|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Наночастица для применения при выработке ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), указанная наночастица содержит: (i) ядро, содержащее атом металла и/или полупроводника; (ii) корону, содержащую множество лигандов, ковалентно связанных с ядром, при этом, по меньшей мере, первый лиганд из указанного множества содержит углеводный фрагмент, ковалентно связанный с ядром через первый линкер, или содержит глутатион, и при этом, по меньшей мере, второй лиганд из указанного множества содержит эпитопный пептид, который состоит из последовательности из 8-12 аминокислотных остатков и связывается с молекулой I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), причём указанный эпитопный пептид ковалентно связан с ядром через второй линкер, при этом указанный второй линкер содержит пептидную часть и непептидную часть, при этом указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит последовательность X 1 X 2 Z 1 , где X 1 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; Х 2 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; и Z 1 представляет собой аминокислоту, выбранную из Y и F, и при этом указанная непептидная часть включает С 2 -С 15 алкил и/или С 2 -С 15 гликоль. 2. Наночастица по п.1, отличающаяся тем, что указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из: (i) AAY и (ii) FLAAY (SEQ ID NO: 1). 3. Наночастица по п.2, отличающаяся тем, что указанный второй лиганд выбран из группы, состоящей из: (i) HS-(CH 2 ) 2 -CONH-AAYZ 2 ; (ii) HS-(CH 2 ) 2 -CONH-FLAAYZ 2 ; (iii) HS-(CH 2 ) 3 -CONH-AAYZ 2 ; (iv) HS-(CH 2 ) 3 -CONH-FLAAYZ 2 ; (v) HS-(CH 2 ) 10 -(CH 2 OCH 2 ) 7 -CONH-AAYZ 2 и (vi) HS-(CH 2 ) 10 -(CH 2 OCH 2 ) 7 -CONH-FLAAYZ 2 , где Z 2 представляет собой указанный эпитопный пептид. 4. Наночастица по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанный эпитопный пептид образует по меньшей мере часть или получен из опухолеассоциированного антигена (ТАА) или вирус-, бактериально- или паразитассоциированного антигена.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Наночастица для применения при выработке ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), указанная наночастица содержит: (i) ядро, содержащее атом металла и/или полупроводника; (ii) корону, содержащую множество лигандов, ковалентно связанных с ядром, при этом, по меньшей мере, первый лиганд из указанного множества содержит углеводный фрагмент, ковалентно связанный с ядром через первый линкер, или содержит глутатион, и при этом, по меньшей мере, второй лиганд из указанного множества содержит эпитопный пептид, который состоит из последовательности из 8-12 аминокислотных остатков и связывается с молекулой I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), причём указанный эпитопный пептид ковалентно связан с ядром через второй линкер, при этом указанный второй линкер содержит пептидную часть и непептидную часть, при этом указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит последовательность X 1 X 2 Z 1 , где X 1 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; Х 2 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; и Z 1 представляет собой аминокислоту, выбранную из Y и F, и при этом указанная непептидная часть включает С 2 -С 15 алкил и/или С 2 -С 15 гликоль. 2. Наночастица по п.1, отличающаяся тем, что указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из: (i) AAY и (ii) FLAAY (SEQ ID NO: 1). 3. Наночастица по п.2, отличающаяся тем, что указанный второй лиганд выбран из группы, состоящей из: (i) HS-(CH 2 ) 2 -CONH-AAYZ 2 ; (ii) HS-(CH 2 ) 2 -CONH-FLAAYZ 2 ; (iii) HS-(CH 2 ) 3 -CONH-AAYZ 2 ; (iv) HS-(CH 2 ) 3 -CONH-FLAAYZ 2 ; (v) HS-(CH 2 ) 10 -(CH 2 OCH 2 ) 7 -CONH-AAYZ 2 и (vi) HS-(CH 2 ) 10 -(CH 2 OCH 2 ) 7 -CONH-FLAAYZ 2 , где Z 2 представляет собой указанный эпитопный пептид. 4. Наночастица по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанный эпитопный пептид образует по меньшей мере часть или получен из опухолеассоциированного антигена (ТАА) или вирус-, бактериально- или паразитассоциированного антигена.
Евразийское 025758 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201490415
(22) Дата подачи заявки
2012.09.07
(51) Int. Cl.
A61K 47/48 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) A61P31/00 (2006.01)
(54) КОМПОЗИЦИИ НАНОЧАСТИЦА-ПЕПТИД
(31) 61/531,745
(32) 2011.09.07
(33) US
(43) 2014.08.29
(86) PCT/EP2012/067561
(87) WO 2013/034726 2013.03.14
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
МИДАТЕК ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Рейдмечер Томас, Уилльямс Филлип
(GB)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(56) OJEDA et al.: "Preparation of
multifunctional glyconanoparticles as a platform for potential carbohydrate-based anticancer vaccines", CARBOHYDRATE RESEARCH, PERGAMON, GB, vol. 342, no. 3-4, 30 January 2007 (2007-01-30), pages 448-459, XP005865366, ISSN: 0008-6215, DOI: 10.1016/J.CARRES.2006.11.018, pages 448-449, "Introduction", pages 449-451, "Results and Discussion", pages 455-458, "3.9. Synthesis of GNP1" to "3.18. Synthesis of GNP10".
Charts 1-2, table 1
WO-A2-2006037979 WO-A2-2007015105
VELDERS M.P. et al.: "DEFINED FLANKING SPACERS AND ENHANCED I PROTEOLYSIS IS ESSENTIAL FOR I ERADICATION OF ESTABLISHED TUMORS BY 1
AN EPITOPE STRING DNA VACCINE", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, US, vol.
166, no. 9, 1 May 2001 (2001-05-01), pages
5366-5673, XP002974628, ISSN: 0022-1767, the
whole document
(57) Согласно настоящему изобретению предложены наночастицы и композиции, содержащие указанные наночастицы, а также способы внутриклеточной доставки пептидов и способы получения наночастиц и родственных продуктов. Указанные наночастицы содержат ядро, содержащее атом металла и/или полупроводника; и корону, содержащую множество лигандов, ковалентно связанных с ядром, при этом, по меньшей мере, первый лиганд из указанного множества содержит углеводный фрагмент, который ковалентно связан с ядром через первый линкер, и при этом, по меньшей мере, второй лиганд из указанного множества содержит выбранный пептид, который ковалентно связан с ядром через второй линкер. Второй линкер содержит пептидную часть и непептидную часть, при этом указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит последовательность X1X2Z1, где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; X2 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; и Z1 представляет собой аминокислоту, выбранную из Y и F.
Область техники
Настоящее изобретение относится к веществам и композициям, подходящим для внутриклеточной доставки пептидов, в частности опосредованной наночастицами доставки пептидов. В некоторых случаях настоящее изобретение относится к внутриклеточной доставке эпитопных пептидов, например, для индуцирования Т-клеточного ответа. Внутриклеточную доставку пептидов можно применять для терапевтического и/или профилактического лечения, в частности опухолей и/или опосредованного патогеном заболевания, такого как бактериальная, вирусная или паразитарная инфекция.
Уровень техники
Трудной задачей, стоящей при создании и разработке терапии на основе пептидов, такой как иммунотерапия, является внутриклеточная доставка пептидов во внутриклеточные компартменты. Примером является необходимость доставки антигенных пептидов в "аппарат" для процессирования антигена, в результате чего указанные пептиды представляются связанными с молекулой I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) и таким образом стимулируют ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Другие примеры включают доставку лекарственных средств на основе пептидов во внутриклеточные мишени для лекарственных средств. В частности, свободные пептиды часто демонстрируют плохое поглощение клетками.
Один из подходов, который до сих пор использовали, заключается в доставке пептидов внутрь клетки путем введения вектора, такого как вирусный вектор, содержащего полинуклеотид, кодирующий выбранный пептид, так, что клетку можно трансфицировать указанным вектором и пептид образуется в результате работы аппарата трансляции клетки. Другой пример стратегии доставки пептида внутрь клетки описан в Muders et al., 2009, Clin Cancer Res, Vol. 15(12), pp. 4095-4103, в котором GIPC-PDZ-прицельно воздействующий пептид доставляли в определенные клетки опухоли поджелудочной железы. Указанный пептид модифицировали путем N-концевого миристоилирования.
Однако сохраняется необходимость в разработке дополнительных способов и композиций для внутриклеточной доставки пептидов, например, для индуцирования иммунного ответа, или для введения некоторых лекарственных средств на основе пептидов. Настоящее изобретение удовлетворяет этим и другим потребностям.
В WO 2006/037979 описаны наночастицы, содержащие антигены и адъюванты, и иммуногенные структуры, содержащие указанные наночастицы.
Краткое описание изобретения
В широком смысле настоящее изобретение относится к внутриклеточной доставке пептидов на основе наночастиц. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что наночастицы согласно настоящему изобретению, описанные в настоящем документе, которые содержат корону, содержащую выбранный пептид, ковалентно присоединенный к ядру указанной наночастицы через конкретные линкеры, могут поглощаться клетками и таким образом доставлять указанный выбранный пептид к внутриклеточной мишени. Как описано в настоящем документе, затем выбранный пептид может высвобождаться из нано-частицы, например, за счет процессов специфического расщепления, для того чтобы выбранный пептид был свободным для взаимодействия с внутриклеточной мишенью. Одним из примеров этого является доставка эпитопного пептида в антигенпредставляющие клетки (АПК) для процессирования и представления через молекулу МНС I класса, в результате чего может вырабатываться ответ CTL.
Соответственно, согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена наночастица, содержащая:
(i) ядро, содержащее атом металла и/или полупроводника;
(ii) корону, содержащую множество лигандов, ковалентно связанных с ядром, где по меньшей мере первый лиганд из указанного множества содержит углеводный фрагмент, ковалентно связанный с ядром через первый линкер, или где указанный первый лиганд из указанного множества содержит глутатион, и при этом по меньшей мере второй лиганд из указанного множества содержит выбранный пептид, который ковалентно связан с ядром через второй линкер, при этом указанный второй линкер содержит
пептидную часть и непептидную часть, при этом указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит последовательность X1X2Z1, где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; Х2 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; и Z1 представляет собой аминокислоту, выбранную из Y и F.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению непептидная часть второго линкера содержит С2-С15 алкил и/или С2-С15 гликоль, например, тиоэтильную группу или тиопропильную группу.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению первый лиганд и/или указанный второй лиганд ковалентно связаны с ядром через серосодержащую группу, аминосодержащую группу, фосфат-содержащую группу или кислородсодержащую группу.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из:
(i) AAY и
(ii) FLAAY (SEQ ID NO: 1).
В некоторых предпочтительных случаях указанный второй линкер выбран из группы, состоящей из:
(i) HS-(CH2)2-CONH-AAY;
(ii) HS-(CH2)2-CONH-FLAAY;
(iii) HS-(CH2)3-CONH-AAY;
(iv) HS-(CH2)3-CONH-FLAAY;
(v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY и
(vi) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY,
при этом указанный второй линкер ковалентно связан с указанным ядром через тиольную группу непептидной части линкера.
Предпочтительно выбранный пептид связан через N-конец с указанной пептидной частью указанного второго линкера.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанный второй лиганд выбран из группы, состоящей из:
(i) HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2;
(ii) HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2;
(iii) HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2;
(iv) HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2;
(v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2 и
(vi) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2,
где Z2 представляет собой указанный выбранный пептид.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанный выбранный пептид представляет собой эпитопный пептид, который связывается с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса или может быть процессирован, чтобы связываться с молекулой МНС I класса.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанный выбранный пептид состоит из последовательности из 8-40 аминокислотных остатков. В частности, выбранный пептид может состоять из последовательности из 8-12 аминокислотных остатков.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению выбранный пептид представляет собой эпитопный пептид, который может быть представлен молекулой МНС I класса, чтобы стимулировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL).
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению выбранный пептид образует по меньшей мере часть или получен из опухолеассоциированного антигена (tumor associated antigen, TAA) или антигена, ассоциированного с вирусом, бактерией или паразитом. В частности, ТАА может представлять собой антиген рака легкого. В некоторых случаях рак легкого может быть выбран из мелкоклеточной карциномы легкого и любой немелкоклеточной карциномы легкого, при этом возможно указанная немелко-клеточная карцинома легкого включает аденокарциному. Патогенассоциированный антиген в некоторых случаях может представлять собой вирусный, бактериальный или паразитарный антиген.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению углеводный фрагмент указанного первого лиганда содержит моносахарид и/или дисахарид. В частности, указанный углеводный фрагмент может содержать глюкозу, маннозу, фукозу и/или N-ацетилглюкозамин.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанное множество лигандов содержит один или более лигандов, выбранных из группы, состоящей из: глюкозы, N-ацетилглюкозамина и глута-тиона, в дополнение к одному или более лигандам, содержащим указанный выбранный пептид.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанное множество лигандов содержит:
(a) глюкозу;
(b) N-ацетилглюкозамин;
(c) глутатион;
(d) глюкозу и N-ацетилглюкозамин;
(e) глюкозу и глутатион;
(f) N-ацетилглюкозамин и глутатион или
(g) глюкозу, N-ацетилглюкозамин и глутатион
в дополнение к указанному лиганду, содержащему указанный выбранный пептид.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанный первый линкер содержит С2-С15 алкил и/или С2-С15 гликоль.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению указанный первый лиганд содержит 2'-тиоэтил-р-О-глюкопиранозид или 2'-тиоэтил-а-О-глюкопиранозид, ковалентно присоединенный к ядру через атом серы тиола.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению наночастица содержит по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40 или по меньшей мере 50 углеводсо-держащих лигандов и/или глутатионовых лигандов.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению наночастица содержит по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 пептидсодержащих лигандов.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению молярное соотношение углеводсодержа
щих лигандов и/или глутатионовых лигандов и пептидсодержащих лигандов находится в диапазоне от 5:1 до 100:1, например, в диапазоне от 10:1 до 30:1.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению диаметр ядра наночастицы находится в диапазоне от 1 до 5 нм.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению диаметр наночастицы, включая ее лиган-ды, находится в диапазоне от 5 до 20 нм, возможно от 5 до 15 нм или от 8 до 10 нм.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению ядро содержит металл, выбранный из группы, состоящей из Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd и Zn или любой комбинации указанных металлов.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению ядро является магнитным.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению ядро содержит полупроводник. В частности, указанный полупроводник в некоторых случаях может быть выбран из группы, состоящей из: селе-нида кадмия, сульфида кадмия, кадмия теллура и сульфида цинка.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению ядро способно выступать в качестве квантовой точки.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению наночастица содержит по меньшей мере два лиганда, содержащих выбранный пептид, и при этом выбранные пептиды каждого из указанных по меньшей мере двух лигандов, содержащих выбранный пептид, отличаются.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению каждый из выбранных пептидов указанных по меньшей мере двух лигандов, содержащих выбранный пептид, образует по меньшей мере часть или каждый из указанных пептидов получен из одного или более антигенов, таких как ТАА. В некоторых случаях согласно настоящему изобретению каждый из выбранных пептидов указанных по меньшей мере двух лигандов, содержащих выбранный пептид, образует по меньшей мере часть или каждый из пептидов получен из ТАА разного рака легкого.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена композиция, содержащая множество наночастиц в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения. Указанная композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, соль и/или разбавитель.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению композиция содержит первый тип наноча-стицы, который содержит первый лиганд, содержащий выбранный пептид, и второй тип наночастицы, который содержит второй лиганд, содержащий выбранный пептид, при этом выбранные пептиды указанного первого и второго типа отличаются. Выбранные пептиды каждого из указанных первого и второго типов наночастицы в некоторых случаях могут образовывать по меньшей мере часть или каждый может быть получен из одного или более антигенов, таких как ТАА.
В некоторых случаях в соответствии с настоящим изобретением композиция согласно настоящему изобретению может содержать пул по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 разных типов наночастиц, при этом каждый тип содержит отличающийся выбранный пептид.
Композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один адъювант, при этом указанный адъювант может быть ковалентно присоединен к ядру по меньшей мере одной наночастицы. В качестве альтернативы, композиция согласно настоящему изобретению по существу может не содержать адъювант или эффект единственного адъюванта может быть обеспечен наночастицами.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая композицию согласно настоящему изобретению. Указанная вакцина может быть предназначена для терапевтического или профилактического лечения рака, включая рак легкого.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложена наночастица, композиция или вакцина согласно настоящему изобретению для применения в медицине.
Указанная наночастица, композиция или вакцина может быть предназначена для применения в способе лечения рака или патогенной инфекции у субъекта, представляющего собой млекопитающее.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложено применение наночастицы, композиции или вакцины согласно настоящему изобретению при получении лекарственного средства для лечения рака или патогенной инфекции у субъекта, представляющего собой млекопитающее.
Наночастица, композиция или вакцина согласно настоящему изобретению может быть предназначена для введения через лимфатическое поглощение.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ профилактического или терапевтического лечения рака или патогенной инфекции, включающий введение профилактически или терапевтически достаточного количества наночастицы, композиции или вакцины нуждающемуся в этом субъекту, представляющему собой млекопитающее. В некоторых случаях в соответствии с указанным аспектом способа согласно настоящему изобретению указанную наночастицу, композицию или вакцину вводят путем, выбранным из группы, состоящей из
инъекции в орган или ткань субъекта, представляющего собой млекопитающее, на участке лимфатического поглощения или вблизи него;
интраназальной доставки через спрей или гель;
трансбуккальной доставки через спрей или гель, или растворимую во рту пленку; пероральной доставки через растворимую пленку;
трансдермальной доставки через пластырь, содержащий наночастицу; и доставки композиции, содержащей наночастицу, путем ингаляции.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ in vitro или in vivo для выработки ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), включающий:
(i) приведение по меньшей мере одной антигенпредставляющей клетки (АПК) в контакт по меньшей мере с одной наночастицей согласно настоящему изобретению, в результате чего указанный выбранный пептид оказывается представленным на молекуле МНС I класса указанной АПК; и
(ii) приведение указанной по меньшей мере одной АПК из п. (i) в контакт по меньшей мере с одной клеткой CTL, в результате чего указанная клетка CTL активируется указанной АПК с выработкой ответа CTL, специфичного в отношении указанного выбранного пептида,
при этом указанный выбранный пептид представляет собой эпитопный пептид.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению АПК культивируют в присутствии указанной наночастицы и одновременно или последовательно культивируют совместно с указанной клеткой CTL. Возможно, АПК может быть подвергнута этапу промывки после приведения в контакт с наноча-стицей перед совместным культивированием с указанной клеткой CTL. В некоторых случаях указанный способ может дополнительно включать введение клетки CTL субъекту, представляющему собой млекопитающее.
В некоторых случаях согласно настоящему изобретению наночастица может быть доставлена путем введения, выбранным из группы, состоящей из
инъекции в орган или ткань субъекта, представляющего собой млекопитающее, на участке лимфатического поглощения или вблизи него;
интраназальной доставки через спрей или гель;
трансбуккальной доставки через спрей или гель, или растворимую во рту пленку; пероральной доставки через растворимую пленку; трансдермальной доставки через пластырь, содержащий наночастицу; и доставки композиции, содержащей наночастицу, путем ингаляции.
В некоторых случаях указанная по меньшей мере одна наночастица включает пул наночастиц, содержащих различные выбранные пептиды.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ получения наноча-стицы согласно настоящему изобретению, включающий
дериватизацию углевода первым линкером;
дериватизацию выбранного пептида вторым линкером; и
проведение реакции дериватизированного первым линкером углевода и дериватизированного вторым линкером выбранного пептида с реагентами для получения ядра наночастицы таким образом, что во время самосборки наночастицы, ядро наночастицы присоединилось к углеводу и выбранному пептиду через соответствующие линкеры. В некоторых случаях реакционная смесь содержит дериватизирован-ный углевод, дериватизированный выбранный пептид, соль атомов металла и/или полупроводника и восстанавливающий агент для получения наночастицы. Дополнительно или в качестве альтернативы, указанный углевод может быть заменен или дополнен глутатионом.
В некоторых случаях в соответствии с этим и другими аспектами настоящего изобретения продукт реакции, содержащий наночастицу, подвергают этапу очистки с удалением непрореагировавшего свободного пептида, при этом этап очистки возможно включает пропускание продукта реакции через колонку G-50 Sephadex(tm)
В некоторых случаях в соответствии с этим и другими аспектами настоящего изобретения указанный способ может дополнительно включать этап включения наночастицы в состав композиции по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, солью или разбавителем.
В некоторых случаях в соответствии с этим и другими аспектами настоящего изобретения указанный способ предназначен для присоединения указанного выбранного пептида через указанный второй линкер к указанной наночастице, в результате чего наночастица с присоединенным выбранным пептидом может интернализоваться клеткой.
В некоторых случаях в соответствии с этим и другими аспектами настоящего изобретения указанный способ предназначен для присоединения указанного выбранного пептида через указанный второй линкер к указанной наночастице, в результате чего наночастица с присоединенным выбранным пептидом может интернализоваться антигенпредставляющей клеткой (АПК).
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ внутриклеточной доставки выбранного пептида, включающий приведение клетки в контакт с наночастицей или композицией согласно настоящему изобретению.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложено применение наночастицы или композиции согласно настоящему изобретению для внутриклеточной доставки выбранного пептида.
Настоящее изобретение включает комбинацию описанных аспектов и предпочтительных признаков
за исключением случаев, когда такая комбинация является явным образом неприемлемой или когда явным образом указано, что ее необходимо избегать. Эти и другие аспекты, и варианты реализации настоящего изобретения более подробно описаны ниже и со ссылкой на прилагаемые примеры и фигуры.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано представление SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) из наночастиц золота (НЧЗ): клетки LKb высевали в 24-луночные планшеты и оставляли на ночь для протекания адгезии. Затем НЧЗ активировали до эквивалента 1 мкг/мл пептида (зеленый), 0,1 мкг/мл (синий) или 0,01 мкг/мл (красный). Через два часа клетки промывали и подвергали (A-D) проточно-цитометрическому мечению антителом 25.D1.16 (Angel) или (Е) объединяли с B3Z CTL для совместного культивирования в течение ночи. На следующий день клетки лизировали и измеряли активность бета-галактозидазы.
Фиг. 2: представление НЧЗ по сравнению с представлением свободного пептида: (А-В) НЧЗ 8 и 9 делили с помощью колонки Sephadex на 15 фракций, которые затем анализировали путем УФ-поглощения на предмет уровней белка. Красная линия (отмеченная кружками) на фиг. 2А представляет собой свободный пептид отдельно. (С-Н) Клетки LKb активировали в течение 2 ч указанными НЧЗ или соответствующим свободным пептидом в указанной концентрации (1 мкг/мл пептида (зеленый), 0,1 мкг/мл (синий) или 0,01 мкг/мл (красный)). Считывание выполняли путем (C-F) проточной цитометрии или (G-H) анализа B3Z. (I-N) LKb активировали указанным свободным пептидом в течение 2 ч на льду (IK) или при 37°С (L-N). Затем клетки анализировали путем проточной цитометрии на предмет представления SIINFEKL (SEQ ID NO: 2). Красные области гистограммы представляют собой положительное окрашивание по сравнению с неактивированными клетками.
Фиг. 3: представление НЧЗ из препаратов, не содержащих свободный пептид: (А-В) Новые препараты НЧЗ 8 и 9 делили с помощью колонки Sephadex G-50 на 15 фракций, которые затем анализировали путем УФ-поглощения на предмет уровней белка. Стрелки показывают какие фракции объединяли в пул для дальнейшего применения. (C-E, F) Клетки LKb активировали в течение 2 ч указанными предыдущими препаратами НЧЗ (старые НЧЗ) или более новыми препаратами из (А и В) (новые НЧЗ) в указанных концентрациях (1 мкг/мл пептида (зеленый) или 0,1 мкг/мл (красный)). Считывание выполняли путем (СЕ) проточной цитометрии или (F) анализа B3Z.
Подробное описание изобретения
В описании настоящего изобретения будут употребляться следующие термины, и они определены, как указано ниже.
В настоящем описании термин "наночастица" относится к частице, имеющей наномерный размер, и не выражает какое-либо конкретное ограничение формы. В частности, термин "наночастица" включает наносферы, нанотрубки, наноящики, нанокластеры, наностержни и т.п. В некоторых вариантах реализации наночастицы и/или ядра наночастиц, предусмотренные согласно настоящему изобретению, в целом, имеют многогранную или сферическую геометрию.
Наночастицы, содержащие множество углеводсодержащих лигандов, были описаны, например, в WO 2002/032404, WO 2004/108165, WO 2005/116226, WO 2006/037979, WO 2007/015105, WO 2007/122388, WO 2005/091704 (полное содержание каждого из которых явным образом включено в настоящее описание посредством ссылки) и такие наночастицы могут найти применение в соответствии с настоящим изобретением. Более того, покрытые золотом наночастицы, содержащие магнитное ядро из ферритов на основе оксида железа (имеющих формулу XFe2O4, где X = Fe, Mn или Со), функционализи-рованное органическими соединениями (например, через связь тиол-золото), описаны в ЕР2305310 (полное содержание которого явным образом включено в настоящее описание посредством ссылки) и, в частности, предусмотрены для применения в качестве наночастиц/ядер наночастиц в соответствии с настоящим изобретением.
В настоящем описании термин "корона" относится к слою или покрытию, которое может частично или полностью покрывать открытую поверхность ядра наночастицы. Корона содержит множество ли-гандов, которые содержат по меньшей мере один углеводный фрагмент, один поверхностно-активный фрагмент и/или один глутатионовый фрагмент. Таким образом, корону можно считать органическим слоем, окружающим или частично окружающим металлическое ядро. В некоторых вариантах реализации корона обеспечивает и/или участвует в пассивации ядра наночастицы. Таким образом, в некоторых случаях корона может включать достаточно полный покрывающий слой по существу для стабилизации металлсодержащего ядра. Однако согласно настоящему изобретению, в частности, предусмотрено, что некоторые наночастицы, содержащие ядра, например, которые содержат внутреннее ядро, содержащее оксид металла, покрытое благородным металлом, могут содержать корону, которая лишь частично покрывает поверхность ядра. В некоторых случаях корона облегчает растворимость, такую как растворимость в воде, наночастиц согласно настоящему изобретению.
Наночастицы
Наночастицы представляют собой мелкие частицы, например, кластеры атомов металла или полупроводника, которые могут быть использованы в качестве подложки для иммобилизации лигандов.
Предпочтительно наночастицы содержат ядра, имеющие средние диаметры от 0,5 до 50 нм, более предпочтительно от 0,5 до 10 нм, более предпочтительно от 0,5 до 5 нм, более предпочтительно от 0,5 до
3 нм и еще более предпочтительно от 0,5 до 2,5 нм. Когда лиганды рассматриваются в дополнение к ядрам, предпочтительно общий средний диаметр частиц составляет от 5,0 до 100 нм, более предпочтительно от 5 до 50 нм и наиболее предпочтительно от 5 до 10 нм. Средний диаметр может быть измерен с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, таких как просвечивающая электронная микроскопия.
Материал ядра может представлять собой металл или полупроводник и может быть образован более чем одним типом атома. Предпочтительно материал ядра представляет собой металл, выбранный из Au, Fe или Cu. Ядра наночастиц также могут быть получены из сплавов, включая Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd и Au/Fe/Cu/Gd, и могут быть использованы согласно настоящему изобретению. Предпочтительные материалы ядра представляют собой Au и Fe, при этом наиболее предпочтительным материалом является Au. Ядра наночастиц предпочтительно содержат от примерно 100 до 500 атомов (например, атомов золота) для получения диаметров ядра в нанометровом диапазоне. Другие наиболее подходящие материалы ядра легируют одним или более атомами, которые являются ЯМР-активными, что позволяет детектировать наночастицы с использованием ЯМР как in vitro, так и in vivo. Примеры ЯМР-активных атомов включают Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 и лантаноиды+3 или квантовые точки, описанные в иных местах настоящей заявки.
Ядра наночастиц, содержащие атомы полупроводника, можно детектировать, т.к. полупроводниковые кристаллы нанометрового размера способны выступать в качестве квантовых точек, т.е. они могут поглощать свет, тем самым возбуждая электроны в материалах на более высокие энергетические уровни, а затем высвобождая фотоны света на характерных для материала частотах. Примером полупроводникового материала ядра является селенид кадмия, сульфид кадмия, кадмий теллур. Также включены соединения цинка, такие как сульфид цинка.
В некоторых вариантах реализации ядро наночастиц может быть магнитным и содержать атомы магнитного металла, возможно в комбинации с атомами пассивного металла. В качестве примера, пассивный металл может представлять собой золото, платину, серебро или медь, а магнитный металл может представлять собой железо или гадолиний. В предпочтительных вариантах реализации пассивный металл представляет собой золото, и магнитный металл представляет собой железо. В данном случае отношение атомов пассивного металла к атомам магнитного металла в ядре удобным образом составляет от примерно 5:0,1 до примерно 2:5. Более предпочтительно указанное отношение составляет от примерно 5:0,1 до примерно 5:1. В настоящем описании термин "пассивные металлы" относится к металлам, которые не демонстрируют магнитные свойства и химически устойчивы к окислению. Пассивные металлы могут быть диамагнитными или суперпарамагнитными. Предпочтительно такие наночастицы являются суперпарамагнитными.
Примеры наночастиц, которые содержат ядра, содержащие парамагнитный металл, включают на-ночастицы, содержащие Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 и лантаноиды+3.
Другие магнитные наночастицы могут быть получены из материалов, таких как MnFe (феррит-шпинель), или CoFe (феррит кобальта) может быть превращен в наночастицы (магнитную жидкость) с или без добавления дополнительного материала ядра, определенного выше. Примеры химии самосборки и присоединения для получения таких наночастиц приведены в Biotechnol. Prog., 19:1095-100 (2003), J. Am. Chem. Soc. 125:9828-33 (2003), J. Colloid Interface Sci. 255:293-8 (2002).
В некоторых вариантах реализации наночастица или ее лиганд содержит детектируемую метку. Указанная метка может представлять собой элемент ядра наночастицы или лиганда. Метку можно детектировать благодаря внутреннему свойству данного элемента наночастицы или за счет связывания, конъюгации или ассоциации с другим фрагментом, который является детектируемым. Предпочтительные примеры меток включают метку, которая представляет собой флуоресцентную группу, радионуклид, магнитную метку или краситель. Флуоресцентные группы включают флуоресцеин, родамин или тетра-метилродамин, техасский красный, Су3, Су5 и т.д., и могут быть детектированы путем возбуждения флуоресцентной метки и детектирования излучаемого света с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния (Y.C. Cao, R. Jin, CA. Mirkin, Science 2002, 297: 1536-1539).
В некоторых вариантах реализации наночастицы могут содержать радионуклид для применения в детектировании наночастицы с использованием радиоактивности, излучаемой указанным радионуклидом, например, путем использования позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), или для терапии, т.е. для уничтожения клеток-мишеней. Примеры радионуклидов, обычно используемых в данной области техники, которые можно легко адаптировать для применения согласно настоящему изобретению, включают 1с, существующий в различных состояниях окисления, хотя наиболее стабильным является ТсО -; Р или 33Р; 57Со; 59Fe; 67Cu, которую часто используют в виде солей Cu2+; 67Ga, который обычно используют в виде соли Ga3+, например, цитрата галлия; 68Ge; 82Sr; 99Mo; 103Pd; 111In, который обычно используют в виде солей In3+; 125I или 131I, который обычно используют в виде иодида натрия; 137Cs; 153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re; 201Tl, обычно используемый в виде соли Tl , такой как хлорид таллия; 9Y ; Lu и Cr2 . Общее использование радионуклидов в качестве меток и индикаторов хорошо известно в данной области техники и может быть легко адаптировано специалистом для использования в соответствии с аспектами настоящего изобретения. Радионук
лиды можно наиболее легко использовать путем легирования ядер наночастиц или включения их в качестве меток, присутствующих в составе лигандов, иммобилизованных на наночастицах.
Дополнительно или в качестве альтернативы, наночастицы согласно настоящему изобретению или результаты их взаимодействий с другими частицами можно детектировать с использованием ряда способов, хорошо известных в данной области техники, с использованием метки, связанной с наночастицей, как указано выше, или путем использования их свойства. Данные способы детектирования наночастиц могут простираться от детектирования агрегации, происходящей, когда наночастицы связываются с другими частицами, например, путем простого визуального контроля или путем использования рассеяния света (прозрачность раствора, содержащего наночастицы), до использования сложных способов, таких как просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) или атомно-силовая микроскопия (АСМ), для визуализации наночастиц. Другой способ детектирования частиц металла заключается в использовании плазмонного резонанса, представляющего собой возбуждение электронов на поверхности металла, как правило, вызываемое оптическим излучением. Явление поверхностного плазмонного резонанса (ППР) существует на поверхности металла (такого как Ag или Au) и диэлектрического материала, такого как воздух или вода. Изменения ППР происходят по мере связывания аналитов с лигандом, иммобилизованным на поверхности наночастицы, что приводит к изменению показателя преломления границы раздела. Другим преимуществом ППР является то, что его можно использовать для контроля взаимодействий в реальном времени. Как указано выше, если наночастицы содержат или легированы атомами, которые являются ЯМР-активными, то данный способ можно использовать для детектирования частиц как in vitro, так и in vivo, с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Наночасти-цы также можно детектировать с использованием системы на основе количественного усиления сигнала с использованием восстановления серебра (I), которому способствуют наночастицы. Флуоресцентную спектроскопию можно использовать, если наночастицы содержат лиганды в качестве флуоресцентных зондов. Кроме того, для облегчения детектирования можно использовать изотопное мечение углевода.
Выбранный пептид
Наночастица согласно настоящему изобретению содержит пептидсодержащий лиганд ("указанный второй лиганд"), который ковалентно связан с ядром наночастицы через линкер ("указанный второй линкер"). Второй лиганд содержит пептид, который может быть предназначен для внутриклеточной доставки. Данный "выбранный пептид" может представлять собой любой подходящий пептид. В частности, указанный пептид может представлять собой фрагмент более крупного полипептида, который способен оказывать эффект при доставке во внутриклеточный участок. В некоторых случаях выбранный пептид может представлять собой лекарственное средство на основе пептида. В некоторых случаях выбранный пептид может содержать эпитоп ("эпитопный пептид"), вызывающий иммунный ответ при доставке, например, во внутриклеточный компартмент АПК. В некоторых предпочтительных случаях выбранный пептид может представлять собой пептид, который связывается с молекулой главного комплекса гисто-совместимости (МНС) I класса или может быть процессирован, чтобы связываться с молекулой МНС I класса. В некоторых случаях согласно настоящему изобретению выбранный пептид может состоять из последовательности из 8-40 аминокислотных остатков, такой как последовательность из 8-12 аминокислотных остатков. В некоторых случаях выбранный пептид может быть представлен молекулой МНС I класса, чтобы стимулировать ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Такие эпитопные пептиды могут образовывать по меньшей мере часть или быть получены из опухолеассоциированного антигена (ТАА) или ассоциированного с патогеном антигена (например, вирусного, бактериального или паразитарного антигена). В некоторых случаях выбранный пептид может представлять собой пептидное лекарственное средство, такое как пептид, прицельно воздействующий на внутриклеточную мишень. Одним из примеров такого внутриклеточного прицельно воздействующего пептида является ингибитор домена GIPC-PDZ, описанный в Muders et al., 2009, Clin Cancer Res, Vol. 15(12), pp. 4095-4103 (полное содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки).
Введение и лечение
Наночастицы и композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены пациентам множеством различных путей, включая энтеральные или парентеральные пути. Парентеральное введение включает введение следующими путями: внутривенным, кожным или подкожным, интраназальным, внутримышечным, внутриглазным, трансэпителиальным, интраперитонеальным и местным (включая дермальное, глазное, ректальное, назальное введение, введение путем ингаляции и с использованием аэрозоля), и ректальным системными путями.
Введение можно осуществлять, например, путем инъекции или баллистически с использованием шприца-пистолета для доставки для ускорения трансдермального прохождения через внешний слой эпидермиса. Затем наночастицы могут поглощаться, например, дендритными клетками, которые созревают по мере миграции через лимфатическую систему, что приводит к модуляции иммунного ответа и вакцинированию против эпитопного пептида и/или антигена, из которого эпитопный пептид был получен или часть которого он образует. Наночастицы также могут быть доставлены в аэрозолях. Это стало возможным благодаря малому размеру наночастиц.
Исключительно малый размер наночастиц согласно настоящему изобретению является большим
преимуществом для доставки в клетки и ткани, т.к. они могут поглощаться клетками, даже когда они связаны с прицельно воздействующими или терапевтическими молекулами. Таким образом, наночасти-цы могут интернализоваться клетками, такими как АПК, пептиды могут процессироваться и высвобождаться, например, для представления через I класс МНС или для взаимодействия с внутриклеточными компонентами.
Наночастицы согласно настоящему изобретению могут быть представлены в виде фармацевтических композиций, которые могут находиться в форме твердых или жидких композиций. Такие композиции, как правило, будут содержать какой-либо носитель, например, твердый носитель, такой как желатин, или адъювант, или инертный разбавитель, или жидкий носитель, такой как вода, нефть, масла животного или растительного происхождения, минеральное масло или синтетическое масло. Может быть включен физиологический раствор или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или поли-этиленгликоль. Такие композиции и препараты, как правило, содержат по меньшей мере 0,1 мас.% соединения.
Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в месте поражения активный ингредиент будет находиться в форме парентерально приемлемого водного раствора, который не содержит пирогенных веществ и имеет подходящий рН, изотоничность и стабильность. Специалист в данной области техники может легко приготовить подходящие растворы с использованием, например, растворов соединений или их производного, например, в физиологическом растворе, дисперсии, полученной с помощью глицерина, жидкого полиэтиленгликоля или масел.
В дополнение к одному или более соединениям, возможно в комбинации с другим активным ингредиентом, композиции могут содержать один или более из фармацевтически приемлемого наполнителя, носителя, буфера, стабилизатора, изотонического агента, консерванта или антиоксиданта, или других веществ, хорошо известных специалисту в данной области техники. Такие вещества должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или другого вещества может зависеть от пути введения, например, перорально или парентерально.
Жидкие фармацевтические композиции, как правило, изготавливают таким образом, чтобы они имели рН от примерно 3,0 до 9,0, более предпочтительно от примерно 4,5 до 8,5 и еще более предпочтительно от примерно 5,0 до 8,0. рН композиции можно поддерживать путем использования буфера, такого как ацетат, цитрат, фосфат, сукцинат, Трис (Tris) или гистидин, как правило, используемого в диапазоне от примерно 1 до 50 мМ. рН композиций можно регулировать иным образом путем использования физиологически приемлемых кислот или оснований.
Консерванты, как правило, включают в фармацевтические композиции для замедления роста микроорганизмов, продления срока годности композиций и обеспечения упаковки многократного использования. Примеры консервантов включают фенол, метакрезол, бензиловый спирт, парагидроксибензойную кислоту и ее сложные эфиры, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид бензалкония и хлорид бензетония. Консерванты, как правило, используют в диапазоне от примерно 0,1 до 1,0% (мас./об.).
Предпочтительно фармацевтические композиции вводят индивидууму в профилактически эффективном количестве или терапевтически эффективном количестве (в зависимости от ситуации, хотя профилактика может считаться терапией), которое является достаточным для оказания полезного эффекта для указанного индивидуума. Как правило, оно будет таким, чтобы вызывать терапевтически полезную активность, оказывающую полезный эффект для индивидуума. Фактическое количество вводимых соединений и скорость, и период действия введения будут зависеть от природы и тяжести вылечиваемого состояния. Назначение лечения, например, решения относительно дозировки и т.д., находится в рамках ответственности врачей общей практики и других врачей и, как правило, учитывает нарушение, которое лечат, состояние конкретного пациента, участка доставки, способа введения и других факторов, известных практикующим врачам. Примеры методик и протоколы, упомянутые выше, можно найти в Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA); Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994. В качестве примера, композиции предпочтительно вводят пациентам в дозах от примерно 0,01 до 100 мг активного соединения на кг массы тела и более предпочтительно от примерно 0,5 до 10 мг/кг массы тела.
Очевидно, что когда рассматривается лечение опухолей, лечение включает любую меру, принимаемую врачом для ослабления действия опухоли на пациента. Таким образом, хотя полная ремиссия опухоли является желаемой целью, эффективное лечение также будет включать любые меры, которые могут позволить достичь частичной ремиссии опухоли, а также снизить скорость роста опухоли, включая метастазы. Такие меры могут эффективно продлевать и/или повышать качество жизни и облегчать симптомы заболевания.
Иммунотерапия
Композиции согласно настоящему изобретению, такие как вакцины, определенные в формуле изобретения, в некоторых случаях можно применять для профилактики и лечения заболеваний, таких как рак, и, в частности, для иммунотерапии.
Согласно настоящему изобретению термин "вакцинация" означает активную иммунизацию, т.е.
индукцию специфического иммунного ответа в результате введения, например, подкожным, внутрикож-ным, внутримышечным, пероральным или интраназальным путями, маленьких количеств антигена, который распознается вакцинированным индивидуумом как чужеродный и, следовательно, является имму-ногенным, в подходящем составе. Таким образом, указанный антиген используется в качестве "пускового сигнала" для иммунной системы для развития специфического иммунного ответа на антиген.
В соответствии с настоящим изобретением вакцинация может быть терапевтической или профилактической. В качестве примера, вероятно, можно достичь профилактической защиты от внезапного возникновения ракового заболевания путем вакцинирования индивидуумов, не страдающих раком. Примерами индивидуумов, для которых можно применять такую профилактическую вакцинацию, являются индивидуумы, подвергающиеся повышенному риску развития ракового заболевания, хотя данное применение не ограничивается такими индивидуумами. У пациентов, подвергающихся риску возникновения рака, уже могут быть сформировавшиеся опухоли в виде либо первичных опухолей, либо метастазов, или они могут демонстрировать предрасположенностью к раку.
Для активной иммунизации пациентов, страдающих раком, согласно настоящему изобретению на-ночастицы, как правило, представляют в виде вакцин. Предпочтительно такие фармацевтические препараты содержат фармацевтически приемлемый носитель, который, в качестве примера, может дополнительно содержать вспомогательные вещества, буферы, соли и/или консерванты. Фармацевтические препараты можно применять, например, для профилактики и лечения состояний, связанных с раком, таких как образование метастазов, у пациентов, страдающих раком. При этом антигенпредставляющие клетки особым образом модулируются in vivo или также ex vivo, чтобы вырабатывать иммунный ответ на ТАА.
Для активной иммунизации специфическими антигенам или комбинацией антигенов, как правило, используют состав в виде вакцины, содержащий иммуноген -будь то природный ТАА или его эпитоп, имитатор или неоэпитопный (neoepitope) имитатор - в основном в низких концентрациях, например, в иммуногенном количестве в диапазоне от 0,01 мкг до 10 мг, однако диапазон доз может быть увеличен до диапазона от 100 до 500 мг. В зависимости от иммуногенности антигена для вакцинации, которая определяется, например, последовательностями чужеродных веществ или дериватизацией, или также в зависимости от используемых вспомогательных веществ или адъювантов соответственно, подходящая им-муногенная доза может быть выбрана, например, в диапазоне от 0,01 мкг до 1 мг, предпочтительно от 100 мкг до 500 мкг. Однако депо-вакцина, которую необходимо доставлять в организм в течение длительного периода времени, также может содержать гораздо более высокие количества антигена для вакцинации, например, по меньшей мере от 1 мг до более 100 мг.
Концентрация будет зависеть от количества вводимой жидкой или суспендированной вакцины. Вакцину обычно представляют в готовых к использованию шприцах или ампулах, имеющих объем в диапазоне от 0,01 до 1 мл, предпочтительно от 0,1 до 0,75 мл.
Антиген компонента вакцины предпочтительно представлен в фармацевтически приемлемом носителе, подходящем для подкожного, внутримышечного, а также внутрикожного или трансдермального введения. Другой способ введения действует через слизистую, например, вакцинация путем интрана-зального или перорального введения. Если твердые вещества используют в качестве вспомогательного агента для состава в виде вакцины, например, адсорбат или суспендированная смесь соответственно антигена вакцины с указанным вспомогательным агентом будет введена. В определенных вариантах реализации вакцина представлена в виде раствора или жидкой вакцины в водном растворителе.
Предпочтительно, единицы дозы противоопухолевой вакцины уже представлены в подходящем готовом к использованию шприце или ампуле. Стабильный состав вакцины предпочтительно можно выпускать на рынок в готовой к использованию форме. Хотя содержание консервантов, таких как тимеро-сал, или других консервантов с улучшенной переносимостью необязательно требуется, однако оно может быть предусмотрено в составе для более длительной стабильности при температурах хранения от температур охлаждения до комнатной температуры. Однако вакцина согласно настоящему изобретению также может быть представлена в замороженной или лиофилизированной форме и при необходимости может быть разморожена или восстановлена соответственно.
В некоторых случаях в соответствии с настоящим изобретением иммуногенность вакцины согласно настоящему изобретению может быть увеличена путем использования адъювантов. Для этого используют твердые вещества или адъюванты жидких вакцин, например, гидроксид алюминия (Alu-Gel) или фосфат алюминия, факторы роста, лимфокины, цитокины, такие как IL-2, IL-12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), гамма-интерферон или факторы комплемента, такие как C3d, также липосомные препараты или также составы с дополнительными антигенами, к которым иммунная система уже выработала сильный иммунный ответ, такими как столбнячный анатоксин, бактериальные токсины, такие как экзотоксины синегнойной палочки, и производные липида А и липополисахарида.
В некоторых случаях дополнительный адъювант не используют, в частности, примеры, описанные в настоящем документе, показывают, что эффективной выработки ответа CTL достигают с использованием наночастиц согласно настоящему изобретению без какого-либо добавляемого адъюванта (ср. свободные пептиды, которые обычно вводят совместно с одним или более адъювантами). Это крайне благо
приятно в определенных случаях, т.к. некоторые адъюванты считаются токсичными или по иным причинам неподходящими для применения у человека.
Следующее описание приведено в качестве примера и не ограничивает объем формулы изобретения.
Примеры
Пример 1. Синтез и характеристика наночастиц
Тестируемые лиганды и их идентификационные номера приведены ниже (молекулярная масса); SI-INFEKL (963) (SEQ ID NO: 2)
SIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1021) FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1280) (SEQ ID NO: 3) FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1587) (SEQ ID NO: 4) AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1325) (SEQ ID NO: 5)
HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL (1051)
HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL (1309)
HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL (1616)
HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL (1356) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL (1471) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL (1732) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL (2034) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL (1774)
Тестируемые наночастицы (НЧ) синтезировали с использованием 10 мкМоль хлорида золота (Al-drich 484385), 30 мкМоль глюкозы с тиоэтиловым линкером (GlcC2) и 1,5 мкМоль пептидного лиганда (переменное количество 1,5-3 мг).
Использовали следующий способ; 1,5 мкмоль пептида растворяли в 2 мл метанола с последующим добавлением 30 мкмоль GlcC2 в 200 мкл метанола и 116 мкл водного хлорида золота, содержащего 10 мкМоль Au. Образец перемешивали на вортексе в течение 30 с, встряхивали в течение приблизительно 5 минут, а затем при быстром перемешивании на вортексе в течение в общей сложности 30 с добавляли 200 мкл 1M NaBH4, пробирки герметично закрывали, а затем осторожно встряхивали в течение 1,5 ч.
Образцы центрифугировали в настольной центрифуге, надосадочную жидкость удаляли, и темный осадок растворяли в 2 мл воды, а затем переносили в Vivaspin 10кДа для промывки 2 мл воды в общей сложности 4 раза, каждый в течение 8 мин на 5 тыс. об/мин. Наночастицы (НЧ) извлекали из Vivaspin и доводили водой до объема 500 мкл, затем их подвергали центрифугированию в настольной центрифуге на 15 тыс. об/мин с удалением любых крупных агрегатов.
Содержание золота после центрифугирования/получения по данным внутреннего анализа показано ниже, 100% выход составил бы 1,97 мг.
Общее
содержание
Аи, мг
1,14
0,03
0,00
0,05
1,34
1,06
1,59
1,69
1,37
1,49
Glc
1,02
НЧ 3, 4 и 5 демонстрировали значительную почти полную агрегацию, добавление ДМСО к данным агрегатам не приводило к солюбилизации данных частиц.
Остальные образцы НЧ повторно центрифугировали с удалением любых новых агрегатов и брали аликвоты для проведения анализов позже, в частности, на предмет содержания золота и пептидов. Одну из аликвот доводили водой до объема 500 мкл, указывали дату и помечали, затем их использовали для тестирования представления антигенов лейкоцитов человека (HLA).
Окончательный анализ данных 500 мкл образцов на предмет представления HLA был следующим:
Используемые соотношения лигандов были такими, что 2 пептида теоретически должны были быть присоединены к каждой НЧ из приблизительно 100 атомов Au, данные, приведенные выше, позволяют предположить приблизительно 6-8 пептидов/100 атомов Au. Это может быть просто артефактом метода ВСА (и стандарта BSA), используемого для измерения пептидов, связанных с НЧ, или, возможно, присоединением пептидных лигандов.
Анализ содержания пептидов одновременно имеет критическое значение и является сложным в данном случае, использовали метод ВСА. К сожалению, НЧ золота демонстрируют большое поглощение в УФ/видимой области, поэтому в дополнение к исследованию тестируемых образцов, аликвоты НЧ также измеряли в воде и в качестве раствора сравнения использовали воду с определением поглощения при длине волны 565 нм, используемой в анализе ВСА, данное поглощение составляло приблизительно 20% значения тестируемого образца в анализе ВСА и его индивидуально корректировали. Однако данная корректировка позволяет предположить, что комплекс пептид-НЧ, подвергнутый анализу ВСА, по-прежнему будет сохранять такое же поглощение, наблюдаемое для свободной НЧ, вдобавок к специфичному компоненту ВСА; это согласуется с высокими коэффициентами экстинкции, наблюдаемыми в случае лишь чистых НЧ золота.
В таблице выше * относится к количественному определению, относящемуся к стандарту BSA, первоначально на основе массы, затем преобразованной в моли пептида, в столбце ** индивидуальные пептидные лиганды использовали в качестве стандартов.
Первоначальные анализы с использованием Sephadex G-50 с элюированием ФБР для попытки отделить пептид, связанный с НЧ, в свободной форме, выполненные главным образом с использованием НЧ6, позволяют предположить, что препараты НЧ загрязняет малое количество/отсутствие свободного лиганда. Йод использовали для высвобождения всех лигандов, связанных с НЧ, йод стал появляться во фракциях 16+ для фиг. 1.
Затем использовали фракции больших размеров и эквивалентные количества НЧ до и после обработки йодом, высвобожденный с помощью йода пептид элюировали с пиком во фракции 10, данное вещество оказалось меньше стандартного пептида, возможно из-за того, что последний окисляется/является димерным. Индивидуальные корректировки также использовали для непептидного поглощения из НЧ6, почти эквивалентные площади под кривой получали для скорректированных НЧ6 и НЧ6+йод.
Получение НЧ 8 и 12
НЧ 8 и 12 успешно получали способами, описанными выше; данные количественного определения, приведенные ниже, представлены для используемого впоследствии 500 мкл образца, который, в свою очередь, составляет 60% от всего препарата
Au, мкмоль
пептид, нмоль*
5,28
175
3,21
*Определено методом с использованием Кумасси Повторное получение НЧ 2-5
НЧ 2-5 получали путем изменения с использованием 75% метанола, а не 95% на стадии синтеза. НЧ2 представляли собой "нормальные" НЧ как и ранее, НЧ 3, 4 и 5, как и ранее, образовывали агрегаты, данные агрегаты были не растворимы в воде, 10% уксусной кислоте, ФБР, ДМСО или ДМФА, однако
300 мМ NaOH действительно приводил к полной солюбилизации НЧ.
Дополнительный синтез осуществляли с использованием Sephadex G-50 для удаления любого свободного пептида. Данные НЧ получали, как указано выше, но со следующими изменениями:
Свободные пептиды не были полностью растворимы в МеОН, поэтому в дополнение к 2 мл МеОН добавляли 100 мкл воды плюс для Ч8 70 мкл 1М NaOH и для 49 только 20 мкл NaOH, который был необходим для осуществления полной солюбилизации пептидов. NaOH совместим с синтезом НЧ, вода и щелочь уменьшали конечный %МеОН после восстановления борогидридом до 82 и 83,5% для НЧ8 и НЧ9 соответственно.
Включали дополнительный этап промывки после первоначального осаждения путем центрифугирования после восстановления, но перед использованием Vivaspin, его выполняли с использованием 2 мл МеОН и 100 мкл 1М NaCl.
После использования Vivaspin половину каждого препарата подвергали пропусканию через колонку Sephadex G-50, элюируемую ФБР, собирали фракции и измеряли аликвоты на предмет белка с помощью ВСА, объединяли узкие фракции, соответствующие основным пикам белковых соединений, а затем снова подвергали обработке в Vivaspin с промывками водой для осуществления замены растворителя.
Только половину препарата НЧ пропускали через G-50, обнаруживали, что полученные характеристики и пулы по существу не содержали свободный пептид. Коричневую окраску НЧ можно было визуально наблюдать до фракции 12, в отдельном анализе 50 мкл исходного препарата повторно анализировали в тех же условиях и измеряли поглощение при 515 нм (которое позволяет детектировать НЧ Au, а не свободные пептиды), и оно показывает, если НЧ покидает колонку G-50.
Конечное объединенное в пул вещество имело следующие характеристики:
НЧ8
НЧ9
Объем, мл
0,5
0,5
Пептид по данным ВСА (BSA станд ), мкг/мл
638
490
Теоретическое содержание пептида, мкг/мл
225
118
Au, мг/мл
1,30
0,81
Теоретические значения определяли путем предположения 44 лигандов/100Au, случайной конкуренции между двумя лигандами в момент образования НЧ и выхода Au. Высвобождение лиганда НЧ с помощью йодида
Аликвоту НЧ9 смешивали с 4-кратным избытком объема 1М KI и оставляли при 4°С в течение 4 дней для полного высвобождения лиганда. Через 4 дня вещество центрифугировали и прозрачную надо-садочную жидкость пропускали через G-50, и фракции собирали, и анализировали с помощью ВСА. Проанализированное количество НЧ9 после KI было ровно в два раза больше количества, использованного только для НЧ9 (коррекцию 1,1 использовали для различий поглощения в серии анализов), было обнаружено, что площади были почти точно 2:1, что позволяло предположить полное удаление лиганда. Количество высвобожденного лиганда определяли с использованием 2 анализов: Кумасси и ВСА в сочетании с 2 стандартами, пептидом 9 и BSA, и оно приведено в таблице ниже.
Используемый белок, станд.
Кумасси, мкг
ВСА, мкг
BSA
377
611
Пептид 9
2210
1062
Данные в таблице были скорректированы до общего ожидаемого выхода для всего препарата.
В заключение, были синтезированы пептидсодержащие НЧ. Указанные пептидсодержащие НЧ по существу не содержат загрязняющие свободные пептиды благодаря простому использованию гель-фильтрационной хроматографии на Sephadex G-50.
Йодид успешно использовали для высвобождения пептида, связанного с НЧ, и он позволял получить количественные данные выхода.
Пример 2 - оценка анализов представления
Рецепторы Т-клеток (TCR) располагаются на поверхности Т-лимфоцитов и распознают пептиды в рамках главного комплекса гистосовместимости (МНС) (1). Как правило, антигенпредставляющие клетки (АПК) содержат "аппарат" для процессирования белков и их "загрузки" на пустой МНС. Тогда как CD4+ Т-клетки распознают II класс МНС (MHCII), CD8+ Т-клетки реагируют на I класс МНС (MHCI). Традиционно, пептиды MHCII происходят из эндоцитозированных компонентов внеклеточной среды. MHCI, напротив, "загружает" процесссированные пептиды из внутриклеточного источника (1, 2).
SIINFEKL (SEQ ID NO: 2), пептидный эпитоп, полученный из овальбумина (OVA), представляется
в рамках аллеля MHCI мыши, называемого (3). Если OVA экспрессируется в клетки мыши, экс-
прессирующей H-2Kb, SIINFEKL представляется обычным способом. Однако если OVA доставляется экзогенно, SIINFEKL может быть представлен альтернативным способом, известным как перекрестное представление MHCI (4, 5). В действительности, соответствующая гаплотипу мышь, иммунизированная OVA, вырабатывает иммунодоминантный ответ на SIINFEKL (SEQ ID NO: 2).
Поэтому было разработано много реагентов для анализа представления данного пептида с целью дальнейшего понимания традиционного и альтернативного представления MHCI. Данные реагенты могут быть использованы для проведения экспериментов с возможными химическими связями пептидов в наночастицах. Таким образом, можно обнаружить какая связь легче всего процессируется в линии клеток мыши.
Результаты и обсуждение
Проточная цитометрия как средство измерения представления
Для анализа связи эпитопа с наночастицами авторы настоящего изобретения сначала оптимизировали анализ считывания для представления эпитопа, высвобождаемого из наночастицы. С этой целью оценивали представление SIINFEKL в клетках LKb. Как указано ранее, существует больше одного реагента. Из двух тестируемых способов, один основан на проточной цитометрии, тогда как другим является способ на основе клеток. Способ на основе проточной цитометрии начинается с активации клеток LKb различными количествами пептида SIINFEKL. После выделения достаточного количества времени на связывание пептида с поверхностными молекулами Kb, клетки промывали и инкубировали совместно с антителом 25.D1.16, специфичным в отношении комплекса SIINFEKL:Kb. Затем клетки метили вторично и подвергали анализу способом проточной цитометрии с использованием неактивированных клеток в качестве фонового показателя. Было обнаружено, что данный способ позволял детектировать поверхностные комплексы, когда клетки активировали до 5 нг/мл.
Активация Т-клеток как мера представления антигена
Другой формой представления эпитоп-специфического антигена является измерение активации Т-клеток пептидным комплексом MHCI. В данном случае авторы настоящего изобретения использовали B3Z (линия Т-клеток, специфичная в отношении пептида OVA), распознающую SIINFEKL в рамках Kb. В качестве удобной меры данная линия Т-клеток содержит р-галактозидазу, клонированную с помощью промотора NFAT. После распознания пептида и активации Т-клеток, р-галактозидаза экспрессируется и превращение детектируемого субстрата служит отличной мерой представления антигена Т-клеткам.
Для оценки данного способа авторы настоящего изобретения проводили схожий эксперимент, что описан выше. Клетки LKb активировали пептидом SIINFEKL, промывали, а затем инкубировали совместно с линией Т-клеток B3Z в течение ночи. На следующий день клетки лизировали и р-галактозидазу измеряли с использованием люминесцентного субстрата. Как и ожидали, разрешение данного способа было схоже с предыдущим способом с пределом детектирования при приблизительно 5 нг/мл.
Следовательно, оба способа демонстрировали приблизительно одинаковое разрешение и их выбирали для использования в оценке конструкций наночастица-пептид.
Материалы и методы
Линии клеток
Клетки LKb представляют собой фибробласты мыши, и они являлись используемой первичной линией. В частности, они представляют собой клетки L929, стабильно экспрессирующие молекулу H-2Kb мыши.
Синтетические пептиды
Синтетические пептиды SIINFEKL (OVA 257-264) (SEQ ID NO: 2) приобретали у Genscript США (Пискатауэй, Нью-Джерси). Пептиды ресуспендировали до 5 мг/мл в ДМСО и активировали ими клетки в концентрации, указанной на фигурах.
Т-клеточные гибридомы
Специфичная в отношении SIINFEKL:Kb Т-гибридома (B3Z) экспрессирует Р-галактозидазу после распознавания комплексов пептид-I класс МНС, и была описана ранее (3, 6). Т-клеточные гибридомы выдерживали в полной среде RPMI плюс 10% FCS и 0,05 мМ 2-МЕ. Активацию измеряли с использованием люминесцентного субстрата "Galactolight Plus" (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Интенсивность света измеряли с использованием планшет-ридера TopCount NXT (Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс).
Проточная цитометрия
Клетки LKb обрабатывали различными количествами пептидов SIINFEKL (SEQ ID NO: 2). После инкубации в течение 2 ч клетки собирали, промывали один раз ФБР, а затем инкубировали в течение 1 ч совместно с надосадочной жидкостью культуры 25.D1.16 (моноклональное антитело, специфичное в отношении комплекса SIINFEKL с Н^^) (7) на льду. Затем клетки промывали два раза в ФБР и инкубировали в течение 30 минут на льду совместно с меченым флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) вторичным антителом козы к IgG мыши (Caltag Laboratories, Бурлингейм, Калифорния). Наконец, клетки промывали два раза ФБР и ресуспендировали в ФБР + 0,1% BSA для проточной цитометрии на проточном цитомет-ре Guava EasyCyte Plus (Millipore, Биллерика, Массачусетс) и анализировали с использованием прила-
гаемого программного обеспечения. Анализы представления антигена
Для анализа представления SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) с использованием способа проточной цито-метрии или способа на основе клеток авторы настоящего изобретения активировали клетки LKb в 15 мл конической пробирке при 37°С в течение 2 часов. После данной инкубации клетки один раз промывали ФБР, а затем подвергали детектированию с использованием проточной цитометрии или добавляли к клеткам B3Z в соотношении эффектор-мишень, составляющем 1:1.
Ссылки
1. Vyas, J.M., A.G. Van der Veen, and H.L. Ploegh. 2008. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature reviews 8:607-618.
2. Hansen, T.H., and M. Bouvier. 2009. MHC class I antigen presentation: learning from viral evasion strategies. Nature reviews 9:503-513.
3. Shastri, N., and F. Gonzalez. 1993. Endogenous generation and presentation of the ovalbumin pep-tide/Kb complex to T cells. Journal of Immunology 150:2724-2736.
4. Amigorena, S., and A. Savina. 2010. Intracellular mechanisms of antigen cross presentation in dendritic cells. Current opinion in immunology 22:109-117.
5. Blanchard, N., and N. Shastri. 2010. Cross-presentation of peptides from intracellular pathogens by MHC class I molecules. Annals of the New York Academy of Sciences 1183:237-250.
6. Tewari, M.K., G. Sinnathamby, D. Rajagopal, and L. С Eisenlohr. 2005. A cytosolic pathway for MHC class II-restricted antigen processing that is proteasome and TAP dependent. Nature immunology 6:287-294.
7. Porgador, A., J.W. Yewdell, Y. Deng, J.R. Bennink, and R. N. Germain. 1997. Localization, quantitation, and in situ detection of specific peptide-MHC class I complexes using a monoclonal antibody. Immunity 6:715-726.
Пример 3. Анализы представления комплекса наночастица-пептид
Тестируемые лиганды, перечисленные ниже, получали и присоединяли к наночастицам золота (НЧЗ) с помощью химии линкеров, описанной выше.
1. SIINFEKL (SEQ ID NO: 2)
2. SIINFEKL-N-(CH2)2-SH
3. FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (SEQ ID NO: 3)
4. FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (SEQ ID NO: 4)
5. AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (SEQ ID NO: 5)
6. HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL
7. HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL
8. HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL
9. HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL
10. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL
11. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL
12. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL
13. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL
SIINFEKL (SEQ ID NO: 2), эпитоп, полученный из овальбумина, который представляется в рамках
молекулы MHCI мыши измеряли с использованием двух способов. В одном способе использовали
подобное TCR антитело, называемое 25.D1.16, также называемое Angel, которое распознает комплекс SIINFEKL/MHCI. Кроме того, авторы настоящего изобретения оценивали представление с использованием B3Z, гибридомы CTL, специфичной в отношении пептида SIINFEKL, которая экспрессирует бета-галактозидазу под контролем промотора NFAT (сигнальная молекула CTL), который при активации экс-прессирует бета-галактозидазу, измеряемую с помощью светоизлучающего субстрата.
A. Анализ НЧЗ
Для оценки способности клеток процессировать и представлять SIINFEKL, связанный с НЧЗ, авторы настоящего изобретения использовали фибробласты мыши L-Kb. Как показано на фиг. 1, НЧЗ 8, 9, 12 и 13 демонстрировали хорошее процессирование и представление. Было обнаружено, что это имело место как для способов на основе проточной цитометрии (фиг. 1A-D - процессирование), так и для способов на основе CTL (фиг. 1E - представление). Таким образом, FLAAYSIINFEKL (SEQ ID NO: 4) и AAY-SIINFEKL (SEQ ID NO: 5) демонстрировали превосходное процессирование SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) in vitro (подчеркнутый участок показывает пептидную часть линкера). Кроме того, как показано на фиг. 1E, было обнаружено, что HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH с точки зрения химии лучше процессируется, чем HS(CH2)2-CONH. Однако было обнаружено, что HS(CH2)2-CONH все же очень эффективно процессируется. Кроме того, авторы настоящего изобретения отмечают дозозависимое уменьшение представления с отсутствием детектирования при 0,01 мкг/мл.
B. Анализ свободного пептида
Было важно рассмотреть возможное влияние любого свободного пептида, присутствующего в образцах наночастиц (фиг. 2А-В). Поэтому авторы настоящего изобретения оценивали насколько эффективно представляется соответствующий свободный пептид из каждого препарата. Как и в ггоедьщущих
экспериментах, клетки LKb активировали в течение 2 ч тремя концентрациями НЧЗ или свободного пептида. Представление оценивали путем проточной цитометрии (фиг. 2C-F) или анализа B3Z (фиг. 2G-H). Исходя из данных результатов, авторы настоящего изобретения пришли к заключению, что свободный пептид хорошо представляется. Наконец, авторы настоящего изобретения пытались определить является ли процессирование необходимым для представления данных свободных пептидов. Для тестирования было необходимо активировать пептиды на льду по сравнению с 37°С. При 37°С клетки могут поглощать пептид и процессировать его в пределах эндосомы, однако на льду пептид может быть лишь "загружен" на поверхность без процессирования. В действительности авторы настоящего изобретения обнаружили, что свободные пептиды с линкерами, в целом, нуждаются в процессировании, тогда как пептид без линкера может быть представлен (фиг. 2I-N) без какого-либо процессирования.
C. Анализ препаратов, не содержащих свободный пептид
Принимая во внимание результаты, демонстрирующие возможное влияние загрязняющих свободных пептидов, получали очищенные препараты. Проводили очистку НЧЗ (8 и 9) с использованием колонки Sephadex G-50 с полным удалением свободного пептида (фиг. 3А-В). Наконец, повторяли эксперименты, указанные выше, с использованием гфедыдущих и более новых препаратов в том же анализе. Авторы настоящего изобретения продлевали двухчасовую инкубацию до периода инкубации в течение ночи, который, как было показано, был достаточным для представления SIINFEKL (данные не приведены). В результате анализа способом проточной цитометрии авторы настоящего изобретения обнаружили, что образцы, не содержащие свободный пептид, действуют так же как и образцы, содержащие пептид (фиг. 3С-Е). Затем данные результаты подтверждали с использованием анализа B3Z (фиг. 3F). Следовательно, очевидно, что НЧЗ 8 и 9 служат в качестве возможного варианта доставки пептида в антиген-представляющую клетку для представления MHCI.
D. Выводы
НЧЗ 8, 9, 12 и 13 очень хорошо процессируются и представляются по сравнению с остальными.
Это соответствует последовательностям FLAAYSIINFEKL (SEQ ID NO: 4) и AAYSIINFEKL (SEQ
ID NO: 5), которые являются лучшими для представления SIINFEKL (SEQ ID NO: 2) in vitro (пептидная часть линкера подчеркнута).
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH с точки зрения химии лучше процессируется, чем HS(CH2)2-CONH. Однако HS(CH2)2-CONH также очень хорошо процессируется и при этом является более экономически эффективным.
Загрязняющий свободный пептид может обуславливать представление.
Более новые препараты, не содержащие свободный пептид, также хорошо процессируются и представляются.
Это позволяет предположить, что НЧЗ 8 и 9 эффективно процессируются для представления SIIN-FEKL (SEQ ID NO: 2).
Полное содержание всех источников, приведенных в настоящем описании, включено в настоящее описание посредством ссылки и для всех целей так же, как если бы полное содержание каждой индивидуальной публикации или патента, или заявки на патент было специально включено отдельно.
Конкретные варианты реализации, описанные в настоящем документе, предложены в качестве примера и не являются ограничивающими. Любые подзаголовки в настоящем описании включены лишь для удобства и их не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение каким-либо образом.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Наночастица для применения при выработке ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), указанная наночастица содержит:
(i) ядро, содержащее атом металла и/или полупроводника;
(ii) корону, содержащую множество лигандов, ковалентно связанных с ядром, при этом, по меньшей мере, первый лиганд из указанного множества содержит углеводный фрагмент, ковалентно связанный с ядром через первый линкер, или содержит глутатион, и при этом, по меньшей мере, второй лиганд из указанного множества содержит эпитопный пептид, который состоит из последовательности из 8-12 аминокислотных остатков и связывается с молекулой I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), причём указанный эпитопный пептид ковалентно связан с ядром через второй линкер, при этом указанный второй линкер содержит
пептидную часть и непептидную часть, при этом указанная пептидная часть указанного второго линкера содержит последовательность X1X2Z1, где
X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; Х2 представляет собой аминокислоту, выбранную из А и G; и Z1 представляет собой аминокислоту, выбранную из Y и F,
и при этом указанная непептидная часть включает С2-С15 алкил и/или С2-С15 гликоль.
2. Наночастица по п.1, отличающаяся тем, что указанная пептидная часть указанного второго лин
кера содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из:
(i) AAY и
(ii) FLAAY (SEQ ID NO: 1).
3. Наночастица по п.2, отличающаяся тем, что указанный второй лиганд выбран из группы, состоящей из:
(i) HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2;
(ii) HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2;
(iii) HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2;
(iv) HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2;
(v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2 и
(vi) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2,
где Z2 представляет собой указанный эпитопный пептид.
4. Наночастица по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанный эпитопный пептид образует по меньшей мере часть или получен из опухолеассоциированного антигена (ТАА) или вирус-, бактериально- или паразитассоциированного антигена.
График 2: Выбранная область для анализа: Область 1 График 2: Выбранная область для анализа: Область 1
НЧ32 НЧ36
Фиг. 1А
НЧ37
Фиг.
НЧ39
Старые НЧ38 Старые НЧ39
Фиг. 3С
График 2: Выбранная область для анализа: Область 1
Новые НЧ38
Фиг. 3D
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025758
- 1 -
(19)
025758
- 1 -
(19)
025758
- 4 -
(19)
025758
- 16 -
025758
- 17 -
025758
- 20 -
|
