EA 025786B1 20170130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/025786 Полный текст описания [**] EA201391400 20120329 Регистрационный номер и дата заявки US61/468,981 20110329 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2012/031253 Номер международной заявки (PCT) WO2012/135522 20121004 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21701 Номер бюллетеня [**] СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОНЪЮГАТОВ С УЛУЧШЕННОЙ ГОМОГЕННОСТЬЮ Название документа [8] A61K 47/48, [8] A61P 35/00 Индексы МПК [US] Цзинь Шэнцзинь Сведения об авторах [US] ИММУНОДЖЕН, ИНК. Сведения о патентообладателях [US] ИММУНОДЖЕН, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000025786b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ получения связывающего клетку полипептида с присоединенным к нему линкером, включающий приведение связывающего клетку полипептида с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, содержащим группу N-сукцинимидилового эфира, группу N-сульфосукцинимидилового эфира, часть на основе малеимида или часть на основе галоацетила, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку полипептиду с получением тем самым смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами.

2. Способ по п.1, где способ дополнительно включает конъюгирование цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами путем осуществления реакции связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе с рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 с получением смеси, включающей (i) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, и подвергание указанной смеси, включающей (i) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для очистки связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов смеси с получением тем самым очищенной смеси связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.

3. Способ по п.2, где способ дополнительно включает подвергание смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для приготовления очищенной смеси связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами до конъюгирования цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами в указанной очищенной смеси.

4. Способ по п.2 или 3, где цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из майтансиноидов, таксанов, СС1065 и аналогов перечисленных веществ.

5. Способ по п.4, где цитотоксический агент представляет собой майтансиноид.

6. Способ по п.5, где майтансиноид включает тиоловую группу.

7. Способ по п.6, где майтансиноид представляет собой DM1 или DM4.

8. Способ по любому из пп.1-7, где приведение в контакт на стадии (а) происходит в растворе, имеющем рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9.

9. Способ по п.8, где рН составляет приблизительно 7,8.

10. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из цитратного буфера, ацетатного буфера, сукцинатного буфера и фосфатного буфера.

11. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из группы, состоящей из HEPPSO (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (пиперазин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновая кислота) дегидрата), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота), HEPPS (EPPS) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), TES (N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота) и их комбинации.

12. Способ по любому из пп.1-11, где указанное приведение в контакт происходит при температуре от приблизительно -10°С до приблизительно 15°С.

13. Способ по п.12, где температура составляет приблизительно 10°С.

14. Способ по любому из пп.1-13, где связывающий клетку полипептид выбирают из группы, состоящей из антител, интерферонов, интерлейкина 2 (IL-2), интерлейкина 3 (IL-3), интерлейкина 4 (IL-4), интерлейкина 6 (IL-6), инсулина, EGF, TGF- α, FGF, G-CSF, VEGF, MCSF, GM-CSF и трансферрина.

15. Способ по п.14, где связывающий клетку полипептид представляет собой антитело.

16. Способ по п.15, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

17. Способ по п.16, где антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.

18. Способ по любому из пп.15-17, где антитело выбирают из группы, состоящей из huN901, huMy9-6, huB4, huC242, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, CNTO95, huDS6, ритуксимаба, антитела к CD27L, антитела к Her2, антитела к EGFR, антитела к EGFRvIII, Cripto, антитела к CD138, антитела к CD38, антитела к EphA2, интегрин-связующего антитела, антитела к CD37, антитела к фолату, антитела к Her3 и антитела к IGFIR.

19. Способ по п.1, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, включает часть на основе малеимида.

20. Способ по п.19, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, выбирают из группы, состоящей из N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроата) (LC-SMCC), κ-малеимидоундеканоевой кислоты N-сукцинимидилового эфира (KMUA), γ-малеимидобутирата N-сукцинимидилового эфира (GMBS), β-малеимидопропилокси-сукцинимидилового эфира (BMPS), ε-малеимидокапроновой кислоты N-гидроксисукцинимидного эфира (EMCS), m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидного эфира (MBS), N-( α-малеимидоацетокси)сукцинимидного эфира (AMAS), сукцинимидил-6-( β-малеимидопропионамидо)гексаноата (SMPH), N-сукцинимидил 4-(p-малеимидофенил)бутирата (SMPB) и N-(p-малеимидофенил)изоцианата (PMPI), сульфо-Mal, PEG 4 -Mal и CX1-1.

21. Способ по п.20, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, представляет собой N-сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат (SMCC).


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Способ получения связывающего клетку полипептида с присоединенным к нему линкером, включающий приведение связывающего клетку полипептида с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, содержащим группу N-сукцинимидилового эфира, группу N-сульфосукцинимидилового эфира, часть на основе малеимида или часть на основе галоацетила, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку полипептиду с получением тем самым смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами.

2. Способ по п.1, где способ дополнительно включает конъюгирование цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами путем осуществления реакции связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе с рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 с получением смеси, включающей (i) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, и подвергание указанной смеси, включающей (i) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для очистки связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов смеси с получением тем самым очищенной смеси связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.

3. Способ по п.2, где способ дополнительно включает подвергание смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для приготовления очищенной смеси связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами до конъюгирования цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами в указанной очищенной смеси.

4. Способ по п.2 или 3, где цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из майтансиноидов, таксанов, СС1065 и аналогов перечисленных веществ.

5. Способ по п.4, где цитотоксический агент представляет собой майтансиноид.

6. Способ по п.5, где майтансиноид включает тиоловую группу.

7. Способ по п.6, где майтансиноид представляет собой DM1 или DM4.

8. Способ по любому из пп.1-7, где приведение в контакт на стадии (а) происходит в растворе, имеющем рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9.

9. Способ по п.8, где рН составляет приблизительно 7,8.

10. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из цитратного буфера, ацетатного буфера, сукцинатного буфера и фосфатного буфера.

11. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из группы, состоящей из HEPPSO (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (пиперазин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновая кислота) дегидрата), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота), HEPPS (EPPS) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), TES (N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота) и их комбинации.

12. Способ по любому из пп.1-11, где указанное приведение в контакт происходит при температуре от приблизительно -10°С до приблизительно 15°С.

13. Способ по п.12, где температура составляет приблизительно 10°С.

14. Способ по любому из пп.1-13, где связывающий клетку полипептид выбирают из группы, состоящей из антител, интерферонов, интерлейкина 2 (IL-2), интерлейкина 3 (IL-3), интерлейкина 4 (IL-4), интерлейкина 6 (IL-6), инсулина, EGF, TGF- α, FGF, G-CSF, VEGF, MCSF, GM-CSF и трансферрина.

15. Способ по п.14, где связывающий клетку полипептид представляет собой антитело.

16. Способ по п.15, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

17. Способ по п.16, где антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.

18. Способ по любому из пп.15-17, где антитело выбирают из группы, состоящей из huN901, huMy9-6, huB4, huC242, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, CNTO95, huDS6, ритуксимаба, антитела к CD27L, антитела к Her2, антитела к EGFR, антитела к EGFRvIII, Cripto, антитела к CD138, антитела к CD38, антитела к EphA2, интегрин-связующего антитела, антитела к CD37, антитела к фолату, антитела к Her3 и антитела к IGFIR.

19. Способ по п.1, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, включает часть на основе малеимида.

20. Способ по п.19, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, выбирают из группы, состоящей из N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроата) (LC-SMCC), κ-малеимидоундеканоевой кислоты N-сукцинимидилового эфира (KMUA), γ-малеимидобутирата N-сукцинимидилового эфира (GMBS), β-малеимидопропилокси-сукцинимидилового эфира (BMPS), ε-малеимидокапроновой кислоты N-гидроксисукцинимидного эфира (EMCS), m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидного эфира (MBS), N-( α-малеимидоацетокси)сукцинимидного эфира (AMAS), сукцинимидил-6-( β-малеимидопропионамидо)гексаноата (SMPH), N-сукцинимидил 4-(p-малеимидофенил)бутирата (SMPB) и N-(p-малеимидофенил)изоцианата (PMPI), сульфо-Mal, PEG 4 -Mal и CX1-1.

21. Способ по п.20, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, представляет собой N-сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат (SMCC).


Евразийское 025786 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201391400
(22) Дата подачи заявки
2012.03.29
(51) Int. Cl. A61K47/48 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)
(54) СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОНЪЮГАТОВ С УЛУЧШЕННОЙ ГОМОГЕННОСТЬЮ
(31) 61/468,981; 61/468,997
(32) 2011.03.29
(33) US
(43) 2014.02.28
(86) PCT/US2012/031253
(87) WO 2012/135522 2012.10.04
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ИММУНОДЖЕН, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Цзинь Шэнцзинь (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-2005261232 US-A1-2006193865 US-A1-2011064754 WO-A2-2005037992
(57) Изобретение описывает способы производства конъюгатов связывающего клетку агент-цитотоксического агента с улучшенной гомогенностью, и такие способы включают проведение реакции модификации при пониженной температуре. Способы по изобретению включают контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту и получения смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке истребуется преимущество в отношении Предварительной Заявки на Патент США № 61/468997 от 29 марта 2011 г., и Предварительной Заявки на Патент США № 61/468981 от 29 марта 2011 г., которые включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
Уровень техники
Конъюгаты антитело-препарат (КАП), которые используют в лечении рака и других заболеваний, обычно состоят из трех различных элементов: связывающего клетку агента; линкера; и цитотоксического агента. Обычно используемые способы производства включают стадию модификации, при которой связывающий клетку агент реагирует с бифункциональным линкером при комнатной температуре (приблизительно 20°С) или выше с образованием связывающего клетку агента, ковалентно присоединенного к линкеру, имеющему реакционную группу, и стадию конъюгации, при котором модифицированный связывающий клетку агент реагирует с цитотоксическим агентом с образованием ковалентной химической связи от линкера (посредством реакционной группы) к цитотоксическому агенту.
Оптимизация стадии модификации (реакции связывающего клетку агента с линкером) требуем максимизации реакции линкера со связывающим клетку агентом и минимизации побочных реакций реакционной группы на линкере, например, с водой и реакционными группами на связывающем клетку агенте. Такие побочные реакции особенно проблематичны, когда реакционная группа на линкере является чрезвычайно реакционной функциональной группой, такой как малеимид. Побочные реакции могут привести к нежелательным продуктам реакции, таким как связывающие клетку агенты, сшитые перекрестными связями друг с другом, а также связывающие клетку агенты, имеющие линкеры, неспособные реагировать с цитотоксическим агентом.
На основании вышеизложенного, существует потребность в научной разработке улучшенного способа получения связывающих клетку агентов с присоединенным к ним линкером, который позволяет получить большой выход требуемых видов связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами, и такой способ должен быть совместим с крупномасштабными производственными способами. Изобретение описывает подобный способ. Эти и другие преимущества изобретения, а также дополнительные характеристики изобретения станут очевидными из представленного в данном документе описания изобретения.
Краткая сущность изобретения
Изобретение описывает способ получения связывающего клетку агента с присоединенным к нему линкером, и такой способ включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентно-го присоединения линкера со связывающим клетку агентом с получением смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами.
В одном варианте воплощения изобретения описывается способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) подвергание первой смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов с получением очищенной первой смеси связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами, (в) конъюгацию цитотоксиче-ского агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами в очищенной первой смеси путем реакции связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами с цитоток-сическим агентом в растворе, имеющим рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (i) связывающий клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент, и (iii) побочные продукты реакции, и (г) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотокси-ческим агентом.
Другой вариант воплощения изобретения описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) конъюгацию цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами и цитотоксического агента в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (i) связывающий
клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент, и (iii) побочные продукты реакции, и (в) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
Данное изобретение также включает конъюгат, включающий связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, полученный в соответствии с описанными в данном документе способами.
Описание изобретения
Специалисту в данной области будет очевидно, что конъюгаты, включающие связывающий клетку агент, такой как антитело, химически связанный с цитотоксическим агентом ("конъюгаты антитело-цитотоксический агент"), обычно получают модификацией антитела бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при комнатной температуре (т.е. приблизительно 20°С или выше), очисткой антитела с присоединенными к нему линкерами, конъюгацией цитотоксического агента с антителом с присоединенными к нему линкерами и очисткой конъюгата антитело-цитотоксический агент. Изобретение улучшает такие способы путем оптимизации стадии модификации в целях максимизации реакции линкера со связывающим клетку агентом и сведения к минимуму нежелательных побочных реакций. В частности, неожиданно было обнаружено, что проведение реакции модификации (реакции связывающего клетку агента с линкером) при пониженной температуре (например, приблизительно 15°С или менее) расширяет интервал максимизации уровня требуемых видов связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами до образования значительных уровней нежелательных побочных продуктов реакции, что обеспечивает соответствие способа широкомасштабному производству. В соответствии с этим, изобретение описывает способы производства конъюгатов связывающего клетку агента - цитоток-сического агента с улучшенной гомогенностью, включающие проведение реакции модификации при пониженной температуре.
Изобретение описывает способ получения связывающего клетку агента с присоединенным к нему линкером, и такой способ включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентно-го присоединения линкера со связывающим клетку агентом с получением смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами. Например, способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С, приблизительно 14°С, приблизительно 13°С, приблизительно 12°С, приблизительно 11°С, приблизительно 10°С, приблизительно 9°С, приблизительно 8°С, приблизительно 7°С, приблизительно 6°С, приблизительно 5°С, приблизительно 4°С, приблизительно 3°С, приблизительно 2°С, приблизительно 1°С или приблизительно 0°С, приблизительно -1°С, приблизительно -2°С, приблизительно -3°С, приблизительно -4°С, приблизительно -5°С, приблизительно -6°С, приблизительно -7°С, приблизительно -8°С, приблизительно -9°С или приблизительно -10°С, при условии, что раствор защищен от замораживания, например, присутствием органического растворителя(-ей), используемого для растворения бифункционального реагента, образующего перекрестные связи. В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре от приблизительно -10°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 10°С, от приблизительно 0°С до приблизительно 5°С, от приблизительно 5°С до приблизительно 15°С, от приблизительно 10°С до приблизительно 15°С или от приблизительно 5°С до приблизительно 10°С. В другом варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 10°С (например, при температуре от 8 до 12°С или при температуре от 9 до
11°С).
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,5 или выше. Например, способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,5, приблизительно 7,6, приблизительно 7,7, приблизительно 7,8, приблизительно 7,9, приблизительно 8,0, приблизительно 8,1, приблизительно 8,2, приблизительно 8,3, приблизительно 8,4, приблизительно 8,5, приблизительно 8,6, приблизительно 8,7, приблизительно 8,8, приблизительно 8,9 или приблизительно 9,0. В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,0, от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,5, от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,0, от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0 или от приблизительно 8,5 до приблизительно 9,0. В другом варианте воплощения изобре
тения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,8 (например, рН от 7,6 до 8,0 или рН от 7,7 до 7,9). Может использоваться любой подходящий буферный агент. Подходящие буферные агенты включают, например, цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер. В предпочтительном варианте воплощения изобретения буферный агент выбирают из группы, состоящей из HEPPSO (М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-М'-(2-гидроксипропансульфоновая кислоты)), POPSO (пиперазин-1,4-бис-(2-гидрокси-пропансульфоновая кислота) дегидрата), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислоты), HEPPS (EPPS) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислоты), TES (М-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислоты) и их комбинаций.
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем высокий рН (например, приблизительно 7,5 или выше), при низкой температуре (например, приблизительно 15°С или менее). В предпочтительном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 7,8, при температуре приблизительно 10°С. В другом варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, в растворе, имеющем рН приблизительно 8,5, при температуре приблизительно 0°С.
В соответствии со способом по изобретению, контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, приводит к образованию первой смеси, включающей связывающий клетку агент с присоединенными к нему линкерами, а также реагенты и другие побочные продукты реакции. В некоторых вариантах воплощения изобретения первая смесь включает связывающий клетку агент с присоединенными к нему линкерами стабильным и нестабильным способом, а также реагенты и другие побочные продукты реакции. Линкер "стабильно" присоединен к связывающему клетку агенту, когда ковалентная связь между линкером и связывающим клетку агентом по существу не ослабляется или не разрывается при обычных условиях хранения в течение периода времени, который может варьироваться от нескольких месяцев до нескольких лет. В отличие от этого, линкер "нестабильно" присоединен к связывающему клетку агенту, когда ковалентная связь между линкером и связывающим клетку агентом по существу ослабляется или разрывается при обычных условиях хранения в течение периода времени, который может варьироваться от нескольких месяцев до нескольких лет.
В одном варианте воплощения изобретения очистка модифицированного связывающего клетку агента от реагентов и побочных продуктов реакции проводится подверганием первой смеси способу очистки. В этом отношении первая смесь может быть очищена посредством фильтрации тангенциальными потоками (ФТП), например, способом фильтрации тангенциальными потоками на основе мембраны, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации или избирательной преципитации или любым другим подходящим способом очистки, а также их комбинациями. Такая первая стадия очистки обеспечивает очищенную первую смесь, т.е. повышенную концентрацию связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами и сниженное количество несвязанного бифункционального реагента, образующего перекрестные связи, в сравнении с первой смесью до очистки согласно способам по изобретению. Первую смесь предпочтительно очищают посредством фильтрации тангенциальными потоками.
После очистки первой смеси для получения очищенной первой смеси связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами, цитотоксический агент конъюгируют со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами в первой очищенной смеси путем реакции связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9, при этом полученная вторая смесь включает (i) связывающий клетку агент, химически связанный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент, и (iii) побочные продукты реакции.
В некоторых случаях очистку модифицированного связывающего клетку агента можно не проводить. Таким образом, в одном варианте воплощения изобретения первую смесь, включающую связывающий клетку агент с присоединенными к нему линкерами, а также реагенты и другие побочные продукты реакции, не подвергают способу очистки. В такой ситуации цитотоксический агент может быть добавлен одновременно с реагентом, образующим перекрестные связи, или несколько позже, например, спустя 1, 2 или 3 ч после добавления реагента, образующего перекрестные связи, к связывающему клетку агенту. Модифицированный связывающий клетку агент конъюгируют с цитотоксическим аген-том(например, майтансиноидом) путем реакции модифицированного связывающего клетку агента с ци-тотоксическим агентом в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9, при этом стадия конъюгации приводит к образованию смеси стабильных конъюгатов связывающего клетку агента цитотоксического агента, нестабильных конъюгатов связывающего клетку агента - цитотоксического агента, нестабильного цитотоксического агента (т.е. "несвязанного цитотоксического агента), реагентов и побочных продуктов.
Реакцию конъюгации предпочтительно проводят при рН от приблизительно 4 до приблизительно рН 9 (например, рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5 до приблизительно 8, от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 6,0 до приблизительно 7). В некоторых вариантах воплощения изобретения реакцию конъюгации проводят при рН от приблизительно 6 до приблизительно 6,5 (например, рН от 5,5 до 7, рН от 5,7 до 6,8, рН от 5,8 до 6,7, рН от 5,9 до 6,6 или рН от 6 до 6,5), рН приблизительно 6 или ниже (например, рН от приблизительно 4 до 6, от приблизительно 4 до приблизительно 5,5, от приблизительно 5 до 6) или при рН приблизительно 6,5 или выше (например, рН от 6,5 до приблизительно 9, от приблизительно 7 до приблизительно 9, от приблизительно 7,5 до приблизительно 9 или от 6,5 до приблизительно 8). В одном варианте воплощения изобретения реакцию конъюгации проводят при рН от приблизительно 4 рН менее 6 или при рН больше чем от 6,5 до 9. Если стадию конъюгации проводят при рН приблизительно 6,5 или выше, некоторые цитоток-сические агенты, содержащие сульфгидрильные группы, могут димеризировать с образованием дисуль-фидных связей. В одном варианте воплощения изобретения для эффективной реакции в подобной ситуации может потребоваться удаление из реакционной смеси следовых металлов и/или кислорода, а также в некоторых случаях добавление антиоксидантов или использование линкеров с более реакционными замещаемыми группами, или добавление цитотоксического агента в количестве более одной аликвоты.
Способ по изобретению в некоторых случаях может включать добавление сахарозы на стадии конъюгации, используемом в способе по изобретению, для увеличения растворимости и восстановления конъюгатов связывающего клетку агента цитотоксического агента. Желательно добавление сахарозы в концентрации от приблизительно 0,1% (в/о) до приблизительно 20% (в/о) (например, приблизительно 0,1% (в/о), 1% (в/о), 5% (в/о), 10% (в/о), 15% (в/о) или 20% (в/о)). Предпочтительно сахарозу добавляют в концентрации от приблизительно 1% (в/о) до приблизительно 10% (в/о) (например, приблизительно 0,5% (в/о), приблизительно 1% (в/о), приблизительно 1,5% (в/о), приблизительно 2% (в/о), приблизительно 3% (в/о), приблизительно 4% (в/о), приблизительно 5% (в/о), приблизительно 6% (в/о), приблизительно 7% (в/о), приблизительно 8% (в/о), приблизительно 9% (в/о), приблизительно 10% (в/о) или приблизительно 11% (в/о)). Кроме того, реакция конъюгации также может включать добавление буферного агента. Может использоваться любой подходящий буферный агент, известный в науке. Подходящие буферные агенты включают, например, цитратный буфер, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и фосфатный буфер. В предпочтительном варианте воплощения изобретения буферный агент выбирают из группы, состоящей из HEPPSO (М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (пиперазин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновая кислота) дегидрат), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пипе-разин-1-этансульфоновая кислота), HEPPS (EPPS) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), TES (М-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота) и их комбинаций.
После стадии конъюгации конъюгат подвергают стадии очистки. В этом отношении смесь конъю-гатов может быть очищена посредством фильтрации тангенциальными потоками (ФТП), например, способом фильтрации тангенциальными потоками на основе мембраны, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации или избирательной преципитации или любым другим подходящим способом очистки, а также их комбинациями. Специалисту в данной области станет очевидно, что очистка после стадии конъюгации позволяет выделить стабильный конъюгат, включающий связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом.
В одном варианте воплощения изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает первую стадию очистки после стадии модификации и вторую стадию очистки после стадии конъюгации. Например, изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) подвергание первой смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов с получением очищенной первой смеси связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами, (в) конъюгацию цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами в очищенной первой смеси путем реакции связывающих клетку агентов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (i) связывающий клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент, и (iii) побочные продукты реакции, и (г) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотокси-ческим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
В одном варианте воплощения изобретения в стадиях очистки используют фильтрацию тангенциальными потоками (ФТП, также известна как фильтрация перекрестными потоками, ультрафильтрация и диафильтрация) и/или адсорбционную хроматографию на смолах. Например, способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством ФТП после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством ФТП после стадии конъюгации. С другой стороны, способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии конъюгации. Также способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством ФТП после стадии конъюгации или первую стадию очистки посредством ФТП после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством адсорбционной хроматографии после стадии конъюгации.
В одном варианте воплощения изобретения в качестве стадии очистки используют неадсорбционную хроматографию. Например, способ по изобретению может включать первую стадию очистки посредством неадсорбционной хроматографии после стадии модификации и вторую стадию очистки посредством неадсорбционной хроматографии после стадии конъюгации.
В другом варианте воплощения изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает одну стадию очистки после стадии конъюгации. Например, способ по изобретению может включать способ получения конъюгата, при этом смесь не подвергают очистке после стадии модификации. В этом отношении изобретение описывает способ получения конъюгата, включающего связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, и такой способ включает (а) контакт связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку агенту с получением первой смеси, включающей связывающие клетку агенты с присоединенными к ним линкерами, (б) конъюгацию цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами и цитотоксического агента в растворе, имеющем рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 для получения второй смеси, включающей (i) связывающий клетку агент, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент, и (iii) побочные продукты реакции, и (в) подвергание второй смеси фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или комбинации таких способов для очистки связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов второй смеси с получением очищенной второй смеси связывающих клетку агентов, химически соединенных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению включает две отдельных стадии очистки после стадии конъюгации.
Для очистки могут использоваться любые подходящие системы ФТП, включая систему по типу Pel-licon (Millipore, Billerica, MA), кассетную систему Sartocon (Sartorius AG, Edgewood, NY) и систему по типу Centrasette (Pall Corp., East Hills, NY).
Для очистки может использоваться любая подходящая адсорбционная хроматографическая смола. Предпочтительные адсорбционные хроматографические смолы включают гидроксиаппатитовую хроматографию, гидрофобную хроматографию с индукционным зарядом (HCIC), хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC), ионообменную хроматографию, ионообменную хроматографию с комбинированным режимом, аффинную хроматографию с иммобилизированным металлом (IMAC), лигандную хроматографию с красителем, аффинную хроматографию, хроматографию с обращенными фазами и их комбинации. Примеры подходящих гидроксиаппатитовых смол включают керамический гидроксиаппа-тит (СНТ тип I и тип II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), гидроксиаппатит НА Ultrogel (Pall Corp., East Hills, NY) и керамический фтораппатит (CFT тип I и тип II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Примером подходящей смолы HCIC является смола МЕР Hypercel (Pall Corp., East Hills, NY). Примеры подходящих смол HIC включают смолы бутил-сефароза, гексил-сефароза, фенил-сефароза и октил-сефароза (все производства GE Healthcare, Piscataway, NJ), а также смолы Macro-prep метил и Macro-Prep t-бутил (Biorad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих ионообменных смол включают смолы SP-Sepharose, CM-Sepharose и Q-Sepharose (все производства GE Healthcare, Piscataway, NJ) и смолу Uno-sphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих ионообменных смол смешанного режима включают смолу Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg NJ). Примеры подходящих смол IMAC включают хелатную сефарозную смолу (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и смолу Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих лигандных смол с красителем включают голубую се-фарозную смолу (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и смолу Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Примеры подходящих аффинных смол включают смолу сефарозы и белка А (например, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, NJ), при этом связывающий клетку агент является антителом, и лектин-аффинные смолы, например, лектин-сефарозная смола Lentil (GE Healthcare, Piscataway, NJ), при этом связывающий клетку агент содержит соответствующие сайты связывания лектина. С другой стороны
может использоваться антитело, специфическое к связывающему клетку агенту. Такое антитело может быть иммобилизировано, например, смолой Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Примеры подходящих смол с обращенными фазами включают смолы С4, С8 и С18 (Grace Vydac, Hesperia,
CA).
Для очистки может использоваться любая подходящая неадсорбционная хроматографическая смола. Примеры подходящих неадсорбционных хроматографических смол включают, но не ограничиваются, смолы SEPHADEX(tm) G-25, G-50, G-100, SEPHACRYL(tm) (например, S-200 и S-300), смолы SUPERDEX(tm) (например, SUPERDEX(tm) 75 и SUPERDEX(tm) 200), смолы BIO-GEL(r) (например, Р-6, Р-10, Р-30, Р-60 и Р-100), и другие, известные специалисту в данной области.
В одном варианте воплощения изобретения способ по изобретению дополнительно включает стадию выдержки для высвобождения нестабильно связанных линкеров от связывающих клетку агентов. Стадия выдержки включает удерживание смеси после модификации связывающего клетку агента с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, после конъюгации цитотоксического агента со связывающими клетку агентами с присоединенными к ним линкерами, и/или после стадии очистки.
Стадия выдержки включает выдерживание раствора при подходящей температуре (например, от приблизительно 2°С до приблизительно 37°С) в течение подходящего периода времени (например, от приблизительно 1 часа до приблизительно 1 недели) для высвобождения нестабильно связанных линкеров от связывающего клетку агента, при этом стабильно связанные линкеры по существу не высвобождаются от связывающих клетку агентов. В одном варианте воплощения изобретения стадия выдержки включает выдерживание раствора при низкой температуре (например, от приблизительно 2°С до приблизительно 10°С или приблизительно 4°С), при комнатной температуре (например, от приблизительно 20°С до приблизительно 30°С или от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С) или при повышенной температуре (например, от приблизительно 30°С до приблизительно 37°С).
Длительность стадии выдержки зависит от температуры, при которой проводят стадию выдержки. Например, длительность стадии выдержки может быть по существу снижена проведением стадии выдержки при повышенной температуре, при этом максимальная температура ограничена стабильностью конъюгата связывающего клетку агент-цитотоксического агента. Стадия выдержки может включать выдерживание раствора в течение от приблизительно 1 ч до приблизительно 1 дня (например, приблизительно 1 ч, приблизительно 2 ч, приблизительно 3 ч, приблизительно 4 ч, приблизительно 5 ч, приблизительно 6 ч, приблизительно 7 ч, приблизительно 8 ч, приблизительно 9 ч, приблизительно 10 ч, приблизительно 12 ч, приблизительно 14 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 18 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 22 ч или приблизительно 24 ч), от приблизительно 5 ч до приблизительно 1 недели, от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели (например, приблизительно 12 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней или приблизительно 7 дней), в течение от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели (например, приблизительно 12 ч, приблизительно 16 ч, приблизительно 20 ч, приблизительно 24 ч, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней или приблизительно 7 дней), или приблизительно от 1 дня до приблизительно 1 недели.
В одном варианте воплощения изобретения стадия выдержки включает выдерживание раствора при температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 8°С в течение периода по меньшей мере от приблизительно 12 ч до 1 дня.
Значение рН для стадии выдержки предпочтительно составляет от приблизительно 4 до приблизительно 10. В одном варианте воплощения изобретения значение рН для стадии выдержки составляет приблизительно 4 или более, но не менее 6 (например, от 4 до 5,9), или приблизительно 5 или более, но не менее 6 (например, от 5 до 5,9). В другом варианте воплощения изобретения значения рН для стадии выдержки варьируется от приблизительно 6 до приблизительно 10 (например, от приблизительно 6,5 до приблизительно 9, от приблизительно 6 до приблизительно 8). Например, значения рН для стадии выдержки могут составлять приблизительно 6, приблизительно 6,5, приблизительно 7, приблизительно 7,5, приблизительно 8, приблизительно 8,5, приблизительно 9, приблизительно 9,5 или приблизительно 10.
Стадия выдержки может проводиться до или после конъюгации связывающего клетку агента с ци-тотоксическим агентом. В одном варианте воплощения изобретения стадию выдержки проводят непосредственно после модификации связывающего клетку агента бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи. Например, способ по изобретению включает стадию выдержки после модификации связывающего клетку агента бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, и перед конъюгацией. После модификации связывающего клетку агента, стадия очистки может проводиться до стадии выдержки и/или после стадии выдержки, но перед стадией конъюгации. В другом варианте воплощения изобретения стадию выдержки проводят непосредственно после конъюгации цитотоксиче-ского агента со связывающим клетку агентом с присоединенными к нему линкерами и перед стадией очистки. В другом варианте воплощения изобретения стадию выдержки проводят после стадий конъю
гации и очистки и после дополнительной стадии очистки.
В специфических вариантах воплощения изобретения стадия выдержки может включать инкубацию смеси при 4°С и рН приблизительно 6-7,5 в течение от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели, инкубацию смеси при 25°С и рН приблизительно 6-7,5 в течение от приблизительно 12 ч до приблизительно 1 недели, инкубацию смеси при 4°С и рН приблизительно 4,5-5,9 в течение от приблизительно 5 ч до приблизительно 5 дней, или инкубацию смеси при 25°С и рН приблизительно 4,5-5,9 в течение от приблизительно 5 ч до приблизительно 1 дня.
Изобретение описывает способ получения композиций стабильных конъюгатов, включающих связывающий клетку агент, химически соединенный с цитотоксическим агентом, при этом композиции по существу не содержат нестабильных конъюгатов. В этом отношении изобретение описывает способ получения конъюгата связывающего клетку агент - цитотоксический агент по существу с высокой чистотой и стабильностью. Такие композиции могут использоваться для лечения заболеваний по причине высокой чистоты и стабильности конъюгатов. Композиции, включающие связывающий клетку агент, такой как антитело, химически соединены с цитотоксическим агентом, таким как майтансиноид, описаны, например, в патенте США No. 7374762. В одном аспекте изобретения конъюгат связывающий клетку агент -цитотоксический агент, по существу, высокой чистоты обладает одной или несколькими следующим характеристиками: (а) более чем приблизительно 90% (например, более чем или равно приблизительно 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%), предпочтительно более чем приблизительно 95% видов конъ-югата являются мономерными, (б) уровень неконъюгированного линкера в композиции конъюгата составляет менее чем приблизительно 10% (например, менее чем или равно приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0%) (относительно общего содержания линкера), (в) менее чем 10% видов конъюгата связаны перекрестными связями (например, менее чем или равно приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 или 0%), (г) уровень несвязанного цитотоксического агента в композиции конъюгата составляет менее чем приблизительно 2% (например, менее чем или равно приблизительно 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 или 0%) (относительно общего содержания цитотоксического агента), и/или (д) отсутствие по существу повышения уровня несвязанного цитотоксического агента при хранении (например, спустя приблизительно 1 неделю, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 1 месяц, приблизительно 2 месяца, приблизительно 3 месяца, приблизительно 4 месяца, приблизительно 5 месяцев, приблизительно 6 месяцев, приблизительно 1 год, приблизительно 2 года или приблизительно 5 лет). "По существу повышение" уровня несвязанного цитотоксического агента обозначает, что после определенного времени хранения повышение уровня несвязанного цитотоксического агента менее чем приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,9%, приблизительно 1,0%, приблизительно 1,1%, приблизительно 1,2%, приблизительно 1,3%, приблизительно 1,4%, приблизительно 1,5%, приблизительно 1,6%, приблизительно 1,7%, приблизительно 1,8%, приблизительно 1,9%, приблизительно 2,0%, приблизительно 2,2%, приблизительно 2,5%, приблизительно 2,7%, приблизительно 3,0%, приблизительно 3,2%, приблизительно 3,5%, приблизительно 3,7% или приблизительно 4,0%.
В контексте данного изобретения термин "неконъюгированный линкер" обозначает связывающий клетку агент, который ковалентно присоединен к бифункциональному реагенту, образующему перекрестные связи, при этом связывающий клетку агент нековалентно присоединен к цитотоксическому агенту посредству линкера бифункционального реагента, образующего перекрестные связи (т.е. "неконъюгиро-ванный линкер" может быть представлен CBA-L, при этом СВА является связывающим клетку агентом, a L является бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи. В отличие от этого, конъ-югат связывающий клетку агент -цитотоксический агент может быть представлен как CBA-L-D, где D является цитотоксическим агентом).
В одном варианте воплощения изобретения среднее молярное соотношение цитотоксического агента и связывающего клетку агента в конъюгате связывающий клетку агент - цитотоксический агент составляет от приблизительно 1 до приблизительно 10, от приблизительно 2 до приблизительно 7, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 2,5 до приблизительно 4,5 (например, приблизительно 2,5, приблизительно 2,6, приблизительно 2,7, приблизительно 2,8, приблизительно 2,9, приблизительно 3,0, приблизительно 3,1, приблизительно 3,3, приблизительно 3,4, приблизительно 3,5, приблизительно 3,6, приблизительно 3,7, приблизительно 3,8, приблизительно 3,9, приблизительно 4,0, приблизительно 4,1, приблизительно 4,2, приблизительно 4,3, приблизительно 4,4, приблизительно 4,5), от приблизительно 3,0 до приблизительно 4,0, от приблизительно 3,2 до приблизительно 4,2, от приблизительно 4,5 до 5,5 (например, приблизительно 4,5, приблизительно 4,6, приблизительно 4,7, приблизительно 4,8, приблизительно 4,9, приблизительно 5,0, приблизительно 5,1, приблизительно 5,2, приблизительно 5,3, приблизительно 5,4, приблизительно 5,5).
Связывающий клетку агент может быть любым подходящим агентом, который связывается с клеткой, обычно и предпочтительно животной клеткой (например, клеткой человека). Связывающий клетку агент предпочтительно является пептидом или полипептидом или гликотопом. Подходящие связывающие клетки агенты включают, например, антитела (например, моноклональные антитела и их фрагмен
ты), интерфероны (например, а, бета, гамма), лимфокины (например. IL-2, IL-3, IL-4, IL-6), гормоны (например, инсулин, ТРГ (тиреотропин-рилизинг гормон), МСГ (меланоцит-стимулирующий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены), факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как EGF, TGF-а, ФФР, VEGF, К-КСФ, MCSF и GM-CSF (Burgess, Immunology Topday 5:155-158 (1984), питательные транспортные молекулы (например, трансферрин), витамины (например, фолат) и любые другие агенты или молекулы, которые специфически связываются с молекулой-мишенью на поверхности клетки.
Если связывающий клетку агент является антителом, он связывается с антигеном, представленным полипептидом, и может быть трансмембранной молекулой (например, рецептором) или лигандом, таким как фактор роста. Типичные антигены включают молекулы, такие как ренин; гормон роста, включая гормон роста человека и бычий гормон роста; рилизинг-фактор гормона роста; паратгормон; тироид-стимулирующий гормон; липопротеины; а-1-антитрипсин; инсулина А-цепь; инсулина В-цепь; проинсу-лин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания, такие как фактор vmc, фактор IX, тканевой фактор (TF) и фактор фон-Виллебранда; факторы антикоагуляции, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; сурфактант легкого; активатор плазминогена, такой как урокиназа или мочевина человека или активатор плазминогена тканевого типа (t-PA); бомбезин; тромбин; гематопоэтический фактор роста; фактор некроза опухоли -альфа и -бета; энкефалиназа; RANTES (фактор регуляции активации здоровой экспрессии и секреции Т-клеток); воспалительный белок макрофагов человека (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; релаксина А-цепь; релаксина В-цепь; прорелаксин; мышиный гонадотропин - связанный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; цитотоксический Т-лимфоцитарный связанный антиген (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы к гормонам или факторам роста; белок А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как нейротрофиче-ский фактор, полученный из кости (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT4, NT-5 или NT-6) или ростовой фактор нервов, такой как NGF-P; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фиброб-ластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (ТФР), такой как ТФР-а и ТФР-бета, включая ТФР-ф1, ТФР-Р2, ТФР-Р3, ТФР-Р4 или ТФР-Р5; инсули-ноподобный фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUC1, MUC16, STEAP, CEA, TENB2, EphA рецепторы, EphB рецепторы, фолатный рецептор, FOLR1, мезотелин, крипто, avp6, интег-
рины, VEGF, VEGFR, EGFR, рецептор трансферрина, IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5; CD белки, такие как CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80, CD81,
CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152 или антитело, которое связывается с одним или несколькими опухолеассоциированными антигенами или рецепторами клеточных поверхностей, описанных в публикации заявки на патент США № 2008/0171040 или публикации заявки на патент США № 2008/0305044, которые включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки; эри-тропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины;
морфогенетический белок кости (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (КСФ), такие как, MCSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; поверхностные мембранные белки; комплементзависимый стимулятор гемолиза; вирусный антиген, такой как, например, фрагмент капсида ВИЧ; транспортные белки; "хоминг"-рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолеассоциированный белок, такой как HER2, HER3 или HER4 рецептор; эндоглин, c-Met, IGF1R, простат-антигены, такие как РСА3, PSA, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, TMEFF2 и STEAP1; LGR5, В7Н4 и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.
Кроме того, GM-CSF, который связывается с миелоидными клетками, может использоваться в качестве связывающего клетку агента относительно клеток, пораженных острым миелоидным лейкозом. IL-2, который связывается с активированными Т-клетками, может использоваться для профилактики отторжения трансплантата, для лечения и предотвращения заболевания трансплантат против хозяина, и для лечения острого Т-клеточного лейкоза. MSH, который связывается с меланоцитами, может использоваться для лечения меланомы, как и антитела к меланомам. Фолиевая кислота может использоваться для связывания фолатного рецептора, экспрессированного на опухолях яичников и других опухолях. Эпи-дермальный фактор роста может использоваться для связывания с клетками плоскоклеточных видов рака, таких как рак легких, головы и шеи. Соматостатин может использоваться при нейробластомах и опухолях других типов.
Рак грудной железы и яичек может с успехом пролечиваться эстрогеном (или аналогами эстрогена) или андрогеном (или аналогами андрогена), соответственно, в виде связывающих клетку агентов.
Термин "антитело" в контексте данного изобретения обозначает любой иммуноглобулин, любой
фрагмент иммуноглобулина, такой как Fab, Fab', F(ab')2, dsFv, sFv, минитела, диатела, тритела, тетратела (Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol. 113: 470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960), Kim et al., Mol, Cancer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6: 343-357 (2006)), или химеры иммуноглобулинов, которые могут связываться с антигеном на поверхности клеток (например, которые содержат определяющий комплементарность участок (CDR)). В качестве связывающего клетку агента может использоваться любое подходящее антитело. Специалисту в данной области станет очевидно, что выбор соответствующего антитела будет зависеть от популяции клеток-мишеней. В этом отношении тип и количество молекул на поверхности клетки (т.е. антигенов), которые избирательно экспрессируются отдельной популяцией клеток (обычно и предпочтительно популяцией больных клеток), будут направлять выбор соответствующего антитела для использования в композиции по изобретению. Профили экспрессии клеточной поверхностью известны для целого ряда типов клеток, включая типы опухолевых клеток, или, если не известны, они могут быть определены посредством стандартных способов молекулярной биологии и гистохимии.
Антитело может быть поликлональным или моноклональным, однако предпочтительно оно является моноклональным антителом. В контексте данного изобретения "поликлональные" антитела обозначают гетерогенные популяции молекул антител, обычно содержащихся в сыворотке иммунизированных животных.
"Моноклональное" антитело обозначает гомогенные популяции молекул антител, специфических к отдельному антигену. Моноклональные антитела обычно вырабатываются отдельным клоном В-лимфоцитов ("В-клеток"). Моноклональные антитела могут быть получены посредством целого ряда способов, известных специалисту в данной области, включая стандартный способ гибридомы (см., например, Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), и С.А. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Краткое описание: способа гибридомы для получения моноклональных антител обычно включает инъецирование любому подходящему животному, обычно и предпочтительно мыши, антигена (т.е. "иммуногена"). Животное впоследствии умерщвляют, и В-клетки, выделенные из его селезенки, сливают с клетками миеломы человека. Получают гибридную клетку (т.е. "гибридому"), которая пролиферирует неограниченно долго и непрерывно секретирует высокие титры антитела с требуемой специфичностью in vitro. Любой соответствующий способ, известный в науке, может использоваться для идентификации клеток гибридомы, вырабатывающих антитело с требуемой специфичностью. Такие способы включают, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), вестерн-блоттинг и радиоиммуноанализ. Популяцию клеток гибридомы подвергают скринингу для выделения отдельных клонов, каждый из которых секретирует отдельные виды антител к антигену. Принимая во внимание, что каждая гибридома является клоном, полученным при слиянии отдельной В-клетки, все молекулы антител, которые она вырабатывают, являются идентичными по структуре, включая их анти-генсвязующий участок и изотип. Моноклональные антитела также могут быть получены посредством других подходящих способов, включая способ EBV-гибридомы (см., например, Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2): 361-67 (1984) и Roder et al., Methods Enzymol., 121: 140-67 (1986)), системы экспрессии вектора бактериофага (см., например, Huse et al., Science, 246: 1275-81 (1989)) или библиотеки фаговых дисплеев, включающие фрагменты антител, такие как Fab и scFv (одноцепочечный вариабельный участок) (см., например, патенты США №№ 5885793 и 5969108, и публикации заявок на международные патенты WO 92/01047 и WO 99/06587).
Моноклональное антитело может быть выделено из или выработано в любом подходящем животном, но предпочтительно оно вырабатывается в млекопитающем, более предпочтительно, мыши или человеке, и более предпочтительно, человеке. Способы получения антитела у мышей известны специалисту в данной области и описаны в тексте данной заявки. Относительно антител человека, специалисту в данной области станет очевидно, что поликлональные антитела могут быть выделены из сыворотки субъектов-людей, вакцинированных или иммунизированных соответствующим антигеном. С другой стороны, антитела человека могут быть получены путем адаптации известных способов для получения антител человека у видов животных, за исключением человека (см., например, патенты США №№ 5545806, 5569825 и 5714352, и публикацию заявки на патент США № 2002/0197266 А1).
Будучи идеальным выбором для терапевтического применения у человека, антитела человека, в частности, моноклональные антитела человека, обычно более трудно получить, чем моноклональные антитела мыши. Мышиные моноклональные антитела, однако, индуцируют быстрый ответ хозяина на антитело при введении человеку, что может снизить терапевтический или диагностический потенциал конъ-югата антитело-цитотоксического агента. Чтобы обойти такие осложнения, моноклональное антитело предпочтительно не распознается в качестве "инородного" иммунной системой человека.
Для этого для получения антитела может использоваться фаговая библиотека. В этом отношении, фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязующие вариабельные домены (V) антител, могут быть получены посредством стандартных способов молекулярной биологии и рекомбинации ДНК (см., например, Sambrook et al. (eds.),Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Фаг, кодирующий вариабельный участок с требуемой специфичностью,
выбирают на предмет специфического связывания с требуемым антигеном, и собирают полное антитело человека, включающее выбранный вариабельный домен. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих восстановленное антитело, вводят в подходящую линию клеток, такую как клетки миеломы, используемые для выработки антитела, такие как антитела человека, имеющие характеристики монокло-нальных антител, секретируемых клеткой (см., например, Janeway et al., выш, Huse et al., выше, и патент США № 6265150). С другой стороны, моноклональные антитела могут быть получены у мышей, являющихся трансгенными относительно специфических генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека. Такие способы известны в науке и описаны, например, в патентах США №№ 5545806 и 5569825 и Janeway et al., выше.
Более предпочтительно, антитело является гуманизированным антителом. В контексте данного изобретения "гуманизированное" антитело является антителом, в котором определяющие комплементар-ность участки (CDR) мышиного моноклонального антитела, образующие антигенсвязующие петли антитела, привиты на каркасном участке молекулы антитела человека. Благодаря сходству каркасных участков антител мыши и человека, в науке общепринято, что такой способ позволяет получить моноклональ-ное антитело, являющееся антигенно-идентичным антителу человека, которое связывается с одним и тем же антигеном, что и моноклональное антитело, из которого получены последовательности CDR. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны в науке и подробно описаны, например, в Janeway et al., выше, патентах США №№ 5225539, 5585089 и 5693761, европейском патенте № 0239400 B1 и патенте Великобритании № 2188638. Гуманизированные антитела также могут быть получены посредством способа изменения поверхности антитела, описанного в патенте США № 5639641 и Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235: 959-973 (1994). В то время как антитело, участвующее в конъюгате композиции по изобретению, более предпочтительно является гуманизированным моноклональным антителом, мо-ноклональное антитело человека и моноклональное антитело мыши, как это описано выше, также могут охватываться данным изобретением.
Фрагменты антитела, имеющие, по меньшей мере, один антигенсвязующий сайт, и, следовательно, распознающие и связывающие по меньшей мере один антиген или рецептор, присутствуют на поверхности клетки-мишени, и также включены в объем данного изобретения. В этом отношении протеолитиче-ское расщепление интактной молекулы антитела может привести к образованию целого ряда фрагментов антитела, которые сохраняют способность распознавать и связывать антигены. Например, ограниченное расщепление молекулы антитела протеазой папаином обычно приводит к образованию трех фрагментов, два из которых являются идентичными и обозначаются как фрагменты Fab, поскольку они сохраняют антигенсвязующую активность молекулы исходного антитела. Расщепление молекулы антитела ферментом пепсин обычно приводит к образованию двух фрагментов антитела, один из которых сохраняет ан-тигенсвязующие участки молекулы антитела и, следовательно, обозначается как фрагмент F(ab')2. Восстановление фрагмента F(ab')2 дитиотреитолом или меркаптоэтиламином приводит к образованию фрагмента, обозначаемого фрагментом Fab'. Одноцепочечный фрагмент вариабельного участка (sFv) антитела, который состоит из разветвленного фрагмента Fab, включающего вариабельный домен антитела (V) тяжелой цепи, присоединенный к домену V легкой цепи антитела посредством синтетического пептида, может быть получен посредством стандартных способов рекомбинации ДНК (см., например, Janeway et al., выше). Подобным образом, фрагменты вариабельных участков, стабилизированных дисульфидными связями (dsFv), могут быть получены посредством способов рекомбинации ДНК (см., например, Reiter et al., Protein Engineering, 7:697-704 (1994)). Однако в контексте изобретения фрагменты антитела не ограничены данными типичными образцами фрагментов антител. Может использоваться любой подходящий фрагмент антитела, который распознает и связывает требуемый рецептор клеточной поверхности или антиген. Фрагменты антитела дополнительно описаны, например, в Parham, J. Immunol., 131: 2895-2902 (1983), Spring et al., J. Immunol., 113: 470-478 (1974), и Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244 (1960). Связывание антитело-антиген может оцениваться посредством любого подходящего способа, известного в науке, такого как, например, радиоиммуноанализ (РИА), ИФА, вестерн-блоттинг, иммуно-преципитация и анализы конкурентного связывания (см., например, Janeway et al., выше, и публикацию
заявки на патент США № 2002/0197266 А1).
Кроме того, антитело может быть химерным или его антигенсвязующим фрагментом. Под "химерным" понимают антитело, которое включает по меньшей мере два иммуноглобулина или фрагмента, полученных или выработанных, по меньшей мере, двумя отдельными видами (например, два разных иммуноглобулина, таких как константный участок иммуноглобулина человека, скомбинированный с вариабельным участком иммуноглобулина мыши). Антитело также может быть доменным антителом (dAb) или его антигенсвязующим фрагментом, таким как, например, антитело верблюдовых (см., например, Desmyter et al., Nature Struct.Biol., 3: 752, (1996)), или антителом акульих, таким как, например, новый рецептор антигена (IgNAR) (см., например, Greenberg et al., Nature, 374: 168 (1995), и Stanfield et al., Science, 305: 1770-1773 (2004)).
В контексте изобретения может использоваться любое подходящее антитело. Например, монокло-нальное антитело J5 является мышиным антителом IgG2a, специфичным к общему антигену острого лимфобластного лейкоза (CALLA) (Ritz et al., Nature, 283: 583-585 (1980)), и может использоваться для
связывания клеток, экспрессирующих CALLA (например, клетки острого лимфобластного лейкоза). Мо-ноклональное антитело MY9 является мышиным антителом IgG1, которое специфически связывается с антигеном CD33 (Griffin et al., Leukemia Res., 8: 521 (1984)), и может использоваться для связывания клеток, экспрессирующих CD33 (например, клетки острого миелогенного лейкоза (ОМЛ)).
Подобным образом, моноклональное антитело к В4 (также обозначается как В4) является мышиным антителом IgG1, которое связывается с антигеном CD19 на В-клетках (Nadler et al., J. Immunol., 131: 244-250 (1983)), и может использоваться для связывания В-клеток, экспрессирующих CD19 (например, клетки неходжкинской лимфомы и клетки хронического лимфобластного лейкоза). N901 является мышиным моноклональным антителом, которое связывается с антигеном CD56 (адгезионная молекула нейронных клеток), находящимся на клетках нейроэндокринного происхождения, включая мелкоклеточную опухоль легкого, и такое антитело может использоваться в конъюгате для доставки препаратов к клеткам нейроэндокринного происхождения. У антител J5, MY9 и В4 предпочтительно изменяют поверхность или перед использованием как части конъюгата их гуманизируют. Изменение поверхности или гуманизация антител описаны, например, в Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 91: 969-73 (1994).
Кроме того, моноклональное антитело С242 связывается с антигеном CanAg (см., например, патент США № 5552293) и может использоваться для доставки конъюгата к опухолям, экспрессирующим Ca-nAg, таким как колоректальный рак, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легкого и рак желудка. HuC242 является гуманизированной формой моноклонального антитела С242 (см., например, патент США No. 5552293). Гибридома, из которой производят НиС242, находится в ЕСАСС под идентификационным номером 90012601. HuC242 может быть получено посредством способа прививания CDR (см., например, патенты США №№ 5585089, 5693761 и 5693762) или способа изменения поверхности (см., например, патент США №. 5639641). НиС242 может использоваться для доставки конъюгата к опухолевым клеткам, экспрессирующим антиген CanAg, таким как, например, клетки колоректального рака, рака поджелудочной железы, немелкоклеточного рака легкого и рака желудка.
Для связи с клетками рака яичников и рака предстательной железы в конъюгате может использоваться антитело к MUC1 в качестве связывающего клетку агента. Антитела к MUC1 включают, например, антитело к HMFG-2 (см., например, Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28: 17-21 (1981)), hCTM01 (см., например, van Hof et al. , Cancer Res., 56: 5179-5185 (1996)) и DS6. Клетки рака предстательной железы также могут быть связаны конъюгатом посредством антитела к простатспецифическому антигену (PSMA) в качестве связывающего клетку агента, такого как J591 (см., например, Liu et al., Cancer Res., 57: 3629-3634 (1997)). Кроме того, раковые клетки, экспрессирующие антиген Her2, такие как клетки рака молочной железы, предстательной железы и яичников, могут быть связаны конъюгатом посредством антител к HER2, например, трастузумаба, в качестве связывающего клетку агента. Клетки, которые экспрессируют рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и его варианты, такие как мутант с делецией по типу III, EGFRvIII, могут быть связаны конъюгатом посредством антител к EGFR. Антитела к EGFR описаны в публикациях международных патентов №№ PCT/US11/058385 и PCT/US11/058378. Антитела к EGFRvIII описаны в патентах США №№ 7736644 и 7628986, и публикациях заявок на патенты США 2010/0111979, 2009/0240038, 2009/0175887, 2009/0156790 и 2009/0155282. Антитела к IGF-IR, связывающиеся с рецептором инсулиноподобного фактора роста, такие как антитела, описанные в патенте США № 7982024, также могут использоваться в конъюгате. Антитела, связывающиеся с CD27L, Cripto, CD138, CD38, EphA2, интегринами, CD37, фолатом, CD20, PSGR, NGEP, PSCA,
TMEFF2, STEAP1, эндоглином и Her3, также могут использоваться в конъюгате.
В одном варианте воплощения изобретения антитело выбирают из группы, состоящей из huN901, huMy9-6, huB4, huC242, антитела к HER2 (например, трастузумаб), биватузумаба, сибротузумаба, ритук-симаба, huDS6, антител к мезотелину, описанных в публикациях заявки на международный патент WO 2010/124797 (такое как MF-T), антител к крипто, описанных в публикации заявки на патент США 2010/0093980 (такое как huB3F6), антител к CD138, описанных в публикации заявки на патент США 2007/0183971 (такое как huB-B4), антител к EGFR, описанных в заявках на международный патент № PCT/US11/058385 и PCT/US11/058378 (такое как EGFR-7), антител к EGFRvIII, описанных в патентах США №№ 7736644 и 7628986 и публикациях заявки на патент США 2010/0111979, 2009/0240038,
2009/0175887, 2009/0156790 и 2009/0155282, гуманизированных антител EphA2, описанных в публикациях заявок на международный патент WO 2011/039721 и WO 2011/039724 (такое как 2H11R35R74); антител к CD38, описанных в публикации заявки на международный патент WO 2008/047242 (такое как hu38SB19), антител к фолату, описанных в публикации заявки на международный патент WO 2 011/10 6528 и публикации заявки на патент США 2012/0009181 (например, huMov19); антител к IGF1R, описанных в патентах США №№ 5958872, 6596743 и 7982024; антител к CD37, описанных в публикации заявки на патент США 2011/0256153 (например, huCD37-3); антител к интегрину avp6, описанных в публикации заявки на патент США 2006/0127407 (например, CNTO95); и антител к Her3, описанных в публикации заявки на международный патент WO 2012/019024.
В частности, предпочтительные антитела являются описанными в данном документе гуманизированными моноклональными антителами. Примеры включают, но не ограничиваются, huN901, huMy9-6, huB4, huC242, гуманизированное моноклональное антитело к Her2 (например, трастузумаб), биватузу
маб, сибротузумаб, CNTO95, huDS6 и ритуксимаб (см., например, патенты США №№ 5639641 и 5665357, временную заявку на патент США № 60/424332 (которая относится к патенту США № 7557189), публикацию заявки на международный патент (РСТ) № WO 02/16401, Pedersen et al., выше, Roguska et al., выше, Liu et al., выше, Nadler et al., выше, Colomer et al., Cancer Invest., 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 31A: 2385-2391 (1995), Welt et al., J. Clin. Oncol., 12: 1193-1203 (1994), и Ma-loney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)). В науке известных и другие гуманизированные моноклональные антитела, которые могут использоваться в связи с изобретением.
В одном варианте воплощения изобретения связывающий клетку агент является гуманизированным антифолатным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, который специфически связывается с рецептором фолата человека 1, при этом антитело включает: (а) CDR1 тяжелой цепи, включающий GYFMN; CDR2 тяжелой цепи, включающий RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3; и CDR3 тяжелой цепи, включающий YDGSRAMDY; и (б) CDR1 легкой цепи, включающий KASQSVSFAGTSLMH; CDR2 легкой цепи, включающий RASNLEA; и CDR3 легкой цепи, включающий QQSREYPYT; при этом Xaa1 выбирают из K, Q, Н и R; Xaa2 выбирают из Q, Н, N и R; а Хаа3 выбирают из G, Е, Т, S, А и V. Предпочтительно последовательность CDR2 тяжелой цепи включает RIHPYDGDTFYNQKFQG.
В другом варианте воплощения изобретения антифолатное антитело является гуманизированным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, который специфически связываются с рецептором фолата человека 1 и включает тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью
QVQLVQSGAEVWPGASWISCKASGYTFTGYMNWWQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQK FQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLWDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK.
В другом варианте воплощения изобретения антифолатное антитело является гуманизированным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, кодируемым плазмидной ДНК, включенной в АТСС
7 апреля 2010 г. под номерами АТСС №№ РТА-10772 и РТА-10773 или 10774.
В одном варианте воплощения изобретения антифолатное антитело является гуманизированным антителом или его антигенсвязующим фрагментом, включающим вариабельный домен тяжелой цепи, который, по меньшей мере, на 90, 95, 99 или 100% идентичен
QVQLVQSGAEWKPGASVKISCKASGYTFTGYEMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQK
FQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS, и
вариабельный домен легкой цепи, который, по меньшей мере, на
90S, 954, 99% или 100% идентичен
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVP DRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR; или DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVP DRFSGSGSKTDF1LTISPVEAEDAATYYCQQSREYPY1FGGGTKLEIKR.
В то время как связывающий клетку агент предпочтительно является антителом, связывающий клетку агент также может быть молекулой, не являющейся антителом. Такие подходящие молекулы, не являющиеся антителом, включают, например, интерфероны (например, альфа, бета или гамма интерферон), лимфокины (например, интерлейкин 2 (IL-2), IL-3, IL-4 или IL-6), гормоны (например, инсулин), факторы роста (например, EGF, TGF-а, ФФР или VEGF), колониестимулирующие факторы (например, G-CSF, MCSF и GM-CSF (см., например, Burgess, Immunology Today, 5: 155-158 (1984)), соматостатин и трансферрин (см., например, O'Keefe et al., J. Biol. Chem., 260: 932-937 (1985)). Например, GM-CSF, который связывается с миелоидными клетками, может использоваться в качестве связывающего клетку агента для связывания клеток, пораженных острым миелоидным лейкозом. Кроме того, IL-2, который связывается с активированными Т-клетками, может использоваться для профилактики отторжения трансплантата, для лечения и предотвращения заболевания трансплантат против хозяина, и для лечения острого Т-клеточного лейкоза. Эпидермальный фактор роста (EGF) может использоваться для связывания с плоскоклеточными видами рака, такими как рак легких, рак головы и шеи. Соматостатин может использоваться для связывания клеток нейробластомы и клеток опухолей других типов. Конъюгат может включать любой подходящий цитотоксический агент. В контексте данного изобретения "цитотоксиче-ский агент" обозначает любое соединение, которое приводит к смерти клетку, индуцирует смерть клетки или снижает жизнеспособность клетки. Подходящие цитотоксические агенты включают, например, май-тансиноиды и конъюгируемые ансамитоцины (см., например, PCT/US11/059131 от 3 ноября 2011 г.), так-соиды, аналоги СС-1065 и СС-1065, а также доластатин и аналоги доластатина. В предпочтительном варианте воплощения изобретения цитотоксический агент является майтансиноидом, включая майтанси-нол и аналоги майтансинола. Майтансиноиды являются соединениями, ингибирующими образование
микротрубочек и являющимися чрезвычайно токсичными для клеток млекопитающих. Примеры подходящих аналогов майтансинолов включают соединения, имеющие модифицированное ароматическое кольцо, и соединения, имеющие модификации в других положениях. Такие майтансиноиды описаны, например, в патентах США №№ 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4322348, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4424219, 4371533, 4450254, 5475092, 5585499, 5846545 и 6333410.
Примеры аналогов майтансинола с модифицированным ароматическим кольцом включают: (1) С-19-дехлор (патент США № 4256746) (получен восстановлением LAH ансамитоцина Р2), (2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил) +/-С-19-дехлор (патенты США №№4361650 и 4307016) (получены путем деметилирования посредством Streptomyces или Actinomyces или дехлоринацией посредством LAH) и (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США No. 4294757) (получен путем ацилиро-вания посредством ацилхлоридов).
Примеры аналогов майтансинола, имеющих модификации в положениях, отличных от ароматического кольца, включают: (1) С-9-SH (патент США № 4424219) (получены путем реакции майтансинола с H2S или P2S5), (2) С-14-алкоксиметил (деметокси/C^OR) (патент США №. 4331598), (3) С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (СН2ОН или СН2ОАс) (патент США № 4450254) (получен из Nocar-dia), (4) С-15-гидрокси/ацилокси (патент США № 4364866) (получен конверсией майтансинола Streptomyces), (5) С-15-метокси (патенты США №№. 4313946 и 4315929) (выделен из Trewia nudiflora) , (6) С-18-^деметил (патенты США №№. 4362663 и 4322348) (получен деметилированием майтансинола Streptomyces) и (7) 4,5-дезокси (патент США № 4371533) (получен восстановлением трихлорида титана/LAH майтансинола).
В предпочтительном варианте воплощения изобретения конъюгат в качестве цитотоксического агента использует тиолсодержащий майтансиноид DM1, также известный как ^-деацетил-^-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтансин. Структура DM1 представлена формулой (I)
В другом предпочтительном варианте воплощения изобретения конъюгат в качестве цитотоксиче-ского агента использует тиолсодержащий майтансиноид DM4, также известный как ^-деацетил-^-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтансин. Структура DM4 представлена формулой (II)
Другие майтансиноиды могут использоваться в контексте изобретения, включая, например, тиол- и дисульфид-содержащие майтансиноиды, несущие моно- или диалкильные замены на атоме углерода, несущем атом серы. В частности, предпочтительным является майтансиноид, имеющий в С-3 положении (а) С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20 десметил функциональность, и (б) ацилированную аминокислотную боковую цепь с ацильной группой, несущей блокированную сульфгидрильную группу, при этом атом углерода ацильной группы, несущей тиоловую функциональность, имеет одну или две замены, и указанные замены представлены СН3, C2H5, линейным или разветвленным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоал-кильным радикалом, и, кроме того, одна из замен может быть представлена Н, и при этом ацильная группа имеет длину линейной цепи, по меньшей мере, три атома углерода между карбонилом и атомом серы.
Дополнительные майтансиноиды для использования в контексте изобретения включают соединения, представленные формулой (III)
при этом
Y' является (CR7R8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAo(CR5R6)mDu(CRn=CR12)r(C=C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ,
при этом R1 и R2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкени-лом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фениломили гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом R2 также может быть Н, при этом А, В, D являются циклоалкилом или циклоалкенилом, имеющем 3-10 атомов углерода, простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 и R12 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или ал-кенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом l, m, n, о, р, q, r, s и t каждый независимым образом является нулем или целым числом от 1 до 5, при условии, что, по меньшей мере, два l, m, n, о, р, q, r, s и t не являются нулем в любой момент времени, и при этом Z является Н, SR или COR, при этом R является линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формуле (III) включают соединения по формуле (III), при этом (a) R1 является Н, R2 является метилом и Z является Н, (б) R1 и R2 являются метилом и Z является Н, (в) R1 является Н, R2 является метилом и Z является -SCH3, и (г) R1 и R2 являются метилом и Z является -SCH3.
Такие дополнительные майтансиноиды также включают соединения, представленные формулой (IV-L), (IV-D) или (IV-D,L):
(IV-L) (IV-D) (IV-D,L)
при этом Y является (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, при этом R1 и R2 каждый независимым образом являются СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом R2 также может являться Н, при этом R3, R4, R5, R6, R7 и R8 каждый независимым образом является Н, СН3, C2H5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом l, m и n каждый независимым образом является целым числом от 1 до 5, и, кроме того, n может быть нулем, при этом Z является Н, SR или COR, при этом R является линейным или разветвленным ал-килом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом May является майтансиноидом, несущим боковую цепь в положении С-3, С-14 гидроксиметил, С-15 гидрокси или С-20 десметил.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формулам (IV-L), (IV-D) и (IV-D,L) включают соединения по формулам (IV-L), (IV-D) и (IV-D,L), при этом (a) R1 является Н, R2 является метилом, R5, R6, R7 и R8 каждый является Н, l и m каждый является 1, n является 0, и Z является Н, (б) R1 и R2 являются метилом, R5, R6, R7, R8 каждый является Н, l и m являются 1, n является 0, и Z является Н, (в) R1 является Н, R2 является метилом, R5, R6, R7 и R8 каждый является Н, l и m каждый является 1, n является 0, и Z является -SCH3, или (г) R1 и R2 являются метилом, R5, R6, R7, R8 каждый является Н, l и m являются 1, n является 0, и Z является -SCH3.
Предпочтительно, цитотоксический агент представлен формулой (IV-L).
(V)
при этом Y является (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, при этом R1 и R2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом,
Дополнительные предпочтительные майтансиноиды также включают соединения, представленные формулой (V):
замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом R2 также может являться Н, при этом R3, R4, R5, R6, R7 и R8 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом l, m и n каждый независимым образом является целым числом от 1 до 5, и, кроме того, n может быть нулем, и при этом Z является Н, SR или COR, при этом R является линейным алкилом или алкени-лом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формуле (V) включают соединения по формуле (V), при этом (a) R1 является Н, R2 является метилом, R5, R6, R7 и R8 каждый является Н; l и m каждый является 1; n является 0; и Z является Н, (б) R1 и R2 являются метилом; R5, R6, R7, R8 каждый является Н, l и m являются 1; n является 0; и Z является Н, (в) R1 является Н, R2 является метилом, R5, R6, R7 и R8 каждый является Н, l и m каждый являются 1, n является 0, и Z является -SCH3, или (г) R1 и R2 являются метилом, R5, R6, R7, R8 каждый является Н, l и m являются 1, n является 0, и Z является -SCH3.
Дополнительные предпочтительные майтансиноиды также включают соединения, представленные формулой (VI-L), (VI-D) или (VI-D,L):
НзЧ/ J нзС н о н о
о I о 1 о 1
(VI-L) (VI-D) (VI-D, L),
при этом Y2 является (CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, при этом R1 и R2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом R2 также может являться Н, при этом R3, R4, R5, R6, R7 и R8 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом l, m и n каждый независимым образом является целым числом от 1 до 5, и, кроме того, n может быть нулем, и при этом Z2 является SR или COR при этом R является линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или ал-кенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом May является макроцикличе-ской кольцевой структурой майтансиноида.
Дополнительные предпочтительные майтансиноиды включают соединения, представленные формулой (VII):
при этом Y2' является (CR7R8)i(CR9=CR10)p(C=C)qA^^
при этом R1 и R2 каждый независимым образом является СН3, С2Н5, линейным разветвленным ал-килом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, и при этом R2 может быть Н, при этом А, В и D каждый независимым образом является циклоалкилом или циклоалкенилом, имеющем 3-10 атомов углерода, простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 и R12 каждый независимым образом является Н, СН3, С2Н5, линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом, при этом l, m, n, о, р, q, r, s и t каждый независимым образом является нулем или целым числом от 1 до 5, при условии, что по меньшей мере два l, m, n, о, р, q, r, s и t не являются нулем в любой момент времени, и при этом Z2
является SR или -COR, при этом R является линейным алкилом или алкенилом, имеющем от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющем от 3 до 10 атомов углерода, или простым или замещенным арилом, или гетероциклическим ароматическим или гетероциклоалкильным радикалом.
Предпочтительные варианты воплощения изобретения по формуле (VII) включают соединения по формуле (VII), при этом R1 является Н и R2 является метилом.
Кроме майтансиноидов, цитотоксический агент, используемый в конъюгате, может быть таксаном или его производным. Таксаны являются семейством соединений, которые включают паклитаксел (Так-сол(r)), цитотоксический натуральный продукт, и доцетаксел (Таксотер(r)), полусинтетическое производное, оба из которых используют в лечении рака. Таксаны являются ингибиторами митотического веретена и ингибируют деполимеризацию тубулина, что приводит к смерти клетки. В то время как доцетаксел и паклитаксел используют в лечении рака, их противоопухолевая активность ограниченна по причине их неспецифической токсичности относительно здоровых клеток. Кроме того, соединения, подобные пакли-такселю и доцетакселю, сами по себе не достаточно сильные для использования в конъюгатах связывающих клетку агентов.
Предпочтительный таксан для использования в получении цитотоксического конъюгата является таксаном по формуле (VIII):
(VIII)
Способы синтеза таксанов, которые могут использоваться в контексте изобретения, вместе со способами конъюгации таксанов со связывающими клетку агентами, такими как антитела, подробно описаны в патентах США №№ 5416064, 5475092, 6340701, 6372738, 6436931, 6596757, 6706708, 6716821 и 7390898.
Цитотоксический агент также может быть представлен СС-1065 или его производным. СС-1065 является сильным противоопухолевым антибиотиком, выделенным из культуральной жидкости Streptomy-ces zelensis. СС-1065 приблизительно в 1000 раз сильнее in vitro, чем обычно используемые противораковые препараты, такие как доксорубицин, метотрексат и винкристин (Bhuyan et al., Cancer Res., 42: 35323537 (1982)). СС-1065 и его аналоги описаны в патентах США №№ 5585499, 5846545, 6340701 и 6372738. Цитотоксическая активность СС-1065 коррелировала с его алкилирующей активностью, а также активностью в связывании ДНК и интеркаляции ДНК. Эти два свойства присущи двум отдельным частям молекулы. В этом отношении алкилирующая активность присуща единице циклопропапирролоин-долу (CPI), и активность связывания ДНК присуща двум единицам пирролоиндола СС-10 65.
В науке известно несколько аналогов СС-1065, которые также могут использоваться в качестве ци-тотоксического агента в конъюгате (см., например, Warpehoski et al., J. Med. Chem., 31: 590-603 (1988)). Была разработана целая серия аналогов СС-1065, в которых молекула CPI замещена молекулой цикло-пропабензиндола (CBI) (Boger et al., J. Org. Chem., 55: 5823-5833 (1990), и Boger et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1: 115-120 (1991)). Такие аналоги СС-1065 поддерживают высокую активность in vitro исходного препарата без выявления замедленной токсичности у мышей. Подобно СС-1065, такие соединения являются алкилирующими агентами, которые ковалентно связываются с малой бороздкой ДНК для вызова смерти клетки.
Терапевтическая эффективность аналогов СС-1065 может быть по существу улучшена изменением распределения in vivo посредством целенаправленной доставки к месту опухоли, что приводит к сниженной токсичности для других тканей и, следовательно, пониженной системной токсичности. Вследствие этого были получены конъюгаты аналогов и производных СС-1065 со связывающими клетку агентами, которые специфически направлены на опухолевые клетки (см., например, патенты США №№ 5475092, 5585499 и 5846545). Эти конъюгаты обычно обладают высокой мишень-специфической цито-токсичностью in vitro и противоопухолевой активностью в моделях опухолевых ксенотрансплантатов у мышей (см., например, Chari et al., Cancer Res., 55: 4079-4084 (1995)).
Способы синтеза аналогов СС-1065 описаны подробно в патентах США №№ 5475092, 5585499, 5846545, 6534660, 6586618, 6756397 и 7329760.
Такие препараты, как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфа-лан, митомицин С, хлорамбуцил, калихеамицин, тубулизин и аналоги тубулизина, дуокармицин и аналоги дуокармицина, доластатин и аналоги доластатина также могут использоваться в качестве цитотокси-ческих агентов по изобретению. Доксарубицин и соединения даунорубицина (см., например, патент США No. 6630579) также могут использоваться в качестве цитотоксических агентов.
Конъюгаты связывающего клетку агента и цитотоксического агента могут быть получены способами in vitro. Для присоединения цитотоксического агента к антителу используют соединительную группу.
Подходящие соединительные группы хорошо известны в науке и включают дисульфидные группы, ки-слотонеустойчивые группы, фотонеустойчивые группы, пептидазонеустойчивые группы и эстеразоне-устойчивые группы, а также нерасщепляемые соединительные группы.
Согласно изобретению, связывающий клетку агент модифицируют реакцией бифункционального реагента, образующего перекрестные связи со связывающим клетку агентом, что приводит к ковалент-ному присоединению молекулы линкера к связывающему клетку агенту. В контексте данного изобретения термин "бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи" обозначает реагент, которые обладает двумя реакционными группами, одна из которых способна реагировать со связывающим клетку агентом, в то время как другая способна реагировать с цитотоксическим агентом для связи связывающего клетку агента с цитотоксическим агентом, образуя тем самым конъюгат.
Для использования в изобретении может использоваться любой подходящий бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, при условии, что реагент линкера обеспечивает сохранение терапевтических, например, цитотоксичности, и связующих характеристик цитотоксическому агенту и связывающему клетку агенту, соответственно, при сохранении приемлемого профиля токсичности. Предпочтительно, молекула линкера соединяет цитотоксический агент со связывающим клетку агентом посредством химических связей (как это описано выше), таким образом, цитотоксический агент и связывающий клетку агент являются химически соединенными (например, ковалентно соединенными) друг с другом.
В одном варианте воплощения изобретения бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, включает нерасщепляемые линкеры. Нерасщепляемый линкер является любой химической молекулой, которая способна связывать цитотоксический агент, такой как майтансиноид, таксан или аналог СС-1065, со связывающим клетку агентом стабильным, ковалентным способом. Таким образом, нерас-щепляемые линкеры по существу устойчивы к кислотному расщеплению, расщеплению, индуцированному светом, расщеплению, индуцированному пептидазой, расщеплению, индуцированному эстеразой, и расщеплению дисульфидной связи в условиях, при которых цитотоксический агент или связывающий клетку агент остаются активными.
Подходящие реагенты, образующие перекрестные связи и нерасщепляемые линкеры между цито-токсическим агентом и связывающим клетку агентом, хорошо известны в науке. В одном варианте воплощения изобретения цитотоксический агент присоединен к связывающему клетку агенту посредством тиоэфирной связи. Примеры нерасщепляемых линкеров включают линкеры, имеющие молекулы на основе малеимида или галоацетила для реакции с цитотоксическим агентом. Такие бифункциональные реагенты, образующие перекрестные связи, хорошо известны в науке (см. публикации заявок на патенты США №№ 2010/0129314, 2009/0274713, 2008/0050310, 2005/0169933 и Pierce Biotechnology Inc. P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, USA) и включают, но не ограничиваются, N-сукцинимидил 4-(малеимидометил) циклогексанкарбоксилат (SMCC), №сущинимидил-4-^-малеимидометил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который является "длинноцепочечным" аналогом SMCC (LC-SMCC), к-малеимидоунде-каноевой кислоты N-сукцинимидиловый эфир (KMUA), у-малеимидомасляной кислоты N-сукцини-мидиловый эфир (GMBS), е-малеимидокапроевой кислоты N-гидроксисукцинимидный эфир (EMCS), m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBS), ^(а-малеимидоацетокси)-сущинимидный эфир (AMAS), сукцинимидил-6-(Р-малеимидопропионамидо) гексаноат (SMPH), N-сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)-бутират (SMPB) и N-(р-малеимидофенил)изоцианат (PMPI). Реагенты, образующие перекрестные связи и включающие молекулу галоацетила, включают №сукцинимидил-4-(йодоацетил)-аминобензоат (SIAB), N-сукцинимидил йодоацетат (SIA), N-сукцинимидил бромацетат (SBA) и N-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (SBAP), бис-малеидополиэтиленгликоль (ВМРЕО), BM(PEO)2,BM(PEO)3, N-(P-малеимидопропилокси)сукцинимидный эфир (BMPS), 5-малеимидовале-риановой кислоты NHS, HBVS, 4-(4-N-малеимидофенил)-масляной кислоты гидразид-HCl (МРВН), сук-цинимидил-(4-винилсульфонил)бензоат (SVSB), дитиобис-малеимидоэтан (DTME), 1,4-бис-малеимидобутан (ВМВ), 1,4 бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан (BMDB), бис-малеимидогексан (ВМН), бис-малеимидоэтан (BMOE), сульфосукцинимидил 4-(№малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфосукцинимидил(4-йодоацетил)аминобензоат (сульфо-SIAB), m-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидный эфир (сульфо-MBS), №(у-малеимидобутирил-окси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-GMBS), N-(е-малеимидокапроилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-EMCS), N-(к-малеимидоундеканоилокси)сульфосукцинимидный эфир (сульфо-KMUS) и сульфосукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB) CX1-1, сульфо-Mal и PEGn-Mal. Предпочтительно бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, является SMCC.
В одном варианте воплощения изобретения соединяющий реагент является расщепляемым линкером. Примеры подходящих расщепляемых линкеров включают дисульфидные линкеры, кислотоне-устойчивые линкеры, светонеустойчивые линкеры, пептидазонеустойчивые линкеры и эстеразонеустой-чивые линкеры. Содержащие дисульфид линкеры являются линкерами, расщепляемыми посредством дисульфидного обмена, который может возникать при физиологических условиях. Кислотонеустойчивые линкеры являются линкерами, расщепляемыми при кислом рН. Например, определенные внутриклеточные компартменты, такие как эндосомы и лизосомы, имеют кислый рН (рН 4-5) и обеспечивают условия, подходящие для расщепления кислотонеустойчивых линкеров. Светонеустойчивые клинкеры используют на поверхности тела и в большинстве полостей, доступных для света. Кроме того, инфракрасный свет может проникать через ткань. Пептидазонеустойчивые линкеры также могут использоваться для расщепления определенных пептидов внутри или снаружи клеток (см., например, Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 626-629 (1982), и Umemoto et al., Int. J. Cancer, 43: 677-684 (1989)). В одном варианте воплощения изобретения расщепляемый линкер расщепляется при умеренных условиях, т.е. условиях в клетке, при которых активность цитотоксического агента сохранена.
В одном варианте воплощения изобретения цитотоксический агент присоединен к связывающему клетку агенту посредством дисульфидной связи. Молекула линкера включает реакционную химическую группу, которая реагирует со связывающим клетку агентом. Предпочтительными реакционными химическими группами для реакции со связывающим клетку агентом, являются N-сукцинимидиловые эфиры и N-сульфосукцинимидиловые эфиры. Кроме того, линкерная молекула включает реакционную химическую группу, предпочтительно дитиопиридиловую группу, которая может реагировать с цитотоксиче-ским агентом с образованием дисульфидной связи. Бифункциональные реагенты, образующие перекрестные связи и способные связывать связывающий клетку агент с цитотоксическим агентом посредством дисульфидных связей, известны науке и включают, например, N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см., например, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB) (см., например, патент США № 4563304), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP) (см., например, CAS регистрационный номер 34149808-6) и №сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)2-сульфобутаноат (сульфо-SPDB) (см., например, публикацию заявки на патент США № 2009/0274713). Другие бифункциональные реагенты, образующие перекрестные связи, которые могут использоваться для введения дисульфидных групп, известны науке и описаны в патентах США №№ 6913748, 6716821 и публикациях заявок на патенты США 2009/0274713 и 2010/0129314, все из которых включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.
В способе по изобретению также могут использоваться и другие реагенты, образующие перекрестные связи, при отсутствии атома серы, который образует нерасщепляемые линкеры. Такие линкеры могут быть получены из молекул на основе дикарбоновой кислоты. Подходящие молекулы на основе ди-карбоновой кислоты включают, но не ограничиваются, а,ю-дикарбоновые кислоты по общей формуле (IX)
HOOC-X,-Yn-Zm-COOH
(IX),
при этом X является линейной или разветвленной алкильной, алкенильной или алкинильной группой, имеющей от 2 до 20 атомов углерода, Y является циклоалкильной или циклоалкенильной группой, несущей от 3 до 10 атомов углерода, Z является замещенной или незамещенной ароматической группой, несущей от 6 до 10 атомов углерода, или замещенной или незамещенной гетероциклической группой, при этом гетероатом выбирают из N, О или S, и при этом l, m и n каждый является 0 или 1, при условии, что l, m и n не являются нулем в одно и то же время.
Большое количество описанных в данном документе нерасщепляемых линкеров подробно описано в публикации заявки на патент США № 2005/0169933 А1.
Представленные ниже примеры дополнительно демонстрируют изобретение, но, конечно же, не должны никоим образом ограничивать объем изобретения.
Пример 1.
Данный пример описывает способы производства конъюгатов связывающий клетку агент-цитотоксический агент с улучшенной гомогенностью, включающие проведение реакции модификации при пониженной температуре.
Гуманизированное антитело CD37-3 (huCD37-3) было подвергнуто реакции с гетеробифункцио-нальным реагентом SMCC (N-сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат), образующим перекрестные связи, и майтансиноидом DM1 посредством описанного ранее способа, а также улучшенного способа, описанного в тексте данной заявки.
Для описанного ранее способа, в способе А (см., например, Chari et al., патент США No. 5208020), huCD37-3 (15 мг/мл) вначале было подвергнуто реакции с SMCC (6,0-кратный молярный избыток относительно количества антитела, растворенного в DMA, диметилацетамиде) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 20°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 6,7), содержащем 2 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в 10% DMA в течение 180 мин. Реакция была погашена 1 М ацетата для коррекции рН до 4,5, и модифицированное антитело было очищено посредством колонки со смолой Sephadex G-25F с установленным равновесием и элюированием в 20 мМ натрия ацетата (рН 4,5), содержащем 2 мМ ЭДТА. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) было скорректировано до рН 5,0 буфером трехосновного калия фосфата и подвергнуто реакции с майтансиноидом DM1 (7,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела, растворенного в DMA) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при 20° С в 20 мМ буфера натрия ацетата (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% DMA в течение приблизительно 20 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой Se-phadex G-25F с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Для способа В (включающего стадию модификации при высоком рН и комнатной температуре), huCD37-3 (15 мг/мл) вначале прореагировало с SMCC (6,0-кратный молярный избыток относительно количества антитела, растворенного в DMA) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 20°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 7,5), содержащем 2 мМ ЭДТА в 10% DMA в течение 50 мин. Реакция была погашена 1 М уксусной кислоты для коррекции рН до 4,5, а модифицированное антитело было очищено посредством колонки со смолой Sephadex G-25F с установленным равновесием и элюированием в 20 мМ натрия ацетата (рН 4,5), содержащем 2 мМ ЭДТА. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) было скорректировано до рН 5,0 буфером трехосновного калия фосфата и подвергнуто реакции с майтансиноидом DM1 (7,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела, растворенного в DMA) с образованием конъюги-рованного антитела. Реакцию конъюгации проводили при 20°С в 20 мМ буфера натрия ацетата (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% DMA в течение приблизительно 20 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой Sephadex G-25F с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Для способа по изобретению, в Способе С (включающего стадию модификации при высоком рН и низкой температуре), huCD37-3 (15 мг/мл) вначале прореагировало с SMCC (6,0-кратный молярный избыток относительно количества антитела, растворенного в DMA) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 10°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 7,5), содержащем 2 мМ ЭДТА в 10% DMA в течение 50 мин. Реакция была погашена 1 М уксусной кислоты для коррекции рН до 4,5, а модифицированное антитело было очищено посредством колонки со смолой Se-phadex G-25F с установленным равновесием и элюированием в 20 мМ натрия ацетата (рН 4,5), содержащем 2 мМ ЭДТА. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) было скорректировано до рН 5,0 буфером трехосновного калия фосфата и подвергнуто реакции с майтансиноидом DM1 (7,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела, растворенного в DMA) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при 20° С в 20 мМ буфера натрия ацетата (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% DMA в течение приблизительно 20 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой Sephadex G-25F с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Конъюгат, полученный тремя способами, был анализирован следующим образом: УФ спектроскопия для определения соотношения концентрации конъюгата и майтансиноида к антителу (MAR); несвязанного майтансиноида двухколоночной хроматографией с обращенными фазами; масс-спектрометрией для определения уровня неконъюгированного линкера; восстановительного электрофореза SDS PAGE для определения уровня невосстанавливаемых видов; невосстанавливающего электрофореза SDS PAGE для определения уровня фрагментов; и эксклюзионной ВЭЖХ для определения мономера конъюгата.
Соотношение концентрации и майтансиноида к антителу было определено измерением поглощаемости конъюгата при проведении спектроскопии при УФ и видимом спектре при 252 и 280 нм и использовании коэффициентов молярной экстинкции DM1 и антитела при двух длинах волн для расчета молярных концентраций антитела и DM1.
Уровень неконъюгированного линкера для конъюгатов был проанализирован масс-спектрометрией: площади пиков отдельных видов конъюгатов (включая конъюгаты с или без неконъюгированных линке
ров) были измерены; уровень неконъюгированного линкера был рассчитан по соотношению суммы площадей, содержащих неконъюгированные линкеры (взвешено по количеству линкеров) к сумме площадей всех конъюгированных видов (также взвешены по количеству линкеров).
Уровень невосстанавливаемых видов конъюгатов был проанализирован восстановительным гель-электрофорезом SDS: площади пиков отдельного восстановленного вида конъюгата (включая восстановленную легкую цепь, восстановленную тяжелую цепь, легкие цепи, сшитые поперечными связями, легкие и тяжелые цепи, сшитые поперечными связями и т.д.) были измерены; уровень невосстанавливаемых видов был рассчитан по соотношению сумм площадей невосстанавливаемых видов к сумме площадей всех видов.
Уровень мономеров конъюгатов был проанализирован эксклюзионной ВЭЖХ: площади пиков мономеров, димеров, агрегатов и низкомолекулярных видов были измерены посредством детектора поглощения, установленного на длину волны 252 нм или 280 нм; уровень мономеров был рассчитан по соотношению площади мономеров к общей площади.
Количество несвязанного майтансиноида, присутствующего в конъюгате, было проанализировано двухколоночной ВЭЖХ (колонки HiSep и С18): площади пиков общих несвязанных видов майтансинои-дов (элюированных в градиенте и идентифицированных сравнением времени элюирования с известными стандартами) были измерены посредством детектора поглощения, установленного на длину волны 2 52 нм; количество несвязанного майтансиноида было рассчитано посредством стандартной кривой, полученной по площади пиков известного количества стандартов.
Как это показано в табл. 1 ниже, конъюгат, полученный посредством способа по изобретению (способ С), превосходил конъюгат, полученный посредством описанного ранее способа, способа А, относительно неконъюгированного линкера, невосстанавливаемых видов и мономера, а также способа В, включающего проведение стадии модификации при высоком рН и комнатной температуре. Таблица 1. Сравнение основных свойств конъюгата, полученного посредством способа по изобретению,
Результаты экспериментов, описанных в данном примере, показывают, что проведение стадии модификации при низкой температуре (например, 10°С), позволяет получить конъюгат, превосходящий конъюгат, полученный посредством описанного ранее способа. Кроме того, результаты экспериментов, описанных в данном примере, показывают, что проведение стадии модификации при высоком рН (например, 7,5), позволяет получить конъюгат лучшего качества только в том случае, если стадию модификации проводят при низкой температуре (например, 10°С).
Пример 2.
Данный пример описывает способы производства конъюгатов связывающего клетку агент-цитотоксического агента с улучшенной гомогенностью, включающие проведение реакции модификации при пониженной температуре и повышенном рН.
Гуманизированное антитело реагировало с гетеробифункциональным реагентом SMCC, образующим перекрестные связи, и майтансиноидом DM1 с получением конъюгата с MAR (соотношение май-тансиноида к антителу, также известно как соотношение препарата к антителу) приблизительно 3,5.
Реакцию проводили посредством описанного ранее способа (см., например, публикации заявок на патенты США 2011/0166319 и 2006/0182750), а также способа по изобретению, включающего проведение реакции модификации при повышенном рН и пониженной температуре.
Посредством описанного ранее способа, гуманизированное антитело (15 мг/мл) вначале было подвергнуто реакции с SMCC (7,5-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 21°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 6,7), содержащем 2 мМ ЭДТА в 5% DMA в течение 120 мин. Реакция была погашена 0,5М цитрата для корректирования рН до 5,0, и модифицированное антитело было очищено посредством колонки Sephadex G25F. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 5 мг/мл) про
реагировало с майтансиноидом DM1 (5,4-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела; 1,3-кратный молярный избыток в сравнении с измеренным количеством линкера на антителе) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при комнатной температуре в 20 мМ цитратного буфера (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% DMA в течение приблизительно 17 ч. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой Sephadex G25F с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
В способе по изобретению гуманизированное антитело (3 мг/мл) вначале было подвергнуто реакции с SMCC (6,0-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела) с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводили при 0°С в 50 мМ буфера натрия фосфата (рН 8,2), содержащем 2 мМ ЭДТА в 5% DMA в течение 117 минут. Реакция была погашена 0,5М цитрата для корректирования рН до 5,0, и модифицированное антитело было очищено посредством колонки Se-phadex G25F. После очистки, модифицированное антитело (при концентрации 2,5 мг/мл) прореагировало с майтансиноидом DM1 (5,2-кратный молярный избыток в сравнении с количеством антитела; 1,3-кратный молярный избыток в сравнении с измеренным количеством линкера на антителе) с образованием конъюгированного антитела. Реакцию конъюгации проводили при комнатной температуре в 20 мМ цитратного буфера (рН 5,0), содержащем 2 мМ ЭДТА и 5% DMA в течение приблизительно 20 часов. Затем реакционная смесь была очищена посредством колонки со смолой Sephadex G25F с установленным равновесием и элюирована в 10 мМ натрия сукцината (рН 5,0).
Конъюгат, полученный в ходе двух способов, был анализирован следующим образом: масс-спектрометрией для определения уровня неконъюгированного линкера;
восстановительным электрофорезом SDS PAGE для определения уровня невосстанавливаемых видов; и эксклюзионной ВЭЖХ для определения мономера конъюгата.
Как это показано ниже в табл. 2, конъюгат, полученный посредством способа по изобретению, превосходил конъюгат, полученный посредством описанного ранее способа относительно неконъюгирован-ного линкера и невосстанавливаемых видов.
Таблица 2. Сравнение основных свойств конъюгата, полученного посредством способа по изобретению,
в сравнении с описанным ранее способом
Описанный ранее
Способ по
способ
изобретению
Модификация при рН 6,7, комнатная
Модификация при рН 8,2,
температура
0°С
MAR
3, 6
3,1
Мономер % (эксклюзионная ВЭЖХ)
96, 8%
97, 5%
Невосстанавливаемые виды
(восстановленный Gel Chip)
12, 9%
6, S%
Неконъютированный линкер Ъ
(MDP)
12, 3%
1,6%
Общее количество
несвязанного майтансиноида
0, 2%
0, 1%
Результаты экспериментов, описанных в данном примере, указывают, что проведение стадии модификации при комнатной температуре (например, 0°С) и высоком рН (например, рН 8,2) позволяет получить конъюгат, превосходящий конъюгат, полученный посредством описанного раннего способа, при котором стадию модификации проводят при комнатной температуре и пониженном рН (например, рН
6,7).
Пример 3.
Данный пример демонстрирует широкомасштабный способ производства конъюгатов связывающего клетку агент-цитотоксического агента с улучшенной гомогенностью, включающий проведение реакции модификации при пониженной температуре и повышенном рН.
Гуманизированное антитело подвергают реакции с гетеробифункциональным реагентом SMCC, образующим перекрестные связи, с майтансиноидом DM1 для получения стабильного конъюгата гуманизированное антитело-SMCC-DML
В частности, посредством описанного в данном документе способа по изобретению, гуманизированное антитело реагирует с SMCC с образованием модифицированного антитела. Реакцию модификации проводят в течение 4 0 минут посредством молярного избытка SMCC в сравнении с антителом, равном 5,7, при температуре приблизительно 10°С в буфере, имеющем рН приблизительно 7,8 в 50 мМ на
трия фосфата, 2 мМ ЭДТА с 7% (о/о) DMA. После модификации, рН реакционной смеси корректируют до 4,5 посредством 1М уксусной кислоты, и модифицированное антитело очищают посредством ФТП. После очистки, модифицированное антитело реагирует с майтансиноидом DM1 (приблизительно 1,2-кратный молярный избыток в сравнении со связанным линкером) с образованием конъюгированного антитела. Реакция конъюгации проводится в течение 16 часов при комнатной температуре при рН приблизительно 5,0 в 20 мМ натрия ацетата, 2,0 мМ ЭДТА с 5,0% (о/о) DMA. Затем реакционную смесь очищают посредством ФТП.
Анализ конъюгата может быть проведен следующим образом: масс-спектрометрией для определения уровня неконъюгированного линкера; восстановительным электрофорезом SDS PAGE для определения уровня невосстанавливаемых видов; и эксклюзионной ВЭЖХ для определения мономера конъюгата. Результаты анализа показывают, что конъюгат, полученный способом по изобретению, превосходит конъюгат, полученный посредством описанных ранее способов (см., например, публикации заявок на патенты США 2011/0166319 и 2006/0182750).
Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, процитированные в тексте данной заявки, включены в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была представлена отдельным и специальным образом с указанием путем ссылки и в полном своем объеме.
Использование единственного числа и подобных понятий, используемых в контексте данного изобретения (особенно в контексте представленной ниже формулы изобретения), включают единственное и множественное число, если четко не указано иное или если это четко не следует из контекста. Термины "включать", "иметь", "включая" и "содержать" обозначают неограничивающие термины (т.е. обозначают "включая, но не ограничиваясь"), если не указано иное. Указание диапазонов значений в тексте данной заявки служит только в качестве способа сокращения обозначения ссылки на каждое отдельное значение, включенное в диапазон, если не указано иное, и каждое отдельное значение включено в текст, как если бы оно было указано отдельно. Все описанные в данном документе способы могут проводиться в любом подходящем порядке, если не указано иное, или если иное четко не следует из контекста. Использование любого и всех примеров или типичных терминов (например, "такой как") в тексте данной заявки предназначено только для демонстрации изобретения и не должно ограничивать объем изобретения, если не указано иное. Ни один термин в тексте заявки не должен рассматриваться как указывающий на любой незаявленный элемент, необходимый для практического использования изобретения.
В данном документе описаны предпочтительные варианты воплощения данного изобретения, включая наиболее известный способ осуществления изобретения, известный исследователям. Специалисту в данной области после прочтения представленного выше описания станут очевидными вариации предпочтительных вариантов воплощения изобретения. Исследователи ожидают, что специалисты в данной области будут использовать данные вариации соответствующим образом, кроме того, исследователи предполагают, что изобретение может быть использовано иным способом, чем это описано в данной заявке. В соответствии с этим, данное изобретение включает все модификации и эквиваленты сущности изобретения, представленной в прилагаемой формуле изобретения в соответствии с действующим законодательством. Более того, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариациях охватывается данным изобретением, если иное не будет указано отдельно или если это четко не следует из контекста.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ImmunoGen, Inc.
<120> СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОНЪЮГАТОВ С УЛУЧШЕННОЙ ГОМОГЕННОСТЬЮ
<130> 710090
<140> PCT/US12/31253 <141> 2012-03-29
<150> US 61/468,981
<151> 2011-03-29 <160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь CDR1
<400> 1
Gly Tyr Phe Met Asn 1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь CDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14) .. (14)
<223> Xaa представляет собой Lys, Gln, His, или Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa представляет собой Gln, His, Asn, или Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> Xaa представляет собой Gly, Glu, Thr, Ser, Ala, или Val
<400> 2
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Xaa Phe Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь CDR3
<400> 3
Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr 1 5
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь CDR1
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь CDR2
<400> 5
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala 1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь CDR3
<400> 6
Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь CDR2
<400> 7
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 448
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 9
<211> 117
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь Variable Domain
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
10 15
Ser Val Lys Ile Ser Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Phe
20 25 30
Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His Met
65 70 75 80
Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь Variable Domain
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь Variable Domain
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения связывающего клетку полипептида с присоединенным к нему линкером, включающий приведение связывающего клетку полипептида с бифункциональным реагентом, образующим перекрестные связи, содержащим группу N-сукцинимидилового эфира, группу N-сульфосукцинимидилового эфира, часть на основе малеимида или часть на основе галоацетила, при температуре приблизительно 15°С или менее для ковалентного присоединения линкера к связывающему клетку полипептиду с получением тем самым смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами.
2. Способ по п.1, где способ дополнительно включает конъюгирование цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами путем осуществления реакции связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами с цитотоксическим агентом в растворе с рН от приблизительно 4 до приблизительно 9 с получением смеси, включающей (i) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, и подвергание указанной смеси, включающей (i) связывающий клетку полипептид, химически соединенный посредством линкера с цитотоксическим агентом, (ii) несвязанный цитотоксический агент и (iii) побочные продукты реакции, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хрома
1.
тографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для очистки связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом, от других компонентов смеси с получением тем самым очищенной смеси связывающих клетку полипептидов, химически связанных посредством линкеров с цитотоксическим агентом.
3. Способ по п.2, где способ дополнительно включает подвергание смеси, включающей связывающие клетку полипептиды с присоединенными к ним линкерами, фильтрации тангенциальными потоками, избирательной преципитации, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, адсорбционной хроматографии или их комбинации, для приготовления очищенной смеси связывающих клетку полипептидов с присоединенными к ним линкерами до конъюгирования цитотоксического агента со связывающими клетку полипептидами с присоединенными к ним линкерами в указанной очищенной смеси.
4. Способ по п.2 или 3, где цитотоксический агент выбирают из группы, состоящей из майтанси-ноидов, таксанов, СС1065 и аналогов перечисленных веществ.
5. Способ по п.4, где цитотоксический агент представляет собой майтансиноид.
6. Способ по п.5, где майтансиноид включает тиоловую группу.
7. Способ по п.6, где майтансиноид представляет собой DM1 или DM4.
8. Способ по любому из пп.1-7, где приведение в контакт на стадии (а) происходит в растворе, имеющем рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9.
9. Способ по п.8, где рН составляет приблизительно 7,8.
10. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из цитратного буфера, ацетатного буфера, сукцинатного буфера и фосфатного буфера.
11. Способ по п.8 или 9, где раствор включает буферный агент, выбранный из группы, состоящей из HEPPSO (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-гидроксипропансульфоновая кислота)), POPSO (пипера-зин-1,4-бис-(2-гидроксипропансульфоновая кислота) дегидрата), HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота), HEPPS (EPPS) (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-пропансульфоновая кислота), TES (№[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновая кислота) и их комбинации.
12. Способ по любому из пп.1-11, где указанное приведение в контакт происходит при температуре от приблизительно -10°С до приблизительно 15°С.
13. Способ по п.12, где температура составляет приблизительно 10°С.
14. Способ по любому из пп.1-13, где связывающий клетку полипептид выбирают из группы, состоящей из антител, интерферонов, интерлейкина 2 (IL-2), интерлейкина 3 (IL-3), интерлейкина 4 (IL-4), интерлейкина 6 (IL-6), инсулина, EGF, TGF-a, FGF, G-CSF, VEGF, MCSF, GM-CSF и трансферрина.
15. Способ по п.14, где связывающий клетку полипептид представляет собой антитело.
16. Способ по п.15, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
17. Способ по п.16, где антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
18. Способ по любому из пп.15-17, где антитело выбирают из группы, состоящей из huN901, huMy9-6, huB4, huC242, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, CNTO95, huDS6, ритуксимаба, антитела к CD27L, антитела к Her2, антитела к EGFR, антитела к EGFRvIII, Cripto, антитела к CD138, антитела к CD38, антитела к EphA2, интегрин-связующего антитела, антитела к CD37, антитела к фолату, антитела к Her3 и антитела к IGFIR.
19. Способ по п.1, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, включает часть на основе малеимида.
20. Способ по п.19, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, выбирают из группы, состоящей из N-сукцинимидил 4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилата (SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроата) (LC-SMCC), к-малеи-мидоундеканоевой кислоты N-сукцинимидилового эфира (KMUA), у-малеимидобутирата N-сукцини-мидилового эфира (GMBS), р-малеимидопропилокси-сукцинимидилового эфира (BMPS), е-малеимидо-капроновой кислоты N-гидроксисукцинимидного эфира (EMCS), гп-малеимидобензоил-^гидрокси-сукцинимидного эфира (MBS), ^(а-малеимидоацетокси)сущинимидного эфира (AMAS), сукциними-дил-6-(Р-малеимидопропионамидо)гексаноата (SMPH), N-сукцинимидил 4-(p-малеимидофенил)бутирата (SMPB) и N-(p-малеимидофенил)изоцианата (PMPI), сульфо-Mal, PEG4-Mal и CX1-1.
21. Способ по п.20, где бифункциональный реагент, образующий перекрестные связи, представляет собой №сущинимидил-4-(малеимидометил)циклогексанкарбоксилат (SMCC).
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025786
- 1 -
(19)
025786
- 1 -
(19)
025786
- 1 -
(19)
025786
- 4 -
(19)
025786
- 23 -
025786
- 28 -