EA 025766B1 20170130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/025766 Полный текст описания [**] EA201190309 20091231 Регистрационный номер и дата заявки ESP200930265 20090604 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2009/009342 Номер международной заявки (PCT) WO2010/139352 20101209 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21701 Номер бюллетеня [**] ЛИПОПОЛИСАХАРИД OCHROBACTRUM INTERMEDIUM И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ Название документа [8] A61K 31/739 Индексы МПК [ES] Овехеро Гисасола Хуан Игнасио, [ES] Фресно Эскудеро Мануэль Сведения об авторах [ES] ЛАБОРАТОРИОС ОВЕХЕРО, С.А. Сведения о патентообладателях [ES] ЛАБОРАТОРИОС ОВЕХЕРО, С.А. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000025766b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Применение липополисахарида Ochrobactrum intermedium LMG3306 для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.

2. Способ получения липополисахарида Ochrobactrum intermedium LMG3306, включающий культивирование бактериального штамма О. intermedium LMG3306 на триптиказо-соевом бульоне и экстракцию липополисахарида путем следующих стадий: a) центрифугирование инактивированной культуры О. intermedium LMG3306; b) ресуспендирование полученного осадка в солевой суспензии; c) диализ при помощи очищенной воды и полиэтиленгликоля; d) осаждение при помощи четырех объемов метанола и 1% метанола, насыщенного ацетатом натрия; и e) лиофилизация полученного неочищенного ЛПС.

3. Способ по п.2, дополнительно включающий очистку неочищенного ЛПС при помощи следующих стадий: a) растворение неочищенного ЛПС в буфере (10 мМ Трис-HCl рН 7,5), необязательно при помощи ультразвука; b) добавление протеиназы К и инкубирование при комнатной температуре; c) получение очищенного ЛПС посредством ультрацентрифугирования и d) лиофилизация образца.

4. Применение композиции, содержащей липополисахарид Ochrobactrum intermedium LMG3306 и при необходимости один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов для получения лекарственного средства для модуляции иммунного ответа.

5. Применение по п.4, характеризующееся тем, что композиция содержит химически чистый ЛПС Ochrobactrum intermedium LMG3306, где нерастворимый компонент контаминирован другими соединениями не более чем на 0,2%.

6. Применение по любому из пп.4, 5, характеризующееся тем, что композиция содержит 0,5-120 мкг/мл ЛПС штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306.

7. Применение по любому из пп.4-6, где липополисахарид представляет собой гомогенную суспензию, в которой мицеллярная фаза стабильна при 4°С в течение периода более 1 года.

8. Применение по любому из пп.4-7, где рН композиции составляет от 2 до 12.

9. Применение по любому из пп.4-8 для получения лекарственного средства для модулирования иммунного ответа у млекопитающих.

10. Применение по п.9, где модулирование включает повышение иммунокомпетентности млекопитающих.

11. Применение по п.10, где модулирование иммунного ответа заключается в индукции дифференциации макрофагов, продукции ФНО, продукции ИЛ-12, продукции ИФН-гамма лимфоцитами селезенки и/или активации вирус-специфичных CD8 и CD4 Т-клеток.

12. Применение по п.10, где модулирование включает ингибирование продукции провоспалительных цитокинов у субъекта.

13. Применение по п.12, где провоспалительный цитокин представляет собой ИЛ-12.

14. Применение по любому из пп.4-8, где средство представляет собой адъювант для вакцин для лучшей иммунизации против специфичных вирусов и/или бактерий, содержащихся в вакцине.

15. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения септицемии.

16. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения эндотоксикоза.

17. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения инфекционных заболеваний.

18. Применение по п.17, где лекарственное средство предназначено для лечения и/или предупреждения инфекций у иммуносупрессированных животных.

19. Применение по любому из пп.17, 18, где лекарственное средство представляет собой адъювант для вакцин против инфекций, вызванных Leishmania.

20. Применение по п.19, где лекарственное средство используют в качестве адъюванта для вакцины против кожных инфекций, вызванных Leishmania.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Применение липополисахарида Ochrobactrum intermedium LMG3306 для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.

2. Способ получения липополисахарида Ochrobactrum intermedium LMG3306, включающий культивирование бактериального штамма О. intermedium LMG3306 на триптиказо-соевом бульоне и экстракцию липополисахарида путем следующих стадий: a) центрифугирование инактивированной культуры О. intermedium LMG3306; b) ресуспендирование полученного осадка в солевой суспензии; c) диализ при помощи очищенной воды и полиэтиленгликоля; d) осаждение при помощи четырех объемов метанола и 1% метанола, насыщенного ацетатом натрия; и e) лиофилизация полученного неочищенного ЛПС.

3. Способ по п.2, дополнительно включающий очистку неочищенного ЛПС при помощи следующих стадий: a) растворение неочищенного ЛПС в буфере (10 мМ Трис-HCl рН 7,5), необязательно при помощи ультразвука; b) добавление протеиназы К и инкубирование при комнатной температуре; c) получение очищенного ЛПС посредством ультрацентрифугирования и d) лиофилизация образца.

4. Применение композиции, содержащей липополисахарид Ochrobactrum intermedium LMG3306 и при необходимости один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов для получения лекарственного средства для модуляции иммунного ответа.

5. Применение по п.4, характеризующееся тем, что композиция содержит химически чистый ЛПС Ochrobactrum intermedium LMG3306, где нерастворимый компонент контаминирован другими соединениями не более чем на 0,2%.

6. Применение по любому из пп.4, 5, характеризующееся тем, что композиция содержит 0,5-120 мкг/мл ЛПС штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306.

7. Применение по любому из пп.4-6, где липополисахарид представляет собой гомогенную суспензию, в которой мицеллярная фаза стабильна при 4°С в течение периода более 1 года.

8. Применение по любому из пп.4-7, где рН композиции составляет от 2 до 12.

9. Применение по любому из пп.4-8 для получения лекарственного средства для модулирования иммунного ответа у млекопитающих.

10. Применение по п.9, где модулирование включает повышение иммунокомпетентности млекопитающих.

11. Применение по п.10, где модулирование иммунного ответа заключается в индукции дифференциации макрофагов, продукции ФНО, продукции ИЛ-12, продукции ИФН-гамма лимфоцитами селезенки и/или активации вирус-специфичных CD8 и CD4 Т-клеток.

12. Применение по п.10, где модулирование включает ингибирование продукции провоспалительных цитокинов у субъекта.

13. Применение по п.12, где провоспалительный цитокин представляет собой ИЛ-12.

14. Применение по любому из пп.4-8, где средство представляет собой адъювант для вакцин для лучшей иммунизации против специфичных вирусов и/или бактерий, содержащихся в вакцине.

15. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения септицемии.

16. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения эндотоксикоза.

17. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения инфекционных заболеваний.

18. Применение по п.17, где лекарственное средство предназначено для лечения и/или предупреждения инфекций у иммуносупрессированных животных.

19. Применение по любому из пп.17, 18, где лекарственное средство представляет собой адъювант для вакцин против инфекций, вызванных Leishmania.

20. Применение по п.19, где лекарственное средство используют в качестве адъюванта для вакцины против кожных инфекций, вызванных Leishmania.


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
025766 (13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации
и выдачи патента: 2017.01.30
(51) Int. Cl. A61K31/739 (2006.01)
(21) Номер заявки:
(22) Дата подачи:
201190309 2009.12.31
(54) ЛИПОПОЛИСАХАРИД OCHROBACTRUM INTERMEDIUM И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
(31) P200930265
(32) 2009.06.04
(33) ES (43) 2012.05.30
(86) PCT/EP2009/009342
(87) WO 2010/139352 2010.12.09
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЛАБОРАТОРИОС ОВЕХЕРО, С.А. (ES)
(72) Изобретатель:
Овехеро Гисасола Хуан Игнасио, Фресно
Эскудеро Мануэль (ES)
(74) Представитель:
Харин А.В., Котов И.О. (RU)
(56) VELASCO J. ET AL.: "Structural studies on the
lipopolysaccharide from a rough strain of Ochrobactrum anthropi containing a 2,3-diamino-2,3-dideoxy-d-glucose disaccharide lipid A backbone" CARBOHYDRATE RESEARCH, PERGAMON, GB, vol. 306, no. 1-2, 1 January 1998 (1998-01-01), pages 283-290, XP004204808 ISSN: 00086215 the whole document
VELASCO JULIAN ET AL.: "Evaluation of the relatedness of Brucella spp. and Ochrobactrum anthropi and description of Ochrobactrum intermedium sp. nov., a new species with a closer relationship to Brucella spp" INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, READING, GB, vol. 48, no. 3 PART 4, 1 July 1998 (1998-0701), pages 759-768, XP002520371 ISSN: 0020-7713, the whole document
VELASCO J. ET AL.: "Determination of the 0-specific polysaccharide structure in the lipopolysaccharide of Ochrobactrum anthropi LMG 3331" CARBOHYDRATE RESEARCH, PERGAMON, GB, vol. 287, no. 1, 7 June 1996 (1996-06-07), pages 123-126, XP004018635 ISSN: 0008-6215, the whole document
TEYSSIER CORINNE ET AL.: "Atypical 16S rRNA gene copies in Ochrobactrum intermedium strains reveal a large genomic rearrangement by recombination between rrn copies". JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 185, no. 9, May 2003 (2003-05), pages 2901-2909, XP002573610 ISSN: 0021-9193 the whole document
HOLMES В. ET AL.: "OCHROBACTRUM-ANTHROPI NEW-GENUS NEW-SPECIES FROM HUMAN CLINICAL SPECIMENS AND PREVIOUSLY KNOWN AS GROUP VD" INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, vol. 38, no. 4, 1988, pages 406-416, XP002573611 ISSN: 0020-7713, the whole document
US-A-5824310
VELASCO J. ET AL.: "Brucella abortus and its closest phylogenetic relative, Ochrobactrum spp., differ in outer membrane permeability and cationic peptide resistance" INFECTION AND IMMUNITY, vol. 68, no. 6, June 2000 (2000-06), pages 3210-3218, XP002573612 ISSN: 0019-9567, the whole document
SCHOLZ ET AL.: "Genetic diversity and phylogenetic relationships of bacteria belonging to the Ochrobactrum-Brucella group by recA and 16S rRNA gene-based comparative sequence analysis" SYSTEMATIC AND APPLIED MICROBIOLOGY, URBAN UND FISCHER VERLAG, DE, vol. 31, no. 1, 28 January 2008 (2008-01-28), pages 1-16, XP022510718 ISSN: 0723-2020, the whole document
BATHE STEPHAN ET AL.: "Genetic and phenotypic microdiversity of Ochrobactrum spp." FEMS MICROBIOLOGY ECOLOGY, vol. 56, no. 2, May 2006 (2006-05), pages 272280, XP002573613 ISSN: 0168-6496, the whole document
WO-A1-2009012166
CRYZ S.J. JR ET AL.: "Protection against fatal Pseudomonas aeruginosa burn wound sepsis by immunization with lipopolysaccharide and high-molecular-weight polysaccharide." INFECTION AND IMMUNITY MAR 1984, vol.43, no. 3, March 1984 (1984-03), pages 795-799, XP002573614 ISSN: 0019-9567, the whole document
GALANOS С. ЕТ AL.: "A NEW METHOD FOR THE
EXTRACTION OF R LIPOPOLYSACCHARIDES" EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, BLACKWELL PUBLISHING, BERLIN, DE, vol. 9, no. 2, 1
June 1969 (1969-06-01), pages 245-249, XP009019240 ISSN:
0014-2956, the whole document
Изобретение относится к выделению, очистке и характеристике липополисахарида (ЛПС) штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 и его применению в качестве иммуностимулятора у млекопитающих, способу получения фармацевтического соединения для лечения и/или предупреждения сепсиса и адъюванта вакцины для иммуносупрессированных животных и от Leishmania.
Область техники
Члены рода Ochrobactrum включены в подгруппу альфа-2 домена Proteobacteria. Они в основном являются почвенными обитателями, становясь патогенными только в случае тяжелобольных или пациентов с ослабленным иммунитетом, или в случае пациентов с постоянно находящимся катетером. Хотя в таких ситуациях Ochrobactrum может быть причиной менингита, остеомиелита, бактериемии и септицемии, эти бактерии не способны вызывать хронические инфекции сами по себе и элиминируются из обычных хозяев после удаления катетера (Cieslak, T.J., C.J. Drabick, and M.L. Robb. 1996. Pyogenic infections due to Ochrobactrum anthropi. Clin. Infect. Dis. 22:845-847).
Поскольку состав всех липополисахаридов, основного компонента наружной мембраны грамотри-цательных бактерий, соответствует общему принципу, предусматривающему полисахарид, прикрепленный к липидному компоненту, называемому липидом А, через специфический сахар, называемый 2-кето-3-дезоксиоктулозоновая кислота (КДО) (Rietschel, E.T., Schade, U., Jensen, M., Wollenweber, H.W., Lude-ritz, О. and Greisman, S.G. 1982. Bacterial endotoxins: chemical structure, biological activity and role in septicaemia. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 3:8), предполагали, что все молекулы ЛПС оказывают одинаковые биологические эффекты.
Однако данная концепция претерпела изменения в результате исследований, продемонстрировавших значительную разницу в способности некоторых видов ЛПС вызывать синтез цитокинов, данный эффект связан со структурными чертами части их липида A (Netea, M.G., van Deuren, M., Kullberg, B.J., Cavaillon, J.M. and van der Meer, J.W.M. 2002. Does the shape of lipid A determine the interaction of LPS with Toll-like receptors? Trends Immunol. 23:135).
Legionella pneumophila, грамотрицательная факультативная внутриклеточная бактерия, также сходная с Brucella как в отношении низкой эндотоксичности, так и химической структуры своего ЛПС, и в меньшей степени с таковыми, установленными для энтеробактериального ЛПС (Zahringer, U., Knirel, Y.A., Lindner, В., Helbig, J.H., Sonesson, A., Marre, R. and Rietschel, E.T. 1995. The lipopolysaccharide of Legionella pneumophilla serogroup 1 (strain Philadelphia 1): chemical structure and biological significance.
Prog. Clin. Biol. Res. 392:113.26).
Известно, что Ochrobactrum anthropi тесно связан с Brucellae (Velasco et.al. International Journal of Systematic Bacteriology 48 (1998) 759-768). Несмотря на их тесное филогенетическое родство, В. abortus и Ochrobactrum заметно отличаются по свойствам ОМ, и эти значительные различия по меньшей мере отчасти обусловлены небольшими изменениями в ЛПС (Velasco et.al. Infection and Immunity 68 (2000) 32103218).
Был определен полный остов кор-липида А ЛПС Ochrobactrum intermedium LMG 3301 и О-цепь Ochrobacrtum anthropi LMG 3331 (Velasco et.al. Carbohydrates Research 306 (1996) 123-126; Velasco et.al. Carbohydrates Research 306 (1998) 283-290; Velasco et.al. Infection and Immunity 68 (2000) 3210-3218).
Штамм Ochrobactrum intermedium LMG 3306 описан Velasco et.al. (International Journal of Systematic Bactreriology 48 (1998) 759-768), но несмотря на это ЛПС Ochrobactrum intermedium LMG 3306 не был описан ранее.
С другой стороны, приблизительно 900000 случаев сепсиса происходит ежегодно только в Соединенных штатах, вызывая около 210000 смертей и требуя затрат почти 17 миллиардов долларов. Сепсис представляет собой широко распространенное заболевание с возрастающей распространенностью и смертностью, варьирующей в пределах 27-48%. Септический шок является следствием сепсиса, зачастую летальным. Очень сильное воспаление, возникающее при инфекции в ходе сепсиса представляет собой мишень для ряда терапевтических воздействий. Несмотря на воспалительные аспекты сепсиса более 20 лет клинических испытаний с общими противовоспалительными агентами показали, что данный подход не слишком эффективен.
Патологические механизмы, приводящие к сепсису, являются комплексными и далеки от понимания. Сепсис включает системный воспалительный ответ с последующим компенсаторным противовоспалительным ответом. Баланс между ними является решающим для выживания хозяина. Более того, животные модели сепсиса не воспроизводят весь комплексный характер сепсиса у пациентов людей.
Недавно были предприняты попытки лечения таких эффектов посредством антагонистов Toll-подобных рецепторов (TLR), поскольку полагают, что большинство последствий септического шока являются результатом значительного высвобождения циркулирующего эндотоксина (ЛПС). Так, эриторан, структурный аналог части ЛПС липида А, действующий в качестве антагониста TLR4, присутствует в фазе II и демонстрирует уменьшение смертности пациентов с сильным сепсисом. Кроме того, ТАК-242 представляет собой ингибитор сигнальной трансдукции TLR4, снижающий уровни прововоспалитель-ных цитокинов, а также уменьшающий смертность в подгруппе пациентов с сильным сепсисом с высокими уровнями ИЛ-6.
В настоящее время существует множество инфекционных заболеваний, для которых нет доступных
вакцин. В некоторых из этих случаев неудача обусловлена отсутствием подходящего адъюванта для индукции соответствующего и правильного иммунного ответа. Для некоторых инфекционных агентов, таких как внутриклеточные бактерии, вирусы и большинство простейших, защитным иммунным ответом являются Т-хелперы типа 1 (Тх1), характеризующиеся продукцией гамма-ИФН. Напротив, защитный иммунный ответ против гельминтов представляет собой тип 2 (Тх2), характеризующийся продукцией ИЛ-4 (Fresno, M., M. Kopf, and L. Rivas. 1997. Cytokines and infectious diseases. Immunol. Today 18:56-8). Только некоторые из адъювантов приемлемы для вакцинного препарата человека, поскольку большинство из них токсичны, из-за повышенной индукции Тх 1. Алюминий, в действительности не являющийся адъювантом, применяют в большинстве вакцинных препаратов человека. Недавно значительный интерес привлек к себе агонист Toll-подобного рецептора (TLR) (Hoffman, Nature Reviews Drug Discovery 4, 879, 2005) (Kwissa; Expert Vaccine Rev., 6, G73, 2007). В настоящее время проанализированы некоторые антигены совместно с рядом агонистов различных TLR.
В заключение, одной из основных проблем любого вакцинного препарата, включая уже лицензированные, является то, что они редко работают у иммунносупрессированных пациентов. Кроме того, некоторые из них оказывают вторичные эффекты на этих пациентов (Kwissa et.al., 2007).
Полный остов кор-липида А погруженного шероховатого ЛПС (ЛПС, в котором отсутствует О-цепь и некоторые моносахарид из внешней части кора) дикого штамма Ochrobactrum intermedium LMG 3301 описан Velasco et.al. Carbohydrates Research 306 (1998)283-290; была определена О-цепь гладкого ЛПС дикого штамма Ochrobactrum anthropi LMG 3331 (Velasco et.al. Carbohydrates Research 306 (1996)123-126; и липид А и молекулярная масса полного ЛПС опубликованы Velasco et.al. Infection and Immunity 68 (2000)3210-3218.
Штамм Ochrobactrum intermedium LMG 3306 описан Velasco et.al. (international Journal of Systematic Bacteriology 48 (1998) 759-768), но несмотря на это гладкий ЛПС дикого Ochrobactrum intermedium LMG 3306 не был описан ранее.
Краткое описание изобретения
В настоящее время продемонстрировано, что липополисахарид штамма Ochrobactrum intermedium LMG 3306 (IM) является эффективным при лечении и/или предупреждении сепсиса, а также в качестве адъюванта вакцин для иммуносупрессированных животных и от лейшманиоза.
Таким образом, согласно первому аспекту настоящего изобретения оно относится к применению липополисахарида штамма Ochrobactrum intermedium LMG 3306 (IM) для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса, а также в качестве вакцинного адъюванта для им-муносупрессированных животных и от лейшманиоза.
Согласно воплощению настоящего изобретения оно предлагает применение липополисахарида штамма Ochrobactrum intermedium LMG 3306 (IM) для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения септического шока и эндотоксического шока.
Согласно другому воплощению настоящего изобретения оно предлагает применение липополиса-харида штамма Ochrobactrum intermedium LMG 3306 (IM) в качестве адъюванта вакцин от инфекционных заболеваний, как человека, так и животных.
Согласно частному воплощению настоящего изобретения оно предлагает применение IM для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения инфекций у иммунносупрессирован-ных животных, включая человека.
Согласно настоящему изобретению применения, описанные для липополисахарида штамма Ochrobac-trum intermedium LMG 3306 (IM), пригодны как для человека, так и для животных. Таким образом, ссылка на применение у животных на протяжении всего настоящего изобретения также включает человека.
Итак, иммуностимулятор млекопитающих лечит и предотвращает септицемию и эндотоксимию, обладает свойствами вакцинного адъюванта для иммунносупрессированных животных и обладает свойствами вакцинного адъюванта и защитным и лечебным эффектом на экспериментальной мышиной модели лейшманиоза стоп.
Показано, что IM (липополисахарид штамма Ochrobactrum intermedium LMG 3306) обладает широкой активностью в качестве иммуностимулятора, включая индукцию продукции ИЛ-12 в макрофагах;
уровни ФНО (фактор некроза опухолей), индуцированные ЛПС по изобретению значительно меньшие, чем индуцированные кишечным ЛПС, что приводит к отсутствию патологического эффекта;
ЛПС по настоящему изобретению индуцирует активацию Т-хелперов типа 1 (Тх 1) и продукцию гамма-ИФН.
Установлена связь данного соединения со способностью стимулировать иммунный ответ у млекопитающих. Таким образом, изобретение предлагает иммуностимулирующую композицию, содержащую липополисахарид штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 и, необязательно, один или более фармацевтически приемлемых эксципиента. Предпочтительно, модулирование иммунного ответа заключается в повышении иммунокомпетентности людей.
Изобретение относится к применению IM, иммунностимулятора млекопитающих, в качестве со
единения, которое предупреждает и лечит септицимию и эндотоксимию. В частности, изобретение связано с применением в качестве адъюванта с целью улучшения вакцинации нормальных животных и экспериментально иммуносупрессированных животных. В этой связи, в качестве примера его свойств адъ-юванта настоящее изобретение, в частности, относится к применению IM в качестве вакцинного адъю-ванта для экспериментальной инфекции лейшманиоза и лекарственного и защитного эффекта кожного лейшманиоза при помощи экспериментальной мышиной модели Leishmania major лейшманиоза стоп.
Настоящее изобретение относится к способу приготовления ЛПС штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 в качестве соединения для применения в области медицины в качестве иммуностимулятора млекопитающих.
Изобретение предлагает специфическую активность в качестве иммуностимулятора в области экспериментальных исследований в отношении коров, свиней, молочного скота и мышей:
влияние в отношении повышения нейтрализующих антител к вирусам IBR после специфической вакцинации в сочетании с настоящим изобретением;
индукция дифференциации макрофагов;
индукция ФНО в макрофагах;
индукция ИЛ-12 в макрофагах;
индукция продукции гамма-ИФН лимфоцитами селезенки; иммуностимулирующая активность через посредство рецепторов TLR4 и TLR2; влияние стимуляции Т клеток в дозозависимой манере.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способности липополисахарида (ЛПС) штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 стимулировать иммунный ответ млекопитающих. Таким образом, изобретение предлагает иммуностимулирующую композицию, содержащую липополисахарид штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 и по желанию один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Предпочтительно, модулирование иммунного ответа заключается в повышении иммуно-компетентности млекопитающих.
Настоящее изобретение также относится к способам модулирования иммунного ответа млекопитающего, предусматривающим введение ЛПС штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 или содержащей его фармацевтической композиции млекопитающему. Таким образом, изобретение также относится к применению иммуностимулирующей композиции для приготовления лекарственного средства для индукции общего клеточного иммунитета млекопитающих. Настоящее изобретение также относится к применению иммуностимулирующей композиции по изобретению при приготовлении лекарственного средства для индукции дифференциации макрофагов, продукции ФНО, продукции ИЛ-12, продукции ИФН-гамма лимфоцитами селезенки и активирования вирус специфичных CD8 и CD4 Т-клеток у млекопитающих, предусматривающему введение ЛПС О. intermedium LMG3306 млекоСпоигтлааюснщое мдру.угому воплощению иммуностимулирующую композицию по изобретению применяют в качестве адъюванта вакцин для лучшей иммунизации против определенных вирусов и бактерий, содержащихся в вакцине.
Большинство работ, связанных с предотвращением эндотоксического шока посредством низких сублетальных доз этих или другого менее токсичного ЛПС, показали, что требуется предварительная инокуляция (Hatao, F.et.al., The induction of super-resistance using synthetic lipopolysaccharide receptor agonist rescues fatal endotoxemia in rats without excessive immunosuppression. Shock 2005; 23 (4): 365-70.). Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что липополисахарид штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 не требует предварительного периода десенсибилизации и только инокулирование липополисахарида штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 совместно с ЛПС защищало от токсического эффекта.
Также большинство опубликованных данных обнаруживают родство между ними, супрессию ФНО in vitro или в клеточных линиях и эффекты десенсибилизации in vivo (см., например, Lehner, MD, et.al., Lipopolysaccharide and Highly Puriefed Lipoteichoic Acid Via Different Toll-like receptors Independent of Paracrine Mediators. 2,001. J.Immunol. 166: 5161-5167). Однако авторы изобретения на данный момент показали, что липополисахарид штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 хотя и сохраняет действие ЛПС in vivo, но не снижает секрецию ФНО или ИЛ-12 в линиях макрофагов, а также в перитонеальных макрофагах или клетках селезенки. Предварительные результаты in vivo также подтверждают, что липо-полисахарид (IM) штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 способен существенно снижать уровни ФНО, индуцируемые ЛПС, тем же образом. В любом случае не существует прямой зависимости между уровнями ФНО и иммунитетом. Данные результаты явились неожиданными.
Другие гипотезы объясняют эффект десенсибилизации повышенной продукцией ИЛ-10 или ФНО-Р (Randow, F.et.al., Mechanism of endotoxin desensitization: involvement of 35 interleukin 10 and transforming growth factor beta. J. Exp. Med. 1995. 181, 1887-1892). Однако, по-видимому, это не так, поскольку ИЛ-10 тяжело индуцировать in vitro посредством IM, видимо что-то ингибирует продукцию ИЛ-10 (хотя это не значительно) в перитонеальных макрофагах или клетках селезенки, и уровни ИЛ-10, индуцируемого ЛПС, незначительно повышаются посредством IM за исключением случая клеток селезенки из C57BL/6 мышей.
Другой интересный аспект представляет собой способность IM модулировать иммунные ответы между патогенами. Так, применение системы инфекции Leishmania major показало, что IM усиливает
действие иммуногенного антигенного экстракта Leishmania аналогично CpG. CpG является известным иммунномодулятором, который посредством своего соединения с TLR9 усиливает Тх1 ответ (являющийся защитой против патогенов, таких как Leishmania и многие другие) и патентован в качестве имму-номодулятора и вакцинного адъюванта. Однако IM не изменяет профиль Тх 1/Тх 2 in vivo так, как его усиливает CpG. Это может означать, что IM будет лучше адъюванта CpG при инфекциях, где как гуморальный (Тх 2), так и клеточный (Тх 1) ответы играют важную роль в защите. Пожалуй, более важно продемонстрировать, что IM может не только индуцировать защитный ответ, но и защищать напрямую, т.е. оказывая терапевтический эффект на инфекцию, вызванную Leishmania.
На всем протяжении описания и формулы изобретения слово "содержит" и варианты этого слова не предназначены для исключения других технических особенностей, добавок, компонентов или этапов. Дополнительные цели, преимущества и особенности изобретения будут ясны специалистам в области техники после изучения описания или могут быть изучены при применении изобретения. Следующие примеры и рисунки предложены в качестве иллюстраций и не ограничивают настоящее изобретение. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает все возможные комбинации частных и предпочтительных воплощений, описанных в данном документе.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 отображает предупреждение токсического эффекта, обусловленного ЛПС E.coli, в результате применения IM. Группы из 5 мышей обрабатывали при помощи ЛПС (1,75 мг) или 0,6 мкг/кг (доза 60) или 3 мкг/кг (доза 300) IM (ЛПС Ochrobactrum intermedium) по отдельности или совместно и оценивали выживаемость;
фиг. 2 - лечение эндотоксического шока, вызванного ЛПС. Группы из 5 животных обрабатывали при помощи ЛПС (2 мг/животное). После 24 ч им инъецировали 0,6 мкг/кг (доза 60) или 3 мкг/кг (доза 300) IM (ЛПС Ochrobactrum intermedium) и оценивали выживаемость;
фиг. 3 - предупреждение перитонита, вызванного Е. coli. Группы из 5 мышей инфицировали при помощи Е. coli (1E7 единиц для образования колоний, КОЕ); после 24 ч животных инокулировали при помощи 0,6 мкг/кг (доза 60) или 6 мкг/кг (доза 600) IM (ЛПС Ochrobactrum intermedium) и оценивали выживаемость (верхняя панель) и клинические симптомы (нижняя панель);
фиг. 4 - лечение перитонита, вызванного E.coli. Группы из 5 мышей инфицировали при помощи E.coli (1E8 единиц для образования колоний; КОЕ); после 4 ч животных инокулировали при помощи 6 мкг/кг (доза 600) IM (ЛПС Ochrobactrum intermedium) и оценивали выживаемость (верхняя панель) и клинические симптомы (нижняя панель);
фиг. 5 - защитный иммунитет против лейшманиоза и общие характеристики схемы иммунизации способа действия. Как приведено на фигуре, взаимодействие паразитов с макрофагами вызывает иммунный ответ, который, в случае если он основан на активации Тх 1 лимфоцитов, является эффективным и успешным по отношению к паразитам, в то время как ответ при помощи Тх 2 является типичным, а инфекция станет манифестной;
фиг. 6 - протокол иммунизации для оценки потенциального адъюванта IM 25 (липополисахарид Ochrobactrum intermedium LMG3306) в вакцине против лейшманиоза. Группы из 5 мышей вакцинировали при помощи антигена SLA самого по себе или в сочетании с CpG или IM на день 0, 15 и 30. На 60-й день каждому животному инокулировали 1000 промастигот в подушечку любой стопы и оценивали развитие поражения и иммунные параметры;
фиг. 7 - развитие поражения у животных, вакцинированных при помощи SLA и SLA-CpG (верхняя панель) или при помощи SLA-IM в качестве адъюванта. Она количественно определяет опухание подушечки стопы вследствие инфекции;
фиг. 8 - макроскопическое состояние травмы на подушечке стопы животных, вакцинированных при помощи SLA и SLA-CpG, SLA-IM по сравнению с контролем (PBS). На фигуре приведены фото животных в контрольной группе, одного, вакцинированного при помощи SLA, одного - при помощи SLA-CpG и шести, вакцинированных при помощи SLA-IM, в течение шести недель инфекции;
фиг. 9 - количественную оценку числа паразитов в селезенке и лимфоузлах (DLN), где иммунизация при помощи SLA не вызывает какого-либо снижения числа паразитов, подсчитанных в приведенных органах, по отношению к контрольной группе, в то время как SLA-CpG снижало значение приблизительно на 2 log, которые были значимы, и где в группе SLA-IM были получены сходные результаты по снижению;
фиг. 10 - графические результаты оценки Тх1 ответа (у-ИФН) и/или Тх2 (ИЛ-4) в клетках селезенки умерщвленных животных, в то время как эти клетки изолировали и стимулировали in vitro при помощи SLA;
фиг. 11 - оценку Тх 1/Тх 2 ответа в зависимости от анализа уровней Leishmania в отношении изоти-пов специфичных антител IgG2a (Tx 1) и IgG1 (Тх2);
фиг. 12 - протокол оценки терапевтического эффекта IM при экспериментальной инфекции, вызванной Leishmania;
фиг. 13(А) - развитие поражения у животных, вакцинированных при помощи IM. Она количественно определяет опухание подушечки стопы вследствие инфекции. (В) - макроскопическое состояние поражений подушечки стопы животных, вакцинированных при помощи IM, по сравнению с контрольной
группой (PBS). Включены фото одного животного, принадлежащего к контрольной группе, одного животного вакцинированного при помощи CpG, и всех шести животных, вакцинированных при помощи SLA-IM, в течение шести недель инфекции. (С) - количественную оценку числа паразитов в селезенке и лимфоидных узлах (DLN) после семи недель;
фиг. 14 - сравнительную таблицу между контрольным образцом PBS, CpG и IM для IgG1 и IgG2a антител, включая соотношение между ними;
фиг. 15 - схему протокола, примененного для анализа роли адъюванта RT у иммунносупрессиро-ванных животных. Группам из 5 животных снижали иммунитет при помощи дексаметазона и вакцинировали при помощи SLA, SLA-CpG или SLA-IM. После 24 ч животных инфицировали и затем повторно инфицировали на 8-й день. После умерщвления на 60-й день оценивали развитие поражения и иммунные параметры;
фиг. 16 - эффект адъюванта IM после вакцинации при помощи SLA в клетках селезенки мыши. Клетки селезенки культивировали с или без антигена SLA (10 г/мл) в течение 72 ч и пролиферацию оценивали посредством включения тримидина в ДНК спустя период 72 ч. Результаты показывают среднее по двум экспериментам в трех повторностях с применением 6 животных в каждом эксперименте;
фиг. 17 - воздействие на продукцию ИЛ-4 клетками селезенки вакцинированных животных. Клетки селезенки изолировали из различных животных, стимулировали SLA (10 г/мл) и анализировали секрецию ИЛ-4 посредством ELISA;
фиг. 18 - воздействие ИЛ-4 и гамма-ИФН клеток селезенки мышей, вакцинированных и обработанных при помощи дексаметазона (DEX);
фиг. 19 - клеточный ответ по отношению к SLA у вакцинированных животных. Отображает специфичный ответ в отношении гамма-ИФН и ответ по отношению к SLA спустя 17 дней после добавления SLA in vitro. Отображает соотношение секреции гамма-ИФН (Тх1)/ ИЛ-4(Тх2);
фиг. 20 - дифференциацию клеток J774 после добавления иммуностимулирующего соединения по сравнению с ЛПС E.coli в макрофагах Raw. Иммуностимулирующее соединение по изобретению индуцирует дозозависимое ингибирование дифференциации макрофагов J774. Данный эффект приблизительно в 500 раз меньше, чем таковой, наблюдаемый при помощи ЛПС E.coli на основании массы/объема в J774 или Raw макрофагах (не показано);
фиг. 21 - нестимулированные макрофаги, не синтезирующие ФНО, определяемый посредством ELISA. Иммуностимулирующая композиция по изобретению при дозах 0,1-10 мкг/мл индуцирует в дозо-зависимой манере значительные реактивные уровни продукции ФНО до 4000 пг/мл в J774 макрофагах (фиг. 21а), а также в необработанных клетках (не приведено). Эффект иммунностимулятора по изобретению, хотя и значительно высокий, все же был в 500 раз менее сильным, чем ЛПС E.coli (фигура 21b);
фиг. 22 - иммуностимулирующую композицию по изобретению, индуцирующую продукцию ФНО в макрофагах как из Balb/c, так и из С57В16 линий мышей, хотя и с меньшей силой, чем ЛПС Е.аэИ в эквивалентных концентрациях (фиг. 3);
фиг. 23 - иммунностимулятор по изобретению при дозе 10 мкг/мл, индуцирующий большие количества ИЛ-12 в перитонеальных макрофагах, как из C57BI/6, так и из Balb/c (фиг. 4);
фиг. 24 - стимулирование секреции большого количества гамма-ИФН клетками селезенки обеих линий мышей, напоминающее стимулирование Тх 1 ответа, характеризующегося продукцией гамма-ИФН. Иммуностимулирующая композиция по изобретению при дозах 1-10мг/мл индуцирует большие количества гамма-ИФН лимфоцитами селезенки как из C57BI/6, так и из Balb/c;
фиг. 25 - иммуностимулирующую композицию по изобретению, индуцирующую ФНО в перитоне-альных макрофагах из C57BI/6, при этом отсутствие TLR-2 только частично предотвращает активность и отсутствие TLR-4 в макрофагах сильно снижало индукцию;
фиг. 26 - иммуностимулирующую композицию по изобретению, индуцирующую ИЛ-12 в перито-неальных макрофагах из C57BI/6, при этом отсутствие TLR-2 только частично предотвращает активность, и отсутствие TLR-4 в макрофагах сильно снижало индукцию;
фиг. 27 - стимулирование индукции секреции гамма-ИФН, которая была существенно ниже в клетках селезенки из C57BI/6 tlr2-/- и почти полностью отсутствовала в случае с C57BI/6 ^^-/-клеткой при применении 10 мг иммуностимулирующего соединения;
фиг. 28 - Т-клеточный ответ CD4 (фиг. 28а) или CD8 (фиг. 28b), индуцированный после инфекции вирусом Lymphochoremeningitis в клетках селезенки из В6 С57 мышей и добавления различных стимулов; слева направо: без пептида; LCMV NP 396 пептид (PEPTIDE NP 396); только среда; ФМА и ионо-мицин; и иммуностимулирующее соединение в различных концентрациях;
Подробное описание частных воплощений/примеры
Термин "иммуностимулирующая композиция" определен в настоящем документе в широком смысле и относится к любому типу биологического агента во вводимой форме, способному стимулировать иммунный ответ млекопитающего, инокулированного при помощи продукта.
Как применено в данном документе, термин "очищенный" в отношении ЛПС означает, что ЛПС подвергают процедурам фракционирования или очистки, как, например, но не ограничено, таким проце
дурам, раскрытым ранее, для удаления различных других компонентов, и композиции которого в значительной степени сохраняют экспрессируемую ими биологическую активность. Где применен "практически очищенный", это обозначение будет относится к композиции, в которой ЛПС образует главный нерастворимый компонент композиции. Например, "практически очищенный ЛПС" означает, что более чем приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95% нерастворимого компонента раствора или композиции представляет собой ЛПС по настоящему изобретению.
Согласно предпочтительному воплощению иммуностимулирующая композиция включает ЛПС штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 в практически очищенной форме, где нерастворимый компонент контаминирован другими соединениями менее чем на 0,2% (ДНК, РНК, белки, глюканы, липиды...).
"Иммунологически эффективное количество" относится к количеству иммуногена, достаточному для индукции детектируемого клеточного или гуморального иммунного ответа у млекопитающих.
"Защитный иммунный ответ", как употреблено в данном документе, относится к клеточному или гуморальному иммунному ответу, который предотвращает или замедляет инфекцию или заболевание, вызванное определенным патогеном.
Соединение по изобретению может быть приготовлено при помощи обычных способов приготовления на основе эксципиента, рН и концентрации.
Согласно воплощению по изобретению липополисахарид выделяют из штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306 посредством следующих стадий:
a) центрифугируют инактивированную культуру О. intermedium LMG3306;
b) ресуспендируют полученный осадок в суспензии в солевом растворе;
c) диализуют при помощи очищенной воды и полиэтиленгликоля;
d) осаждают при помощи четырех объемов метанола и 1% метанола, насыщенного ацетатом натрия;
e) высушивают сублимацией для получения неочищенного ЛПС. Согласно предпочтительному воплощению после высушивания сублимацией неочищенного ЛПС, его очищают при помощи следующих стадий:
1) растворение неочищенного ЛПС в буфере (10 мМ Трис-HCl рН 7,5), по желанию с применением
ультразвука;
2) добавление протеиназы K и инкубирование при комнатной температуре;
3) получение очищенного ЛПС при помощи ультрацентрифугирования;
4) лиофилизация образца.
Более подробное описание предпочтительного воплощения способа приготовления иммуностимулирующего соединения по изобретению представлено на следующей блок-схеме.
Блок-схема способа экстракции ЛП из штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306:
Экстракт Супернатант
Ресуспендирование в очищенной воде I
Высушивание неочищенного ЛПС сублимацией
Очистка (энзиматическая обработка) Высушивание сублимацией очищенного ЛПС
Процесс получения включает следующие стадии:
i) размораживание рабочего посевного материала бактерий (штамм LMG3306). Приготовление преинокулята.
1. Приготовление 1 л триптиказо-соевого бульона (ТСБ).
2. Приготовление пробирки с 60 мл ТСБ.
3. Взятие крупинки из сосуда с замороженным посевным материалом и внесение его в пробирку с
60 мл ТСБ.
4. Инкубирование при 37°С±0,1 в течение 24 ч с покачиванием.
5. Контроли в преинокуляте: идентификационный контроль и контроль чистоты: проверка морфологии колоний и микроскопической морфологии культуры.
ii) Рост в контрольных ферментерах. Приготовление инокулята.
1. Приготовление культуральной среды ТСБ, дополненной 2 % сахарозы.
2. Приготовление инокуляционной бутылки с 5 л ТСБ, дополненной 2% термически обработанной сахарозы, и с рН 6,5±0,15.
3. Внесение преинокулята в инокуляционную бутылку с культуральной средой.
4. Инкубирование при 37°С±0,1 в течение 24 ч с покачиванием.
5. Контроли в инокуляте: идентификационный контроль и контроль чистоты: проверка морфологии колоний и микроскопической морфологии культуры.
Культивирование.
1. Очистка и стерилизация ферментаторов.
2. Приготовление 400 л ТСБ, дополненной 2% сахарозы.
3. Заполнение ферментеров 400 л ТСБ, дополненной 2% сахарозы с рН доведенным до 6,75+0,15.
4. Внесение инокулятов в ферментеры с культуральной средой.
5. Инкубирование при 37°С+0,1 в течение 24 ч при максимальном покачивании 50 об/мин.
6. Контроли культивирования: идентификационный контроль и контроль чистоты: проверка морфологии колоний и микроскопической морфологии культуры.
Инактивация.
1. Перенесение культуры в инактивационный резервуар посредством стерильного переноса.
2. Добавление раствора формальдегида до конечной концентрации 0,4% и инкубирование при температуре 37°С при 10 об/мин в течение 3 дней.
Центрифугирование.
1. Соединение ферментеров с центрифугой непрерывного действия и центрифугирование содержимого ферментеров.
2. Разливание инактивированной культуры в пластиковые бутылки емкостью 10 л. Хранение при 4°С до использования.
iii) Выполнение способа экстракции ЛПС, описанного ниже.
1 - Центрифугирование инактивированной культуры Ochrobactrum intermedium LMG3306. Удаление супернатанта.
2 - Ресуспендирование полученного осадка в солевом растворе: 200 г/л 15мМ NaCl.
3 - Добавление фенола в водный раствор из расчета 90% и 65°С.
4 - Покачивание в течение 20 мин при 65°С. Охлаждение смеси до 10°С.
5 - Центрифугирование при 9000 об/мин в течение 20 мин. Выдерживание при 4°С в течение 24 ч.
6 - Диализ. Сначала при помощи очищенной воды и затем при помощи полиэтиленгликоля.
7 - Осаждение при помощи четырех объемов метанола и при помощи 1% метанола, насыщенного ацетатом натрия.
8 - Центрифугирование при 9000 об/мин в течение 20 мин. Удаление супернатанта. Ресуспендиро-вание экстракта при помощи очищенной воды и покачивания.
9 - Повторение этапа 7.
10 - Лиофилизация образца для получения неочищенного ЛПС.
iv) Очищение ЛПС согласно следующему способу.
iv)
1. Растворение 100 мг неочищенного ЛПС в 20 (5 мг/мл) буфера (10 мМ Трис-HCl рН 7,5) при помощи ультразвука. Применение 5-10 мг ЛПС в качестве контроля.
2. Добавление 0,5 мл протеиназы К (50 мкг/мл или 5 мкг протеиназы К на мг ЛПС). Инкубирование при комнатной температуре в течение 12 ч при перемешивании и мягком покачивании.
3. Получение очищенного ЛПС посредством ультрацентрифугирования (100000 об/мин, 6 ч). Ре-суспендирование осадка в очищенной воде.
4. Лиофилизация образца.
v) Вычисление концентрации ЛПС для приготовления основного объема раствора, как описано ниже. Материалы и реагенты.
1. 1,25 Н H2SO4: 6,66 мл коммерческого реагента в DD H2O до 100 мл.
2. 0,042 Н периодная кислота: 0,48 г периодной кислоты (парапериодная кислота H15IO6) в 100 мл 0,125 N H2SO4.
3. 2% арсенит натрия в 0,5 Н HCl: (8,3 мл концентрированной HCl до 200 мл H2O).
4. Тиобарбитуровая кислота (Sigma): 0,3% рН 2 (растворение в DD H2O при 50°С). Применяют в течение 15 дней.
5. Диметилсульфоксид.
6. Стандарты: КДО (молекулярная масса=255,1) (Sigma, хранение при -20°С). Дезоксирибоза (молекулярная масса=136) (Sigma, хранение при -20°С).
7. ЛПС, количественно определенный из предыдущей части.
8. Стеклянные пробирки (очищенные при помощи хромовой смеси или эквивалента) со стеклянными шариками.
9. Спектрофотометр.
Процесс.
1. Приготовление пробирок со стандартами КДО (0,05 мкг), дезоксирибозой (0,025 мкг), ЛПС, количественно определенным из предыдущей части (0,2 мкг) и холостого раствора (200 мкл Н2О).
a) В случае если образец представляет собой ЛПС, экстрагированный и лиофилизированный, взве-
шивают 0,2 мкг и готовят одну пробирку.
b) В случае если образец представляет собой конечный продукт, готовят пробирку 200 мкл.
В пробирки добавляют воду до 200 мкл.
2. Пробирки с образцами помещают в лед, добавляют 20 мкл 1,25 N H2SO4 в каждую пробирку и кипятят их, закрытые стеклянными шариками в течение ровно 20 мин. Охлаждают их на льду. Со стандартами данный этап не выполняют.
3. Добавляют незамедлительно 0,25 мл периодной кислоты к образцам и стандартам, перемешивают и инкубируют их при комнатной температуре в течение 20 мин (отсчет с первой пробирки). Для добавления периодной кислоты пробирки располагают в том же порядке, что и при добавлении H2SO4.
Время гидролиза оптимизировали, поскольку количество измеренного КДО зависит от растворения КДО, а также его деградации при условиях гидролиза (20 мин достаточно для ЛПС Ochrobactrum intermedium LMG3306).
4. К пробиркам в том же порядке, что и в п.3, добавляют 0,5 мл арсенита натрия, перемешивают на вортексе и выдерживают 2 мин после добавления в первую пробирку (желтый цвет, который появляется при добавлении реагента исчезает в это время).
5. Немедленно добавляют 2 мл тиобарбитуровой кислоты к каждой пробирке в том же порядке что и ранее. Затем их кипятят со стеклянными шариками в течение 20 мин.
6. Добавляют ровно 1 мл ДМСО (избегая взмучивания) к каждой пробирке до их охлаждения в емкости с водопроводной водой.
7. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Включают спектрофотометр за 30 мин до начала для стабилизации лампы.
8. Считывают каждую пробирку при 552 и 536 нм (максимальная абсорбция КДО и дезоксирибозы соответственно). Могут быть применены пластиковые кюветы.
Вычисления.
Mk552=Abs552/мкмольk; Мк536, Md552 и Md536 вычисляют таким же образом.
Md536Abs552 - Md552Abs536
мкмоль КДО
Mk552 Md536 - Мк536 Md552
k: КДО; d: дезоксирибоза; Abs: абсорбция.
vi) Гомогенность смеси до завершающего процесса осуществляли, как описано ниже.
Проверку однородности процесса количественного анализа осуществляли дважды в течение приготовления продукта и согласно EMEA/CVMP/598/99 "Note for guidance on process validation"
в конце экстракции ЛПС из инактивированной культуры Ochrobactrum intermedium LMG3306 до ее обогащения;
проверка количества ЛПС в конечном продукте.
Процесс проверки осуществляют в конце периода экстракции. Количества, применяемые в аналитическом способе значительно выше таковых, вычисленных в конечном продукте. При применении данного способа необходимо знать концентрацию экстрагируемого ЛПС.
Количественный анализ ЛПС выполняют на основании количественного анализа одного из его компонентов, КДО. КДО представляет собой часть молекулы ЛПС, и ее количество всегда постоянно для определенного ЛПС, но различно для ЛПС разных бактерий. У Ochrobactum intermedium LMG3306 в каждой молекуле ЛПС присутствуют две молекулы КДО.
Количественный анализ выполняют посредством спектрофотометрии.
Способ количественного анализа КДО не является специфичным в случае, когда образец представляет собой экстрагируемый ЛПС, поскольку любая остаточная дезоксирибоза (ДНК компонент), элиминируемая в конце процесса экстракции и очистки ЛПС, может препятствовать испытанию из-за абсорбции при максимальной длине абсорбции КДО (552 нм).
Проверка количественного анализа КДО при помощи стандартного КДО продемонстрирует, что КДО вычислен линейно, точно и безошибочно. Отсутствие специфичности способа в случае контаминации образца ЛПС дезоксирибозой разрешают при помощи поправочной формулы. Данная формула приводит в соответствие получаемое теоретическое значение КДО до реального значения, исключая влияние дезоксирибозы, присутствующей в образце.
Линейность количественного анализа дезоксирибозы будет показывать, что этот компонент ведет себя линейно не только сам по себе, но и в качестве контаминанта ЛПС.
Каждый раз при применении данного способа образцы с различными концентрациями стандартного КДО, образцы с различными концентрациями дезоксирибозы, образцы с различными концентрациями ЛПС предварительно определяют количественно, и образцы с различными концентрациями тестового образца применяют и их всех измеряют при максимальной длине волны абсорбции дезоксирибозы (552 нм).
Исходя из полученных результатов выполняют следующие этапы:
стандартная прямая линия со стандартным КДО: проверка линейности;
стандартная прямая линия со стандартной дезоксирибозой: проверка линейности;
прямая линия с ЛПС, определенным ранее. Проверка способа. Проверка линейности;
вычисление отношения между значениями абсорбции, полученными для каждого образца, нахождение нумератора абсорбции при 552 нм для стандартного КДО, для предварительно определенного ЛПС и для тестовых образцов, и абсорбции при 536 нм для стандартной дезоксирибозы.
Для применения формулы берут значения концентрации тестовых образцов, для которых значения отношений близки к таковым, полученным из концентраций стандартного КДО и стандартной дезокси-рибозы, при условии что выбранные значения лежат в пределах стандартной прямой линии. Если значение лежит вне пределов стандартной прямой линии, вместо него берут самое близкое значение.
Применение формулы определяет КДО в микромолях в тестовом образце.
Настоящее изобретение в дальнейшем предлагает фармацевтические композиции, содержащие ЛПС иммуностимулирующее соединение, предлагаемое в данном документе в смеси с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами. Приемлемые носители будут зависеть от состояния, подлежащего лечению, а также от пути введения. Станет понятно, что фармацевтические композиции по изобретению могут быть применены в качестве адъювантов для повышения иммунного ответа по отношению к антигену или повышения определенных активностей клеток иммунной системы или в некоторых случаях в качестве профилактической или терапевтической композиции для предупреждения или лечения отдельных состояний у субъекта.
Таким образом, в одном воплощении настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую ЛПС по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, где ЛПС присутствует в количестве эффективном для модулирования иммунного ответа, которое представляет собой количество соединения, требуемое для достижения желаемого эффекта в области стимулирования желаемого иммунного ответа, лечении или подавлении заболевания или состояния. Фармацевтические композиции также могут действовать в качестве адъюванта при одновременном введении с антигеном.
Иммуностимулирующая композиция по настоящему изобретению проявляет сильные иммуностимулирующие эффекты при введении в широких пределах доз и соотношений. Согласно предпочтительному воплощению иммуностимулирующая композиция содержит между 0,5 и 120 мкг/мл ЛПС. Более предпочтительно композиция содержит между 0,5 и 10 мкг/мл ЛПС.
Согласно предпочтительному воплощению липополисахарид представляет собой гомогенную суспензию, в которой мицелиарная фаза стабильна при 4°С в течение периода более 1 года.
Предпочтительно рН иммуностимулирующей композиции по изобретению составляет между 2-12.
Количество иммуностимулятора, вводимого совместно с дозой вакцины, обычно выбирают как количество, которое вместе с вакциной индуцирует иммунозащитный ответ без значительных вредных побочных воздействий при обычных вакцинах. Такое количество будет также зависеть от специфичности применяемых иммуногенов и того, насколько они представлены. Обычно ожидают, что каждая доза будет содержать приблизительно 1-1000 мкг антигена и 0,1-200 мкг иммуностимулятора, наиболее типично приблизи
тельно 2-100 мкг антигена и 0,5-150 мкг иммуностимулятора и предпочтительно 5-50 мкг препарата антигена и 1-75 мкг иммуностимулятора. Разумеется, вводимые дозы могут зависеть от возраста, массы, типа сопутствующего лечения, если требуется, и природы вводимых антигена и иммуностимулятора.
Способ введения иммуностимулирующей композиции по изобретению может быть любым приемлемым способом, обеспечивающим общую иммуностимуляцию. Однако иммуностимулирующую композицию предпочтительно вводят парентерально посредством внутримышечного или подкожного пути. Более предпочтительно иммуностимулирующую композицию вводят подкожно. Также, при желании, могут быть применены другие способы введения, таким образом, примеры композиций по изобретению включают жидкие препараты для введения через отверстие, например оральные, назальные, анальные, вагинальные и т.д., такие как суспензии, сиропы или эликсиры; и препараты для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, введения путем инъекции), таких как стерильные суспензии или эмульсии. В таких композициях иммуностимулирующая композиция по изобретению может быть в смеси с приемлемым носителем, разбавителем или эксципи-ентом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза и т.п.
Соответствующая иммунопротекция и нетоксичная доза таких доз могут быть легко определены специалистами в области техники, т.е. соответствующее иммунозащитное и нетоксичное количество штамма по данному изобретению, содержащееся в продукте по данному изобретению, может быть в диапазоне эффективных количеств ЛПС. Не существует минимального рекомендованного возраста для применения, более того, показаны некоторые исследования, выполненные в первый день.
Разумеется, в случае необходимости введение может быть повторено с приемлемыми интервалами. Предпочтительно инструкция по применению представляет собой следующее:
первое применение 0,1 мкг/кг массы тела (м.т.) посредством внутрикожного пути;
второе применение в той же дозе после 15 дней.
Дальнейшее применение: хорошо зарекомендовало себя применение в течение 6 месяцев - 1 года (0,1 мкг/кг м.т., подкожно).
Пример 1. Лечение и предотвращение эндотоксемии.
Для этого мы применяли ЛПС из E.coli в острой модели на Balb/c мышах. Во-первых, мы определяли дозу ЛПС E.coli, которая приводит к 100% смертности в течение периода 6 дней (летальная доза 100).
ЛПС из штамма E.coli О111:В4 был закуплен у коммерческого дома SIGMA (St.Louis, МО, USA). Во всех исследованиях применяли фосфатно-солевой буфер в качестве разбавителя ЛПС. Во всех случаях применяемым наполнителем был фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Подходящую дозу ЛПС для исследований выживаемости определяли посредством кривой зависимости от дозы, где повышающие дозы ЛПС вводили самкам BALB/c интраперитонеально (ИП).
Предупреждение летальных эффектов эндотоксемии.
Самок BALB/c мышей, испытывающих эндотоксемию, обрабатывали или не обрабатывали при помощи 2 различных доз IM, 0,6 мкг/кг (доза 60) или 3 мкг/кг (доза 300), ИП, 24 ч перед введением ЛПС (Е. coli 0111 :В4). ЛПС инъецировали ИП в количестве 1,75 мг/мышь.
Для обеспечения эквивалентной регидратации при сепсисе все инъекции делали в одинаковом объеме.
IM при обеих дозах полностью предотвращал ЛПС ассоциированную смерть животных в результате эндотоксического шока из-за ЛПС E.coli. Более того, животные, обработанные IM, не проявляли каких-либо признаков, ассоциированных с септическим шоком (фиг. 1). Примененная доза ЛПС была значительно выше, чем доза IM. Таким образом, маловероятно, что IM (ЛПС Ochrobactrum intermedium 3306) может перебороть ЛПС.
Лечение эндотоксического летального шока.
Основной проблемой сепсиса обычно является не предупреждение, а скорее лечение при начале процесса. Для исследования этого 5 мышей инфицировали ИП (интраперитонеально) при помощи 2 мг/животное ЛПС (E.coli: 0111: В4) и 24 ч спустя обрабатывали ИП при помощи 0,6 мкг/кг (доза 60) или 3 мкг/кг (доза 300) ЛПС IM. IM оказывал защитное воздействие в отношении ЛПС-индуцированной смертности. Таким образом, к 72 ч после лечения плацебо все животные погибали. Однако лечение IM приводило к выживанию 20% животных и значительно задерживало их смерть. Это означает, что IM способен к частичному вылечиванию мышей, испытавших эндотоксический шок (фиг. 2).
Неожиданно, животные, обработанные IM, проявляли более низкие уровни свертывания крови, чем в группе плацебо. Данный факт очень важен, поскольку проблемы повышенной свертываемости ассоциированы с феноменом сепсиса, и фактически, только недавно одобренное соединение для данного состояния оказывает блокирующее действие на коагуляцию.
Бактериальный перитонит.
Липополисахарид Ochrobactrum intermedium LMG3306 испытывали на другой модели сепсиса, сепсиса, вызванного перитонитом, индуцированным E.coli. Лечение летального перитонита, вызванного E.coli.
Для данного исследования самок мышей C57BL/6 инокулировали при помощи 107 или 108 живых колониеформирующих единиц (КОЕ) ОВ6 E.coli и 24 или 4 ч спустя соответственно животных обраба
тывали при помощи 0,6 мкг/кг (доза 60) или 3 мкг/кг (доза 300) ЛПС IM, или плацебо при помощи единичной ИП инъекции.
В дальнейшем оценивали выживаемость и патологические симптомы (анорексию, смертность, ал-лопецию, кахексию, физическую активность и т.д.).
Спустя 24 ч после инъекции E.coli некоторые мыши, инокулированные при помощи 107 КОЕ, начинали погибать (20% из них) и проявляли патологические признаки сепсиса (в среднем 3 по шкале от 0 до 5).
Лечение при помощи IM предотвращало смерть животных и полностью обращало, в дозозависимой манере, патологические признаки сепсиса (фиг. 3).
В случае применения дозы 108 E.coli, все животные умирали к 24 ч; поэтому их обрабатывали при помощи IM спустя 4 ч после инокуляции Е. coli. В это время мыши не умирали, несмотря на то что средний показатель патологических симптомов был очень высок (4 из 5). К 14 ч все мыши, инфицированные E.coli, погибали. Тем не менее, 3 мкг/кг (доза 300) IM предотвращала гибель большинства животных (80% выживаемости) и постепенно снижала серьезность клинических симптомов (фиг. 4).
Эффект адъюванта при экспериментальной инфекции Leishmania.
Эффект адъюванта при инфекции в подушечки стоп.
Хорошо известно, что экстракт антигена SLA (растворимый антиген Leishmania) не оказывает защитный эффект в отношении экспериментальной инфекции, вызванной Leishmania major, поскольку данный антиген не способен активировать Тх1 защитный ответ (фиг. 5). Но в случае сочетания SLA с адъювантом, например CpG (патент США №7521063) в качестве адъюванта для вакцин благодаря стимулированию иммунного ответа через TLR9 и повышению Тх1 ответа (Heeg, Int. J.Microbiol., 298, 33, 2008), способен через TLR9 (Toll-подобный рецептор) индуцировать защитную Тх 1 (у-ИФН) активацию
(патент США №6890542).
Таким образом, данная модель является очень полезной для тестирования IM в сравнении с общепризнанным применением CPG в качестве адъюванта при вакцинации от экспериментального лейшманиоза. На фиг. 6 приведен протокол для данной цели.
В основном антиген SLA инокулируют сам по себе или совместно с CPG или с IM на день 0, 15 и 30.
На 60-й день 1000 промастигот инокулируют в подушечку стопы каждой мыши и отслеживают поражения и иммунологические параметры. Развитие инфекции может наблюдаться макроскопически и коррелирует с числом паразитов. Как приведено на фиг. 7, после инокуляции очевидна инфекция в контрольной группе. Антиген SLA не оказывает какого-либо защитного эффекта, в то время как в обеих SLA+CPG и SLA+IM группах значительно снижались поражения.
Более того, макроскопические результаты 6 недель после инфекции приведены на фиг. 8 и демонстрируют значительное снижение поражений у животных, обработанных при помощи SLA-CpG или SLA-IM по сравнению с формой подушечки стопы животных, обработанных при помощи одного SLA.
Кроме того, подсчитывали число паразитов в подушечке стопы и селезенке. На 7-й неделе после инфекции животных умерщвляли и определяли паразитов, присутствующих в селезенке и в дренирующих лимфатических узлах (DLN). SLA иммунизация не приводила к какому-либо снижению в числе паразитов по сравнению с IM и CpG. CpG снижало данное число на величину близкую к 2log и IM проявляла такие же результаты по меньшей мере в 4 из всех 6 животных (фиг. 9).
Коротко, SLA не протектирует сам по себе, но в сочетании с CpG или IM оказывает защитное воздействие в отношении инфекции.
Клетки селезенки умерщвленных животных собирали, стимулировали "in vitro" при помощи SLA и оценивали Тх1 (у-ИФН) и/или Тх2 (Ил-4) ответ.
Хорошо описано, что инфекция, вызванная Leishmania major, на чувствительной Balb/c модели сравнительно повышает уровни ИЛ-4 по отношению к таковым у-ИФН. Хотя вакцинация SLA не изменяет данный принцип, его сочетание с CpG повышает Тх 1 ответ, вычисленный на основании продукции у-ИФН, и следовательно снижает относительную экспрессию ИЛ-4. Таким образом, соотношение у-ИФН (Тх 1 ответ)/ИЛ-4 (Тх 2 ответ) значительно повышается (фиг. 10).
Неожиданно, хотя IM обладает сходством и защитным эффектом как CpG, их иммунологические механизмы различны. Защитное действие не коррелирует абсолютно с соотношением у-ИФН (ответ Тх 1)/ИЛ-4 (ответ Тх 2), поскольку оба параметра повышаются в одно время (фиг. 10).
Второй путь определения ответа Тх 1/Тх 2 представляет собой анализ уровней Leishmania-специфичных изотипов антител lgG2a 0"х1) и lgG1 (Тх2).
Хотя механизм не ясен, уровни IgG2a коррелируют с иммунитетом против Leishmania. У необработанных животных или обработанных только при помощи, SLA уровни IgG2a не определялись. Однако уровни IgG2a определяли у животных, обработанных при помощи CpG или IM. Таким образом, соотношение IgG2a/lgG1 является низким у необработанных животных или обработанных только при помощи SLA по сравнению с таковыми у SLA-CpG и SLA-IM групп (фиг. 11).
Защитный и терапевтический эффект IM на экспериментальной модели заражения мышей через подушечки стоп.
На фиг. 12 приведен протокол для оценки терапевтического эффекта IM при длительной экспери
ментальной инфекции, вызванной Leishmania.
Для этого IM инокулировали в то же время, что и Leishmania в двух различных дозах:
1) группа IMF-1, 2 и 3, получающая 0,6 мкг/кг (18 нг/мышь);
2) группа IMF-4, 5 и 6, получавшая 1,2 мкг/кг (36 нг/мышь). Результаты показывают, что IM способен протектировать с эффективностью, сходной с получаемой при помощи CpG, в отношении инфекции, вызванной Leishmania major (фиг. 13А).
Животные, обработанные при помощи IM, не проявляли каких-либо значительных поражений (фиг. 13В). После 7 недель инфекции животных умерщвляли и подсчитывали число паразитов в селезенке и лимфатических узлах (ЛУ). Сходные результаты были получены в группах CpG и IM со значительным снижением (10000 раз) в лимфатических узлах и отсутствием паразитов в селезенке (фиг. 13С).
В заключение, и в соответствии с предыдущими экспериментами, группа CpG индуцирует значительное изменение в соотношении уровней антител IgG2a/IgG1. Более того, IM не показывает значительного изменения в данном соотношении, что также соответствует результатам, полученным ранее (фиг. 14).
В качестве окончательного заключения мы обнаружили, что IM обладает свойствами схожими с CpG, но отличается от последнего по иммунному механизму, из-за отсутствия изменений в профиле и в соотношении Тх 1/Тх 2 или IgG2a/IgG1. В связи с этим, IM может быть лучшим адъювантом, поскольку активирует оба ответа (а не только Тх 1, как показано для CpG).
IM (ЛПС Ochrobactrum intermedium) обладает свойствами вакцинного адъюванта для иммунносу-прессированных животных.
Ранее было показано, что IM оказывает эффект вакцинного адъюванта на инфекцию, вызванную Leishmania при помощи SLA в качестве антигена.
Данный антиген недостаточно иммуногенен и, более важно, в основном индуцирует Тх2 ответ (характеризующийся преобладанием IgG1 антител и продукцией ИЛ-4), а не Тх 1 ответ (характеризующийся ответом IgG2a и продукцией гамма-ИФН), являющийся защитным ответом.
Для исследования воздействия адъюванта на иммунносупрессированных мышей самок Balb/c обрабатывали при помощи кортикостероида Дексаметазона (Dex), 20 мкг ИП/животное и спустя 24 ч животных инокулировали при помощи одного SLA (10 мкг/животное) или в сочетании с 0,6 мкг/кг (доза 60) или 3 мкг/кг (доза 300) IM, или CpG, соединение ранее описанное для индукции Тх1 ответов (см. фиг. 15 для используемого протокола). Спустя неделю животных вторично прививали при помощи одного SLA и на 17-й день животных умерщвляли, собирали клетки селезенки и оценивали титры анти-SLA в сыворотке.
Как показано на фиг. 16, специфические анти-SLA антитела определялись у всех животных, инъецированных при помощи SLA, но не в контролях с одним Dex, но большинство антител представляли собой IgG1 изотип. Как сообщается, CpG адъювант повышал соотношение IgG2a/IgG1, и, боле важно, IM лучше CPG индуцировал данное изменение, отображая переключение с Тх2 на Тх1 in vivo. Это означает, что IM обладает активностью адъюванта у иммуносупрессированных животных, и, более важно, при сохранении преимущественно ТХ1 ответов даже у иммунносупрессированных животных.
Кроме того, получали клетки селезенки из различных животных, стимулировали in vitro при помощи SLA и оценивали пролиферацию и у-ИФН (Тх 1 цитокин, необходимый для защиты против Leishma-nia). Как показано на фиг. 7, SLA индуцировал пролиферативный ответ у животных, обработанных Dex. Животные, обработанные CpG, обладали улучшенным пролиферативным ответом. Интересно, что животные, обработанные при помощи IM, также имели лучший пролиферативный ответ в дозозависимой манере по сравнению с SLA (фиг. 17). У всех животных наблюдалось отсутствие отличий в ответах по отношению к митогенам (не приведено).
Мы проверили у-ИФН (цитокин Тх 1) и ИЛ-4 (цитокин Тх 2), высвобождаемые в супернатантах из клеток селезенки после обработки клеток селезенки "in vitro" при помощи SLA. Как показано на фиг. 18, не вакцинированные Dex-контрольные животные не имели определяемой продукции ИЛ-4 или у-ИФН в результате контрольного заражения SLA in vitro. У SLA-вакцинированных животных, контрольное заражение SLA "in vitro", приводило к продукции ИЛ-4, но очень маленькой у-ИФН, в соответствии с результатами IgG1/IgG2a в сыворотке тех же животных.
Обработка CpG индуцировала повышение как ИЛ-4, так и у-ИФН без существенного изменения их соотношения (фиг. 19). Интересно, что ЛПС IM также повышал оба цитокина, но у-ИФН в более высокой пропорции, чем ИЛ-4. Это было особенно заметно у животных, обработанных при помощи 3 мкг/кг (доза 300), 10-кратное увеличение соотношения у-ИФН/ИЛ-4 (фиг. 19).
Пример 2. Способ получения.
Иммуностимулятор ЛПС получали из штамма О. intermedium LMG3306, следуя способу приготовления, описанному ранее.
1. Способ получения ферментационной массы антигена согласно части (ii), описанной ранее (способ получения).
2. Способ экстракции ЛПС согласно части (iii), описанной ранее (способ получения).
3. Очистка и определение количества ЛПС согласно частям (iv) и (v), описанным ранее (способ приготовления).
1.
Продукт хранили в чане из нержавеющей стали, предварительно стерилизованном и оснащенном системой постоянного перемешивания с целью сохранения гомогенности загрузки до 24 ч при 4°С. Продукт переносили из чана в область розлива при помощи стерильной системы газовых трубок.
Розлив выполняли в стерильных условиях, класс 100А, 100В окружение. В этой же области применяли резиновые пробки и крышки.
Сосуды, содержащие конечный продукт, хранили при 4°С, до того как их маркировали и упаковывали. Маркирование и упаковку выполняли в отдельной области, и только одну загрузку конечного продукта и материал для ее обработки можно вносить в данную область в одно время. Окончательное хранение до продажи осуществляли при 5+3°С.
Пример 3. Композиция.
Пример 4. Исследование КДО.
Основная цель данного исследования представляет собой проверку воспроизводимости определения наномолей на мл ЛПС, следуя колориметрическому способу КДО, описанному ранее.
Исследованные параметры: 1-внутрианалитическая сходимость; 2-межаналитическая сходимость; 3-внутригрупповая сходимость.
Результаты 1-внутрианалитической сходимости.
В данном исследовании применяли одну партию продукта по изобретению (А003А), 3 образца титровали в один день с 10 повторностями на образец. Затем три разведения каждого образца (1/2, 1/4 и 1/8) с 10 повторностями на разведение тестировали для проверки воспроизводимости испытания.
Разведение 1/2
Результаты.
образец
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
Среднее
(стандартное отклонение)
(коэффициент вариации)
0,25
0,003
1,2%
Разведение 1/4
Разведение 1/8
Среднее
0,121
0,003051
2,52%
Среднее
0,061333
0,003457
5,63%
Среднее
0,031
0,003051
9,84%
Мы исследовали KB для каждого разведения. Полученные результаты означают воспроизводимость исследования; каждый KB был ниже 10%. 2-межаналитическая сходимость.
Для проверки вариабельности в основном из-за технических манипуляций одну и ту же партию продукта по изобретению титровали в три разных дня. Каждый день заново готовили все необходимые растворы и образцы продукта хранили при 4°С между первым и последним днем эксперимента.
В данном исследовании одну партию по изобретению (А003А) титровали в три разных дня, 3 различных образца с 10 повторностями на образец. Результаты.
день
образец
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
Среднее
0,25
0,003352
1,34%
Полученные результаты означают воспроизводимость исследования; KB был ниже 10%.
3-внутригрупповая сходимость.
Для проверки вариабельности продукции загрузки.
В данном исследовании титровали три партии продукта по изобретению (А001А, А002А и А003А). Три образца каждой загрузки с 10 повторностями на образец.
загрузка
Испы тание
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,25
0,25
0,24
0,26
0,25
0,25
0,25
0,26
0,25
0,24
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,24
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
Среднее
0,25
0,004475
1,78%
Значительных различий в активности КДО при результатах одного анализа, разных анализов и временных анализов с образцами продукта по изобретению не наблюдалось.
Пример 5. Исследование иммуногенности как адъюванта для вирусных инактивированных вакцин. Полевые исследования.
Полевые исследования проводили, чтобы оценить воздействие иммуностимулятора на иммунный ответ через сывороточные, общие и нейтрализующие антитела против вируса герпеса 1 крупного рогатого скота (BHV-1) или вируса инфекционного ринотрахеиита крупного рогатого скота (IBR), индуцируемого посредством иммунизации при помощи рутинной инактивированной вакцинации, у серонегативных телят.
Материалы и методы.
1. Групповой отбор.
Для выбора тестовой группы предварительно были протестированы 120 животных из других 5 групп молочного скота. Поскольку в этих 5 группах были серопозитивные животные, образцы брали из шестой группы; протестированные животные оказались серонегативными, и данная группа была выбрана.
Серологию проводили при помощи коммерческого теста ELISA, определяющего общие антитела к вирусу IBR.
2. Протокол действий: лечение, вакцинация и получение образца.
2.1. Лечение и вакцинация.
Тест проводили на 22 серонегативных телках из молочной группы свободной от вируса IBR. В течение теста новых животных в стадо не вводили. Телок разделяли по следующим группам:
группа 1 - тринадцать телок обрабатывали при помощи 5 мл иммуностимулирующего соединения (6 мкг/мл) в дни теста 0 и 7 и вакцинировали при помощи 5 мл зарегистрированной коммерческой вакцины, которая содержит инактивированные вирусы IBR на 7- и 28-й дни. Оба продукта инъецировали при помощи глубоких внутримышечных впрыскиваний в шею;
группа 2 - шесть телок иммунизировали при помощи одинаковой дозы и способа вакцинации на 7-и 28-й день;
группа 3 - три телки представляли собой контрольную группу; их не обрабатывали или не иммунизировали с целью установить отсутствие циркуляции вируса.
2.2. Получение образца.
2.2.
2.2.
активности.
Для изучения этого клеточные линии макрофагов мышей J774 (клон J774A168) и Raw264.7 культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO, Gran Island, NY), с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma), антибиотиков, гентамицина и 5% ФТС. В течение экспериментов клетки культивировали в RPMI, с добавлением 0,5% ФТС и различными дозами иммуностимулирующего соединения по изобретению или ЛПС из E.coli. Культуры инкубировали в течение 72 ч при 37°С и пролиферацию клеток оценивали посредством введения (3Н) тимидина (New England Nuclear, Boston, MA) в ДНК в течение последних 16 ч культивирования. Клетки активировали при помощи 1 цО (3H) тимидина и собирали в стекловолоконные фильтры при помощи автоматического сборщика клеток. Радиоактивное включение измеряли в жидком сцин-цилляционном спектрометре. Исследование проводили при трехкратном культивировании.
Иммуностимулирующая композиция по изобретению индуцирует дифференциацию клеток J774, как показано на фиг. 1, по сравнению с ЛПС E.coli в Raw макрофагах. Дифференциация макрофагов обычно ассоциирована со снижением пролиферации клеток. Иммуностимулирующая композиция индуцирует дозозависимое ингибирование дифференциации макрофагов J774. Этот эффект приблизительно в 500 раз менее сильный, чем таковой, наблюдаемый при помощи ЛПС Е^И на основе массы/объема J774 или Raw макрофагов.
Пример 7. Индукция ФНО в макрофагах.
Одним из наиболее чувствительных испытаний для исследования активности лигандов TLR является исследование продукции цитокина ФНО макрофагами или клеточными линиями макрофагов. Для исследования этого клеточные линии макрофагов мышей J774 (клон J774A168) и Raw264.7 (от АТСС TIB-71) культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO, Gran Island, NY), дополненной при помощи 2 мМ L-глутамина (Sigma), антибиотиков, гентамицина и 5% ФТС. В течение экспериментов клетки культивировали в RPMI, дополненной при помощи 0,5% ФТС и различными дозами иммуностимулирующего соединения по изобретению или ЛПС E.coli. Культуры инкубировали в течение при 37°С, 5% СО2 в течение 24 ч и собирали супернатанты. ФНО определяли посредством двухстадийного сэндвич-ELISA (En-dogen, Woburn, MA).
Нестимулированные макрофаги не синтезировали ФНО, определяемый посредством ELISA. Иммуностимулирующая композиция по изобретению при дозах 0,1-10 мкг/мл индуцировала в дозозависимой манере значительные реактивные уровни продукции ФНО до 4000 пг/мл в макрофагах J774 (фиг. 2а), а также в необработанных клетках. Эффект иммуностимулятора по изобретению, хотя и высокозначимый, был приблизительно в 500 раз менее сильным, чем ЛПС E.coli (фиг. 2b).
Кроме того, перитонеальные макрофаги изолировали посредством перитонеального лаважа из BALB/c или C57BI/6, 12-недельных мышей, 4 дня спустя единичная перитонеальная инъекция 10% раствора тиогликолата (1 мл Difco Laboratories). Макрофаги из C57BI/6, являющихся породой мышей склонных к Тх 1 ответам, и из Balb/c, которые наоборот, склонны к Тх 2 ответам, обрабатывали при помощи иммуностимулирующей композиции по изобретению. Клетки (1,5х101/лунку) оставляли адгезиро-вать в течение 1 ч в 12-луночных плоскодонных планшетах и покрывали при помощи свежей RPMI/0,5% ФТС в присутствии или отсутствии индикаторного количества ЛПС (E.coli серотип 026.В6, Sigma) или иммуностимулятора по изобретению. Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 24 ч и собирали супернатанты. ФНО определяли посредством двухстадийного сэндвич-ELISA (Endogen, Woburn, MA).
Иммуностимулирующая композиция по изобретению индуцирует продукцию ФНО в макрофагах как из породы мышей Balb/c, так и из С57В16, хотя с меньшей силой, чем ЛПС E.coli в эквивалентных концентрациях (фиг. 3). Можно сделать вывод, что иммуностимулятор по изобретению в 500 раз менее эффективен, чем ЛПС E.coli, индуцирующий ФНО в эквивалентных концентрациях. Таким образом, иммуностимулирующая композиция по изобретению способна индуцировать иммуностимулирующие дозы ФНО, но не избыточные дозы, которые могут быть токсичными и ответственны за эндотоксический шок, индуцируемый ЛПС E.coli.
Пример 8. Индукция ИЛ-12 в макрофагах.
ИЛ-12 представляет собой цитокин, в основном секретируемый макрофагами в ответ на многие стимулы, включая TCR лиганды. ИЛ-12 представляет собой один из наиболее важных цитокинов, поскольку ИЛ-12 контролирует дифференциацию Т-хелперов (Тх ) в фенотип Тх 1. ИЛ-12 представляет собой 70 кДа гетеродимер, состоящий из р35/р40 белковых цепей.
Для исследования этого перитонеальные макрофаги изолировали посредством перитонеального ла-важа из 12-недельных мышей BALB/c или C57BI/6 4 дня спустя после перитонеальной инъекции 10% раствора тиогликолата (1 мл; Difco Laboratories). Клетки (1,5х102/лунку) оставляли адгезировать в течение 1 ч в 12-луночных плоскодонных планшетах и покрывали свежей RPMI/0,5% ФТС в присутствии или отсутствии индикаторного количества ЛПС (0,26 В6 E.coli серотип, Sigma) или иммуностимулирующей композиции по изобретению. Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 24 ч и собирали супернатанты. ИЛ-12 определяли посредством ELISA. Иммуностимулятор по изобретению в дозах 10 ммкг/мл индуцирует большие количества ИЛ-12 в перитонеальных макрофагах, как из C57BI/6, так и
из Balb/c (фиг. 4).
Пример 9. Индукция продукции гамма-ИФН лимфоцитами селезенки.
Суспензии клеток селезенки (КС) готовили из мышей. КС очищали от эритроцитов посредством гиптонического лизиса при помощи дистиллированной воды и ресуспендировали в полной среде RPMI-1640, содержащей 5% ФТС, 2 мМ L-глутамина, пенициллин (100 ед./мл) и стрептомицин (100 нг/мл)
(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY).
Клетки селезенки (0,4х106 клеток/лунку) культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах (Costar, Cambridge, MA) в 250 мкл культуральной среды (RPMI, 10% ФТС, 2 мМ L-глутамина, 5х10-5 М 2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл пенициллина, 0,1 мкг/мл стрептомицина) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Клетки активировали при помощи Конканавалина А (Кон А) (10 нг/мл) в присутствии или отсутствии индикаторного количества иммуностимулирующего соединения.
у-ИФН мышей измеряли в 24 ч супернатантах, полученных из клеточных культур селезенки в присутствии или отсутствии Кон А. Они были проанализированы посредством специфичного набора "sandwich ELISA mouse MiniKit" (Endogen) согласно протоколу производителя. Как показано на фиг. 5, стимуляция Кон А индуцирует секрецию большого количества гамма-ИФН клетками селезенки обеих пород мышей, вызывая стимуляцию Тх 1 ответа, характеризующегося продукцией гамма-ИФН.
Пример 10. Иммуностимулирующее действие через TLR4 и TLR2 рецепторы.
В исследованиях, упомянутых выше, применяли перитонеальные макрофаги и клетки селезенки мышей с недостатком либо TLR2, либо TLR4, для изучения предполагаемого рецептора иммуностимулятора по изобретению.
Перитонеальные макрофаги изолировали посредством перитонеального лаважа из 12-недельных мышей C57BI/6 или C57BI/6 tlr4-/- или C57BI/6 tlr2-/- (Sarna J.R., Dyck R.H., Whishaw I.Q. 2000. The Da-lilia effect: C57BL6 mice barber whiskers by plucking. Behavioral Brain Research, 108(1):39-45. PubMedID: 10680755) 4 дня спустя после единичной перитонеальной инъекции 10% раствора тиогликолата (1 мл, Difco Laboratories). Клетки (1,5х106/лунку) оставляли адгезировать в течение 1 ч в 12-луночных плоскодонных планшетах и покрывали свежей RPMI/0,5% ФТС в присутствии или отсутствии индикаторного количества ЛПС (E.coli серотип 026.В6, Sigma) или иммуностимулятора по изобретению. Культуры инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 24 ч и собирали супернатанты. ФНО и ИЛ-12 определяли посредством двухстадийного сэнвич-ELISA. Утрата TLR4 макрофагами сильно снижала способность иммуностимулятора по изобретению индуцировать ФНО (фиг. 6) и ИЛ-12 (фиг. 7), тогда как недостаток TLR2 только частично нарушал активность.
Суспензии клеток селезенки (КС) готовили из мышей. КС очищали от эритроцитов посредством гипотонического лизиса при помощи дистиллированной воды и ресуспендировали в полной среде RPMI-1640, содержащей 5% ФТС, 2мМ L-глутамина, пенициллин (100 ед.мл) и стрептомицин (100 нг/мл)
(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY).
Клетки селезенки (0,4х106 клеток/лунку) культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах (Costar, Cambridge, MA) в 250 мкл культуральной среды (RPMI, 10% FCS, 2 мМ L-глутамина, 5х 10-5 М 2-меркаптоэтанола, 100 ед./мл пенициллина, 0,1 мкг/мл стрептомицина) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Клетки активировали при помощи Конканавалина А (Кон А) (10 нг/мл).
у-ИФН мышей измеряли в 24 ч супернатантах, полученных из клеточных культур селезенки в присутствии или отсутствии Кон А и иммуностимулирующей композиции по изобретению. Они были проанализированы посредством специфичного набора "sandwich ELISA mouse MiniKit" (Endogen) согласно протоколам производителя. Как показано на фиг. 8, стимуляция Кон А индуцировала секрецию большого количества гамма-ИФН, которая была значительно снижена в клетках селезенки из C57BI/6 tlr2-/- и практически полностью исчезала в случае применения клеток C57BI/6 tlr4-/-.
Таким образом, иммуностимулятор по изобретению действует в основном через воздействие на рецепторы TLR4 и частично TLR2.
Пример 11. Т-клетки стимулируют при помощи ЛПС Ochrobactrum intermedium LMG3306 в дозоза-висимой манере.
Мы исследовали иммуностимулирующие возможности ЛПС посредством проведения определенного эксперимента.
В6С57 мышей инфицировали при помощи 2х 105 КОЕ Lymphochoremeningitis virus (LCMV) и 7 дней спустя, на пике Т-клеточного ответа, индуцированного вирусом, мышей умерщвляли, их клетки селезенки изолировали и затем подвергали стимуляции ex vivo в течение нескольких часов при помощи различных стимулов.
С целью изучения пептид специфичной стимуляции клетки селезенки инкубировали в течение 6 ч в присутствии Брефелдина А (чтобы избежать секреции гамма-ИФН) с одной средой или с пептидом LCMV NP396, одним из основным Н2Ь рестрицированных CTL эпитопов из LCMV (Denis Hudrisier, Jo-elle Riond and Jean Edouard Gairin, Molecular and Functional Dissection of the H-2Db-Restricted Subdominant Cytotoxic T-cell Response to Lymphocytic Choriomeningitis Virus, J. Virol. 2001. March; 75(5): 2468-2471).
С целью определения всех активированных Т-клеток у мыши в тот же момент времени (независимо от пептидной специфичности), клетки селезенки инкубировали с и без форболмиристатацетата (ФМА) и
иономицина в оптимальных концентрациях.
В конце также исследовали стимулирующую возможность ЛПС О. intermedium, соединение добавляли в различных концентрациях: при 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл.
Как приведено на фиг. 9, при 0,1 и 1 мкг/мл стимуляция была субоптимальной. Максимальный уровень стимуляции достигался при концентрациях выше 10 мкг/мл. При этих концентрациях большинство активированных CD8 и CD4-Т-клеток считались позитивными по экспрессии гамма-ИФН, по меньшей мере по сравнению с "оптимальным" протоколом стимуляции Т-клеток.
ЛПС из Brucella spp. и O.anthropi, содержащий группы липида А со структурными чертами, отличными от таковых у Enterobacteriaceae, вызывают биохимический сигналлинг только через TLR4 при высоких концентрациях (10 мкг/мл). Следует отметить, что в то время как ФМА/иономицин был токсичен для CD8 и CD4-Т-клеток, примененный ЛПС не оказывал такого воздействия даже при максимальных концентрациях. Большое процентное отношение этих клеток возникает в результате добавления ФМА/иономицина, приводящему к более низким количествам Т-клеток.
ЛПС из O.intermedium обладает многими характеристиками, делающими его не только хорошим адъювантом для более классических применений, но также повышает иммунные ответы, индуцируемые ДНК вакцинами.
1. Результаты, полученные в нашей лаборатории при помощи оптимальных доз ЛПС, улучшают иммунный ответ, индуцируемый ДНК плазмидами, по меньшей мере, повышают ответы антител, индуцируемые у мышей.
2. ЛПС способен к активации вирусспецифичных как CD8, так и CD4-T-клеток при добавлении in vitro в дозозависимой манере.
3. При добавлении в количестве 100 мкг/мл он является абсолютно нетоксичным, в то время как ФМА/иономицин (общепризнанное применение) индуцирует апоптоз клеток селезенки.
Он продуцируется непатогенной бактерией, которую легко трансформировать.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение липополисахарида Ochrobactrum intermedium LMG3306 для получения лекарственного средства для лечения и/или предупреждения сепсиса.
2. Способ получения липополисахарида Ochrobactrum intermedium LMG3306, включающий культивирование бактериального штамма О. intermedium LMG3306 на триптиказо-соевом бульоне и экстракцию липополисахарида путем следующих стадий:
a) центрифугирование инактивированной культуры О. intermedium LMG3306;
b) ресуспендирование полученного осадка в солевой суспензии;
c) диализ при помощи очищенной воды и полиэтиленгликоля;
d) осаждение при помощи четырех объемов метанола и 1% метанола, насыщенного ацетатом натрия; и
e) лиофилизация полученного неочищенного ЛПС.
3. Способ по п.2, дополнительно включающий очистку неочищенного ЛПС при помощи следующих стадий:
a) растворение неочищенного ЛПС в буфере (10 мМ Трис-HCl рН 7,5), необязательно при помощи ультразвука;
b) добавление протеиназы К и инкубирование при комнатной температуре;
c) получение очищенного ЛПС посредством ультрацентрифугирования и
d) лиофилизация образца.
4. Применение композиции, содержащей липополисахарид Ochrobactrum intermedium LMG3306 и при необходимости один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов для получения лекарственного средства для модуляции иммунного ответа.
5. Применение по п.4, характеризующееся тем, что композиция содержит химически чистый ЛПС Ochrobactrum intermedium LMG3306, где нерастворимый компонент контаминирован другими соединениями не более чем на 0,2%.
6. Применение по любому из пп.4, 5, характеризующееся тем, что композиция содержит 0,5-120 мкг/мл ЛПС штамма Ochrobactrum intermedium LMG3306.
7. Применение по любому из пп.4-6, где липополисахарид представляет собой гомогенную суспензию, в которой мицеллярная фаза стабильна при 4°С в течение периода более 1 года.
8. Применение по любому из пп.4-7, где рН композиции составляет от 2 до 12.
9. Применение по любому из пп.4-8 для получения лекарственного средства для модулирования иммунного ответа у млекопитающих.
10. Применение по п.9, где модулирование включает повышение иммунокомпетентности млекопитающих.
11. Применение по п.10, где модулирование иммунного ответа заключается в индукции дифференциации макрофагов, продукции ФНО, продукции ИЛ-12, продукции ИФН-гамма лимфоцитами селезенки
10.
и/или активации вирус-специфичных CD8 и CD4 Т-клеток.
Лечение эндотоксического шока, вызванного ЛПС
12. Применение по п.10, где модулирование включает ингибирование продукции провоспалитель-ных цитокинов у субъекта.
13. Применение по п.12, где провоспалительный цитокин представляет собой ИЛ-12.
14. Применение по любому из пп.4-8, где средство представляет собой адъювант для вакцин для лучшей иммунизации против специфичных вирусов и/или бактерий, содержащихся в вакцине.
15. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения септицемии.
16. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения эндотоксикоза.
17. Применение по любому из пп.4-8, где средство предназначено для лечения и/или предупреждения инфекционных заболеваний.
18. Применение по п.17, где лекарственное средство предназначено для лечения и/или предупреждения инфекций у иммуносупрессированных животных.
19. Применение по любому из пп.17, 18, где лекарственное средство представляет собой адъювант для вакцин против инфекций, вызванных Leishmania.
20. Применение по п.19, где лекарственное средство используют в качестве адъюванта для вакцины против кожных инфекций, вызванных Leishmania.
12.
12.
Кожный лейшманиоз мышей
Защитный иммунитет зависит от индукции продукции Тх1 цитокинов Т-клетками
L-аргинин
Тх1
| Тх2
iNOS
Аргиназа-1
| NO (нитриты)
полиамины
Гуморальный ответ. lgG1 е lgG2a anti-SLA Смесь сывороток/5 животных на группу
SLA-специфичная пролиферация клеток селезенки
DEX DEX DEX DEX DEX
контроль SLA SLA SLA1M SLAIM
CpG 60 300
Фиг. 17
ФНО перитонеальных макрофагов
ИЛ-12 перитонеальных макрофагов
контроль 10 мг INM
Фиг. 26
Секреция гамма-ИФН клетками селезенки
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
вом стандартной реакции нейтрализации вируса; для этого применяли 100 DI50CT/25 мкл штамма Colo
вом стандартной реакции нейтрализации вируса; для этого применяли 100 DI50CT/25 мкл штамма Colo
025766
- 1 -
025766
- 1 -
025766
- 1 -
025766
- 1 -
025766
- 1 -
025766
- 4 -
025766
- 13 -
025766
- 13 -
025766
- 20 -
025766
- 21 -
025766
- 22 -
025766
- 24 -
025766
- 25 -
025766
- 29 -
025766
- 30 -