EA 025843B1 20170228 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/025843 Полный текст описания [**] EA200970925 20080403 Регистрационный номер и дата заявки US60/910,008 20070404 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок IB2008/002645 Номер международной заявки (PCT) WO2009/031031 20090312 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21702 Номер бюллетеня [**] УСТОЙЧИВОЕ К ГЕРБИЦИДУ РАСТЕНИЕ BRASSICA JUNCEA, СПОСОБ БОРЬБЫ С СОРНЯКАМИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ УСТОЙЧИВОГО К ГЕРБИЦИДУ РАСТЕНИЯ BRASSICA JUNCEA Название документа [8] C12N 15/82, [8] C12N 9/00, [8] C12N 9/88, [8] A01H 5/00, [8] A01H 5/10 Индексы МПК [CA] Яо Кенинг, [CA] Поттс Дерек, [CA] Мэйлс Дарил Сведения об авторах [DE] БАСФ СЕ, [CA] ВАЙТЕРРА, ИНК. Сведения о патентообладателях [DE] БАСФ СЕ, [CA] ВАЙТЕРРА, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000025843b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) генома A Brassica, кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид (AHASL), имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и геном В, включающий ген AHASL генома В Brassica, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, оба вместе, обеспечивают синергический уровень резистентности к AHAS-ингибирующему гербициду указанному растению Brassica juncea.

2. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и геном В, включающий ген AHASL генома В Brassica, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид (AHASL), который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, оба вместе, предоставляют указанному растению Brassica juncea синергический уровень резистентности к AHAS-ингибирующему гербициду.

3. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.2, где ген AHASL в геноме А локализирован в локусе AHASL генома А.

4. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-3, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 10% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.

5. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.4, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 20% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.

6. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.5, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 30% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.

7. Часть устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где часть растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2, и часть растения выбрана из каллусов растений, протопластов растений, культур растительных клеток, стеблей, листьев, корней, соцветий, цветов, цветов компактного соцветия, плодов, цветоножек, плодоножек, тычинок, пыльников, рылец, столбиков, завязей, лепестков, чашелистиков, плодолистиков, кончиков корня, корневых чехликов, корневых волосков, волосков семени, пыльцевых зерен, микроспор, зародышей, семяпочек, семядолей, гипокотилей, эпикотилей, ксилем, флоэм, паренхим, эндоспермов, клеток-спутниц, замыкающих клеток.

8. Часть растения по п.7, где часть растения выбрана из пыльцы, протопластов и завязей.

9. Клетка устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где клетка растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2.

10. Семя устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где семя растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2.

11. Семя по п.10, где семя обработано препаратом для обработки семян, содержащим AHAS-ингибирующий гербицид.

12. Семя по п.11, где препарат для обработки семян включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатового гербицида.

13. Семя по п.12, где препарат для обработки семян включает имидазолиноновый гербицид.

14. Семя по п.13, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

15. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле с растениями рода Brassica, где указанный способ включает выращивание на поле устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6 и приведение в контакт указанного растения Brassica juncea и сорняков, растущих на поле, с эффективным количеством гербицида, ингибирующего AHAS, к которому растение Brassica juncea является устойчивым, осуществляя тем самым борьбу с сорняками.

16. Способ по п.15, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.

17. Способ по п.16, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

18. Способ по п.17, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

19. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле в непосредственной близости от семян растений рода Brassica, где указанный способ включает посев обработанного семени по любому из пп.11-13.

20. Способ по п.19, в котором гербицид, ингибирующий AHAS, включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидиного гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.

21. Способ по п.20, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

22. Способ по п.21, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

23. Семя по п.11, где семя обработано одним из следующих способов: опрыскивание семени, нанесение покрытия на семя, окатывание семени, опыление семени, пропитка семени, пеллетизация семени, или их комбинация.

24. Семя по п.11, где семя обработано перед посевом семени и/или после проращивания семени.

25. Способ отбора устойчивого к гербициду растения Brassica juncea из множества растений Brassica, включающий предоставление множества растений Brassica, которое может включать устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-6; нанесение эффективного количества AHAS-ингибирующего гербицида на указанное растение Brassica juncea и идентификацию растения Brassica juncea, способного расти в присутствии указанного гербицида, осуществляя тем самым отбор растения Brassica juncea, устойчивого к гербициду.

26. Способ по п.25, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.

27. Способ по п.26, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

28. Способ по п.27, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

29. Экспрессирующий вектор, содержащий: (a) первую молекулу полинуклеотида, большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или (b) первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2.

30. Трансформированное растение, которое трансформировано экспрессирующим вектором по п.29 и имеет повышенную устойчивость к AHAS-ингибирующему гербициду.

31. Растение по п.30, где гербицид выбран из группы, состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов и пиримидинилоксибензоатовых гербицидов.

32. Растение по п.31, где растение выбрано из В. juncea, В. napus, В. rapa, В. carinata, В. oleracea и В. nigra.

33. Способ получения трансгенного растения, имеющего повышенную устойчивость к AHAS-ингибирующим гербицидам, включающий стадии трансформации растительной клетки экспрессирующим вектором по п.29 и регенерации из растительной клетки трансгенного растения, которое экспрессирует полипептиды AHASL.

34. Способ идентификации или отбора устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растительной ткани или растения или его части из множества трансформированных растительных клеток, растительной тканей или растений или его частей, включающий получение множества трансформированных растительных клеток, растительной ткани или растений или его частей, которые могут включать трансформированную растительную клетку, растительную ткань или растение или его часть, которые содержат полинуклеотиды AHASL экспрессирующего вектора по п.29, причем полинуклеотиды AHASL кодируют мутантные полипептиды AHASL, которые обеспечивают устойчивость к AHAS-ингибирующему гербициду трансформированной растительной клетке, растительной ткани или растению или его части, экспрессирующие данные полипептиды, причем полипептиды используются в качестве селективных маркеров; осуществление контакта трансформированных растительных клеток, растительных тканей, растений или их частей по меньшей мере с одним AHAS-ингибирующим гербицидом; определение того, подвергается ли растительная клетка, растительная ткань, растение или его часть действию AHAS-ингибирующего гербицида; и идентификацию или отбор устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растительной ткани, растения или его части, которые содержат полинуклеотиды AHASL экспрессирующего вектора по п.29.

35. Способ получения устойчивого к AHAS-ингибирующему гербициду растения, включающий скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое не является устойчивым к гербициду, при этом первое растение является растением по любому из пп.1-6, и отбор растения-потомка, которое устойчиво к гербициду.

36. Устойчивое к AHAS-ингибирующему гербициду растение, полученное способом по п.35.

37. Семя растения по п.36, где семя содержит гены AHASL первого растения.

38. Способ получения устойчивого к AHAS-ингибирующему гербициду семени растения Brassica, при этом способ включает скрещивание первого растения Brassica со вторым растением Brassica с получением растения-потомка, где первое растение Brassica представляет собой устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-6; получение семян от растения-потомка.

39. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения масла из семени.

40. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения пищевого продукта на основе семени.

41. Способ идентификации растения по любому из пп.1-6, включающий: а) получение биологического материала из растения, b) осуществление ПЦР или исследования на основе гибридизации генов AHASL указанного биологического материала с целью определения (i) содержит ли его геном А ген AHASL, который кодирует первый полипептид AHASL, раскрытый в любом из пп.1-6, и (ii) содержит ли его геномом В ген AHASL, который кодирует второй полипептид AHASL, раскрытый в любом из пп.1, 2, и c) идентификацию растения, упомянутого на стадии а), имеющего признаки растения по любому из пп.1-6, основываясь на полученных результатах стадии b).

42. Способ по п.41, где указанным биологическим материалом является семя растения.

43. Способ по п.42, где гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида, пиримидинилоксибензоатного гербицида.

44. Способ по п.43, где гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

45. Способ по п.44, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

46. Способ получения устойчивого к гербициду растения Brassica juncea, где способ включает трансформацию клетки растения Brassica: (а) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или (b) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и регенерацию из растительной клетки растения Brassica, которое экспрессирует первый и второй полипептиды AHASL.

47. Способ получения устойчивого к гербициду растения Brassica juncea, где способ включает трансформацию клетки растения Brassica экспрессирующим вектором и регенерацию из растительной клетки Brassica растения Brassica, которое экспрессирует по крайней мере два устойчивых к гербициду полинуклеотида, представляющие собой большую субъединицу синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), где: (a) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, (b) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, (c) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или (d) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) генома A Brassica, кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид (AHASL), имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и геном В, включающий ген AHASL генома В Brassica, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, оба вместе, обеспечивают синергический уровень резистентности к AHAS-ингибирующему гербициду указанному растению Brassica juncea.

2. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и геном В, включающий ген AHASL генома В Brassica, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид (AHASL), который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, оба вместе, предоставляют указанному растению Brassica juncea синергический уровень резистентности к AHAS-ингибирующему гербициду.

3. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.2, где ген AHASL в геноме А локализирован в локусе AHASL генома А.

4. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-3, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 10% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.

5. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.4, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 20% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.

6. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.5, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 30% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.

7. Часть устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где часть растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2, и часть растения выбрана из каллусов растений, протопластов растений, культур растительных клеток, стеблей, листьев, корней, соцветий, цветов, цветов компактного соцветия, плодов, цветоножек, плодоножек, тычинок, пыльников, рылец, столбиков, завязей, лепестков, чашелистиков, плодолистиков, кончиков корня, корневых чехликов, корневых волосков, волосков семени, пыльцевых зерен, микроспор, зародышей, семяпочек, семядолей, гипокотилей, эпикотилей, ксилем, флоэм, паренхим, эндоспермов, клеток-спутниц, замыкающих клеток.

8. Часть растения по п.7, где часть растения выбрана из пыльцы, протопластов и завязей.

9. Клетка устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где клетка растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2.

10. Семя устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где семя растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2.

11. Семя по п.10, где семя обработано препаратом для обработки семян, содержащим AHAS-ингибирующий гербицид.

12. Семя по п.11, где препарат для обработки семян включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатового гербицида.

13. Семя по п.12, где препарат для обработки семян включает имидазолиноновый гербицид.

14. Семя по п.13, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

15. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле с растениями рода Brassica, где указанный способ включает выращивание на поле устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6 и приведение в контакт указанного растения Brassica juncea и сорняков, растущих на поле, с эффективным количеством гербицида, ингибирующего AHAS, к которому растение Brassica juncea является устойчивым, осуществляя тем самым борьбу с сорняками.

16. Способ по п.15, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.

17. Способ по п.16, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

18. Способ по п.17, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

19. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле в непосредственной близости от семян растений рода Brassica, где указанный способ включает посев обработанного семени по любому из пп.11-13.

20. Способ по п.19, в котором гербицид, ингибирующий AHAS, включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидиного гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.

21. Способ по п.20, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

22. Способ по п.21, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

23. Семя по п.11, где семя обработано одним из следующих способов: опрыскивание семени, нанесение покрытия на семя, окатывание семени, опыление семени, пропитка семени, пеллетизация семени, или их комбинация.

24. Семя по п.11, где семя обработано перед посевом семени и/или после проращивания семени.

25. Способ отбора устойчивого к гербициду растения Brassica juncea из множества растений Brassica, включающий предоставление множества растений Brassica, которое может включать устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-6; нанесение эффективного количества AHAS-ингибирующего гербицида на указанное растение Brassica juncea и идентификацию растения Brassica juncea, способного расти в присутствии указанного гербицида, осуществляя тем самым отбор растения Brassica juncea, устойчивого к гербициду.

26. Способ по п.25, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.

27. Способ по п.26, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

28. Способ по п.27, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

29. Экспрессирующий вектор, содержащий: (a) первую молекулу полинуклеотида, большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или (b) первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2.

30. Трансформированное растение, которое трансформировано экспрессирующим вектором по п.29 и имеет повышенную устойчивость к AHAS-ингибирующему гербициду.

31. Растение по п.30, где гербицид выбран из группы, состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов и пиримидинилоксибензоатовых гербицидов.

32. Растение по п.31, где растение выбрано из В. juncea, В. napus, В. rapa, В. carinata, В. oleracea и В. nigra.

33. Способ получения трансгенного растения, имеющего повышенную устойчивость к AHAS-ингибирующим гербицидам, включающий стадии трансформации растительной клетки экспрессирующим вектором по п.29 и регенерации из растительной клетки трансгенного растения, которое экспрессирует полипептиды AHASL.

34. Способ идентификации или отбора устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растительной ткани или растения или его части из множества трансформированных растительных клеток, растительной тканей или растений или его частей, включающий получение множества трансформированных растительных клеток, растительной ткани или растений или его частей, которые могут включать трансформированную растительную клетку, растительную ткань или растение или его часть, которые содержат полинуклеотиды AHASL экспрессирующего вектора по п.29, причем полинуклеотиды AHASL кодируют мутантные полипептиды AHASL, которые обеспечивают устойчивость к AHAS-ингибирующему гербициду трансформированной растительной клетке, растительной ткани или растению или его части, экспрессирующие данные полипептиды, причем полипептиды используются в качестве селективных маркеров; осуществление контакта трансформированных растительных клеток, растительных тканей, растений или их частей по меньшей мере с одним AHAS-ингибирующим гербицидом; определение того, подвергается ли растительная клетка, растительная ткань, растение или его часть действию AHAS-ингибирующего гербицида; и идентификацию или отбор устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растительной ткани, растения или его части, которые содержат полинуклеотиды AHASL экспрессирующего вектора по п.29.

35. Способ получения устойчивого к AHAS-ингибирующему гербициду растения, включающий скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое не является устойчивым к гербициду, при этом первое растение является растением по любому из пп.1-6, и отбор растения-потомка, которое устойчиво к гербициду.

36. Устойчивое к AHAS-ингибирующему гербициду растение, полученное способом по п.35.

37. Семя растения по п.36, где семя содержит гены AHASL первого растения.

38. Способ получения устойчивого к AHAS-ингибирующему гербициду семени растения Brassica, при этом способ включает скрещивание первого растения Brassica со вторым растением Brassica с получением растения-потомка, где первое растение Brassica представляет собой устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-6; получение семян от растения-потомка.

39. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения масла из семени.

40. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения пищевого продукта на основе семени.

41. Способ идентификации растения по любому из пп.1-6, включающий: а) получение биологического материала из растения, b) осуществление ПЦР или исследования на основе гибридизации генов AHASL указанного биологического материала с целью определения (i) содержит ли его геном А ген AHASL, который кодирует первый полипептид AHASL, раскрытый в любом из пп.1-6, и (ii) содержит ли его геномом В ген AHASL, который кодирует второй полипептид AHASL, раскрытый в любом из пп.1, 2, и c) идентификацию растения, упомянутого на стадии а), имеющего признаки растения по любому из пп.1-6, основываясь на полученных результатах стадии b).

42. Способ по п.41, где указанным биологическим материалом является семя растения.

43. Способ по п.42, где гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида, пиримидинилоксибензоатного гербицида.

44. Способ по п.43, где гербицид включает имидазолиноновый гербицид.

45. Способ по п.44, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.

46. Способ получения устойчивого к гербициду растения Brassica juncea, где способ включает трансформацию клетки растения Brassica: (а) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или (b) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и регенерацию из растительной клетки растения Brassica, которое экспрессирует первый и второй полипептиды AHASL.

47. Способ получения устойчивого к гербициду растения Brassica juncea, где способ включает трансформацию клетки растения Brassica экспрессирующим вектором и регенерацию из растительной клетки Brassica растения Brassica, которое экспрессирует по крайней мере два устойчивых к гербициду полинуклеотида, представляющие собой большую субъединицу синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), где: (a) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, (b) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, (c) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или (d) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5.


Евразийское
патентное
ведомство
025843
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 200970925
(22) Дата подачи заявки 2008.04.03
(51) Int. Cl.
C12N15/82 (2006.01) C12N 9/00 (2006.01) C12N 9/88 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) A01H 5/10 (2006.01)
(54) УСТОЙЧИВОЕ К ГЕРБИЦИДУ РАСТЕНИЕ BRASSICA JUNCEA, СПОСОБ БОРЬБЫ С СОРНЯКАМИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ УСТОЙЧИВОГО К ГЕРБИЦИДУ РАСТЕНИЯ BRASSICA JUNCEA
(31) 60/910,008
(32) 2007.04.04
(33) US
(43) 2010.04.30
(86) PCT/IB2008/002645
(87) WO 2009/031031 2009.03.12
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАСФ СЕ (DE); ВАЙТЕРРА, ИНК. (CA)
(72) Изобретатель:
Яо Кенинг, Поттс Дерек, Мэйлс Дарил
(CA)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-2005283858
RAY K. ET AL.: "Mutant acetolactate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (oilseed mustard)". JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, FISCHER, STUTTGART, DE, vol. 161, no. 9, 20 September 2004 (2004-09-20), pages 1079-1083, XP004955445, ISSN: 0176-1617 abstract; pages 1080
and 1082
TAN S. ET AL.: "Herbicidal inhibitors of
amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant crops".
AMINO ACIDS; THE FORUM FOR AMINO ACID AND PROTEIN RESEARCH, SPRINGER-
VERLAG, VI, vol. 30, no. 2, 1 March 2006 (2006-03-01), pages 195-204, XP019379389, ISSN: 1438-2199. Figures 1 and 2; table 1; pages 198, 199
and 201
US-A1-2004171027 US-A1-2002138866
TAN S. ET AL.: "IMIDAZOLINONE-
TOLERANT CROPS: HISTORY, CURRENT STATUS AND FUTURE". PEST MANAGEMENT
SCIENCE, WILEY & SONS, BOGNOR REGIS, GB, vol. 61, no. 3, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 246-257, XP009058795, ISSN: 1526-498X. Abstract;
pages 247-250; table 2
DUGGLEBY R.G. ET AL.: "ACETOHYDROXYACID SYNTHASE". JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND
MOLECULAR BIOLOGY, vol. 33, no. 1, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 1-36, XP001119823, ISSN: 1225-8687. Figure 3; tables 1 and 4; pages 20-27
WO-A-2006007373
WO-A-03014357
WO-A-2009046334
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка притязает на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США № 60/910008, поданной 4 апреля 2007 года, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Brassica и новым поли-нуклеотидным последовательностям, которые кодируют белки большой субъединицы синтазы ацетогид-роксикислоты растений Brassica дикого типа и резистентных к имидазолинонам, к семенам и способам применения таких растений.
Уровень техники
Синтаза ацетогидроксикислоты (AHAS; ЕС 4.1.3.18, также известная как ацетолактатсинтаза или ALS) является первым ферментом, который катализирует биохимический синтез аминокислот с разветвленной цепью валина, лейцина и изолейцина (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine", в Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247). AHAS является местом действия пяти структурно отличающихся семейств гербицидов, включая сульфонилмочевины (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith и Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620626; LaRossa и Falco (1984) Trends Biotechnol. 2: 158-161), имидазолиноны (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546), триазолопиримидины (Subramanian и Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines", в Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. и Sonnet, P.E. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288), Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith и Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626, сульфониламинокарбо-нилтриазолиноны (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61: 246-57; Mallory-Smith и Retzinger (2003) Weed Technology 17: 620-626). Гербициды на основе имидазолинона и сульфонилмочевины широко используются в настоящее время в сельском хозяйстве благодаря их эффективности при очень низких нормах внесения и относительной нетоксичности для животных. Посредством ингибирования активности AHAS указанные семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие чувствительных растений, включая многие виды сорняков. Некоторыми примерами коммерчески доступных имидазолиноновых гербицидов являются PURSUIT(r) (имазетапир), SCEPTER(r) (имазахин) и ARSENAL(r) (имазапир). Примерами гербицидов на основе сульфонилмочевин являются хлорсульфурон, метсульфуронметил, суль-фометуронметил, хлоримуронэтил, тифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, нико-сульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисуль-фуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил и галосульфурон.
Вследствие высокой эффективности и низкой токсичности, имидазолиноновые гербициды являются предпочтительными для применения посредством опрыскивания сверху большой площади поверхности, занятой растительностью. Возможность распылять гербицид сверху над большой площадью растительности снижает затраты, связанные с посадкой и поддержанием насаждений, и снижает необходимость в подготовке места перед применением таких химикатов. Опыление сверху требуемого толерантного вида также дает возможность достигать максимального потенциально возможного урожая требуемого вида благодаря отсутствию конкурирующих видов. Однако возможность применения такой методики опыления сверху зависит от присутствия резистентного к имидазолинону вида нужных растений на опыляемой площади.
Среди основных сельскохозяйственных культур некоторые виды бобовых, такие как соя, резистентны к имидазолиноновым гербицидам от природы, благодаря своей способности быстро метаболи-зировать гербицидные соединения (Shaner и Robinson (1985) Weed Sd. 33: 469-471). Другие культуры, такие как кукуруза (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882886) и рис (Barrett et al. (1989) Crop Saf-eners for Herbicides, Academic Press, New York, pp. 195-220) в определенной степени чувствительны к имидазолиноновым гербицидам. Различная чувствительность к имидазолиноновым гербицидам зависит от химической природы конкретного гербицида и разного метаболизма соединения из токсичной в нетоксичную форму в каждом растении (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76: 545-546; Brown et al., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27: 24-29). Другие физиологические различия растений, такие как всасывание и передвижение вещества, также играют важную роль в чувствительности (Shaner и Robinson (1985) Weed
Sd. 33: 469-471).
Растения, резистентные к имидазолинонам, сульфонилмочевинам и триазолопиримидинам, были успешно получены с использованием мутагенеза семени, микроспоры, пыльцы и каллуса Zea mays, Ara-bidopsis thaliana, Brassica napus (т.е. канолы), Glycine max, Nicotiana tabacum и Oryza sativa (Sebastian et al. (1989) Crop. Sci. 29: 1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78: 525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83: 65-70; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97: 1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity 84: 91-96; патент США № 5545822). Во всех случаях резистентность придает один не полностью доминантный ядерный ген. Четыре резистентных к имидазолинону растений пшеницы также были ранее выделены после мутагенеза семян Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886). Исследования наследования подтвердили, что резистентность придает один не полностью до
минантный ген. На основании исследований аллелей авторы пришли к выводу, что мутации в четырех идентифицированных линиях находились в одном и том же локусе. Один из генов резистентности культурного сорта Fidel назван FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100: 882-886).
В результате компьютерного моделирования трехмерной конформации комплекса AHAS-ингибитор спрогнозировано наличие нескольких аминокислот в предполагаемом кармане связывания ингибитора в качестве сайтов, индуцированные мутации в которых вероятно могли бы придавать избирательную резистентность к имидазолинонам (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368). Растения пшеницы, полученные с некоторыми из таких рационально сконструированных мутаций в предполагаемых сайтах связывания фермента AHAS действительно обладали специфичной резистентностью к одному классу гербицидов (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 359-368). О резистентности растений к имидазоли-ноновым гербицидам также сообщалось в нескольких патентах. В патентах США № 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 и 6222100 в общем описано применение измененного гена AHAS для того, чтобы вызвать резистентность к гербицидам у растений, и в частности, описаны некоторые резистентные к имидазолинонам линии кукурузы. В патенте США № 5013659 описаны растения, обладающие резистентностью к гербицидам вследствие мутаций по меньшей мере в одной аминокислоте в одном или нескольких консервативных областях. Описанный в указанной публикации мутации кодируют либо перекрестную резистентность к имидазолинонам и сульфонилмочевинам, либо специфичную резистентность к сульфонилмочевинам, но специфичная к имидазолинонам резистентность не описана. В патенте США № 5731180 и патенте США № 5767361 обсуждается изолированный ген, имеющий одну аминокислотную замену в аминокислотной последовательности AHAS однодольного растения дикого типа, который приводит к специфичной к имидазолинонам резистентности. Кроме того, были созданы растения риса, которые резистентны к гербицидам, которые отрицательно влияют на AHAS, в результате селекции мутаций, а также с помощью отбора резистентных к гербицидам растений из пула растений риса, полученных в результате культивирования пыльника. Смотрите патенты США № 5545822, 5736629, 5773703, 5773704,5952553 и 6274796.
В растениях, также как во всех других исследованных организмах, фермент AHAS состоит из двух субъединиц: большой субъединицы (каталитическая роль) и малой субъединицы (регуляторная роль) (Duggleby и Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33: 1-36). Большая субъединица AHAS (также называемая в настоящем описании AHASL) может кодироваться одним геном, как в случае Arabidopsis и риса, или несколькими представителями семейства генов, как у кукурузы, канолы и хлопка. Специфичные одно-нуклеотидные замены в большой субъединице придают ферменту некоторую степень нечувствительности к одному или нескольким классам гербицидов (Chang и Duggleby (1998) Biochem J. 333: 765-777).
Например, пшеница обыкновенная, Triticum aestivum L., содержит три гомологичных гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот. Каждый из генов экспрессируется на значительном уровне, о чем свидетельствует реакция на гербициды и биохимический данные, полученные для мутантов по каждому из трех генов (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17). Кодирующие последовательности всех трех генов имеют обширную гомологию на нуклеотидном уровне (WO 03/014357). Посредством секвенирования генов AHASL нескольких сортов Triticum aestivum обнаружено, что молекулярной основой толерантности к гербицидам у большинства IMI-толерантных (толерантных к имидазолинонам) линий является мутация Ser653(At)Asn, означающая замену серина на аспарагин в положении, эквивалентном присутствию серина в положении аминокислоты 653 у Arabidopsis thaliana (WO 03/014357). Указанная мутация является следствием одно-нуклеотидного полиморфизма (SNP) в последовательности ДНК, кодирующей белок AHASL.
Также известно, что многочисленные гены AHASL встречаются у видов двудольных растений. Недавно, Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) сообщили об идентификации, клонировании и секвенировании трех генов AHASL (AHASL1, AHASL2 и AHASL3) из резистентных к гербицидам генотипов и генотипов дикого типа подсолнечника (Helianthus annuus L.). Kolkman et al. сообщили, что резистентность к гербицидам является следствием либо замены Pro197Leu (используется обозначение положений аминокислот AHASL), либо замены Ala205Val в белке AHASL1, и что каждая из указанных замен придавала резистентность как к имидазолиноновым гербицидам, так и гербицидам на основе сульфонилмочевины.
Принимая во внимание высокую эффективность и низкую токсичность, имидазолиноновые гербициды являются предпочтительными для применения в сельском хозяйстве. Однако возможность применения имидазолиноновых гербицидов в конкретной системе возделывания сельскохозяйственных культур зависит от возможности использования резистентных к имидазолинонам сортов представляющего интерес культурного растения. Чтобы фермеры могли более гибко использовать типы и нормы внесения имидазолиноновых гербицидов и гербициды на основе сульфонилмочевины, часто требуется более высокая степень толерантности к гербицидам. Также для селекционеров растений, которые разрабатывают толерантные к гербицидам сорта, желательна работа с мутациями, которые обеспечивают более высокую толерантность к гербицидам, обеспечивающим для селекционеров большую гибкость в подборе исходной зародышевой плазмы, которую они используют для создания новых сортов. Чтобы получить такие резистентные к имидазолинонам сорта, селекционерам растений необходимо создавать дополнительные
селекционные линии, предпочтительно с повышенной резистентностью к имидазолинонам. Таким образом, необходимы дополнительные резистентные к имидазолинонам селекционные линии и сорта культурных растений, а также способы и композиции для получения и применения резистентных к имидазо-линонам селекционных линий и сортов.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к растениям Brassica, обладающим повышенной резистентностью к гербицидам, по сравнению с растением Brassica дикого типа. В частности, растения Brassica согласно изобретению обладают повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, который отрицательно влияет на активность фермента AHAS по сравнению с растением Brassica дикого типа. Растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), который кодирует резистентный к гербициду полипептид AHASL, при этом полипептид AHASL выбран из группы, состоящей из: а) полипептида, имеющего аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO:1 или положению 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или положению 635 в последовательности SEQ ID NO:3; b) полипептида, имеющего треонин в положении, соответствующем положению 122 в последовательности SEQ ID NO:1 или положению 107 в последовательности SEQ ID NO:4, или положению 104 в последовательности SEQ ID NO:5; и с) полипептида, имеющего лейцин в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO:1 или положению 557 в последовательности SEQ ID
NO:6.
Настоящее изобретение также относится к повышенной устойчивости к гербицидам, которая достигается в случае сочетания мутаций AHAS из разных геномов в растении В. juncea. В одном примере растения, сочетающие в себе мутацию bR (AHAS1) (в геноме В Brassica juncea) с введенной в результате интрогрессии мутацией РМ2 (AHAS3) (в геноме A Brassica napus, интрогрессированной в Brassica juncea). Полученная устойчивость гибридов значительно повышена и оказывает неожиданный синерге-тический эффект по сравнению с эффектом, который наблюдается в современном коммерческом продукте, в котором сочетаются РМ1 и РМ2. В другом примере предлагается растение В. juncea, в котором сочетаются мутации aR (AHAS1) (в геноме А В. juncea) с мутацией А107Т (в геноме В В. juncea), которые также обеспечивают синергетические уровни устойчивости к гербицидам по сравнению с растениями, сочетающими в себе мутации РМ1 и РМ2.
В одном варианте настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам двойным му-тантным растениям Brassica, которые происходят из линии Brassica, которая была названа J05Z-07801. В другом варианте настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Brassica, которые происходят из линии Brassica, которая была названа J04E-0139. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Brassica, которые происходят из линии Brassica, которая была названа J04E-0130. В еще одном варианте, настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Brassica, которые происходят из линии Brassica, которая была названа J04E-0122.
Резистентное к гербицидам растение Brassica согласно изобретению может содержать одну, две, три, четыре или больше копий гена или полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок AHASL согласно изобретению. Резистентное к гербицидам растение Brassica согласно изобретению может содержать ген или полинуклеотид, кодирующий резистентный к гербицидам белок AHASL, содержащий одиночную, двойную или большее количество мутаций. Растения Brassica согласно изобретению также включают семена и растения-потомки, которые содержат по меньшей мере одну копию гена или полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок AHASL согласно изобретению. Семена или полученные из них растения-потомки, которые содержат один полинуклеотид, кодирующий полипептид AHASL, содержащий одиночную, двойную или большее количество мутаций, или два или более полинуклеотидов, кодирующих полипептиды AHASL с одиночной мутацией, имеют неожиданно более высокий уровень устойчивости к AHAS-ингибирующему гербициду, например, имидазолиноново-му гербициду или гербициду на основе сульфонилмочевины, чем предполагается на основании данных о наличии полипептидов AHASL с одиночной мутацией в одном растении. В растениях и их потомстве наблюдается синергетический эффект, а не аддитивный эффект в отношении устойчивости к гербицидам, при этом уровень устойчивости к гербицидам у растений и их потомства, содержащих множественные мутации, выше чем уровень устойчивости к гербицидам у растения, содержащего белок AHASL с единичной мутацией.
Настоящее изобретение относится к способу борьбы с сорняками, растущими рядом с нетрансген-ными и трансгенными резистентными к гербицидам растениями согласно изобретению. Такие растения включают, например, резистентные к гербицидам растения Brassica, описанные выше, и растения, трансформированные молекулой полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок AHASL согласно изобретению. Трансформированные растения содержат в своих геномах по меньшей мере одну кассету экспрессии, содержащую промотор, который управляет экспрессией гена в растительной клетке, при этом промотор оперативно связан с полинуклеотидом AHASL согласно изобретению. Способ включает в себя применение эффективного количества гербицида по отношению к сорнякам и
резистентному к гербицидам растению, при этом резистентное к гербицидам растение имеет повышенную резистентность по меньшей мере к одному гербициду, в частности к имидазолиноновому или суль-фонилмочевинному гербициду, по сравнению с растением дикого типа или нетрансформированным растением. Настоящее изобретение относится к способам повышения активности AHAS в растении для получения резистентного к гербицидам растения и для повышения устойчивости к гербицидам уже устойчивого к гербицидам растения. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы включают в себя трансформацию растительной клетки полинуклеотидной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке, и регенерацию трансформированного растения из трансформированной растительной клетки. Нуклеотидная последовательность выбрана из таких нуклеотидных последовательностей, которые кодируют резистентные к гербицидам белки AHASL согласно изобретению. В других вариантах способы включают в себя обычную селекцию растений, которая заключается в перекрестном опылении резистентного к гербицидам растения согласно изобретению с другим растением и, кроме того, может включать в себя отбор потомства, которое обладает свойствами резистентности к гербицидам родительского растения, которое является резистентным к гербицидам растением согласно изобретению.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к изолированным молекулам полинуклеотидов и изолированным полипептидам белков AHASL Brassica. Молекулы полинуклеотидов согласно изобретению содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют резистентные к гербицидам белки AHASL согласно изобретению. Резистентные к гербицидам белки AHASL согласно изобретению содержат полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из а) нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO:13; b) нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO:14; с) нуклеотидной последовательности, указанной в SEQ ID NO:15; d) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:13, при этом белок имеет аспарагин в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO:1, или положению 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или положению 635 в последовательности SEQ ID NO:3; е) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с нуклеотид-ной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:14, при этом белок имеет треонин в положении, соответствующем положению 122 в последовательности SEQ ID NO:1, или положению 107 в последовательности SEQ ID NO:4, или положению 104 в последовательности SEQ ID NO:5; f) нуклеотидной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 90% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:15, при этом белок имеет треонин в положении, соответствующем положению 122 в последовательности SEQ ID NO:1, или положению 107 в последовательности SEQ ID NO:4, или положению 104 в последовательности SEQ ID NO:5. Вышеуказанный белок AHASL дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из а) аспарагина в положении, соответствующем положению 653 в последовательности SEQ ID NO:1, или положению 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или положению 635 в последовательности SEQ ID NO:3; b) треонина в положении, соответствующем положению 122 в последовательности SEQ ID NO:1, или положению 107 в последовательности SEQ ID NO:4, или положению 104 в последовательности SEQ ID NO:5; и с) лейцина в положении, соответствующем положению 574 в последовательности SEQ ID NO:1 или положению 557 в последовательности SEQ ID NO:6.
Также предлагаются кассеты экспрессии, векторы для трансформации, трансформированные клетки-хозяева, отличные от клеток человека, и трансформированные растения, части растений и семена, которые содержат одну или несколько молекул полинуклеотидов согласно изобретению.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображено выравнивание нуклеотидных последовательностей кодирующих областей гена AHASL дикого типа из Arabidopsis thaliana (AtAHASL, SEQ ID NO:11), резистентного к гербицидам гена BjAHASL1B-S653N Brassica juncea из линии J04E-0044 (J04E-0044, SEQ ID NO:12), резистентного к гербицидам гена BjAHASL1A-S653N Brassica juncea из линии J04E-0139 (J04E-0139, SEQ ID NO:13), резистентного к гербицидам гена BjAHASL1B-А122Т Brassica juncea из линии J04E-0130 (J04E-0130, SEQ ID NO:14), резистентного к гербицидам гена BjAHASL1A-A122T Brassica juncea из линии J04E-0122 (BjAHASL1A, SEQ ID NO:15), резистентного к гербицидам гена BnAHASL1A-W574L Brassica napus из линии РМ2 (BnAHASL1A, SEQ ID NO:16), гена BjAHASL1A дикого типа Brassica juncea (BjAHASL1A, SEQ ID NO:17), гена BjAHASL1B дикого типа Brassica juncea (BjAHASL1B, SEQ ID NO:18), гена BnA-HASL1A дикого типа Brassica napus (BnAHASL1A, SEQ ID NO:19), гена BnAHASL1C дикого типа Brassica napus (BnAHASL1C, SEQ ID NO:20). Анализ осуществляли с помощью пакета программ Vector NTI, использующих алгоритм Fast Algorithm (открытие пробела 15, продолжение пробела 6,66 и разделение пробелов 8, матрица swgapdnamt).
На фиг. 2 изображено выравнивание аминокислотных последовательностей гена AHASL дикого типа из Arabidopsis thaliana (AtAHASL, SEQ ID NO:1), резистентного к гербицидам гена BjAHASL1B-S653N Brassica juncea из линии J04E-0044 (J04E-0044, SEQ ID NO:2), резистентного к гербицидам гена BjAHASL1A-S653N Brassica juncea из линии J04E-0139 (J04E-0139, SEQ ID NO:3), резистентного к гер
бицидам гена BjAHASL1B-A122T Brassica juncea из линии J04E-0130 (J04E-0130, SEQ ID N0:4), резистентного к гербицидам гена Bj AHASL 1A-A122T Brassica juncea из линии J04E-0122 (J04E-0122, SEQ ID NO:5), резистентного к гербицидам гена BnAHASL1A-W574L Brassica napus из линии РМ2 (BnA-HASL1A, SEQ ID NO:6), гена BjAHASL1A дикого типа Brassica juncea (BjAHASL1A, SEQ ID NO:7), гена BjAHASL1B дикого типа Brassica juncea (BjAHASL1B, SEQ ID NO:8), гена BnAHASL1A дикого типа Brassica napus (BnAHASL1A, SEQ ID NO:9), гена BnAHASL1C дикого типа Brassica napus (BnAHASL1C, SEQ ID NO:10). Анализ осуществляли, используя пакет программ Vector NTI (штраф за открытие пробела равен 10, штраф за продолжение пробела равен 0,05, штраф за разделение пробелов равен 8, матрица blosum 62МТ2).
Фиг. 3 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую результаты анализа активности фермента AHAS для линий растений В. juncea.
Фиг. 4 представляет собой диаграмму, показывающую результаты анализа опрыскивания в теплице линий растений В. juncea.
На фиг. 5 приведена таблица, показывающая идентификационные номера соответствующих последовательностей ДНК или белка.
На фиг. 6 показана активность фермента AHAS в белковых экстрактах, выделенных из гомозиготных линий В. juncea, линий, содержащих сочетания мутаций aR, bR, A107T и А104Т В. juncea друг с другом и с интрогрессированной в В. juncea мутацией РМ2, при концентрации имазамокса 100 мкМ.
На фиг. 7 показано среднее значение повреждения растений (фитотоксичность) линий F2 В. juncea, имеющих разную зиготность и разные сочетания мутаций AHAS aR и А107Т, через 2 недели после опрыскивания теплицы 35 г активного ингредиента имазамокса/га.
На фиг. 8 показано среднее значение фитотоксичности для растений линий DH В. juncea, содержащих сочетания мутаций В. juncea aR, bR, A107T и А104Т друг с другом и с интрогрессированной в В. juncea мутацией РМ2, после опрыскивания 35 г активного ингредиента имазамокса/га (Raptor(r)).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к растениям Brassica, имеющим повышенную резистентность к гербицидам по сравнению с растением Brassica дикого типа. Резистентные к гербицидам растения Bras-sica получали как подробно описано ниже, воздействуя на изолированные микроспоры Brassica дикого типа (в отношении резистентности к гербицидам) мутагеном, культивируя микроспоры в присутствии эффективного количества имидазолинонового гербицида и отбирая выжившие зародыши. Из выживших зародышей получали гаплоидные растения Brassica и затем хромосомы удваивали, чтобы получить способные к размножению дигаплоидные растения Brassica, которые имеют повышенную резистентность к имидазолиноновому гербициду по сравнению с резистентностью растения Brassica дикого типа. В одном варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, называемой в настоящем описании J04E-0139, которая была получена в результате мутагенеза микроспор, как подробно описано ниже. В другом варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, называемой в настоящем описании J04E-0130, которая была получена в результате мутагенеза микроспор. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, называемой в настоящем описании J04E-0122, которая была получена в результате мутагенеза микроспор. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, называемой в настоящем описании J05Z-07801, которая была получена скрещиванием
мутантной линии В. juncea bR (U.S. 2005/0283858) с мутантной линией РМ2 (смотрите US 2004/0142353 и US 2004/0171027; также смотрите Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, 1995), которая исходно была получена в результате интрогрессии в Brassica juncea из Brassica napus.
Таким образом, настоящее изобретение относится к растениям Brassica juncea, обладающим резистентностью к гербицидам, ингибирующим AHAS. Предлагаются линии В. juncea, которые содержат одиночную мутацию по меньшей мере в одном полинуклеотиде AHASL, при этом одиночная мутация выбрана из группы, состоящей из трансверсии G-на-А, которая соответствует аминокислоте в положении 653 последовательности AHASL1 Arabidposis thaliana, и трансверсии G-на-А, которая соответствует аминокислоте в положении 122 последовательности AHASL1 A. thaliana.
Из резистентных к гербицидам растений Brassica juncea J04E-0139 и растений Brassica juncea дикого типа выделяли кодирующую область гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (называемого AHASL1) посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирова-ли. В результате сравнения полинуклеотидных последовательностей резистентных к гербицидам растений Brassica и растений Brassica дикого типа было обнаружено, что кодирующая область полинуклео-тидной последовательности AHASL1 из резистентного к гербицидам растения Brassica локализована в геноме A Brassica juncea и отличается от полинуклеотидной последовательности AHASL1 растения дикого типа одним нуклеотидом в результате трансверсии G-на-А (фиг. 1). Указанная трансверсия G-на-А в полинуклеотидной последовательности AHASL1 приводит к новой замене Ser на Asn в положении аминокислоты 635 (соответствующей аминокислоте 653 AHASL1 A. thaliana) в консервативной области рассчитанной аминокислотной последовательности белка AHASL1 в сравнении с аминокислотной последовательностью белка AHASL1 дикого типа (фиг. 2).
Из резистентных к гербицидам растений Brassica juncea J04E-0130 и растений Brassica juncea дикого типа выделяли кодирующую область гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (называемого AHASL1) посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирова-ли. В результате сравнения полинуклеотидных последовательностей резистентных к гербицидам растений Brassica и растений Brassica дикого типа было обнаружено, что кодирующая область полинуклео-тидной последовательности AHASL1 из резистентной к гербицидам линии Brassica J04E-0130 локализована в геноме В Brassica juncea и отличается от полинуклеотидной последовательности AHASL1 растения дикого типа одним нуклеотидом в результате трансверсии G-на-А (фиг. 1). Указанная трансверсия G-на-А в полинуклеотидной последовательности AHASL1 приводит к новой замене Ala на Thr в положении аминокислоты 107 (соответствующей аминокислоте 122 AHASL1 A. thaliana) в консервативной области рассчитанной аминокислотной последовательности белка AHASL1 в сравнении с аминокислотной последовательностью белка AHASL1 дикого типа (фиг. 2).
Из резистентных к гербицидам растений Brassica juncea J04E-0122 и растений Brassica juncea дикого типа выделяли кодирующую область гена большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (называемого AHASL1) посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирова-ли. В результате сравнения полинуклеотидных последовательностей резистентных к гербицидам растений Brassica и растений Brassica дикого типа было обнаружено, что кодирующая область полинуклео-тидной последовательности AHASL1 из резистентной к гербицидам линии Brassica J04E-0122 локализована в геноме A Brassica juncea и отличается от полинуклеотидной последовательности AHASL1 растения дикого типа одним нуклеотидом в результате трансверсии G-на-А (фиг. 1). Указанная трансверсия G-на-А в полинуклеотидной последовательности AHASL1 приводит к новой замене Ala на Thr в положении аминокислоты 104 (соответствующей аминокислоте 122 AHASL1 A. thaliana) в консервативной области рассчитанной аминокислотной последовательности белка AHASL1 в сравнении с аминокислотной последовательностью белка AHASL1 дикого типа (фиг. 2).
Настоящее описание также относится к растениям В. juncea, которые содержат, по меньшей мере, два мутантных полинуклеотида AHASL. Такие растения также называют в настоящем описании растениями, содержащими "сочетанные" мутации. Мутации могут быть в одном и том же или в разных геномах растения В. juncea. Растения В. juncea могут содержать любое количество мутантных полинуклеоти-дов AHASL и любое сочетание мутаций, включая без ограничения мутации, соответствующие положению 653 в последовательности SEQ ID NO:1, положению 638 в последовательности SEQ ID NO:2, положению 635 в последовательности SEQ ID NO:3, положению 122 в последовательности SEQ ID NO:1, положению 107 в последовательности SEQ ID NO:4, положению 104 в последовательности SEQ ID NO:5, положению 574 в последовательности SEQ ID NO:1 или положению 557 в последовательности SEQ ID
NO:6.
Также в настоящем изобретении предлагаются растения В. juncea, имеющие два мутантных поли-нуклеотида AHASL в разных геномах, один мутантный полинуклеотид AHASL в геноме А и второй му-тантный полинуклеотид AHASL в геноме В. Такие растения В. juncea, имеющие два мутантных поли-нуклеотида AHASL, включают растения, содержащие мутацию bR мутация и мутацию РМ2. К таким растениям относятся растения В. juncea линии J05Z-07801, а также их семена и потомство, а также потомки, полученные от скрещиваний с линией В. juncea J05Z-07801. В другом аспекте растения В. juncea, имеющие две мутации AHASL, включают растения, в которых сочетается мутация aR (например, из линии J04E-0139) с мутацией А122Т (например, из линии J04E-0130), в линии потомков В. juncea. В одном аспекте такие растения, сочетающие в себе две мутации AHASL1, имеют синергетический уровень устойчивости к гербицидам по сравнению с аддитивными уровнями устойчивости к гербицидам растений В. juncea, содержащих соответствующие отдельные мутации.
Мутации РМ1 и РМ2 получали, используя мутагенез микроспор Brassica napus, как описано в Swan-son et al. (Plant Cell Reports 7: 83-87(1989)). Мутация РМ2 характеризуется заменой одного нуклеотида (G на Т) на 3'-конце гена AHAS3, предположительно в геноме A Brassica napus (Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229: 31-40 (1991)), что приводит к аминокислотной замене Trp на Leu, Trp556(Bn)Leu (Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246: 419-425, 1995). Мутация РМ1, предположительно присутствующая в геноме С Brassica napus (Rutledge et al. Mol. Gen. Genet. 229: 31-40 (1991)), характеризуется заменой одного нук-леотида в геноме AHAS1 (G на А), приводящей к аминокислотной замене Ser на Asn, Ser638(Bn)Asn (смотрите Sathasivan et al., Plant Physiol. 97: 1044-1050, 1991, и Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 232: 167-173, 1992; также смотрите US 2004/0142353 и US 2004/0171027). Сообщалось, что мутантные гены РМ1 (AHAS1) и РМ2 (AHAS3) действуют аддитивно, обеспечивая устойчивость к имидазолиноновым гербицидам (Swanson et al., Theor. Appl. Genet. 78: 525-530, 1989).
Поскольку полагают, что РМ2 локализована в геноме А Brassica napus, и оба вида: Brassica juncea и Brassica rapa, содержат геном А, то перенос мутантного гена РМ2 из napus либо в juncea, либо в rapa можно осуществить, используя скрещивание видов (интрогрессию) и отбор при селекции у условиях низких уровней гербицида. Поскольку полагают, что РМ1 локализована в геноме С Brassica napus, то интрогрессия такого мутанта из В. napus в Brassica juncea (А,В) или Brassica rapa (А,А) намного более сложна, так как она зависит от того произойдет ли редкое событие хромосомной транслокации (между
геномом С Brassica napus и либо геномом А, либо геномом В Brassica juncea). Такое событие хромосомной транслокации часто может быть отягощено отсутствием стабильности, а также неспособностью исключить сопротивление связывания, которое часто имеет место при использовании такого способа. В патенте США № 6613963 описаны устойчивые к гербицидам растения Brassica juncea PM1/PM2, полученные с использованием такого способа интрогрессии. Исходя из аддитивной устойчивости, обеспечиваемой мутациями РМ1 и РМ2 у В. napus, можно ожидать, что интрогрессия двух мутаций, РМ1 и РМ2, в Brassica juncea также приведет в аддитивной устойчивости к гербицидам.
Чтобы преодолеть проблемы, связанные с переносом признака устойчивости к гербицидам из генома С Brassica napus в геномы А или В Brassica rapa и/или Brassica juncea, предпочтительно прямое получение мутации в требуемом геноме. В заявке на выдачу патента США 2005/0283858 описана устойчивая к гербицидам мутация AHAS1 Brassica juncea, bR, которую получали прямым мутагенезом, приводящим к SNP в гене AHAS1, что вызывало замену Ser638Asn (положение 653 на основании использования номенклатуры положений аминокислот в AHASL Arabidopsis) в гене AHASL в геноме В.
Растения В. juncea, имеющие две или более мутаций AHASL, предлагаемые в настоящем изобретении, могут иметь повышенные уровни резистентности к гербицидам по сравнению с аддитивными уровнями резистентности в случае отдельных мутаций. Растения, имеющие две или более мутаций AHASL, могут иметь уровни резистентности, которые на 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50%, или еще выше в сравнении с аддитивным уровнями резистентности, обеспечиваемые отдельными мутациями AHASL.
Увеличение резистентности можно измерить, используя любой способ определения резистентности AHAS. Например, резистентность можно измерить, определяя резистентность в В. juncea в процентах через период времени, составляющий 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28 дней, после обработки гербицидом, ингибирующим AHAS. Затем резистентность в процентах можно сравнить с уровнями, полученными суммированием резистентности в процентах растений, содержащих соответствующие отдельные мутации AHASL. В одном аспекте резистентность определяют измерением резистентности растений в процентах через 14 дней после обработки 2-кратным количеством гербицида, ингибирующего AHAS.
Изобретение, кроме того, относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, содержащим нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки большой субъединицы синтазы ацетогид-роксикислот (AHASL), и к таким белкам AHASL. Изобретение раскрывает выделение и нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам белок AHASL1 Brassica, из резистентного к гербицидам растения Brassica, которое было получено с помощью химического мутагенеза растений Brassica дикого типа. Резистентные к гербицидам белки AHASL1 согласно изобретению имеют замену серина на аспарагин в положении 635 гена AHASL1 В. juncea, локализованного в геноме А, или замену аланина на треонин в положении 107 гена AHASL1 В. juncea, локализованного в геноме В, или замену аланина на треонин в положении 104 гена AHASL1 В. juncea, локализованного в геноме А. В изобретении, кроме того, раскрыто выделение и нуклеотидная последовательность молекулы полинук-леотида, кодирующей белок AHASL1 дикого типа Brassica.
Настоящее изобретение относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, которые кодируют белки AHASL1 из Brassica, в частности Brassica juncea. В частности, изобретение относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, содержащим: нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:13, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок AHASL1, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:14, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок AHASL1, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:4, нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:15, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок AHASL1, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:5, и фрагменты и варианты таких нуклеотидных последовательностей, которые кодируют функциональные белки AHASL1.
Изолированные резистентные к гербицидам молекулы полинуклеотидов AHASL1 согласно изобретению содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют резистентные к гербицидам белки AHASL1. Такие молекулы полинуклеотидов можно использовать в полинуклеотидных конструкциях для трансформации растений, в частности культурных растений, чтобы повысить резистентность растений к гербицидам, в частности, гербицидам, которые, как известно, ингибируют активность AHAS, более конкретно к имидазолиноновым гербицидам. Такие полинуклеотидные конструкции можно использовать в кассетах экспрессии, экспрессирующих векторах, векторах для трансформации, плазмидах и тому подобном. Трансгенные растения, полученные после трансформации такими полинуклеотидными конструкциями, проявляют повышенную резистентность к AHAS-ингибирующим гербицидам, таким как, например, имидазолиноновые и сульфонилмочевинные гербициды.
Композиции согласно изобретению включают в себя нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки AHASL1. В частности, настоящее изобретение относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:3, 4 или 5, и их фрагменты и варианты, которые кодируют полипептиды, обладающие активностью AHAS. Кроме того, предлагаются полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидной молекулой, описанной в настоящей
публикации, например, нуклеотидной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:13, 14 или 15 и ее фрагментами и вариантами, которые кодируют полипептиды, обладающие активностью AHAS.
Настоящее изобретение относится к белкам AHASL с аминокислотными заменами в конкретных аминокислотных положениях в консервативных областях белков AHASL Brassica, раскрытых в настоящем описании. Если в настоящем описании не оговорено особо, конкретные аминокислотные положения относятся к положению такой аминокислоты в полноразмерной аминокислотной последовательности AHASL A. thaliana, указанной в SEQ ID NO:1. Кроме того, специалистам в данной области будет понятно, что такие аминокислотные положения могут варьировать в зависимости от того, добавляются или удаляются аминокислоты, например, на N-конце аминокислотной последовательности. Таким образом, изобретение охватывает аминокислотные замены в указанном положении или эквивалентном положении (например, "в положении аминокислоты 653 или эквивалентном положении").
Подразумевается, что "эквивалентное положение" означает положение, которое находится в той же самой консервативной области, что и указанное положение аминокислоты. Например, аминокислота 122 в последовательности SEQ ID NO:1 находится в положении, эквивалентном положению аминокислоты 107 в последовательности SEQ ID NO:4, и в положении, эквивалентном положению аминокислоты 104 в последовательности SEQ ID NO:5. Подобным образом, аминокислота 653 в белке AHASL Arabidopsis thaliana, имеющем аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, находится в положении, эквивалентном положению аминокислоты 638 в AHASL1B Brassica и положению аминокислоты 635 в белках AHASL1A Brassica, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:2 и 3 соответственно.
Изобретение охватывает изолированные или по существу очищенные композиции нуклеиновых кислот или белков. "Изолированная" или "очищенная" молекула полинуклеотида или белка или его биологически активная часть в значительной степени или по существу не содержит компонентов, которые обычно сопровождают или взаимодействуют с молекулой полинуклеотида или белком и обнаружены в его природном окружении. Таким образом, изолированная или очищенная молекула полинуклеотида или белка по существу не содержит других клеточных компонентов или культуральной среды при получения основанными на рекомбинации способами, или по существу не содержит химических предшественников или других химических вещества при химическом синтезе. Предпочтительно "изолированная" нуклеиновая кислота не содержит последовательностей (предпочтительно кодирующих белок последовательностей), которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого нуклеиновая кислота получена. Например, в различных вариантах изолированная молекула полинуклеотида может содержать меньше, чем примерно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют молекулу полинуклеотида в геномной ДНК клетки, из которой нуклеиновая кислота получена. Белок, который по существу не содержит клеточного материала, включает препараты белка, содержащие менее чем примерно 30, 20, 10, 5 или 1% (сухой массы) загрязняющего белка. В том случае, когда белок согласно изобретению или его биологически активную часть получают способами на основе рекомбинации, предпочтительно культуральная среда составляет менее чем примерно 30, 20, 10, 5 или 1% (сухой массы) химических предшественников или химических вещества, отличных от представляющего интерес белка.
Настоящее изобретение относится к изолированным полипептидам, составляющим белки AHASL1. Изолированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO:3, 4 или 5, аминокислотных последовательностей, кодируемых нуклеотидными последовательностями, указанными в SEQ ID NO:13, 14 или 15, и функциональных фрагментов и вариантов указанных аминокислотных последовательностей, которые кодируют полипептид AHASL1, обладающий активностью AHAS. Под "функциональными фрагментами и вариантами" подразумевают фрагменты и варианты указанных полипептидов, которые обладают активностью AHAS.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способы включают в себя применение устойчивых к гербицидам или резистентных к гербицидам растений. Под "устойчивым к гербицидам" или "резистентным к гербицидам" растением подразумевают растение, которое устойчиво или резистентно по меньшей мере к одному гербициду на уровне, которое обычно может убивать или ингибировать рост нормального растения или растения дикого типа. В одном варианте осуществления изобретения устойчивые к гербицидам растения согласно изобретению содержат устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок AHASL. Под "устойчивым к гербицидам белком AHASL" или "резистентным к гербицидам белком AHASL" подразумевают, что такой белок AHASL обладает более высокой активностью AHAS по сравнению с активностью AHAS белка AHASL дикого типа в присутствии по меньшей мере одного гербицида, который, как известно, препятствует проявлению активности AHAS, и при концентрации или уровне гербицида, который, как известно, ингибирует активность AHAS белка AHASL дикого типа. Кроме того, активность AHAS такого устойчивого к гербицидам или резистентного к гербицидам белка AHASL может быть названа в настоящем описании "устойчивой к гербицидам" или "резистентной к гербицидам" активностью AHAS.
Для настоящего изобретения термины "устойчивый к гербицидам" и "резистентный к гербицидам" используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон использования. Подобным образом, термины "устойчивость к гербицидам" и "резистентность к гербицидам" используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон. Подобным образом, термины "резистентный к имидазоли-нонам" и "резистентность к имидазолинонам" используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон как и термины "устойчивый к имидазо-линонам" и "устойчивость к имидазолинонам" соответственно.
Изобретение охватывает резистентные к гербицидам полинуклеотиды AHASL1 и резистентные к гербицидам белки AHASL1. Под "резистентным к гербицидам полинуклеотидом AHASL1" подразумевают полинуклеотид, который кодирует белок, обладающий резистентной к гербицидам активностью AHAS. Под "резистентным к гербицидам белком AHASL1" подразумевают белок или полипептид, который обладает резистентной к гербицидам активностью AHAS. Кроме того, понятно, что устойчивый гербицидам или резистентный к гербицидам белок AHASL может быть введен в растение в результате трансформации растения или его предка нуклеотидной последовательностью, кодирующей устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок AHASL. Такие устойчивые к гербицидам или резистентные к гербицидам белки AHASL кодируются устойчивыми к гербицидам или резистентными к гербицидам полинуклеотидами AHASL. Альтернативно устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок AHASL может встречаться в растении в результате происходящей в природе или индуцированной мутации в эндогенном гене AHASL в геноме растения или его предка.
Настоящее изобретение относится к растениям, растительным тканям, растительным клеткам и клеткам-хозяевам с увеличенной и/или повышенной резистентностью или устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, в частности, к гербициду, который препятствует проявлению активности фермента AHAS, более конкретно к имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду. Термин "повышенная" относится к увеличению резистентности или устойчивости в большей степени, чем ожидается. Предпочтительное количество или концентрация гербицида является "эффективным количеством" или "эффективной концентрацией". "Под эффективным количеством" и "эффективной концентрацией" подразумевают количество и концентрацию, соответственно, которые достаточны для того, чтобы убить или ингибировать рост сходного растения дикого типа, растительной ткани, растительной клетки, микроспоры или клетки-хозяина, но такое указанное количество не убивает или не ингибирует так сильно рост резистентного к гербицидам растения, растительной ткани, растительных клеток, микроспор и клеток-хозяев согласно настоящему изобретению. Обычно эффективное количество гербицида представляет собой количество, которое обычно используют в системах производства сельскохозяйственной продукции, чтобы убить представляющие интерес сорняки. Такое количество известно специалистам в данной области или может быть легко определено способами, известными в данной области. Кроме того, понятно, что эффективное количество гербицида в системах производства сельскохозяйственной продукции может в значительной степени отличаться от эффективного количества гербицида для системы культивирования растений, такой как, например, система культивирования микроспор.
Гербициды согласно настоящему изобретению представляют собой гербициды, которые препятствуют проявлению активности фермента AHAS, например активность AHAS снижается в присутствии гербицида. Такие гербициды также могут быть названы в настоящем описании "AHAS-ингибирующими гербицидами" или просто "ингибиторами AHAS". В используемом в настоящем описании смысле "AHAS-ингибирующий гербицид" или "ингибитор AHAS" не означает ограничение одним гербицидом, который препятствует проявлению активности фермента AHAS. Таким образом, если не указано или не очевидно из контекста иное, "AHAS-ингибирующий гербицид" или "ингибитор AHAS" может означать один гербицид или смесь двух, трех, четырех или более гербицидов, каждый из которых препятствует проявлению активности фермента AHAS.
Под "сходным растением дикого типа, растительной тканью, растительной клеткой или клеткой-хозяином" подразумевают растение, растительную ткань, растительную клетку или клетку-хозяина, соответственно, которые не обладают свойствами резистентности к гербицидам и/или которые не имеет конкретного полинуклеотида согласно изобретению, который раскрыт в настоящем описании. Следовательно, использование термина "дикого типа" не означает, что растение, растительная ткань, растительная клетка, или другая клетка-хозяин не имеет рекомбинантной ДНК в своем геноме и/или не обладает свойствами резистентности к гербицидам, которые отличаются от свойств, описанных в настоящей публикации.
В используемом в настоящем описании смысле и если четко не указано иное термин "растение" означает растение на любой стадии развития, а также любую часть или части растения, которые могут быть не отделены или отделены от целого интактного растения. Такие части растения включают без ограничения органы, ткани и клетки растения, включая каллусы растений, скопления растительных клеток, протопласты растений и культуры растительных клеток, из которых растения могут быть регенерированы. Примеры конкретных частей растения включают стебель, лист, корень, соцветие, цветок, цветок компактного соцветия, плод, цветоножку, плодоножку, тычинку, пыльник, рыльце, столбик, завязь, лепе
сток, чашелистик, плодолистик, кончик корня, корневой чехлик, корневой волосок, волосок семени, пальцевое зерно, микроспору, зародыш, семяпочку, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему, флоэму, паренхиму, эндосперм, клетку-спутницу, замыкающую клетку и любые другие известные органы, ткани и клетки растения. Кроме того, понятно, что семя относится к понятию "растение".
Растения согласно настоящему изобретению включают как нетрансгенные растения, так и трансгенные растения.
Подразумевается, что "нетрансгенное растение" означает растение, не имеющее рекомбинантной ДНК в своем геноме. "Трансгенное растение" означает растение, содержащее рекомбинантную ДНК в своем геноме. Такое трансгенное растение может быть получено введением рекомбинантной ДНК в геном растения. В том случае, когда такую рекомбинантная ДНК вводят в геном трансгенного растения, потомство растения также может содержать рекомбинантную ДНК. Растение-потомок, которое содержит по меньшей мере часть рекомбинантной ДНК по меньшей мере одного трансгенного растения-предка, также является трансгенным растением.
Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, которую называют в настоящем описании J04E-0122. Депонировано по меньшей мере 2500 семян Brassica линии J04E-0122 в депозитарии для нужд патентования Американской коллекции типов культур (АТСС), Mansassas, VA 20110 USA, 19 октября 2006 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-7944. Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, которую называют в настоящем описании J04E-0130. Депонировано по меньшей мере 2500 семян Brassica линии J04E-0130 19 октября 2006 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-7945. Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, которую называют в настоящем описании J04E-0139. Депонировано по меньшей мере 2500 семян Brassica линии J04E-0139 19 октября 2006 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-7946. Настоящее изобретение относится к резистентной к гербицидам двойной мутант-ной линии Brassica, которую называют в настоящем описании J05Z-07801. По меньшей мере, 625 семян линии Brassica J05Z-07801 депонировано 2 апреля 2007 года, остальные 1875 депонированы 15 января 2008 года с номером патентуемого депозита АТСС РТА-8305. Депозит будет храниться по условиям Будапештского договора о признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Депозит линий Brassica J04E-0122, J04E-0130, J04E-0130 и J05Z-07801 помещен на срок по меньшей мере 30 лет и будет храниться по меньшей мере 5 лет с момента последнего запроса о выдаче образца депозита, полученного АТСС. Кроме того, заявители удовлетворили все требования статьи 37 C.F.R. § 1.8011.809, включая предоставление свидетельства о жизнеспособности образца.
Имеющие одиночную мутацию резистентные к гербицидам линии Brassica J04E-0122, J04E-0130 и J04E-0139 согласно настоящему изобретению получали в результате мутационной селекции. Микроспоры Brassica дикого типа подвергали мутагенезу, воздействуя мутагеном, в частности химическим мутагеном, более конкретно этилнитрозомочевиной (ENU). Однако настоящее изобретение не ограничено резистентными к гербицидам растениями Brassica, которые получены способом мутагенеза с использованием химического мутагена ENU. Любой способ мутагенеза, известный в данной области, может быть использован для получения резистентных к гербицидам растений Brassica согласно настоящему изобретению. Такие способы мутагенеза могут включать в себя, например, использование любого одного или нескольких из следующих мутагенов: излучения, такого как рентгеновское излучение, гамма-излучение (например, кобальт-60 или цезий-137), нейтроны (например, продукт деления ядра урана-235 в атомном реакторе), бета-излучение (например, испускаемого радиоактивными изотопами, такими как фосфор-32 или углерод-14) и ультрафиолетовое излучение (предпочтительно от 250 до 290 нм), и химические мутагены, такие как этилметансульфонат (EMS), аналоги оснований (например, 5-бромурацил), родственные соединения (например, 8-этоксикофеин), антибиотики (например, стрептонигрин), алкилирующие агенты (например, сернистый иприт, азотистый иприт, эпоксиды, этиленамины, сульфаты, сульфонаты, сульфоны, лактоны), азид, гидроксиламин, азотистая кислота или акридины. Резистентные к гербицидам растения также могут быть получены с использованием способов культивирования тканей, чтобы отобрать растительные клетки, содержащие мутации резистентности к гербицидам, и затем из них регенерировать резистентные к гербицидам растения. Смотрите, например, патенты США № 5773702 и 5859348, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. Дополнительные подробности мутационной селекции можно найти в публикации "Principals of Cultivar Development", Fehr, 1993 Mac-millan Publishing Company, содержание которой включено в настоящее писание в виде ссылки.
Анализ гена AHASL1 растения Brassica линии J04E-0139 выявил мутацию, которая приводит к замене серина на аспарагин в положении аминокислоты 635 в гене AHASL генома А В. juncea и придает повышенную резистентность к гербициду. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает тот факт, что замена серина другой аминокислотой в положении 635 (соответствующем положению аминокислоты 653 в AHASL1 A. thaliana) может быть причиной того, что растение Brassica приобретает повышенную резистентностью к гербициду, в частности, к имидазолиноновому и/или сульфонилмочевинному гербициду. Резистентные к гербицидам растения Brassica согласно изобретению включают без ограничения такие растения Brassica, которые содержат в своих геномах по меньшей мере одну копию полинуклеоти-да AHASL1, который кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL1, который содержит аспарагин
в положении аминокислоты 635 или эквивалентном положении.
Анализ гена AHASL1 растения Brassica линии J04E-0130 выявил мутацию, которая приводит к замене аланина на треонин в положении аминокислоты 107 в гене AHASL в геноме В В. juncea и придает повышенную резистентность к гербициду. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает тот факт, что замена аланина другой аминокислотой в положении 107 (соответствующем положению аминокислоты 122 в AHASL1 A. thaliana) может быть причиной того, что растение Brassica приобретает повышенную резистентностью к гербициду, в частности, к имидазолиноновому и/или сульфонилмочевинному гербициду. Резистентные к гербицидам растения Brassica согласно изобретению включают без ограничения такие растения Brassica, которые содержат в своих геномах по меньшей мере одну копию полинук-леотида AHASL1, который кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL1, который содержит треонин в положении аминокислоты 107 или эквивалентном положении.
Анализ гена AHASL1 растения Brassica линии J04E-0122 выявил мутацию, которая приводит к замене аланина на треонин в положении аминокислоты 104 в гене AHASL в геноме А В. juncea и придает повышенную резистентность к гербициду. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает тот факт, что замена аланина другой аминокислотой в положении 104 (соответствующем положению аминокислоты 122 в AHASL1 A. thaliana) может быть причиной того, что растение Brassica приобретает повышенную резистентностью к гербициду, в частности к имидазолиноновому и/или сульфонилмочевинному гербициду. Резистентные к гербицидам растения Brassica согласно изобретению включают без ограничения такие растения Brassica, которые содержат в своих геномах по меньшей мере одну копию полинук-леотида AHASL1, который кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL1, который содержит треонин в положении аминокислоты 104 или эквивалентном положении.
Растения Brassica согласно изобретению дополнительно включают растения, которые содержат, по сравнению с белком AHASL1 дикого типа, аспарагин в положении аминокислоты 653 (номенклатура для A. thaliana), треонин в положении аминокислоты 122 (номенклатура для A. thaliana) и одну или несколько дополнительных замен в белке AHASL1 по сравнению с белком AHASL1 дикого типа, при этом такое растение Brassica обладает повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду по сравнению с растением Brassica дикого типа.
Настоящее изобретение относится к растениям и способам получения растений Brassica, резистентных к гербицидам, действующим на AHAS, растений Brassica, обладающих повышенной устойчивостью к AHAS-гербицидам, и семенам таких растений. Таким образом, растения, описанные в настоящей публикации, могут быть использованы в программах селекции, чтобы создать дополнительные устойчивые к гербицидам растения В. juncea, такие как коммерческие сорта В. juncea. В соответствии с такими способами первое родительское растение Brassica может быть использовано в скрещиваниях со вторым родительским растением Brassica, при этом по меньшей мере одно из указанных двух родительских растений Brassica имеет по меньшей мере одну мутацию, придающую резистентность AHAS к гербицидам. Одним из применений способа является применение для получения гибридных растений F1. Другой важный аспект такого способа заключается в том, что способ может быть использован для создания новых родительских дигаплоидных или инбредных линий. Например, линия Brassica, которая описана в настоящей публикации, может быть скрещена с любым вторым растением, и полученное гибридное потомство подвергнуто самоопылению и/или скрещиванию между сибсами в течение примерно 5-7 поколений или большего количества поколений, с получением таким образом большого количества отдельных родительских линий. Затем указанные родительские линии могут быть скрещены с другими линиями, и полученное гибридное потомство может быть подвергнуто анализу в отношении наличия полезных свойств. Таким образом могут быть идентифицированы новые линии, придающие требуемые свойства. В указанных способах можно использовать различные методики селекции, включая гаплоидию, способ отбора "педигри", способ отбора одного семени в потомстве, модифицированный способ отбора одного семени в потомстве, повторяющийся отбор и возвратное скрещивание.
Линии Brassica можно скрещивать, используя любые естественные или механические методики. Механическое опыление может быть осуществлено посредством контролирования типов пыльцы, которая может быть перенесена на рыльце, либо ручным опылением.
Растения-потомки Brassica можно оценивать любым способом, чтобы определить присутствие му-тантного полинуклеотида или полипептида AHASL. Такие способы включают фенотипическую оценку, генотипическую оценку или их сочетания. Потомство растений Brassica можно оценить в последующих поколениях в отношении резистентности к гербицидам и других требуемых свойств. Резистентность к ингибирующим AHAS гербицидам можно оценить, подвергая растения воздействию одного или нескольких подходящих ингибирующих AHAS гербицидов и оценивая повреждение гербицидами. Некоторые свойства, такие как устойчивость к полеганию и высота растения, можно оценивать посредством визуального осмотра растений, тогда как способность быстро созревать, могут быть оценены в результате визуального осмотра семян в стручках. Другие свойства, такие как процентное содержание масла, процентное содержание белка и общее содержание глюкозинолатов в семенах, могут быть оценены с использованием таких методик, как спектроскопия в ближней инфракрасной области и/или жидкостная хроматография и/или газовая хроматография. Генотипическая оценка растений Brassica включает в себя
применение таких методик, как электрофорез изоферментов, оценка полиморфизма длин рестрикцион-ных фрагментов (RFLP), оценка случайно амплифицированных полиморфных ДНК (RAPD), случайно праймируемая полимеразная цепная реакция (АР-ПЦР), фингерпринтинг амлифицированной ДНК (DAF), оценка амплифицированной области с охарактеризованной последовательностью (SCAR), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP), оценка повторов простых последовательностей (SSR), которые также называют "микросателлитами".
Дополнительные композиции и способы анализа генотипа растений Brassica, предлагаемых в настоящем изобретении, включают способы, описанные в публикации патента США № 2004/0171027, публикации патента США № 2005/02080506 и публикации патента США № 2005/0283858, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.
Оценка и обработка (посредством воздействия одного или нескольких подходящих AHAS-ингибирующих гербицидов) может быть осуществлена на протяжении нескольких поколений. Эффективность новых линий можно оценить, используя объективные критерии в сравнении с контрольными сортами. Линии, обладающие требуемыми сочетаниями свойств, либо скрещивают с другой линией, либо подвергают самоопылению, чтобы получить семена. Самоопыление относится к переносу пыльцы с одного цветка на тот же самый цветок или другой цветок на том же растении. Растения, которые были подвергнуты самоопылению и селекции в отношении типа в течение многих поколений, становятся гомозиготными почти по всем локусам и дают однородную популяцию гомозиготного потомства.
Любой способ селекции можно использовать в способах согласно настоящему изобретению. В одном примере резистентные к гербицидам растения согласно настоящему изобретению можно разводить, используя способ на основе гаплоидов. В таких способах родителей, имеющих генетическую базу для требуемого дополнения свойств, скрещивают, используя простое или сложное скрещивание. Скрещивание (или перекрестное опыление) относится к переносу пыльцы с одного растения на другое растение. Потомство от скрещивания выращивают и микроспоры (незрелые пыльцевые зерна) отделяют и фильтруют, используя методики, известные специалистам в данной области [(например, Swanson E. В. et al., "Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus", L. Plant Cell Reports, 6: 94-97 (1987); и Swanson, E. В., Microspore culture in Brassica, pp. 159-169 in Methods in Molecular Biology, vol. 6, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press, (1990)]. В указанные микроспорах наблюдается расщепление генов. Микроспоры культивируют в присутствии подходящего AHAS-ингибирующего гербицида, такого как имазетапир (например, PURSUIT.TM.) или имазамокс (например, RAPTOR.TM.) или смесь 50/50 имазетапира и имазамокса (например, ODYSSEY.TM.), который убивает микроспоры, в которых отсутствуют мутации, ответственные за резистентность к гербициду.
Микроспоры, несущие гены, ответственные за резистентность к гербициду, выживают и дают зародыши, которые образуют гаплоидные растения. Затем их хромосомы удваивают, получая удвоенные гаплоиды.
Другие способы селекции также используют согласно настоящему изобретению. Например, отбор способом "педигри" можно использовать для улучшения в основном самоопыляющихся культур, таких как Brassica и канола. Селекцию "педигри" начинают со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может иметь одно или несколько требуемых свойств, которые отсутствуют в другом или которые дополняют другое свойство. Если два исходных родителя не обеспечивают всех требуемых свойств, то в план скрещиваний можно включать дополнительных родителей.
Таких родителей можно скрещивать в виде простого или сложного скрещивания, чтобы получить простые или сложные гибриды F1. Популяцию F2 получают из F1 в результате самоопыления одного или нескольких растений F1 или взаимного скрещивания двух растений F1 (т.е. скрещивания между сибсами).
Отбор наилучших вариантов можно начинать в F2-поколении, и начиная с F3, отбирают лучшие семьи, и наилучших представителей в наилучших семьях. Повторное тестирование семей можно начинать в Fzi-поколении, чтобы повысить эффективность селекции в отношении свойств с низкой наследуемостью. На поздней стадии инбридинга (т.е. F6 и F7) наилучшие линии или смеси фенотипически сходных линий можно тестировать в отношении возможного выпуска новых сортов. Однако способ селекции пе-дигри более трудоемок, чем способ на основе гаплоидии, для создания улучшенных растений с резистентной к гербицидам AHAS, поскольку растения дают расщепление в течение нескольких поколений и выход требуемых свойств является относительно низким.
Способ отбора одного семени в потомстве (SSD) также можно использовать для селекции улучшенных сортов. Способ SSD в строгом смысле относится к посадке сегрегирующей популяции, сбора образца в виде одного семени от растения и использование популяции из одиночных семян для посадки с целью получения следующего поколения. Когда популяция будет доведена от F2 до требуемого уровня инбридинга, каждое из растений, из которых получены линии, можно будет проследить до разных особей F2. Количество растений в популяции снижается в каждом поколении вследствие неспособности некоторых семян прорасти или неспособности некоторых растений дать по меньшей мере одно семя. В результате не все растения, образцы которых были исходно взяты в популяции F2, будут представлены потомством, когда продвижение поколений будет завершено.
В случае способа, основанного на использовании нескольких семян, селекционеры канолы обычно
собирают один или несколько стручков с каждого растения в популяции и молотят их вместе, получая общую массу. Часть общей массы используют для посадки следующего поколения, а часть откладывают в запас. Способ был назван модифицированным способом отбора одного семени в потомстве или способом отбора массы семян одного стручка в потомстве. Способ отбора нескольких семян использовали для того, чтобы уменьшить трудозатраты на сбор. Значительно быстрее обмолотить стручки машиной, чем извлекать одно семя из каждого стручка вручную в случае способом отбора одного семени в потомстве. Способ отбора нескольких семян также позволяет высаживать одинаковое количество семян в популяции каждого поколения при инбридинге. Собирают достаточное количество семян, чтобы компенсировать растения, которые не прорастают или не дают семян.
Возвратное скрещивание можно использовать для переноса гена или генов легко и в высокой степени наследуемого признака от исходного сорта или линии (родитель-донор) в другой требуемый культурный сорт или инбредную линию (рекуррентного родителя, т.е. родительскую форму, с которой гибрид скрещивается вновь). После начального скрещивания особи, имеющие фенотип родителя-донора, отбирают и повторно скрещивают (подвергают возвратному скрещиванию) с рекуррентным родителем. Ожидается, что после выполнения возвратного скрещивания полученное растение будет обладать признаками рекуррентного родителя и требуемым свойством, перенесенным от родителя-донора.
В результате повторяющегося отбора также могут быть созданы улучшенные сорта. Генетически разнообразную популяцию гетерозиготных особей либо идентифицируют, либо создают в результате взаимного скрещивания нескольких разных родителей. Наилучшие растения отбирают на основании их собственного превосходства, выдающегося потомства или превосходной способности к скрещиванию. Отобранные растения подвергают взаимному скрещиванию, получая новую популяцию, в которой продолжают последующие циклы селекции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения растения Brassica, обладающего резистентностью к AHAS-гербицидам, включающему в себя: (а) скрещивание первой линии Brassica со второй линией Brassica, чтобы получить сегрегирующую популяцию, при этом первая линия Brassica представлена резистентным к AHAS-гербицидам растением Brassica; (b) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к AHAS-гербицидам; и (с) отбор одного или нескольких представителей популяции, имеющих повышенную резистентсноть AHAS по сравнению с растением Brassica дикого типа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу интрогрессии признака резистентности к гербицидам, действующим на AHAS, в растение Brassica, включающему в себя: (а) скрещивание, по меньшей мере, первой линии Brassica, резистентной к гербицидам, действующим на AHAS, со второй линией Brassica с получением сегрегирующей популяции; (b) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к гербицидам, действующим на AHAS; и (с) отбор по меньшей мере одного представителя популяции, обладающего резистентностью к действующим на AHAS гербицидам.
Альтернативно в другом аспекте изобретения и первое и второе родительские растения Brassica могут быть резистентными к действующему на AHAS гербициду растениями Brassica, которые описаны в настоящей публикации. Таким образом, любое растение Brassica, полученное с использованием растения Brassica, обладающего повышенной резистентностью к действующему на AHAS гербициду, которое описано в настоящей публикации, составляет часть изобретения. В используемом в настоящем описании смысле скрещивание может означать самоопыление, скрещивание сибсов, возвратное скрещивание, скрещивание с другой или той же самой родительской линией, скрещивание с популяциями и тому подобное.
Настоящее изобретение также относится к способам получения резистентного к гербицидам растения, в частности резистентного к гербицидам растения Brassica, посредством обычной селекции растений, основанной на половом размножении. Способы включают в себя скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое не является резистентным к гербициду. Первое растение может быть любым резистентным к гербицидам растением согласно настоящему изобретению, включая, например, трансгенные растения, содержащие по меньшей мере один из полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, которые кодируют резистентную к гербицидам AHASL, и нетрансгенные растения Brassica, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам растения Brassica J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 или J04E-0122. Второе растение может быть любым растением, которое способно давать жизнеспособное потомство (т.е. семена) при скрещивании с первым растением. Обычно, но не обязательно, первое и второе растения относятся к одному и тому же виду. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя одно или несколько возвратных скрещиваний растений-потомков от первого скрещивания с растением такой же линии или генотипа, как и первое или второе растение. Альтернативно, потомство от первого скрещивания или любого последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое является растением другой линии или другого генотипа, чем в случае первого или второго растения. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя отбор растений, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам первого растения.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам повышения резистентности к гербици
дам растения, в частности, резистентного к гербицидам растения Brassica, посредством обычной селекции растений, основанной на половом размножении. Способы включают в себя скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое может являться или не являться резистентным к гербициду или может быть резистентным к другому гербициду или гербицидам, отличным от гербицида, к которому резистентно первое растение. Первое растение может представлять собой любое резистентное к гербицидам растение согласно настоящему изобретению, включая, например, трансгенные растения, содержащие по меньшей мере один из полинуклеотидов согласно настоящему изобретению, которые кодируют резистентную к гербициду AHASL, и нетрансген-ные растения Brassica, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам растения Brassica J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 или J04E-0122. Вторым растением может быть любое растение, которое способно давать жизнеспособные растения-потомки (т.е. семена) при скрещивании с первым растением. Обычно, но не обязательно, первое и второе растения относятся к одному и тому же виду; а также первое и второе растения могут относится к разными, видам, но в пределах одного рода (пример: Brassica juncea х Brassica napus, Brassica juncea x Brassica rapa, Brassica juncea x Brassica oleracea, Brassica junceax Brassica nigra и т.д.), а также первое и второе растения относятся к разным родам (пример: Brassica х Sinapis). Растения-потомки, полученные таким способом согласно настоящему изобретению, обладают повышенной резистентностью к гербициду по сравнению либо с первым, либо со вторым растением, либо с обоими растениями. В том случае, когда первое и второе растения резистентны к разным гербицидам, растения-потомки будут обладать комбинированными свойствами резистентности к гербицидам первого и второго растений. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя одно или несколько возвратных скрещиваний растений-потомков от первого скрещивания с растением такой же линии или генотипа, как и первое или второе растение. Альтернативно, потомство от первого скрещивания или любого последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое является растением другой линии или другого генотипа, чем в случае первого или второго растения. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя отбор растений, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам первого растения, второго растения или обоих растений.
Растения согласно настоящему изобретению могут быть трансгенными или нетрансгенными. Примером нетрансгенного растения Brassica, обладающего повышенной резистентностью к имидазолиноно-вым и/или сульфонилмочевинным гербицидам является растение Brassica J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 или J04E-0122; или мутантное, рекомбинантное или генетически сконструированное производное растения J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 или J04E-0122; или любое потомство растения J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 или J04E-0122; или растение, которое является потомком любого из указанных растений; или растение, которое обладает свойствами резистентности к гербицидам растения J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 или J04E-0122.
Настоящее изобретение также относится к растениям, органам растения, растительным тканям, растительным клеткам, семенам и клеткам-хозяевам, отличным от клеток человека, которые трансформированы по меньшей мере одной молекулой полинуклеотида, кассетой экспрессии или вектором для трансформации согласно изобретению. Такие трансформированные растения, органы растений, растительные ткани, растительные клетки, семена и клетки-хозяева, отличные от клеток человека, обладают повышенной устойчивостью или резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, при использовании уровней гербицида, которые убивают или ингибируют рост нетрансформированного растения, растительной ткани, растительной клетки или клетки-хозяина, отличной от клетки человека, соответственно. Предпочтительно трансформированные растения, растительные ткани, растительные клетки и семена согласно изобретению представляют собой растения Brassica и сельскохозяйственные растения.
Настоящее изобретение также относится к семени растения Brassica, способного давать растение Brassica, обладающее резистентностью к AHAS-гербициду, полученному из растений Brassica, которые получены способами согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к растению, выращенному из семени растения Brassica, обладающего резистентностью к AHAS-гербициду, полученному из растений Brassica, выращенных для получения семян, обладающих свойством резистентности к гербицидам, а также частям растений и культурам тканей из таких растений.
Также в настоящем изобретении предлагаются емкости с семенами Brassica, при этом семена способны производить резистентное к AHAS-гербициду растение Brassica. Емкость с семенами Brassica может содержать любое количество, массу или объем семян. Например, емкость может содержать, по меньшей мере или больше чем примерно 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или больше семян. Альтернативно емкость может содержать, по меньшей мере или больше чем примерно 1 унцию (28,3 г), 5 унций (141,5 г), 10 унций (283 г), 1 фунт (0,453 кг), 2 фунта (0,906 кг), 3 фунта (1,359 кг), 4 фунта (1,812 кг), 5 фунтов (22665 кг) или большую массу семян.
Емкости с семенами Brassica могут представлять собой любую емкость, имеющуюся в данной области. В качестве не ограничивающего примера емкость может представлять собой коробку, мешок, пач
ку, пакет, ленточный рулон, ведро, крышку чашки Петри или пробирку.
В другом аспекте семена, находящиеся в емкостях с семенами Brassica, могут представлять собой обработанные или необработанные семена. В одном аспекте семена могут быть обработаны для улучшения прорастания, например, с помощью проращивания семян, или посредством дезинфекции, чтобы защитить против имеющихся в семенах патогенов. В другом аспекте семена могут быть покрыты любым доступным покрытием, чтобы улучшить, например, посев, прорастание семян и защиту от патогенов, имеющихся на семенах. Покрытие семян может представлять собой любую форму покрытия для семян, включая без ограничения дражирование, пленочное покрытие и инкрустацию.
Настоящее изобретение также относится к способам повышения активности AHAS в растении, включающим в себя трансформацию растения полинуклеотидной конструкцией, содержащей промотор, оперативно связанный с нуклеотидной последовательностью AHASL1 согласно изобретению. Способы включают в себя введение полинуклеотидной конструкции согласно изобретению по меньшей мере в одну растительную клетку и регенерацию из нее трансформированного растения. Полинуклеотидная конструкция содержит по меньшей мере один нуклеотид, который кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL согласно изобретению, в частности нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:13, 14 или 15, нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 или 5, и их фрагменты и варианты. Способы, кроме того, включают в себя использованием промотора, который способен управлять экспрессией генов в растительной клетке. Предпочтительно такой промотор является конститутивным промотором или тканеспецифичным промотором. Растение, полученное указанным способом, обладает повышенной активностью AHAS, в частности, устойчивой к гербицидам активностью AHAS, по сравнению с нетрансформированным растением. Таким образом, способы применимы для усиления или повышения резистентности растения по меньшей мере к одному гербициду, который препятствует проявлению каталитической активности фермента AHAS, в частности к имидазолиноновому гербициду.
Настоящее изобретение относится к способу получения резистентного к гербицидам растения, включающему в себя трансформацию растительной клетки полинуклеотидной конструкцией, содержащей нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке, и регенерацию трансформированного растения из указанной трансформированной растительной клетки. Нуклеотидная последовательность выбрана из таких нуклеотидных последовательностей, которые кодируют резистентные к гербицидам белки AHASL согласно изобретению, в частности, нуклеотидных последовательностей, указанных в SEQ ID NO:13, 14 или 15, нуклео-тидных последовательностей, кодирующих аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:3, 4 или 5, и их фрагментов и вариантов. Резистентное к гербицидам растение, полученное таким способом, обладает повышенной резистентностью по сравнению с нетрансформированным растением по меньшей мере к одному гербициду, в частности к гербициду, который препятствует проявлению активности фермента AHAS, такому как, например, имидазолиноновый гербицид или сульфонилмочевинный гербицид.
Настоящее изобретение относится к кассетам экспрессии для экспрессии полинуклеотидных молекул согласно изобретению в растениях, растительных клетках и других клетках-хозяевах, отличных от клеток человека. Кассеты экспрессии содержат промотор, экспрессируемый в растении, растительной клетке или других представляющих интерес клетках-хозяевах, оперативно связанный с молекулой поли-нуклеотида согласно изобретению, которая кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL. В случае необходимости целенаправленной экспрессии в хлоропласте кассета экспрессии также может содержать оперативно связанную направляющую в хлоропласт последовательность, которая кодирует транзитный пептид хлоропласта, чтобы направить экспрессированный белок AHASL в хлоропласт.
Кассеты экспрессии согласно изобретению применимы в способе повышения устойчивости к гербицидам растения или клетки-хозяина. Способ заключается в трансформации растения или клетки-хозяина кассетой экспрессии согласно изобретению, при этом кассета экспрессии содержит промотор, экспрессируемый в представляющем интерес растения или клетке-хозяине, и промотор оперативно связан с полинуклеотидом согласно изобретению, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую резистентный к гербицидам белок AHASL1 согласно изобретению. Кроме того, способ включает в себя регенерацию трансформированного растения из трансформированной растительной клетки.
Использование в настоящем описании термина "полинуклеотидные конструкции" не означает ограничение настоящего изобретения полинуклеотидными конструкциями, содержащими ДНК. Специалистам в данной области будет понятно, что полинуклеотидные конструкции, в частности, полинуклеотиды и олигонуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и сочетаний рибонуклеотидов и дезоксирибонуклео-тидов также могут быть использованы в способах, раскрытых в настоящем описании. Таким образом, полинуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению охватывают все полинуклеотидные конструкции, которые могут быть использованы в способах согласно настоящему изобретению для трансформации растений, включая без ограничения полинуклеотидные конструкции, состоящие из де-зоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и их сочетаний. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклео
тиды включают как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. Полинуклеотид-ные конструкции согласно изобретению также охватывают все формы полинуклеотидных конструкций, включая без ограничения однонитевые формы, двунитевые формы, шпильки, структуры типа "стебель-петля" и тому подобное. Кроме того, специалистам в данной области понятно, что каждая из нуклеотид-ных последовательностей, описанных в настоящей публикации, также охватывает комплемент такой описанной нуклеотидной последовательности.
Кроме того, понятно, что в способах согласно изобретению может быть использована полинуклео-тидная конструкция, которая способна в трансформированном растении управлять экспрессией по меньшей мере одного белка или по меньшей мере одной РНК, такой как, например, антисмысловая РНК, которая комплементарна по меньшей мере части мРНК. Обычно такая полинуклеотидная конструкция состоит из последовательности, кодирующей белок или РНК, оперативно связанной с 5'- и 3'-областями регуляции транскрипции. Альтернативно также понятно, что в способах согласно изобретению можно использовать полинуклеотидную конструкцию, которая не способна управлять экспрессией белка или РНК в трансформированном растении.
Кроме того, понятно что для экспрессии полинуклеотидов согласно изобретению в представляющей интерес клетке-хозяине полинуклеотид обычно оперативно связан с промотором, который способен управлять экспрессией гена в представляющей интерес клетке-хозяине. Способы согласно изобретению для экспрессии полинуклеотидов в клетках-хозяевах не зависят от конкретного промотора. Способы охватывают применение любого промотора, который известен в данной области и который способен управлять экспрессией гена в представляющей интерес клетке-хозяине.
Настоящее изобретение охватывает молекулы полинуклеотидов AHASL1 и их фрагменты и варианты. Молекулы полинуклеотидов, которые представляют собой фрагменты таких нуклеотидных последовательностей, также входят в объем настоящего изобретения. "Фрагмент" означает часть нуклеотидной последовательности, кодирующую белок AHASL1 согласно изобретению. Фрагмент нуклеотидной последовательности AHASL1 согласно изобретению может кодировать биологически активную часть белка AHASL1 или может представлять собой фрагмент, который может быть использован в качестве зонда для гибридизации или праймера ПЦР с использованием описанных ниже способов. Биологически активная часть белка AHASL1 может быть получена посредством выделения части одной из нуклеотидных последовательностей AHASL1 согласно изобретению, экспрессии кодируемой части белка AHASL1 (например, в результате экспрессии рекомбинантов in vitro) и оценки активности кодируемой части белка AHASL1. Молекулы полинуклеотидов, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности AHASL1, содержат по меньшей мере примерно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или 900 нуклеотидов, или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в полноразмерной нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем описании, в зависимости от предполагаемого применения.
Фрагмент нуклеотидной последовательности AHASL1, которая кодирует биологически активную часть белка AHASL1 согласно изобретению будет кодировать по меньшей мере примерно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 или 250 соседних аминокислот или вплоть до общего количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке AHASL1 согласно изобретению. Фрагменты нуклео-тидной последовательности AHASL1, которые применимы в качестве зондов гибридизации для ПЦР-праймеров обычно не должны кодировать биологически активную часть белка AHASL1.
Молекулы полинуклеотидов, которые представляют собой варианты нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, также входят в объем настоящего изобретения. К "вариантам" нуклеотидных последовательностей AHASL1 согласно изобретению относятся последовательности, которые кодируют белки AHASL1, описанные в настоящей публикации, но которые имеют консервативные отличия вследствие вырожденности генетического кода. Такие встречающиеся в природе аллельные варианты могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и способы гибридизации, которые описаны ниже. Варианты нуклеотидных последовательностей также включают синтетически полученные нуклео-тидные последовательности, которые были созданы, например, с использованием сайт-специфичного мутагенеза, но которые все еще кодируют белок AHASL1, раскрытый в настоящем изобретении, как обсуждается ниже. Обычно варианты нуклеотидных последовательностей согласно изобретению будут, по меньшей мере, примерно на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны конкретной нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем описании. Вариант нуклеотидной последовательности AHASL1 будет кодировать белок AHASL1, соответственно, который имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности белка AHASL1, раскрытого в настоящем описании.
Кроме того, специалисту будет понятно, что изменения могут быть введены в результате мутации в нуклеотидных последовательностях согласно изобретению, таким образом приводящих к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемых белков AHASL1 без изменения биологической активности белков AHASL1. Таким образом, изолированная молекула полинуклеотида, кодирующего белок
AHASL1, имеющий последовательность, которая отличается от последовательности, указанной в SEQ ID NO:11, может быть создана введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений или де-леций в соответствующую нуклеотидную последовательность, описанную в настоящей публикации, так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводится в кодируемый белок. Мутации могут быть введены стандартными способами, такими как сайт-специфичный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие варианты нуклеотидных последовательностей также входят в объем настоящего изобретения.
Например, предпочтительно консервативные аминокислотные замены могут быть осуществлены в одном или нескольких вычисленных несущественных аминокислотных остатках.
"Несущественным" аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен по сравнению с последовательностью дикого типа белка AHASL1 (например, последовательностью SEQ ID NO:1) без изменения биологической активности, тогда как "существенный" аминокислотный остаток необходим для биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, в случае которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Такие семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фе-нилаланин, триптофан, гистидин). Такие замены не могут быть осуществлены в случае консервативных аминокислотных остатков или в случае аминокислотных остатков, находящихся в консервативном мотиве.
Белки согласно изобретению могут быть изменены различными путями, включая аминокислотные замены, делеции, укорочения и инсерции. Способы таких обработок, в общем, известны в данной области. Например, варианты аминокислотных последовательностей белков AHASL1 могут быть получены в результате мутаций в ДНК. Способы мутагенеза и изменений нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области. Смотрите, например, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; патент США № 4873192; Walker и Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) и приведенные в указанных публикациях ссылки. Инструкции по поводу соответствующих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес белка, можно найти в описании модели Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включенном в настоящее описание в виде ссылки. Предпочтительными могут быть консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные свойства.
Альтернативно варианты нуклеотидных последовательностей AHASL1 могут быть получены в результате случайного введения мутаций на протяжении всей или части кодирующей последовательности AHASL1, например с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу в отношении активности AHAS, чтобы идентифицировать мутанты, которые сохраняют активность AHAS, включая резистентную к гербицидам активность AHAS. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован рекомбинантно, и активность белка может быть определена стандартными способами анализа.
Таким образом, нуклеотидные последовательности согласно изобретению включают последовательности, раскрытые в настоящем описании, а также их фрагменты и варианты. Нуклеотидные последовательности AHASL1 согласно изобретению и их фрагменты и варианты могут быть использованы в качестве зондов и/или праймеров для идентификации и/или клонирования гомологов AHASL в других растениях. Такие зонды могут быть использованы для выявления транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих одинаковые или идентичные белки.
Таким образом, способы, таки как ПЦР, гибридизация и тому подобные, могут быть использованы для идентификации таких последовательностей, имеющих значительную идентичность с последовательностями согласно изобретению. Смотрите, например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) и Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Нуклеотидные последовательности AHASL, выделенные на основе идентичности их последовательности с нуклеотидными последовательностями AHASL1, указанными в настоящем описании, или их фрагменты и варианты входят в объем настоящего изобретения.
В способе гибридизации вся или часть известной нуклеотидной последовательности AHASL1 может быть использована для скрининга кДНК или геномных библиотек. Способы конструирования такой кДНК и геномных библиотек, в общем, известны в данной области и описаны в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Так называемые зонды гибридизации могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты
кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и их можно метить регистрируемой группой, такой как 32Р или любым другим регистрируемым маркером, таким как другие радиоизотопы, флуоресцирующее соединение, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены мече-нием синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной нуклеотидной последовательностью AHASL1, описанной в настоящей публикации. Кроме того, могут быть использованы вырожденные праймеры, сконструированные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в известной нуклеотидной последовательности AHASL1. Зонд обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях, по меньшей мере, примерно с 12, предпочтительно примерно с 25, более предпочтительно примерно с 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 или 900 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности AHASL1 согласно изобретению или ее фрагмента или варианта. Получение зондов для гибридизации в общем известно в данной области и описано в публикации Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), включенной в настоящее описание в виде ссылки.
Например, полная последовательность AHASL1, описанная в настоящей публикации, или одна или несколько из ее частей могут быть использованы в качестве зонда, способного специфично гибридизо-ваться с соответствующими последовательностями AHASL1 и матричными РНК. Способы гибридизации включают основанный на гибридизации скрининг посеянных на чашках библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; смотрите, например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Гибридизацию таких последовательностей можно осуществлять в жестких условиях. Под "жесткими условиями" или "жесткими условиями гибридизации" подразумевают условия, в которых зонд будет гибридизоваться с совей последовательностью-мишенью в регистрируемо более высокой степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза выше фона). Условия жесткости зависят от последовательности и будут отличаться в разных случаях.
Обычно жесткие условия могут представлять собой условия, при которых концентрация соли меньше, чем примерно 1,5 М иона Na, обычно концентрация соли составляет примерно от 0,01 до 1,0 М ионов Na (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, и температура составляет по меньшей мере примерно 30°С в случае коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°С в случае длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Жестких условий также можно достичь с помощью добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Примеры условий низкой жесткости включают гибридизацию с использованием буферного раствора, содержащего от 30 до 35% фор-мамида, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия), при 37°С и промывку в 1х-2х gSC (20х SSC=3,0 M NaCl/0,3 M цитрат тринатрия) при 50-55°С. Примеры условий умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°С и промывку в 0,5х-1х SSC при 55-60°. Примеры условий высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°С и промывку в 0,1 х SSC при 60-65°С. Необязательно буферы для промывки содержат примерно от 0,1% до примерно 1% SDS. Продолжительность гибридизации обычно составляет менее чем примерно 2 4 часа, обычно примерно от 4 до примерно 12 ч.
Специфичность обычно зависит от промывок после гибридизации, при этом решающими факторами являются ионная сила и температура конечного раствора для промывки. В случае гибридов ДНК-ДНК Tm может быть аппроксимирована из уравнения Meinkoth и Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm=81,5°C+16,6 (log M)+0,41 (%GC)-0,61 (% form)-500/L; где М означает молярность одновалентных катионов, %GC означает процентное содержание гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % form означает процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и L означает длину гибрида в парах нуклеотидов. Tm означает температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с идеально совпадающим зондом. Tm снижают примерно на 1°С для каждого 1% ошибочных спариваний; таким образом, Tm, условия гибридизации и/или промывки можно корректировать для последовательностей, имеющих требуемую идентичность. Например, если необходимо найти последовательности с > 90% идентичностью, то Tm может быть снижена на 10°С. Обычно условия жесткости выбирают так, чтобы температура была на 5°С ниже, чем температура точки плавления (Tm) для конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и рН. Однако при очень жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем температура точки плавления (Tm); в случае умеренно жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем температура точки плавления (Tm); в случае условий низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем температура точки плавления (Tm). При использовании уравнения, составов для гибридизации и промывки и требуемой Tm специалистам в данной области будет понятно, что варианты жесткости растворов для гибридизации и/или промывки по сути описаны. Если требуемая степень ошибочного спаривания приводит к Tm менее чем 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор формамида), то предпочти
тельно увеличить концентрацию SSC так, чтобы можно было использовать более высокую температуру.
Всестороннее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено в публикации Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry и Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); и Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Смотрите Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Понятно, что молекулы полинуклеотидов и белки согласно изобретению охватывают молекулы по-линуклеотидов и белки, содержащие нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая в достаточной степени идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:13, 14 и/или 15 или аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, 4 и/или 5. Термин "в значительной степени идентичный" используют в настоящем описании по отношению к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит, достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью) аминокислотных остатков или нуклеотидов по сравнению со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, так что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий структурный домен и/или обладают общей функциональной активностью. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий структурный домен, имеющие, по меньшей мере примерно 45, 55 или 65% идентичность, предпочтительно 75% идентичность, более предпочтительно 85, 95 или 98% идентичность, определяют в настоящем описании как идентичные в достаточной степени.
Чтобы определить идентичность в процентах двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения. Идентичность в процентах между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, имеющихся в последовательностях (т.е. идентичность в процентах равно количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений) х 100). В одном варианте две последовательности имеют одинаковую длину. Идентичность в процентах между двумя последовательностями может быть определена с помощью способов, подобных способам, описанным ниже, с учетом или без учета пробелов. При расчете идентичности в процентах обычно подсчитывают точные совпадения.
Определение идентичности в процентах между двумя последовательностями можно осуществить, используя математический алгоритм. Предпочтительным не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм, описанный в Karlin и Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, модифицированный как описано в Karlin и Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. Поиски нуклеотидов BLAST могут быть осуществлены с использованием программы NBLAST, счет равен 100, длина слова равна 12, чтобы получить нук-леотидные последовательности, гомологичные молекулам полинуклеотидов согласно изобретению. Поиски белков BLAST могут быть осуществлены с использованием программы XBLAST, счет равен 50, длина слова равна 3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам белков согласно изобретению. Чтобы получить выравнивания с пробелами в целях сравнения, можно использовать Gapped BLAST, который описан в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Альтернативно можно использовать PSI-Blast, чтобы осуществить итерационный поиск, который позволяет выявлять отдаленные взаимосвязи между молекулами. Смотрите Altschul et al. (1997) выше. В случае применения программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм, описанный в Myers и Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета компьютерных программ для выравнивания последовательностей GCG. В случае применения программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать матрицу весов остатков РАМ120, штраф за длину пробела 12 и штраф за пробел 4. Выравнивание также можно осуществлять вручную с помощью просмотра.
Если не указано иное, значения идентичности/сходства последовательностей, приведенные в настоящем описании, относятся к значению, полученному с использованием полноразмерных последовательностей согласно изобретению и с использованием множественного выравнивания с помощью алгоритма Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22): 4673-4680, 1994), используя программу AlignX, входящую в пакет компьютерных программ Vector NTI, версия 9 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с параметрами по умолчанию; или любую эквивалентную программу. Под "эквивалентной программой" подразумевают любую программу для сравнения последовательностей, которая в случае любых двух рассматриваемых последовательностей осуществляет выравнивание, дающее идентичные совпадения нуклеотидов или аминокислотных остатков и одинаковую идентичность последовательностей в процентах в сравнении с соответствующим выравниванием, осуществляемым с помощью AlignX, входящей в пакет компьютерных программ Vector NTI, версия 9.
Нуклеотидные последовательности AHASL1 согласно изобретению включают как встречающиеся в
природе последовательности, так и мутантные формы, в частности, мутантные формы, которые кодируют белки AHASL1, обладающие резистентной к гербицидам AHAS-активностью. Подобным образом белки согласно изобретению охватывают как встречающиеся в природе белки, так и их варианты и модифицированные формы. Такие варианты продолжают обладать требуемой AHAS-активностью. Очевидно что мутации, которые могут быть осуществлены в ДНК, кодирующей вариант, не должны выводить последовательность из рамки считывания и предпочтительно не будут создавать комплементарные области, которые могут вызывать образование вторичной структуры мРНК. Смотрите заявку на выдачу
патента ЕР № 75444.
Предполагается, что делеции, инсерции и замены последовательностей белков, входящих в настоящее изобретение, не вызывают коренных изменений свойств белка. Однако в том случае, когда трудно предсказать точный эффект замены, делеции или инсерции до их осуществления, специалисту в данной области будет понятно, что эффект можно оценить в обычных скрининговых анализах. То есть активность можно оценить с помощью анализов активности AHAS. Смотрите, например, публикацию Singh et al. (1988) Anal. Biochem. 171: 173-179, включенную в настоящее описание в виде ссылки.
Варианты нуклеотидной последовательности и белки также охватывают последовательности и белки, полученные с помощью способов мутагенеза и рекомбинации, таких как перетасовка ДНК. В случае такого способа одну или несколько разных кодирующих последовательностей AHASL можно подвергнуть обработки, чтобы создать новый белок AHASL, обладающий требуемыми свойствами. Таким образом создают библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов из популяции родственных полинуклеотид-ных последовательностей, содержащих области последовательности, которые обладают существенной идентичностью и могут быть подвергнуты гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с использованием указанного способа мотивы последовательности, кодирующие представляющий интерес домен, могут быть перетасованы между геном AHASL1 согласно изобретению и другими известными генами AHASL, чтобы получить новый ген, кодирующий белок с улучшенным представляющим интерес свойством, таким как повышенный Km в случае фермента. Методики такой перетасовки ДНК известны в данной области. Смотрите, например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stem-mer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291 и патенты США № 5605793 и 5837458.
Нуклеотидные последовательности согласно изобретению могут быть использованы для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, в частности, из других растений, более конкретно других двудольных растений. Таким образом, способы, такие как ПЦР, гибридизация и тому подобные, могут быть использованы для идентификации таких последовательностей на основе гомологии их последовательностей с последовательностями, указанными в настоящем описании. Последовательности, выделенные на основе идентичности их последовательностей с полными последовательностями AHASL1, указанными в настоящем описании, или с их фрагментами, входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, изолированные последовательности, которые кодируют белок AHASL и которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностью, описанной в настоящей публикации, или с ее фрагментами, входят в объем настоящего изобретения.
В случае применения способа ПЦР могут быть сконструированы олигонуклеотидные праймеры для использования в реакциях ПЦР, чтобы амплифицировать соответствующие последовательности ДНК из кДНК или геномной ДНК, экстрагированной из любого представляющего интерес растения. Способы конструирования праймеров для ПЦР и ПЦР-клонирования, в общем, известны в данной области и описаны в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). See also Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis и Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); и Innis и Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Известные способы ПЦР включают без ограничения способы с использованием спаренных праймеров, вложенных прайме-ров, отдельных специфичных праймеров, вырожденных праймеров, специфичных для гена праймеров, специфичных для вектора праймеров, частично ошибочно спариваемых праймеров и тому подобных.
Полинуклеотидные последовательности AHASL1 согласно изобретению предлагаются в кассетах экспрессии для экспрессии в представляющем интерес растении. Кассета будет содержать 5'- и 3'-регуляторные последовательности, оперативно связанные с полинуклеотидной последовательностью AHASL1 согласно изобретению. Под "оперативно связанной" подразумевается функциональная связь между промотором и второй последовательностью, при этом промоторная последовательность инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Обычно оперативно связанная означает, что связанные последовательности нуклеиновой кислоты являются соседними и, в случае необходимости связать две кодирующие белки области, являются соседними и находящимися в одной и той же рамке считывания. Кассета дополнительно может содержать по меньшей мере один дополнительный ген, который необходим для котрансформации организма. Альтернативно дополнительный ген (гены) может находится в кассетах для множественной экспрессии.
Такая кассета экспрессии снабжена множеством сайтов рестрикции для инсерции полинуклеотид
ной последовательности AHASL1 под транскрипционным контролем регуляторных областей. Кассета экспрессии дополнительно может содержать гены селектируемых маркеров.
Кассета экспрессии может содержать в 5'-3'-направлении транскрипции область инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), полинуклеотидную последовательность AHASL1 согласно изобретению и область терминации транскрипции и трансляции (т.е. область терминации), функционирующие в растениях. Промотор может быть нативным или аналогичным или чужеродным или гетерологич-ным по отношению к растению-хозяину и/или полинуклеотидной последовательности AHASL1 согласно изобретению. Кроме того, промотор может представлять собой природную последовательность или альтернативно синтетическую последовательность. В том случае, когда промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" по отношению к растению-хозяину, подразумевается, что промотор не встречается в нативном растении, в которое вводят промотор. В то случае, когда промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" по отношению к полинуклеотидной последовательности AHASL1 согласно изобретению, подразумевается, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для оперативно связанной полинуклеотидной последовательности AHASL1 согласно изобретению. В используемом в настоящем описании смысле химерный ген содержит кодирующую последовательность оперативно, связанную с областью инициации транскрипции, которая является гетерологич-ной по отношению к кодирующей последовательности.
Хотя предпочтительно можно экспрессировать полинуклеотиды AHASL1 согласно изобретению с использованием гетерологичных промоторов, можно использовать нативные промоторные последовательности. Такие конструкции могут изменять уровни экспрессии белка AHASL1 в растении или растительной клетке. Таким образом, изменяется фенотип растения или растительной клетки.
Область терминации может быть нативной по отношению к области инициации транскрипции, может быть нативной по отношению к оперативно связанной представляющей интерес последовательности AHASL1, может быть нативной по отношению к растению-хозяину или может быть получена из другого источника (т.е. быть чужеродной или гетерологичной по отношению к промотору, представляющей интерес полинуклеотидной последовательности AHASL1, растению-хозяину или любому их сочетанию). Подходящие области терминации доступны из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как области термина-ции октопинситазы и нопалинсинтазы. Смотрите также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.
В подходящих случаях ген (гены) могут быть оптимизированы для повышенной экспрессии в трансформированном растении. То есть гены могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для растения кодонов для повышенной экспрессия. Смотрите, например, публикацию Campbell и Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11, в которой обсуждается предпочтительное для хозяина использованием кодонов. В данной области имеются способы синтеза предпочтительных для растения генов. Смотрите, например, патенты США № 5380831 и 5436391 и Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Известно, что дополнительные модификации последовательности усиливают экспрессию генов в клетке-хозяине. Такие модификации включают исключение последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналов сайтов экзон-интронного сплайсинга, подобных транспозонам повторов и других хорошо охарактеризованных последовательностей, которые вредить экспрессии генов. Содержание G-C в последовательности можно корректировать до средних уровней для данной клетки-хозяина, которые рассчитывают на основании известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Когда это возможно, последовательность модифицируют так, чтобы избежать образования предполагаемых вторичных структур мРНК в виде шпилек.
Нуклеотидные последовательности для усиления экспрессии генов также могут быть использованы в экспрессирующих векторах растений. К таким последовательностям относятся интроны гена AdhI in-tronl кукурузы (Callis et al. Genes and Development 1: 1183-1200, 1987) и лидерные последовательности (W-последовательность) из вируса мозаики табака (TMV), вируса хлоротической пятнистости кукурузы и вируса мозаики люцерны (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15: 8693-8711, 1987 и Skuzeski et al. Растение Mol. Biol. 15: 65-79, 1990). Показано, что первый интрон из локуса shrunkent-1 кукурузы увеличивает экспрессию генов в химерных генных конструкциях. В патентах США № 5424412 и 5593874 раскрыто применение специфичных интронов в экспрессирующих генных конструкциях, и в Gallie et al. (Plant Physiol. 106: 929-939, 1994) также показано, что интроны применимы для регуляции экспрессии генов на тканеспецифичной основе. Чтобы дополнительно усилить или оптимизировать экспрессию гена малой субъединицы AHAS, экспрессирующие векторы растений согласно изобретению также могут содержать последовательности ДНК, содержащие области прикрепления к матриксу (MAR). Растительные клетки, трансформированные такими модифицированными системами экспрессии, затем могут осуществлять сверхэкспрессию или конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности согласно изобретению.
Кассеты экспрессии дополнительно могут содержать 5'-лидерные последовательности в конструк
ции кассеты экспрессии. Такие лидерные последовательности могут действовать, усиливая трансляцию. Лидеры трансляции известны в данной области и включают: лидеры пикорнавирусов, например, лидер EMCV (5'-некодирующая область энцефаломиокардита) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); лидеры потивирусов, например, лидер TEV (вируса гравировки табака) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233-238), лидер MDMV (вируса карликовой мозаики кукурузы) (Virology 154: 9-20) и белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 9094); нетранслируемый лидер из мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622-625); лидер вируса мозаики табака (TMV) (Gallie et al. (1989) в Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); и лидер вируса хлоротической пятнистости кукурузы (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). Также смотрите Della-Cioppa et al. (1987) Plant Phys-iol. 84: 965-968. Также можно использовать другие способы, которые как известно усиливают трансляцию, например, с использованием интронов и тому подобного.
При получении кассеты экспрессии можно подвергать обработке различные фрагменты ДНК так, чтобы получить последовательности ДНК в правильной ориентации и, в соответствующем случае, в правильной рамке считывания. Для этой цели можно использовать адаптеры и линкеры, чтобы связать фрагменты ДНК, или можно использовать другие манипуляции, чтобы ввести подходящие сайты рестрикции, удалить избыточную ДНК, удалить сайты рестрикции или тому подобное. Для указанной цели можно использовать мутагенез in vitro, репарацию с праймерами, рестрикцию, отжиг, повторные замены, например, транзиции и трансверсии.
Ряд промоторов можно использовать при практическом осуществлении изобретения. Промоторы могут быть выбраны на основе требуемого результата. Нуклеиновые кислоты можно сочетать с конститутивными, предпочтительными для определенной ткани или другими промоторами для экспрессия в растениях.
Такие конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 и другие конститутивные промоторы, описанные в WO 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); промотор актина риса (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); убиквитина (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 и Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al.
(1984) EMBO J. 3: 2723-2730); промотор ALS (патент США № 5659026) и тому подобные. Другие конститутивные промоторы включают, например, промоторы, описанные в патентах США № 5608149, 5608144,5604121, 5569597, 5466785,5399680,5268463, 5608142 и 6177611.
Предпочтительные для ткани промоторы могут быть использованы для обеспечения целенаправленной усиленной экспрессии AHASL1 в конкретной растительной ткани. Такие предпочтительные для ткани промоторы включают без ограничения предпочтительные для листьев промоторы, предпочтительные для корней промоторы, предпочтительные для семян промоторы и предпочтительные для стебля промоторы. Предпочтительные для ткани промоторы описаны в Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6 (2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112 (3) :1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mo I Biol. 23 (6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; и Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4 (3) :495-505. Такие промоторы при необходимости могут быть модифицированы в отношении слабой экспрессии.
В одном варианте представляющие интерес нуклеиновые кислоты направляют в мишень - хлоропласт, для экспрессии. Таким образом, когда представляющая интерес нуклеиновая кислота непосредственно не встроена в хлоропласт, кассета экспрессии будет дополнительно содержать направляющую в хлоропласт последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует транзитный пептид хлоропласта, для того, чтобы направить продукт представляющего интерес гена в хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны в данной области. Что касается направляющих в хлоропласт последовательностей, то "оперативно связанная" означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая транзитный пептид (т.е. направляющая в хлоропласт последовательность), связана с полинуклеотидом AHASL согласно изобретению так, что две последовательности непосредственно следуют друг за другом и находятся в одной и той же рамке считывания. Смотрите, например, Von Hei-jne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; и Shah et al. (1986) Science 233: 478-481. Хотя белки AHASL1 согласно изобретению включают в себя нативный транзитный пептид хлоропласта, любой транзитный пептид хлоропласта, известный в данной области, может быть слит с аминокислотной последовательностью зрелого белка AHASL1 согласно изобретению посредством оперативного связывания направляющей в хлоропласт последовательности с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый белок AHASL1 согласно изобретению.
Направляющие в хлоропласт последовательности известны в данной области и включают малую
субъединицу рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы хлоропласта (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al.
(1996) Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(5): 3335-3342); 5-(енолпи-рувил)шикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6): 789-810); триптофансинтазу (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11): 6081-6087); пластоцианин (Lawrence et al.
(1997) J. Biol. Chem. 272(33): 20357-20363); хоризматсинтазу (Schmidt et al. (1993) J. Biol Chem. 268(36): 27447-27457); и светособирающий хлорофилл a/b-связывающий белок (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Смотрите также Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; и Shah et al. (1986) Science 233: 478481.
Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. Смотрите, например, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab и Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913917; Svab и Maliga (1993) EMBOJ. 12: 601-606. Способ основан на использовании пушки для частиц для доставки ДНК, содержащей селектируемый маркер, и целенаправленном встраивании ДНК в геном пластид с помощью гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформация пластид может быть осуществлена посредством трансактивации молчащего трансгена, который несут пластиды, в результате тка-неспецифичной экспрессии кодируемой в ядре и направленной в пластиды РНК-полимеразы. Такая система описана в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.
Представляющие интерес нуклеиновые кислоты, которые необходимо направить в хлоропласт, могут быть оптимизированы для экспрессии в хлоропласте с учетом различий в использовании кодонов между ядром растения и данным органоидом. Таким образом, представляющие интерес нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для хлоропластов кодонов. Смотрите, например, патент США № 5380831, включенный в настоящее описание в виде ссылки.
Как указано в настоящем описании, нуклеотидные последовательности AHASL1 согласно изобретению применимы для усиления устойчивости к гербицидам растений, которые содержат в своих геномах ген, кодирующий устойчивый к гербицидам белок AHASL1. Такой ген может представлять собой эндогенный ген или трансген. Кроме того, в некоторых вариантах последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению можно комплектовать с любым сочетанием представляющих интерес полинуклеотидных последовательностей, чтобы создать растения с требуемым фенотипом. Например, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению можно сочетать с любыми другими поли-нуклеотидами, кодирующими полипептиды, обладающие пестицидной и/или инсектицидной активностью, такие как, например, белки токсины Bacillus thuringiensis (описанные в патентах США № 5366892, 5747450, 5737514, 5723756, 5593881 и Geiser et al. (1986) Gene 48: 109). Полученные комбинации также могут включать в себя множественные копии любого одного из представляющих интерес полинуклеоти-
дов.
Понятно, что наряду с такими нуклеотидными последовательностями могут быть сконструированы антисмысловые конструкции, комплементарные, по меньшей мере, части полинуклеотидных последовательностей матричной РНК (мРНК) для AHASL1. Антисмысловые нуклеотиды конструируют для гибридизации с соответствующими мРНК. Могут быть осуществлены модификации антисмысловых последовательностей при условии, что последовательности гибридизуются и препятствуют экспрессии соответствующей мРНК. Таким образом, могут быть использованы антисмысловые конструкции, имеющие 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 85% идентичность последовательности с соответствующими антисмысловыми последовательностями. Кроме того, части антисмысловых нуклеотидов могут быть использованы для нарушения экспрессии гена-мишени. Обычно можно использовать последовательности длиной, по меньшей мере, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 200 нуклеотидов или больше.
Нуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению также можно использовать в смысловой ориентации, чтобы подавить экспрессию эндогенных генов в растениях. Способы подавления экспрессии генов в растениях с использованием нуклеотидных последовательностей в смысловой ориентации известны в данной области. Способы обычно включают в себя трансформацию растений конструкцией ДНК, содержащей промотор, который управляет экспрессией в растении, оперативно связанный, по меньшей мере, с частью нуклеотидной последовательности, которая соответствует транскрипту эндогенного гена. Обычно такая нуклеотидная последовательность имеет значительную идентичность последовательности с последовательностью транскрипта эндогенного гена, предпочтительно больше чем примерно 65% идентичность последовательности, более предпочтительно больше чем примерно 85% идентичность последовательность, наиболее предпочтительно больше чем примерно 95% идентичность последовательности. Смотрите патенты США № 5283184 и 5034323, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Хотя резистентные к гербицидам полинуклеотиды AHASL1 согласно изобретению применимы в качестве генов селектируемых маркеров для трансформации растений, кассеты экспрессии согласно изобретению могут содержать другой ген селектируемого маркера для селекции трансформированных клеток. Гены селектируемых маркеров, включая гены согласно настоящему изобретению, применяют для селекции трансформированных клеток или тканей. Маркерные гены включают без ограничения гены,
кодирующие резистентность к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (NEO) и гигромицинфосфотрансферазу (НРТ), а также гены, придающие резистентность к гербицид-ным соединениям, таким как глюфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфенок-сиацетат (2,4-D). В общем, смотрите Yarranton(1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wy-borski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology. Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Указанные публикации включены в настоящее описание в виде ссылки.
Приведенный выше список генов селектируемых маркеров не следует рассматривать как ограничивающий. В настоящем изобретении можно использовать любой ген селектируемого маркера.
Изолированные молекулы полинуклеотидов, содержащие нуклеотидную последовательность, которая кодирует белки AHASL1 согласно изобретению, можно использовать в векторах для трансформации растений, для того чтобы созданные растения имели повышенную резистентность к гербицидам, в частности, к имидазолиноновым гербицидам. Изолированные молекулы полинуклеотидов AHASL1 согласно изобретению можно использовать в векторах отдельно или в сочетании с нуклеотидной последовательностью, кодирующей малую субъединицу фермента AHAS (AHASS), для придания растениям резистентности к гербицидам. Смотрите патент США № 6348643, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к векторам для трансформации, содержащим ген селектируемого маркера согласно изобретению. Ген селектируемого маркера содержит промотор, который управляет экспрессией в клетке-хозяине, оперативно связанный с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, которая кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL согласно изобретению. Вектор для трансформации дополнительно может содержать представляющий интерес ген, который необходимо экспрессировать в клетке-хозяине, а также, при необходимости, может содержать направляющую в хлоропласт последовательность, которая оперативно связана с полинуклеотидом согласно изобретению.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам применения векторов для трансформации согласно изобретению для селекции в отношении клеток, трансформированных представляющим интерес геном. Такие способы заключаются в трансформации клетки-хозяина трансформирующим вектором, воздействии на клетку определенным уровнем имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида, который может убивать или ингибировать рост нетрансформированной клетки-хозяина, и идентификации трансформированной клетки-хозяина по ее способности расти в присутствии гербицида. В одном варианте согласно изобретению клетка-хозяин представляет собой растительную клетку, и ген селектируемого маркера содержит промотор, который управляет экспрессией в растительной клетке.
Векторы для трансформации согласно изобретению можно применять для получения растений, трансформированных представляющим интерес геном. Векторы для трансформации будут содержать ген селектируемого маркера согласно изобретению и представляющий интерес ген, который необходимо ввести и, как правило, экспрессировать в трансформированном растении. Такой ген селектируемого маркера содержит резистентный гербицидам полинуклеотид AHASL1 согласно изобретению, оперативно связанный с промотором, который управляет экспрессией в клетке-хозяине. В случае применения в растениях и растительных клетках вектор для трансформации содержит ген селектируемого маркера, включающий в себя резистентный к гербицидам полинуклеотид AHASL1 полинуклеотид согласно изобретению, оперативно связанный с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке.
Изобретение также относится к экспрессирующему вектору растений, содержащему промотор, который управляет экспрессией в растении, оперативно связанный с изолированной молекулой полинук-леотида согласно изобретению. Изолированная молекула полинуклеотида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок AHASL1, в частности белок AHASL1, содержащий аминокислотную последовательность, которая указана в SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 или 6, или ее функциональный фрагмент и вариант. Экспрессирующий вектор растений согласно изобретению не зависит от конкретного промотора, за исключением того, что такой промотор должен обладать способностью управлять экспрессией генов в растительной клетке. Предпочтительные промоторы включают конститутивные промоторы и предпочтительные для тканей промоторы.
Представляющие интерес гены согласно изобретению варьируют в зависимости от требуемого ре
зультата. Например, интерес могут представлять различные изменения фенотипа, включая модификацию состава жирных кислот в растении, изменение содержания аминокислот в растении, изменение механизмов защиты растения от насекомых и/или патогенов и тому подобные. Указанные результаты могут быть достигнуты в результате экспрессии гетерологичных продуктов или повышенной экспрессии эндогенных продуктов в растениях. Альтернативно результаты могут быть достигнуты в результате снижения экспрессии одного или нескольких эндогенных продуктов в растении, в частности, ферментов или кофакторов. Такие изменения приводят к изменению фенотипа трансформированного растения.
В одном варианте осуществления изобретения представляющими интерес генами являются гены резистентности к насекомым, например, такие как гены белка токсина Bacillus thuringiensis (патенты США № 5366892, 5747450, 5736514, 5723756, 5593881 и Geiser et al. (1986) Gene 48: 109).
Белки или полипептиды AHASL1 согласно изобретению могут быть очищены, например, из растений Brassica и могут быть использованы в композициях. Также изолированная молекула полинуклеоти-да, кодирующего белок AHASL1 согласно изобретению, может быть использована для экспрессии белка AHASL1 согласно изобретению в микроорганизме, таком как Е. coli или дрожжи. Экспрессированный белок AHASL1 можно очистить из экстрактов Е. coli или дрожжей любым способом, известным специалисту в данной области.
Изобретение также относится к способу создания трансгенного растения, которое резистентно к гербицидам, включающему в себя трансформацию растения экспрессирующим вектором растений, содержащим промотор, который управляет экспрессией в растении, оперативно связанный с изолированной молекулой полинуклеотида согласно изобретению. Изолированная молекула полинуклеотида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок AHASL1 согласно изобретению, в частности, белок AHASL1, содержащий аминокислотную последовательность, которая указана в SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 или 6, аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:12, 13, 14, 15 или 16, или функциональный фрагмент и вариант указанных аминокислотных последовательностей.
Изобретение также относится к нетрансгенным растениям Brassica, трансгенным растениям, полученным способами согласно изобретению, и потомству и другим потомкам таких нетрансгенных и трансгенных растений, при этом растения обладают усиленной или повышенной резистентностью к гербицидам, которые отрицательно влияют на фермент AHAS, в частности, имидазолиноновым и сульфо-нилмочевинным гербицидам.
Полинуклеотиды AHASL1 согласно изобретению, в частности, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам белки AHASL1, применимы в способах усиления резистентности устойчивых к гербицидам растений. В одном варианте осуществления изобретения устойчивые к гербицидам растения содержат устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам белок AHASL. Устойчивые к гербицидам растения включают как растения, трансформированные устойчивыми к гербицидам нуклеотид-ными последовательностями AHASL, так и растения, которые содержат в своих геномах эндогенный ген, который кодирует устойчивый к гербицидам белок AHASL. Такое устойчивое к гербицидам растение может представлять собой устойчивое к гербицидам растение, которое было генетически сконструировано для получения устойчивости к гербицидам, или устойчивое к гербицидам растение, которое было создано способами, в которых не используют рекомбинантную ДНК, например, такие как растения Bras-sica согласно настоящему изобретению. Нуклеотидные последовательности, кодирующие устойчивые к гербицидам белки AHASL, и устойчивые к гербицидам растения, содержащие эндогенный ген, который кодирует устойчивый к гербицидам белок AHASL, включают полинуклеотиды и растения согласно настоящему изобретению или полинуклеотиды и растения, которые известны в данной области. Смотрите,
например, патенты США № 5013659, 5731180, 5767361, 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 и
6274796, которые все включены в настоящее описание в виде ссылки. Такие способы усиления резистентности устойчивых к гербицидам растений включают в себя трансформацию устойчивого к гербицидам растения по меньшей мере одной полинуклеотидной конструкцией, содержащей промотор, который управляет экспрессией в растительной клетке, который оперативно связан с резистентным к гербицидам полинуклеотидом AHASL1 согласно изобретению, в частности полинуклеотидом, кодирующим резистентный к гербицидам белок AHASL1, указанный в SEQ ID NO:12, 13, 14, 15 или 16, полинуклео-тидами, кодирующими аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:2, 3, 4, 5 или 6, и фрагментами и вариантами указанных полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды, обладающие резистентной к гербицидам активностью AHAS. Растение, полученное таким способом обладает повышенной резистентностью, по меньшей мере. к одному гербициду по сравнению с резистентным к гербицидам растением до трансформации полинуклеотидной конструкцией согласно изобретению.
Доступны многочисленные векторы для трансформации растений и способы трансформации растений. Смотрите, например, An, G. et al. (1986) Plant Pysiol, 81: 301-305; Fry, J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6: 321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet. 16: 161-114; Hinchee, et al. (1990) Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18: 481-494; Chee, P.P. и Slightom, J.L. (1992) Gene. 118: 255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10: 239-246; D'Halluin, et al. (1992) Bio/Technol. 10: 309-314; Dhir, et al. (1992) Plant Physiol. 99: 81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci.
USA 90: 11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P: 119-124; Davies, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12: 180-183; Dong, 1А. и Mchughen, A. (1993) Plant Sci. 91: 139-148; Franklin, C.I. и Trieu, T.N. (1993) Plant. Physiol. 102: 167; Golovkin, et al. (1993) Plant Sci. 90: 41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38: 20722078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N.M. и Park, W.D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13: 219239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J. 5: 583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5: 299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16: 225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13: 582-586; Hartman, et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24: 317-325; и Wan, Y.C. и Lemaux, P.G. (1994) Plant Physiol. 104: 3748.
Способы согласно изобретению заключаются во введении полинуклеотидной конструкции в растение. Под "введением" подразумевают воздействие на растение полинуклеотидной конструкцией таким образом, чтобы конструкция получила доступ внутрь клетки растения. Способы согласно изобретению не зависят от конкретного способа введения полинуклеотидной конструкции в растение при условии, что полинуклеотидная конструкция получает доступ внутрь по меньшей мере одной клетки растения. Способы введения полинуклеотидных конструкций в растения известны в данной области, включая без ограничения способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и опосредованные вирусами способы.
Под "стабильной трансформацией" подразумевают, что полинуклеотидная конструкция, введенная в растение, интегрируется в геном растения и может наследоваться его потомством. Под "временной трансформацией" подразумевают, что полинуклеотидная конструкция, введенная в растение, не интегрируется в геном растения.
Для трансформации растений и растительных клеток нуклеотидные последовательности согласно изобретению встраивают, используя стандартные методики, в любой вектор, известный в данной области, который подходит для экспрессии нуклеотидных последовательностей в растении или растительной клетке. Выбор вектора зависит от предпочтительной методики трансформации и вида растения-мишени, которое необходимо трансформировать. В одном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность AHASL1 оперативно связана с промотором растений, который, как известно, обеспечивает высокие уровни экспрессии в растительной клетке, и такую конструкцию затем вводят в растение, которое является чувствительным к имидазолиноновому гербициду, и регенерируют трансформированное растение. Трансформированное растение устойчиво к воздействию такого уровня имидазолино-нового гербицида, который убивает или в значительной степени повреждает нетрансформированное растение. Указанный способ может быть применим для любого вида растения; однако он наиболее полезен для применения по отношению к культурным растениям, в частности культурным растениям, которые обычно выращивают в присутствии по меньшей мере одного гербицида, в частности имидазолинонового гербицида.
Методики конструирования кассет экспрессии в растениях и введения чужеродных нуклеиновых кислот в растения, в общем, известны в данной области и описаны ранее. Например, чужеродную ДНК можно вводить в растения, используя векторы на основе индуцирующих опухоли (Ti)-плазмид. Способы трансформации на основе Agrobacterium хорошо известны в данной области. Штамм Agrobacterium (например, Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes) содержит плазмиду (Ti- или Ri-плазмиду) и элемент Т-ДНК, который переносят в растение в результате инфекции Agrobacterium. Т-ДНК (переносимая ДНК) интегрируется в геном растительной клетки. Т-ДНК может быть локализована в Ri- или Ti-плазмиде или содержится отдельно в так называемом бинарном векторе. Способы опосредованной Agrobacterium трансформации описаны, например, в Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229f. Опосредованная Agrobacterium трансформация может быть использована как для двудольных растений, так и для однодольных растений. Трансформация растений с помощью Agrobacteria описана в White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung и R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38; Jenes В et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S.D. Kung и R. Wu, Academic Press, pp. 128143; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol 42: 205-225. Другие способы, используемые для доставки чужеродной ДНК, включают в себя применение опосредованной ПЭГ трансформации протопластов, электропорацию, микроинъекцию нитевидных кристаллов и баллистические способы или бомбардировку микрочастицами для прямого захвата ДНК. Такие способы известны в данной области (патент США № 5405765, Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al., (1991) Mol Gen. Genet, 228: 104-112; Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al., (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al., (1980) Science 208:1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach и Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988) и Methods in Plant Molecular Biology (Schuler и Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Способ трансформации зависит от растительной клетки, которую необходимо трансформировать, стабильности используемых векторов, уровня экспрессии генных продуктов и других параметров.
Другие подходящие способы введения нуклеотидных последовательностей в растительные клетки и последующего встраивания в геном растения, включают микроинъекцию, как описано в Crossway et al.
(1986) Biotechniques 4: 320-334, электропорацию, как описано в Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606, опосредованную Agrobacterium трансформацию, как описано Townsend et al. в патенте США № 5563055, Zhao et al. в патенте США № 5981840, прямой перенос генов, как описано в Pasz-kowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722, и баллистическое ускорение частиц, как описано, например, Sanford et al. в патенте США № 4945050; Tomes et al. в патенте США № 5879918; Tomes et al. в патенте США № 5886244; Bidney et al. в патенте США № 5932782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg и Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923-926); и трансформацию Lecl (WO 00/28058). Также смотрите Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421477; Sanford et al. (1987) Paniculate Science and Technology 5: 27-37 (лук); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674 (соя); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923-926 (соя); Finer и McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (соя); Singh et al. (1998) Theor. Appl Genet. 96: 319-324 (соя); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (рис); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (кукуруза); Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (кукуруза); Tomes, патент США № 5240855; Buising et al., патенты США №№ 5322783 и 5324646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," в Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (кукуруза); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (кукуруза); Froram et al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (кукуруза); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763764; Bowen et al., патент США № 5736369 (злаковые); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345-5349 (лилейные); De Wet et al. (1985) в The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (пыльца); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 и Ka-eppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (опосредованная нитевидными кристаллами трансформация); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (электропорация); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250-255 и Christou и Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (рис); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (кукуруза посредством Agrobacterium tumefaciens); все публикации включены в настоящее описание в виде ссылки.
Полинуклеотиды согласно изобретению могут быть введены в растения в результате контактирования растений с вирусом или вирусными нуклеиновыми кислотами. В общем, такие способы заключаются во введении полинуклеотидной конструкции согласно изобретению в молекулу вирусной ДНК или РНК. Понятно, что белок AHASL1 согласно изобретению может быть исходно синтезирован в виде части вирусного полибелка, который позднее процессируется в результате протеолиза in vivo или in vitro с образованием требуемого рекомбинантного белка. Кроме того, понятно, что промоторы согласно изобретению также охватывают промоторы, используемые для транскрипции вирусными РНК-полимеразами. Способы введения полинуклеотидных конструкций в растения и экспрессии в растениях кодируемого белка, включая введение молекул вирусных ДНК или РНК, известны в данной области. Смотрите, например, патенты США № 5889191, 5889190, 5866785, 5589367 и 5316931, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения согласно обычным способам. Смотрите, например, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Такие растения затем могут быть выращены и опылены либо такой же трансформированной линией, либо другой линией, и может быть идентифицирован полученный гибрид, имеющий конститутивную экспрессию требуемого феноти-пического признака. Могут быть выращены два или больше поколений, чтобы удостовериться, что экспрессия требуемого фенотипического признака стабильно поддерживается и наследуется, и затем могут быть собраны семена, чтобы гарантировать, что достигнута экспрессия требуемого фенотипического признака. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированному семени (также называемому "трансгенным семенем"), содержащему полинуклеотидную конструкцию согласно изобретению, например, кассету экспрессии согласно изобретению, стабильно внедренную в его геном.
Настоящее изобретение можно применять для трансформации любого вида растения, включая без ограничения однодольные и двудольные растения. Примеры представляющих интерес видов растений включают без ограничения кукурузу (Zea mays), виды Brassica (например, В. napus, В. rapa, В. juncea), в частности, виды Brassica, применимые в качестве источников масла, получаемого из семян, люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, просо африканское (Pennisetum glaucum), просо обыкновенное (Panicum miliaceum), просо итальянское (Setaria italica), элевзине (Eleusine coracana)), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор (Car-thamus tinctorius), пшеницу (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum), сою (Glycine max), табак (Nico-tiana tabacum), картофель (Solatium tuberosum), арахис (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium bar-badense, Gossypium hirsutum), батат (Ipomoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофе (Coffea spp.), кокос (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусовые деревья (Citrus spp.), какое (Theobroma cacao), чай (Camellia sinensis), бананы (Musa spp.), авокадо (Persea americana), смоковницу (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), оливу (Olea europaea), папайю (Carica papaya), кешью (Ana-cardium occidentale), макадамию (Macadamia integrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), сахарную свеклу (Beta vulgaris), сахарный тростник (Saccharum spp.), овес, ячмень, овощи, декоративные растения и хвой
ные. Предпочтительно растения согласно настоящему изобретению представляют собой сельскохозяйственные растения (например, подсолнечник, виды Brassica, хлопчатник, сахарный тростник, свеклу, сою, арахис, люцерну, сафлор, табак, кукурузу, рис, пшеницу, рожь, ячмень, тритикале, сорго, просо и т.д.).
Резистентные к гербицидам растения согласно изобретению применимы в способах борьбы с сорняками. Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу борьбы с сорняками, растущими рядом с резистентным к гербицидам растением согласно изобретению. Способ включает в себя нанесение эффективного количества гербицида на сорняки и резистентное к гербициду растение, при этом растение обладает повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, в частности, к имидазолиноновому или сульфонилмочевинному гербициду, по сравнению с растением дикого типа. В таком способе борьбы с сорняками резистентные к гербицидам растения согласно изобретению предпочтительно являются сельскохозяйственными растениями, включая без ограничения подсолнечник, люцерну, виды Brassica, сою, хлопчатник, сафлор, арахис, табак, томат, картофель, пшеницу, рис, кукурузу, сорго, ячмень, рожь, просо и сорго.
Благодаря получению растений, обладающих повышенной резистентностью к гербицидам, в частности, имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, можно использовать широкое множество препаратов для защиты растений от сорняков, для того чтобы ускорить рост растений и снизить конкуренцию за питательные вещества. Гербицид можно использовать отдельно для довсходовой, по-слевсходовой, предпосевной и осуществляемой при посеве борьбы с сорняками на площадях, окружающих растения, описанные в настоящей публикации, или можно использовать препараты имидазолиноно-вых гербицидов, которые содержат другие добавки. Гербицид также можно применять для обработки семян. То есть эффективную концентрацию или эффективное количество гербицида или композиции, содержащей эффективную концентрацию или эффективное количество гербицида можно вносить непосредственно в семена перед или во время посева семян. Добавки, имеющиеся в препарате или композиции имидазолинонового или сульфонилмочевинного гербицида, включают другие гербициды, детергенты, адъюванты, средства для распыления, склеивающие средства, стабилизаторы или тому подобное. Гербицидный препарат может представлять собой влажный или сухой препарат, и такие препараты включают без ограничения сыпучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. Гербицид и гербицидные препараты можно применять согласно обычным способам, например, опрыскиванием, орошением, опылением, нанесением покрытия и тому подобными способами.
Настоящее изобретение относится к способам, которые заключаются в применении AHAS-ингибирующего гербицида. В таких способах AHAS-ингибирующий гербицид можно применять, используя любой способ, известный в данной области, включая без ограничения обработку семян, обработку почвы и внекорневую обработку.
Настоящее изобретение относится к способам повышения устойчивости или резистентности растения, растительной ткани, растительной клетки или другой клетки-хозяина по меньшей мере к одному гербициду, который препятствует проявлению активности Фермента AHAS. Предпочтительно такой ин-гибирующий AHAS гербицид является имидазолиноновым гербицидом, сульфонилмочевинным гербицидом, триазолопиримидиновым гербицидом, пиримидинилоксибензоатным гербицидом, сульфонила-минокарбонилтриазолиноновым гербицидом или их смесью. Более предпочтительно такой гербицид является имидазолиноновым гербицидом, сульфонилмочевинным гербицидом или их смесью. В случае настоящего изобретения имидазолиноновые гербициды включают без ограничения PURSUIT(r) (имазе-тапир), CADRE(r) (имазапик), RAPTOR(r) (имазамокс), SCEPTER(r) (имазахин), ASSERT(r) (имазетабенз), ARSENAL(r) (имазапир), производное любого из вышеназванных гербицидов и смесь двух или более из вышеназванных гербицидов, например, имазапир/имазамокс (ODYSSEY(r)). Более конкретно имидазоли-ноновый гербицид может быть выбран из группы, без ограничения состоящей из 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидиазолин-2-ил)никотиновой кислоты, [2-(4-изопропил)-4-][метил-5-оксо-2-имидазо-лин-2-ил)-3-хинолинкарбоновой] кислоты, [5-этил-2-(4-изопропил-]-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никоти-новой кислоты, [2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-]имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновой кислоты и смеси метил[6-(4-изопропил-4-]метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил[2-(4-изопропил-4-метил-5-]оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата. Применение 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-ими-дазолин-2-ил)никотиновой кислоты и [2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-]ил)-5-(метокси-метил)никотиновой кислоты является предпочтительным. В частности, предпочтительно применение [2-(4-изопропил-4-]метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты.
В случае настоящего изобретения к сульфонилмочевинным гербицидам относятся без ограничения хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, трифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлу-сульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасуль-фурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, эток-сисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфуронметил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфу-рон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, произ
водное любого из вышеуказанных гербицидов и смесь двух или более из вышеуказанных гербицидов. Триазолопиримидиновые гербициды согласно изобретению включают без ограничения клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пенокссулам. Пиримидинилоксибензоатные гербициды согласно изобретению включают без ограничения биспирибак, пиритиобак, пириминобак, пири-бензоксим и пирифталид.
Сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды включают без ограничения флукарбазон и пропоксикарбазон.
Понятно, что пиримидинилоксибензоатные гербициды являются близко родственными пиримиди-нилтиобензоатным гербицидам, и Американским научным обществом по исследованию сорняков указанным гербицидам присвоено одно общее последнее название. Соответственно к гербицидам согласно настоящему изобретению дополнительно относятся пиримидинилтиобензоатные гербициды, включая без ограничения пиримидинилоксибензоатные гербициды, описанные выше.
Перед применением AHAS-ингибирующий гербицид может быть превращен в обычные препараты, например растворы, эмульсии, суспензии, пылевидные препараты, порошки, пасты и гранулы. Форма применения зависит от конкретной предполагаемой цели; в каждом случае она должна гарантировать тонкодисперсное и равномерное распределение соединения согласно изобретению.
Препараты готовят известным способом (смотрите, например обзор в US 3060084, ЕР-А707445 (жидкие концентраты), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, 4 декабря 1967 г., 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, с. 8-57 и et seq. WO 91/13546, US 4172714, US 4144050, US 3920442, US 5180587, US 5232701, US 5208030, GB 2095558, US 3299566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley и Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 и Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), например, посредством введения вместе с активным соединением вспомогательных средств, подходящих для приготовления агрохимикатов, таких как растворители и/или носители, при необходимости эмульгаторов, поверхностно-активных веществ и диспергирующих агентов, консервантов, противопенных средств, антифризы, в случае препарата для обработки семян также необязательно красители и/или связывающие средства и/или гелеобразующие средства.
Примерами подходящих растворителей являются вода, ароматические растворители (например продукты Solvesso, ксилен), парафины (например фракции минерального масла), спирты (например, метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, циклогексанон, гамма-бутиролактон), пирролидоны (NMP, NOP), ацетаты (гликольдиацетат), гликоли, диметиламиды жирных кислот, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот. В принципе, также можно использовать смеси растворителей.
Примерами подходящих носителей являются измельченные природные минералы (например, каолины, глины, тальк, мел) и измельченные синтетические минералы (например, высокодисперсный диоксид кремния, силикаты).
Подходящими эмульгаторами являются неионные и анионные эмульгаторы (например, эфиры по-лиоксиэтилена и жирных спиртов, алкилсульфонаты и арилсульфонаты). Примерами диспергирующих средств являются лигнин-отработанный сульфитный щелок и метилцеллюлоза.
Подходящими используемыми поверхностно-активными веществами являются соли щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и аммония и лигносульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, фенолсульфоновой кислоты, дибутилнафталинсульфоновой кислоты, алкиларилсульфонаты, алкилсульфаты, алкилсульфонаты, сульфаты жирных спиртов, жирных кислот и сульфатированные гли-колевые эфиры жирных спиртов, а также конденсаты сульфонированного нафталина и производных нафталина с формальдегидом, конденсаты нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленоктилфеноловый эфир, этоксилированный изооктилфенол, октилфе-нол, нонилфенол, эфиры алкилфенолполигликоля, эфир трибутилфенилполигликоля, эфир тристеарил-фенилполигликоля, алкиларилполиэфирные спирты, конденсаты этиленоксида со спиртами и жирными спиртами, этоксилированное касторовое масло, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, этоксилированный полиоксипропилен, ацеталь полигликолевого эфира лаурилового спирта, сложные эфиры сорбита, лиг-носульфитный отработанный щелок и метилцеллюлоза.
Веществами, которые подходят для получения непосредственно разбрызгиваемых растворов, эмульсий, паст или масляных дисперсий, являются фракции минерального масла с точкой кипения от среднего до высокого значения, такие как керосин или дизельное топливо, кроме того, каменноугольные смолы и масла растительного или животного происхождения, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например, толуол, ксилол, парафин, тетрагидронафталин, алкилированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогенсанол, циклогексанон, изофорон, высоко полярные растворители, например, диметилсульфоксид, N-метилпирролидон или вода.
Также в препарат могут быть добавлены антифризы, такие как глицерин, этиленгликоль, пропи-ленгликоль и бактерицидные средства.
Подходящими противопенными средствами являются, например, противопенные средства на осно
ве кремния или стеарата магния. Препараты для обработки семян дополнительно могут содержать связывающие средства и необязательно красители.
Связывающие средства могут быть добавлены для улучшения адгезии активных вещества на семенах после обработки. Подходящими связывающими средствами являются поверхностно-активные вещества на основе блок-сополимеров ЕО/РО, а также поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, по-лиакрилаты, полиметакрилаты, полибутены, полиизобутилены, полистирол, полиэтиленамины, полиэти-ленамиды, полиэтиленимины (Lupasol(r), Polymin(r)), полиэфиры, полиуретаны, поливинилацетат, тилоза и сополимеры, полученные из таких полимеров.
Необязательно в препарат также могут быть включены красители. Подходящими красителями для препаратов, используемых для обработки семян, являются родамин В, C.I. пигмент красный 112, C.I. растворитель-красный 1, пигмент синий 15:4, пигмент синий 15:3, пигмент синий 15:2, пигмент синий 15:1, пигмент синий 80, пигмент желтый 1, пигмент желтый 13, пигмент красный 112, пигмент красный 48:2, пигмент красный 48:1, пигмент красный 57:1, пигмент красный 53:1, пигмент оранжевый 43, пигмент оранжевый 34, пигмент оранжевый 5, пигмент зеленый 36, пигмент зеленый 7, пигмент белый 6, пигмент коричневый 25, основной фиолетовый 10, основной фиолетовый 49, кислый красный 51, кислый красный 52, кислый красный 14, кислый синий 9, кислый желтый 23, основной красный 10, основной красный
108.
Примером подходящего гелеобразующего средства является карраген (Satiagel(r)). Порошки, вещества для рассеивания и распыляемые продукты могут быть получены смешиванием или совместным измельчением активных веществ с твердым носителем.
Гранулы, например, гранулы с покрытием, гранулы пропиткой и гомогенные гранулы, могут быть получены связыванием активных соединений с твердыми носителями. Примерами твердых носителей являются минералы, такие как силикагели, силикаты, тальк, каолин, аттапульгит, известняк, известь, мел, железистая известковая глина, лесс, глина, доломит, диатомовая земля, сульфат кальция, сульфат магния, оксид магния, измельченные синтетические материалы, удобрения, такие как, например, сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевины и продукты растительного происхождения, такие как мука из злаков, мука из древесной коры, древесная мука и мука из ореховой скорлупы, целлюлозные порошки и другие твердые носители.
В общем, препараты содержат от 0,01 до 95 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 90 мас.% AHAS-ингибирующего гербицида. В данном случае применяют AHAS-ингибирующие гербициды с чистотой от 90 до 100 мас.%, предпочтительно от 95 до 100 мас.% (согласно ЯМР-спектру). В целях обработки семян соответствующие препараты можно разбавить в 2-10 раз, получая концентрации в готовых к применению препаратах от 0,01 до 60 мас.% активного соединения, предпочтительно от 0,1 до 40 мас.%.
AHAS-ингибирующий гербицид может быть использован как таковой, в форме препаратов или в виде полученных из них форм для применения, например в форме непосредственно разбрызгиваемых растворов, порошков, суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, распыляемых продуктов, веществ для рассеивания или гранул, с помощью разбрызгивания, распыления, опыливания, рассеивания или заливки. Формы для применения полностью зависят от предполагаемых целей; они должны в каждом случае гарантировать наилучшее распределение AHAS-ингибирующего гербицида согласно изобретению.
Применяемые водные формы могут быть получены из концентратов эмульсий, паст или смачиваемых порошков (распыляемых порошков, масляных дисперсий) посредством добавления воды. Чтобы получить эмульсии, пасты или масляные дисперсии вещества как таковые или растворенные в масле или растворителе могут быть гомогенизированы в воде с использованием увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергирующего средства или эмульгатора. Однако также можно получать концентраты, состоящие из активного вещества, увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергирующего средства или эмульгатора, и в соответствующем случае растворителя или масла, и такие концентраты являются подходящими для разбавления водой.
Количества концентратов активного соединения в готовых к применению препаратах могут варьировать в относительно широких диапазонах. В общем они составляют от 0,0001 до 10%, предпочтительно от 0,01 до 1 мас.%.
AHAS-ингибирующий гербицид также можно успешно применять в способе, основанном на использовании сверхмалых объемов (ULV), и при этом можно применять препараты, содержащие более 95 мас.% активного соединения, или даже применять активное соединение без добавок.
Далее приведены примеры препаратов
1. Продукты для разбавления водой в случае внекорневой обработки. В целях обработки семян такие продукты можно наносить на семена разбавленными или неразбавленными. A) Растворимые в воде концентраты (SL, LS)
Десять частей по массу AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 90 массовых частей воды или водорастворимого растворителя. В качестве альтернативы добавляют увлажнители или другие вспомогательные вещества. AHAS-ингибирующий гербицид растворяется при разбавлении водой, при этом
получают препарат, содержащий 10% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
B) Диспергируемые концентраты (DC)
Двадцать массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 70 массовых частях циклогексанона с добавлением 10 массовых частей диспергирующего агента, например поливинилпир-ролидона. Разбавление водой дает дисперсию, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
C) Эмульгируемые концентраты (ЕС)
Пятнадцать массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 7 массовых частях ксилена с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 массовых частей). Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают препарат, содержащий 15% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
D) Эмульсии (EW, ЕО, ES) Двадцать пять массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 35 массовых частях ксилена с добавлением с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 массовых частей). Полученную смесь вводят в 30 массовых частей воды с помощью эмульгирующего устройства (например, Ultraturrax) и получают гомогенную эмульсию. Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают препарат, содержащий 25% (мас./мас.) AHAS- ингибирующего гербицида.
E) Суспензии (SC, OD, FS)
Во встряхиваемой шаровой мельнице измельчают 20 массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида с добавлением 10 массовых частей диспергирующих средств, увлажнителей и 70 массовых частей воды или органического растворителя, получая тонкодисперсную суспензию AHAS-ингибирующего гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
F) Диспергируемые в воде гранулы и водорастворимые гранулы (WG, SG)
Пятьдесят массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида тонко измельчают с добавлением 50 массовых частей диспергирующих средств и увлажнителей и получают в виде диспергируемых в воде или водорастворимых гранул с помощью технических устройств (например, с помощью экструзии, скруббера с разбрызгивающим устройством, псевдоожиженного слоя). Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 50% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
G) Диспергируемые в воде порошки и водорастворимые порошки (WP, SP, SS, WS)
Семьдесят пять массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида измельчают в роторно-статорной мельнице с добавлением 2 5 массовых частей диспергирующих средств, увлажнителей и сили-кагеля. Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 75% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
I) Гелевый препарат (GF)
Во встряхиваемой шаровой мельнице измельчают 20 массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида с добавлением 10 массовых частей диспергирующих средств, 1 массовой части гелеобразующих средств и 70 массовых частей воды или органического растворителя, получая тонкодисперсную суспензию AHAS- ингибирующего гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида. Указанный гелевый препарат подходит для применения при обработке семян.
2. Продукты, применяемые неразбавленными для некорневых обработок. В целях обработки семян такие продукты можно наносить на семена разбавленными.
A) Распыляемые порошки (DP, DS)
Пять массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида тонко измельчают и тщательно смешивают с 95 массовыми частями тонкодисперсного каолина. При этом получают распыляемый продукт, содержащий 5% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
B) Гранулы (GR, FG, GG, MG)
Половину массовой части AHAS-ингибирующего гербицида тонко измельчают и объединяют с 95,5 массовыми частями носителей, при этом получают препарат, содержащий 0,5% (мас./мас.) AHAS- ингибирующего гербицида. Используют имеющиеся в настоящее время способы экструзии, сушки с распылением или ожиженного слоя. При этом получают гранулы, которые используют неразбавленными при внекорневой обработке.
Обычные препараты для обработки семян включают, например, текучие концентраты FS, растворы LS, порошки для сухой обработки DS, диспергируемые в воде порошки для обработки взвесями WS, растворимые в воде порошки SS и эмульсии ES и ЕС и гелевый препарат GF. Такие препараты можно использовать для обработки семян разбавленными или неразбавленными. Обработку семян осуществляют перед посевом или непосредственно наносят на семена.
В предпочтительном варианте для обработки семян используют препарат FS. Обычно препарат FS может содержать 1-800 г/л активного ингредиента, 1-200 г/л поверхностно-активного вещества, от 0 до
200 г/л антифриза, от 0 до 400 г/л связывающего средства, от 0 до 200 г/л пигмента и до 1 л растворителя, предпочтительно воды.
Настоящее изобретение относится к нетрансгенным и трансгенным семенам резистентных гербицидам растений согласно настоящему изобретению. Такие семена включают, например, нетрансгенные семена Brassica, обладающие признаками резистентности к гербицидам растения J05Z-07801, J04E-0139, J04E-0130 или J04E-0122, и трансгенные семена, содержащие молекулу полинуклеотида согласно изобретению, которая кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL1.
В случае обработки семян семена резистентных к гербицидам растений согласно настоящему изобретению обрабатывают гербицидами, предпочтительно гербицидами, выбранными из группы, состоящей из AHAS-ингибирующих гербицидов, таких как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, пира-зосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, три-бенурон, трифтоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имаза-пик, имазапир, имазахин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритиобак и их смеси, или препаратом, содержащим AHAS-ингибирующий гербицид.
Термин "обработка семян" включает в себя все подходящие способы обработки семян, известные в данной области, такие как протравливание семян, дражирование семян, опудривание семян, намачивание семян и пеллетирование семян.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения дополнительным объектом изобретения является способ обработки почвы, в частности внесением в рядовую сеялку: либо гранулярного препарата, содержащего AHAS-ингибирующий гербицид, в виде композиции/препарат, например, гранулярного препарата, необязательно с одним или несколькими твердыми или жидкими приемлемыми для сельского хозяйства носителями и/или необязательно с одним или несколькими приемлемыми для сельского хозяйства поверхностно-активными веществами. Такой способ преимущественно применяют, например, для обработки почвы, приготовленной для посева зерновых, кукурузы, хлопчатника и подсолнечника.
Настоящее изобретение также относится к семенам, покрытым или содержащим препарат для обработки семян, содержащий по меньшей мере один ALS-ингибитор, выбранный из группы, состоящей из амидосульфурона, азимсульфурона, бенсульфурона, хлоримурона, хлорсульфурона, циносульфурона, циклосульфамурона, этаметсульфурона, этоксисульфурона, флазасульфурона, флупирсульфурона, фо-рамсульфурона, галосульфурона, имазосульфурона, йодсульфурона, мезосульфурона, метсульфурона, никосульфурона, оксасульфурона, примисульфурона, просульфурона, пиразосульфурона, римсульфуро-на, сульфометурона, сульфосульфурона, тифенсульфурона, триасульфурона, трибенурона, трифтокси-сульфурона, трифлусульфурона, тритосульфурона, имазаметабенза, имазамокса, имазапика, имазапира, имазахина, имазетапира, клорансулама, диклосулама, флорасулама, флуметсулама, метосулама, пенок-ссулама, биспирибака, пириминобака, пропоксикарбазона, флукарбазона, пирибензоксима, пирифталида, пиритиобака.
Термин "семя" охватывает семена и участвующие в размножении части растений всех видов, включая без ограничения настоящие семена, кусочки семян, корневые отпрыски, клубнелуковицы, луковицы, плоды, клубни, зерно, черенки, отрезки и тому подобное, и в предпочтительном варианте термин означает настоящие семена.
Термин "покрытый и/или содержащий", в общем, означает, что активный ингредиент главным образом находится на поверхности продукта размножения во время применения, хотя большая или меньшая часть ингредиента может проникать в продукт размножения, в зависимости от способа применения. Когда указанный продукт размножения снова высевают, он может поглощать активный ингредиент.
Проведение обработки семян AHAS-ингибирующим гербицидом или препаратом, содержащим AHAS-ингибирующий гербицид, осуществляют опрыскиванием или опудриванием семян перед посевом растений и перед всходами растений.
При обработке семян соответствующие препараты применяют в виде обработки семян эффективным количеством AHAS-ингибирующего гербицида или препарата, содержащего AHAS-ингибирующий гербицид. В данном случае нормы внесения обычно составляют от 0,1 г до 10 кг активного ингредиента (или смеси активного ингредиента или препарата) на 100 кг семян, предпочтительно от 1 г до 5 кг на 100 кг семян, в частности, от 1 г до 2,5 кг на 100 кг семян. В случае конкретных сельскохозяйственных культур, таких как салат-латук, норма может быть выше.
Настоящее изобретение относится к способу борьбы с нежелательными растениями или борьбы с сорняками, включающему в себя осуществление контакта семян резистентных растений согласно настоящему изобретению перед посевом и/или после предварительного проращивания AHAS-ингибирующим гербицидом.
Способ дополнительно может включать в себя посев семян, например, в почву на поле или в среду
для горшечных культур в теплице. Способ имеет особое применение для борьбы с нежелательными растениями или борьбы с сорняками, находящимися в непосредственной близости с семенами.
Подразумевается, что борьба с нежелательными растениями означает уничтожение сорняков и/или иным образом замедление или ингибирование нормального роста сорняков. Подразумевают, что сорняки в широком смысле означают все растения, которые растут с тех местах, где они нежелательны.
Сорняки согласно настоящему изобретению включают, например, двудольные и однодольные сорняками. К двудольным сорнякам без ограничения относятся сорняки родов: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus и Taraxacum. К однодольным сорнякам без ограничения относятся сорняки родов: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus и Apera.
Кроме того, сорняки согласно настоящему изобретению могут включать, например, культурные растения, которые растут в нежелательном месте. Например, самосевное растение кукурузы, которое находится на поле, на котором преимущественно растут растения сои, можно считать сорняком, если растение кукурузу нежелательно на поле с растениями сои.
Упоминание слов в единственном числе используют в настоящем описании по отношению к одному или больше чем одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту в описании. В качестве примера, "элемент" означает один или несколько элементов.
В используемом в настоящем описании смысле слово "содержащие" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий" следует понимать как означающее включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Следующие примеры предлагаются в целях иллюстрации, но не в целях ограничения.
Пример 1. Анализ фермента AHAS in vitro Анализ фермента AHAS представляет собой быстрый колориметрический способ, который используют для количественной оценки уровней устойчивости разных образцов посредством измерения уровня активности фермента AHAS в присутствии ингибиторов AHAS, как описано в Singh et al. (Anal. Biochem. 171: 173-179, 1988). Применяют два типа тестов: основной тест с использованием только одного ингибитора и усиленный тест, который требует использования двух ингибиторов. Оба теста показывают уровни устойчивости к имидазолинону, при этом усиленный тест дает возможность точно определять незначительные различия в уровнях устойчивости между некоторыми линиями растений. Исходный раствор для анализа AHAS содержит: 0,2 М однозамещенный фосфат натрия+0,2 М двузамещенный фосфат натрия+50 мМ 1,1-циклопропандикарбоновую кислоту (СРСА)+полный состав основных солей Мурасиге и Скуга+1 мМ имазамокс (АС 299263 технической чистоты)+5% H2SO4+2 M NaOH+2,5% а-нафтол+0,25% креатин в 1 М фосфатном буфере, рН 6,0.
Конечные растворы для анализа AHAS представляют собой три типа растворов: Раствор А содержит: 10 мМ фосфатный буфер+10% среда М & S+500 мкМ СРСА+0,5% L-аланин+50 мМ пируват. Раствор В содержит: раствор А+2,5 мкМ имазамокс. Раствор С содержит: раствор В+0,2 мкМ хлорсульфу-рон.
Основной тест AHAS: Ингибитор имазамокс
Тест проводили в 96-луночных планшетах. Каждый 96-луночный планшет находился в камере на 19-21 образцов, включая контроли. Каждая лунка содержала 100 мкл AHAS-буфера, который описан ниже. В вытяжном шкафу с ламинарным потоком стерильный AHAS-буфер асептически переносили в две лунки для растворов, промаркированных А и В. В лунку "В" добавляли имазамокс из исходного раствора, который имел концентрацию 2,5 мкМ. 100 мкл раствора А переносили во все нечетные ряды на каждом планшете, и 100 мкл раствора В переносили во все четные ряды.
Фаза 1. Отбор образцов
Четыре диска вырезали с нижней части наименьшей листовой пластинки десятидневных саженцев, используя сверло для пробок. Образцы растений брали перед стадией стрелкования, так как после указанной стадии роста активируется другой ген AHAS, следовательно, потенциально возможно получение ложных результатов. После вырезания диски переносили в лунки планшета для микротитрования, содержащие растворы А и В.
После заполнения всего планшета для микротитрования его инкубировали при люминесцентном освещении и комнатной температуре в течение 14-18 ч. Для остановки инкубации после указанного периода времени планшеты замораживали в морозильной камере при -80°С.
Фаза 2. Реакция
AHAS-планшеты вынимали из морозильной камеры с температурой -80°С и размораживали при комнатной температуре или при 60°С в инкубаторе. В каждую лунку добавляли двадцать пять микролитров 5% H2SO4. Планшеты после подкисления инкубировали при 60°С до тех пор, пока все диски не становились коричневыми, примерно в течение 15 мин. В течение этого периода времени готовили раствор
нафтола и затем в каждую лунку добавляли 150 мкл раствора а-нафтола/креатина. Каждый планшет инкубировали при 60°С в течение 15 мин. После инкубации визуально сравнивали различия в активности AHAS между образцами, обработанными имидазолиноном, и образцами, не обработанными имидазоли-ноном. Интенсивность "красной" окраски в результате проявления активности AHAS измеряли, используя считывающее устройство для планшетов для микротитрования, получая количественное значение для образцов, обработанных и не обработанных имидазолиноном.
Оптическую плотность в каждой лунке регистрировали при 530 нм. При таких параметрах получали значение, которое отображает интенсивность красного. Полученную интенсивность красного переводили в количественное значение активности AHAS в каждой лунке. Когда активность AHAS в лунке, содержащей данный образец с добавлением имазамокса, делили на активность AHAS в контроле, то получали отношение в виде "активности AHAS в процентах от контроля".
Усиленный тест AHAS: Ингибиторы имазамокс и хлорсульфурон
Введение хлорсульфурона, SU, в тесте AHAS основано на свойстве устойчивости генов РМ1 и bR. PM1 и bR не устойчивы к SU, тогда как РМ2 проявляет определенную устойчивость ко SU. Отношение, полученное при делении активности SU на активность имазамокса дает уникальное значение для всех четырех уровней устойчивости (РМ1/РМ2, РМ2, РМ1, WT).
Результаты показаны на фиг. 3 для bR, PM2 и bR/PM2 у В. juncea при ингибировании имазамоксом и хлорсульфуроном.
Активность фермента AHAS для разных сочетаний мутаций у В. juncea в присутствии имазамокса Активность фермента AHAS в белковых экстрактах гомозиготных дигаплоидных (DH) линий В. juncea, содержащих разные сочетания мутаций (aR х bR, РМ2 х А107Т, PM2 х bR, A104T х bR) измеряли в виде процента активности от активности в необработанном (0 мкМ имазамокса) образце. В качестве контроля также были включены белковые экстракты из трех линий В. napus: В. napus PM1, В. napus PM2 и В. napus PM1/PM2. Результаты для указанных мутантных сочетаний и проверки при концентрации имазамокса 100 мкМ показаны на фиг. 6.
Пример 2. Тестирование устойчивости к гербицидам в теплице
Проведение первого эксперимента планировалось для определения того, имеются ли различи в устойчивости к гербициду имидазолинону между линиями В. juncea, содержащими один ген (bR или РМ2) и два гена (bR/PM2), и линией В. napus, содержащей два гена (РМ1/РМ2).
Шесть отдельных растений из каждой линии подвергали обработке опрыскиванием. Имидазолино-новый гербицид Odyssey(r) наносили в дозе 1х (17 г активного ингредиента/акр (0,4 га)), 2х (34 г активного ингредиента/акр (0,4 га)) и 3х (51 г активного ингредиента/акр (0,4 га)) на стадии 2-3 листьев. Растения опрыскивали на стадии 2-3 листьев примерно через 14 дней после посадки. Давление в камере для опрыскивания устанавливали при 40 фунтах на кв. дюйм (0,279 МПа) и скорость устанавливали на значении "80" (34,98 л/акр (0,4 га)). Для получения 25 мл исходного раствора Odyssey(r) проводили следующий расчет: 17х0,025/34,98=0,1215 г гранул Odyssey(r). Расчет был основан на следующих допущениях: количество Odyssey(r), необходимого на акр (0,4 га) составляло 17 г; и 8,33 мл раствора подается за каждый проход из камеры для опрыскивания. Merge(r) добавляли в соотношении 0,5 л/100 л или 0,000125 л или 125 мкл. После опрыскивания растения случайным образом распределяли на поддонах. Растения оценивали по визуальному повреждению (через 7-10 дней после опрыскивания) согласно следующему рейтингу:
1) растения, у которых не наблюдается никакого повреждения;
2) растения, у которых наблюдается обесцвечивание листьев или небольшое скручивание листьев;
3) растения, у которых наблюдается сильное обесцвечивание листьев (например, листья становятся желтыми или багровыми), а также наблюдается некоторое базальное ветвление;
4) растения, у которых наблюдается сильное повреждение, приводящее к гибели или тяжелой задержке развития Рост растения и биомассу (массу растения) измеряли после появления повреждения. Проводили сравнения между растениями после обработки опрыскиванием и контролями для каждого сорта. Результаты показаны в табл. 1.
1)
Проведение второго эксперимента планировалось для сравнения разных мутаций, bR, bR/PM2, PM2, aR, A104T и А107Т у В. juncea при обработке разными дозами имазамокса в теплице. Образцы, используемые для тестирования опрыскивания имазамоксом (второй эксперимент в теплице), показаны в табл. 2 ниже.
Двенадцать отдельных растений каждой линии подвергали обработке на определенном уровне, как пока-
зано в табл. 3. Проводили 7 обработок имазамоксом (Raptor(r))+0,5% об./об Merge(r). Растения обрабаты-
вали на стадии 1-2 настоящих листьев. Результаты показаны на фиг. 4.
Таблица 3. Уровни обработки
Обработка
Имазамокс (г активного ингредиента/га)
100
В другом эксперимента в теплице получали линии DH В. juncea в результате скрещивания между линиями В. juncea, которые содержал мутацию AHAS в геноме A (aR, А104Т или РМ2), и линиями В. juncea, которые содержали мутацию AHAS в геноме В (bR, A107T). Линии DH, которые, как было подтверждено, были гомозиготными по мутациям как в геноме А, так и в геноме В (например, aR/bR или A104T/bR и т.д.), отбирали для последующего тестирования устойчивости к гербициду в теплице с использованием 0, 35, 70 и 100 г активного ингредиента/га имазамокса (Raptor(r)+0,75% Merge(r)). Фиток-сичность оценивали по шкале от 0 до 9, где значение 0 эквивалентно отсутствию повреждения культуры,
а 9 эквивалентно наличию тяжелого некроза растения, приводящего к гибели растения. Результаты в виде графиков фитотоксичности показаны на фиг. 8.
В случае таких сочетаний, при которых не идентифицировали дважды гомозиготной линии DH (как в случае сочетания мутаций aR/A107T), в теплице высевали сегрегирующую популяцию F2. Каждую особь F2 подвергали секвенированию, чтобы определить природу мутации и зиготность, и затем опрыскивали 35 г активного ингредиента/га имазамокса, чтобы определить соответствующий фенотип повреждения. Результаты определения взаимосвязи между генотипом и фенотипом повреждения культуры в случае мутаций aR и А107Т показаны на фиг. 7.
Пример 3. Тестирование устойчивости к гербицидам на поле
Четыре объекта В. juncea и один объект В. napus тестировали в испытаниях на основе плана с рандомизированными расщепленными блоками (4 повтора) в четырех местах в Северной Дакоте в отношении устойчивости к гербицидам (различные обработки смотрите в табл. 4) и урожайности. Делянки имели размер минимум 1,5 х 5 м, и на отдельных делянках проводили валкование и при созревании собирали урожай. Из четырех объектов исследования В. juncea один объект представлял собой линию РМ1/РМ2 В. juncea, которую получали в результате интрогрессии обеих мутаций РМ1 и РМ2 из Brassica napus в Brassica juncea с использованием обычной методики возвратного скрещивания с последующим самоопылением на протяжении двух поколений, чтобы получить гомозиготную линию В. juncea PM1/PM2. Другие три объекта В. juncea имели разные генотипы В. juncea, содержащие мутацию bR в геноме В вместе с мутацией РМ2. все линии bR/PM2 В. juncea были гомозиготными по обеим мутациям. Объект В. napus представлял собой коммерческий контрольный сорт CLEARFIELD(r), гомозиготный по мутациям РМ1/РМ2. Оценку повреждения культур (% фитотоксичности) проводили через 5-7 дней после обработки (DAT) и через 18-24 DAT. Средняя фитотоксичность в процентах для одного из четырех местоположений представлена в табл. 5.
Таблица 4
Обработки:
1. Необработанные
2. 1х норма внесения следующих
гербицидных продуктов для канолы
Clearfield(r):
30 г активного ингредиента/га Odyssey(r)+0,5% {об./об.) Merge(r)
Объем опрыскивания:
100 литров/га
Стадия роста:
2-4 листа
CLEARFIELD(r) и уникальное название CLEARFIELD являются зарегистрированными торговыми марками BASF
Таблица 5. Средняя фитотоксичность в процентах и средняя урожайность объектов исследования В.
juncea PM1/PM2 и В. juncea bR/PM2 после 1х обработки гербицидом Odyssey
в одном местоположении в Велва, Северная Дакота
Объект исследования
Обработка
Средняя фнтотоксичность в % через 5-7 дней после обработки
Средняя фитотоксичность в % через i 8-24 дня после обработки
Средняя урожайность кг/та
В. juncea РМ1/РМ2
Необработанные
0,00
0,00
896
В. napus РМ1/РМ2
Необработанные
0,00
0,00
1119
B.junceabR/PM2(S006)
Необработанные
0,00
0,00
1217
B.junceabR/PM2(S007)
Необработанные
0,00
0,00
1382
В. juncea bR/PM2(S008)
Необработанные
0,00
0,00
1343
В. juncea PM1/PM2
1 * Odyssey
48,75
50,00
351
В. napus PM1/PM2
1 * Odyssey
13,75
3,75
910
B.junceabR/PM2(S006)
1 * Odyssey
3,75
1,25
1231
B.junceabR/PM2(S007)
1 * Odyssey
6,25
1,25
1334
B.junceabR/PM2(S008)
1 * Odyssey
5,00
2,50
1527
5,01
3,40
254
LCD (Р=0,05)
13,96
Результаты в табл. 5 показывают, что мутации РМ1/РМ2, интрогрессированные в В. juncea, не обеспечивают устойчивости, достаточной для коммерческого применения. Значение фитотоксичности после обработки гербицидом (Odyssey(r)) для линии РМ1/РМ2 В. juncea было в диапазоне от 25 до 50% во всех тестированных местоположениях (Velva, Mohall, Fargo, Hettinger), тогда как урожайность обработанного Odyssey(r) объекта РМ1/РМ2 В. juncea была снижена в среднем на 50% по сравнению с не опрыскиваемым объектом РМ1/РМ2 В. juncea. В случае объектов bR/PM2 B. juncea (S006, S007, S008) не показана фитотоксичность при обработке 1 х Odyssey(r) во всех тестированных местоположениях и не показано какое-либо существенное снижение урожайности. В случае объектов bR/PM2 B. juncea также показана более низкие значения фитотоксичности, чем для объекта РМ1/РМ2 В. napus во всех местоположениях.
Подобным образом двадцать восемь разных объектов (генотипов) В. juncea, содержащих сочетан
ную мутацию bR/PM2, вместе только с одним объектом В. juncea PM2 (J03Z-16413) и одним коммерческим контрольным сортом CLEARFIELD(r) В. napus, содержащим сочетанные мутации РМ1/РМ2, тестировали на поле в трех местоположениях, использовали план с рандомизированными целостными блоками (1 обработка) с 2 повторами, при этом средний размер делянки составлял 1,5 х 5 м. Использовали региональные нормы высева канолы, и нормы высева на отдельных делянках корректировали для достижения одинаковой плотности посева в каждом местоположении на основании массы 1000 семян каждого объекта. В данном испытании гербицид применяли по отношению ко всем объектам, как показано в таблице ниже.
CLEARFIELD(r) и уникальное название CLEARFIELD являются зарегистрированными торговыми марками BASF
Таблица 7. Агрономическая оценка
Урожайность в килограммах на гектар, кг/га преобразованная из данных в граммах/делянку с использованием площади сбора урожая - 7% расчетная влажность
" Относительная урожайность по сравнению со % от контролем . " средним значением для 4 контролен
кг/га
Урожайность в килограммах на гектар, преобразованная из данных в граммах/делянку с использованием площади сбора урожая - 7% расчетная влажность
Агрономическая
Агрономическая оценка по шкале от 0 до Э, 0 означает очень плохо, 9 означает очень хорошо
Повреждение
Визуальная оценка повреждения в % на ранней стадии - 7-10 дней после опрыскивания Beyond(r)
Дни цветения
Дни от посева до первого цветка
Продолжительно сть цветения
Дни от первого цветка до конца цветения
Созревание
Дни от посева до созревания
Высота
Высота при созревании в см
Полегание
Оценка полегания по шкале от 1 до 5, 1 означает отсутствие полегания, 5 означает значительное полегание
J05Z-078I4
bR/PM2
B. juncea
6,1
8,7
42,0
18,2
87,7
137,0
1,7
3758,0
110,4
J05Z-07830
ЬМ> М2
B. juncea
6,5
2,8
44,8
18,2
90,6
143,7
1,1
3642,5
107,0
J05Z-07848
bR/PM2
B. juncea
5,7
7.3
43,0
18,8
88,3
133.7
1,4
3570,0
104,9
J05Z-07937
WVPM2
B. juncea
6,2
5,0
43,2
17,2
89,7
132,7
1,6
3570,6
104,9
J05Z-07952
bR/PM2
B. juncea
6,8
4,7
44,6
16,9
91,8
136,3
1,4
3545,1
104,2
J05Z-07957
bR/PM2
B. juncea
5.9
2,0
44,4
18,3
89,9
139,6
1,2
3839,5
112,8
J05Z-07975
bR/PM2
B. juncea
5,3
3.0
41,8
16,9
89,9
128.6
2,0
3642,1
107,0
J05Z-07984
bR/PM2
B. juncea
5,4
9.5
43,9
17,8
90,2
130,1
1,5
3637,3
106,9
J05Z-07989
bR/PM2
B. juncea
7.3
2.3
44,3
18,0
89.9
134,0
1.2
3989,5
117,2
J05Z-07994
bRVPM2
B. juncea
6,7
6,0
43,2
18,6
89,3 88,8
129,7
1,4
3710,6
109,0
J05Z-08018
bR/PM2
B. juncea
7,1
1,7
43,3
18,6
129,2
1,4
3977,1
116,9
J05Z-08029
bR/PM2
B. juncea
6,5
2,0
45,0
18,3
92,2
143,1
1,1
3469,5
102,0
J05Z-08045
bR/PM2
B. juncea
5,9
2.3
43,0
18.2
92,1
131,2
1,5
3304,2
97,1
J05Z-08I22
bR/PM2
B. juncea
6,8
2,3
43,4
16,0
87,9
131,6
1,2
3760,7
110,5
J05Z-08131
bR/PM2
B. juncea
5.2
4,7
42.3
15,5
88,1
129,7
2,0
3411,9
100,3
J05Z-O8I33
bR/PM2
B, juncea
7.2
6,0
42,3
17,2
91,4
134,9
1,1
3947,6
116,0
J05Z-08I59
MVPM2
B. juncea
6,8
4.7
43,2
17,6
88,4
135,1
1,3
3959,5
116,4
J05Z-08I90
bR/PM2
B. juncea
7,1
4,3
43,5
16,1
88,6
123,3
1,2
3883,3
114,1
Средняя генеральная
6,0
4,7
44,1
17,5
90,2
136,2
1,4
3650,7
12,5
58,7
0.8
5,6
2,3
3,0
23.0
8,1
LSD
1,3
3,7
0,6
1,7
2,8
6.9
0,6
401,9
Два дополнительные разных объекта В. juncea (генотипы), содержащих сочетанные мутации bR/PM2, и один коммерческий контроль CLEARFIELD(r) B. napus, содержащий сочетанные мутации РМ1/РМ2, подвергали полевому испытанию в нескольких местоположениях на протяжении двух следующих друг за другом лет. Использовали региональные нормы высева канолы, и нормы высева на отдельных делянках корректировали для достижения одинаковой плотности посева в каждом местоположении на основании массы 1000 семян каждого объекта. В данном испытании гербицид (Beyond(r)) применяли по отношению ко всем объектам, как показано в табл. 9 ниже.
Таблица 9
Повреждение
Цветение
Созревание
Высота
Урожайность
Местоположение
Сорт
Норма внесения
7-10 день
14-21 день
(дни)
(дни)
(см)
(кг/га)
Yearl
Watrous
B, napus контроль
РМ1/РМ2
0,0
0,0
89,8
134,5
3867,1
Watrous
В, napus контроль
РМ1/РМ2
8,3
0.0
46,3
87,8
132,5
4463,8*
Watrous
В,napus контроль
РМ1/РМ2
12,5
Watrous
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
44.8
94,8
158,8
4661,7
Watrous
J05Z-G8376
bR/PM2
0,0
0,0
156,8
4807,8
Watrous
J05Z-OS376
bR/PM2
3,0
Watrous
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
43,8
94,3
151,3
4571,6
Watrous
J05Z-07784
bR/PM2
0,5
0,0
44,3
95,3
157,5
4870,7
Watrous
J05Z-07784
bR/PM2
2,0
CV (%)
7,4
LSD (0,05)
1,6
1,4
0,64
3,12
10,1
450,6
Avonlea
В. napus контроль
PM1/PM2
0,0
0,0
50,5
90,8
Н7.8
2940,7
Avonlea
В. napus контроль
PM1/PM2
2,5
0,0
50,5
90,5
115,8
3150,7
Avonlea
В. napus контроль
PM1/PM2
7,0
Avonlea
J05Z-G8376
bR7PM2
0,0
0,0
48,5
89,3
138,8
3295,4
Avonlea
J05Z-08376
bR/PM2
1,5
0,5
48,3
90,3*
140,8
3608,4*
Avonlea
J05Z-08376
bR/PM2
1,0
Avonlea
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
46,5
88,8
131,3
3532,7
Avonlea
J05Z-07784
bR/PM2
2,0
0,0
46,5
89,5
138,8*
3438,5
Avonlea
J05Z-07784
bR/PM2
1,0
CV (%)
6,6
LSD (0,05)
2,7
1,8
0,76
0,85
6,9
309,7
Hanley
B. napus контроль
PM1/PM2
0,0
0,0
49,8
92,8
124,5
2473,6
Hanley
В.napus контроль
PM1/PM2
15,0
9.3
49,3
92,0
123,8
3057,4*
Hanley
В. napus контроль
PM1/PM2
20,0
Hanley
J05Z-08376
bPv/PM2
0,0
0,0
48,8
86,0
147,3
2915,1
Hanley
J05Z-08376
bR/PM2
lx-
2,8
11,0
48,0
84,3
146,3
3316,9*
Hanley
J05Z-08376
bR/PM2
2,0
Hanley
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0.0
48,3
87,8
142,3
3356,3
Hanley
J05Z-07784
bR/PM2
2,8
2.0
47,0
87,3
141,8
3702,7*
Hanley
J05Z-07784
bR/PM2
3,5
CV (%)
6,3
LSD (0,05)
4,7
3,6
3,2
2,52
7,4
277
Craik
В. napus контроль
PMI/PM2
0,0
0,0
49,0
86,0
116,5
3394.6
Craik
В. napus контроль
PMI/PM2
2,0
0.0
49,0
86,0
110,5
3213,5
Craik
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
47,0
87,8
132,0
3137,4
Craik
J05Z-08376
bR/PM2
0,8
0,3
46,5
85,0
121,8*
2904,6
Craik
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
46,0
88,8
132,8
3633,9
Craik
J05Z-07784
bR/PM2
3,5
0,0
46,3
87,0
130,0
3626,0
CV (%)
8,3
LSD (0,05)
5,0
2,1
1,0
3,8
7,4
365,5
Trochu
В. napus контроль
PMI/PM2
0,0
0,0
49,8
102,0
132,5
4791,1
Trochu
В. napus контроль
PM1/PM2
0,5
4,3
49,8
102,0
136,3
4831,1
Trochu
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
47,8
103,3
148,8
6021,3
Trochu
J05Z-08376
bR/PM2
1,0
0,5
47,8
101,3*
150,0
5954,2
Trochu
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
47,0
103,5
148,8
6413,1
Trochu
J05Z-07784
bR/PM2
3,0
0,5
45,8*
103,5
153,0
5954,2
CV (%)
8,3
LSD (0,05)
13,1
14,5
0,9
1,9
10,7
627,9
Year 2
Watrous
B. napus контроль
PM1/PM2
0,0
0.0
36,8
87,8
122,0
3886,1
Watrous
В. napus контроль
PMI/PM2
0,0
1,0
37,0
85,5
129,3
3506,9
Watrous
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
35,8
81,8
130,3
3525,9
Watrous
J05Z-08376
bR/PM2
2,5
0,0
35,8
82,8
136,8
3615,5
Watrous
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
35,3
86,0
131,3
3952,8
Watrous
J05Z-07784
bR/PM2
2,0
35,8
84,5
127,8
3818,0
Watrous
PM2
PM2
0,0
0,0
39,8
> 90
118,0
3987,0
Watrous
PM2
PM2
22,5
25,0
44,3*
> 90
103,5*
2984,9*
CV (%)
11,7
LSD (0,05)
5,7
5,8
0,9
2,9
6,6
584,4
Craik
B. napus контроль
РМ1Л> М2
0,0
0,0
49,5
84,3
114,5
2165,0
Craik
В. napus контроль
PMI/PM2
2,5
0,3
49,3
84,5
115,0
2171,3
Craik
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
47,5
87,8
139,0
2372,6
Craik
J05Z-08376
bR/PM2
1,0
0,0
48,0
90,0
140,3
3080,5*
Craik
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
47,8
88,5
136,8
2194,3
Craik
J05Z-07784
bR/PM2
1,5
0,3
47,5
88,3
133,3
3085,5*
Craik
PM2
PM2
0,0
0,0
52,0
91,0
115,0
1874,2
Craik
PM2
PM2
4,5
3,3
55.8*
90,3
108,0
1980,8
CV (%)
9,9
LSD (0,05)
1,8
1,0
1,1
2,4
7,9
330,1
Eyebrow
B. napus контроль
PM1/PM2
0,0
0,0
41,5
74,3
121,3
1687,1
Eyebrow
В. napus контроль
PM1/PM2
1,5
0,0
42,0
72,8
114,8
1477,1
Eyebrow
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
38,8
73,5
147,8
2034,1
Eyebrow
J05Z-08376
bR/PM2
2,8
1,0
38,0
71,8
133,8*
2131,2
Eyebrow
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
39,0
72,3
134,8
1909,5
Eyebrow
J05Z-07784
bR/PM2
3,3
1,8
39,3
74,8
124,8*
1903.7
Eyebrow
PM2
PM2
0,0
0,0
44,0
78,7
113,5
1434,4
Eyebrow
PM2
PM2
1,9
2,8
49,5*
82,3*
97,0*
742,4*
CV (%)
9,7
LSD (0,05)
1,5
1,1
1,0
2,9
7,8
277,7
Vulcan
B. napus контроль
PM1/PM2
0,0
0,0
88,0
103,8
3527,5
Vulcan
В. napus контроль
PM1/PM2
1,0
0,5
88,0
101,9
3202,4
Vulcan
J052-08376
bR/PM2
0,0
0,0
89,8
123,8
4177,0
Vulcan
J05Z-08376
bR/PM2
6,3
2,8
85,0
118,8
3807,9
Vulcan
J052-07784
D-R/PM2
0,0
0,0
89,8
115,0
2995,2
Vulcan
J05Z-07784
bR/PM2
13,8
11,3
88,5
108,8
2672,5
Vulcan
PM2
PM2
0,0
0,0
88,0
108,8
2566,2
Vulcan
PM2
PM2
42,5
26,3
91,5
100,6
2357,2
CV (%)
13,3
LSD (0,05)
12,0
9,6
5,2
16,4
619,6
Orkney
B. napus контроль
PM1/PM2
0,0
0,0
46,3
88,8
87,5
1407,3
Orkney
В. napus контроль
PM1/PM2
3,0
0,5
47,5
90,0
77,8*
1398,0
Orkney
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
46,8
88,5
89,0
2028,8
Orkney
J05Z-08376
bR/PM2
9,3
5,0
47,3
92,0*
93,3
2000,8
Orkney
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
47,3
91,3
91,3
2002,3
Orkney
J05Z-07784
bR/PM2
13,8
6:8
48,3
91,5
93,3
2062,8
Orkney
PM2
PM2
0,0
0,0
49,0
90,3
80,3
1315,1
Orkney
PM2
PM2
10,0
11,3
51,5*
99,5*
73,5
316,4*
CV (%)
10,5
LSD (0,05)
29,2
12,7
2,2
3,5
9,0
256,4
Hanley
B. napus контроль
PM1/PM2
0,0
0,0
85,3
133,0
1084,6
Hanley
В. napus контроль
PM1/PM2
16,5
14,8
89,5*
117,5*
1287,3
Hanley
J05Z-08376
bR/PM2
0,0
0,0
90,3
144,0
1808,8
Hanley
J05Z-08376
bR/PM2
41,5
21,5
88,5
143,0
1866,3
Hanley
J05Z-07784
bR/PM2
0,0
0,0
90,8
134,0
1909,0
Hanley
J05Z-07784
bR/PM2
24,3
14,3
91,0
129,3
1761,1
Hanley
PM2
PM2
0,0
0,0
94,0
122,3
1249,6
Hanley
PM2
PM2
26,5
74,5
99,5*
92,5*
746,2*
CV (%)
16,0
LSD (0,05)
21,3
14,9
4,2
7,4
404,7
Данные о фитотоксичности в полевых условиях также получали для 3 разных линий, содержащих обе мутации bR и РМ2 (гомозиготных по bR/PM2), и сравнивали с фитотоксичностью в полевых условиях для коммерческой линии В. napus, содержащей обе мутации РМ1 и РМ2 (гомозиготной по РМ1/РМ2). Указанные линии опрыскивали 1х BEYOND(r) (35 г активного ингредиента/га имазамокса) и оценивали в отношении фитотоксичности через 7-10 дней после обработки (DAT). Линию В. juncea дикого типа (т.е. не имеющую мутаций AHAS) также опрыскивали 1х BEYOND(r) в качестве контроля. Результаты представлены в табл. 10 ниже.
Таблица 10
Полевой сезон 1 рода - агрономические характеристики в. juncea, опрыскиваемых 1* Beyond(r)
Фитотоксичность в % на 7-10 день после обработки
В. napus РМ1/РМ2
5,7
В. juncea bR/PM2 S 002
1,2
В. juncea bR/PM2 S 003
2,4
В. juncea bR/PM2 S 006
2,8
Сходную группу экспериментов проводили на четырех дополнительных линии В. juncea со средним содержанием олеиновой кислоты, которые содержали обе мутации bR и РМ2 (гомозиготные по bR/PM2), опрыскиваемых 2х BEYOND(r). Результаты представлены в табл. 11 ниже.
Таблица 11
Полевой сезон 1 года - агрономические характеристики линий В, juncea, опрыскиваемых 2* Beyond(r)
Фитотоксичность в % на 7-10 день после обработки
В, napus РМ1/РМ2
13,2
Б. juncea
bR/PM2
J05Z-5105
4,2
В. juncea
bR/PM2
J05Z-7146
1,3
В. juncea
bR/PM2
J05Z07154
2,2
6. juncea
bR/PM2
J05Z07160
2,3
Чтобы исследовать влияние сочетания мутаций bR и РМ2 вместе по сравнению с соответствующими отдельными мутациями проводили полевые испытания устойчивости к гербицидам на объектах В. juncea, содержащих либо мутацию РМ2 отдельно, либо мутацию bR отдельно, или объекты, содержащие обе мутации bR и РМ2. Все мутации были гомозиготными у всех объектов. Использовали план с рандомизированными полными блоками (4 обработки), состоящий из 3 повторов, со средним размером делянок 1,5 х 5 м. Использовали региональные нормы высева канолы, и нормы высева на отдельных делянках корректировали для достижения одинаковой плотности посева в каждом местоположении на основании массы 1000 семян каждого объекта. В данном испытании гербицид (Beyond(r), 1х доза составляла 35 г активного ингредиента/га) применяли по отношению ко всем объектам как показано в табл. 10 ниже. Линии В. juncea, имеющие одиночные или комбинированные признаки, обрабатывали гербицидом на уровне 0х, 1х, 2х или 4х, и оценивали на 10, 12, 14 или 28 день после обработки (DAT). Два разных человека оценивали фитотоксичность на 10, 12, 14 и/или 28 день после обработки соответствующими количествами гербицида (как показано в табл. 12: исследователь 1 по сравнению с исследователем 2). Результаты представлены в табл. 12 ниже.
Таблица 12
Средняя фютоФОксичность в процентах (3 повтора)
Исследователь
Исследователь
Исследователь
Исследователь
Объект и доза гербицида
10 DAT
12 DAT
14 DAT
2 8 DAT
bR/PM2 0*
0, 0
0, 0
0,0
0, 0
bR/PM2 1*
4,0
7, 5
2,3
0,7
bR/PM2 2*
11, 7
10,8
10, 0
3,0
bR/PM2 4*
25, 0
21,7
28, 3
15, 0
PM2 0"
0,0
0, 0
0, 0
0,7
PM2 lx
11,7
17,5
6, 7
5,7
PM2 2*
35,0
28,3
35,0
33, 3
PM2 4x
53, 3
36, 7
56, 7
65, 0
bR Ox
0, 0
0, 0
0,0
0, 0
bR lx
98, 7
81,7
99, 3
99, 0
bR 2*
100, 0
85,0
99, 7
99, 3
bR 4x
100,0
93,3
100, 0
73,3
16, 4
9, 5
19,0
48, 3
LSD
10,2
5, 1
11, 8
26, 9
Чтобы более четко продемонстрировать, что устойчивость линии с сочетанными мутациями bR/PM2 выше, чем сумма устойчивости отдельных мутантных линий (повреждение культур или фито-токсичность показана в табл. 12), фактически полученную устойчивость к гербициду в процентах для сочетания bR/PM2 сравнивали с суммой устойчивости к гербицидам в процентах линии с отдельной му
тацией bR и линии с отдельной мутацией РМ2 (предполагаемая устойчивость к гербициду) (табл. 13). При уровнях гербицида, которые ограничивают или подавляют отдельные мутации (наиболее заметно при 2х- и 4х-дозах), уровни устойчивости к гербицидам, наблюдаемые для линии с сочетанными мутациями bR/PM2, превышают устойчивость к гербициду, получаемую при сложении двух отдельных значений устойчивости bR+PM2 вместе. В линии с сочетанными мутациями bR/PM2 наблюдается синерге-тический уровень устойчивости к гербициду, а не аддитивный уровень. Такой повышенный (синергети-ческий) уровень устойчивости к имидазолинону наблюдали у более чем 30 разных генотипов В. juncea, содержащих сочетанные мутации bR/PM2.
Таблица 13
Устойчивость к имидазолинону в процентах
Описание объекта
10 DAT
12 DAT
14 DAT
28 DAT
bR/PM2 О"
100, 0
100,0
100, 0
100,0
bR/PM2 lx
96, 0
92, 5
97, 7
99, 3
bR/PM2 2*
88, 3
89, 2
90, 0
97,0
bR/PM2 4*
75, 0
78,3
71,7
85,0
РМ2 Ox
100, 0
100, 0
100, 0
99, 3
PM2 lx
88, 3
82,5
93, 3
94, 3
PM2 2*
65, 0
71,7
65, 0
66,7
PM2 4*
46,7
63, 3
43,3
35,0
bR Ox
100,0
100,0
100, 0
100, 0
bR lx
1,3
18,3
0, 7
1,0
bR 2x
0,0
15,0
0, 3
0,7
bR 4'
0,0
6,7
0, 0
26,7
Устойчивость к имидазолинону, предполагаемая на основании отдельных испытаний
PM2+bR lx
89, 6
100, 8
94,0
95, 3
PM2+bR 2*
65, 0
86, 7
65, 3
67, 4
PM2+bR 4х
46, 7
70, 0
43, 3
61, 7
В заключение, показано, что синергетический или повышенный уровень устойчивости линий В. juncea bR/PM2 больше, чем уровень устойчивости, наблюдаемый в линиях В. napus с сочетанными мутациями РМ1/РМ2, а также намного больше, чем устойчивость, наблюдаемая в линиях В. juncea с сочетан-ными мутациями РМ1/РМ2 (табл. 5). В линиях В. juncea bR/PM2 не обнаружено какого-либо снижения урожайности при обработке имидазолиноновыми гербицидами, тогда как в линии В. juncea PM1/PM2 обнаружено значительное снижение урожайности при обработке коммерческими дозами имидазолино-нового гербицида.
Все публикации и заявки на выдачу патента, упоминаемые в описании, являются показателем уровня специалистов в области, к которой относится изобретение. Все публикации и заявки на выдачу патентов включены в настоящее описание в виде ссылки в такой же степени, как в случае, когда специально и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или заявка на выдачу патента включена в виде ссылки.
Хотя раскрытое выше изобретение описано подробно в качестве иллюстрации и примера в целях для лучшего понимания, будет очевидно, что в объеме прилагаемой формулы изобретения на практике могут быть осуществлены некоторые изменения и модификации.
Список последовательностей
<160> 20
<170> Patentln Ver. 3.3
<210> 1 <211> 670 <212> Белок
<213> Arabidopsis thaliana <400> 1
Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser lie Ser Phe
Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser
20 25 30
Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser
35 40 45
Ser Arg Arg Arg Gly He Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser He Ser Ala
50 55 60
Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys
65 70 75 80
Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe He Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gin Pro
Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr Leu
210 2L5 220
Val Met Asp Val Glu Asp He Pro Arg Ik He Glu Glu Ala Phe Phe
225 230 235 240
Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys
245 250 255
Asp He Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Glu Gin Ala Met Arg
260 265 270
Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Met Pro Lys Pro Pro Glu Asp Ser His
275 280 285
Leu Glu Gin He Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu
290 295 300
Tyr Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg Phe
305 310 315 320
Val Glu Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Pro Cys Asp Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His
340 345 350
Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu
355 360 365
Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala
370 375 380
Phe Ala Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala Glu
385 390 355 400
lie Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys
405 410 415
Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu
420 425 430
Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gin Lys
435 440 445
Gin Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala He Pro Pro
450 455 460
Gin Tyr Ala lie Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala He
465 470 475 480
He Ser Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe Tyr
485 490 495
Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala
500 505 510
Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro
515 520 525
Asp Ala He Val Val Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe lie Met Asn
530 535 540
Val Gin Glu Leu Ala Thr He Arg Val Glu Gin Leu Pro Val Lys He
545 550 555 560
Leu Leu Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Val Met Gin Trp Glu Asp
565 570 575
Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Phe Leu Gly Asp Pro Ala
580 585 590
He Gin Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val He
625 630 635 640
<210> 2
<211> 655
<212> Белок
<213> Brassica juncea
<400> 2
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro He Ser Phe Thr Ala Lys Pro
Ser Ser Lys Ser Leu Leu Pro He Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu He Pro Gin Lys Pro Ser Ser Leu Arg His Ser Pro Leu Ser He
Ser Ala Val Leu Asn Thr Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu
Lys He Glu Lys Asn Lys Thr Phe He Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu
65 70 75 80
Pro Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly
35 90 95
He Thr Gly Gin Val Pro Arg Arg Met He Gly Thr Asp Ala Phe Gin
180 185 190
Glu Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr
195 200 205
Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro
225 230 235 240
Lys Asp He Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Asp Gin Pro Met
245 250 255
Gin Leu Gly Gin He Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val
275 280 285
Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gin Met Leu Gly Met
325 330 335
His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu
340 345 350
Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala
370 375 380
Lys Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu
4Q5 410 415
Pro Gin Tyr Ala He Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala
450 455 460
Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly
485 490 495
Pro Asp Ala He Val Val 515
Asp He
520
Thr He 535
Asp Gly Asp Arg Val Glu
Gly Ser
525
Phe He Met
Asp Arg Phe Tyr Lys Ala 565
Ala His Thr
570
Ala Lys Glu Asn Glu He
580
Thr Lys Lys ¦ Pro Gly Pro
Glu Glu 605
Leu Arg Asp Leu Asp Val
He Cys Pro His Gin Glu 625 630
i Asn Gly Gly 64 0
Thr Phe Lys Asp Val He ' 64 5
<210> 3
<211> 652
<212> Белок
<213> Brassica juncea
<400> 3
Met Ala Ala Ala Thr Ser
1 5
Ser Ser Lys Ser Pro Leu
Leu Thr Pro Gin Lys Pro 35
Ser Ala Val Leu Asn Ser 50
Lys He Lys Thr Phe He
65 70
Gly Ala Asp He Leu Val
Ser Ser Pro He Ser Leu Thr Ala Lys Pro 10 15
Pro He Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser 25 30
Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala He 40 45
Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp 55 60
Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
75 80
Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly Val Glu Thr
He Cys He Ala The Ser 145 150
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly 155 160
: Asp Ser Val Pro Leu Val Ala He Thr Gly 170 175
He Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Thr Pro 185 190
Phe Gly Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala
500 505 510
lie Val Val Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met Asn Val Gin
515 520 525
Glu Leu Ala Thr He Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys He Leu Leu
530 535 540
Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Val Met Gin Trp Glu Asp Arg Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu
565 5Ю 575
Asn Glu He Phe Pro Asn Met Leu Gin Phe Ala Gly Ala Cys Gly lie
580 585 590
Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala He Gin
595 600 605
Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val He Cys Pro
610 615 620
His Gin Glu His Val Leu Pro Met He Pro Asn Gly Gly Thr Phe Lys
625 630 635 640
Asp Val He Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr 64 5 650
<210> 4
<2H> 655
<212> белок
<213> Brassica juncea
<400> 4
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro He Ser Phe Thr Ala Lys Pro
Ser Ser Lys Ser Leu Leu Pro lie Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu lie Pro Gin Lys Pro Ser Ser Leu Arg His Ser Pro Leu Ser He
Ser Ala Val Leu Asn Thr Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu
Lys He Glu Lys Asn Lys Thr Phe He Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu
65 70 75 80
Pro Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly
Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Thr Ser Met Glu He His
100 105 110
Gin Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr He Arg Asn Val Leu Pro Arg His
115 120 125
Glu Gin Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly
130 135 140
Lys Pro Gly He Cys lie Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu
145 150 155 160
Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala
165 170 175
He Thr Gly Gin Val Pro Arg Arg Met He Gly Thr Asp Ala Phe Gin
180 185 190
Glu Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr
195 200 205
Leu Val Met Asp Val Asp Asp He Pro Arg He Val Gin Glu Ala Phe
210 215 220
Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro
225 230 235 240
Lys Asp He Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Asp Gin Pro Met
245 250 255
Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gin Pro Pro Glu Val Ser
260 265 270
Gin Leu Gly Gin He Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val
275 280 285
Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg
290 295 300
Phe Val Glu Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu
305 310 315 320
Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gin Met Leu Gly Met
325 330 335
His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu
340 345 350
Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu
355 360 365
Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala
370 375 380
Glu He Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val
385 390 395 400
Lys Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu
405 410 415
Glu Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gin
420 425 430
Lys Gin Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala He Pro
435 440 445
Pro Gin Tyr Ala He Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala
450 455 460
He He Ser Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe
465 470 475 480
Tyr Lys Туг Arg Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly
485 490 495
Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Ser Val Ala Asn
500 505 510
Pro Asp Ala He Val Val Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met
515 520 525
He Cys Pro His Gin Glu His Val Leu Pro Met He Pro Ser Gly Gly
625 630 635 640
<210> 5
<211> 652
<212> Белок
<213> Brassica juncea
<400> 5
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro He Ser Leu Thr Ala Lys Pro
Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu Thr Pro Gin Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala He
35 40 45
Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp
50 55 60
Lys He Lys Thr Phe He Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
65 70 75 80
Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly Val Glu Thr
Thr Arg Ser Ser Thr He Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gin Gly
115 120 125
Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
lie Cys He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala He Thr Gly
165 170 175
He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met
195 200 205
Asp Val Asp Asp lie Pro Arg He Val Gin Glu Ala Phe Phe Leu Ala
210 215 220
Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp He
225 230 235 240
Gin Gin Gin Leu Ala lie Pro Asn Trp Asp Gin Pro Met Arg Leu Pro
245 250 255
Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gin Pro Pro Glu Val Ser Gin Leu Gly
260 265 270
Gin He Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu
290 295 300
Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gin Met Leu Gly Met His Gly Thr
325 330 335
Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe
340 345 350
Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala
355 360 365
Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala Glu He Gly
370 375 380
Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala
335 390 395 400
Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys
405 410 415
Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gin Lys Gin Lys
420 425 430
Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala He Pro Pro Gin Tyr
435 440 445
Ala He Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Gin Gly Lys Ala He He Ser
450 455 460
Ala He Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Gin Gly Lys Ala He He Ser
450 455 460
Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe Tyr Lys Tyr
465 470 415 480
Arg Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly
485 490 495
Phe Gly Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala
500 505 510
lie Val Val Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met Asn Val Gin
515 520 525
Glu Leu Ala Thr He Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys He Leu Leu
530 535 540
Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Val Met Gin Leu Glu Asp Arg Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu
565 570 575
Asn Glu He Phe Pro Asn Met Leu Gin Phe Ala Gly Ala Cys Gly lie
580 585 590
Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala He Gin
595 600 605
Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val He Cys pro
610 615 620
His Gin Glu His Val Leu Pro Met He Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys
625 630 635 640
Asp Val He Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr 645 650
<210> 7
<211> 652
<212> Белок
<213> Brassica juncea
<400> 7
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro He Ser Leu Thr Ala Lys pro
Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu Thr Pro Gin Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala lie
35 40 45
Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp
50 55 60
Lys He Lys Thr Phe He Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
65 70 75 80
Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly Val Glu Thr
Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu He His Gin Ala Leu
100 105 110
Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
He Cys He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala lie Thr Gly
165 170 175
Gin Val Pro Arg Arg Met He Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Thr Pro
180 185 190
He val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met
195 200 205
Asp Val Asp Asp He Pro Arg He Val Gin Glu Ala phe Phe Leu Ala
210 215 220
Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp lie
225 230 235 240
Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Asp Gin Pro Met Arg Leu Pro
245 250 255
Gin lie Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu
290 295 300
Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gin Met Leu Gly Met His Gly Thr
325 330 335
Gly Val Arg phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala
355 360 365
Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala Glu He Gly
370 375 380
Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala
385 390 395 400
Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys
405 410 415
Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gin Lys Gin Lys
420 425 430
Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala He Pro Pro Gin Tyr
435 440 445
Ala He Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Gin Gly Lys Ala He He Ser
450 455 460
Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe Tyr Lys Tyr
465 470 475 480
Arg Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly
485 490 495
Phe Gly Leu Pro Ala Ala lie Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala
500 505 510
Asn Glu He Phe Pro Asn Met Leu Gin Phe Ala Gly Ala Cys Gly He
530 585 590
His Gin Glu His Val Leu Pro Met lie Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys
625 630 635 640
<210> 8
<211> 655
<2 12 > Белок
<213> Brassica juncea
<400> 8
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro He Ser Phe Thr Ala Lys Pro
Ser Ser Lys Ser Leu Leu Pro He Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu He Pro Gin Lys Pro Ser Ser Leu Arg His Ser Pro Leu Ser He
Ser Ala Val Leu Asn Thr Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu
Lys He Glu Lys Asn Lys Thr Phe He Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu
Pro Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly
Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu He His
100 105 110
Gin Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr He Arg Asn Val Leu Pro Arg His
115 120 125
Glu Gin Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly
130 135 140
Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala
165. 170 175
Glu Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr
195 200 205
Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Giy Pro Val Leu Val Asp Val Pro
225 230 235 240
Lys Asp He Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Asp Gin Pro Met
245 250 255
Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gin Pro Pro Glu Val Ser
260 265 270
Gin Leu Gly Gin He Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val
275 280 285
Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Asp Glu Leu Gly Arg
290 295 300
Phe Val Glu Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu
305 310 315 320
Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gin Met Leu Gly Met
325 330 335
His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu
340 345 350
Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu
355 360 365
Glu He Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val
385 390 395 400
Lys Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu
405 410 415
Glu Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gin
420 425 430
Lys Gin Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala He Pro
435 440 445
Pro Gin Tyr Ala He Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala
450 455 460
He He Ser Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe
465 470 475 480
Tyr Lys Tyr Arg Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly
485 490 495
Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala lie Gly Ala Ser Val Ala Asn
500 505 510
Pro Asp Ala He Val Val Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met
515 520 525
Asn Val Gin Glu Leu Ala Thr He Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys
530 535 540
Val Leu Leu Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Val Met Gin Trp Glu
545 550 555 560
Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pi о
565 570 575
Ala Lys Glu Asn Glu He Phe Pro Asn Met Leu Gin Phe Ala Gly Ala
580 585 590
Cys Gly He Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Asp
595 600 605
Ala He Gin Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val
610 615 620
He Cys Pro His Gin Glu His Val Leu Pro Met He Pro Ser Gly Gly
625 630 635 640
Thr Phe Lys Asp Val He Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr
645 650 655
<210> 9
<211> 652
<212> Белок
<213> Brassica napus
<400> 9
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro He Ser Leu Thr Ala Lys Pro
Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu Thr Pro Gin Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala lie
35 40 4b
Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp
Lys He Lys Thr Phe He Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
65 70 75 80
Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly Val Glu Thr
Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu He His Gin Ala Leu
100 105 110
Thr Arg Ser Ser Thr He Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gin Gly
115 120 125
Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
He Cys He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala He Thr Gly
165 170 175
Gin Val Pro Arg Arg Met lie Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu Thr Pro
180 185 190
He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Met
195 200 205
Asp Val Asp Asp lie Pro Arg He Val Gin Glu Ala Phe Phe Leu Ala
210 215 220
Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp He
225 230 235 240
Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Asp Gin pro Met Arg Leu Pro
245 250 255
Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gin Pro Pro Glu Val Ser Gin Leu Gly
260 265 270
Gin He Val Arg Leu He Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu
290 295 300
Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gin Met Leu Gly Met His Gly Thr
325 330 335
Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe
340 345 350
Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala
355 360 365
Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala Glu He Gly
370 375 380
Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala
385 390 395 400
Leu Gin Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys
405 410 415
Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gin Lys Gin Lys
420 425 430
Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala He Pro Pro Gin Tyr
435 440 445
Ala He Gin Val Leu Asp Glu Leu Thr Gin Gly Lys Ala He He Ser
450 455 460
Thr Gly Val Gly Gin His Gin Met Trp Ala Ala Gin Phe Tyr Lys Tyr
465 470 475 480
Arg Lys Pro Arg Gin Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly
485 490 495
Phe Gly Leu Pro Ala Ala He Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala
500 505 510
He Val Val Asp He Asp Gly Asp Gly Ser Phe He Met Asn Val Gin
515 520 525
Glu Leu Ala Thr He Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys He Leu Leu
530 535 540
Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met Val Met Gin Trp Glu Asp Arg Phe
545 550 555 560
Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu
565 570 575
Asn Glu He Phe Pro Asn Met Leu Gin Phe Ala Gly Ala Cys Gly lie
580 585 590
Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala lie Gin
595 600 605
Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val He Cys Pro
610 615 620
His Gin Glu His Val Leu Pro Met He Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys
625 630 635 640
Asp Val He Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr 645 650
<210> 10
<211> 655
<212> Белок
<213> Brassica napus
<400> 10
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro He Ser Leu Thr Ala Lys Pro
Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu Thr Pro Gin Lys Asp Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala He
Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu
50 55 60
Lys Thr Asp Lys Asn Lys Thr Phe Val Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu
65 70 75 80
Pro Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly
Val Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu He His
100 105 110
Gin Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr He Arg Asn Val Leu Pro Arg His
115 120 125
Glu Gin Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly
130 135 140
Lys Pro Gly He Cys He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu
145 150 155 160
Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala
165 170 175
Glu Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr
195 200 205
Leu Val Met Asp Val Asp Asp He Pro Arg He Val Gin Glu Ala Phe
210 215 220
Phe Leu Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro
225 230 235 240
Lys Asp He Gin Gin Gin Leu Ala He Pro Asn Trp Asp Gin Pro Met
245 250 255
Arg Leu Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gin Pro Pro Glu Val Ser
260 265 270
Leu Tyr Val Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg
290 295 300
Phe Val Glu Leu Thr Gly He Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu
305 310 315 320
Gly Ser Tyr Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gin Met Leu Gly Met
325 330 335
Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu
355 360 365
Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys He Val His He Asp He Asp Ser Ala
370 375 380
<210> 11 <2ll> 2013 <212> ДНК
<213> Arabidopsis thaliana <400> 11
atggcggcgg
caacaacaac
aacaacaaca
tcttcttcga
tctccttctc
caccaaacca
tctccttcct
cctccaaatc
accattacca
atctccagat
tctccctccc
attctcccta
120
aaccccaaca
aatcatcctc
ctcctcccgc
cgccgcggta
tcaaatccag
ctctccctcc
180
tccatctccg
ccgtgctcaa
cacaaccacc
aatgtcacaa
ccactccctc
tccaaccaaa
240
cctaccaaac
ccgaaacatt
catctcccga
ttcgctccag
atcaaccccg
caaaggcgct
300
<210> 12 <211> 2024 <212> ДНК
<213> Brassica juncea <400> 12
cacgttcaca aactcattca tcatctctcg ctcatttctc tccctctcct ctaaccatgg 60
cggcggcaac atcgtcttct ccaatctcct tcaccgctaa accttcttcc aaatcccttt 120
tacccatttc cagattctcc cttcccttct ccttaatccc gcagaaaccc tcctcccttc 180
gccacagtcc tctctccatc tcagccgttc tcaacacacc cgtcaatgtc gcacctcctt 240
cccctgaaaa aattgaaaag aacaagactt tcatctcccg ctacgctccc gacgagcccc 300
gcaagggcgc cgatatcctc gtcgaagccc tcgagcgtca aggcgtcgaa accgtctteg 3 60
cttacccggg aggtgettec atggagatcc accaagcctt aactcgatcc tctaccatcc 420
gtaaegtect cccccgtcac gaacaaggag gagtctttgc cgccgagggt tacgetegtt 480
cctctggtaa acegggaate tgeatageca cgtcaggtcc cggagccacc aacctegtta 540
gcggtttagc egacgegatg ctcgacagtg tccctctcgt cgctattaca ggacaggtcc 600
ctegteggat gattggtact gacgcgttcc aggagacgee aatcgttgag gtaacgaggt 660
ctattacgaa acataactat ctggtcatgg atgttgatga catacctagg atcgtgcaag 720
aggctttctt tctagctact teeggtagae ccggaccggt tttagttgat gttcctaagg 780
atattcagca geagcttgeg attcctaact gggatcagee tatgegctta cctggttaca 840
tgtctaggct gcctcagcct ccggaagttt ctcagttagg geagategtt aggttgatct 900
ctgaatctaa gaggcctgtt ttgtatgttg gtggtggaag cttgaactcg agtgatgaac 960
tggggaggtt tgtggagctt actgggatcc ctgtcgcgag tactttgatg gggcttggtt 1020
cttatccttg taacgatgag ttgtctctgc agatgettgg tatgeaeggg actgtgtacg 1080
etaattaege tgtggagcat agtgatttgt tgctggcgtt tggtgttagg tttgatgacc 1140
gtgtcactgg aaagctcgag gettttgega gcagggctaa gattgtgcac attgacattg 1200
attctgetga gattgggaag aacaagaege ctcatgtgtc tgtgtgtggt gatgttaagc 12 60
tggctttgea agggatgaac aaggttcttg agaaccgagc agaggagctc aagcttgact 1320
tcggagtttg gaggagtgaa ttgagegage agaaacaaaa gttcccgttg agttttaaaa 1380
cgtttggaga agctattcct ccacagtacg cgattcaggt cctcgacgag ctaaccgatg 1440
ggaaggcaat catcagtact ggtgttgggc aacatcagat gtgggcggcg cagttttaca 1500
agtacaggaa gecgaggcag tggttgtcat catcaggcct tggagctatg ggttttggac 1560
<210> 14 <211> 2024 <212> ДНК
cacgttcaca aactcattca tcatctctcg cggcggcaac atcgtcttct ccaatctcct tacccatttc cagattctcc cttcccttct gccacagtcc tctctccatc tcagccgttc
<213> Brassica juncea <400> 14
ctcatttctc tccctctcct ctaaccatgg 60 tcaccgctaa accttcttcc aaatcccttt 120 ccttaatccc gcagaaaccc tcctcccttc 180 tcaacacacc cgtcaatgtc gcacctcctt 240
<210> 15 <211> 2015 <212> ДНК
<213> Brassica juncea <400> 15
cacgttcaca aactcattca tcatctctct ctcatttctc tctctctcat ctaaccatgg 60
cggcggcaac atcgtcttct ccgatctcct taaccgctaa accttcttcc aaatcccctc 120
tacccatttc cagattctcc cttcccttct ccttaacccc acagaaaccc tcctcccgtc 180
tccaccgtcc tctcgccatc tccgccgttc tcaactcacc cgtcaatgtc gcacctgaaa 240
aaaccgacaa gatcaagact ttcatctccc gctacgctcc cgacgagccc cgcaagggtg 300
ctgatatcct cgtggaagcc ctcgagcgtc aaggcgtcga aaccgtcttc gcttatcccg 360
gaggtacctc catggagatc caccaagcct tgactcgctc ctccaccatc cgtaacgtcc 420
tcccccgtca cgaacaagga ggagtcttcg ccgccgaggg ttacgctcgt tcctccggca 430
aaccgggaat ctgcattgcc acttcgggtc ccggagctac caacctcgtc agcgggttag 540
ccgacgcgat gcttgacagt gttcctctcg tcgccattac aggacaggtc cctcgccgga 600
tgatcggtac tgacgccttc caagagacgc caatcgttga ggtaacgagg tctattacga 660
aacataacta tctggtgatg gatgttgatg acatacctag gatcgttcaa gaagctttct "720
ttctagctac ttccggtaga cccggaccgg ttttggttga cgttcctaag gatattcagc 780
agcagcttgc gattcctaac tgggatcaac ctatgcgctt gcctggctac atgtctaggc 840
tgcctcagcc accggaagtt tctcagttag gtcagatcgt taggttgatc tcggagtcta 900
agaggcctgt tttgtacgtt ggtggtggaa gcttgaactc gagtgaagaa ctggggagat 960
ttgtcgagct tactgggatc cctgttgcga gtacgttgat ggggcttggc tcttatcctt 1020
gtaacgatga gttgtccctg cagatgcttg gcatgcacgg gactgtgtat gctaactacg 1080
ctgtggagca tagtgatttg ttgctggcgt ttggtgttag gtttgatgac cgtgtcacgg 1140
gaaagctcga ggcgtttgcg agcagggcta agattgtgca catagacatt gattctgctg 1200
agattgggaa gaataagaca cctcacgtgt ctgtgtgtgg tgatgtaaag ctggctttgc 1260
aagggatgaa caaggttctt gagaaccggg cggaggagct caagcttgat ttcggtgttt 1320
ggaggagtga gttgagcgag cagaaacaga agttcccgtt gagcttcaaa acgtttggag 1380
aagccattcc tccgcagtac gcgattcagg tcctagacga gctaacccaa gggaaggcaa 1440
ttatcagtac tggtgttgga cagcatcaga tgtgggcggc gcagttttac aagtacagga 1500
<210> 17 <211> 2015 <212> ДНК
cacgttcaca aactcattca tcatctctct
cggcggcaac atcgtcttct ccgatctcct
tacccatttc cagattctcc cttcccttct
tccaccgtcc tctcgccatc tccgccgttc
<213> Brassica juncea <400> 17
ctcatttctc tctctctcat ctaaccatgg 60 taaccgctaa accttcttcc aaatcccctc 120 ccttaacccc acagaaaccc tcctcccgtc 180 tcaactcacc cgtcaatgtc gcacctgaaa 240
aaaccgacaa gatcaagact ttcatctccc gctacgctcc cgacgagccc cgcaagggtg 300
ctgatatcct cgtggaagcc ctcgagcgtc aaggcgtcga aaccgtcttc gcttatcccg 360
gaggtgcctc catggagatc caccaagcct tgactcgctc ctccaccatc cgtaacgtcc 420
tcccccgtca cgaacaagga ggagtcttcg ccgccgaggg ttacgctcgt tcctccggca 480
aaccgggaat ctgcattgcc acttcgggtc ccggagctac caacctcgtc agcgggttag 540
ccgacgcgat gcttgacagt gttcctctcg tcgccattac aggacaggtc cctcgccgga 600
tgatcggtac tgacgccttc caagagacgc caatcgttga ggtaacgagg tctattacga 660
aacataacta tctggtgatg gatgttgatg acatacctag gatcgttcaa gaagctttct 720
ttctagctac ttccggtaga cccggaccgg ttttggttga cgttcctaag gatattcagc 780
agcagcttgc gattcctaac tgggatcaac ctatgcgctt gcctggctac atgtctaggc 840
tgcctcagcc accggaagtt tctcagttag gtcagatcgt taggttgatc tcggagtcta 900
agaggcctgt tttgtacgtt ggtggtggaa gcttgaactc gagtgaagaa ctggggagat 960
ttgtcgagct tactgggatc cctgttgcga gtacgttgat ggggcttggc tcttatcctt 1020
gtaacgatga gttgtccctg cagatgcttg gcatgcacgg gactgtgtat gctaactacg 1080
ctgtggagca tagtgatttg ttgctggcgt ttggtgttag gtttgatgac cgtgtcacgg 1140
gaaagctcga ggcgtttgcg agcagggcta agattgtgca catagacatt gattctgctg 1200
agattgggaa gaataagaca cctcacgtgt ctgtgtgtgg tgatgtaaag ctggctttgc 1260
aagggatgaa caaggttctt gagaaccggg cggaggagct caagcttgat ttcggtgttt 1320
ggaggagtga gttgagcgag cagaaacaga agttcccgtt gagcttcaaa acgtttggag 1380
aagccattcc tccgcagtac gcgattcagg tcctagacga gctaacccaa gggaaggcaa 1440
ttatcagtac tggtgttgga cagcatcaga tgtgggcggc gcagttttac aagtacagga 1500
agccgaggca gtggctgtcg tcctcaggac tcggagctat gggtttcgga cttcctgctg 15 60
cgattggagc gtctgtggcg aaccctgatg cgattgttgt ggacattgac ggtgatggaa 1620
gcttcataat gaacgttcaa gagctggcca caatccgtgt agagaatctt cctgtgaaga 1680
tactcttgtt aaacaaccag catcttggga tggtcatgca atgggaagat cggttctaca 1740
aagctaacag agctcacact tatctcgggg acccggcaag ggagaacgag atcttcccta 1800
acatgctgca gtttgcagga gcttgcggga ttccagctgc gagagtgacg aagaaagaag 1860
aactccgaga agctattcag acaatgctgg atacacctgg accgtacctg ttggatgtca 1920
tctgtccgca ccaagaacat gtgttaccga tgatcccaag tggtggcact ttcaaagatg 1980
taataaccgaaggggatggtcgcactaagtactga 2015
<210> 19
<211> 2017
<212> ДНК
<213> Brassica napus
<400> 19
cacgttcaca ggcggcggca tctacccatt tctccaccgt aaaaaccgac tgctgatatc cggaggtgcc cctcccccgt caaaccggga agccgacgcg gatga tcggt gaaacataac ctttctagct gcagcagctt gctgcctcag taagaggcct atttgtcgag ttgtaacgat cgctgtggag gggaaagctc tgagattggg gcaagggatg ttggaggagt agaagccatt aattatcagt gaagccgagg tgcgattgga aagct tcata gatactcttg caaagctaac taacatgctg agaactccga catctgtccg tgtaataacc aactcattca acatcgtctt tccagattct ccactcgcca aagatcaaga ctcgtggaag tccatggaga cacgaacaag atctgcatag atgc ttgaca actgacgcgt tatctggtga acttccggta gcgattccta ccaccggaag gttttgtacg cttactggga gagt tgtccc ca t a gt ga 11 gaggcgtttg aagaataaga aacaaggt tc gagt tgagcg cctccgcag t actggtgttg cagtggctgt gcgt ctgtgg atgaacgttc ttaaacaacc agagctcaca cagt ttgcag gaagctattc caccaagaac gaaggggatg tcatctctct ctccgatctc cccttccctt
tctccgccgt ctttcatctc ccctcgagcg tccaccaagc gaggagtctt ccacttcggg gtgttcctct tccaagagac tggatgttga gacccggacc actgggatca tttctcagtt ttggtggtgg tccctgttgc tgcagatgct tgttgctggc cgagcagggc cacctcacgt ttgagaaccg agcagaaaca acgcgattca gacagcatca cgtcctcagg cgaaccctga aagagctggc agcatcttgg cttatctcgg gagcttgcgg agacaatgct atgtgttacc gtcgcactaa ctcatttctc cttaaccgct ctccttaacc tctcaactca ccgctacgct tcaaggcgtc cttgactcgc cgccgccgag tcccggagct cgtcgccatc gccaatcgtt tgacatacct ggttttggtt acctatgcgc aggccagatc aagcttgaac gagtacgttg tggcatgcac gtttggtgtt taagattgtg gtctgtgtgt ggcggaggag gaagt tcccg ggtcctagac gatgtgggcg actcggagct tgcgattgtt cacaatccgt gatggtcatg ggacccggca gattccagct ggatacacct gatgatccca gtactga tctctctctc aaaccttctt ccacagaaac cccgtcaatg cccgacgagc gaaaccgtct tcctccacca ggttacgctc accaacctcg acaggacagg gaggtaacga aggatcgttc gatgttccta ttgcctggct gttaggttga tcgagtgaag atggggcttg gggactgtgt aggtttgatg cacatagaca ggtgatgtaa ctcaagcttg t tgagcttca gagctaaccc gcgcagtttt atgggtttcg gtggacattg gtagagaatc caatgggaag agggagaacg gcgagagtga ggaccgtacc agtggtggca atctaaccat ccaaatcccc cctcctcccg tcgcacctga cccgcaaggg tcgcttatcc tccgtaacgt gttcctccgg tcagcgggtt tccctcgccg ggtctat tac aagaagcatt aggatattca acatgtctag tctcggagtc aactggggag gctct tatcc atgctaacta accgtgtcac ttgattctgc agctggcttt atttcggtgt aaacgtttgg aagggaaggc acaagtacag gacttcctgc acggtgatgg ttcctgtgaa atcggttcta agatcttccc cgaagaaaga tgttggatgt ctttcaaaga
120
180 240 300 360 420 430 54 0 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2017
<210> 20 <211> 2009 <212> ДНК
<213> Brassica napus <400> 20
cacgttcaca aactcattca tcatctctct ctcctctaac catggcggcg gcaacatcgt cttctccgat ctccttaacc gctaaacctt cttccaaatc ccctctaccc atttccagat tctcccttcc cttctcctta accccacaga aagactcctc ccgtctccac cgtcctctcg
120 180
ccatctccgc acaagaacaa tcctcgtcga cttccatgga gtcacgaaca gaatctgcat cgatgcttga gtactgacgc actatttggt ctacttccgg ttgcgattcc agcctccgga ctgttttgta agcttactgg atgagt tgtc agcatagtga tcgaggcttt ggaagaataa tgaacaaggt gtgagttgag ttcctccgca gtactggtgt gacagtggct gagcgtctgt taatgaacgt tgttaaacaa acagagctca tgcagtttgc gagaagctat cgcaccaaga cagaagggga cgttctcaac gactttcgtc agccctcgag gatccaccaa aggaggagtc agccacttcg cagtgttcct cttccaagag gatggatgtt tagacccgga taactgggat agtttctcag cgttggtggt gatccccgtt cctgcagatg tttgttgctg cgctagcagg gacacctcac tcttgagaac cgagcagaaa gtacgcgatt tggacagcat gtcgtcatca ggcgaaccct tcaagagctg ccagcatctt cacttatctc aggagcttgc tcagacaatg acatgtgtta tggtcgcact tcacccgtca tcccgctacg cgtcaaggcg gccttgactc ttcgccgccg ggtcccggag cttgtcgcca acaccaatcg gatgacatac ccggttttgg caacctatgc ttaggtcaga ggaagct tga gcgagtactt cttggcatgc gcgtttggtg gctaaaattg gtgtctgtgt cgggcggagg cagaagttcc cagatcctcg cagatgtggg ggcctcggag gatgcgattg gccacaatcc gggatggtca ggggacccgg gggattccag ctggatacac ccga tgatcc aagtactga atgtcgcacc ctcccgacga tcgaaaccgt gctcctccac agggttacgc ctaccaacct ttacaggaca ttgaggtaac ctaggatcgt t tgatgttcc gcttacctgg tcgttaggtt actcgagtga tgatggggct acgggactgt ttaggt t tga tgcacataga gtggtgatgt agctcaagct ctttgagctt acgagctaac cggcgcagtt ctatgggttt ttgtggatat gtgtagagaa tgcaatggga caagggagaa ctgcgagagt caggaccata caagtggtgg tccttcccct gccccgcaag ctttgcttat catccgtaac tcgttcctcc cgtcagcggg ggtccctcgc gaggtctatt tcaagaagct taaggatat t ctacatgtct gatctcggag agaactgggg tggctcttat gtatgctaac tgaccgtgtc cattgattct aaagctggct tgatttcggt caaaacgttt cgaagggaag ttacaagtac tggacttcct tgacggtgat tcttcctgtg agatcggttc cgagatcttc gacgaagaaa cctgttggat cactttcaaa gaaaaaaccg ggtgctgata cccggaggtg gtccttcccc ggcaaaccgg ttagcagacg cggatgatcg acgaaacata ttctttctag cagcagcagc aggttgcctc tctaagaggc agatttgtcg ccttgtaacg tacgctgtgg acgggaaagc gctgagattg ttgcaaggga gtttggagga ggagaagcca gcaattatca aggaagccga gctgcgattg ggaagcttca aagatactct tacaaagcta cctaacatgc gaagaactcc gtgatatgtc ga tgtaataa
240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2009
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) генома A Brassica, кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид (AHASL), имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и геном В, включающий ген AHASL генома В Brassica, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, оба вместе, обеспечивают синергический уровень резистентности к AHAS-ингибирующему гербициду указанному растению Brassica juncea.
2. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea, содержащее геном А, включающий ген большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующий первый устойчивый к гербициду полипептид субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и геном В, включающий ген AHASL генома
1.
В Brassica, кодирующий второй устойчивый к гербициду полипептид (AHASL), который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, где первый и второй устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, оба вместе, предоставляют указанному растению Brassica juncea си-нергический уровень резистентности к AHAS-ингибирующему гербициду.
3. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.2, где ген AHASL в геноме А локализирован в локусе AHASL генома А.
4. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-3, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 10% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.
5. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.4, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 20% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.
6. Устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по п.5, где устойчивое к гербициду растение Brassica juncea обладает по меньшей мере или примерно на 30% более высокой резистентностью по сравнению с аддитивными уровнями резистентности для растения Brassica juncea, содержащего первый ген AHASL, и растения Brassica juncea, содержащего второй ген AHASL.
7. Часть устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где часть растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2, и часть растения выбрана из каллусов растений, протопластов растений, культур растительных клеток, стеблей, листьев, корней, соцветий, цветов, цветов компактного соцветия, плодов, цветоножек, плодоножек, тычинок, пыльников, рылец, столбиков, завязей, лепестков, чашелистиков, плодолистиков, кончиков корня, корневых чехликов, корневых волосков, волосков семени, пыльцевых зерен, микроспор, зародышей, семяпочек, семядолей, гипокотилей, эпикотилей, ксилем, флоэм, паренхим, эндоспермов, клеток-спутниц, замыкающих клеток.
8. Часть растения по п.7, где часть растения выбрана из пыльцы, протопластов и завязей.
9. Клетка устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где клетка растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2.
10. Семя устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6, где семя растения содержит гены AHASL, кодирующие устойчивые к гербициду полипептиды AHASL, раскрытые в пп.1, 2.
11. Семя по п.10, где семя обработано препаратом для обработки семян, содержащим AHAS-ингибирующий гербицид.
12. Семя по п.11, где препарат для обработки семян включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатового гербицида.
13. Семя по п.12, где препарат для обработки семян включает имидазолиноновый гербицид.
14. Семя по п.13, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
15. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле с растениями рода Brassica, где указанный способ включает выращивание на поле устойчивого к гербициду растения Brassica juncea по любому из пп.1-6 и приведение в контакт указанного растения Brassica juncea и сорняков, растущих на поле, с эффективным количеством гербицида, ингибирующего AHAS, к которому растение Brassica juncea является устойчивым, осуществляя тем самым борьбу с сорняками.
16. Способ по п.15, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.
17. Способ по п.16, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
18. Способ по п.17, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
19. Способ борьбы с сорняками, растущими на поле в непосредственной близости от семян растений рода Brassica, где указанный способ включает посев обработанного семени по любому из пп. 11-13.
20. Способ по п.19, в котором гербицид, ингибирующий AHAS, включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопи-римидиного гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.
21. Способ по п.20, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
22. Способ по п.21, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
23. Семя по п.11, где семя обработано одним из следующих способов: опрыскивание семени, нанесение покрытия на семя, окатывание семени, опыление семени, пропитка семени, пеллетизация семени,
10.
или их комбинация.
24. Семя по п.11, где семя обработано перед посевом семени и/или после проращивания семени.
25. Способ отбора устойчивого к гербициду растения Brassica juncea из множества растений Bras-sica, включающий
предоставление множества растений Brassica, которое может включать устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-6;
нанесение эффективного количества AHAS-ингибирующего гербицида на указанное растение Bras-sica juncea и
идентификацию растения Brassica juncea, способного расти в присутствии указанного гербицида, осуществляя тем самым отбор растения Brassica juncea, устойчивого к гербициду.
26. Способ по п.25, в котором гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имидазолинонового гербицида, сульфонилмочевинного гербицида, триазолопиримидинового гербицида и пиримидинилоксибензоатного гербицида.
27. Способ по п.26, в котором гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
28. Способ по п.27, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
29. Экспрессирующий вектор, содержащий:
(a) первую молекулу полинуклеотида, большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или
(b) первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2.
30. Трансформированное растение, которое трансформировано экспрессирующим вектором по п.29 и имеет повышенную устойчивость к AHAS-ингибирующему гербициду.
31. Растение по п.30, где гербицид выбран из группы, состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов и пиримидинилоксибензоато-вых гербицидов.
32. Растение по п.31, где растение выбрано из В. juncea, В. napus, В. rapa, В. carinata, В. oleracea и В.
nigra.
33. Способ получения трансгенного растения, имеющего повышенную устойчивость к AHAS-ингибирующим гербицидам, включающий стадии
трансформации растительной клетки экспрессирующим вектором по п.29 и
регенерации из растительной клетки трансгенного растения, которое экспрессирует полипептиды AHASL.
34. Способ идентификации или отбора устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растительной ткани или растения или его части из множества трансформированных растительных клеток, растительной тканей или растений или его частей, включающий
получение множества трансформированных растительных клеток, растительной ткани или растений или его частей, которые могут включать трансформированную растительную клетку, растительную ткань или растение или его часть, которые содержат полинуклеотиды AHASL экспрессирующего вектора по п.29, причем полинуклеотиды AHASL кодируют мутантные полипептиды AHASL, которые обеспечивают устойчивость к AHAS-ингибирующему гербициду трансформированной растительной клетке, растительной ткани или растению или его части, экспрессирующие данные полипептиды, причем полипептиды используются в качестве селективных маркеров;
осуществление контакта трансформированных растительных клеток, растительных тканей, растений или их частей по меньшей мере с одним AHAS-ингибирующим гербицидом;
определение того, подвергается ли растительная клетка, растительная ткань, растение или его часть действию AHAS-ингибирующего гербицида; и
идентификацию или отбор устойчивой к гербициду трансформированной растительной клетки, растительной ткани, растения или его части, которые содержат полинуклеотиды AHASL экспрессирующего вектора по п.29.
35. Способ получения устойчивого к AHAS-ингибирующему гербициду растения, включающий скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое не является устойчивым к гербициду, при этом первое растение является растением по любому из пп.1-6, и отбор растения-потомка, которое устойчиво к гербициду.
36. Устойчивое к AHAS-ингибирующему гербициду растение, полученное способом по п.35.
37. Семя растения по п.36, где семя содержит гены AHASL первого растения.
35.
38. Способ получения устойчивого к AHAS-ингибирующему гербициду семени растения Brassica, при этом способ включает
скрещивание первого растения Brassica со вторым растением Brassica с получением растения-потомка, где первое растение Brassica представляет собой устойчивое к гербициду растение Brassica juncea по любому из пп.1-6;
получение семян от растения-потомка.
39. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения масла из семени.
40. Применение семени по любому из пп.10 и 37 для получения пищевого продукта на основе семени.
41. Способ идентификации растения по любому из пп.1-6, включающий:
a) получение биологического материала из растения,
b) осуществление ПЦР или исследования на основе гибридизации генов AHASL указанного биологического материала с целью определения (i) содержит ли его геном А ген AHASL, который кодирует первый полипептид AHASL, раскрытый в любом из пп.1-6, и (ii) содержит ли его геномом В ген AHASL, который кодирует второй полипептид AHASL, раскрытый в любом из пп.1, 2, и
c) идентификацию растения, упомянутого на стадии а), имеющего признаки растения по любому из пп.1-6, основываясь на полученных результатах стадии b).
42. Способ по п.41, где указанным биологическим материалом является семя растения.
43. Способ по п.42, где гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имида-золинонового гербицида, сульфонилмочевиного гербицида, триазолопиримидинового гербицида, пири-мидинилоксибензоатного гербицида.
44. Способ по п.43, где гербицид включает имидазолиноновый гербицид.
45. Способ по п.44, где имидазолиноновый гербицид включает один или несколько гербицидов, выбранных из имазетапира, имазапика, имазамокса, имазахина и имазапира.
46. Способ получения устойчивого к гербициду растения Brassica juncea, где способ включает трансформацию клетки растения Brassica:
(a) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспара-гин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или
(b) первым экспрессирующим вектором, содержащим первую молекулу полинуклеотида большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), кодирующую первый устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и вторым экспрессирующим вектором, содержащим вторую молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую второй устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспара-гин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и
регенерацию из растительной клетки растения Brassica, которое экспрессирует первый и второй полипептиды AHASL.
47. Способ получения устойчивого к гербициду растения Brassica juncea, где способ включает
трансформацию клетки растения Brassica экспрессирующим вектором и
регенерацию из растительной клетки Brassica растения Brassica, которое экспрессирует по крайней мере два устойчивых к гербициду полинуклеотида, представляющие собой большую субъединицу синта-зы ацетогидроксикислот (AHASL), где:
(a) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2,
(b) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на лейцин в положении 556 в последовательности SEQ ID NO:6,
(c) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID NO:5, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на аспарагин в положении 638 в последовательности SEQ ID NO:2, или
(d) растительная клетка изначально содержит молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, имеющий замещение на аспарагин в положении 638 в после
(a)
довательности SEQ ID NO:2, и указанная клетка трансформирована экспрессирующим вектором, содержащим молекулу полинуклеотида AHASL, кодирующую устойчивый к гербициду полипептид AHASL, который имеет замещение на треонин в положении 104 в последовательности SEQ ID N0:5.
AtAHASL Bn_PM2 BllAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB JQ4E-0044 JQ4E-0122 J04E-0130 J04E-013.9 151
TCTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT TTTCCAGATT
CTCCCTCCCA CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC CTCCCTTCCC
TTCTCCCTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA TTCTCCTTAA
200
ACCCCAACAA ATCATCCTCC
CCCCACAGAA ACC . С
CCCCACAGAA ACC С
CCCCACAGAA AGA С
CCCCACAGAA ACC С
TCCCGCAGAA ACC С
TCCCGCAGAA ACC ,C
CCCCACAGAA ACC...... С
TCCCGCAGAA ACC С
CCCCACAGAA ACC С
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 251
CGTGCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC
ACAACCACCA TCACCCGTCA TCACCCGTCA TCACCCGTCA TCACCCGTCA ACACCCGTCA ACACCCGTCA TCACCCGTCA ACACCCGTCA TCACCCGTCA
ATGTCACAAC ATGTCGCA.C ATGTCGCA.C ATGTCGCACC ATGTCGCACC ATGTCGCACC ATGTCGCACC ATGTCGCACC ATGTCGCACC ATGTCGCACC
AtAKASL Bn__PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0C44 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 301
CTACCAAACC CGACAAGATC CGACAAGATC CGACAAGAAC CGACAAGATC TGAAAAGAAC TGAAAAGAAC CGACAAGATC TGAAAAGAAC CGACAAGATC
CGAAACATTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC A.AGACTTTC
ATCTCCCGAT ATCTCCCGCT ATCTCCCGCT GTCTCCCGCT ATCTCCCGCT ATCTCCCGCT ATCTCCCGCT ATCTCCCGCT ATCTCCCGCT ATCTCCCGCT
TCGCTCCAGA ' ACGCTCCCGA i ACGCTCCCGA i ACGCTCCCGA i ACGCTCCCGA I ACGCTCCCGA I ACGCTCCCGA " ACGCTCCCGA < ACGCTCCCGA f ACGCTCCCGA i
351
AAAGGCGCTG AAGGGTGCTG AAGGGTGCTG AAGGGTGCTG AAGGGTGCTG AAGGGCQCCG AAGGGCGCCG AAGGGTGCTG AAGGGCGCCG AAGGGTGCTG
ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT ATATCCTCGT
CGAAGCTTTA GGAAGCCCTC GGAAGCCCTC CGAAGCCCTC GGAAGCCCTC CGAAGCCCTC CGAAGCCCTC GGAAGCCCTC CGAAGCCCTC GGAAGCCCTC
GAACGTCAAG I GAGCGTCAAG i GAGCGTCAAG ' GAGCGTCAAG I GAGCGTCAAG I GAGCGTCAAG ' GAGCGTCAAG i GAGCGTCAAG ¦ GAGCGTCAAG i GAGCGTCAAG i
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 JG4E-0122 J04E-0130 J04E-O139
TACCCTOGAG TATCCCGGAG 1 TATCCCGGAG TATCCCGGAG TATCCCGGAG 1 TACCCGGGAG ' TACCCGGGAG 1 TATCCCGGAG TACCCGGGAG ' TATCCCGGAG
GTGCATCAAT GTGCCTCCAT GTGCCTCCAT I GTGCTTCCAT " GTGCCTCCAT < GTGCTTCCAT i GTGCTTCCAT I GTACCTCCAT I GTACTTCCAT < GTGCCTCCAT I
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 451
CCCGCTCTTC CTCGCTCCTC CTCGCTCCTC CTCGCTCCTC CTCGCTCCTC CTCGATCCTC CTCGATCCTC CTCGCTCCTC CTCGATCCTC CTCGCTCCTC
CTCAATCCGT CACCATCCGT CACCATCCGT CACCATCCGT CACCATCCGT TACCATCCGT TACCATCCGT CACCATCCGT TACCATCCGT CACCATCCGT
AACGTCCTTC ' AACGTCCTCC ' AACGTCCTCC ' AACGTCCTTC ' AACGTCCTCC ' AACGTCCTCC ¦ AACGTCCTCC ' AACGTCCTCC ' AACGTCCTCC ' AACGTCCTCC ¦
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 JO4E-013O ОГ04Е-0139 501
GTATTCGCAG GTCTTCGCCG GTCTTCGCCG GTCTTCGCCG GTCTTCGCCG GTCTTTGCCG GTCTTTGCCG GTCTTCGCCG GTCTTTGCCG GTCTTCGCCG
CAGAAGGATA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA CCGAGGGTTA
CGCTCGATCC ' CGCTCGTTCC ' CGCTCGTTCC ' CGCTCGTTCC ' CGCTCGTTCC ' CGCTCGTTCC ' CGCTCGTTCC ' CGCTCGTTCC 1 CGCTCGTTCC 1 CGCTCGTTCC 1
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA
BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139
CATAGCCACT CATTGCCACT CATAGCCACG CATAGCCACG CATTGCCACT CATAGCCACG CATTGCCACT
TCGGGTCCCG TCGGGTCCCG TCAGGTCCCG TCAGGTCCCG TCGGGTCCCG TCAGGTCCCG TCGGGTCCCG
GAGCTACCAA GAGCTACCAA GAGCCACCAA i GAGCCACCAA GAGCTACCAA I GAGCCACCAA I GAGCTACCAA
Фиг. 1 (продолжение)
AtAHASL Bn_PH2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J01E-0130 J04B-0139 601
ATGCGTTGTT ACGCGATGCT ACGCGATGCT ACGCGATGCT ACGCGATGCT ACGCGATGCT ACGCGATGCT ACGCGATGCT ACGCGATGCT ACGCGATGCT
AGATAGTGTT TGACAGTGTT TGACAGTGTT TGACAGTGTT TGACAGTGTT CGACAGTGTC CGACAGTGTC TGACAGTGTT CGACAGTGTC TGACAGTGTT
CCTCTTGTAG CCTCTCGTCG CCTCTCGTCG CCTCTTSTCG CCTCTCGTCG CCTCTCGTCG CCTCTCGTCG CCTCTCGTCG CCTCTCGTCG CCTCTCGTCG
CAATCACAGG . CCATCACAGG CCATCACAGG . CCATTACAGG CCATTACA3G CTATTACAGG . CTATTACAGG CCATTACAGG . CTATTACAGG . CCATTACAGG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-013 0 J04E-0139 651
CGTCGTATGA CGCCGGATGA CGCCGGATGA CGCCGGATGA CGCCGGATGA CGTCGGATGA CGTCGGATGA CGCCGGATGA CGTCGGATGA CGCCGGATGA
TTGGTACAGA TCGGTACTGA TCGGTACTGA TCGGTACTGA TCGGTACTGA TTGGTACTGA TTGGTACTGA TCGGTACTGA TTGGTACTGA TCGGTACTGA
TGCGTTTCAA CGCGTTCCAA CGCGTTCCAA CGCCTTCCAA CGCCTTCCAA CGCGTTCCAG CGCGTTCCAG CGCCTTCCAA CGCGTTCCAG CGCCTTCCAA
GASACTCCGA ' GAGACGCCAA ' GAGACGCCAA GAGACACCAA ' GAGACGCCAA ' GAGACGCCAA GAGACGCCAA GAGACGCCAA GAGACGCCAA 1 GAGACGCCAA
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0133 701
AACGCGTTCG AACGAGGTCT AACGAGGTCT AACGAGGTCT AACGAGGTCT AACGAGGTCT AACGAGGTCT AACGAGGTCT AACGAGGTCT AACGAGGTCT
ATTACGAAGC ATTACGAAAC ATTACGAAAC ATTACGAAAC ATTACGAAAC ATTACGAAAC ATTACGAAAC ATTACGAAAC ATTACGAAAC ATTACGAAAC
ATAACTATCT ATAACTATCT ATAACTATCT ATAACTATTT ATAACTATCT ATAACTATCT ATAACTATCT ATAACTATCT ATAACTATCT ATAACTATCT
TGTGATGGAT
GGTGATGGAT
GGTGATGGAT
GGTGATGGAT
GGTGATGGAT '
OGTCATGGAT
GGTCATGGAT
GGTGATGGAT ¦
GGTCATGGAT
GGTGATGGAT
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-OO44 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 751
TCCCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT TACCTAGGAT
TATTGAGGAA CGTTCAAGAA CGTTCAAGAA CGTTCAAGAA CGTTCAAGAA CGTGCAAGAG CGTGCAAGAG CGTTCAAGAA CGTGCAAGAG CGTTCAAGAA
GCTTTCTTTT GCATTCTTTC GCATTCTTTC GCTTTCTTTC GCTTTCTTTC GCTTTCTTTC GCTTTCTTTC GCTTTCTTTC
GCTTTCTTTC
GCTTTCTTTC
TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC TAGCTACTTC
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04B-0122 J04E-0130 J04E-0139
TGGTTGATGT TGG TTGATGT TGGTTGATGT TGGTTGATGT TGGTTGACGT TAGTTGATGT TAGTTGATGT TGGTTGACGT TAGTTGATGT TGGTTGACGT
TCCTAAAGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT TCCTAAGGAT
ATTCAACAAC . ATTCAGCAGC . ATTCAGCAGC ATTCAGCAGC ATTCAGCAGC . ATTCAGCAGC ATTCAGCAGC . ATTCAGCAGC ATTCAGCAGC ATTCAGCAGC .
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 JO4E-0122 J04E-0130 J04E-0139 851
TCCTAATTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG TCCTAACTGG
GAACAGGCTA GATCAACCTA GATCAACCTA GATCAACCTA GATCAACCTA GATCAGCCTA GATCAGCCTA GATCAACCTA GATCAGCCTA GATCAACCTA
TGAGATTACC TGCGCTTGCC TGCGCTTGCC TGCGCTTACC TGCGCTTGCC TGCGCTTACC TGCGCTTACC TGCGCTTGCC TGCGCTTACC TGCGCTTGCC
TGGTTATATG TGGCTACATG TGGCTACATG TGGCTACATG TGGCTACATG TGGTTACATG TGGTTACATG TGGCTACATG TGGTTACATG TGGCTACATG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0O44 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 901
CTAAACCTCC CTCAGCCACC CTCAGCCACC CTCAGCCTCC CTCAGCCACC CTCAGCCTCC CTCAGCCTCC CTCAGCCACC CTCAGCCTCC CTCAGCCACC
GGAAGATTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT GGAAGTTTCT
CATTTGGAGC CAGTTAGGCC CAGTTAGGCC CAGTTAGGTC CAGTTAGGTC CAGTTAGGGC CAGTTAGGGC CAGTTAGGTC CAGTTAGGGC CAGTTAGGTC
AGATTGTTAG
AGATCGTTAG
AGATCGTTAG
AGATCGTTAG
AGATCGTTAG
AGATCGTTAG
AGATCGTTAG <
AGATCGTTAG I
AGATCGTTAG
AGATCGTTAG i
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-D13S 9S1
GAGTCTAAGA GAGTCTAAGA GAGTCTAAGA GAGTCTAAGA GAGTCTAAGA GAATCTAAGA GAATCTAAGA GAGTCTAAGA GAATCTAAGA GAGTCTAAGA
AGCCTGTGTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT GGCCTGTTTT
GTATGTTGGT GTACGTTGQT GTACGTTGGT GTACGTTGGT GTACGTTGGT GTATGTTGGT GTATGTTGGT GTACGTTGGT GTATGTTGGT GTACGTTGGT
GGTGGTTGTT ' GGTGGAAGCT ' GGTGGAA3CT ' GGTGGAAGCT GGTGGAAGCT ' GGTGGAAGCT 1 GGTGGAAGCT GGTGGAAGCT GGTGGAAGCT GGTGGAAGCT
Фиг. 1 (продолжение)
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139
GGTAGGTTTG GGGAGATTTG GGGAGATTTG GGGAGATTTG GGGAGATTTG GGGAGGTTTG GGGAGGTTTG GGGAGATTTG GGGAGGTTTG GGGAGATTTG
TTGAGCTTAC TCGAGCTTAC TCGAGCTTAC TCGAGCTTAC TCGAGCTTAC TGGAGCTTAC TGGAGCTTAC TCGAGCTTAC TGGAGCTTAC TCGAGCTTAC
GGGGATCCCT I
TGGGATCCCT
TGGGATCCCT
TGGGATCCCC
TGGGATCCCT
TGGGATCCCT I
TGGGATCCCT
TGGGATCCCT I
TGGGATCCCT
TGGGATCCCT
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1051
CGTTGATGGG CGTTGATGGG CGTTGATGGG CTTTGATGGG CGTTGATGGG CTTTGATGGG CTTTGATGGG CGTTGATGGG CTTTGATGGG CGTTGATGGG
GCTGGGATCT GCTTGGCTCT GCTTGGCTCT GCTTGGCTCT GCTTGGCTCT GCTTGGTTCT GCTTGGTTCT GCTTGGCTCT GCTTGGTTCT GCTTGGCTCT
TATCCTTGTG TATCCTTGTA TATCCTTGTA TATCCTTGTA TATCCTTGTA TATCCTTGTA TATCCTTGTA TATCCTTGTA TATCCTTGTA TATCCTTGTA
ATGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT ACGATGAGTT
1100 GTCGTTACAT GTCCCTGCAG GTCCCTGCAG GTCCCTGCAG GTCCCTGCAG GTCTCTGCAG GTCTCTGCAG GTCCCTGCAG GTCTCTGCAG GTCCCTGCAG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-013Q J04E-0139 1101
ATGCTTGGAA ATGCTTGGCA ATGCTTGGCA ATGCTTGGCA ATGCTTGGCA ATGCTTGGTA ATGCTTGGTA ATGCTTGQCA ATGCTTGGTA ATGCTTGGCA
TGCATGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC TGCACGGGAC
TGTGTATGCA TGTGTATGCT TGTGTATGCT TGTGTATGCT TGTGTATGCT TGTGTACGCT TGTGTACGCT TGTGTATGCT TGTGTACGCT TGTGTATGCT
AATTACGCTG AACTACGCTG AACTACGCTG AACTACGCTG AACTACGCTG AATTACGCTG AATTACGCTG AACTACGCTG AATTACGCTG AACTACGCTG
1150 TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG TGGAGCATAG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 JO4E-0130 J04E-O13 9 1151
TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG TGATTTGTTG
TTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG CTGGCGTTTG
GGGTAAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT GTGTTAGGTT
TGATGATCGT i TGATGACCGT TGATGACCGT i TGATGACCGT I TGATGACCGT I TGATGACCGT i TGATGACCGT I TGATGACCGT TGATGACCGT i TGATGACCGT I
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139
TTTTGCTAGT GTTTGCGAGC GTTTGCGAGC TTTCGCTAGC GTTTGCGAGC TTTTGCGAGC TTTTGCGAGC GTTTGCGAGC TTTTGCGAGC GTTTGCGAGC
AGGGCTAAGA AGGGCTAAGA AGGGCTAAGA AGGGCTAAAA AGGGCTAAGA AGGGCTAAGA AGGGCTAAGA AGGGCTAAGA AGGGCTAAGA AGGGCTAAGA
TTGTTCATAT TTGTGCACAT . TTGTGCACAT . TTGTGCACAT . TTGTGCACAT , TTGTGCACAT TTGTGCACAT TTGTGCACAT . TTGTGCACAT TTGTGCACAT ,
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0O44 J04E-0122 J04E-0130 JQ4E-0139 1251
TCGGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA TCTGCTGAGA
TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA TTGGGAAGAA
TAAGACTCCT TAAGACACCT TAAOACACCT TAAGACACCT TAAGACACCT CAAGACGCCT CAAGACGCCT TAAGACACCT CAAGACGCCT TAAGACACCT
CATGTGTCTG CACGTGTCTG CACGTGTCTG CACGTGTCTG CACGTGTCTG CATGTGTCTG CATGTGTCTG CACGTGTCTG CATGTGTCTG CACGTGTCTG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1301
TGTTAAGCTG TGTAAAGCTG TGTAAAGCTG TGTAAAGCTG TGTAAAGCTG TGTTAAGCTG TGTTAAGCTG TGTAAAGCTG TGTTAAGCTG TGTAAAGCTG
GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG GCTTTGCAAG
GGATGAATAA GGATGAACAA GGATGAACAA GGATGAACAA GGATGAACAA GGATGAACAA GGATGAACAA GGATGAACAA GGATGAACAA GGATGAACAA
GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG GGTTCTTGAG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1351
AGGAGCTTAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA AGGAGCTCAA
GCTTGATTTT GCTTGATTTC GCTTGATTTC GCTTGATTTC GCTTGATTTC GCTTGACTTC GCTTGACTTC GCTTGATTTC GCTTGACTTC GCTTGATTTC
GGAGTTTGGA GGTGTTTGGA GGTGTTTGGA GGTGTTTGGA GGTGTTTGGA GGAGTTTGGA GGAGTTTGGA GGTGTTTGGA GGAGTTTGGA GGTGTTTGGA
GGAATQAGTT GGAGTGAGTT GGAGTGAGTT GGAGTGAGTT GGAGTGAGTT GGAGTGAATT GGAGTGAATT GGAGTGAGTT GGAGTGAATT GGAGTGAGTT
Фиг. 1 (продолжение)
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-O122 J04E-0130 J04E-013S 1401
AAACAGAAGT AAACAGAAGT AAACAGAAGT AAACAGAAGT AAACAGAAGT AAACAAAAGT AAACAAAAGT AAACAGAAGT AAACAAAAGT AAACAGAAGT
TTCCGTTGAG TCCCGTTGAG TCCCGTTGAG TCCCTTTGAG TCCCGTTGAG TCCCGTTGAG TCCCGTTGAG TCCCGTTGAG TCCCGTTGAG TCCCGTTGAG
CTTTAAGACG CTTCAAAACQ CTTCAAAACG CTTCAAAACG CTTCAAAACG TTTTAAAACG TTTTAAAACG CTTCAAAACG TTTTAAAACG CTTCAAAACG
TTTGGGGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG TTTGGAGAAG
1450 CTATTCCTCC CCATTCCTCC CCATTCCTCC CCATTCCTCC CCATTCCTCC CTATTCCTCC CTATTCCTCC CCATTCCTCC CTATTCCTCC CCATTCCTCC
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 JO4E-0130 J04E-0139 1451
ACAGTATGCG GCAGTACGCG GCAGTACGCG GCAGTACGCG GCAGTACGCG ACAGTACGCG ACAGTACGCG GCAGTACGCG ACAGTACGCG GCAGTACGCG
ATTAAGGTCC ATTCAGGTCC ATTCAGGTCC ATTCAGATCC ATTCAGGTCC ATTCAGGTCC ATTCAGGTCC ATTCAGGTCC ATTCAGGTCC ATTCAGGTCC
TTGATGAGTT TAGACGAGCT TAGACGAGCT TCGACGAGCT TAGACGAGCT TCGACGAGCT TCGACGAGCT TAGACGAGCT TCGACGAGCT TAGACGAGCT
GACTGATGGA .
AACCCAAGGG
AACCCAAGGG
AACCGAAGGG
AACCCAAGGG
AACCGATGGG .
AACCGATGGG
AACCCAAGGG .
AACCGATGGG
AACCCAAGGG .
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1501
TAAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG TCAGTACTGG
TGTCGGGCAA TGTTGGACAG TGTTGGACAG TGTTGGACAG TGTTGGACAG TGTTGGGCAA TGTTGGGCAA TGTTGGACAG TGTTGGGCAA TGTTGGACAG
CATCAAATGT CATCAGATGT CATCAGATGT CATCAGATGT CATCAGATGT CATCAGATGT CATCAGATGT CATCAGATGT CATCAGATGT CATCAGATGT
GGGCGGCGCA
GGGCGGCGCA
GGGCGGCGCA
GGGCGGCGCA
GGGCGGCGCA
GGGCGGCGCA
GGGCGGCGCA
GGGCGGCGCA I
GGGCGGCGCA i
GGGCGGCGCA
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1551
TACAAGAAAC TACAGGAAGC TACAGGAAGC TACAGGAAGC TACAGGAAGC TACAGGAAGC TACAGGAAGC TACAGGAAGC TACAGGAAGC TACAGGAAGC
CAAGGCAGTG CGAGGCAGTG CGAGGCAGTG CGAGACAGTG CGAGGCAGTG CGAGGCAGTG CGAGGCAGTG CGAGGCAGTG CGAGGCAGTG CGAGGCAGTG
GCTATCATCA GCTGTCGTCC GCTGTCGTCC GCTGTCGTCA GCTGTCGTCC GTTGTCATCA GTTGTCATCA GCTGTCGTCC GTTGTCATCA GCTGTCGTCC
GGAGGCCTTG TCAGGACTCG TCAGGACTCG TCAGGCCTCG TCAGGACTCG TCAGGCCTTG TCAGGCCTTG TCAGGACTCG TCAGGCCTTG TCAGGACTCG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139
CCTGCTGCGA CCTGCTGCGA CCTGCTGCGA CCTGCTGCGA CCTGCTGCGA CCTGCTGCCA CCTGCTGCCA CCTGCTGCGA CCTGCTGCCA CCTGCTGCGA
TTGGAGCGTC TTGGAGCGTC TTGGAGCGTC ' TTGGAGCGTC ' TTGGAGCGTC ' TTGGAGCGTC 1 TTGGAGCGTC TTGGAGCGTC TTGGAGCGTC ¦ TTGGAGCGTC 1
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 16S1
TAGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA TTGTTGTGGA
TATTGACGGA CATTGACGGT CATTGACGGT TATTGACGGT CATTGACGGT CATTGACGGT CATTGACGGT CATTGACGGT CATTGACGGT CATTGACGGT
GATGGAAGCT 1 GATGGAAGCT 1 GATGGAAGCT GATGGAAGCT 1 GATGGAAGCT 1 GACGGAAGCT ' GACGGAAGCT GATGGAAGCT ' GACGGAAGCT GATGGAAGCT
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-O044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1701
CTAGCCACTA CTGGCCACAA CTGGCCACAA CTGGCCACAA CTGGCCACAA CTGGCCACAA CTGGCCACAA CTGGCCACAA CTGGCCACAA CTGGCCACAA
TTCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA TCCGTGTAGA
GAATCTTCCA < GAATCTTCCT i GAATCTTCCT GAATCTTCCT GAATCTTCCT GAATCTTCCT i GAATCTTCCT i GAATCTTCCT I GAATCTTCCT ' GAATCTTCCT '
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0O44 J04E-0122 J04E-0130 J04E-O139 1751
CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT CAACCAGCAT
CTTGGCATGG CTTGGGATGG CTTGGGATGG CTTGGGATGG CTTGGGATGG CTTGGCATGG CTTGGCATGG CTTGGGATGG CTTGGCATGG CTTGGGATGG
TTATGCAATG '
TCATGCAATT i
TCATGCAATG <
TCATGCAATG
TCATGCAATG I
TTATGCAATG
TTATGCAATG
TCATGCAATG
TTATGCAATG
TCATGCAATG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 JO4E-013O J04E-0139 1851
TTCCCGAACA TTCCCTAACA TTCCCTAACA TTCCCTAACA TTCCCTAACA TTCCCAAACA TTCCCAAACA TTCCCTAACA TTCCCAAACA TTCCCTAACA
TGTTGCTGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT TGCTGCAGTT
TGCAGCAGCT TGCAGGAGCT TGCAGGAGCT TGCAGGAGCT TGCAGGAGCT TGCAGGAGCC TGCAGGAGCC TGCAGGAGCT TGCAGGAGCC TGCAGGAGCT
TGCGGGATTC TGCGGGATTC TGCGGGATTC TGCGGGATTC TGCGGGATTC TGTGGGATTC TGTGGGATTC TGCGGGATTC TGTGGGATTC TGCGGGATTC
1900 CAGCGGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG CAGCTGCGAG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0O44 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1901
GGTGACAAAG AGTGACGAAG AGTGACGAAG AGTGACGAAG AGTGACGAAG GGTGACGAAG GGTGACGAAG AGTGACGAAG GGTGACGAAG AGTGACGAAG
AAAGCAGATC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC AAAGAAGAAC
TCCGAGAAGC TCCGAGAAGC TCCGAGAAGC TCCGAGAAGC TCCGAGAAGC TCCGAGATGC TCCGAGATGC TCCQAGAAGC TCCGAGATGC TCCGAGAAGC
TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA . TATTCAGACA .
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-O130 J04B-0139 1951
CACCAGGACC CACCTGGACC CACCTGGACC CACCAGGACC CACCTGGACC CACCAGGACC CACCAGGACC CACCTGGACC CACCAGGACC CACCTGGACC
TTACCTGTTG GTACCTGTTG GTACCTOTTG ATACCTGTTG GTACCTGTTG ATACCTGTTG ATACCTGTTG GTACCTGTTG ATACCTGTTG GTACCTGTTG
GATGTGATTT GATGTCATCT GATGTCATCT GATGTGATAT GATGTCATCT GATGTGATCT GATGTGATCT GATGTCATCT GATGTGATCT GATGTCATCT
GTCCGCACCA . GTCCGCACCA . GTCCGCACCA , GTCCGCACCA , GTCCGCACCA GTCCGCACCA . GTCCGCACCA . GTCCGCACCA GTCCGCACCA , GTCCGCACCA .
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-O044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 2001
TTGCCGATGft TTACCGATGA TTACCGATGA TTACCGATGA TTACCGATGA TTACCGATGA TTACCGATGA TTACCGATGA TTACCGATGA TTACCGATGA
TCCCGAGTGG TCCCAAGTGG TCCCAAGTGG TCCCAAGTGG TCCCAAGTGG TCCCAAGTGG TCCCAAATGG TCCCAAGTGG TCCCAAGTGG TCCCAAATGG
TGGCACTTTC TGGCACTTTC TGGCACTTTC TGGCACTTTC TGGCACTTTC TGGTACTTTC TGGTACTTTC TGGCACTTTC TGGTACTTTC TGGCACTTTC
AACGATGTCA AAAGATGTAA AAAGATGTAA AAAGATGTAA AAAGATGTAA AAAGATGTCA AAAGATGTCA AAAGATGTAA AAAGATGTCA AAAGATGTAA
2050 TAACGGAAGG TAACCGAAGG TAACCGAAGG TAACAGAAGG TAACCGAAGG TAACAGAAGG TAACAGAAGG TAACCGAAGG TAACAGAAGG TAACCGAAGG
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 2051
AGATGGCCGG GGATGGTCGC GGATGGTCGC GGATGGTCGC GGATGGTCGC GGATGGTCGC GGATGGTCGC GGATGGTCGC GGATGGTCGC GGATGGTCGC
ATTAAATACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA ACTAAGTACT GA
Фиг. 1 (продолжение)
AtAHASL Bn_PM2 BllAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 1
MAAATTTTTT
MAAATS
MAAATS....
MAAATS
MAAATS....
MAAATS
MAAATS
MAAATS.... MAAATS.... MAAATS....
SSSISFSTKP SSPISLTAKP SSPISLTAKP SSPISLTAKP SSPISLTAKP SSPISFTAKP SSPISFTAKP SSPISLTAKP SSPISFTAKP SSPISLTAKP
SPSSSKSPLP S...SKSPLP S...SKSPLP S...SKSPLP S...SKSPLP S...SKSLLP S...SKSLLP S...SKSPLP S...SKSLLP S...SKSPLP
ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL ISRFSLPFSL
NPNKSSSSSR TPQKPSS... TPQKPSS... TPQKDSS... TPQKPSS... IPQKPSS...
XPQKPSS...
TPQKPSS... IPQKPSS... TPQKPSS...
1O0
AtAHASL
RRGIKSSSPS
SISAVLNTTT
NVTTTPSPTK
PTKPETFISR
FAPDQPRKGA
Bn_PH2
....RLHRPL
AISAVLHSPV
NVA.
. . РЕК
TDKIKTFISR
YAPDEPRKGA
BnAHASLlA
RLHRPL
AISAVLNSPV
NVA.
. . РЕК
TDKIKTFISR
YAPDEPRKGA
BnAHASLlC
....RLHRPL
AISAVLNSPV
NVAP
PSPEK
TDKNKTFVSR
YAPDEPRKGA
BjAHASLlA
....RLHRPL
AISAVLNSPV
NVA.
. , РЕК
TDKIKTFISR
YAPDEPRKGA
BjAHASLlB
. . ..LRHSPL
SISAVLNTPV
NVAP.PSРЕК
IEKNKTFISR
YAPDEPRKGA
J04E-0044
....LRHSPL
SISAVLHTPV
HVAP
PSPEK
IEKNKTFISR
YAPDEPRKGA
J04E-0122
....RLHRPL
AISAVLHSPV
NVA.
. , РЕК
TDKIKTFISR
YAPDEPRKGA
J04E-0130
....LRHSPL
SISAVLHTPV
NVAP
PSPEK
IEKNKTFISR
YAPDEPRKGA
J04E-0139
RLHRPL
AISAVLNSPV
NVA.
. . РЕК
TDKIKTFISR
YAPDEPRKGA
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-Q044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 101
DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ DILVEALERQ
GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG GVETVFAYPG
GASMEIHQAL GASMEXHQAJj GASMEIHQAL GASMEIHQAL GASMEIHQAL GASMEIHQAL GASMEIHQAL GTSMEIHQAL GTSMEIHQAL GASMEIHQAL
TRSSSIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL TRSSTIRNVL 150
PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA PRHEQGGVFA
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0I30 J04E-0139 151
AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK AEGYARSSGK
PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP PGICIATSGP
GATNLVSGLA GATNLVSGIA GATNLVSGLA GATNLVSGLA GATNLVSGLA GATNLVSGLA GATNLVSGLA GATNLVSGLA GATNLVSGLA GATNLVSGLA
DALLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV DAMLDSVPLV 200
AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM AITGQVPRRM
Фиг. 2
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB JO4E-O044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 201
IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP IGTDAFQETP
IVEVTRSITK IVEVTESITK IVEVTESITK IVEVTRSITK IVEVTESITK IVEVTESITK IVEVTRSITK IVEVTRSITK IVEVTESITK IVEVTRSITK
HNYLVMDVED HNYLVMDVDD HNYLVMBVDD HNYLVMDVDD HNYLVMDVDD HNYLVMDVDD HNYLVMDVDD HNYLVMDVDD HNYLVMDVDD HNYLVHDVDD
IPRIIEEAFF
IPRIVQEAFF
IPRIVQEAFF
IPRIVQEAFF
IPRIVQEAFF
IPRIVQEAFF :
IPRIVQEAFF
IPRIVQEAFF
IPRIVQEAFF
IPRIVQEAFF
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 251
LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ LVDVPKDIQQ
QLAIPNWEQA QIAIPNWDQP QLAIPNWDQP QLAIPNWDQP QLAIPHWDQP QLAIPHWDQP QLAIPHWDQP QLAIPNWDQP QLAIPNWDQP QLAIPNWDQP
MRLPGYMSRM MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL MRLPGYMSRL
PKPPEDSHLE PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG PQPPEVSQLG 300
QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK QIVRLISESK
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-013 0 JQ4E-0139 301
KPVLYVGGGC RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS RPVLYVGGGS
LHSSDELGRP LHSSEELGRF LNSSEELGRF LNSSEELGRF LNSSEELGRF LNSSDELGRF LHSSDELGRF LHSSEELGRF LNSSDELGRF LHSSEELGRF
VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS VELTGIPVAS
TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC TLMGLGSYPC 350
DDELSLHMLG NDELSLQMLG NDELSLQMLG HDELSLQMLG HDELSLQMLG NDELSLQMLG NDELSLQMLG HDELSLQMLG NDELSLQMLG NDELSLQMLG
AtAHASL ВПРМ2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-OO44 J04E-O122 J04E-0130 J04E-0139 351
MHGTVYAHYA MHGTVYAHYA MHGTVYAHYA MHGTVYAHYA MHGTVYAHYA MHGTVYAHYA MHGTVYANYA MHGTVYAHYA MHGTVYAHYA MHGTVYAHYA
VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF VEHSDLLLAF
GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG GVRFDDRVTG
KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK KLEAFASRAK 400
IVHIDJDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE IVHIDIDSAE
Фиг. 2 (продолжение)
AtAHASL ВП_РМ2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 401
IGKNKTPHVS IGKHKTPHVS IGKHKTPHVS IGKHKTPHVS IGKHKTPHVS IGKNKTPHVS IGKNKTPHVS IGKNKTPHVS IGKNKTPHVS IGKNKTPHVS
VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ VCGDVKLALQ
GMHKVLENRA GMHKVLENRA GMHKVLEHRA GMHKVLEHRA GMHKVLEHRA GMHKVLEHRA GMNKVLENRA GMHKVLENRA GMHKVLENRA GMHKVLENRA
EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW EELKLDFGVW 450
RNELHVQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK RSELSEQKQK
AtAHASL ВП_РМ2 BllAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 451
FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE FPLSFKTFGE
A1PPQYAIKV AIPPQYAIQV AIPPQYAIQV AIPPQYAIQI AIPPQYAIQV AIPPQYAIQV AIPPQYAIQV AIPPQYAIQV AIPPQYAIQV AIPPQYAIQV
LDELTDGKAI LDELTQGKA1 LDELTQGKAI LDELTEGKAI LDELTQGKAI LDELTDGKAI LDELTDGKAI LDELTQGKAI LDELTDGKAI LDELTQGKAI
ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM ISTGVGQHQM 500
WAAQFYNYKK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK WAAQFYKYRK
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 501
PRQWLSSGGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL PRQWLSSSGL
GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA GAMGFGLPAA
IGASVAHPDA IGASVANPDA IGASVAHPDA IGASVANPDA IGASVANPDA IGASVANPDA IGASVAHPDA IGASVAHPDA IGASVANPDA IGASVANPDA
IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS IWDIDGDGS 550
FIMHVQELAT FIMHVQELAT FIMHVQELAT FIMNVQELAT FIMNVQELAT FIMHVQELAT FIMHVQELAT FIMNVQELAT FIMNVQELAT FIMNVQELAT
AtAHASL Bn_PM2 BnAHASLlA BnAHASLlC BjAHASLlA BjAHASLlB J04E-0044 J04E-0122 J04E-0130 J04E-0139 551
IRVBQLPVKI IRVEHLPVKI IRVSNLPVKI IRVEHLPVKI IRVEMLPVKI IRVEHLPVKV IRVESLPVKV IRVEHLPVKI IRVEMLPVKV IRVEHLPVKI
LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM LLLNNQHLGM
VMQWEDRFYK VMQLEDRFYK VMQWEDRFYK VMQWEDRFYK VMQWEDRFYK VMQWEDRFYK VMQWEDRFYK VMQWEDRFYK VMQWEDRFYK VMQWEDRFYK
ANRAHTFLGD ANRAHTYLGD ANRAHTYLGD ANRAHTYLGD ANRAHTYLGD ANRAHTYLGD ANRAHTYLGD ANRAHTYLGD ANRAHTYLGD ASRAHTYLGD 600
PAQEDEIFPN PARENEIFPN PARENEIFPN PARENEIFPN PARENEIFPN PAKENEIFPN PAKENSIFPN PARENEIFPN PAKENEIFPN PARENEIFPN
1. В. juncea Arid (контроль - отсутствие устойчивости к гербицидам) 2. В. napus Коммерческий CLEARFIELD Контроль (РМ1/РМ2) 3. В. juncea J04E-0044 (bR) 4. B.juncea J03Z-16413(PM2) 5. В. juncea XJ04-057-034 F5 (bR/PM2) 6. В. juncea J05Z-00791 (bR/PM2) Фиг. 3
SEQ ID NO:
Тип
юследовагельносте
Номенклатура гена AHAS (номенклатура аминокислотных положений A. thaliana)
Сокращенное название мутации/ код линии или дикий ТИП
белок
AtAHASL
A. tfla/iarre дикого типа
белок
BJAHASL1B-S653(A1}N
BR(638)/J04E-0044
белок
BjAHASL1A-S653(At)N
AR(638)/J04E-0139
белок
BjAHASL1B-A122(At)T
A107T/J04E-0130
белок
BjAHASL1A-A122(At)T
A104T/J04E-0122
белок
BnAHASL!A-W574(At)L
РМ2 (557)
белок
BjAHASLlA
B.juncea дикого типа
белок
BjAHASLlB
B.juncea дикого типа
белок
BnAHASLlA
В. napus дикого типа
белок
BnAHASHC
В. napus дикого типа
ДНК
AtAHASL
A. tfia/iena дикого типа
ДНК
BjAHASL1B-S653{At)N
BR(638)/J04E-0044
ДНК
BjAHASL1A-S653(At)N
AR(638)/J04E-0139
ДНК
BjAHASLI B-A122(At)T
A107T/J04E-0130
ДНК
BjAHASL1A-A122(At)T
A104T/J04E-0122
ДНК
BnAHASLI A-W574(A1)L
РМ2 {557)
ДНК
BjAHASLlA
B. juncea дикого типа
ДНК
BjAHASLlB
B. juncea дикого типа
ДНК
BnAHASLlA
В. napus дикого типа
Днк
BnAHASLlC
В. napus дикого типа
% I I I I I I I I III I III
Шкала фитотоксичности (от 0 до 9): где 0 означает отсутствие повреждения растений, и 9 означает тяжелый некроз растения, приводящий к гибели растения; п означает количество отдельных растений, оцениваемых в случае каждого мутантного/зиготного генотипа
Фиг. 7
Шкала фитотоксичности (от 0 до 9): где 0 означает отсутствие повреждения растений, и 9 означает тяжелый некроз растения, приводящий к гибели растения Фиг. 8
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025843
025843
- 1 -
- 1 -
025843
025843
- 1 -
- 1 -
025843
025843
- 1 -
- 1 -
025843
025843
- 2 -
- 1 -
025843
025843
- 4 -
- 3 -
025843
025843
- 39 -
- 39 -
025843
025843
- 40 -
- 40 -
025843
025843
- 43 -
- 43 -
025843
025843
- 43 -
- 43 -
025843
025843
- 43 -
- 43 -
025843
025843
- 44 -
- 44 -
025843
025843
- 44 -
- 44 -
025843
025843
- 45 -
- 45 -
025843
025843
- 45 -
- 45 -
025843
025843
- 45 -
- 45 -
025843
025843
- 45 -
- 45 -
025843
025843
- 46 -
- 46 -
025843
025843
- 46 -
- 46 -
025843
025843
- 47 -
- 47 -
025843
025843
- 47 -
- 47 -
025843
025843
- 49 -
- 49 -
025843
025843
- 49 -
- 49 -
025843
025843
- 50 -
- 50 -
025843
025843
- 50 -
- 50 -
025843
025843
- 51 -
- 51 -
025843
025843
- 51 -
- 51 -
025843
025843
- 51 -
- 51 -
025843
025843
- 51 -
- 51 -
025843
025843
- 51 -
- 51 -
025843
025843
- 51 -
- 51 -
025843
025843
- 52 -
- 52 -
025843
025843
- 52 -
- 52 -
025843
025843
- 52 -
- 52 -
025843
025843
- 52 -
- 52 -
025843
025843
- 56 -
- 56 -
025843
025843
- 56 -
- 56 -
025843
025843
- 56 -
- 56 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 60 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 61 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 63 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 63 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 63 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 63 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 64 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 64 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 64 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 64 -
025843
025843
Фиг. 1 (продолжение)
- 64 -
Фиг. 1 (продолжение)
- 64 -
025843
025843
- 65 -
Фиг. 2 (продолжение)
- 66 -
025843
025843
- 65 -
Фиг. 2 (продолжение)
- 66 -
025843
025843
- 65 -
Фиг. 2 (продолжение)
- 66 -
025843
025843
- 65 -
Фиг. 2 (продолжение)
- 66 -
025843
025843
- 65 -
Фиг. 2 (продолжение)
- 66 -
025843
025843
- 68 -
- 68 -