификацию субъекта как имеющего плохой или хороший прогноз на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже пороговой оценки экспрессии соответственно.

14. Способ по п.13, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.

15. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где каждый вес для каждого биомаркера соответствует указанному в табл. 2А и 2В.

16. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.

17. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.

18. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут стандартной химиотерапии.

19. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут хирургической резекции рака.

20. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой глиобластому.

21. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором мерой прогноза является выживание.

22. Способ прогнозирования отклика субъекта на стандартную терапию рака, включающий измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии; классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к стандартной терапии рака, на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.

23. Способ по п.22, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.

24. Способ по любому из пп.22 и 23, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.

25. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.

26. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.

27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и стандартная терапия представляет собой стандартную цитотоксическую химиотерапию на основе платины и таксана.

---

Евразийское 025926 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201391805
(22) Дата подачи заявки 2012.06.04
(51) Int. Cl. G01N33/50 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01)
(54) МОЛЕКУЛЯРНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ТЕСТ НА РАК
(31) 61/492,488
(32) 2011.06.02
(33) US
(43) 2014.03.31
(86) PCT/US2012/040805
(87) WO 2012/167278 2012.12.06
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ОЛМАК ДАЙЭГНОСТИКС ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Харкин Денис Пол, Паттерсон Фионнуала, Триндер Клэр, О'Брайен Имонн Дж., Мичи Кэролайн, Гурли Чарли, Хилл Лора А., Китинг Кэтрин Э., О'Доннелл Джуд, Бюлешо Макс, Деаро Стив, Прутский Виталий, Кеннеди Ричард (GB), Дэвисон Тимоти (US), Винтер Андреас (DE), Маккэйвиган Эндрена (IE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-2011005273 US-A1-20090304594 WO-A1-2009022129
(57) Предлагаются способы и композиции для идентификации молекулярно-диагностического теста на рак. Тест идентифицирует субтипы рака, восприимчивые к антиангиогенной терапии, и позволяет классифицировать пациентов в пределах этого субтипа. Настоящее изобретение может быть использовано для определения того, будут ли раковые пациенты клинически откликаться или не откликаться на схему лечения до введения какого-либо антиангиогенного агента. Этот тест может быть использован при разных типах рака и с разными препаратами, которые прямо или косвенно влияют на ангиогенез или сигнальные пути ангиогенеза. В дополнение к этому, настоящее изобретение может быть использовано в качестве прогностического индикатора для определенных типов рака. В частности, изобретение касается использования определенных комбинаций прогностических маркеров, где экспрессия прогностических маркеров коррелирует с восприимчивостью или невосприимчивостью к схеме лечения.
Перекрестная ссылка на родственную заявку
Настоящее изобретение заявляет приоритет временной патентной заявки США 61/492488, поданной 2 июня 2011 г., которая включена в описание в качестве ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к молекулярно-диагностическому тесту, пригодному для диагностирования раков из разных анатомических участков, включающему использование общего субтипа, связанного с ангиогенезом. Изобретение включает разработку модели классификации генов по уровням экспрессии генов. Одним способом применения является стратификация ответов на и селекция пациентов по терапевтическим классам противораковых препаратов и, таким образом, управление выбором лечения для пациентов. Другим применением является стратификация раковых пациентов на тех, кто отзывается, и тех, кто не отзывается на антиангиогенную терапию. Настоящее изобретение предлагает тест, который может направлять выбор терапии, а также выбор групп пациентов для стратегий обогащения при проведении клинических испытаний по оценке новых терапий. Изобретение может быть использовано в качестве прогностического индикатора для определенных раков, включая рак яичников, рак молочной железы и глиобластому. Субтип ангиогенеза может быть идентифицирован по свежим/замороженным (FF) или фиксированным формалином залитым в парафин (FFPE) образцам, взятым у пациента.
Известный уровень техники
Фармацевтическая промышленность находится в непрерывном поиске новых вариантов лекарственной терапии, являющихся более эффективными, более специфическими или имеющими меньше нежелательных побочных эффектов, чем используемые в настоящее время препараты. Альтернативные виды лекарственной терапии разрабатываются постоянно, потому что генетическая изменчивость в человеческой популяции приводит к существенным различиям в эффективности многих признанных препаратов. Поэтому, хотя в настоящее время доступен широкий спектр лекарственных терапий, дополнительные терапии всегда необходимы на случай, если пациент не отвечает на лечение.
Традиционно, парадигма лечения, используемая врачами, заключалась в прописывании для лечения болезни лекарственной терапии первой линии, которая приводит к наибольшим возможным показателям успеха. Затем прописывают альтернативные лекарственные терапии, если первые оказались неэффективными. Эта парадигма, очевидно, не является лучшим способом лечения для определенных болезней. Например, при таких болезнях, как рак, первое лечение часто является наиболее важным и обеспечивает наилучшие возможности успешной терапии, поэтому существует высокая потребность в выборе начального препарата, который был бы наиболее эффективным против болезни данного конкретного пациента.
Рак яичников является главной причиной смертности из всех гинекологических раков в западных странах. Такая высокая смертность вызвана установлением диагноза на поздней стадии у большинства пациентов. Эпителиальный рак яичников (ЕОС) составляет 90% злокачественных новообразований яичников и классифицируется на разные гистологические категории, включая серозный, мукоидный, эндо-метриоидный, прозрачно-клеточный, переходный, смешанный и недифференцированный субтипы. Все больше данных указывают на то, что такие различные гистологии вызваны разными этиологиями. В последнее время был достигнут прогресс в методологии, используемой для классификации эпителиального рака яичников (McCluggage, W.G. "Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and патогенез," Pathology 2011 Aug; 43(5):420-32). Одним из следствий этого является то, что многие опухоли, которые ранее классифицировались бы как эндометриоидные, теперь классифицируются как серозные.
Текущим стандартом лечения рака яичников является хирургическое уменьшение объема опухоли и стандартная цитотоксическая химиотерапия на основе платины и таксана. Однако не все пациенты отзываются на него, и из тех, кто не отзывается, приблизительно у 70% наблюдаются рецидивы. Специфические прицельные терапии при раке яичников на основании гистологической или молекулярной классификации еще не достигли рыночной стадии. Аналогично, для других типов рака в настоящее время не существует точных способов выбора пригодных цитотоксических химиотерапевтических агентов.
Прогресс в развитии микрочипов и молекулярной геномики обладает потенциалом значительного воздействия на диагностические возможности и прогностическую классификацию заболевания, что может способствовать прогнозированию отклика индивидуального пациента на определенную схему лечения. Микрочипы обеспечивают анализ больших количеств генетической информации, тем самым позволяя получить генетический "отпечаток пальцев" индивидуума. Существует значительный энтузиазм в отношении того, что эта технология, в конечном счете, обеспечит необходимые инструменты для разработки схем лекарственной терапии для индивидуальных пациентов.
В настоящее время работники здравоохранения имеют незначительное количество механизмов, помогающих им идентифицировать раковых пациентов, которые могли бы получить пользу от применения химиотерапевтических агентов. Идентификация оптимального препарата первой линии была сложной задачей из-за отсутствия способов точного прогнозирования того, какая лекарственная терапия была бы наиболее эффективной для конкретной физиологии рака. Это отсутствие приводит к относительно низким показателям отклика на отдельно взятый агент и увеличению заболеваемости и смертности от рака. Кроме того, пациенты часто без необходимости получают неэффективную токсичную лекарственную
терапию.
Ангиогенез представляет собой ключевой компонент неоваскуляризации опухолей и является существенным для онкогенеза и метастазирования. По существу, он является ключевой областью терапевтического вмешательства и коррелирует с плохим прогнозом и сниженным выживанием. Это привело к разработке ряда агентов, нацеленных на связанные с ангиогенезом процессы и пути, включая лидирующий на рынке и первый одобренный FDA (Управление по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами США) антиангиогенный препарат, бевацизумаб (авастин), производимый фирмой Genentech/Roche.
Схемы лечения, включающие бевацизумаб, продемонстрировали широкую клиническую активность [1-10]. Однако не наблюдалось положительного эффекта на общую выживаемость (OS) после добавления бевацизумаба к цитотоксической химиотерапии при большинстве видов рака [8, 12, 13]. Это позволяет предположить, что существенная часть опухолей или изначально являются резистентными, или быстро вырабатывают резистентность к блокаде VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия, VEGF) (механизм действия бевацизумаба). Фактически, 21% пациентов с раком яичников, 10% с раком почки и 33% с раком прямой кишки демонстрируют частичный регресс при получении монотерапии бевацизума-бом, что позволяет предположить, что бевацизумаб может быть активным в маленьких подгруппах пациентов, но такое приращение полезного эффекта не достигает значимых уровней для неотобранных пациентов. По существу, использование биомаркера отклика на бевацизумаб улучшило бы оценку результатов лечения и, таким образом, позволило бы идентифицировать подгруппы пациентов, которые получили бы наибольшую клиническую пользу от лечения бевацизумабом. Это было бы особенно важно в случае метастазирующего рака молочной железы, при котором отсутствие клинически полезного биомаркера подрывает использование бевацизумаба. До настоящего времени не существует таких клинически подтвержденных биомаркеров, предсказывающих эффективность бевацизумаба. Гипертензия и полиморфизмы VEGF до сих пор являются единственными биомаркерами, демонстрирующими потенциал, но остаются существенные вопросы, касающиеся их использования в клинических условиях.
Другим подходом к антиангиогенной терапии является одновременное нацеливание на множество ангиогенных путей, а не селективное нацеливание на путь VEGF. Теоретически, многоцелевые антиан-гиогенные агенты должны более полно ингибировать ангиогенез, чем такие агенты, как бевацизумаб и, таким образом, могут обеспечивать большую терапевтическую пользу. Было выдвинуто предположение, что в некоторых опухолях ангиогенез может нуждаться в VEGF только на ранних стадиях заболевания, но по мере прогрессирования болезни обеспечивается дополнительными ангиогенными путями. Поэтому нацеливание на множество путей может позволить противодействовать механизмам компенсаторного избегания, которые могут приводить к резистентности к ингибированию VEGF.
Для других типов рака до настоящего времени не существует точных способов определения того, какие из пациентов будут или не будут откликаться на стандартный уход с использованием антиангио-генной терапии или антиангиогенную терапию одним агентом.
Таким образом, существует потребность в молекулярно-диагностическом тесте, который способствовал бы стратификации пациентов на основании их прогнозируемого отклика на антиангиогенную терапию в комбинации со стандартным уходом или терапию одним агентом. Это позволило бы быстро идентифицировать тех пациентов, которые должны получать альтернативные виды терапии. Такой моле-кулярно-диагностический тест должен прогнозировать терапевтическую восприимчивость при разных типах рака с достаточной точностью.
Сущность изобретения
Раскрыты способы использования набора биомаркеров, экспрессируемых при раке таким образом, что при чрезмерной или недостаточной экспрессии некоторых или всех транскриптов они идентифицируют субтип рака, демонстрирующие повышающую регуляцию молекулярной сигнализации, связанной с ангиогенезом. Изобретение также предусматривает способы определения восприимчивости или невосприимчивости к антиангиогенным агентам. В разных аспектах такой набор биомаркеров может быть основой однопараметрического или многопараметрического прогностического теста, который может быть проведен с использованием способов, известных специалистам, таких как микрочипы, Q-PCR (количественная ПЦР), иммуногистохимия, ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ) или других технологий, позволяющих количественно определять экспрессию мРНК или белка.
В дополнение к этому, субтип рака, описанный здесь, является общим для многих типов рака и не ограничен одним типом ракового заболевания. Поэтому сигнатуры (характерные профили) экспрессии, раскрытые здесь, могут быть использованы для предсказания восприимчивости или невосприимчивости к терапии рака для разных типов рака в разных тканях. В одном варианте исполнения изобретения такие биомаркеры являются пригодными для оценки восприимчивости раковой опухоли к антиангиогенной терапии. В одном типичном варианте исполнения рак представляет собой рак яичников. В другом типичном варианте исполнения рак представляет собой глиобластому. В другом типичном варианте исполнения рак представляет собой рак молочной железы.
Изобретение, описанное здесь, не ограничено каким-либо одним препаратом; оно может быть использовано для идентификации особ, откликающихся и не откликающихся на любой из спектра препара
тов, используемых в настоящее время, находящихся в процессе разработки, и новых, которые прямо или косвенно влияют на или нацелены на ангиогенные процессы. В одном варианте исполнения настоящее изобретение может быть использовано для оценки адъюванта или неадъюванта бевацизумаба или даса-тиниба, при использовании в качестве отдельно взятых агентов, или в комбинации со стандартным лечением. В другом варианте исполнения настоящее изобретение может быть использовано для оценки лечения авастином, VEGF-TRAP (ловушка VEGF), при раке яичников.
Настоящее изобретение относится к предсказанию ответа на препараты с использованием по меньшей мере или до 10 разных классификаций ответа, таких как общая выживаемость, выживаемость без прогрессирования заболевания, радиологический ответ, определяемый по критериям RECIST (система оценки ответа солидных опухолей), полный ответ, частичный ответ, стабильные маркеры заболевания и серологические маркеры, такие как, без ограничений, PSA (простатический специфический антиген), СЕА (карциноэмбриональный антиген), СА125, СА15-3 и СА19-9. В определенных вариантах исполнения данное изобретение может быть использовано для оценки выживаемости при раке яичников, молочной железы и глиобластоме.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к идентификации субтипа ангиогенеза при раках. Субтип может быть детектирован путем определения уровней экспрессии определенных биомаркеров. Сигнатура экспрессии определяет набор биомаркеров, экспрессия которых является прогностической для типов рака, откликающихся или не откликающихся на антиангиогенные агенты. В определенных типичных вариантах исполнения сигнатура экспрессии включает два или больше биомаркера, выбранных из биомаркеров, перечисленных в табл. 1А и 1В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает два или больше биомаркера, выбранных из последовательностей SEQ ID NOs: 632-801 (группа I) или SEQ ID NOs: 802-974 (группа II). В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает два или больше биомаркера, выбранных из биомаркеров, перечисленных в табл. 2А и 2В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает биомаркеры, перечисленные в табл. 2А и 2В, и их соответствующие веса, определенные с использованием классификатора PLS.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к наборам для обычных диагностических применений, перечисленных выше, таких как qPCR, микрочипы и иммуноанализы, такие как иммуногисто-химия, ELISA, вестерн-блоттинг и т.п. Такие наборы включают соответствующие реагенты и указания по проведению анализа экспрессии генов или генных продуктов и количественному определению экспрессии мРНК или белка.
Также раскрыты способы идентификации опухолей человека с фенотипом ангиогенеза или без него. В определенных типичных вариантах исполнения такие способы могут быть использованы для идентификации пациентов, чувствительных к и откликающихся на препараты, ингибирующие, прямо или косвенно, процессы, связанные с ангиогенезом. В определенных других типичных вариантах исполнения такие способы могут быть использованы для идентификации пациентов, резистентных к или не откликающихся на препараты, ингибирующие, прямо или косвенно, процессы, связанные с ангиогенезом.
В другом аспекте изобретение может быть использовано как прогностический индикатор при определенных типах рака. В одном типичном варианте исполнения рак представляет собой рак яичников. В другом типичном варианте исполнения рак представляет собой рак молочной железы. В еще одном типичном варианте исполнения рак представляет собой глиобластому.
Настоящее изобретение также относится к выдаче рекомендаций по эффективному лечению пациентов. Кроме того, предусматриваются способы, относящиеся к выбору схем лечения пациента и отбору пациентов для клинических испытаний существующих или находящихся на стадии разработки препаратов, которые прямо или косвенно влияют на ангиогенез.
В дополнение к этому, тут описаны способы, позволяющие использовать законсервированные фиксированные формалином залитые в парафин (FFPE) биоптаты, а также свежую/замороженную (FF) ткань, для анализа всех транскриптов, и потому совместимые с наиболее широко распространенным типом биоптатов. Уровень экспрессии биомаркера может быть определен с использованием РНК, выделенной из FFPE-ткани, свежезамороженной ткани или свежей ткани, хранящейся в таких растворах, как RNAIater(r).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует тепловую карту (карту интенсивностей), представляющую результаты иерархического агломеративного кластерного анализа наиболее вариабельных генов из 199 серозных образцов из набора образцов эпителиального рака яичников фирмы Almac Diagnostics. Функциональный анализ кластеров набора зондов подытожен справа от изображения. Надписи вверху изображения указывают группу классификатора, к которой был отнесен каждый образец для создания классификатора (т.е. метки классов).
Фиг. 2А и 2В иллюстрируют результаты функционального анализа ангиогенеза для кластера набора зондов 199 только серозных образцов из обучающего набора эпителиального рака яичников с использованием функционального анализа обогащения. Фиг. 2А иллюстрирует гистограмму, представляющую значимость 10 биологических процессов Gene Ontology с наибольшей степенью обогащения. Красные
столбцы указывают значимость процесса с р-значением 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Фиг. 2В иллюстрирует подмножество дерева биологических процессов Gene Ontology, в котором процессы включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере 3. Процессы, окрашенные в красный цвет, указывают значимость этого процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Процессы, окрашенные в черный цвет, включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере 3, но не являющихся значимыми.
Фиг. 3 иллюстрирует результаты функционального обогащения для генов, входящих в типовую 25-генную сигнатуру экспрессии, идентифицирующую молекулярный субтип, ассоциированный с ангио-генезом. Красные столбцы указывают значимость процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения.
Фиг. 4 иллюстрирует кривые Каплана-Майера для безрецидивной выживаемости (время до наступления события в неделях) после начальной хирургической резекции у пациентов с глиобластомой высокой степени без предварительного лечения (Phillips H.S., Kharbanda S., Chen R., Forrest W.F. et al. "Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis", Cancer Cell 2006 Mar; 9(3):157-73. PMID: 16530701; Costa B.M., Smith J.S., Chen Y., Chen J. et al. "Reversing HOXA9 oncogene activation by PI3K inhibition: epigenetic mechanism and prognostic significance in human glioblastoma", Cancer Res 2010 Jan 15; 70(2):453-62. PMID:
20068170).
Фиг. 5 иллюстрирует график ROC-кривой характеристик классификации для типовой модели 25-генного классификатора 16 клеточных линий простаты после лечения дасатинибом. Величина ППК (площадь под кривой, AUC) составляет приблизительно 0,84 после применения модели классификатора. Границы 95% доверительного интервала были определенны с использованием 1000 бутстрап-итераций (Wang X.D., Reeves K., Luo F.R., Xu L.A. et al. "Identification of candidate predictive and surrogate molecular markers for dasatinib in prostate cancer: rationale for patient selection and efficacy monitoring", Genom. Biol. 2007; 8(11):R255. PMID: 18047674).
Фиг. 6 иллюстрирует тепловую карту, представляющую иерархический агломеративный кластерный анализ наиболее вариабельных генов 265 серозных образцов из набора образцов эпителиального рака яичников реклассифицированных в соответствии с уточненными критериями патологической классификации. Функциональный анализ кластеров наборов зондов подытожен справа от изображения. Надписи сверху изображения указывают группу классификатора, к которой был отнесен каждый образец для составления классификатора (т.е. метки классов).
Фиг. 7А и 7В иллюстрируют результаты функционального анализа набора зондов ангиогенеза из 265 только серозных образцов в обучающем наборе эпителиального рака яичников с использованием алгоритма инструмента функционального обогащения (FET). Фиг. 7А изображает гистограмму, представляющую значимость 10 биологических процессов Gene Ontology с наибольшим обогащением. Красные столбцы указывают значимость процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Фиг. 7В иллюстрирует подмножество дерева биологических процессов Gene Ontology, в котором процессы включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере 2 (ангиогенез). Окрашенные в красный цвет процессы указывают значимость данного процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения. Окрашенные в черный цвет процессы включают один или несколько генов, кодируемых наборами зондов в кластере ангиогенез, но не являются значимыми.
Фиг. 8 представляет результаты функционального обогащения для генов из типовой 45-генной модели классификатора, идентифицирующей молекулярный субтип, ассоциированный с ангиогенезом. Красные столбцы указывают значимость процесса с р-значением, равным 0,05, после коррекции на показатель ошибочного определения.
Фиг. 9 иллюстрирует график ROC-кривой характеристик классификации 45-генной модели классификатора для 16 клеточных линий простаты после лечения дасатинибом. Величина ППК составляет около 0,95 после применения модели классификатора. Границы 95% доверительного интервала были определены с использованием 1000 бутстрап-итераций.
Фиг. 10 иллюстрирует тепловую карту, представляющую иерархический агломеративный кластерный анализ наиболее вариабельных генов для 265 серозных образцов набора образцов эпителиального рака яичников, реклассифицированного в соответствии с уточненными критериями патологической классификации. Функциональный анализ кластеров наборов зондов подытожен справа от изображения. Надпись сверху изображения указывает группу классификатора, к которой должен быть отнесен каждый образец для создания классификатора для группы без ангиогенеза или без ответа.
Фиг. 11 иллюстрирует кривые Каплана-Майера для выживаемости без прогрессирования (в неделях) в группе образцов без ангиогенеза (фиг. 3А, кластер образцов 1) по сравнению с группой образцов с ангиогенезом (фиг. 10, кластеры образцов 2 и 3) в реклассифицированном наборе образцов яичников.
Фиг. 12А и 12В иллюстрируют тепловые карты, представляющие иерархический агломеративный кластерный анализ наиболее вариабельных генов для 51 ER-отрицательных образцов (фиг. 12А) набора
образцов рака молочной железы и наиболее вариабельных генов для 56 ER-положительных образцов набора образцов рака молочной железы (фиг. 12В). Функциональный анализ кластеров наборов зондов подытожен справа от изображения для кластеров, демонстрирующих развитие сосудистой се-ти/ангиогенез или иммунный ответ/интерферон-опосредованную передачу сигналов.
Перечень последовательностей
Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, приведены с использованием стандартных буквенных обозначений нуклеотидных оснований, определенных в 37 C.F.R. (Свод федеральных постановлений США) § 1.822. Приведена только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но комплементарная цепь считается включенной по любой ссылке на приведенную цепь.
Перечень последовательностей приводится на оптическом диске, который прилагается к данному патенту.
Детальное описание изобретения
Если не указано иное, технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, общеизвестные рядовому специалисту в области техники, к которой относится данное описание. Определения обычных терминов молекулярной биологии приведены в Benjamin Lewin, Genes IX, опубликованной Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994) и March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992).
Термины в единственном числе включают соответствующие термины во множественном числе, если из контекста четко не следует иное. Аналогично, союз "или" должен включать "и", если из контекста четко не следует иное. Термин "содержит" означает "включает". В случае конфликта главенствующим должно считаться данное описание, включая объяснения терминов.
В используемом в данном документе значении термины "панель маркеров", "классификатор экспрессии", "классификатор", "сигнатура экспрессии" или "сигнатура" могут быть использованы взаимозаменяемо.
Все публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки, упоминаемые в данном документе, указывают на уровень квалификации специалистов в области, к которой относится данное изобретение. Все публикации, опубликованные патентные документы и патентные заявки, упоминаемые в описании, настоящим включены в документ в качестве ссылок таким же образом, как если бы каждая индивидуальная публикация, опубликованный патентный документ или патентная заявка были специально и индивидуально указаны как включенные в качестве ссылок.
Обзор.
Важной целью проводящихся в настоящее время исследований рака является увеличение эффективности периоперационной системной терапии пациентов путем включения молекулярных параметров в клинические терапевтические решения. Фармакогенетика/геномика представляет собой исследование генетических/геномных факторов, задействованных в ответе индивидуума на чужеродное соединение или препарат. Агенты или модуляторы, обладающие стимулирующим или ингибирующим действием на экспрессию биомаркера по изобретению, могут быть введены индивидуумам для лечения (профилактически или терапевтически) рака у пациента. Идеальным было бы также учитывать фармакогеномику индивидуума в сочетании с таким лечением. Различия в метаболизме терапевтических средств могут, возможно, вызывать тяжелую токсичность или неудачу терапии в результате изменения соотношения между дозой и концентрацией в крови фармакологически активного препарата. Таким образом, понимание фармакогеномики индивидуума позволяет проводить выбор эффективных агентов (например, препаратов) для профилактического или терапевтического лечения. Такая фармакогеномика может быть дополнительно использована для определения пригодных дозировок и схем лечения. Соответственно, может быть определен уровень экспрессии биомаркера по изобретению у индивидуума для выбора, таким образом, пригодного агента (агентов) для терапевтического или профилактического лечения индивидуума.
Настоящее изобретение относится к молекулярно-диагностическим тестам, пригодным для диагностирования раков из разных анатомических участков, которые включают использование общего субтипа, ассоциированного с ангиогенезом. Изобретение включает сигнатуры экспрессии, которые идентифицируют субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к антиангиогенной терапии. Сигнатуру экспрессии определяют путем получения профилей экспрессии образцов из набора образцов с известной патологией и/или клиническим результатом. Образцы могут быть получены из образцов тканей одного типа или из тканей разных типов. В используемом в данном документе значении "профиль экспрессии" включает набор значений, характеризующих уровень экспрессии для каждого анализируемого биомаркера из данного образца.
Профили экспрессии для набора образцов затем анализируют с использованием математической модели. Могут быть применены разные математические модели, которые включают, без ограничений,
модели из области распознавания образов (Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001), машинного обучения (Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002, Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995), статистики (Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001), биоинформатики (Dudoit et al., 2002, J. Am. Statist. Assoc. 97:77-87, Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6567-6572) или хемометрики (Vandeginste, et al., Handbook of Chemometrics and Qualimetrics, Part B, Elsevier, Amsterdam 1998). Математическая модель идентифицирует один или несколько биомаркеров, экспрессируемых в наборе образцов, являющихся наиболее прогностическими для данного фенотипа болезни. Эти один или несколько биомаркеров определяют сигнатуру экспрессии. Соответственно, сигнатура экспрессии включает биомаркеры, идентифицированные как наиболее прогностические для данного фенотипа болезни. В определенных типичных вариантах исполнения математическая модель определяет переменную, такую как вес, для каждого идентифицированного биомаркера. В определенных типичных вариантах исполнения математическая модель определяет решающую функцию. Решающая функция может дополнительно определять порог оценки, разделяющий набор образцов на два фенотипа болезни, такие как, без ограничений, образцы, являющиеся восприимчивыми и невосприимчивыми к антиангиогенной терапии. В одном типичном варианте исполнения решающая функция и сигнатура экспрессии определяются с использованием линейного классификатора.
Для классификации новых образцов с использованием определенной сигнатуры экспрессии выделяют биомаркеры, определенные сигнатурой экспрессии, и определяют профиль экспрессии биомаркера (биомаркеров). Профиль экспрессии биомаркера нового образца анализируют с помощью той же самой математической модель, которую используют для определения сигнатуры экспрессии. В определенных типичных вариантах исполнения математическая модель определяет оценку экспрессии для нового образца. Оценка экспрессии может быть определена путем объединения значений экспрессии биомаркеров с соответствующими скалярными весами с использованием нелинейных, алгебраических, тригонометрических или корреляционных средних для получения единого скалярного значения. Оценку экспрессии сравнивают с порогом оценки и образец классифицируют как восприимчивый или невосприимчивый к антиангиогенной терапии. В одном типичном варианте исполнения значение экспрессии образца, большее контрольного значения экспрессии, указывает, что пациент будет восприимчивым к антиангиоген-ной терапии. В другом типичном варианте исполнения оценка экспрессии образца ниже порога оценки указывает, что пациент не будет восприимчивым к антиангиогенной терапии. В другом типичном варианте исполнения оценка экспрессии образца ниже пороговой оценки экспрессии указывает, что пациент болеет раком типа или имеет повышенный риск развития рака типа, являющегося невосприимчивым к антиангиогенной терапии. В другом типичном варианте исполнения оценка экспрессии образца выше контрольной оценки экспрессии указывает, что пациент болеет раком типа или имеет повышенный риск развития рака типа, являющегося восприимчивым к антиангиогенной терапии. В тех случаях, когда сигнатуру экспрессии получают из набора образцов тканей, включающего один тип раковой ткани, сигнатура экспрессии не ограничена идентифицированием одного и того же субтипа рака только в тканях того же самого типа рака, но может быть использована для других типов рака с тем же самым субтипом рака. Например, в тех случаях, когда сигнатуру экспрессии получают из образцов рака яичников, сигнатура экспрессии может быть использована для идентификации схожего субтипа ангиогенеза при разных раках, таких как глиобластома или рак молочной железы.
Одним из применений сигнатур экспрессии, раскрытых в описании, является стратификация отклика на и селекция пациентов по терапевтическим классам препаратов, охватывающих антиангиогенные терапии. По результатам анализа экспрессии набора идентифицированных биомаркеров в опухоли можно определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут наиболее вероятно снижать скорость роста раковой опухоли. Также можно определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут с наименьшей вероятностью снижать скорость роста раковой опухоли. По результатам анализа экспрессии набора биомаркеров, таким образом, можно исключить неэффективные или непригодные терапевтические агенты. Важно, что в определенных вариантах исполнения такие определения могут быть выполнены для отдельных пациентов или для отдельных агентов. Таким образом, можно определить, может или нет определенная схема лечения принести пользу конкретному пациенту или типу пациентов и/или следует ли продолжать определенную схему. Настоящее изобретение обеспечивает тест, который может направлять выбор терапии, а также отбирать группы пациентов для стратегии обогащения при проведении клинических испытаний по оценке новых терапий. Например, при оценке предполагаемого антиангиогенного агента или схемы лечения сигнатуры экспрессии и способы, раскрытые в описании, могут быть использованы для отбора для клинических испытаний индивидуумов с типами рака, являющимися восприимчивыми к антиангиогенным агентам. Субтип ангиогенеза может быть идентифицирован по свежим/замороженным (FF) или фиксированным формалином залитым в парафин (FFPE) образцам пациента. В одном типичном варианте исполнения типом рака является рак яичников. В другом типичном варианте исполнения типом рака является глиобластома. В еще одном типичном варианте исполнения типом рака является рак молочной железы.
Рак является "восприимчивым" к терапевтическому агенту, если его скорость роста ингибируется в результате контакта с терапевтическим агентом, по сравнению с его ростом в отсутствие контакта с терапевтическим агентом. Рост рака может быть измерен различными способами. Например, по размеру опухоли или путем измерения экспрессии опухолевых маркеров, соответствующих данному типу опухоли.
Рак является "невосприимчивым" к терапевтическому агенту, если его скорость роста не ингибиру-ется или ингибируется в очень низкой степени в результате контакта с терапевтическим агентом по сравнению с его ростом в отсутствие контакта с терапевтическим агентом. Как было указано выше, рост рака может быть измерен различными способами, например по размеру опухоли или путем измерения экспрессии опухолевых маркеров, соответствующих этому типу опухоли. Свойство невосприимчивости к терапевтическому агенту является в высшей степени изменчивым, причем разные раки демонстрируют разные уровни "невосприимчивости" к данному терапевтическому агенту, в разных условиях. Дополнительно, измерения невосприимчивости могут быть оценены с использованием дополнительных критериев, кроме роста размера опухоли, таких как, без ограничений, качество жизни пациента и степень мета-стазирования.
Идентификация сигнатур экспрессии.
Сигнатуры экспрессии по настоящему изобретению идентифицируют путем анализа профилей экспрессии определенных биомаркеров в наборе образцов пациента. Биомаркеры, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают ДНК, РНК и белки. Биомаркеры выделяют из образца пациента и их уровни экспрессии определяют для получения набора профилей экспрессии для каждого анализируемого образца из набора образцов пациента.
a) Профили экспрессии.
В определенных вариантах исполнения полученный профиль экспрессии представляет собой геномный профиль или профиль экспрессии нуклеиновой кислоты, где определяют количество или уровень одной или нескольких нуклеиновых кислот в образце. В таких вариантах исполнения образец, анализируемый для получения профиля экспрессии, используемого в диагностических или прогностических способах, представляет собой образец нуклеиновой кислоты. Образец нуклеиновой кислоты включает популяцию нуклеиновых кислот, которая включает информацию об экспрессии определяющих фенотип биомаркеров анализируемой клетки или ткани. В некоторых вариантах исполнения нуклеиновая кислота может включать РНК или ДНК нуклеиновые кислоты, например мРНК, кРНК, кДНК и т.д., при условии, что образец сохраняет информацию об экспрессии клетки-хозяина или ткани, из которой он получен. Образец может быть приготовлен рядом различных способов, как известно специалистам, например путем выделения мРНК из клетки, причем выделенная мРНК используется в том виде, как она была выделена, амплифицируется или используется для получения кДНК, кРНК и т.д., как известно в области дифференциальной генной экспрессии. Соответственно, определение уровня мРНК в образце включает приготовление кДНК или кРНК из мРНК и последующее измерение кДНК или кРНК. Образец типично готовят из клеток или ткани, взятых у субъекта, нуждающегося в лечении, например, путем биопсии ткани, с использованием стандартных протоколов, где типы клеток или тканей, из которых могут быть получены такие нуклеиновые кислоты, включают любую ткань, в которой существует характер экспрессии определяемого фенотипа, включая, без ограничений, больные клетки или ткани, жидкости организма и т.д.
Профили экспрессии могут быть получены из исходного образца нуклеиновой кислоты с использованием любого удобного протокола. Хотя известны разные методы получения профилей экспрессии, такие как используемые в области дифференциальной генной экспрессии/анализа биомаркеров, одним из репрезентативных и удобных типов протокола получения профилей экспрессии являются протоколы получения матричного профиль генной экспрессии. Такие методики представляют собой анализы гибридизации, в которых используется нуклеиновая кислота, демонстрирующая "зондовые" нуклеиновые кислоты для каждого оцениваемого/профилируемого гена получаемого профиля. В таких анализах образец нуклеиновых кислот-мишеней сначала готовят из исходного образца анализируемой нуклеиновой кислоты, причем приготовление может включать мечение нуклеиновых кислот-мишеней меткой, например элементом системы продуцирования сигнала. После приготовления образца нуклеиновой кислоты-мишени образец вводят в контакт с матрицей в условиях гибридизации, в результате чего образуются комплексы с целевыми нуклеиновыми кислотами, являющимися комплементарными к последовательностям зонда, закрепленными на поверхности матрицы. Затем детектируют присутствие гибридизованных комплексов, качественно или количественно. Технология специфической гибридизации, которая может быть реализована для получения профилей экспрессии, используемых в способах по настоящему изобретению, включает технологии, описанные в патентах США № 5143854; 5288644; 5324633; 5432049; 5470710; 5492806; 5503980; 5510270; 5525464; 5547839; 5580732; 5661028; 5800992; описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылок; а также WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; ЕР 373203 и ЕР 785280. В этих способах матрицу "зондовых" нуклеиновых кислот, включающую зонд для каждого из биомаркеров, экспрессия которых анализируется, вводят в контакт с нуклеиновыми кислотами-мишенями, как описано выше. Контакт осуществляют в условиях гибридизации,
например в жестких условиях гибридизации, как описано выше, и несвязанную нуклеиновую кислоту затем удаляют. Полученный профиль гибридизованных нуклеиновых кислот обеспечивает информацию, касающуюся экспрессии каждого из биомаркеров, используемых в качестве зондов, где информация об экспрессии указывает, экспрессируется данный ген или нет и, типично, на каком уровне, причем данные об экспрессии, т.е., профиль экспрессии, могут быть как качественными, так и количественными.
b) Болезни и источники образцов тканей.
В определенных типичных вариантах исполнения набор образцов пациента включает образцы раковой ткани, такие как законсервированные образцы. Набор образцов пациента предпочтительно получают из образцов раковой ткани, охарактеризованных с помощью прогноза, вероятности рецидива, долгосрочной выживаемости, клинического результата, отклика на лечение, диагноза, классификации рака или персонализованного геномного профиля. В используемом здесь значении рак включает, без ограничений, лейкоз, рак мозга, рак простаты, рак печени, рак яичников, рак желудка, колоректальный рак, рак горла, рак молочной железы, рак кожи, меланому, рак легкого, саркому, цервикальный рак, тестикуляр-ный рак, рак мочевого пузыря, эндокринный рак, эндометриальный рак, рак пищевода, глиому, лимфому, нейробластому, остеосаркому, рак поджелудочной железы, рак гипофиза, рак почки и т.п. В одном варианте исполнения описанные способы относятся к ракам, которые лечат антиангиогенными агентами, ан-тиангиогенными прицельными терапиями, ингибиторами сигнального пути ангиогенеза, без ограничений этими классами. Такие раки также включают подклассы и субтипы таких раков на разных стадиях патогенеза. В определенных типичных вариантах исполнения набор образцов пациента включает образцы рака яичников. В другом типичном варианте исполнения набор образцов пациента включает образцы рака молочной железы. В еще одном типичном варианте исполнения набор образцов пациента включает образцы глиобластомы.
"Биологический образец", "образец" и "исследуемый образец" используются взаимозаменяемо по отношению к любому материалу, биологической жидкости, ткани или клетке, полученной или иначе взятой от индивидуума. Они включают кровь (включая цельную кровь, лейкоциты, мононуклеарные клетки периферической крови, лейкоцитную пленку, плазма и сыворотку), слюну, слезы, слизь, назальные смывы, назальный аспират, выдыхаемый воздух, мочу, сперму, слюну, менингеальную жидкость, амниоти-ческую жидкость, железистую жидкость, лимфатическую жидкость, аспират сосков, бронхиальный аспират, синовиальную жидкость, аспират суставов, асцит, клетки, клеточный экстракт и цереброспинальную жидкость. Они также включают экспериментально выделенные фракции всего вышеперечисленного. Например, образец крови может быть фракционирован для выделения сыворотки или на фракции, содержащие конкретные типы клеток крови, таких как красные кровяные клетки или белые кровяные клетки (лейкоциты). При необходимости, образец может быть комбинацией образцов индивидуума, такой как комбинацией ткани и образца жидкости. Термин "биологический образец" также включает материалы, содержащие гомогенизированный твердый материал, например, такие как из образца стула, образца ткани или биопсии ткани. Термин "биологический образец" также включает материалы, полученные из культуры ткани или культуры клеток. Могут быть использованы любые пригодные способы получения биологического образца; типичные способы включают, например, флеботомию, мазки (например, буккальный мазок) и процедуру биопсию аспирата тонкой иглой. Образцы также могут быть взяты, например, путем микродиссекции (например, лазерная захватывающая микродиссекция (LCM) или лазерная микродиссекция (LMD)), смыва мочевого пузыря, мазка (например, мазок РАР (Папаниколау)) или протокового лаважа. "Биологический образец", полученный или взятый у индивидуума, включает любой такой образец, который был обработан любым пригодным способом после получения от индивидуума, например свежезамороженный или фиксированный формалином и/или залитый в парафин.
В используемом в данном документе значении термин "пациент" включает человека и не относящихся к человеку животных. Предпочтительным пациентом для проведения лечения является человек. "Пациент" и "субъект" используются в данном документе взаимозаменяемо.
c) Биомаркеры.
В используемом в данном документе значении термин "биомаркер" может относиться к гену, мРНК, кДНК, антисмысловому транскрипту, микроРНК, полипептиду, белку, белковому фрагменту или любой другой последовательности нуклеиновой кислоты или полипептидной последовательности, которые указывают или уровни экспрессии генов или уровни продуцирования белка. В тех случаях, когда биомаркер указывает или является признаком аномального процесса, болезни или другого состояния у индивидуума, этот биомаркер в общем описывается как сверхэкспрессируемый или недостаточно экс-прессируемый по сравнению с уровнем экспрессии или величиной показателя биомаркера, указывающими или являющимися признаком нормального процесса, отсутствия болезни или другого состояния у индивидуума. "Повышающая регуляция", "с повышенной регуляцией", "сверхэкспрессия", "сверхэкс-прессируемый" и любые их вариации используются взаимозаменяемо по отношению к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, большему значения величины или уровня (или интервал значений или уровней) биомаркера, типично детектируемого в аналогичных биологических образцах от здоровых или нормальных индивидуумов. Термины могут также относиться к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, превышающему значение величины или уро
вень (или интервал значений или уровней) биомаркера, который может быть детектирован на другой стадии конкретной болезни.
"Понижающая регуляция", "с понижающей регуляцией", "недостаточная экспрессия", "недостаточно экспрессируемый" и любые их вариации используются взаимозаменяемо по отношению к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, меньшему значения величины или уровня (или интервала значений или уровней) биомаркера, которое типично детектируется в аналогичных биологических образцах от здоровых или нормальных индивидуумов. Термины могут также относиться к значению величины или уровню биомаркера в биологическом образце, меньшему значения величины или уровня (или интервала значений или уровней) биомаркера, которое может быть детектировано на другой стадии конкретной болезни.
Кроме того, биомаркер, который является сверхэкспрессируемым или недостаточно экспрессируе-мым, также может быть назван "с дифференцированной экспрессией" или имеющим "дифференцированный уровень" или "дифференцированное значение" по сравнению с "нормальным" уровнем экспрессии или величиной показателя биомаркера, который указывает на или является признаком нормального процесса или отсутствия болезни или другого состояния у индивидуума. Таким образом, "дифференцированная экспрессия" биомаркера также может быть названа отклонением от "нормального" уровня экспрессии биомаркера.
Термины "дифференцированная экспрессия биомаркера" и "дифференцированная экспрессия" используются взаимозаменяемо по отношению к биомаркеру, экспрессия которого активируется до более высокого или более низкого уровня у субъекта, страдающего от определенной болезни, по сравнению с его экспрессией у нормального субъекта или по сравнению с его экспрессией у пациента с дифференцированным ответом на определенную терапию или имеющего отличающийся прогноз. Термины также включают биомаркеры, экспрессия которых активируется до более высокого или более низкого уровня на разных стадиях той же болезни. Также следует понимать, что биомаркер с дифференцированной экспрессией может активироваться или ингибироваться при уровне нуклеиновой кислоты или уровне белка или может подвергаться альтернативному сплайсингу, приводящему к другому полипептидному продукту. Такие различия могут быть засвидетельствованы различными изменениями, включая уровни мРНК, уровни микроРНК, уровни антисмыслового транскрипта или экспрессию поверхностного белка, секрецию или другое распределение полипептида. Дифференцированная экспрессия биомаркера может включать сравнение экспрессии двух или больше генов или их генных продуктов; или сравнение соотношений экспрессии двух или больше генов или их генных продуктов; или даже сравнение двух различно процессированных продуктов одного и того же гена, которые различаются у нормальных субъектов и субъектов, страдающих от болезни; или между разными стадиями одной и той же болезни. Дифференцированная экспрессия включает как количественные, так и качественные различия временного или клеточного профиля экспрессии биомаркера, например, между нормальными и больными клетками или между клетками, в которых происходят разные связанные с болезнью явления, или находящимися на разных стадиях болезни.
В определенных типичных вариантах исполнения биомаркер представляет собой транскрипт РНК. В используемом в данном документе значении "транскрипт РНК" относится как к кодирующей, так и к некодирующей РНК, включая матричные (информационные) РНК (мРНК), альтернативно сплайсирован-ные мРНК, рибосомальные РНК (рРНК), транспортную РНК (тРНК), малые ядерные РНК (мяРНК) и антисмысловую РНК. Измерение мРНК в биологическом образце может быть использовано в качестве замены детектирования уровня соответствующего белка и гена в биологическом образце. Таким образом, любые биомаркеры или панели биомаркеров, описанные в документе, также могут быть детектированы путем детектирования соответствующей РНК. Способы определения профилей экспрессии биомаркеров включают, без ограничений, количественную ПЦР, технологию NGS (секвенирование следующего поколения), нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, микрочипы, SAGE (серийный анализ генетической экспрессии), иммуноанализы (ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), EIA (иммуноферментный анализ), агглютинацию, нефелометрию, турбидиметрию, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, иммуно-цитохимию, проточную цитометрию, анализы по технологии Luminex (множественное флуоресцентное кодирование и цитометрия)) и масс-спектрометрию. Общие данные об экспрессии для данного образца могут быть нормированы с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, для внесения поправок на различные количества исходных материалов, разные эффективности экстракции и реакций амплификации.
В определенных типичных вариантах исполнения биомаркеры, пригодные для распознавания типов рака, восприимчивых и невосприимчивых к антиангиогенной терапии, могут быть определены путем идентификации биомаркеров, демонстрирующих наивысшую степень изменчивости в разных образцах набора данных пациента, определенных с использованием способов детектирования экспрессии и наборов образцов пациентов, описанных выше. Стандартные статистические способы идентификации точек данных с высокой степенью изменчивости в данных об экспрессии, известные специалистам, могут быть использованы для идентификации биомаркеров с высокой степенью изменчивости. Например, комбинированный фильтр фона и дисперсии набора данных пациента. Фильтр фона основан на селекции наборов
зондов с экспрессией Е и дисперсией экспрессии varE выше пороговых значений, определенных стандартным отклонением фона aBg (в прикладной программе Expression Console), и квантиль стандартного нормального распределения za при заданной значимости а наборов зондов сохраняется, если: Е > log2((zacr eg)); log2((varЈ) > 2 [log2(oBg) - E - log2(log(2))] где а обозначает порог значимости.
В определенном типичном варианте исполнения порог значимости равен 6,3-10-5. В другом типичном варианте исполнения порог значимости может иметь значение от 1,0-10-7 до 1,0-10-3.
В определенных типичных вариантах исполнения биомаркеры с высокой степенью изменчивости могут быть дополнительно проанализированы для группирования образцов в наборе данных пациента в субтипы или кластеры на основании схожих профилей генной экспрессии. Например, биомаркеры могут быть разбиты на кластеры на основании того, насколько сильно коррелирует повышающая регуляция или понижающая регуляция их экспрессии друг с другом. Могут быть использованы различные методики кластерного анализа, известные специалистам. В одном типичном варианте исполнения иерархическая агломеративная кластеризация используется для идентификации субтипов рака. Для определения биологической релевантности каждого субтипа биомаркеры внутри каждого кластера могут быть дополнительно картированы по их соответствующим генам и аннотированы с помощью ссылок на одну или несколько баз данных генетической онтологии, содержащих информацию о биологической активности и биологических путях, ассоциированных с этим геном. В одном типичном варианте исполнения биомаркеры в кластерах, обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа, собраны в группу предполагаемого образца ангиогенеза и используются для получения сигнатуры экспрессии. В другом типичном варианте исполнения биомаркеры в кластерах с повышающей регуляцией и обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа, собраны в группу предполагаемого образца ангиогенеза и используются для получения сигнатуры экспрессии. В другом типичном варианте исполнения биомаркеры в кластерах с понижающей регуляцией и обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа собраны в группу предполагаемого образца ангиогенеза и используются для получения сигнатуры экспрессии. Дополнительные подробности проведения функционального анализа кластеров биомаркеров приведены в разделе "Примеры" ниже.
В одном типичном варианте исполнения биомаркеры, пригодные для получения сигнатуры экспрессии для различения субтипов рака, восприимчивых или нет к антиангиогенной терапии, включают биомаркеры, перечисленные в табл. 1А, 1В или в обеих таблицах. В другом типичном варианте исполнения биомаркеры, пригодные для получения сигнатуры экспрессии для различения субтипов рака, восприимчивых или нет к антиангиогенной терапии, включают биомаркеры, перечисленные в группе I (включающей SEQ ID NOs: 632-801) или группе II (включающей SEQ ID NOs: 802-974) или обеих группах. Такие биомаркеры идентифицируют как имеющие прогностическое значение для определения ответа пациента на терапевтический агент. Их экспрессия коррелирует с ответом или его отсутствием на агент и, более конкретно, антиангиогенный терапевтический агент. По результатам анализа экспрессии набора идентифицированных биомаркеров в опухоли можно определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут наиболее вероятно снижать скорость роста рака. Путем анализа набора идентифицированных биомаркеров в опухоли можно также определить, какой терапевтический агент или комбинация агентов будут с наименьшей вероятностью снижать скорость роста рака. Таким образом, по результатам анализа экспрессии набора биомаркеров можно устранить неэффективные или непригодные терапевтические агенты. Важно, в определенных вариантах исполнения такие определения могут проводиться для отдельных пациентов или для отдельных агентов. Таким образом, можно определить, будет ли определенная схема лечения вероятно обеспечивать полезный эффект для конкретного пациента или типа пациентов и/или следует ли продолжать лечение по определенной схеме.
смысловая
MIR21
смысловая
BASP1
смысловая
IFIT2
смысловая
SULF1
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
смысловая (полностьюОэкзонная)
IGLC2 /// IGLC3
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
смысловая
IGLC1
смысловая
IGLC1
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
смысловая
ANGPTL2
смысловая
COL5A2
смысловая
IGJ
смысловая
THY1
смысловая
NDN
смысловая
RGS2
смысловая
MEIS3P1 /// MEIS3P2
смысловая
GBP2
смысловая
CSF1R
смысловая
C1R
смысловая
FAT1
смысловая
COL1A1
смысловая
RHOB
смысловая
ММР11
смысловая
GADD45B
смысловая
ММР14
смысловая
ММР14
смысловая
IGHG4
смысловая
DDX60L
смысловая
SPP1
смысловая
ROR2
смысловая
CTSK
смысловая
FCGR2B
смысловая
PTAFR
смысловая
ICAM1
смысловая
HCLS1
нет соответствующего транскрипта
смысловая
SLFN11
нет соответствующего транскрипта
смысловая
JAM3
смысловая
ТМЕМ49
смысловая
ТМЕМ49
смысловая
LTBP2
смысловая
IRS1
смысловая
COL5A2
смысловая
C17orf91
смысловая
GPNMB
смысловая
FAM198B
смысловая
MICAL2
смысловая
ТМЕМ2
смысловая
CHST15
смысловая
SECTM1
смысловая
DCN
смысловая
VCAM1
смысловая
TNFAIP3
100
смысловая
C1QA
101
смысловая
C1QA
102
смысловая
FBX032
103
смысловая
COL12A1
104
смысловая
CPE
105
смысловая
СИТА
106
смысловая
GAS7
107
смысловая
COL3A1
108
смысловая
FN1
109
смысловая
IFI30
110
смысловая
ITGB2
111
смысловая
ELN
112
смысловая
СМТМЗ
113
смысловая
ANTXR1
114
смысловая
ARHGDIB
115
смысловая
LAPTM5
116
смысловая
SOX4
117
смысловая
IFI44L
118
смысловая
IL4I1
119
смысловая
ANTXR2
120
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
121
смысловая
EPSTI1
122
смысловая
BIRC3
123
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
124
смысловая
BST2
125
смысловая
TNFSF10
126
смысловая
COL10A1
127
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
128
смысловая
FBP1
129
смысловая
RHOBTB3
130
смысловая
CDK6
131
смысловая
CD74
132
смысловая
ISM1
133
смысловая
C1QC
134
смысловая
BIN2
135
смысловая
CSRNP1
136
смысловая
TYROBP
137
смысловая
C1QTNF3
138
смысловая
DCN
139
смысловая
IGFBP4
140
смысловая
АОАН
141
смысловая
SIRPA
142
смысловая
FOSB
143
смысловая
CCDC80
144
смысловая
IGLC1
145
смысловая
HCST
146
смысловая
IFI35
147
смысловая
BIRC3
148
смысловая
COL3A1
149
смысловая
IFITM2
150
смысловая
ZFP36
151
смысловая
ММР11
152
смысловая
COL1A2
153
смысловая
HLA-DPA1
154
смысловая
TWIST 1
155
смысловая
ZNF154
156
смысловая
EGR1
157
смысловая
IGLC2 /// IGLC3
158
смысловая
TNFSF10
159
смысловая
IGKC
160
смысловая
IGHG1 /// IGHG4
161
смысловая
GBP5
162
смысловая
COL1A2
163
смысловая
АРОС1
164
нет соответствующего транскрипта
165
смысловая
COL3A1
166
антисмыслов
PXDN
167
антисмыслов
EGR1
168
смысловая
GBP3
169
смысловая
ISG15
170
смысловая
171
смысловая
KIAA0146
172
смысловая
СМАН
173
смысловая
АРВВ2
174
смысловая
ТРМ1
175
нет соответствующего транскрипта
176
смысловая
DMD
177
нет совпадения в геноме
178
смысловая
IL10RA
179
смысловая
180
нет соответствующего транскрипта
181
смысловая
DUSP1
182
смысловая
GBP1
183
смысловая
PARVG
184
смысловая
MAFF
185
смысловая
PDGFC
186
смысловая
MSN
187
смысловая
RSAD2
188
смысловая
ТРМ1
189
смысловая
ЕМВ
190
смысловая
C6orf155
191
смысловая
FOS
192
смысловая
DEXI
193
смысловая
RNF19A
194
смысловая
FBX032
195
смысловая
DPYSL3
196
смысловая
PRICKLE1
197
антисмысловая
EGR1
198
антисмысловая
NRP2
199
смысловая
В2М
200
антисмысловая
MIR21
201
смысловая
ММР2
202
смысловая
CDR1
203
смысловая
HLA-B
204
смысловая
CTGF
205
смысловая
DCN
206
смысловая
SOD2
207
смысловая
FN1
208
смысловая
COL8A2
209
смысловая
SGK1
210
смысловая
TIMP3
211
смысловая
АСТА2
212
смысловая
SRGN
213
смысловая
LOXL1
214
смысловая
CCR1
215
смысловая
GBP1
216
смысловая
CDH11
217
смысловая
FCGR3A
218
смысловая
219
смысловая
NNMT
220
смысловая
COL1A2
221
смысловая
RGS1
222
смысловая
GJA1
223
смысловая
SPARCL1
224
смысловая
DAB2
225
антисмысловая
CTHRC1
226
смысловая
RGS16
227
смысловая
FBLN1
228
смысловая
SPP1
229
смысловая
CTSB
230
смысловая
SPP1
231
смысловая
SDC1
232
смысловая
PLAU
233
смысловая
PDGFRA
234
смысловая
SERPINF1
235
смысловая
BGN
236
смысловая
COL6A3
237
антисмысловая
238
антисмысловая
239
антисмысловая
SPP1
240
антисмысловая
HLA-DQA1
241
антисмысловая
GAS1
242
смысловая
VCAN
243
антисмысловая
244
смысловая
IGHG4 III IGHG2 /// IGHG1 /// IGHGP
245
смысловая
IGHG2
246
смысловая
C3orf26
247
антисмысловая
ATF3
248
антисмысловая
ATF3
249
антисмысловая
SULF1
250
смысловая
FN1
251
антисмысловая
CALD1
252
антисмысловая
CALD1
253
смысловая
ТМЕМ49
254
смысловая
ТМЕМ49
255
смысловая
CHD5
256
антисмысловая
EGR1
257
антисмысловая
SNAI2
258
антисмысловая
ITPRIPL2
259
антисмысловая
GABBR1 /// UBD
260
антисмысловая
GABBR1 /// UBD
261
антисмысловая
TWIST1
262
антисмысловая
TWIST1
263
антисмысловая
BATF2
264
антисмысловая
NFKBIZ
265
смысловая
C3orf26
266
антисмысловая
LOXL1
267
смысловая
268
антисмысловая
TIMP2
269
антисмысловая
FN1
270
антисмысловая
COL1A1
271
антисмысловая
DCN
272
смысловая
TREH
273
антисмысловая
UBE2L6
274
антисмысловая
APOL1
275
антисмысловая
BIRC3
276
антисмысловая
BIRC3
277
смысловая
LILRB4
278
смысловая
FGD2
279
смысловая
ТМЕМ49
280
смысловая
NCF4
281
смысловая
COL10A1
282
смысловая
GAL3ST4
283
смысловая
НСК
284
смысловая
TAGLN
285
смысловая
TWIST1
286
смысловая
HCLS1
287
смысловая
LPAR6
288
смысловая
ITGB2
289
смысловая
LST1
290
смысловая
HLA-B
291
смысловая
C17orf91
292
смысловая
ZC3H12A
293
смысловая
KLF10
294
смысловая
BASP1
295
смысловая
BASP1
смысловая (полностью экзонная)
FCGR1B
смысловая (полностью экзонная)
EDA2R
смысловая (полностью экзонная)
COL8A1
смысловая (полностью экзонная)
COL12A1
смысловая (полностью экзонная)
HLA-B
смысловая
HLA-F
смысловая (полностью экзонная)
EGR1
смысловая (полностью экзонная)
SULF2
смысловая (полностью экзонная)
CERCAM
смысловая (полностью экзонная)
ATF3
смысловая (полностью экзонная)
MIR21
смысловая (полностью экзонная)
IFIT2
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
смысловая (полностью экзонная)
ANGPTL2
смысловая (полностью экзонная)
COL5A2
смысловая (полностью экзонная)
THY1
смысловая (полностью экзонная)
NDN
смысловая (полностью экзонная)
RGS2
смысловая (полностью экзонная)
MEIS3P2
смысловая (полностью экзонная)
GBP2
смысловая (полностью экзонная)
FAT1
смысловая (полностью экзонная)
COL1A1
смысловая (полностью экзонная)
ММР11
смысловая (полностью экзонная)
GADD45B
смысловая (полностью экзонная)
ММР14
смысловая (полностью экзонная)
IGHG4
смысловая (полностью экзонная)
HCLS1
нет соответствующего транскрипта
смысловая (полностью экзонная)
JAM3
смысловая (полностью экзонная)
ТМЕМ49
смысловая (полностью экзонная)
LTBP2
смысловая (полностью экзонная)
IRS1
смысловая (полностью экзонная)
C17orf91
смысловая (полностью экзонная)
GPNMB
смысловая (полностью экзонная)
FAM198B
смысловая (полностью экзонная)
CHST15
смысловая (полностью экзонная)
DCN
смысловая (полностью экзонная)
VCAM1
105
смысловая (полностью экзонная)
СИТА
106
смысловая (полностью экзонная)
GAS7
107
смысловая (полностью экзонная)
COL3A1
110
смысловая (полностью экзонная)
ITGB2
111
смысловая (полностью экзонная)
ELN
112
смысловая (полностью экзонная)
СМТМЗ
113
смысловая (полностью экзонная)
ANTXR1
118
смысловая (полностью экзонная)
IL4I1
119
смысловая (полностью экзонная)
ANTXR2
120
смысловая (полностью экзонная)
IGLC2 /// IGLC3
123
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
124
смысловая (полностью экзонная)
BST2
126
смысловая (полностью экзонная)
COL10A1
127
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
128
смысловая (полностью экзонная)
FBP1
129
смысловая (полностью экзонная)
RHOBTB3
131
смысловая (полностью экзонная)
CD74
132
смысловая (полностью экзонная)
ISM1
135
смысловая (полностью экзонная)
CSRNP1
138
смысловая (полностью экзонная)
DCN
139
смысловая (полностью экзонная)
IGFBP4
143
смысловая (полностью экзонная)
CCDC80
148
смысловая (полностью экзонная)
COL3A1
150
смысловая (полностью экзонная)
ZFP36
151
смысловая (полностью экзонная)
ММР11
152
смысловая (полностью экзонная)
COL1A2
153
смысловая (полностью экзонная)
HLA-DPA1
154
смысловая (полностью экзонная)
TWIST1
155
смысловая (полностью экзонная)
ZNF154
157
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
159
смысловая (полностью экзонная)
IGKC
160
смысловая (полностью экзонная)
IGHG1
162
смысловая (полностью экзонная)
COL1A2
163
смысловая (полностью экзонная)
АРОС1
167
антисмысловая
EGR1
171
смысловая (полностью экзонная)
KIAA0146
174
смысловая (полностью экзонная)
ТРМ1
176
смысловая (включает интронную)
DMD
180
нет соответствующего транскрипта
181
смысловая (полностью экзонная)
DUSP1
182
смысловая (полностью экзонная)
GBP1
185
смысловая (включает интронную)
PDGFC
186
смысловая (включает интронную)
MSN
188
смысловая (включает интронную)
ТРМ1
189
смысловая (полностью экзонная)
EMB
191
смысловая (полностью экзонная)
FOS
195
смысловая (включает интронную)
DPYSL3
197
антисмысловая
EGR1
198
антисмысловая
NRP2
201
смысловая (полностью экзонная)
MMP2
204
смысловая (полностью экзонная)
CTGF
211
смысловая (полностью экзонная)
ACTA2
213
смысловая (полностью экзонная)
LOXL1
216
смысловая (полностью экзонная)
CDH11
218
смысловая (полностью экзонная)
LUM
219
смысловая (полностью экзонная)
NNMT
222
смысловая (полностью экзонная)
GJA1
225
антисмысловая
CTHRC1
229
смысловая (полностью экзонная)
CTSB
232
смысловая (полностью экзонная)
PLAU
233
смысловая (полностью экзонная)
PDGFRA
242
смысловая (полностью экзонная)
VCAN
243
антисмысловая
244
смысловая (полностью экзонная)
IGHG4 ///IGHG2///IGHG1 1Н\ GHGP
245
смысловая (полностью экзонная)
IGHG2
246
смысловая (включает интронную)
C3orf26
247
антисмысловая
ATF3
248
антисмысловая
ATF3
250
смысловая (полностью экзонная)
FN1
251
антисмысловая
CALD1
252
антисмысловая
CALD1
256
антисмысловая
EGR1
261
антисмысловая
TWIST1
262
антисмысловая
TWIST1
263
антисмысловая
BATF2
264
антисмысловая
NFKBIZ
265
смысловая (включает интронную)
C3orf26
266
антисмысловая
LOXL1
267
смысловая (включает интронную)
269
антисмысловая
FN1
270
антисмысловая
COL1A1
272
смысловая (полностью экзонная)
TREH
274
антисмысловая
APOL1
281
смысловая (полностью экзонная)
COL10A1
282
смысловая (полностью экзонная)
GAL3ST4
284
смысловая (полностью экзонная)
TAGLN
285
смысловая (полностью экзонная)
TWIST1
286
смысловая (полностью экзонная)
HCLS1
288
смысловая (полностью экзонная)
ITGB2
290
смысловая (полностью экзонная)
HLA-B
291
смысловая (полностью экзонная)
C17orf91
296
смысловая (полностью экзонная)
FBLIM1
297
смысловая (полностью экзонная)
COL15A1
298
смысловая (полностью экзонная)
AQP7P3
299
антисмысловая
IGFBP5
300
смысловая (полностью экзонная)
FANK1
301
антисмысловая
INS
302
смысловая (полностью экзонная)
COL27A1
303
смысловая (полностью экзонная)
COL5A1
304
смысловая (полностью экзонная)
PRICKLE2
305
смысловая (полностью экзонная)
N/A
306
смысловая (полностью экзонная)
GXYLT2
307
смысловая (включает интронную)
KLF12
308
нет соответствующего транскрипта
309
смысловая (полностью экзонная)
FBX032
310
нет соответствующего транскрипта
311
смысловая (полностью экзонная)
ASAH2B
312
антисмысловая
PPFIBP1
313
антисмысловая
XIST
314
смысловая (полностью экзонная)
IGFBP6
315
смысловая (полностью экзонная)
ROB01
316
смысловая (полностью экзонная)
ТРМ1
317
антисмысловая
N/A
318
антисмысловая
PLEKHG1
319
смысловая (полностью экзонная)
NR2F1
320
смысловая (полностью экзонная)
NPDC1
321
антисмысловая
INS
322
смысловая (полностью экзонная)
TRAF5
323
смысловая (полностью экзонная)
CALD1
324
смысловая (включает интронную)
CHRM3
325
смысловая (полностью экзонная)
AMOTL1
326
смысловая (включает интронную)
COL12A1
327
смысловая (полностью экзонная)
PLXNA4
328
смысловая (включает интронную)
ТМЕМ43
329
смысловая (включает интронную)
RORA
330
антисмысловая
INS
331
смысловая (полностью экзонная)
TSPAN18
332
нет соответствующего транскрипта
333
смысловая (полностью экзонная)
TNC
334
смысловая (полностью экзонная)
TYR03
335
антисмысловая
EFNA5
336
смысловая (полностью экзонная)
MYL9
337
смысловая (полностью экзонная)
MIR198
338
смысловая (включает интронную)
N/A
339
смысловая (включает интронную)
PLA2R1
340
смысловая (полностью экзонная)
COL14A1
341
смысловая (полностью экзонная)
NRP1
342
смысловая (полностью экзонная)
FSCN1
343
смысловая (включает интронную)
PDGFD
344
нет соответствующего транскрипта
345
смысловая (включает интронную)
DOCK4
346
смысловая (полностью экзонная)
TRIM13
347
смысловая (полностью экзонная)
IGFBP5
348
смысловая (полностью экзонная)
C190I163
349
антисмысловая
KLF6
350
антисмысловая
TRIO
351
смысловая (полностью экзонная)
COL4A1
352
смысловая (полностью экзонная)
EPDR1
353
смысловая (полностью экзонная)
FNDC1
354
смысловая (полностью экзонная)
IL1R1
355
смысловая (полностью экзонная)
CES4
356
смысловая (полностью экзонная)
GPR176
357
смысловая (включает интронную)
GXYLT2
358
антисмысловая
WHSC1L1
359
смысловая (полностью экзонная)
N/A
360
смысловая (полностью экзонная)
RGN
361
смысловая (включает интронную)
САЗ
362
смысловая (полностью экзонная)
TIMP3
363
смысловая (полностью экзонная)
EFNA5
364
смысловая (полностью экзонная)
RASGRF2
365
смысловая (включает интронную)
RELL1
366
антисмысловая
ACSS3
367
смысловая (полностью экзонная)
STMN3
368
смысловая (полностью экзонная)
N/A
369
антисмысловая
C7orf29
370
смысловая (полностью экзонная)
НОХС6
371
смысловая (полностью экзонная)
KLF8
372
смысловая (включает интронную)
SERINC5
373
смысловая (полностью экзонная)
АКТЗ
374
смысловая (полностью экзонная)
TGFB2
375
антисмысловая
WNT5A
376
нет соответствующего транскрипта
377
нет соответствующего транскрипта
378
антисмысловая
IGFBP7
379
нет соответствующего транскрипта
380
смысловая (включает интронную)
SULT1C4
381
смысловая (полностью экзонная)
AASS
382
смысловая (полностью экзонная)
НЕРН
383
смысловая (полностью экзонная)
ADH5
384
смысловая (полностью экзонная)
TIMP2
385
смысловая (полностью экзонная)
ЕМР1
386
смысловая (полностью экзонная)
CXCL14
387
смысловая (полностью экзонная)
ZNF548
388
смысловая (полностью экзонная)
SGCB
389
смысловая (включает интронную)
ASH2L
390
смысловая (включает интронную)
SERINC5
391
нет соответствия в геноме
392
смысловая (полностью экзонная)
ТМЕМ159
393
смысловая (включает интронную)
RBMS3
394
смысловая (полностью экзонная)
ТМЕМ49
395
смысловая (включает интронную)
RORA
396
нет соответствующего транскрипта
397
антисмысловая
ZNF608
398
нет соответствия в геноме
399
смысловая (полностью экзонная)
ADAMTS2
400
смысловая (полностью экзонная)
APCDD1
401
антисмысловая
GXYLT2
402
смысловая (полностью экзонная)
XIST
403
смысловая (полностью экзонная)
MBNL2
404
смысловая (полностью экзонная)
SHF
405
смысловая (включает интронную)
АРВВ2
406
нет соответствующего транскрипта
407
смысловая (полностью экзонная)
COL14A1
408
смысловая (полностью экзонная)
IGFBP5
409
смысловая (полностью экзонная)
CREB5
410
антисмысловая
INS
411
смысловая (полностью экзонная)
ВАНСС1
412
смысловая (полностью экзонная)
RFXAP
413
смысловая (полностью экзонная)
INS
414
смысловая (полностью экзонная)
DDR2
415
смысловая (полностью экзонная)
СА12
416
смысловая (полностью экзонная)
RHOB
417
смысловая (полностью экзонная)
N/A
418
смысловая (полностью экзонная)
SNORD116-4
419
смысловая (полностью экзонная)
MEG3
420
смысловая (полностью экзонная)
WNT4
421
смысловая (полностью экзонная)
FBLN2
422
антисмысловая
DAAM1
423
нет соответствующего транскрипта
424
смысловая (полностью экзонная)
CHN1
425
смысловая (включает интронную)
APBB2
426
смысловая (полностью экзонная)
PTRF
427
антисмысловая
IGF1
428
смысловая (полностью экзонная)
U ST
429
смысловая (полностью экзонная)
SMARCA1
430
смысловая (включает интронную)
N/A
431
смысловая (полностью экзонная)
IGLC3
432
антисмысловая
INS
433
смысловая (полностью экзонная)
KANK4
434
антисмысловая
IGF1
435
смысловая (полностью экзонная)
CYP27A1
436
антисмысловая
EIF2B5
437
нет соответствующего транскрипта
438
смысловая (полностью экзонная)
SNRNP25
439
смысловая (полностью экзонная)
SETD7
440
смысловая (полностью экзонная)
MSX1
441
смысловая (полностью экзонная)
НОРХ
442
смысловая (полностью экзонная)
NID2
443
смысловая (полностью экзонная)
IGF1
444
смысловая (полностью экзонная)
PSD3
445
смысловая (полностью экзонная)
FGFR1
446
смысловая (полностью экзонная)
ETV1
447
смысловая (полностью экзонная)
ZNF655
448
нет соответствия в геноме
449
антисмысловая
INS
450
смысловая (полностью экзонная)
SFRP2
451
смысловая (полностью экзонная)
SPAG16
452
антисмысловая
NR2F2
453
смысловая (включает интронную)
SYNP02
454
смысловая (полностью экзонная)
FAM101B
455
антисмысловая
IGF2
456
смысловая (полностью экзонная)
САЗ
457
смысловая (полностью экзонная)
XIST
458
нет соответствующего транскрипта
459
смысловая (полностью экзонная)
WNT7A
460
смысловая (включает интронную)
N/A
461
смысловая (полностью экзонная)
FGFR1
462
антисмысловая
FXYD6
463
смысловая (полностью экзонная)
FGFR1
464
смысловая (включает интронную)
IGFBP7
465
смысловая (полностью экзонная)
TIMP2
466
смысловая (полностью экзонная)
DUSP1
467
смысловая (включает интронную)
SERINC5
468
нет соответствующего транскрипта
469
смысловая (полностью экзонная)
ABLIM1
470
смысловая (полностью экзонная)
ARL4A
471
антисмысловая
SH3TC2
472
антисмысловая
NR2F2
473
смысловая (полностью экзонная)
ENG
474
смысловая (полностью экзонная)
MGP
475
смысловая (полностью экзонная)
MEG3
476
антисмысловая
FAM115A
477
смысловая (полностью экзонная)
EGR1
478
смысловая (полностью экзонная)
SNORD116-3
479
смысловая (полностью экзонная)
АЕВР1
480
смысловая (включает интронную)
SDK1
481
смысловая (полностью экзонная)
ENC1
482
смысловая (полностью экзонная)
SNORD116-7
483
смысловая (полностью экзонная)
N/A
484
смысловая (полностью экзонная)
APOD
485
антисмысловая
N/A
486
антисмысловая
GAS1
487
смысловая (полностью экзонная)
VPS36
488
нет соответствующего транскрипта
489
смысловая (полностью экзонная)
SPHK2
490
смысловая (полностью экзонная)
SNORD116-8
491
смысловая (полностью экзонная)
MYO10
492
смысловая (полностью экзонная)
НОХС6
493
смысловая (полностью экзонная)
RNF149
494
смысловая (полностью экзонная)
BTG2
495
смысловая (включает интронную)
МАРЗК1
496
смысловая (полностью экзонная)
SNORD116-23
497
смысловая (включает интронную)
ACSL4
498
смысловая (полностью экзонная)
CYP27C1
499
смысловая (включает интронную)
COL12A1
500
смысловая (полностью экзонная)
IGFBP5
501
смысловая (полностью экзонная)
DUSP4
502
смысловая (полностью экзонная)
PFKFB3
503
смысловая (полностью экзонная)
SDC2
504
антисмысловая
FXYD6
505
смысловая (полностью экзонная)
COL5A1
506
смысловая (полностью экзонная)
MARCKS
507
смысловая (полностью экзонная)
IRS2
508
смысловая (полностью экзонная)
N/A
509
антисмысловая
FSCN1
510
смысловая (полностью экзонная)
FYN
511
смысловая (полностью экзонная)
IGFBP5
512
смысловая (полностью экзонная)
NUDT4P1
513
смысловая (полностью экзонная)
NFKBIZ
514
смысловая (полностью экзонная)
N/A
515
смысловая (полностью экзонная)
С70ГГ41
516
смысловая (полностью экзонная)
MEG3
517
смысловая (полностью экзонная)
N/A
518
смысловая (полностью экзонная)
PLEKHG1
519
смысловая (полностью экзонная)
ZNF827
520
смысловая (полностью экзонная)
ZNF175
521
смысловая (полностью экзонная)
XIST
522
смысловая (включает интронную)
GSN
523
смысловая (включает интронную)
RORA
524
смысловая (полностью экзонная)
СА13
525
антисмысловая
ТМХ4
526
смысловая (полностью экзонная)
KIT
527
смысловая (включает интронную)
WDR78
528
смысловая (полностью экзонная)
ECEL1
529
смысловая (полностью экзонная)
XIST
530
смысловая (полностью экзонная)
PROCR
531
смысловая (полностью экзонная)
C9orf167
532
смысловая (полностью экзонная)
MUC6
533
смысловая (включает интронную)
P4HA2
534
смысловая (полностью экзонная)
FAM69C
535
смысловая (полностью экзонная)
N0X4
536
смысловая (включает интронную)
N/A
537
нет соответствующего транскрипта
538
смысловая (полностью экзонная)
SMOX
539
смысловая (полностью экзонная)
KIAA0922
540
нет соответствующего транскрипта
541
смысловая (полностью экзонная)
XIST
542
смысловая (полностью экзонная)
NPAS2
543
смысловая (полностью экзонная)
NAV1
544
смысловая (включает интронную)
N/A
545
смысловая (полностью экзонная)
HLA-A
546
смысловая (полностью экзонная)
FAM46C
547
смысловая (полностью экзонная)
N/A
548
смысловая (полностью экзонная)
SLAMF7
549
смысловая (полностью экзонная)
FCER1G
550
смысловая (полностью экзонная)
C1S
551
смысловая (полностью экзонная)
NUPR1
552
антисмысловая
C1QC
553
антисмысловая
SAT1
554
смысловая (полностью экзонная)
SOD2
555
смысловая (полностью экзонная)
IRF1
556
смысловая (полностью экзонная)
SFN
557
антисмысловая
LTB
558
смысловая (полностью экзонная)
ARID5A
559
смысловая (полностью экзонная)
BST2
560
смысловая (полностью экзонная)
HLA-F
561
смысловая (полностью экзонная)
XAF1
562
смысловая (полностью экзонная)
TCOF1
563
смысловая (полностью экзонная)
RPL23AP1
564
смысловая (полностью экзонная)
IL1RN
565
смысловая (полностью экзонная)
IFIT5
566
смысловая (полностью экзонная)
B2M
567
антисмысловая
GBP1
568
смысловая (полностью экзонная)
HLA-F
569
смысловая (полностью экзонная)
DGKA
570
смысловая (полностью экзонная)
ХВР1
571
смысловая (полностью экзонная)
PLCG2
572
смысловая (полностью экзонная)
FAM46C
573
нет соответствия в геноме
574
смысловая (полностью экзонная)
TREM2
575
смысловая (полностью экзонная)
LGALS9
576
смысловая (полностью экзонная)
HLA-DPB1
577
антисмысловая
ODF3B
578
смысловая (полностью экзонная)
МХ1
579
смысловая (полностью экзонная)
STAT1
580
смысловая (полностью экзонная)
CTSB
581
смысловая (полностью экзонная)
FAM26F
582
смысловая (включает интронную)
PARP14
583
антисмысловая
SAT1
584
смысловая (полностью экзонная)
CTSS
585
нет соответствующего транскрипта
586
смысловая (полностью экзонная)
CTSB
587
смысловая (полностью экзонная)
ADAM8
588
смысловая (включает интронную)
В2М
589
смысловая (полностью экзонная)
FLVCR2
590
смысловая (полностью экзонная)
TYROBP
591
антисмысловая
SAMD9L
592
смысловая (полностью экзонная)
SAMD9L
593
смысловая (полностью экзонная)
SIGLEC1
594
смысловая (полностью экзонная)
ММР7
595
смысловая (полностью экзонная)
APOL1
596
смысловая (полностью экзонная)
CYLD
597
смысловая (полностью экзонная)
HLA-B
598
смысловая (полностью экзонная)
SAT1
599
смысловая (полностью экзонная)
C1QB
600
смысловая (полностью экзонная)
HLA-DMB
601
смысловая (полностью экзонная)
NLRC5
602
смысловая (полностью экзонная)
FAM20A
603
антисмысловая
N/A
604
смысловая (полностью экзонная)
STAT1
605
смысловая (включает интронную)
STAT1
606
смысловая (полностью экзонная)
STAT1
607
антисмысловая
N/A
608
смысловая (полностью экзонная)
DERL3
609
смысловая (полностью экзонная)
HLA-F
610
смысловая (полностью экзонная)
MAFB
611
смысловая (полностью экзонная)
CD4
612
смысловая (полностью экзонная)
HLA-A
613
смысловая (полностью экзонная)
UBE2L6
614
смысловая (полностью экзонная)
C1QC
615
смысловая (полностью экзонная)
CD 163
616
смысловая (полностью экзонная)
LRMP
617
смысловая (полностью экзонная)
C11orf17
618
смысловая (полностью экзонная)
XAF1
619
смысловая (полностью экзонная)
GLRX
620
смысловая (полностью экзонная)
IFIH1
621
смысловая (полностью экзонная)
CD44
622
смысловая (полностью экзонная)
LITAF
623
смысловая (полностью экзонная)
CCDC69
624
смысловая (полностью экзонная)
GBP5
625
смысловая (полностью экзонная)
PML
626
смысловая (полностью экзонная)
SAMD9
627
смысловая (полностью экзонная)
CBR3
628
смысловая (полностью экзонная)
RASGRP2
629
смысловая (полностью экзонная)
FCGR2A
630
смысловая (полностью экзонная)
BST2
631
смысловая (полностью экзонная)
HLA-A
В определенных типичных вариантах исполнения все или часть биомаркеров, перечисленных в табл. 1А и 1В, могут быть использованы в сигнатуре экспрессии. В определенных других типичных вариантах исполнения все или часть биомаркеров, перечисленных в группе I или группе II, могут быть использованы в сигнатуре экспрессии. Например, сигнатуры экспрессии, включающие биомаркеры, указанные в табл. 1А, 1В, группе I и группе II, могут быть получены с использованием способов, предусмотренных в данном документе, и могут включать от одного до всех маркеров, приведенных в табл. 1А, 1В, группе I, группе II, и любую и все возможные промежуточные комбинации (например, четыре выбранных маркера, 16 выбранных маркеров, 74 выбранных маркера и т.д.). В некоторых вариантах исполнения сигнатура экспрессии включает по меньшей мере 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200 или 300 или больше маркеров. В других вариантах исполнения прогностическая панель биомаркеров включает не более 5, 10, 20, 40, 60, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600 или 700 маркеров. В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество маркеров, перечисленных в табл. 1А. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в табл. 1В. В еще одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в табл. 1А и 1В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в группе I. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в таблице группы II. В еще одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает множество биомаркеров, перечисленных в группах I и II. В некоторых вариантах исполнения сигнатура экспрессии включает по меньшей мере примерно 1%, примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98% или примерно 99% маркеров, перечисленных в табл. 1А, 1В, группе I, группе II, или их комбинацию. Выбранные сигнатуры экспрессии могут быть собраны из биомаркеров, полученных с использованием описанных способов и аналогичных способов, известных спе
циалистам. В одном варианте исполнения сигнатура экспрессии содержит все 250 генов или генных продуктов, указанных в табл. 1А. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии содержит все 486 генов или генных продуктов, указанных в табл. 1В. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает SEQ ID NOs: 632-801. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает SEQ ID NOs: 802-974. Математические модели.
Нижеописанные способы могут быть использованы для получения сигнатуры экспрессии для распознавания субъектов, восприимчивых или невосприимчивых к антиангиогенной терапии, или в качестве прогностических индикаторов определенных типов рака, включая сигнатуры экспрессии, полученные из биомаркеров, раскрытых выше. В определенных других типичных вариантах исполнения сигнатуру экспрессии получают с использованием дерева решений (Hastie et al. The Elements of Statistical Learning, Springer, New York 2001), случайного леса (Breiman, 2001 Random Forests, Machine Learning 45:5), нейронной сети (Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Clarendon Press, Oxford 1995), дискрими-нантного анализа (Duda et al. Pattern Classification, 2nd ed., John Wiley, New York 2001), включая, без ограничений, линейный, диагональный линейный, квадратический и логистический дискриминантный анализ, прогностического анализа для микрочипов (РАМ, (Tibshirani et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:6567-6572)) или анализа методом формального независимого моделирования аналогий классов. (SIMCA, (Wold, 1976, Pattern Recogn. 8:127-139)).
Значения экспрессии биомаркера могут быть определены в комбинации с соответствующими скалярными весами в реальном масштабе величин с переменными значениями, которые затем комбинируют с помощью линейного или нелинейного, алгебраического, тригонометрического или корреляционного среднего в единое скалярное значение с использованием алгебраического, статистического обучающего, байесова, регрессионного или аналогичных алгоритмов, обеспечивающие вместе с математически определенной решающей функцией скалярного значения прогностическую модель, с помощью которой профили экспрессии образцов могут быть разделены на отдельные классы откликающихся или не откликающихся на, резистентных или нерезистентных к, определенному препарату, классу препаратов или схеме лечения. Такие прогностические модели, включающие совокупность входящих в них биомаркеров, разрабатывают путем определения весов и порога решения, оптимизированного по чувствительности, специфичности, отрицательных и положительных прогностических значений, отношению рисков или любым их комбинациям, в условиях кросс-валидации, обобщенной кросс-валидации или аналогичной методики составления выборки, из набора типичных профилей экспрессии для исторических образцов, взятых у пациента с известным ответом на препарат и/или резистентностью.
В одном варианте исполнения биомаркеры используются для определения взвешенной суммы их сигналов, где индивидуальные веса могут быть положительными или отрицательными. Результирующую сумму ("оценку экспрессии") сравнивают с предварительно определенной контрольной точкой или значением. Сравнение с контрольной точкой или значением может быть использовано для диагностики или прогнозирования клинического состояния или результата.
Как описано выше, рядовому специалисту в данной области техники будет понятно, что биомаркеры, включенные в классификатор, приведенный в табл. 1А, 1В, группе I и группе II, будут иметь неравные веса в классификаторе для восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту. Поэтому, хотя всего одна последовательность может быть использована для диагностики или прогнозирования результата, такого как восприимчивость к терапевтическому агенту, специфичность и чувствительность или точность диагноза или прогноза могут увеличиваться при использовании большего количества последовательностей.
В используемом в данном документе значении термин "вес" относится к относительной важности элемента в статистических расчетах. Вес каждого биомаркера в классификаторе генной экспрессии может быть определен для набора данных образцов, взятых у пациента, с использованием аналитических способов, известных специалистам.
В определенных типичных вариантах исполнения сигнатуру экспрессии определяют с помощью решающей функции. Решающая функция представляет собой набор взвешенных значений экспрессии, полученных с использованием линейного классификатора. Все линейные классификаторы определяют решающую функцию с использованием следующего уравнения:
f(x) = w'*x + b = X Wj*Xj +b (1)
Все измеренные значения, такие как интенсивности генной экспрессия на микрочипе xi, для определенного образца собирают в вектор х. Каждую интенсивность затем умножают на соответствующий вес wi для получения значения решающей функции f(x) после прибавления члена смещения b. При определении решающей функции линейный классификатор будет дополнительно определять пороговое значение, которое разделяет пространство данных генной экспрессии space на две непересекающиеся половины. Типичные линейные классификаторы включают, без ограничений, частные наименьшие квадраты (PLS), (Nguyen et al., Bioinformatics 18 (2002) 39-50), методы опорных векторов (SVM) (Scholkopf et al., Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002) и сокращающий (shrinkage) дискриминантный анализ
(SDA) (Ahdesmaki et al., Annals of applied statistics 4, 503-519 (2010)). В одном типичном варианте исполнения линейный классификатор представляет собой линейный PLS-классификатор.
Решающую функцию эмпирически получают на основе большого набора обучающих образцов, например, от пациентов, демонстрирующих восприимчивость или резистентность к терапевтическому агенту. Пороговое значение делит группу пациентов на основании разных характеристик, таких как, без ограничений, восприимчивость/невосприимчивость к лечению. Интерпретацию этой величины, т.е. отсекающего порога восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту, получают на этапе разработки ("обучения") для набора пациентов с известным результатом. Соответствующие веса и отсекающий порог восприимчивости/резистентности для оценки решения заданы a priori на основании обучающих данных способами, известными квалифицированным специалистам. В одном типичном варианте исполнения для определения веса используется дискриминантный анализ методом частных наименьших квадратов (PLS-DA). (L. Stable, S. Wold, J. Chem. 1 (1987) 185-196; D. V. Nguyen, D.M. Rocke, Bioin-formatics 18 (2002) 39-50).
По существу, это означает, что пространство данных, т.е. набор всех возможных комбинаций значений экспрессии биомаркера, разделен на две взаимно исключающие части, соответствующие разным клиническим классификациям или прогнозам, например одному, соответствующему восприимчивости к терапевтическому агенту, и другому - невосприимчивости. В контексте общего классификатора относительная сверхэкспрессия определенного биомаркера может или увеличивать оценку решения (положительный вес), или уменьшать ее (отрицательный вес) и, таким образом, вносить свой вклад в общее решение, например восприимчивость или резистентность к терапевтическому агенту.
В определенных типичных вариантах исполнения изобретения данные нелинейно трансформируют перед применением взвешенной суммы, как описано выше. Эта нелинейная трансформация может включать увеличение размерности данных. Нелинейная трансформация и взвешенное суммирование также могут быть проведены имплицитно, например, путем использования кернфункции (Scholkopf et al. Learning with Kernels, MIT Press, Cambridge 2002).
В определенных типичных вариантах исполнения данные обучающего набора пациента получают путем выделения РНК из соответствующего набора образцов раковых тканей и определения значений экспрессии гибридизацией выделенной РНК с микрочипом. В определенных типичных вариантах исполнения микрочип, используемый для получения сигнатуры экспрессии, представляет собой матрицу для транскриптомного анализа. В используемом в данном документе значении "матрица для транскриптом-ного анализа" относится к микрочипу, содержащему наборы зондов, предназначенных для гибридизации с последовательностями, верифицированными как экспрессируемые в больной ткани, представляющей интерес. С учетом альтернативного сплайсинга и переменного процессинга поли-А последовательности тканей и биологических контекстов возможно, что зонды, предназначенные для детектирования одной и той же генной последовательности, полученной из другого источника ткани или биологического контекста, не будут эффективно связываться с транскриптами, экспрессируемыми в больной ткани, представляющей интерес, приводя к потере потенциально значимой биологической информации. Соответственно, полезно проверять, какие последовательности экспрессируются в больной ткани, представляющей интерес, перед разработкой набора зондов для микрочипа. Верификация экспрессируемых последовательностей в контексте определенной болезни может быть осуществлена, например, путем выделения и секве-нирования общей РНК из набора образцов больных тканей и перекрестного сравнения выделенных последовательностей с известными базами данных последовательностей нуклеиновой кислоты для подтверждения того, что набор зондов на матрице для транскриптомного анализа рассчитан на последовательности, действительно экспрессируемые в больной ткани, представляющей интерес. Способы изготовления матриц для транскриптомного анализа описаны в публикации патентной заявки США № 2006/0134663, которая включена в описание в качестве ссылки. В определенных типичных вариантах исполнения набор зондов матрицы для транскриптомного анализа рассчитан на связывание с участками в пределах 300 нуклеотидов на 3'-конце транскрипта. Способы проектирования матриц для транскрип-томного анализа с наборами зондов, связывающимися с участками в пределах 300 нуклеотидов на 3'-конце транскриптов-мишеней, раскрыты в публикации патентной заявки США № 2009/0082218, которая включена в описание в качестве ссылки. В определенных типичных вариантах исполнения микрочип, используемый для получения профилей генной экспрессии по настоящему изобретению, представляет собой микрочип для дифференциального анализа рака яичников Almac DSA(tm) (Almac Group, Craigavon, United Kingdom).
Оптимальный линейный классификатор может быть выбран путем оценки характеристик линейного классификатора с использованием таких методов диагностики, как "площадь под кривой" (ППК). ППК относится к площади под характеристической кривой обнаружения (ROC-кривая), оба эти понятия хорошо известны специалистам. Измерения ППК пригодны для сравнения точности классификатора в полном диапазоне данных. Линейные классификаторы с более высокими значениями ППК являются более пригодными для точной классификации неизвестных между двумя группами, представляющими интерес (например, образцы рака яичников и нормальные или контрольные образцы). ROC-кривые являются пригодными для графического представления определенного признака (например, любых биомаркеров,
описанных здесь, и/или любого элемента дополнительной биомедицинской информации) при распознавании двух популяций (например, индивидуумов, восприимчивых и невосприимчивых к терапевтическому агенту). Типично, данные для признака по популяции в целом (например, истории болезни и контроль) сортируют в восходящем порядке на основании значения отдельного признака. Затем для каждого значения данного признака рассчитывают относительные показатели числа истинно положительных и ложноположительных заключений. Относительное число истинно положительных заключений определяют путем подсчета числа случаев болезни со значением показателя выше величины этого признака и затем деления на общее число случаев. Относительное число ложноположительных заключений определяют путем подсчета числа контрольных субъектов со значением показателя выше величины этого признака и затем деления на общее число контрольных субъектов. Хотя такое определение относится к сценариям, в которых признак имеет значение показателя, повышенное по сравнению с контролем, это определение также применимо к сценариям, в которых признак имеет значение показателя, пониженное сравнению с контролем (в таком сценарии будут подсчитываться образцы, имеющие значение показателя ниже величины данного признака). ROC-кривые могут быть построены для отдельного признака, а также для других отдельных результатов, например, комбинация двух или больше признаков может быть математически комбинирована (например, сложена, вычтена, перемножена и т.д.) для получения единого суммарного значения, и такое единое суммарное значение может быть графически представлено в виде ROC-кривой. Дополнительно, любая комбинация множества признаков, где комбинация имеет единое результирующее значение, может быть графически представлена в виде ROC-кривой. Такие комбинации признаков могут представлять собой тест. ROC-кривая является графиком зависимости относительного числа истинно положительных заключений (чувствительность) теста от относительного числа ложнопо-ложительных заключений (1 - специфичность) теста.
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии касается 25 биомаркеров, описанных в табл. 2А, с соответствующими рангами и весами, указанными в таблице, или альтернативными значениями рангов и весов, в зависимости, например, от характеристик болезни. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии касается 45 биомаркеров, описанных в табл. 2В, с соответствующими рангами и весами, указанными в таблице, или альтернативными значениями рангов и весов, в зависимости, например, от характеристик болезни. Табл. 2А и 2В ранжируют биомаркеры в порядке убывания веса в классификаторе, определенном как ранг среднего веса в составной функции решающей оценки, определенной с кросс-валидацией.
COL10A1
0,0197
RAB31
0,0180
ANGPTL2
0,0166
PLAU
0,0166
COL8A1
0,0164
MIR1245
0,0153
POLD2
0,0146
NKD2
0,0145
FZD1
0,0143
COPZ2
0,0139
ITGA5
0,0136
VGLL3
0,0125
INHBA
-0,0118
MMP14
0,0110
VCAN
0,0100
THBS2
-0,0087
RUNX2
0,0083
TIMP3
0,0081
SFRP2
-0,0079
COL1A2
0,0078
COL5A2
-0,0072
SERPINF1
0,0068
KIF26B
-0,0052
TNFAIP6
0,0050
MMP2
0,0040
FN1
0,0031
ALPK2
0,0024
CTSK
0,0015
LOXL1
-0,0014
FAP
0,0000
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает один или несколько биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из CCDC80, INHBA, THBS2, SFRP2, ММР2, PLAU, FAP,
FN1, COL8A1, RAB31, FAM38B, VCAN, GJB2, ITGA5, CRISPLD2, С17, f91, BGN, TIMP3, ALPK2, LUM, NKD2, LOX, MIR1245, LOXL1 и CXCL12.
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, CCDC80, INHBA, THBS2 и SFRP2 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или
21. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем
проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомарке-
ров, каждый из которых соответствует биомаркерам CCDC80, INHBA, THBS2 и SFRP2 и одному по
меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N
равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21. В дополнительном аспекте тера-
певтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического
образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует
биомаркеру CCDC80 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из пе-
речня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21,
22, 23 или 24. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозиру-
ется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей
биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру INHBA и одному по меньшей мере из N до-
полнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23 или 24. В дополнительном аспекте терапевтическая
восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от
индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру
THBS2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23 или 24. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру SFRP2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23 или 24.
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает один или несколько биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из ТМЕМ200А, GJB2, ММР13, GFPT2, POSTN, BICC1, CDH11, MRVI1, РМР22, COL11A1, IGFL2, LUM, NTM, BGN, COL3A1, COL10A1, RAB31, ANGPTL2, PLAU, COL8A1, MIR1245, POLD2, NKD2, FZD1, COPZ2, ITGA5, VGLL3, INHBA, MMP14, VCAN, THBS2, RUNX2, TIMP3, SFRP2, COL1A2, COL5A2, SERPINF1, KIF26B, TNFAIP6, ММР2, FN1, ALPK2, CTSK, LOXL1 и FAP.
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, ТМЕМ200А, GJB2, ММР13 и GFPT2 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров, выбранных из
перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40 или 41. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркерам ТМЕМ200А, GJB2, ММР13 и GFPT2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40 или 41. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ТМЕМ200А и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39,
40, 41, 42, 43 или 44. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру GJB2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2а, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ММР13 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру GFPT2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров в табл. 2В, где N равно 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44.
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает один или несколько биомаркеров, выбранных из группы, состоящей из ALPK2, BGN, COL8A1, FAP, FN1, GJB2, INHBA, ITGA5, LOXL1, LUM, MIR1245, ММР2, NKD2, PLAU, RAB31, SFRP2, THBS2, TIMP3 и VCAN.
В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, ALPK2, BGN, COL8A1, FAP и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров FN1, GJB2, INHBA, ITGA5, LOXL1, LUM, MIR1245, ММР2, NKD2, PLAU, RAB31, SFRP2, THBS2, TIMP3 и VCAN, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркерам ALPK2, BGN, COL8A1 и FAP и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров FN1, GJB2, INHBA, ITGA5, LOXL1, LUM, MIR1245, ММР2, NKD2, PLAU, RAB31, SFRP2, THBS2, TIMP3 и VCAN, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру ALPK2 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров BGN, COL8A1, FAP, FN1, GJB2, INHBA, ITGA5, LOXL1, LUM, MIR1245, MMP2, NKD2, PLAU, RAB31, SFRP2, THBS2, TIMP3 и VCAN где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образ- 41
ца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру BGN и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров ALPK2, COL8A1, FAP, FN1, GJB2, INHBA, ITGA5, LOXL1, LUM, MIR1245, ММР2, NKD2, PLAU, RAB31, SFRP2, THBS2, TIMP3 и VCAN, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру COL8A1 и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров ALPK2, BGN, FAP, FN1, GJB2, INHBA, ITGA5, LOXL1, LUM, MIR1245, ММР2, NKD2, PLAU, RAB31, SFRP2, THBS2, TIMP3 и VCAN, где N равно 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном аспекте терапевтическая восприимчивость у индивидуума прогнозируется путем проведения анализа биологического образца от индивидуума и детектирования показателей биомаркеров, каждый из которых соответствует биомаркеру FAP и одному по меньшей мере из N дополнительных биомаркеров, выбранных из перечня биомаркеров ALPK2, BGN, COL8A1, FN1, GJB2, INHBA, ITGA5, LOXL1, LUM, MIR1245, ММР2, NKD2, PLAU, RAB31, SFRP2, THBS2, TIMP3 и VCAN, где N равно 2, 3,4, 5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.
В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает набор биомаркеров с понижающей регуляцией. В одном типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, GJB2, INHBA, THBS2, SFRP2, PLAU и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, GJB2 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает INHBA и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает THBS2 и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает, по меньшей мере, SFRP2, где N равно 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает PLAU и по меньшей мере N дополнительных биомаркеров из табл. 1А или 1В, где N равно 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70. В другом типичном варианте исполнения сигнатура экспрессии включает GJB2, INHBA, THBS2, SFRP2, PLAU и по меньшей мере примерно 1%, примерно 5%, примерно 10%, примерно 20%, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99% биомаркеров, перечисленных в табл. 1А, 1В или их комбинацию.
Классификация новых опытных образцов с использованием сигнатуры экспрессии.
Для классификации новых опытных образцов с использованием сигнатуры экспрессии, таких как описанные выше, измеряют относительные уровни экспрессии биомаркеров в раковой ткани для получения профиля экспрессии исследуемого образца. В определенных типичных вариантах исполнения профиль экспрессии исследуемого образца объединяется в виде составной решающей оценки ("оценка экспрессии") и сравнивается с порогом оценки, которую математически определяют по обучающему набору данных пациентов. Порог оценки разделяет группу пациентов на основании разных характеристик, таких как, без ограничений, восприимчивость/невосприимчивость к лечению. Обучающий набор данных пациентов предпочтительно получают из образцов раковой ткани, охарактеризованных по прогнозу, вероятности рецидива, долгосрочной выживаемости, клиническому результату, отклику на лечение, диагнозу, классификации рака или персонализованному геномному профилю. Профили экспрессии и соответствующие решающие оценки образцов, взятых у пациента, могут быть скоррелированы с характеристиками образцов пациентов в обучающем наборе, находящихся по ту же сторону от математически определенного порога решающей оценки. Порог скалярного результата линейного классификатора оптимизируют для максимизации суммы чувствительности и специфичности при кросс-валидации в наборе обучающих данных.
Общие данные об экспрессии для данного образца нормируют с использованием способов, известных квалифицированным специалистам, для внесения поправок на различия в количествах исходного материала, разные эффективности экстракции и реакции амплификации и т.д.
В одном варианте исполнения профиль экспрессии биомаркера образца ткани пациента оценивается с помощью линейного классификатора. В используемом в данном документе значении, линейный классификатор относится к взвешенной сумме интенсивностей биомаркеров индивидуума в составной решающей оценке ("решающая функция"). Решающую оценку затем сравнивают с предварительно определенным отсекающим порогом оценки, соответствующим определенной заданной точке по показателям чувствительности и специфичности, которая указывает, находится ли образец выше порога оценки (положительная решающая функция) или ниже (отрицательная решающая функция).
Использование линейного классификатора для нормированных данных для диагностического или прогностического заключения (например, о восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту), по существу, означает разделение пространства данных, т.е. всех возможных комбинаций значений экспрессии для всех генов, входящих в классификатор, на две непересекающиеся части с помощью разделяющей гиперплоскости. Такое деление эмпирически осуществляют на большом наборе обучающих примеров, например, от пациентов, демонстрирующих восприимчивость или резистентность к терапевтическому агенту. Без потери всеобщего характера можно предположить определенный заданный набор значений всех биомаркеров, кроме одного, который будет автоматически определять пороговое значение для этого оставшегося биомаркера, при котором решение будет изменяться, например, от восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту. Значения экспрессии выше этого динамического порога будут тогда указывать или на резистентность (для биомаркера с отрицательным весом) или на восприимчивость (для биомаркера с положительным весом) к терапевтическому агенту. Точное значение этого порога зависит от фактически измеренного профиля экспрессии всех других биомаркеров в классификаторе, но общий признак определенных биомаркеров остается неизменным, т.е. высокие значения или "относительная сверхэкспрессия" всегда являются вкладом или в восприимчивость (гены с положительным весом), или в резистентность (гены с отрицательным весом). Поэтому в контексте общего классификатора генной экспрессии относительная экспрессия может указывать, является ли повышающая или понижающая регуляция определенного биомаркера индикатором восприимчивости или резистентности к терапевтическому агенту.
Существует ряд пригодных способов измерения профилей экспрессии опытных образцов в зависимости от типа анализируемого биомаркера. Измерения мРНК в биологическом образце могут быть использованы взамен детектирования уровня соответствующего белка в биологическом образце. Таким образом, любые биомаркеры или панели биомаркеров, описанные здесь, также могут быть детектированы путем детектирования соответствующей РНК. Способы определения профилей генной экспрессии включают, без ограничений, использование микрочипов, ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCT), количественной ПЦР, NGS, нозерн-блоттинга, SAGE, масс-спектрометрии.
Уровни экспрессии мРНК измеряют методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР с последующей количественной ПЦР). ОТ-ПЦР используется для получения кДНК из мРНК. кДНК может быть использована в анализе методом количественной ПЦР для получения флуоресценции в процессе амплификации ДНК. Путем сравнения со стандартной кривой количественная ПЦР может дать абсолютное значение результата измерений, такое как число копий мРНК на клетку. Нозерн-блоттинг, микрочипы, анализы Invader и ОТ-ПЦР в комбинации с капиллярным электрофорезом, все, используются для измерения уровней экспрессии мРНК в образце. См. Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004.
Молекулы микроРНК представляют собой малые РНК, которые являются некодирующими, но могут регулировать генную экспрессию. Любые способы, пригодные для измерения уровней экспрессии мРНК, также могут быть использованы для соответствующих микроРНК. В последнее время многие лаборатории исследовали использование микроРНК в качестве биомаркеров болезней. Многие болезни сопровождаются широко распространенным регулированием транскрипции, и потому не удивительно, что микроРНК могут найти применение в качестве биомаркеров. Связь между концентрациями мик-роРНК и болезнью часто еще менее понятна, чем связи между уровнями белков и болезнью, но ценность биомаркеров на основе микроРНК может быть существенной. Конечно, как и для любых РНК, дифференциально экспрессируемых при болезни, проблемы на пути разработки in vitro диагностического продукта будут включать требование, чтобы микроРНК выживали в больной клетке и легко экстрагировались для анализа, или чтобы микроРНК выделялись в кровь или другие матрицы, где они должны выживать в течение достаточно длительного времени для проведения измерений. К белковым биомаркерам выдвигаются аналогичные требования, хотя многие потенциальные белковые биомаркеры секретируют-ся целенаправленно в области патологии и функционируют, во время болезни, по паракринному механизму. Многие потенциальные белковые биомаркеры рассчитаны на то, что они будут функционировать вне клеток, в которых такие белки синтезируются.
Генную экспрессию также можно оценить с использованием масс-спектрометрических способов. Различные конфигурации масс-спектрометров могут быть использованы для детектирования значений
биомаркеров. Несколько типов масс-спектрометров являются доступными или могут быть произведены с различными конфигурациями. В общем, масс-спектрометр состоит из следующих основных компонентов: устройство ввода образца, ионный источник, анализатор массы, детектор, вакуумная система, система управления инструментом и система сбора данных. Различия в устройстве ввода образца, ионном источнике и анализаторе массы в общем определяют тип инструмента и его возможности. Например, устройство ввода может быть источником в виде капиллярной колонки для жидкостной хроматографии или может представлять собой непосредственно пробу или столик, как используется в методах матрич-но-активируемой лазерной десорбции. Обычными ионными источниками являются, например, электрораспыление, включая нанораспыление и микрораспыление, или матрично-активируемая лазерная десорбция. Обычные анализаторы массы включают квадрупольный масс-фильтр, анализатор массы типа ионной ловушки и времяпролетный анализатор массы. Дополнительные масс-спектрометрические способы хорошо известны специалистам (см. Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000)).
Белковые биомаркеры и значения биомаркеров могут детектироваться и измеряться любыми из следующих методов: масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, времяпролетная масс-спектрометрия с ионизацией матрично-активируемой лазерной десорбцией (MALDI-TOF-MS), времяпролетная масс-спектрометрия с поверхностно усиленной лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF-MS), десорбция/ионизация на кремнии (DIOS), масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS), квадрупольная времяпролетная (Q-TOF), тандемная времяпролетная (TOF/TOF) технология, называемая ultraflex III TOF/TOF, масс-спектрометрия с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS).sup.N, масс-спектрометрия с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), APPI-MS/MS и APPI-(MS).sup.N, квадрупольная масс-спектрометрия, масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (FTMS), количественная масс-спектрометрия и масс-спектрометрия с ионной ловушкой.
Стратегии приготовления образцов используются для мечения и обогащения образцов перед масс-спектроскопической характеризацией белковых биомаркеров и определения значений биомаркеров. Способы мечения включают, без ограничений, изобарную метку для относительной и абсолютной квантифи-кации (iTRAQ) и мечение стабильными изотопами аминокислот в клеточной культуре (SILAC). Захватывающие реагенты, используемые для селективного обогащения образцов для белков-кандидатов биомаркеров перед масс-спектроскопическим анализом, включают, без ограничений, аптамеры, антитела, нук-леиново-кислотные зонды, химеры, малые молекулы, фрагмент F(ab')2, фрагмент одноцепочечного антитела, фрагмент Fv, одноцепочечный фрагмент Fv, нуклеиновую кислоту, лектин, лигандсвязывающий рецептор, аффитела (affybodies), нанотела (nanobodies), анкирины, доменные антитела, альтернативные структуры антител (например, диатела и т.д.), импринтированные полимеры, авимеры, пептидомимети-ки, пептоиды, пептидные нуклеиновые кислоты, треозо-нуклеиновую кислоту, рецептор гормона, рецептор цитокина и синтетические рецепторы и их модификации и фрагменты.
Вышеупомянутые анализы позволяют детектировать значения биомаркера, пригодные для использования в способах прогнозирования восприимчивости к терапевтическому агенту для лечения рака, где способы включают детектирование, в биологическом образце от индивидуума, по меньшей мере N значений биомаркеров, каждое из которых соответствует биомаркеру, выбранному из группы, состоящей из биомаркеров, представленных в табл. 1А, 1В, 2А, 2В или группах I и II, где классификация с использованием значений биомаркеров, как детально описано ниже, указывает, будет ли индивидуум восприимчивым к терапевтическому агенту. Хотя некоторые из описанных прогностических биомаркеров являются пригодными сами по себе для прогнозирования восприимчивости к терапевтическому агенту, здесь также описаны способы группирования нескольких подмножеств биомаркеров, каждый из которых является пригодным, в панели из двух или больше биомаркеров. Таким образом, различные варианты исполнения данного изобретения обеспечивают комбинации, включающие N биомаркеров, где N составляет по меньшей мере три биомаркера. Следует понимать, что N может быть выбрано из любых чисел в любых из вышеописанных диапазонах значений, а также аналогичных диапазонах значений более высокого порядка. В соответствии с любым из описанных способов значения биомаркеров могут детектироваться и классифицироваться индивидуально или они могут детектироваться и классифицироваться коллективно, например, в формате мультиплексного анализа.
b) Способы на основе микрочипов.
В одном варианте исполнения настоящее изобретение использует "олигонуклеотидные матрицы" (также называемые "микрочипами"). Микрочипы могут быть использованы для анализа экспрессии биомаркеров в клетке и, в частности, для измерений экспрессии биомаркеров раковых тканей.
В одном варианте исполнения матрицы биомаркеров получают путем гибридизации детектируемо меченых полинуклеотидов, представляющих транскрипты мРНК, присутствующих в клетке (например, флуоресцентно меченые кДНК, синтезированные из полной клеточной мРНК или меченой кРНК) на микрочипе. Микрочип представляет собой поверхность с упорядоченной матрицей сайтов связывания (например, гибридизации) для продуктов многих генов из генома клетки или организма, предпочтительно большей части или почти всех генов. Микрочипы могут быть изготовлены с использованием ряда
способов, известных специалистам. Независимо от способа изготовления, микрочипы имеют некоторые общие характеристики. Матрицы являются воспроизводимыми, что позволяет получать множество копий данной матрицы и легко сравнивать их друг с другом. Предпочтительно микрочипы являются маленькими, обычно менее 5 см2, и изготовлены из материалов, стабильных в условиях связывания (например, гибридизации нуклеиновой кислоты). Данный сайт связывания или уникальный набор сайтов связывания на микрочипе будет специфически связывать продукт отдельного гена клетки. В конкретном варианте исполнения используются позиционно адресуемые матрицы, содержащие закрепленные нуклеиновые кислоты с известной последовательностью в каждом положении.
Следует понимать, что, когда получают кДНК, комплементарную к рНК клетки и гибридизуют на микрочипе в пригодных условиях гибридизации, уровень гибридизации в сайте матрицы, соответствующем любому конкретному гену, будет отражать распространенность в клетке мРНК, транскрибируемой с данного гена/биомаркера. Например, при гибридизации с микрочипом детектируемо меченой (например, с помощью флуорофора) кДНК или кРНК, комплементарных к полной клеточной мРНК, участок матрицы, соответствующий гену (т.е. способный специфически связываться с продуктом гена), который не транскрибируется в клетке, будет иметь слабый сигнал или его отсутствие (например, флуоресцентный сигнал), а ген, кодированная мРНК которого имеет широкое распространение, будет иметь относительно сильный сигнал. Условия гибридизации нуклеиновой кислоты и промывки выбирают так, чтобы зонд "специфически связывал" или "специфически гибридизовался" со специфическим участком матрицы, т.е. зонд гибридизуется, образует дуплексы или связывается с участком матрицы последовательностей, несущим комплементарную последовательность нуклеиновой кислоты, но не гибридизуется с участком с некомплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты. В используемом в данном документе значении одна полинуклеотидная последовательность считается комплементарной к другой, когда, если более короткий из полинуклеотидов имеет длину менее или равную 25 основаниям, не наблюдается ошибок спаривания с использованием стандартных правил спаривания последовательностей или, если более короткий из полинуклеотидов имеет длину более 25 оснований, количество ошибок спаривания не превышает 5%.
Предпочтительно полинуклеотиды являются полностью комплементарными (отсутствие ошибок спаривания). Можно продемонстрировать, что условия специфической гибридизации приводят к специфической гибридизации путем проведения анализа гибридизации с отрицательным контролем с использованием обычных методик эксперимента.
Оптимальные условия гибридизации будут зависеть от длины (например, олигомер vs. полинуклео-тида длиной более 200 оснований) и типа (например, РНК, ДНК, PNA (пептидо-нуклеиновая кислота)) меченого зонда и иммобилизованного полинуклеотида или олигонуклеотида. Общие параметры для специфических (т.е. жестких) условий гибридизации нуклеиновых кислот описаны в Sambrook et al., supra и в Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing и Wiley-Interscience, NY (1987), которые целиком включены сюда в любых целях. В тех случаях, когда используются микрочипы на основе кДНК, типичными условиями гибридизации являются гибридизация в 5xSSC плюс 0,2% ДСН (SDS) при 65°C в течение 4 ч с последующими промываниями при 25°C в промывочном буфере низкой жесткости (1xSSC плюс 0,2% ДСН), а затем 10 мин при 25°C в промывочном буфере высокой жесткости (0,1SSC плюс 0,2% ДСН) (см. Shena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, p. 10614 (1996)). Пригодные условия гибридизации также приведены, например, в Tijessen, "Hybridization With Nucleic Acid Probes", Elsevier Science Publishers B.V. (1993) и Kricka, "Nonisotopic DNA Probe Techniques", Academic Press, San
Diego, Calif. (1992).
с) Способы иммуноанализа.
Способы иммуноанализа основаны на реакции антитела с его соответствующей мишенью или ана-литом и могут детектировать аналит в образце в зависимости от формата конкретного анализа. Для улучшения специфичности и чувствительности метода анализа, основанного на иммунореактивности, часто используют моноклональные антитела вследствие того, что они специфически распознают эпитоп. Поликлональные антитела также успешно использовались в различных иммуноанализах благодаря их повышенной аффинности к мишени по сравнению с моноклональными антителами. Были разработаны иммуноанализы для использования с широким спектром матриц биологических образцов. Форматы им-муноанализов были разработаны таким образом, чтобы они обеспечивали качественные, полуколичественные и количественные результаты.
Количественные результаты могут быть получены путем использования стандартной кривой, получаемой для известных концентраций конкретного аналита, который должен детектироваться. Строят график отклика или сигнала для неизвестного образца на стандартной кривой и определяют количество или значение величины, соответствующие мишени в неизвестном образце.
Были разработаны многочисленные форматы иммуноанализа. ELISA или EIA могут быть количественными при детектировании аналита/биомаркера. Этот метод основан на присоединении метки к анали-ту или антителу, и компонент метки включает, прямо или косвенно, фермент. Тесты ELISA могут быть разработаны в форматах прямого, непрямого, конкурентного или сэндвич-метода детектирования анали
та. Другие способы используют метки, такие как, например, радиоизотопы (125I) или флуоресценцию. Дополнительные методики включают, например, агглютинацию, нефелометрию, турбидиметрию, вес-терн-блоттинг, иммунопреципитацию, иммуноцитохимию, иммуногистохимию, проточную цитометрию, анализ Luminex и другие (см. ImmunoAssay: A Practical Guide, ред. Brian Law, опубликована Taylor & Francis, Ltd., издание 2005 г.).
Типичные форматы анализов включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радио-иммуноанализ, иммуноанализы с использованием флуоресценции, хемолюминесценции и резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) или FRET с временным разрешением (TR-FRET). Примеры процедур детектирования биомаркеров включают иммунопреципитацию биомаркера с последующими количественными способами, позволяющими дифференцировать размеры и уровни пептидов, такими как электрофорез на геле, капиллярный электрофорез, планарная электрохроматография и т.п.
Способы детектирования и/или количественного определения детектируемой метки или материала, генерирующего сигнал, зависят от природы метки. Продукты реакций, катализируемых соответствующими ферментами (в тех случаях, когда детектируемая метка представляет собой фермент; см. выше) могут быть, без ограничений, флуоресцентными, люминесцентными или радиоактивными или они могут поглощать видимый или ультрафиолетовый свет. Примеры детекторов, пригодных для детектирования таких детектируемых меток, включают, без ограничений, рентгеновскую пленку, счетчики радиоактивности, сцинтилляционные счетчики, спектрофотометры, колориметры, флуорометры, люминометры и денситометры.
Любые способы детектирования могут быть осуществлены в любом формате, позволяющем использовать любой пригодный способ приготовления, процессинг и анализ реакций. Это могут быть, например, многолуночные аналитические планшеты (например, 96-луночные или 384-луночные) или способы, использующие любую пригодную матрицу или микрочип. Маточные растворы для различных агентов могут быть приготовлены вручную или роботизированными методами, и все последующие операции пипетирования, разбавления, смешения, распределения, промывания, инкубирования, считывания образцов, сбора данных и анализа могут выполняться роботизированно с использованием коммерчески доступных прикладных программ для анализа, робототехнических устройств и детектирующих инструментов, способных детектировать детектируемую метку.
Наборы.
Реагенты, инструменты, и/или инструкции по проведению способов, описанных здесь, могут быть представлены в виде набора. Например, набор может содержать реагенты, инструменты и инструкции по определению пригодной терапии для ракового пациента. Такой набор может включать реагенты для отбора образцов ткани у пациента, такого как путем биопсии, и реагенты для обработки тканей. Набор может также включать один или несколько реагентов для проведения анализа экспрессии гена или генного продукта, таких как реагенты для проведения ОТ-ПЦР, количественной ПЦР, нозерн-блоттинга, проте-омного анализа или иммуногистохимии для определения уровней экспрессии маркеров гена или генного продукта в образце пациента. Например, такие наборы могут включать праймеры для проведения ОТ-ПЦР, зонды для проведения анализов методом нозерн-блоттинга, и/или антитела для проведения протеомного анализа, такого как вестерн-блоттинг, иммуногистохимия и анализы ELISA. Также могут быть включены пригодные буферы для анализов. Также могут быть включены детектирующие реагенты, необходимые для любого из этих анализов. Пригодные реагенты и способы дополнительно детально описаны ниже.
Наборы, описанные здесь, могут также включать лист-вкладыш с инструкциями, описывающими, как проводить анализы для измерения экспрессии генов или генных продуктов. Листок с инструкциями также может включать инструкции о том, каким образом определять референсную когорту, включая методы определения уровней экспрессии маркеров гена или генного продукта в референсной когорте и сбора данных об экспрессии для установления эталона для сравнения с обследуемым пациентом. Листок с инструкциями также может включать инструкции по оценке экспрессии генов или генных продуктов у обследуемого пациента и для сравнения уровня экспрессии с экспрессией в референсной когорте, для последующего определения пригодной химиотерапии для обследуемого пациента. Способы определения пригодной химиотерапии описаны выше и могут быть детально описаны в листке с инструкциями.
Информационные материалы, включенные в наборы, могут быть описательными, инструктивными, маркетинговыми или другими материалами, которые относятся к способам, описанным здесь, и/или к использованию реагентов для способов, описанных здесь. Например, информационные материалы в наборе могут содержать контактную информацию, например физический адрес, адрес электронной почты, веб-сайт или телефонный номер, причем пользователь набора может получить значимую информация о проведении анализа генной экспрессии и интерпретации результатов, особенно касающихся вероятности достижения у человека положительного ответа на конкретный терапевтический агент.
Наборы, описанные здесь, могут также содержать прикладные программы, необходимые для достижения вывода о вероятности положительного ответа у пациента на конкретный терапевтический агент по экспрессии маркера генного продукта.
Терапевтические агенты.
Как описано выше, способы, описанные здесь, обеспечивают классификацию пациентов на откликающихся или не откликающихся на терапевтический агент, нацеленный на ангиогенные процессы и передачу сигналов в опухоли. Некоторые такие современные терапии, используемые для лечения рака, включают, без ограничений, следующие агенты: терапевтический агент, нацеленный на путь VEGF, включая многоцелевые ингибиторы пути (VEGF/PDGF/FGF/EGFT/FLT-3/c-KIT), ингибиторы пути ан-гиопоэтина-TIE2, эндогенные ангиогенные ингибиторы, иммуномодулирующие агенты. Специфические ингибиторы VEGF включают, без ограничений, бевацизумаб (авастин), афиберцепт (ловушка VEGF), IMC-1121В (рамуцирумаб). Многоцелевые ингибиторы пути включают, без ограничений, иматиниб (гливек), сорафениб (нексавар), гефитиниб (иресса), сунитиниб (сутент), эрлотиниб, тивозиниб, цедира-ниб (рецентин), пазопаниб (вотриент), BIBF 1120 (варгатеф), довитиниб, семаксаниб (суген), акситиниб (AG013736), вандетаниб (зактима), нилотиниб (тасигна), дасатиниб (спрайсел), ваталаниб, мотесаниб, ABT-869, TKI-258. Ингибиторы пути ангиопоэтина-TIE2 включают, без ограничений, AMG-386, PF-4856884 CVX-060, СЕР-11981, СЕ-245677, MEDI-3617, CVX-241, трастузумаб (герцептин). Эндогенные ангиогенные ингибиторы включают, без ограничений, тромбоспондин, эндостатин, тумстатин, канста-тин, аррестин, ангиостатин, вазостатин, интерферон-альфа. Иммуномодулирующие агенты включают, без ограничений, талидомид и леналидомид.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано приведенными далее примерами, которые не должны рассматриваться как каким-либо образом накладывающие ограничения на его объем. Наоборот, следует четко понимать, что могут быть предусмотрены различные другие варианты его исполнения модификации и эквиваленты, которые, после прочтения приведенного тут описания, могут быть предложены квалифицированными специалистами без выхода за пределы сущности настоящего изобретения и/или объема приложенной формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Процессинг тканей, иерархическая кластеризация, идентификация субтипа и разработка классификатора.
Материал опухоли.
Типичные сигнатуры экспрессии были идентифицированы путем проведения анализа генной экспрессии для когорты полученных путем макродиссекции FFPE-образцов (фиксированных формалином залитых в парафин) тканей эпителиальной серозной опухоли яичников, полученных от NHS Lothian и Университета Эдинбурга (University of Edinburgh).
Протокол гистологической классификации эпителиального рака яичников для определения серозной, эндометриоидной, прозрачно-клеточной и мукоидной гистологий был недавно обновлен. Одним из последствий этого является то, что многие опухоли, которые ранее классифицировались бы как эндомет-риоидные, теперь классифицируются как серозные. (McCluggage, W.G. "Morphological subtypes of ovarian carcinoma: a review with emphasis on new developments and pathogenesis", Pathology 2011 Aug; 43(5):420-32). Серозные образцы, используемые в данных исследованиях, относились к большему набору образцов эпителиального рака яичников всех гистологий, собранному в период между 1984 и 2006 гг. Патология для определения гистологического статуса проводилась патологами каждого из центров в момент забора материала. На протяжении марта и апреля 2012 г., 357 этих образцов эпителиального рака яичников были проанализированы для проведения гистологической классификации двумя независимыми патологами-консультантами по раку яичников в соответствии с пересмотренным протоколом. Это привело к переклассификации нескольких из этих образцов, как указано в табл. 3.
Исходные три серозных субтипа, идентифицированных ниже, и следовательно, 25-генная сигнатура, описанная в примере ниже (фиг. 1), были идентифицированы по 199 образцам, которые были классифицированы как серозные в соответствии с отчетами первоначальных патологов. Аналогично был проведен биоинформационный анализ 277 образцов, классифицированных как серозный рак яичников высокой степени злокачественности стадий III и IV с использованием уточненного метода патологической классификации. Этот анализ идентифицировал уточненные серозные подгруппы, представленные на фиг. 2, впоследствии использованные для определения 45-генной сигнатуры.
Определение профилей генной экспрессии для FFPE-образцов.
Экстрагировали общую РНК из полученной методом макродиссекции FFPE-ткани с использованием набора для получения высокочистой РНК (High Pure RNA Paraffin Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). РНК конвертировали в комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК), которую впоследствии амплифицировали и конвертировали в одноцепочечную форму с использованием технологии SPIA(r) в системе WT-Ovation(tm) FFPE RNA Amplification System V2 (NuGEN Technologies Inc., San Carlos, CA, USA). Амплифицированную одноцепочечную кДНК затем фрагменти-ровали и метили биотином с использованием FL-Ovation(tm) cDNA Biotin Module V2 (NuGEN Technologies Inc.). Фрагментированную и меченую кДНК затем гибридизировали с помощью Almac Ovarian Cancer DSA(tm). Исследовательский инструмент Almac Ovarian Cancer DSA(tm) был оптимизирован для анализа FFPE-образцов тканей, что позволило использовать ценные банки законсервированных тканей. Исследовательский инструмент Almac Ovarian Cancer DSA(tm) представляет собой новаторскую платформу с микрочипом, представляющим транскриптому как в нормальных, так и в раковых тканях яичников. Вследствие этого, Ovarian Cancer DSA(tm) обеспечивает всестороннее представление транскриптомы в условиях болезни яичников и в тканях, недоступное при использовании универсальных платформ микрочипов. Матрицы сканировали с использованием сканера Affymentrix Genechip(r) Scanner 7G (Affymetrix Inc.,
Santa Clara, CA).
Подготовка данных.
Контроль качества (QC) профилированных образцов проводили с использованием алгоритма предварительной обработки MAS5. Анализировались разные технические аспекты: средний шум и гомогенность фона, процент правильных определений (качество матрицы), качество сигнала, качество РНК и качество гибридизации. Распределения и медианное абсолютное отклонение соответствующих параметров анализировали и использовали для идентификации возможных выбросов.
Almac Ovarian Cancer DSA(tm) содержит зонды, нацеленные преимущественно на участок, охватывающий 300 нуклеотидов на 3'-конце. Поэтому стандартные меры качества РНК Affymetrix были адаптированы - для интенсивностей генов домашнего хозяйства 3'-конца были использованы наборы зондов с соотношениями интенсивности набора зондов 3'-конца к средней интенсивности фона в дополнение к обычным соотношениям 3'/5'. Контрольные образцы гибридизации проверяли для обеспечения того, чтобы их интенсивности и относительное количество правильных определений соответствовали требованиям, установленным Affymetrix.
Предпроцессинг первичных данных, полученных в результате определения профилей экспрессии обучающего набора эпителиальных серозных раков яичников, был проведен с помощью программы Expression Console v.1.1 no протоколу робастного многоматричного анализа (Robust Multi-array Analysis,
RMA). Иерархическая кластеризация и функциональный анализ
a) Анализ иерархической кластеризации.
Методы иерархической кластеризации были применены к данным, полученным с использованием микрочипа для эпителиальных серозных опухолей яичников, проанализированных с использованием платформы Ovarian Cancer DSA(tm) (болезнь-специфическая матрица). Первичные данные об экспрессии были подвергнуты предпроцессингу с использованием стандартной процедуры робастного многочипового алгоритма (Robust Multichip Algorithm, RMA). Небиологическую систематическую дисперсию в наборе данных идентифицируют и устраняют. Были идентифицированы наборы зондов, в которых уровни экспрессии значимо варьировались между разными опухолями. Такие наборы зондов составили характеристический список.
Был проведен двумерный кластерный анализ (опухоль, набор проб) для определения соотношений опухоли на основании характеристического списка. Была применена иерархическая агломеративная кластеризация (пирсоновская корреляция - первичный анализ - или эвклидово расстояние -модифицированный анализ - и сцепление Варда (Ward's linkage)). Оптимальное число разбиений выбирали с использованием индекса GAP (Tibshirani et al., 2002, J. R. Stat. Soc., 63:411-423). Все наборы данных, присутствующие в подгруппах кластера, были картированы по названиям генов.
b) Функциональный анализ генных кластеров.
Для установления функциональной значимости кластеров наборов зондов, наборы зондов были картированы по генам (идентификаторы (ID) генов Entrez) и был проведен анализ обогащения. Значимость обогащения рассчитывали на основании гипергеометрической функции (с учетом показателя ошибочного определения (Benjamini and Hochberg, 1995, J. R. Stat. Soc. 57:289:300)). Чрезмерную представительность биологических процессов и путей анализировали для каждой группы генов, полученной в результате иерархической кластеризации образцов эпителиального серозного рака яичников с использованием фирменного Инструмента функционального обогащения (Functional Enrichment Tool, FET) Almac Diagnostics. Антисмысловые наборы зондов были исключены из анализа. Гипергеометрические р-значения оценивали для каждого обогащенного класса функциональных объектов. Классы функциональных объектов с наибольшими р-значениями были выбраны как репрезентативные для группы и общая функциональная категория, представляющая эти функциональные объекты, была присвоена генным кластерам на основании значимости репрезентативности (т.е. р-значения).
Для создания классификатора ангиогенеза с использованием первичных 199 эпителиальных серозных опухолей яичников, гены в кластерах, обогащенных по общим функциональным термам ангиогене-за, развития сосудистой сети и иммунного ответа, были сгруппированы в предполагаемую генную группу ангиогенеза и использованы для получения сигнатуры. Кластеры образцов, презентующих высокую экспрессию генов, задействованных в общих функциональных термах ангиогенеза, развития сосудистой сети и иммунного ответа, были выбраны для классификации и помечены "ангиогенез". Кластеры, не демонстрирующие высокой экспрессии генов, задействованных в этих функциональных термах, были помечены "без ангиогенеза".
Для создания классификатора ангиогенеза с использованием переклассифицированных 265 эпителиальных серозных опухолей яичников гены в кластерах, обогащенных по общим функциональным термам ангиогенеза и развития сосудистой сети, были сгруппированы в предполагаемую генную группу ангиогенеза и использованы для получения сигнатуры. Кластеры образцов, презентующих высокую экспрессию генов, задействованных в общих функциональных термах ангиогенеза и развития сосудистой сети, были выбраны для классификации и помечены "ангиогенез". Кластеры, не демонстрирующие высокой экспрессии генов, задействованных в этих функциональных термах, были помечены "без ангиоге-неза".
Разработка классификатора на генном уровне.
Для облегчения валидации классификатора для множества матричных платформ классификатор ан-гиогенеза был сгенерирован на генном уровне. Следующие стадии описывают процедуры, использованные для разработки генного уровня сигнатуры (каждая стадия проводилась с внутренней кросс-валидацией с использованием 10 повторов 5-кратной кросс-валидации):
Разработка генного уровня сигнатуры.
Предпроцессинг:
Поправка на фон RMA.
Эталонный набор генов состоит из генов (только наборы смысловых зондов), уникальных для платформы DSA яичников.
Суммаризация генного уровня проводилась в две стадии: сначала проводили суммаризацию зондов для наборов зондов путем расчета медианной экспрессии зондов в наборе зондов; во-вторых, рассчитывали медианную экспрессию (только смысловых) картирования наборов зондов по каждому гену в эталонном распределении с получением "гена уровня" матрицы экспрессии.
Проводили нормализацию квантиля по полной матрице данных генной экспрессии и контрольный квантиль, полученный для обучающих данных, использовали для нормализации опытных образцов в каждом раунде кросс-валидации.
Селекция признаков:
Фильтрация 75% генов по дисперсии, интенсивности и корреляции с концентрацией кДНК с последующими или рекурсивной элиминацией признака (RFE) или фильтрующей селекцией признака (FFS) на основании оценок CAT.
Алгоритмы классификации: частных наименьших квадратов (PLS), SDA (сжимающий дискрими-нантный анализ) и DSDA (диагональный SDA). Выбор модели.
Критериями, используемыми для выбора модели, были ППК после внутренней кросс-валидации и элиминации признака. Функциональное обогащение сигнатур после кросс-валидации с использованием FET на основании генной онтологии, промежуточные наборы данных валидации, которые включали два набора технических реплик, для которых стандартное отклонение в бальных оценках сигнатуры для параллельных образцов оценивали после кросс-валидации и элиминации признака и оценки независимости от клинических и технических факторов после кросс-валидации (факторы, перечисленные в табл. 4).
Следует отметить, что, поскольку выделение подгруппы (т.е. метки класса) осуществляли с использованием экспрессии на микрочипе для той же когорты образцов, которая была использована для разработки сигнатуры, в любых оценках характеристик на основании ППК присутствовало ожидаемое положительное смещение. Это подчеркивает важность расширения критериев, используемых для выбора модели, путем включения дополнительных метрик, таких как функциональное обогащение и оценка независимости от клинических и технических факторов.
Расчет балльных оценок классификаторов для валидации наборов данных.
Все наборы данных подвергались предварительной обработке с использованием RMA. Для каждого набора валидации были определены наборы зондов, картированные по генам классификатора, за исключением антисмысловых наборов зондов (если такие были). Аннотации для матриц Affymetrix Plus 2.0 и U133A доступны на веб-сайте Affymetrix. Была рассчитана медианная интенсивность по всем наборам зондов, картированных по каждому гену в классификаторе, с получением матрицы интенсивности генов. Классификатор затем применяли к этой матрице данных для получения балльной оценки/прогноза классификатора для каждого образца.
Одномерный и многомерный анализ.
Одномерный и многомерный анализ может быть проведен для набора данных глиобластомы для оценки, соответственно, связи между субтипом классификатора ангиогенеза и выживаемостью и для определения того, будет ли связь, если она существует, независимой от известных клинических прогностических показателей. р-значения для одномерного анализа рассчитывали с использованием логистического регресса в программе MATLAB. Для многомерного анализа авторы использовали критерий отношения правдоподобия для логистического регресса, где р-значения представляют снижение логарифма вероятности (log-likelihood) при сравнении модели с клиническими ковариантами и прогнозами для сокращенной модели только с клиническими ковариантами. Критерий отношения правдоподобия измеряет важность гена-предиктора при моделировании выживаемости и указывает его независимость как прогностического показателя относительно клинических прогностических показателей. Как в одномерном, так и в многомерном анализе в качестве критерия значимости использовали р-значение <0,05. Кроме того, образцы с неизвестными клиническими факторами исключали в данной оценке.
Результаты.
Идентификация подгрупп и получение сигнатуры из первичной и уточненной классификации гис-тологий.
Анализ иерархической кластеризации.
Селекция признаков позволила выбрать 1200 наборов зондов из первичного набора данных эпителиального серозного рака яичников (199 образцов) и 1400 наборов зондов (PS) из переклассифицированного набора данных эпителиального серозного рака яичников (265 образцов). Анализ GAP выявил три кластера образцов и три группы кластеров наборов зондов в обоих наборах образцов (фиг. 1, 6).
Классификация опухолей на группы образцов "ангиогенез" или "без ангиогенеза".
Классификация образцов на "ангиогенез" или "без ангиогенеза" была основана на результатах функционального анализа набора данных эпителиального серозного рака яичников (фиг. 1, 6). Целью
данных исследований была характеризация на транскриптомном уровне набора генов, способных определять восприимчивость или резистентность патогенной клетки к антиангиогенным агентам, и, потенциально, идентификация пациентов, которые могут получить пользу от антиангиогенной терапии. Для этого нужно было выбрать образцы из наборов данных эпителиального серозного рака яичников, которые наилучшим образом представляют данную биологию, и сравнить с остальными образцами для создания классификатора (см. следующий раздел). Было решено, что образцы из кластера образцов ангиогенеза в первичном набор образцов эпителиального серозного рака яичников (199 образца) были наиболее релевантными образцами для такой селекции, поскольку эти образцы демонстрировали повышающую регуляцию генов, задействованных в передачу сигналов, связанных ангиогенными процессами и путями и иммунным ответом, как было определено с помощью функционального анализа (фиг. 2А и 2В). Было решено, что образцы из кластера, три образца в переклассифицированном наборе образцов эпителиального серозного рака яичников (265 образцов), были наиболее релевантными образцами для данной селекции, поскольку эти образцы демонстрировали повышающую регуляцию генов, задействованных в передачу сигналов, связанных ангиогенными процессами и путями, как было определено с помощью функционального анализа (фиг. 2А и 2В)
Идентичный подход иерархической кластеризации был применен к 105 образцам рака молочной железы. Доминирующей биологией при раке молочной железы является статус ER, и потому для идентификации структуры биологии образцов эта когорта была разделена на две популяции для кластерного анализа. Авторы идентифицировали субтипы ангиогенеза и развития сосудистой сети (фиг. 12А и 12В), что демонстрирует выделение субтипа ангиогенеза из образцов рака молочной железы.
Разработка и валидация моделей классификаторов субтипа ангиогенеза.
Для простоты понимания приведенные ниже стадии описаны со ссылкой на сигнатуры экспрессии, взятые из из табл. 1А или 1В. Однако аналогичная процедура может быть применена к другим предполагаемым кластерам биомаркеров, связанных с субтипами ангиогенеза, таких как раскрытые в SEQ ID NOs: 632-801 и SEQ ID NOs: 802-974). После идентификации класса опухолей, образующих предполагаемую подгруппу "ангиогенез", была проведена расчетная классификация этих опухолей в отличие от всех остальных в когорте опухолей со ссылкой на функциональный перечень генов "ангиоге-нез" (ангиогенез, развитие сосудистой сети, иммунный ответ) (табл. 1А или 1В) для идентификации уточненной модели классификации генов, которая классифицирует субтип "ангиогенез".
Конвейер (pipeline) классификации был использован для определения модели с использованием набора образцов эпителиального серозного рака яичников. Конвейер классификации был разработан в соответствии с критериями общепринятой добросовестной практики (MAQC Consortium, Nat Biotechnol 2010). Процесс будет параллельно 1) выводить модели классификации генов из эмпирических данных и 2) оценивать классификационные характеристики моделей, все с кросс-валидацией. Характеристики и успешность создания классификатора зависят от числа параметров, которое может быть переменным, например, выбора способа классификации или фильтрации набора зондов. С учетом этого оценивали два набора признаков: (i) полный перечень признаков с фильтрацией 75% дисперсии/интенсивности (с принудительным включением перечня генов ангиогенеза, табл. 1А) и (ii) перечень только генов ангиогенеза; и оценивали три алгоритма классификации, а именно PLS; SDA и DSDA. При разработке модели использовали RFE, который представляет собой итерационную процедуру удаления части признаков с наименьшим рангом при каждой итерации; с остановкой только после того, как останется минимальное число признаков. ППК использовали для оценки характеристик классификации, поскольку эта мера является независимой от отсекающей границы между группами и коэффициентов распространенности данных. Она также является одним из лучших признанных измеряемых показателей для определения характеристик классификации. По существу, наилучшее число признаков для каждой модели выбирали на основании средней ППК с кросс-валидацией.
По результатам описанного выше анализа, модель PLS FFS была признана наиболее пригодной моделью классификатора. Были рассчитаны веса для каждого гена с использованием PLS-регрессии, в результате чего были получены окончательные модели генных классификаторов (25-генная модель классификатора для исходного подхода и 45-генный классификатор для образцов, переклассифицированных с учетом последних изменений стандартных протоколов гистологии), которые могут быть использованы для валидации внешних наборов данных от разных матричных платформ. Процесс разработки генной сигнатуры был сфокусирован на идентификации онтологических процессов и путей, связанных с ангио-генезов, для обеспечения биологической релевантности любых разработанных сигнатур. По существу, был проведен функциональный анализ обоих сигнатур для определения их релевантности к ангиогенезу и родственным процессам. Значимые процессы на фиг. 3 и 8 ассоциированы с ангиогенезом и развитием сосудистой сети.
Пример 2. Компьютерная (in silico) валидация классификаторов субтипа ангиогенеза и модели ан-гиогенез.
Достоверность характеристик как 25-генного (исходный подход), так и 45-генного (подход с учетом переклассификации) классификаторов модели ангиогенеза подтверждали с помощью площади под кривой (ППК) ROC (характеристическая кривая обнаружения) для первичного набора данных Almac эпите
лиального серозного рака яичников и двух независимых наборов данных. ППК представляет собой статистический показатель, рассчитываемый по шкале наблюдаемой болезни scale, и является мерой эффективности прогноза фенотипа с использованием модели классификатора (Wray et. al., PLoS Genetics Vol 6, 1-9). Значение ППК, равное 0,5, является типичным для статистического классификатора, а значение ППК, равное 1,0, будет представлять точное разделение классов. Поэтому для определения того, будет ли модель классификатора субтипа ангиогенеза способна предсказывать ответ на и позволять выбирать пациентов для классов терапевтических антиангиогенных препаратов против рака яичников в виде отдельно взятого агента или в комбинации со стандартным лечением, гипотеза заключается в том, что ППК после применения в таких наборах данных должна быть выше 0,5, при наименьшем значении доверительного интервала также выше 0,5.
Применение модели классификатора к независимым клиническим наборам данных на микрочипах.
Для оценки прогностической мощности 25-генной и 45-генной моделей классификаторов их применили к набору данных для 77 образцов глиобластомы, взятых во время первичной хирургической резекции у пациентов (в возрасте старше 21 года) без предшествующей терапии (Phillips et. al., 2006). Этот анализ показал, что 25-генная модель классификатора была независимо ассоциирована с прогнозом гли-областомы. Важно отметить, что при многомерном анализе по Коксу (Сох) было обнаружено, что сигнатура ангиогенез является прогностической для выживаемости, независимо от степени злокачественности опухоли по классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и/или присутствия некроза (р=0,37). Оба эти клинических фактора коррелируют с выживаемостью при глиобластоме. Группа высокого ангиогенеза была ассоциирована со значительно худшей выживаемостью по сравнению с группой низкого ангиогенеза (отношение рисков = 1,7814, р=0,0269). Это указывает, что 25-генный классификатор является независимым прогностическим биомаркером выживаемости при глиобластоме.
Применение моделей классификаторов к независимому набору данных клеточных линий рака простаты.
Для оценки прогностической мощности 25-генной и 45-генной моделей классификаторов они были применены к набору данных для 16 клеточных линий простаты после лечения дасатинибом. Клеточные линии были определены как "восприимчивые" или "невосприимчивые" на основании анализов клеточной пролиферации. Этот анализ показал, что 25-генная модель классификатора ассоциирована с откликом на дасатиниб при ППК, равной 0,8364 (CI=0,5255-1,0000), что указывает на то, что 25-генный классификатор является прогностическим для отклика на дасатиниб. Анализ показал, что 45-генная модель классификатора ассоциирована с откликом на указанное соединение, с ППК, равной 0,9455 (CI=0,7949-1,0000), что указывает на то, что 45-генный классификатор также является прогностическим для отклика на даса-тиниб.
Пример 4. Идентификация и компьютерная (in silico) валидация антиангиогенной "невосприимчивой" подгруппы рака яичников.
Экспрессия генов ангиогенеза в кластере 2х наборов зондов подвергается понижающей регуляции во всех образцах кластера 2 иерархической кластеризации 265 образцов, заново классифицированных как серозные (фиг. 6 и 10). Эти образцы в кластере 2 образцов имеют лучший прогноз, чем остальные серозные образцы в образцах объединенных кластеров 1 и 3, как показано на фиг. 11. Это указывает на то, что данная группа определяется понижающей регуляцией экспрессии генов ангиогенеза, идентифицированных в табл. 2В. Пациенты с понижающей регуляцией генов, задействованных в ангиогенезе и потому относящиеся к данной подгруппе, названы "невосприимчивой" группой". Этот фенотип был также идентифицирован при ER+ и ER- раке молочной железы, как видно для средней группы образцов на фиг. 12А и второй группы образцов на фиг. 12В.
Литература
1. Friedman HS, Prados MD, Wen PY, ef al. Bevacizumab alone and in combination with irinotecan in recurrent glioblastoma. J Clin Опсо/;27:4733^Ю (2009).
2. Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J /Wec/;350:2335-42 (2004),
3. Rini Bl, Halabi S, Rosenberg JE, ef al. Bevacizumab plus interferon alfa compared with interferon alfa monotherapy in patients with metastatic renal cell carcinoma: CALGB 90206. J Clin Oncol; 26:5422-8 (2008).
4. Sandler A, Gray R, Perry MC, ef al. Paclitaxel-carboplatin alone or with bevacizumab for non-small-cell lung cancer. N Engl J Med; 355: 2542-50 (2006).
5. Wolmark N, Yothers G, O'Connell MJ, ef al. A phase III trial comparing mFOLFOXe to mFOLFOX6 plus bevacizumab in stage II or III carcinoma of the colon: results of NSABP protocol C-08. J Clin Oncol; 27:LBA4 (2009).
6. Yang JC, Haworth L, Sherry RM, ef al., A randomized trial of bevacizumab, an anti-vascular endothelial growth factor antibody, for metastatic renal cancer, N Engl J Med 349 427-434 (2003).
7. Willett CG, Boucher Y, di Tomaso E, ef al., Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer, Nat. Med. 10, 145-147 (2004).
8. Miller K, Wang M, Gralow J, ef al., Paclitaxel plus bevacizumab versus paclitaxel alone for metastatic breast cancer, N Engl J Med 357 2666-2676 (2007).
9. Miller KD, Chap LI , Holmes FA, ef al., Randomized phase III trial of capecitabine compared with bevacizumab plus capecitabine in patients with previously treated metastatic breast cancer, J Clin Oncol 23 792-799 (2005).
10. O'Shaughnessy J, Miles D, Gray RJ, ef al., A meta-analysis of overall survival data from three randomized trials of bevacizumab (BV) and first-line chemotherapy as treatment for patients with metastatic breast cancer (MBC), J Clin Oncol 28 (suppl) (abstr 1005) (2010).
11. Reck M, von Pawel J, Zatloukal P, ef a/., Phase III trial of cisplatin plus gemcitabine with either placebo or bevacizumab as first-line therapy for nonsquamous non-small-cell lung cancer: AVAil, J Clin Oncol 27,1227-1234 (2009).
12. Escudier B, Bellmunt J, Negrier S ef al., Phase III trial of bevacizumab plus interferon alfa-2a in patients with metastatic renal cell carcinoma (AVOREN): final analysis of overall survival, J Clin Oncol 28, 2144-2150 (2010)
13. Burger RA, Sill MW, Monk BJ, ef. al. Phase II trial of bevacizumab in persistent or recurrent epithelial ovarian cancer or primary peritoneal cancer: a Gynecologic Oncology Group Study. J Clin Oncol; 20;25(33):5165-71 (2007).
1.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ прогнозирования восприимчивости субъекта к агенту антиангиогенной терапии, включающий
измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии;
классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к антиангиогенному терапевтическому агенту на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.
2. Способ по п.1, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому, рак простаты, ко-лоректальный рак или рак молочной железы.
3. Способ по любому из пп.1 и 2, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.
4. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, и где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.
5. Способ по любому из пп.1 и 3, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в
табл. 2В.
6. Способ по любому из пп.1, 3-5, в котором антиангиогенный терапевтический агент представляет собой терапевтический агент, нацеленный на путь VEGF, ингибитор пути ангиопоэтина-ТП12, эндогенные ангиогенные ингибиторы и иммуномодулирующие агенты.
7. Способ по п.6, в котором терапевтический агент, нацеленный на путь VEGF, выбран из беваци-зумаба (авастин), афиберцепта (ловушка VEGF), IMC-1121B (рамуцирумаб), иматиниба (гливек), сора-фениба (нексавар), гефитиниба (иресса), сунитиниба (сутент), эрлотиниба, тивозиниба, цедираниба (ре-центин), пазопаниба (вотриент), BIBF 1120 (варгатеф), довитиниба, семаксаниба (суген), акситиниба (AG013736), вандетаниба (зактима), нилотиниба (тасигна), дасатиниба (спрайсел), ваталаниба, мотесани-ба, АВТ-869, TKI-258 и их комбинации.
8. Способ по п.6, в котором ингибитор пути ангиопоэтина-ТП52 выбран из AMG-386, PF-4856884 CVX-060, СЕР-11981, СЕ-245677, MEDI-3617, CVX-241, трастузумаба (герцептин) или их комбинации.
9. Способ по п.6, в котором эндогенные ангиогенные ингибиторы выбраны из тромбоспондина, эн-достатина, тумстатина, канстатина, аррестина, ангиостатина, вазостатина, интерферона-альфа или их комбинации.
10. Способ по п.6, в котором иммуномодулирующий агент выбран из талидомида, леналидомида и их комбинации.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором прогнозирование выполнено в контексте стандартной терапии и/или терапии антиангиогенным терапевтическим агентом, где антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.
12. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и субъект был ранее подвергнут цитотоксической химиотерапии на основе платины и таксана или в котором антиангиогенный терапевтический агент используется в адъювантной или неадъювантной терапии.
13. Способ определения прогноза для субъекта, больного раком, включающий
измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в исследуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца; сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии;
классификацию субъекта как имеющего плохой или хороший прогноз на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже пороговой оценки экспрессии соответственно.
14. Способ по п.13, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.
15. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где каждый вес для каждого биомаркера соответствует указанному в табл. 2А и 2В.
16. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.
14.
17. Способ по любому из пп.13 и 14, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в
табл. 2В.
18. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут стандартной химиотерапии.
19. Способ по любому из пп.13-17, в котором субъект был ранее подвергнут хирургической резекции рака.
20. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой глиобластому.
21. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором мерой прогноза является выживание.
22. Способ прогнозирования отклика субъекта на стандартную терапию рака, включающий
измерение уровней экспрессии 25 биомаркеров из табл. 2А или 45 биомаркеров из табл. 2В в иссле-
дуемом образце раковой ткани, полученном от субъекта, для определения оценки экспрессии образца;
сравнение оценки экспрессии образца с пороговой оценкой экспрессии;
классификацию субъекта как восприимчивого или невосприимчивого к стандартной терапии рака, на основании того, что оценка экспрессии образца имеет значение выше/равное или ниже порога оценки экспрессии соответственно.
23. Способ по п.22, в котором рак представляет собой рак яичников, глиобластому или рак молочной железы.
24. Способ по любому из пп.22 и 23, в котором значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого биомаркера и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера соответствует весу, указанному в табл. 2А и 2В.
25. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 25 генов из табл. 2А, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 25 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2А.
26. Способ по любому из пп.22-24, в котором измеряемыми биомаркерами являются 45 генов из табл. 2В, где значение экспрессии образца определяют путем измерения уровня экспрессии для каждого из 45 биомаркеров и умножения его на соответствующий вес, где вес для каждого биомаркера указан в табл. 2В.
27. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором рак представляет собой рак яичника и стандартная терапия представляет собой стандартную цитотоксическую химиотерапию на основе платины и таксана.
23.
Фиг. 2В
(1 - Специфичность) Фиг. 9
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025926
025926
- 1 -
- 1 -
(19)
025926
025926
- 1 -
- 1 -
(19)
025926
025926
- 1 -
- 1 -
(19)
025926
025926
- 4 -
- 3 -
025926
025926
- 11 -
- 11 -
025926
025926
- 34 -
- 34 -
025926
025926
- 38 -
- 38 -
025926
025926
- 40 -
025926
025926
- 43 -
- 43 -
025926
025926
- 53 -
- 53 -
025926
025926
- 54 -
- 54 -
025926
025926
- 56 -
- 56 -