EA 025783B1 20170130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/025783 Полный текст описания [**] EA201390856 20111214 Регистрационный номер и дата заявки US61/423,512 20101215 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2011/064960 Номер международной заявки (PCT) WO2012/082931 20120621 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21701 Номер бюллетеня [**] ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ УЛУЧШЕННОГО СПОСОБА РАСТВОРИТЕЛЬ-ДЕТЕРГЕНТ Название документа [8] A61K 35/37, [8] A61L 2/00 Индексы МПК [AT] Фельгенхауэр Мартин, [CH] Мизон Доминик, [FR] Монтандон Фредерик, [AT] Фарцет Мария Сведения об авторах [US] БАКСАЛТА ИНКОРПОРЕЙТИД, [CH] БАКСАЛТА ГМБХ Сведения о патентообладателях [US] БАКСАЛТА ИНКОРПОРЕЙТИД, [CH] БАКСАЛТА ГМБХ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000025783b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, включающий стадии: а) получения жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивания три(н-бутил)фосфата, полиоксиэтиленоктилфенилового эфира и полисорбата 80 сорбитана моноолеата с жидкостью с созданием в результате этого смеси, в которой конечная концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.), конечная концентрация полиоксиэтиленоктилфенилового эфира составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 10,0% (об./об.) и конечная концентрация полисорбата 80 сорбитана моноолеата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.); и с) инкубации смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).

2. Способ по п.1, в котором концентрация три(н-бутил)фосфата составляет приблизительно 0,3% (об./об.), концентрация полиоксиэтиленоктилфенилового эфира составляет приблизительно 1,0% (об./об.) и концентрация полисорбата 80 сорбитана моноолеата составляет приблизительно 0,3% (об./об.).

3. Способ по п.1, в котором фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 50% от активности, имеющейся на стадии (а).

4. Способ по п.1, в котором фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 75% от активности, имеющейся на стадии (а).

5. Способ по п.1, где жидкость представляет собой клеточный лизат, супернатант клеток, элюат с предшествующей стадии очистки или биологическую жидкость.

6. Способ по п.1, где фактор VIII представляет собой рекомбинантный фактор VIII.

7. Способ по п.1, где на стадии (с) смесь инкубируют в течение от приблизительно 10 до приблизительно 90 мин или от приблизительно 30 до приблизительно 60 мин.

8. Способ по п.1, где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 4°С.

9. Способ по п.1, где смесь после инкубации включает по меньшей мере в 100 раз менее ID 50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, чем перед инкубацией; менее 1 ×10 1 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и/или полностью свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.

10. Способ по п.1, где вирус, имеющий липидную оболочку, представляет собой ДНК-вирус, РНК-вирус, обратно транскрибирующий вирус, вирус иммунодефицита человека, вирус Синдбис, вирус простого герпеса, вирус ложного бешенства, вирус Сендай, вирус везикулярного стоматита, вирус лихорадки западного Нила, вирус вирусной диареи коров, коронавирус, вирус артрита лошадей, вирус тяжелого острого респираторного синдрома, вирус мышиного лейкоза Молони, вирус коровьей оспы, вирус herpesviridae, вирус poxviridae, вирус hepadnaviridae; вирус flaviviridae, вирус togaviridae, вирус coronaviridae, вирус deltavirus, вирус orthomyxoviridae, вирус paramyxoviridae, вирус rhabdoviridae, вирус bunyaviridae, вирус filoviridae, вирус retroviridae и/или вирус hepadnaviridae.

11. Способ по п.1, где способ дополнительно включает одну или более стадий после стадии (с), включая удаление три(н-бутил)фосфата из смеси; удаление полиоксиэтиленоктилфенилового эфира и полисорбата 80 сорбитана моноолеата из смеси и/или удаление нежизнеспособного вируса из смеси.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Способ инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, включающий стадии: а) получения жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивания три(н-бутил)фосфата, полиоксиэтиленоктилфенилового эфира и полисорбата 80 сорбитана моноолеата с жидкостью с созданием в результате этого смеси, в которой конечная концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.), конечная концентрация полиоксиэтиленоктилфенилового эфира составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 10,0% (об./об.) и конечная концентрация полисорбата 80 сорбитана моноолеата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.); и с) инкубации смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).

2. Способ по п.1, в котором концентрация три(н-бутил)фосфата составляет приблизительно 0,3% (об./об.), концентрация полиоксиэтиленоктилфенилового эфира составляет приблизительно 1,0% (об./об.) и концентрация полисорбата 80 сорбитана моноолеата составляет приблизительно 0,3% (об./об.).

3. Способ по п.1, в котором фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 50% от активности, имеющейся на стадии (а).

4. Способ по п.1, в котором фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 75% от активности, имеющейся на стадии (а).

5. Способ по п.1, где жидкость представляет собой клеточный лизат, супернатант клеток, элюат с предшествующей стадии очистки или биологическую жидкость.

6. Способ по п.1, где фактор VIII представляет собой рекомбинантный фактор VIII.

7. Способ по п.1, где на стадии (с) смесь инкубируют в течение от приблизительно 10 до приблизительно 90 мин или от приблизительно 30 до приблизительно 60 мин.

8. Способ по п.1, где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 4°С.

9. Способ по п.1, где смесь после инкубации включает по меньшей мере в 100 раз менее ID 50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, чем перед инкубацией; менее 1 ×10 1 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и/или полностью свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.

10. Способ по п.1, где вирус, имеющий липидную оболочку, представляет собой ДНК-вирус, РНК-вирус, обратно транскрибирующий вирус, вирус иммунодефицита человека, вирус Синдбис, вирус простого герпеса, вирус ложного бешенства, вирус Сендай, вирус везикулярного стоматита, вирус лихорадки западного Нила, вирус вирусной диареи коров, коронавирус, вирус артрита лошадей, вирус тяжелого острого респираторного синдрома, вирус мышиного лейкоза Молони, вирус коровьей оспы, вирус herpesviridae, вирус poxviridae, вирус hepadnaviridae; вирус flaviviridae, вирус togaviridae, вирус coronaviridae, вирус deltavirus, вирус orthomyxoviridae, вирус paramyxoviridae, вирус rhabdoviridae, вирус bunyaviridae, вирус filoviridae, вирус retroviridae и/или вирус hepadnaviridae.

11. Способ по п.1, где способ дополнительно включает одну или более стадий после стадии (с), включая удаление три(н-бутил)фосфата из смеси; удаление полиоксиэтиленоктилфенилового эфира и полисорбата 80 сорбитана моноолеата из смеси и/или удаление нежизнеспособного вируса из смеси.


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
025783 (13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации
и выдачи патента: 2017.01.30
(51) Int. Cl. A61K35/37 (2006.01) A61L 2/00 (2006.01)
(21) Номер заявки:
(22) Дата подачи:
201390856 2011.12.14
(54) ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ УЛУЧШЕННОГО СПОСОБА РАСТВОРИТЕЛЬ-ДЕТЕРГЕНТ
(31) 61/423,512
(32) 2010.12.15
(33) US
(43) 2013.12.30
(86) PCT/US2011/064960
(87) WO 2012/082931 2012.06.21
(71) (73) Заявитель:
БАКСАЛТА ИНКОРПОРЕЙТИД (US); БАКСАЛТА ГМБХ (CH)
(72) Изобретатель:
Фельгенхауэр Мартин (AT), Мизон Доминик (CH), Монтандон Фредерик (FR), Фарцет Мария (AT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) HERBERT O. DICHTELMULLER ET AL.:
"Robustness of solvent/detergent treatment of plasma derivatives: a data collection from Plasma Protein Therapeutics Association member companies", TRANSFUSION, vol. 49, no. 9, 1 September 2009 (2009-09-01), pages 1931-1943, XP55020543, ISSN: 0041-1132, DOI: 10.1111/j.1537-2995.2009.02222.x, page 1931 - page 1942; figures 1-7; tables 1-4 & ROBERTSON J.S. ET AL.: "Virus & TSE safety forum 2008", BIOLOGICALS, ACADEMIC PRESS LTD., LONDON, GB, vol. 37, no. 5, 1 October 2009 (200910-01), pages 345-354, XP026574352, ISSN: 10451056, DOI: 10.1016/J.BIOLOGICALS.2009.05.001 [retrieved on 2009-07-30] page 349, left-hand column, paragraph 3; tables 3, 5, 6
ROBERTS P.L. ET AL.: "Virus inactivation in a factor VIII/VWF concentrate treated using a solvent/detergent procedure based on polysorbate 20", BIOLOGICALS, ACADEMIC PRESS LTD., LONDON, GB, vol. 37, no. 1, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 26-31, XP025771406, ISSN: 1045-1056, DOI: 10.1016/J.BIOLOGICALS.2008.08.003 [retrieved on 2008-10-10] page 26 - page 30; tables 1-7
EP-A2-0378208
EP-A1-0534812
"Annex 4 Guidelines on viral inactivation and removal of procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products", WHO Technical Report Series, 924, 1 January 2004 (200401-01), pages 151-242, XP55020431, Retrieved from the Internet: URL:http://whqlibdoc.who.int/trs/ WHO_TRS_924.pdf [retrieved on 2012-02-28]
ROBERTS P.L. ET AL.: "Effect of manufacturing process parameters on virus inactivation by solvent-detergent treatment in a high-purity factor
IX concentrate", VOX SANGUINIS, vol. 83, no. 3, 1
April 2003 (2003-04-01), pages 170-175, XP55020546, DOI: 10.1046/j.1423-0410.2003.00275.x, tables 1, 4-8
(57) В настоящем описании раскрываются способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, и белки, по существу, свободные от вируса, имеющего липидную оболочку, полученные с помощью таких способов.
Заявление о приоритете
По настоящей заявке в соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) испрашивается приоритет временной патентной заявки США с порядковым № 61/423512, поданной 15 декабря 2010 г., которая таким образом включена в качестве ссылки в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее описание относится к способам инактивации вирусных загрязнений в процессе получения белков.
Введение.
Продолжает расти важность использования фармацевтических композиций, включающих терапевтический белок, в качестве метода лечения многих заболеваний, нарушений или состояний, которые влияют на здоровье индивидуума. Многие белки, используемые в фармацевтической композиции, обычно получают с помощью рекомбинантных способов продукции с применением клеточной линии млекопитающих или путем очистки из биологической жидкости. Однако терапевтический белок, полученный такими методами, может быть загрязнен инфекционными патогенными вирусами, опасными для здоровья индивидуума. Следовательно, важной является обработка терапевтического белка для устранения любой загрязняющей вирусной активности, в результате этого обеспечивается гарантия того, что полученная в результате фармацевтическая композиция безопасна для введения индивидууму.
В настоящее время существует много различных методов инактивации инфекционных патогенных вирусов, включая, например, тепловую инактивацию, инактивацию растворителем/детергентом (S/D), инактивацию с помощью рН, химическую инактивацию и/или инактивацию с помощью ультрафиолетового облучения. Среди них инактивация S/D является, вероятно, наиболее широкораспространенным вирулицидным методом, так как почти все важные патогены человека представляют собой покрытые оболочкой вирусы, чувствительные к разрушению мембран растворителями и детергентами. Кроме того, метод S/D лучше предохраняет содержимое и биологическую активность жидкости, используемой для лечения, по сравнению с другими вирулицидными методами. Например, методы инактивации, использующие нагревание, кислый рН, химические агенты и облучение, являются проблематичными, так как эти агенты являются грубыми и/или инвазивными и склонны к индукции денатурации или к другому варианту инактивации подвергаемого очистке терапевтического белка.
В методе инактивации S/D органический растворитель и детергент смешивают с жидкостью, включающей подвергаемый очистке белок, и инкубируют. Растворитель создает окружение, стимулирующее агрегацию детергента и липидной мембраны, инкапсулирующей вирус, а детергент разрушает взаимодействия между молекулами в этой липидной мембране. После разрушения оболочки вирус не может больше связываться с клеткой и инфицировать ее и не способен к репродукции, так как интактная ли-пидная мембрана важна для таких типов активности. Эта инактивация обычно осуществляется при температуре выше 20°С, потому что более высокие температуры облегчают разрушение оболочки. Например, обычные условия, используемые в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), представляют собой 0,3% три(н-бутил)фосфат (TNBP) и 1% полисорбат 80 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 80), инкубируемые при 24°С в течение как минимум 6 ч, или 0,3% TNBP и 1% по-лиоксиэтиленоктилфениловый эфир (TRITON(r) X-100), инкубируемые при 24°С в течение как минимум 4 ч. См., например, технический отчет ВОЗ, приложение 4 руководств по инактивации вирусов и способам удаления, предназначенным для обеспечения вирусной безопасности продуктов плазмы крови человека, серия № 924, р. 151-224, (2004).
Инкубация смеси растворитель/детергент при температуре выше 20°С имеет несколько недостатков. Во-первых, инактивация при более высоких температурах является затратной по времени, так как для предварительного нагревания смеси до температур выше 20°С к суммарному времени обработки добавляется дополнительные от приблизительно двух до приблизительно шести часов. Во-вторых, инкубация при этой более высокой температуре в сочетании с перемешиванием, необходимым для облегчения равномерного нагревания, повышает образование агрегатов белка, приводящее к снижению выхода активного и/или полезного белка. Экспозиция с температурами выше 20°С повышает также чувствительность белка к деградации. В настоящем описании раскрыт новый способ S/D инактивации инфекционных патогенных вирусов в образце, который направлен на преодоление этих недостатков. В способе, раскрытом в настоящем описании, периоды времени инкубации составляют менее 2 ч, а температуры инкубации ниже 20°С. Снижение времени инкубации снижает суммарное время, необходимое для метода и/или получения белка с помощью рекомбинантного способа продукции или с помощью очистки биологической жидкости. Кроме того, снижение как времени, так и температуры, приводит в результате к улучшенным выходам белка путем снижения его чувствительности к агрегации и деградации.
Краткое изложение сущности изобретения
Таким образом, в аспектах настоящего описания раскрыты способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, причем способы включают стадии: а) получение жидкости, включающей белок, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более прибли
зительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляют при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где белок после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а). Жидкость может представлять собой клеточный лизат, суперна-тант клеток, элюат с предыдущей стадии очистки или биологическую жидкость. Белок может быть получен с помощью рекомбинантного способа продукции с использованием клеточной линии или с помощью очистки из биологической жидкости. Органический растворитель может представлять собой простой эфир, спирт или алкилфосфат, такой как диалкилфосфат или триалкилфосфат. Поверхностно-активное вещество может представлять собой ионное поверхностно-активное вещество, такое как анионное поверхностно-активное вещество или катионное поверхностно-активное вещество, цвиттерионное (амфо-терное) поверхностно-активное вещество или неионное поверхностно-активное вещество. Способ может дополнительно включать или не включать после стадии (с) стадию удаления из смеси растворителя, поверхностно-активного вещества и/или нежизнеспособного вируса.
В других аспектах настоящего описания раскрыт белок, по существу, свободный от вируса, имеющего липидную оболочку, полученный с помощью способа, включающего стадии: а) получение жидкости, включающей белок, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где белок после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
В еще одних аспектах настоящего описания раскрыты способы инактивации вируса, имеющего ли-пидную оболочку, причем способы включают стадии: а) получение жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липид-ную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
В еще одних аспектах настоящего описания раскрыт фактор VIII, по существу, свободный от вируса, имеющего липидную оболочку, полученный с помощью способа, включающего стадии: а) получение жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
Описание
В аспектах настоящего описания раскрыт, в частности, вирус, имеющий липидную оболочку. Целая вирусная частица, известная как вирион, состоит из нуклеиновой кислоты, либо ДНК, либо РНК, окруженной защитным белковым покрытием, называемым капсидом. Вирусы могут быть сгруппированы в вирусы, имеющие оболочку и не имеющие оболочку. При применении в настоящем описании термин "вирус, имеющий липидную оболочку", относится к любому вирусу, имеющему мембрану или оболочку, включающую липид, такому, например, как вирус, имеющий оболочку. Вирусы с оболочкой обладают своим капсидом, окруженным липопротеидной мембраной или оболочкой. Эта оболочка происходит из клетки-хозяина, когда вирус "отпочковывается" от ее поверхности, и состоит главным образом из липи-дов, не кодируемых вирусным геномом. Даже несмотря на то, что она несет молекулярные детерминанты для прикрепления, входит в клетки-мишени и существенна для инфекционности оболочечных вирусов, она не является объектом формирования устойчивости к лекарствам или антигенного сдвига. Оболочеч-ные вирусы имеют диапазон размеров от приблизительно 45-55 нм до приблизительно 120-200 нм. Вирусы, имеющие липидную оболочку, которые могут инфицировать клетки млекопитающих, включают ДНК-вирусы, подобные вирусу herpesviridae, вирусу poxviridae или вирусу hepadnaviridae; РНК-вирусы, подобные вирусу flaviviridae, вирусу togaviridae, вирусу coronaviridae, вирусу deltavirus, вирусу ortho-myxoviridae, вирусу paramyxoviridae, вирусу rhabdoviridae, вирусу bunyaviridae или вирусу filoviridae; и обратно транскрибирующие вирусы, подобные вирусу retroviridae или вирусу hepadnaviridae. Неограничивающие примеры вирусов, имеющих липидную оболочку, включают вирус иммунодефицита человека, вирус Синдбис, вирус простого герпеса, вирус ложного бешенства, вирус Сендай, вирус везикулярного стоматита, вирус лихорадки западного Нила, вирус вирусной диареи коров, коронавирус, вирус артрита лошадей, вирус тяжелого острого респираторного синдрома, вирус мышиного лейкоза Молони или вирус коровьей оспы.
Вирус, не имеющий оболочку, относится к вирусу, чей капсид не имеет липопротеидной мембраны или оболочки. У вируса, не имеющего оболочку, капсид опосредует прикрепление к клеткам-хозяевам и
проникновение в них. Капсиды обычно бывают либо спиралевидными, либо икосаэдральными. Размер вирусов, не имеющих оболочку, находится в диапазоне от приблизительно 18-26 нм до приблизительно 70-90 нм. Вирусы, не имеющие оболочку, которые могут инфицировать клетки млекопитающих, включают, например, вирус parvoviridae, вирус adenoviridae, вирус birnaviridae, вирус papillomaviridae, вирус polyomaviridae, вирус picornaviridae, вирус reoviridae и вирус calciviridae.
В аспектах настоящего описания раскрыта, в частности, жидкость, включающая белок, обладающий активностью. Жидкость может представлять собой любую жидкость, у которой есть вероятность загрязнения вирусом. Неограничивающие примеры жидкости включают, например, любую очищенную, частично очищенную или неочищенную жидкость или коллоид, включая, например, элюат с предшествующей стадии очистки; экстракт тканевой или клеточной культуры, такой как клеточный лизат, суперна-тант клеток, экстракты плаценты или асцитная жидкость; биологическую жидкость, такую как кровь, плазма, сыворотка, молоко, слюна, семенная жидкость; или любая другая жидкость, которая включает белок, обладающий активностью.
Белок, обладающий активностью, может являться любым представляющим интерес белком, в котором желательно устранение любой загрязняющей вирусной активности. Белок, раскрытый в настоящем описании, может представлять собой белок крови, такой как, например, белок свертывания крови, альбумин и/или иммуноглобулин. Неограничивающие примеры белка крови включают ADAMTS-13, а1-антиплазмин, а2-антиплазмин, антитромбин, антитромбин III, раковый прокоагулянт, эритропоэтин, фактор II, фактор V, фактор VI, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, фибронектин, фибриноген, кофактор II гепарина, высокомолекулярный кининоген, внутримышечный иммуноглобулин, внутривенный иммуноглобулин, плазминоген, ингибитор-1 активатора плазминогена, ингибитор-2 активатора плазминогена, прекалликреин, белок С, белок S, белок Z, ингибитор протеазы, относящейся к белку Z, тканевой фактор, тканевой активатор плазминогена, урокиназу или фактор фон Виллибранда.
Раскрытый в настоящем описании белок может быть выделен из организма, который природно экс-прессирует белок, из трансгенного организма, созданного в результате генетического конструирования для экспрессии белка, или из клеточной линии, продуцирующей белок рекомбинантным способом. Неограничивающие примеры организма включают птиц и млекопитающих, таких как, например, мыши, крысы, козы, овцы, лошади, ослы, коровы, приматы и люди. Неограничивающие примеры трансгенных организмов включают организмы, раскрытые в настоящем описании, которые созданы генетическим конструированием для экспрессии белка, представляющего интерес. Раскрытый в настоящем описании белок из организма или трансгенного организма может быть получен из биологической жидкости, экстракта ткани или органа или другого источника организма с использованием общепринятых методов, известных в данной области техники. Например, для получения белка крови цельную кровь из организма или трансгенного организма можно разделить в пробирке для отделения сыворотки. Крови дают свернуться и свернувшуюся кровь центрифугируют для осаждения разрушенных клеток. Полученный в результате образец сыворотки (т.е. супернатант) можно затем аликвотировать и/или хранить при -20°С до использования. Неограничивающие примеры конкретных протоколов сбора крови и получения сыворотки описаны, например, в Di Lorenzo and Strasinger, BLOOD COLLECTION IN HEALTHCARE (F.A. Davis Company, 2001); и Diana Garza & Kathleen Becan-McBride, PHLEBOTOMY HANDBOOK: BLOOD COLLECTION ESSENTIALS (Prentice Hall, 6th ed., 2002).
Альтернативно, для рекомбинантной экспрессии белка, раскрытого в настоящем описании, можно также использовать различные прокариотные и/или эукариотные экспрессионные системы. Экспресси-онные системы могут включать любые из различных свойств, включая без ограничения индуцибельную экспрессию, неиндуцибельную экспрессию, конститутивную экспрессию, тканеспецифическую экспрессию, специфическую для клетки экспрессию, опосредованную вирусом экспрессию, стабильно интегрированную экспрессию и временную экспрессию. В данной области техники известно, как создать и использовать такие экспрессионные системы.
Обычно полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес белок, клонируют в экспрессион-ный вектор. Прокариотные экспрессионные векторы обычно включают ориджин репликации, подходящий промотор и/или энхансерные элементы, а также сайты, необходимые для связывания рибосом, по-лиаденилирования, терминации транскрипции, а также 5'-примыкающие нетранскрибируемые последовательности и другие нетранскрибируемые генетические элементы. Примеры прокариотных векторов включают рЕТ и pRSET, использующих такие промоторы, как, например, промотор бактериофага Т7. Эукариотные экспрессионные векторы обычно включают ориджин репликации, подходящий промотор и/или энхансерные элементы, а также сайты, необходимые для связывания рибосом, полиаденилирова-ния, сплайсинга, терминации транскрипции, а также 5'-примыкающие нетранскрибируемые последовательности и другие нетранскрибируемые генетические элементы. Примеры дрожжевых векторов включают pAO, pMET, pPIC, pPICZ и pYES, использующие такие промоторы, как, например, АОХ1, AUG1, GAP и GALL. Примеры векторов насекомых включают рАс5, рВАС, pIB, pMIB, pMT, использующие такие промоторы, как, например, РН, p10, MT, Ас5, OplE2, gp64 и polh. Примеры векторов млекопитаю
щих включают pBPV, pCMV, pCMVTNT, pDNA, pDisplay, pMSG, pOG44, PQBI25, pRc/RSV, pSECTag, pSECTag2, pSG, pSV2cat, pSVK3, pSVL, pUCIG-MET, pVAX1, pWLneo и pXT1, использующие такие промоторы, как, например, промоторы р-казеина, р-лактглобулина, промоторы белка сыворотки молока, тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промотор вируса 40 обезьян (SV40), LTR ретровируса и метал-лотионеина-1 мыши. Маркеры селекции включают ампициллин, хлорамфениколтрансферазу, канамицин, неомицин и тетрациклин. Подходящие экспрессионные векторы известны в данной области техники и имеются в продаже.
Клетки, способные экспрессировать совместимый вектор, включают прокариотные клетки, эукари-отные клетки и клеточные линии, происходящие из прокариотных и эукариотных клеток. Неограничивающие примеры прокариотных штаммов включают штаммы, происходящие, например, от Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficle, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens и Salmonella typhimurium. Неограничивающие примеры штаммов дрожжей включают штаммы, происходящие, например, от Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia an-gusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica. Клетки растений и клеточные линии, происходящие от растений, включают клетки, например, от видов однодольных, таких как Zea mays, и от видов двудольных, таких как, например, Arabidopsis thaliana, Triticum aestivum, Lemna gib-ba и Lemna minor. Клетки насекомых и клеточные линии, происходящие от насекомых, включают клетки, например, от Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster и Manduca sexta. Неограничивающие примеры клеточных линий насекомых включают клеточные линии High-Five, Kc, линию 2 Schneider's Drosophila (S2), SF9 и SF21. Клетки млекопитающих и клеточные линии, происходящие от клеток млекопитающих, включают клетки, например, от мыши, крысы, хомячка, свиньи, коровы, лошади, примата и человека. Неограничивающие примеры клеточных линий млекопитающих включают клеточные линии 1А3, 3Т3, 6Е6, 10Т1/2, APRT, BALB/3T3, BE (2)-С, BHK, ВТ, С6, С127, СНО, СНР3, COS-1, COS-7, CPAE, ESK-4, FB2, GH1, GH3, HeLa, HEK-293, HepG2, HL-60, IMR-32, L2, LLC-PK1, L-M, MCF-7, NB4, NBL-6, NCTC, Neuro 2A, NIE-115, NG108-15, NIH3T3, PC12, PK15, SBAC, SH-SY5Y, SK-Hep, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-SH, ST, SW-13 и W-1. Клеточные линии могут быть получены от Американской коллекции типов культур, Европейской коллекции типов культур и/или Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур.
После первоначального выделения из организма, трансгенного организма или системы клеточной культуры белок, раскрытый в настоящем описании, может подвергаться процессу очистки белка. Обычно очистка белка включает получение белка в более концентрированной форме, стадии промежуточной очистки для удаления загрязнений, окончательную обработку для удаления дополнительных загрязнений и вариантов белка. См., например, Current Protocols in Protein Science, "Conventional chromatographic Separations," Ch. 8-9, (John Wiley & Sons Inc., Hoboken, N.J., 1995). Обычные методы получения включают аффинную хроматографию, гель-фильтрацию, преципитацию и/или хроматографию, исключающую по размеру. Методы, пригодные для промежуточных или конечных стадий очистки, включают катионооб-менную хроматографию, анионообменную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием и хроматографию на керамическом гидроксиапатите, ВЭЖХ с обратной фазой, гель-фильтрацию, преципитацию, диафильтрацию, аффинную хроматографию или хроматофокусирование.
Способ, раскрытый в настоящем описании, может быть осуществлен в любой момент в течение процесса очистки. В целом, необходимы более высокие количества реагентов и более длительное время инкубации, когда способ, раскрытый в настоящем описании, осуществляется в начале метода получения по сравнению с более поздними стадиями метода. Это происходит потому, что объемы способа являются более высокими, и продукт обычно менее очищен вначале, тогда как позже загрязнения снижаются, и продукт в большинстве случаев лучше определяется и характеризуется более высокой чистотой и активностью при сниженном объеме, или потому, что вирусная нагрузка снижена или уменьшена в результате предшествующих методов очистки.
В аспектах настоящего описания, в частности, предлагается смешивание жидкости, раскрытой в настоящем описании, с органическим растворителем и поверхностно-активным веществом с созданием в результате этого смеси. Смешивание жидкости с органическим растворителем и поверхностно-активным веществом может продолжаться в течение любого периода времени с той оговоркой, что используемое время смешивания приводит к смеси, которая, по существу, включает органический растворитель, поверхностно-активное вещество и жидкость. По существу, смешивание должно обеспечивать 1) стимуляцию органическим растворителем контакта между поверхностно-активным веществом и липопротеидной оболочкой, инкапсулирующей вирус, имеющий липидную оболочку, и 2) нарушение поверхностно-активным веществом взаимодействия между молекулами в липопротеидной мембране вируса, имеющего липидную оболочку. В аспектах этого варианта осуществления смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества происходит в течение периода времени, например, не более 1 мин, не более 5 мин или не более 10 мин. В других аспектах этого варианта осуществления смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества происходит в течение периода времени, например, от приблизительно 1 до приблизительно 5 мин, от приблизительно 2 до приблизительно 5 мин,
от приблизительно 3 до приблизительно 5 мин, от приблизительно 1 до приблизительно 10 мин, от приблизительно 2 до приблизительно 10 мин, от приблизительно 3 до приблизительно 10 мин, от приблизительно 4 до приблизительно 10 мин или от приблизительно 5 до приблизительно 10 мин. Как раскрыто в настоящем описании, смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества осуществляется при температуре не выше приблизительно 20°С.
С раскрытой в настоящем описании жидкостью может быть смешан либо единственный органический растворитель, либо множество органических растворителей. В аспекте этого варианта осуществления жидкость может быть смешана по меньшей мере с двумя, по меньшей мере с тремя, по меньшей мере с четырьмя, по меньшей мере с пятью органическими растворителями. Пригодные органические растворители создают среду, стимулирующую контакт между поверхностно-активным веществом и липо-протеидной оболочкой, инкапсулирующей вирус. По существу, любой органический растворитель, который стимулирует такой контакт, может быть использован в раскрытом в настоящем описании способе, включая без ограничения простой эфир, спирт, алкилфосфат, такой как диалкилфосфат или триалкил-фосфат, или любое их сочетание.
Простые эфиры, пригодные для раскрытого в настоящем описании способа, включают эфиры, имеющие формулу R1-O-R2, где R1 и R2 независимо представляют собой C1-C18 алкил или C1-C18 алкенил, которые могут содержать атом кислорода или серы, предпочтительно C1-C18 алкил или C1-C18 алкенил. Неограничивающие примеры простых эфиров включают диметиловый эфир, диэтиловый эфир, этилпро-пиловый эфир, метилбутиловый эфир, метилизопропиловый эфир и метилизобутиловый эфир. Спирты, пригодные для раскрытого в настоящем описании способа, включают спирты, имеющие C1-C8 алкильные группы или C1-C8 алкенильные группы. Неограничивающие примеры спиртов включают метанол, этанол, пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, н-пентанол и изопентанолы. Алкилфосфаты, пригодные для раскрытого в настоящем описании способа, включают алкилфосфаты, имеющие C1-C18 алкильные группы или C1-C18 алкенильные группы, каждая из которых может содержать атом кислорода или серы.
Неограничивающие примеры алкилфосфатов включают диалкилфосфаты, такие как ди-(н-бутил)фосфат, ди-(трет-бутил)фосфат, ди-(н-гексил)фосфат, ди-(2-этилгексил)фосфат, ди-(н-децил)фос-фат или этил-ди-(н-бутил)фосфат; и триалкилфосфаты, такие как три-(н-бутил)фосфат, три-(трет-бутил)фосфат, три-(н-гексил)фосфат, три-(2-этилгексил)фосфат или три-(н-децил)фосфат. Другие неограничивающие примеры органического растворителя, пригодного для раскрытых в настоящем описании способов, могут быть найдены, например, в Winslow, et al., Methods and Compositions for Simultaneously Isolating Hemoglobin from Red Blood Cells and Inactivating Viruses, в патенте США 2008/0138790, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Может быть использована любая концентрация органического растворителя с той оговоркой, что используемая концентрация достаточна для стимуляции агрегации поверхностно-активного вещества с липопротеидной мембраной вируса, имеющего липидную оболочку. В аспектах этого варианта осуществления поверхностно-активное вещество используется в конечной концентрации, например, приблизительно 0,01% (об./об.), приблизительно 0,05% (об./об.), приблизительно 0,075% (об./об.), приблизительно 0,1% (об./об.), приблизительно 0,2% (об./об.), приблизительно 0,3% (об./об.), приблизительно 0,4% (об./об.), приблизительно 0,5% (об./об.), приблизительно 0,6% (об./об.), приблизительно 0,7% (об./об.), приблизительно 0,8% (об./об.), приблизительно 0,9% (об./об.) или приблизительно 1,0% (об./об.). В других аспектах этого варианта осуществления поверхностно-активное вещество используется в конечной концентрации, например, по меньшей мере 0,01% (об./об.), по меньшей мере 0,05% (об./об.), по меньшей мере 0,075% (об./об.), по меньшей мере 0,1% (об./об.), по меньшей мере 0,25% (об./об.), по меньшей мере 0,5% (об./об.), по меньшей мере 0,75% (об./об.) или по меньшей мере 1,0% (об./об.) . В еще одних аспектах этого варианта осуществления поверхностно-активное вещество используется в конечной концентрации, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5% (об./об.), от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,75% (об./об.), от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,5% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,75% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,0% (об./об.), от приблизительно 0,5 до приблизительно 0,75% (об./об.) или от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0% (об./об.).
Поверхностно-активные вещества являются компонентами, которые снижают поверхностное натяжение жидкости, индуцируя ее более легкое распределение и снижая пограничное натяжение между двумя жидкостями или между жидкостью и твердым веществом. Либо единственное поверхностно-активное вещество может быть смешано с жидкостью, раскрытой в настоящем описании, либо множество поверхностно-активных веществ может быть смешано с жидкостью, раскрытой в настоящем описании. В аспекте этого варианта осуществления жидкость может быть смешана по меньшей мере с одним, по меньшей мере с двумя, по меньшей мере с тремя, по меньшей мере с четырьмя или по меньшей мере с пятью поверхностно-активными веществами. Пригодные поверхностно-активные вещества разрушают взаимодействия между молекулами в липопротеидной мембране вируса, имеющего липидную оболочку. В сущности, любое поверхностно-активное вещество, которое облегчает такое разрушение, может быть использовано в раскрытом в настоящем описании способе, включая без ограничения ионные поверхно
стно-активные вещества, цвиттерионные (амфотерные) поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества или любое их сочетание.
Ионные поверхностно-активные вещества включают анионные поверхностно-активные вещества на основе постоянных (сульфат, сульфонат, фосфат) или рН-зависимых (карбоксилат) анионов. Анионные поверхностно-активные вещества включают без ограничения алкилсульфаты, такие как лаурилсульфат аммония и лаурилсульфат натрия (SDS); алкиловые эфиры сульфатов, такие как этерифицированный лаурилсульфат натрия и этерифицированный миристилсульфат натрия; докузат, такой как диоктилсуль-фосукцинат натрия; фторированные поверхностно-активные вещества на основе сульфоната, такие как перфтороктансульфонат (PFOS) и перфторбутансульфонат; алкилбензоловые сульфонаты; алкиларило-вые эфиры фосфатов; алкиловые эфиры фосфатов; алкилкарбоксилаты, такие как соли жирных кислот и стеарат натрия; лауроилсаркозинат натрия; и фторированные поверхностно-активные вещества на основе карбоксилата, такие как перфторнонаноат и перфтороктаноат.
Ионные поверхностно-активные вещества включают также катионные поверхностно-активные вещества на основе постоянных или рН-зависимых катионов. Катионные поверхностно-активные вещества включают без ограничения алкилтриметиламмонийные соли, такие как бромид цетилтриметиламмония (СТАВ) и хлорид цетилтриметиламмония (СТАС); хлорид цетилпиридиния (СРС); полиэтоксилирован-ный амин твердого жира (РОЕА); хлорид бензалкония (ВАС); хлорид бензетония (BZT); 5-бром-5-нитро-1,3-диоксан; хлорид диметилдиоктадециламмония; бромид диоктадецилдиметиламмония (DODAB), а также рН-зависимые первичные, вторичные или третичные амины, такие как поверхностно-активные вещества, где первичные амины становятся положительно заряженными при рН <10, или вторичные амины становятся положительно заряженными при рН <4, такие как октенидиндигидро хлорид.
Цвиттерионные поверхностно-активные вещества основаны на первичных, вторичных или третичных аминах или четвертичном катионе аммония с сульфонатом, карбоксилатом или фосфатом. Цвитте-рионные поверхностно-активные вещества включают без ограничения 3-[(3-холамидопропил)диме-тиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS); султейны, такие как кокамидопропилгидроксисултейн; бетаины, такие как кокамидопропилбетаин; или лецитины.
Неионные поверхностно-активные вещества являются менее денатурирующими и, по существу, пригодны для солюбилизации мембранных белков и липидов при сохранении белок-белковых взаимодействий. Неограничивающие примеры поверхностно-активных веществ включают сложные алкиловые эфиры полиоксиэтиленгликоля-сорбитана, такие как полисорбат 20 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 20), полисорбат 40 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 40), полисорбат 60 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 60), полисорбат 61 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 61), полисорбат 65 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 65), полисорбат 80 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 80) и полисорбат 81 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 81); полоксамеры (сополимеры полиэтилена-полипропилена), такие как Poloxamer 124 (PLURONIC(r) L44), Poloxamer 181 (PLURONIC(r) L61), Poloxamer 182 (PLURONIC(r) L62), Poloxamer 184 (PLURONIC(r) L64), Poloxamer 188 (PLURONIC(r) F68), Poloxamer 237 (PLURONIC(r) F87), Poloxamer 338 (PLURONIC(r) L108), Poloxamer 407 (PLURONIC(r) F127); алкилфеноловые эфиры полигликоля; алкилариловые эфиры полиэтиленгликоля; алкиловые эфиры полиоксиэтиленгликоля, такие как монододециловый эфир окта-этиленгликоля, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, BRIJ(r) 30 и BRIJ(r) 35; 2-додекоксиэтанол (LUBROL(r)-PX) ; октилфеноловые эфиры полиоксиэтиленгликоля, такие как полиоксиэтилен(4-5)п-трет-октилфенол (TRITON(r) X-45) и октилфеноловый эфир полиоксиэтилена (TRITON(r) X-100); алкилфено-ловые эфиры полиоксиэтиленгликоля, такие как Nonoxynol-9; феноксиполиэтоксилэтанолы, такие как нонилфеноксиполиэтоксилэтанол и октилфеноксиполиэтоксилэтанол; алкиловые эфиры глюкозида, такие как октилглюкопиранозид; алкиловые эфиры мальтозида, такие как додецилмальтопиранозид; алки-ловые эфиры тиоглюкозида, такие как гептилтиоглюкопиранозид; дигитонины; алкиловые эфиры глицерина, такие как глицериллаурат; сульфаты алкилариловых полиэфиров; сульфонаты спиртов; алкиловые эфиры сорбитана; кокамид этаноламинов, такой как кокамид моноэтаноламина и кокамид диэтанолами-на; монолаурат сахарозы; оксид додецилдиметиламина и хлорат натрия. Другие неограничивающие примеры поверхностно-активных веществ, пригодных для способов, раскрытых в настоящем описании, могут быть найдены, например, в Winslow, et al., Methods and Compositions for Simultaneously Isolating Hemoglobin from Red Blood Cells and Inactivating Viruses, патенте США 2008/0138790; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); и Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003), все они включены, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Может быть использована любая концентрация поверхностно-активного вещества с той оговоркой, что используемая концентрация достаточна для нарушения взаимодействий между молекулами в липо-протеидной мембране вируса, имеющего липидную оболочку, что вызывает инактивацию вируса. В аспектах этого варианта осуществления поверхностно-активное вещество используется в концентрации,
например, приблизительно 0,01% (об./об.), приблизительно 0,05% (об./об.), приблизительно 0,075% (об./об.), приблизительно 0,1% (об./об.), приблизительно 0,2% (об./об.), приблизительно 0,3% (об./об.), приблизительно 0,4% (об./об.), приблизительно 0,5% (об./об.), приблизительно 0,6% (об./об.), приблизительно 0,7% (об./об.), приблизительно 0,8% (об./об.), приблизительно 0,9% (об./об.), приблизительно 1,0% (об./об.), приблизительно 2,0% (об./об.), приблизительно 3,0% (об./об.), приблизительно 4,0% (об./об.), приблизительно 5,0% (об./об.), приблизительно 6,0% (об./об.), приблизительно 7,0% (об./об.), приблизительно 8,0% (об./об.), приблизительно 9,0% (об./об.) или приблизительно 10,0% (об./об.). В других аспектах этого варианта осуществления поверхностно-активное вещество используется в концентрации, например, по меньшей мере 0,01% (об./об.), по меньшей мере 0,05% (об./об.), по меньшей мере 0,075% (об./об.), по меньшей мере 0,1% (об./об.), по меньшей мере 0,25% (об./об.), по меньшей мере 0,5% (об./об.), по меньшей мере 0,75% (об./об.), по меньшей мере 1,0% (об./об.), по меньшей мере 2,5% (об./об.), по меньшей мере 5,0% (об./об.), по меньшей мере 7,5% (об./об.) или по меньшей мере 10,0% (об./об.). В еще одних аспектах этого варианта осуществления поверхностно-активное вещество используется в концентрации, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5% (об./об.), от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,5% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,0% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 2,0% (об./об.), от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0% (об./об.) или от приблизительно 1,0 до приблизительно 10,0% (об./об.).
Жидкость, раскрытая в настоящем описании, может быть смешана с единственным органическим растворителем и множеством поверхностно-активных веществ, с множеством органических растворителей и единственным поверхностно-активным веществом или с множеством органических растворителей и множеством поверхностно-активных веществ. Обычно конечные концентрации органического растворителя и единственного поверхностно-активного вещества в жидкости составляют от приблизительно 0,1 до приблизительно 5% (об./об.) органического растворителя и от приблизительно 0,1 до приблизительно 10% (об./об.) поверхностно-активного вещества. Когда множество поверхностно-активных веществ смешивают с жидкостью, конечная концентрация органического растворителя составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5% (об./об.), конечная концентрация одного поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10% (об./об.), от приблизительно 0,5 до приблизительно 5% (об./об.) или от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0% (об./об.), а конечная концентрация оставшихся поверхностно-активных веществ составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5% (об./об.), от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0% (об./об.) или от приблизительно 0,2 до приблизительно 4% (об./об.).
В аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом и полиок-сиэтиленоктилфениловым эфиром (TRITON(r) X-100), так что конечная концентрация составляет, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1% (об./об.) три(н-бутил)фосфата и от приблизительно 1,0 до приблизительно 10,0% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100). В другом аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом и полисорбатом 80 сорбитана моноолеатом (TWEEN(r) 80), так что конечная концентрация составляет, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1% (об./об.) три(н-бутил)фосфата и от приблизительно 1,0 до приблизительно 10,0% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80).
В другом аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом, по-лиоксиэтиленоктилфениловым эфиром (TRITON(r) X-100) и полисорбатом 80 сорбитана моноолеатом (TWEEN(r) 80), так что конечная концентрация составляет, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.) три(н-бутил)фосфата, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10,0% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80). В еще одном аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом, полиоксиэтиленоктилфениловым эфиром (TRITON(r) X-100) и полисорбатом 80 сорбитана моноолеатом (TWEEN(r) 80), так что конечная концентрация составляет, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,7% (об./об.) три(н-бутил)фосфата, от приблизительно 0,6 до приблизительно 1,4% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилово-го эфира (TRITON(r) X-100) и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,7% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80). В еще одном аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом, полиоксиэтиленоктилфениловым эфиром (TRITON(r) X-100) и по-лисорбатом 80 сорбитана моноолеатом (TWEEN(r) 80), так что конечная концентрация составляет, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.) три(н-бутил)фосфата, от приблизительно 0,7 до приблизительно 1,3% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r)
80).
В другом аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом, по-лиоксиэтиленоктилфениловым эфиром (TRITON(r) X-100) и полисорбатом 80 сорбитана моноолеатом (TWEEN(r) 80), так что конечная концентрация составляет, например, от приблизительно 0,2 до прибли
зительно 0,5% (об./об.) три(н-бутил)фосфата, от приблизительно 0,7 до приблизительно 1,3% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,5% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80). В еще одном аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом, полиоксиэтиленоктилфениловым эфиром (TRITON(r) X-100) и полисорбатом 80 сорбитана моноолеатом (TWEEN(r) 80), так что конечная концентрация составляет, например, от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,4% (об./об.) три(н-бутил)фосфата, от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,2% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилово-го эфира (TRITON(r) X-100) и от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,4% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80). В еще одном аспекте этого варианта осуществления жидкость смешивают с три(н-бутил)фосфатом, полиоксиэтиленоктилфениловым эфиром (TRITON(r) X-100) и по-лисорбатом 80 сорбитана моноолеатом (TWEEN(r) 80), так что конечная концентрация составляет, например, приблизительно 0,3% (об./об.) три(н-бутил)фосфата, приблизительно 1,0% (об./об.) полиокси-этиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и приблизительно 0,3% (об./об.) полисорбата 80 сор-битана моноолеата (TWEEN(r) 80).
После смешивания жидкости с органическим растворителем и поверхностно-активным веществом полученную смесь инкубируют в течение конкретного периода времени при конкретной температуре. Может быть использовано любое время инкубации с той оговоркой, что используемое время приводит к тому, что смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липид-ную оболочку. В аспектах этого варианта осуществления жидкость инкубируют в течение периода времени, например, приблизительно 10 мин, приблизительно 20 мин, приблизительно 30 мин, приблизительно 40 мин, приблизительно 50 мин, приблизительно 60 мин, приблизительно 70 мин, приблизительно 80 мин, приблизительно 90 мин, приблизительно 100 мин, приблизительно 110 мин или приблизительно 120 мин. В других аспектах этого варианта осуществления жидкость инкубируют в течение периода времени, например, не более приблизительно 10 мин, не более приблизительно 20 мин, не более приблизительно 30 мин, не более приблизительно 40 мин, не более приблизительно 50 мин, не более приблизительно 60 мин, не более приблизительно 70 мин, не более приблизительно 80 мин, не более приблизительно 90 мин, не более приблизительно 100 мин, не более приблизительно 110 мин или не более приблизительно 120 мин. В еще одних аспектах этого варианта осуществления жидкость инкубируют в течение периода времени, например, от приблизительно 10 до приблизительно 60 мин, от приблизительно 10 до приблизительно 90 мин, от приблизительно 10 до приблизительно 120 мин, от приблизительно 30 до приблизительно 60 мин, от приблизительно 30 до приблизительно 90 мин, от приблизительно 30 до приблизительно 120 мин, от приблизительно 60 до приблизительно 90 мин, от приблизительно 60 до приблизительно 120 мин или от приблизительно 90 до приблизительно 120 мин.
В частности, предлагаются аспекты настоящего описания, где жидкость смешивают с органическим растворителем и поверхностно-активным веществом при температуре не выше приблизительно 20°С, и где смесь инкубируют при температуре не выше приблизительно 20°С. Может быть использована любая температура инкубации с той оговоркой, что используемая температура представляет собой температуру не выше приблизительно 20°С, и она приводит к смеси после инкубации, которая, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, а активный белок открывается после инкубации. Хотя обычно инкубация проводится при той же температуре, жидкость может быть смешана с органическим растворителем и поверхностно-активным веществом при одной температуре, а смесь инкубироваться при другой температуре.
В аспектах этого варианта осуществления жидкость смешивают и смесь инкубируют при температуре, например, приблизительно 2°С, приблизительно 4°С, приблизительно 6°С, приблизительно 8°С, приблизительно 10°С, приблизительно 12°С, приблизительно 14°С, приблизительно 16°С, приблизительно 18°С или приблизительно 20°С. В других аспектах этого варианта осуществления жидкость смешивают и инкубируют при температуре, например, не более 2°С, не более 4°С, не более 6°С, не более 8°С, не более 10°С, не более 12°С, не более 14°С, не более 16°С, не более 18°С или не более 20°С. В еще одних аспектах этого варианта осуществления жидкость смешивают и смесь инкубируют при температуре, например, от приблизительно 0 до приблизительно 2°С, от приблизительно 0 до приблизительно 4°С, от приблизительно 0 до приблизительно 6°С, от приблизительно 0 до приблизительно 8°С, от приблизительно 0 до приблизительно 10°С, от приблизительно 0 до приблизительно 12°С, от приблизительно 0 до приблизительно 14°С, от приблизительно 0 до приблизительно 16°С, от приблизительно 0 до приблизительно 18°С, от приблизительно 0 до приблизительно 20°С, от приблизительно 2 до приблизительно 4°С, от приблизительно 2 до приблизительно 6°С, от приблизительно 2 до приблизительно 8°С, от приблизительно 2 до приблизительно 10°С, от приблизительно 2 до приблизительно 12°С, от приблизительно 2 до приблизительно 14°С, от приблизительно 2 до приблизительно 16°С, от приблизительно 2 до приблизительно 18°С, от приблизительно 2 до приблизительно 20°С, от приблизительно 4 до приблизительно 6°С, от приблизительно 4 до приблизительно 8°С, от приблизительно 4 до приблизительно 10°С, от приблизительно 4 до приблизительно 12°С, от приблизительно 4 до приблизительно 14°С, от приблизительно 4 до приблизительно 16°С, от приблизительно 4 до приблизительно 18°С или от приблизительно 4 до при
близительно 20°С.
В одном варианте осуществления смесь, раскрытую в настоящем описании, можно инкубировать в течение любого промежутка времени и при любой температуре не выше приблизительно 20°С, с той оговоркой, что используемые время инкубации и температура приводят к смеси после инкубации, которая, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, и включает белок, обладающий активностью. В аспектах этого варианта осуществления смесь инкубируют не более 120 мин при температуре не выше приблизительно 20°С, как, например, не более 90 мин при температуре не выше приблизительно 20°С, не более 60 мин при температуре не выше приблизительно 20°С, не более 30 мин при температуре не выше приблизительно 20°С. В других аспектах этого варианта осуществления смесь инкубируют не более 120 мин при температуре не выше приблизительно 16°С, не более 120 мин при температуре не выше приблизительно 12°С или не более 120 мин при температуре не выше приблизительно 8°С. В других аспектах этого варианта осуществления смесь инкубируют от приблизительно 10 до приблизительно 120 мин при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 20°С, от приблизительно 30 до приблизительно 120 мин при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 16°С, от приблизительно 30 до приблизительно 120 мин при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 12°С или от приблизительно 30 до приблизительно 120 мин при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С. В еще одних аспектах этого варианта осуществления смесь инкубируют от приблизительно 45 до приблизительно 75 мин при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С, приблизительно 60 мин при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С, от приблизительно 45 до приблизительно 75 мин при температуре приблизительно 4°С или приблизительно 60 мин при температуре приблизительно 4°С.
В аспектах настоящего описания, в частности, предлагается смесь после инкубации, которая, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку. При применении в настоящем описании термин "по существу свободна от вируса, имеющего липидную оболочку", обозначает, что только следовые количества жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, могут быть определены или подтверждены с помощью прибора или метода, используемого для определения или подтверждения присутствия или активности жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, и что такое следовое количество жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, не достаточно для вредного влияния на здоровье человека. В аспекте этого варианта осуществления смесь после инкубации полностью свободна от вируса, имеющего липидную оболочку. При применении в настоящем описании термин "полностью свободна от вируса, имеющего липидную оболочку", обозначает, что присутствие жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, не может быть определено или подтверждено в пределах диапазона измерения прибором или методом, используемым для определения или подтверждения присутствия или активности жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку. Белок, содержащийся в жидкости, которая по существу свободна или полностью свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, может быть использован для создания фармацевтической композиции, которая является безопасной при введении человеку, потому что вируса не достаточно для вредного влияния на здоровье человека. В другом аспекте этого варианта осуществления смесь после инкубации включает менее 1х 101 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку. Ко-лониеобразующая единица (КОЕ) является мерой количества вирусных частиц, способных образовывать колонии на единицу объема. Она является функциональной мерой измерения, а не мерой измерения абсолютного количества частиц, так как вирусные частицы, которые неактивны, дефектны или другим образом не способны инфицировать свою клетку-мишень, не будут образовывать колонии и в результате этого не будут подсчитаны. В других аспектах этого варианта осуществления смесь после инкубации включает, например, менее 1х100 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, менее 1х10-1 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, менее 1х10-2 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, или менее 1х10-3 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.
В еще одном аспекте этого варианта осуществления смесь после инкубации включает менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, присутствовавшего перед инкубацией. ID50 представляет собой количество вируса, которое будет инфицировать 50% популяции клеток-мишеней. Это функциональная единица измерения, потому что вирусные частицы, которые неактивны, или по-другому дефектны, не будут инфицировать свою клетку-мишень и в результате этого не будут подсчитаны. В других аспектах этого варианта осуществления смесь после инкубации включает, например, по меньшей мере в 10 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 100 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 200 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 300 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 400 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 500 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 600 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 700 раз менее ID50 жизнеспособ
ного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 800 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 900 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, по меньшей мере в 1000 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, присутствовавшего перед инкубацией.
При применении в настоящем описании термин "инактивированный вирус" или "инактивация вируса" относится к процессу, при котором вирус больше не может инфицировать клетки, реплицироваться и размножаться, и к удалению вируса per se. По существу, термин "инактивация вируса" относится в целом к способу создания жидкости, раскрытой в настоящем описании, полностью свободной от загрязнений инфицирующим вирусом.
Желательна любая степень инактивации вируса с использованием способов, раскрытых в настоящем описании. Однако желательно достичь степени инактивации вируса, необходимой для соответствия строгим руководствам по безопасности для лекарственных препаратов. Эти руководства установлены ВОЗ и хорошо известны специалистам в данной области техники.
Определение жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, может быть осуществлено с помощью любого метода, при котором можно количественно или качественно измерить присутствие или активность жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку. Для определения уровней титра вируса обычно используется метод на основе клеточной культуры, но могут также применяться методы оценки инфективности in vivo. Может быть выполнено определение амплификации вируса, например, с помощью микроскопического исследования (в случае ясно видимого цитопатогенного эффекта), метода определения на основе ПЦР или метода определения на основе антител. Одним неограничивающим примером является метод определения инфективности in vitro, называемый методом определения 50% инфицирующей дозы в тканевой культуре (TCID50). В этом методе образцы жидкости и их серийные разведения разносят в 96-луночные планшеты с высеянными клетками, которые могут служить хозяевами для вируса, имеющего липидную оболочку, подлежащего определению. После инокуляции планшеты инкубируют в течение периода времени и при температуре, достаточных для возможности репликации вируса в клетках-хозяевах. После инкубации клетки анализируют под микроскопом на признаки инфицирования, такие как, например, лизированные клетки, клетки, проявляющие цитопатогенный эффект, или любые другие критерии, указывающие на инфицирование вирусом. Титр вируса рассчитывают исходя из паттерна позитивных (инфицированных вирусом) и негативных (неинфицированных вирусом) лунок. Отсутствие каких-либо лунок, демонстрирующих позитивные признаки инфицирования, является указанием на то, что жидкость является, по существу, свободной от вируса, имеющего липидную оболочку.
Другим методом на основе клеточной культуры является метод образования колоний, в котором индуцируемые вирусом эффекты в слое клеточной культуры являются видимыми или делаются видимыми макроскопически в виде колоний. Отсутствие каких-либо колоний является показателем того, что жидкость, по существу, свободна от вируса, имеющего липидную оболочку.
В настоящем описании, в частности, предлагается смесь после инкубации, в которой активность белка составляет по меньшей мере 25% от активности белка, имеющейся перед инкубацией с органическим растворителем и поверхностно-активным веществом, как раскрыто в настоящем описании. В аспектах этого варианта осуществления предлагается смесь после инкубации, в которой активность белка составляет, например, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 100% от активности белка, имеющейся перед инкубацией. В других аспектах этого варианта осуществления предлагается смесь после инкубации, в которой активность белка составляет, например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от активности белка, имеющейся перед инкубацией. В еще одних аспектах этого варианта осуществления предлагается смесь после инкубации, в которой активность белка составляет, например, от приблизительно 25 до приблизительно 100%, от приблизительно 30 до приблизительно 100%, от приблизительно 40 до приблизительно 100%, от приблизительно 50 до приблизительно 100%, от приблизительно 60 до приблизительно 100%, от приблизительно 70 до приблизительно 100%, от приблизительно 75 до приблизительно 100%, от приблизительно 80 до приблизительно 100%, от приблизительно 85 до приблизительно 100%, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, от приблизительно 25 до приблизительно 95%, от приблизительно 30 до приблизительно 95%, от приблизительно 40 до приблизительно 95%, от приблизительно 50 до приблизительно 95%, от приблизительно 60 до приблизительно 95%, от приблизительно 70 до приблизительно 95%, от приблизительно 75 до приблизительно 95%, от приблизительно 80 до приблизительно 95%, от приблизительно 85 до приблизительно 95%, от приблизительно 90 до приблизительно 95%, от приблизительно 25 до приблизительно 90%, от приблизительно 30 до приблизительно 90%, от приблизительно 40 до приблизительно 90%, от приблизительно 50 до приблизительно 90%, от приблизительно 60 до приблизительно 90%, от приблизительно 70 до приблизительно 90%, от приблизительно 75 до приблизительно 90%, от приблизительно 80 до приблизительно 90% или от приблизительно 85 до приблизительно 90% от активности белка, имеющейся
перед инкубацией.
В настоящем описании, в частности, предлагается присутствующий в смеси после инкубации белок с активностью, составляющей, например, по меньшей мере 25% от активности белка, имеющейся перед инкубацией с органическим растворителем и поверхностно-активным веществом, как раскрыто в настоящем описании. В аспектах этого варианта осуществления активность белка, присутствующего в смеси после инкубации, составляет, например, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90% или приблизительно 100% от активности белка, имеющейся перед инкубацией. В других аспектах этого варианта осуществления активность белка, присутствующего в смеси после инкубации, составляет, например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от активности белка, имеющейся перед инкубацией. В еще одних аспектах этого варианта осуществления активность белка, присутствующего в смеси после инкубации, составляет, например, от приблизительно 25 до приблизительно 100%, от приблизительно 30 до приблизительно 100%, от приблизительно 40 до приблизительно 100%, от приблизительно 50 до приблизительно 100%, от приблизительно 60 до приблизительно 100%, от приблизительно 70 до приблизительно 100%, от приблизительно 75 до приблизительно 100%, от приблизительно 80 до приблизительно 100%, от приблизительно 85 до приблизительно 100%, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, от приблизительно 25 до приблизительно 95%, от приблизительно 30 до приблизительно 95%, от приблизительно 40 до приблизительно 95%, от приблизительно 50 до приблизительно 95%, от приблизительно 60 до приблизительно 95%, от приблизительно 70 до приблизительно 95%, от приблизительно 75 до приблизительно 95%, от приблизительно 80 до приблизительно 95%, от приблизительно 85 до приблизительно 95%, от приблизительно 90 до приблизительно 95%, от приблизительно 25 до приблизительно 90%, от приблизительно 30 до приблизительно 90%, от приблизительно 40 до приблизительно 90%, от приблизительно 50 до приблизительно 90%, от приблизительно 60 до приблизительно 90%, от приблизительно 70 до приблизительно 90%, от приблизительно 75 до приблизительно 90%, от приблизительно 80 до приблизительно 90% или от приблизительно 85 до приблизительно 90% от активности белка, имеющейся перед инкубацией.
Определение активности белка может быть осуществлено любым методом, с помощью которого может быть количественно или качественно измерена характеристика, демонстрирующая активность, связанную с отслеживаемым белком, включая без ограничения неспецифическое определение белка, такое как, например, поглощение в УФ-свете или метод на основе химических реакций, такой как метод Бредфорда; или специфическое определение белка, такое как, например, метод in vitro, клеточный метод или метод in vivo. Фактический метод, используемый для определения активности белка, как раскрыто в настоящем описании, может быть определен специалистом в данной области техники, принимая во внимание факторы, включая без ограничения белок, подвергаемый анализу, количество белка, присутствующее в смеси после инкубации, определяемую характеристику и предпочтение специалиста в данной области техники.
Например, метод с использованием хромогена, основанный на каскаде свертывания крови, может быть использован для определения активности фактора VIII. В этом методе активированный тромбином фактор VIII образует комплекс с фактором IXa, и этот комплекс затем активирует фактор X. Активность активированного фактора X может быть определена с помощью гидролиза хромогенного субстрата, при котором высвобождается хромогенная группа, такая как п-нитроанилин (pNA). Первоначальная скорость высвобождения pNA при измерении по изменению поглощения в минуту при 405 нм в dOD пропорциональна активности фактора Ха и впоследствии активности фактора VIII в образце. В результате использования избытка фактора IXa и фактора X скорость активации фактора X пропорциональна исключительно количеству расщепляемого тромбином фактора VIII, присутствующего в образце.
Альтернативно, активность фактора IXa может быть определена путем изменения условий, так чтобы фактор VIII и фактор X находились в избытке, и, по существу, лимитирующим скорость являлся фактор IXa. Сходно, активность фактора X может быть определена путем изменения условий так, чтобы фактор VIII и фактор IXa находились в избытке, и, по существу, лимитирующим скорость являлся фактор X. Таким образом, активность фактора VIII, а также фактора IXa и фактора X может быть определена при применении метода с использованием хромогена, основанного на каскаде свертывания крови.
В качестве другого примера для определения активности фактора VIII может быть применен одностадийный метод по свертыванию, в котором используется активированное частичное тромбопластино-вое время (АРТТ). В этом методе образцы, включающие фактор VIII вместе с CaCl2, добавляют к плазме, дефицитной по фактору VIII, для того, чтобы стимулировать свертывание, и влияние этого образца на время свертывания АРТТ плазмы является мерой активности фактора VIII. Активность неизвестных образцов рассчитывают путем сопоставления выявляемой активности фактора VIII со стандартной кривой, полученной с помощью образцов с известной активностью фактора VIII. Этот метод по свертыванию крови может быть также использован для любого другого белка, вовлеченного в каскад свертывания крови, с помощью использования плазмы, дефицитной по белку, подвергаемому анализу.
В настоящем описании, в частности, предлагается смесь после инкубации, которая, по существу, свободна от агрегатов белка, обладающего активностью. При применении в настоящем описании термин "по существу свободна от агрегатов белка" обозначает, что только следовые количества агрегатов белка, обладающего активностью (представляющего интерес белка), могут быть определены или подтверждены с помощью прибора или метода, используемого для определения или подтверждения присутствия или активности агрегатов белка, и что такое следовое количество агрегатов белка не достаточно для вредного влияния на здоровье человека, такого как, например, индукция иммунного ответа у индивидуума. В аспекте этого варианта осуществления смесь после инкубации полностью свободна от агрегатов белка, обладающего активностью. При применении в настоящем описании термин "полностью свободна от агрегатов белка" обозначает, что присутствие агрегатов белка, обладающего активностью (представляющего интерес белка), не может быть определено или подтверждено в диапазоне определения прибора или метода, используемого для определения или подтверждения присутствия или активности агрегатов белка. Жидкость, которая, по существу, свободна или полностью свободна от агрегатов белка, обладающего активностью (представляющего интерес белка), может быть использована для создания фармацевтической композиции, которая безопасна для введения человеку, потому что агрегатов белка не достаточно для вредного влияния на здоровье человека.
В аспектах этого варианта осуществления смесь после инкубации имеет, например, менее приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно б%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2%, приблизительно 1%, приблизительно 0,9%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,1%, приблизительно 0,09%, приблизительно 0,08%, приблизительно 0,07%, приблизительно 0,06%, приблизительно 0,05%, приблизительно 0,04%, приблизительно 0,03%, приблизительно 0,02% или приблизительно 0,01% белка, обладающего активностью, в агрегированной форме. В других аспектах этого варианта осуществления смесь после инкубации имеет менее, например, от приблизительно 1 до приблизительно 0,1%, от приблизительно 0,9 до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,8 до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,7 до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,6 до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,5 до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,4 до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,01%, от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,01% или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,01% белка, обладающего активностью, в агрегированной форме.
Определение агрегатов белка может быть осуществлено любым методом, с помощью которого может быть количественно или качественно измерено присутствие или активность белковых агрегатов, связанных с отслеживаемым белком, представляющим интерес, включая без ограничения исключающую по размеру хроматографию в сочетании с раскрытым в настоящем описании неспецифическим и/или специфическим определением белка. Фактический метод, используемый для определения белковых агрегатов, как раскрыто в настоящем описании, может быть определен специалистом в данной области техники, принимая во внимание факторы, включая без ограничения, белок, подвергаемый анализу, количество белка, присутствующее в смеси после инкубации, определяемую характеристику и предпочтение специалиста в данной области техники.
Раскрытые в настоящем описании способы могут дополнительно включать стадию удаления из смеси после инкубации органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента, используемых в раскрытых в настоящем описании способах. После завершения раскрытого в настоящем описании способа органический растворитель, поверхностно-активное вещество и/или другой реагент или компонент могут быть удалены. Обычно применяемые методы удаления детергента включают экстракцию, фильтрацию, диафильтрацию, замену буфера, аффинную или ионообменную хроматографию, преципитацию или лиофилизацию. См., например, руководство Current Protocols in Protein Science, "Conventional Chromatographic Separations," Ch. 8-9, (John Wiley & Sons Inc., Hoboken, N.J.), включенное таким образом в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. После удаления оставшееся количество органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента представляет собой количество, которое, по существу, не оказывает длительного или постоянного вредного влияния при введении человеку.
В одном варианте осуществления смесь после удаления органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента, по существу, свободна от органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента. При применении в настоящем описании термин "по существу, свободна от органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента" обозначает, что только следовые количества органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента могут быть определены или подтверждены с помощью прибора или метода, используемого для определения или подтверждения присутствия или активности органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента, и что такое следовое количество органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента не ока
зывает длительного или постоянного вредного эффекта при введении человеку. В аспекте этого варианта осуществления смесь после удаления органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента полностью свободна от органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента. При применении в настоящем описании термин "полностью свободна от органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента" обозначает, что присутствие органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента не может быть определено или подтверждено в пределах диапазона определения прибора или метода, используемого для определения или подтверждения присутствия или активности органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента. Белок, содержащийся в смеси, которая, по существу, свободна или полностью свободна от органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента, может быть использован для создания фармацевтической композиции, которая безопасна для введения человеку, потому что количества органического растворителя, поверхностно-активного вещества и/или другого реагента или компонента не достаточно для вредного влияния на здоровье человека.
В аспектах этого варианта осуществления количество органического растворителя, остающееся в смеси, составляет, например, приблизительно 1 м.д., приблизительно 3 м.д., приблизительно 5 м.д., приблизительно 10 м.д., приблизительно 15 м.д., приблизительно 20 м.д., приблизительно 25 м.д., приблизительно 30 м.д. или приблизительно 35 м.д. В других аспектах этого варианта осуществления количество органического растворителя, остающееся в смеси, составляет, например, не более 1 м.д., не более 3 м.д., не более 5 м.д., не более 10 м.д., не более 15 м.д., не более 20 м.д., не более 25 м.д., не более 30 м.д. или не более 35 м.д. В еще одних аспектах этого варианта осуществления количество органического растворителя, остающееся в смеси, составляет, например, от приблизительно 1 до приблизительно 20 м.д., от приблизительно 1 до приблизительно 25 м.д., от приблизительно 1 до приблизительно 30 м.д., от приблизительно 1 до приблизительно 35 м.д., от приблизительно 3 до приблизительно 20 м.д., от приблизительно 3 до приблизительно 25 м.д., от приблизительно 3 до приблизительно 30 м.д. или от приблизительно 3 до приблизительно 35 м.д.
В аспектах этого варианта осуществления количество поверхностно-активного вещества, остающееся в смеси, составляет, например, приблизительно 1 м.д., приблизительно 3 м.д., приблизительно 5 м.д., приблизительно 10 м.д., приблизительно 15 м.д., приблизительно 20 м.д., приблизительно 25 м.д., приблизительно 30 м.д., приблизительно 35 м.д., приблизительно 40 м.д., приблизительно 45 м.д., приблизительно 50 м.д., приблизительно 55 м.д., приблизительно 60 м.д., приблизительно 65 м.д., приблизительно 70 м.д., приблизительно 75 м.д., приблизительно 80 м.д., приблизительно 85 м.д., приблизительно 90 м.д. или приблизительно 100 м.д. В других аспектах этого варианта осуществления количество поверхностно-активного вещества, остающееся в смеси, составляет, например, не более 1 м.д., не более 10 м.д., не более 20 м.д., не более 30 м.д., не более 40 м.д., не более 50 м.д., не более 60 м.д., не более 70 м.д., не более 80 м.д., не более 90 м.д. или не более 100 м.д. В еще одних аспектах этого варианта осуществления количество поверхностно-активного вещества, остающееся в смеси, составляет, например, от приблизительно 1 до приблизительно 25 м.д., от приблизительно 1 до приблизительно 50 м.д., от приблизительно 1 до приблизительно 75 м.д., от приблизительно 1 до приблизительно 100 м.д., от приблизительно 5 до приблизительно 25 м.д., от приблизительно 5 до приблизительно 50 м.д., от приблизительно 5 до приблизительно 75 м.д., от приблизительно 5 до приблизительно 100 м.д., от приблизительно 10 до приблизительно 25 м.д., от приблизительно 10 до приблизительно 50 м.д., от приблизительно 10 до приблизительно 75 м.д. или от приблизительно 10 до приблизительно 100 м.д.
В аспекте этого варианта осуществления количество органического растворителя, остающееся в смеси, составляет не более 35 м.д., а количество поверхностно-активного вещества, остающееся в смеси, составляет не более 100 м.д. В другом аспекте этого варианта осуществления количество органического растворителя, остающееся в смеси, составляет не более 3 м.д., а количество поверхностно-активного вещества, остающееся в смеси, составляет не более 10 м.д. В еще одном аспекте этого варианта осуществления количество органического растворителя, остающееся в смеси, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 35 м.д., а количество поверхностно-активного вещества, остающееся в смеси, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 100 м.д.
В другом аспекте этого варианта осуществления раскрытый в настоящем описании способ не включает стадию удаления органического растворителя из смеси после инкубации. В еще одном аспекте этого варианта осуществления раскрытый в настоящем описании способ не включает стадию удаления поверхностно-активного вещества из смеси после инкубации.
Раскрытые в настоящем описании способы могут дополнительно включать стадию удаления вируса из смеси после инкубации. При применении в настоящем описании термин "удаление вируса" или "удаление вирусов" относится к методу, с помощью которого вирус удаляется из раскрытой в настоящем описании смеси, так что вирусные частицы эффективно экстрагируются из смеси. Вирус может представлять собой жизнеспособный вирус или инактивированный вирус. Удаление обычно осуществляется с помощью хроматографии, исключающей по размеру, или адсорбционной хроматографии с положитель
ным зарядом, когда представляющий интерес белок связывается с хроматографической смолой. После удаления оставшееся количество вируса представляет собой количество, которое, по существу, не оказывает длительного или постоянного вредного эффекта при введении человеку.
В одном варианте осуществления смесь после удаления вируса, по существу, свободна от вируса. При применении в настоящем описании термин "по существу свободна от вируса" обозначает, что только следовые количества вируса могут быть определены или подтверждены с помощью прибора или метода, используемого для определения или подтверждения присутствия или активности вируса, и что такое следовое количество вируса не достаточно для вредного влияния на здоровье человека. В аспекте этого варианта осуществления смесь после удаления вируса полностью свободна от вируса. При применении в настоящем описании термин "полностью свободна от вируса" обозначает, что присутствие вируса не может быть определено или подтверждено в пределах диапазона определения с помощью прибора или метода, используемого для определения или подтверждения присутствия или активности вируса. Белок, содержащийся в смеси, которая, по существу, свободна или полностью свободна от вируса, может быть использован для создания фармацевтической композиции, которая является безопасной при введении человеку, потому что вируса не достаточно для вредного влияния на здоровье человека.
В других аспектах этого варианта осуществления смесь после удаления вируса включает менее 1х101 КОЕ/мл вируса, например менее 1х100 КОЕ/мл вируса, менее 1х10-1 КОЕ/мл вируса, менее 1 х 10-2 КОЕ/мл вируса или менее 1х10-3 КОЕ/мл вируса.
В еще одних аспектах этого варианта осуществления смесь после удаления вируса включает менее ID50 вируса, например по меньшей мере в 10 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 100 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 200 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 300 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 400 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 500 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 600 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 700 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 800 раз менее ID50 вируса, по меньшей мере в 900 раз менее ID50 вируса или по меньшей мере в 1000 раз менее ID50 вируса.
В другом аспекте этого варианта осуществления способ, раскрытый в настоящем описании, не включает стадию удаления вируса из смеси после инкубации.
Аспекты настоящего описания могут быть также описаны следующим образом.
1. Способ инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, причем способ включает стадии: а) получение жидкости, включающей белок, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где белок после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
2. Белок, по существу, свободный от вируса, имеющего липидную оболочку, полученный с помощью способа, включающего стадии: а) получение жидкости, включающей белок, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где белок после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
3. Способ инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, причем способ включает стадии: а) получение жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
4. Фактор VIII, по существу, свободный от вируса, имеющего липидную оболочку, полученный с помощью способа, включающего стадии: а) получение жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивание органического растворителя и поверхностно-активного вещества с жидкостью с созданием в результате этого смеси и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
5. Варианты осуществления 1-4, где жидкость представляет собой клеточный лизат, супернатант клеток, элюат с предыдущей стадии очистки или биологическую жидкость.
6. Вариант осуществления 5, где клеточный лизат получают из клеточной линии млекопитающих.
7. Вариант осуществления 6, где клеточная линия млекопитающих представляет собой клеточную линию яичника китайского хомячка (СНО).
8. Варианты осуществления 1-4, где белок представляет собой рекомбинантный белок.
9. Варианты осуществления 1-4, где белок получен из организма или трансгенного организма.
10. Варианты осуществления 8-9, где белок представляет собой белок крови.
11. Вариант осуществления 10, где белок крови представляет собой белок свертывания крови.
12. Варианты осуществления 8-10, где белок крови представляет собой ADAMTS-13, а1-антиплазмин, а2-антиплазмин, антитромбин, антитромбин III, раковый прокоагулянт, эритропоэтин, фактор II, фактор V, фактор VI, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, фибронектин, фибриноген, кофактор II гепарина, высокомолекулярный кининоген, внутримышечный иммуноглобулин, внутривенный иммуноглобулин, плазминоген, ингибитор-1 активатора плазминогена, ингибитор-2 активатора плазминогена, прекалликреин, белок С, белок S, белок Z, ингибитор протеазы, относящейся к белку Z, тканевой фактор, тканевой активатор плазминогена, урокиназу или фактор фон Виллибранда.
13. Варианты осуществления 1-12, где органический растворитель представляет собой простой эфир, спирт, диалкилфосфат или триалкилфосфат.
14. Вариант осуществления 13, где простой эфир представляет собой диметиловый эфир, диэтило-вый эфир, этилпропиловый эфир, метилбутиловый эфир, метилизопропиловый эфир или метилизобути-ловый эфир.
15. Вариант осуществления 13, где спирт представляет собой метанол, этанол, пропанол, изопропа-нол, н-бутанол, изобутанол, н-пентанол или изопентанол.
16. Вариант осуществления 13, где диалкилфосфат представляет собой ди-(н-бутил)фосфат, ди-(трет-бутил)фосфат, ди-(н-гексил)фосфат, ди-(2-этилгексил)фосфат, ди-(н-децил)фосфат или этил-ди-(н-бутил)фосфат.
17. Вариант осуществления 13, где триалкилфосфат представляет собой три-(н-бутил)фосфат, три-(трет-бутил)фосфат, три-(н-гексил)фосфат, три-(2-этилгексил)фосфат или три-(н-децил)фосфат.
18. Варианты осуществления 1-17, где конечная концентрация органического растворителя составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.), от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,5% (об./об.), от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,4% (об./об.), приблизительно 0,3% (об./об.).
19. Варианты осуществления 1-18, где поверхностно-активное вещество представляет собой ионное поверхностно-активное вещество, цвиттерионное (амфотерное) поверхностно-активное вещество или неионное поверхностно-активное вещество.
20. Вариант осуществления 19, где ионное поверхностно-активное вещество представляет собой анионное поверхностно-активное вещество или катионное поверхностно-активное вещество.
21. Вариант осуществления 20, где анионное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилсульфат, алкиловый эфир сульфата, докузат, фторированное поверхностно-активное вещество на основе сульфоната, алкилбензоловый сульфонат, алкилариловый эфир фосфата, алкиловый эфир фосфата, алкилкарбоксилат, лауроилсаркозинат натрия или фторированное поверхностно-активное вещество на основе карбоксилата.
22. Вариант осуществления 21, где алкилсульфат представляет собой лаурилсульфат аммония или лаурилсульфат натрия (SDS).
23. Вариант осуществления 21, где алкиловый эфир сульфата представляет собой этерифицирован-ный лаурилсульфат натрия или этерифицированный миристилсульфат натрия.
24. Вариант осуществления 21, где докузат представляет собой диоктилсульфосукцинат натрия.
25. Вариант осуществления 21, где фторированное поверхностно-активное вещество на основе сульфоната представляет собой перфтороктансульфонат (PFOS) или перфторбутансульфонат.
26. Вариант осуществления 21, где алкилкарбоксилат представляет собой соль жирных кислот или стеарат натрия.
27. Вариант осуществления 21, где фторированное поверхностно-активное вещество на основе кар-боксилата представляет собой перфторнонаноат и перфтороктаноат.
28. Вариант осуществления 20, где катионное поверхностно-активное вещество представляет собой алкилтриметиламмонийную соль, хлорид цетилпиридиния (СРС), полиэтоксилированный амин твердого жира (РОЕА), хлорид бензалкония (ВАС), хлорид бензетония (BZT), 5-бром-5-нитро-1,3-диоксан, хлорид диметилдиоктадециламмония, бромид диоктадецилдиметиламмония (DODAB), рН-зависимый первичный амин, рН-зависимый вторичный амин или рН-зависимый третичный амин.
29. Вариант осуществления 28, где алкилтриметиламмонийная соль представляет собой бромид це-тилтриметиламмония (СТАВ) или хлорид цетилтриметиламмония (СТАС).
30. Вариант осуществления 28, где первичный амин становится положительно заряженным при рН <10, или вторичный амин становится положительно заряженными при рН <4.
31. Вариант осуществления 20, где катионное поверхностно-активное вещество представляет собой
10.
октенидиндигидрохлорид.
32. Вариант осуществления 20, где цвиттерионное поверхностно-активное вещество представляет собой 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS), султейн, бетаин или лецитин.
33. Вариант осуществления 32, где султейн представляет собой кокамидопропилгидроксисултейн.
34. Вариант осуществления 32, где бетаин представляет собой кокамидопропилбетаин.
35. Вариант осуществления 20, где неионное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный алкиловый эфир полиоксиэтиленгликоля-сорбитана, полоксамер, алкилфеноловый эфир полигликоля, алкилариловый эфир полиэтиленгликоля, алкиловый эфир полиоксиэтиленгликоля, 2-додекоксиэтанол (LUBROL(r)-PX), октилфеноловый эфир полиоксиэтиленгликоля, алкилфеноловый эфир полиоксиэтиленгликоля, феноксиполиэтоксилэтанол, алкиловый эфир глюкозида, алкиловый эфир мальтозида, алкиловый эфир тиоглюкозида, дигитонин, алкиловый эфир глицерина, сульфат алкилари-лового полиэфира, сульфонат спирта, алкиловый эфир сорбитана, кокамид этаноламина, монолаурат сахарозы, оксид додецилдиметиламина или хлорат натрия.
36. Вариант осуществления 35, где сложный алкиловый эфир полиоксиэтиленгликоля-сорбитана представляет собой полисорбат 20 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 20), полисорбат 40 сорбитан монооле-ат (TWEEN(r) 40), полисорбат 60 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 60), полисорбат 61 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 61), полисорбат 65 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 65), полисорбат 80 сорбитан моноолеат
(TWEEN(r) 80) или полисорбат 81 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 81).
37. Вариант осуществления 35, где полоксамер представляет собой Poloxamer 124 (PLURONIC(r) L44), Poloxamer 181 (PLURONIC(r) L61), Poloxamer 182 (PLURONIC(r) L62), Poloxamer 184 (PLURONIC(r) L64), Poloxamer 188 (PLURONIC(r) F68), Poloxamer 237 (PLURONIC(r) F87), Poloxamer 338 (PLURONIC(r) L108) или Poloxamer 407 (PLURONIC(r) F127).
38. Вариант осуществления 35, где алкиловый эфир полиоксиэтиленгликоля представляет собой монододециловый эфир октаэтиленгликоля, монододециловый эфир пентаэтиленгликоля, BRIJ(r) 30 или
BRIJ(r) 35.
39. Вариант осуществления 35, где октилфеноловый эфир полиоксиэтиленгликоля представляет собой полиоксиэтилен(4-5)п-трет-октилфенол (TRITON(r) X-45) или октилфеноловый эфир полиоксиэтиле-
на (TRITON(r) X-100).
40. Вариант осуществления 35, где алкилфеноловый эфир полиоксиэтиленгликоля представляет собой ноноксинол-9.
41. Вариант осуществления 35, где феноксиполиэтоксилэтанол представляет собой нонилфенокси-полиэтоксилэтанол или октилфеноксиполиэтоксилэтанол.
42. Вариант осуществления 35, где алкиловый эфир глюкозида представляет собой октилглюкопи-ранозид.
43. Вариант осуществления 35, где алкиловый эфир мальтозида представляет собой додецилмаль-топиранозид.
44. Вариант осуществления 35, где алкиловый эфир тиоглюкозида представляет собой гептилтиог-люкопиранозид.
45. Вариант осуществления 35, где алкиловый эфир глицерина представляет собой глицериллаурат.
46. Вариант осуществления 35, где кокамид этаноламина представляет собой кокамид моноэтано-ламина или кокамид диэтаноламина.
47. Варианты осуществления 1-46, где конечная концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10,0% (об./об.) или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0% (об./об).
48. Варианты осуществления 1-47, где поверхностно-активное вещество включает множество поверхностно-активных веществ.
49. Варианты осуществления 1-48, где множество поверхностно-активных веществ соответствует пп.19-46.
50. Вариант осуществления 48 или 49, где конечная концентрация одного поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 10,0% (об./об.), от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0% (об./об) или от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0% (об./об), а конечная концентрация оставшихся поверхностно-активных веществ составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.), от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0% (об./об.) или от приблизительно 0,2 до приблизительно 4% (об./об.).
51. Варианты осуществления 1-50, где на стадии (с) смесь инкубируют в течение от приблизительно 10 до приблизительно 90 мин.
52. Варианты осуществления 1-50, где на стадии (с) смесь инкубируют в течение от приблизительно 30 до приблизительно 60 мин.
53. Варианты осуществления 1-52, где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 16°С.
40.
54. Варианты осуществления 1-52, где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 12°С.
55. Варианты осуществления 1-52, где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С.
56. Варианты осуществления 1-52, где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 4°С.
57. Варианты осуществления 1-56, где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.
58. Варианты осуществления 1-57, где смесь после инкубации полностью свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.
59. Варианты осуществления 1-58, где смесь после инкубации включает менее 1х101 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.
60. Варианты осуществления 1-59, где смесь после инкубации включает по меньшей мере в 100 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, чем перед инкубацией.
61. Варианты осуществления 1-60, где смесь после инкубации, по существу, свободна от агрегатов белка.
62. Варианты осуществления 1-61, где смесь после инкубации полностью свободна от агрегатов белка.
63. Варианты осуществления 1-62, где смесь после инкубации содержит менее приблизительно 1%, менее приблизительно 0,9%, менее приблизительно 0,8%, менее приблизительно 0,7%, менее приблизительно 0,6%, менее приблизительно 0,5%, менее приблизительно 0,4%, менее приблизительно 0,3%, менее приблизительно 0,2% или менее приблизительно 0,1% белка, обладающего активностью, в агрегированной форме.
64. Варианты осуществления 1-63, где активность белка, присутствующего в смеси после инкубации, составляет по меньшей мере 50% от активности белка, имеющейся на стадии (а), или по меньшей мере 75% от активности белка, имеющейся на стадии (а).
65. Варианты осуществления 1-64, где жидкость дополнительно включает вирус, имеющий липид-ную оболочку.
66. Вариант осуществления 65, где вирус, имеющий липидную оболочку, представляет собой ДНК-вирус, РНК-вирус или обратно транскрибирующий вирус.
67. Вариант осуществления 66, где ДНК-вирус представляет собой вирус herpesviridae, вирус pox-viridae или вирус hepadnaviridae.
68. Вариант осуществления 66, где РНК-вирус представляет собой вирус flaviviridae, вирус togaviri-dae, вирус coronaviridae, вирус deltavirus, вирус orthomyxoviridae, вирус paramyxoviridae, вирус rhab-doviridae, вирус bunyaviridae или вирус ffiloviridae.
69. Вариант осуществления 66, где обратно транскрибирующий вирус представляет собой вирус ret-roviridae или вирус hepadnaviridae.
70. Вариант осуществления 65, где вирус, имеющий липидную оболочку, представляет собой вирус иммунодефицита человека, вирус Синдбис, вирус простого герпеса, вирус ложного бешенства, вирус Сендай, вирус везикулярного стоматита, вирус лихорадки западного Нила, вирус вирусной диареи коров, коронавирус, вирус артрита лошадей, вирус тяжелого острого респираторного синдрома, вирус мышиного лейкоза Молони или вирус коровьей оспы.
71. Варианты осуществления 1-70, где способ дополнительно включает стадию удаления растворителя из смеси после стадии (с).
72. Варианты осуществления 1-71, где способ дополнительно включает стадию удаления неионного поверхностно-активного вещества из смеси после стадии (с).
73. Варианты осуществления 1-72, где способ дополнительно включает стадию удаления нежизнеспособного вируса из смеси после стадии (с).
74. Способ инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, причем способ включает стадии: а) получение жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивание три(н-бутил)фосфата, полиоксиэтиленоктилфенила и сорбитана-полисорбата 80 с жидкостью с созданием в результате этого смеси, где конечная концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.), конечная концентрация полиоксиэтиленоктилфенила составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 10,0% (об./об.) и конечная концентрация сорбитана-полисорбата 80 составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.); и с) инкубации смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
75. Фактор VIII, по существу, свободный от вируса, имеющего липидную оболочку, полученный с помощью способа, включающего стадии: а) получение жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивание три(н-бутил)фосфата, полиоксиэтиленоктилфенила и сорбитана
40.
полисорбата 80 с жидкостью с созданием в результате этого смеси, где конечная концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.), конечная концентрация полиоксиэтиленоктилфенила составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 10,0% (об./об.) и конечная концентрация сорбитана-полисорбата 80 составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.); и с) инкубация смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре не выше приблизительно 20°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии
(а).
76. Вариант осуществления 74 или 75, где концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,7% (об./об.), концентрация полиоксиэтиленоктилфенила составляет от приблизительно 0,6 до приблизительно 1,4% (об./об.) и концентрация сорбитана-полисорбата 80 составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,7%.
77. Вариант осуществления 74 или 75, где концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5% (об./об.), концентрация полиоксиэтиленоктилфенила составляет от приблизительно 0,7 до приблизительно 1,3% (об./об.) и концентрация сорбитана-полисорбата 80 составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5%.
78. Вариант осуществления 74 или 75, где концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,4% (об./об.), концентрация полиоксиэтиленоктилфенила составляет от приблизительно 0,8 до приблизительно 1,2% (об./об.) и концентрация сорбитана-полисорбата 80 составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,4%.
79. Вариант осуществления 74 или 75, где концентрация три(н-бутил)фосфата составляет приблизительно 0,3% (об./об.), концентрация полиоксиэтиленоктилфенила составляет приблизительно 1,0% (об./об.) и концентрация сорбитана-полисорбата 80 составляет приблизительно 0,3% (об./об.).
80. Варианты осуществления 74-79, где смесь после инкубации содержит менее приблизительно 1%, менее приблизительно 0,9%, менее приблизительно 0,8%, менее приблизительно 0,7%, менее приблизительно 0,6%, менее приблизительно 0,5%, менее приблизительно 0,4%, менее приблизительно 0,3%, менее приблизительно 0,2% или менее приблизительно 0,1% белка, обладающего активностью, в агрегированной форме.
81. Варианты осуществления 74-80, где активность белка, присутствующего в смеси после инкубации, составляет по меньшей мере 50% от активности белка, имеющейся на стадии (а), или по меньшей мере 75% от активности белка, имеющейся на стадии (а).
82. Варианты осуществления 1-81, как описано в настоящем документе.
83. Способ инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, как описано в настоящем документе.
84. Фактор VIII, по существу, свободный от вируса, имеющего липидную оболочку, полученный с помощью способа, описанного в настоящем документе.
85. Белок, по существу, свободный от вируса, имеющего липидную оболочку, полученный с помощью способа, описанного в настоящем документе.
Примеры
Следующие неограничивающие примеры предлагаются только с целью иллюстрации для того, чтобы содействовать более полному пониманию типичных вариантов осуществления, рассматриваемых в настоящем описании. Эти примеры не должны истолковываться как ограничивающие любой из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, включая варианты, касающиеся способов инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, раскрытых в настоящем описании, и продуктов, полученных с применением этих способов.
Пример 1. Оценка инактивации вируса.
В этом примере проиллюстрировано, что способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, раскрытые в настоящем описании, приводят к смеси после инкубации, которая, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.
Рекомбинантный фактор VIII, продуцируемый клеточной линией СНО, которая секретирует белок в среду клеточной культуры, собирали путем получения среды и ее центрифугирования для удаления разрушенных клеток. В холодной комнате, поддерживаемой при температуре 10°С или ниже, собранный супернатант разводили и фильтровали через 0,2-мкм фильтр, и фактор VIII захватывался при прохождении через иммуноаффинную хроматографическую колонку, включающую иммобилизованные мышиные моноклональные антитела против а-фактора VIII, элюат собирали. Фактор VIII дополнительно обрабатывали после иммуноаффинной хроматографии путем прохождения элюата через катионообменную хроматографическую колонку, включающую отрицательно заряженные группы сульфоната. Собранный с этой ионообменной колонки элюат затем охлаждали либо до приблизительно 2°С, либо до приблизительно 10°С.
Охлажденный элюат затем делили на три аликвоты и добавляли модельный вирус с липидной оболочкой в виде вируса ложного бешенства в отношении 1:13 (например, 24 мл начального раствора плюс
2 мл вирусного маточного раствора). Аликвоты затем смешивали с раствором растворителя/детергента и охлаждали до той же самой температуры следующим образом: аликвота 1, 0,21% (об./об.) три(н-бутил)фосфата (TNBP), 0,7% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,21% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80); аликвота 2, 0,06% (об./об.) три(н-бутил)фосфата (TNBP), 0,2% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,06% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80); и аликвота 3, 0,03% (об./об.) три(н-бутил)фосфата (TNBP), 0,1% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,03% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80). Концентрации компонентов растворов растворитель/детергент равны, соответственно, 70, 20 и 10% номинальной концентрации этих компонентов в процессе обычного получения. Эти субоптимальные концентрации использовали для оценки робастности метода, используя условия, наименее благоприятные для инактивации вируса, а также для оценки кинетики инактивации.
Для оценки эффективности обработки S/D определяли log10 снижения вируса с липидной оболочкой. Наносили величины для образцов обогащенного вирусом исходного материала и в течение обработки S/D; действие компонентов растворителя/детергента на инактивацию вируса останавливали в образцах путем немедленного разведения холодной средой клеточной культуры перед титрованием вируса. Log факторов снижения рассчитывали вычитанием (log) титра конечного образца из (log) титра обогащенного исходного материала; предел определения для этого расчета был взят, когда можно было видеть отсутствие инфективности в конечном образце.
Результаты показывают, что инактивация вируса ложного бешенства наступала в пределах от приблизительно 1 до приблизительно 2 мин либо при приблизительно 2°С, либо при приблизительно 10°С (табл. 1). Так как экспериментальные тесты были сделаны при нижних или еще более низких пределах концентрации компонентов растворитель/детергент и ниже нижних пределов продолжительности обработки S/D, полученные факторы снижения устойчиво оценивают способность широкомасштабного метода к инактивации вируса. Эти результаты показывают, что обработки S/D при приблизительно 10°С и при приблизительно 2°С являются робастными и очень эффективно и быстро инактивируют вирусы с липидной оболочкой.
Таблица 1
Пример 2. Оценка инактивации вируса.
В этом примере проиллюстрировано, что способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, раскрытые в настоящем описании, приводят к смеси после инкубации, которая, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку.
Рекомбинантный фактор VIII экспрессировали и очищали, по существу, как описано в примере 1. Собранный элюат с катионообменной колонки затем охлаждали до приблизительно 2°С.
Охлажденный элюат затем делили на шесть аликвот, и к аликвотам добавляли вирусы с липидной оболочкой в отношении 1:13 (например, 24 мл начального раствора плюс 2 мл вирусного маточного раствора) следующим образом: к аликвотам 1 и 2 добавляли вирус ложного бешенства (PRV); к аликвотам 3 и 4 добавляли вирус мышиного лейкоза Молони (X-MuLV); и к аликвотам 5 и 6 добавляли вирус вирусной диареи коров (BVDV). Аликвоты затем смешивали с раствором растворителя/детергента и охлаждали до приблизительно 2°С следующим образом: аликвоты 1, 3 и 5: 0,21% (об./об.) три(н-бутил)фосфата (TNBP), 0,7% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,21% (об./об.) поли-сорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80); и аликвоты 2, 4 и 6: 0,03% (об./об.) три(н-бутил)фосфа-та (TNBP), 0,1% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) Х-100) и 0,03% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80). Концентрации компонентов растворов растворитель/детергент равны, соответственно, 70 и 10% номинальной концентрации этих компонентов в процес
се обычного получения. Эти субоптимальные концентрации использовали для оценки робастности метода, используя условия, наименее благоприятные для инактивации вируса, а также для оценки кинетики инактивации.
Для оценки эффективности обработки S/D определяли log10 снижения каждого из трех вирусов с липидной оболочкой. Наносили величины для образцов обогащенного вирусом исходного материала и в течение обработки S/D; действие компонентов растворителя/детергента на инактивацию вируса останавливали в образцах путем немедленного разведения холодной средой клеточной культуры перед титрованием вируса. Log факторов снижения рассчитывали вычитанием (log) титра конечного образца из (log) титра обогащенного исходного материала; предел определения для этого расчета был взят, когда можно было видеть отсутствие инфективности в конечном образце.
Результаты показывают, что инактивация PRV, X-MuLV и BVDV у всех наступала в пределах приблизительно 1-2 мин при приблизительно 2°С при инкубации с 70% раствором растворитель/детергент (табл. 2). Так как экспериментальные тесты были сделаны при нижних или еще более низких пределах концентрации компонентов растворителя/детергента и ниже нижних пределов продолжительности обработки S/D, полученные факторы снижения устойчиво оценивают способность широкомасштабного метода к инактивации вируса. Эти результаты показывают, что обработки S/D при приблизительно 2°С являются робастными и очень эффективно и быстро инактивируют вирусы с липидной оболочкой.
Таблица 2
Пример 3. Определение времени смешивания, фильтрации и выхода белка.
В этом примере проиллюстрировано, что способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, раскрытые в настоящем описании, не оказывают отрицательного влияния на время смешивания компонентов растворителя/детергента, на сохранение компонентов растворителя/детергента в процессе фильтрации и на выход белка после фильтрации.
Для того чтобы оценить влияние более низкой температуры на время смешивания компонентов растворителя/детергента, получали 50 мл растворов растворителя/детергента путем добавления 0,3% (об./об.) TNBP, 1,0% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,3% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80) и перемешивания при 4±2°С в течение 10, 20 или 30 мин. Так как раствор растворителя/детергента уже содержал 0,1% полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80), конечная концентрация этого соединения составляла 0,4%. Концентрацию TNBP и полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) определяли одновременно с использованием С18 ОФ-ВЭЖХ с детектором коэффициента преломления (RID).
Концентрацию полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80) определяли с помощью С1 ОФ-ВЭЖХ с использованием детектора светорассеяния испаренного образца (ELSD). Для ВЭЖХ анализа TNBP и полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) применяли изократическое элюи-рование с использованием 68% метанола в воде. При анализе полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80) использовали градиентную элюцию от 60% метанола в воде до 100% метанола.
Таблица 3
Эти результаты подтверждают, что концентрация TNBP, полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80) быстро стабилизировалась в пределах 10 мин, и что низкая температура 4±2°С не оказывала отрицательного влияния на время смешивания компонентов растворителя/детергента (табл. 3).
Для оценки влияния температуры на возможное сохранение компонентов растворителя/детергента на стадии фильтрации получали 50 мл растворов растворителя/детергента путем добавления 0,3% (об./об.) TNBP, 1,0% (об./об.) полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,3% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80) с перемешиванием при 4±2°С в течение 30 мин и измеряли концентрацию каждого компонента, как описано выше. Растворы растворителя/детергента затем обрабатывали при трех различных температурных режимах: 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 8 ч; 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 2 ч и 4°С без какого-либо нагревания или стадии предварительного подогрева. В конце инкубационного периода образцы фильтровали через 0,2-мкм фильтр и концентрации TNBP, полиоксиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80) измеряли с помощью ВЭЖХ.
Таблица 4
Результаты указывают на то, что ни один из компонентов растворителя/детергента не удерживался на 0,2-мкм фильтре (табл. 4). Кроме того, более низкая температура инкубации (4°С±2°С) не оказывала отрицательного влияния на способность к фильтрации компонентов растворителя/детергента.
Для оценки влияния низкой температуры на активность открываемого белка получали 50 мл растворов растворителя/детергента путем добавления 0,3% (об./об.) TNBP, 1,0% (об./об.) полиоксиэтиле-ноктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,3% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моноолеата (TWEEN(r) 80) с перемешиванием при 4±2°С в течение 30 мин. Растворы растворителя/детергента затем обрабатывали при трех различных температурных режимах: 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 8 ч; 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 2 ч и 4°С без какого-либо нагревания или стадии предварительного подогрева. В конце инкубационного периода образцы фильтровали через 0,2-мкм фильтр и активность фактора VIII измеряли после фильтрации с использованием метода с хромогенным субстратом.
Для осуществления метода определения активности фактора VIII с использованием хромогена али-квоту раствора, обработанного растворителем/детергентом, предварительно разводили в буфере для разведения образцов (50 мМ трис, 5 мМ CaCl2, 225 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 80 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 80), рН 6,7±0,2) до приблизительно 2 5 МЕ/мл и затем дополнительно разводили до 1 МЕ/мл в плазме, лишенной фактора VIII. 100 мкл предварительно разведенного образца затем смешивали с 0,03М CaCl2, 0,06 мМ фосфолипидов, 100 мкл 0,3 мкМ фактора IXa, 100 мкл фактора X и 500 мкл 3,4 мкМ хро-могенного субстрата СН3ОСО-Б-циклогексилглицилглициларгинил-п-нитроанилида для обеспечения гарантии того, что фактор VIII является лимитирующим скорость компонентом реакции. Смесь инкубировали при 37°С в течение 90 с и затем снимали показания на спектрофотометре при 405 нм для определения степени гидролиза хромогенного субстрата и высвобождения п-нитроанилина.
Измеренная активность фактора VIII была одинакова перед стадией фильтрации через 0,2-мкм фильтр и после нее. Этот результат подтверждает, что низкая температура инкубации не оказывает отрицательного влияния на открытие фактора VIII после стадии фильтрации через 0,2-мкм фильтр в отсутствие компонентов S/D.
Таблица 5
Результаты показывают, что открытие фактора VIII составляло приблизительно 100% для всех оцениваемых температурных условий, и что активность белка была одинаковой перед стадией фильтрации и после нее, несмотря на присутствие компонентов растворителя/детергента (табл. 5).
Пример 4. Инактивация вируса, имеющего липидную оболочку, в жидкости, включающей белок, обладающий активностью.
В этом примере иллюстрируются раскрытые в настоящем описании способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, в жидкости, включающей белок, обладающий активностью.
Для оценки общей эффективности раскрытого в настоящем описании способа в отношении инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, и его влияния на активность открываемого белка получали 50 мл растворов растворителя/детергента путем добавления 0,3% (об./об.) TNBP, 1,0% (об./об.) полиок-сиэтиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) X-100) и 0,3% (об./об.) полисорбата 80 сорбитана моно-олеата (TWEEN(r) 80) с перемешиванием при 4±2°С в течение 30 мин. Растворы растворителя/детергента затем обрабатывали при трех различных температурных режимах: 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 8 ч; 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 2 ч и 4°С без какого-либо нагревания или стадии предварительного подогрева. В конце инкубационного периода образцы очищали с использованием ионообменной колоночной хроматографии и активность фактора VIII измеряли с использованием метода с хромогенным субстратом перед фильтрацией и после нее, по существу, как описано в примере 3.
Результаты показывают, что средние выходы открываемого фактора VIII составляли 83,02% при обработке растворителем/детергентом, осуществляемой при 4°С в течение 2 ч; 82,83% при обработке, осуществляемой при 22,5°С в течение 2 ч; и 80,93% при обработке, осуществляемой при 22,5°С в течение 8 ч (табл. 6).
Эти результаты подтверждают, что обработка растворителем/детергентом, осуществляемая при 4°С в течение 2 ч, существенно не влияет на открытие активного фактора VIII. Более того, специфическая активность фактора VIII, очевидно, лучше сохранялась, когда инкубация осуществлялась при 4°С, чем
при 22,5°С. Приблизительно 6% специфической активности терялось, когда обработку растворителем/детергентом осуществляли при 22,5°С, тогда как только легкое снижение специфической активности приблизительно на 1% наблюдалось для фактора VIII, когда обработку осуществляли при 4°С. Следовательно, неожиданное повышение среднего открытия фактора VIII наблюдалось, когда обработку растворителем/детергентом осуществляли при низкой температуре.
Таблица 6
Пример 5. Определение агрегации белка.
В этом примере проиллюстрировано, что способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, раскрытые в настоящем описании, предотвращают агрегацию белка.
Для оценки влияния стадии инактивации вируса при низкой температуре на образование агрегатов белка обработку растворителем/детергентом осуществляли при трех различных температурных режимах: 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 8 ч; 22,5°С с периодом нагревания в течение приблизительно 2 ч и 4°С без какого-либо нагревания или стадии предварительного подогрева. При всех условиях реагенты растворителя/детергента добавляли, когда была достигнута желаемая температура. После инкубационного периода, составляющего 1 ч при всех температурных режимах, компоненты растворителя/детергента удаляли с помощью ионообменной хроматографии и количество агрегатов измеряли в конечных объемах. Для всех режимов для растворителя/детергента осуществляли три повтора.
Определение агрегатов (выражаемое в процентах) осуществляли с помощью хроматографии, исключающей по размеру (SEC), в системе ВЭЖХ, снабженной колонкой Bio-Sep-SEC-S4000. Стационарная фаза содержит гидрофильные группы, связанные с силикагелевой подложкой, которая подходит для разделения белков с диапазоном молекулярной массы от 15 до 2000 кДа. Образцы, взятые из растворов, обработанных растворителем/детергентом, разводили до 50 мкг/мл и 11 мкл наносили на колонку. Элю-ирующий буфер представлял собой 20 мМ Трис, 250 мМ NaCl, 3 мМ дигидрат CaCl2, 0,05% (об./об.) полисорбат 80 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 80), 7,5% (об./об.) этиленгликоль, рН доводили до 7,0±2. Разделение осуществляли буфером с изократической мобильной фазой. Определение проводили с использованием детектора флуоресценции при возбуждающей длине волны 285 нм и длине волны излучения 335 нм. Ответ пропорционален количеству белков, присутствующих в различных пиках полученной хроматограммы. Проценты агрегатов рассчитывали как отношение области пика фракции к области суммарного пика (табл. 7).
Таблица 7
Неожиданно, эксперименты, осуществляемые при 4°С, привели к неопределяемому ( <0,25%) количеству агрегатов в конечном объеме элюата, тогда как при обработке, осуществляемой при 22,5°С, определялось намного более высокое образование агрегатов (0,7 и 0,6%). Уменьшение агрегатов в конечном объеме является существенным, так как агрегаты обычно, как известно, усиливают иммунные ответы против мономерных форм белка.
Пример 6. Инактивация вируса, имеющего липидную оболочку, в жидкости, включающей белок, обладающий активностью.
В этом примере иллюстрируются раскрытые в настоящем описании способы инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, в жидкости, включающей белок, обладающий активностью.
Рекомбинантный фактор VIII, продуцируемый клеточной линией СНО, которая секретирует белок в среду клеточной культуры, выращиваемой в биореакторах объемом 2500 л, собирали при охлаждении до 10°С, получая среду и центрифугируя для удаления разрушенных клеток. В холодной комнате, поддерживаемой при 10°С или ниже, собранный супернатант разводили и фильтровали через 0,2-мкм фильтр, и фактор VIII захватывался при прохождении через иммуноаффинную хроматографическую колонку, включающую иммобилизованные мышиные моноклональные антитела против а-фактора VIII, и элюат собирали. Фактор VIII дополнительно обрабатывали путем прохождения элюата после иммуноаффинной хроматографии через катионообменную хроматографическую колонку, включающую отрицательно заряженные группы сульфоната. Около 8 л собранного с этой ионообменной колонки элюата затем охлаждали до приблизительно 4°С и смешивали в течение приблизительно 10 мин с раствором растворителя/детергента, охлажденным до той же самой температуры, в количестве 16,6 г раствора растворителя/детергента на 1 кг элюата с ионообменной колонки. Раствор растворителя/детергента включает три-(н-бутил)фосфат (TNBP), полиоксиэтиленоктилфениловый эфир (TRITON(r) Х-100) и полисорбат 80 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 80) в весовом отношении 18,3:66,3:20,2. Это равно конечной концентрации приблизительно 0,3% (об./об.) три-(н-бутил)фосфата (TNBP), приблизительно 1,0% (об./об.) полиокси-этиленоктилфенилового эфира (TRITON(r) Х-100) и приблизительно 0,3% (об./об.) полисорбата 80 сор-битана моноолеата (TWEEN(r) 80). После непрерывного перемешивания при приблизительно 4°С в течение не более приблизительно 120 мин элюат, обработанный растворителем/детергентом, затем фильтровали через 0,2-мкм фильтр для удаления разрушенных вирусов. Профильтрованный раствор, обработанный растворителем/детергентом, разводили уравновешивающим буфером для анионообменной хроматографии и дополнительно обрабатывали, пропуская через анионообменную хроматографическую колонку для удаления компонентов растворителя/детергента. Конечный очищенный раствор, включающий фактор VIII, собирали из фракций элюата после анионообменной хроматографии. В конечном очищенном растворе, включающем фактор VIII, затем измеряли присутствие вирусов, имеющих липидную оболочку, активность фактора VIII, количество агрегатов и следовое количество компонентов растворителя/детергента.
Для определения присутствия или активности жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, в конечном очищенном растворе, включающем фактор VIII, выполняли тест TCID50. Отбирали образец профильтрованного, обработанного растворителем/детергентом раствора и разводили 1:00 или 1:10 культуральной средой клеток Vero. Делали серийные разведения 0,5 log10 образцов культуральной средой клеток Vero и 100 мкл каждого разведения добавляли к каждой из 8 лунок колоночного планшета для микротитрования с высеянными клетками Vero. Планшеты для микротитрования инкубировали в инкубаторе с регулируемым СО2 с увлажнением при 36±2°С в течение 7 дней. После инкубации клетки проверяли под микроскопом на признаки инфицирования, такие как, например, лизированные клетки, клетки, проявляющие цитопатогенный эффект, или любые другие критерии, указывающие на инфицирование вирусом. Титр вирусов рассчитывали из распределения положительных (инфицированных вирусом) и отрицательных (не инфицированных вирусом) лунок в соответствии с распределением Пуассона и выражали в КОЕ/мл и log10 [TCID^/мл]. Отсутствие положительных признаков инфицирования в каких-либо лунках указывает на то, что обработанный раствор, по существу, свободен от вируса, имеющего липидную оболочку.
Для определения уровня активности фактора VIII, присутствующего в конечном очищенном растворе, использовали метод определения активности фактора VIII с использованием хромогена. Аликвоту профильтрованного раствора, обработанного растворителем/детергентом, предварительно разводили в буфере для разведения образцов (50 мМ Трис, 5 мМ CaCl2, 225 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 80 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 80), рН 6,7±0,2) до приблизительно 25 МЕ/мл и затем дополнительно разводили до 1 МЕ/мл в плазме, лишенной фактора VIII. 100 мкл предварительно разведенного образца затем смешивали с 0,03М CaCl2, 0,06 мМ фосфолипидов, 100 мкл 0,3 мкМ фактора IXa, 100 мкл фактора X и 500 мкл 3,4 мкМ хромогенного субстрата C^OCO-D-циклогексилглицижлициларгинил-п-нитроанилида для гарантии того, что фактор VIII является лимитирующим скорость компонентом реакции. Смесь инкубировали при 37°С в течение 90 с и затем снимали показания на спектрофотометре при 405 нм для определения степени гидролиза хромогенного субстрата и высвобождения п-нитроанилина.
Для определения уровня активности фактора VIII, присутствующего в конечном очищенном растворе, применяли одностадийный метод определения активности фактора VIII по свертыванию. Аликво-ту профильтрованного раствора, обработанного растворителем/детергентом, предварительно разводили в буфере для разведения образцов (50 мМ Трис, 5 мМ CaCl2, 225 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 80 сорбитан моноолеат (TWEEN(r) 80), рН 6,7±0,2) до приблизительно 25 МЕ/мл и затем дополнительно разводили до 1 МЕ/мл в плазме, лишенной фактора VIII. 100 мкл предварительно разведенного образца затем смеши
вали с 100 мкл плазмы, лишенной фактора VIII. Смесь инкубировали при 37°С в течение 3 мин и добавляли 100 мкл 25 мМ CaCl2 для начала процесса свертывания. Количество присутствующего фактора VIII определяли путем сравнения величины времени свертывания АРТТ со стандартной кривой, рассчитанной с помощью программы расчета данных теста с прибора, которая создает график зависимости времени свертывания от концентрации фактора VIII в двойных логарифмических координатах. Анализатор свертывания и соответствующие реагенты для тестов по свертыванию предназначаются для измерения активности параметров свертывания в физиологическом диапазоне. Результаты показывают, что средняя специфическая активность фактора VIII составляла приблизительно 6,120 МЕ/мг. Эта средняя специфическая активность выше, чем 5,809 МЕ/мг, средняя специфическая активность фактора VIII, обработанного с использованием метода инактивации вируса, при котором жидкость в смеси органический растворитель/детергент инкубируется при от приблизительно 20 до приблизительно 25°С.
Для оценки количества агрегатов белка, присутствующих в конечном очищенном растворе, включающем фактор VIII, проводятся эксперименты с использованием хроматографии, исключающей по размеру, и поглощения в УФ, по существу, как описано в примере 5.
Для оценки следового количества компонентов растворителя/детергента, присутствующих в конечном очищенном растворе, включающем фактор VIII, проводятся эксперименты с использованием ОФ-ВЭЖХ, по существу, как описано в примере 3.
В заключение должно быть понятно, что хотя аспекты настоящего описания освещаются со ссылкой на конкретные варианты осуществления, специалист в данной области техники должен без труда понять, что эти раскрытые варианты осуществления являются только иллюстрацией принципов предмета изобретения, раскрытого в настоящем описании. Следовательно, должно быть понятно, что раскрытый предмет изобретения никоим образом не ограничивается описанными в настоящем документе конкретной методологией, протоколом и/или реагентом и т.д. По существу, различные модификации или изменения раскрытого предмета изобретения или его альтернативные формы могут быть осуществлены в соответствии с указаниями настоящего документа, не выходя за рамки сущности настоящего описания. Наконец, используемая в настоящем описании терминология применяется только с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определен исключительно формулой изобретения.
Соответственно, настоящее изобретение не ограничивается тем, что конкретно показано и описано.
В настоящем документе описаны определенные варианты осуществления настоящего изобретения, включая лучший вариант осуществления изобретения, известный изобретателям. Конечно, вариации этих описанных вариантов осуществления должны быть понятны специалистам в данной области техники при прочтении вышеупомянутого описания. Изобретатели надеются, что специалисты используют такие вариации соответствующим образом, и изобретатели подразумевают, что настоящее изобретение может быть применено на практике другим образом, отличным от конкретно описанного в настоящем документе. Соответственно, изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, изложенного в формуле изобретения, прилагаемой к настоящему документу, как разрешается действующим законом. Более того, любое сочетание описанных выше вариантов осуществления во всех возможных их вариациях охватывается изобретением до тех пор, пока в настоящем документе не указывается иначе или иным образом ясно опровергается контекстом.
Группирования альтернативных вариантов осуществления, элементов или стадий настоящего изобретения не истолковываются как ограничения. Каждый член группы может быть обозначен и заявлен индивидуально или в любом сочетании с другими членами группы, раскрытыми в настоящем описании. Предупреждается, что один или более членов группы может быть включен в группу или исключен из нее по причинам удобства и/или патентоспособности. Когда осуществляется любое такое включение или исключение, считается, что в описании содержится группа в качестве модифицированной, таким образом удовлетворяя письменному описанию всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.
Если не указано иначе, все пункты, выражающие характеристику, предмет, количество, параметр, свойство, термин и так далее, используемые в настоящем описании и формуле изобретения, должны во всех случаях пониматься как модифицированные с помощью термина "приблизительно". При применении в настоящем описании термин "приблизительно" обозначает, что характеристика, предмет, количество, параметр, свойство или термин, определенные таким образом, охватывают диапазон плюс или минус 10% выше или ниже величины установленной характеристики, предмета, количества, параметра, свойства или термина. Соответственно, если не указано обратное, количественные параметры, представленные в описании и прилагаемой формуле изобретения, имеют приближенные значения, которые могут варьироваться. В весьма малой степени и не в виде попытки ограничить заявку теорией эквивалентов объема формулы изобретения каждое количественное указание должно, по меньшей мере, истолковываться в свете представленных значащих цифр и применения обычных методов округления. Несмотря на то что количественные диапазоны и величины, представляющие широкий объем изобретения, имеют приближенное значение, количественные диапазоны и величины, представленные в конкретных примерах, даются настолько точно, насколько это возможно. Любой количественный диапазон или величина,
однако, в своей основе содержит определенные ошибки, необходимо возникающие из стандартного отклонения, выявляемого в соответствующих измерениях при их тестировании. Перечисление количественных диапазонов величин в настоящем описании предназначено единственно для использования в качестве способа условного обозначения индивидуальной ссылки на каждую отдельную количественную величину, попадающую в пределы диапазона. Если в настоящем описании не указано иначе, каждая индивидуальная величина количественного диапазона включается в настоящее описание, как если бы она индивидуально цитировалась в настоящем документе.
Все способы, описанные в настоящем документе, могут осуществляться в любом подходящем порядке, если в настоящем описании не указано иначе или ясно опровергается контекстом. Использование любого или всех примеров или языка примеров (например, "такой как"), предлагаемое в настоящем описании, предназначено исключительно для лучшей иллюстрации настоящего изобретения и не является ограничением объема изобретения, иным образом заявленного в формуле изобретения. Никакой язык в настоящем описании не должен истолковываться как указывающий на какой-либо элемент, существенный для практики изобретения, не заявленный в формуле изобретения.
Конкретные варианты осуществления, раскрытые в настоящем описании, могут быть дополнительно ограничены в формуле изобретения при использовании выражения "состоящий из или, по существу, состоящий из". При использовании в формуле изобретения, будь то зарегистрированная или добавленная исправленная формула изобретения, переходный термин "состоящий из" исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не описанный в формуле изобретения. Переходный термин "по существу, состоящий из" ограничивает объем формулы изобретения конкретными материалами или стадиями и тем, что не материально влияет на основную(ые) и новую(ые) характеристику(ки). Варианты осуществления настоящего изобретения, изложенные в формуле изобретения таким образом, по сути или в прямой форме описаны и разрешены в настоящем описании.
Все патенты, патентные публикации и другие публикации, на которые ссылаются и которые идентифицируются в настоящем описании, индивидуально и в прямой форме включены в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме с целью описания и раскрытия, например, композиций и способов, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Эти публикации предлагаются исключительно в отношении их раскрытия, предшествующего зарегистрированной дате настоящей заявки. Ничего в этом отношении не должно истолковываться как признание того, что изобретатели не дают права датирования задним числом такое раскрытие на основании предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все утверждения как в отношении даты или заявления, так и в отношении содержания этих документов, основываются на информации, доступной заявителям, и не основываются на каком-либо признании в отношении корректности дат или содержания этих документов.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ инактивации вируса, имеющего липидную оболочку, включающий стадии: а) получения жидкости, включающей фактор VIII, обладающий активностью; b) смешивания три(н-бутил)фосфата, полиоксиэтиленоктилфенилового эфира и полисорбата 80 сорбитана моноолеата с жидкостью с созданием в результате этого смеси, в которой конечная концентрация три(н-бутил)фосфата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.), конечная концентрация полиоксиэтиленоктилфенило-вого эфира составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 10,0% (об./об.) и конечная концентрация полисорбата 80 сорбитана моноолеата составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0% (об./об.); и с) инкубации смеси в течение не более приблизительно 120 мин; где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 8°С; где смесь после инкубации, по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и где фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 25% от активности, имеющейся на стадии (а).
2. Способ по п.1, в котором концентрация три(н-бутил)фосфата составляет приблизительно 0,3% (об./об.), концентрация полиоксиэтиленоктилфенилового эфира составляет приблизительно 1,0% (об./об.) и концентрация полисорбата 80 сорбитана моноолеата составляет приблизительно 0,3% (об./об.).
3. Способ по п.1, в котором фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 50% от активности, имеющейся на стадии (а).
4. Способ по п.1, в котором фактор VIII после инкубации обладает активностью, составляющей по меньшей мере 75% от активности, имеющейся на стадии (а).
5. Способ по п.1, где жидкость представляет собой клеточный лизат, супернатант клеток, элюат с предшествующей стадии очистки или биологическую жидкость.
6. Способ по п.1, где фактор VIII представляет собой рекомбинантный фактор VIII.
7. Способ по п.1, где на стадии (с) смесь инкубируют в течение от приблизительно 10 до приблизительно 90 мин или от приблизительно 30 до приблизительно 60 мин.
1.
8. Способ по п.1, где обе стадии (b) и (с) осуществляются при температуре от приблизительно 2 до приблизительно 4°С.
9. Способ по п.1, где смесь после инкубации включает по меньшей мере в 100 раз менее ID50 жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку, чем перед инкубацией; менее 1Х101 КОЕ/мл жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; по существу, свободна от жизнеспособного вируса, имеющего липидную оболочку; и/или полностью свободна от жизнеспособного вируса, имеющего ли-пидную оболочку.
10. Способ по п.1, где вирус, имеющий липидную оболочку, представляет собой ДНК-вирус, РНК-вирус, обратно транскрибирующий вирус, вирус иммунодефицита человека, вирус Синдбис, вирус простого герпеса, вирус ложного бешенства, вирус Сендай, вирус везикулярного стоматита, вирус лихорадки западного Нила, вирус вирусной диареи коров, коронавирус, вирус артрита лошадей, вирус тяжелого острого респираторного синдрома, вирус мышиного лейкоза Молони, вирус коровьей оспы, вирус her-pesviridae, вирус poxviridae, вирус hepadnaviridae; вирус flaviviridae, вирус togaviridae, вирус coronaviridae, вирус deltavirus, вирус orthomyxoviridae, вирус paramyxoviridae, вирус rhabdoviridae, вирус bunyaviridae, вирус filoviridae, вирус retroviridae и/или вирус hepadnaviridae.
11. Способ по п.1, где способ дополнительно включает одну или более стадий после стадии (с), включая удаление три(н-бутил)фосфата из смеси; удаление полиоксиэтиленоктилфенилового эфира и полисорбата 80 сорбитана моноолеата из смеси и/или удаление нежизнеспособного вируса из смеси.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025783
- 1 -
025783
- 1 -
025783
- 1 -
025783
- 4 -