[RU]

1. Вакцина, включающая выделенный белок Hyr1 Candida (SEQ ID NO: 1) или его иммуногенный фрагмент, для использования в способе лечения или профилактики инфекции Acinetobacter у млекопитающего.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что упомянутый белок Hyr1 Candida или его фрагмент получен из Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata или Candida parapsilosis.

3. Вакцина по п.1 или 2, отличающаяся тем, что упомянутая инфекция является результатом Acinetobacter baummani.

4. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является фрагмент N-концевой области упомянутого белка Hyr1 Candida.

5. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенный фрагмент включает аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, или фрагмент Hyr1p, показанный в табл. 1 или 2.

6. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является один или больше из фрагментов Hyr1p, показанных в табл. 1 или 2, или его иммуногенный фрагмент.

7. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутую вакцину вводят подкожно, как бустер-дозу, или она включает иммуностимулирующий адъювант (такой как квасцы).

8. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутый Hyr1p или его иммуногенный фрагмент получают рекомбинантно (так как в Saccharomyces cerevisiae) или синтезируют химически.

9. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или ее вариантную последовательность, имеющую до трех замен, делеций или добавлений к упомянутой аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 3-10, причем упомянутый полипептид не включает больше 20 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2.

10. Полипептид по п.9, включающий аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 3-10.

11. Полипептид по п.9 или 10, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанного полипептида состоит из 14-20 аминокислот.

12. Полипептид по любому одному из пп.9-11, отличающийся тем, что N-концевым аминокислотным остатком или С-концевым аминокислотным остатком упомянутого полипептида является цистеин; причем аминокислотная последовательность указанного полипептида включает аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 11-18; или аминокислотная последовательность упомянутого полипептида состоит из аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 11-18.

13. Выделенный конъюгат, включающий полипептид по любому одному из пп.9-12 и носитель.

14. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является гемоцианин фиссуреллы (KLH), CRM197 или токсоид столбняка.

15. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является фаг, дрожжи, вирус, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица или отличающийся тем, что упомянутым конъюгатом является рекомбинантный составной белок.

16. Вакцина, включающая иммуногенное количество полипептида по любому одному из пп.9-12 или конъюгата по любому одному из пп.13-15 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

17. Вакцина по п.16, включающая смесь разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.

18. Вакцина по любому одному из пп.16, 17, отличающаяся тем, что полипептид или конъюгат получен путем синтеза или отличающаяся тем, что упомянутый полипептид или конъюгат получен рекомбинантным путем.

19. Вакцина по любому одному из пп.16-18 для использования при вакцинации млекопитающего (например, человека) против кандидоза или против Acinetobacter.

20. Вакцина по п.19, отличающаяся тем, что она вводится внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

21. Способ вакцинации млекопитающего против кандидоза, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.

22. Способ вакцинации млекопитающего против Acinetobacter, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.

23. Способ получения химерной вакцины, включающий следующие этапы: (a) получение фага, дрожжей или вируса; (b) введение в упомянутый фаг, дрожжи или вирус молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому одному из пп.9-12 или 13-15; (c) экспрессия упомянутого полипептида в упомянутом фаге, дрожжах или вирусе; (d) выделение упомянутого фага, дрожжей или вируса этапа (с), включающего указанный экспрессированный полипептид; и (e) добавление фармацевтически приемлемого наполнителя к указанному выделенному фагу, дрожжам или вирусу этапа (d).

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что полипептид содержится на поверхности упомянутого фага, дрожжей или вируса после этапа (с).

25. Выделенное моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15.

26. Диагностическая композиция для диагностики кандидоза или инфекции Acinetobacter, включающая антитело по п.25.

27. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики кандидоза или инфекции Acinetobacter, включающая антитело по п.25.

28. Фармацевтическая композиция, включающая поликлональные антитела, которые связываются с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15 или которые связываются со смесью разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.

29. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза.

30. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против Acinetobacter.

31. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

33. Способ по п.31 или 32, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

34. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против Acinetobacter, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

36. Способ по п.34 или 35, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

37. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид HYR1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO:12), CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18), отличающаяся тем, что полипептид включает в длину менее чем 930 аминокислотных остатков.

38. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, выбранный из SEQ ID NO: 11-18.

39. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что упомянутый полипептид включает в длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.

40. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.37.

41. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.37.

42. Набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий по меньшей мере один олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественник белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественник липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной мембранный белок AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.

43. Выделенный полипептид HYR1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO: 12), CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18), отличающийся тем, что полипептид имеет длину меньше чем 930 аминокислотных остатков.

44. Выделенный полипептид HYR1 по п.43 отличающийся тем, что упомянутый фрагмент полипептида имеет длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.

45. Выделенный полипептид HYR1 по п.43, отличающийся тем, что полипептид может быть связан антителом к HYR1.

46. Выделенный полипептид HYR1 по п.43, отличающийся тем, что он является иммуногенным.

47. Выделенный полипептид HYR1 по п.46, отличающийся тем, что он способен вызывать выработку антитела к HYR1 у пациента.

48. Составной белок, включающий полипептид, соединенный с носителем белка, меткой системы "антиген-антитело" или линкерной последовательностью, отличающийся тем, что указанный полипептид включает полипептид HYR1 по любому одному из пп.43-47.

49. Выделенное белковое антитело к Acinetobacter, имеющее специфическую реактивность с полипептидом HYR1 по любому одному из пп.43-47, белком 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белком теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактором элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественником белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественником липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительным к глюкозе порином (подобным OprB) Acinetobacter baumannii, составным мембранным белком AdeA Acinetobacter baumannii, белком деления клеток Acinetobacter baumannii или белком деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.

50. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является моноклональным.

51. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является поликлональным.

52. Линия клеток, вырабатывающая моноклональное антитело по п.50.

53. Набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий выделенное белковое антитело к Acinetobacter по пп.43-47.

54. Способ обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты Acinetobacter в пробе, включающий контакт упомянутой пробы с двумя или больше олигонуклеотидами, включающими от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii, амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты и обнаружение указанной амплификации.

55. Способ по п.54, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют при помощи полимеразной цепной реакции.

56. Способ обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий контакт пробы с белковым антителом к Acinetobacter по п.49 и обнаружение присутствия специфического связывания антитела с пробой, этим обнаруживая присутствие Acinetobacter в указанной пробе.

57. Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемый носитель и белковое антитело к Acinetobacter по любому одному из пп.49-51 или белковое антитело к HYR1, имеющее специфическую реактивность с белком HYR1 (SEQ ID NO: 9) или его фрагментом.

58. Композиция вакцины для иммунизации пациента против инфекции Acinetobacter, включающая фармацевтически приемлемый носитель и иммуногенное количество полипептида HYR1 по любому одному из пп.43-47, составного белка по п.48, белка HYR1 (SEQ ID NO: 9) или его фрагмента, белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii или его фрагмента, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii или его фрагмента, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii или его фрагмента, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii или ее фрагмента, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii или его фрагмента, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или его фрагмента или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii или его фрагмента.

59. Композиция вакцины по п.58, кроме того, включающая адъювант.

60. Способ лечения или профилактики инфекции Acinetobacter у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.28 или композиции вакцины по п.57.

61. Способ по п.60, кроме того, включающий совместное введение антибиотика.

62. Способ диагностики инфекции Acinetobacter у пациента, включающий следующие этапы: (a) получение пробы для проверки от пациента; (b) контакт упомянутой пробы со средством, которое может связывать выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественник белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественник липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной мембранный белок AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii, или полипептид HYR1 по п.41 в подходящих условиях, обеспечивающих специфическое связывание указанного средства с нуклеиновой кислотой или полипептидом; и (с) сравнение степени специфического связывания в пробе со степенью специфического связывания в контрольной пробе, причем повышенное или пониженное связывание в упомянутой пробе указывает на инфекцию Acinetobacter.

63. Способ по п.62, отличающийся тем, что упомянутым средством является белковое антитело к Acinetobacter по п.48 или олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.

(57) Реферат / Формула:

1. Вакцина, включающая выделенный белок Hyr1 Candida (SEQ ID NO: 1) или его иммуногенный фрагмент, для использования в способе лечения или профилактики инфекции Acinetobacter у млекопитающего.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что упомянутый белок Hyr1 Candida или его фрагмент получен из Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata или Candida parapsilosis.

3. Вакцина по п.1 или 2, отличающаяся тем, что упомянутая инфекция является результатом Acinetobacter baummani.

4. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является фрагмент N-концевой области упомянутого белка Hyr1 Candida.

5. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенный фрагмент включает аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, или фрагмент Hyr1p, показанный в табл. 1 или 2.

6. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является один или больше из фрагментов Hyr1p, показанных в табл. 1 или 2, или его иммуногенный фрагмент.

7. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутую вакцину вводят подкожно, как бустер-дозу, или она включает иммуностимулирующий адъювант (такой как квасцы).

8. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутый Hyr1p или его иммуногенный фрагмент получают рекомбинантно (так как в Saccharomyces cerevisiae) или синтезируют химически.

9. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или ее вариантную последовательность, имеющую до трех замен, делеций или добавлений к упомянутой аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 3-10, причем упомянутый полипептид не включает больше 20 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2.

10. Полипептид по п.9, включающий аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 3-10.

11. Полипептид по п.9 или 10, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанного полипептида состоит из 14-20 аминокислот.

12. Полипептид по любому одному из пп.9-11, отличающийся тем, что N-концевым аминокислотным остатком или С-концевым аминокислотным остатком упомянутого полипептида является цистеин; причем аминокислотная последовательность указанного полипептида включает аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 11-18; или аминокислотная последовательность упомянутого полипептида состоит из аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 11-18.

13. Выделенный конъюгат, включающий полипептид по любому одному из пп.9-12 и носитель.

14. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является гемоцианин фиссуреллы (KLH), CRM197 или токсоид столбняка.

15. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является фаг, дрожжи, вирус, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица или отличающийся тем, что упомянутым конъюгатом является рекомбинантный составной белок.

16. Вакцина, включающая иммуногенное количество полипептида по любому одному из пп.9-12 или конъюгата по любому одному из пп.13-15 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

17. Вакцина по п.16, включающая смесь разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.

18. Вакцина по любому одному из пп.16, 17, отличающаяся тем, что полипептид или конъюгат получен путем синтеза или отличающаяся тем, что упомянутый полипептид или конъюгат получен рекомбинантным путем.

19. Вакцина по любому одному из пп.16-18 для использования при вакцинации млекопитающего (например, человека) против кандидоза или против Acinetobacter.

20. Вакцина по п.19, отличающаяся тем, что она вводится внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

21. Способ вакцинации млекопитающего против кандидоза, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.

22. Способ вакцинации млекопитающего против Acinetobacter, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.

23. Способ получения химерной вакцины, включающий следующие этапы: (a) получение фага, дрожжей или вируса; (b) введение в упомянутый фаг, дрожжи или вирус молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому одному из пп.9-12 или 13-15; (c) экспрессия упомянутого полипептида в упомянутом фаге, дрожжах или вирусе; (d) выделение упомянутого фага, дрожжей или вируса этапа (с), включающего указанный экспрессированный полипептид; и (e) добавление фармацевтически приемлемого наполнителя к указанному выделенному фагу, дрожжам или вирусу этапа (d).

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что полипептид содержится на поверхности упомянутого фага, дрожжей или вируса после этапа (с).

25. Выделенное моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15.

26. Диагностическая композиция для диагностики кандидоза или инфекции Acinetobacter, включающая антитело по п.25.

27. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики кандидоза или инфекции Acinetobacter, включающая антитело по п.25.

28. Фармацевтическая композиция, включающая поликлональные антитела, которые связываются с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15 или которые связываются со смесью разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.

29. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза.

30. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против Acinetobacter.

31. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

33. Способ по п.31 или 32, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

34. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против Acinetobacter, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.

36. Способ по п.34 или 35, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.

37. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид HYR1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO:12), CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18), отличающаяся тем, что полипептид включает в длину менее чем 930 аминокислотных остатков.

38. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, выбранный из SEQ ID NO: 11-18.

39. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что упомянутый полипептид включает в длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.

40. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.37.

41. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.37.

42. Набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий по меньшей мере один олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественник белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественник липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной мембранный белок AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.

43. Выделенный полипептид HYR1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO: 12), CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18), отличающийся тем, что полипептид имеет длину меньше чем 930 аминокислотных остатков.

44. Выделенный полипептид HYR1 по п.43 отличающийся тем, что упомянутый фрагмент полипептида имеет длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.

45. Выделенный полипептид HYR1 по п.43, отличающийся тем, что полипептид может быть связан антителом к HYR1.

46. Выделенный полипептид HYR1 по п.43, отличающийся тем, что он является иммуногенным.

47. Выделенный полипептид HYR1 по п.46, отличающийся тем, что он способен вызывать выработку антитела к HYR1 у пациента.

48. Составной белок, включающий полипептид, соединенный с носителем белка, меткой системы "антиген-антитело" или линкерной последовательностью, отличающийся тем, что указанный полипептид включает полипептид HYR1 по любому одному из пп.43-47.

49. Выделенное белковое антитело к Acinetobacter, имеющее специфическую реактивность с полипептидом HYR1 по любому одному из пп.43-47, белком 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белком теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактором элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественником белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественником липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительным к глюкозе порином (подобным OprB) Acinetobacter baumannii, составным мембранным белком AdeA Acinetobacter baumannii, белком деления клеток Acinetobacter baumannii или белком деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.

50. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является моноклональным.

51. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является поликлональным.

52. Линия клеток, вырабатывающая моноклональное антитело по п.50.

53. Набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий выделенное белковое антитело к Acinetobacter по пп.43-47.

54. Способ обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты Acinetobacter в пробе, включающий контакт упомянутой пробы с двумя или больше олигонуклеотидами, включающими от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii, амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты и обнаружение указанной амплификации.

55. Способ по п.54, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют при помощи полимеразной цепной реакции.

56. Способ обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий контакт пробы с белковым антителом к Acinetobacter по п.49 и обнаружение присутствия специфического связывания антитела с пробой, этим обнаруживая присутствие Acinetobacter в указанной пробе.

57. Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемый носитель и белковое антитело к Acinetobacter по любому одному из пп.49-51 или белковое антитело к HYR1, имеющее специфическую реактивность с белком HYR1 (SEQ ID NO: 9) или его фрагментом.

58. Композиция вакцины для иммунизации пациента против инфекции Acinetobacter, включающая фармацевтически приемлемый носитель и иммуногенное количество полипептида HYR1 по любому одному из пп.43-47, составного белка по п.48, белка HYR1 (SEQ ID NO: 9) или его фрагмента, белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii или его фрагмента, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii или его фрагмента, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii или его фрагмента, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii или ее фрагмента, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii или его фрагмента, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или его фрагмента или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii или его фрагмента.

59. Композиция вакцины по п.58, кроме того, включающая адъювант.

60. Способ лечения или профилактики инфекции Acinetobacter у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.28 или композиции вакцины по п.57.

61. Способ по п.60, кроме того, включающий совместное введение антибиотика.

62. Способ диагностики инфекции Acinetobacter у пациента, включающий следующие этапы: (a) получение пробы для проверки от пациента; (b) контакт упомянутой пробы со средством, которое может связывать выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественник белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественник липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной мембранный белок AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii, или полипептид HYR1 по п.41 в подходящих условиях, обеспечивающих специфическое связывание указанного средства с нуклеиновой кислотой или полипептидом; и (с) сравнение степени специфического связывания в пробе со степенью специфического связывания в контрольной пробе, причем повышенное или пониженное связывание в упомянутой пробе указывает на инфекцию Acinetobacter.

63. Способ по п.62, отличающийся тем, что упомянутым средством является белковое антитело к Acinetobacter по п.48 или олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.

---

Евразийское 025831 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.02.28
(21) Номер заявки 201391199
(22) Дата подачи заявки 2012.09.14
(51) Int. Cl.
A61K36/06 (2006.01) C07K14/00 (2006.01) A61K38/00 (2006.01) C12Q1/68 (2006.01)
(54) КОМПОЗИЦИИ ИЗ ИУЮ-ПРОИЗВОДНЫХ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИМИ
(31) 61/534,734; 61/564,201
(32) 2011.09.14; 2011.11.28
(33) US
(43) 2014.04.30
(86) PCT/US2012/055604
(87) WO 2013/040478 2013.03.21
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЛОС-АНДЖЕЛЕС БИОМЕДИКАЛ РЕСЕРЧ ИНСТИТУТ ЭТ ХАРБОР-УКЛА МЕДИКАЛ ЦЕНТЕР (US)
(72) Изобретатель:
Ибрагим Ашраф С., Йиман Майкл Р., Эдвардс Джон Е. Джр., Ло Гуаньпиншэн, Фу Юэ (US)
(74) Представитель:
Ловцов С.В., Левчук Д.В. (RU)
(56) WO-A1-2011003085
KRAMER et al. How longido nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? A systematic review. BMC Infect. Dis. 2006, Vol. 6:130 PDF file pg. 1-8, Abstract, pg. 2, para 2, pg. 3, col. 1, para 2, pg. 4, col. 1, last para, Fig. 1, and Table 2, and pg. 5, col. 1, middle para and last para
PELEG et al. Prokaryote-eukaryote interactions identified by using Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, vol. 105(38), p. 14585-90. Entire documentation, especially Abstract
CHOI et al. Acinetobacter baumannii invades epithelial cells and outer membrane protein A mediates interactions with epithelial cells. BMC Microbiol. 2008, Vol. 8: 216. PDF file: pg. 1-11, Abstract, pg. 2, middle para, pg. 3, Fig. 1, and pg. 9, col. 1, last para
NCBI_YP_001084998, putative outer membrane protein [Acinetobacter baumannii ATCC 17978] 29 May 2010 [online]. [Retrieved on 2012.11.27]. Retrieved from the Internet Definition, and Reference
SMITH et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes Dev. 2007, Vol. 21(5), p. 601-14 pg. 605, Fig. 3, pg. 608, Table 1, and pg. 613, col. 1, para 4
SOARES et al. 2-DE analysis indicates that Acinetobacter baumannii displays a robust and versatile metabolism. Proteome Sci. 2009, Vol. 7:37. PDF file: pg. 1-10. Abstract; and pg. 6, para 1
US-A1-20100150942
Заявление об исследованиях, финансируемых Федеральным Правительством
Изобретение было сделано при поддержке правительства по грантам Министерства здравоохранения и социальных услуг R01 AI19990, R01 AI063382, R01 AI063503, R03 AI083251 и R21 AI082414. Правительство США имеет определенные права на настоящее изобретение.
Область техники
Изобретение относится в общем к композициям и способам обнаружения, лечения и профилактики инфекционных заболеваний у пациента.
Предпосылки для создания изобретения
Вид Candida, третья наиболее распространенная причина инфекций крови, связанных со здравоохранением, приводит приблизительно к 60000 случаев кандидоза, распространяющегося в крови, в год в США, вызывая многомиллиардные расходы на здравоохранение. Несмотря на текущее состояние противогрибковой терапии смертность остается неприемлемо высокой. Из-за растущей частоты угрожающего жизни кандидоза и высокой частоты неудачного лечения необходимы более эффективные стратегии профилактики и терапии.
Основным защитным механизмом организма против распространяющегося кандидоза является иммунологическое фагоцитарное уничтожение. Только фагоцитарные клетки способны непосредственно уничтожать Candida in vitro. Помимо этого, в течение 30 мин после внутривенной инокуляции Candida у мышей, кроликов, собак или людей дрожжи сохраняются в ретикулоэндотелиальной системе, особенно в печени. Печень, богатая макрофагами Купфера, способна очистить 99,9% дрожжей в портальной системе за один прогон, подчеркивая эффективность фагоцитарных защитных механизмов против грибка. Следовательно, устойчивость С. albicans к фагоцитарному уничтожению является важной вирулентной функцией организма.
Белки, прикрепленные к гликозилфосфатидилинозитолу (ГФИ) поверхности клеток находятся на критической поверхности контакта между патогенным микроорганизмом и иммунной системой, что делает эти белки вероятными участниками взаимодействия между иммунной системой и патогенным микроорганизмом.
Идентификация эффекторов в регуляторных путях организма, которые способствуют вирулентности, дает возможность для терапевтического вмешательства с помощью способов или композиций, которые лучше по качеству, чем современные противогрибковые вещества. Идентификация белков клеточных поверхностей или гифальных белков, которые отрицательно влияют на регуляторный путь, вовлеченный в вирулентность, является особенно перспективной, поскольку определение характеристик белка позволяет применить иммунотерапевтические способы, которые, вероятно, лучше по качеству или действуют совместно с существующими противогрибковыми средствами в борьбе с кандидозной инфекцией.
Вирулентность С. albicans регулируется несколькими предполагаемыми факторами вирулентности, из которых адгезия к составляющим организма-носителя и способность трансформироваться из дрожжей в гифы являются одними из наиболее критических при определении патогенности. Хотя существуют сильные противогрибковые средства, которые являются бактерицидными для Candida, смертность, относимая на счет кандидемии, составляет приблизительно 38%, даже при лечении сильными противогрибковыми средствами, такими как амфотерицин В. Кроме того, существующие средства, такие как амфоте-рицин В, стремятся к проявлению нежелательной токсичности. Хотя могут быть разработаны дополнительные противогрибковые средства, которые менее токсичные, чем амфотерицин В, маловероятно, что будут разработаны средства, которые более сильные. Поэтому пассивная или активная иммунотерапия для лечения или профилактики распространяющегося кандидоза является перспективной альтернативой стандартной противогрибковой терапии.
Летальные инфекции стойких к антибиотикам патогенных бактерий, как и инфекции, вызываемые Candida, становятся все более частыми. Более того, риск заражения этими летальными инфекциями чрезмерно высокий для многих пациентов, подверженных ему, которые ежегодно находятся в отделениях интенсивной терапии, а также для солдат, находящихся на передней линии зон боевых действий. Виды Acinetobacter часто являются источником инфекции для госпитализированных пациентов и солдат, в частности вид Acinetobacter baumannii. Acinetobacter является родом грамотрицательных бактерий, принадлежащих к гаммапротеобактериям. Виды Acinetobacter способствуют минерализации ароматических соединений в почве. К сожалению, в настоящее время не существует технологии, которая препятствует инфекциям, вызываемым Acinetobacter, помимо стандартного мытья рук и других способов избежать инфекции в больничной обстановке.
Активная и пассивная иммунизация пациентов против стойких к антибиотикам патогенных бактерий представляется удобным и потенциально экономичным способом попытки борьбы с этими инфекциями. Однако выявление и разработка эффективных антигенных мишеней для осуществления пассивной и активной иммунизации против бактерий в общем представляет серьезную трудность из-за огромного массива видов бактерий. Выявление соединений, которые влияют на вирулентность конкретных семейств или родов бактерий, дает возможность разрабатывать новые терапевтические вмешательства. В частности, распознавание повсеместных белков клеточных поверхностей, которые присутствуют на се
мействах или родах бактерий, которые могут быть идентифицированы иммунной системой человека, позволят разработать способы иммунотерапии. Эти способы вероятно будут лучше, чем антибиотики и будут действовать совместно с последними для профилактики или лечения бактериальных инфекций.
Соответственно, существует потребность в соединениях и способах, которые снижают риск инфекционных заболеваний, связанных с Candida, и бактериальных инфекций и обеспечивают эффективную терапию. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность и предлагает связанные с этим преимущества.
Раскрытие изобретения
Было установлено, что фрагменты белка Hyr1 поверхностей клеток Candida помогают иммунизировать пациента от инфекций Candida. Также было установлено, что белок Hyr1 также борется с инфекциями Acinetobacter.
Соответственно, в первом аспекте изобретение предлагает выделенный полипептид, включающий любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 3-10, или вариант последовательности, имеющий до трех замен, делеций или добавлений к любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 3-10, причем полипептид не включает более чем 20 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления полипептид включает любую одну аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 3-10. В некоторых вариантах осуществления полипептид состоит из 14-20 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления N-концевым аминокислотным остатком или С-концевым аминокислотным остатком полипептида является цистеин. В других вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида включает или состоит из любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 11-18.
Во втором аспекте изобретение предлагает выделенный конъюгат, включающий полипептид первого аспекта, конъюгированный с носителем. Например, носителем может быть гемоцианин фиссуреллы (KLH), CRM197, или токсоид столбняка, или фаг, дрожжи, вирус, виросома, или рекомбинантная вирусоподобная частица. В некоторых вариантах осуществления конъюгатом является рекомбинантный составной белок.
В третьем аспекте изобретение предлагает вакцину, включающую иммуногенное количество полипептида первого аспекта или конъюгата второго аспекта и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах осуществления вакцина включает смесь разных полипептидов первого аспекта или конъюгатов второго аспекта. В некоторых вариантах осуществления вакцина, кроме того, включает адъ-ювант, например Альгидрогель. В некоторых вариантах осуществления полипептид первого аспекта или конъюгат второго аспекта получают синтетически или рекомбинантно. В некоторых вариантах осуществления вакцина предназначена для вакцинации млекопитающего, например человека, против кандидоза или вакцинации млекопитающего против Acinetobacter. В некоторых вариантах осуществления вакцина должна вводиться внутримышечно, подкожно или внутрикожно. В некоторых вариантах осуществления вакцинация, кроме того, включает введение бустер-дозы. В некоторых вариантах осуществления канди-дозом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кандидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой, или кандидозом является вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван Candida, таким как Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis или Candida tropicahs.
В четвертом аспекте изобретение предлагает способ вакцинации млекопитающего, например человека, против кандидоза, включающий введение млекопитающему вакцины третьего аспекта, этим вакцинируя млекопитающего против кандидоза или вакцинируя млекопитающего против Acinetobacter. В некоторых вариантах осуществления вакцину вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно. В некоторых вариантах осуществления введение кроме того включает введение бустер-дозы. В некоторых вариантах осуществления кандидозом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кан-дидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой или вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван Candida, таким как Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis или Candida tropicahs.
В пятом аспекте изобретение предлагает способ получения химерной вакцины, включающий следующие этапы: (а) получения фага, дрожжей или вируса; (b) введение в фаг, дрожжи или вирус молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид первого аспекта; (с) экспрессию полипептида в фаге, дрожжах или вирусе; (d) выделение фага, дрожжей или вируса с этапа (с), включая экспрессиро-ванный полипептид; и (е) добавление фармацевтически приемлемого наполнителя к выделенному фагу, дрожжам или вирусу с этапа (d). В некоторых вариантах осуществления полипептид проявляют на поверхности фага, дрожжей или вируса после этапа (с).
В шестом аспекте изобретение предлагает выделенное моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом первого аспекта или конъюгатом второго аспекта. В некоторых вариантах осуществления антитело является человеческим или гуманизированным или является химерным. В некоторых вариантах осуществления антитело получают рекомбинантно или синтезируют химически.
В седьмом аспекте изобретение предлагает диагностическую композицию, включающую антитело шестого аспекта.
В восьмом аспекте изобретение предлагает фармацевтическую композицию, включающую антите
ло шестого аспекта и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает смесь антител шестого аспекта с несколькими отдельными специфическими характеристиками.
В девятом аспекте изобретение предлагает фармацевтическую композицию, включающую поли-клональные антитела, которые связываются с полипептидом первого аспекта или конъюгатом второго аспекта, или которые связываются со смесью разных полипептидов первого аспекта или конъюгатов второго аспекта.
В некоторых вариантах осуществления восьмого или девятого аспекта фармацевтическая композиция предназначена для использования при пассивной иммунизации млекопитающего, например человека, против кандидоза или против Acinetobacter. Например, фармацевтическая композиция может быть введена внутримышечно, подкожно или внутрикожно. В некоторых вариантах осуществления кандидо-зом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кандидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой, такой как вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван Candida, таким как Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, или Candida tropicalis.
В десятом аспекте изобретение предлагает способ пассивной иммунизации млекопитающего, например человека, против кандидоза, включающий введение млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции восьмого или девятого аспекта, в результате чего млекопитающее иммунизируется против кандидоза или против Acinetobacter. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно или даже интраназально. В некоторых вариантах осуществления кандидозом является рассеянный кандидоз, например рассеянный в крови кандидоз, или кандидозом является кандидоз слизистой, такой как вагинальный кандидоз, или кандидоз вызван Candida, таким как Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis или Candida tropicalis.
В других аспектах изобретение предлагает раскрытые в настоящем документе композиции и способы, которые основаны, по меньшей мере, отчасти на выявлении того, что иммунная реакция, такая как антитела и другие механизмы, которые нацелены на полипептид Candida HYR1 и обеспечивают защиту от инфекции Acinetobacter, такой как Acinetobacter baumannii. Подходы активной или пассивной иммунизации, использующие полипептид HYR1 или специфические белки Acinetobacter baumannii, раскрытые в настоящем документе, подходят для защиты от инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, включая, но без ограничения, Acinetobacter baumannii. Некоторые виды использования композиций и способов, раскрытых в настоящем документе, включают пассивную вакцинацию пациентов с острыми рисками такой дозой антитела к HYR1, чтобы предотвратить приобретение инфекции Acinetobacter bau-mannii. Помимо этого, пациенты с активной инфекцией Acinetobacter baumannii могут получать лечение только этим антителом или в сочетании с другими противобактериальными средствами. Альтернативно, пациенты с риском развития таких инфекций, например военнослужащие, могут быть активно вакцинированы полипептидами HYR1 или специфическими полипептидами Acinetobacter baumannii, раскрытыми в настоящем документе, чтобы предотвратить такие инфекции.
В других аспектах изобретение в этом контексте предлагает пассивную или активную вакцинацию, как она раскрыта в настоящем документе, которая способна заметно уменьшить приобретение стойкой к лекарствам, летальной инфекции Acinetobacter baumannii. Поскольку в настоящее время нет антибиотиков с активностью против рода Acinetobacter, предотвращение таких инфекций имеет очень важное значение, помимо этого, вакцина и фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем документе, имеют потенциал действия против других инфекций, вызываемых грамотрицательными палочками, поскольку пассивные и активные стратегии, предлагаемые изобретением, действуют против ксеноантитела Candida albicans, которое имеет значительную структурную гомологию с антигенами к грамотрицатель-ным палочкам, включая таковые из вида Acinetobacter baumannii. Использование антигена не к Acineto-bacter для защиты против инфекции Acinetobacter дает крупное преимущество в борьбе с инфекцией.
Изобретение поэтому предлагает активную вакцинацию, подходящую для предотвращения инфекций у госпитализированных пациентов, с использованием полипептида HYR1 или его фрагмента или белков Acinetobacter baumannii, раскрытых в настоящем документе. Изобретение также предлагает способы и композиции для активной вакцинации, чтобы предотвратить инфекцию Acinetobacter у военнослужащих, что крайне желательно, поскольку Acinetobacter является одной из наиболее распространенных причин инфицирования ран в боевых условиях. Изобретение, кроме того, предлагает способы и композиции для пассивной иммунизации в качестве дополнительной терапии при активной инфекции с использованием антитела как поликлонального, так и моноклонального, действующего против полипептида HYR1 или белков Acinetobacter baumannii, раскрытых в настоящем документе. Кроме того, изобретение предлагает диагностический биомаркер, путем обнаружения антитела или ПЦР, чтобы определять присутствие Acinetobacter в инфицированных жидкостях или тканях. Изобретение также предлагает, что вышеуказанные применения могут быть распространены на другие медицински важные грамотрицатель-ные бактерии.
В других аспектах изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют специфические полипептиды HYR1 или их фрагменты, которые могут действовать как антигены для создания им
мунной реакции на грамотрицательные бактерии, включая бактерии рода Acinetobacter, например Acine-tobacter baumannii.
Например, в некоторых аспектах изобретения нуклеиновые кислоты изобретения кодируют полипептид HYR1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из одной или нескольких из SEQ ID NO: 3-10 или из одной или нескольких из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO: 12), CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18). Более того, в некоторых аспектах изобретения полипептид HYR1 может включать меньше чем 937, 936, 935, 934, 933, 932,
931, 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 690, 680, 670, 660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 320, 310, 300, 290, 280,
270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков в длину и может быть иммуногенным. В некоторых аспектах изобретения нуклеиновые кислоты изобретения не кодируют полипептид HYR1 SEQ ID NO: 1 или 2. В других аспектах нуклеиновые кислоты кодируют любую одну из SEQ ID NO: 3-10 или 11-18 отдельно или в сочетании.
Изобретение также предлагает варианты осуществления, в которых нуклеинокислотная последовательность кодирует больше чем одну аминокислотную последовательность в любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или SEQ ID NO: 11-18 отдельно или в сочетании. Например, нуклеинокислотная последовательность изобретения может кодировать две аминокислотные последовательности, например SEQ ID NO: 15 в сочетании с SEQ ID NO: 12 или, альтернативно, SEQ ID NO: 11 в сочетании с SEQ ID NO: 17, или, альтернативно, SEQ ID NO: 13 в сочетании с SEQ ID NO: 18. При этом понимается, что нуклеиновые кислоты изобретения могут кодировать две, три, четыре, пять, шесть, семь или все восемь аминокислотных последовательностей, выбираемых из SEQ ID NO: 11-18. При этом также понимается, что кодируемая аминокислотная последовательность необязательно будет непрерывной и может быть связана промежуточными спейсерными последовательностями, которые могут, например, позволять экспресси-рованному полипептиду представлять желательную аминокислотную последовательность или эпитоп для создания иммунной реакции.
В некоторых аспектах изобретения аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеиновыми кислотами изобретения, включает, по существу, такую же аминокислотную последовательность, которая содержится в любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или SEQ ID NO: 11-18. Например, аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности с любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или 11-18, причем полипептид может быть связан антителом к HYR1, раскрытым в настоящем документе. В других аспектах полипептид HYR1, экспрессированный нуклеиновыми кислотами изобретения, может быть иммуногенным и способным активировать создание антитела к HYR1 или иммуногенную реакцию у пациента.
После введения в разные системы экспрессии белков, известные специалистам в данной области, молекулы нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, подходят для получения полипептида (полипептидов) изобретения. Помимо этого, такие молекулы нуклеиновых кислот или их фрагменты могут быть помечены легко обнаруживаемым заместителем и использованы как гибридизационные пробники для анализа на наличие и/или количество грамотрицательных бактерий, таких как, например, Acinetobacter baumannii в пробе. Описанные здесь молекулы нуклеиновых кислот и их фрагменты также подходят для использования в качестве праймеров и/или шаблонов в реакции ПЦР для амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды изобретения или описанные здесь белки.
Изобретение также предлагает векторы, содержащие нуклеиновые кислоты изобретения. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны в данной области и включают векторы, способные экс-прессировать нуклеиновую кислоту, оперативно связываемую с регуляторной последовательностью или элементом, таким как участок промотера или участок энхансера, который способен регулировать экспрессию нуклеиновой кислоты. Подходящие экспрессирующие векторы включают векторы, которые могут воспроизводиться в эукаритических клетках и/или прокариотических клетках, и векторы, которые остаются эписомными или интегрируются в геном клетки-хозяина.
В других аспектах изобретение дополнительно предлагает выделенное белковое антитело к Acine-tobacter. "Белковое антитело к Acinetobacter" распознает по меньшей мере один белок или его фрагмент, который встречается в естественных условиях в Acinetobacter baumannii. Антитело изобретения к HYR1, которое имеет специфическую реактивность с полипептидом HYR1, раскрытым в настоящем документе, является одним примером белкового антитела к Acinetobacter. Как раскрыто в настоящем документе, были выявлены специфические белки Acinetobacter baumannii, которые связываются с антителами, выведенными против полипептида HYR1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. Эти белки Acinetobacter baumannii включают белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acine
tobacter baumannii, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter bauman-nii, трансмембрана предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной белок мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii. Белковое антитело изобретения к Acinetobacter может быть мо-ноклональным или поликлональным. Изобретение кроме того предлагает клеточные линии, вырабатывающие моноклональные антитела, имеющие специфическую реактивность с фрагментом HYR1, раскрытым в настоящем документе, белком 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком рецептора с сидерофорной активностью к железу Acine-tobacter baumannii, белком теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактором элонгации G Acineto-bacter baumannii, прекурсором белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, трансмембраной предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемым чувствительным к глюкозе порином (подобным OprB) Acinetobacter baumannii, составным белком мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белком деления клеток Acinetobacter baumannii или белком FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii.
В других аспектах изобретение кроме того предлагает способ диагностики инфекции Acinetobacter у пациента. Эти способы могут включать следующие этапы: (а) получение пробы для проверки от пациента; (b) контакт пробы со средством, которое может связывать выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует раскрытый здесь белок Acinetobacter или раскрытый здесь белок Acinetobacter в подходящих условиях; и (с) сравнение величины специфического связывания в пробе для проверки с величиной специфического связывания в контрольной пробе, причем повышенная или пониженная величина специфического связывания в пробе для проверки по сравнению с контрольной пробой диагностирует инфекцию Acinetobacter. Условия, используемые в способах изобретения, понимаются как позволяющие специфическое связывание средства с нуклеиновой кислотой или белком.
Как сказано в настоящем описании, белки Acinetobacter, кодируемые выделенными нуклеиновыми кислотами способа, включают белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acinetobacter bau-mannii, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, трансмембрана предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной белок мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii, или белок FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii.
Средства, которые могут быть использованы в способах изобретения, включают белковое антитело к Acinetobacter, которое раскрыто в настоящем документе, или олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной белок мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii.
Дополнительно изобретение предлагает олигонуклеотиды, включающие от 15 до 300 смежных нук-леотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка рецептора с сидерофорной активностью к железу Acineto-bacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii, прекурсора белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, трансмембраны предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемого чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного белка мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii. Используемый в настоящем описании термин "олигонуклеотид" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая включает по меньшей мере 15 смежных нуклеоти-дов из контрольной нуклеотидной последовательности и может включать по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20 или по меньшей мере 25 смежных нуклеотидов и часто включает по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, до 350 смежных нуклеотидов из контрольной нук-леотидной последовательности. Контрольной нуклеотидной последовательностью может быть смысловая цепь или антисмысловая цепь.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот изобретения могут быть использованы для разных диагностических и терапевтических применений. Например, выделенные молекулы нуклеиновых кислот изобретения могут быть использованы в качестве зондов и праймеров. Изобретение таким образом предлагает способы обнаружения нуклеиновой кислоты в пробе. Способы обнаружения нуклеиновой кисло
ты в пробе могут быть или качественными или количественными, по выбору. Например, присутствие, изобилие, целостность или структура нуклеиновой кислоты могут быть определены, по выбору, в зависимости от формата анализа и зонда, используемого для гибридизации или пары праймеров, выбранных для применения.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ обнаружения молекулы нуклеиновых кислот Acinetobacter в пробе, включающий контакт пробы с двумя или больше олигонуклеотидами, включающими от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter bauman-nii, белка рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii, прекурсора белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, трансмембраны предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемого чувствительного к глюкозе по-рина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного белка мембраны AdeA Acinetobacter bauman-nii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii, амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты и обнаружение упомянутой амплификации. В некоторых аспектах изобретения амплификацию выполняют, используя полимеразную цепную реакцию. Так, в некоторых аспектах изобретение предлагает набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий по меньшей мере один олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter bau-mannii, прекурсора белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, трансмембраны предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемого чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного белка мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii.
В некоторых вариантах осуществления изобретения также предложен набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий выделенное белковое антитело к Acinetobacter, которое раскрыто в настоящем документе.
Таким образом, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения предложены диагностические системы в форме набора, которые включают по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или антитело изобретения в подходящей упаковке. Диагностические наборы, содержащие нуклеиновые кислоты, получены из описанных здесь кодирующих нуклеиновых кислот. В одном варианте осуществления, например, диагностические нуклеиновые кислоты получены из любой части нуклеинокис-лотной последовательности, кодирующей белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acine-tobacter baumannii, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter bauman-nii, трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной белок мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii, или любой один из олигонуклеотидов изобретения. Диагностические системы изобретения подходят для анализа на присутствие или отсутствие нуклеиновой кислоты в геномной ДНК или мРНК.
Подходящая диагностическая система включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту или антитело изобретения и отдельно упакованный химический реагент (реагенты) в количестве, достаточном по меньшей мере для одного анализа. Что касается диагностического набора, содержащего нуклеиновые кислоты изобретения, то он обычно будет включать две или больше нуклеиновые кислоты. Если диагностический набор должен использоваться для ПЦР, то он будет содержать по меньшей мере два олигонуклеотида, которые могут служить как праймеры для ПЦР. Специалисты в данной области могут легко объединить нуклеиновые зонды изобретения и/или праймеры или антитела изобретения в форму набора в сочетании с подходящими буферами и растворами для осуществления на практике описанных здесь способов изобретения. Набор, содержащий антитело, может содержать реакционный коктейль, который обеспечивает надлежащие условия для выполнения анализа, например твердофазного иммуно-ферментного анализа (ELISA) или другого иммунологического анализа, для определения уровня экспрессии полипептида в пробе, и может содержать контрольные пробы, которые включают известные количества полипептида и, по желанию, второго антитела, специфического для антитела изобретения.
Содержимое набора изобретения, например нуклеиновые кислоты или антитела, помещены в упаковочный материал, предпочтительно создающий стерильную среду без загрязнений. Кроме того, упаковочный материал содержит инструкции о том, как материалы в наборе могут быть использованы для обнаружения присутствия или отсутствия конкретной последовательности или белка или для диагностики присутствия бактериальной инфекции или предрасположенности к состоянию, связанному с бактериаль
ной инфекцией. Инструкции по использованию обычно включают четкое указание, описывающее концентрацию реагента или по меньшей мере один параметр способа выполнения анализа, такой как относительные количества реагента и пробы, которые необходимо смешать, время, в течение которого можно использовать смеси реагента/пробы, температуру, буферные условия и т.д.
Под "адъювантом" понимается одно или несколько веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В этом контексте адъювант используется для усиления иммунной реакции на один или несколько антигенов или антител вакцины. Адъювант может быть введен пациенту до, вместе или после введения вакцины или антитела. Примеры химических соединений, используемых в качестве адъюван-тов, включают, но без ограничения, соединения алюминия (например, квасцы, Альгидрогель), масла, блок-полимеры, иммуностимулирующие комплексы, витамины и минералы (например, витамин Е, витамин А, селен и витамин В12), Квил А (сапонины), компоненты клеточных стенок бактерий и грибков (например, липополисахариды, липопротеины и гликопротеины), гормоны, цитокины и совместно стимулирующие факторы. Другие примеры адъювантов включают, например, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, адъюванты с алюминием, MF59, QS21 иммуномодулирующий адъювант, такой как токсин, цитокин и микобактериальный дериват; масляную композицию, полимер, мицеллооб-разующий адъювант, сапонин, матрицу иммуностимулирующего комплекса (матрица ISCOM(r)), частицу, DDA (диметилдиоктадециламмоний) бромид, адъюванты ДНК и инкапсулирующий адъювант. Липо-сомные композиции также, как известно, дают эффекты адъювантов, и поэтому липосомные адъюванты также включены согласно изобретению. Адъюванты могут способствовать поглощению молекул вакцины клетками, представляющими антигены, такими как дендритные клетки, и активировать эти клетки. Способность адъюванта повышать иммунную реакцию проявляется в повышении иммунно-опосредованной защиты. Повышение гуморального иммунитета можно определить, например, по увеличению титра антитела, выведенного для антигена. Повышение клеточного иммунитета можно измерить, например, положительным тестом кожи, цитотоксическим анализом Т-клеток, иммуноферментным спот-анализом ELISPOT на гамма-интерферон или IL-2.
Под "антителом" понимаются целые антитела, иммуноглобулины или любой их антиген-связывающий фрагмент или одиночные цепи. Антитела, которые используются в настоящем описании, могут быть антителами млекопитающего (например, человека или мыши), гуманизированными, химерными, рекомбинантными, полученными путем синтеза или выделенными в естественных условиях, и могут быть, например, моноклональными или поликлональными. У большинства млекопитающих, включая человека, целые антитела имеют по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из переменного участка тяжелой цепи (здесь в сокращении VH) и постоянного участка тяжелой цепи. Постоянный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3 и шарнирного участка между CH1 и CH2. Каждая легкая цепь состоит из переменного участка легкой цепи (здесь в сокращении VL) и постоянного участка легкой цепи. Постоянный участок легкой цепи состоит из одного домена, CL. Участки VH и VL могут быть далее подразделены на участки гипервариабельности, называемые участками определения комплементарности (CDR), с вкраплениями участков, которые более консервативные и называются каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Переменные участки тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Постоянные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма-хозяина, включая разные клетки иммунной системы (например, клетки эффектора) и первый компонент (Clq) классической комплементарной системы.
Антитела настоящего изобретения включают все известные формы антител и других белковых каркасов со свойствами, подобными антителам. Например, антитело может быть антителом человека, гуманизированным антителом, биспецифическим антителом, химерным антителом или белковым каркасом со свойствами, подобными антителу, таким как повторы фибронектина или анкирина. Антителом также может быть Fab, Fab'2, scFv, SMIP, димерные мини-антитела, нанотела, аптамеры, или доменное антитело. Антитело может иметь любой из следующих изотипов: IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgM, IgA (например, IgA1, IgA2 и IgAsec), IgD или IgE.
Используемый здесь термин "фрагмент антитела" относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Функция антитела связываться с антигеном может быть выполнена фрагментами антитела полной длины, которые включают, но без ограничения: (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисуль-фидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одной ветви антитела, (v) фрагмент dAb, включающий домены VH и VL; (vi) фрагмент dAb (Уард и др. (Ward et al.), Nature 341:544-546 (1989)), который состоит из домена VH; (vii) фрагмент dAb, который состоит из домена VH или VL; (viii) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR); и (ix) сочетание двух или больше выделенных CDR, которые могут быть связаны, по выбору, синтетическим линкером. Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH,
кодируются разными генами, они могут быть объединены рекомбинантными способами с использованием синтетического линкера, который позволяет сделать их одной белковой цепью, в которой участки VL aVH спарены, чтобы сформировать одновалентные молекулы (известна как одна цепь Fv (scFv); см., например, Берд и др. (Bird et al.), Science 242:423-426 (1988) и Хастон и др. (Huston et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Эти фрагменты антитела получают, используя способы, известные специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела. Фрагменты антитела могут быть получены способами рекомбинантной ДНК или ферментным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов.
Под "антигеном" понимается молекула, с которой антитело может селективно связываться. Антигеном-мишенью может быть белок (например, антигенный пептид), углеводород, нуклеиновая кислота, липид, гаптен или другое природное или синтетическое соединение. Антигеном-мишенью может быть полипептид или пептидный мимик. Антиген также может быть введен животному, чтобы создать иммунную реакцию у животного.
Под "носителем" в контексте конъюгата понимается доля или частица, например, KLH, CRM197, токсоид столбняка, фаг, дрожжи, вирус, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица, которая подходит для соединения с ней или для отображения полипептида, как сказано выше.
Под "химерным антителом" понимается иммуноглобулин или антитело, переменные участки которого являются производными первого вида и постоянные участки которого являются производными второго вида. Химерные антитела могут быть получены, например, способами генной инженерии из сегментов гена иммуноглобулина, принадлежащих разным видам (например, мыши и человека).
Под "химерной вакциной" понимается вакцина, которая включает по меньшей мере два разных антигена, соединенных, например, ковалентно. Одним примером химерной вакцины является композиция, которая включает полипептид, отображенный, например, на поверхности частицы, такой как фаг, вирус, дрожжи, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица.
Под "конъюгатом" понимается соединение, которое включает полипептид изобретения, связанный с другой долей или частицей, например, KLH, CRM197, токсоид столбняка, фаг, дрожжи, вирус, виросо-ма или рекомбинантная вирусоподобная частица.
Под "консервативной заменой" в аминокислотной последовательности понимается замена одной аминокислоты другой в семействе аминокислот, которые родственны по химической природе их боковых цепей.
Генетически кодируемые аминокислоты могут быть разделены на четыре семейства: кислые (ас-партат, глутамат); основные (лизин, аргинин, гистидин); неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и незаряженные полярные (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда объединяют в группу ароматических аминокислот. Подобным же образом аминокислоты также могут быть разделены на следующие группы: кислые (аспартат, глутамат), основные (лизин, аргинин, гистидин); алифатические (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин), притом что серин и треонин, по выбору, могут быть отдельно объединены в группу алифатически-гидроксильных; ароматические (фенилаланин, тирозин, триптофан); амидные (аспарагин, глутамин) и серосодержащие (цистеин, метионин).
Приводит ли изменение в аминокислотной последовательности к функциональному варианту, можно определить путем оценки способности вариантного полипептида функционировать подобно полипептиду дикого типа, используя стандартные способы, такие как описанные в настоящем документе.
Под "диагностической композицией" понимается композиция, содержащая полипептид, конъюгат, вакцину или антитело изобретения, подготовленная для использования вместе со способом диагностики.
Под "эффективным количеством" в контексте пассивной иммунизации с использованием фармацевтической композиции, например, включающей антитело, понимается количество фармацевтической композиции, требующееся для пассивной иммунизации клиническим способом. Эффективное количество фармацевтической композиции, используемое для осуществления на практике способов пассивной иммунизации, описанных в настоящем документе, изменяется в зависимости от способа введения, возраста, массы тела и общего здоровья пациента. В конечном счете вопросы подходящего количества и режима дозировки решают врачи, которые выписывают назначения.
Под "фланкирующей аминокислотой" понимается аминокислота в полипептидной последовательности, которая непосредственно примыкает к N- или С-концу конкретной последовательности. Желательно, чтобы фланкирующая аминокислота присутствовала на N- и/или С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 или ее фрагмента и, более желательно, чтобы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот присутствовали на N- и/или С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 или ее фрагмента.
Под "составным белком" понимается белок, который включает полипептид изобретения, например фрагмент или вариант HYR1 и сливающийся объект.
Под "сливающимся объектом" понимается гетерологичная последовательность, которая может быть соединена с полипептидом изобретения, например, фрагментом или вариантом HYR1. Примеры сливающихся объектов описаны в настоящем документе и включают маркеры обнаружения, стабилизирую
щие домены, последовательности, которые способствуют получению или очистке белка, или домены, которые повышают антигенность полипептида.
Под "полипептидом HYR1" понимается полипептид, который, по существу, идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Желательно, чтобы полипептид HYR1 имел по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 или даже 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID
NO: 1.
Под "фрагментом HYR1" или "фрагментом полипептида HYR1" понимается часть полипептида HYR1, содержащая меньше чем 937, 936 или 935 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления фрагменты HYR1 по длине имеют 300-350 или 250-500 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления фрагмент имеет меньше чем 937, 936, 935, 934, 933, 932, 931, или 930, 920, 910, 900, 890, 880, 870,
860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 690, 680, 670, 660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210,
200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15 или 10 аминокислот и в некоторых случаях является иммуногенным.
Примером фрагмента HYR1 является Hyr1p-N (SEQ ID NO: 2) или его фрагмент. В некоторых случаях фрагменты Hyr1p-N имеют в длину от 14 до 20 аминокислот. В общем, фрагменты могут иметь
меньше чем, например, 325, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170,
160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 или 11 аминокислот и, желательно, быть иммуногенными. В некоторых случаях фрагмент Hyr1p-N имеет от 14 до 20 аминокислот.
Помимо этого, фрагменты HYR1 могут содержать, например, одну или больше консервативных замен аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2. Также желательно, чтобы фрагменты HYR1 содержали одну или больше консервативных замен аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2 и/или по меньшей мере одну фланкирующую аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот) на N- и/или С-конце последовательности SEQ ID NO: 2. Другие предпочтительные фрагменты HYR1 содержат семь или больше непрерывных аминокислотных последовательностей
SEQ ID NO: 2.
Неограничивающие примеры фрагмента HYR1 включают аминокислоты 1-40, 10-50, 20-60, 30-70,
40-80, 50-90, 60-100, 70-110, 80-120, 90-130, 100-140, 110-150, 120-160, 130-170, 140-180, 150-190, 160200, 170-210, 180-220, 190-230, 200-240, 210-250, 220-260, 230-270, 240-280, 250-290, и 260-300, 270-310, 280-320 и 290-331 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и эти фрагменты имеют один или больше из следующих признаков: одна или несколько консервативных замен аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 консервативных замен аминокислот) в последовательности SEQ ID NO: 2; одна или несколько аминокислот (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот), отсеченных от N и/или С-конце последовательности SEQ ID NO: 2, и по меньшей мере одну фланкирующую аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 фланкирующих аминокислот) на N- и/или С-конце последовательности SEQ ID NO: 2.
Под "иммуногенным" понимается любое вещество, которое способно индуцировать иммунную реакцию у пациента.
Под "иммуногенным количеством" в контексте вакцины понимается количество вакцины, требующееся для того, чтобы индуцировать иммунную реакцию у пациента клиническим образом. Иммуноген-ное количество вакцины, используемое при осуществлении на практике описанных в настоящем документе способов вакцинации, изменяется в зависимости от способа введения, возраста, массы тела и общего здоровья пациента. В конечном счете вопросы подходящего количества и режима дозировки решают врачи, которые выписывают назначения.
Используемый здесь термин "иммуногенное количество" относится к эффективному количеству конкретного полипептида изобретения или его фрагмента, которое может индуцировать иммунную реакцию у пациента против полипептида или инфекционного агента, экспрессирующего полипептид. Это количество обычно составляет от 20 мкг до 10 мг антигена на дозу вакцины и зависит от пациента, способности иммунной системы пациента синтезировать антитела и желательной степени защиты. Точное требуемое количество иммуногена можно вычислить разными способами, такими как, например, титрование антитела. Термин "эффективное количество" относится к количеству соединения или композиций, которого достаточно для получения желательного результата. Таким образом, при использовании для описания вакцины эффективное количество относится к количеству соединения или композиции (например, антигена), которого достаточно для получения защитной иммунной реакции. Эффективное количество по отношению к иммунологической композиции является количеством, которого достаточно для того, чтобы вызвать иммунную реакцию независимо от того, является ли она защитной.
"Выделенное" или "очищенное" понимается как отделенное от других естественно сопровождающих компонентов. Обычно соединение (например, нуклеиновая кислота, полипептид, антитело или небольшая молекула), по существу, выделено, если оно по меньшей мере на 60 мас.% свободно от белков и/или встречающихся в природе органических молекул, с которыми оно естественно связано. Это опре
деление также распространяется, например, на полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, выделенную из ее фланкирующих последовательностей (например, для аминокислотной последовательности "выделенная" относится к последовательности, которая свободна ото фланкирующих аминокислот, с которыми эта последовательность естественно связана в полипептиде). В некоторых случаях соединение выделено по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99 мас.%. Выделенное соединение, например полипептид, может быть получено стандартными способами, например, экстракцией из натурального источника (например, очищение из клетки, инфицированной Candida); экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент или вариант HYR1 или его составной белок, или химическим синтезом полипептида. Чистота может быть измерена подходящим способом, например колоночной хроматографией, электрофорезом на полиакриламидном геле или анализом ЖХВР. Использование терминов "выделенный" и/или "очищенный" в настоящем описании и формуле изобретения как модификаторов ДНК, РНК, полипептидов или белков означает, что соответствующие ДНК, РНК, полипептиды или белки были получены в такой форме человеком и, таким образом, отделены ото их природной клеточной среды in vivo.
Под "связанным с" или "конъюгированным с" в контексте конъюгата понимается ковалентное или нековалентное взаимодействие между полипептидом и носителем или сливающимся объектом. Некова-лентные взаимодействия включают, но без ограничения, водородную связь, ионные взаимодействия между заряженными группами, электростатическое связывание, ванн-дер-ваальсовы взаимодействия, гидрофобные взаимодействия между неполярными группами, липофобные взаимодействия и притяжения, основанные на LogP.
Под "моноклональным антителом" понимается антитело, полученное из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в малых количествах. Моноклональные антитела являются высоко специфическими и направленными на один антигенный сайт. Кроме того, в противоположность традиционным препаратам из (поликлональных) антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпито-пов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Монокло-нальные антитела могут быть приготовлены с использованием любого способа, признанного в данной области и способов, описанных в настоящем документе, таких как, например, гибридомный способ, описанный Колером и др. (Kohler et al.), Nature 256:495 (1975), трансгенного животного (например, Лонберг и др. (Lonberg et al.), Nature 368(6474):856-859 (1994)), способов рекомбинантной ДНК (например, патент США № 4816567) или с использованием библиотек антител фагов, дрожжей или синтетических каркасов способами, описанными, например, Клаксоном и др. (Clackson et al.), Nature 352:624-628 (1991) и Марксом и др. (Marks et al.), J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).
Под "молекулой нуклеиновой кислоты" понимается молекула, например РНК или ДНК, имеющая последовательность из двух или больше ковалентно связанных, встречающихся в природе или модифицированных нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одно- или двухнитевой и может включать модифицированные или немодифицированные нуклеотиды или их смеси или комбинации. Сюда также включены разные соли, смешанные соли и свободные формы кислоты.
Термин "нуклеиновая кислота", также упоминаемый как полинуклеотиды, охватывает рибонуклеиновую кислоту (РНК) или деоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), зонды, олигонуклеотиды и праймеры и может быть одно- или двухнитевой. ДНК может быть комплементарной ДНК (кДНК) или геномной ДНК и может представлять смысловую цепь, антисмысловую цепь или обе. Примерами нуклеиновых кислот являются РНК, кДНК или выделенная геномная ДНК. Такие нуклеиновые кислоты включают, но без ограничения, нуклеиновые кислоты, содержащие, по существу, такие же нуклеотидные последовательности, которые описаны в настоящем документе.
Под "пациентом" понимается млекопитающее, включая, но без ограничения, человека или другое млекопитающее, такое как корова, лошадь, собака, овца или кошка. "Пациент" или "индивидуум" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к позвоночному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку. Млекопитающие включают, но без ограничения, мышей, крыс, кроликов, обезьян, коров, овец, свиней, собак, кошек, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних питомцев, лошадей и приматов, в частности людей.
Термины "фармацевтически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый наполнитель" используются взаимозаменяемо и означают носитель или наполнитель, который физиологически приемлем для пациента при сохранении терапевтических свойств соединения, с которым его вводят. Одним примером вещества фармацевтически приемлемого носителя является физиологический раствор. Другие физиологически приемлемые носители и их составы известны специалистам в данной области и описаны, например, в Фармацевтике Ремингтона (20-е издание), под ред. Э. Геннаро, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.
Под "фармацевтической композицией" понимается композиция, содержащая полипептид, конъю-гат, вакцину или антитело изобретения, вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем, которая производится и продается с одобрения государственного регулирующего органа как часть терапевтиче
ского режима для лечения или профилактики заболевания или события у млекопитающего. Фармацевтические композиции могут иметь форму, например, для внутривенного введения (например, стерильный раствор, свободный от закупоривающих частиц и в системе растворителя, подходящей для внутривенного применения), для перорального введения (например, таблетка, капсула, овальная таблетка, желатиновая капсула или сироп) или любую другую форму, описанную в настоящем документе, например форму разовых доз. Изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически приемлемый носитель и соединение, содержащее белковое антитело к Acinetobacter, которое раскрыто в настоящем документе, или антитело к HYR1, имеющее специфическую реактивность с белком HYR1 (SEQ ID NO: 1) или его фрагментом, который раскрыт в настоящем документе. Изобретение дополнительно предлагает способ лечения или профилактики инфекций от грамотрицательных бактерий, таких как бактерии рода Acinetobacter включая, например, Acinetobacter baumannii, для нуждающегося в этом пациента. Способы изобретения могут включать введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и соединение, включающее белковое антитело к Acinetobacter, которое раскрыто в настоящем документе, или антитело к HYR1, имеющее специфическую реактивность с белком HYR1 (SEQ ID NO: 1) или его фрагментом. Изобретение дополнительно предлагает способ лечения или профилактики бактериальной инфекции у нуждающегося в этом пациента путем введения терапевтически эффективного количества композиции вакцины, раскрытой в настоящем документе.
Используемый здесь термин "полипептид" относится к двум или больше аминокислотам. Такие полипептиды обычно являются непрерывным и неразветвленным пептидом. Пептидом является короткий полимер из мономеров аминокислот. "Белки" включают один или несколько полипептидов, расположенных биологически функциональным образом. Аминокислоты, включающие полипептиды изобретения, могут быть соединены пептидными или другими связями, например, сложными или простыми эфирами. Аминокислоты, содержащие полипептиды изобретения, могут включать не генетически кодируемые аминокислоты, которые или встречаются в природе, или синтезированы химическим путем. Полипептид изобретения также может включать одну или несколько консервативных замен. Консервативные замены кодируемых аминокислот включают, например, аминокислоты, которые принадлежат к следующим группам: (1) неполярные аминокислоты (Gly, Ala, Val, Leu и Ile); (2) полярные нейтральные аминокислоты (Cys, Met, Ser, Thr, Asn и Gln); (3) полярные кислые аминокислоты (Asp и Glu); (4) полярные основные аминокислоты (Lys, Arg и His) и (5) ароматические аминокислоты (Phe, Trp, Tyr и His). Другие малые модификации также включены в полипептиды изобретения, если полипептид сохраняет некоторые или все из его функций, которые описаны в настоящем документе.
Полипептиды изобретения могут также включать их производные, аналоги и миметики при условии, что такой полипептид сохраняет некоторые или все его функции, раскрытые в настоящем документе,. Например, производные могут включать химические модификации полипептида, такие как алкили-рование, ацилирование, карбамилирование, иодирование или любую модификацию, которая дает производное полипептида. Такие производные молекулы включают, например, те молекулы, у которых свободные аминогруппы были дериватированы, чтобы образовать амингидрохлориды, р-толуолсульфонильные группы, карбобензоксигруппы, t-бутилоксикарбонилгруппы, хлороацетилгруппы или формилгруппы. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватированы для образования солей, метиловых и этиловых сложных эфиров или других типов сложных эфиров или гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватированы для образования О-ацильных или О-алкильных производных. Имидазольный азот гистидина может быть дериватирован для образования N-им-бензилгистидина. Также включены в качестве производных или аналогов те пептиды, которые содержат одно или несколько встречающихся в природе производных аминокислот из двадцати стандартных аминокислот, например 4-гидроксипролин, 5-гидроксилизин, 3-метилгистидин, гомосерин, орнитин или карбоксиглутамат, и могут включать аминокислоты, которые не соединены пептидными связями. Полипептиды настоящего изобретения также включают любой полипептид, имеющий одно или несколько добавлений и/или делеций остатков относительно последовательности полипептида, которая показана в настоящем документе, если сохраняется иммуногенная активность, раскрытая в настоящем документе.
Полипептиды изобретения могут быть выделены разными способами, хорошо известными в данной области, такими как рекомбинантные экспрессирующие системы, осаждение, гель-фильтрация, ионный обмен, хроматография с обращенной фазой и аффинная хроматография и т.д. Другие хорошо известные способы описаны у Дойчера и др. (Deutscher et al.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Руководство по очищению белков: способы в ферментологии) Vol. 182, (Academic Press, (1990)). Альтернативно, выделенные полипептиды настоящего изобретения могут быть получены путем использования хорошо известных рекомбинантных способов (см., например, Осубель и др. (Ausubel et al.), "Иммунология", Short Protocols in Molecular Biology (Короткие протоколы в молекулярной биологии), John Wiley & Sons, Inc. Chapter 11. Page 11.1-11.29 (1999); Сэмбрук и Расселл (Sambrook and Russell), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ("Молекулярное клонирование: лабораторное руководство"), Cold Spring Harbor Laboratory (2001)). Способы и условия для биохимической очистки полипептида изобретения могут быть выбраны специалистами в данной области, и очистку можно контролировать, например,
иммунологическим анализом или функциональным анализом.
Примером средства для приготовления полипептида изобретения является экспрессия нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид изобретения в подходящей клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка, клетка дрожжей, клетка амфибии, такая как ооцит, или клетка млекопитающего, с использованием способов, хорошо известных в данной области, и извлечение экспрессированного полипептида снова с использованием хорошо известных способов очистки, описанных в настоящем документе. Полипептиды изобретения могут быть выделены непосредственно из клеток, которые были трансформированы экс-прессирующими векторами, как сказано в настоящем документе. Полипептиды изобретения также могут быть получены путем химического синтеза. Способы химического синтеза полипептидов хорошо известны в данной области и коммерчески доступны.
Рекомбинантно экспрессированные полипептиды изобретения также могут быть экспрессированы как составные белки с подходящими сливающимися объектами. Подходящим сливающимся объектом может быть аминокислотная последовательность, которая обычно не соединена с аминокислотной последовательностью, такой как гетерологичная последовательность, которая выполняет конкретную функцию или придает дополнительную характеристику полипептидам изобретения. Неограничивающие примеры подходящих гетерологичных последовательностей включают обнаруживаемый маркер, стабилизирующий домен, белок-носитель для создания антитела, линкерную последовательность и последовательность, которая способствует очистке полипептида. Последовательности, которые могут способствовать очистке полипептидов изобретения включают аффинные метки, такие как глутатион^-трансфераза (GST) или поли-His. Таким образом, в некоторых аспектах изобретение предлагает составной белок, имеющий полипептид, который раскрыт в настоящем документе, объединенный с гетерологичной последовательностью, белком-носителем, аффинной меткой или линкерной последовательностью.
Настоящее изобретение также предлагает композиции, содержащие приемлемый носитель и любой из выделенных полипептидов, раскрытых в настоящем документе, отдельно или в сочетании друг с другом. Эти полипептиды могут быть получены рекомбинантными способами, синтезированы химически или очищены от природных источников. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" охватывает любые из стандартных фармацевтических носителей, известных в данной области, такие как фосфатный буферный раствор, вода и эмульсии, такие как масляная и водная эмульсия, и разные типы смачивающих агентов.
Изобретение также предлагает способ экспрессии полипептида, раскрытого в настоящем документе, путем культивирования клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид в условиях, подходящих для экспрессии полипептида. Таким образом, предложен способ рекомбинантного получения полипептида изобретения путем экспрессии нуклеинокислотных последовательностей, кодирующих полипептид в подходящих клетках-хозяевах. Системы экспрессии рекомбинантной ДНК, которые подходят для получения полипептидов, описаны в настоящем документе и хорошо известны в данной области (см. Осубель и др., выше, 1999). Например, вышеописанные нуклеотидные последовательности могут быть введены в векторы для дальнейшего манипулирования. Векторы могут включать плаз-мид или вирус рекомбинантной ДНК или РНК, содержащий дискретные элементы, которые используются для введения гетерологичной ДНК в клетки для экспрессии или репликации.
Под выражением "специфически связывается" понимается предпочтительная связь связывающей доли (например, антитело, фрагмент антитела, рецептор, лиганд или небольшая доля молекулы агента, описанного в настоящем документе) с молекулой-мишенью (например, полипептид или конъюгат, включающий его) или с клеткой или тканью, имеющей эту молекулу-мишень (например, антиген клеточной поверхности, такой как рецептор или лиганд), а не с молекулами, клетками или тканями, не имеющими этой молекулы-мишени. Признано, что определенная степень неспецифического взаимодействия может происходить между связывающей долей и молекулой, не являющейся мишенью (присутствует отдельно или в сочетании с клеткой или тканью). Тем не менее специфическое связывание можно отличить как опосредованное через специфическое распознавание молекулы-мишени. Специфическое связывание приводит к более короткой связи между связывающейся долей (например, антитело) и молекулой-мишенью (например, полипептид или включающий его конъюгат) чем между связывающейся долей и, например, молекулами, не являющимися мишенями, или другими композициями без молекулы-мишени. Специфическое связывание обычно приводит более чем к двукратному, предпочтительно более чем пятикратному, более предпочтительно более чем десятикратному и наиболее предпочтительно более чем стократному увеличению количества связанной связывающейся доли (в единицу времени) например, клетки или ткани, имеющей молекулу-мишень или маркер, по сравнению с клеткой или тканью без такой молекулы-мишени или маркера. Связывающиеся доли связываются с молекулой-мишенью или маркером с константой диссоциации, например, меньше чем 10-6M меньше чем 10-7М, 10-8М, 10-9М, 10-10М, 10-11М или 10-12М, или даже меньше чем 10-13М, 10-14М или 10-15М. Специфическое связывание с белком в таких условиях требует связывающейся доли, которую выбирают по ее специфичности для этого конкретного белка. Разные форматы анализа подходят для выбора связывающихся долей (например, антител), способных специфически связываться с конкретной клеткой-мишенью. Например, твердофазный иммунологический анализ ELISA обычно используют для выбора моноклональных антител, специфически имму
нореактивных с белком. Смотрите: Хэрлоу и Лейн (Harlow & Lane), Антитела, Лабораторное руководство, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), в части описания форматов иммунологических анализов и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактив-ности.
Под "по существу, идентичной" понимается аминокислотная последовательность или нук-леинокислотная последовательность, которая имеет по меньшей мере 50% идентичность с контрольной последовательностью. Такая последовательность обычно идентична по меньшей мере, например, на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% на уровне аминокислоты или уровне нуклеиновой кислоты с контрольной последовательностью. В общем, для полипептидов длина последовательностей сравнения может составлять по меньшей мере пять аминокислот, например, 10, 20, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 или больше аминокислот, до полной длины полипептида. Для нуклеиновых кислот длина последовательностей сравнения обычно может составлять по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или больше нуклеотидов, до полной длины молекулы нуклеиновой кислоты. При этом понимается, что для целей определения идентичности последовательности при сравнении последовательности ДНК с последовательностью РНК нук-леотид тимин эквивалентен нуклеотиду урацилу.
Как используется в настоящем документе, когда полипептид или нуклеинокислотная последовательность упоминается как имеющая "по меньшей мере Х% идентичности последовательности" с контрольной последовательностью, это означает, что по меньшей мере X процентов аминокислот или нук-леотидов в полипептиде или нуклеиновой кислоте идентичны таковым в контрольной последовательности, когда последовательности оптимально выровнены. Оптимальное выравнивание последовательностей можно определить разными путями, которые известны специалисту в данной области, например, с использованием алгоритма выравнивания Смита-Уотермана (Смит и др. (Smith et al.), J. Mol. Biol. 147:195-7, 1981) и алгоритма BLAST (программа нахождения участков локального сходства между последовательностями; Альтшуль и др. (Altschul et al.), J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990). Эти и другие алгоритмы выравнивания доступны через общедоступное программное обеспечение для компьютера, такое как "Best Fit" (Смит и Уотерман (Smith and Waterman), Advances in Applied Mathematics (Достижения прикладной математики), 482-489, 1981), которое включено в программу GeneMatcher PlusTM (Шварц и Дейхоф (Schwarz and Dayhof), Atlas of Protein Sequence and Structure (Атлас белковых последовательностей и структур), Dayhoff, M.O., Ed pp 353-358, 1979), BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X,
WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL или Megalign (DNASTAR). Помимо этого, специалисты в
данной области могут определить подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения оптимального выравнивания по длине сравниваемых последовательностей.
"Молекула-мишень" или "клетка-мишень" означает молекулу (например, полипептида, эпитопа, антигена, рецептора или лиганда) или клетку, с которой может специфически связываться связывающаяся доля (например, антитело). В некоторых случаях молекулы-мишени открыты снаружи клетки-мишени (например, на клеточной поверхности или секретированном белке), но молекулы-мишени могут альтернативно или также присутствовать внутри клетки-мишени.
"Терапевтически эффективное количество" будет изменяться в зависимости от используемых композиций белков, полипептидов или антител, заболевания и его тяжести, возраста, веса и т.д. пациента, причем все это входит в знания лечащего врача. Предусматривается, что терапевтически эффективное количество одной или нескольких описанных здесь композиций белков, полипептидов или антител будет изменять патогенность грамотрицательных бактерий. Терапевтически эффективное количество отличается от количества, имеющего биологический эффект. Композиции белков, полипептидов или антител настоящего изобретения могут иметь один или больше биологических эффектов in vitro или даже in vivo, например снижение функции белка или полипептида, экспрессированного грамотрицательными бактериями. Биологический эффект, однако, может не приводить к какому-либо клинически измеримому терапевтическому эффекту, который описан в настоящем документе и который может быть определен способами, известными лечащему врачу.
Под "лечением" понимается медицинский уход за пациентом с намерением излечить, уменьшить, стабилизировать снизить вероятность или предотвратить заболевание, патологическое состояние, нарушение или событие путем введения фармацевтической композиции. Этот термин включает активное лечение, то есть лечение, специфически направленное на улучшение, или связанное с излечением заболевания, патологического состояния, нарушения или события, а также включает этиотропную терапию, то есть лечение, направленное на устранение причины соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или события. Кроме того, этот термин включает паллиативное лечение, то есть лечение, предназначенное для снижения симптомов, а не на излечение заболевания, патологического состояния, нарушения или события; симптоматическое лечение, то есть лечение, направленное на системные симптомы соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или события; профилактическое лечение, то есть лечение, направленное на минимизацию или частичное или полное ингибирование развития соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или
события, например, у пациента, который еще не болен, но который восприимчив или имеет иной риск к конкретному заболеванию, патологическому состоянию, нарушению или событию; и поддерживающую терапию, то есть лечение, применяемое для дополнения другой специфической терапии, направленной на улучшение соответствующего заболевания, патологического состояния, нарушения или события.
Под "вакциной", как она здесь используется, понимается композиция, которая вызывает иммунную реакцию у пациента, которому она введена.
Под термином "вакцинировать", как он здесь используется, понимается лечение пациента путем введения вакцины, например для предотвращения или уменьшения симптомов заболевания, патологического состояния, нарушения или события.
Под "вариантом" в контексте полипептида или его части, как здесь описано, или молекулы нуклеиновой кислоты, их кодирующей, понимается включение замен или изменений в аминокислотную последовательность или нуклеинокислотную последовательность, что приводит, например, к, по существу, идентичной последовательности. Полипептид, имеющий вариантную последовательность, может сохранять по меньшей мере одну биологическую активность оригинального полипептида, например, иммуно-генную активность. Термин "вариант" включает, например, инсерционные производные аминокислот, такие как амино- и/или карбоксиконцевые гибриды, а также вставки одной или нескольких аминокислот в последовательности. Инсерционные аминокислотные варианты - это те, в которых один или несколько аминокислотных остатков введены в определенный сайт в белке. Случайная вставка также возможна при подходящем скрининге полученного продукта. Делеционные варианты характеризуются удалением одной или нескольких аминокислот из последовательности. Варианты аминокислот с заменами - это те, в которых по меньшей мере один остаток вставлен на его место. Если необходимо получить производное белка путем замены аминокислоты, аминокислоты обычно заменяют консервативными заменами, например, другими аминокислотами, имеющими сходные физико-химические свойства, такие как гидро-фобность, гидрофильность, электроотрицательность, объемные боковые цепи и т.д.
Для целей настоящего изобретения варианты также включают одиночные или множественные замены, делеции и/или добавления любого компонента (или компонентов), естественно или искусственно связанного с частью встречающегося в природе белка, из которого может быть получен полипептид, такого как углеводород, липид и/или другие белковые доли. Все такие молекулы охватываются термином "вариант".
Под "вариантной последовательностью" понимается аминокислотная или нуклеинокислотная последовательность варианта, согласно приведенному определению.
Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из последующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А-1В - улучшенное выживание и сниженная грибковая нагрузка после введения вакцины rHyr1p-N мышам с инфекцией Candida albicans. (А) Выживание вакцинированных или контрольных мышей (n = 15 в одной группе), инфицированных внутривенно Candida albicans штамм 15563, клинический изолят (9х105 на дозу), *, Р < 0,001 по сравнению только с квасцами по критерию Мантела-Кокса. (В) Грибковая нагрузка на почки мышей (n=10 в подгруппе), вакцинированных 30 мкг rHyr1p-N + квасцы или только квасцами, измеренная через 3 суток после инфицирования С. albicans 15663 (7х105 на дозу). Данные представлены как средний ± межквартильный размах. *, Р < 0,001 по сравнению с результатами, полученными из почек, взятых у мышей, вакцинированных только квасцами по U-критерию Манна-Уитни;
фиг. 2А-2С - показаны репрезентативные гистопатологические срезы с почек. (А) Контрольные мыши, инфицированные С. albicans, имели множественные абсцессы по большей части с дрожжевой форме с гифами и псевдогифами в почках. (В) rHyr1p-N-вакцинированные мыши (30 мкг), инфицированные С. albicans, имели меньше абсцессов с намного меньшими видимыми количествами грибков. (С) Полуколичественная оценка тяжести инфекции показала значительный абсцесс и уменьшение числа клеток Candida у вакцинированных мышей по сравнению с контрольными мышами. Срезы были окрашены PAS. Тридцать произвольных полей были изучены слепым оценщиком (GL), чтобы оценить число поражений на одно поле. Число организмов в одном поражении оценили в 120 поражениях у контрольных, невакци-нированных мышей. Среднее число организмов в одном поражении определяли путем деления общего числа грибковых клеток на число подсчитанных поражений;
фиг. 3А-3С - вакцина rHyr1p-N продлила выживание и уменьшила грибковую нагрузку у нейтропе-нических мышей, инфицированных С. albicans. Мыши Balb/c (n=20 на группу) были вакцинированы rHyr1p-N, смешанной с квасцами, или только квасцами, обработаны циклофосфамидом, затем инфицированы С. albicans 15563 в количестве 1х105 бластоспор. За двое суток до обработки циклофосфамидом, половину мышей обескровили и индивидуально пометили для титрования антител, используя ИФА (А) и выживание (В). Другую половину мышей использовали для грибковой нагрузки (С). *р <0,05 для вакцинированных против контрольных по критерию Мантела-Кокса;
фиг. 4A-4D - зависящая от дозы пассивная иммунизация IgG к Hyr1p для защиты от мышиного,
распространяющегося в крови кандидоза. Мышам ввели внутрибрюшинно 0,3 мг (А), 1 мг (В) и 3 мг (С) IgG к Hyr1p за 2 ч до инфицирования 6,2х105 бластоспорами Candida albicans 15563 через хвостовую вену. Выживание мышей (n= 10 в одной группе) контролировали два раза в сутки. *Р = 0,001 по критерию Мантела-Кокса против мышей, получивших контрольный IgG, соответствующий изотипу. (D) Влияние вакцинированного или контрольного F(ab')2 на блокирование HL-60-производного нейтрофила, убивающего С. albicans. В этом анализе использовали сверхэкспрессию С. albicans или подавление Hyr1p, чтобы продемонстрировать специфичность фрагментов F(ab')2 для Hyr1p. Контрольный обозначает анализ, выполненный в отсутствие F(ab')2 или в присутствии F(ab')2 из IgG, совпадающего с изотипом. Данные показаны как средний ± интерквартильный размах. * Р = 0,001 по критерию Манна-Уитни;
фиг. 5А-5В - защита от распространяющегося в крови кандидоза с использованием очищенного смешанного IgG, специфического для Hyr1p. А) Косвенная иммунофлуоресценция с IgG кролика, специфического для Hyr1p, продемонстрировала поверхностную экспрессию Hyr1p на гифе С. albicans и успешную абсорбцию антитела к Hyr1p. В) Выживание мышей, обработанных 1 мг: 1) смешанных IgG к Hyr1 (n=20); 2) смешанного IgG к Hyr1p, абсорбированного гифой С. albicans (n=10); или 3) контрольный IgG кролика (n=20) за два часа до инфицирования 8,7х105 бластоспорами С. albicans 15563 через хвостовую вену. Дозу антитела повторили через 3 суток после инфицирования. *р=0,002 против абсорбированного IgG и 0,03 против контрольного IgG, **р=0,28 против абсорбированного IgG по критерию Мантела-Кокса;
фиг. 6 - вакцина rHyr1p-N снижает грибковую нагрузку в тканях у мышей BALB/c, инфицированных Candida, не относящейся к виду albicans. Мышей BALB/c (n = 10 в группе) вакцинировали квасцами или квасцами плюс rHyr1p-N (30 мкг) и через три недели ввели бустер-дозу. Через две недели после бустер-дозы мышам через хвостовую вену ввели С. glabrata (3,2х107), С. krusei (3,4х107), С. parapsilosis (9,6х106) или С. tropicalis (3,2х106). Грибковую нагрузку на почки определяли на третьи сутки после инфицирования. Ось у показывает нижний предел обнаружения при анализе. *Р < 0,001 против контрольного адъюванта по U-критерию Манна-Уитни;
на фиг. 7 показана активная иммунизация с использованием rHYR1p-N (SEQ ID NO: 2) для защиты диабетических мышей от бактериемии Acinetobacter baumannii. Мышей иммунизировали только гидро-ксидом алюминия (n=10) или rHYR1p-N (30 мг) в смеси с гидроксидом алюминия (n=9) в день 0, ввели бустер-дозу в день 21 и инфицировали Acinetobacter baumannii в день 35. *Р <0,005 против контрольных;
на фиг. 8 показано влияние активной вакцинации rHYR1p-N (SEQ ID NO: 2) на бактериальную нагрузку в почечной, легочной и селезеночной ткани. Контрольные мыши были иммунизированы только гидроксидом алюминия, тогда как вакцинированные мыши были иммунизированы rHYR1p-N (30 мг), смешанным с гидроксидом алюминия в день 0, бустер-дозой в день 21 и инфицированы Acinetobacter baumannii в день 35;
на фиг. 9 - пассивная иммунизация для защиты диабетических мышей от бактериемии Acinetobacter baumannii. Мышей обработали 1 мг контрольного IgG кролика (n=18) в качестве контрольных. Экспериментальных мышей обработали смешанным поликлональным IgG к rHYR1p (n=20) за два часа до инфицирования A. baumannii. Каждое из поликлональных антител к rHYR1p, составивших пул, было предназначено против одного из синтетических антигенных полипептидов, включая полипептид из SEQ ID NO: 11-18. *Р <0,005 против контрольного IgG;
на фиг. 10 - пассивная иммунизация для защиты диабетических мышей от бактериемии Acinetobac-ter baumannii. Мышей обработали 1 мг контрольного IgG кролика (n=18) или поликлональным IgG к HYR1p, полученным индивидуально против одного из восьми разных синтетических пептидов HYR1, за 2 ч до инфицирования A. baumannii. № 1 был выведен против CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11). № 2 был выведен против CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO: 12). № 3 был выведен против CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13). № 4 был выведен против CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14). № 5 был выведен против CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15). № 6 был выведен против NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16). № 7 был выведен против CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17). № 8 был выведен против TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18). Сочетание 1 (Comb1) включает антитела № 2, 3, 5 и 8. Сочетание 2 (Comb2) включает антитела № 2, 5 и 8;
на фиг. 11 - пример двухмерного анализа на геле и вестерн-блоттинга экстрактов клеточной поверхности Acinetobacter. IgG кролика, выведенный против CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), использовали для зондирования верхнего блота, тогда как неиммунную сыворотку использовали в качестве контроля для зондирования нижнего блота.
Подробное описание изобретения
Candida albicans является широко распространенным патогеном для человека. Например, С. albicans, хотя обычно и безвредный симбионт, может вызывать разные состояния от поверхностной сли-зисто-кожной инфекции, такой как вагинальный и/или орофарингеальный кандидоз, до глубокого проникновения в орган рассеянного кандидоза. Перед тем как вызвать заболевание, грибок колонизирует желудочно-кишечный тракт и, в некоторых случаях, кожу и слизистые оболочки. Адгезия к слизистым поверхностям организма-хозяина является одним из главных условий на этом начальном этапе. После
колонизации С. albicans проходит в поток крови через инфицированные внутрисосудистые устройства или путем трансмиграции через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, состояние которой ухудшено химиотерапией или язвами, вызванными стрессом. Затем организмы распространяются через поток крови, связываются с сосудистым эндотелием и проникают в него, чтобы выйти из дерева сосудов и поразить глубокие органы, такие как печень, селезенка и почки.
Идентификация фрагментов HYR1 и других описанных здесь композиций позволяет, например, эффективно лечить и вакцинировать против не только кандидоза, но и инфекцию Acinetobacter.
Изобретение предлагает полипептиды, например производные HYR1 или Hyr1p-N, конъюгаты, вакцины, антитела, композиции, способы вакцинации с их использованием и способы их получения, о чем более подробно сказано ниже.
Полипептиды.
Изобретение предлагает полипептиды, например, выделенные полипептиды, производные от HYR1, например, Hyr1p (SEQ ID NO: 1) или Hyr1p-N (SEQ ID NO: 2), например, включающие аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 3-10, или ее вариантную последовательность, имеющую нуль, одну, две или три замены, делеции или добавления к аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 3-10, при этом полипептид не включает больше 20 заменимых аминокислот SEQ ID NO: 2.
SEQ ID N0:1 является аминокислотной последовательностью С. albicans Hyrlp (SEQ ID NO: 1). MKWSNFI FT ILLTLNLS AALE WTSRIDRGGIQGFHGDVKVHSGATWAILGTTLCSFFG GLEVEKGASLFIKSDNGPVLALNVALSTLVRPVINNGVISLNSKSSTSFSNFDIGGSSFT NNGEIYLASSGLVKSTAYLYAREWTNNGLIVAYQKQKAAGNIAFGTAyQTITMNGQICLR HQDFVPATKIKGTGCVTADEDTWIKLGMTILSVEPTHNFYLKDSKSSLIVHAVSSKQTFT VHGFGNGKECLGLTLPLTGNRDHFRPEYYPDTGILQLRAAALPQYFKIGKGYDSKLFRIVK SRGLKNAVTYDGPVPNNEIPAVCLIPCTNGPSAPESESDLNTPTTSSIETSSYSSAATES SVVSESSSAVDSLTSSSLSSKSESSDWSSTTNIESSSTAIETTMNSESSTDAGSSSISQ SESSSTAITSSSETSSSESMSASSTTASNTSIETDSGIVSQSESSSNALSSTEQSITSSP GQSTIYVNSTVTSTITSCDEKKCTEDWTIFTTVPCSTDCVPTTGDIPMSTSYTQRTVTS TITNCDEVSCSQDVVTYTTNVPHTTVDATTTTTTSTGGDNSTGGNESGSNHGPGNGSTEG SGNGSGAGSNEGSQSGPNNGSGSGSEGGSNNGSGSDSGSNNGSGSGSNNGSGSGSTEGSE GGSGSNEGSQSGSGSQPGPNEGSEGGSGSNEGSNHGSNEGSGSGSGSGSNNGSGSGSQSG SGSGSQSGSESGSNSGSNEGSNPGAGNGSNEGSGQGSGNGSEAGSGQGSGPNNGSGSGHN DGSGSGSNQGSNPGAGSGSGSESGSNAGSHSGSNEGAKTDSIEGFHTESKPGFNTGAHTD ATVTGNSVANPVTTSTESDTTISVTVSIT3YMTGFDGKPKPFTTVDVIPVPHSKPSNTTD SS3SVPTIDTNENGSSIVTGGKSILFGLIVSMWLFM (SEQ ID N0:1)
SEQ ID NO:2 является аминокислотной последовательностью рекомбинантного N-концевого домена Hyrlp (rHyrlp-N, SEQ ID NO: 2).
TSRIDRGGIQ,
GFHGDVKVHS
GATWAILGTT
LCSFFGGLEV
EKGASLFIKS
DNGPVLALNV
ALSTLVRPVI
NNGVISLNSK
SSTSFSNFDI
GGSSFTNNGE
101
IYLASSGLVK
STAYLYAREW
121
TNNGLIVAYQ
NQbTiAGNIAF
141
GTAYQTITNN
GQICLRHQDF
161
VPATKIKGTG
CVTADEDTWI
181
KLGNTILSVE
PTHNFYLKDS
201
KSSLIVHAVS
SNQTFTVHGF
221
GNGNKLGLTL
PLTGNRDHFR
241
FEYYPDTGIL
QLRAAALPQY
261
FKIGKGYDSK
LFRIVNSRGL
281
KNAVTYDGPV
PNNEIPAVCL
301
IPCTNGPSAP
ESESDLNTPT
321
TSSIET (SEQ ID N0:2}
SEQ ID NO: 3-10 являются 14-мер фрагменты аминокислотной последовательности Hyr1p-N (SEQ ID NO: 2), как показано в табл. 1.
Таблица 1. Примеры фрагментов Hyrlp-N
SEQ ID
No.
Последовательность
GPSAPESESDLNTP
GNRDHFRFEYYPDT
GYDSKLFRTVNSRG
KIKGTGCVTADEDT
LKNAVTYDGPVPNN
NSKSSTSFSNFDIG
EPTHNFYLKDSKSS
TSRIDRGGIQGFHG
Полипептиды из табл. 1 или другие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут иметь вариантную или иначе модифицированную аминокислотную последовательность. Например, в вариантных полипептидах из табл. 1, каждая замена, делеция или добавление, если таковые имеются, могут быть сделаны, например, в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14, или на N- или С-конце полипептида.
В некоторых случаях полипептид включает 14 и 20 аминокислот, например 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот. В других случаях полипептид короче чем 14 аминокислот, например 11, 12 или 13 аминокислот. Полипептид может быть длиннее чем 20 аминокислот при условии, что он не включает больше 20 заменимых аминокислот из SEQ ID NO: 2.
В некоторых случаях модификация полипептида, который описан в настоящем документе, незначительно снижает биологическую активность, например иммуногенную активность, полипептида. Модифицированный полипептид может иметь или оптимизировать характеристику полипептида, такую как стабильность in vivo, биодоступность, токсичность, иммунологическую активность, иммунологическую идентичность или свойства конъюнкции.
Модификации включают модификации естественными процессами, такие как посттрансляционная обработка, или химическими способами модификации, известными в данной области. Модификации могут происходить в любом месте полипептида, включая полипептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксиконец. Тот же тип модификации может присутствовать в такой же или изменяющейся степени в нескольких местах данного полипептида, и полипептид может содержать модификации больше чем одного типа.
Вариантный или иначе модифицированный полипептид может также включать одну или больше вставок, делеций или замен аминокислот как консервативных, так и неконсервативных (например, D-аминокислоты, дезаминокислоты) в полипептидной последовательности. Например, добавление одного или нескольких цистеиновых остатков к амино- или карбоксиконцу любого полипептида изобретения может способствовать конъюнкции этих полипептидов. Примеры полипептидов, имеющих N- или С-концевой цистеин, включают, например, полипептиды SEQ ID NO: 11-18, например которые приведены в табл. 2 и описаны в примере 1.
Замены аминокислот могут быть консервативными (т.е. когда остаток заменяют другим того же общего типа или группы) или неконсервативным (т.е. когда остаток заменяют аминокислотой другого типа). Помимо этого, не встречающаяся в природе аминокислота может быть заменена на встречающуюся в природе аминокислоту (т.е. консервативная замена не встречающейся в природе аминокислоты или неконсервативная замена не встречающейся в природе аминокислоты).
Полипептиды, полученные путем синтеза, например с использованием способов, известных в данной области, могут включать замены аминокислот, не кодируемых ДНК в естественных условиях (например, не встречающейся в природе или ненатуральной аминокислоты). Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают D-аминокислоты, аминокислоту, имеющую ацетиламинометиловую группу, прикрепленную к атому серы в цистеине, пегилированную аминокислоту, омега-аминокислоты формулы NH2(CH2)nCOOH, где n = 2-6, нейтральные неполярные аминокислоты, такие как саркозин, t-бутилаланин, t-бутилглицин, N-метилизолейцин и норлейцин. Фелинглицином можно заменить Trp, Tyr или Phe; цитруллин и метионинсульфоксид являются нейтральными неполярными, цистеиновая кислота является кислой, и орнитрин является основным. Пролин можно заменить гидроксипролином и сохра
нить свойства, придающие конформацию.
Варианты могут быть созданы мутагенезом с заменой и сохранять или даже повышать биологическую активность, например иммуногенную активность, исходного полипептида.
Полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть получены, например, химическим синтезом с использованием имеющегося в продаже автоматизированного синтезатора пептидов. Синтезированный белок или полипептид могут быть осаждены и далее очищены, например, жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР). Альтернативно, белки и полипептиды могут быть получены рекомбинантными способами, например теми, которые хорошо известны в данной области.
Конъюгаты.
Полипептиды изобретения могут быть конъюгированы с другой долей или частицей. Доли белка.
В некоторых случаях может быть полезно конъюгировать полипептид с белком, который является иммуногенным в иммунизируемых видах, например гемоцианином фиссуреллы (KLH), CRM197, ток-соидом столбняка, токсоидом дифтерии, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином, ингибитором соевого трипсина или поликатионом (поли^-лизином или поли^-аргинином), например с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, который известен в данной области, например малеимидобензоилсульфосукцинимидный эфир (конъюнкция через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимид (через остатки лизина), глутаральдегид или янтарный ангидрид.
В некоторых случаях конъюгат может быть рекомбинантным составным белком, например для облегчения экспрессии и очищения полипептида.
Частицы для конъюнкции или отображения полипептидов.
В некоторых случаях полипептиды конъюгированы с частицей или отображены на частице, например фаге, дрожжах, вирусе, виросоме или рекомбинантной вирусоподобной частице.
Например, один или несколько полипептидов могут быть конъюгированы с фагом, дрожжами или вирусной частицей, например с поверхности частицы. В одном варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, вводят в фаг, дрожжи или вирусную частицу, что приводит к экспрессии полипептида в фаге, дрожжах или вирусе, например на поверхности частицы. Популяция фага, дрожжей или вируса, содержащая полипептид, затем может быть выделена и приготовлена, например, как вакцина путем добавления фармацевтически приемлемого наполнителя.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды, которые описаны в настоящем документе, конъюгированы с виросомой или вирусоподобной частицей (ВПЧ). Виросомы и ВПЧ обычно содержат один или несколько белков из вируса, по выбору объединенного или смешанного с фосфолипидом. Они обычно не патогенные, не воспроизводящиеся и обычно не содержат нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть рекомбинантно получены или выделены из целых вирусов. Вирусные белки, подходящие для использования в виросомах или ВПЧ, включают белки, производные от вируса гриппа (такие как НА или NA), вируса гепатита В (такие как капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящера, ретровируса, вируса Норволк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Кью-бета-фага (такого как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, АР205 фага и Ту (такого как белок р 1 Ту ретротранспозона). Виросомы более подробно описаны, например, в публикации Глюка и др. (Gluck et al.) (2002), Vaccine 20:B10-B16, которая включена в полном объеме путем ссылки. ВПЧ описаны более подробно, например, в публикациях Ниикуры и др. (Niikura et al.) (2002), Virology 293:273-280; Ленца и др. (Lenz et al.) (2001), J. Immunol. 166:5346-5355; Пинто и др. (Pinto et al.) (2003), J. Infect. Dis. 188:327-338; Гербера и др. (Gerber et al.) (2001), Viral. 75:4752-4760; WO 03/024480 и WO 03/024481, каждая из которых включена в полном объеме путем ссылки.
Антитела.
Изобретение предлагает моноклональное и поликлональное антитела, которые связываются с полипептидами или конъюгатами, описанными в настоящем документе. Моноклоналъные антитела.
Моноклональные антитела могут быть получены, например, с использованием гибридомного способа, впервые описанного Колером и др. (Kohler et al.), Nature 256:495, 1975, или способами рекомби-нантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). Согласно гибридомному способу мышь или другое подходящее животное-хозяин, такое как хомяк или макака, иммунизируют, например, используя полипептид или конъюгат, описанный в настоящем документе, чтобы активировать лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с полипептидом или конъюгатом, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты соединяют с клетками миеломы, используя подходящий соединяющий агент, такой как полиэтиленгликоль, чтобы получить гибридомную клетку (Годинг (Goding), Monoclonal Antibodies: Principles и Practice (Моноклоналъные антитела: принципы и практика), стр. 59103, Academic Press, 1986).
Полученные таким образом гидридомные клетки засевают и выращивают в подходящей питательной среде, которая может содержать одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание несоединившихся, родительских миеломных клеток. Например, если родительские миеломные
клетки не имеют фермента гипоксантин-гуанин - фосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), питательная среда для гибридом обычно будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые предотвращают рост клеток с дефицитом HGPRT.
Примерами миеломных клеток являются клетки, которые эффективно соединяются, поддерживают стабильное продуцирование антител на высоком уровне клетками, продуцирующими выбранное антитело, и чувствительны к среде, такой как среда HAT. Из них конкретными миеломными клеточными линиями, которые могут рассматриваться для использования, являются линии мышиных миелом, такие как полученные из опухолей МОРС-21 и МРС-11 мышей, доступных из Института Салка Центра распространения клеток, Сан-Диего, Калифорния, США, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные из Американской коллекции типовых культур, Манассас, Вирджиния, США. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека также описаны как подходящие для продуцирования моноклональных антител человека (Козбор (Kozbor), J. Immunol. 133:3001, 1984; Бродер и др. (Brodeur et al.), Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Способы продуцирования и применения моноклональ-ных антител), стр. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
Питательная среда, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют на продуцирование моноклональных антител, направленных против антигена. Специфичность связывания моноклональных антител, произведенных гибридомными клетками, можно определить путем иммуноосаждения или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммуноанализ (РИА) или ферментный иммуносорбентный тест
(ELISA).
После идентификации гидридомных клеток, которые продуцируют антитела желательной специфичности, аффинности и/или активности, клоны могут быть субклонированы путем ограничения процедур разбавления и роста стандартными способами (Годинг (Goding), Monoclonal Antibodies: Principles и Practice (Моноклинальные антитела: принципы и практика), стр. 59-103, Academic Press, 1986). Культу-ральные среды, подходящие для этой цели, включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Помимо этого, гибридомные клетки могут быть выращены in vivo как асцитные опухоли у животного.
Моноклональные антитела, секретированные субклонами, подходящим образом отделяют от питательной среды, асцитической жидкости или сыворотки традиционными способами очистки иммуноглобулинами, такими как, например, белковая А-сефароза, гидроксилапатитная хроматография, электрофорез на геле, диализ или аффинная хроматография.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и определить ее последовательность, используя известные способы (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи моноклональных антител). Гид-ридомные клетки служат в качестве источника такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которые затем переносят в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомяка (СНО) или миеломные клетки, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулин, чтобы синтезировать моноклональные антитела в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантное продуцирование антител будет более подробно описано ниже.
В еще одном варианте осуществления антитела или фрагменты антитела могут быть выделены из библиотек фагов антител с использованием способов, описанных, например, Маккафферти и др. (McCaf-
ferty et al.), Nature 348:552-554, 1990.
Клаксон и др. (Clackson et al.), Nature 352:624-628, 1991 и Маркс и др. (Marks et al.), J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, описывают выделение антител мышей и человека, соответственно, с использованием библиотек фагов. Последующие публикации описывают продуцирование высоко аффинных (в диапазоне нМ) антител человека путем перестановки цепей (Маркс и др. (Marks et al.), Bio/Technology 10:779-783,
1992) , а также комбинаторное инфицирование и рекомбинацию in vivo как стратегию для построения очень больших библиотек фагов (Уотерхаус и др. (Waterhouse et al.), Nucl. Acids. Res. 21:2265-2266,
1993) . Таким образом, эти способы являются действующими альтернативами традиционным гибридом-ным способам получения моноклональных антител для выделения моноклональных антител.
ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательности для постоянных доменов тяжелых и легких цепей человека вместо гомологичных последовательностей мышей (патент США № 4816567; Моррисон и др. (Morrison et al.), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1984), или путем ковалентного связывания с кодирующей иммуноглобулин последовательностью всей или части кодирующей последовательности для полипептида, не содержащего иммуноглобулин.
Обычно такие полипептиды без иммуноглобулина используют для замены постоянных доменов антител или вариабельных доменов одного объединяющего с антигеном сайта антитела, чтобы создать химерное бивалентное антитело, включающее один сайт объединения с антигеном, имеющий специфичность к антигену, и еще один сайт объединения с антигеном, имеющий специфичность к другому антигену.
Поликлоналъные антитела.
Поликлональные антитела обычно выращивают у животных путем множественных инъекций, например подкожных или интраперитонеальных, соответствующего антигена и адъюванта. В некоторых
случаях может быть полезным конъюгировать полипептид с белком, который иммуногенный для иммунизируемых видов, например с гемоцианином фиссуреллы (KLH), CRM197, токсоидом столбняка, ток-соидом дифтерии, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином, ингибитором соевого трипсина или поликатионом (поли^-лизином или поли^-аргинином), например с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, который известен в данной области, например малеимидобен-зоилсульфосукцинимидным эфиром (конъюнкция через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимидом (через остатки лизина), глутаральдегидом или янтарным ангидридом.
Помимо этого, антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть встречающимся в природе антителом, а также не встречающимся в природе антителом, включая, например, однонитевым антителом, химерным, бифункциональным или гуманизированным антителом, а также его фрагментами, связывающимися с антигеном. Такие не встречающиеся в природе антитела могут быть сконструированы путем твердофазного пептидного синтеза, могут быть продуцированы рекомбинантно или могут быть получены, например, путем скрининга комбинаторных библиотек, как описывают Понсел и др. (Ponsel et al.) (Molecules, 16(5):3675-3700 (2011)). Эти и другие способы получения, например, химерных, гуманизированных, CDR-привитых, однонитевых и бифункциональных антител хорошо известны специалистам в данной области и имеются в продаже.
Белковые антитела к Acinetobacter могут быть выращены с использованием иммуногенного полипептида, такого как выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3-10 или SEQ ID NO: 11-18, или любого из белков, специфических к Acinetobacter baumannii, раскрытых в настоящем документе, или его фрагмента, который может быть получен из природных источников или продуцирован рекомбинантно, или пептидной части белка Acinetobacter baumannii. Такие пептидные части белков Acinetobacter baumannii, раскрытых в настоящем документе, являются функциональными антигенными фрагментами антигенных пептидов, которые можно использовать для создания антитела, специфического к белку Acinetobacter. Неиммуногенный или слабоиммуногенный полипептид или его часть может быть сделан иммуногенным, путем соединения полипептида с молекулой носителя, такого как бычий сывороточный альбумин (BSA) или гемоцианин фиссуреллы (KLH). В данной области хорошо известны другие молекулы носителя и способы соединения полипептида с молекулой носителя (см., например, Харлоу и Лейн (Harlow and Lane), выше, 1988). Иммуногенный фрагмент полипептида также может быть создан путем экспрессии пептидной части как составного белка, например, с глутатион-S-трансферазой (GST), polyHis и т.д. Способы экспрессии слияний пептидов хорошо известны специалистам в данной области (Осубель и др., выше).
Изобретение, кроме того, предлагает способ обнаружения присутствия грамотрицательных бактерий, таких как бактерии рода Acinetobacter, в пробе путем введения пробы в контакт со специфическим антителом и обнаружения присутствия специфического связывания антитела с пробой, этим обнаруживая присутствие грамотрицательных бактерий в пробе. Например, специфические антитела к белку Aci-netobacter можно использовать в способах диагностики, раскрытых в настоящем документе, чтобы обнаруживать уровень присутствия Acinetobacter в пробе.
Используемый здесь термин "проба" предназначен для обозначения любой биологической жидкости, клетки, ткани, органа или их части, которые включают или потенциально включают нуклеиновые кислоты или полипептиды. Термин включает пробы, присутствующие в пациенте, а также пробы, полученные или производные от пациента. Например, пробой может быть гистологический срез образца, полученного биопсией, или клетки, которые помещены в культуру ткани или адаптированы к ней. Пробой, кроме того, может быть субклеточная фракция, или экстракт, или сырая или, по существу, чистая нуклеиновая кислота, или белковый препарат.
Иммунологические процедуры, подходящие для обнаружения in vitro целевых белков Acinetobacter в пробе, включают иммунологические анализы, в которых используется обнаруживаемое антитело. Такие иммунологические анализы включают, например, иммуногистохимию, иммунофлуоресценцию, анализы ИФА, радиоиммуноанализ, анализ FACS, иммуноосаждение, иммуноблот-анализ, микрофлуори-метрический анализ Pandex, агглютинационные анализы, проточную цитометрию и диагностические анализы сыворотки, которые хорошо известны в данной области (Харлоу и Лейн, выше, 1988; Харлоу и Лейн, Using Antibodies: A Laboratory Manual (Использование антител: лабораторное руководство), Cold Spring Harbor Press (1999)).
Антитело может быть сделано обнаруживаемым разными средствами, хорошо известными в данной области. Например, обнаруживаемый маркер может быть прикреплен прямо или косвенно к антителу или с использованием, например, вторичного агента, который распознает антитело к белку Acinetobacter. Подходящие маркеры включают, например, радионуклеотиды, ферменты, связывающиеся белки, такие как биотин, фторогены, хромогены и хемилюминисцентные метки.
Метки, которые подходят для изобретения, включают одиночные атомы и молекулы, которые прямо или косвенно вовлечены в продуцирование обнаруживаемого сигнала. Любая метка или индикатор может быть связана с нуклеиновыми кислотами, полипептидами или антителами изобретения. Эти атомы или молекулы могут быть использованы отдельно или вместе с дополнительными реагентами. Сами такие метки хорошо известны в клинической диагностической химии.
В одном варианте осуществления меткой может быть флуоресцентная метка, которая химическим путем связывается с антителами без денатурации, чтобы образовать фторохром (краситель), который является полезным иммунофлуоресцентным индикатором. Способы получения и использования флуоресцентного агента-метки хорошо известны в данной области и имеются в продаже.
В одном варианте осуществления метящей группой может быть фермент, такой как пероксидаза хрена (HRP), оксидаза глюкозы и т.д. В еще одном варианте изобретения в качестве метящих агентов применяются радиоактивные элементы. Связывание метки с субстратом, т.е. мечение нуклеиновых кислот, антител и полипептидов, хорошо известно в данной области. Например, антитело изобретения может быть помечено путем метаболического включения меченой радиоактивным изотопом аминокислоты, полученной в питательной среде. См., например, Галфре и др. (Galfre et al.), Meth. Enzymol, 73:3-46 (1981). Помимо этого, антитело изобретения может быть помечено путем инкубации антитела изобретения, конъюгированного с бифункциональным хелатором в растворе радиоактивных изотопов. См., например, патент США № 7229620. Известные средства конъюнкции или соединения белков активированными функциональными группами имеются в продаже.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе. Эти способы могут включать контакт пробы с антителом, как сказано в настоящем документе, и обнаруживать присутствие специфического связывания антитела с пробой, посредством чего обнаруживается присутствие Acinetobacter в пробе. В некоторых аспектах связывание антитела происходит со специфическим белком Acinetobacter, определенным в настоящем документе. Например, способ может включать связывание с белком 1 наружной мембраны Acinetobacter конъюгир, белком 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белком теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактором элонгации G Acinetobacter baumannii, прекурсором белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, трансмембраной предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, предполагаемым чувствительным к глюкозе порином (подобным OprB) Acinetobacter baumannii, составным белком мембраны AdeA Acinetobacter baumannii, белком деления клеток Acinetobacter baumannii, или белком FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii, который присутствует в пробе.
Композиции и способы, описанные для обнаружения и анализа Acinetobacter, в равной степени применимы к обнаружению Candida.
Вакцины и содержащие антитело фармацевтические композиции.
Составы вакцин и содержащих антитело фармацевтических композиций (совместно "композиции"), которые описаны в настоящем документе, могут быть приготовлены с использованием стандартных химических способов и методологий приготовления фармацевтических составов, которые легко доступны среднему специалисту. Например, полипептиды, конъюгаты или антитела, описанные в настоящем документе, могут быть объединены с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями или средами. Вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные вещества для регулировки рН и т.д., могут присутствовать в наполнителе или среде. Эти наполнители, среды и вспомогательные вещества обычно являются фармацевтическими агентами, которые не вызывают иммунную реакцию у пациента, принимающего композицию, и которые могут быть введены без ненужной токсичности. Фармацевтически приемлемые наполнители включают, но без ограничения, жидкости, такие как вода, физраствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновую кислоту, глицерин и этанол. Также могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.д., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д.. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей, сред и вспомогательных веществ можно найти в Фармакологии Ремингтона
(Mack Pub. Co., N.J. 1991).
Такие композиции могут быть приготовлены, упакованы или предлагаться в продаже в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Композиции для инъекций могут быть приготовлены, упакованы или предлагаться в продаже в форме единичной дозы, такой как ампулы, или в контейнерах на несколько доз, содержащих консервант. Композиции могут включать, но без ограничения, суспензии, растворы, эмульсии в масляной или водной среде, пасты и имплантируемые формы с продолженным высвобождением или биоразлагаемые. Такие композиции могут кроме того включать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая, но без ограничения, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие вещества. В одном варианте осуществления композиции для парентерального введения активный ингредиент представлен в сухой (например, порошок или гранулы) форме для восстановления подходящей средой (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением восстановленной композиции. Композиции могут быть приготовлены, упакованы или предлагаться в продаже в форме стерильной водной или масляной суспензии или раствора для инъекций. Эта суспензия или раствор могут быть приготовлены согласно известному уровню техники и могут включать, в дополнение к активному ингредиенту, дополнительные ингредиенты, такие как дис-пергаторы, смачивающие агенты или суспендирующие агенты, описанные в настоящем документе. Такие
стерильные композиции для инъекций могут быть приготовлены с использованием нетоксичного, приемлемого для парентерального введения разбавителя или растворителя, такого как, например, вода или 1,3-бутандиол. Другие приемлемые разбавители и растворители включают, но без ограничения, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и фиксированные масла, такие как синтетические моно-или диглицериды.
Другие подходящие композиции для парентерального введения включают те, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме, в липосомном препарате или как компонент биораз-лагаемых полимерных систем. Композиции для продленного высвобождения или имплантации могут включать фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы, такие как эмульсия, ионообменная смола, труднорастворимый полимер или труднорастворимую соль.
Альтернативно, полипептиды, конъюгаты и антитела, описанные в настоящем документе, могут быть инкапсулированы, адсорбированы на корпускулярные носители или связаны с ними. Подходящие корпускулярные носители включают производные полимеров полиметилметакрилата, а также микрочастицы PLG, полученные из полилактидов и полилактидкогликолидов. См., например, Джеффери и др. (Jeffery et al.) (1993) Pharm. Res. 10:362-368. Могут быть использованы и другие корпускулярные системы и полимеры, например такие полимеры, как полилизин, полиаргинин, полиорнитрин, спермин, спер-мидин, а также конъюгаты этих молекул.
Приготовленные композиции будут включать некоторое количество одного или нескольких полипептидов или конъюгатов, описанных в настоящем документе, которого достаточно для создания иммунной реакции. Иммуногенное количество может легко определить специалист в данной области. Такое количество попадает в относительно широкий диапазон, который можно определить посредством обычных экспериментов. Композиции могут содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 99,9% полипептидов, конъюгатов или антител и могут быть введены непосредственно пациенту или, альтернативно, доставлены ex vivo, к клеткам, взятым у пациента, с использованием способов, известных специалистам в данной области.
Композиции могут включать смесь разных полипептидов, конъюгатов или антител, описанных в настоящем документе. Например, вакцины могут включать, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше разных полипептидов или конъюгатов, описанных в настоящем документе, например, содержащих или состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 3-10 или 11-18, или их вариантной последовательности, имеющей до трех замен, делеций или добавлений в аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или 11-18. В одном варианте осуществления вакцина включает восемь разных полипептидов, причем аминокислотная последовательность восьми полипептидов состоит из последовательности из SEQ ID NO: 11-18. В еще одном варианте изобретения содержащие антитело фармацевтические композиции могут включать смесь моноклональных или поликлональных антител, имеющих, например, разную специфичность к полипептидам или конъюгатам, описанным в настоящем документе.
Вещества, которые стимулируют иммунную реакцию, например адъюванты, могут быть включены в композиции, например в вакцины. Примеры химических соединений, используемых в качестве адъю-вантов, включают, но без ограничения, соединения алюминия (например, квасцы, Альгидрогель), масла, блок-полимеры, иммуностимулирующие комплексы, витамины и минералы (например, витамин Е, витамин А, селен и витамин В12), Quil А (сапонины), компоненты клеточных стенок бактерий и грибков (например, липополисахариды, липопротеины и гликопротеины), гормоны, цитокины и костимулирующие факторы.
В еще одном аспекте изобретение предлагает композицию вакцины, включающей: иммуногенное количество полипептида HYR1, описанного в настоящем документе, составной белок, описанный в настоящем документе, белок HYR1 (SEQ ID NO: 1) или его фрагмент, белок 1 наружной мембраны Acine-tobacter baumannii или его фрагмент, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii или его фрагмент, белок рецептора с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii или его фрагмент, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii или его фрагмент, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii или его фрагмент, прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Acinetobac-ter baumannii или его фрагмент, трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acine-tobacter baumannii или ее фрагмент, предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii или его фрагмент, составной белок мембраны AdeA Acinetobacter baumannii или его фрагмент, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или его фрагмент или белок FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii или его фрагмент. Композиция вакцины может включать адъювант. Состав композиции вакцины изобретения эффективно индуцирует защитный иммунитет у пациента, стимулируя специфические гуморальные (нейтрализующие) антитела и иммунные реакции, опосредованные клетками эффектора, полипептиду антигену. Композиция вакцины изобретения также используется при лечении или профилактике инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, такими как, например, бактериями рода Acinetobacter, включающими, например, Acinetobacter baumannii.
Вакцина настоящего изобретения будет содержать иммунозащитное количество полипептид антигенов и может быть приготовлена способами, хорошо известными в данной области. Приготовление вак
цин в общем описано, например, М.Ф. Пауэллом и М.Дж. Ньюменом (МТ. Powell and M.J. Newman), eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (1995); Э. Робинсоном, М. Кренед-жем и М. Хадсоном (A. Robinson, M. Cranage, and M. Hudson), eds., "Vaccine Protocols (Methods in Molecular Medicine)," Humana Press (2003); и Д. Охаганом (D. Ohagan), ed., "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine),"Humana Press" (2000).
Полипептиды изобретения и их пептидные фрагменты могут включать иммуногенные эпитопы, которые могут быть идентифицированы экспериментальными способами, хорошо известными в данной области. Помимо этого, для идентификации иммуногенных эпитопов также может быть использовано вычислительное моделирование. См., например, Тонг и др. (Tong et al.) (Brief Bioinform. 8(2):96-108 (2006)) и Пономаренко и др. (Ponomarenko et al.) (2008) "B-cell epitope prediction", в Structural Bioinfor-matics, Bourne P.E. and Gu J. (eds) Wiley-Liss; 2 изд, стр. 849-879. После идентификации эпитопа, имеющего реактивность с антителом, выведенным против интактного белка, пептид может быть испытан на специфичность путем замены аминокислоты в каждом положении и/или расширения на С- и/или N-конце. Такой эпитоп, имеющий полипептиды, обычно содержит по меньшей мере 6-14 аминокислотных остатков и может быть продуцирован, например, синтезом полипептида с использованием способов, хорошо известных в данной области, или путем фрагментации существующего полипептида. По отношению к молекуле, используемой в качестве иммуногена согласно настоящему изобретению, специалисты в данной области поймут, что полипептид может быть усечен или фрагментирован без потери существенных качеств иммуногенной вакцины. Например, полипептид может быть усечен, чтобы получить N-концевой фрагмент путем отсечения от С-конца с сохранением функциональных свойств молекулы как иммуногенной. Подобно этому С-концевые фрагменты могут быть получены путем отсечения от N-конца с сохранением функциональных свойств молекулы как иммуногенной. Другие модификации в соответствии с настоящим документом могут быть выполнены согласно настоящему изобретению, чтобы создать другие функциональные фрагменты, иммуногенные фрагменты, варианты, аналоги полипептида или его производных, чтобы получить терапевтически полезные свойства, описанные в настоящем документе, у нативных белков и полипептидов.
Композиции вакцин изобретения, кроме того, включают обычные фармацевтические носители. Подходящие носители хорошо известны хорошо известны специалистам в данной области. Эти композиции вакцин могут быть приготовлены в жидких формах единичных доз. Другие компоненты, добавляемые по выбору, например стабилизаторы фармацевтического класса, буферы, консерванты, наполнители и т.д., могут быть легко выбраны специалистом в данной области. Однако композиции могут быть лиофилизированы и восстановлены перед использованием. Альтернативно, композиции вакцин могут быть приготовлены любым способом, подходящим для выбранного режима введения, например интрана-зального, перорального и т.д. Приготовление фармацевтически приемлемой вакцины с должным учетом рН, изотоничности, стабильности и т.д., известно специалистам в данной области.
Иммуногенность композиций вакцин изобретения может быть далее усилена, если вакцина будет также содержать вещество-адьювант. Известны разные способы достижения эффектов адъюванта для вакцины. Общие принципы и способы детализированы в публикации "Vaccine Design: Innovative Approaches and Novel Strategies", 2011, Rappuoli R. and Bagnoli F. (eds.), Caister Academic Press, и также в публикации "Vaccine Adjuvants and Delivery Systems", 2007, Singh M. (ed.), John Wiley & Sons, Inc.
Вакцины согласно изобретению относятся к композиции, которая может быть введена пациенту для защиты его от инфекционного заболевания. Вакцины защищают от заболеваний, индуцируя или увеличивая иммунную реакцию в животном против инфекционного заболевания. Примеры инфекционных заболеваний, поддающихся лечению вакцинами изобретения, включают тяжелую пневмонию, инфекции мочевых путей, инфекции кровеносной системы и инфекции других частей тела. Опосредованная вакциной защита может быть гуморальным и/или опосредованным клетками иммунитетом, индуцированном в организме-хозяине, когда на пациента воздействуют иммуногенной частью полипептида или белка, описанного в настоящем документе.
В дополнение к вакцинации пациентов, восприимчивых к инфекциям Acinetobacter или Candida или и тем и другим, композиции вакцин настоящего изобретения также могут быть использованы для лечения, иммунотерапевтически, пациентов, страдающих от разных инфекций, вызываемых грамотрицатель-ными бактериями. Соответственно, вакцины, которые содержат один или несколько композиций полипептидов и/или антител, описанных в настоящем документе, в сочетании с адъювантами, могут применяться для целей профилактического или терапевтического лечения инфекций, вызываемых грамотрица-тельными бактериями. В одном варианте осуществления вакцины настоящего изобретения будут индуцировать собственную иммунную систему организма, чтобы найти и ингибировать грамотрицательные бактерии или бактерии Candida или и те и другие.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает способ лечения или профилактики инфекции от грамотрицательных бактерий нуждающегося в этом пациента путем введения терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, раскрытой в настоящем документе, или композиции вакцины, раскрытой в настоящем документе. Например, изобретение предлагает способы лечения или предотвращения инфекций, вызываемых одной или несколькими грамотри
цательными бактериями, включая бактерии рода Acinetobacter, такие как A. baumannii, A. iwoffii, A. hae-molyticus, A. calcoaceticus, A. johnsonii, A. radioresistens и A. junii, бактерии рода Haemophilus, такие как Н. aegyptius, Н. aphrophilus, H. avium, H. ducreyi, H. felis, H. haemolyticus, H. influenza, H. parainfluenzae, Н. paracuniculus, Н. parahaemolyticus, H. pittmaniae и Н. somnus, бактерии рода Bordetella, такие как В. ansorpii, В avium, В. bronchseptica, В. hinzii, В. holmesii, В. parapertussis, В. pertussis, В. petrii и В. trematum, бактерии рода Salmonella, такие как S. typhimurium, S. bongori, S. enterica subsp. enterica, S. en-terica subsp. salamae, S. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae и S. enterica subsp. indica, бактерии рода Yersina, такие как Yersina pseudotuber, Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. en-terocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei и Y. ruckeri, бактерии рода Escherichia, такие как E. albertii, E. blattae, E. coli, E. fergusonii, E. her-mannii и E. vulneris, бактерии рода Pedobacter, такие как P. heparinus, P. roseus sp. nov. и Р. aquatilis sp. nov, бактерии рода Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, P. alcaligenes, P. mendocina, P. fluorescens, P. monteilii, P. oryzihabitans, P. luteola, P. putida, P. cepacia, P. stutzeri, P. maltophilia, P. putrefaciens, P. mallei и Р. pseudomallei, или бактерии рода Klebsiella, такие как K. pneumoniae, K. planticola K. oxytoca и K. rhino-scleromatis. В других вариантах осуществления лечение или профилактика может относиться к видам Candida, раскрытым в настоящем документе.
Более того, изобретение также предлагает, что в дополнение к отдельному введению вакцины и фармацевтические композиции изобретения могут быть введены совместно с одним или несколькими антибиотиками. Антибиотики, которые подходят для совместного введения, могут быть легко определены специалистом в данной области. Неограничивающие примеры антибиотиков, которые подходят для совместного введения, включают антибиотик карбапенем, такой как имипенем, или антибиотик второй линии, такой как полимиксины, тигециклин или аминогликозиды. См., например, Бассетти и др. (Bassetti et al.) (Future Microbiol., 3(6): 649-60 (декабрь 2008)).
Лечение.
Изобретение предлагает способы вакцинации млекопитающего против кандидоза, включая введение животному вакцины, описанной в настоящем документе, этим вакцинируя млекопитающего против кандидоза. Помимо этого, изобретение предлагает способы пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза, включая введение млекопитающему эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, этим пассивно иммунизируя млекопитающего против кандидоза. Кандидоз может включать, например, рассеянный кандидоз, например кандидоз, рассеянный в крови, или кандидоз слизистой. В некоторых случаях кандидоз вызван, например, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kruset, Candida parapsilosis или Candida tropicalis. Другие виды Candida включают Candida lusitaniae и Candida stellatoidea.
Вакцины и содержащие антитело фармацевтические композиции (совместно "композиции"), которые описаны в настоящем документе, могут быть введены с профилактическими или терапевтическими целями отдельно или в сочетании с другими, известными в данной области композициями, которые индуцируют защитные реакции против патогенов (например, вирусных, бактериальных, грибковых или паразитарных патогенов), опухолей или раков, аллергенов, аутоиммунных расстройств или отторжения трансплантата. Например, композиции могут быть введены одновременно, отдельно или последовательно, например, с другой иммунизирующей вакциной, такой как вакцина против, например, гриппа, малярии, туберкулеза, оспы, кори, краснухи, свинки, или с любыми другими вакцинами, известными в данной области.
Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть доставлены млекопитающему пациенту (например, человеку или другому млекопитающему, указанному в настоящем документе) путем использования разных известных путей и способов. Например, композиция может иметь форму раствора, суспензии или эмульсии для инъекций и вводиться как внутримышечная, подкожная, внутрикожная, внутриполостная, парентеральная, эпидермальная, внутриартериальная, интраперитонеальная или внутривенная инъекция с использованием обычной иглы и шприца или с использованием струйной системы для жидких инъекций. Композиции также могут быть введены топикально на кожу или слизистую ткань, например, назально, внутритрахеально, интестинально, ректально или вагинально, или же иметь форму мелкого аэрозоля, подходящего для респираторного или пульмонального введения. Другие режимы введения включают пероральное введение, свечи и способы активной или пассивной трансдермальной доставки.
Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть введены млекопитающему пациенту (например, человеку или другому млекопитающему, указанному в настоящем документе) в количестве, которое совместимо с дозировкой и будет иметь профилактический и/или терапевтический эффект. Подходящее эффективное количество подпадает под относительно широкий диапазон, но может быть легко определено специалистом в данной области путем обычных испытаний. Для цели определения необходимого количества можно использовать публикации "Настольная книга врача" (Physicians Desk Reference) и "Фармакологические основы клинической медицины Гудмена и Гилмена" (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics).
Профилактика или терапия могут быть осуществлены путем одиночного прямого введения за один
раз или путем множественных введений, по выбору в разные моменты времени. Введение также может быть направлено на доставку к одному или нескольким местам. Специалисты в данной области могут регулировать дозировку и концентрацию для конкретного пути доставки. В одном варианте осуществления одну дозу вводят в единичном случае. В альтернативном варианте осуществления несколько доз вводят пациенту в одном случае, но, например, в разных местах. В еще одном варианте осуществления несколько доз вводят в нескольких случаях. Такие множественные дозы могут быть введены сериями, т.е. путем множественных введений в разных местах за один раз, или могут быть введены по отдельности, с одним введением в каждом из нескольких случаев (по выбору, в разных местах). Можно использовать любое сочетание таких режимов введения.
В одном варианте осуществления разные композиции изобретения могут быть введены в разных местах или в разные случаи как часть одного режима лечения.
Разные введения могут быть выполнены в одном случае, в тот же день, через один, два, три, четыре, пять или шесть дней или через одну, две, три, четыре или больше недель. В некоторых случаях введения разделяют 1-5 недель, например 2-4 недели, т.е. 2, 3 или 4 недели. График и хронометраж таких множественных введений могут быть оптимизированы для конкретной вакцины или фармацевтической композиции специалистом в данной области путем обычных испытаний.
Используемый здесь термин "лечение" предназначен для обозначения уменьшения клинического симптома, указывающего на бактериальную инфекцию. Уменьшение клинического симптома включает, например, уменьшение по меньшей мере одного симптома бактериальной инфекции у пациента, получающего лечение, по сравнению с уровнями до лечения или по сравнению с пациентом с бактериальной инфекцией. Лечение также включает уменьшение тяжести патологического состояния, хронического осложнения или оппортунистической инфекции, которая связана с бактериальной инфекцией. Патологические состояния, хронические осложнения и оппортунистические инфекции также описаны, например, в руководстве "Merck Manual", Sixteenth Edition, 1992, и в публикации "Acinetobacter: Molecular Biology", Ulrike Gerischer (Editor), Caister Academic Press; 1st edition (2008).
Используемые здесь термины "профилактика" или "предотвращение" предназначены для обозначения предотвращения клинического симптома, указывающего на бактериальную инфекцию. Такое предотвращение включает, например, поддержание нормальных физиологических индикаторов пациента с риском инфицирования бактериями перед развитием явных симптомов такого состояния или перед диагнозом такого состояния. Поэтому профилактика может включать профилактическое лечение пациентов, чтобы защитить их от случая бактериальной инфекции. Предотвращение бактериальной инфекции у пациента также должно включать ингибирование или остановку развития инфекции. Ингибирование или остановка развития состояния включает, например, ингибирование или остановку проявления ненормальных физиологических индикаторов или клинических симптомов, таких как покраснение, жар, разбухание и локализованная боль и/или других хорошо известных симптомов. Поэтому эффективное предотвращение бактериальной инфекции включает поддержание нормальной температуры и массы тела или предотвращение других патологических проявлений у пациента, предрасположенного к бактериальной инфекции. Пациенты, предрасположенные к бактериальной инфекции включают пациента с ухудшенным иммунным состоянием, например, но без ограничения, пациента со СПИДом, азотемией, сахарным диабетом, диабетическим кетоацидозом, нейропенией, бронхоэктазией, эмфиземой, туберкулезом, лимфомой, лейкемией или ожогами или пациента, получающего химиотерапию, с трансплантацией костного мозга, стволовых клеток и/или твердого органа или пациента с историей восприимчивости к бактериальной инфекции. Ингибирование или остановка развития состояния также включает, например, ингибирование или остановку прогресса одного или нескольких патологических состояний, хронических осложнений или восприимчивости к оппортунистической инфекции, связанной с бактериями.
Дозировки.
Подходящая доза вакцин или содержащих антитело фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, может изменяться в зависимости от таких факторов как способ приготовления, способ введения, возраст, масса тела и пол пациента, тяжесть симптомов, время введения, путь введения, частота экскреции и чувствительность. Средний врач в этой области легко определит и диагностирует дозу, эффективную для лечения.
Композиции могут быть приготовлены как единичные дозы или множественные дозы специалистами в этой области с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или наполнителя согласно способу, известному в данной области.
Векторы.
Изобретение также предлагает векторы, содержащие нуклеиновые кислоты изобретения. Подходящие экспрессирующие векторы хорошо известны в данной области и включают векторы, способные экс-прессировать нуклеиновую кислоту, оперативно связанную с регуляторной последовательностью или элементом, таким как участок промотора или участок энхансера, который способен регулировать экспрессию нуклеиновой кислоты. Подходящие экспрессирующие векторы включают векторы, которые могут реплицироваться в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, и векторы, которые остаются эписомальными или интегрируются в геном клетки-хозяина.
Термины "вектор", "клонирующий вектор" и "экспрессирующий вектор" означают средство, которым нуклеиновая кислота может быть введена в клетку хозяина. Вектор можно использовать для репродукции или размещения нуклеиновой кислоты или для экспрессии полипептида кодированной последовательности. В данной области известен широкий круг векторов, которые включают, например, плазми-ды, фаги и вирусы. Примеры векторов описаны, например, в публикациях Сэмбрука и др. (Sambrook et al.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; и Осубеля и др. (Ausubel et al.), "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley и
Sons, Baltimore, MD (1999)).
Промоторы и энхансеры, в зависимости от характера регулирования, могут быть конститутивными или регулируемыми. Регуляторные последовательности или регуляторные элементы оперативно связаны с нуклеиновой кислотой изобретения, так что физическое и функциональное отношение между нуклеиновой кислотой и регуляторной последовательностью позволяет осуществлять транскрипцию нуклеиновой кислоты.
Векторы, подходящие для экспрессии в эукариотических клетках, могут включать, например, регу-ляторные элементы, включая ранний промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), индуцируемый стероидом промотор вируса опухоли молочных желез мыши (MMTV), промотор вируса Молони, вызывающего лейкемию у мышей (MMLV) и т.д. Векторы изобретения подходят для субклонирования и амплификации молекулы нуклеиновой кислоты и для рекомбинантной экспрессии полипептида, раскрытого в настоящем документе. Вектор изобретения может включать, например, вирусные векторы, такие как бактериофаг, бакуловирус или ретровирус; космиды или плазмиды; и, в частности для клонирования больших молекул нуклеиновых кислот, векторы бактериальных искусственных хромосом (ВАС) и векторы дрожжевых искусственных хромосом (YAC). Такие векторы имеются в продаже, и их использование хорошо известно в данной области. Специалист в данной области узнает или сможет легко определить подходящий промотор для экспрессии в конкретной клетке-хозяине.
Изобретение помимо этого предлагает рекомбинантные клетки, содержащие нуклеиновые кислоты изобретения. Рекомбинантные клетки получают, вводя в клетку-хозяин вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты. Такие рекомбинантные клетки трансдуцированы, трансформированы или иначе генетически модифицированы. Примеры клеток-хозяев, которые могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных молекул, включают первичные клетки млекопитающего; установившиеся клеточные линии млекопитающего, такие как клетки COS, CHO, HeLa, NIH3T3, HEK 293 и PC12; клетки земноводных, такие как эмбрионы и ооциты Xenopus; и клетки других позвоночных. Примеры клеток-хозяев также включают клетки насекомых, таких как Drosophila, клетки дрожжей, таких как Saccharomyces cere-visiae, Saccharomyces pombe или Pichia pastoris, и прокариотические клетки, такие как Escherichia coli.
Варианты осуществления настоящего изобретения также предлагают специфические полипептиды HYR1, которые могут действовать как антигены для создания иммунной реакции на грамотрицательные бактерии, включая бактерии рода Acinetobacter, например Acinetobacter baumannii. В некоторых аспектах изобретения полипептиды HYR1 изобретения включают аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO: 3-10, а также из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO: 12), CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18). Более того, в некоторых аспектах изобретения полипептид HYR1 может включать меньше чем 937, 936, 935, 934, 933, 932, 931, 930, 920, 910, 900, 890,
880, 870, 860, 850, 840, 830, 820, 810, 800, 790, 780, 770, 760, 750, 740, 730, 720, 710, 700, 690, 680, 670, 660, 650, 640, 630, 620, 610, 600, 590, 580, 570, 560, 550, 540, 530, 520, 510, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220,
210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков в длину и может быть иммуногенным. В некоторых аспектах изобретения полипептиды HYR1 изобретения не являются полипептидом HYR1 SEQ ID NO: 1.
В других аспектах изобретение также предлагает варианты осуществления, в которых полипептиды включают больше чем одну аминокислотную последовательность, соответствующую любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или SEQ ID NO: 11-18. Например, полипептиды изобретения могут включать две аминокислотных последовательности, такие как SEQ ID NO: 15 в сочетании с SEQ ID NO: 12, или, альтернативно, SEQ ID NO: 11 в сочетании с SEQ ID NO: 17, или, альтернативно, SEQ ID NO: 13 в сочетании с SEQ ID NO: 18. При этом понимается, что полипептиды изобретения могут включать две, три, четыре, пять, шесть, семь или все восемь аминокислотных последовательностей, выбираемых из SEQ ID NO: 310 или SEQ ID NO: 11-18. Также при этом понимается, что аминокислотная последовательность необязательно должна быть сцепленной и может быть связана промежуточными спейсерными последовательностями, которые могут, например, позволять полипептиду представлять желательную аминокислотную последовательность или эпитоп для создания иммунной реакции.
В некоторых аспектах изобретения полипептиды изобретения включают, по существу, ту же аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или SEQ ID NO: 11-18. Например, аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%
идентичности последовательности с любой одной из SEQ ID NO: 11-18, в которой фрагмент полипептида может быть связан антителом к HYR1, раскрытым в настоящем документе. В других аспектах полипептид HYR1 изобретения может быть иммуногенным и способным активировать продуцирование антитела к HYR1 или иммуногенную реакцию у пациента.
Как сказано в настоящем документе, полипептиды изобретения могут охватывать, по существу, одинаковые аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере приблизительно 65% идентичности по отношению к контрольной аминокислотной последовательности и сохраняющие сравнимую функциональную и биологическую активность, характерную для контрольной аминокислотной последовательности. В одном аспекте полипептиды, имеющие, по существу, такую же аминокислотную последовательность, будут иметь по меньшей мере 65% идентичности, по меньшей мере 70% идентичности, по меньшей мере 75% идентичности, по меньшей мере 80% идентичности, по меньшей мере 85% идентичности, по меньшей мере 90% идентичности, по меньшей мере 95% идентичности, по меньшей мере 98% идентичности или по меньшей мере 99% идентичности. При этом понимается, однако, что полипептиды или кодирующие нуклеиновые кислоты, содержащие меньше чем указанные уровни идентичности последовательности, являющиеся сплайсовыми вариантами или модифицированные консервативными заменами аминокислот или заменой дегенеративных кодонов также входят в объем настоящего изобретения.
Примеры
Следующий пример предназначен для иллюстрации изобретения. Он не предназначен для ограничения изобретения каким-либо образом.
Пример I. Активная и пассивная иммунизация с помощью rHyr1-N защищает от кандидоза, рассеянного в крови.
HYR1 относится к семейству генов IFF С. albicans, которое включает 12 членов. Он кодирует белок, сцепленный с гликозилфосфатдиинозитолом (ГФИ) клеточной поверхности, который экспрессируется во время образования гифов. Ранее было доказано, что Hyr1p опосредует стойкость С. albicans к умерщвлению фагоцитов in vitro и способствует повышенной грибковой нагрузке на органы, богатые фагоцитами (например, печень и селезенка). Нативный HYR1 положительно регулируется фактором транскрипции Bcr1p. Было установлено, что автономная экспрессия HYR1 обращает гипервосприимчивость к опосредованному фагоцитами умерщвлению нулевого мутанта bcr1 С. albicans in vitro. Кроме того, гетероло-гичная экспрессия HYR1 в С. glabrata делает организм более стойким к умерщвлению нейтрофилами. Предыдущие исследования также показали, что вакцина на основе рекомбинантного N-конца Hyr1p (rHyr1p-N) заметно улучшает выживание иммунокомпетентных мышей, инфицированных внутривенно С. albicans в смеси с адъювантом Фрейнда или квасцами в качестве адъюванта.
Настоящие исследования были выполнены, помимо прочего, для дальнейшего уточнения эффективности вакцины на основе rHyr1p-N у иммунокомпетентных и иммунодефицитных мышей с использованием одобренных Управлением США по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами (FDA) квасцов в качестве адъюванта. Кроме того, объем защиты, индуцируемой rHyr1p-N, оценивали по эффективности против видов, отличных от albicans Candida. В заключение, мы хотели изучить потенциальное использование пассивной иммунной терапии при рассеянном кандидозе с применением антитела к Hyr1.
Материалы и способы.
Штаммы Candida и условия роста.
С. albicans 15663, С. glabrata 31028, С. parapsilosis 22019 и С. tropicahs 4243 являются клиническими изолятами из потока крови, полученными от Медицинского центра UCLA в Харборе. С. krusei 91-1159 был любезно предоставлен Майклом Риналди из Сан-Антонио, штат Техас. Штаммы С. albicans СААН-31 и ТНЕ31 были получены генно-инженерным путем, как сказано в нашем предыдущем исследовании, и доксициклин использовали для регулирования экспрессии HYR1, как сказано у Луо и др. [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 1718-1728 (2010)]. Все испытанные штаммы были обычным образом выращены в среде YPD (2% бактопептона, 1% экстракта дрожжей, 2% декстрозы). Плотности клеток определяли путем подсчета в гемацитометре.
Продуцирование rHyr1p-N.
rHyr1p-N, помеченный 6XHis, продуцировали в Е. coli и очищали аффинной колонкой с Ni-агарозой, как было описано ранее [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 1718-1728 (2010)]. Эндотоксин удалили из rHyr1p-N, используя набор ProteoSpin для удаления эндотоксина (компания Norgen Bioteck Corporation, Онтарио, Канада), и уровень эндотоксина определяли с помощью эндохрома лизата амебоцитов мечехвоста (Charles River Laboratories, Уилмингтон, Массачусетс) согласно инструкции изготовителя. При использовании этой процедуры эндотоксин был уменьшен до уровня <0,1 EU на дозу вакцины.
Поликлональные антитела синтезированных пептидов и кролика к Hyr1p.
Восемь пептидов, производных от rHyr1p-N (табл. 1) были коммерчески синтезированы и использовались для создания антител к Hyr1p. Пептиды имели чистоту > 85%, которая была определена ЖХВР и масс-спектрометрией (компания GenScript, Пискатауэй, Нью-Джерси). Они были конъюгированы с ге-моцианином фиссуреллы (KLH) перед отдельным выращиванием антисыворотки кролика с использованием стандартного протокола иммунизации (компания GenScript, Пискатуэй, Нью-Джерси). Весь IgG из
смешанной сыворотки был аффинно очищен с использованием протеина A Pierce плюс агароза (компания Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс) согласно инструкции изготовителя перед введением в ходе исследований пассивной иммунизации.
Иммунофлуоресцентное обнаружение клеточной локализации Hyr1p.
Косвенную иммунофлуоресценцию выполнили, используя смешанный кроличий IgG к Hyr1p, выращенный против 8 пептидов r-Hyr1p-N, как было описано раньше [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 17181728 (2010)]. Вкратце, бластоспоры С. albicans (1x107) предварительно проращивали в RPMI 1640 в течение 90 мин при 37°С и перенесли на предметное стекло с 4 лунками (компания Nalge Nunc International). После инкубации при 4°С в течение 30 мин клетки блокировали с помощью 300 мкл 1,5% сыворотки мыши, затем окрашивали раствором 1:500 или 1) смешанного IgG к Hyr1, 2) смешанного IgG к Hyr1p, абсорбированного гифами С. albicans (путем четырехкратной инкубации смешанного IgG с гифами (1x107) С. albicans в течение 30 мин, каждый раз на льду), или 3) контрольного IgG кролика. Клетки контрастно окрашивали помеченным флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) IgG козы, являющимся антителом к кролику, с разбавлением 1:100 перед получением изображений с помощью флуоресцентного микроскопа Axioskop от компании Zeiss.
Протокол иммунизации и исследования на животных.
Все активные вакцинации проводили, как было описано раньше [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 17181728 (2010)] Вкратце, молодых (10-12 недель) мышей Balb/C вакцинировали подкожно 30 мкг rHyr1p-N в смеси с квасцами (2% Альгидрогель; компания Brenntag Biosector, Фредериксзунд, Дания) в качестве адъюванта в фосфатном буферном физрастворе (PBS) в день 0, вводили такую же бустер-дозу в день 21, затем инфицировали через хвостовую вену в день 35 [Ibrahim et al., Infect. Immun. 73:999-1005 (2005)]. Контрольных мышей вакцинировали только квасцами.
Для проверки эффективности вакцины у иммунодефицитных мышей их вакцинировали перед индукцией нейтропении путем интраперитонеальной инъекции циклофосфамида в количестве 200 мг/кг в день -2, после чего вводили еще одну дозу 100 мг/кг в день +7 относительно инфицирования. Этот режим приводит приблизительно к 10 суткам лейкопении с уменьшением числа нейтрофилов, лейкоцитов и моноцитов, как было описано раньше [Spellberg et al., Infect. Immun. 73:6191-6193 (2005); Fu et al., Eukaryot. Cell. 7:483-492 (2008); Sheppard et al., Antimicrob. Agents Chemother. 48:1908-1911 (2004)]. Для иммуно-компетентных и нейтропенических мышей различия в выживании между вакцинированными и вакцинированными адъювантом мышами сравнивали, используя критерий Мантела-Кокса.
пассивной иммунизации иммунный IgG вводили интраперитонеально ранее не использовавшимся в опытах мышам за 2 ч перед внутривенной инъекцией С. albicans. Контрольным мышам давали IgG, совпадающий с изотипом (компания Innovative Research, USA). Дозы IgG повторили через 3 суток после инфицирования и выживание мышей контролировали ежедневно.
Количественное культивирование почек от вакцинированных или контрольных мышей инфицировали разными видами Candida в порядке, описанном раньше [Ibrahim et al., Infect. Immun. 74:3039-3041 (2006)]. Вкратце, мышей инфицировали через хвостовые вены. Почки забрали через 3 суток после инфицирования, гомогенизировали, последовательно разбавили 0,85%-ным физраствором и количественно культивировали на среде YPD, которая содержала 50 мкг/мл хлорамфеникола. Колонии подсчитали после инкубации предметных стекол при 37 °С в течение 24 -48 ч и результаты выразили как логарифм КОЕ на 1 г инфицированного органа.
Одновременно с экспериментом по грибковой нагрузке почки удалили асептически у двух мышей из каждой группы для гистопатологического исследования. Почки погрузили в фиксирующий раствор, содержащий цинк и формалин, до исследования. Фиксированные органы дегидрировали в спиртовых растворах, погрузили в парафин и сделали срезы толщиной 6 мкм. Срезы окрасили серебряным гексаме-тилентетрамином Гомори и исследовали под оптическим микроскопом [Davis et al., Infect. Immun. 68:5953-5959 (2000)].
Ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA).
Для проверки того, индуцировали ли вакцина rHyr1p-N иммунную реакцию, титры антитела из проб сыворотки, взятых у вакцинированных и контрольных мышей, определяли анализом ELISA в планшетах с 96 лунками, как были описано раньше [Ibrahim et al., Infect. Immun. 73:999-1005 (2005)]. Каждую из лунок покрыли 100 мкл rHyr1p-N в концентрации 5 мкг/мл в фосфатном буфере. Сыворотку мышей инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре после этапа блокирования с помощью Tris-буферного физраствора (TBS; 0,01 М Tris HCl [рН 7,4], 0,15 М NaCl), содержащего 3% бычьего сывороточного альбумина. Лунки промыли три раза раствором TBS, содержащим 0,05% Tween 20, после чего еще три раза промыли TBS. Вторичное козье антитело к мыши, конъюгированное с пероксидазой хрена (компания Sigma), добавили при конечном разбавлении 1:5000 и планшет затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки промыли TBS и инкубировали с субстратом, содержащим 0,1М цитратного буфера (рН 5,0), 50 мг о-фенилендиамина (компания Sigma) и 10 мкл 30% Н2О2. Цвету дали развиваться в течение 30 мин, после чего реакцию прекратили путем добавления 10% H2SO4 и оптическую плотность (ОП) на 490 нм определили в устройстве для считывания микротитровального
планшета. Отрицательные контрольные мыши получили только разбавитель и фоновую спектральную поглощательную способность вычли для проверяемых лунок, чтобы получить конечные показания ОП. Титр ELISA взяли как обратную величину от последнего разбавления сыворотки, которое дало положительное показание ОП (т.е. больше, чем среднее показание ОП отрицательных контрольных проб плюс 2 стандартных отклонения).
Блокирующий анализ F(ab')2.
Для изучения механизма защиты, опосредованного антителами к Hyr1p в опосредованном фагоцитами умерщвлении С. albicans, использовали клетки HL-60, которые были дифференцированы по ней-трофилподобному фенотипу с [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 1718-1728 (2010)]. Анализ умерщвления выполнили в присутствии фрагментов IgG или F(ab)2 к Hyr1p, как было описано раньше [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 1718-1728 (2010)]. Вкратце, клетки HL-60 индуцировали с помощью 2,5 мкМ ретиноловой кислоты и 1,3% ДМСО в течение трех суток при 37 °С с 5% СО2. Смешали иммунные сыворотки с пептидами к Hyr1 (табл. 1) и выделили весь IgG, используя агарозу белка А (компания Thermo Scientific). Сыворотка, взятая у тех же кроликов перед иммунизацией пептидами, служила в качестве контрольной сыворотки. Фрагменты F(ab)2 из иммунного или контрольного IgG очистили, используя набор компании Pierce для подготовки F(ab)2 согласно инструкции изготовителя. Анализ SDS-PAGE показал, что > 95% фрагмента Fc было переварено этим набором (данные не приведены). Далее, клетки С. albicans, сверх-экспрессирующие или подавляющие Hyr1p [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 1718-1728 (2010)], инкубировали с 50 мкг/мл фрагментов F(ab)2 из вакцинированной или контрольной группы на льду в течение 45 мин. С. albicans, культивированную совместно с фрагментами F(ab)2, инкубировали с HL-60-производными ней-трофилами в течение 1 ч при 37°С с 5% СО2 перед обработкой ультразвуком и количественным культивированием на планшетах с YPD. Процент умерщвления вычислили путем деления числа КОЕ после совместного культивирования с HL-60-производными нейтрофилами на число КОЕ от С. albicans, инкубированной со средами без нейтрофилоподобных клеток.
Статистический анализ.
Непараметрический критерий Мантела-Кокса был использован для определения различий во времени выживания мышей. Анализ нейтрофильного умерщвления, титры антитела и грибковую нагрузку на ткань сравнили по U-критерию Манна-Уитни для непарных сравнений. Корреляции вычислили по коэффициенту корреляции Спирмена. Значения Р <0,05 были сочтены значащими.
Все процедуры с мышами были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными Института биомедицинских исследований Лос-Анджелеса для проекта 11672-05 специфически для этого исследования вакцины согласно Рекомендациям Национальных институтов здравоохранения по размещению животных и уходу за ними, институт имеет утвержденный Министерством здравоохранения и социальных служб США номер обеспечения благополучия животных A3330-01.
Результаты.
Вакцина rHyr1p-N значительно улучшила выживание и снизила грибковую нагрузку у иммуноком-петентных мышей, внутривенно инфицированных С. albicans.
Для определения наиболее эффективной дозы иммуногена rHyr1p-N оценили диапазон трехкратной дозы (1-30 мкг на 1 мышь). Молодых самок мышей BALB/c иммунизировали, используя rHyr1p-N плюс квасцы (2% Альгидрогеля; компания Brenntag Biosector) или только квасцы. Этих мышей затем инфицировали летальным инокулятом С. albicans (7x105 бластоспор). Вакцинированные мыши имели значительные улучшения в выживании по сравнению с адъювант-ными контрольными мышами (фиг. 1А). Все испытанные дозы, за исключением 1 мкг, продлевали или улучшали выживание по сравнению с мышами, получившими только адъювант, и было установлено, что реакция на дозы 10 и 30 мкг имела наибольшую эффективность (фиг. 1А). Эксперимент прекратили в день 28, причем все оставшиеся мыши выглядели здоровыми.
Для того чтобы определить воздействие вакцинации на грибковую нагрузку, молодых мышей вакцинировали и инфицировали так, как сказано выше. В день 3 после инфицирования (за один день до того, как контрольные мыши по прогнозу должны были умереть в предыдущем эксперименте), мышей подвергли эвтаназии и забрали почки, являющиеся первичным целевым органом, чтобы определить грибковую нагрузку на ткань. Вакцинация уменьшила грибковую нагрузку на ткань приблизительно в 16 раз по сравнению с контрольными мышами (р < 0,01) (фиг. 1В).
Равным образом с данными по выживанию и грибковой нагрузке гистопатологическое исследование почек, взятых у мышей, вакцинированных rHyr1p-N, продемонстрировало очень мало абсцессов с минимальными грибковыми остатками, в основном присутствующими в бластоспорной формации (фиг. 2В). Наоборот, многочисленные абсцессы, полные грибковых клеток, имеющих по большей части формы дрожжей с некоторыми гифами и псевдогифами, были обнаружены в почках мышей, вакцинированных только квасцами (фиг. 2А). Полуколичественная оценка тяжести инфекции показала значительное уменьшение абсцессов на 1 поле, а также уменьшенное число клеток Candida на 1 абсцесс у вакцинированных мышей по сравнению с контрольными (фиг. 2С, Р < 0,0001 по ранговому критерию Уилкинсона).
rHyr1p-N эффективно защищает иммунодефицитных мышей от кандидоза.
Известно, что значительная доля иммунодефицитных пациентов не реагирует на разные вакцины
[Dockrell et al., вакцина 17:2779-2785 (1999); Chokephaibulkit et al., вакцина 22:2018-2022 (2004); dos Santos et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 20:493-496 (2004); King et al., Pediatrc. Infect. Dis. 15:192-196 (1996)]. Мы хотели определить потенциальное использование вакцины rHyr1p-N для защиты нейтропе-нических мышей от рассеянного кандидоза. У иммунизированных мышей взяли кровь через 12 суток после бустер-дозы 30 мг rHyr1p-N. Вакцинация значительно повысила иммунную реакцию мышей, что было определено путем обнаружения увеличенных титров антитела к rHyr1p-N (фиг. 3А). Через сутки после взятия крови мыши стали нейтропеническими. Вакцинация привела к значительным улучшениям в выживании (Р = 0,007 по критерию Мантела-Кокса против контрольных мышей) (фиг. 3В).
Мы также оценили грибковую нагрузку на почки в день 10 после инфицирования. Согласно нашему результату по выживанию мы обнаружили, что мыши, вакцинированные 30 мкг rHyr1p-N, имели снижение грибковой нагрузки в 1,50 раза по сравнению с почками, взятыми у контрольных мышей (фиг. 3С, Р=0,0021 по ранговому критерию Уилкинсона).
Пассивная иммунизация иммуноглобулином IgG к Hyr1 продлила выживание мышей, инфицированных С. Albicans.
Поскольку некоторые пациенты могут не реагировать на активную стратегию вакцинации, мы оценили возможность использования пассивной иммунотерапии, нацеленной на Hyr1p. Мы подготовили поликлональные антитела путем вакцинации кроликов восемью гидрофильными, высоко антигенными 14-мер пептидами, расположенными в области rHyr1p-N (табл. 1). Очищенные IgG, нацеленные на эти 8 гидрофильных пептидов, были смешаны с использовались для лечения ранее не участвовавших в экспериментах мышей, инфицированных летальной дозой С. albicans. Мыши, получившие IgG к Hyr1p в дозе 1 или 3 мг (но не при введении 0,3 мг) получили существенную защиту от инфекции по сравнению с мышами, получившими неспецифический контрольный IgG от коммерческого источника (фиг. 4А, В и
С).
Для того чтобы определить, усилили ли созданные антитела к Hyr1p функцию фагоцитов путем повышения опсонофагоцитоза или нейтрализации вирулентной функции Hyr1p, мы выделили и подготовили фрагменты F(ab)2 из смешанного IgG, выращенного против 8 пептидов Hyr1p, или из совпадающего с изотипом контрольного IgG. Эти фрагменты использовали в анализе нейтрофильного умерщвления HL-60-производных клеток против С. albicans, условно сверхэкспрессирующих или подавляющих Hyr1p, а не С. albicans дикого типа, чтобы продемонстрировать специфичность этих фрагментов к Hyr1p, а не к другим членам семейства Iff [d'Enfer et al., Nuclear Acids Res. 33:D353-357 (2005)]. Согласно с нашими предыдущими данными по IgG для мышей [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 1718-1728 (2010)], мы обнаружили, что фрагменты F(ab)2, приготовленные из антитела к Hyr1p, но не фрагменты, приготовленные из контрольных антител, смогли восстановить умерщвление HL-60-производными нейтрофилами условного экспресси-рующего штамма HYR1 до уровней, эквивалентных уровню подавляющего штамма (фиг.
4D).
Для проверки того, что защита, активированная антителами, действительно была вызвана антителами к Hyr1p, а не была неспецифической защитой, вызванной антителами, реагирующими на несвязанный иммуноген (например, антителами к KLH), очищенный IgG, нацеленный на 8 гидрофильных пептидов rHyr1p-N, абсорбировали гифами С. albicans перед проверкой на их защитную активность против кандидоза, рассеянного в крови. Абсорбированный IgG не окрашивал гифы С. albicans (фиг. 5А), указывая на то, что IgG к Hyr1p был устранен. Кроме того, подобно контрольному IgG (т.е. неспецифическому IgG от коммерческого источника), абсорбированный IgG не защитил мышей от инфекции С. albicans, тогда как неабсорбированный очищенный IgG защитил (фиг. 5В, р=0,002). Эти результаты подтверждают специфичность антител к rHyr1p при защите от кандидоза, рассеянного в крови.
Вакцина rHyr1p-N существенно снизила грибковую нагрузку на ткань у мышей BALB/c, инфицированных несколькими видами не относящимися к Candida albicans.
Вакцина, которая активирует защиту от С. albicans и других видов не albicans, крайне желательна, поскольку значительное число инфекций Candida вызываются видами, не относящимися к albicans. Например, С. glabrata представляет вторую наиболее распространенную причину кандидоза и С. krusei стойкая к азольной терапии. Используя поиски возбудителей, мы смогли обнаружить ортологи Hyr1p-N в нескольких видах Candida со сходством аминокислот в диапазоне 47-72% в определенной области. Так, мы вакцинировали мышей rHyr1p-N плюс квасцы, как сказано выше, затем инфицировали их С. albicans, С. glabrata, С. krusei, С. parapsilosis или С. tropicalis. Через трое суток после инфицирования мышей умертвили и взяли у них почки для определения грибковой нагрузки на ткань посредством подсчета колоний. Мыши, вакцинированные rHyr1p-N, имели 0,65-1,69 логарифмическое снижение в грибковой нагрузке на почки по сравнению с мышами, вакцинированными только квасцами (фиг. 6).
Мы идентифицировали свойства рекомбинантного N-конца Hyr1p (rHyr1p-N) [Luo et al., J. Infect. Dis. 201: 1718-1728 (2010)], которые делают его подходящим для целей активной и пассивной иммунотерапии. Поликлональный IgG кролика, выведенный против 8 разных 14-мерных пептидов из участков rHyr1p-N, существенно защищает мышей от экспериментального рассеянного кандидоза. Кроме того, rHyr1p-N сохранил свою эффективность в модели нейтропенических мышей.
Грибковая нагрузка на ткань и гистопатологическое исследование почек, взятых у мышей, вакци
нированных rHyr1p-N или только квасцами, подтвердили эффективность вакцины rHyr1p-N. Однако при гистопатологии разница между контрольными (фиг. 2А) и вакцинированными rHyr1p-N мышами (фиг. 2В) была намного более выраженной чем разница в грибковой нагрузке на ткань в тех же органах. В этом отношении ранее сообщалось, что метод подсчета колоний может недооценивать грибковую нагрузку на ткань в присутствии гиф и псевдогиф [Spellberg et al., J. Leukoc. Biol. 78:338-344 (2005), Spellberg et al., J. Infect. Dis. 194256-260 (2006)], вероятно потому, что гомогенизация ткани убивает грибковые нити. Мы обнаружили, что у контрольных мышей было значительно больше нитевидных грибков в почках чем у вакцинированных мышей, которые имели меньше абсцессов, в основном состоящих из грибковых элементов дрожжевой формы. Поэтому вероятно, что гомогенизация ткани искусственно снижает число колоний в почках, взятых у контрольных мышей, но не у мышей, вакцинированных rHyr1p-N, делая разницу менее выраженной.
Наши результаты также показывают реакцию на дозу IgG к Hyr1p при защите мышей от рассеянного кандидоза. Мы также подтвердили, что защита, активируемая IgG к Hyr1p, является специфической к Hyr1p, поскольку абсорбированный IgG при гифах С. albicans теряет свою способность защищать мышей от кандидоза, рассеянного в крови (фиг. 5В). Эти результаты предполагают, что механизм защиты, придаваемый rHyr1p-N, кажется относится, по меньшей мере, отчасти, к защитной реакции антитела.
В этом исследовании мы показали, что смешанный IgG, выведенный против 8 пептидов Hyr1, непосредственно нейтрализует функцию Hyr1p стойкости к фагоцитарному умерщвлению, а не усиливает опсонофагоцитоз. Это очевидно по способности фрагментов F(ab)2 (приготовленных из антитела к rHyr1p-N) восстанавливать фагоцитарное умерщвление С. albicans, сверхэкспрессируя Hyr1p до уровней, эквивалентных подавляющему штамму (фиг. 4D). Однако вакцина rHyr1p-N сохранила свою эффективность у нейтропенических мышей. Это можно объяснить тем фактом, что циклофосфамид индуцирует лейкопению у мышей с минимальным воздействием на фагоциты ткани.
В заключение, вакцина rHyr1p-N эффективна как для иммунокомпетентных, так и для им-мунодефицитных мышей, если она смешана с квасцами в качестве адъюванта, против многих клинически выделенных штаммов С. albicans и против нескольких видов, не относящихся к Candida albicans.
Пример II. Фрагменты белка HYR1 предотвращают инфекцию Acinetobacter baumannii.
Candida albicans является диплоидным грибком, который растет и как дрожжи, и как нитевидные клетки. С. albicans вызывает приблизительно 60000 случаев рассеянного кандидоза в год в США. Белок HYR1 С. albicans является белком клеточной поверхности, который придает грибковым клеткам стойкость к фагоцитам белыми кровяными тельцами во время грибковых инфекций. Было доказано, что вакцинация рекомбинантным белком HYR1 защищает мышей от инфекции Candida. Более того, пассивная иммунизация антителом к белку HYR1 защищает от кандидоза, рассеянного в крови.
Посредством моделирования прогнозной гомологии структуры было выявлено, что белок HYR1 С. albicans имеет значительную гомологию к нескольким белкам грамотрицательных бактерий, включающих Acinetobacter baumannii. Следовательно, была изучена возможность использования активной и пассивной иммунизации, нацеленной на белок HYR1, для защиты от Acinetobacter baumannii.
Были выполнены трехмерные исследования гомологии структуры с использованием конвергентных способов моделирования структурной гомологии. Они включают выравнивание множественных последовательностей, соединение со структурными гомологами на основании идентичности и сходства последовательностей и трехмерное структурное моделирование. Этот анализ показал, что полноразмерный полипептид HYR1 Candida имеет значительную гомологию с белками нескольких грамотрицательных бактерий, включая виды Haernophilus, Bordetella, Salmonella, Bordetella, Yersina, Escherichia и Acinetobac-ter (табл. 3).
65% Лкга Лназа выршыцаининна В Staphylococcus aurvusCGty
На основе структурного анализа rHYR1-N (SEQ ID NO: 2) был продуцирован в Е. coli и использовался для активной вакцинации мышей. Мышей иммунизировали только гидроксидом алюминия (n=10) или rHYR1p-N (30 мг) в смеси с гидроксидом алюминия (n=9) в день 0 и вводили им бустер-дозу в день 21. Вакцинированных мышей затем инфицировали А. baumannii в день 35. Вакцинированные мыши имели 67% выживания по сравнению с 10% выживания в контрольной группе (р <0,05 по критерию Манте-ла-Кокса) (фиг. 7). Помимо этого, исследовали бактериальную нагрузку в ткани вакцинированных и инфицированных мышей. Бактериальная нагрузка, которую определили по числу колониеобразующих единиц на 1 г ткани, показала, что изоляты ткани из почек, легких и селезенки имели более низкую бактериальную нагрузку по сравнению с пробами контрольной ткани (фиг. 8).
Затем были взяты поликлональные антитела у кроликов против восьми специфических полипептидных участков, выбранных из белка HYR1. Эти участки были структурно картированы, чтобы быть открытыми гидрофильными участками экспрессии С. albicans и по прогнозам должны быть высоко антигенными. Эти восемь специфических полипептидных участков состояли из 14 аминокислотных остатков плюс дополнительный цистеиновый участок на N-конце или С-конце полипептида (табл. 2). Концевые цистеиновые участки предназначались для прикрепления к белку-носителю, гемоцианину фиссуреллы (KLH), который использовали для продуцирования поликлональных антител.
Общая пассивная иммунизация против инфекции Acinetobacter baumannii была проанализирована на диабетических мышах. Очищенные IgG из восьми разных поликлональных антител, созданных как сказано выше, смешали и дали диабетическим мышам (n=20) за 2 ч до инфицирования. Имеющийся в продаже несвязанный IgG кролика дали диабетическим контрольным мышам (n=18). Затем мышей инфицировали летальной дозой Acinetobacter baumannii путем инъекции в хвостовую вену. Мыши, получившие одну дозу IgG к Hyr1p, выживали значительно дольше чем мыши, получившие контрольный IgG (т.е. 80% выживания в группе IgG к Hyr1p против 0% в контрольной группе, р <0,0001 по критерию Ман-тела-Кокса) (фиг. 9).
Пассивная иммунизация поликлональными антителами против индивидуальных аминокислотных последовательностей также была проанализирована у диабетических мышей, инфицированных Acineto-bacter baumannii. За 2 ч перед инфицированием диабетическим мышам дали 1 мг контрольного IgG кролика (n=18) или поликлональный IgG к полипептиду HYR1, выведенный индивидуально против одного из восьми разных синтетических пептидов HYR1 (табл. 2). Помимо этого, были проанализированы две отдельных сочетания смеси антител. Сочетание 1 включало антитела № 2, 3, 5 и 8, и сочетание 2 включало антитела № 2, 5 и 8. Антитела, выведенные против пептида № 5 (SEQ ID NO: 15) защитили мышей от инфекции Acinetobacter baumannii в степени, подобной смеси антител (т.е. 86% выживания с антипептидом 5 Ab против 80% выживания со смесью IgG). Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 10.
Пример III. Антитело к HYR1 связывает специфические белки, экспрессируемые Acinetobacter baumannii.
Экстракты клеточных стенок Acinetobacter baumannii были пропущены на двухмерном геле и проанализированы вестерн-блоттингом с использованием IgG кролика, выведенным против CLKNAV-
TYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15). Блоты сравнили с предиммунной сывороткой в качестве контрольной. IgG к HYR1 распознавал уникальные полосы в экстрактах клеточных стенок (фиг. 11). Выбранные споты экстрагировали и секвенировали. Анализ секвенирования показал, что антитело к HYR1 перекрестно реагировало с несколькими белками, включая белок 1 наружной мембраны of Acinetobacter baumannii (GI № |126642014| GenBank ref|YP_001084998.1|) (SEQ ID NO: 19), белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii (GI № |126640296| GenBank ref|YP_001083280.1|) (SEQ ID NO: 20), белок рецептора с сидеро-форной активностью к железу Acinetobacter baumannii (включающий GI № |126641700| GenBank ref|YP_001084684.1| (SEQ ID NO: 21); GI № |126640547| GenBank ref|YP_001083531.1| (SEQ ID NO: 22); GI № |126643331| GenBank ref|YP_001086315.1|) (SEQ ID NO: 23), белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii (GI № |126642981| GenBank ref|YP_001085965.1|) (SEQ ID NO: 24), фактор элонгации G Acinetobacter baumannii (GI № |126640918| GenBank ref|YP_001083902.1|) (SEQ ID NO: 25), прекурсор белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii (GI № |126641591| GenBank ref|YP_001084575.1|) (SEQ ID NO: 26), трансмембрану предполагаемого прекурсора липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii (GI № |126640689| GenBank ref|YP_001083673.1|) (SEQ ID NO: 27), предполагаемый чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii (GI № |126642873| Gen-Bank ref|YP_001085857.11) (SEQ ID NO: 28), составной белок мембраны AdeA Acinetobacter baumannii (GI № |126641797| GenBank ref|YP_001084781.1|) (SEQ ID NO: 29), белок деления клеток Acinetobacter baumannii (GI № |126643339| GenBank ref|YP_001086323.1|) (SEQ ID NO: 30) и белок FtsZ деления клеток Acinetobacter baumannii (GI № |126643338| GenBank ref|YP_001086322.1|) (SEQ ID NO: 31). Другие варианты осуществления.
Все публикации, включая публикации номеров GenBank и GI, патенты и патентные заявки, упомянутые в вышеприведенном описании изобретения, включены в настоящий документ путем ссылки. Разные модификации и вариации описанных способов изобретения будут очевидны специалистам в данной области без нарушения объема и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в связи со специфическими вариантами осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не должно быть ограничено такими специфическими вариантами осуществления. В действительности, предполагается, что разные модификации описанных режимов осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в данной области, входят в объем изобретения.
Другие варианты осуществления изложены в формуле изобретения.
Перечень последовательностей
<110> НОВАДИГМ ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.
<120> КОМПОЗИЦИИ ИЗ HYRI-ПРОИЗВОДНЫХ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИМИ
<130> 50665-013W02
<140> PCT/US12/55604 <141> 2012-09-14
<150> 61/564,201 <151> 2011-11-28
<150> 61/534,734 <151> 2011-09-14
<160> 31
<170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 937 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 1
Met Lys Val Val Ser Asn Phe lie Phe Thr He Leu Leu Thr Leu Asn
15 10 15
Leu Ser Ala Ala Leu Glu Val Val Thr Ser Arg He Asp Arg Gly Gly
20 25 30
lie Gin Gly Phe His Gly Asp Val Lys Val His Ser Gly Ala Thr Trp
35 40 45
Ala He Leu Gly Thr Thr Leu Cys Ser Phe Phe Gly Gly Leu Glu Val
50 55 60
Glu Lys Gly Ala Ser Leu Phe He Lys Ser Asp Asn Gly Pro Val Leu
65 70 75 80
Ala Leu Asn Val Ala Leu Ser Thr Leu Val Arg Pro Val He Asn Asn
85 90 95
Gly Val He Ser Leu Asn Ser Lys Ser Ser Thr Ser Phe Ser Asn Phe
100 105 110
Asp He Gly Gly Ser Ser Phe Thr Asn Asn Gly Glu lie Tyr Leu Ala
115 120 125
<4О0> 3
Gly Pro Ser Ala Pro Glu Ser Glu Ser Asp Leu Asn Thr Pro
1 5 10
<210> 4 <211> 14 <212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 4
Gly Asn Arg Asp His Phe Arg Phe Glu Туг Туг Pro Asp Thr
1 5 10
<210> 5 <211> 14 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 5
Gly Asn Arg Asp His Phe Arg Phe Glu Туг Тут Pro Asp Thr
1 5 10
<210> 6 <211> 14 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 6
Lys He Lys Gly Thr Gly Cys Val Thr Ala Asp Glu Asp Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<2I2> PRT
<213> Candida albicans
<400> 7
Leu Lys Asn Ala Val Thr Тут Asp Gly Pro Val Pro Asn Asn
1 5 10
<210> 8
<2U> 14
<2I2> PRT
<213> Candida albicans
<400> 8
Asn Ser Lys Ser Ser Thr Ser Phe Ser Asn Phe Asp He Gly
I 5 10
<21Q> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 9
Glu Pro Thr His Asn Phe Тут Leu Lys Asp Ser Lys Ser Ser
1 5 10
<210> 10 <211> 14 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 10
Thr Ser Arg He Asp Arg Gly Gly He Gin Gly Phe His Gly
1 5 10
<210> 11 <211> 15 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> II
Cys Gly Pro Ser Ala Pro Glu Ser Glu Ser Asp Leu Asn Thr Pro
15 10 15
<210> 12 <2I1> 15 <2I2> PRT
<2I3> Candida albicans
<400> 12
Cys Gly Asn Arg Asp His Phe Arg Phe Glu Туг Тут Pro Asp Thr
15 10 15
<2I0> 13 <2I1> 15 <212> PRT
<2I3> Candida albicans <400> 13
Cys Gly Tyr Asp Ser Lys Leu Phe Arg He Val Asn Ser Arg Gly
15 10 15
<210> 14 <21l> 15 <212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 14
Cys Lys He Lys Gly Thr Gly Cys Val Thr Ala Asp Glu Asp Thr
15 10 15
<210> 15 <21l> 15 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 15
Cys Leu Lys Asn Ala Val Thr Tyr Asp Gly Pro Val Pro Asn Asn
15 10 15
<210> 16 <21I> 15 <212> PRT
<213> Candida albicans <400> 16
Asn Ser Lys Ser Ser Thr Ser Phe Ser Asn Phe Asp He Gly Cys
15 10 15
<2I0> 17 <2I1> 15 <212> PRT
<2I3> Candida albicans
<400> 17
Cys Glu Pro Thr His Asn Phe Tyr Leu Lys Asp Ser Lys Ser Ser
15 10 15
<2I0> 18 <211> 15 <2I2> PRT
<2I3> Candida albicans <400> 18
Thr Ser Arg He Asp Arg Gly Gly He Gin Gly Phe His Gly Cys
15 10 15
<210> 19 <211> 829 <212> PRT
<213> Acinetobacter baumannii <400> 19
Met Pro Leu Ala Leu Val Ser Ala Met Ala Ala Val Gin Gin Ala Tyr
15 10 15
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Вакцина, включающая выделенный белок Hyrl Candida (SEQ ID NO: 1) или его иммуногенный фрагмент, для использования в способе лечения или профилактики инфекции Acinetobacter у млекопитающего.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что упомянутый белок Hyrl Candida или его фрагмент получен из Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata или Candida parapsilosis.
3. Вакцина по п.1 или 2, отличающаяся тем, что упомянутая инфекция является результатом Acinetobacter baummani.
4. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является фрагмент N-концевой области упомянутого белка Hyr1 Candida.
5. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенный фрагмент включает аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, или фрагмент Hyr1p, показанный в табл. 1 или 2.
6. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что иммуногенным фрагментом является один или больше из фрагментов Hyr1p, показанных в табл. 1 или 2, или его иммуноген-ный фрагмент.
7. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутую вакцину вводят подкожно, как бустер-дозу, или она включает иммуностимулирующий адъювант (такой как квасцы).
8. Вакцина по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что упомянутый Hyr1p или его иммуногенный фрагмент получают рекомбинантно (так как в Saccharomyces cerevisiae) или синтезируют химически.
9. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 3-10 или ее вариантную последовательность, имеющую до трех замен, делеций или добавлений к упомянутой аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 3-10, причем упомянутый полипептид не включает больше 20 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 2.
10. Полипептид по п.9, включающий аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID
NO: 3-10.
11. Полипептид по п.9 или 10, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность указанного полипептида состоит из 14-20 аминокислот.
12. Полипептид по любому одному из пп.9-11, отличающийся тем, что N-концевым аминокислотным остатком или С-концевым аминокислотным остатком упомянутого полипептида является цистеин; причем аминокислотная последовательность указанного полипептида включает аминокислотную последовательность любой одной из SEQ ID NO: 11-18; или аминокислотная последовательность упомянутого полипептида состоит из аминокислотной последовательности любой одной из SEQ ID NO: 11-18.
13. Выделенный конъюгат, включающий полипептид по любому одному из пп.9-12 и носитель.
14. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является гемоцианин фиссуреллы (KLH), CRM197 или токсоид столбняка.
15. Конъюгат по п.13, отличающийся тем, что носителем является фаг, дрожжи, вирус, виросома или рекомбинантная вирусоподобная частица или отличающийся тем, что упомянутым конъюгатом является рекомбинантный составной белок.
16. Вакцина, включающая иммуногенное количество полипептида по любому одному из пп.9-12 или конъюгата по любому одному из пп.13-15 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
17. Вакцина по п.16, включающая смесь разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.
18. Вакцина по любому одному из пп.16, 17, отличающаяся тем, что полипептид или конъюгат получен путем синтеза или отличающаяся тем, что упомянутый полипептид или конъюгат получен реком-бинантным путем.
19. Вакцина по любому одному из пп.16-18 для использования при вакцинации млекопитающего (например, человека) против кандидоза или против Acinetobacter.
20. Вакцина по п.19, отличающаяся тем, что она вводится внутримышечно, подкожно или внутри-кожно.
21. Способ вакцинации млекопитающего против кандидоза, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.
22. Способ вакцинации млекопитающего против Acinetobacter, включающий введение эффективного количества вакцины по любому одному из пп.16-20.
23. Способ получения химерной вакцины, включающий следующие этапы:
(a) получение фага, дрожжей или вируса;
(b) введение в упомянутый фаг, дрожжи или вирус молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому одному из пп.9-12 или 13-15;
(c) экспрессия упомянутого полипептида в упомянутом фаге, дрожжах или вирусе;
(a)
(d) выделение упомянутого фага, дрожжей или вируса этапа (с), включающего указанный экспрес-сированный полипептид; и
(e) добавление фармацевтически приемлемого наполнителя к указанному выделенному фагу, дрожжам или вирусу этапа (d).
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что полипептид содержится на поверхности упомянутого фага, дрожжей или вируса после этапа (с).
25. Выделенное моноклональное антитело, которое связывается с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15.
26. Диагностическая композиция для диагностики кандидоза или инфекции Acinetobacter, включающая антитело по п.25.
27. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики кандидоза или инфекции Acine-tobacter, включающая антитело по п.25.
28. Фармацевтическая композиция, включающая поликлональные антитела, которые связываются с полипептидом по любому одному из пп.9-12 или конъюгатом по любому одному из пп.13-15 или которые связываются со смесью разных полипептидов по любому одному из пп.9-12 или конъюгатов по любому одному из пп.13-15.
29. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза.
30. Фармацевтическая композиция по п.27 или 28 для использования при пассивной иммунизации млекопитающего против Acinetobacter.
31. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против кандидоза, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.
32. Способ по п.31, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.
33. Способ по п.31 или 32, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.
34. Способ пассивной иммунизации млекопитающего против Acinetobacter, включающий введение ему эффективного количества фармацевтической композиции по любому одному из пп.27 или 28.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что млекопитающим является человек.
36. Способ по п.34 или 35, отличающийся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно, подкожно или внутрикожно.
37. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид HYR1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO:12), CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAVTYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18), отличающаяся тем, что полипептид включает в длину менее чем 930 аминокислотных остатков.
38. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность состоит из аминокислотной последовательности, выбранный из SEQ ID NO: 11-18.
39. Выделенная нуклеиновая кислота по п.37, отличающаяся тем, что упомянутый полипептид включает в длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.
40. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.37.
41. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.37.
42. Набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий по меньшей мере один олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок с сидеро-форной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter bau-mannii, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественник белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественник липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной мембранный белок AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.
43. Выделенный полипептид HYR1, включающий аминокислотную последовательность, выбираемую из CGPSAPESESDLNTP (SEQ ID NO: 11), CGNRDHFRFEYYPDT (SEQ ID NO: 12),
CGYDSKLFRIVNSRG (SEQ ID NO: 13), CKIKGTGCVTADEDT (SEQ ID NO: 14), CLKNAV-TYDGPVPNN (SEQ ID NO: 15), NSKSSTSFSNFDIGC (SEQ ID NO: 16), CEPTHNFYLKDSKSS (SEQ ID
NO: 17) и TSRIDRGGIQGFHGC (SEQ ID NO: 18), отличающийся тем, что полипептид имеет длину меньше чем 930 аминокислотных остатков.
44. Выделенный полипептид HYR1 по п.43 отличающийся тем, что упомянутый фрагмент полипептида имеет длину меньше чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 аминокислотных остатков.
45. Выделенный полипептид HYR1 по п.43, отличающийся тем, что полипептид может быть связан
антителом к HYR1.
46. Выделенный полипептид HYR1 по п.43, отличающийся тем, что он является иммуногенным.
47. Выделенный полипептид HYR1 по п.46, отличающийся тем, что он способен вызывать выработку антитела к HYR1 у пациента.
48. Составной белок, включающий полипептид, соединенный с носителем белка, меткой системы "антиген-антитело" или линкерной последовательностью, отличающийся тем, что указанный полипептид включает полипептид HYR1 по любому одному из пп.43-47.
49. Выделенное белковое антитело к Acinetobacter, имеющее специфическую реактивность с полипептидом HYR1 по любому одному из пп.43-47, белком 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белком с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белком теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактором элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественником белка толерантности к органическому растворителю Acine-tobacter baumannii, предшественником липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительным к глюкозе порином (подобным OprB) Acinetobacter baumannii, составным мембранным белком AdeA Acinetobacter baumannii, белком деления клеток Acinetobacter baumannii или белком деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.
50. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является моноклональным.
51. Антитело по п.49, отличающееся тем, что оно является поликлональным.
52. Линия клеток, вырабатывающая моноклональное антитело по п.50.
53. Набор для обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий выделенное белковое антитело к Acinetobacter по пп.43-47.
54. Способ обнаружения молекулы нуклеиновой кислоты Acinetobacter в пробе, включающий контакт упомянутой пробы с двумя или больше олигонуклеотидами, включающими от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter bau-mannii, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii, амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты и обнаружение указанной амплификации.
55. Способ по п.54, отличающийся тем, что амплификацию осуществляют при помощи полимераз-ной цепной реакции.
56. Способ обнаружения присутствия Acinetobacter в пробе, включающий контакт пробы с белковым антителом к Acinetobacter по п.49 и обнаружение присутствия специфического связывания антитела с пробой, этим обнаруживая присутствие Acinetobacter в указанной пробе.
57. Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемый носитель и белковое антитело к Acinetobacter по любому одному из пп.49-51 или белковое антитело к HYR1, имеющее специфическую реактивность с белком HYR1 (SEQ ID NO: 9) или его фрагментом.
58. Композиция вакцины для иммунизации пациента против инфекции Acinetobacter, включающая фармацевтически приемлемый носитель и иммуногенное количество полипептида HYR1 по любому одному из пп.43-47, составного белка по п.48, белка HYR1 (SEQ ID NO: 9) или его фрагмента, белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii или его фрагмента, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii или его фрагмента, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii или его фрагмента, предшественника липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii или ее фрагмента, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acineto-bacter baumannii или его фрагмента, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii или его фрагмента, белка деления клеток Acinetobacter baumannii или его фрагмента или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii или его фрагмента.
59. Композиция вакцины по п.58, кроме того, включающая адъювант.
60. Способ лечения или профилактики инфекции Acinetobacter у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.28 или композиции вакцины по п.57.
61. Способ по п.60, кроме того, включающий совместное введение антибиотика.
62. Способ диагностики инфекции Acinetobacter у пациента, включающий следующие этапы:
(a) получение пробы для проверки от пациента;
(b) контакт упомянутой пробы со средством, которое может связывать выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок 2 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белок с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белок теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактор элонгации G Acinetobacter baumannii, предшест
(a)
венник белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественник липопротеина (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительный к глюкозе порин (подобный OprB) Acinetobacter baumannii, составной мембранный белок AdeA Acinetobacter baumannii, белок деления клеток Acinetobacter baumannii или белок деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii, или полипептид HYR1 по п.41 в подходящих условиях, обеспечивающих специфическое связывание указанного средства с нуклеиновой кислотой или полипептидом; и
(с) сравнение степени специфического связывания в пробе со степенью специфического связывания в контрольной пробе, причем повышенное или пониженное связывание в упомянутой пробе указывает на инфекцию Acinetobacter.
63. Способ по п.62, отличающийся тем, что упомянутым средством является белковое антитело к Acinetobacter по п.48 или олигонуклеотид, включающий от 15 до 300 смежных нуклеотидов, которые кодируют часть белка 1 наружной мембраны Acinetobacter baumannii, белка 2 наружной мембраны Acine-tobacter baumannii, белка с сидерофорной активностью к железу Acinetobacter baumannii, белка теплового шока Dnak Acinetobacter baumannii, фактора элонгации G Acinetobacter baumannii, предшественника белка толерантности к органическому растворителю Acinetobacter baumannii, предшественника липопротеи-на (VacJ) Acinetobacter baumannii, чувствительного к глюкозе порина (подобного OprB) Acinetobacter baumannii, составного мембранного белка AdeA Acinetobacter baumannii, белка деления клеток Acineto-bacter baumannii или белка деления клеток FtsZ Acinetobacter baumannii.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025831
- 1 -
(19)
025831
- 1 -
(19)
025831
- 2 -
(19)
025831
- 4 -
025831
- 34 -
025831
- 40 -
025831
- 43 -
025831
- 72 -
025831
- 76 -
025831
- 78 -