EA 025894B1 20170228

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000025894b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-22 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна I в ориентации 5'-3': (R)x-N ^B -N ^Q -N ^Q -N ^B -(N ^Q -N ^Q -N ^Q -N ^B ) ₃ -N ^Q -N ^Z , где каждый R независимо представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4; каждый N ^B независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый N ^Q независимо представляет собой небициклический нуклеозид; N ^Z представляет собой модифицированный нуклеозид, и где 1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или 2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид.

2. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна II в ориентации 5'-3': N ^M -N ^B -N ^Q -N ^Q -N ^B -(N ^Q -N ^Q -N ^Q -N ^B ) ₃ -N ^Q -N ^Z _, где N ^M независимо представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый N ^B независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый N ^Q независимо представляет собой небициклический нуклеозид; N ^Z представляет собой модифицированный нуклеозид, и где 1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или 2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид.

3. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна III в ориентации 5'-3': (R) _X -N ^B -N ^Q -N ^Q -N ^B -(N ^Q -N ^Q -N ^Q -N ^B ) ₃ -N ^Y -N ^Z , где каждый R представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4; каждый N ^B представляет собой бициклический нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой небициклический нуклеозид; N ^Y представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; N ^Z представляет собой модифицированный нуклеозид, и где 1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или 2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид.

4. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна IV в ориентации 5'-3': N ^M -N ^B -N ^Q -N ^Q -N ^B -(N ^Q -N ^Q -N ^Q -N ^B ) ₃ -N ^Y -N ^Z , где N ^M представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый N ^B представляет собой бициклический нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой небициклический нуклеозид; N ^Y представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; N ^Z представляет собой модифицированный нуклеозид, и где 1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или 2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид.

5. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна V в ориентации 5'-3': N ^M -N ^B -(N ^Q -N ^Q -N ^B -N ^B ) ₄ -N ^Z , где N ^M представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый N ^B представляет собой бициклический нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой небициклический нуклеозид; N ^Z представляет собой модифицированный нуклеозид.

6. Соединение по любому из пп.1-5, где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или 22 смежных нуклеозида нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.

7. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарна нуклеотидной последовательности miR-21 (SEQ ID NO:1).

8. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из LNA-нуклеозида, cEt-нуклеозида и ENA-нуклеозида.

9. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой S-cEt-нуклеозид.

10. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой LNA-нуклеозид.

11. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из β-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида.

12. Соединение по любому из пп.1-10, где каждый небициклический нуклеозид представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид.

13. Соединение по любому из пп.1-10, где каждый небициклический нуклеозид представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.

14. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.

15. Соединение по любому из пп.1-14, где по меньшей мере один цитозин представляет собой 5-метилцитозин или где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

16. Соединение по п.1, где: a) R состоит из четырех связанных нуклеозидов N ^R1 -N ^R2 -N ^R3 -N ^R4 , где N ^R1 представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид, и каждый N ^R2 -N ^R3 -N ^R4 представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; b) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; c) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; d) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой S-cEt-нуклеозид; e) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой LNA-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; или f) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой LNA-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой LNA-нуклеозид.

17. Соединение по п.1, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру, выбранную из T _E ^Me C _E A _E A _E C _S A _E T _E C _S A _E G _E T _E C _S T _E G _E A _E U _S A _E A _E G _E C _S T _E A _E и T _E ^Me CAAC _S ATC _S AGTC _S TGAU _S AAGC _S TA _E , где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и верхний индекс "Me" означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.

18. Соединение по п.2, где: a) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; b) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; c) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; каждый N представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой S-cEt-нуклеозид; d) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой LNA-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид или e) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой LNA-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой LNA-нуклеозид.

19. Соединение по п.2, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру, выбранную из A _E C _S ATC _S AGTC _S TGAU _S AAGC _S TA _E , A _E C _S A _E T _E C _S A _E G _E T _E C _S T _E G _E A _E U _S A _E A _E G _E C _S T _E A _E , A _E ^Me C _S AT ^Me C _S AGT ^Me C _S TGAT _S AAG ^Me C _S TA _E , A _E C _S ATC _S AGTC _S TGAU _S AAGC _S TA _S и A _E ^Me C _S AT ^Me C _S AGT ^Me C _S TGAT _S AAG ^Me C _S TA _S , где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и верхний индекс "Me" означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.

20. Соединение по п.19, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру A _E C _S ATC _S AGTC _S TGAU _S AAGC _S TA _E , где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды.

21. Соединение по п.3, где: a) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Y представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; b) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Y представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой S-cEt-нуклеозид или c) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Y представляет собой S-cEt-нуклеозид; N ^Z представляет собой S-cEt-нуклеозид.

22. Соединение по п.4, где: a) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Y представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; b) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Y представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой S-cEt-нуклеозид; c) N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Y представляет собой S-cEt-нуклеозид; N ^Z представляет собой S-cEt-нуклеозид.

23. Соединение по п.5, где N ^M представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый N ^B представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N ^Q представляет собой β-D-дезоксирибонуклеозид; N ^Z представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.

24. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 или где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4 и где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.

25. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью, или где каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь, и где модифицированная межнуклеозидная связь возможно представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.

26. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид A _E C _S ATC _S AGTC _S TGAU _S AAGC _S TA _E , где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь.

27. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида A _E C _S ATC _S AGTC _S TGAU _S AAGC _S TA _E , где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь.

28. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.26 или 27 и фармацевтически приемлемый носитель.

29. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для ингибирования активности miR-21 в клетке, где лекарственное средство предназначено для приведения в контакт с клеткой.

30. Применение по п.29, отличающееся тем, что клетка находится в условиях in vivo или клетка находится в условиях in vitro.

31. Применение по п.29 или 30, отличающееся тем, что клетка представляет собой фибробласт, клетку, характеризующуюся гиперпролиферацией, кератиноцит или клетку, находящуюся под действием гипоксии.

32. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для снижения экспрессии коллагена в клетке, где лекарственное средство предназначено для приведения в контакт с клеткой.

33. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для лечения, предупреждения или отсрочки начала развития заболевания, ассоциированного с miR-21, у субъекта, имеющего заболевание, ассоциированное с miR-21, где лекарственное средство предназначено для введения субъекту, имеющему заболевание, ассоциированное с miR-21.

34. Применение по п.33, отличающееся тем, что заболевание представляет собой фиброз.

35. Применение по п.34, отличающееся тем, что фиброз выбирают из фиброза почек, фиброза легких, фиброза печени, фиброза сердца, фиброза кожи, возрастного фиброза, фиброза селезенки, склеродермии и посттрансплантационного фиброза.

36. Применение по п.35, отличающееся тем, что a) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из гломерулосклероза, тубулоинтерстициального фиброза, IgA-нефропатии, интерстициального фиброза/тубулярной атрофии; хронического повреждения почек, поражения нефронов, гломерулонефрита, сахарного диабета, идиопатического фокально-сегментарного гломерулосклероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек и терминальной стадии почечной недостаточности, присутствует фиброз почек; b) фиброз почек возникает в результате острой или повторной травмы почек; c) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из хронического повреждения печени, инфекционного гепатита, неалкогольного стеатогепатита и цирроза, присутствует фиброз печени; легочный фиброз представляет собой идиопатический легочный фиброз; и/или d) субъект имеет хроническое обструктивное заболевание легких.

37. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для лечения фибропролиферативного нарушения у субъекта, где лекарственное средство предназначено для введения субъекту.

38. Применение по любому из пп.33-37, включающее отбор субъекта, имеющего повышенную экспрессию miR-21 в одной или нескольких тканях.

39. Применение по любому из пп.33-37, отличающееся тем, что субъект нуждается в улучшенной функции органов, где функцию органов выбирают из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.

40. Применение по любому из пп.33-39, отличающееся тем, что введение улучшает функцию органов у субъекта, где функцию органа выбирают из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.

41. Применение по любому из пп.33-40, где указанное лечение включает введение по меньшей мере одного терапевтического средства, выбранного из противовоспалительного средства, иммуносупрессивного средства, противодиабетического средства, дигоксина, вазодилататора, ингибиторов ангиотензин-II-превращающего фермента (АСЕ), блокаторов рецепторов ангиотензина II (ARB), блокатора кальциевых каналов, динитрата изосорбида, гидралазина, нитрата, гидралазина, бета-блокатора, натрийуретических пептидов, гепариноида и ингибитора фактора роста соединительной ткани.

42. Применение по п.41, где указанное терапевтическое средство представляет собой по меньшей мере один ингибитор АСЕ.

43. Применение по п.42, где ингибитор АСЕ выбран из каптоприла, эналаприла, лизиноприла, беназеприла, хинаприла, фозиноприла и рамиприла.

44. Применение по п.41, включающее введение по меньшей мере одного ингибитора ARB.

45. Применение по п.44, где ингибитор ARB выбран из кандесартана, ирбесартана, олмесартана, лозартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.

46. Применение по п.33, отличающееся тем, что заболевание представляет собой рак и/или включает метастазирование.

47. Применение по п.46, отличающееся тем, что рак представляет собой рак печени, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак головного мозга, гемобластоз, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак языка, рак желудка, рак кожи или рак щитовидной железы.

48. Применение по любому из пп.46 или 47, где указанное лечение дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного дополнительного средства противораковой терапии.

49. Применение по п.33, где заболевание представляет собой заболевание сердца.

50. Применение по любому из пп.33-49, отличающееся тем, что субъект является человеком.

51. Применение по любому из пп.33-50, отличающееся тем, что соединение представлено в виде фармацевтической композиции.

52. Применение соединения по любому из пп.1-27 в терапии.

53. Применение соединения по любому из пп.1-27 для получения лекарственного препарата.

54. Применение соединения по любому из пп.1-27 для получения лекарственного препарата для стимулирования заживления ран.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

9. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой S-cEt-нуклеозид.

10. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой LNA-нуклеозид.

28. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.26 или 27 и фармацевтически приемлемый носитель.

34. Применение по п.33, отличающееся тем, что заболевание представляет собой фиброз.

44. Применение по п.41, включающее введение по меньшей мере одного ингибитора ARB.

49. Применение по п.33, где заболевание представляет собой заболевание сердца.

50. Применение по любому из пп.33-49, отличающееся тем, что субъект является человеком.

52. Применение соединения по любому из пп.1-27 в терапии.

53. Применение соединения по любому из пп.1-27 для получения лекарственного препарата.

Евразийское
патентное
ведомство
025894
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201391492
(22) Дата подачи заявки 2012.04.25
(51) Int. Cl.
C12N15/113 (2010.01) A61P35/00 (2006.01)
(54)
СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МИКРОРНК И СПОСОБЫ МОДУЛИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ MIR-21
(31) 61/478,767; 61/565,779
(32) 2011.04.25; 2011.12.01
(33) US
(43) 2014.04.30
(86) PCT/US2012/034880
(87) WO 2012/148952 2012.11.01
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
РЕГУЛУС ТЕРАПЬЮТИКС ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Бхат Балкришен (US)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(56) WO-A2-2007027894 WO-A2-2009043353 WO-A1-2009106367 WO-A1-2010144485 WO-A2-2009058907
WO-A1-2010099161
WO-A2-2005013901 EP-A2-2261333
LIU G. ET AL.: "miR-21 mediates fibrogenic activation of pulmonary fibroblasts and lung fibrosis", JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 207, no. 8, 2 August 2010 (2010-08-02), pages 1589-1597, XP55031311, ISSN: 0022-1007, DOI: 10.1084/jem.20100035 the whole document
CHAN J.A. ET AL.: "MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma
cells", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 65, no. 14, 15 July 2005 (2005-07-15), pages 6029-6033, XP002457479, ISSN: 0008-5472, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-05-0137 the whole
document
(57) В изобретении представлены композиции и способы для ингибирования активности miR-21. Композиции имеют определенные паттерны модификаций нуклеозидов, позволяющие получать сильные ингибиторы активности miR-21. Композиции можно применять для ингибирования miR-21, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с аномальной экспрессией miR-21, таких как фиброз и рак.
Настоящая заявка заявляет преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США № 61/478767, поданной 25 апреля 2011 г., и по предварительной заявке на патент № 61/565779, поданной 1 декабря 2011 г., которые включены в настоящую заявку ссылкой в полном объеме для любых целей.
Область настоящего изобретения
В данном документе обеспечены способы и композиции для модуляции активности miR-21.
Описание известного уровня техники
МикроРНК (микроРНК), также известные как "зрелые микроРНК", являются небольшими (имеющими длину приблизительно 18-24 нуклеотидов) молекулами некодирующих РНК, закодированными в геномах растений и животных. В некоторых случаях высококонсервативные эндогенно экспрессирую-щиеся микроРНК регулируют экспрессию генов путем связывания с 3'-нетранслируемыми областями (3'-UTR) конкретных мРНК. Более 1000 различных микроРНК выявили в растениях и животных. Определенные зрелые микроРНК, по-видимому, происходят из длинных эндогенных первичных транскриптов микроРНК (также известных как при-микроРНК, при-mir, при-miR или при-пре-микроРНК), которые часто имеют длину в несколько сотен нуклеотидов (Lee et al., EMBO J., 2002, 21(17), 4663-4670).
Функциональные анализы микроРНК выявили, что эти небольшие некодирующие РНК способствуют различным физиологическим процессам у животных, включая контроль продолжительности развития, органогенез, дифференцировку, паттернинг, эмбриогенез, контроль роста и запрограммированную гибель клеток. Примеры конкретных процессов, в которых участвуют микроРНК, включают дифференцировку стволовых клеток, нейрогенез, ангиогенез, гемопоэз и экзоцитоз (обзор приведен в Alvarez-Garcia and Miska, Development, 2005, 132, 4653-4662).
Краткое описание настоящего изобретения
В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21, и где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеозидный паттерн, описанный в данном документе.
В данном документе обеспечены способы ингибирования активности miR-21, включающие приведение клетки в контакт с соединением, описанным в данном документе. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях in vivo. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях in vitro.
В данном документе обеспечены способы лечения заболевания, ассоциированного с miR-21, включающие введение субъекту, имеющему заболевание, ассоциированное с miR-21, соединения, описанного в данном документе. В определенных вариантах осуществления животное является человеком.
Соединения, описанное в данном документе, обеспечены для применения в терапии.
В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-22 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного оли-гонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна I в ориентации 5'-3':
(R)x-NB-NQ-NQ-NB4NQ-NQ-NQ-NB),-№-Nz ,
где каждый R независимо представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4;
каждый NB независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ независимо представляет собой небициклический нуклеозид; и каждый NZ независимо представляет собой модифицированный нуклеозид.
В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного оли-гонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна II в ориентации 5'-3':
NM-NB-NQ-NQ-NB-(NQ-NQ-NQ-NB)rNQ-Nz ,
где NM независимо представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бицикличе-ским нуклеозидом;
каждый NB независимо представляет собой бициклический нуклеозид;
каждый NQ независимо представляет собой небициклический нуклеозид; и
независимо представляет собой модифицированный нуклеозид. В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного оли-гонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна III в ориентации 5'-3':
(R)x-NB-№-NQ-NB-(NQ-NQ-NQ-NB)3-NY-Nz ,
где каждый R представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид;
каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид;
NY представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и каждый NZ представляет собой модифицированный нуклеозид.
В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного оли-гонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна IV в ориентации 5'-3':
NM-NB-NQ-NQ-NB4NQ-T> 1Q-NQ-NB)3-NV-NZ ,
где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклео-зидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид;
NY представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и
представляет собой модифицированный нуклеозид. В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного оли-гонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна V в ориентации 5-3':
NM-NB-(NQ-NQ-NB-NB)4-NZ ,
где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклео-зидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид; и
представляет собой модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I или III X равен 1, X равен 2, X равен 3 или X равен 4.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или 22 смежных нуклеозида нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95 или на 100% комплементарна нуклеотидной последовательности miR-21 (SEQ ID
NO:1).
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, нуклеиновое основание в положении 1 miR-21 спарено с первым нуклеиновым основанием на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из LNA-нуклеозида, cEt-нуклеозида и ENA-нуклеозида.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере два небициклических нуклеозида содержат сахарные фрагменты, отличающиеся друг от друга. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид имеет тот же тип сахарного фрагмента.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид представляет собой cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления cEt-нуклеозид представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления cEt-нуклеозид представляет собой R-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид представляет собой LNA-нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из p-D-дезоксирибонуклеозида, P-D-рибонуклеозида, 2'-О-метилнуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый неби-циклический нуклеозид независимо выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспечен
ных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды. В таких определенных вариантах осуществления каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, самый крайний с 5'-конца и самый крайний с 3'-конца небициклические нуклеозиды представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, два небициклических нуклеозида представляют собой 2'-МОЕ-нуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I или III каждый нуклеозид R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозид-ного паттерна I или III три нуклеозида R представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и один нук-леозид R представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, по меньшей мере один цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, цитозин во втором положении модифицированного олигонуклеотида представляет собой 5-метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I R состоит из четырех связанных нуклеозидов NR1-NR2-NR3-NR4, где NR1 представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид, и каждый из NR2-NR3-NR4 представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый
представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой LNA-нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; каждый
N представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой LNA-нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозид-ного паттерна III каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый
представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой S-cEt-нуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой S-cEt-нуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V NM представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U. В определенных вариантах осуществления любого из соединений, обеспеченных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4, где каждый Т в последовательности независимо выбран из T и U.
В данном документе обеспечены способы ингибирования активности miR-21, включающие приведение клетки в контакт с соединением, обеспеченным в данном документе. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях in vivo. В определенных вариантах осуществления клетка находится в условиях in vitro. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой фиб-робласт, клетку, характеризующуюся гиперпролиферацией, кератиноцит или клетку, находящуюся под действием гипоксии. В определенных вариантах осуществления фибробласт представляет собой фиброб-ласт, характеризующийся гиперпролиферацией.
В данном документе обеспечены способы уменьшения экспрессии коллагена в клетке, включающие приведение клетки в контакт с соединением, обеспеченным в данном документе.
В данном документе обеспечены способы лечения, предупреждения или отсрочки начала заболевания, ассоциированного с miR-21, включающие введение субъекту, имеющему такое заболевание, любого из соединений, обеспеченных в данном документе.
В определенных вариантах осуществления заболеванием является фиброз. В определенных вариантах осуществления фиброз является фиброзом почек, фиброзом легких, фиброзом печени, фиброзом сердца, фиброзом кожи, возрастным фиброзом, фиброзом селезенки, склеродермией или посттрансплантационным фиброзом.
В определенных вариантах осуществления фиброз является фиброзом почек и присутствует у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из гломерулосклероза, тубулоинтерстициального фиброза, IgA-нефропатии, интерстициального фиброза/атрофии канальцев; хронического повреждения почек, повреждение нефронов, гломерулонефрита, сахарного диабета, идиопатического фокально-сегментарного гло-мерулосклероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек и терминальной стадии почечной недостаточности.
В определенных вариантах осуществления фиброз почек возникает в результате острой или повторной травмы почки.
В определенных вариантах осуществления фиброз является фиброзом печени и присутствует у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из хронического повреждения печени, инфекционного гепатита, неалкогольного стеатогепатита и цирроза.
В определенных вариантах осуществления легочный фиброз является идиопатическим легочным фиброзом, или субъект имеет хроническое обструктивное заболевание легких.
В определенных вариантах осуществления заболевание является воспалительным заболеванием.
В данном документе обеспечены способы стимулирования заживления ран у субъекта, включающие введение субъекту, имеющему острую или хроническую рану, любого из соединений, обеспеченных в данном документе.
В определенных вариантах осуществления хроническая рана является острой или хронической послеоперационной раной, проникающей раной, авульсионным повреждением, переломом, резаным повреждением, ожоговым поражением, рваной раной, укушенной раной, артериальной язвой, венозной язвой, пролежнем или диабетической язвой.
В определенных вариантах осуществления соединение местно вводят в рану.
В данном документе обеспечены способы лечения фибропролиферативного нарушения у субъекта, включающие введение субъекту любого из соединений, обеспеченных в данном документе.
Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать выбор субъекта, обладающего повышенной экспрессией miR-21 в одной или нескольких тканях.
В определенных вариантах осуществления введение любого из соединений, обеспеченных в данном документе, субъекту снижает экспрессию коллагена.
В определенных вариантах осуществления субъект нуждается в улучшенной функции органов, где функция органов выбрана из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.
В определенных вариантах осуществления введение любого из соединений, обеспеченных в данном документе, улучшает функцию органов у субъекта, где функция органов выбрана из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.
Любой из способов, обеспеченных в данном документе, включает оценивание функции почек у субъекта, что может включать измерение уровня остаточного азота мочевины в крови субъекта; измерение уровня креатинина в крови субъекта; измерение у субъекта клиренса креатинина; измерение у субъекта степени протеинурии; измерение у субъекта соотношения альбумин: Cr и/или измерение у субъекта количества выделяемой мочи.
Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать оценивание функции печени у субъекта, что может включать измерение в крови субъекта уровней аланинаминотрансферазы; измерение в крови субъекта уровней аспартатаминотрансферазы; измерение в крови субъекта уровней билирубина; измерение в крови субъекта уровней альбумина; измерение у субъекта протромбинового времени; измерение у субъекта степени асцита и/или измерение у субъекта степени энцефалопатии.
Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать оценивание функции легких у субъекта, что может включать измерение у субъекта жизненной емкости легких; измерение у субъекта форсированной жизненной емкости легких; измерение у субъекта объема форсированного выдоха за одну секунду; измерение у субъекта максимальной объемной скорости выдоха; измерение у субъекта скорости форсированного выдоха; измерение у субъекта максимальной произвольной вентиляции; определение у субъекта соотношения объема форсированного выдоха за одну секунду и форсированной жизненной емкости; измерение у субъекта соотношения вентиляция/перфузия; измерение у субъекта вымывания азотаи/или измерение абсолютного объема воздуха в одном или нескольких легких субъекта.
Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать оценивание у субъекта функции сердца, что может включать измерение у субъекта минутного объема сердца; измерение у субъекта ударного объема сердца; измерение у субъекта средней скорости систолического выброса; измерение у субъекта систолического давления крови; измерение у субъекта фракции выброса левого желудочка; определение у субъекта ударного индекса; определение у субъекта сердечного индекса; измерение у субъекта процентного снижения фракции выброса левого желудочка; измерение у субъекта средней скорости циркулярного укорочения волокон миокарда; измерение у субъекта характера скорости притока крови в левый желудочек; измерение у субъекта характера скорости потока крови через легочные вены и/или измерение максимальной скорости раннего диастолического движения фиброзного кольца митрального клапана субъекта.
Любой из способов, обеспеченных в данном документе, может включать введение субъекту по меньшей мере одного терапевтического средства, выбранного из противовоспалительного средства, им-муносупрессивного средства, противодиабетического средства, дигоксина, вазодилататора, ингибиторов ангиотензин-П-превращающего фермента (АСЕ), блокаторов рецепторов ангиотензина II (ARB), блока-тора кальциевых каналов, динитрата изосорбида, гидралазина, нитрата, гидралазина, бета-блокатора, натрийуретических пептидов, гепариноида и ингибитора фактора роста соединительной ткани. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой нестероидное противовоспалительное средство, где нестероидное противовоспалительное средство необязательно выбрано из ибупрофена, ингибитора СОХ-1 и ингибитора СОХ-2. В определенных вариантах осуществле
ния иммуносупрессивное средство выбрано из кортикостероида, циклофосфамида и микофенолата мо-фетила. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид, где кортикостероид необязательно представляет собой преднизон. В определенных вариантах осуществления ингибиторы ангиотензин-И-превращающего фермента (АСЕ) выбраны из капто-прила, эналаприла, лизиноприла, беназеприла, хинаприла, фозиноприла и рамиприла. В определенных вариантах осуществления блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB) выбраны из кандесартана, ирбе-сартана, олмесартана, лозартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.
В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой рак. В определенных вариантах осуществления рак является раком печени, раком молочной железы, раком мочевого пузыря, раком предстательной железы, раком толстой кишки, раком легких, раком мозга, гемобластозом, раком поджелудочной железы, раком головы и шеи, раком языка, раком желудка, раком кожи или раком щитовидной железы. В определенных вариантах осуществления рак печени является гепатоклеточной карциномой. В определенных вариантах осуществления рак мозга является мультиформной глиобластомой. В определенных вариантах осуществления гемобластоз является острым миелогенным лейкозом, острым лимфоцитарным лейкозом, острым моноцитарным лейкозом, множественной миеломой, хроническим лимфоцитарным лейкозом, хроническим миелоидным лейкозом, лимфомой Ходжкина или неходжкин-ской лимфомой.
В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают применение по отношению к субъекту по меньшей мере одной дополнительной противораковой терапии. В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой применение средства, вызывающего повреждение ДНК, ингибитора пролиферации, антифолата, ингибитора рецепторов факторов роста, антиангиогенного средства, ингибитора рецепторных тирозинкиназ, ингибитора ки-наз, ингибитора факторов роста, цитотоксического средства, радиотерапию или хирургическое удаление опухоли. В определенных вариантах осуществления средство, вызывающее повреждение ДНК, представляет собой 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевину, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбу-цил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, ида-рубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлорэтамин, мельфалан, митомицин С, митоксантрон, оксалиплатин, темозоломид или топотекан. В определенных вариантах осуществления антифолат представляет собой метотрексат, аминоптерин, тимидилатсинтазу, серингидроксиметилтрансферазу, фолил-полиглутамилсинтетазу, g-глутамилгидролазу, глицинамидрибонуклеотидтрансформилазу, лейковорин, аминоимидазолкарбоксамидрибонуклеотидтрансформилазу, 5-фторурацил или переносчик фолатов. В определенных вариантах осуществления ингибитор рецепторов факторов роста представляет собой эрло-тиниб или гефитиниб. В определенных вариантах осуществления ингибитор ангиогенеза представляет собой бевацизумаб, талидомид, карбоксиамидотриазол, TNP-470, СМ101, IFN-a, тромбоцитарный фак-тор-4, сурамин, SU5416, тромбоспондин, антагонист VEGFR, ингибиторный фактор ангиогенеза, получаемый из хрящевой ткани, ингибитор матриксных металлопротеиназ, ангиостатин, эндостатин, 2-метоксиэстрадиол, текогалан, тетратиомолибдат, пролактин или линомид. В определенных вариантах осуществления ингибитор киназ представляет собой бевацизумаб, BIBW 2992, цетуксимаб, иматиниб, трастузумаб, гефитиниб, ранибизумаб, пегаптапниб, сорафениб, дазатиниб, сунитиниб, эрлотиниб, нило-тиниб, лапатиниб, панитумумаб, вандетаниб, Е7080, пазопаниб, мубритиниб или фостаматиниб.
В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, приводит в результате к уменьшению размера опухолей и/или числа опухолей. В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, предупреждает или задерживает увеличение размера опухолей и/или числа опухолей. В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, предупреждает или замедляет метастатическое прогрессирование. В определенных вариантах осуществления введение субъекту, имеющему рак, увеличивает время общего выживания и/или выживание без прогрес-сирования у субъекта. В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают выбор субъекта с повышенным уровнем сывороточного альфа-фетопротеина и/или повышенным уровнем сывороточного дез-гамма-карбоксипротромбина. В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают снижение уровня сывороточного альфа-фетопротеина и/или сывороточного дез-гамма-карбоксипротромбина. В определенных вариантах осуществления способы, обеспеченные в данном документе, включают выбор животного с аномальной функцией печени.
В любом из способов, обеспеченных в данном документе, субъект является человеком.
В любом из способов, обеспеченных в данном документе, соединение присутствует в виде фармацевтической композиции.
Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в терапии. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в лечении фиброза. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в стимулировании заживления ран. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в лечении рака. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в предупреждении и/или
отсрочке начала метастазирования.
Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в лечении заболевания сердца.
Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для лечения фиброза. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для стимулирования заживления ран. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для лечения рака. Любое из соединений, обеспеченных в данном документе, может быть предназначено для применения в получении лекарственного препарата для предупреждения и/или отсрочки начала метастазирования.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано соотношение альбумина и креатинина в моче (ACR, мкг Alb/мг Cr) в модели ишемии-реперфузии/нефрэктомии (IR/Nx) на мышах, которым вводили соединения на основе анти-miR21, как описано в примере 5.
На фиг. 2 показана экспрессия (А) коллагена 1А1 и (В) коллагена 3А1 в почках в модели UUO на мышах, которым вводили соединения на основе анти-miR21, как описано в примере 6.
Подробное описание
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют то же значение, какое обычно понимает специалист в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Если не приводятся конкретные определения, номенклатура, используемая по отношению к аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии и их способам и методикам, описываемым в данном документе, хорошо известны и широко применяются в данной области техники. В случае если в данном документе имеются несколько определений терминов, преимущество имеют таковые из данного раздела. Для химического синтеза, химического анализа, получения, составления и доставки фармацевтических препаратов и лечения субъектов можно применять стандартные методики. Такие определенные методики и способы можно найти, например, в "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" под редакцией Sangvi и Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994 и в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18-е издание, 1990; и которые включены в данный документ ссылкой для любых целей. В допустимых случаях все патенты, заявки на патенты, опубликованные заявки и публикации, последовательности из GENBANK, веб-сайты и другие опубликованные материалы, на которые ссылаются по всему полному раскрытию в данном документе, если не указано иное, включены ссылкой во всем объеме. Если ссылка делается на URL или другой подобный идентификатор или адрес, то понимают, что такие идентификаторы могут изменяться, и конкретная информация в интернете может изменяться, но путем поиска в интернете можно найти эквивалентную информацию. Ссылки на нее свидетельствуют о доступности и публичном распространении такой информации.
Перед тем как будут раскрыты и описаны настоящие композиции и способы, следует понимать, что терминология, использованная в данном документе, служит только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничивающей. Следует отметить, что использованные в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
Определения.
"Фиброз" означает образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани. В определенных вариантах осуществления фиброз имеет место как репаративный или реактивный процесс. В определенных вариантах осуществления фиброз имеет место в ответ на повреждение или поражение. Выражение "фиброз" следует понимать как образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в качестве репаративного или реактивного процесса, в отличие от образования фиброзной ткани как нормальной составляющей органа или ткани.
"Субъект, предположительно имеющий" означает субъекта, у которого проявляются один или несколько клинических индикаторов заболевания.
"Субъект, предположительно имеющий фиброз" означает субъекта, у которого проявляются один или несколько клинических индикаторов фиброза.
"Фибробласт" означает клетку, которая дает начало образованию соединительной ткани.
"Фибропролиферативное нарушение" означает нарушение, характеризующееся избыточной пролиферацией и/или активацией фибробластов.
"Рак печени" означает злокачественную опухоль печени, либо первичный рак, либо метастазирую-щий рак. В определенных вариантах осуществления рак печени включает, без ограничений, рак, происходящий из гепатоцитов, такой как, например, виды гепатомы и гепатоклеточной карциномы; фиброла-меллярной карциномы и виды холангиокарциномы (или рака желчных протоков).
"Метастазирование" означает процесс, благодаря которому рак распространяется из места, где он
впервые возник как первичная опухоль, в другие места локализации в организме. Метастатическое про-грессирование первичной опухоли отражается в нескольких стадиях, включая отделение от соседних клеток первичной опухоли, выживание в кровотоке и рост в месте вторичной локализации.
"Время общего выживания" означает период времени, в течение которого субъект остается в живых после диагностирования или лечения заболевания. В определенных вариантах осуществления заболевание представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления время общего выживания представляет собой выживание после диагностирования. В некоторых вариантах осуществления время общего выживания представляет собой выживание после начала лечения.
"Выживание без прогрессирования" означает период времени, в течение которого субъект, имеющий заболевание, остается в живых без ухудшения течения заболевания. В определенных вариантах осуществления выживание без прогрессирования определяют путем определения стадии заболевания или проведения его количественной оценки. В определенных вариантах осуществления выживание без прогрессирования у субъекта, имеющего рак печени, определяют путем оценивания размера опухолей, числа опухолей и/или метастазирования.
"Анти-miR" означает олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью, комплементарной микроРНК. В определенных вариантах осуществления анти-miR представляет собой модифицированный олигонуклеотид.
"Анти-miR-X", где "miR-X" обозначает конкретную микроРНК, означает олигонуклеотид с нуклео-тидной последовательностью, комплементарной miR-X. В определенных вариантах осуществления анти-miR-X полностью комплементарна miR-X. В определенных вариантах осуществления анти-miR-X по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90 или по меньшей мере на 95% комплементарна miR-X. В определенных вариантах осуществления анти-miR-X представляет собой модифицированный олигонуклеотид.
"miR-21" означает зрелую микроРНК с нуклеотидной последовательностью UAGCUUAUCA-
GACUGAUGUUGA (SEQ ID NO:1).
"Последовательность miR-21 со структурой типа стебель-петля" означает последовательность со структурой типа стебель-петля с нуклеотидной последовательностью UGUCGGGUAGCUU-
AUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA (SEQ ID NO:2).
"Целевая нуклеиновая кислота" означает нуклеиновую кислоту, с которой предназначено гибриди-зировать олигомерное соединение.
"Нацеливание" означает процесс конструирования и выбора нуклеотидной последовательности, которая будет гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой.
"Нацеленный на" означает с нуклеотидной последовательностью, которая будет позволять осуществлять гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой.
"Захват мишени" означает взаимодействие олигонуклеотида с микроРНК, которой он комплементарен, таким образом, чтобы изменять активность, экспрессию или уровень микроРНК. В определенных вариантах осуществления захват мишени означает взаимодействие анти-miR с микроРНК, которой она комплементарна, таким образом, чтобы ингибировать активность микроРНК.
"Модуляция" означает отклонение функции, количества или активности. В определенных вариантах осуществления модуляция означает увеличение функции, количества или активности. В определенных вариантах осуществления модуляция означает уменьшение функции, количества или активности.
"Экспрессия" означает любые функции и этапы, благодаря которым кодируемая геном информация превращается в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке.
"5'-концевой целевой сайт" означает нуклеиновое основание целевой нуклеиновой кислоты, комплементарное самому крайнему с 3'-конца нуклеиновому основанию конкретного олигонуклеотида.
"3'-концевой целевой сайт" означает нуклеиновое основание целевой нуклеиновой кислоты, комплементарное самому крайнему с 5'-конца нуклеиновому основанию конкретного олигонуклеотида.
"Область" означает часть из связанных нуклеозидов в нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную области целевой нуклеиновой кислоты. Например, в определенных подобных вариантах осуществления олигонуклеотид комплементарен области последовательности микроРНК со структурой типа стебель-петля. В таких определенных вариантах осуществления олигонуклеотид полностью комплементарен области последовательности микроРНК со структурой типа стебель-петля.
"Сегмент" означает меньшую часть или субфрагмент области.
"Нуклеотидная последовательность" означает порядок смежных нуклеиновых оснований в олиго-мерном соединении или нуклеиновой кислоте, как правило, перечисленных в ориентации 5'-3', независимо от какой-либо модификации сахаров, связей и/или нуклеиновых оснований.
"Смежные нуклеиновые основания" означают нуклеиновые основания, непосредственно прилегающие друг к другу в нуклеиновой кислоте.
"Комплементарность нуклеиновых оснований" означает способность двух нуклеиновых оснований к нековалентному спариванию посредством образования водородных связей.
"Комплементарный" означает, что одна нуклеиновая кислота способна гибридизироваться с другой нуклеиновой кислотой или олигонуклеотидом. В определенных вариантах осуществления комплементарный относится к олигонуклеотиду, способному гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой.
"Полностью комплементарный" означает, что каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида способно спариваться с нуклеиновым основанием в каждом соответствующем положении в целевой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид полностью комплементарен микроРНК, т. е. каждое нуклеиновое основание олигонуклеотида комплементарно нуклеиновому основанию в соответствующем положении в микроРНК. В определенных вариантах осуществления олиго-нуклеотид, где каждое нуклеиновое основание обладает комплементарностью по отношению к нуклеиновому основанию в области последовательности микроРНК со структурой типа стебель-петля, полностью комплементарен последовательности микроРНК со структурой типа стебель-петля.
"Процентная комплементарность" означает процентную долю нуклеиновых оснований олигонукле-отида, комплементарных части целевой нуклеиновой кислоты, имеющей такую же длину. Процентную комплементарность вычисляют путем деления числа нуклеиновых оснований олигонуклеотида, комплементарных нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях в целевой нуклеиновой кислоте, на общее число нуклеиновых оснований в олигонуклеотиде.
"Процентная идентичность" означает число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте, идентичных нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях во второй нуклеиновой кислоте, деленное на общее число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте. В определенных вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота представляет собой микроРНК, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой микроРНК.
В определенных вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота представляет собой олиго-нуклеотид, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой олигонуклеотид.
"Гибридизировать" означает гибридизацию комплементарных нуклеиновых кислот, происходящую в результате комплементарности нуклеиновых оснований.
"Несовместимость" означает нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты, неспособное спариваться с нуклеиновым основанием в соответствующем положении второй нуклеиновой кислоты.
"Идентичный" применительно к нуклеотидным последовательностям означает имеющий такую же нуклеотидную последовательность независимо от модификаций сахаров, связей и/или нуклеиновых оснований и независимо от метилированного состояния любых присутствующих пиримидинов.
"МикроРНК" означает эндогенную некодирующую РНК, имеющую длину от 18 до 25 нуклеиновых оснований, являющуюся продуктом расщепления пре-микроРНК с помощью фермента Dicer. Примеры зрелых микроРНК находятся в базе данных микроРНК, известной как miRBase (http://microma.sanger.ac.uk/). В определенных вариантах осуществления микроРНК сокращают как "мик-
роРНК" или "miR".
"Пре-микроРНК" или "пре-miR" означает некодирующую РНК, имеющую шпилечную структуру, являющуюся продуктом расщепления при-miR с помощью рибонуклеазы, специфичной к двуцепочеч-ным РНК, известной как Drosha.
"Последовательность со структурой типа стебель-петля" означает РНК, имеющую шпилечную структуру и содержащую последовательность зрелой микроРНК. Последовательности пре-микроРНК и последовательности со структурами типа стебель-петля могут перекрываться. Примеры последовательностей со структурами типа стебель-петля находятся в базе данных микроРНК, известной как miRBase (http://microrna. sanger. ac .uk/).
"При-микроРНК" или "при-miR" означает некодирующую РНК, имеющую шпильковую структуру, являющуюся субстратом для рибонуклеазы Drosha, специфичной к двуцепочечным РНК.
"Предшественник микроРНК" означает транскрипт, происходящий из геномной ДНК и содержащий некодирующую структурированную РНК, содержащую одну или несколько последовательностей мик-роРНК. Например, в определенных вариантах осуществления предшественник микроРНК представляет собой пре-микроРНК. В определенных вариантах осуществления предшественник микроРНК представляет собой при-микроРНК.
"МикроРНК-регулируемый транскрипт" означает транскрипт, регулируемый с помощью мик-
роРНК.
"Моноцистронный транскрипт" означает предшественник микроРНК, содержащий одну последовательность микроРНК.
"Полицистронный транскрипт" означает предшественник микроРНК, содержащий две или более последовательности микроРНК.
"Затравочная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, содержащую от 6 до 8 смежных нуклеиновых оснований из нуклеиновых оснований 1-9 5'-конца последовательности зрелой микроРНК.
"Соответствующая затравочной последовательности" означает нуклеотидную последовательность, комплементарную затравочной последовательности и имеющую такую же длину, как затравочная последовательность.
"Олигомерное соединение" означает соединение, содержащее несколько связанных мономерных субъединиц. Олигомерные соединения включают олигонуклеотиды.
"Олигонуклеотид" означает соединение, содержащее несколько связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от друга.
"Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь" означает 3'-5'-фосфодиэфирную связь между нуклеозидами.
"Природный сахар" означает сахар, обнаруживаемый в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
"Межнуклеозидная связь" означает ковалентную связь между прилегающими нуклеозидами.
"Связанные нуклеозиды" означают нуклеозиды, соединенные с помощью ковалентной связи.
"Нуклеиновое основание" означает гетероциклический фрагмент, способный к нековалентному спариванию с другим нуклеиновым основанием.
"Нуклеозид" означает нуклеиновое основание, связанное с сахарным фрагментом.
"Нуклеотид" означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
"Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из" ряда связанных нуклеозидов, означает соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, имеющий установленное число связанных нуклеозидов. Таким образом, соединение может включать дополнительные заместители или конъюгаты. Если не указано иное, соединение не включает каких-либо дополнительных нуклеозидов помимо таковых олигонуклеотида.
"Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из" ряда связанных нуклеозидов, означает соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, имеющий установленное число связанных нуклеозидов. Таким образом, соединение может включать дополнительные заместители или конъюгаты. Если не указано иное, соединение не включает каких-либо дополнительных нуклеозидов помимо таковых модифицированного олигонуклеотида.
"Модифицированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, имеющий одну или несколько модификаций в отношении встречающихся в природе конца, сахара, нуклеинового основания и/или межнуклеозидной связи. Модифицированный олигонуклеотид может содержать немодифицированные нуклеозиды.
"Одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид" означает модифицированный олигонукле-отид, не гибридизирующийся с комплементарной цепью.
"Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий любое изменение по сравнению со встречающимся в природе нуклеозидом. Модифицированный нуклеозид может иметь модифицированный сахар и немодифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может иметь модифицированный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. Модифицированный нуклеозид может иметь природный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой бициклический нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой небициклический нуклеозид.
"Модифицированная межнуклеозидная связь" означает любое изменение по сравнению со встречающейся в природе межнуклеозидной связью.
"Фосфотиоатная межнуклеозидная связь" означает связь между нуклеозидами, где один из немос-тиковых атомов является атомом серы.
"Модифицированный сахарный фрагмент" означает замещение и/или любое изменение по сравнению с природным сахаром.
"Немодифицированное нуклеиновое основание" означает встречающиеся в природе гетероциклические основания РНК или ДНК: пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) (включая 5-метилцитозин) и урацил (U).
"5-метилцитозин" означает цитозин, содержащий метальную группу, присоединенную к 5-положению.
"Неметилированный цитозин" означает цитозин, не имеющий метальной группы, присоединенной к 5-положению.
"Модифицированное нуклеиновое основание" означает любое нуклеиновое основание, не являющееся немодифицированным нуклеиновым основанием.
"Фуранозил" означает структуру, содержащую 5-членное кольцо, состоящее из четырех атомов углерода и одного атома кислорода.
"Встречающийся в природе фуранозил" означает рибофуранозил, обнаруженный во встречающейся в природе РНК, или дезоксирибофуранозил, обнаруженный во встречающейся в природе ДНК.
"Сахарный фрагмент" означает встречающийся в природе фуранозил или модифицированный сахарный фрагмент.
"Модифицированный сахарный фрагмент" означает замещенный сахарный фрагмент или заменитель сахара.
"Замещенный сахарный фрагмент" означает фуранозил, не являющийся встречающимся в природе
фуранозилом. Замещенные сахарные фрагменты включают, без ограничений, сахарные фрагменты, содержащие модификации в 2'-положении, 5'-положении и/или 4'-положении встречающегося в природе фуранозила. Определенные замещенные сахарные фрагменты являются бициклическими сахарными фрагментами.
"Заменитель сахара" означает структуру, не содержащую фуранозил и способную заменять встречающийся в природе фуранозил нуклеозида таким образом, чтобы полученный в результате нуклеозид был способен (1) включаться в состав олигонуклеотида и (2) гибридизироваться с комплементарным нуклеозидом. Такие структуры включают относительно простые изменения фуранозила, такие как кольца, содержащие различное число атомов (например, 4-, 6- или 7-членные кольца); замену кислорода фу-ранозила атомом, не являющимся кислородом (например, углеродом, серой или азотом); или как изменение числа атомов, так и замену кислорода. Такие структуры могут также содержать замещения, соответствующие таковым, описанным в отношении замещенных сахарных фрагментов (например, 6-членные карбоциклические бициклические заменители сахара, необязательно содержащие дополнительные заместители). Заменители сахара также включают более сложные замены сахара (например, некольцевые системы пептидной нуклеиновой кислоты). Заменители сахара включают без ограничения морфолино, циклогексенилы и циклогекситы.
"2'-О-метиловый сахар" или "2'-ОМе-сахар" означает сахар, имеющий О-метиловую модификацию в 2'-положении.
"2'-О-метоксиэтиловый сахар" или "2'-МОЕ-сахар" означает сахар, имеющий О-метоксиэтиловую модификацию в 2'-положении.
"2'-О-фтор" или "2'-F" означает сахар, имеющий фтормодификацию в 2'-положении.
"Бициклический сахарный фрагмент" означает модифицированный сахарный фрагмент, содержащий 4-7 членное кольцо (включая без ограничений фуранозил), содержащее мостик, соединяющий два атома 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, что дает в результате бициклическую структуру. В определенных вариантах осуществления 4-7-членное кольцо является кольцом сахара. В определенных вариантах осуществления 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В таких определенных вариантах осуществления мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила.
"Сахарный фрагмент закрытой нуклеиновой кислоты (LNA)" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик (СН2)-Э между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.
"Сахарный фрагмент ENA" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик (СН2)2-O между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.
"Сахарный фрагмент с закрепленным этилом (cEt)" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий мостик СЩСН^Ю между 4' и 2' атомами кольца фуранозы. В определенных вариантах осуществления мостик СЩСН^Ю закреплен в S-ориентации. В определенных вариантах осуществления (СН2)2-О закреплен в R-ориентации.
"S-cEt-сахарный фрагмент" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий S-закрепленный мостик СЩСН^Ю между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.
"R-cEt-сахарный фрагмент" означает замещенный сахарный фрагмент, содержащий R-закрепленный мостик СЩСН^Ю между 4' и 2' атомами кольца фуранозы.
"2'-О-метилнуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-О-метиловую модификацию сахара.
"2'-О-метоксиэтилнуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-О-метоксиэтиловую модификацию сахара. 2'-О-метоксиэтилнуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"2'-фторнуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий 2'-фтормодификацию сахара. 2'-фторнуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"Бициклический нуклеозид" означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий бициклический сахарный фрагмент. Бициклический нуклеозид может иметь модифицированное или немодифицирован-ное нуклеиновое основание.
"cEt-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий cEt-сахарный фрагмент. cEt-нуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"S-cEt-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий S-cEt-сахарный фрагмент.
"R-cEt-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий R-cEt-сахарный фрагмент.
"Небициклический нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий сахар, отличный от бициклического сахара. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид содержит встречающийся в природе сахар. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид содержит модифицированный сахар. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления небициклический нуклеозид представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.
"P-D-дезоксирибонуклеозид" означает встречающийся в природе ДНК-нуклеозид. p-D
дезоксирибонуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание.
"P-D-рибонуклеозид" означает встречающийся в природе РНК-нуклеозид. p-D-рибонуклеозид может содержать модифицированное или немодифицированное нуклеиновое основание. "LNA-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий сахарный фрагмент LNA. "ENA-нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий сахарный фрагмент ENA.
"Мотив" означает паттерн модифицированных и/или немодифицированных нуклеиновых оснований, сахаров и/или межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде. В определенных вариантах осуществления мотив представляет собой нуклеозидный паттерн.
"Нуклеозидный паттерн" означает паттерн модификаций нуклеозидов в модифицированном олиго-нуклеотиде или его области. Нуклеозидный паттерн представляет собой мотив, описывающий расположение модификаций нуклеозидов в олигонуклеотиде.
"Полностью модифицированный олигонуклеотид" означает, что каждое нуклеиновое основание, каждый сахар и/или каждая межнуклеозидная связь модифицированы.
"Единообразно модифицированный олигонуклеотид" означает, что каждое нуклеиновое основание, каждый сахар и/или каждая межнуклеозидная связь имеют одну и ту же модификацию во всем модифицированном олигонуклеотиде.
"Стабилизирующая модификация" означает модификацию нуклеозида, обеспечивающую повышенную стабильность модифицированного олигонуклеотида в присутствии нуклеаз по сравнению с таковой, обеспеченной 2'-дезоксинуклеозидами, связанными фосфодиэфирными межнуклеозидными связями. Например, в определенных вариантах осуществления стабилизирующая модификация представляет собой стабилизирующую модификацию нуклеозида. В определенных вариантах осуществления стабилизирующая модификация представляет собой модификацию межнуклеозидной связи.
"Стабилизирующий нуклеозид" означает нуклеозид, модифицированный с обеспечением повышенной нуклеазной стабильности олигонуклеотиду по сравнению с таковой, обеспеченной 2'-дезоксинуклеозидом. В одном из вариантов осуществления стабилизирующий нуклеозид представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид.
"Стабилизирующая межнуклеозидная связь" означает межнуклеозидную связь, обеспечивающую улучшенную нуклеазную стабильность олигонуклеотида по сравнению с таковой, обеспеченной фосфо-диэфирной межнуклеозидной связью. В одном из вариантов осуществления стабилизирующая межнук-леозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
"Субъект" означает человека или животное, отличное от человека, выбранных для лечения или терапии.
"Субъект, нуждающийся в этом" означает статус, при котором субъекта идентифицируют как нуждающегося в терапии или лечении.
"Субъект, предположительно имеющий" означает субъекта, у которого проявляется один или несколько клинических индикаторов заболевания.
"Введение" означает предоставление субъекту фармацевтического средства или композиции и включает без ограничений введение медицинским работником и самостоятельное введение.
"Парентеральное введение" означает введение посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает без ограничений подкожное введение, внутривенное введение или внутримышечное введение.
"Подкожное введение" означает введение непосредственно под кожу. "Внутривенное введение" означает введение в вену.
"Внутрисердечное введение" означает введение в сердце. В определенных вариантах осуществления внутрисердечное введение происходит с помощью катетера. В определенных вариантах осуществления внутрисердечное введение происходит с помощью операции на открытом сердце.
"Легочное введение" означает введение в легкие.
"Вводимый сопутствующим образом" относится к совместному введению двух средств любым способом, при котором фармакологические эффекты обоих таковых проявляются у пациента одновременно. При сопутствующем введении не требуется, чтобы оба средства вводили в одной фармацевтической композиции, в одной и той же лекарственной форме или используя один и тот же путь введения. Не требуется, чтобы эффекты обоих средств проявлялись в одно и то же время. Требуется только, чтобы эффекты перекрывались в течение определенного периода времени, и не требуется, чтобы они были одинакового протяжения во времени.
"Продолжительность" означает период времени, в течение которого продолжается активность или событие. В определенных вариантах осуществления продолжительность лечения представляет собой период времени, в течение которого вводят дозы фармацевтического средства или фармацевтической композиции.
"Терапия" означает способ лечения заболевания. В определенных вариантах осуществления терапия включает без ограничений химиотерапию, радиотерапию или введение фармацевтического средства.
"Лечение" означает применение одной или нескольких конкретных процедур, применяемых для из
лечения или улучшения течения заболевания. В определенных вариантах осуществления конкретная процедура представляет собой введение одного или нескольких фармацевтических средств.
"Улучшение течения" означает уменьшение тяжести по меньшей мере одного индикатора состояния или заболевания. В определенных вариантах осуществления улучшение течения включает отсрочку или замедление прогрессирования одного или нескольких индикаторов состояния или заболевания. Тяжесть индикаторов может определяться с помощью субъективных или объективных мер, известных специалистам в данной области.
"Подверженный риску развития" означает статус, при котором субъект предрасположен к развитию состояния или заболевания. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития состояния или заболевания, проявляет один или несколько симптомов состояния или заболевания, но не проявляет достаточного числа симптомов, чтобы у него можно было диагностировать состояние или заболевание. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития состояния или заболевания, проявляет один или несколько симптомов состояния или заболевания, но в меньшей степени, чем требуется для диагностирования состояния или заболевания.
"Предупредить начало" означает предупредить развитие состояния или заболевания у субъекта, подверженного риску развития заболевания или состояния. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития заболевания или состояния, получает лечение, подобное лечению, получаемому субъектом, у которого уже есть заболевание или состояние.
"Отсрочить начало" означает отсрочить развитие состояния или заболевания у субъекта, подверженного риску развития заболевания или состояния. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития заболевания или состояния, получает лечение, подобное лечению, получаемому субъектом, у которого уже есть заболевание или состояние.
"Терапевтическое средство" означает фармацевтическое средство, применяемое для излечения, улучшения течения или предупреждения заболевания.
"Доза" означает установленное количество фармацевтического средства, обеспеченного в одном введении. В определенных вариантах осуществления дозу можно вводить в двух или более болюсах, таблетках или инъекциях. Например, в определенных вариантах осуществления, где необходимо подкожное введение, для необходимой дозы требуется объем, который нелегко предоставить посредством одной инъекции. В таких вариантах осуществления можно применять две или более инъекций для достижения необходимой дозы. В определенных вариантах осуществления дозу можно вводить в двух или более инъекциях для того чтобы свести к минимуму реакцию в месте инъекции у индивида. В определенных вариантах осуществления дозу вводят посредством медленной инфузии.
"Единица дозирования" означает форму, в которой обеспечено фармацевтическое средство. В определенных вариантах осуществления единица дозирования представляет собой флакон, содержащий лио-филизированный олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления единица дозирования представляет собой флакон, содержащий восстановленный олигонуклеотид.
"Терапевтически эффективное количество" относится к количеству фармацевтического средства, обеспечивающему терапевтическую пользу животному.
"Фармацевтическая композиция" означает смесь веществ, подходящих для введения индивиду, включающую фармацевтическое средство. Например, фармацевтическая композиция может содержать стерильный водный раствор.
"Фармацевтическое средство" означает вещество, обеспечивающее терапевтический эффект при введении субъекту.
"Активный фармацевтический ингредиент" означает вещество в фармацевтической композиции, обеспечивающее необходимый эффект.
"Улучшенная функция органа" означает изменение функции органа в сторону нормального диапазона значений. В определенных вариантах осуществления функцию органа определяют путем измерения уровня молекул, обнаруживаемых в крови субъекта. Например, в определенных вариантах осуществления улучшенную функцию печени измеряют по уменьшению уровней печеночной трансаминазы в крови.
"Приемлемый профиль безопасности" означает картину побочных эффектов, находящуюся в клинически приемлемых пределах.
"Побочный эффект" означает физиологический ответ, связанный с лечением, отличный от необходимых эффектов. В определенных вариантах осуществления побочные эффекты включают без ограничений реакции в месте инъекции аномалии функциональных проб печени, аномалии почечной функции, гепатотоксичность, нефротоксичность, аномалии центральной нервной системы и виды миопатии. Такие побочные эффекты можно выявить прямо или косвенно. Например, повышенные уровни аминотрансфе-разы в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или аномалию функции печени. Например, повышенный уровень билирубина может указывать на гепатотоксичность или аномалию функции печени.
"Реакция в месте инъекции" означает воспаление или аномальное покраснение кожи в месте инъекции у индивида.
"Податливость субъекта" означает соблюдение субъектом указаний в отношении рекомендованной или назначенной терапии.
"Следовать предписаниям" означает соблюдение субъектом указаний в отношении рекомендованной терапии.
"Рекомендованная терапия" означает лечение, рекомендованное медицинским работником для лечения, улучшения течения, отсрочки или предупреждения заболевания. Обзор.
miR-21 является убиквитарно экспрессирующейся микроРНК, связанной с разнообразными клеточными процессами, включая дифференцировку клеток, пролиферацию, апоптоз и обновление матрикса. Кроме того, miR-21 ассоциирована с несколькими заболеваниями. miR-21 часто регулируется на повышенном уровне при раке, и ингибирование miR-21 показало уменьшение роста опухоли в нескольких моделях рака на животных.
Ингибирование miR-21 в модели гипертрофии сердца на животных показало роль miR-21 в заболевании сердца. Роль в фиброзе была показана в моделях фиброза сердца, фиброза почек и фиброза легких на животных. Изучение ингибирования miR-21 в модели на тканевых эксплантатах проиллюстрировало, что ингибирование miR-21 стимулирует заживление ран. Ингибиторы miR-21 как таковые применимы в разнообразных условиях научных исследований и клинических условиях.
Чтобы идентифицировать сильные ингибиторы miR-21, было создано большое число соединений на основе анти-пЖ-21. Соединения варьировали по длине, а также по числу, размещению и идентичности бициклических нуклеозидов и небициклических нуклеозидов. Исходную серию соединений тестировали в in vitro анализе с применением люциферазы, в котором идентифицировали подгруппу соединений как активные соединения, являющиеся активными соединениями in vitro. Эти in vitro активные соединения затем тестировали в in vivo анализах, чтобы идентифицировать те соединения, которые являются сильными ингибиторами miR-21 in vivo. Из первоначальных in vitro и in vivo этапов скрининга выбирали определенные соединения в качестве основы для создания дополнительных соединений. Экспериментально наблюдаемые корреляции между структурой и активностью (как in vitro, так и in vivo) применяли для информационного обеспечения создания этих дополнительных соединений, с дополнительными изменениями длины, отбора и расположения бициклических и небициклических нуклеозидов. Скрининговые анализы in vitro и in vivo затем повторили в отношении этих дополнительных соединений. Определенные соединения также тестировали на другие свойства, например восприимчивость к активности экзонукле-аз. Наблюдали, что наиболее активные in vitro соединения, являющиеся наиболее активными in vitro, не обязательно были наиболее активными in vivo соединениями, являющимися наиболее активными in vivo, и, дополнительно, что некоторые умеренно активные in vitro соединения, являющиеся умеренно активными in vitro, были высокоактивными соединениями in vivo. Среди 178 соединений, подвергнутых скринингу in vitro в ходе этого способа, 60 идентифицировали как активные в анализе с применением люциферазы. Среди этих 60 активных in vitro соединений идентифицировали подгруппу таковых как активные in vivo. В ходе этого повторяющегося способа создания и скрининга соединений наблюдали, что соединения, имеющие конкретные паттерны модификаций бициклических и небициклических нуклеозидов, были сильными ингибиторами miR-21 in vivo. Эти соединения как таковые применимы для модуляции клеточных процессов, стимулируемых активностью miR-21. Дополнительно, такие соединения применимы для лечения, предупреждения и/или отсрочки начала заболеваний, ассоциированных с miR-21. Такие заболевания могут характеризоваться аномально высокой экспрессией miR-21 по сравнению с образцами, не имеющими заболевания. Такие заболевания включают без ограничений фиброз, острое повреждение почек, гипертрофию сердца, инфаркт миокарда и рак. Дополнительно, композиции и способы, обеспеченные в данном документе, можно применять для стимулирования заживления ран.
Определенные модифицированные олигонуклеотиды, нацеленные на miR-21.
В данном документе обеспечены модифицированные олигонуклеотиды, имеющие определенные паттерны бициклических и небициклических нуклеозидов. Модифицированные олигонуклеотиды с паттернами, идентифицированными в данном документе, являются эффективными ингибиторами активности miR-21.
Каждый из нуклеозидных паттернов, проиллюстрированных в данном документе, показан в ориентации 5'-3'.
В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-22 связанных нуклеозидов, где последовательность модифицированного олигонуклеотида, состоящая из нуклеиновых оснований, комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна I в ориентации 5'-3':
(R)x-NB-NQ-NQ-NB-(NQ-NQ-N0-NB)5-N где каждый R представляет собой небициклический нуклеозид;
X равен от 1 до 4;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид; и каждый NZ представляет собой модифицированный нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 1. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 2. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 3. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 4.
В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна II в ориентации 5-3':
NM-NB-NQ-NQ-NB-(NQ-NQ-NQ-NB)3-№-Nz,
где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклео-зидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид; и
представляет собой модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-22 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна III в ориентации 5'-3':
где каждый R представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4; каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид;
NY представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и каждый NZ представляет собой модифицированный нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III X равен 1. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 2. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III X равен 3. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III X равен 4.
В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна IV в ориентации 5'-3':
NM-NB-NQ-№-NB-(NQ-№-NQ-NB)3-NY-Nz,
где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклео-зидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид;
NY представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и
представляет собой модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна V в ориентации 5'-3':
NM-NB-(NQ-NQ-NB-NVNZ,
где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклео-зидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид; и
представляет собой модифицированный нуклеозид.
Следующие варианты осуществления применяют к любому из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, включая нуклеозидные паттерны I-V.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или 22 смежных нуклеозида нуклеозидно-го паттерна, описанного в данном документе.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1). В определенных вариантах осуществления нуклео-тидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 95% комплементарна (SEQ ID NO:1). В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна (SEQ ID NO:1).
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21, так что положение 1 микроРНК спарено с 3'-концевым нуклеиновым основанием олигонукле-отида. Например
Следует понимать, что в SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 каждый "Т" в последовательности может независимо представлять собой либо нуклеиновое основание "Т", либо нуклеиновое основание "U", и что соединение, имеющее последовательность SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4, может содержать все Т, все U или любую комбинацию U и Т. Таким образом, присутствие "Т" в различных положениях в SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 во всем данном раскрытии и в сопроводительном перечне последовательностей не является ограничивающим по отношению к тому, представляет ли собой конкретное нуклеиновое основание "Т" или "U".
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из LNA-нуклеозида, cEt-нуклеозида и ENA-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления сахарные фрагменты по меньшей мере двух бициклических нуклеозидов отличаются друг от друга. В определенных вариантах осуществления все бициклические нуклеозиды имеют одинаковые сахарные фрагменты. В определенных вариантах осуществления каждый бициклический нуклеозид представляет собой cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления каждый бициклический нуклеозид представляет собой LNA-нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, cEt-нуклеозид представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, cEt-нуклеозид представляет собой R-cEt-нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида, P-D-рибонуклеозида, 2'-О-метилнуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, по меньшей мере два небициклических нуклеозида содержат сахарные фрагменты, отличающиеся друг от друга, и независимо выбраны из P-D-дезоксирибонуклеозида, P-D-рибонуклеозида, 2'-О-метилнуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, по меньшей мере два небициклических нуклеозида содержат сахарные фрагменты, отличающиеся друг от друга, и независимо выбраны из P-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид имеет один и тот же тип сахарного фрагмента и выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида, P-D-рибонуклеозида, 2'-О-метилнуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и 2'-фторнуклеозида.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, каждый небициклический нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления каждый небициклический нуклеозид представляет собой 2'-О-метилнуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, не более 3 небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О
метоксиэтилнуклеозиды. В определенных вариантах осуществления не более 2 небициклических нуклео-зидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды. В определенных вариантах осуществления не более 1 небициклического нуклеозида представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, один небициклический нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ-нуклеозид, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления два небициклических нуклеозида представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления три небициклических нуклеозида представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, самый крайний с 5'-конца небициклический нуклеозид и самый крайний с 3'-конца неби-циклический нуклеозид представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, и каждый другой небицикли-ческий нуклеозид представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид.
В определенных вариантах осуществления любого нуклеозидного паттерна I, где X равен 4, каждый нуклеозид R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I, где X равен 4, два нуклеозида R представляют собой P-D-дезоксирибонуклеозиды, и два нуклеозида R представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I, где X равен 4, три нуклеозида R представляют собой P-D-дезоксирибонуклеозиды, и один нуклеозид R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I R представляет собой NR1-NR2-NR3-NR4, где NR1 представляет собой 2'-МОЕ-нуклеозид, NR2 представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид, NR3 представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид, и NR4 представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I R состоит из четырех связанных нуклеозидов NR1-NR2-NR3-NR4, где NR1 представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид, и каждый из NR2-NR3-NR4 представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 1, и каждый нуклео-зид R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый
представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из T и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна I X равен 4, и каждый нуклео-зид R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый
представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид; и NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4, где каждый Т в последовательности независимо выбран из T и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна II NM представляет собой 2'-О
метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой LNA-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III R представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; и X равен 1. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III R представляет собой модифицированный нуклео-зид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; X равен 1; и каждый NQ представляет собой немоди-фицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III R представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый NQ представляет собой немодифицированный нуклеозид; каждый NB независимо выбран из S-cEt-нуклеозида и LNA-нуклеозида; и NY выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, S-cEt-нуклеозида и LNA-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III R представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бицик-лическим нуклеозидом; Х равен 1; и каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III R представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; каждый NB независимо выбран из S-cEt-нуклеозида и LNA-нуклеозида; и NY выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, S-cEt-нуклеозида и LNA-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III R представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый NQ представляет собой немодифицированный нуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; и NY выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и S-cEt-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна III R представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; Х равен 1; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; и NY выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида, 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и S-cEt-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна III имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB выбран из S-cEt-нуклеозида и LNA-нуклеозида; каждый NQ выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-O-метоксиэтилнуклеозида; NY выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, S-cEt-нуклеозида, LNA-нуклеозида и P-D-дезоксирибонуклеозида; и NZ выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, LNA-нуклеозида и S-cEt-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна IV имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый N выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида; NY выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида, S-cEt-нуклеозида и P-D-дезоксирибонуклеозида; и NZ выбран из 2'-О-метоксиэтилнуклеозида и S-cEt-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна IV имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна IV NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой S-cEt-нуклеозид; и NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна IV имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из T и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V NM представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB выбран из S-cEt-нуклеозида и LNA-нуклеозида; каждый NQ выбран из P-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-O-метоксиэтилнуклеозида; и NZ выбран из 2'-О-метоксиэтил-нуклеозида, LNA-нуклеозида и S-cEt-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна V имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ выбран из 2'-O-метоксиэтилнуклеозида и S-cEt-нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна V имеет состоящую из нуклеиновых оснований последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления нуклеозидного паттерна V NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой P-D-дезоксирибонуклеозид; и NZ представляет собой 2'-O-метоксиэтилнуклеозид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид паттерна V имеет нуклеиновую последовательность SEQ ID NO:3, где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, имеет последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований и модификаций, как показано в табл. 1. Модификации нуклеозидов обозначаются следующим образом: нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают P-D-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "L" представляют собой LNA-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Верхний индекс "Me" означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.
В определенных вариантах осуществления любого из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе, модифицированный олигонуклеотид состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозидный паттерн I. В определенных вариантах осуществления модифицированный олиго-нуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозидный паттерн II. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклео-тид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нук-леозидный паттерн III. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклео-зидный паттерн IV. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна, описанного как нуклеозид-ный паттерн V.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид с любым из нук-леозидных паттернов, описанных в данном документе, содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклео-зидную связь.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотид-ную последовательность, где по меньшей мере одно нуклеиновое основание представляет собой цитозин. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В определенных вариантах осуществления каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание.
Модифицированные олигонуклеотиды могут подвергаться расщеплению экзонуклеазами и/или эн-донуклеазами в разных положениях по всей длине модифицированного олигонуклеотида. Продукты такого ферментативного расщепления могут сохранять ингибирующую активность в отношении miR-21 и как таковые считаться активными метаболитами. Продукт метаболизма модифицированного олигонук-леотида как таковой можно применять в способах, описанных в данном документе.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на miR-21, имеет нуклеозидный паттерн, выбранный из табл. 2А, где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый NB представляет собой бицик-лический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид; и NZ представляет собой модифицированный нуклеозид.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на miR-21, имеет нуклеозидный паттерн, выбранный из табл. 2В, где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый NB представляет собой бицик-лический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид; NY представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид; и NZ представляет собой модифицированный нуклеозид.
Таблица 2В
Продукты метаболизма нуклеозидного паттерна IV
N'J
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на miR-21, имеет нуклеозидный паттерн, выбранный из табл. 2С, где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклеозидом; каждый NB представляет собой бицик
лический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид; и NZ представляет собой модифицированный нуклеозид.
Таблица 2С
Продукты метаболизма нуклеозидного паттерна VII
14М
N*^
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на miR-21, имеет нуклеозидный паттерн и нуклеотидную последовательность, выбранные из табл. 3А. Нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают P-D-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфо-тиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.
Таблица 3А Продукты метаболизма соединения № 25070
N,"
N15
N16
N19
I I 1 I I I I I I ] ] G |Л ] US I A I A ]G I CS I T I ~1
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на
miR-21, имеет нуклеозидный паттерн и нуклеотидную последовательность, выбранные из табл. 3В. Нук-леозиды без последующего нижнего индекса означают P-D-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфо-тиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.
Таблица 3В Продукты метаболизма соединения № 25923
N,"
N12
N,3
N16
N,7
N,"
N1,
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на miR-21, имеет нуклеозидный паттерн и нуклеотидную последовательность, выбранные из табл. 3С. Нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают P-D-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфо-тиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на miR-21, имеет нуклеозидный паттерн и последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований, выбранных из табл. 3D. Нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают P-D-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Нуклеиновые основания могут содержать или не содержать метальную группу в 5'-положении.
Таблица 3D Продукты метаболизма соединения № 25220
Ni,
N,2
N,;
N,7
N18
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из более чем 19 связанных нуклеозидов и содержит нуклеозидный паттерн, описанный в данном документе. Нук-леозиды, присутствующие в дополнение к нуклеозидам, описанным нуклеозидным паттерном, являются
либо модифицированными, либо немодифицированными. Например, модифицированный олигонуклео-тид, состоящий из 21 связанного нуклеозида и имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную miR-21, может иметь нуклеозидный паттерн II длиной 19 связанных нуклеозидов. Дополнительные два нуклеозида могут состоять из модифицированных или немодифицированных сахарных фрагментов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 связанного нуклео-зида и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 23 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 25 связанных нуклеозидов и содержит любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе.
Определенные пути применения настоящего изобретения.
Модуляция активности miR-21.
Соединения, обеспеченные в данном документе, являются сильными и специфичными ингибиторами активности miR-21 и являются, таким образом, применимыми для модулирования активности miR-21.
МикроРНК связываются с матричными РНК и подавляют их экспрессию. В некоторых случаях ин-гибирование активности микроРНК приводит к дерепрессии матричной РНК, т.е. экспрессия матричной РНК повышается на уровне РНК и/или белка. В данном документе обеспечены способы модулирования экспрессии miR-21-регулируемого транскрипта, включающие приведение клетки в контакт с соединением согласно настоящему изобретению, где соединение содержит модифицированный олигонуклеотид с последовательностью, комплементарной miR-21.
В определенных вариантах осуществления miR-21-регулируемый транскрипт представляет собой YOD1, и ингибирование miR-21 приводит в результате к повышению уровня мРНК YOD1. В определенных вариантах осуществления miR-21-регулируемый транскрипт представляет собой PPAR-альфа, и ингибирование miR-21 приводит в результате к повышению уровня мРНК PPAR-альфа. В определенных вариантах осуществления miR-21-регулируемый транскрипт представляет собой RNF167.
В определенных вариантах осуществления miR-21-регулируемый транскрипт представляет собой SPG20. В определенных вариантах осуществления ингибирование miR-21 в печени приводит в результате к повышению уровня мРНК SPG20.
В определенных вариантах осуществления после приведения клетки в контакт с соединением со-ласно настоящему изобретению наблюдают по меньшей мере 1,5-кратное повышение уровня мРНК miR-21-регулируемого транскрипта. В определенных вариантах осуществления после приведения клетки в контакт с соединением согласно настоящему изобретению наблюдают по меньшей мере 2,0-кратное повышение уровня мРНК miR-21-регулируемого транскрипта. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 2,5-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 3,0-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 3,5-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 4,0-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК микроРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 4,5-кратно. В определенных вариантах осуществления уровень мРНК мик-роРНК-регулируемого транскрипта повышается по меньшей мере 5,0-кратно.
Определенные микроРНК, как известно, нацеливаются на несколько матричных РНК, в некоторых случаях на несколько сотен матричных РНК. Ингибирование активности одной микроРНК может привести к выявляемым изменениям экспрессии многих микроРНК-мишеней. В данном документе обеспечены способы модулирования нескольких miR-21-регулируемых транскриптов, включающие ингибиро-вание активности miR-21, где происходят обширные изменения экспрессии генов.
В определенных вариантах осуществления после ингибирования miR-21 с помощью соединения согласно настоящему изобретению могут наблюдаться фенотипические изменения. Такие фенотипические изменения могут происходить с выявляемыми изменениями экспрессии miR-21-регулируемого транскрипта или без них.
Фибропролиферативные нарушения.
Нормальным физиологическим ответом на повреждение или поражение органа или ткани включается восстановление поврежденной ткани, что является фундаментальным биологическим процессом, необходимым для выживания. В ходе процесса восстановления после того как чужеродные материалы,
бактерии и поврежденная ткань устраняются, фибробласты мигрируют в место поражения с отложением нового внеклеточного матрикса, который затем становится структурно организованным, что является частью фазы ремоделирования ткани.
Фибробласты являются наиболее распространенными клетками, обнаруживаемыми в соединительной ткани, и отвечают за синтез ретикулина и других эластических волокон, поддерживающих внеклеточный матрикс и играющих важную роль в нормальном заживлении ран (Sempowski G.D. et al., 2002. Wound Repair Regeneration. 3:120-131). Фибробласты отвечают за отложение коллагена, необходимого для восстановления пораженной ткани и возврата в прежнее состояние ее структуры и функции. В ходе процесса заживления ран активированные фибробласты превращаются в миофибробласты, являющиеся альфа-SMA+фибробластами, секретирующими коллаген. На начальных стадиях процесса заживления ран миофибробласты вырабатывают матриксные металлопротеазы, разрывающие базальную мембрану и позволяющие воспалительным клеткам эффективно мобилизоваться в место поражения. В ходе поздних стадий восстановления после поражения миофибробласты стимулируют закрытие раны, процесс, благодаря которому края раны перемещаются по направлению к центру раны. Таким образом, активность фибробластов является существенной для нормального процесса заживления.
Фибробласты, принимающие участие в нормальном процессе восстановления после поражения, могут происходить из локальных мезенхимальных клеток, мобилизованных из костного мозга, или быть полученными благодаря эпителиально-мезенхимальному переходу. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ) описывает ряд быстрых изменений клеточного фенотипа (Kalluri R. and Neilson E.G. 2003. J. Clin. Invest. 112:1776-1784), во время которых неподвижные эпителиальные клетки утрачивают межклеточные контакты, приобретают мезенхимальные признаки и проявляют миграционный фенотип. Резидентные фибробласты, инфильтрирующие фиброциты или перицитоподобные клетки могут также принимать участие в процессе восстановления после поражения.
В определенных условиях процесс восстановления ткани происходит в избытке, что приводит в результате к избыточному накоплению компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ) и существенному ре-моделированию ЕСМ, что способствует образованию постоянного фиброзного рубца. Образование этой избыточной фиброзной соединительной ткани, процесс, известный как фиброз, способствует аномальным изменениям архитектуры ткани и препятствует нормальной функции органов.
Фиброз может иметь место в любой части организма и может являться результатом разнообразных физических, метаболических, ишемических, инфекционных, воспалительных или иммунологических поражений. Хотя места анатомической локализации, происхождение и клинические проявления фиброза могут различаться, существуют важные патологические признаки, общие для всех типов фиброза. Независимо от места локализации, в котором имеет место фиброз, фиброзный процесс включает секрецию и активацию профибротических цитокинов, рост и активацию популяций мезенхимальных клеток и синтез и организацию внеклеточного матрикса и, в конечном счете, приводит к разрушению нормальной ткани. Фиброз, если его оставить без лечения, может привести к разнообразным состояниям сердца, легких, почек, печени, глаз и кожи, среди других тканей.
Как демонстрируется в данном документе, ингибирование miR-21 в модели фиброза приводит к пониженному отложению коллагена. Соответственно в данном документе обеспечены композиции и способы лечения, предупреждения и/или отсрочки начала фиброза, включающие введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид комплементарен miR-21, субъекту. Субъект с диагнозом "фиброз" может быть подвержен риску развития фиброза или может предположительно иметь фиброз.
В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет фиброз почек, фиброз легких, фиброз печени, фиброз сердца, фиброз кожи, возрастной фиброз, фиброз селезенки, склеродермию или посттрансплантационный фиброз.
Многие заболевания или аномалии почек характеризуются наличием фиброза. Соединения, обеспеченные в данном документе, как таковые применимы для лечения, улучшения течения, предупреждения и/или отсрочки начала развития любого заболевания почек, характеризующегося наличием фиброза. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние почек. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития фиброза, имеет заболевание или состояние почек. В определенных вариантах осуществления субъект, предположительно имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние почек. Соответственно в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фиброз, подверженного риску его развития или предположительно имеющего фиброз, где субъект имеет заболевание или состояние почек. Заболевание или состояние почек может быть одним или несколькими из, без ограничения, поражения нефронов, тубулоинтер-стициального фиброза, IgA-нефропатии, интерстициального фиброза/тубулярной атрофии, гломерулоск-лероза, гломерулонефрита, сахарного диабета, идиопатического фокально-сегментарного гломерулоск-лероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек, сахарного диабета, диабетической нефропатии, хронической рецидивирующей инфекции почек, гипертензии, системной гипертензии, интрагломерулярной гипертензии или терминальной стадии почечной недостаточности.
Хроническое заболевание почек может характеризоваться наличием фиброза. Соответственно в определенных вариантах осуществления заболевание или состояние почек представляет собой хроническое заболевание почек. В определенных вариантах осуществления субъект подвержен риску развития хронического заболевания почек. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий острое повреждение почек, подвержен риску развития фиброза и/или хронического заболевания почек. Соответственно композиции и способы, обеспеченные в данном документе, можно применять в отношении субъекта, имеющего острое повреждение почек, для предупреждения или отсрочки начала развития фиброза и/или хронического заболевания почек.
В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет фиброз почек, возникающий в результате острой или повторной травмы почек. Травма может возникать в результате хирургического вмешательства, химиотерапии, обработки радиоактивным излучением, отторжения аллотранс-плантата, хронического отторжения трансплантата и острого отторжения трансплантата.
В определенных вариантах осуществления фиброз почек может возникать в результате подвергания действию любого средства, которое может быть нефротоксичным, после острого или хронического воздействия. Такие средства включают фармацевтические средства, включая без ограничений аналгетики, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, антибиотики, литий, циклоспорин, меса-лазин, контрастные средства, химиотерапевтические средства; профессиональные токсины, включая без ограничений тяжелые металлы; и токсины окружающей среды, включая без ограничений тяжелые металлы (например, кадмий, хлорид ртути) или растительные нефротоксины (например, аристолохиевая кислота).
Многие заболевания или аномалии печени характеризуются наличием фиброза. Соответственно в определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние печени. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития фиброза, имеет заболевание или состояние печени. В определенных вариантах осуществления субъект, предположительно имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние печени. Соответственно в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фиброз, подверженного риску его развития или предположительно имеющего фиброз, где субъект имеет заболевание или состояние печени. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние печени может быть одним или несколькими, без ограничений, из хронического повреждения печени, инфекционного вирусного гепатита (включая инфекционный вирусный гепатит С и инфекционный вирусный гепатит В), неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), неалкогольный стеатогепатит (NASH), алкогольную болезнь печени (ALD), алкогольный стеатогепатит, мостовидный фиброз или цирроз. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние печени ассоциировано с воздействием токсичных химических веществ. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние печени возникает в результате воздействия фармацевтических средств, например ацетаминофена. В определенных вариантах осуществления субъект, получающий химиотерапию, подвержен риску развития фиброза печени и/или хронического повреждения печени.
Фиброз может присутствовать при многих заболеваниях или аномалиях легких. Соответственно в определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние легких. В определенных вариантах осуществления субъект, подверженный риску развития фиброза, имеет заболевание или состояние легких. В определенных вариантах осуществления субъект, предположительно имеющий фиброз, имеет заболевание или состояние легких. Соответственно в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фиброз, подверженного риску его развития или предположительно имеющего фиброз, где субъект имеет заболевание или состояние легких. В определенных вариантах осуществления заболевание или состояние легких может быть одним или несколькими, без ограничений, из фиброза легких, идиопатического легочного фиброза или хронического обструктивного заболевания легких. В определенных вариантах осуществления фиброз легких может возникать в результате вдыхания частиц вещества, таких как обнаруживаемые в силикагеле, асбесте, загрязнителях воздуха или сигаретном дыме.
В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой фиброз сердца.
В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой фиброз кожи. В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой возрастной фиброз. В определенных вариантах осуществления фиброз представляет собой фиброз селезенки.
Склеродермия представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание, характеризующееся фиброзом наряду с другими симптомами. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий фиброз, имеет склеродермию. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий склеродермию, имеет фиброз внутренних органов в дополнение к фиброзу кожи.
Фиброз часто имеет место в трансплантированных органах, что приводит к потере функции органа и, в конечном счете, к хроническому отторжению трансплантированного органа. Предупреждение или лечение фиброза в трансплантированных органах может предупреждать или задерживать хроническое отторжение трансплантированного органа, или, другими словами, может продлевать функционирование трансплантированного органа. Соответственно в определенных вариантах осуществления субъект имеет
посттрансплантационный фиброз. В определенных вариантах осуществления посттрансплантационный фиброз представляет собой посттрансплантационный фиброз почек. В определенных вариантах осуществления фиброз, ассоциированный с трансплантацией, представляет собой посттрансплантационный фиброз печени. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, вводят перед трансплантацией. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, вводят одновременно с трансплантацией. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в данном документе, вводят после трансплантации.
В данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего фибропролиферативное нарушение. В определенных вариантах осуществления такие способы включают введение субъекту, имеющему или предположительно имеющему фибропролиферативное нарушение, модифицированного олигонуклеотида с нуклеотидной последовательностью, комплементарной микроРНК или ее предшественнику. В определенных вариантах осуществления микроРНК представляет собой miR-21.
Рак и метастазирование.
При многочисленных типах рака демонстрировалась аномально высокая экспрессия miR-21. Дополнительно, ингибирование miR-21 в in vitro и in vivo моделях демонстрировало, что ингибиторы miR-21 применимы для ингибирования клеточных процессов, содействующих росту раковых клеток, а также для лечения рака.
Соответственно в определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены соединения, применяемые для лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала развития рака. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак печени, рак молочной железы, рак легких, рак толстой кишки, рак яичников, рак шейки матки, лейкоз, лимфому, рак мозга, рак пищевода, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак почки, меланому, миелому, рак полости рта, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак прямой кишки, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак щитовидной железы или рак яичка. В определенных вариантах осуществления рак печени представляет собой гепатоклеточную карциному. В определенных вариантах осуществления рак печени связан с метастазированием рака, возникшего в другой части организма, например рака костей, рака толстой кишки или рака молочной железы.
В определенных вариантах осуществления при раке печени уровень miR-21 повышен, и уровень одного или нескольких miR-21-регулируемых транскриптов понижен. В определенных вариантах осуществления miR-21-регулируемый транскрипт, уровень которого понижен, представляет собой SPG20.
В определенных вариантах осуществления рак печени представляет собой гепатоклеточную карциному (НСС). Диагностирование гепатоклеточной карциномы, как правило, производят с помощью визуа-лизационных тестов в отношении печени, таких как ультразвуковое исследование органов брюшной полости, сканирование при помощи спиральной компьютерной томографии (СТ) или сканирование при помощи трехфазной СТ. Такие визуализационные тесты можно выполнять в сочетании с измерением уровней альфа-фетопротеина в крови и/или уровней дез-гамма-карбоксипротромбина в крови. В отношении определенных субъектов можно применять MRI вместо сканирования при помощи СТ. Визуализа-ционные тесты в отношении печени позволяют определять оценку размера, числа, локализации, метаста-зирования опухолей вне печени, раскрытого состояния артерий и вен печени и/или инвазии опухоли в них. Данное определение оценки способствует принятию решения относительно того, какой режим терапевтического или паллиативного вмешательства является подходящим. Окончательный диагноз, как правило, подтверждается с помощью игольной биопсии и патогистологического исследования.
Соответственно в определенных вариантах осуществления рак печени выявляют после сканирования при помощи компьютерной томографии (СТ), выявляющей опухоли. В определенных вариантах осуществления рак печени выявляют после магнитно-резонансной томографии (MRI). В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется одной первичной опухолью. В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется несколькими первичными опухолями. В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется плохо определяемой первичной опухолью с паттерном инфильтрирующего роста. В определенных вариантах осуществления НСС представляет собой одну первичную опухоль с сосудистой инвазией. В определенных вариантах осуществления НСС характеризуется несколькими первичными опухолями с сосудистой инвазией. В определенных вариантах осуществления НСС метастазирует в один или несколько лимфатических узлов. В определенных подобных вариантах осуществления лимфатические узлы являются региональными лимфатическими узлами. В определенных вариантах осуществления НСС метастазирует в одну или несколько отдаленных тканей. В определенных вариантах осуществления НСС метастазирует в другие области печени, воротную вену, лимфатические узлы, надпочечники, кости или легкие. В определенных вариантах осуществления присутствует фиброз.
Использовали ряд систем, чтобы определить прогноз в отношении НСС, включая систему TNM, систему по Окуда, систему Барселонской клиники лечения рака печени (BCLC) и количественный показатель по системе CLIP. Каждая из этих систем включает четыре признака, признаваемые важными детерминантами выживания: тяжесть основного заболевания печени, размер опухоли, распространение опухоли в прилегающие структуры и наличие метастазов. Система TNM классифицирует НСС как стадии I, II, III, IV или V. Система BCLC классифицирует НСС как стадии А1, А2, A3, А4, В, С и D и включает рас
чет количественного показателя тяжести печеночной недостаточности согласно классификации по Чайлд-Пью.
В определенных вариантах осуществления рак печени классифицируют как стадию 1, стадию 2, стадию 3А, стадию 3В, стадию 3С или стадию 4. Стадия 1 характеризуется тем, что раковая опухоль имеет размер не больше 2 см и не начинает распространяться. На стадии 2 раковая опухоль поражает кровеносные сосуды печени или в печени находится более чем одна опухоль. На стадии 3А раковая опухоль имеет размер больше 5 см или распространяется в кровеносные сосуды возле печени. На стадии 3В раковая опухоль распространяется в близлежащие органы, такие как кишечник или желудок, но не распространяется в лимфатические узлы. На стадии 3С раковая опухоль может быть любого размера и распространяться в близлежащие лимфатические узлы. На стадии 4 раковая опухоль распространяется в части организма, расположенные далеко от печени, такие как легкие.
Биомаркеры в крови субъекта можно применять для дополнения диагностирования рака печени, определения стадии рака печени или разработки прогноза в отношении выживания. Такие биомаркеры включают опухолевые биомаркеры крови, такие как альфа-фетопротеин и дез-гамма-карбоксипротромбин. В определенных подобных вариантах осуществления у субъекта повышен уровень альфа-фетопротеина в крови. В определенных подобных вариантах осуществления у субъекта повышен уровень дез-гамма-карбоксипротромбина в крови.
Субъект, имеющий рак печени, также может страдать от аномальной функции печени. Оценку функции печени можно определить с помощью функциональных проб печени, в которых измеряют, помимо прочих параметров, уровни печеночных трансаминаз в крови. В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий аномальную функцию печени, имеет повышенные уровни печеночных тран-саминаз в крови. Печеночные трансаминазы крови включают аланинаминотрансферазу (ALT) и аспарта-таминотрансферазу (AST). В определенных вариантах осуществления субъект, имеющий аномальную функцию печени, имеет повышенный уровень билирубина в крови. В определенных вариантах осуществления субъект имеет аномальные уровни альбумина в крови.
В определенных вариантах осуществления оценку функции печени субъекта определяют по классификационной системе Чайлд-Пью, которая определяет три класса функции печени. В данной классификационной системе баллы присваивают в соответствии с измерениями в одной из пяти категорий: уровни билирубина, уровни альбумина, протромбиновое время, степень асцита и степень энцефалопатии. Один балл присваивают за каждую из следующих имеющихся характеристик: уровень билирубина в крови меньше 2,0 мг/дл; уровень альбумина в крови больше 3,5 мг/дл; протромбиновое время по показателю международного нормализованного отношения (INR) меньше 1,7; асцит отсутствует; или энцефалопатия отсутствует. Два балла присваивают за каждую из следующих имеющихся характеристик: уровень билирубина в крови 2-3 мг/дл; уровень альбумина в крови 3,5-2,8 мг/дл; протромбиновое время по INR 1,7-2,3; асцит от слабого до умеренного или энцефалопатия слабая. Три балла присваивают за каждую из следующих имеющихся характеристик: уровень билирубина в крови больше 3,0 мг/дл; уровень альбумина в крови меньше 2,8 мг/дл; протромбиновое время по INR больше 2,3; асцит от тяжелого до стойкого или энцефалопатия тяжелая. Количественные показатели складывают, и класс А присваивают по количественному показателю 5-6 баллов, класс В присваивают по количественному показателю 7-9 баллов, и класс С присваивают по количественному показателю 10-15 баллов.
Субъект, имеющий рак печени, мог ранее страдать от инфекции хронического гепатита С, инфекции хронического гепатита В, неалкогольной жировой болезни печени или цирроза или может страдать от них в настоящее время. Субъектов, имеющих рак печени, сопровождающийся инфекцией гепатита С, инфекцией гепатита В, неалкогольной жировой болезнью печени или циррозом и/или являющийся их результатом, можно лечить с помощью способов, описанных в данном документе.
Ответ субъекта на лечение можно оценивать с помощью тестов, подобных таковым, применяемым для диагностирования рака печени, включая без ограничений сканирование при помощи СТ, MRI и игольную биопсию. Оценку ответа на лечение можно также определить путем измерения уровней биомаркеров в крови для сравнения с уровнями биомаркеров до лечения.
miR-21 также связана с процессом метастазирования. Хотя ЕМТ имеет место при нормальных физиологических процессах, ЕМТ связан с процессом метастазирования. Значимость ЕМТ в прогрессиро-вании опухолей изучали в нескольких исследованиях (Greenburg G. and Hay E., 1986. Dev. Biol. 115:363379; Boyer В. et al., 1989. J. Cell. Bid. 109:1495-1509; Uehara Y. et al., 1992. J. Cell. Biol. 117: 889-894). Эпителиальные клетки объединяются с помощью интегринов в основной внеклеточный матрикс (ЕСМ), называемый базальной мембраной. Мезенхимальные клетки, с другой стороны, имеют способность инва-зировать и перемещаться по трехмерной структуре ЕСМ. Следовательно, ЕМТ, по меньшей мере, поверхностно напоминает превращение нормальных прилипающих клеток в метастатический фенотип.
В данном документе обеспечены способы лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала метастазирования. Метастазирование может являться результатом миграции раковых клеток из любого первичного очага рака в любой вторичный очаг рака.
Острое повреждение почек.
Острое повреждение почек представляет собой быструю потерю функции почек, которая может
быть вызвана многочисленными причинами, включая низкий объем крови, воздействие токсинов и мочевую обструкцию. В модели острого повреждения почек наблюдали повышенный уровень miR-21. Соответственно в определенных вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, применяют для лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала развития острого повреждения почек. В определенных вариантах осуществления острое повреждение почек может быть результатом воздействия токсичных веществ, таких как токсины окружающей среды или противораковые терапевтические средства. Острое повреждение почек может возникать вследствие повреждения самой почки, например, при состояниях, таких как гломерулонефрит, острый тубулярный некроз и острый интерстициальный нефрит. В определенных вариантах осуществления острое повреждение почек вызвано обструкцией мочеточника, такой как связанная с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, камнями в почках, закупоренным мочевым катетером, камнями в мочевом пузыре, злокачественной опухолью мочевого пузыря, мочеточника или почек. В определенных вариантах осуществления острое повреждение почек может прогрессировать до фиброза и/или хронического заболевания почек. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, вводят субъекту с острым повреждением почек, чтобы предупредить или задержать начало развития фиброза и/или хронического заболевания почек. В некоторых вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, вводят субъекту для того, чтобы усилить восстановление после острого повреждения почек. Заболевания сердца.
При заболевании сердца человека обнаруживали повышенную экспрессию miR-21, и ингибирова-ние miR-21 в соответствующих моделях на животных продемонстрировало улучшения относительно фиброза сердца и функции сердца. Соответственно в определенных вариантах осуществления соединения, обеспеченные в данном документе, применяют для лечения, предупреждения, улучшения течения и/или отсрочки начала развития одного ил нескольких заболеваний сердца. В определенных вариантах осуществления заболевание сердца представляет собой фиброз сердца, увеличение сердца, гипертрофию сердца, расширение сердца, гипертрофическую кардиомиопатию, сердечную недостаточность, ремоде-лирование после инфаркта миокарда, инфаркт миокарда, кардиомиопатию (например, гипертрофическую кардиомиопатию, рестриктивную кардиомиопатию, дилатационную кардиомиопатию (DCM), идиопати-ческую дилатационную кардиомиопатию или дилатационную кардиомиопатию с формами аритмии), диастолическую сердечную недостаточность, хроническую фибрилляцию предсердий, первичную легочную гипертензию, синдром острой дыхательной недостаточности, синдром Бругада, прогрессирующее поражение проводящей системы сердца, уремический перикардит, антрациклиновую кардиомиопатию, артериальный фиброз, лучевой фиброз лимфатических сосудов, саркоидоз, склеродермию, фиброэластоз эндокарда, избыточный серотонинергический эффект, поражение клапанов сердца, фиброз предсердий, фибрилляцию предсердий, митральный порок сердца, гипертензию, хроническую дисфункцию желудочка, перегрузку давлением и объемом или фиброз миокарда.
Клеточные процессы.
В данном документе обеспечены композиции и способы для снижения или предупреждения пролиферации или активации фибробластов. Также в данном документе обеспечены композиции и способы для ингибирования синтеза внеклеточного матрикса, который включает без ограничений синтез коллагена, фибронектина, коллагеназы или тканевого ингибитора металлопротеиназы.
В данном документе обеспечены способы модулирования клеточных процессов, связанных с эпите-лиально-мезенхимальным переходом (ЕМТ). Такие способы включают приведение эпителиальной клетки в контакт с соединением, состоящим из модифицированного олигонуклеотида, где модифицированный олигонуклеотид комплементарен miR-21. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт задерживает переход эпителиальной клетки к фибробласту. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт предупреждает переход эпителиальной клетки к фибробласту.
В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, может останавливать, замедлять или снижать пролиферацию раковых клеток. В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, может индуцировать апоптоз раковых клеток. В определенных вариантах осуществления соединение, обеспеченное в данном документе, может снижать выживание раковых клеток.
В определенных вариантах осуществления эпителиальная клетка представляет собой раковую клетку. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт задерживает метастазирование раковой клетки. В определенных вариантах осуществления приведение в контакт предупреждает метаста-зирование раковой клетки.
Некоторые клинические исходы.
В определенных вариантах осуществления применение соединений или способов, обеспеченных в данном документе, в результате приводит к одному или нескольким клинически желательным исходам у субъекта. Такие улучшения можно применять для определения степени, до которой субъект отвечает на лечение.
В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение
течения фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является замедление дальнейшего прогрессирования фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является остановка дальнейшего прогрессирования фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является ослабление проявлений фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение содержания коллагена в органе, в котором имеется фиброз.
В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение течения фиброза в любом органе или ткани. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является замедление дальнейшего прогрессирования фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является остановка дальнейшего прогрессиро-вания фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является ослабление проявлений фиброза. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение содержания коллагена в пораженном органе.
В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция почек. Оценку функции почек можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение уровня остаточного азота мочевины в крови субъекта; измерение уровня креатинина в крови субъекта; измерение у субъекта клиренса креатинина; измерение у субъекта степени протеинурии; измерение у субъекта соотношения микроальбумин:креатинин; измерение у субъекта количества выделяемой мочи; измерение уровней мРНК молекулы повреждения почек-1 (KIM-1) в моче и/или измерение уровней кластерина в моче.
В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция печени. Оценку функции печени можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение уровней аланинаминотрансферазы в крови субъекта; измерение уровней аспартатаминотрансферазы в крови субъекта; измерение уровней билирубина в крови субъекта; измерение уровней альбумина в крови субъекта; измерение у субъекта протромбинового времени; измерение у субъекта степени асцита и/или измерение у субъекта степени энцефалопатии.
В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция легких у субъекта, имеющего легочный фиброз. В определенных вариантах осуществления субъект имеет идиопатический легочный фиброз. Оценку функции легких можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение у субъекта жизненной емкости легких; измерение у субъекта форсированной жизненной емкости легких; измерение у субъекта объема форсированного выдоха за одну секунду; измерение у субъекта максимальной объемной скорости выдоха; измерение у субъекта скорости форсированного выдоха; измерение у субъекта максимальной произвольной вентиляции легких; определение у субъекта соотношения объема форсированного выдоха за одну секунду и форсированной жизненной емкости легких; измерение у субъекта соотношения вентиляция/перфузия; измерение у субъекта вымывания азота; измерение абсолютного объема воздуха в одном или нескольких легких субъекта и применение теста с 6-минутной ходьбой.
В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшенная функция сердца у субъекта, имеющего фиброз сердца. Оценку функции сердца можно определить с помощью одного или нескольких известных способов, обычно выполняемых в клинических условиях, включая без ограничений измерение у субъекта минутного объема сердца; измерение у субъекта ударного объема сердца; измерение у субъекта средней скорости систолического выброса; измерение у субъекта систолического давления крови; измерение у субъекта фракции выброса левого желудочка; определение у субъекта ударного индекса; определение у субъекта сердечного индекса; измерение у субъекта процентного снижения фракции выброса левого желудочка; измерение у субъекта средней скорости циркулярного укорочения волокон миокарда; измерение у субъекта характера скорости притока крови в левый желудочек; измерение у субъекта характера скорости потока крови через легочные вены; измерение у субъекта пиковой скорости раннего диастолического движения фиброзного кольца митрального клапана.
В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение числа опухолей и/или уменьшение размера опухолей у субъекта, имеющего рак. В определенных вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение числа раковых клеток у субъекта, имеющего рак. Дополнительные клинически желательные исходы включают увеличение времени общего выживания у субъекта и/или увеличение времени выживания без прогрессирования у субъекта. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает увеличение размера опухолей и/или числа опухолей. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает метастатическое прогрессирование. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, замедляет или останавливает метастатическое прогрессирование. В определенных
вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает рецидив опухолей. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, предупреждает рецидив метастазирования опухолей.
Оценку некоторых желательных клинических исходов можно определить с помощью измерений биомаркеров крови. В определенных вариантах осуществления введение соединения, обеспеченного в данном документе, может в результате приводить к снижению уровня альфа-фетопротеина в крови и/или уровня дез-гамма-карбоксипротромбина в крови. Введение соединения, обеспеченного в данном документе, может дополнительно приводить в результате к улучшению функции печени, о чем свидетельствует уменьшение уровней ALT и/или AST в крови.
Некоторые дополнительные терапевтические средства.
Методы лечения фиброза или любого из состояний, перечисленных в данном документе, могут включать применение более чем одного терапевтического средства. Соответственно в определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего или предположительно имеющего фиброз, включающие введение по меньшей мере одного терапевтического средства в дополнение к введению модифицированного олигонуклеотида, имеющего последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований, комплементарную miR-21.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство включает фармацевтическое средство.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противовоспалительные средства. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой стероидное противовоспалительное средство. В определенных вариантах осуществления стероидное противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид. В определенных вариантах осуществления кортикостероид представляет собой преднизон. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. В определенных вариантах осуществления нестероидное противовоспалительное средство представляет собой ибупрофен, ингибитор COX-I или ингибитор СОХ-2.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают иммуносупрес-сивные средства. В определенных вариантах осуществления иммуносупрессивное средство представляет собой кортикостероид, циклофосфамид или мофетил микофенолата.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противодиабети-ческое средство. Противодиабетические средства включают без ограничений бигуаниды, ингибиторы глюкозидазы, инсулины, сульфонилмочевины и тиазолидиндионы.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB). В определенных вариантах осуществления блокатор рецепторов ангиотен-зина II представляет собой кандесартан, ирбесартан, олмесартан, лозартан, валсартан, телмисартан или эпросартан.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают без ограничений диуретики (например, спиронолактон, эплеренон, фуросемид), инотропные препараты (например, добу-тамин, милринон), дигоксин, вазодилататоры, ингибиторы ангиотензин-И-превращающего фермента (АСЕ) (например, представляющие собой каптоприл, эналаприл, лизиноприл, беназеприл, хинаприл, фо-зиноприл и рамиприл), блокаторы кальциевых каналов, динитрат изосорбида, гидралазин, нитраты (например, мононитрат изосорбида, динитрат изосорбида), гидралазин, бета-блокаторы (например, карведи-лол, метопролол) и натрийуретические пептиды (например, несиритид).
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают гепариноиды. В определенных вариантах осуществления гепариноид представляет собой полисульфат пентозана.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой фармацевтическое средство, блокирующее один или несколько ответов на фиброгенные сигналы.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой терапевтическое средство на основе антитела к фактору роста соединительной ткани. В определенных вариантах осуществления терапевтическое средство на основе антитела к CTGF представляет собой моноклональ-ное антитело к CTGF.
В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может представлять собой фармацевтическое средство, усиливающее иммунную систему организма, включая низ-кодозовый циклофосфамид, тимостимулин, витамины и биологически активные добавки (например, ан-тиоксиданты, включая витамины А, С, Е, бета-каротин, цинк, селен, глутатион, коэнзим Q-10 и эхина-цею) и вакцины, например комплекс с иммуностимулирующими свойствами (ISCOM), содержащий вакцинный состав, в котором объединены мультимерная система презентации антигена и адъювант.
В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство выбрано для лечения или улучшения течения побочного эффекта одной или нескольких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Такие побочные эффекты включают без ограничений реакции в месте инъекции, аномалии функциональных проб печени, аномалии почечной функции, токсичность в отношении печени, токсичность в отношении почек, аномалии центральной нервной системы и формы
миопатии. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на токсичность в отношении печени или аномалию функции печени. Например, повышенный уровень билирубина может указывать на токсичность в отношении печени или аномалию функции печени.
Еще одни примеры дополнительных фармацевтических средств включают без ограничений иммуноглобулины, включая без ограничений иммуноглобулин для внутривенного введения (IVIg); аналгетики (например, ацетаминофен); салицилаты; антибиотики; противовирусные средства; противогрибковые средства; модификаторы адренергических рецепторов; гормоны (например, стероидные анаболические средства, андроген, эстроген, кальцитонин, прогестин, соматостатин и тиреоидные гормоны); иммуно-модуляторы; миорелаксанты; антигистаминные средства; средства против остеопороза (например, би-фосфонаты, кальцитонин и эстрогены); простагландины, противоопухолевые средства; психотерапевтические средства; седативные средства; продукты, полученные из сумаха укореняющегося или сумаха лакового; антитела и вакцины.
Методы лечения рака часто включают применение более чем одного терапевтического средства. Соответственно в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы уменьшения или предупреждения метастазирования, включающие введение субъекту соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид комплементарен miR-21, и введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, являющегося средством противораковой терапии.
В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой химиотерапию. Подходящие химиотерапевтические средства включают доцетаксел, циклофосфамид, ифосфамид, метотрексат, винбластин, цисплатин, 5-фторурацил, гемцитабин, доксорубицин, митомицин С, сорафе-ниб, этопозид, карбоплатин, эпирубицин, иринотекан и оксалиплатин. Дополнительное подходящее хи-миотерапевтическое средство включает олигомерное соединение, отличное от композиции, нацеленной на miR-21, обеспеченной в данном документе, которое применяют для лечения рака.
В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой радиотерапию. В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой хирургическое удаление опухоли. В определенных вариантах осуществления средство противораковой терапии представляет собой средство, вызывающее повреждение ДНК, ингибитор пролиферации, антифолат, ингибитор рецепторов факторов роста, антиангиогенное средство, ингибитор рецепторных тирозинкиназ, ингибитор киназ, ингибитор факторов роста или цитотоксическое средство.
В определенных вариантах осуществления средство, вызывающее повреждение ДНК, представляет собой 1,3-бис(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевину, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цис-платин, циклофосфамид, дакарбазин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлорэтамин, мельфалан, митомицин С, митоксантрон, оксалипла-тин, темозоломид или топотекан.
В определенных вариантах осуществления антифолат представляет собой метотрексат, аминопте-рин, тимидилатсинтазу, серингидроксиметилтрансферазу, фолилполиглутамилсинтетазу, гамма-глутамилгидролазу, глицинамидрибонуклеотидтрансформилазу, лейковорин, аминоимидазолкарбок-самидрибонуклеотидтрансформилазу, 5-фторурацил или переносчик фолатов.
В определенных вариантах осуществления ингибитор рецепторов факторов роста представляет собой эрлотиниб или гефитиниб.
В определенных вариантах осуществления ингибитор ангиогенеза представляет собой бевацизумаб, талидомид, карбоксиамидотриазол, TNP-470, СМ101, IFN-a, тромбоцитарный фактор-4, сурамин, SU5416, тромбоспондин, антагонист VEGFR, ингибиторный фактор ангиогенеза, получаемый из хрящевой ткани, ингибитор матриксных металлопротеиназ, ангиостатин, эндостатин, 2-метоксиэстрадиол, те-когалан, тетратиомолибдат, пролактин или линомид.
В определенных вариантах осуществления ингибитор киназ представляет собой бевацизумаб, BIBW 2992, цетуксимаб, иматиниб, трастузумаб, гефитиниб, ранибизумаб, пегаптаниб, сорафениб, даза-тиниб, сунитиниб, эрлотиниб, нилотиниб, лапатиниб, панитумумаб, вандетаниб, Е7080, пазопаниб, муб-ритиниб или фостаматиниб.
Некоторые последовательности микроРНК, состоящие из нуклеиновых оснований.
Модифицированные олигонуклеотиды, имеющие нуклеозидный паттерн, описанный в данном документе, имеют последовательность, состоящую из нуклеиновых оснований, которая комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1) или ее предшественнику (SEQ ID NO:2). В определенных вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида способно подвергаться спариванию оснований с нуклеиновым основанием в каждом соответствующем положении в нуклеотидной последовательности miR-21 или ее предшественника. В определенных вариантах осуществления нуклео-тидная последовательность модифицированного олигонуклеотида может иметь одну или несколько пар оснований с нарушением комплементарности по отношению к нуклеотидной последовательности miR-21 или последовательности предшественника, и остается способной гибридизироваться с ее целевой последовательностью.
Поскольку последовательность miR-21 содержится в последовательности предшественника miR-21,
модифицированный олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную miR-21, также комплементарен области предшественника miR-21.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из числа связанных нуклеозидов, которое равно длине miR-21.
В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного оли-гонуклеотида меньше длины miR-21. Модифицированный олигонуклеотид с числом связанных нуклео-зидов, которое меньше длины miR-21, где каждое нуклеиновое основание модифицированного олиго-нуклеотида является комплементарным каждому нуклеиновому основанию при соответствующем положении miR-21, считается модифицированным олигонуклеотидом с нуклеотидной последовательностью, которая полностью комплементарна области последовательность miR-21. Например, модифицированный олигонуклеотид состоящий из 19 связанный нуклеозидов, где каждое нуклеиновое основание комплементарно соответствующему положению miR-21, которая составляет 22 нуклеиновых оснований в длину, является полностью комплементарным области miR-21 длиной 19 нуклеиновых оснований. Такой модифицированный олигонуклеотид характеризуется приблизительно 86% полной комплементарности к полной длине miR-21, а также характеризуется 100% комплементарности к части miR-21 длиной 19 нуклеиновых оснований.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклео-тидную последовательность, которая является комплементарной затравочной последовательности, т.е. модифицированный олигонуклеотид содержит соответствующую затравочную последовательность. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из шести нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 1-6 miR-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 2-7 miR-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 3-8 miR-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из семи нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из семи нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 1-7 miR-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из семи нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 2-8 miR-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из восьми нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из восьми нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 1-8 miR-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из восьми нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 2-9 miR-21.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклео-тидную последовательность с одним несовпадением по отношению к нуклеотидной последовательности miR-21 или ее предшественнику. В определенных вариантах осуществления модифицированный олиго-нуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с двумя несовпадениями по отношению к нук-леотидной последовательности miR-21 или ее предшественнику. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с не более двумя несовпадениями по отношению к нуклеотидной последовательности miR-21 или ее предшественнику. В таких определенных вариантах осуществления несовпадающие нуклеиновые основания являются смежными. В таких определенных вариантах осуществления несовпадающие нуклеиновые основания не являются смежными.
В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного оли-гонуклеотида больше длины miR-21. В таких определенных вариантах осуществления нуклеиновое основание добавочного нуклеозида является комплементарным нуклеиновому основанию последовательности miR-21 со структурой типа стебель-петля. В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида на одну единицу больше длины miR-21. В таких определенных вариантах осуществления дополнительный нуклеозид находится на 5'-конце олиго-нуклеотида. В определенных таких вариантах осуществления дополнительный нуклеозид находится на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида на две единицы больше длины miR-21. В таких определенных вариантах осуществления два добавочных нуклеозида находятся на 5'-конце олигонуклеотида. В таких определенных вариантах осуществления два добавочных нуклеозида находятся на 3'-конце олигонуклеотида. В таких определенных вариантах осуществления один дополнительный нуклеозид расположен на 5'-конце, и один дополнительный нуклеозид расположен на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления область олигонуклеотида может быть полностью комплементарна нуклеотид-ной последовательности miR-21, но весь модифицированный олигонуклеотид не полностью комплементарен miR-21. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 24 связанных нуклеозидов, где каждое нуклеиновое основание нуклеозидов 1-23 комплементарно соответствующему положению miR-21, которая составляет 22 нуклеиновых оснований в длину, имеет часть из 22 нуклеозидов, которая
полностью комплементарна нуклеотидной последовательности miR-21, и приблизительно 96% полной комплементарности нуклеотидной последовательности miR-21. Некоторые модифицированные олигонуклеотиды.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 8-30 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-30 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-25 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-16 связанный нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19-24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21-24 связанных нуклеозидов.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 8 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 9 связанный нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 10 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 11 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 13 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклео-тид состоит из 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеози-дов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 связанного нуклеозида. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный оли-гонуклеотид состоит из 23 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 25 связанных нуклеозидов.
Нуклеотидные последовательности, изложенные в данном документе, включающие без ограничения те, которые находятся в примерах и в перечне последовательностей, не зависят от любой модификации нуклеиновой кислоты. Поэтому нуклеиновые кислоты, определенные в SEQ ID NO, могут независимо содержать одну или несколько модификаций одного или нескольких остатков сахара, одну или несколько межнуклеозидных связей и/или одно или несколько нуклеиновых оснований.
Хотя в перечне последовательностей, прилагаемом к данной заявке, каждая нуклеотидная последовательность указывается либо как "РНК", либо "ДНК", в соответствии с требованием на практике эти последовательности могут быть модифицированы с помощью любой комбинации химических модификаций. Специалист в данной области техники легко поймет, что такое обозначение как "РНК" или "ДНК" для описания модифицированных олигонуклеотидов носит несколько условный характер. Например, модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеозид, содержащий фрагмент сахара 2'-ОН и ти-миновое основание, может быть описан как ДНК с модифицированным сахаром (2'-ОН для природного 2'-Н ДНК) или как РНК с модифицированным основанием (тимин (метилированный урацил) для природного урацила РНК).
Соответственно нуклеотидные последовательности, обеспеченные в данном документе, включая без ограничения те, которые находятся в перечне последовательностей, предназначены охватить нуклеиновые кислоты, содержащие какую-либо комбинацию природной или модифицированной РНК и/или ДНК, включая без ограничения такие нуклеиновые кислоты с модифицированными нуклеиновыми основаниями. Посредством дополнительного примера и без ограничения олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью "ATCGATCG" охватывает любой олигонуклеотид с такой нуклеотидной последовательностью, либо модифицированной либо немодифицированной, включая без ограничения такие соединения, содержащие РНК-основания, такие как те, которые имеют последовательность "AUCGAUCG", и те, которые имеют несколько ДНК-оснований и несколько РНК-оснований, таких как "AUCGATCG", и олигонуклеотиды с другими модифицированными основаниями, такими как "ATmeCGAUCG," где meC обозначает 5-метилцитозин. Подобным образом, олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью "AUCGAUCG" охватывает любые олигонуклеотиды с такой нуклеотидной последовательностью, либо модифицированной, либо немодифицированной, включая без ограничения такие соединения, содержащие ДНК-основания, такие как те, которые имеют последовательность "ATCGATCG", и те, которые имеют несколько ДНК-оснований и несколько РНК-оснований, таких как "AUCGATCG", и олигонуклео
тиды с другими модифицированными основаниями, такими как "ATmeCGAUCG," где meC обозначает 5-метилцитозин.
Некоторые модификации.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды, обеспеченные в данном документе, могут содержать одну или несколько модификаций нуклеинового основания, сахара и/или межнуклео-зидной связи, и поэтому представляют собой модифицированный олигонуклеотид. Модифицированное нуклеиновое основание, сахар и/или межнуклеозидная связь могут быть выбраны среди немодифициро-ванных форм из-за необходимых свойств, таких как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенное сродство в отношении других мишеней олигонуклеотидов или нуклеиновой кислоты и повышенная стабильность в присутствии нуклеазы.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит один или несколько модифицированных нуклеозидов. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой стабилизирующий нуклеозид. Примером стабилизирующего нуклеозида является нуклеозид с модифицированным сахаром.
В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой нук-леозид с модифицированным сахаром. В таких определенных вариантах осуществления нуклеозиды с модифицированным сахаром могут дополнительно содержать природный или модифицированный фрагмент гетероциклического основания и/или природную или модифицированную межнуклеозидную связь, и могут включать дополнительные модификации независимо от модификации сахара. В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид, где сахарное кольцо модифицировано при 2' атоме углерода из природной рибозы или 2'-дезоксирибозы.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит фрагмент бициклического сахара. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой D-caxap в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой D-caxap в бета-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой L-caxap в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой L-caxap в бета-конфигурации.
В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит мостиковую группу между 2'- и 4' атомами углерода. В таких определенных вариантах осуществления мостиковая группа содержит от 1 до 8 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит от 1 до 4 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит 2 или 3 связанные бирадикальные группы. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит 2 связанные бирадикальные группы. Примеры таких заместителей сахаров по 4'-2' включают без ограничения -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- или -C(RaRb)-O-N(R)-; 4'-СН2-2', 4'-(СН2)2-2', 4'-(СН2)3-2'; 4'-(СН2)-О-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-СН(СН3)-O-2' (cEt) и 4'-СН(СН2ОСН3)-О-2', а также их аналоги (см., например, патент США № 7399845, выданный 15 июля 2008 г.); 4'-С(СН3)(СН3)-О-2' и его аналоги (см., например, WO 2009/006478, опубликованную 8 января 2009 г.); 4'-CH2-N(OCH3)-2' и его аналоги (см., например, WO 2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 г.); 4'-СН2-О-^Ш3)-2' (см., например, US 2004/0171570, опубликованную 2 сентября 2004 г.); 4'-СН2-O-N(R)-2' и 4'-CH2-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или С1-С12алкил; 4'-CH2-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, С1-С12алкил или защитную группу (см. патент США № 7427672, выданный 23 сентября 2008 г.); 4'-СН2-С(Н)(СН3)-2' (см., например, Chattopadhyaya, et al., J. Org Chem., 2009, 74, 118-134) и 4'-CH2-C(=CH2)-2', а также его аналоги (см., опубликованную международную заявку РСТ WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 г.).
В определенных вариантах осуществления такие 4'-2' мостики независимо содержат 1 или 2-4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- и -N(Ra)-;
где x равен 0, 1 или 2;
n равен 1, 2, 3 или 4;
каждый Ra и Rb независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, С1-С12алкил, замещенный С1-С12алкил, С2-С12алкенил, замещенный С2-С12алкенил, С2-С12алкинил, замещенный С2-С12алкинил, С5-С20арил, замещенный С6-С20арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С5-С7алициклический радикал, замещенный С5-С7алициклический радикал, галоген, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, ацил (C(=O)-H), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)2-J1), или сульфоксил (S(=O)-J1); и каждый J1 и J2 независимо представляет собой Н, С1-С12алкил, замещенный С1-С12алкил, С2-С12алкенил, замещенный С2-С12алкенил, С2-С12алкинил, замещенный С2-С12алкинил, С5-С20арил, замещенный ^-С^арил, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, С1-С12аминоалкил, замещенный С1-С12аминоалкил или защитную группу.
Нуклеозиды, содержащие такие остатки бициклического сахара, называют бициклическими нук-леозидами или BNA. В определенных вариантах осуществления бициклические нуклеозиды включают без ограничения (А) a-L-метиленокси (4'-СН2-О-2') BNA; (В) p-D-метиленокси (4'-СН2-О-2') BNA; (С)
этиленокси (4'-(СН2)2-О-2') BNA; (D) аминоокси (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA; (Е) оксиамино (4'-CH2-N(R)-O-
2') BNA; (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН3)-О-2') BNA (также называемый связанный этил или cEt); (G) метилен-тио (4'-CH2-S-2') BNA; (Н) метилен-амино (4'-CH2-N(R)-2') BNA; (I) метил-карбоциклический (4'-СН2-СН(СН3)-2') BNA; (J) c-MOE (4'-CH2-OMe-2') BNA и (К) пропилен-карбоциклический (4'-(СН2)3-2') BNA, как изображено ниже
где Вх представляет собой фрагмент нуклеинового основания, и R независимо представляет собой Н, защитную группу или С1-С12алкил.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из галогена, аллила, амино, азидо, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, О-, S- или N(Rm)-алкила; O-, S- или N(Rm)-алкенила; O-, S- или N(Rm)-алкинила; O-алкиленил-О-алкила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила, О-аралкила, O(CH2)2SCH3,O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) или O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой Н, защитную аминогруппу или замещенный или незамещенный Q-Qc^raui. Такие 2'-замещающие группы могут быть дополнительно замещены одной или несколькими замещающими группами, независимо выбранными из гидроксила, амино, алкок-си, карбокси, бензила, фенила, нитро (NO2), тиола, тиоалкокси (S-алкил), галогена, алкила, арила, алке-нила и алкинила.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из F, NH2, N3, OCF3, O-CH3, O(CH2)3NH2, CH2-СН=СН2, О-СН2-СН=СН2, ОСН2СН2ОСН3, O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2 и N-замещенного ацетамида (O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый Rm и Rn независимо представляет собой Н, защитную аминогруппу или замещенный или незамещенный C1-С10алкил.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-
замещающую группу, выбранную из F, OCF3, O-CH3, ОСН2СН2ОСН3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(CH3)2, -O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2 и O-CH2-C(=O)-N(H)CH3.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из F, О-СН3 и ОСН2СН2ОСН3.
В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-2'-модифицированный нуклеозид. 4'-Тио-модифицированный нуклеозид содержит p-D-рибонуклеозид, где 4'-O заменен 4'-S. 4'-Тио-2'-модифицированный нуклеозид представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид, содержащий 2'-ОН, замененный 2'-замещающей группой. Подходящие 2'-замещающие группы включают 2'-ОСН3, 2'-
О-(СН2)2-ОСН3 и 2'-F.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одну или несколько межнуклеозидных модификаций. В таких определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозид-ная связь содержит атом фосфора.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь не содержит атом фосфора. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется меж-нуклеозидной связью на основе короткоцепочечного алкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется межнуклеозидной связью на основе циклоалкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется смешанной межнуклеозидной связью на основе гетероатома и алкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозид-ная связь образуется смешанной межнуклеозидной связью на основе гетероатома и циклоалкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется одной или несколькими ко-роткоцепочечными гетероатомными межнуклеозидными связями. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется одной или несколькими гетероциклическими межнуклео-зидными связями. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь имеет амид-ный скелет. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь содержит смешанные составные части на основе N, О, S и СН2.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит один или несколько 5-метилцитозинов. В определенных вариантах осуществления каждый цитозин модифицированного олигонуклеотида содержит 5-метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5-гидроксиметил-цитозина, 7-деазагуанина и 7-деазааденина. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 7-деазааденина, 7-деазагуанозина, 2-аминопиридина и 2-пиридона. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5-замещенных пиримидинов, 6-азапиримидинов и N-2, N-6 и O-6 замещенных пуринов, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит полициклический гетероцикл. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит трициклический гетероцикл. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит производное феноксазина. В определенных вариантах осуществления феноксазин может быть дополнительно модифицирован с образованием нуклеинового основания, известного из уровня техники как G-clamp.
Некоторые фармацевтические композиции.
В данном документе обеспечены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления такие фармацевтические композиции применяют для лечения нарушения обмена веществ и связанных состояний. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-30 связанных нуклеозидов и содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную miR-21 или ее предшественнику. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 8-30 связанных нуклеозидов и содержащего нуклеотидную последовательность, комплементарную miR-21 или ее предшественнику.
Подходящие пути введения включают без ограничения пероральный, ректальный, чресслизистый, интестинальный, энтеральный, местный, в виде суппозиториев, посредством ингаляции, интратекаль-ный, интракардиальный, интравентрикулярный, интраперитонеальный, интраназальный, интраокуляр-ный, внутриопухолевый и парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, внутримозго-вой и подкожный). В определенных вариантах осуществления фармацевтические препараты для интра-текального введения вводят для достижения локальных, а не системных воздействий. Например, фармацевтические композиции могут вводить непосредственно на участок необходимого эффекта (например, в печень).
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят в форме единицы дозирования (например, таблетки, капсулы, болюса и т. п.). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид при дозе в пределах диапазона, выбранного из 25-800 мг, 25-700 мг, 25-600 мг, 25-500 мг, 25-400 мг, 25-300 мг, 25-200 мг, 25-100
мг, 100-800 мг, 200-800 мг, 300-800 мг, 400-800 мг, 500-800 мг, 600-800 мг, 100-700 мг, 150-650 мг, 200600 мг, 250-550 мг, 300-500 мг, 300-400 мг и 400-600 мг. В определенных вариантах осуществления такие фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид в дозе, выбранной из 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155,
160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 270, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375,
380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795 и 800 мг. В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит дозу модифицированного олигонуклеотида, выбранную из 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 и 800 мг.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическим средством является стерильный лио-филизированный модифицированный олигонуклеотид, который перерастворяют подходящим растворителем, например стерильной водой для инъекций или стерильным солевым раствором для инъекций. Пе-рераствренный продукт вводят в виде подкожной инъекции или в виде внутривенной инфузии после разбавления в солевом растворе. Продукт лиофилизированного лекарственного средства состоит из модифицированного олигонуклеотида, который был приготовлен в воде для инъекций или в солевом растворе для инъекций, доведенный до рН 7,0-9,0 с помощью кислоты или основания во время приготовления, и затем лиофилизирован. Лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид может составлять 25800 мг олигонуклеотида. Понятно, что диапазон включает 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250,
275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 и 800 мг
модифицированного лиофилизированного олигонуклеотида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид представляет собой количество оли-гонуклеотида в пределах диапазона, выбранного из 25-800 мг, 25-700 мг, 25-600 мг, 25-500 мг, 25-400 мг, 25-300 мг, 25-200 мг, 25-100 мг, 100-800 мг, 200-800 мг, 300-800 мг, 400-800 мг, 500-800 мг, 600-800 мг, 100-700 мг, 150-650 мг, 200-600 мг, 250-550 мг, 300-500 мг, 300-400 мг и 400-600 мг. Продукт лиофилизированного лекарственного средства может быть упакован в 2 мл флакон типа I из прозрачного стекла (обработанный сульфатом аммония), закрытый пробкой из бромбутиловой резины и уплотненный алюминиевой крышкой FLIP-OFF(r).
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, обеспеченные в данном документе, могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно находящиеся в фармацевтических композициях, при их уровнях применения, установленных в области техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически-активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или может содержать дополнительные материалы, применяемые при физическом составлении различных лекарственных форм композиций согласно настоящему изобретению, такие как красители, ароматизирующие средства, консерванты, антиоксиданты, замут-няющие средства, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении не должны чрезмерно препятствовать биологическим активностям компонентов композиции настоящего изобретения. Составы могут стерилизовать и, при необходимости, смешивать с вспомогательными средствами, например смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, отдушками и/или ароматическими веществами и т. п., которые не оказывают вредного воздействия на оли-гонуклеотид(ы) состава.
Липидные фрагменты применялись при различных видах терапии нуклеиновыми кислотами в разнообразных способах. В одном способе нуклеиновую кислоту вводят в предварительно сформированные липосомы или липоплексы, полученные из смесей катионных липидов и нейтральных липидов. В другом способе ДНК-комплексы с моно- или поликатионными липидами образуются без присутствия нейтральных липидов. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в определенной клетке или ткани. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в жировой ткани. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в мышечной ткани.
В определенных вариантах осуществления INTRALIPID применяют для получения фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид. INTRALIPID является жировой эмульсией, полученной для внутривенного введения. В ее составе содержится 10% соевого масла, 1,2% фосфолипидов яичного желтка, 2,25% глицерина и вода для инъекций. К тому же гидроксид натрия добавляли для доведения рН так, чтобы конечный рН продукт находился в диапазоне 6-8,9.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит соединение полиамина или липидный фрагмент, образующий комплекс с нуклеиновой кислотой. В определенных вариантах осуществления такие препараты содержат одно или несколько соединений, каждое в отдельности имеющее структуру, определенную формулой (Z), или их фармацевтически приемлемую соль
где каждый Ха и Xb для каждого случая независимо представляют собой С1-6алкилен; n равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; каждый R независимо представляет собой Н, где по меньшей мере n+2 R-фрагментов в по меньшей мере приблизительно 80% молекул соединения формулы (Z) в препарате не является Н; m равно 1, 2, 3 или 4; Y представляет собой О, NR2 или S; R1 представляет собой алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими заместителями; и R2 представляет собой Н, алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими заместителями; при условии, что если n=0, тогда по меньшей мере n+3 R-фрагментов не являются Н. Такие препараты описаны в публикация РСТ WO/2008/042973, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме для раскрытия липидных препаратов. Некоторые дополнительные препараты описаны в Akinc et al., Nature Biotechnology 26, 561 -569 (1 мая 2008 г.), которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме для раскрытия липидных препаратов.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, обеспеченные в данном документе, содержат один или несколько модифицированных олигонуклеотидов и один или несколько наполнителей. В таких определенных вариантах осуществления наполнители выбирают из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, обеспеченную в данном документе, получают с использованием известных способов, включая без ограничения способы смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, отмучивания, эмульгирования, помещения в капсулы, захватывания или таблетирования.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, представляет собой жидкость (например, суспензию, крепкий настой и/или раствор). В таких определенных вариантах осуществления жидкую фармацевтическую композицию получают с использованием ингредиентов, известных из уровня техники, включая без ограничения воду, гликоли, масла, спирты, ароматизирующие средства, консерванты и красящие вещества.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, представляет собой твердое вещество (например, порошок, таблетку и/или капсулу). В таких определенных вариантах осуществления твердую фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько олигонуклеотидов, получают с использованием ингредиентов, известных из уровня техники, включая без ограничения крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связующие и средство для улучшения распадаемости таблеток.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, составлена в виде депо-препарата. Некоторые такие депо-препараты, как правило, являются длительно действующими по сравнению с препаратами, не относящимися к депо-препаратам. В определенных вариантах осуществления такие препараты вводят путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. В определенных вариантах осуществления депо-препараты получают с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, эмульсия в подходящем масле), или ионообменных смол, или в виде труднорастворимых производных, например в виде труднорастворимой соли.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит систему доставки. Примеры систем доставки включают без ограничения липосомы и эмульсии. Некоторые системы доставки применяют для получения некоторых фармацевтических композиций, включая такие, которые содержат гидрофобные соединения. В определенных вариантах осуществления используют некоторые органические растворители, например диметилсульфоксид.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит один или несколько тканеспецифических молекул для доставки, разработанные для доставки одного или нескольких фармацевтических средств согласно настоящему изобретению к конкретному типу ткани или клетки. Например, в определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифическим антителом.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит систему сорастворителей. Некоторые такие системы сорастворителей содержат, например, бензиловый спирт, неполярное поверхностно-активное вещество, водорастворимый органический полимер и водную фазу. В определенных вариантах осуществления такую систему сорастворителей применяют для гидрофобных соединений. Неограничивающим примером такой системы сорастворите-лей является система сорастворителей VPD, которая представляет собой раствор абсолютного этанола, содержащего 3% вес./об., бензилового спирта, 8% вес./об. неполярного поверхностно-активного вещества Polysorbate 80(tm) и 65% вес./об. полиэтиленгликоля 300. Пропорции таких систем сорастворителей могут варьироваться существенно без значительного изменения их характеристик растворимости и токсичности. Кроме того, идентичность компонентов сорастворителей может изменяться, например, вместо Polysorbate 80(tm) могут применять другие поверхностно-активные вещества; размер фракции полиэти-ленгликоля может изменяться; другие биосовместимые полимеры могут заменять полиэтиленгликоль,
например, поливинил пирролидоном; а также другие сахара или полисахариды могут замещать декстрозы.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит систему замедленного высвобождения. Неограничивающий пример такой системы замедленного высвобождения представляет собой полупроницаемую матрицу твердых гидрофобных полимеров. В определенных вариантах осуществления системы замедленного высвобождения могут в зависимости от их химической природы высвобождать фармацевтические средства в течение часов, дней, недель или месяцев.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, обеспеченную в данном документе, получают для перорального введения. В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию составляют путем комбинирования одного или нескольких соединений, содержащих модифицированный олигонуклеотид, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Такие определенные носители позволяют составлять фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и т. п. для перораль-ного приема внутрь субъектом. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального применения получают путем смешивания олигонуклеотида и одной или нескольких сред. Подходящие среды включают без ограничения наполнитель, такой как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагантовую камедь, метилцеллю-лозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон (PVP). В определенных вариантах осуществления такая смесь необязательно является измельченной и необязательно добавляют вспомогательное средство. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции образуют с получением таблетки или ядер драже. В определенных вариантах осуществления добавляют средства для улучшения распадаемости таблеток (например, поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соль, такую как альгинат натрия).
В определенных вариантах осуществления на ядрах драже предусматривается покрытие. В таких определенных вариантах осуществления могут применять концентрированные сахарные растворы, которые необязательно могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбопол-гель, поли-этиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В таблетки или покрытия драже могут добавлять красящие вещества или пигменты.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального введения находятся в твердых капсулах из двух частей, изготовленных из желатина. Некоторые такие твердые капсулы из двух частей содержат одно или несколько фармацевтических средств согласно настоящему изобретению в смеси с одной или несколькими средами для лекарства, такими как лактоза, связующими, такими как крахмалы, и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального введения находятся в мягких герметизированных капсулах, изготовленных из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. В некоторых мягких капсулах одно или несколько фармацевтических средств согласно настоящему изобретению растворяют или суспендируют в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. К тому же могут добавляться стабилизаторы.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции получают для буккаль-ного введения. Некоторые такие фармацевтические композиции представляют собой таблетки или пастилки, составленные традиционным способом.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают для введения путем инъекции (например, внутривенный, подкожный, внутримышечный и т. д.). В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит носитель и составлена в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хенкса, раствор Рин-гера, или физиологический солевой буфер. В определенных вариантах осуществления включают другие ингредиенты (например, ингредиенты которые способствуют растворимости или служат в качестве консервантов). В определенных вариантах осуществления инъецируемые суспензии получают с применением подходящих жидких носителей, суспендирующих средств и т. п. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представлены в стандартной лекарственной форме, например в ампулах или в многодозных контейнерах. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций являются суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных средах и могут содержать средства для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Некоторые растворители, подходящие для применения в фармацевтической композиции для инъекций, включают без ограничения липофильные растворители и жирные масла, такие как кунжутное масло, сложные эфи-ры синтетической жирной кислоты, такие как этилолеат или триглицериды, и липосомы. Водная суспензии для инъекции может содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно такие суспензии могут также содержать
подходящие стабилизаторы или средства, которые повышают растворимость фармацевтических средств, что позволяет получение высококонцентрированных растворов.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для чрессли-зистого введения. В таких определенных вариантах осуществления применяют в составе смачивающие средства, соответствующие барьеру, через который проходят. Такие смачивающие средства, как правило, известны из уровня техники.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для введения путем ингаляции. Некоторые из таких фармацевтических композиций для ингаляции получают в форме аэрозоля в упаковке, находящейся под давлением, или распылителя. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат распыляющее средство, например дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или другой подходящий газ. В определенных вариантах осуществления при применении аэрозоля, находящегося под давлением, единица дозирования может определяться с помощью клапана, который доставляет измеренное количество. В определенных вариантах осуществления могут быть составлены капсулы и гильзы для применения в ингаляторе или инсуффляторе. Некоторые из таких составов содержат порошкообразную смесь фармацевтического средства согласно настоящему изобретению и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для ректального введения, например суппозитории или удерживающую клизму. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат известные ингредиенты, такие как масло какао и/или другие глицериды.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для наружного введения. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат мягкие увлажняющие основы, такие как мази или кремы. Иллюстративный пример подходящих мазевых основ включает без ограничения вазелин, вазелин с летучими силиконами, а также ланолин и воду в масляных эмульсиях. Иллюстративный пример подходящих основ на основе крема включают без ограничения кольдкрем и гидрофильную мазь.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит модифицированный олигонуклеотид в терапевтически эффективном количестве. В определенных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество является достаточным для предупреждения, облегчения или уменьшения интенсивности симптомов заболевания или для продления выживания субъекта, подвергающегося лечению. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах возможности специалиста в данной области техники.
В определенных вариантах осуществления один или несколько модифицированных олигонуклеоти-дов, обеспеченных в данном документе, составляют в виде пролекарства. В определенных вариантах осуществления при введении in vivo пролекарства химически превращаются в биологически, фармацевтически или терапевтически более активную форму олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления применяют пролекарства, поскольку они являются более простыми для введения, чем соответствующая активная форма. Например, в некоторых случаях пролекарство может быть более биодоступным (например, посредством перорального введения), чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях пролекарство может обладать улучшенной растворимостью по сравнению с соответствующей активной формой. В определенных вариантах осуществления пролекарства менее водорастворимы, чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях такие пролекарства обладают превосходной передачей через клеточные мембраны, где водорастворимость пагубно воздействует на подвижность. В определенных вариантах осуществления пролекарство представляет собой сложный эфир. В таких определенных вариантах осуществления сложный эфир метаболически гидролизуется в карбоновую кислоту при введении. В определенных случаях карбоновая кислота, содержащаяся в соединении, находится в соответствующей активной форме. В определенных вариантах осуществления пролекарство содержит короткий пептид (полиаминокислоту), связанный с кислотной группой. В таких определенных вариантах осуществления пептид расщепляется при введении с образованием соответствующей активной формы.
В определенных вариантах осуществления пролекарство получают путем модифицирования фармацевтически активного соединения так, чтобы активное соединение образовывалось при введении in vivo. Пролекарство может быть разработано, чтобы изменять метаболическую стабильность или транспортные характеристики лекарственного средства, защитить от побочных эффектов или токсичности, для улучшения аромата лекарственного средства или изменения других характеристик или свойств лекарственного средства. В силу знания фармакодинамических процессов и метаболизма лекарственного средства in vivo специалист в данной области техники, как только фармацевтически активное соединение стало известно, может разработать пролекарства соединения (см., например, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392).
Некоторые пути введения.
В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает парентеральное введение. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает внутривенное введение. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает подкожное введение.
В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает внутриартериальное введе
ние. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает интракардиальное введение. Подходящие средства для интракардиального введения включают применение катетера или введение во время операции на открытом сердце. В определенных вариантах осуществления введение включает применение стента.
В определенных вариантах осуществления введение включает пульмональное введение. В определенных вариантах осуществления пульмональное введение включает доставку аэрозолизованного олиго-нуклеотида в легкое субъекта путем ингаляции. После ингаляции субъектом аэрозолизованного олиго-нуклеотида олигонуклеотид распределяется в клетках как нормальной, так и воспаленной легочных тканей, включая альвеолярные макрофаги, эозинофилы, эпителий, эндотелий кровеносных сосудов и брон-хиолярный эпителий. Подходящее устройство для доставки фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, включает без ограничения стандартное распылительное устройство. Составы и способы модуляции размера капель при применении распылительных устройств для нацеливания на конкретные участки дыхательного пути и легких хорошо известны специалистам в данной области техники. Дополнительные подходящие устройства включают ингаляторы сухого порошка или ингаляторы с измеренной дозой.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции вводят для достижения локальных, а не системных воздействий. Например, при пульмональном введении фармацевтическую композицию доставляют в легкое с минимальным системным воздействием.
Дополнительные подходящие пути введения включают без ограничения пероральный, ректальный, чресслизистый, интестинальный, энтеральный, местный, посредством суппозиториев, интратекальный, интравентрикулярный, интраперитонеальный, интраназальный, интраокулярный, внутримышечный, внутримозговой и внутриопухолевый.
Некоторые соединения.
В данном документе обеспечены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид с определенными нуклеозидными паттернами, и применения таких соединений для модуляции активности, уровня или экспрессии целевой нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид. В таких определенных вариантах осуществления соединение состоит из олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид является комплементарным небольшой некодирующей РНК. В определенных вариантах осуществления небольшая некодирующая РНК является miR-21.
В таких определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олиго-нуклеотид, гибридизированный с комплементарной цепью, т. е. соединение содержит двухцепочечное олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления при гибридизации модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью образуется по меньшей мере один тупой конец. В таких определенных вариантах осуществления гибридизация модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью образуется тупой конец на каждом конце двухцепочечного олигомерного соединения. В определенных вариантах осуществления конец модифицированного олигонуклеотида содержит один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов по отношению к количеству связанных нуклео-зидов комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных нуклеозидов находятся на 5'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных нуклеозидов находятся на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одно нуклеиновое основание нуклеозида одного или нескольких добавочных нуклеозидов комплементарно целевой РНК. В определенных вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание каждого одного или нескольких дополнительных нуклеозидов комплементарно целевой РНК. В определенных вариантах осуществления конец комплементарной цепи содержит один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов по отношению к количеству связанных нуклеозидов олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов находятся на 3'-конце комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов находятся на 5'-конце комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления два дополнительных связанных нуклеозида являются связанными с концом. В определенных вариантах осуществления один дополнительный нуклеозид является связанным с концом.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклео-тид, сопряженный с одним или несколькими фрагментами, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученных в результате антисмысловых олигонуклеотидов. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой фрагмент холестерина. В определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой липидный фрагмент. Дополнительные фрагменты для конъюгации включают карбогидраты, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флюоресцеины, родамины, кумарины и красители. В определенных вариантах осуществления сопряженная группа присоединена непосредственно к олигонуклеотиду. В определенных вариантах осуществления сопряженная группа присоединена к модифицированному олиго
нуклеотиду с помощью связывающего фрагмента, выбранного из амино, гидроксила, карбоновой кислоты, тиола, ненасыщенностей (например, двойных или тройных связей), 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (ADO), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC), 6-аминогексановой кислоты (АНЕХ или AHA), замещенного C1-С10алкила, замещенного или незамещенного С2-С10алкенила и замещенного или незамещенного С2-С10алкинила. В таких определенных вариантах осуществления замещающая группа выбрана из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро, тиола, тиоалкокси, галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
В таких определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олиго-нуклеотид, содержащий одну или несколько стабилизирующих групп, которые присоединены к одному или обоим концам модифицированного олигонуклеотида, для улучшения свойств, таких как, например, стабильность по отношению к воздействию нуклеазы. Включенные стабилизирующие группы являются сар-структурами. Такие концевые модификации защищают модифицированный олигонуклеотид от экзо-нуклеазного разрушения и могут помочь при доставке и/или локализации в пределах клетки. Сар может присутствовать на 5'-конце (5'-сар) или на 3'-конце (3'-сар) или может присутствовать на обоих концах. Cap-структуры включают, например, инвертированные деоксиабазические cap.
Подходящие cap-структуры включают 4',5'-метилен-нуклеотид, 1-(бета^-еритрофураносил)-нуклеотид, 4'-тио-нуклеотид, карбоциклический аналог нуклеотида, 1,5-ангидрогекситол-нуклеотид, L-нуклеотид, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, фосфородитиоатную связь, трео-пентафураносил-нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутил-нуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентил-нуклеотид, 3'-3'-инвертированный фрагмент нуклеоти-да, 3'-3'-инвертированный абазический фрагмент, 3'-2'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 3'-2'-инвертированный абазический фрагмент, 1,4-бутандиолфосфат, 3'-фосфорамидат, гексилфосфат, амино-гексилфосфат, 3'-фосфат, 3'-фосфотиоат, фосфородитиоат, образующий мостик фрагмент метилфосфона-та и необразующий мостик фрагмент метилфосфоната, 5'-аминоалкилфосфат, 1,3-диамино-2-пропилфосфат, 3-аминопропилфосфат, 6-аминогексилфосфат, 1,2-аминододецилфосфат, гидроксипро-пилфосфат, 5'-5'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 5'-5'-инвертированный абазический фрагмент, 5'-фосфорамидат, 5'-фосфотиоат, 5'-амино, образующий мостик и/или необразующий мостик 5'-фосфорамидат, фосфотиоат и фрагмент 5'-меркапто.
Некоторые дополнительные терапевтические средства.
Лечение заболевания, ассоциированного с miR-21, может включать более одного терапевтического средства. Поэтому в определенных вариантах осуществления в данном документе обеспечены способы лечения субъекта, имеющего заболевание или с подозрением на заболевание, ассоциированное с miR-21, включающие введение по меньшей мере одного терапевтического средства дополнительно к введению модифицированного олигонуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, комплементарную микроРНК.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство содержит фармацевтическое средство.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противовоспалительные средства. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой стероидное противовоспалительное средство. В определенных вариантах осуществления стероидное противовоспалительное средство представляет собой кортикостероид. В определенных вариантах осуществления кортикостероидом является преднизон. В определенных вариантах осуществления противовоспалительное средство представляет собой нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. В определенных вариантах осуществления нестероидным противовоспалительным средством является ибупрофен, ингибитор COX-I или ингибитор СОХ-2.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают противодиабети-ческие средства. Противодиабетические средства включают без ограничения бигуаниды, ингибиторы глюкозидазы, инсулины, сульфонилмочевины и тиазолидинедионы.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают без ограничения диуретические средства (например, спиронолактон, эплеренон, фуросемид), инотропы (например, добу-тамин, милринон), дигоксин, сосудорасширяющие средства, ингибиторы фермента, превращающего ан-гиотензин II (АСЕ), (например, каптоприл, эналаприл, лизиноприл, беназеприл, хинаприл, фозиноприл и рамиприл), блокаторы рецептора ангиотензина II (ARB) (например, кандесартан, ирбесартан, олмесар-тан, лозартан, валсартан, телмисартан, эпросартан), блокаторы кальциевого канала, изосорбид динитрат, гидралазин, нитраты (например, изосорбид мононитрат, изосорбид динитрат), гидралазин, бета-блокаторы (например, карведилол, метопролол) и натрийуретические пептиды (например, несиритид).
В определенных вариантах осуществления фармацевтические средства включают гепариноиды. В определенных вариантах осуществления гепариноидом является пентозан полисульфат.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой фармацевтическое средство, которое блокирует один или несколько ответов на фиброгенные сигналы.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой терапевтическое средство антитела к фактору роста соединительной ткани. В определенных вариантах осущест
вления терапевтическое средство анти-CTGF представляет собой моноклональное антитело к CTGF.
В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может представлять собой фармацевтическое средство, которое укрепляет иммунную систему организма, включая малодозовый циклофосфамид, тимостимулин, витамины и пищевые добавки (например, антиоксиданты, включая витамины А, С, Е, бета-каротин, цинк, селен, глутатион, коэнзим Q-10 и эхинацею), а также вакцины, например иммуностимулирующий комплекс (ISCOM), который содержит вакцину, состав которой сочетает в себе мультимерное презентирование антигена и адъюванта.
В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство выбирают для лечения или уменьшения интенсивности побочного эффекта одной или нескольких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Такие побочные эффекты включают без ограничения реакции в участке инъекции, отклонения от нормы печеночной пробы, отклонения от нормы почечной функции, гепатотоксичность, нефротоксичность, отклонения от нормы центральной нервной системы и виды миопатии. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке может указывать на гепатотоксичность или отклонение от нормы функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на гепатотоксичность или отклонение от нормы функции печени.
Дополнительные примеры дополнительных фармацевтических средств включают без ограничения иммуноглобулины, включая без ограничения внутривенный иммуноглобулин (IVIg); анальгетики (например, ацетаминофен); салицилаты; антибиотики; противовирусные средства; противогрибковые средства; адренергические модификаторы; гормоны (например, анаболические стероиды, андроген, эстроген, кальцитонин, прогестин, соматостатин и тироидные гормоны); иммуномодуляторы; мышечные релаксанты; антигистамины; средства против остеопороза (например, бифосфонаты, кальцитонин и эстрогены); простагландины, противоопухолевые средства; психотерапевтические средства; седативные средства; продукты сумаха укореняющегося или сумаха ядовитого; антитела и вакцины.
Некоторые наборы.
Настоящее изобретение также обеспечивает наборы. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению, содержащих модифицированный олигонуклеотид, где нуклеотидная последовательность олигонуклеотида комплементарна нук-леотидной последовательности miR-21. Соединения, комплементарные miR-21, могут содержать любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления соединения, комплементарные miR-21, могут находиться во флаконе. Несколько флаконов, например 10, могут находиться, например, в распределительных упаковках. В некоторых вариантах осуществления флакон изготовлен так, чтобы он был доступным для шприца. Набор также может содержать инструкции для применения соединений, комплементарных miR-21.
В некоторых вариантах осуществления наборы могут применять для введения соединения, комплементарного miR-21, субъекту. В таких случаях дополнительно к соединению, комплементарному miR-21, набор может дополнительно содержать одно или несколько из следующего: шприц, тампон, пропитанный спиртом, ватный шарик и/или марлевую прокладку. В некоторых вариантах осуществления соединения, комплементарные miR-21, могут находиться в предварительно наполненном шприце (например, шприцах с разовой дозой с, например, калибром иглы 27, иглой 1/2 дюйма с колпачком иглы), вместо флакона. Несколько предварительно заполненных шприцов, например 10, могут находиться, например, в распределительных упаковках. Набор также может содержать инструкции для введения соединений, комплементарных miR-21.
Некоторые экспериментальные модели.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы применения и/или испытания модифицированных олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению на экспериментальной модели. Специалисты в данной области техники имеют возможность выбирать и модифицировать протоколы для таких экспериментальных моделей для оценки фармацевтического средства согласно настоящему изобретению.
Обычно модифицированные олигонуклеотиды сначала испытывают в культивируемых клетках. Подходящие типы клеток включают те, которые относятся к типу клеток, для которого необходима доставка модифицированного олигонуклеотида in vivo. Например, подходящие типы клеток для изучения способов, описанных в данном документе, включают эмбриональные или культивируемые клетки.
В определенных вариантах осуществления степень, в которой модифицированный олигонуклеотид препятствует активности miR-21, оценивают в культивируемых клетках. В определенных вариантах осуществления ингибирование активности микроРНК может быть оценено путем измерения уровней микроРНК. Альтернативно, могут измерять уровень предсказанного или подтвержденного микроРНК-регулируемого транскрипта. Ингибирование активности микроРНК может приводить в результате к повышению количества miR-21-регулируемого транскрипта и/или белка, кодируемого miR-21-регулируемым транскриптом. Кроме того, в определенных вариантах осуществления некоторые могут измерять фенотипические результаты.
Несколько животных моделей доступны специалистам в данной области техники для изучения miR-21 на моделях заболевания человека. Например, ингибиторы miR-21 могут быть изучены на моделях ра
ка, таких как ортотопические модели ксенотрансплантата, модели токсининдуцированного рака или модели генетически индуцированного рака. В таких моделях рака исследования могут быть проведены для оценки эффектов ингибиторов miR-21 на размер опухоли, число опухолей, общее выживание и/или выживание без прогрессирования заболевания.
Эффекты ингибиторов miR-21 на сердечную функцию и фиброз могут быть изучены на моделях трансаортальной исчерченности или инфаркта миокарда, каждый из которых индуцирует отклонения сердечной функции и фиброз. Модели фиброза почек включают одностороннюю обструкцию мочеточника и ишемическое/реперфузионное повреждение. В течение ранних моментов времени модель ишеми-чески-реперфузионного повреждения почек может применяться в качестве модели для острого повреждения почек, в то время как поздние моменты времени служат в качестве модели для фиброза почек. Модели фиброза печени индуцируют с помощью, например, интоксикации четыреххлористым углеродом или иссечения желчного протока. Эффекты miR-21 на фиброз легкого может быть изучен, например, на модели блеомицин-индуцированного пульмонального фиброза. Модели заживления ран также доступны специалистам в данной области техники, например мышах C57B1/KsJ-db/db, которые проявляют несколько характеристик видов диабета зрелого возраста, таких как значительно отсроченное закрытие раны.
Некоторые количественные анализы.
Эффекты антисмыслового ингибирования miR-21, следующего после введения модифицированных олигонуклеотидов, могут быть оценены с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. В определенных вариантах осуществления такие способы применяют для проведения количественного анализа уровней микроРНК в клетках или ткани in vitro или in vivo. В определенных вариантах осуществления изменения уровней микроРНК измеряют с помощью микроматричного анализа. В определенных вариантах осуществления изменения уровней микроРНК измеряют с помощью одного из нескольких коммерчески доступных ПЦР анализов, таких как TaqMan(r) MicroRNA Assay (Applied Bio-systems). В определенных вариантах осуществления антисмысловое ингибирование miR-21 оценивают путем измерения уровня мРНК и/или белка мишени miR-21. Антисмысловое ингибирование miR-21, как правило, приводит в результате к повышению уровня мРНК и/или белка мишени микроРНК.
Анализ захвата мишени.
Модуляция активности микроРНК с помощью анти-miR или имитатора микроРНК может быть оценена путем измерения захвата мишени. В определенных вариантах осуществления захват мишени измеряют с помощью микроматричного профилирования мРНК. В последовательностях мРНК, которые модулируются (активность либо повышается, либо понижается) с помощью анти-miR или имитатора мик-роРНК, выполняется поиск на предмет затравочных последовательностей микроРНК для сравнения модуляции мРНК, которые являются мишенями микроРНК, с модуляцией мРНК, которые не являются мишенями микроРНК. Таким образом, может оцениваться взаимодействие анти-miR с miR-21 или имитатора miR-21 с его мишенями. В случае анти-miR проводится скрининг мРНК, уровни экспрессии которых повышаются, в отношении последовательностей мРНК, которые содержат затравочное совпадение с микроРНК, к которой комплементарна анти-miR.
Примеры
Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако их не следует рассматривать как ограничивающие широкий объем настоящего изобретения.
Специалисту в данной области техники будет легко позаимствовать основополагающие принципы данного открытия для разработки различных соединений без отклонения от сущности настоящего изобретения.
Пример 1. Скрининг in vitro соединений анти-пШ1-21.
Различные анти-miR, нацеленные на miR-21 и содержащие cEt-нуклеозиды, оценивали в отношении их ингибирующих эффектов на активность miR-21. Как показано в табл. А, эти соединения различны по длине, а также по числу, типу и размещению модифицированных нуклеозидов. 25919 содержит 2'-МОЕ и 2'-фтор-нуклеозиды, а также известно ингибирование miR-21, и, таким образом, его включали в качестве положительного контроля. Оставшиеся соединения содержат cEt-нуклеозиды в комбинации с 2'-МОЕ-нуклеозидами и/или p-D-дезоксирибонуклеозидами.
В предыдущей табл. А нуклеозиды, не сопровождающиеся индексом, обозначают P-D-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "Е", обозначают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "S", обозначают S-cEt-нуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "F", обозначают 2'-фтор-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Верхний индекс "Me" обозначает 5-метальную группу в пиримидиновом основании нуклеозида.
Соединения оценивали в отношении ингибирующей активности miR-21 при анализе с применением люциферазы. Конструкт с люциферазой в качестве датчика для выявления микроРНК сконструировали с применением pGL3-MCS2 (Promega). Конструкт вводили в клетки Hela для испытания способности соединений анти-miR ингибировать активность miR-21. В данном анализе miR-21, присутствующая в клетках Hela, связывалась со своим родственным сайтом(ми) в конструкте с люциферазой в качестве датчика и подавляла экспрессию люциферазы. Когда соответствующую анти-miR вводили в клетки, она связывалась с miR-21 и ослабляла подавление экспрессии люциферазы. Таким образом, в данном анализе анти-miR, которые являются эффективными ингибиторами экспрессии miR-21, будут вызывать повышение экспрессии люциферазы.
День 1.
Клетки Hela (АТСС), стабильно трансфицированные конструктом с люциферазой, сконструированным так, что он содержал последовательность, комплементарную miR-21, посеяли в колбы Т-170 (BD Falcon) при 3,5* 106 клеток/колба. Клетки Hela выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen).
День 2.
В каждой колбе клетки Hela трансфицировали 0,5 мкг плазмидой phRL, применяемой для выявления (Promega), экспрессирующей ген Renilla, для применения при нормализации. Клетки Hela трансфи-цировали с применением 20 мкл липофектамина 2000/колба (Invitrogen). Через 4 ч трасфекции клетки промывали с помощью PBS и трипсинизировали. Клетки Hela помещали на 40к/лунка в 24-лунковые планшеты (BD Falcon) и оставляли на ночь.
День 3.
Клетки Hela трансфицировали анти-miR с применением липофектина (Invitrogen) при 2,5 мкл липо-фектина/100 нМ ASO/мл Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Invitrogen) в течение 4 ч. После ASO-трасфекции клетки Hela снова подпитывали модифицированной по способу Дульбекко средой Игла с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen).
День 4.
Клетки Hela пассивно лизировали и измеряли активность люциферазы с применением Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega).
Анализ с применением люциферазы проводили для испытания способности анти-miR с нуклеозид-ными паттернами, описанными в данном документе, для ингибирования активности miR-21. Результаты сравнивали с "фиктивным" лечением, при котором клетки не получали лечение анти-miR. Эксперимент повторяли и результаты двух экспериментальных реплик, показанных в следующей табл. В, в виде значений для люциферазы нормализовали к бета-галактозидазной активности.
Как проиллюстрировано в табл. В, несколько cEt-содержащих соединений продемонстрировали ингибирование miR-21 дозозависимым образом: 25068, 25070, 25072 и 25082.
Пример 2. Вариации модифицированных нуклеозидов соединения анти-пЖ-21 25070.
Как показано в предыдущем примере, 25070 представляет собой сильный ингибитор активности miR-21 при анализе с применением люциферазы. Для оценки изменений типа модифицированного нук-леозида при различных положениях 25070 разработали дополнительные соединения анти-ггШ1-21, как показано в табл. С.
Таблица С
В табл. F нуклеозиды, не сопровождающиеся индексом, обозначают p-D-дезоксирибонуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "Е", обозначают 2'-МОЕ-нуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "S", обозначают S-cEt-нуклеозиды. Нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "F", обозначают 2'-фтор-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоат-ную межнуклеозидную связь. Верхний индекс "Me" обозначает 5-метальную группу в пиримидиновом основании нуклеозида.
Анализ с применением люциферазы проводили, как описано в данном документе, для испытания способности анти-miR в табл. F ингибирования активности miR-21. Результаты сравнивали с "фиктивным" лечением, при котором клетки не получали лечение анти-miR. Эксперимент повторяли и результаты двух экспериментальных реплик, показанных в следующей таблица D, в виде кратного изменения значения люциферазы по отношению к фиктивному лечению.
Как проиллюстрировано в табл. D, несколько cEt-содержащих соединений продемонстрировали ингибирование miR-21 дозозависимым образом дополнительно к 25070: 25922, 25923 и 25924. Соединения анти-пшЧ.-21 25116 и 25117, каждое из которых содержит модификацию сахара при каждом нуклеозиде, где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, были неэффективными ингибиторами miR-21.
Пример 3. Сравнение нуклеозидных паттернов, придающих активность соединениям анти-пшЧ.-21.
Для определения взаимосвязи между нуклеозидными паттернами, которые придают активность соединениям анти-пшЧ.-21, размещение модифицированных и немодифицированных нуклеозидов сравнивали по всем активным соединениям анти-пЖ-21, которые показаны в табл. Е.
Сравнение размещения модифицированных и немодифицированных нуклеозидов (табл. F выше) выявило некоторые нуклеозидные паттерны, которые были общими для каждого высокоактивного соединения анти-гги^-21.
Например, сравнение структуры на 5'-конце каждого соединения выявило область, которая по длине находится в диапазоне от 1 до 4 нуклеозидов, каждый из которых представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид (колонка R в табл. G ниже). Следующая область содержит один бициклический нуклеозид, за которым следует два не являющихся бициклическими нуклеозида, за которым следует один бициклический нуклеозид (колонка 1 в табл. G ниже).
Затем следует повторяющийся блок из четырех нуклеозидов, после трех не являющихся бицикли-ческими нуклеозидов следует один бициклический нуклеозид, и данный блок из четырех нуклеозидов встречается всего три раза (колонка 2 в табл. G ниже).
В каждой активной анти-гтЖ-21 два 3'-концевых нуклеозида не являются бициклическими нуклео-зидами (колонка Т в табл. G ниже).
Таблица G
Данный нуклеозидный паттерн представлен следующей формулой I в ориентации 5'-3':
(R> x-NB-NQ-NQ-NB.(NQ-NQ-NQ-NB)3-NQ-Nz, где каждый R представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид; X равен от 0 до 4; каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид; и каждый NZ представляет собой модифицированный нуклеозид.
Таблица Е
Данная формула охватывает каждый из нуклеозидных паттернов соединений активной анти-пЖ-21 25068, 25070, 25072, 25082, 25922, 25923 и 25924, при этом продемонстрировано, что нуклеозидный паттерн I обеспечивает активность активной анти-miR, причем обеспечивается возможность выбирать из бициклического нуклеозида, не являющегося бициклическим нуклеозидом и модифицированным нук-леозидом. Соответственно в данном документе обеспечиваются композиции, содержащие модифицированные олигонуклеотиды с нуклеиновым основанием, комплементарнным miR-21, и нуклеозидным паттерном, описанным формулой I.
Для определения взаимосвязи между нуклеозидными паттернами, которые придают активность соединениям активной анти-пЖ-21, которые составляют 19 связанных нуклеозидов в длину, сравнивали размещение модифицированных и немодифицированных нуклеозидов во всех высокоактивных соединениях, которые показаны в табл. Н. Для иллюстрации подобных размещений некоторых нуклеозидов соединения показаны повторно в табл. I.
Таблица Н
Сравнение размещения модифицированных и немодифицированных нуклеозидов (табл. I выше) выявило определенные нуклеозидные паттерны, которые были общие для каждого высокоактивного соединения анти-гги^-21, которое составляет 19 связанных нуклеозидов в длину.
Например сравнение структур на 5'-конце каждого соединения выявило один модифицированный нуклеозид, который не является бициклическим нуклеозидом (колонка NM в табл. J ниже). Следующая область содержит один бициклический нуклеозид, за которым следует два не являющихся бицикличе-скими нуклеозида, за которой следует один бициклический нуклеозид (колонка 1 в табл. J ниже).
Затем следует повторяющийся блок из четырех нуклеозидов, после трех не являющихся бицикли-ческими нуклеозидов следует один бициклический нуклеозид, и данный блок из четырех нуклеозидов встречается всего три раза (колонка 2 в табл. J ниже).
В каждой активной анти-ггЖ-21 предпоследний нуклеозид на 3'-конце представляет собой немоди-фицированный нуклеозид (колонка N в табл. J ниже). Нуклеозид на 3'-конце, который комплементарен нуклеотидному основанию в положении 1 miR-21, представляет собой модифицированный нуклеозид (колонка NZ в табл. J ниже).
Таблица J
Данный нуклеозидный паттерн представлен следующей формулой II в ориентации 5'-3':
NM-NB-№-NQ-NB-(NQ-№-NQ-NB)j-NQ-Nz7 где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, который не является бициклическим нуклеозидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид;
каждый NQ представляет собой не являющийся бициклическим нуклеозид; и
представляет собой модифицированный нуклеозид.
Данные, обеспеченные в данном документе, демонстрируют, что данный нуклеозидный паттерн придает активность соединению анти-ггшЗ.-21, и, кроме того, что активность соединения поддерживается разнообразием модифицированных нуклеозидов. Соответственно в данном документе обеспечены композиции, содержащие модифицированный олигонуклеотид с последовательностью нуклеиновых оснований, комплементарную miR-21, и нуклеозидный паттерн формулы II.
Подобные анализы проводили в группе соединений анти-ггЖ-21, включая 25211 и 25220. В результате проведенных анализов были установлены формулы III-V.
Пример 2. Ингибирование miR-21 в модели фиброза почек.
Односторонняя обструкция мочеточника (UUO) представляет собой устойчивую экспериментальную модель повреждения почек, приводящее к интерстициальному фиброзу, и таким образом применяется в качестве экспериментальной модели, которая отражает заболевание почек человека. UUO проводят путем хирургического лигирования одного мочеточника. Фиброз характеризуется повышением коллагена, наличие и степень фиброза почек могут быть определены путем измерения содержания коллагена. Для оценки содержания коллагена измеряют как коллаген 1А1 (Col 1A1), так и коллаген 3А1 (Col 3A1). Фиброз почек может быть визуализирован путем окрашивания образцов ткани пикро-сириусом красным для определения повышения содержания коллагена. Фиброз почек может также наблюдаться путем измерения количества гидроксипролина, который представляет собой основной компонент коллагена, в образце.
На модели UUO фиброза почек испытывали cEt-содержащие соединения анти-птЖ-21, признанные активными при анализе с применением люциферазы. Известно ингибирование активности miR-21 in vivo с помощью 25919, содержащего 2'-МОЕ и 2'-фтор-модификации, при этом его включали в качестве положительного контроля. Каждую группу из 8 животных лечили следующим образом: только UUO, UUO с PBS или UUO с соединением анти-птЖ-21. Что касается дня процедуры UUO, PBS или соединения ан-ra-miR-21 вводили на -3, -1 и +5 день. Соединения анти-гги^-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения анти-miR вводили до процедуры UUO, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. На 11 день животных умерщвляли и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в реальном времени и нормализовали сперва к GAPDH, а затем к контрольным животным фиктивного лечения. Экспрессия коллагена 1А1 и коллагена 3А1 показана в таблице К ниже.
Таблица К
Снижение экспрессии коллагена в модели UUO несколькими соединениями aHTH-miR-21
Группа
лечения
Животное
Коллаген 1А1 (Норшлизир
ованная экспрессия)
Среднее
Коллаген ЗА1 (Нормализир
ованная экспрессия)
Среднее
Фиктивное лечение
0,5
0,9
0,5
1,3
0,9
0,9
1,1
1,1
0,5
0,6
0,7
0,7
0,7
0,9
1,3
4,1
1,6
1,5
UUO-PBS
96,9
114,9
52,5
87,2
108,4
67,0
115,0
78,6
102,0
91,0
103,1
88,4
144,5
117,4
134,3
103,4
115,0
99,3
UUO-25068
84,7
96,4
64,8
60,6
75,1
56,2
85,5
47,4
89,1
76,2
90,4
57,0
125,8
63,0
124,4
59,6
UUO-25070
67,7
81,0
36,4
55,5
97,7
75,6
88,8
473
95,9
55,5
71,4
63,3
44,5
28,5
73,0
64,2
109,4
72,9
UUO-25072
96,2
113,8
69,4
65,5
85,7
54,5
127,4
58,8
100,0
69,2
159,2
93,8
120,5
65,8
108,0
46,9
UUO-25082
122,2
91,7
62,9
59,1
188,3
78,9
102,5
82,2
67,6
43,8
40,6
32,6
44,1
34,3
73,8
75,8
94,7
62,5
UUO-25919
150,2
86,6
67,1
56,9
54,2
33,9
84,6
87,6
67,7
47,3
78,7
67,7
62,2
46,7
89,2
47,0
106,2
57,8
Данное исследование повторяли 2-3 раза с каждой из групп лечения выше. Метаанализ исследований выявил, что лечение 25070 проявляет наибольшую активность исходя из экспрессии коллагена, приводящей к 40% ингибированию коллагена 1А1 и 30% ингибированию коллагена 3А1. 25068 было также активным при снижении экспрессии коллагена, но в меньшей степени чем 25070. 25072 и 25082, несмотря на активные ингибиторы miR-21 в испытаниях in vitro, описанные в данном документе, демонстрируют снижение экспрессии коллагена непостоянно.
UUO-исследование повторяли для подтверждения активности 25070. Анти-miR вводили подкожно при дозе 20 мг/кг. Результаты в табл. L ниже подтверждают, что 25070 представляет собой сильный ингибитор экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1.
Таблица L
Снижение экспрессии коллагена в модели UUO при профилактическом введении 25070
Коллаген
Коллаген
1А1
ЗА1
Лечение
Животное
(Нормализир
ованная экспрессия)
Среднее
(Нормализир
ованная экспрессия)
Среднее
1,0
0,7
Фиктивное
1,3
1,0
0,8
1,3
лечение
1,0
2,9
0,8
0,6
102,7
64,5
76,3
61,9
76,5
79,5
UUO-PBS
53,4
74,3
61,3
58,8
88,8
44,8
70,7
44,4
58,8
53,3
67,4
60,6
13,9
34,9
9,2
47,4
32,3
25,3
UUO-25070
57,2
30,2
38,0
42,4
20 мг/кг SC
47,6
47,9
26,1
54,3
35,0
56,1
20,4
35,2
Сравнение UUO-исследований выявило 25070 в качестве весьма сильного ингибитора экспрессии коллагена в модели UUO, таким образом, 25070 представляет собой терапевтическое средство-кандидат для лечения фиброза, включая фиброз почек.
Пример 3. Сравнение анти-ггЖ-21 с блокатором рецептора ангиотензина.
Блокатор рецептора ангиотензина ирбесартан, как было показано, блокирует образование тубуло-интерстициального фиброза в модели хронического повреждения почек, характеризующегося фиброзом. Эффекты 25070 сравнивали с ирбесартаном в модели UUO фиброза.
Контрольные группы лечения включали только UUO (фиктивное лечение) и UUO с подкожным введением PBS. Дополнительная контрольная группа включала UUO с носителем Tween-MC/20 перо-рально. 25070 вводили подкожно при дозе 20 мг/кг на 5 день до, 2 день до и 3 день после процедуры UUO. Ирбесартан вводили перорально ежедневно в 0 день вплоть до 7 после процедуры UUO. Животных умерщвляли на 10 день после процедуры UUO. Ткань почек собирали для измерения экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1. Результаты показаны в табл. М ниже и иллюстрируют статистически значимое снижение (р <0,05 с помощью одностороннего ANOVA) экспрессии Col1A1 у обработанных 25070 животных по отношению к животным, обработанных солевым раствором. Ирбесартан не выявлял статистически значимого снижения экспрессии Col1A1. Как ирбесартан, так и 25070 выявляли значительные снижения экспрессии Со13а1, при этом 25070 выявляло большее снижение по сравнению с ирбесарта-ном.
Таблица М
Большая степень снижения экспрессии коллагена с помощью 25070 по сравнению с ирбесартаном в модели UUO
Группа
Животное
Коллаген 1А1 (Нормализирова иная экспрессия)
Среднее
Коллаген ЗА 1 (Нормализиро ванная экспрессия)
Среднее
1,1
0,9
Фиктивное
0,8
1,0
0,6
лечение
0,9
1,6
1,4
1,1
112,5
92,1
167,2
97,9
179,0
85,6
UUO-PBS
93,1
129,6
95,5
93,2
(подкожно)
151,7
66,3
87,1
71,3
117,5
142,4
129,1
94,9
87,5
38,6
67,4
56,9
UUO+2507G (20 мг/кг подкожно)
22,2
77,2
61,9
64,2
50,7
53,7
42,0
76,4
69,2
49,7
68,4
44,3
95,2
35,9
иио-
272,9
150,2
248,0
132,4
носителъ
127,9
180,4
Tween/MC
108,4
142,8
(РО)
101,1
57,1
125,0
108,5
304,2
186,2
119,9
88,6
42,4
47,5
125,4
65,5
86,7
(образец отсутствует)
иио-
106,6
63,8
ирбесартан
110,7
117,8
63,2
73,2
(РО)
198,3
50,8
92,2
63,6
118,1
82,8
104,1
122,5
Дополнительным индикатором фиброза является процентное отношение ткани почек, которая проявляет экспрессию коллагена, после процедуры UUO. Соответственно ткань почек также собирали для гистологического анализа для оценки доли ткани почек, которая проявляет повышенную экспрессию коллагена; результаты находятся в табл. N ниже. "Долю площади коллагена" измеряют гистологически посредством количественного анализа площади ткани почек при обработке изображения, которую окрашивают в красный цвет с помощью окрашивающего средства пикросириуса красного; процент окрашенной красным стандартизировали к площади среза почки. Поскольку срезы ткани анализировали слепым способом, несмотря на то что образцы в табл. М и N являются образцами одного и того же исследования, нумерация образцов в табл. N ниже не обязательно соответствует нумерации образцов в табл. М выше.
Таблица N
Большая степень снижения экспрессии коллагена с помощью 25070 по сравнению с ирбесартаном в модели UUO
Группа
(номера не тождественны номерам ПЦР)
Доля площади
коллагена <%)
Среднее
1,419
Фиктивное
1,178
1,5
лечение
1,615
1,675
12,988
UUO-PBS
17,691
11,1
(подкожно)
12,55
9,99
8,828
9,394
9,491
7,49
7,632
9,937
UUO+25070 (20 мг/кг подкожно)
8,015
6,611
8,0
6,319
11,272
6,803
7,405
10,587
8,499
UUO-
11,339
носитель
3,244
8,0
Tween/MC
2,954
(РО)
8,748
9,5
9,29
6,105
7,481
UUO-Ирбссартан (РО)
15,877
7,914
8,0
6,614
5,706
7,798
6,154
Данные результаты демонстрируют, что ингибирование miR-21 с помощью 25070 ингибирует экспрессию коллагена с большей активностью, нежели ирбесартан, при этом дополнительно подтверждается, что 25070 представляет собой средство-кандидат для лечения, предупреждения и/или улучшения течения фиброза.
Пример 4. Ингибирование miR-21 в модели ишемического/реперфузионного повреждения.
Модель ишемически-реперфузионного повреждения (IRJ) создают у мыши посредством одностороннего или двустороннего пережатия почечных артерий, которое приводит к повреждению канальцев, воспалению и фиброзу. Почечная дисфункция в данной модели может произойти либо рано ( <5 дней), либо поздно (> 7 дней), причем ранние моменты времени применяемы для испытания средств-кандидатов для лечения острого повреждения почек, а поздние моменты времени применяемы для модели хронического фиброза.
Соединения анти-пЖ-21 испытывали на модели одностороннего IRI. Одностороннее IRI индуцировали в течение периода времени 30 мин. Группы лечения были следующими: фиктивное лечение с процедурой IRI; IRI с введением PBS подкожно; IRI с соединением 25070 с анти-пЖ-21 вводили интра-перитонеально при дозе 20 мг/кг; 25919 с 2'-фтор/2'-МОЕ-модифицированной анти-пЖ-21 вводили ин-траперитонеально при дозе 20 мг/кг и 25319 с 2'-фтор/2'-модифицированной анти-пЖ-21 с несовпадением (содержит три несовпадения с последовательностью miR-21) вводили интраперитонеально при дозе 20 мг/кг. PBS или соединения анти-miR вводили на 5, 6, и 7 день после IRI и животных умерщвляли через 14 дней после IRI. Поскольку соединение анти-miR вводили через 5 дней после повреждения в почке или позже, когда фиброз проявлялся в некоторой степени, данная схема лечения считается лечебной схемой, а не профилактической схемой.
Ткань почек собирали для анализа экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1 (показан в табл. О) и доли площади коллагена (показаны в табл. Р). Поскольку "долю площади коллагена" анализировали слепым способом, несмотря на то что образцы в табл. О и Р являются образцами одного и того же исследования, нумерация образцов в табл. О не соответствовала нумерации образцов в табл. Р. Ошибка обработки данных образца помешала проанализировать долю площади коллагена для контрольного лечения ан-ra-miR-21 с несовпадением, поэтому результаты для данной группы лечения представлены только для экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1. В данном исследовании 25070 проявляло статистически значимое снижение доли площади коллагена.
Таблица О
Снижение экспрессии коллагена с помощью 25070 в модели ГШ при введении дозы на 5, 6 и 7 день
Группа
Животное Jfe
Коллаген 1А1 (Нормализирова иная экспрессия)
Среднее
Коллаген ЗА1 (Нормализирова иная экспрессия)
Среднее
Фиктивное лечение
1,1
2,6
1,1
1,1
1,0
0,7
0,7
0,7
0,7
1,0
0,7
0,7
0,9
0,9
1,0
1.3
1,3
IRI-PBS
83,5
85,1
64,9
63,9
34,8
29,4
79,0
61,9
74,5
46,6
102,3
61,9
128,6
99,5
92,9
82,8
IR1-25319 (ММ)
155,8
923
119,5
79,3
181,2
209,9
33,4
29,0
34,7
18,9
81,8
74,7
90,4
50,1
68,5
53,1
IW-25919
108,7
72,0
87,5
59,9
103,9
72,3
29,5
14,3
95,8
104,4
35,5
27,1
42,2
34,9
64,1
56,1
96,4
82,8
IRI-25070
81,7
50,2
57,8
34,2
57,4
18,1
37,9
39,3
55,3
36,0
22,3
20,6
52,4
38,6
53,0
33,4 29,7
41,5
Таблица Р
Снижение доли площади коллагена с помощью 25070 в модели ГШ при введении дозы на 5, 6 и 7 день
Группа
Животное (не тождественны как для ПЦР)
Доля площади коллагена (#)
Среднее
1,398
1,406
2,88
Фиктивное
1,782
1,8
лечение
1,119
2,11
1,552
1,795
12,181
16,352
IRI-PBS
14,818
15,1
17,089
14,552
16,92
13,629
7,093
8,254
8,095
IR1-25919
8,559
8,2
8,681
6,31
8,416
9,905
10,266
11,772
10,267
Ш-25070
8,404
9,7
7,862
6,975
8,381
13,773
Аналогичное исследование проводили с теми же группами лечения и дополнительными днями лечения В данном исследовании средства лечения вводили интраперитонеально на 5, 6, 7, 14 и 21 день после процедуры IRI. Животных умерщвляли на 27 день и почечную ткань собирали для анализа экспрессии коллагена 1А1 и коллагена 3А1, а также доли площади коллагена. Поскольку "долю площади коллагена" анализировали слепым способом, несмотря на то что образцы в табл. Q и R являются образцами одного и того же исследования, нумерация образцов в табл. Q ниже не соответствовала нумерации образцов в табл. R. В данном исследовании 25070 выявляло статистически значимое снижение доли площади коллагена.
19,81
13,981
16,528
10,804
11,548
10,614
IRJ-25319
12,149
13,5
(ММ)
21,52
14,214
13,917
11,882
9,755
9,506
IRI-25919
12,654
12,8
20,319
11,551
12,224
14,468
7,354
9,241
9,589
IRI-25070
11,573
10,1
8,182
10,695
13,978
10,12
Данные исследования продемонстрировали снижение содержания коллагена после ингибирования miR-21 на модели острого повреждения почек. Таким образом, соединение анти-1ш^-21 25070 представляет собой терапевтическое средство для лечения острого повреждения почек. Например, предупреждение или отсрочка начала фиброза после острого повреждения почек может предотвратить или замедлить появление хронического заболевания почек.
Для оценки гибкости введения соединения анти-п^-21 25070 сравнивали активность соединения в 14-дневном исследовании выше, где анти-п^-21 вводили на 3, 5 и 7 день после процедуры IRI, с различными в 14-дневном исследовании, где анти-1т^-21 вводили интраперитонеально на 3, 5 и 7 день после процедуры IRI. Данные в табл. S демонстрируют, что аналогичное ингибирование экспрессии коллагена наблюдали в одном из исследований, указывая на то, что режим дозирования может быть гибким. Кратное изменение экспрессии коллагена 1А1 или коллагена 3А1 по отношению к животным фиктивного лечения показано в табл. S и иллюстрирует статистически значимое снижение экспрессии коллагена при одном из режимов дозирования.
Таблица S
Уменьшение экспрессии коллагена с помощью 25070 в модели IRI при введении дозы на 3, 5 и 7 день
Группа
Животное
Коллаген 1А1 (Норм ализирован ная экспрессия)
Среднее
Коллаген ЗА1 (Норм ализирован ная экспрессия)
Среднее
0,9
0,9
Фиктивное
1,0
1,2
1,0
лечение
1,2
1,2
0,7
0,8
30,3
35,0
30,9
29,2
33,6
29,3
50,7
52,4
27,7
25,9
IRI-PBS
28,1
37,6
33,5
39,6
20,9
23,5
34,0
40,0
34,3
33,2
45,1
51,5
66,9
75,0
48,4
46,9
37,5
35,3
21,9
23,6
35,3
32,1
26,0
25,1
24,9
31,3
25070
16,8
27,2
18,6
27,9
(3,5,7 день)
30,8
30,3
34,3
37,6
36,8
40,0
9,4
9,5
28,0
23,2
24,6
28,7
21,7
24,9
22,8
26,3
15,8
13,6
27,6
25,4
27,1
32,7
25070
29,3
24,5
29,9
26,2
(5,6,7 день)
10,8
9,7
21,5
22,2
29,9
33,2
35,0
35,4
28,3
32,3
24,2
28,9
Пример 5. Ингибирование miR-21 в модели ишемически-реперфузионного поврежде-ния/нефрэктомии.
Модель ишемически-реперфузионного повреждения/нефрэктомии (IR/Nx) создают у мыши посредством временного одностороннего пережатия артерии у одной почки, которое приводит к повреждению канальцев, воспалению и фиброзу, после которого следует удаление второй почки в ранний момент времени. В данной модели фазы острой почечной дисфункции пригодны для испытания средств-кандидатов для лечения острого повреждения почек (т. е. вплоть до приблизительно первых 5 дней), а поздние фазы почечной дисфункции пригодны для модели хронического фиброза (т. е. после приблизительно первых 5 дней).
Соединения анти-ггиТ <-21 испытывали на модели IR/Nx. 25109. с несовпадением 6-основания к miR-21, применяли в качестве контрольного соединения (AEASATCsTGTCsTCAUsAATASAAE; где нуклеозиды, не сопровождающиеся индексом, обозначают р-дезоксинуклеозиды; нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "Е", обозначают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды, сопровождающиеся индексом "S", обозначают S-cEt-нуклеозиды; и все межнуклеозидные связи являются фосфотиоатными межнуклеозидны-ми связями).
Односторонний IR индуцировали в течение периода 30 мин. Группы лечения были следующие фиктивное лечение с процедурой IR, IR с введением PBS подкожно, IR с введением контроля 25109 с несовпадением подкожно при дозе 20 мг/кг; IR с введением соединения 25070 анти-ггиТ <-21 подкожно при дозе 20 мг/кг и IR с введением соединения 25923 анти-ггиТ <-21 подкожно при дозе 20 мг/кг. PBS или анти-miR вводили на 2, 3, 4 и 8 день после IR. На 8 день здоровую почку извлекали с помощью нефрэктомии из каждого животного и животных умерщвляли на 9 день. Непосредственно перед умерщвлением собирали мочу путем прямой пункции мочевого пузыря.
В моче каждой мыши измеряли соотношение альбумина к креатинину. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 1. В данном исследовании как 25070 ,так и 25923 выявляли статистически значимое снижение соотношения мочевого альбумина к креатинину. Геометрическое среднее соотношения альбумина к креатинину в каждой группе мышей составляло 16 мкг Alb/мг Cr (контроль только с неф-рэктомией), 127 мкг Alb/мг Cr (IR/Nx, контроль PBS), 140 мкг Alb/мг Cr (IR/Nx, контроль 25109), 40 мкг Alb/мг Cr (IR/Nx, 25070) и 31 мкг Alb/мг Cr (IR/Nx, 25923). Уровни остаточного азота мочевины и сывороточного креатинина были аналогичными у всех мышей IR/Nx, и были повышены по отношению к контрольным мышам только с нефрэктомией (данные не показаны).
Пример 6. Выживание мышей модели IR/Nx после введения соединения анти-1гпТ <-21.
Частоту выживания мышей модели IR/Nx через два дня после нефрэктомии определяли в шести различных экспериментах для определения, повышает ли введение соединения анти-гги^-21 выживание. В первых трех экспериментах соединение анти-гги!1-21 вводили на 5, 6 и 7 день после ишемически-реперфузионного повреждения и нефрэктомию проводили на 10 или 11 день. Во вторых трех экспериментах соединение анти-ггиТ <-21 вводили на 2, 3 и 4 день, а нефрэктомию проводили на 7 день. Частоты выживания мышей IR/Nx в каждом эксперименте показаны в табл. Т.
В первых трех экспериментах, в которых нефрэктомию проводили на 10 или 11 день, частота выживания PBS-обработанных мышей составляла 55%, в то время как частота выживания 25070-обработанных мышей составляла 80% (Р=0,02 с использованием 1-стороннего точного критерия Фишера) Во вторых трех экспериментах, в которых нефрэктомию проводили на 7 день, частота выживания PBS-обработанных мышей составляла 52%, в то время как частота выживания 25070-обработанных мышей составляла 69% (Р=0,11 с использованием 1-стороннего точного критерия Фишера)
Пример 7. Разработка дополнительных соединений анти-пзЖ-21.
При следующем введении соединения 25070 мышам было обнаружено, что приблизительно в 50% соединения, присутствующего в ткани почек, не хватает 3'-концевого нуклеозида через 7 дней после инъекции. Стабильность 25070 и 25923 оценивали в анализе гомогената печени ex vivo В данном анализе 5 мкМ олигонуклеотида инкубировали в гомогенате печени (50 мг ткани на мл) в течение 24 ч при 37°С. После данного инкубирования олигонуклеотид экстрагировали с помощью экстракции жидкостью жидкости (LLE) с последующей твердофазной экстракцией (SPE). Длины олигонуклеотида и количества измеряли с помощью времяпролетной масс-спектрометрии высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC-TOF MS). Активность нуклеазы в гомогенате ткани печени подтверждали с применением эталонных олигонуклеотидов, которые включали соединение с известной устойчивостью к активности нуклеаз, соединение, чувствительное к активности 3'-экзонуклеазы, и соединение, чувствительное к активности эндонуклеазы. Соединение внутреннего стандарта применяли для контроля эффективности экстракции. В данном анализе приблизительно 58% соединения 25070 присутствует в виде соединения полной длины, и в приблизительно 27% соединения 25070 отсутствует 3'-концевой нуклеозид приблизительно 68% соединения 25923 присутствует в виде соединения полной длины, и в приблизительно 18% соединения отсутствует 3'-концевой нуклеозид.
Разработали дополнительные соединения и данные соединения испытали в отношении стабильности ex vivo и in vivo. Ex vivo проводили, как описано выше. Для испытания in vivo соединения вводили мышам, выделяли почечную ткань, а также проводили экстракцию и определение соединения, как для анализа ex vivo. В табл. U показаны структуры для соединения 25923, 25220 и 25221, а также результаты измерений стабильности.
Таблица U
Соединения 25220 и 25221, а также 25923 испытывали в модели UUO в отношении их эффектов на фиброз. Каждую группу из 8 животных обрабатывали следующим образом: фиктивная операция, UUO с PBS, UUO с 25220, UUO с 25221 или UUO с 25923. Относительно дня процедуры UUO, PBS или соединения анти-шП1-21 вводили на -5, -3 и +3 день. Соединения анти-пи!1-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения анти-miR вводили до процедуры UUO, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. На 10 день животных умерщвляли и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в режиме реального времени и стандартизировали к GAPDH.
Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 2. Экспрессия коллагена 1А1 и коллагена 3А1 показана на фиг. 2А и 2В соответственно. Введение соединения 25220 или 25221 снижало экспрессию коллагена 1А1 и коллагена 3А1 на статистически значимую величину (*=р <0,05; **=р <0,01; ***=р <0,001), так как и введение соединения 25923.
Различные модификации настоящего изобретения в дополнение к таким, описанным в данном документе, будут очевидны специалистам в данной области техники из приведенного выше описания. Такие модификации также предназначены для попадания в пределы объема приложенной формулы изобретения. Каждая ссылка (включая без ограничения журнальные статьи, патенты США и не США, публикации патентных заявок, публикации международных патентных заявок, номера доступа GENBANK(r) и т. п.), приведенная в настоящей заявке, в частности, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-22 связанных
нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплемен-
тарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16
смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна I в ориентации 5'-3':
(R)x-NB-NQ-NQ-NB-(NQ-NQ-NQ-NB)3-NQ-NZ, где каждый R независимо представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4;
каждый NB независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ независимо представляет собой небициклический нуклеозид;
представляет собой модифицированный нуклеозид, и где
1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или
2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид.
2. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных
нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплемен-
тарна miR-21 (SEQ ID NO:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16
смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна II в ориентации 5'-3':
NM-NB-NQ-NQ-NB-(NQ-NQ-NQ-NB)3-NQ-NZ, где NM независимо представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бицикличе-ским нуклеозидом;
каждый NB независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ независимо представляет собой небициклический нуклеозид;
представляет собой модифицированный нуклеозид, и где
1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или
2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид.
1)
3. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных
нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплемен-
тарна miR-21 (SEQ ID NO:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16
смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна III в ориентации 5'-3':
(R)X-NB-NQ-NQ-NB-(NQ-NQ-NQ-NB)3-NY-NZ, где каждый R представляет собой небициклический нуклеозид; X равен от 1 до 4;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид;
NY представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид;
представляет собой модифицированный нуклеозид, и где
1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или
2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид.
4. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных
нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплемен-
тарна miR-21 (SEQ ID NO:1), и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16
смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна IV в ориентации 5'-3':
NM-NB-NQ-NQ-NB-(NQ-NQ-NQ-NB)3-NY-NZ, где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклео-зидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид;
NY представляет собой модифицированный нуклеозид или немодифицированный нуклеозид;
представляет собой модифицированный нуклеозид, и где
1) каждый бициклический нуклеозид содержит неметилированное нуклеиновое основание или
2) не более двух небициклических нуклеозидов представляют собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды и каждый другой небициклический нуклеозид представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид.
5. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16-19 связанных нуклеозидов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна miR-21 (SEQ ID NO:1) и где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеозидов следующего нуклеозидного паттерна V в ориентации 5'-3':
NM-NB-(NQ-NQ-NB-NB)4-NZ, где NM представляет собой модифицированный нуклеозид, не являющийся бициклическим нуклео-зидом;
каждый NB представляет собой бициклический нуклеозид; каждый NQ представляет собой небициклический нуклеозид;
представляет собой модифицированный нуклеозид.
6. Соединение по любому из пп.1-5, где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или 22 смежных нуклеозида нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.
7. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарна нуклеотидной последовательности miR-21 (SEQ ID NO:1).
8. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из LNA-нуклеозида, cEt-нуклеозида и ENA-нуклеозида.
9. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой S-cEt-нуклеозид.
10. Соединение по любому из пп.1-7, где каждый бициклический нуклеозид представляет собой LNA-нуклеозид.
11. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из p-D-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида.
12. Соединение по любому из пп.1-10, где каждый небициклический нуклеозид представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид.
13. Соединение по любому из пп.1-10, где каждый небициклический нуклеозид представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.
14. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 связанных нуклеозидов нуклеозидного паттерна I, II, III, IV или V.
15. Соединение по любому из пп.1-14, где по меньшей мере один цитозин представляет собой 5-метилцитозин или где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
16. Соединение по п.1, где:
10.
a) R состоит из четырех связанных нуклеозидов NR1-NR2-NR3-NR4, где NR1 представляет собой 2'-О-
метоксиэтилнуклеозид, и каждый NR2-NR3-NR4 представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид;
каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
b) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид;
каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
c) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид;
каждый NQ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
d) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид;
каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
представляет собой S-cEt-нуклеозид;
e) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид;
каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; или
f) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид;
каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
представляет собой LNA-нуклеозид.
17. Соединение по п.1, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру, выбранную из
TE^CEAEAECSAETECSAEGETECSTEGEAEUSAEAEGECSTEAE и TE^CAACSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE,
где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают p-D-дезоксирибонуклеозиды; нук-
леозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последую-
щим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и верхний индекс "Me" означает 5-метильную
группу при основании нуклеозида.
18. Соединение по п.2, где:
a) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
b) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
c) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; каждый N представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
представляет собой S-cEt-нуклеозид;
d) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид или
e) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой LNA-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
представляет собой LNA-нуклеозид.
19. Соединение по п.2, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру, выбранную из
AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE, AECSAETECSAEGETECSTEGEAEUSAEAEGECSTEAE,
AEMeCSATMeCSAGTMeCSTGATSAAGMeCSTAE,
AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAS и AEMeCSATMeCSAGTMeCSTGATSAAGMeCSTAS, где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают p-D-дезоксирибонуклеозиды; нук-леозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и верхний индекс "Me" означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.
20. Соединение по п.19, где модифицированный олигонуклеотид имеет структуру
AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE, где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают p-D-дезоксирибонуклеозиды; нук-леозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды.
21. Соединение по п.3, где:
a) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
b) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NZ представляет собой S-cEt-нуклеозид или
c) каждый R представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; X равен 1;
каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид;
каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
NY представляет собой S-cEt-нуклеозид;
представляет собой S-cEt-нуклеозид.
22. Соединение по п.4, где:
a) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
b) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид;
представляет собой S-cEt-нуклеозид;
c) NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NY представляет собой S-cEt-нуклеозид;
представляет собой S-cEt-нуклеозид.
23. Соединение по п.5, где
NM представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый NB представляет собой S-cEt-нуклеозид; каждый NQ представляет собой p-D-дезоксирибонуклеозид; NZ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид.
24. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 или где модифицированный олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4 и где каждый Т в последовательности независимо выбран из Т и U.
25. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью, или где каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь, и где модифицированная межнуклео-зидная связь возможно представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
26. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид
24.
AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE,
где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают p-D-дезоксирибонуклеозиды; нук-леозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь.
27. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида
AECSATCSAGTCSTGAUSAAGCSTAE,
где нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают p-D-дезоксирибонуклеозиды; нук-леозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕ-нуклеозиды и нуклеозиды с последующим нижним индексом "S" означают S-cEt-нуклеозиды и где каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по п.26 или 27 и фармацевтически приемлемый носитель.
29. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для ин-гибирования активности miR-21 в клетке, где лекарственное средство предназначено для приведения в контакт с клеткой.
30. Применение по п.29, отличающееся тем, что клетка находится в условиях in vivo или клетка находится в условиях in vitro.
31. Применение по п.29 или 30, отличающееся тем, что клетка представляет собой фибробласт, клетку, характеризующуюся гиперпролиферацией, кератиноцит или клетку, находящуюся под действием гипоксии.
32. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для снижения экспрессии коллагена в клетке, где лекарственное средство предназначено для приведения в контакт с клеткой.
33. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для лечения, предупреждения или отсрочки начала развития заболевания, ассоциированного с miR-21, у субъекта, имеющего заболевание, ассоциированное с miR-21, где лекарственное средство предназначено для введения субъекту, имеющему заболевание, ассоциированное с miR-21.
34. Применение по п.33, отличающееся тем, что заболевание представляет собой фиброз.
35. Применение по п.34, отличающееся тем, что фиброз выбирают из фиброза почек, фиброза легких, фиброза печени, фиброза сердца, фиброза кожи, возрастного фиброза, фиброза селезенки, склеродермии и посттрансплантационного фиброза.
36. Применение по п.35, отличающееся тем, что
a) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из гломерулосклероза, тубулоинтерстициального фиброза, IgA-нефропатии, интерстициального фиброза/тубулярной атрофии; хронического повреждения почек, поражения нефронов, гломерулонефрита, сахарного диабета, идиопатического фокально-сегментарного гломерулосклероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек и терминальной стадии почечной недостаточности, присутствует фиброз почек;
b) фиброз почек возникает в результате острой или повторной травмы почек;
c) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из хронического повреждения печени, инфекционного гепатита, неалкогольного стеатогепатита и цирроза, присутствует фиброз печени; легочный фиброз представляет собой идиопатический легочный фиброз; и/или
d) субъект имеет хроническое обструктивное заболевание легких.
37. Применение соединения по любому из пп.1-27 в изготовлении лекарственного средства для лечения фибропролиферативного нарушения у субъекта, где лекарственное средство предназначено для введения субъекту.
38. Применение по любому из пп.33-37, включающее отбор субъекта, имеющего повышенную экспрессию miR-21 в одной или нескольких тканях.
39. Применение по любому из пп.33-37, отличающееся тем, что субъект нуждается в улучшенной функции органов, где функцию органов выбирают из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.
40. Применение по любому из пп.33-39, отличающееся тем, что введение улучшает функцию органов у субъекта, где функцию органа выбирают из функции сердца, функции легких, функции печени и функции почек.
41. Применение по любому из пп.33-40, где указанное лечение включает введение по меньшей мере одного терапевтического средства, выбранного из противовоспалительного средства, иммуносупрессив-ного средства, противодиабетического средства, дигоксина, вазодилататора, ингибиторов ангиотензин-II-превращающего фермента (АСЕ), блокаторов рецепторов ангиотензина II (ARB), блокатора кальциевых каналов, динитрата изосорбида, гидралазина, нитрата, гидралазина, бета-блокатора, натрийуретических пептидов, гепариноида и ингибитора фактора роста соединительной ткани.
37.
42. Применение по п.41, где указанное терапевтическое средство представляет собой по меньшей мере один ингибитор АСЕ.
43. Применение по п.42, где ингибитор АСЕ выбран из каптоприла, эналаприла, лизиноприла, бена-зеприла, хинаприла, фозиноприла и рамиприла.
44. Применение по п.41, включающее введение по меньшей мере одного ингибитора ARB.
45. Применение по п.44, где ингибитор ARB выбран из кандесартана, ирбесартана, олмесартана, ло-
зартана, валсартана, телмисартана и эпросартана.
46. Применение по п.33, отличающееся тем, что заболевание представляет собой рак и/или включа-
ет метастазирование.
47. Применение по п.46, отличающееся тем, что рак представляет собой рак печени, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак головного мозга, гемобластоз, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак языка, рак желудка, рак кожи или рак щитовидной железы.
48. Применение по любому из пп.46 или 47, где указанное лечение дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного дополнительного средства противораковой терапии.
49. Применение по п.33, где заболевание представляет собой заболевание сердца.
50. Применение по любому из пп.33-49, отличающееся тем, что субъект является человеком.
51. Применение по любому из пп.33-50, отличающееся тем, что соединение представлено в виде фармацевтической композиции.
52. Применение соединения по любому из пп.1-27 в терапии.
53. Применение соединения по любому из пп.1-27 для получения лекарственного препарата.
54. Применение соединения по любому из пп.1-27 для получения лекарственного препарата для
стимулирования заживления ран.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025894
- 1 -
025894
- 1 -
025894
- 1 -
025894
- 1 -
025894
- 1 -
025894
- 1 -
025894
- 4 -
025894
- 54 -
025894
- 55 -