[RU]

1. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию; указанный водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МРС); указанный углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO ₄ ), тетраацетата свинца (Pb(OAc) ₄ ) и перрутената калия (KRuO ₄ ); причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь; при этом образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, таким как м-толуидин.

2. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые позволяют конъюгацию; упомянутый терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia); упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь; причем образование упомянутой оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, который представляет собой м-толуидин.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что величина рН раствора, содержащего исходную концентрацию терапевтического белка от 0,3 до 3,0 мг/мл, доводится до величины от 5,0 до 8,0 перед контактированием с активированным водорастворимым полимером.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка равна 1,0 мг/мл, а рН равен 6,0.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтический белок контактирует с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, причем избыточная концентрация составляет от 1- до 300-молярного избытка.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что избыточная концентрация равна 50-кратному молярному избытку.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что условия включают период времени 120 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

9. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация нуклеофильного катализатора составила от 1,0 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что итоговая концентрация нуклеофильного катализатора равна 10 мМ, а условия включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

11. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислитель добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация окислителя составила от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что итоговая концентрация окислителя равна 400 мкМ, а условия включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

13. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгацию водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, натрия метабисульфита (Na ₂ S ₂ O ₅ ), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гасителем является L-цистеин.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что L-цистеин добавляют до итоговой концентрации 10 мМ, а условия включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

16. Способ по п.2, отличающийся тем, что включает: а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН от 5,0 до 8,0, при этом концентрация терапевтического белка составляет от 0,3 до 3,0 мг/мл; б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтическом белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой концентрации от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация составляет от 1-молярного избытка до 300-молярного избытка, в условиях, включающих период времени от 0,5 до 24 ч, температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от 1 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка, в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, Na ₂ S ₂ O ₅ (натрия метабисульфита), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

17. Способ по п.2, отличающийся тем, что он включает: а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН, равного 6,0, где исходная концентрация терапевтического белка равна 1 мг/мл; б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтическом белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой концентрации 400 мкМ, в условиях, которые включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация составляет 50-молярный избыток, в условиях, включающих период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила 10 мМ, в условиях, которые включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка, в условиях, которые включают период времени 2 ч, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; и е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем добавления гасителя, представляющего собой L-цистеин, при этом L-цистеин добавляется до итоговой концентрации в 10 мМ, а условия на шестом этапе включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание.

18. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.

19. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПЭГ.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК содержит 10-300 единиц сиаловой кислоты.

21. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-IX.

22. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIIa.

23. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIII.

24. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислителем является натрия периодат (NaIO ₄ ).

25. Способ по п.23, отличающийся тем, что окисленный углеводный фрагмент терапевтического белка расположен в активационном пептиде белка системы свертывания крови.

26. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК подготавливают путем взаимодействия активированного аминооксисшивающего агента с окисленной ПСК; при этом аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из: а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина формулы б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы при этом ПСК окислена путем инкубирования с окислителем для образования терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве аминооксисшивающего агента используют 3-оксапентан-1,5-диоксиамин.

28. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве окислителя используют NaIO ₄ .

29. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор вводится в концентрации 1-50 мМ.

30. Способ по п.2, отличающийся тем, что м-толуидин находится при реакции конъюгирования в концентрации 10 мМ.

31. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап восстановления оксимной связи в конъюгированном терапевтическом белке путем инкубирования конъюгированного терапевтического белка в буфере, содержащем восстановитель, выбранный из группы, состоящей из цианоборогидрида натрия (NaCNBH ₃ ), аскорбиновой кислоты (витамина С) и NaBH ₃ .

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что в качестве восстановителя используют цианоборогидрид натрия (NaCNBH ₃ ).

33. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап очистки конъюгированного терапевтического белка.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищается способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии,фильтрации и осаждения.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), ионообменной хроматографии (IEC), эксклюзионной хроматографии (SEC), аффинной хроматографии и обратно-фазовой хроматографии.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что на хроматографическом этапе загрузки и хроматографическом этапе промывания используют антихаотропическую соль.

37. Способ по п.35, отличающийся тем, что хроматографию выполняют в колонке.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что в колонке содержится хроматографическая смола, выбранная из группы, состоящей из фенил-сефарозы FF и бутил-сефарозы FF.

39. Способ по п.38, отличающийся тем, что в колонке находится слой смолы высотой от 5 до 20 см.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что высота слоя составляет 10 см.

41. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов отмывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин.

42. Способ по п.41, отличающийся тем, что скорость потока составляет 2 см/мин.

43. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от 0,1 до 6,7 см/мин.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что скорость потока составляет 1 см/мин.

45. Способ по п.33, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).

46. Способ по п.33, отличающийся тем, что итоговая концентрация терапевтического белка составляет от 0,5 до 3 мг/мл.

47. Способ по п.33, отличающийся тем, что терапевтический белок включает 5-11 фрагментов водорастворимого полимера.

48. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищают при помощи хроматографии; при этом на этапе загрузки и на этапе промывки используют антихаотропическую соль; при этом способ включает один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин, и один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин; и дополнительно включает концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ).

49. Способ по п.48, отличающийся тем, что хроматография является хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC); при этом скорость потока на одном или более этапов промывки равна 2 см/мин; и при этом скорость потока на одном или более этапов элюирования равна 1 см/мин.

50. Модифицированный терапевтический белок, получаемый способом по п.2.

51. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

52. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia); при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

53. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи; при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

54. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи; при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia); при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

55. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

56. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

57. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

58. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе б), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; г) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

59. Способ по п.55, отличающийся тем, что окисленный водорастворимый полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС), при этом упомянутый водорастворимый полимер окисляется путем инкубирования с окислителем с образованием терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце водорастворимого полимера.

60. Способ по п.59, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.

61. Способ по п.59, отличающийся тем, что окислителем является NaIO ₄ .

62. Способ по п.55, отличающийся тем, что аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из: а) сшивающего агента 3-оксапентан-1,5-диоксиамина формулы б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы

63. Способ по п.56, отличающийся тем, что восстановитель выбирают из группы, состоящей из натрия цианоборогидрида (NaCNBH ₃ ), аскорбиновой кислоты (витамин С) и NaBH ₃ .

64. Способ по п.63, отличающийся тем, что восстановителем является натрия цианоборогидрид (NaCNBH ₃ ).

65. Способ по п.57, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы дать итоговую концентрацию от 1,0 до 50 мМ нуклеофильного катализатора.

66. Способ по п.55, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).

67. Модифицированный терапевтический белок, полученный способом по п.1, где терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia).

68. Модифицированный терапевтический белок по п.67, где белок выбран из группы, состоящей из фактора Ф-VIIa, фактора Ф-VIII и фактора Ф-IX, и где водорастворимый полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полисалициловой кислоты (ПСК).

(57) Реферат / Формула:

1. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию; указанный водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МРС); указанный углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO ₄ ), тетраацетата свинца (Pb(OAc) ₄ ) и перрутената калия (KRuO ₄ ); причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь; при этом образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, таким как м-толуидин.

2. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые позволяют конъюгацию; упомянутый терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia); упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь; причем образование упомянутой оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, который представляет собой м-толуидин.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что величина рН раствора, содержащего исходную концентрацию терапевтического белка от 0,3 до 3,0 мг/мл, доводится до величины от 5,0 до 8,0 перед контактированием с активированным водорастворимым полимером.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка равна 1,0 мг/мл, а рН равен 6,0.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтический белок контактирует с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, причем избыточная концентрация составляет от 1- до 300-молярного избытка.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что избыточная концентрация равна 50-кратному молярному избытку.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что условия включают период времени 120 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

9. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация нуклеофильного катализатора составила от 1,0 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что итоговая концентрация нуклеофильного катализатора равна 10 мМ, а условия включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

11. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислитель добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация окислителя составила от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что итоговая концентрация окислителя равна 400 мкМ, а условия включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

13. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгацию водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, натрия метабисульфита (Na ₂ S ₂ O ₅ ), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гасителем является L-цистеин.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что L-цистеин добавляют до итоговой концентрации 10 мМ, а условия включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

16. Способ по п.2, отличающийся тем, что включает: а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН от 5,0 до 8,0, при этом концентрация терапевтического белка составляет от 0,3 до 3,0 мг/мл; б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтическом белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой концентрации от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация составляет от 1-молярного избытка до 300-молярного избытка, в условиях, включающих период времени от 0,5 до 24 ч, температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от 1 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка, в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, Na ₂ S ₂ O ₅ (натрия метабисульфита), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

17. Способ по п.2, отличающийся тем, что он включает: а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН, равного 6,0, где исходная концентрация терапевтического белка равна 1 мг/мл; б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтическом белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой концентрации 400 мкМ, в условиях, которые включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация составляет 50-молярный избыток, в условиях, включающих период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила 10 мМ, в условиях, которые включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка, в условиях, которые включают период времени 2 ч, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание; и е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем добавления гасителя, представляющего собой L-цистеин, при этом L-цистеин добавляется до итоговой концентрации в 10 мМ, а условия на шестом этапе включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание.

18. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.

19. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПЭГ.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК содержит 10-300 единиц сиаловой кислоты.

21. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-IX.

22. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIIa.

23. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIII.

24. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислителем является натрия периодат (NaIO ₄ ).

25. Способ по п.23, отличающийся тем, что окисленный углеводный фрагмент терапевтического белка расположен в активационном пептиде белка системы свертывания крови.

26. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК подготавливают путем взаимодействия активированного аминооксисшивающего агента с окисленной ПСК; при этом аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из: а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина формулы б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы при этом ПСК окислена путем инкубирования с окислителем для образования терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве аминооксисшивающего агента используют 3-оксапентан-1,5-диоксиамин.

28. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве окислителя используют NaIO ₄ .

29. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор вводится в концентрации 1-50 мМ.

30. Способ по п.2, отличающийся тем, что м-толуидин находится при реакции конъюгирования в концентрации 10 мМ.

31. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап восстановления оксимной связи в конъюгированном терапевтическом белке путем инкубирования конъюгированного терапевтического белка в буфере, содержащем восстановитель, выбранный из группы, состоящей из цианоборогидрида натрия (NaCNBH ₃ ), аскорбиновой кислоты (витамина С) и NaBH ₃ .

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что в качестве восстановителя используют цианоборогидрид натрия (NaCNBH ₃ ).

33. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап очистки конъюгированного терапевтического белка.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищается способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии,фильтрации и осаждения.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), ионообменной хроматографии (IEC), эксклюзионной хроматографии (SEC), аффинной хроматографии и обратно-фазовой хроматографии.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что на хроматографическом этапе загрузки и хроматографическом этапе промывания используют антихаотропическую соль.

37. Способ по п.35, отличающийся тем, что хроматографию выполняют в колонке.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что в колонке содержится хроматографическая смола, выбранная из группы, состоящей из фенил-сефарозы FF и бутил-сефарозы FF.

39. Способ по п.38, отличающийся тем, что в колонке находится слой смолы высотой от 5 до 20 см.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что высота слоя составляет 10 см.

41. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов отмывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин.

42. Способ по п.41, отличающийся тем, что скорость потока составляет 2 см/мин.

43. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от 0,1 до 6,7 см/мин.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что скорость потока составляет 1 см/мин.

45. Способ по п.33, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).

46. Способ по п.33, отличающийся тем, что итоговая концентрация терапевтического белка составляет от 0,5 до 3 мг/мл.

47. Способ по п.33, отличающийся тем, что терапевтический белок включает 5-11 фрагментов водорастворимого полимера.

48. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищают при помощи хроматографии; при этом на этапе загрузки и на этапе промывки используют антихаотропическую соль; при этом способ включает один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин, и один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин; и дополнительно включает концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ).

49. Способ по п.48, отличающийся тем, что хроматография является хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC); при этом скорость потока на одном или более этапов промывки равна 2 см/мин; и при этом скорость потока на одном или более этапов элюирования равна 1 см/мин.

50. Модифицированный терапевтический белок, получаемый способом по п.2.

51. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

52. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia); при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

53. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи; при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

54. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO ₄ ), свинца тетраацетата (Pb(OAc) ₄ ) и калия перрутената (KRuO ₄ ); б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи; при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia); при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС); при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

55. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

56. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

57. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

58. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; в) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе б), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; г) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

59. Способ по п.55, отличающийся тем, что окисленный водорастворимый полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG ®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС), при этом упомянутый водорастворимый полимер окисляется путем инкубирования с окислителем с образованием терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце водорастворимого полимера.

60. Способ по п.59, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.

61. Способ по п.59, отличающийся тем, что окислителем является NaIO ₄ .

62. Способ по п.55, отличающийся тем, что аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из: а) сшивающего агента 3-оксапентан-1,5-диоксиамина формулы б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы

63. Способ по п.56, отличающийся тем, что восстановитель выбирают из группы, состоящей из натрия цианоборогидрида (NaCNBH ₃ ), аскорбиновой кислоты (витамин С) и NaBH ₃ .

64. Способ по п.63, отличающийся тем, что восстановителем является натрия цианоборогидрид (NaCNBH ₃ ).

65. Способ по п.57, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы дать итоговую концентрацию от 1,0 до 50 мМ нуклеофильного катализатора.

66. Способ по п.55, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).

67. Модифицированный терапевтический белок, полученный способом по п.1, где терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia).

68. Модифицированный терапевтический белок по п.67, где белок выбран из группы, состоящей из фактора Ф-VIIa, фактора Ф-VIII и фактора Ф-IX, и где водорастворимый полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полисалициловой кислоты (ПСК).

---

Евразийское ои 025738 (13) В9
патентное
ведомство
(12) ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(15) Информация об исправлении (51) Int. Cl. A6IK47/48 (2006.01)
Версия исправления: 1 (W1 В1)
исправления в описании:стр.5
исправления в формуле: п.17 (48) Дата публикации исправления
2018.05.31, Бюллетень №5'2018 (45) Дата публикации и выдачи патента
2017.01.30
(21) Номер заявки 201300190
(22) Дата подачи заявки
2011.07.29
(31) 61/369,186
(32) 2010.07.30
(33) US
(43) 2013.07.30
(86) PCT/US2011/045873
(87) WO 2012/016131 2012.02.02
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАКСАЛТА ИНКОРПОРЕЙТИД
(US); БАКСАЛТА ГМБХ (CH)
(72) Изобретатель:
Зикманн Юрген, Хайдер Штефан, Роттенштайнер Ханспетер (AT), Ивенс Андреас (CH), Турецек Петер, Цехлинг Оливер (AT)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A2-2008025856 WO-A2-2005014024
DIRKSEN A. ET AL.: "Nucleophilic catalysis of oxime ligation", ANGEWANDTE CHEMIE.
INTERNATIONAL EDITION, WILEY VCH VERLAG, WEINHEIM, vol. 45, no. 45, 20 November 2006 (2006-11-20), pages 7581-7584, XP002605858, ISSN: 1433-7851, DOI: 10.1002/ANIE.200602877 [retrieved on 2006-10-19], the whole document
EUGENE H. CORDES ET AL.: "Nucleophilic Catalysis of Semicarbazone Formation by Anilines", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY,
AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, WASHINGTON,
DC; US, vol. 84, no. 5, 1 March 1962 (1962-03-01), pages 826-831, XP008145178, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ JA00864A030, the whole document and especially table I
WO-A1-9428024
MIKKEL B. THYGESEN ET AL.: "Nucleophilic Catalysis of Carbohydrate Oxime Formation by Anilines", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 75, no. 5, 5 March 2010 (2010-03-05), pages 1752-1755, XP55011729, ISSN: 0022-3263, DOI 10.1021/jo902425v, the whole document
ANOUK DIRKSEN ET AL.: "Rapid Oxime and Hydrazone Ligations with Aromatic Aldehydes for
Biomolecular Labeling", BIOCONJUGATE CHEMISTRY,
vol. 19, no. 12, 17 December 2008 (2008-12-17), pages 2543-2548, XP55011724, ISSN: 1043-1802, DOI: 10.1021/ bc800310p, the whole document
WO-A2-2011017055 WO-A2-2011012850 WO-A1-2010131015
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Область техники
Данное изобретение относится к материалам и способам для конъюгирования водорастворимых полимеров с белками.
Уровень техники
Приготовление конъюгатов путем ковалентного связывания водорастворимого полимера с терапевтическим протеином может осуществляться различными химическими способами. Пегилирование полипептидных препаратов защищает их при циркуляции и улучшает их фармакодинамические и фармакоки-нетические профили (Harris and Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003; 2:214-21). Во время процесса пегили-рования происходит присоединение повторяющихся единиц этиленгликоля (полиэтиленгликоля - ПЭГ) к полипептидному препарату. Молекулы ПЭГ обладают большим гидродинамическим объемом (в 5-10 раз превышающим размер глобулярных белков), хорошо растворимы в воде и гидратированы, нетоксичны, неиммуногенны и быстро выводятся из организма. Пегилирование молекул может способствовать повышению устойчивости препаратов к ферментативному расщеплению, увеличивать период полужизни in vivo, уменьшать частоту введения доз, понижать иммуногенность, повышать физическую и термическую стабильность, растворимость, стабильность в жидком виде и уменьшать агрегацию. Первые пегилиро-ванные препараты были утверждены Управлением США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) в начале 1990-х гг. С тех пор FDA утвердило ряд пегилированных препаратов для приема внутрь, парентерального введения и местного применения.
Полисиаловая кислота (ПСК), также называемая коломиновой кислотой (КК), является природным полисахаридом. Это гомополимер N-ацетилнейраминовой клслоты с а(2-8)-кетозидными связями, содержащий вицинальные диольные группы на своем невосстанавливающем конце. Она несет отрицательный заряд и встречается в организме человека. Она может быть легко получена с помощью бактерий в больших количествах и с предопределенными физическими характеристиками (патент US № 5846951). Поскольку бактериальная ПСК химически и иммунологически идентична человеческой ПСК, бактериальная ПСК неиммуногенна, даже при соединении с протеинами. В отличие от некоторых полимеров, ПСК подвергается биоразложению. При ковалентном соединении коломиновой кислоты с каталазой и аспарагиназой было выявлено увеличение стабильности этих ферментов в присутствии протеолитиче-ских энзимов плазмы крови. Сравнительные исследования in vivo с полисиалированной и немодифици-рованной аспарагиназой показали, что полисиалирование увеличивало время полужизни фермента (Fer-nandes and Gregoriadis, Int J. Pharm. 2001; 217:215-24).
Связывание ПЭГ-производных с пептидами или белками описано в работе Roberts et al. (Adv Drug Deliv Rev 2002; 54:459-76). Один подход к связыванию водорастворимых полимеров с терапевтическими протеинами заключается в конъюгации полимеров с углеводными фрагментами молекул протеинов. Ви-цинальные гидроксильные (ОН) углеводные группы протеинов могут быть легко окислены периодатом натрия (NaIO4) с образованием активных альдегидных групп (Rothfus et Smith, J. Biol Chem 1963; 238:1402-10; van Lenten et Ashwell, J. Biol Chem 1971; 246:1889-94). Потом полимер можно соединить с альдегидными группами углеводов, используя реагенты, содержащие, например, активные гидразидные группы (Wilchek M. and Bayer E.A., Methods Enzymol 1987; 138:429-42). Более современная технология заключается в использовании реагентов, содержащих аминооксигруппы, которые реагируют с альдегидными, формируя оксимные связи (WO 96/40662, WO 2008/025856).
Дополнительные примеры конъюгации водорастворимого полимера с терапевтическим протеином представлены в WO 06/071801, в котором описывается окисление углеводных фрагментов фактора Фон Виллебранда и последующее связывание с ПЭГ гидразидным способом; публикации US 2009/0076237, в которой описывается окисление рф-VIII и последующее связывание с ПЭГ и иными водорастворимыми полимерами (например, ПСК, ГЭК (HES), декстран) гидразидным способом; WO 2008/025856, в котором описывается окисление различных факторов свертывания, в том числе рф-IX, Ф-VIII и Ф-VIIa и их, например, с ПЭГ, способом аминооксигрупп с формированием оксимных связей; и в патенте US № 5621039, в котором описывается окисление Ф-IX и последующее связывание с ПЭГ гидразидным способом.
Недавно был предложен улучшенный способ, заключающийся в мягком периодатном окислении сиаловых кислот с формированием альдегидных групп и последующем их взаимодействии с реагентом, содержащим аминооксигруппы в присутствии каталитических количеств анилина (Dirksen A., and Daw-son Р.Е., Bioconjugate Chem. 2008; 19,2543-8; и Zeng Y et al., Nature Methods 2009; 6:207-9). Катализ анилином значительно ускоряет образование оксимных связей, что позволяет использовать очень низкие концентрации реагента. Применение нуклеофильных катализаторов также описано в работах Dirksen, A., et al., J. Am Chem. Soc., 128:15602-3 (2006); Dirksen, A., et al., Angew chem. Int Ed., 45:7581-4 (2006); Koh-ler, J.J., ChemBioChem., 10:2147-50 (2009); Giuseppone, N., et al., J. Am Chem. Soc., 127:5528-39 (2005); и Thygesen, M.B., et al., J. Org. Chem., 75:1752-5 (2010).
Хотя катализ анилином может ускорять образование оксимных связей, позволяя быстрое протекание реакции и использование низких концентраций аминоокси-реагента, анилин характеризуется токсичностью, с которой приходится считаться, к примеру, при конъюгировании терапевтического белка с целью получения лекарственного средства. К примеру, было показано, что анилин может вызывать мет
гемоглобинемию (Harrison, J.H., and Jollow, D.J., Molecular Pharmacology, 32(3) 423-431, 1987). Долгосрочное его введение крысам с едой, как показано, приводило к образованию опухолей селезенки (Goodman, D.G., et al., J. Natl. Cancer Inst., 73 (1):265-73, 1984). Исследования in vitro также показали, что анилин способен вызывать хромосомные мутации и обладает потенциально генотоксической активностью (Bombhard Е.М. et Herbold В., Critical Reviews in Toxicology 35,783-835, 2005).
Учитывая потенциально опасные свойства анилина и несмотря на то, что способы конъюгирования водорастворимых полимеров с терапевтическими протеинами известны, остается необходимость в разработке материалов и способов для конъюгирования водорастворимых полимеров с протеинами, которые улучшали бы фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства белка с минимизацией затрат на различные реагенты, а также минимизировали бы риски для здоровья пациента-реципиента.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предлагает материалы и способы для конъюгации полимеров и белков, что улучшает фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства белков, минимизирующие затраты, связанные с различными реагентами и риски для здоровья пациентов-реципиентов при катализе реакции конъюгации нуклеофильным катализатором. В различных воплощениях изобретения предлагаются альтернативные анилину катализаторы.
В одном воплощении изобретения предлагается способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом белка свертывания крови, который включает контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию; упомянутый водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруп-пу и выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, PolyPEG(r) (Warwick Effect Polymers; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хито-зана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбокси-метил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливи-нилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, поли-стирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); а упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO4), тетраацетата свинца (Pb(OAc)4) и перрутената калия (KRuO4); причем оксим-ная связь формируется между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера; и причем упомянутое образование оксимной связи катализируется нуклеофиль-ным катализатором, выбранным из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В другом воплощении изобретения предлагается способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, который включает контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию; упомянутый терапевтический белок выбирается из группы, состоящей из фактора IX (Ф-IX), фактора VIII (Ф-VIII), фактора VIIa (Ф-VIIa), фактора Фон Виллебранда (ФВф), фактора FV (Ф-V), фактора X (фХ), фактора XI (Ф-XI), фактора XII (Ф-XII), тромбина (Ф-II), протеина С, протеина S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (Тф), протеазы ADAMTS 13, IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, гранулоци-тарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусно-го интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-
I, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтин-подобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтин-подобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтин-подобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтин-подобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтин-подобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтин-подобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтин-подобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного мор-фогенного белка-1, костного морфогенного белка-2, костного морфогенного белка-3, костного морфо-генного белка-4, костного морфогенного белка-5, костного морфогенного белка-6, костного морфогенно-го белка-7, костного морфогенного белка-8, костного морфогенного белка-9, костного морфогенного белка-10, костного морфогенного белка-11, костного морфогенного белка-12, костного морфогенного белка-13, костного морфогенного белка-14, костного морфогенного белка-15, костного морфогенного белка рецептора IA, костного морфогенного белка рецептора IB, костного морфогенного белка рецептора
II, мозгового нейротрофического фактора, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофического фактора рецептора, крипто, криптического, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 1, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора ней
трофилов 2а, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2р, р-эндотелиального фактора роста клеток, эндотелина 1, фактора роста эпидермиса, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробла-стов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, кислотного фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора al, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора а2, рост-связанного белка, рост-связанного белка а, рост-связанного белка р, рост-связанного белка у, гепарин-связывающего фактора роста эпидермиса, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулин-подобного фактора роста I, инсулин-подобного фактора роста рецептора, инсулин-подобного фактора роста II, инсулин-подобного фактора роста связывающего белка, фактора роста кератиноцитов, фактора ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептора а, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейтрофина-3, нейтрофина-4, онкостатина М (OSM), фактора роста плаценты, фактора роста плаценты 2, тромбоцитного фактора роста клеток эндотелия, тромбоцитного фактора роста, тромбоцитного фактора роста А цепи, тромбоцитного фактора роста АА, тромбоцитного фактора роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепи, тромбоцитного фактора роста ВВ, тромбоцит-ного фактора роста рецептора а, тромбоцитного фактора роста рецептора р, пре-В клеток роста фактора стимуляции, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, TNF, включая TNF0, TNF1, TNF2, фактора трансформирования роста а, фактора трансформирования роста р, фактора трансформирования роста р1, фактора трансформирования роста р1.2, фактора трансформирования роста р2, фактора трансформирования роста р3, фактора трансформирования роста р5, латентного фактора трансформирования роста р1, фактора трансформирования роста р связывающего белка I, фактора трансформирования роста р связывающего белка II, фактора трансформирования роста р связывающего белка III, тимуса стромального лимфопоэтина (TSLP), фактора некроза опухолей рецептора типа I, фактора некроза опухолей рецептора типа II, урокиназного типа плазминогена активатора рецептора, фос-фолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хорионического гонадо-тропина, фолликул-стимулирующего гормона, тирео-стимулирующего гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, р-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеини-зирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеинов, трансферрина, тромбопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, Humira (адалимумаба), Prolia (денозумаба), Enbrel (этанерцепта), белка из табл. 1 или их биологически активных фрагментов, производных или вариантов; упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу выбирается из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, PolyPEG(r) (Warwick Effect Polymers; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиал-килкрахмала (ГАК), гидроксилэтилкрахмала (ГЭК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиа-луроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), поли-оксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпир-ролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера полиэтилена с малеиновым ангидридом, сополимера полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); а упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO4), тетраацетата свинца (Pb(ОАс)4) и перрутената калия (KRuO4); причем оксимная связь формируется между окисленным углеводным фрагментом и активной аминоок-сигруппой водорастворимого полимера; и причем упомянутое образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, который выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что величина рН раствора, содержащего исходную концентрацию терапевтического белка от приблизительно 0,3 мг/мл до приблизительно 3,0 мг/мл, доводится до величины от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0 до контактирования с активированным водорастворимым полимером.
При использовании здесь, термин "приблизительно" обозначает величину выше или ниже указанной величины. В различных воплощениях термин "приблизительно" включает указанную величину и интервал в пределах выше или ниже на 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% от указанной величины.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка равна приблизительно 1,0 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0. В
родственном воплощении исходная концентрация терапевтического белка равна приблизительно 0,75 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0. В еще одном родственном воплощении исходная концентрация терапевтического белка равна приблизительно 1,25 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок контактирует с желаемой избыточной концентрацией активированного водорастворимого полимера, причем избыточная концентрация составляет от приблизительно 1-молярного до приблизительно 300-молярного избытка. В другом воплощении избыточная концентрация равна приблизительно 50-кратному молярному избытку.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что терапевтический белок инкубируется с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,5 до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В другом воплощении условия включают период времени приблизительно в 120 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания. При использовании здесь, подразумевается, что термин "перемешивание" включает перемешивание на различных скоростях и интенсивностях (например, осторожное перемешивание) при помощи используемого обычно лабораторного или производственного оборудования и продуктов.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что нуклеофиль-ный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1,0 до приблизительно 50 мМ нуклеофильного катализатора, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В другом воплощении итоговая концентрация нуклеофильного катализатора равна приблизительно 10 мМ, а условия включают период времени приблизительно в 15 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света; и наличие перемешивания.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что окислитель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 50 до приблизительно 1000 мкМ окислителя, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В другом воплощении итоговая концентрация окислителя равна приблизительно 400 мкМ, а условия включают период времени приблизительно в 10 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что конъюгация водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка останавливается путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, натрия метабисульфита (Na2S2O5), триптофана, тирозина, гистидина или их производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1 до приблизительно 100 мМ гасителя, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 5 до приблизительно 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В ином воплощении гасителем является L-цистеин. В еще одном воплощении L-цистеин добавляют до итоговой концентрации приблизительно в 10 мМ, а условия включают период времени приблизительно в 60 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В другом воплощении предлагается вышеописанный способ, включающий: а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, причем концентрация терапевтического белка составляет от приблизительно 0,3 мг/мл до приблизительно 3,0 мг/мл; б) второй этап, включающий окисление одного и более углеводов в терапевтическом белке, причем окислитель добавляется к раствору, полученному на первом этапе до итоговой концентрации от приблизительно 50 до приблизительно 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с желаемой избыточной концентрацией активированного водорастворимого полимера, причем избыточная концентрация составляет от приблизительно 1-молярного избытка до приблизительно 300-молярного избытка, в условиях, включающих период времени от приблизительно 0,5 до приблизительно 24 ч, температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, причем нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 50 мМ нуклеофильного катализатора, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,1 до приблизительно 30 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водораство
римым полимером и нуклеофильным катализатором в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводов терапевтического белка, в упомянутых условиях, которые включают период времени от приблизительно 0,5 до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и е) шестой этап, на котором конъюгация водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатая на пятом этапе, останавливается путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метиони-на, глутатиона, глицерина, Na2S2O5 (натрия метабисульфита), триптофана, тирозина, гистидина или их производных, крезола, имидазола и их комбинаций; причем гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ гасителя, в условиях, которые включают период времени от приблизительно 5 мин до приблизительно 120 мин; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него. В ином воплощении исходная концентрация терапевтического белка на первом этапе равна приблизительно 1 мг/мл, а рН равен приблизительно 6,0; причем итоговая концентрация окислителя на втором этапе равна приблизительно 400 мкМ, а условия включают период времени приблизительно 10 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и перемешивание; причем избыточная концентрация на третьем этапе составляет приблизительно 50 молярных избытков; причем условия на третьем этапе включают период времени приблизительно 15 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; причем итоговая концентрация нуклеофильно-го катализатора на четвертом этапе равна приблизительно 10 мМ, а условия на четвертом этапе включают период времени приблизительно 15 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания; причем условия инкубирования терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором на пятом этапе включают период времени приблизительно 2 ч; температуру приблизительно 22°С; отсутствие света и наличие перемешивания; и причем гасителем на шестом этапе выступает L-цистеин; и причем L-цистеин добавляется до итоговой концентрации приблизительно в 10 мМ, а условия на шестом этапе включают период времени приблизительно 60 мин, температуру приблизительно 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК. В ином воплощении ПСК состоит из приблизительно 10-300 единиц сиаловой кислоты. В другом воплощении водорастворимым полимером является ПЭГ. В другом воплощении водорастворимым полимером является ГЭК. В другом воплощении водорастворимым полимером является ГАК.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-IX. В еще одном воплощении терапевтическим белком является Ф-VIIa. В еще одном воплощении терапевтическим белком является Ф-VIII.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что окислителем выступает периодат натрия (NaIO4).
В еще одном воплощении изобретения предлагается способ, отличающийся тем, что окисленные углеводные фрагменты терапевтического белка расположены на участке активационного пептида белка свертывания крови.
В одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что он осуществляется с ПСК, приготовленной путем взаимодействия активированного аминооксисшивающего агента с окисленной ПСК; причем аминооксисшивающий агент выбран из группы, состоящей из:
б) сшивающего агента 3,6,9-триоксоундекан -1,11-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
причем ПСК окислена путем инкубирования с окислителем, чтобы образовать терминальные альдегидные группы на невосстанавливающем конце ПСК. В связанном воплощении аминооксисшивающим агентом является 3-оксопентан-1,5-диоксиамин.
В еще одном воплощении вышеуказанный способ выполняется с использованием в качестве окислителя NaIO4.
В ином воплощении вышеуказанный способ выполняется с использованием нуклеофильного катализатора в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 50 мМ. В одном воплощении в качестве нуклеофильного катализатора выступает м-толуидин. В еще одном воплощении при реакции конъю
гации м-толуидин находится в концентрации приблизительно 10 мМ.
В ином воплощении изобретения вышеупомянутый способ дополнительно содержит этап восстановления оксимной связи конъюгированного терапевтического белка, выполняемый путем инкубирования конъюгированного терапевтического белка в буфере, содержащем восстановитель, выбранный из группы, состоящей из цианоборогидрида натрия (NaCNBH3), аскорбиновой кислоты (витамин С) и NaBH3. В одном воплощении в качестве восстановителя используется цианоборогидрид натрия (NaCNBH3).
В еще одном воплощении предлагается упомянутый выше способ, который дополнительно содержит этап очистки конъюгированного терапевтического белка. В другом воплощении конъюгированный терапевтический белок очищается по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения. В ином воплощении хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), ионообменной хроматографии (IEC), эксклюзионной хроматографии (SEC), аффинной хроматографии и обратно-фазовой хроматографии. В еще одном воплощении на хроматографическом этапе загрузки и хроматографическом этапе промывания используется антихаотропическая соль. В еще одном воплощении хроматография производится в колонке. В ином воплощении в колонке содержится хроматографическая смола, выбранная из группы, состоящей из фе-нил-сефарозы FF и бутил-сефарозы FF. В ином воплощении в колонке находится слой смолы высотой от приблизительно 5 до приблизительно 20 см. В одном воплощении высота слоя равна приблизительно 10 см.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, который содержит один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 6,7 см/мин. При использовании здесь термин "направление потока вниз" обозначает направление потока из верхней части хроматографической колонки в нижнюю часть хроматографической колонки (нормальное направление потока/стандартный режим). При использовании здесь термин "направление потока вверх" обозначает направление потока из нижней части в верхнюю часть колонки (обратное направление потока). В одном воплощении скорость потока равна приблизительно 2 см/мин.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, который содержит один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 6,7 см/мин. В родственном воплощении скорость потока равна приблизительно 1 см/мин.
В еще одном воплощении предлагается упомянутый выше способ, который дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ). В другом воплощении итоговая концентрация терапевтического белка составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 3 мг/мл.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, в котором терапевтический белок содержит от приблизительно 5 до приблизительно 11 фрагментов водорастворимого полимера. В другом воплощении терапевтический белок содержит от приблизительно 1 до приблизительно 3 фрагментов водорастворимых полимеров.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, в котором конъюгированный терапевтический белок очищается при помощи хроматографии; причем на этапе загрузки и на этапе промывки используется антихаотропическая соль; способ, который содержит один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 6,7 см/мин и один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 6,7 см/мин; дополнительно содержащий концентрирование конъюгированного терапевтического белка ульт-рафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ). В другом воплощении хроматография является хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC); при которой скорость потока на одном или более этапов промывки равна приблизительно 2 см/мин; и при которой скорость потока на одном или более этапов элюи-рования равна приблизительно 1 см/мин.
В другом воплощении предлагается модифицированный терапевтический белок, который производится по любому из вышеупомянутых способов.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4); и б) образования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, PolyPEG(r) (Warwick Effect Pol
ymers; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкил-крахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуро-новой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), поли-оксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпир-ролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(ОАс)4) и калия перрутената (KRuO4); и б) образования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи; причем терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX (Ф-IX), фактора VIII (Ф-VIII), фактора VIIa (Ф-VIIa), фактора Фон Виллебранда (ФВф), фактора FV (Ф-V), фактора X (Ф-Х), фактора XI (Ф-XI), фактора XII (Ф-XII), тромбина (FII), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (TF), протеазы ADAMTS 13, IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтин-подобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтин-подобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтин-подобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтин-подобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтин-подобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтин-подобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтин-подобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), ан-гиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенного белка-1, костного морфогенного белка-2, костного морфогенного белка-3, костного морфогенного белка-4, костного морфогенного белка-5, костного морфогенного белка-6, костного морфогенного белка-7, костного морфогенного белка-8, костного морфогенного белка-9, костного морфогенного белка-10, костного морфогенного белка-11, костного морфогенного белка-12, костного морфогенного белка-13, костного морфогенного белка-14, костного морфогенного белка-15, костного морфогенного белка рецептора IA, костного морфогенного белка рецептора IB, костного морфогенного белка рецептора II, мозгового нейротрофического фактора, кар-диотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофического фактора рецептора, крипто, криптического, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 1, ци-токин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2а, цитокин-индуцированного хемо-таксического фактора нейтрофилов 2р, р-эндотелиального фактора роста клеток, эндотелина 1, фактора роста эпидермиса, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофилов, фактора роста фиб-робластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фибробластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробластов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фиб-робластов 21, кислотного фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора al, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора а2, рост-связанного белка, рост-связанного белка а, рост-связанного белка р, рост-связанного белка у, гепарин-связывающего фактора роста эпидермиса, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулин-подобного фактора роста I, инсулин-подобного фактора роста рецептора, инсулин-подобного фактора роста II, инсулин-подобного фактора роста связывающего белка, фактора роста кератиноцитов, фактора ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептора а, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейро-поэтина, нейротрофина-3, нейротрофина-4, онкостатина М (OSM), фактора роста плаценты, фактора роста плаценты 2, тромбоцитного фактора роста клеток эндотелия, тромбоцитного фактора роста, тромбо-цитного фактора роста А цепи, тромбоцитного фактора роста АА, тромбоцитного фактора роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепи, тромбоцитного фактора роста ВВ, тромбоцитного фактора роста рецептора а, тромбоцитного фактора роста рецептора р, пре-В клеток роста фактора стимуляции, факто
ра стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, TNF, TNF0, TNF1, TNF2, фактора трансформирования роста а, фактора трансформирования роста р, фактора трансформирования роста р1, фактора трансформирования роста р1.2, фактора трансформирования роста р2, фактора трансформирования роста р3, фактора трансформирования роста р5, латентного фактора трансформирования роста р1, фактора трансформирования роста р связывающего белка I, фактора трансформирования роста р связывающего белка II, фактора трансформирования роста р связывающего белка III, тимуса стромального лимфопоэтина (TSLP), фактора некроза опухолей рецептора типа I, фактора некроза опухолей рецептора типа II, урокиназного типа плазминогена активатора рецептора, фосфолипаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хорионического гонадотропина, фолликул-стимулирующего гормона, тирео-стимулирующего гормона, тканевого активатора плазминогена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, р-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизирующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеинов, трансферрина, тромбопоэтина, уроки-назы, интегрина, тромбина, лептина, Humira (адалимумаба), Prolia (денозумаба), Enbrel (этанерцепта), белка из табл.1 или их биологически активным фрагментом, производным или вариантом; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, PolyPEG(r) (Warwick Effect Polymers; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой-кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиле-ноксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакроло-илморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазе-на, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфани-ловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(ОАс)4) и калия перрутената (KRuO4); и б) образования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гид-разоновой связи; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, PolyPEG(r) (Warwick Effect Polymers; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбок-симетил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В еще одном воплощении предлагается способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы: а) окисления углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования указанного белка с окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4); и б) образования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гид-разоновой связи; причем, терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX (Ф-IX), фактора VIII (Ф-VIII), фактора VIIa (Ф-VIIa), фактора фон Виллебранда (ФВф), фактора FV (Ф-V), фактора X (фХ), фактора XI (Ф-XI), фактора XII (Ф-XII), тромбина (Ф-II), белка С, белка S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (Тф), протеазы ADAMTS 13, IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующего фактора-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, гранулоцитарного колониестимули
рующего фактора (G-CSF), ЕРО, интерферона-альфа (IFN-альфа), консенсусного интерферона, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 альфа, IL-33, тромбопоэтина (ТРО), Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, ангиопоэтин-подобного полипептида 1 (ANGPTL1), ангиопоэтин-подобного полипептида 2 (ANGPTL2), ангиопоэтин-подобного полипептида 3 (ANGPTL3), ангиопоэтин-подобного полипептида 4 (ANGPTL4), ангиопоэтин-подобного полипептида 5 (ANGPTL5), ангиопоэтин-подобного полипептида 6 (ANGPTL6), ангиопоэтин-подобного полипептида 7 (ANGPTL7), витронектина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), ангиогенина, активина А, активина В, активина С, костного морфогенного белка-1, костного морфогенного белка-2, костного морфогенного белка-3, костного морфогенного белка-4, костного мор-фогенного белка-5, костного морфогенного белка-6, костного морфогенного белка-7, костного морфо-генного белка-8, костного морфогенного белка-9, костного морфогенного белка-10, костного морфоген-ного белка-11, костного морфогенного белка-12, костного морфогенного белка-13, костного морфоген-ного белка-14, костного морфогенного белка-15, костного морфогенного белка рецептора IA, костного морфогенного белка рецептора IB, костного морфогенного белка рецептора II, мозгового нейротрофиче-ского фактора, кардиотрофина-1, цилиарного нейротрофического фактора, цилиарного нейротрофиче-ского фактора рецептора, крипто, криптического, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 1, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2а, цитокин-индуцированного хемотаксического фактора нейтрофилов 2р, р-эндотелиального фактора роста клеток, эндотелина 1, фактора роста эпидермиса, эпигена, эпирегулина, эпителиального аттрактанта нейтрофи-лов, фактора роста фибробластов 4, фактора роста фибробластов 5, фактора роста фибробластов 6, фактора роста фибробластов 7, фактора роста фибробластов 8, фактора роста фибробластов 8b, фактора роста фибробластов 8с, фактора роста фибробластов 9, фактора роста фибробластов 10, фактора роста фиб-робластов 11, фактора роста фибробластов 12, фактора роста фибробластов 13, фактора роста фибробла-стов 16, фактора роста фибробластов 17, фактора роста фибробластов 19, фактора роста фибробластов 20, фактора роста фибробластов 21, фактора роста фибробластов кислотного, фактора роста фибробла-стов основного, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора а1, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептора а2, рост-связанного белка, рост-связанного белка а, рост-связанного белка р, рост-связанного белка ццц, гепарин-связывающего фактора роста эпидермиса, фактора роста гепатоцитов, рецептора фактора роста гепатоцитов, гепатомного фактора роста, инсулин-подобного фактора роста I, инсулин-подобного фактора роста рецептора, инсулин-подобного фактора роста II, инсулин-подобного фактора роста связывающего белка, фактора роста кератиноцитов, фактора ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептора а, фактора роста нервов, рецептора фактора роста нервов, нейропоэтина, нейтрофина-3, нейтрофина-4, онкостатина М (OSM), фактора роста плаценты, фактора роста плаценты 2, тромбоцитного фактора роста клеток эндотелия, тромбоцитного фактора роста, тромбоцитного фактора роста А цепи, тромбоцитного фактора роста АА, тромбоцитного фактора роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепи, тромбоцитного фактора роста ВВ, тромбоцит-ного фактора роста рецептора а, тромбоцитного фактора роста рецептора р, пре-В клеток роста фактора стимуляции, фактора стволовых клеток (SCF), рецептора фактора стволовых клеток, TNF, включая TNF0, TNF1, TNF2, фактора трансформирования роста а, фактора трансформирования роста р, фактора трансформирования роста р1, фактора трансформирования роста р1.2, фактора трансформирования роста р2, фактора трансформирования роста р3, фактора трансформирования роста р5, латентного фактора трансформирования роста р1, фактора трансформирования роста р связывающего белка I, фактора трансформирования роста р связывающего белка II, фактора трансформирования роста р связывающего белка III, тимуса стромальный лимфопоэтин (TSLP), фактора некроза опухолей рецептора типа I, фактора некроза опухолей рецептора типа II, урокиназного типа плазминогена активатора рецептора, фосфо-липаза-активирующего белка (PUP), инсулина, лектина, рицина, пролактина, хорионического гонадотро-пина, фолликул-стимулирующего гормона, тирео-стимулирующего гормона, тканевого активатора плаз-миногена, IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, а-галактозидазы, р-галактозидазы, ДНКазы, фетуина, лютеинизи-рующего гормона, эстрогена, инсулина, альбумина, липопротеинов, фетопротеина, трансферрина, тром-бопоэтина, урокиназы, интегрина, тромбина, лептина, Humira (адалимумаба), Prolia (денозумаба), Enbrel (этанерцепта), белка из табл.1 или их биологически активным фрагментом, производным или вариантом; причем упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, PolyPEG(r) (Warwick Effect Polymers; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкил-крахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуро-новой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), поли-оксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпир-ролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем нуклеофильный катализатор выбран
из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу готовится по способу, включающему: инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным аминоокси-линкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинке-ром, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную ами-нооксигруппу; и б) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения. Термин "активированный водорастворимый полимер" обозначает, в одном воплощении, водорастворимый полимер, содержащий альдегидную группу.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу готовится по способу, включающему: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным ами-нооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминоок-силинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а) с восстанавливающим агентом, в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и с) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, готовится по способу, включающему: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным ами-нооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминоок-силинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а) с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу готовится по способу, включающему: а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с активированным ами-нооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминоок-силинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу; б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а) с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; в) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу после этапа б) с восстанавливающим агентом, в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от приблизительно 1 мин до приблизительно 24 ч; температуру от приблизительно 2 до приблизительно 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; и г) очистку водораствори
мого полимера, содержащего активную аминооксигруппу по способу, выбранному из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
В ином воплощении вышеупомянутый способ выполняется с окисленным водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, PolyPEG(r) (Warwick Effect Polymers; Ковентри, Соединенное Королевство), полисиаловой кислоты (ПСК), крахмала, гидроксиалкилкрахмала (ГАК), гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, крахмала, декстрана, карбок-симетил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полипропиленгликоля (ППГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, полиэтилен-комалеиновой кислоты ангидрида, полистирол-комалеиновой кислоты ангидрида, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС); причем упомянутый водорастворимый полимер окисляется путем инкубирования с окислителем с образованием терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце водорастворимого полимера. В одном воплощении водорастворимый полимер является ПСК.
В другом воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что окислителем является NaIO4.
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что аминоок-силинкер выбран из группы, состоящей из:
а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина, имеющего формулу
H2Nk "CL ,-NH3
б) сшивающего агента 3,6,9-триоксоувдекан-1Д 1-диоксиамина, имеющего формулу
в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1, 17-диоксиамина, имеющего следующую формулу:
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что восстановитель выбран из группы, состоящей из натрия цианоборогидрида (NaCNBH3), аскорбиновой кислоты (витамин С) и NaBH3. В одном воплощении восстанавливающим агентом является натрия цианоборогид-рид (NaCNBH3).
В еще одном воплощении предлагается вышеупомянутый способ, отличающийся тем, что нуклео-фильный катализатор выбран из группы, состоящей из о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, сульфаниловой кислоты, о-аминобензамида, о-толуидина, м-толуидина, п-толуидина, о-анизидина, м-анизидина и п-анизидина. В одном воплощении нуклеофильный катализатор является м-толуидином. В ином воплощении нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы дать итоговую концентрацию от приблизительно 1,0 до приблизительно 50 мМ нуклеофильного катализатора.
В ином воплощении предлагается упомянутый выше способ, который дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ).
Фигуры
На фиг. 1 показана первичная структура фактора свертывания крови IX (SEQ ID NO: 1). На фиг. 2 показано связывание окисленного рф-IX с аминоокси-ПСК.
На фиг. 3 показан синтез водорастворимых диаминооксисшивающих агентов 3-оксопентан-1,5-диоксиамина и 3,6,9-триоксоундекан-1,11-диоксиамина. На фиг. 4 показано приготовление аминоокси-ПСК.
На фиг. 5 представлена визуализация способом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) конъюгатов ПСК-ф-IX, приготовленных в присутствии различных катализаторов, а) сравнение анилина с м-толуидином в различных концентрациях; б) сравнение анилина с о-аминобензойной кислотой, м-аминобензойной кислотой, п-аминобензойной кислотой, п-аминобензамидом и сульфаниловой кислотой; в) сравнение анилина и м-толуидина с о-анизидином и м-анизидином.
На фиг. 6 показаны процентные уровни полисиалирования с различными нуклеофильными катализаторами.
Детальное описание изобретения
Фармакологические и иммунологические свойства терапевтических протеинов могут быть улучшены путем химического модифицирования и конъюгации с полимерными соединениями, например поли-этиленгликолем (ПЭГ), разветвленным ПЭГ, полисиаловой кислотой (ПСК), гидроксиалкилкрахмалом (ГАК), гидроксилэтилкрахмалом (ГЭК), углеводами, полисахаридами, пуллуланом, хитозаном, гиалуро-новой кислотой, хондроитинсульфатом, дерматансульфатом, крахмалом, декстраном, карбоксиметил-декстраном, полиалкиленоксидом (ПАО), полиалкиленгликолем (ПАГ), полипропиленгликолем (ППГ), полиоксазолином, полиакрилоилморфолином, поливиниловым спиртом (ПВС), поликарбоксилатом, по-ливинилпирролидоном, полифосфазеном, полиоксазолином, сополимером полиэтилена с малеиновым ангидридом, сополимером полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен-гидроксиметилформалем) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфатом (МФС). Свойства получаемых конъюгатов обычно сильно зависят от структуры и размера полимера. Как правило, в данной отрасли предпочтительно использовать полимеры определенного размера или имеющие узкий интервал размеров. Синтетические полимеры типа ПЭГ легко могут быть синтезированы в узком интервале размеров, в то время, как ПСК может быть подвергнута очистке с получением. полимерных молекул в узком интервале размеров. Также, реактивы для пегилирования с конкретными полимерными цепями и узким интервалом распределения размеров, присутствуют на рынке и имеются в продаже по доступным ценам.
Добавление растворимого полимера, например, полисиалирование - подход к улучшению свойств терапевтических белков, таких как белки системы свертывания крови, например, Ф-IX, а также иных белков свертывания (например, ФВф, Ф-VIIa (см., к примеру, US 2008/0221032А1, включенный в настоящую заявку посредством ссылки) и Ф-VIII).
Терапевтические белки
В определенных воплощениях изобретения вышеупомянутые полипептиды и полинуклеотиды представлены следующими терапевтическими белками: ферментами, антигенами, антителами, рецепторами, белками свертывания крови, факторами роста, гормонами и лигандами. В определенных воплощениях терапевтический белок является белком свертывания крови, таким как Фактор IX (Ф-IX), фактор VIII (Ф-VIII), фактор VIIa (Ф-VIIa), фактор фон Виллебранда (ФВф), фактор FV (Ф-V), фактор X (фХ), фактор XI (Ф-XI), фактор XII (Ф-XII), тромбин (Ф-II), белок С, белок S, tPA, PAI-1, тканевой фактор (Тф) или протеаза ADAMTS 13. В одном воплощении терапевтический белок по изобретению является глико-протеином или, в различных воплощениях, белком, который не является природно гликозилированным in vivo (т.е. белком, который не содержит природного сайта гликозилирования или белком, который не гликозилирован в клетке-хозяине до очистки).
В определенных воплощениях терапевтический белок является иммуноглобулинами, цитокинами, такими как IL-1 альфа, IL-1 бета, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, колониестимулирующий фактор-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), ЕРО, интерферон-альфа (IFN-альфа), консенсусный интерферон, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-31, IL-32 альфа, IL-33, тромбопоэтин (ТРО), ангиопоэтины, к примеру, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, человеческие ангиопоэтин-подобные полипептиды ANGPTL1-7, витронектин, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), ангиогенин, активин А, активин В, активин С, костный морфогенный белок-1, костный морфо-генный белок-2, костный морфогенный белок-3, костный морфогенный белок-4, костный морфогенный белок-5, костный морфогенный белок-6, костный морфогенный белок-7, костный морфогенный белок-8, костный морфогенный белок-9, костный морфогенный белок-10, костный морфогенный белок-11, костный морфогенный белок-12, костный морфогенный белок-13, костный морфогенный белок-14, костный морфогенный белок-15, костного морфогенного белка рецептор IA, костного морфогенного белка рецептор IB, костного морфогенного белка рецептор II, мозговой нейротрофический фактор, кардиотрофин-1, цилиарный нейротрофический фактор, цилиарного нейротрофического фактора рецептор, крипто, крип-тический, цитокин-индуцированный хемотактический фактор нейтрофилов 1, цитокин-индуцированный хемотактический фактор нейтрофилов 2а, цитокин-индуцированный хемотактический фактор нейтро-филов 2р, р-эндотелиальный фактор роста клеток, эндотелии 1, фактор роста эпидермиса, эпиген, эпире-гулин, эпителиальный аттрактант нейтрофилов, фактор роста фибробластов 4, фактор роста фибробла-стов 5, фактор роста фибробластов 6, фактор роста фибробластов 7, фактор роста фибробластов 8, фактор роста фибробластов 8b, фактор роста фибробластов 8с, фактор роста фибробластов 9, фактор роста фибробластов 10, фактор роста фибробластов 11, фактор роста фибробластов 12, фактор роста фибробла-стов 13, фактор роста фибробластов 16, фактор роста фибробластов 17, фактор роста фибробластов 19, фактор роста фибробластов 20, фактор роста фибробластов 21, фактор роста фибробластов кислотный, фактор роста фибробластов основный, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептор а1, линии глиальных клеток нейтрофического фактора рецептор а2, рост-связанный белок, рост-связанный белок а, рост-связанный белок р, рост-связанный белок у, гепарин-связывающий фактор роста эпидермиса, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, гепатомный фактор роста, инсу
лин-подобный фактор роста I, инсулин-подобного фактора роста рецептор, инсулин-подобный фактор роста II, инсулин-подобного фактора роста связывающий белок, фактор роста кератиноцитов, фактор ингибирования лейкоза, фактора ингибирования лейкоза рецептор а, фактор роста нервов, рецептор фактора роста нервов, нейропоэтин, нейтрофин-3, нейтрофин-4, онкостатин М (OSM), фактор роста плаценты, фактор роста плаценты 2, тромбоцитный фактор роста клеток эндотелия, тромбоцитный фактор роста, тромбоцитного фактора роста А цепь, тромбоцитный фактор роста АА, тромбоцитный фактор роста АВ, тромбоцитного фактора роста В цепь, тромбоцитный фактор роста ВВ, тромбоцитного фактора роста рецептор а, тромбоцитного фактора роста рецептор р, пре-В клеток роста фактор стимуляции, фактор стволовых клеток (SCF), рецептор фактора стволовых клеток, TNF, включая TNF0, TNF1, TNF2, фактор трансформирования роста а, фактор трансформирования роста р, фактор трансформирования роста р1, фактор трансформирования роста р 1.2, фактор трансформирования роста р2, фактор трансформирования роста р3, фактор трансформирования роста р5, латентный фактор трансформирования роста р1, фактора трансформирования роста р связывающий белок I, фактора трансформирования роста р связывающий белок II, фактора трансформирования роста р связывающий белок III, тимуса стромальный лимфопоэтин (TSLP), фактора некроза опухолей рецептор типа I, фактора некроза опухолей рецептор типа II, уроки-назного типа плазминогена активатора рецептор, фактор роста сосудистого эндотелия и химерные белки, а также их биологически или иммунологически активные фрагменты.
В определенных воплощениях терапевтический белок является альфа-, бета- и гамма-интерферонами, колониестимулирующими факторами, включая гранулоцитные колониестимулирующие факторы, факторами роста фибробластов, тромбоцитарными факторами роста, фосфолипаза-активирующим белком (PUP), инсулином, растительными белками, например, лектинами и рицинами, факторами некроза опухолей и родственными аллелями, растворимыми формами рецепторов фактора некроза опухолей, рецепторами интерлейкина и растворимыми формами рецепторов интерлейкина, факторами роста, например, тканевыми факторами роста, такими как TGFa или TGFр и факторами роста эпидермиса, гормонами, соматомединами, пигментарными гормаонами, рилизинг-факторами гипоталамуса, антидиуретическими гормонами, пролактином, хорионическим гонадотропином, фолликул-стимулирующим гормоном, тиреоид-стимулирующим гормоном, тканевым активатором плазминогена и иммуноглобулинами, такими как IgG, IgE, IgM, IgA и IgD, галактозидазой, а-галактозидазой, р-галактозидазой, ДНКазой, фетуином, лютеинизирующим гормоном, эстрогеном, кортикостероидами, инсулином, альбумином, липопротеинами, фетопротеином, трансферрином, тромбопоэтином, урокина-зой, ДНКазой, интегринами, тромбином, гемопоэтическими факторами роста, лептином, гликозидазами, Humira (адалимумабом), Prolia (денозумабом), Enbrel (этанерцептом) и их фрагментами, либо любыми слитыми белками, включающими любой из указанных выше белков или их фрагментов. В дополнение к упомянутым белкам, в табл. 1 ниже представлены терапевтические белки, охватываемые настоящим изобретением.
Секретируемый фосфопротеин 24
Кальретикулин
Желудочный внутренний фактор
Фосфолипаза D4
Глипикан-б
Кортикостероид-связывающий глобулин
Интерлейкин-33
Ретинолдегидрогеназа 10
Секретируемый связанный с ожогом белок 3
Карбоксипептидаза А1
Костный морфогенный белок 2
Сиаловая кислота-связывающий Ig-подобный лектин 14
С-С мотив хемокина 4
Карбоксипептидаза А2
Костный морфогенный белок 6
Трансмембранный белок 161А
Меланоцитный белок Pmel 17
Эотаксин
Неохарактеризованный белок KIAA0564
Трансмембранный белок 161В
Секретируемый Ly-6/uPAR-родственный белок 1
С-С мотив хемокина 13
Cerberus
Трансмембранный белок 182
Бета-микросеминопротеин
С-С мотив хемокина 18
Карбогидратсульфотрансфе раза 8
Белок FAM2 4B
Глипикан-4
С-С мотив хемокина 20
Контактин-связанный белок-подобный 3
Трансмембранный белок 52
Член 15 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках 2
Секреторная фосфолипаза А2-подобный белок группы XIIB
Домен-содержащий белок 4 суперсемейства основного фасилитатора
Резистин-подобный бета
С-С мотив хемокина 2
Кортиколиберин
UDP-
глюкуронозилтрансфераза 2АЗ
Член 12 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Трансформирующего фактора роста-бета-индуцированный белок ig-h3
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 19
Одонтогенный амелобласт-связанный белок
SPARC
CD4 0 лиганд
UPF0556 белок C19orfl0
Нейросекреторный белок VGF
Глипикан-5
Корнеодесмозин
С-Х-С мотив хемокина 3
Секретируемый фосфопротеин 2, 24кДа
Антериорного градиентного белка 2 гомолог
Фактор комплемента D
Цистатин-М
Белок FAM150B
Белка canopy гомолог 2
ХромоГранин-А
Дефенсин-5
Фактор
роста/дифференциации 9
Глипикан-1
Коллаген альфа-1(1) цель
Дефенсин-6
Кластерин-подобный белок 1
фон Виллебранда фактора А домен-содержаший белок 2
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержаший белок 18
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 18
Трансмембранный и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 2
WNT1-индуцируемого-сигнального пути белок 1
Цистеин-богатый секреторный белок LCCL домен-содержащий 1
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 3
С-типа лектина домен-содержаший белок UNQ5810/PRO19627
С-С мотив хемокина 1
Коллаген альфа-4(IV) цепь
Dickkopf-родственный белок 4
Эпидидимально-специфический липокалин-10
SPARC-связанный модулярный кальций-связывающий белок 2
Кератиноцит дифференциация-связанный белок
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 5
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 8
С-типа лектинового домена семейства 11 член А
Комплемент С4-В
Эпендимин-связанный белок 1 млекопитающих
Эпидидимально-специфический липокалин-8
Секретируемый Ly-6/uPAR-родственный белок 2
Коллаген альфа-2(V) цепь
Фибриллин-3
Основной пролин-богатый пептид Р-Е
Глипикан-3
Комплемент С5
Фетуин-В
Мнимый
неохарактеризованный белок C10orf99
Секретируемый и трансмембранный белок 1
Коллаген альфа-1(\/11) цепь
Фактор роста фибробластов 6
^охарактеризованный белок C17orf77
Белок экспрессируемой в яичках
последовательности 2 64
Компонент комплемента С7
Фактор роста кератиноцитов
Арилацетамид деациталаза-подобная 2
Глипикан-2
Компонент комплемента С8 бета цепь
Фактор
роста/дифференциации 8
Эпидидимально-специфический липокалин-12
Сериновая протеаза 2 3
Компонент комплемента С8 гамма цепь
Желудочный ингибиторный полипептид
В меланомы антиген 2
39S рибосомальный белок L55, митохондриальный
Коллаген альфа-1(XV) цепь
Гликопротеиновый гормон бета-5
В меланомы антиген 3
Гомолог ЗА белка NipSnap
Коллаген альфа-1(XVI) цепь
Гранзим М
Бычьего зародышевого плазменного белка гомолог 1
Фибронектин
Коллаген альфа-1(XVIII) цепь
Гастрин-рилизинг пептид
Комплемент Clq-подобный белок 3
Нейдезин
Коллаген альфа-1(XIX) цепь
Сериновая протеаза HTRA1
UPF0565 белок C2orf69
Фактора роста фибробластов рецептор 2
Хрящевой олигомерный матричный протеин
Интерферон альфа-4
UPF0669 белок C6orfl20
Карбоновая ангидраза 6
С-реактивный белок
Интерферон альфа-5
Колипаза-подобный белок C6orfl27
Белок, отсутствующий в злокачественных опухолях мозга 1
Гранулоцит-
кол они е с тимулирующий
фактор
Интерферон альфа-7
Неохарактеризованный белок C7orf69
SPARC-связанный модулярный кальций-связывающий белок 1
Гранулоцит-макрофагоколониестиму лирующий фактор
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина
Тромобоцитарного фактора роста рецептор-подобный белок
Амилоид бета А4 белок
Белок CYR61
Член 10 суперсемейства иммуноглобулинов
Хондроадгерин-подобный белок
Член 6 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Комплемента компонента рецептора 1-подобный белок
Протеаза-связанный домен-содержащий белок 21 кДа
Мнимый
неохарактеризованный белок QNQ6490/PRO21339
Гамма-аминомаслйной кислоты типа В рецептора субъединица 1
Фактор роста стволовых клеток; лимфоцит-
секретируемый лектин С-типа
Абгидролазы домен-содержащий белок FAM108A1
Мнимый
неохарактеризованный белок QNQ6493/PRQ21345
Про-нейрегулин-1, мембранно-связанная изоформа
CMP-N-
ацетилнейраминат-бета-галактозамид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ5815/PR019632
Гликопротеиновый гормон альфа-2
Дипептидилпептидаза 4
Интерлейкина-9 рецептор
Цистатин-А
Мембранная металле-эндопептидаза-подобный 1
Дентин
сиалофосфопротеин
Интерлейкин-9
Ингибитор пептидазы R3HDML
Fc рецептор-подобный А
Эндотелин-1
Ингибина бета В цепь
Цистатин-9
С-С мотив хемокина 4-псдобный
Эфрин-В1
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 2
Член 5 семейства домена DAN
Эпителиального дискоидина домен-содержащий рецептор 1
Эпидермис-специфической сериновой протеазы-подобный белок
BMP-связывающий эндотелиальный регуляторный белок
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок-подобный 1
Муцин-1
EMILIN-1
Кератиноцит-связанный белок 2
Эпидидимально сперма-связывающий белок 1
Фактор роста сосудистого
эндотелия А
Эндоплазмин
Ламинина субъединица альфа-1
Элафин
Фибулин-1
Эфрина типа-А рецептор 3
Лейкоцитарный клеточный хемотаксин-2
Белок FAM55A
Рецептор пролактина
Эфрина типа^В рецептор 6
Желудочная
триацилглицеринлипаза
Фактор
роста/дифференциации 6
Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 6
Гликозилтрансферазы 1 домен-содержащий белок 1
Лейцин-богатый повторами и гомолога калпонина домен-содержащий белок 3
Глюкозы-фруктозы оксидоредуктазы домен-содержащий белок 1
CD209 антиген
Фактор коагуляции X
Панкреатический липаза-связанный белок 2
Эритропоэтин
Коллаген альфа-2(XI) цепь
Фактор коагуляции VIII
Эпидидимис-специфическая альфа-маннозидаза
Глутатионпероксидаза 6
Гранулоцит-
макрофагоколоннестимулир ующий фактора рецептора субъединица альфа
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 7
Фибронектина типа III домен-содержащий белок 7
Неохарактеризованный белок UNQ511/PRO1026
Эластин
Фибриллин-2
Микрофибриллы-связанный белок 5
Бета-дефенсин 128
Интерлейкина-15 рецептора субъединица альфа
Альфа-2-HS-
гликопротеин
Мюллер-ингибирующий фактор
Интерлейкин-31
Мидкин
Фактор роста фибробластов 10
Металлопротеиназа матрикса-21
Интерлейкин-34
Интегрин альфа-7
Фибриноген альфа цепь
Металлопротеиназа матрикса-17
Плазменный калликреин-подобный белок 4
Муцин-4
Фибриноген бета цепь
Матричная
металлопротеиназа-20
Эпидидимально-
специфический липокалин-9
Пептидил-глицин альфа-амидирующая монооксигеназа
Белок, связанный с карциномой эпителия длинного неба,
легкого и носа 1
N-ацетилглюкозамин-Х-фосфотрансферазы субъединица гамма
кДНК FLJ60957, высоко аналогичная С е кр е тируемому связанному с ожогом белку 4
Аполилопротеин A-I
Гастрин
Мультимерин-2
Липазы член М
Протеогликан 4
Гликопротеинового гормона альфа-цепь
Промотилин
CLECSF12
Член 25 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Ы-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазы субъединица альфа/бета
FRAS1-родственный белок внеклеточного матрикса 3
Мнимая неактивная секреторная фосфолипаза А2 группы IIC
Аттрактин
Гранзим А
Протеинкиназы С-связывающий белок NELL1
Сериновая протеаза MPN2
Простата-ассоциированный микросеминопротеин
Фактора роста
гелатоцитов-подобный
белок
Протеинкиназы С-связывающий белок NELL2
Нетрин-5
Альфа-амилаза 1
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок 1
Нейротрипсин
NHL повтор-содержащий белок 3
Мозговой
нейротрофический фактор
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок 2
Нейросерпин
Офлактомедин-подобный белок 2В
С-типа лектинового домена семейства 4 член М
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок 4
Нидоген-2
Овохимаза-2
Гранулодит-колониестимулирующего фактора рецептор
Член 10D суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Абгидролазы домен-содержащий белок FAM108B1
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ3029/PRO9830
Инсулин-подобный фактор роста II
Интерферон альфа-1/13
Нейротрофин-4
Овохимаза-1
Карциноэмбриногенная антиген-родственная молекула клеточной адгезии 1
Интерферон-индуцированной геликазы С домен-содержащий белок 1
Эпидидимальна я
секреторная
глутатионпероксидаза
Мнимый беременность-специфический бета-1-гликопротеин 7
С-типа лектинового домена семейства 7 член А
Интерферон альфа-2
Группы 10 секреторная фосфолипаза А2
Овостатина гомолог 2
CMRF35-noflo6HaH молекула
Интерферон бета
Группы IID секреторная фосфолипаза А2
Орексигенный нейролептид QRFP
Холина транспортера-подобный белок 4
Интерферон гамма
Лактопероксидаза
Лимфоцитарный антиген 6К
Легочный сурфактант-ассоциированный белок А1
Инсулин-подобный
фактор роста IB
р53 апоптоза эффектор, родственный РМР-22
Белок, экспрессируемый простатой и яичками 1
Сперминоксидаза
Индийский еж-белок
Плацента-специфический белок 1
Мнимая фосфолипаза В-подобный 1
CMP-N-ацетилнейраминат-бета-1,4-галактозид альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Нервных клеток адгезивная молекула Ll-подобный белок
Тубероинфундибулярный пептид
с 39 остатками
Мнимый
неохарактеризованный белок FLJ4 2147
Калликреин-8
Интерлейкин-13
Проларгин
Отогелин
Тканевого типа плазминогена активатор
Интерлейкин-2
Секретогранин-2
Рибонуклеаза 8
Пероксисомальная N(1)-
ацетил-спермин/
спермидиноксидаза
Химотрипсин-подобной эластазы семейства член 2А
Эндонуклеазы домен-содержащий 1 белок
Ядерной поры комплекса-взаимодействующий белок-подобный 2
Вероятная
пальмитоилтрансфераза ZDHHC4
Ингибина бета А цепь
Семафорин-ЗВ
Проактиватора полипептида-подобный 1
Холестерилового сложного эфира транпортировочный белок
Панкреатический секреторный трипсина ингибитор
Соматостатин
Велка spinster гомолог 2
HLA класса I гистосовместимости антиген, А-2 альфа цепь
Член 21
суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Дегидрогеназы/редуктазы SDR член семейства 4-псдобный 2
фон Виллебранда фактора С домен-содержащий белок 2-подобный
Коллаген альфа-1(IIJ цепь
Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь HI
Транскобаламин-1
Уротензин-2В
Про-интерлейкин-16
Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Н2
Клеверный фактор 2
Тетраспанин-18
Рецептор лептина
Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь НЗ
Тестикан-1
UPF0514 мембранный белок FAM159A
Декорин
Простата-специфический антиген
Сывороточная параоксоназа/лактоназа 3
Латерин
Стромальных клеток фактор 1
Калликреин-4
Толлоид-подобный белок 2
Метилтрансфераза-подобный белок 7В
Тенасцин
Плазменный калликреин
Трипсин-2
Белок ТЕХ261
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 12
Кальций-активированный хлоридного канала регулятор 4
RING пальцевый и SPRY домен-содержащий белок 1
Алкилированной ДНК восстанавливающего белка alkB гомолог 7
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина
Бактерицидный/проница емость-повышающий белок-подобный 1
Кальций-связывающий и суперспиральный домен-содержащий белок 1
Трансмембранный етпр24 домен-содержащий белок 6
Т-клеток поверхностного гликопротеина CD8 альфа цепь
Лептин
Белок Wnt-2
ХК-родственный белок 5
EGFR-коамплифицируемый и
переэкспрессируемый
белок
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 4
Эктонуклеазид трифосфат дифосфогидролаза 8
Мнимый V-набора и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 7
Аутофагия-родственный белок 16-1
Печеночная
триацилглицеринлипаза
Белок Wnt-8b
Инсулинового фактора роста-подобный член семейства 3
Рака молочной железы анти-эстроген-резистентного белок 3
Лимфоцитного антигена 6 комплексного локуса протеин G6c
UDP-GlcNAc:6eTaGal бета-1,3-N-
а це тилглюкоз амин ил тр а н сф ераза 4
Ядерной поры комплекса-взаимодействующий белок-подобный 1
Кадгерин-23
Эозинофиллизофосфолип аза
EMI домен-содержащий белок 1
Секретируемый фосфопротеин 1
Макрофаговый колониестимулирующий фактор 1
Лютропина субъединица бета
Неохарактеризованный белок C6orfl5
Коллаген альфа-5(У1) цепь
Фолатный рецептор альфа
Микрофибриллярно-связанный белок 1
Коллектин-10
В меланомы антиген 5
Низкой плотности липопротеинов рецептор-родственный белок 8
Мезенцефалический астроцитарный нейротрофический фактор
Длинноцепочечных жирных кислот--КоА лигаза ACSBG2
WAP четырехдисульфидный ядерный доменный белок 10А
ЕЗ убиквитин-протеинлигаза LRSAM1
Матрикса Gla белок
Онкопротеин-индуцированный транскриптный белок 3
UPF0369 белок C6orf57
Нервных клеток адгезивная молекула 1
72 кДа типа IV коллагеназа
Ингибитор пептидазы 15
Мнимый
неохарактеризованный белок C10orf31
Невролигин-4, X-связанный
Стромелизин-1
Пролин-богатый кислотный белок 1
Мнимый
неохарактеризованный белок Cllorf45
Нетрин-Gl
Нейтрофилколлагеназа
Урокортин
Неохарактеризованный белок C12orf28
GPI трансамидазы компонент PIG-T
Мезотелин
Трипсин-ХЗ (ЕС 3.4.21.4)
Неохарактеризованный белок C17orf67
Kit лиганд
Муцин-5АС
HHIP-подобный белок 2
Бета-дефенсин 121
Seizure 6-подобный белок
Муцин-6
Фракталкин
Бета-дефенсин 130
SLAM семейства член 7
Норрин
Белок Wnt-11
Гистидиновой триады нуклеотид-связывающий белок 2
Фактор некроза опухолей
Окситоцин-нейрофизин
Белок Wnt-7a
Апелин
Уромодулин
Бета-фактор роста нервов
FCH и двойных доменов SH3 белок 1
Плацента-специфический белок 9
Член 13 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Член 18
суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Гепатомный фактор роста-родственный белок 2
Гепатоклеточный карциномы-связанный белок TD26
Белок CREG1
Нейротрофин-3
Интерлейкина-12 субъединица альфа
Персефин
EGF-подобный домен-содержащий белок 8
Тромобоцитарного фактора роста субъединица А
UPF0577 белок KIAA1324
Регулированный эндокрин-специфический белок 18
Аминоацил тРНК синтетаза
комплекс-
в за имоде йс т вующий
многофункциональный
белок 1
Фосфопантотеноилцисте индекарбоксилаза
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 9
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 8
ADAMTS-подобный белок 4
Ингибитор активатора плазминогена 1
Муцин-17
Костный морфогенный белок 8А
фактор коагуляции XI
Ингибитор активатора плазминогена 2
Лизосомный белок NCU-G1
Белок WFDC13
Интерлейкина-2 2 рецептора субъединица альфа-2
Проколлаген С-эндопептидазы усилитель 1
Пролил 4-гидроксилазы субъединица альфа-3
белок Wnt-8a
Деформированного эпидермиса ауторегуляторного фактора 1 гомолог
Трансмембранный и убиквитин-подобный домен-содержащий белок 2
Пептидил-пролил цис-транс изомераза SDCCAG10
Ig-подобный домен-содержащий белок ENSP00000270642
Простагландин-Н2 D-изомераза
Протеин дисульфид-
изомераза
Ингибитор пептидазы 16
Абгидролазы домен-содержащий белок 15
Альфа-1-антитрипсин
Пигментного эпителия-произБОдный фактор
Полиовирус рецептор-родственный белок 4
Рибонуклеаза-подобный белок 9
Альфа-1-антихимотрипсин
Пепсин А
Носителей растворенных веществ семейства 22 член 15
Неохарактеризованный белок C2orf66
Ацил-КоА-связывающий белок
Гастриксин
GPI инозитол-деацилаза
Неохарактеризованный белок C17orf99
Фактор комплемента В
Sonic еж-белок
Трансмембранный белок 4 3
Белок FAM150A
Хориогонадотропина субъединица бета
Распознавания пептидогликана белок 1-альфа
Ангиопоэтин-родственный белок 2
Плацента-специфический 1-подобный белок
Versican ядерный белок
Бигликан
Ангиопоэтин-родственный белок б
Неохарактеризованный белок Cl8orf20
Рецептор фактора роста эпидермиса
Пролактин-индуцируемый белок
Арилсульфатаза К
Бета-дефенсин 110
Экто-NOX дисульфид-тиол обменник 2
Фактор тромбоцитов 4
Авгурин
Невритин-подобный белок
Гиалуронидаза-1
Плазминоген
Мозг-специфическая сериновая протеаза 4
Гистидин-богатый белок карбоксильного конца 1
Интерлейкина-1 рецептора антагонистический белок
Сывороточная параоксоназа/арилэсте раза 1
DBH-подобный
монооксигеназный белок 1
С-типа лектинового
Г""- 2 (tm)~
Интерлейкина-б рецептора субъединица бета
Щелочная фосфатаза, плацентарного типа
Неохарактеризованный белок Clorf56
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 7 0
Интерлейкина-1 рецептор-подобный 1
Пептидил-пролил цис-транс изомераза В
Церебеллин-3
Серпин А13
Инсулин
Костномозговой протеогликан
Церебеллин-4
BTB/POZ домен-содержащий белок 17
Гликоделин
Основной слюнный
7(tm)~ "~
Колипаза-подобный белок C6orf126
Неохарактеризованный белок Cl2orf53
Паратгормон-родственный белок
Легочный сурфактант-
с--
Неохарактеризованный белок Cllorf83
С-типа лектинового
Г" 5""""
Нурим
Паратгормон
Неохарактеризованный белок Cl6orf89
Комплемент Clq-подобный белок 4
Пролил 4-гидрокилазы субъединица альфа-2
Сывороточный амилоид Р-компонент
Карбоксипептидаза-
подобный белок Х2
СМЯЕЗБ-подобная молекула
CD276 антиген
Секретогранин-1
Цистатин-9-подобный
Белок FAM151B
Цистеин-богатый с EGF-подобным доменом белок 1
Сердцевинный белок базальной мембраны-специфического гепарансульфат протеогликана
Дегидрогеназы/редуктазы SDR член семейства 13
Абгидролазы домен-содержащий белок FAM10 8A2/A3
CUB и sushi домен-содержащий белок 1
Антилейкопротеиназа
Бета-дефенсин 123
Остеокрин
Фиколин-2
Стабилин-1
Бета-дефенсин 132
Трансмембранная протеаза, сериновая 11Е2
Fc рецептор-подобный белок 5
Внеклеточная супероксиддиемутаза [Cu-Zn]
Цитокин-подобный белок 1
Трансмембранный белок 14Е
Белок GPR8 9
Соматотропин
Diсkkopf-родственный белок 2
Трансмембранный белок 207
Соединительная адгезивная молекула А
Серпин В5
Dickkopf-подобный белок
ТОММ20-подобный белок 1
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 8А
Спондин-1
Эпидидимальный секреторный белок ЕЗ-бета
Неохарактеризованный белок C3orf41
Множественная инозитолполифосфатфосфат аза 1
Белок обеспечения структур хромосом 3
EGF-подбный повторный и дискоидин 1-подобный домен-содержащий белок 3
Подчелюстной железы андроген-регулируемый белок ЗА
Нейропилин-1
Синтаксин-1А
Белок FAM55D
В меланомы антиген 1
Плексин-А4
Тетранектин
Фактор роста фибробластов П
Неактивная карбоксилэстераза 4
Плексин-В1
Трансформирующий фактор роста бета-1
Фактор роста фибробластов 22
Четырехсочлененный коробочный белок 1
Периостин
Тироглобулин
Фибробластов фактор роста-связывающий белок
Белок HSN2
Белок RIC-3
Ингибитор
металлопротеиназы 1
Фактор
роста/дифференциации 3
Гуманин
SLIT и NTRK-подобный белок 2
Ингибитор
металлопротеиназы 2
GLIPRl-подобный белок 1
Килин/хордин-подобный белок
Сульфатаза-
модифицирующий фактор 1
Ингибитор
металлопротеиназы 3
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 6
0PF0624 белок C6orfl86
Сульфатаза-
модифицирующий фактор 2
Урокиназного типа
активатор
плазминогена
Интерлейкин-ПВ
Мнимый нейрофибромин 1-подобный белок 4/6
Транмембранная протеаза, сериновая 6
Лактотрансферрин
Интерлейкин-17с
Пероксидазин-подобный белок
Лимфотоксин-альфа
Трипсин-1
Интерлейкин-170
SCO-спондин
Член 10В суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Подчелюстной железы андроген-регулируемый белок ЗВ
Гиалуронана и протеогликана сшивки белок 3
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ9165/PRO28630
Урокиназы плазминогена активаторный поверхностный рецептор
Член 1А суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Вителлин-мембранного белка 1 внешнего слоя гомолог
Кальций-активированный хлоридного канала регулятора член семейства 3
V-набора домен-содержащий Т-клеток активации ингибитор 1
Фактора роста сосудистого эндотелия рецептор 1
Хориогонадотропина субъединицы бета вариант 1
Вероятная сериновая протеаза
QNQ9391/PR034284
Глюкагон
Витамин D-связывающий белок
Лизоцим-подобный белок 1
Неохарактеризованный белок C4orf26
М-ацетилмурамоил-L-аланинамидаза
Витронектин
Металлопротеиназа матрикса-28
Неохарактеризованный белок С4ог?40
Сульфгидрилоксидаза 1
фон Виллебранда фактор
Нефронектин
Неохарактеризованный белок C5orf55
Дегидрогеназы/редуктазы SDR член семейства А
Лимфоцитного антигена 6 комплексного локуса протеин G5c
WAP четырехдисульфидный ядерный доменный белок 12
Мнимый макрофаг-стимулирующий белок MSTP9
Интерлейкин-18-связывающий белок
Цинк-альфа-2-гликопротеик
Ольфактомедин-подобный белок 1
Неохарактеризованный белок C15orf61
Kin IRRE-подобный белок 2
Неохарактеризованный белок C14orf93
Офлактомедин-подобный белок 2А
Химотрипсиноген В2
Миелоид-ассоциированный маркер дифференциации
Ретиношизин
Сериновая протеаза 27
Бета-дефенсин 106А
Хордин
Альфа-1,3-
маннозилтрансфераза
ALG2
Секретоглобина семейства ЗА член 2
Бета-дефенсин 111
1-ацил-зп-глицерин-З-фосфат ацилтрансфераза гамма
С-типа лектинового домена семейства 11 член А изоформа CRA b
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина
Мнимый V-набора и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок б
Ведущего конца гликозилирования продукт-специфический рецептор
Домен-содержащий белок 7
суперсемейства
основного
фасилитатора
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 28
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 5-подобный 3
NLR семейства CARD домен-содержащий белок 4
Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный нейрональный белок 1
Бактерицидный/проницаемо сть-повышающий белок-подобный 2
Мнимый сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 5-подобный 2
Про-нейрегулин-2, мембрана-связанная изоформа
3N1ADH дегидрогеназы [убихинон] 1 бета субкомплекса субъединица 11, митохондриальная
Кислой сфингомиелиназы-подобная фосфодиэстераза ЗЬ
Дегидрогеназы/редуктазы SDR член семейства 7С
Сперма-ассоциированный антиген НА
UPFQ54 6 мембранный белок Clorf91
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 7
Бета-дефенсин 131
Ооцит-секретируемого белка 1 гомолог
Карбоновая ангидраза-родственный белок 10
Нейрексофилин-4
Бета-дефенсин 134
Сывороточный альбумин
Холецистокинин
Белок Wnt-9b
Бета-дефенсин 136
Кохлин
Коданин-1
Зимогенового гранулярного белка 16 гомолог В
Бета-дефенсин 116
Плазменной протеазы С1 ингибитор
Неохарактеризованный белок C6orf89
Семафорин-30
Белок FAM132A
Интерлейкина-7 рецептора субъединица альфа
Хондроитинсульфатглюк уронилтрансфераза
Аполипопротеин L4
Белок FAM132B
Кнтер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Н5
Хитиназа домен-содержащий белок 1
Транмембранная протеаза, сериновая 11D
Бета-дефенсин 115
Тромобоцитарный фактор роста D
Трансмембранный белок C9orf7
Scrapie-чувствительный белок 1
Бета-дефенсин 114
Белок S100-A7
CMRF3 5-пQдoбнaя молекула 9
Мнимый аннексии А2-подобный белок
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 9
Сиаловая кислота-связывающий Ig-подобный лектин 10
Цитохром Р450 2S1
Костный морфогенный белок 10
Липазы член N
Тубулоинтерстициального нефрита антиген-подобный
Crumbs белка гомолог 3
Секретогранин-3
Панкреатический липаза-связанный белок 3
Член 13В суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Дегидрогеназы/редукта зы SDR член семейства 7
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 4
Белок, экспрессируемый в яичках, простате и плаценте
Длинноцепочечных жирных кислот--КоА лигаза 5
Белок ENED
Неохарактеризованный белок Clorf54
Нейромедин-S
Клаудин-14
Комплемента фактора Н-родственный белок 4
Карбоксипептидаза А6
Нейропептид S
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 20
Лейцин-богатый повторяющийся LGI семейства член 3
С-С мотив хемокина 19
Нейрональный пентраксин-подобный белок C16orf38
Член 7 семейства Интерлейкина-1
Глиомедин
С-С мотив хемокина 2 5
Отолин-1
Лимфоцитного антигена 6 комплексного локуса протеин G5b
Глицерофосфодиэфирфос фодиэстеразы домен-содержащий белок 5
Химотрипсин-подобной эластазы семейства член 2В
Железо/цинк пурпуровая кислая фосфатаза-подобный белок
Ацетилхолинэстераза
Вероятный G-белок сцепленный рецептор 113
Белок CEJ
Овостатина гомолог 1
Амелогенин, X изоформа
Вероятный G-белок сцепленный рецептор 114
Неохарактеризованный белок C6orfl
Плазминоген-родственный белок А
Ангиогенин
Глицерин-3-
фосфатацилтрансфераза
Неохарактеризованный белок C7orf34
Лолисераза-3
сибиреязвенного токсина рецептор 2
Гремлин-1
Кератиноцит-связанный белок 3
Мнимый пептид YY-2
Аннексии А2
Калийного канала подсемейства К член 17
Неохарактеризованный белок C9orf47
Мнимый пептид YY-3
Аполипопротеин C-III
KDEL мотив-содержащий белок 2
Коллаген альфа-1(VIII) цепь
Рибонуклеаза-подобный белок 10
Аполипопротеин L1
Лайилин
Неохарактеризованный белок C18orf54
Рибонуклеаза-подобный белок 12
Субъединица субкомпонента А комплемента Clq
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 8В
Цистатин-подобный 1
Рибонуклеаза-подобный белок 13
Субъединица субкомпонента С комплемента Clq
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 8D
С2 домен-содержащий белок 2
Серпин АН
Кальцитонин
Сиаловая кислота-связывающий Ig-подобный лектин 6
DDRGK домен-содержащий белок 1
Кипitz-типа протеазы ингибитор 4
Растворимая кальций-активируемая нуклеотидаза 1
Мнимый беременность-специфический бета-1-гликопротеин 2
Белок FAM55C
Метеорин-подобный белок
С-С мотив хемокина 15
Ьуб/PLAUR домен-содержащий белок 1
Коллаген альфа-1(XXVI) цепь
Мнимая яичковая сериновая протеаза 2
CD97 антиген(
Ly6/PLAUR домен-содержащий белок 5
Белок FAM19A2
Бета-дефенсин 112
Контактин-4
MLN64 N-терминального домена гомолог
Белок FAM5B
Неохарактеризованный белок FLJ37543
Комплемент С2
Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов
Фактор роста фибробластов 5
Белок FAM24A
Коллаген альфа-6(IV)
цепь
2-ацилглицернл 0-
ацилтрансфераза 3
Вероятная сериновая протеаза HTRA3
Секретируемый связанный с ожогом белок 4
Коллаген альфа-2(VI) цепь
Митохондриального носителя гомолог 1
Член 8 семейства Интерлейкина-1
Комплемент Clq-подобный белок 2
Коллаген альфа-1(XI) цепь
Аполипопротеин L6
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 4
Мнимый
неохарактеризованный белок C17orf69
Crumbs гомолог 1
Протокадгерин альфа-б
Отоспиралин
Мнимый цистатин-13
Цистатин-С
Протокадгерин гамма-А12
Экспрессируемый в печени антимикробный пептид 2
Бета-дефенсин 109
Нейтрофильный дефенсин 1
Вольтаж-открываемый водородный канал 1
Лизилоксидазы гомолог 1
Бета-дефенсин 113
Эндотелии-3
АН-транс-ретинол 13,14-редуктаза
Лизилоксидазы гомолог 2
Бета-дефенсин 135
Низкоаффиный иммун о гл обули н о вый эпсилон Fc-рецептор
Динамики микротубул регуляторный белок 2
Белок, связанный с карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа 4
Пептидаза S1 домен-содержащий белок LOC136242
Рецептор фактора роста фибробластов 3
К-Спондин-4
Лизоцим g-подобный белок 2
Фактор
роста/дифференциации 7
Рецептор фактора роста фибробластов 4
Длинноцепочечных жирных кислот транспортный белок 3
Эндомуцин
IgA-индуцирующего белка гомолог
Роста остановка-специфический белок 6
Пузырек-
транспортирующий белок SEC22C
Нейропептид В
Мнимый липокалин 1-лодобный белок 1
Рецептор гормона роста
Клаудин-1
Кинезин-подобный белок KIF7
Мнимая сериновая протеаза 29
Бифункциональный УДФ-N-ацетилглюкозамино 2-эпимераза/N-ацетилманнозаминокиназа
Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин-подобный домен-содержащий белок 3
Лейкоцит-ассоциированный иммуноглобулин-подобный рецептор 2
Мнимый рецептора Scavenger цистеин-богатый домен-содержащий белок LOCG19207
Член 8 суперсемейства иммуноглобулинов
SLAM семейства член 9
Кальций-зависимая фосфолипаза А2
Секретоглобин-подобный белок
Интерлейкина-4 рецептора альфа-цепь
Транстиретин
Проапоптозный каспазный адаптерный белок
Мнимый стереоцилин-подобный белок
Калликреин-14
Сериновой/ треониновой-киназы белок 32В
Интегрин бета-подобный белок 1
Инсулинового фактора роста-подобный член семейства 2
Калликреин-6
Тромобоцитарного фактора роста субъединица В
Толлоид-подобный белок 1
KIR2DL4
Ламинина субъединица бета-3
Ноггин
Кипitz-типа протеазы ингибитор 3
Мнимый цинк-альфа-2-гликопротеин-подобный 1
Лейцил-цистинил аминопептидаза
Триптаза альфа-1
Белок ТМЕМ155
Инсулинового фактора роста-подобный член семейства 4
Маннан-связывающая лектиновая сериновая протеаза 1
Тетратрикопептидповто рный белок 14
Просалюзин
Неохарактеризованный белок C2orf72
Маннан-связывающая лектиновая сериновая протеаза 2
ХТРЗ-
трансактивированного гена В белок
Белок безамнионный
Начала репликации-подобный белок
Нейтрофилжелатиназы-связанный липокалин
Пальмитоилтрансфераза ZDHHC15
Белок WFDC10B
Белок, экспрессируемый простатой и яичками 3
Нейропептид Y
Вителлинового слоя сперма-связывающий белок 3
WAP четырехдисульфидный ядерный доменный белок 8
В меланомы антиген 4
Aggrecan ядерный белок
Лейцин-богатый повтор-содержащий
белок 39
Белок Wnt-5b
Мнимый
неохарактеризованный белок Clorfl91
Легочный сурфактант-ассоциированный белок В
Панкреатическая триацилглицеринлипаза
Белок Wnt-7b
Бета-дефенсин 108В-подобный
Полиовирус рецептор-родственный белок 1
Трансмембранный белок 139
Вителлинового слоя
г(tm)-
Неохарактеризованный белок FLJ90687
Ренин
Лейкемии ингибирующий фактор
SH3 домен-связывающий белок 5-подобный
Секретируемый связанный с ожогом белок 2
Рибонуклеаза панкреатическая
Галектин-1
Адипоцитов адгезивная молекула
Основной пролин-богатый пептид IB-1
Семеногелин-1
С-С мотив хемокина 21
Неохарактеризованный белок C12orf59
Фактор роста фибробластов 16
Сигнальная молекула активации лимфоцитов
CD5 антиген-подобный
Аполипопротеин A-I-связывающий белок
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа 8
Ингибитор пути тканевого фактора
Карбогидратсульфотран сфераза 9
Клаудин-17
Неохарактеризованный белок KIAA0495
Ушерин
Липополисахарид-связывающий белок
Неактивная каспаза-12
Тромбоцитов основный белок-подобный 2
Фактор роста фибробластов 2 3
Цистеин-богатый моторных нейронов 1 белок
Неохарактеризованный белок C7orf58
Серпин ЕЗ
Интерлейкина-2 3 субъединица альфа
Фактор роста соединительной ткани
Коллаген альфа-1{XXVIII) цепь
CRl-рецептор
Эпидидимальный секреторный белок Е1
Гомолог белка eyes shut
Белок матрикса дентина 4
Секретируемый фосфопротеин 1
ADAMTS-подобный белок 1
Муцин-подобный белок 1
Неохарактеризованный белок C16orf48
Белок, секретируемый при стрессе 1
Хемокин-подобный фактор
Фактор роста фибробластов 19
Карбоксилэстераза 3
Белок Wnt
EGF-подобный домен-содержащий белок 7
Фоллистатин-родственный белок 3
Белок FAM20B
Белок Wnt (Фрагмент)
Тектоник-1
Еж-взаимодействующий белок
GPN-петля ГТФазы 3
Мнимая сериновая протеаза LOC138652
Трансмембранный белок 25
Интерлейкина-17 рецептор В
GRAM домен-содержащий белок 1В
Т0М1
УДФ-GalNAc:бета-1,3-N-ацетилгалактозаминилтран сфераза 1
FXYD домен-содержащий регулятор
транспортировки ионов 5
Фосфатидилинозитолгликан якорного биосинтеза класса U белок
Мнимый
неохарактеризованный белок FLJ46089
Интерлейкин-15 (IL-15)
Эндотелиальная липаза
Интерлейкина-27 субъединица альфа
Мнимый
неохарактеризованный белок Clorfl34
Множественные домены, подобные фактору роста эпидермиса 11
ЭГФ-содержащий фибулин-подобный белок внеклеточного матрикса 2
Про-нейрегулин-4, мембрана-связаная изоформа
UDP-GlcNAc:6eTaGal бета-1,3-N-
ацетилглюкозаминилтрансф ераза 9
Муцин и кадгерин-подобный белок
Отораплин
Лейцин-богатый повторами нейрональный белок 3
Неохарактеризованный белок Cllorf44
Рибонуклеаза 4
Группы 3 секреторная фосфолипаза А2
HMDA рецептор-регулируемый белок 2
Неохарактеризованный белок Cl2orf73
SH2 домен-содержащий белок ЗС
Группы XV Фосфолипаза
NADH-цитохром Ь5 редуктаза 1
Мнимый нистатин-9-подобный 2
СМР-Ы-ацетилнейраминат-бета-галактозамид-альфа-2, 3-сиалилтрансфераза
Член 14
суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Болезни Паркинсона 7 домен-содержащий белок 1
Мнимой абгидролазы домен-содержащий белок FAM108A5
Трансмембранный белок 9
Плексин-А2
БК506-связывающий белок 11
Бета-дефенсин 133
WAP четырехдисульфидный ядерный доменный белок 2
Папилин
С-типа лектинового домена семейства 12 член В
Фиброзин-1
Аденозиновый A3 рецептор
Прокинетицин-1
Носителей растворенных веществ семейства 35 член F5
Вероятный фолатный рецептор дельта
Гамма-секретазы субъединица АРН-1А
Рибонуклеаза 7
Сиаловая кислота-связывающий Ig-подобный лектин 12
RPE-спондин
Базигин
Kunitz-типа протеазы ингибитор 1
Белок БАМ19A3
NPIP-подобный белок ENSP00000346774
Еакуловирусный IAP повтор-содержащий белок 7
Спондин-2
WD повтор-содержащий белок 82
Мнимый яичко-специфический прионный белок
Калуменин
Тестикан-2
Адипоцитарный энхансер-связывающий белок 1
Пролин-богатый белок 1
Альфа-Si-казеин
Неактивная сериновая протеаза PAMR1
ADAMTS-подобный белок 3
Мнимый
неохарактеризованный белок FP24 8
Циклин-Ll
Торсин~2А
Суперспиральный домен-содержащий белок 80
UPF0670 белок C8orf55
Фактор комплемента Н
Вазогибин-1
Экто-WOX дисульфид-тиол обменник 1
Мнимый цинк-альфа-2-гликопротеин-подобный 2
Хорионический
соматомаммотропиновый
гормон
Вазорин
Нейрональный регулятор роста 1
Белок SPARC
Рецептор вируса Коксаки и аденовируса
Ксилозмлтрансфераза 1
Интерфоторецептора матрикса протеогликан 1
Отопетрин-1
Эктонуклеотидных пирофосфатазы/фосфодиэст еразы семейства член 2
Эктонуклеотидных пирофосфатазы/фосфоди
эстеразы семейства член 6
кДНК FLJ36603 fis, клон TRACH2Q15180, высоко аналогичная Секретируемому связанному с ожогом белку 2
кДНК FLJ55667, высоко аналогичная Секретируемому кислотному и цистеин-богатому белку
EROl-пОдобный белок альфа
Онкостатин-М
Липазы член Н
Липазы член К
Фактор коагуляции IX
Дерлин-1
Муцин-19 (MUC-19)
С-типа лектинового домена семейства 18 член
Низкоаффинный иммуноглобулина гамма Fc региона рецептор III-B
HERV-FRD_6p2 4.1 провирусный наследственный полипротеин Env
Чувствительности к псориазу 1 кандидатного гена 2 белок
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ6125/PRO20090
Фиколин-3
Простасин
Интегральный мембранный белок 2А
Комплемент СЗ
Fc рецептор-подобный белок 2
Трансмембранная протеаза, сериновая НЕ
Транспорта пузырьков белок SFT2B
Коллаген альфа-2(IV) цепь
Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный белок FLRT3
HLA класса I гистосовместимости антиген, Cw-16 альфа цепь
фон Виллебранда фактора А домен-содержащий белок ЗА
Неохарактеризованный белок DNQ6126/PRO20091
Гелсолин
Wnt ингибиторный фактор 1
Белка shisa-2 гомолог
Серпин-подобный белок HMSD
Гранулизин
С-типа
натрийуретический пептид
Сигнальной пептидазы комплексная субъединица
Белок, экспрессируемый простатой и яичками 4
Трансмембранный гликопротеин NMB
Ангиопоэтин-2
CD164 сиаломуцин-подобный 2 белок
Коллаген альфа-1(XXII) цепь
Гранулины
Дезоксирибонуклеаза гамма
Кадгерин-16
Мнимый
неохарактеризованный белок C13orf28
Гепараназа
Карбоксипептидаза А5
Кадгерин-19
Цистатин-3
Ig мю цепи С регион
С-С мотив хемокина 14
Церебеллин-2
Я-Спондин-1
Интерлейкин-1 альфа
Интерлейкин-5
Трансмембранный белок C3orfl
C8orf2
Интерлейкина-31 рецептор А
Интерлейкин-10
Спермальный
экваториального сегмента белок 1
Одорант-связывающий белок 2а
Соединительная адгезивная молекула В
С-Х-С мотив хемокина 2
Неохарактеризованный белок C6orf72
Опиорфин
Липокалин-1
С-Х-С мотив хемокина 5
Неохарактеризованный белок Cllorf24
Почек андроген-регулируемый белок
Лейцин-богатый повтор-содержащий G-белок спаренный рецептор 6
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 6
Acyl-CoA синтетазы семейства член 2, митохондриальный
Мнимый
Неохарактеризованный белок UNQ5830/PRO19650/ PR019816
Латентный
трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок 1
Полипептид N-
ацетилгалактозаминилт рансфераза 1
Вероятный УДФ-сахар-транспортирующий белок SLC35A5
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ6975/PR021958
Матрилин-3
Фибулин-2
С-типа лектинового домена семейства 1 член
Трахикинин-3
Миелиновый белок нуль-подобный белок 1
Фиколин^1
С-типа лектинового
Секретируемый фосфопротеин 1
Нейробеахин-подобный белок 2
SL цитокин
С-типа лектинового домена семейства 4 член
Склеростин
Никастрин
Фоллистатин
С-типа лектинового домена семейства 4 член
ADAMTS-подобный белок 2
АДФ-рибоза пирофосфатаза, митохондриальная
FRAS1-связанный
внеклеточного матрикса белок 1
Вероятная катион-транспортирующая АТФаза 13А4
Рецептора Scavenger цистеин-богатый домен-содержащий белок ШС284297
Протокадгерин-15
Энамелин
UPFO480 белок C15orf24
Триптаза бета-1
Фактор роста плаценты
Гиалуронана и протеогликана сшивки белок 1
Вителлинового слоя сперма-связывающий белок
Триптаза дельта
Белок 0-связанная-манноза бета-1,2-N-ацетилглюкозаминилтрансф ераза 1
Лейкоцитарного иммуноглобулин-подобного рецептора подсемейства А член 3
Резидентный белок эндоплазматической сети ERp27
Мнимый белок критического региона
Г*°" ~"""
Вероятная гидролаза PNKD
Интерлейкин-17Б
Трансмембранный белок C16orfS4
Плексин домен-содержащий белок 1
Плейотрофин
Интерлейкина-1 рецептора белок доступа
Цитохром Р4 50 4F12
MC51L-53L-54L гомолог (Фрагмент)
Рецептор полиовируса
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа
Цитохром Р4 50 4X1
COBW-подобный плацентарный белок (фрагмент)
Ретикулон-4 рецептор
Калликреин-15
Цитохром Р450 4Z1
Цитокинового рецептора-подобный фактор 2
Сывороточный амилоидный А белок
Интерферон альфа-14
Белок CREG2
Бета-дефенсин 103
Пол о вых го рмо но в-свя зывающий глобулин
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 4
DnaJ гомолога подсемейства В член 9
Бета-дефенсин 106
SLAM семейства член 6
Коллагеназа 3
Дипептидаза 3
Гиалуронидаза-3
Сарколеммной мембраны-связанный белок
Металлопротеиназа матрикса-16
Мембранный белок FAM17 4A
Интерлейкина-2 8 рецептора альфа-цепь
Sushi, Фон Виллебранда фактора типа А, ЭГФ и пентраксин домен-содержащий белок 1
Питуитарной аденилатциклаза-активирующий полипептид
Тиоредоксин домен-содержащий белок 15
Гликозилтрансфераза 54 домен-содержащий белок
Тироксин-связывающий глобулин
Прокинетицин-2
Белок FAM19A4
Хордин-подобный белок 1
Трансмембранный и суперспиральный домен-содержащий белок 1
Латентный трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок 3
Аденозин монофосфат-белок трансфераза FICD
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ9370/PRO34162
Транмембранная протеаза, сериновая 3
Соматолиберин
Пренилцистеиноксидаза-подобный
Нетрина рецептор UNC5B
Член ЮС суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Тромбоспондина типа-1 домен-содержащий белок 1
Фитаноил-КоА гидроксилаза-взаимодействующий белок-подобный
Рецептор фактора роста фибробластов FGFR-1 секретируемая форма белка (Фрагмент)
Член 11В суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Ангиогенный фактор с G вставкой и FHA доменами 1
FXYD домен-содержащий регулятор
транспортировки ионов 4
Неохарактеризованный белок ENSPOC000244321
Серотрансферрин
TGF-бета рецептор типа III
Фактор
роста/дифференциации 11
ЕСЕ2
Триптаза бета-2
Тиротропина субъединица бета
Церебральный допамин нейротрофический фактор
ЕРА6
Белок YIPF5
Неохарактеризованный белок C19orf36
GPN-петля ГТФазы 2
Мнимый растворимый интерлейкина 18 рецептор 1
Везикула-ассоциированной мембраны белок-ассоциированный белок В/С
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 2
Гормон роста-индуцируемый трансмембранный белок
Мнимой абгидролазы домен-содержащий белок FAM108A6
кДНК FLJ966 69, высоко аналогичная Секретируемому кислотному цистеин-богатому белку Homo sapiens (остеонектин) (SPARC), мРНК
Эктонуклеотидных пирофосфатазы/фосфоди эстеразы семейства член 5
Глицерофосфодиэфирфосфод иэстеразы домен-содержащий белок 2
Мнимый V-набора и иммуноглобулиновый домен-содержащий-подобный белок ENSPOO0O03O3034
кДНК FLJ77519, высоко аналогичная секретируемому связанному с ожогом белку Homo sapiens мРНК
Полипептид N-ацетилгалактозаминилт рансфераза-подобный белок 2
WAP, kazal,
иммуноглобулин, kunitz и NTR домен-содержащий белок 1
В-клеток созревания антигена транскриптный вариант 4 (Член 17 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей)
Т-клеток дифференциации антиген CD6
Slit гомологичный 1 белок
KDEL мотив-содержащий белок 1
UPF0672 белок C3orf58
Пикачурин
Вариант гормона роста
Адипофилин
Метилрибоза-1-фосфатизомераза
Фибриноген-подобный белок 1
Ангиопоэтин-родственный белок 3
Лактаза-подобный белок
17-бета гидроксистероид дегидрогеназа 13
Интерлейкин-32
Ангиопоэтин-родственный белок 7
Хондромодулин-1
Аминопептидаза В
Матрилин-4
Экто-АДФ-
рибозилтрансфераза 5
Коллаген альфа-6{У1) цепь
Дермцидин
Сперма-ассоциированный антиген 11В
Карбоновая ангидраза-родственный белок 11
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 33
Метеорин
Фактор коагуляции XII
Вероятная рибонуклеаза 11
MANSC домен-содержащий белок 1
Метилтрансфераза-подобный белок 7А
Гепцидин
Вероятная
карбоксипептидаза XI
Липокалин-15
KL3
Klotho
Белок FAM3D
Арилсульфатаза I
N-ацетилтрансфераза 15
Серглицин
С-Х-С мотив хемокина 14
Мезодермы развития кандидат 2
Эфрин-А4
Томорегулин-2
Бета-дефенсин 127
Diekkopf-родственный белок 1
Белок Plunc
Хордин-подобный белок 2
Бета-дефенсин 129
Подокан
Калликреин-11
Член 6В суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Цистеин-богатый секреторный белок LCCL домен-содержащий 2
Фибронектина типа III домен-содержащий белок 1
ШТ1 индуцированный секретируемый белок 1 вариант разрезания к (Фрагмент)
UPF0414 трансмембранный белок C2Gorf30
Фактор роста фибробластов 21
Нейротримин
Член 10 семейства Интерлейкина-1
С-типа лектинового домена семейства 4 член С
Плазменная альфа-L-фукозидаза
Обонятельный рецептор 10W1
PLA2G2D
UPF0317 белок C14orfl59, митохондриальный
Гастрокин-1
Белок PARM-1
Протеогликан 3
Нетрин-С2
Гастрокин-2
PDZ домен-содержащий
белок 2
Инсулин-подобный пептид INSL5
Металлоредуктаза STEAP2
Глутатионпероксидаза 7
Проэпирегулин
Ольфактомедин-подобный белок 3
Sushi домен-содержащий белок 4
HHIP-подобный белок 1
Болезни поликистоза почек белок 1-подобный 1
Внеклеточный гликопротеин лакритин
Белок YIF1B
Интерферон каппа
WLPL514
Ретинолдегидрогеназа 13
Аполипопротеин М
Аполипопротеин C-I
Металлопротеиназа матрикса-26
Нейтрофильный дефенсин 3
С4Ь-связывающего белка бета-цепь
Проколлаген С-эндопептидазы усилитель 2
RELT-подобный белок 2
GLGQ5807
Т-клеток поверхностного гликопротеина CD8 бета цепь
Фактор определения лево-право 1
Носителей растворенных веществ семейства 35 член ЕЗ
TUFT1
С-С мотив хемокина 3-подобный 1
Лейцин-богатый повторяющийся LGI семейства член 4
Транспортер цинка ZIP9
DRLV8200
Фактор роста фибробластов 8
BRCA1-A комплексная субединица Abraxas
Ноэлин-2
IDLW5808
Сиаломуциновый ядерный белок 24
Лейцин зипперный белок 2
Seizure б-подобный белок
UBAP2
Программированной клеточной смерти 1 лиганд 2
Нейрексофилин-3
Семафорин-ЗА
Clq/TNF-родственный
белок 8
Се кре тируемый и трансмембранный 1
Остеомодулин
Семафорин-4С
KIR2DL4 (Фрагмент)
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 6
Сериновой протеазы ингибитор Kazal-типа домен-содержащий белок 1
Абгидролазы домен-с оде ржащий бело к 14 А
Хемокин-подобного фактора суперсемейства 2 транскриптный вариант 2
EGF-подобный модуль-содержащий муцин-подобный рецептор-подобный 3
Спермы акросомы мембрана-
ассоциированный белок
Анкирина повтор домен-содержащий белок 36
Кератиноциты(tm) ассоциированный Трансмембранный белок 1
Ноэлин-3
Секретоглобина семейства ЗА член 1
Белка shisa-4
GKGM353
Одорант-связывающий белок 2Ь
Тсукушин
Нейромедин-U*
MATL2963
Уротензин-2
Клаудин-2 (SP82)
Nodal гомолог
NINP6167
Витрин
Комплемента фактора Н-родственный белок 2
Синаптогирин-2
Р0М121-подобный
WNT1-индуцируемого-сигнального пути белок 3
Иммуноглобулина суперсемейства содержащий лейцин-богатый повторами белок
Мозг-специфического ангиогенеза ингибитор 1-ассоциированный белок 2-подобный белок 2
RTFV9368 (SLE-зависимое повышение 1}
cDNA FLJ75759, высокоаналогичный Нолю sapiens фоллистатин-подобному 3 (секретируемому гликопротеину) (FSTL3), мРНК
Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин-подобный домен-содержащий nogo-рецептор-взаимодействующий белок 1
Суперспиральный домен-содержащий белок 104
Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин-подобный домен-содержащий nogo-рецептор-
взаимодействующий белок
Ангиотензин-конвертирующий фермент 2
Kin IRRE-подобного белка 3
Трансмембранный 4 L6 член семейства 20
KCK1Q2
Адипонектин
Гематопоэтических клеток трансдюсер сигнала
Трансмембранный белок 107
ELCV592 9
Ангиопоэтин-родственный белок 4
Фоллитропина субъединица бета
Трансмембранный белок 143
KVVM3106
Аполипопротеин A-V
Белок f ингибирующий активность меланомы 3
Трансмембранный белок 178
ISPF6484
Аспорин
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 4
Трансмембранный белок 205
LKHP9428
Бактерицидный белок, повышающий проницаемость
Транспортер цинка 5
Трансмембранный белок 41А
VNFT9373
CUB домен-содержащий белок 1
Лейцин-богатый повторами
нейрональный белок 1
Трансмембранный белок 50А
АСАН3104
Хряще го промежуточного слоя белок 1
Апикальный
эндосомальный
гликопротеин
Трансмембранный белок 50В
RVLA1944
Бета-Ala-His дипептидаза
Сывороточный амилоидный белок А-4
Интерлейкин-28В
Wpep3002
Коллаген альфа-1(V) цепь
Пробетацеллюлин
Нейрональный пентраксин-
ZDHHC11
Коллаген альфа-1(XXV) цепь
Бета-1,4-
галактозилтрансфераза
Коллектрин
AGLW2560
Эстрадиол 17-бета-дегидрогеназа 11
гидроксибутиратдегидр огеназа типа 2
Трансмембранный белок 92
TSSP3028
DnaJ гомолога субсемейства С член 10
C1GALT1-специфический шаперон 1
Трансмембранный белок 95
RFVG5814
EGF-подобный домен-содержащий белок 6
Бета-казеин
Трансмембранный белок 9В
SHSS3124
Фактора свертывания крови XIII А цепь
Каппа-казеин
Вероятная
карбоксипептидаза РМ20 D1
ММР19
Глюкоза-6-фосфатизомераза
Трансмембранный белок C2orf18
Тетраспанин-12
GSQS6193
Аппетит-регулирующий гормон
Карбоксипептидаза N каталитическая цепь
Тетраспанин-13
VGPW2523
Интерлейкина-12 субъединица бета
CD320 антиген
Тетраспанин-15
LMNE6487
Интерлейкин-22
Хондроитинсульфатсинт аза 1
UPF0513 трансмембранный белок
ALLA24 87
Интелектин-1
Хондроитинсульфатсинт аза 2
Митохондриальный распаривающий белок 4
GALI1870
Лейцин-богатый глиома-деактивирующий белок 1
CMRF35-noflo6Hafl молекула 7
Полисераза-2
FRSS1829
Лимфоцитарный антиген 96
Белка canopy гомолог 3
Вероятная
пальмитоилтрансфераза ZDHHC24
MRSS6228
Матрилизин
Короткоцепочечная дегидрогеназа/редукта
за 3
Вителлинового слоя сперма-связывающий белок 1
GRPR5811
Муцин-20
Дельта-подобный белок 4
Вителлинового слоя сперма-связывающий белок
AVLL5809
Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 9
Delta и Notch-подобный фактора роста эпидермиса -родственный рецептор
Консервативная олигомерная субъединица комплекса Гольджи 7
CR1 СЗЬ/С4Ь рецептор SCR9 (или 16) С-терм. экзон SCR = короткий консенсусный повтор
Распознавания пептидогликана белок
Долихолкиназа
Адипонектина рецептора белок 2
PIKR2786
Интерферон-
индуцированный белок 17 кДа
Эндотелин-конвертирующий фермент-подобный 1
Ингибина бета С цепь
S100 кальцийсвязывающий белок А7-подобный 3
Белок Wnt-4
Интегральный мембранный белок 2В
Брорин
GTWW5826 (LP5085 белок)
Аллографта
воспалительный фактор 1-подобный
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок 5
Семафорин-ЗС
KTIS8219 (HCG2020043)
Armadillo повтор-содержащий Х-связанный белок 3
Эндотелиальных клеток-селективная адгезивная молекула
Гепарансульфатглюкозамин З-О-сульфотрансфераза 2
Гиалуронана и протеогликана сшивки белок 4
Хондроитинсульфат N-ацетилгалактозаминилтран сфераза 1
Сигнальный пептид, CUB и EGF-лодобный домен-содержащий белок 1
Рецептора лептина перекрывающийся транскрипт-подобный 1
Micronovel
Хитотриозидаза-1
Комплемента фактора Н-родственный белок 3
SPARC-подобный белок 1
SAMK3000
Claudin домен-содержащий белок 1
Прорелаксин HI
Фибулин-7
VFLL3057
Эрлин-2
Фоллистатин-родственный белок 1
Белка HEG гомолог 1
CVWG5837
Гликозилтрансферазы 8 домен-содержащий белок 1
Глобозид альфа-1,3-N-ацетилгалактозаминилт рансфераза 1
Фибриноген С домен-содержащий
белок 1
VGSA5840
Гольджи мембранный белок 1
Гамма-
глутамилгидролаза
Фосфолипаза А1 член А
GHPS3125
Вероятный G-белок сцепленный рецептор 125
Кадгерин-2 4
Основной слюнный пролин-богатый белок 2
GRTR3113
Интерлейкина-20 рецептора альфа-цепь
Глицерин-3-фосфатацилтрансфераза
Сперматогенез-ассоциированный белок 6
РАМР6501
Галектин-7
G-белок сцепленный рецептор 56
Sushi повтор-содержащий белок SRPX2
LTLL9335
NKG2D лиганд 4
Гиалуронан-связывающий белок 2
Белка скручивания при гаструляции гомолог 1
VCEW9374
L-аминокислот оксидаза
Прогепарин-связывающий ЭГФ-подобный фактор роста
Торсин-1В
АНРА9419
Пролил 3-гидрокилаза 1
Гистидин-богатый гликопротеин
Белок Wnt-5a
MDHV1887
GPI этаноламин фосфаттрансфераза 2
Карбогидратсульфотран сфераза 14
Акрозин-связывающий белок
HSAL5836
GPI этаноламин фосфаттрансфераза 3
Интерлейкина-20 рецептора бета цепь
С-типа лектинового домена семейства 18 член
LHLC1946
Кальций-связывающий митохондриальный белок-носитель SCaMC-2 (Малый кальций-связывающий митохондриальный белок-носитель 2)
Эктонуклеотидной пирофосфатазы/фосфоди эстеразы член семейства 3
Лизосомно-ассоциированный трансмембранный белок 4А
Белок, связанный с карциномой эпителия длинного неба, легкого и носа 3 (лиганд-связывающий белок RYA3)
Легочный сурфактант-ассоциированный белок А2
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок 7
Семафорин-ЗЕ
LPPA601
Фактор расщепления, аргинин/серин-богатый 16
Каллистатин
Амелобластин
PINK1
Альфа-N-
ацетилгалактозаминид альфа-2,6-сиалилтрансфераза 6
Фибронектина типа III домен-содержащий белок ЗВ
Домен-содержащий белок 5 суперсемейства основного фасилитатора
SERH2790
Одиночный Ig IL-1-связанный рецептор
Лейкемии
ингибирующего фактора рецептор
Ангиопоэтин-1
FLFF9364
Тектоник-3
Lin-7 гомолог В
Ангиопоэтин-4
АПЕЛИН
Член 11 суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей
Тиоредоксин-родственкый трансмембранный белок
Множественные домены, подобные фактору роста эпидермиса 9
GLSH6409
Член 19 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 32
Кислой сфингомиелиназы-подобная фосфодиэстераза За
SFVP2550
Пальмитоилтрансфераза ZDHHC9
Ly6/PLAUR домен-содержащий белок 3
ADAMTS-подобный белок 5
RRLF9220
Фибулин-5
С-типа лектинового домена семейства 14 член А
Спексин
PTML58 3 8
Белок Z-зависимой протеазы ингибитор
Белка cornichon гомолог
Мнимый трипсин-6
VLGN194 5
Альфа-2-макроглобулин
Белок FAM151A
Прото-онкогенный белок Wnt-1
AVPC1948
Agouti-родственный белок
FK506-связывающий белок 14
Костный морфогенный белок ЗЬ
AWQG2 4 91
Панкреатическая альфа-амилаза
Нейропилин и толлоид-подобный белок 2
Костный морфогенный белок 5
PSVL6168
Натрийуретические пептиды В
Протокадгерин бета-13
Костный морфогенный белок 8В
LCII3035
Предсердный
натрийуретический фактор
Пренилцистеиноксидаза 1
Белок FAM2 6D
PPRR6495
Нейтральная церамидаза
Пефлин
Clq-связанный фактор
RLSC6348
Бета-2-микроглобулин
Пептидил-пролил цис-транс изомераза-подобный 1
WAP четырехдисульфидный ядерный доменный белок 1
CSRP2BP
Костный морфогенный белок 4
Стволовых клеток простаты антиген
Церебеллин-1
GLLV3061
Биотинидаза
Белок лоскутный гомолог 2
Карбоксипептидаза 0
GWSI6489
Рецептора Scavenger цистеин-богатый типа 1 белок М130
Хитобиосилдифосфодоли хол бета-
маннозилтрансфераза
Миелиновый белок нуль-подобный белок 2 (Эпителиальный V-подобный антиген 1)
кДНК FLJ539 55, высоко аналогичная Секретируемому связанному с ожогом белку 4
Карбоксипептидаза В2
Белка sel-1 гомолог 1
Сериновая протеаза 1-подобный белок 1
PPIF
Карбоксипептидаза Z
ProSAAS
Суперспиральный домен-содержащий белок 7 0
VSSW1971
С-С мотив хемокина 5
Сиаловая кислота-связывающий Ig-подобный лектин 9
С-С мотив хемокина 28
KLIA6249
С-С мотив хемокина 7
SLIT и NTRK-подобный белок 1
Неохарактеризованный белок C4orf29
ALLW1950
С-С мотив хемокина 8
Статерин
CUB домен-содержащий
белок 2
GVEI466
CD59 гликопротеин
Тестизин
Тгem-подобный транскриптный белок 4
ESFI5812
Фактор комплемента I
Трансмембранный канал-подобный белок
Неохарактеризованный белок C6orf58
GNNC2999
Кластерин
Транмембранная протеаза, сериновая 4
Хондроадгерин
AAGG6488
Коллаген альфа-2(I) цепь
Метастазов-суппрессор KiSS-1
Хрящего промежуточного слоя белок 2
HHSL7 51
Коллаген альфа-1(III) цепь
Островковый амилоидный полипептид
Неохарактеризованный белок C10orf25
Бета-дефенсин 108В
Коллаген альфа-1 (IV) цепь
Тгem-подобный транскриптный белок 2
Истмин-1
Бета-дефенсин 118
Коллаген альфа-3(IV) цепь
Тиоредоксин домен-содержащий белок 12
Цистатин-8
Бета-дефенсин 124
Коллаген альфа-5(IV) цепь
¦ Фактор роста сосудистого эндотелия
Кардиотропин-1 (СТ-1)
Бета-дефенсин 125
Коллаген альфа-3(VI) цепь
Фактора роста сосудистого эндотелия
Химотрипсиноген В
Бета-дефенсин 126
Компонент комплемента С6
Ретикулокальбин-3
С-Х-С мотив хемокина 9
Дезоксирибонуклеаза-1-подобный 2
Коллаген альфа-1(IX) цепь
Фибриллин-1
С-Х-С мотив хемокина 13
Станниокальцин-2
Коллаген альфа-1(X) цепь
Белок FAM3A
EMILIN-3
Эндотелиальная клеточно-специфическая молекула 1
Коллаген альфа-1(XVII) цепь
Белок G7c
Секретагогин
Карбоксилэстераза 7
Коллаген альфа-1(XXI) цепь
Нейропилин и толлоид-подобный белок 1
Эпидидимальный секреторный белок ЕЗ-альфа
Белка NOV гомолог
Коатомер субъединица альфа
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 11
Эпификан
UPF0528 белок FAM172A
Комплемента рецептор типа 1
Серпин В4
Белок FAM5C
Интерлейкина-27 субъединица бета
Цистатин-SN
ADAM DEC1
Фактор роста фибробластов 20
Белок FAM3C
Дезоксирибонуклеаза-1
АДФ-зависимая глюкокиназа
Фибробластов роста-связывающий белок 3
Стромальных клеток фактор 2-подобный белок
Внеклеточный матричный белок 1
Альфа-амилаза 2В
Трансмембранный белок 204
Бутирофилина подсемейства 1 член А1
Низкоаффиный
иммуноглобулиновый гамма
Г ~
UDP-GlcNAc:6eTaGal бета-1,3-N-ацетилглюкозаминилтра нсфераза 3
Фосфатидилэтаноламин-связывающий белок 4
Кератиноцит-ассоциированный трансмембранный белок 2
Альфа-фетопротеин
Кальцитонин ген-связанный пептид 2
Фактор коагуляции V
Иммуноглобулина альфа Fc-рецептор
Гепарин-связывающий фактор роста 2
Карбоксипептидаза Е
Фактор коагуляции VII
EMILIN-2
Фибриноген гамма цепь
Кардиотрофин-подобный цитокиновый фактор 1
Рго-МСН
Эфрина типа-А рецептор 10
Фактор
роста/дифференциации 5
Коллаген альфа-2(VIII) цепь
Фолатный рецептор гамма
Экзостозин-подобный 2
Глиальной клеточной линии-производный нейротрофический фактор
Crumbs гомолог 2
Муцин-7
Фоллистатин-родственный белок 4
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок 3
Дентинового матрикса кислотный фосфопротеин 1
Галанин-подобный пептид
Фоллистатин-родственный белок 5
Инсулин-подобный фактор роста IA
Синдрома Дауна клеток адгезивная молекула
Гемицентин-1
Трансмембранный белок 66
Ig гамма-1 цепи С регион
Член 1 суперсемейства иммуноглобулинов
Интерлейкин-б
Фактор
роста/дифференциации 2
Ig гамма-2 цепи С регион
Интерлейкин-4
Эмбриональный фактор роста/дифференциации 1
GDNF семейства рецептор альфа-4
Ig гамма-3 цепи С регион
Интерлейкина-б рецептора субъединица альфа
Интерлейкин-8
Ig гамма-4 цепи С регион
Инсулин-подобный 3
Интерлейкин-24
Гремлин-2
Лимфоцитарный антиген 8 6
Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь
Ладинин-1
Стромелизин-2
Ингибина бета Е цепь
UPF0378 белок KIAA0100
Липазы член I
Вероятный G-белок сцепленный рецептор 171
GRAM домен-содержащий белок 1С
Кининоген-1
Панкреатический липаза-связанный белок 1
Паппализин-2
Интерферон альфа-10
Ламинина субъединица альфа-2
Лейцин-богатый альфа-2-гликопротеин
Микрофибриллярно-связанный гликопротеин 4
Интерферон альфа-16
Ламинина субъединица альфа-4
Матрикса-ремоделирования-связанный белок 5
Нейромедин-В
Интерферон альфа-6
Ламинина субъединица бета-1
Нетрин-4
Мимекан
Член 21 суперсемейства иммуноглобулинов
Протеин-лизин б-оксидаза
Рецептор фактора роста гепатоцитов
Металлопротеиназа матрикса-19
Агрин
Муль тимерин-1
С-С мотив хемокина 22
Интерлейкин-11
Пролактин
Вазолрессин-нейрофизин 2-колептин
Никталопии
Интерлейкин-17А
Kelch-подобный белок 11
Нидоген-1
Остеокальцин
Интерлейкин-18
Белок Wnt-16
Фосфолипаза А2
Основной слюнный пролин-Оогатый белок 3
Интерлейкин-26
Пропердин
Перфорин-1
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 10
Интерлейкин-28А
Калликреин-13
Фосфатидилинозитол-гликан-специфическая фосфолипаза D
Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный белок FLRT2
Трансмембранный етр24 домек-содержащий белок 3
1-ацил-зп-глицерин-З-фосфат ацилтрансфераза дельта
Фиброцистин
R-Спондин-З
Ин те рл ей кин -2 9
Калликреин-9
Фосфолипидов
транспортировочный белок
Сиалоадгезин
Инсулин-подобный пептид INSL6
Витамин К-зависимый белок S
Кислая фосфатаза простаты
Трипсин-3
Белок Wnt-2b
Бутирофилин-лодобный белок 8
Ви т амин К-за в и с имый белок Z
Дипептидаза 2
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 1
Ламинина субъединица бета-4
Слюнный кислотный пролин-богатый фосфопротеин 1/2
Коллаген и кальций-связывающий ЭГФ домен-содержащий белок 1
Спермы акросомы мембрана-ассоциированный белок 4
Лимфатических сосудов зндотелиальный рецептор гиалуроновой кислоты 1
Белок зоны беременности
Зародышевых клеток-специфический ген 1-подобный белок
Ламинина субъединица гамма-3
Цистатин-SA
Прорелаксин Н2
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 31
Лизилоксидазы гомолог 3
Трансмембранный белок 59
Семафорин-40
Аполипопротеин 0
Нейротензин/нейромедин N
Аполипопротеин(а)-подобный белок 2
Slit гомологичный 2 белок
Дистрогликан
МАМ домен-содержащий белок 2
Лизоцим-подобный белок 2
Альфа-текторин
Нейтрофильный дефенсин 4
Микрофибриллярно-связанный белок 2
Лизоцим-подобный белок 4
Тенасцин-Х
Амфотерин-
индуцированный белок 3
Белок, ингибирующий активность меланомы 2
Рилин
Клеверный фактор 3
Гамма-секретазы субъединица АРН-1В
Металлопротеиназа матрикса-24
Ретинол-связывающий белок 4
Трансферрина рецептора белок 1
Аполипопротеин C-IV
Металлопротеиназа матрикса-25
Карбоновая ангидраза 14
Протрансформирующий фактор роста альфа
Арилсульфатаза G
Нетрин-1
Тубулоинтерстициального нефрита антиген
Трансформирующий фактор роста бета-2
Глия-активирующий фактор
Нетрин-3
Нейропептид W
Член 6 суперсемейства лиганда фактора некроза опухолей
Рекрутинга каспазы домен-содержащий белок 18
Альфа-N-
ацетилгалактозаминид альфа-2,6-сиалилтрансфераза 1
Альфа-1,3-маннозил-гликопротеин 4-бета-Ы-ацетилглюкозаминилтрансф
ераза В
Член 1В суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Гепарансульфатглкжоза мин 3-0-
сульфотрансфераза ЗА1
Альфа-N-
ацетилгалактозаминид альфа-2,6-сиалилтрансфераза 3
Трансмембранный етр24 домен-содержащий белок 5
Член 5 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Тиротропин-рилизинг гормона-деградирующий эктоэнзим
Меланома-происходящий белок регуляции роста
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 3
Тромбопоэтин
Гуанилин
БМИГамид-родственные пептиды
Подокан-подобный белок 1
VIP пептиды
Холина транспортера-подобный белок 3
Отоконин-90
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 5
Кислая хитиназа млекопитающих
17-бета-гидроксистероид дегидрогеназа 14
Нейртурин
Кератокан
Цистеин-богатый секреторный белок 2
Иммуноглобулин лямбда-подобный полипептид 1
Нейрексофилин-1
Группы НЕ секреторная фосфолипаза А2
Гаптоглобин-родственный белок
DnaJ гомолога подсемейства В член 14
Нейрексофилин-2
Фактор определения лево-право 2
С-С мотив хемокина 2 б
F-box only белок 8
Вариантный фактор тромбоцитов 4
NKG2D лиганд 2
Коллектин-11
Фибролейкин
Ноцицептин
Макрофаговая металлоэластаза
Цистеин-богатый с EGF-подобным доменом белок 2
Метионин-R-
сульфоксидредуктаза ВЗ, митохондриальная
V-набора и
трансмембранный домен-содержащий белок 1
Триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках 1
С-Х-С мотив хемокина 16
Лейцин-богатый повторяющийся LGI семейства член 2
Пролин-богатый белок 4
Цитокинового рецептора-подобный фактор 1
Фибробластов фактор
Транспорта пузырьков белок GOT1B
Пролактин-рилизинг пептид
Секретин
Член 5 семейства Интерлейкина-1
Интегральный мембранный белок GPR177
Сериновая протеаза 33
Стромальных клеток фактор 2
Член 9 семейства Интерлейкина-1
Вероятный G-белок сцепленный рецептор 78
Беременность-специфический бета-1-гликопротемн 8
Лизоцим-подобный белок б
Калликреин-5
НЕРАСАМ член семейства 2
Ретбиндин
Серпин А9
Матрилин-2
Интерлейкина-2 7 рецептора субъединица альфа
FMRFaM^i-poflCTBeHHbie пептиды
Склеростин домен-содержащий белок 1
Клеточного поверхностного гликопротеина CD200 рецептор 1
Прознкефалин -А
Рибонуклеаза Кб
Лизокардиолипин ацилтрансфераза 1
Лизофосфатидной кислоты фосфатаза типа 6
Интегрин альфа-10
Рибонуклеаза Т2
Глутамат
карбоксипептидаза плазмы
Фактор обмена нуклеотидов SIL1
KTEL мотив-содержащий белок 1
Репетин
Slit гомологичный 3 белок
Тромбоспондина типа-1 домен-содержащий белок 4
Лейкоцитарного иммуноглобулин-подобного рецептора подсемейства А член 5
Комплемента С1г субкомпонент-подобный белок
СЗ и PZP-подобный альфа-2-макроглобулин домен-содержащий белок В
WNTl-индуцируемого-сигнального пути белок 2
Лейцин-богатый повторами и фибронектина типа III домен-содержащий белок 3
Неохарактеризованная
гликозилтрансфераза
AERG1
Ретиноевой кислоты рецептора респондерный белок 2
Бромодомен-содержащий белок 9
Утероглобин
Семафорин-ЗС
Хрящевой кислотный белок 1
CD99 антиген-подобный белок 2
Нетрин-Gl лиганд
Секретоглобина семейства 1С член 1
Станниокальцин-1
Неохарактеризованный белок Clorfl59
Паннексин-1
Секретоглобина семейства 1D член 1
Бета-текторин
Карбогидратсульфотрансфе раза 12
Протокадгерин-12
Секретоглобина семейства 1D член 2
Пост-GPI присоединения к белкам фактор 3
Вероятная сериновая карбоксипептидаза CPVL
Протокадгерин альфа-10
Серпин А12
Зародышевых клеток-специфический ген 1 белок
Муцин-ЗА
Протокадгерин бета-10
Серпин 12
Интерлейкина-21 рецептор
CUB и вителлиновая зона-подобный домен-содержащий белок 1
Остеопетроз-ассоциированный трансмембранный белок 1
фон Виллебранда фактора С и EGF домен-содержащий
белок
V-набор и
иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 4
Полипептид N-ацетилгалактозаминилтран сфераза 14
Бета-галактозид альфа-2,6-сиалилтрансфераза 1
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина
Рецептора Scavenger цистеин-богатый домен-содержащий группы В белок
Галектин-9
GPI трансамидазы компонент PIG-S
Натриевого канала субъединица бета-2
Протиролиберин
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 17
Пролин-богатый трансмембранный белок 3
Ингибитор
металлопротеиназы 4
Семафорин-4А
Лейцин-богатый повторами нейрональный белок 2
Сульфгидрилоксидаза 2
Т-клеток
иммуномодуляторный белок
Бифункциональная гепарансульфат N-деацетилаза/М-
сульфотрансфераза 3
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами
тромбоспондина 16
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина
Член 27 сулерсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Туфтелин
SH2 домен-содержащий белок ЗА
Тимусный стромальный лимфопоэтин
Toll-подобный рецептор 7
Мозговой
митохондриальный белок-носитель
SНС-транеформирующий белок 4
Трансмембранный белок 130
Сигнальный пептид, CUB и EGF-подобный домен-содержащий белок 3
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 23
Уникальный хрящевой матрикс-ассоциированный белок
Тиоредоксин домен-содержащий белок 16
14-3-3 белок сигма
Трансдуцин бета-подобный белок 2
Урокортин-2
Альфа-2-антиплазмин
Альфа-1-кислый гликопротеин 1
Tudor домен-содержащий белок 10
Урокортин-3(
WAP четырехдисульфидный ядерный доменный белок 3
Альфа-1-кислый гликопротеин 2
Трансмембранный 9 член суперсемейства 3
Белок АМВР
Белок WFDC9
фон Виллебранда фактора
Фон Виллебранда фактора D и EGF домен-содержащий белок
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 9-подобный
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 14
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 9
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами
тромбоспондина 17
Фактор ингибирования и дифференциации-родственный белок 8 8
Адипоцитов
плазматическая мембрана-ассоциированный белок
Ангиотензиноген
Трансмембранный канал-подобный белок
Белок Wnt-10a
Пероксидазина гомолог
Аполипопротеин A-II (Аро-AII) (АроА-Н)
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 3
Белок Wnt-Зэ
Прогрессирующего анкилоза белка гомолог
Аполипопротеин A-IV (Apo-AIV) (ApoA-IV)
Теномодулин
Прото-онкогенный белок Wnt-3
Хитиназа-З-подобный белок 1
Аполипопротеин С-II (Аро-СН) (АроС-П)
Тетраспанин-б
Белок Wnt-б
UPF0672 белок CXorf36
Бета-2-гликопротеин 1
Тиоредоксин домен-содержащий белок 5
Белок Wnt-9a
Арилсульфатаза J
Апоптоз-родственный белок 3
Фактора роста сосудистого эндотелия
Цитокин SCM-1 бета
Кортистатин
Бета-секретаза 2
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 9
Зимогеновый гранулярной мембраны белок 16
Церулоплазмин
Трансферазз
гистосовместимости АВО системы крови
Семафорин-ЗР
Вителлинового слоя-связывающий белок 1
Ангиопоэтин-родственный белок 5
Катепсин L2
Кислая фосфатаза-подобный белок 2
Антериорного градиентного белка 3 гомолог
Суперспиральный домен-содержащий белок 126
С-С мотив хемокина 3
Аполипопротеин 0-подобный
Амелотин
CD177 антиген
С-типа лектинового домена семейства 1 член
Бета-дефенсин 119
Неохарактеризованный белок C5orf46
Белка canopy гомолог 4
Кальций-активированный хлоридного канала регулятор 1
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами
тромбоспондина 12
Неохарактеризованная aarF домен-содержащая протеинкиназа 1
Фибронектина типа-Ш домен-содержащий белок С4ог?~31
Химаза
Белок FAM131A
Драксин
Белок FAM180A
Коллаген альфа-1(VI) цепь
Белок FAM3B
Фактор роста фибробластов 18
Тромбоцитов основный белок
Компонент комплемента С8 альфа-цепь
Бета-галактозидаза-1-подобный белок
С-Х-С мотив хемокина 11
Интерферон эпсилон
Компонент комплемента С9
Лизоцим д-додобный белок 1
Ъуб/PLAUR домен-содержащий белок 6
Интелектин-2
Глюкозы-фруктозы оксидоредуктазы домен-содержащий белок 2
Интер-альфа-трипсин ингибитора тяжелая цепь Н5-подобного белка
Химотрипсин-подобной эластазы семейства член
Альфа-1,3-маннозил-гликопротеин 4-бета-11-ацетилглюкозаминилтрансф
ераза А
DnaJ гомолога подсемейства В член 11
Акросомы
сперматозоидной-
ассоциированный белок
Рецептор эритропоэтина
Фосфогликопротеин внеклеточного матрикса
Эктонуклеотидных пирофосфатазы/фосфодиэст еразы семейства член 7
Лейцин-богатый повторами и иммуноглобулин-подобный домен-содержащий nogo-рецептор-взаимодействующий белок 2
МАМ домен-содержащий гликозилфосфатидилинозит ол-якорный белок 2
кДНК FLJ778G3, высоко аналогичная секретируемому и трансмембранному 1 (SECTM1) белку Homo sapiens мРНК
Аминопептидаза эндоплазматической сети
Сурфактант-ассоциированный белок
Металлопротеиназа матрикса-27
Эпидидимально-специфический липокалин-
Рецепторная тирозин-белок киназа erbB-3
Адипонектина
рецептора белок 1
Неактивная сериновая протеаза 35
Афамин
Резидентный белок эндоплазматической сети ERp4 4
Множественные домены, подобные фактору роста эпидермиса 6
Суперспиральный домен-содержащий белок 134
Вероятная катион-транспортирующая АТФаза 13А5
IgGFc-связывающий белок
Нейроэндокринный белок 7В2
Супрабазин
Глутатионпероксидаза 3
Комплемента фактора неродственный белок 1
Альфа-1В-гликопротеин
Секретоглобина семейства 1D член 4
Клаудин-18
Полипептид N-ацетилгалактозаминилтран
сфераза 2
WAP, kazal, иммуноглобулин, kunitz и NTR домен-содержащий белок 2
V-набора и
трансмембранный домен-содержащий белок 2А
Мнимый клеток-киллеров иммуноглобулин-подобный рецептор подобный белок KIR3DP1
Гемопексин
Арилацетамид
A DM
Секреторной фосфолипазы А2 рецептор
Активатор фактора роста гепатоцитов
Гистатин-3
Неохарактеризованный белок C2orf82
Гаптотлобин
Главного комплекса гистосовмести класса неродственный генный белок
Про-нейрегулин-3,
мембрана-связанная
изоформа
Инсулинового фактора роста-подобный семейства член 1
Карциноэмбрионогенная антиген-родственная молекула клеточной адгезии 20
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок 6
Agouti-
сигнализирующий белок
Кадгерин-подобный белок 29
Костный морфогенный белок 3
Ig дельта цепи С регион
Клаудин-8
Костный морфогенный белок 15
Костномозговой стромальный антиген 2
Интерлейкин-1 бета
UPF0454 белок Cl2orf49
Плазменной сериновой протеазы ингибитор
Цитохром Р4 50 20А1
Низкой плотности липопротеинов рецептор-родственный белок 10
фон Виллебранда фактора А домен-содержащий белок 5В1
Карциноэмбриногенная антиген-родственная молекула клеточной адгезии 21
Бактерицидный/проницаемо сть-повышающий белок-подобный 3
Соединительная адгезивная молекула С
Кадгерин-6
Альфа-лактальбумин
Белка dpy-19 гомолог 2
Неохарактеризованный белок KIAA0319
Кателицидин антимикробный пептид
Сестринский белок когезии хроматид DCC1
Группы IIF секреторная фосфолипаза А2
Ламинина субъединица альфа-5
Ламинина субъединица гамма-1
Галектин-3-связывающий белок
Карбоксипептидаза В
Фибронектина типа III домен-содержащий белок 4
Дегидрогеназы/редукта зы SDR чден семейства 7В
Динеина тяжелой цепи домен-содержащий белок 1
Гликозилтрансферазы 8
домен-содержащий белок 2
Липопротеин липаза
С-С мотив хемокина 16
С-С мотив хемокина 17
Белок FAM19A1
Интерстициальная коллагеназа
С-С мотив хемокина 24
Жирнокислая аЦил-КоА редуктаза 1
GDN F семейства рецептор альфа-подобный
Металлопротеиназа матрикса~9
HEAT повтор-содержащий белок C7orf27
Fin bad гомолог фактора инициации
Вероятная
глутатионпероксидаза 8
Муцин-16
Коллаген альфа-2(IX) цепь
Полимерный
иммуноглобулиновый
рецептор
Цистатин-D
Муцин-2
Коллаген альфа-3(IX) цепь
Прион-подобный белок doppel
Цистатин-F
Муцин-5В
Колипаза
С-Х-С мотив хемокина 6
Тромбоцит-активирующий фактор ацетилгидролаза
Миоцилин
Коллаген альфа-1(XXVII) цепь
С-Х-С мотив хемокина 10
Паппализин-1
Рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1
Карбоксипептидазы N субъединица 2
Бета-дефенсин 1
Носителей растворенных веществ семейства 22 член 12
Избыточно
экспрессируемого гена 1 белок опухоли простаты
Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный нейрональный белок 4
Гиалуронана и протеогликана сшивки белок 2
Хорионический соматомаммотропиновый гормон-подобный 1
Рецептор-взаимодействующая сериново/треониновая-протеинкиназа 2
Коллагена тройной спирали повтор-содержащий белок 1
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 30
Динамики микротубул регуляторный белок 3
Эквилибративный транспортер нуклеозидов
Эндотелин-2
Суппрессор слитого гомолога
ретинолдегидрогеназа 14
Селенопротеин Р
Фибромодулин
Фолатный рецептор бета
Галанин
Легочный сурфактант-ассоциированньгй бедок D
Fc-рецептор-подобный
Внеклеточная сульфатаза Sulf-2
Транскобаламин-2
Стимулируемого ретиноевой кислотой гена 6 белка гомолог
Цинк-пальцевый RAD18 домен-содержащий белок Clorfl24
Член 14 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
Катехол-О-
метилтрансферазы домен-содержащий белок 1
Клеверный фактор 1
Фактор
роста/дифференциации 15
Артемин
Трипептидилпептидаза 1
Ингибитор пути тканевого фактора 2
Глия-производный нексин
Коллаген альфа-1(XII) цепь
Trem-подобный транскриптный белок 1
Протромбин
Прогонадолиберин-1
Коллаген альфа-1(XIV) цепь
Гуанилатциклазы активатор 2В
Toll-подобный рецептор 9
Гранзим К
Бета-дефенсин 2
Индуцируемый Т-клеточный ко-стимулятор
Межклеточных клеток адгезивная молекула 4
Интерферон альфа-17
Интерлейкин-21
Интерлейкин-19
Интерферон альфа-21
Интерлейкин-3
Истмин-2
Интерферон альфа-8
Интерлейкин-7
Notch гомолог 2 N-
терминально-подобного
белка
Kin IRRE-подобного белка
Интерферон омега-1
Ингибина альфа цепь
Ламинина субъединица
бета-2
Калликреин-10
Ранний плацентарный
инсулин-подобный
пептид
Ламинина субъединица альфа-3
Нейропилин-2
Латентный
трансформирующий фактор роста бе^а-связывающий белок 4
EGF, латрофилин и семь трансмембранных доменов-содержащий белок 1
Дегидрогеназы/редуктазы SDR член семейства на хромосоме X
ЭГФ-содержащий фибулин-лодобный белок внеклеточного матрикса 1
Спаренный
иммуноглобулин-подобного типа 2 рецептор альфа
Фибронектин типа 3 и анкирина
повторяющиеся домены белок 1
FXYD домен-содержащий регулятор
транспортировки ионов 6
Рецепторного типа тирозин-протеин фосфатаза каппа
Регенерирующих
островков-происходящий
белок 3 альфа
Лизилоксидазы гомолог
Инкорпоратор серина 2
Регенерирующих островков-происходящий белок 4
ЕЗ убиквитин-протеинлигаза RNF5
Люмикан
Стромелизин-3
Тахикинин-4
Протахикинин-1
Адролин
Секретируемый фосфопротеин 1
Металлопротеиназа матрикса-23
Секретируемый связанный с ожогом белок 1, изоформа CRA а
Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный белок FLRT1
Сериновая бета-лактамаза-подобный белок LACTB, митохондриаль ный
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родственный белок 5
Плазминоген-родственный белок В
Нуклеобиндин-2
Галектин-3
Оптицин
Вероятная
пальмитоилтрансфераза ZDRHC16
Фосфолипаза А2
Панкреатический прогормон
Пре-малый/секретируемый гликопротеин
Ангиопоэтин-родственный белок 1
Проэнкефалин -В
Беременность-специфический бета-1-гликопротеин 6
Пентраксин-родственньгй белок РТХЗ
UPF0510 белок C19orf63
Распознавания пептидогликана белок Т-бета
Di ckkopf-родственный белок 3
Карбоксилэстераза 8
Рецептора Scavenger цистеин-богатый типа 1 белок Ml 60
Иммуноглобулина суперсемейства содержащий лейцин-богатый повторами белок 2
Дегидрогеказы/редуктазы SDR член семейства 11
Тиоредоксин-родственный трансмембранный белок 4
ER деградации-усиления альфа-маннозидаза-подобный 2
V-набор и
иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 2
Регенерирующих островков-происходящий белок 3 гамма
Домен-содержащий белок 2 суперсемейства основного фасилитатора
Бета-галактозидаза-1-подобный белок 2
Пептид YY
RING пальцевый белок 4 3
Калликреин-12
Интерлейкина-П рецептор Е
Ретинол-связывающий белок 3
Семеногелин-2
Brevican ядерный белок
Интерлейкин-20
Атерин
Муцин-15
Поримин
Интерлейкин-2 5
Белка транслокации SEC63 гомолог
Костный сиалопротеин 2
Торсин-1А
PDZ домен-содержащий белок 11
Трансформирующий фактор роста бета-3
Лимфотактин
С-С мотив хемокина 2 3
Релаксин-3
Белок Wnt-10b
Рост-регулируемый белок альфа
Тестикан-3
Ретиноид-индуцируемая
сериновая
карбоксипептидаза
Реналаза
R-Спондин-2
Основной слюнный пролин-богатый белок 4
Белок, связанный с карциномой эпителия короткого неба, легкого и носа 2
Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа А
Трансмембранный и суперспиральный домен-содержащий белок 3
Член 18 суперсемейства рецептора фактора некроза опухолей
WAP четырехдисульфидный ядерный доменный белок 5
Карбоксипептидаза А4
VEGF ко-регулируемый хемокин 1
Братский белок CDO
Тромобоцитарный фактор роста С
Ольфактомедин-4
ADM2
Бета-1,4-
галактозилтрансфераза 4
Дизинтегрина и металлопротеиназы домен-содержащий белок 33
Инсулин-подобного фактора роста-связывающий белок комплексная кислая лабильная цепь
Гидроксистероид 11-бета-дегидрогеназа 1-подобный белок
Дегидрогеназы/редуктазы SDR член семейства 9
BSD домен-содержащий белок 1
Амелогенин, Y изоформа
Дельта-подобный белок 1
Элпин
Клеток адгезивная молекула 3
Арилсульфатаза F
Эфрин~А1
Отоанкорин
CDC 45-родственный белок
Хориогонадотропина субъединицы бета вариант 2
Фактора роста фибробластов рецептор-подобный 1
Тенасцин-R
Хондролектин
Бета-дефенсин 104
GDNF семейства рецептор альфа-3
Фактор роста
Диацилглицерин 0-ацилтрансфераза 2
Бета-дефенсин 105
Рецептор тромбоцитов Gi24
Белок TSPEAR
3-кето-стероидредуктаза
Бета-дефенсин 107
Прогонадолиберин-2
Гефестин
Интерлейкина-17 рецептор С
Белок WFDC11
Калликреин-7
Бутирофиллин-подобный белок 3
Интерлейкина-17 рецептор D
НАР
четырехдисульфидный ядерный доменный белок 6
Аполипопротеин F
Бутирофиллин-подобный белок 9
Интегратора комплексная субъединица 1
Эпиген
Белок CASC4
Ламинина субъединица гамма-2
Соединительная адгезивная молекула-подобная
Белок FAM19A5
УТРЗб-подобный протеин
Белок LMBR1L
ЕЗ убиквитин-белок лигаза LNX
Клаудин-6
Магния транспортерный белок 1
Муцин-21
Лейцин-богатый повторяющийся трансмембранный нейрональный белок 3
Карциноэмбриногенная антиген-родственная молекула клеточной адгезии 19
Амилорид-чувствительная
аминооксидаза
[медь-содержащая)
Эдоплазматической сети маннозил-олигосахарид 1,2-альфа-маннозидаза
Meтионинаденозилтрансфер азы 2 субъединица бета
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина 1
ДНК повреждение-регулируемый аутофагии модуляторный белок 2
Панкреатической секреторной гранулярной мембраны главный гликопротеин GP2
Подокаликсин-подобный белок 2
Белок COQ10, митохондриальный
Трансмембранный белок C17orf87
Семафорин-4В
Проминин-2
Неохарактеризованный белок C19orf41
Комплемента фактора Н-родственный белок 5
Семафорин-SB
Плексин домен-содержащий белок 2
Неохарактеризованный белок C21orf36
ЕК50б-связывающий белок
Эпсилон-саркогликак
Roundabout гомолог 4
Белка delta гомолог 2
Инкорпоратор серина 1
Гуанилат-связывающий
белок 5
Лактоэилцерамид альфа-2, 3-сиалилтрансфераза
Кокаин- и амфетамин-регулируемый транскриптный белок
Трансмембранный и убиквитин-подобный домен-содержащий белок 1
Эктонуклеозид трифосфат дифосфогидролаза б
SID1 трансмембранный член семейства 2
Липомы HMGIC слитый партнер-подобный 1 белок
Белок ERGIC-53-подобный
Серпин БЗ
Sushi домен-содержащий белок 1
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 18
Toll-подобный рецептор 10
Белка RMD5 гомолог В
Сериновая/треониновая-киназа ТА02
Лейцин-богатый повтор-содержащий
белок 2 5
Toll-гюдобный рецептор 8
Scavenger рецептора класса А член 5
Трансмембранная протеаза, сериновая 2
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок ЗВ
Селенопротеин Т
Семафорин-бВ
УДФ-глюкуроновой кислоты декарОоксилаза 1
Лейцин-богатый повтор-содержащий белок 3
Сиаловая кислота-связывающий Ig-подобный лектин 11
Трансмембранный белок 108
Неохарактеризованный белок C10orf58
LyG/PLAUR доменсодержащий белок 4
Сортирующий нексин-2 4
Sushi домен-содержащий белок 3
Тиоредоксин-родственный трансмембранный белок 2
Витамин К эпоксидредуктазы комплексная субъединица 1
Комплемента Clq фактор некроза опухолей-родетвенный белок 1
Латентный
трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок 2
CMP-N-ацетилнейраминат-бета-галактозамид-альфа-2,3-сиалилтрансфераза
Дизинтегрин и металлопротеиназа с мотивами
тромбоспондина 20
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ6494/PR021346
Мнимый
неохарактеризованный белок UNQ6190/PRO20217
Мнимый
неохарактеризованный белок ENSP00Q00380674
Мнимый
неохарактеризованный белок ENSP00000381830
Секретируемый и трансмембранный 1 прекурсорный вариант
Секретируемый и трансмембранный 1 прекурсорный вариант
Трансмембранный белок 119
Белок критического региона синдрома кошачьего глаза 1
С-типа лектинового домена семейства 18 член
Коллаген альфа-1(XX) цепь
Трансмембра н ный бело к 98
Белок экспрессируемой в яичках 101
Цистеин-богатый секреторный белок 3
Нетрина рецептор UNC5D
Пре-В лифоцитарный белок
Ксилозилтрансфераза 2
Комплемент С4 -А
Муцин-13
Мнимый
неохарактеризованный белок C14orfl44
Белок FAM20A
Мнимый
неохарактеризованный белок PR02329
АТР-зависимая металлопротеаза YME1L1
Мембрана-связанный фактор транскрипции сайта-1 протеаза
Трансмембранный и иммуноглобулиновый домен-содержащий белок 1
Кальций-активированный хлоридного канала регулятор 2
Пропротеин конвертаза субтилизин/кексин типа 5
Фиколин
(Коллаген/фибриноген доменсодержащий) 3 {Hakata антиген) (ML3) (Фиколин
{Коллаген/фибриноген доменсодержащий} 3 {Hakata антиген), изоформа CRA Ь)
Мнимый клеток-киллеров иммуноглобулин-подобный рецептор-подобный белок KTR3DX1
[Лейкоцитарного рецептора кластерный член 12)
Нейробластомы суппрессор онкогенности 1
Терапевтические белки, предложенные здесь, не должны расцениваться как исключительные. Напротив, как следует из раскрытия, представленного здесь, способы изобретения применимы к любому белку, для которого желательно присоединение водорастворимого полимера в соответствии с изобрени-ем. К примеру, терапевтические белки, описанные в US 2007/0026485, включены в данное изобретение во всей полноте посредством ссылки.
Белки системы свертывания крови
Одна из особенностей настоящего изобретения - то, что в качестве исходного материала используется белок системы свертывания крови, который может быть получен из человеческой плазмы, либо произведен способами рекомбинантной инженерии, согласно патентам US № 4757006; US № 5733873; US № 5198349; US № 5250421; US № 5919766; а также ЕР 306968.
Терапевтические полипептиды, в частности, белки, отвечающие за систему свертывания крови, включая фактор IX (Ф-IX), фактор VIII (Ф-VIII), фактор Vila (Ф-VIIa), фактор Фон Виллебранда (ФВф), фактор FV (Ф-V), фактор X (фХ), фактор XI (Ф-XI), фактор XII (Ф-XII), тромбин (Ф-II), протеин С, протеин S, tPA, PAI-1, тканевой фактор (Тф) и протеазу ADAMTS 13 быстро разрушаются протеолитиче-скими ферментами и нейтрализуются антителами. Это способствует уменьшению их периода полужизни и времени циркуляции, что ограничивает их терапевтическую эффективность. Для достижения и поддержания желаемых терапевтических и профилактических эффектов этих белков системы свертывания требуется частое их введение в относительно высоких дозах. Как следствие, сложно достигнуть адекватного регулирования дозы, а необходимость частых внутривенных инъекций накладывает ограничения на образ жизни пациента.
Как указывалось здесь, изобретение охватывает белки свертывания крови, включая фактор IX (Ф-IX), фактор VIII (Ф-VIII), фактор VIIa (Ф-VIIa), фактор Фон Виллебранда (ФВф), фактор FV (Ф-V), фактор X (фХ), фактор XI, фактор XII (Ф-XII), тромбин (Ф-II), протеин С, протеин S, tPA, PAI-1, тканевой фактор (Тф) и протеазу ADAMTS 13, но не ограничиваясь ими. Термин "белок свертывания крови", используемый в этом документе, относится к любому белку из фактора IX (Ф-IX), фактора VIII (Ф-VIII), фактора VIIa (Ф-VIIa), фактора Фон Виллебранда (ФВф), фактора FV (Ф-V), фактора X (фХ), фактора XI (Ф-XI), фактора XII (Ф-XII), тромбина (Ф-II), протеина С, протеина S, tPA, PAI-1, тканевого фактора (Тф) и протеазы ADAMTS 13, проявляющему биологическую активность, аналогичную активности на-тивного белка свертывания крови.
Каскад свертывания крови разделен на три отдельных сегмента: внутренний, внешний, а также общий пути (Schenone et al., Curr Opin Hematol. 2004; 11:272-7). Каскад включает ряд ферментов (проферментов) сериновых протеаз и белковые кофакторы. При необходимости неактивный профермент-предшественник превращается в активную форму, которая, в свою очередь, преобразует следующий фермент каскада.
Внутренний путь включает в себя факторы свертывания VIII, IX, X, XI и XII. Инициация внутреннего пути происходит тогда, когда прекалликреин, высокомолекулярный кининоген, фактор XI (Ф-XI) и фактор XII (Ф-XII) вступают в контакт с отрицательно заряженной поверхностью. Также требуются ионы кальция и фосфолипиды, секретируемые из тромбоцитов.
Внешний путь запускается при повреждении внутренних стенок кровеносных сосудов. Обнажается мембранный гликопротеин тканевой фактор, который связывается с циркулирующим фактором VII (Ф-VII) и с малыми присутствующими количествами его активированной формы Ф-VIIa. Это связывание приводит к полной конверсии Ф-VII в Ф-VIIa и, последовательно, в присутствии кальция и фосфолипи-дов, конверсию фактора IX (Ф-IX) в фактор IXa (Ф-IXa) и фактора X (фХ) в фактор Ха (фХа). Ассоциирование Ф-VIIa с тканевым фактором усиливает протеолитическую активность путем перемещения сайтов связывания Ф-VII с субстратами (Ф-IX и фХ) в более доступное положение и путем индукции изменения конформации, усиливающей ферментативную активность Ф-VIIa.
Активация фХ - общая точка обоих путей. Вместе с фосфолипидами и кальцием, факторы Va (Ф-Va) и Ха преобразуют протромбин в тромбин (комплекс протромбиназы), который затем разрезает фибриноген с образованием мономеров фибрина. Мономеры полимеризуются, формируя волокна из фибрина. Фактор XIIIa (Ф-XIIIa) ковалентно связывает эти волокна друг с другом, формируя жесткую сеть.
Превращение Ф-VII в Ф-VIIa также катализируется рядом протеаз, включая тромбин, Ф-IXa, Ф-Ха, фактор XIa (Ф-XIa), фактор XIIa (Ф-XIIa). Для ингибирования ранних стадий каскада, ингибитор пути тканевого фактора воздействует на комплекс Ф-VIIa/тканевой фактор/фХа.
Фактор VIIa.
Ф-VII (также известный как стабильный фактор или проконвертин) является гликопротеином, относящимся к группе витамин К-зависимых сериновых протеаз, обладающим ключевой ролью в гемостазе и свертывании крови (Eigenbrot, Curr Protein Pept Sci. 2002; 3:287-99).
Ф-VII синтезируется в печени и секретируется в виде одноцепочечного гликопротеина с массой 48 кДа. Ф-VII, как и все гликопротеины, относящиеся к группе витамин К-зависимых сериновых протеаз, имеет доменную структуру, содержащую аминотерминальный домен гамма-карбоксиглутаминовой кислоты (Gla) с 9-12 остатками, ответственными за взаимодействие белка с липидными мембранами, кар-бокситерминальный домен сериновой протеазы (каталитический домен), а также два домена, аналогичных доменам фактора роста эпидермиса, содержащие ион кальция, отвечающие за взаимодействие с тканевым фактором. Гамма-глутамилкарбоксилаза катализирует карбоксилирование остатков Gla на амино-терминальном участке молекулы. Действие карбоксилазы зависит от восстановленной формы витамина К, который при этом окисляется до эпоксидной формы. Обратное превращение эпоксида витамина К в восстановленную форму происходит под действием витамин-М-эпоксид-редуктазы.
Основная часть Ф-VII циркулирует в плазме крови в виде профермента, и активация этой формы происходит при разрезании пептидной связи между 152-м остатком аргинина и 153-м остатком изолей-цина. Результирующий активированный Ф-VIIa состоит из ]МН2-конечной легкой цепи (20 кДа) и СООН-конечной тяжелой цепи (30 кДа), связанных единственной дисульфидной цепью (Цис 135 с Цис 262). Легкая цепь содержит мембран-связывающий Gla-домен, в то время как тяжелая цепь содержит каталитический домен.
Концентрация Ф-VII в плазме обусловлена генетическими факторами и факторами окружающей среды и составляет около 0,5 мг/мл (Pinotti et al., Blood. 2000; 95:3423-8). Различные Ф-VII генотипы могут привести к средним уровням Ф-VII, отличающимся в несколько раз. Уровень Ф-VII в плазме повышается у здоровых женщин во время беременности, кроме того, он повышается с возрастом, выше у женщин и у лиц с гипертриглицеридемией. Ф-VII имеет самый короткий период полужизни из всех фак-торов-прокоагулянтов (3-6 ч). У здоровых людей средняя концентрация Ф-VIIa в плазме равна 3,6 нг/мл, период полужизни циркулирующего Ф-VIIa относительно велик (2,5 ч) в сравнении с остальными факторами свертывания крови.
Наследственная недостаточность Ф-VII - редкое аутосомное рецессивное нарушение системы свертывания крови, распространенность которого в популяции оценивается в 1 случай на 500000 людей (Acharya et al., J. Thromb Haemost. 2004; 2248-56). Приобретенная недостаточность Ф-VII из-за применения ингибиторов также очень редка. Описаны случаи недостаточности после применения таких препаратов, как цефалоспорины, пенициллины, антикоагулянты для приема внутрь. Кроме того, приобретенная недостаточность Ф-VII отмечалась при иных состояниях: миеломе, сепсисе, апластической анемии, при терапии интерлейкином-2 и антитимоцитарным глобулином.
К эталонным полинуклеотидным и полипептидным последовательностям относятся, например, последовательности с номерами доступа GenBank J02933 для геномной последовательности, М13232 для кДНК (Hagen et al. PNAS 1986; 83: 2412-6), и Р08709 для полипептидной последовательности (ссылки включены в настоящую заявку во всей полноте). Описано множество полиморфизмов Ф-VII, например, см. Sabater-Lleal et al. (Hum Genet. 2006; 118:741-51) (ссылка включена в настоящую заявку во всей полноте).
Фактор IX.
Ф-IX - витамин-^зависимый протеин плазмы, участвующий во внутреннем пути коагуляции крови путем превращения фХ в его активную форму в присутствии ионов кальция, фосфолипидов и Ф-VTIIa. Предоминантная каталитическая способность Ф-IX аналогична сериновым протеазам со специфичностью к связи аргинин-изолейцин в Ф-Х. Активация Ф-IX происходит под действием Ф-XIa, который отрезает активационный пептид от Ф-IX, формируя активированную молекулу Ф-IX, содержащую две цепи, связываемые одной или большим количеством дисульфидных связей. Дефекты Ф-IX - причина рецессивной гемофилии В, сцепленной с Х-хромосомой.
Гемофилия А и В - наследственные заболевания, которые характеризуются дефицитом полипептидов Ф-VIII и Ф-IX соответственно. Первопричина дефицита зачастую лежит в мутациях в генах Ф-VIII и Ф-IX, которые расположены в Х-хромосоме. Традиционная терапия гемофилии часто заключается во внутривенном введении смешанной плазмы или полуочищенных белков системы свертывания, полученных от людей с нормальной функцией. Эти препараты могут быть загрязнены патогенными агентами или вирусами, например инфекционными прионами, ВИЧ, парвовирусом, гепатитом А, гепатитом С. Вследствие этого, имеется острая потребность в лекарственных средствах, при производстве которых не используется человеческая сыворотка.
Уровень понижения активности Ф-IX прямо пропорционален тяжести гемофилии В. Текущая терапия гемофилии В заключается в замене недостающего белка полученным из плазмы или рекомбинант-ным Ф-IX (так называемая заместительная терапия или лечение Ф-IX).
Полинуклеотидные и полипептидные последовательности Ф-IX приведены, к примеру, в базе Uni-ProtKB/Swiss-Prot, номер доступа Р00740, базе US Pat. номер 6531298, а также на фиг. 1 (SEQ ID NO: 1).
Фактор VIII.
Фактор свертываемости VIII (Ф-VIII) циркулирует в плазме при очень низкой концентрации, он связан нековалентно с фактором Фон Виллебранда (ФВф). Во время гемостаза, Ф-VIII отделяется от ФВф и действует как кофактор при активации фХ, медиируемой фактором IX (Ф-IXa) посредством увеличения скорости активации в присутствии кальция и фосфолипидов или клеточных мембран.
Ф-VIII синтезируется в виде одноцепочечного предшественника с массой примерно 270-330 кДа и с доменной структурой А1-А2-В-А3-С1-С2. При очищении из плазмы (так называемый "полученный из плазмы" или "плазматический"), Ф-VIII состоит из тяжелой цепи (А1-А2-В) и легкой (А3-С1-С2). Молекулярная масса легкой цепи равна 80 кДа, в то время как, вследствие протеолиза В-домена, вес тяжелой цепи варьируется в интервале 90-220 кДа.
Ф-VIII также синтезируется как рекомбинантный белок для терапии нарушений свертываемости крови. Для определения потенциальной эффективности рекомбинантного Ф-VIII (рф-VIII) как терапевтического средства были разработаны различные анализы in vitro. Эти анализы имитируют эффекты эндогенного Ф-VIII in vivo. Обработка тромбина Ф-VIII in vitro приводит к быстрому подъему и после
дующему спаду его прокоагулянтной активности, по данным анализов in vitro. Эта активация и деактивация согласуется со специфическим ограниченным протеолизом тяжелой и легкой цепей, что видоизменяет доступность различных связывающих эпитопов Ф-VIII, например, позволяя Ф-VIII отсоединяться от ФВф и связываться с фосфолипидной поверхностью или изменять способность к связыванию с определенными моноклональными антителами.
Нехватка или дисфункция Ф-VIII ассоциированы с наиболее частым нарушением свертываемости крови - гемофилией А.
Способ выбора для лечения гемофилии А - заместительная терапия плазмой или концентратами рф-VIII. Пациенты с тяжелой гемофилией А с уровнем Ф-VIII ниже 1%, как правило, проходят профилактическую терапию, предназначенную для поддержания уровня Ф-VIII выше 1% между его введениям. Принимая во внимание среднее время полужизни различных препаратов Ф-VIII при циркуляции, как правило, этот уровень достижим при введениях Ф-VIII два-три раза в неделю.
Эталонные полинуклеотидные и полипептидные последовательности включают, например, Uni-ProtKB/Swiss-Prot Р00451 (FA8HUMAN); Gitschier J. et al., Characterization of the human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure of human Factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984); Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29; 11-29 (2002).
Фактор Фон Виллебранда.
Фактор Фон Виллебранда (ФВф) - гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде нескольких мультимеров, варьирующихся в размере от 500 до 20000 кДа. Мультимерные формы ФВф составлены из полипептидных субъединиц массой 250 кДа, связанных друг с другом дисульфидными связями. ФВф вызывает первичную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной сосудистой стенки. Только большие мультимеры проявляют гемостатическую активность. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют большие полимерные формы ФВф, а молекулы ФВф, имеющие низкий молекулярный вес (низкомолекулярные формы ФВф) появляются вследствие протеолитического разрезания. Муль-тимеры, имеющие большие молекулярные массы, накапливаются в тельцах Вейбеля-Паладе клеток эндотелия и высвобождаются после стимуляции.
ФВф синтезируется эндотелиальными клетками и мегакариоцитами в виде препро-ФВф, состоящего из большого количества повторяющихся доменов. После отрезания сигнального пептида, про-ФВф димеризуется посредством образования дисульфидных связей на С-терминальном участке. Димеры служат протомерами мультимеризации, которая управляется путем образования дисульфидных связей на свободных концах. За объединением в мультимеры следует протеолитическое удаление пропептидной последовательности (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261).
Первичный продукт трансляции, считываемый с клонированной кДНК ФВф является полипептидом-предшественником, содержащим 2813 остатков (препро-ФВф). Препро-ФВф состоит из 22 аминокислотных остатков сигнального пептида и 741 аминокислотных остатков пропептида, таким образом, зрелый ФВф содержит 2050 аминокислот (Ruggeri Z.A., and Ware, J., FASEB J., 308-316 (1993)).
Дефекты ФВф вызывают болезнь Фон Виллебранда (ФВБ), которая характеризуется более или менее выраженной кровоточивостью. ФВБ 3 типа - наиболее тяжелая форма, при которой ФВф полностью отсутствует, ФВБ 1 типа обусловлена количественной потерей ФВф и ее проявления могут быть весьма мягкими, а ФВБ 2 типа характеризуется качественными дефектами ФВф, ее проявления могут быть такими же тяжелыми, как и при 3 типе. ФВБ 2 типа имеет много подтипов, некоторые из которых ассоциированы с отсутствием или уменьшением количества мультимеров с высоким молекулярным весом. Болезнь Фон Виллебранда типа 2а (ФВБ-2А) характеризуется утратой мультимеров и промежуточных размеров, и больших размеров. ФВБ-2В характеризуется утратой мультимеров с самым большим молекулярным весом. Специалистам в данной области техники известны и иные болезни и нарушения, связанные с ФВф.
Полинуклеотидная и аминокислотная последовательности препро-ФВф представлены в базе Gen-Bank, номера доступа NM 000552 и NP 000543 соответственно.
Иные белки свертывания крови согласно изобретению описаны в области техники, например, Mann
KG, Thromb Haemost, 1999; 82:165-74.
A. Полипептиды
Одна из особенностей настоящего изобретения - то, что в качестве исходного материала используется белок или полипептид. Как здесь описано, термин "терапевтический белок" относится к любой молекуле терапевтического белка, проявляющей биологическую активность, связанную с активностью терапевтического белка. В одном из воплощений изобретения молекула терапевтического белка представляет собой белок полной длины.
Подразумеваемые молекулы терапевтических белков включают протеины, имеющие полную длину, предшественники протеинов полной длины, биологически активные субъединицы или фрагменты протеинов полной длины, а также биологически активные производные или варианты какой-либо из этих форм терапевтических белков. Итак, к терапевтическим белкам относят те, которые (1) имеют аминокислотную последовательность, более чем на примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, при
мерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 91, примерно 92, примерно 93, примерно 94, примерно 95, примерно 96, примерно 97, примерно 98 или примерно 99% или более идентичную с участком из по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 200, около 300, около 400 и более аминокислот полипептида, закодированного эталонной нуклеиновой кислотой или аминокислотной последовательностью, приведенной здесь; и/или (2) специфически связываются с антителами, например поликлональными или моноклональными антителами, сформированными против иммуногена, содержащего эталонную аминокислотную кислотную последовательность, описанную здесь, ее иммуногенный фрагмент и/или консервативно модифицированный вариант.
Согласно данному изобретению термин "рекомбинантный терапевтический белок" включает любой терапевтический белок, полученный по технологии рекомбинантной ДНК. В некоторых воплощениях термин включает описанные здесь белки.
Термин "эндогенный терапевтический белок", используемый в этом документе, включает терапевтические белки, полученные от млекопитающих, предназначенные для терапии. В это понятие также включаются терапевтические белки, транскрибируемые из трансгенной или иной чужеродной ДНК, присутствующей в указанном млекопитающем. Термин "экзогенный терапевтический белок", используемый здесь, включает белки свертывания крови, полученные не от млекопитающих, предназначенные для терапии.
Термины "полученный из плазмы белок свертывания крови" или "плазматический", используемые в этом документе, включают все формы белков, обнаруживаемые в крови млекопитающих, которые способны участвовать в каскаде коагуляции.
Термины "биологически активное производное" или "биологически активный вариант", используемые в этом документе, включают любые производные или варианты молекулы, имеющие аналогичные с упомянутой молекулой функциональные и/или биологические свойства, например, связывающие свойства, и/либо аналогичную с ней структуру, например, пептидный скелет или основную полимерную единицу.
"Аналог", такой как "вариант" или "производное" - соединение, в значительной степени сходное по структуре и имеющее такую же биологическую активность, что и природное, хотя и имеющее отличия. К примеру, вариант полипептида - полипептид, в значительной степени сходный по структуре и имеющий такую же биологическую активность, что и эталонный полипептид. Варианты или аналоги отличаются по составу аминокислотных последовательностей в сравнении с природными полипептидами, из которых был получен аналог, основываясь на одной и более мутациях, включая (i) делецию одного и большего количества аминокислотных остатков на одном и более концах полипептида и/или на одном и более внутренних участках последовательности природного полипептида (например, фрагменты), (ii) вставку или добавку одной и большего количества аминокислот на одном и более концах полипептида (как правило, "добавление" или "слияние") и/или на одном и более внутренних участках (как правило, "вставка") последовательности природного полипептида или (iii) замещение одной и большего количества аминокислот в последовательности природного полипептида на другие аминокислоты. В качестве примера, "производное" является типом аналога и относится к полипептиду, имеющему аналогичную или в значительной степени сходную структуру с эталонным полипептидом, который был модифицирован, например, химически.
Вариант полипептида является типом аналога полипептида и включает инсерционные варианты, при которых один и большее количество аминокислотных остатков добавлены к аминокислотной последовательности терапевтического белка согласно изобретению. Вставки могут быть расположены на одном или обоих концах протеина, и/или могут располагаться во внутренних участках аминокислотной последовательности терапевтического белка. Инсерционные варианты с дополнительными остатками на одном или обоих концах включают, например, слитые белки и белки, включающие аминокислоты с группами-метками или иные меченые аминокислоты. В одном случае, молекул белка свертывания крови необязательно содержит N-терминальный остаток Мет, особенно, если молекула экспрессируется реком-бинантно в бактериальных клетках, например, E.coli.
Делеционные варианты отличаются тем, что из полипептидной последовательности терапевтического белка, описанного здесь, удалены один или более аминокислотных остатков. Делеции могут быть расположены на одном или обоих концах полипептида терапевтического белка, и/или могут быть обусловлены удалением одного и большего количества остатков из аминокислотной последовательности терапевтического белка. Делеционные варианты, таким образом, включают фрагменты полипептидной последовательности терапевтического белка.
Заместительные варианты характеризуются тем, что один или более аминокислотных остатков в полипептиде терапевтического белка удалены и замещены другими остатками. В одном случае замены могут быть консервативными по природе, консервативные замены этого типа хорошо известны в области техники. Альтернативно, изобретение охватывает замены, которые также являются неконсервативными. Примеры консервативных замещений описаны в Lehninger [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), p. 71-77] и представлены ниже.
Консервативные замещения
ХАРАКТЕРИСТИКА. РАДИКАЛА
Неполярные (гидрофобные)
A. Алифатические
B. Ароматические
C. Серосодержащие
D. Граничные Незаряженные полярные:
A. Гидроксильные
B. Амидные
C. Сульфгидрильные
D. Граничные
Положительно заряженные (основные)
Отрицательно заряженные (кислотные)
АМИНОКИСЛОТА
A L I V Р F W М
STY N Q
К R Н D Е
Альтернативный примерный перечень консервативных вариантов замен приведен ниже.
ПРИМЕРЫ ЗАМЕНЫ
Консервативные замены П
В. Полинуклеотиды
Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические белки по изобретению, включают в рамках изобретения, к примеру, гены, пре-мРНК, мРНК, кДНК, полиморфные варианты, аллели, искусственные и природные мутанты, но не ограничиваясь ими.
Полинуклеотиды, кодирующие терапевтические белки, также включают в рамках изобретения, к примеру, но не ограничиваясь ими, те, которые (1) специфически гибридизированы в жестких гибриди-зационных условиях с нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную здесь, а также их консервативно модифицированные варианты; (2) имеют нуклеотидную последовательность с более чем 95, около 96, около 97, около 98, около 99, и большей идентичностью нуклео-тидной последовательности на участке с по меньшей мере около 25, около 50, около 100, около 150, около 200, около 250, около 500, около 1000 и более нуклеотидов (вплоть до полной длины последователь
ности из 1218 нуклеотидов зрелого белка), с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты, описанной здесь. Примером "жестких гибридизационных" условий служит гибридизация при 42°С в 50% формамиде, 5Х SSC (цитрат и хлорид натрия), 20 мМ Na-PO4, pH 6,8; и отмывка в IX SSC при 55°С в течение 30 мин. Следует понимать, что в зависимости от длины и содержания ГЦ-нуклеотидов гибридизи-руемых последовательностей, эти примерные условия могут быть изменены. Для определения приемлемых условий гибридизации приемлемы стандартные в данной области техники формулы. См. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) § 9.47-9.51.
"Природные" полинуклеотидные или полипептидные последовательности, как правило, происходят от млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, приматов, к примеру, человека; грызунов, к примеру, крыс, мышей, хомяков; от коров, свиней, лошадей, овец или иных млекопитающих. Нуклеиновые кислоты и белки в рамках изобретения могут быть рекомбинантными молекулами (к примеру, гетероло-гическими, кодирующими последовательность дикого типа или ее варианты, или не встречающимися в природе).
С. Получение терапевтических белков
Получение терапевтических белков включает любые способы, известные в области техники, предназначенные для (i) получения рекомбинантной ДНК способами генной инженерии, (ii) внедрения ре-комбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки посредством, к примеру, но не ограничиваясь ими, трансфекции, электропорации или микроинъекции, (iii) культивирования указанных трансформированных клеток, (iv) экспрессирования терапевтических белков, например, конститутивно или по индукции, а также (v) выделения указанных белков свертывания крови, например, из культураль-ной среды или путем сбора трансформированных клеток для получения очищенного терапевтического белка.
В иных случаях, терапевтический белок получают путем экспрессии в подходящей прокариотиче-ской или эукариотической клеточной системе, характеризующейся способностью к синтезу фармакологически приемлемой молекулы белка свертывания крови. Примерами эукариотических клеток являются клетки млекопитающих, например, СНО, COS, HEK 293, ВНК, SK-Hep, а также HepG2.
Для получения терапевтических белков используется множество векторов, выбранных из эукарио-тических и прокариотических векторов экспрессии. Примерами векторов прокариотической экспрессии служат плазмиды, например, но не ограничиваясь ими, pRSET, pET, и pBAD, а промоторы, используемые для прокариотических векторов экспрессии, включают один или более из lac, trc, trp, recA, или ara-BAD, но не ограничиваясь перечисленными. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) для экспрессии в дрожжах - такие векторы, как pAO, pPIC, pYES, или рМЕТ, но не ограничиваясь ими, с использованием таких промоторов, как AOX1, GAP, GAL1, или AUG1, но не ограничиваясь ими; (ii) для экспрессии в клетках насекомых - такие векторы, как рМТ, рАс5, pIB, pMIB, или рВАС, но не ограничиваясь ими, с использованием таких промоторов, как РН, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, или polh, но не ограничиваясь ими, и (iii) для экспрессии в клетках млекопитающих - такие векторы, как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, или pBPV, но не ограничиваясь ими, а также векторы, в одном случае, полученные из таких вирусных систем, как вирус осповакцины, аденосателлитные вирусы, вирусы герпеса, или ретровирусы, с использованием таких промоторов, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, и р-актин, но не ограничиваясь ими.
D. Введение препарата
В одном из воплощений конъюгированный терапевтический белок согласно настоящему изобретению может вводиться путем инъекции, например, внутривенно, внутримышечно, либо интраперитоне-ально.
Для введения композиций человеку или подопытным животным, содержащих конъюгированный терапевтический белок согласно данному изобретению, в их состав могут быть включены один и большее количество фармацевтически приемлемых носителей. Термины "фармацевтически" или "фармакологически приемлемые" относятся к молекулярным структурам и композициям, которые стабильны, инги-бируют деградацию белка, например, агрегацию и разрезание, а также не вызывают аллергических реакций и иных нежелательных реакций при введении путями, известными в области техники, как описано ниже. К "фармацевтически приемлемым носителям" относятся все клинически пригодные растворители, диспергенты, пленки, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические растворы и средства для замедления абсорбции и т.д., включая средства, перечисленные выше.
Термин "эффективное количество" при использовании в этом документе обозначает дозу, пригодную для лечения заболевания или нарушения или ослабления симптома заболевания или нарушения. В одном воплощении термин "эффективное количество" обозначает дозу, пригодную для лечения млекопитающего, имеющего описанное здесь расстройство свертывания крови.
Композиции могут вводиться перорально, местно, чрескожно, парентерально, ингаляционным спреем, вагинально, ректально, либо интракраниальной инъекцией. Термин парентерально включает здесь подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальное введение, а также
инфузии. Введение может осуществляться способами внутривенных, внутрикожных, внутримышечных, интрамаммарных, интраперитонеальных, интратекальных, ретробульбарных, интрапульмонарных инъекций, а также способом хирургической имплантации в конкретный участок тела. Как правило, композиции не содержат пирогенов, а также иных примесей, которые могут быть опасны для реципиента.
Одно- и многократные введения композиций могут проводиться с уровнями дозировок и по схеме, выбранными лечащим врачом. Для профилактики или лечения болезни, приемлемый уровень дозировки будет зависеть от типа болезни, подлежащей лечению, как описано выше, тяжести и течения болезни, целей применения препарата: профилактических или терапевтических, предшествующей терапии, анамнеза больного и реакции на препарат, а также от индивидуальных суждений лечащего врача.
Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество конъюгированного терапевтического белка, как описано здесь. Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель, соли, буферы или вспомогательные добавки. Фармацевтическая композиция может использоваться для лечения указанных выше расстройств свертывания крови. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может являться раствором или лиофилизатом. Растворы фармацевтической композиции могут подвергаться любым подходящим лиофилизационным процессам.
Дополнительно, изобретение включает наборы, содержащие композицию согласно изобретению, упакованную таким способом, чтобы облегчить ее введение субъектам. В одном воплощении в такой набор включено соединение или композиция, описанная здесь (например, композиция, содержащая конъюгированный терапевтический белок), упакованные в контейнер, например запечатанный флакон или бутыль, с этикеткой, прикрепленной к контейнеру или прилагаемой к упаковке, в которой описано практическое использование соединения или композиции. В одном воплощении набор содержит два контейнера, в первом из которых находится композиция, содержащая конъюгированный терапевтический белок, а во втором - физиологически приемлемый раствор для восстановления раствора композиции в первом флаконе. В одном случае соединение или композиция могут быть упакованы в форму, позволяющую дозирование. Набор может дополнительно включать приспособление, предназначенное для введения композиции согласно специфическому способу введения. Предпочтительно, чтобы набор содержал этикетку, в которой описано использование терапевтического белка или пептидной композиции.
Водорастворимые полимеры В одном случае, молекула производного терапевтического белка (т.е. конъюгированный терапевтический белок) связана с водорастворимым полимером, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ), разветвленный ПЭГ, полисиаловую кислоту (ПСК), гидроксиалкилкрахмал (ГАК), гидроксилэтилкрахмал (ГЭК), углеводы, полисахариды, пуллулан, хитозан, гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, дерматансуль-фат, крахмал, декстран, карбоксиметил-декстран, полиалкиленоксид (ПАО), полиалкиленгликоль (ПАГ), полипропиленгликоль (ППГ), полиоксазолин, полиакрилоилморфолин, поливиниловый спирт (ПВС), поликарбоксилат, поливинилпирролидон, полифосфазен, полиоксазолин, сополимер полиэтилена с ма-леиновым ангидридом, сополимер полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаль) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфат (МФС), но не ограничиваясь ими. В одном воплощении изобретения водорастворимый полимер состоит из молекулы сиа-ловой кислоты, имеющей молекулярный вес, находящийся в пределах 350-120000, 500-100000, 100080000, 1500-60000, 2000-45000, 3000-35000 и 5000-25000 Да. Связывание водорастворимого полимера может выполняться путем прямого связывания с белком либо через молекулы сшивающих агентов. Один пример химического сшивающего агента - МВРН (4-[4-№малеимидофенил]масляной кислоты гидразид), содержащий карбогидрат-селективную гидразидную и сульфгидрил-реактивную малеимидную группы (Chamow et al., J. Biol. Chem. 1992; 267:15916-22). Иные примерные и предпочтительные сшивающие агенты приведены ниже.
В одном воплощении производное сохраняет полную функциональную активность нативного терапевтического продукта белка, а также обеспечивает увеличенный период полужизни in vivo в сравнении с нативными терапевтическими продуктами белков. В другом воплощении производное сохраняет по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140,
или 150 % от биологической активности нативного белка свертывания крови. В связанном случае, биологическая активность производного и нативного белков свертывания крови определяется отношениями хромогенной активности антигенов к факторам свертывания крови (фактор свертывания кровшОи": фактор свертывания крови:Ag). В ином воплощении изобретения период полужизни конструкции уменьшен или увеличен в 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз в сравнении с периодом полужизни нативного терапевтического белка in vivo.
А. Сиаловая кислота и ПСК ПСК состоят из полимеров (обычно, гомополимеров) N-ацетилнейраминовой кислоты. Вторичная аминогруппа, как правило, несет ацетильную группу, но может, вместо нее, нести гликолильную группу. Возможные заместители гидроксильных групп включают ацетильную, лактильную, этильную, сульфат
ную и фосфатную группы.
но он N-Ацетилнейраминовая кислота Neu5Ac
Структура сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты).
ПСК и мПСК, как правило, включают линейные полимеры, состоящие, в основном, из фрагментов N- ацетилнейраминовой кислоты, соединенных 2,8- или 2,9- гликозидными связями или их комбинациями (например, чередующимися 2,8- и 2,9-связями). Особенно предпочтительны ПСК и мПСК с а-2,8 гликозидными связями. Подобные ПСК и мПСК, как правило, получаются из коломиновых кислот и обозначаются здесь как "КК" и "мКК". Типичные ПСК и мПСК включают по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20 фрагментов N-ацетилнейраминовой кислоты. Таким образом, в них может содержаться от 2 до 300 фрагментов N-ацетилнейраминовой кислоты, предпочтительно от 5 до 200 фрагментов N-ацетилнейраминовой кислоты или наиболее предпочтительно от 10 до100 фрагментов N-ацетилнейраминовой кислоты. Предпочтительно, чтобы ПСК и КК существенным образом не содержали иных углеводных остатков, кроме как остатков N-ацетилнейраминовой кислоты. Таким образом, ПСК и КК предпочтительно содержат по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% фрагментов N-ацетилнейраминовой кислоты.
Если ПСК и КК содержат фрагменты, отличные от N-ацетилнейраминовой кислоты (как, например, в мПСК и мКК), то предпочтительно, чтобы они располагались на одном или обоих концах полимерной цепи. Подобные "отличные" фрагменты, к примеру, могут быть фрагментами, полученными из терминальных фрагментов N-ацетилнейраминовой кислоты окислением или восстановлением.
К примеру, в WO -A-0187922 описаны подобные мПСК и мКК, у которых невосстанавливающая терминальная единица N-ацетилнейраминовой кислоты превращена в ацетильную группу взаимодействием с натрия периодатом. Помимо этого, в WO 2005/016974 описаны ПСК и КК, в которых восстанавливающая терминальная единица N-ацетилнейраминовой кислоты подвергается восстановлению с восстановительным разрывом кольца восстановительной терминальной единицы N-ацетилнейраминовой кислоты с образованием вицинальной диольной группы, после чего ее окисляют с превращением вици-нальной диольной группы в альдегидную группу.
Гликопротеины, богатые сиаловой кислотой, связывают селектин у человека и других организмов. Они играют важную роль при инфекциях гриппа у человека. Так, например, сиаловая кислота может скрывать от маннозасвязывающего лектина маннозные антигены на поверхности клеток-хозяев или бактерий. Вследствие этого не происходит активации комплемента. Сиаловые кислоты также скрывают предпоследние остатки галактозы, предотвращая быстрый клиренс гликопротеина галактозным рецептором клеток паренхимы печени.
Структура коломиновой кислоты (гомополимера N-ацетилнейраминовой кислоты).
Коломиновые кислоты (подкласс ПСК) являются гомополимерами N-ацетилнейраминовой кислоты (NANA) с а (2-8) кетозидной связью и производятся, среди прочего, определенным штаммами Escherichia coli, несущими антиген К1. Коломиновые кислоты выполняют множество физиологических функций. Они - важное сырье для лекарственных и косметических препаратов.
Сравнительные исследования in vivo с полисиалированной и немодифицированной аспарагиназой показали, что полисиалирование повышает период полужизни фермента (Fernandes and Gregoriadis, Bio-chimica Biophysica Acta 1341: 26-34, 1997).
Термин "фрагменты сиаловых кислот", используемый в этом документе, включает мономеры или полимеры сиаловой кислоты ("полисахариды"), которые растворимы в водном растворе или суспензии и не имеют отрицательных эффектов (либо имеют незначительные), например, побочных эффектов, у млекопитающих при введении конъюгатов ПСК с белками системы свертывания крови в фармацевтически эффективных количествах. Полимеры могут состоять, в одном случае, из 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 или 500 единиц сиаловой кислоты. В ряде случаев различные единицы
сиаловой кислоты объединяются в цепочки.
В одном из воплощений изобретения фрагмент полисахаридного соединения, состоящий из сиало-вой кислоты, очень гидрофилен, в ином воплощении все соединение очень гидрофильно. Гидрофиль-ность в первую очередь обусловлена боковыми карбоксильными группами сиаловой кислоты, а также гидроксильными группами. Сахаридная единица может содержать и иные функциональные группы, например, аминогруппу, гидроксильную или сульфатную группу, а также их комбинации. Эти группы могут присутствовать в природных сахаридных соединениях, либо могут быть введены в получаемые поли-сахаридные соединения.
Природный полимер ПСК доступен в виде полидисперсного препарата с большим разбросом размеров (например, Sigma C-5762) и высокой полидисперсностью (ПД). Поскольку полисахариды, как правило, получают из бактерий, имеется риск попадания эндотоксинов в продукт при его очистке, а при выделении длинноцепочечных полимеров сиаловой кислоты вероятность повышения содержания эндотоксинов повышается. Короткие молекулы ПСК, содержащие 1-4 остатка сиаловой кислоты также могут быть приготовлены синтетически (Kang S.H. et al., Chem Commun. 2000; 227-8; Ress D.K. and Linhardt R.J., Current Organic Synthesis. 2004; 1:31-46), что минимизирует риск высокого содержания эндотоксинов. Тем не менее, препараты ПСК с узким распределением размеров и низкой полидисперсностью, а также свободные от эндотоксинов, могут быть приготовлены в настоящее время. В одном случае в изобретении могут использоваться полисахаридные компоненты, полученные из бактерий. Некоторые из этих природных полисахаридов известны под видом гликолипидов. В одном из воплощений изобретения полисахаридные соединения практически полностью освобождены от терминальных единиц галактозы.
В. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) и пегилирование
В качестве особенности изобретения, терапевтические белки конъюгированы с водорастворимым полимером каким-либо из множества химических способов (Roberts J.M. et al., Advan Drug Delivery Rev 2002; 54:459-76). К примеру, в одном воплощении терапевтический белок модифицирован конъюгацией ПЭГ со свободными аминогруппами белка с использованием N-гидроксисукцинимидных (NHS) сложных эфиров. В ином воплощении водорастворимый полимер, к примеру, ПЭГ, соединен со свободными SH-группами малеимидным способом или связыванием гидразидов ПЭГ или аминов ПЭГ с углеводными фрагментами терапевтического белка после предварительного окисления.
В качестве особенности изобретения, конъюгация осуществляется путем прямого связывания (или связывания посредством сшивающих агентов) водорастворимого полимера с терапевтическим белком с образованием стабильных связей. В определенных случаях изобретения могут использоваться разрушаемые, легкоразрываемые или гидролизуемые системы сшивания (Tsubery et al. J. Biol Chem 2004; 279:38118-24/Greenwald et al., J. Med Chem 1999; 42:3657-67/Zhao et al., Biocom Chem 2006; 17:341-51/WO 2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2).
В одном воплощении изобретения терапевтический белок модифицирован в остатках лизина производными полиэтиленгликоля, содержащими активный N-гидроксисукцинимидный сложный эфир (NHS), например, сукцинат сукцинимидила, глутарат сукцинимидила или пропионат сукцинимидила. Эти производные реагируют с остатками лизина терапевтического белка в мягких условиях, образуя стабильную амидную связь. В одном воплощении изобретения длина цепи производного ПЭГ равна 5000 Да. В иных воплощениях могут использоваться другие производные ПЭГ с длиной цепи от 500 до 2000 Да, от 2000 до 5000 Да, более 5000 вплоть до 10000 Да или более 10000 вплоть до 20000 Да, более 20000 вплоть до 150000 Да, включая линейные и разветвленные структуры.
Среди альтернативных способов пегилирования аминогрупп, но не ограничиваясь перечисленными, можно назвать химическое конъюгирование с карбонатами ПЭГ с образованием уретановых связей, или взаимодействие с альдегидами или кетонами при восстановительном аминировании с образованием вторичных амидных связей.
В одном воплощении данного изобретения молекула терапевтического белка химически модифицирована производными ПЭГ, доступными в продаже. Эти производные ПЭГ в альтернативных вариантах могут иметь линейные или разветвленные структуры. Примеры производных ПЭГ, содержащих группы NHS, приведены ниже.
Следующие производные ПЭГ - неисчерпывающий перечень продуктов, коммерчески доступных у Nektar Therapeutics (Хантсвиль, Алабама; см. www.nektar.com/каталог реагентов ПЭГ; Nektar Advanced
PEGylation, прайс-лист 2005-2006):
мПЭГ-сукцинимидилпропионат (mPEG-SPA)
f к
mPEG-CH,CH-> С-О-N
мПЭГ-сукцинимидил-а-метилбутаноат (mPEG-SMB)
Структура разветвленных производных ПЭГ (Nektar Therapeutics). Разветвленный N-гидроксисукцинимид ПЭГ (mPEG2-NHS)
Этот реагент с разветвленной структурой описан более подробно в работе Kozlowski et al. (BioDrugs
2001; 5:419-29).
Еще один неисчерпывающий перечень производных ПЭГ, доступных в продаже у NOF Corporation (Токио, Япония; см. www.nof.co.jp/english: каталог 2005).
Общая структура линейных производных ПЭГ (NOF Corp.):
Данные производные пропана обладают скелетом глицерина с 1,2-замещением. В данном изобретении также могут применяться разветвленные производные ПЭГ на основе структуры глицерина с 1,3-замещением или иные разветвленные структуры, описанные в US2003/0143596A1.
Также могут использоваться производные ПЭГ с легко разрываемыми связями (например, с гидро-лизуемыми сшивками), как описано Tsubery et al. (J. Biol Chem 2004; 279:38118-24) и Shechter et al.
(WO 04089280 A3).
Как ни удивительно, пегилированный терапевтический белок согласно данному изобретению, обладает функциональной активностью в комбинации с продленным периодом полужизни in vivo. Вдобавок, пегилированные рф-VIII, Ф-VIIa, Ф-IX и иные факторы свертывания крови, видимо, более резистентны к инактивации тромбином.
С. Гидроксиалкилкрахмал (ГАК) и гидроксилэтилкрахмал (ГЭК)
В различных воплощениях настоящего изобретения молекула терапевтического белка химически модеифицирована с использованием гидроксиалкилкрахмала (ГАК) или гидроксилэтилкрахмала (ГЭК) или их производных.
ГЭК является производным природного амилопектина и расщепляется в организме альфа-амилазой. ГЭК является замещенным производным углеводного полимера амилопектина, который присутствует в кукурузном крахмале в концентрации вплоть до 95% по массе. ГЭК обладает выгодными биологическими характеристиками и используется в качестве средства для возмещения объема циркулирующей крови и в гемодилюционной терапии в клиниках (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8 (8), 271278; и Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res. g. 419 494-498).
Амилопектин состоит из фрагментов глюкозы, причем в главной цепи присутствуют альфа-1,4-гликозидные связи, а в местах разветвления присутствуют альфа-1,6-гликозидные связи. Физико-химические свойства этой молекулы, в основном, определяются типом гликозидных связей. Благодаря альфа-1,4-гликозидной связи, получаются спиральные структуры, содержащие приблизительно шесть мономеров глюкозы на оборот. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера могут быть модифицированы замещением. Гидроксиэтильная группа может быть внедрена щелочным гидро-ксиэтилированием. При адаптировании условий реакции возможно добиться различной реакционной способности соответствующей гидроксигруппы незамещенного мономера глюкозы в сравнении с гидро-ксиэтилированием. Благодаря этому факту, специалист может осуществить замещение в желаемой степени.
ГАК обозначает производное крахмала, в котором замещена по меньшей мере одна гидроксиал-кильная группа. Таким образом, термин "гидроксиалкилкрахмал" не ограничивается соединениями, в которых терминальный углеводный фрагмент содержит гидроксиалкильные группы R1, R2 и/или R3, но, также, относится к соединениям, у которых где-либо присутствует по меньшей мере одна гидроксигруп-па в терминальном углеводном фрагменте и/или в оставшейся части молекулы крахмала, ГАК', замещена гидроксиалкильной группой R1, R2 или R3.
Алкильная группа может быть линейной или разветвленной алкильной группой, которая тоже может быть замещена нужным образом. Предпочтительно, чтобы в гидроксиалкильной группе содержалось 1-10 атомов углерода, более предпочтительно 1-6 атомов углерода, более предпочтительно 1-4 атомов углерода, еще более предпочтительно 2-4 атомов углерода.
"Гидроксиалкилкрахмал", таким образом, предпочтительно включает гидроксиэтилкрахмал, гидро-ксипропилкрахмал и гидроксибутилкрахмал, причем особенно предпочтительны гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропилкрахмал.
Гидроксиалкилкрахмал, который содержит две или более различные гидроксиалкильные группы, также охватывается настоящим изобретением. По меньшей мере одна из гидроксиалкильных групп, содержащихся в ГАК, может содержать две или более гидроксильные группы. В соответствии с одним воплощением по меньшей мере одна из гидроксиалкильных групп, находящихся в ГАК, содержит одну гидроксигруппу.
Термин ГАК также включает производные, в которых алкильная группа моно- или полизамещена. В одном воплощении алкильная группа замещена галогеном, в частности фтором, либо арильной группой, так, чтобы ГАК оставался растворимым в воде. Помимо этого, терминальная гидроксигруппа гидро-ксиалкильной группы может входить в состав сложного или простого эфира. Производные ГАК описаны в WO /2004/024776, который включен в это изобретение во всей полноте посредством ссылки.
D. Способы присоединения
Терапевтический белок может быть ковалентно связан с полисахаридными соединениями различными способами, известными специалистам в этой области техники. В качестве особенности изобретения, фрагменты сиаловой кислоты связаны с терапевтическим белком, например, Ф-IX, Ф-VIII, Ф-VIIa или ФВф, например, по способу, описанному в патенте US № 4356170, который включен в данную заявку по ссылке.
В рамках изобретения также предполагается возможность использования иных известных способов связывания ПСК с полипептидами. К примеру, в публикации US № 2007/0282096 описано конъюгирова-ние амино- или гидразидных производных, например, ПСК, с белками. Помимо этого, в публикации US № 2007/0191597 описаны производные ПСК, содержащие альдегидную группу, взаимодействующую с субстратами (например, белками) на их восстанавливающем конце. Эти публикации включены по ссылке во всей полноте.
Различные способы приведены в колонке 7, строке 15, -колонке 8, строке 5 патента U.S. № 5846951 (включен по ссылке во всей полноте). Среди примеров способов можно назвать связывание посредством образования пептидной связи между карбоксильной группой того или иного белка свертывания крови или полисахарида и аминогруппой белка свертывания крови или полисахарида, либо сложноэфирной связи между карбоксильной группой белка свертывания крови или полисахарида и гидроксильной группой терапевтического белка или полисахарида. Другой пример ковалентного связывания терапевтического белка с полисахаридным соединением - через основание Шиффа, т.е. путем взаимодействия свободной аминогруппы белка свертывания крови с альдегидной группой, формируемой на невосстанавли-вающем конце полисахарида при периодатном окислении (Jennings H.J. and Lugowski С., J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Fernandes A.I. and Gregoriadis G., Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). В одном случае образовавшееся основание Шиффа стабилизируется путем специфического восстановления при помощи NaCNBH3 с образованием вторичного амина. Альтернативный подход - формирование терминальных свободных аминогрупп в ПСК путем восстановительного аминирования с NH4Cl после предварительного окисления. Для связывания двух амино- или двух гидроксильных групп могут быть использованы бифункциональные реагенты. Например, ПСК, содержащая аминогруппу может быть связана с аминогруппой белка при помощи реагентов типа BS3 (бис-(сульфосукцинимидил)суберат/Pierce, Рокфорд, Иллинойс). Помимо этого, к примеру, для связывания амино- и тиоловых групп могут использоваться гетеробифункциональные перекрестно-сшивающие реагенты по типу Sulfo-EMCS (N-e-малеимидокапроилокси)сульфосукцинимидный сложный эфир/Pierce).
По иному способу, готовят гидразид ПСК и связывают его с углеводными фрагментами белка после предварительного окисления с формированием альдегидных групп.
Как описано выше, свободная аминогруппа терапевтического протеина реагирует с 1-карбоксильной группой остатка сиаловой кислоты с образованием пептидильной связи или сложноэфир-ная связь образуется между 1-карбоксильной группой кислоты и гидроксильной или иной подходящей активной группой белка свертывания крови. В качестве варианта, карбоксильная группа может образовывать пептидную связь с деацетилированной 5-аминогруппой или альдегидная группа молекулы тера
певтического белка может образовывать основание Шиффа с N-деацетилированной 5-аминогруппой остатка сиаловой кислоты.
Альтернативно, полисахаридное соединение связано нековалентно с терапевтическим белком. К примеру, полисахаридное соединение и фармацевтически активное соединение в одном случае соединяются в одно целое посредством гидрофобных взаимодействий. Иные нековалентные способы связи включают электростатические взаимодействия, при которых противоположно заряженные ионы притягиваются друг к другу.
В различных воплощениях, терапевтический белок связан или ассоциирован с полисахаридным соединением в стехиометрических отношениях (например, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10 и т.д.). В различных воплощениях, 1-6, 7-12 или 13-20 полисахаридов связаны с белком свертывания крови. В иных воплощениях, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и более полисахаридов связаны с белком свертывания крови.
В различных воплощениях, терапевтический белок модифицирован, т.е. в него внедрены сайты гли-козилирования (т.е. сайты, отличные от нативных сайтов гликозилирования). Такая модификация может быть выполнена стандартными способами молекулярной биологии, известными в данной области техники. Более того, терапевтический белок перед конъюгированием с водорастворимым полимером может быть гликозилирован in vivo или in vitro. Эти гликозилированные сайты могут служить мишенями для конъюгации белков с водорастворимыми полимерами (заявка на патент US № 20090028822, заявка на патент US № 2009/0093399, заявка на патент US № 2009/0081188, заявка на патент US № 2007/0254836, заявка на патент US № 2006/0111279, а также DeFrees S. et al., Glycobiology, 2006, 16, 9, 833-43). К примеру, белок, который не гликозилирован в природе in vivo (например, белок, который не является глико-протеином), может быть модифицирован так, как описано выше.
Е. Аминоокси-связывание
В одном воплощении изобретения для приготовления конъюгатов белков системы свертывания крови используется взаимодействие гидроксиламина или гидроксиламиновых производных с альдегидами (например, с углеводными фрагментами, окисленными периодатом натрия) с образованием оксимной группы. К примеру, гликопротеин (например, терапевтический белок согласно данному изобретению) вначале окисляется окислителем типа периодата натрия (NaIO4) (Rothfus JA et Smith EL., J. Biol Chem 1963, 238, 1402-10; и Van Lenten L and Ashwell G., J. Biol Chem 1971, 246, 1889-94). Периодатное окисление гликопротеинов основывается на классической реакции Малапрада, описанной в 1928 г., а именно на окислении вицинальных диолов периодатом с образованием активной альдегидной группы (Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). Окислителями также могут дополнительно выступать тетраацетат свинца ^Ь(ОАС)4 ), ацетат марганца (MnO(Ac)3), ацетат кобальта (Со(ОАс)2), ацетат таллия (TlOAc), сульфат церия (Ce(SO4)2) (US 4367309) или перрутенат калия (KRuO4) (Marko et al., J. Am Chem Soc 1997,119, 12661-2). Под "окислителем" подразумевается соединение, обладающее мягкими окислительными свойствами, позволяющими произвести окисление вицинальных диолов в углеводы и сформировать активные альдегидные группы при протекании реакции в физиологических условиях.
Второй этап - связывание полимера, содержащего аминооксигруппы, с окисленными углеводными фрагментами с образованием оксимной связи. В одном воплощении изобретения этот этап может проводиться в присутствии каталитических количеств нуклеофильного катализатора анилина или его производных (Dirksen A. et Dawson Р.Е., Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y et al., Nature Methods 2009; 6:207-9). Анилиновый катализ существенно ускоряет образование оксимных связей, что позволяет использовать очень малые концентрации реагентов. В другом воплощении данного изобретения оксимная связь стабилизируется восстановлением NaCNBH3 с образованием алкоксиаминовой связи (фиг. 2). Дополнительные катализаторы описаны ниже.
Дополнительные сведения по технологии аминоокси-связывания приведены в следующих источниках, каждый из которых включен в своей полноте: ЕР 1681303А1 (эритропоэтин, связанный с гидрокси-алкилкрахмалом); WO 2005/014024 (конъюгаты полимера и белка, связанные оксимной группой); WO 96/40662 (сшивающие агенты, содержащие аминооксигруппы и их применение для изготовления конъю-гатов); WO 2008/025856 (модифицированные протеины); Peri F. et al., Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J. et Pozsgay V., J. Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees A. et al., Vaccine 2006, 24(6), 716-29; и Heredia K.L. et al., Macromoecules 2007, 40(14), 4772-9.
В различных воплощениях изобретения водорастворимый полимер, соединенный согласно амино-окси-технологии, описанной здесь, с окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка (например, Ф-VIII, Ф-VIIa или Ф-IX), включает, к примеру, но не ограничиваясь перечисленными примерами, полиэтиленгликолем (ПЭГ), разветвленным ПЭГ, полисиаловой кислота (ПСК), углеводами, полисахаридами, пуллуланом, хитозаном, гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатом, дерматан-сульфатом, крахмалом, декстраном, карбоксиметил-декстраном, полиалкиленоксидом (ПАО), полиалки-ленгликолем (ПАГ), полипропиленгликолем (ППГ), полиоксазолином, полиакрилоилморфолином, поливиниловым спиртом (ПВС), поликарбоксилатом, поливинилпирролидоном, полифосфазеном, полиокса-золином, сополимером полиэтилена с малеиновым ангидридом, сополимером полистирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформалем) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'
этилтриметиламмонийфосфатом (МФС).
Нуклеофильные катализаторы Как описано здесь, конъюгирование водорастворимых полимеров" с терапевтическими белками может быть катализировано анилином. Анилин выраженно катализирует реакции в воде альдегидов и кетонов с аминами с образованием стабильных иминов, таких как гидразоны и оксимы. На диаграмме ниже сравниваются некатализированная и анилин-катализированная реакция оксимного связывания (КоЫег J.J., ChemBioChem. 2009; 10:2147-50):
Однако, в связи с тем, что анилин вреден для здоровья, желательны другие катализаторы. В настоящем изобретении в качестве альтернативных катализаторов оксимного связывания предлагаются анилиновые производные. Подобные анилиновые производные включают, но не ограничиваясь перечисленным, о-аминобензойную кислоту, м-аминобензойную кислоту, п-аминобензойную кислоту, сульфа-ниловую кислоту, о-аминобензамид, о-толуидин, м-толуидин, п-толуидин, о-анизидин, м-анизидин и п-анизидин.
В одном воплощении изобретения для катализа реакций конъюгации, описанных здесь, используется м-толуидин (также называемый мета- толуидином, м-метиланилином, 3-метиланилином или 3-амино-1-метилбензолом). М-толуидин и анилин обладают сходными физическими свойствами и практически одинаковой величиной рКа (м-толуидин: рКа 4,73, анилин: рКа 4,63).
Нуклеофильные катализаторы по изобретению пригодны для оксимного связывания (например, с использование аминоокси-связывания) или образования гидразонов (например, по гидразидной химии). В различных воплощениях изобретения нуклеофильный катализатор вводится в реакцию конъюгации в
концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0,
7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мМ. В одном воплощении нуклеофильный катализатор вводится в концентрации 1-10 мМ. В различных воплощениях изобретения интервал рН реакции конъюгации равен 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 и 7,5. В одном воплощении рН лежит в пределах 5,5-6,5.
Очистка конъюгированных белков
В различных воплощениях желательна очистка белка, который был инкубирован с окислителем и/или терапевтического белка, который был конъюгирован с водорастворимым полимером согласно данному раскрытию. В области техники известно множество способов очистки, включая, без ограничений, хроматографические способы, такие как ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, эксклюзионная хроматография и аффинная хроматография или их комбинации, способы фильтрования и способы осаждения (Guide to Protein Purification, Meth. Enzymology, Vol. 463 (edited by Burgess RR and Deutscher MP), 2nd edition, Academic Press 2009).
Следующие примеры не исчерпывающи, но приведены лишь в качестве приблизительных способов воплощения изобретения.
Примеры
Пример 1.
Приготовление гомобифункционального сшивающего агента NH2[OCH2CH2]2ONH2. Гомобифункционалъный сшивающий агент NH2[OCH2CH2]2ONH2
(3-оксопентан-1,5-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) по двухэтапной органической реакции, включающей модифицированную реакцию Габриэля для синтеза первичных аминов (фиг. 3). На первом этапе одна молекула 2,2-хлордиэтилового эфира взаимодействовала с двумя молекулами эндо-^гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в диметилформамиде (ДМФ). Целевой гомобифункциональный продукт приготавливали из полученного интермедиата путем гидразинолиза к этаноле.
Пример 2.
Приготовление гомобифункционального сшивающего агента NH2[OCH2CH2]4ONH2. Гомобифункционалъный сшивающий агент NH2[OCH2CH2]4ONH2
(3,6,9-триоксоундекан-1,11-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) по двухэтапной органической реакции, включающей модифицированную реакцию Габриэля для синтеза первичных аминов (фиг. 3). На первом этапе одна молекула бис-(2-(2-хлорэтокси)-этилового) эфира взаимодействовала с двумя молекулами эндо-N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в диметилформамиде (ДМФ). Целевой гомобифунк-циональный продукт приготавливали из полученного интермедиата путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 3.
Приготовление гомобифункционального сшивающего агента NH2[OCH2CH2]6ONH2. Гомобифункционалъный сшивающий агент NH2[OCH2CH2]6ONH2
/ч. У--. /-Х /О. /\ ,0.
H2N О О О - NH2
(3,6,9,12,15-пентаоксогептадекан-1,17-диоксиамин), содержащий две активные аминооксигруппы, был синтезирован согласно Boturyn et al. (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) по двухэтапной органической реакции, включающей модифицированную реакцию Габриэля для синтеза первичных аминов. На первом этапе одна молекула гексаэтиленгликоля дихлорида взаимодействовала с двумя молекулами эндо-N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимида в диметилформамиде (ДМФ). Целевой гомобифункциональ-ный продукт приготавливали из полученного интермедиата путем гидразинолиза в этаноле.
Пример 4.
Детальный синтез реактива аминоокси-ПСК.
3-оксопентан-1,5-диоксиамин был синтезирован согласно Botyryn et al. (Tetrahedron 1997; 53:548592) двухэтапным способом органического синтеза, описанным в примере 1. Этап 1.
К раствору эндо-^гидрокси-5-норборнен-2, 3-дикарбоксиимида (59,0 г; 1,00 экв.) в 700 мл безводного ^^диметилформамида добавили безводный K2CO3 (45,51 г; 1,00 экв.) и 2,2-дихлордиэтиловый эфир (15,84 мл; 0,41 экв.). Реакционную смесь перемешивали 22 ч при 50°С. Смесь была выпарена досуха под пониженным давлением. Остаток был суспендирован в 2 л дихлорметана и экстрагирован дважды насыщенным раствором NaCl в воде (каждый раз по 1 л). Дихлорметановый слой был высушен над Na2SO4 и выпарен досуха под пониженным давлением, высушен под высоким вакуумом. Было получено 64,5 г желтоватого порошка 3-оксопентан-1,5-диокси-эндо-2',3'-дикарбоксиддимиднорборнена (промежуточный продукт 1).
Этап 2.
К раствору промежуточного продукта 1 (64,25 г; 1,00 экв.) в 800 мл безводного этанола, добавили 31,0 мл гидразингидрата (4,26 экв.). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 2 ч. Концентрация смеси была увеличена путем упаривания раствора до половины исходного объема под пониженным давлением. Выпавший осадок был отфильтрован. Оставшийся этаноловый слой был выпарен досуха под пониженным давлением. Остаток, содержащий сырой продукт 3-оксопентан-1,5-диоксиамина был высушен в вакууме, было получено 46,3 г продукта. Сырой продукт был далее очищен хроматографией на колонке (силикагель 60; изократическое элюирование смесью дихлорметан-метанол, 9/1), было получено 11,7г чистого конечного продукта 3-оксапентан-1,5-диоксиамина.
Пример 5.
Приготовление аминоокси-ПСК.
1000 мг окисленной ПСК (молекулярный вес 20 кДа), полученной из Института сывороток Индии (Пуна, Индия), были растворены в 16 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0. Затем к реакционной смеси добавили 170 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 2 ч при комнатной температуре, добавили 78,5 мг цианоборогидрида натрия, реакцию оставили на ночь на 18 ч. Затем реакци
онная смесь была подвергнута процедуре ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране из регенерированной целлюлозы (Millipore) с порогом фильтрации 5 кДа (50 см2, Millipore). Пример 6.
Приготовление аминоокси-ПСК с использованием этапа хроматографической очистки.
1290 мг окисленной ПСК (ММ=20 кДа), полученной от Института сывороток Индии (Пуна, Индия), растворили в 25 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0 (Буфер А). Затем к реакционной смеси добавили 209 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 1 ч при комнатной температуре добавили 101 мг натрия цианоборогидрида, реакцию выдержали 3 ч. Затем смесь подвергли этапу слабой анионообменной хроматографии на хроматографическом геле Fractogel EMD DEAE 650-М (измерения колонки: ХК26/135). Реакционную смесь разбавили 110 мл буфера А и загрузили в колонку DEAE, предварительно уравновешенную буфером А на скорости потока 1 см/мин. Затем колонку промывали 20 ОК буфера В (20 мМ Hepes, рН 6,0) для удаления свободного 3-оксопентан-1,5-диоксиамина и цианида на скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК затем элюировали ступенчатым градиентом, состоящим из 67% буфера В и 43% буфера С (20 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 7,5). Элюат концентрировали ульт-рафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны 5 кДа из полиэфирсульфона (50 см2, Millipore). Финальный этап диафильтрации проводили против буфера D (20 мМ Hepes, 90 мМ NaCl, pH 7,4). Препарат исследовали аналитически путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего содержания аминооксигрупп (анализ TNBS) для определения степени модифицирования. Помимо этого, определяли полидисперсность и содержание свободных 3-оксопентан-1,5-диоксиамина и цианида.
Пример 7.
Приготовление аминоокси-ПСК без этапа восстановления.
573 мг окисленной ПСК (ММ=20 кДа), полученной от Института сывороток Индии (Пуна, Индия), растворили в 11,3 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0 (Буфер А). Затем к реакционной смеси добавили 94 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После встряхивания в течение 5 ч при комнатной температуре смесь подвергли этапу слабой анионообменной хроматографии на хроматографическом геле Fractogel EMD DEAE 650-М (измерения колонки: ХК16/105). Реакционную смесь разбавили 50 мл буфера А и загрузили в колонку DEAE, предварительно уравновешенную буфером А на скорости потока 1 см/мин. Затем колонку промывали 20 ОК буфера В (20 мМ Hepes, pH 6,0) для удаления свободного 3-оксопентан-1,5-диоксиамина и цианида на скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК затем элюировали ступенчатым градиентом, состоящим из 67% буфера В и 43% буфера С (20 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 7,5). Элюат концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны 5 кДа из полиэфирсульфона (50 см2, Millipore). Финальный этап диафильтрации проводили против буфера D (20 мМ Hepes, 90 мМ NaCl, pH 7,4). Препарат исследовали аналитически путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего содержания аминооксигрупп (анализ TNBS) для определения степени модифицирования. Помимо этого, определяли полидисперсность и содержание свободных 3-оксопентан-1,5-диоксиамина.
Пример 8.
Приготовление аминоокси-ПСК без этапа восстановления в присутствии нуклеофильного катализатора м-толуидина.
573 мг окисленной ПСК (ММ=20 кДа), полученной от Института сывороток Индии (Пуна, Индия), растворяют в 9 мл 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,0 (Буфер А). Затем к этому раствору добавляют 94 мг 3-оксопентан-1,5-диоксиамина. После этого к этой реакционной смеси добавляют 2,3 мл 50 мМ базового раствора м-толуидина. После встряхивания в течение 2 ч при комнатной температуре смесь подвергают этапу слабой анионообменной хроматографии на хроматографическом геле Fractogel EMD DEAE 650-М (измерения колонки: ХК16/105). Реакционную смесь разбавляют 50 мл буфера А и загрузили в колонку DEAE, предварительно уравновешенную буфером А на скорости потока 1 см/мин. Затем колонку промывают 20 ОК буфера В (20 мМ Hepes, рН 6,0) для удаления свободного 3-оксопентан-1,5-диоксиамина и цианида на скорости потока 2 см/мин. Реагент аминоокси-ПСК затем элюируют ступенчатым градиентом, состоящим из 67% буфера В и 43% буфера С (20 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 7,5). Элюат концентрируют ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны 5 кДа из по-лиэфирсульфона (50 см2, Millipore). Финальный этап диафильтрации проводят против буфера D (20 мМ Hepes, 90 мМ NaCl, рН 7,4). Препарат исследуют аналитически путем измерения общей ПСК (анализ с резорцином) и общего содержания аминооксигрупп (анализ TNBS) для определения степени модифицирования. Помимо этого, определяют полидисперсность и содержание свободного 3-оксопентан-1,5-диоксиамина.
Пример 9.
Приготовление реагента аминоокси-ПСК.
Реагент аминоокси-ПСК изготавливался в соответствии с примерами 4-8. После диафильтрации продукт замораживали при -80°С и лиофилизировали. После лиофилизации реагент растворяли в нужном объеме воды и использовали для изготовления конъюгатов ПСК-белок посредством углеводного модифицирования.
Пример 10.
Оценивание эффективности различных альтернативных нуклеофильных катализаторов.
рф-IX был инкубирован с натрия периодатом, реагентом аминоокси-ПСК в стандартных условиях (1 мг/мл рф-IX в 20 мМ L-гистидине, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,0, 5-кратный молярный избыток реагента аминоокси-ПСК, 100 мкМ NaIO4) с использованием различных нуклеофильных катализаторов (анилина, м-толуидина, о-анизидина, м-анизидина, о-аминобензойной кислоты, м-аминобензойной кислоты, п-аминобензойной кислоты, п-аминобензамида, сульфаниловой кислоты/стандартная концентрация: 10 мМ). Реакцию проводили в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливали в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением водного раствора цистеина с конечной концентрацией 1 мМ.
Эффективность спаривания оценивалась способом SDS-PAGE с использованием системы Invitrogen X-cell mini. Образцы метились буфером лития додецилсульфата (LDS) и денатурировались 10 мин при 70°С. Затем образцы наносили на 3-8% гель TRIS-ацетат и снимали при 150 В в течение 60 мин. После этого гель прокрашивали Coomassie.
Образцы дополнительно характеризуют аналитически.
Эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Sho-dex KW 803 в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77).
50 мкл образцов инжектировали неразведенными и элюировали изократически 0,22 мкм фильтрованным раствором 20 мМ NaH2PO4, 50 мМ Na2SO4, рН 6,1 со скоростью потока 0,5 мл/мин. Схему элюи-рования снимали при 280 нм.
Результаты отражены на фиг. 5А-С и 6 (SDS PAGE) и в табл. 2 (результаты SEC-HPLC). Продемонстрирован каталитический эффект различных препаратов. Показано, что при использовании м-толуидина достигаются такие же результаты, как и с анилином.
Таблица 2
нуклеофильные катализаторы
ди-ПСК-
лированный
рф1Х
моно-ПСК-
лированный
рф1Х
свободный рф!Х
без катализаторов
4,5%
24,9%
70, 6%
10 мМ анилин
47, 7%
33, 6%
18,7%
10 мМ м-толуидин
31,4%
40,8%
27,8%
10 мМ о-аминобензойная кислота
30, 9%
38,5%
30,6%
10 мМ м-аминобензойная кислота
27, 6%
38, 0%
34, 4%
10 мМ п-аминобензойная кислота
18, 1%
39,3%
42, 6%
10 мМ о-аминобензамид
15, 9%
38,4%
45,7%
10 мМ сульфаниловая кислота
11,8%
35, 8%
52, 4%
Пример 11.
Полисиалирование рф-IX с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофиль-ного катализатора. Способ 1.
12,3 мг рф-IX растворяли в 6,1 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавили 254 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 6,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (8,8 мл), содержащий окисленный рф-IX, смешивают с 2,46 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавили реактив аминоок-си-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубировали 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный рф-IX удаляли при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавили 15 мл буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Свободный рф-IX элюи-руется при проводимости 12-25 мСм/см, а конъюгат - при 27-45 мСм/см. Проводимость конъюгат
содержащих фракций затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9; и загружали в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировались способом ультрафильт-рации/диафильтрации на центрифужном фильтраторе Vivaspin 15R 10 кДа. Конечный этап диафильтра-ции проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl2. Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-IX. Конъюгат ПСК-рф-IX проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным рф-IX. Способ 2.
12.3 мг рф-IX растворяют в L-гистидиновом буфере, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2) до конечной концентрации белка в 1 мг рф-СС/мл. Добавляют 5 мМ водный раствор периодата натрия до конечной концентрации 100 мкМ и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании при рН 6,0, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина (или иного гасителя) до конечной концентрации 10 мМ. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Полученный ретентат (8,8 мл), содержащий окисленный рф-IX, смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) до конечной концентрации 10 мМ и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют при рН 6,0 в течение 2,5 ч при комнатной температуре; от 0,5 до 18 ч при +4°С) в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный рф-IX удаляют при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавляют достаточными количествами буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюи-руют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Свободный рф-IX элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9; или с использованием антихаотропических солей, таких, как аммония сульфат, аммония ацетат и т.д.) и загружали в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывают 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводят против L-гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl2. Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и хромогенной и коагулирующей активностей Ф-IX. Конъюгат ПСК-рф-IX проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным рф-IX.
Способ 3.
25.4 мг рф-IX растворяли в 18,7 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавили 531 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 5,07 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Затем добавили реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубировали в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 25 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный рф-IX удаляли при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавили 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Свободный рф-IX элюи-ровали при проводимости 12-25 мСм/см, а конъюгат - при 27-45 мСм/см. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9) и загружали в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтраци-ей/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против
гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl2. Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-IX. Конъюгат ПСК-рф-IX проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным рф-IX. Конъюгат дополнительно характеризовали аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803 в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Было показано, что в препарате не содержится свободного Ф-IX. Конъюгат состоял из 57% монополисиалированного и 31% ди-полисиалированного и 12% три-полисиалированного продукта. Способ 4.
25,4 мг рф-IX растворяли в L-гистидиновом буфере, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2) до конечной концентрации белка в 2 мг рф-КУмл. После этого в течение 15 мин добавляли 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавили реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0, смесь инкубировали в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-IX удаляли при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Свободный рф-IX элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали до 190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9; с использованием антихаотропических солей, таких, как аммония ацетат) и загружали в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПСК реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильт-рацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против L-гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl2. Препарат аналитически исследовали измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и хромогенной и коагулирующей активностей Ф-IX. Конъюгат ПСК-рф-IX проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным рф-IX. Конъюгат дополнительно характеризовали аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803 в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Было показано, что в препарате не содержится свободного Ф-IX. Конъюгат состоял из 57% монополисиалированного и 31% ди-полисиалированного и 12% три-полисиалированного продукта.
Пример 12.
Полисиалирование рф-VIII с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклео-фильного катализатора. Способ 1.
50 мг рф-VIII перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавили NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводили при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию остановили цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре. Раствор пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонка была уравновешена 5 ОК буфера А. Затем окисленный рф-VIII был элюирован буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Были собраны фракции, содержащие рф-VIII. Было определено содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М HCl. Затем был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакция спаривания проводилась в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток реактива аминоокси-ПСК удаляли при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси поднимали до 130 мСм/см добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружали в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предвари
тельно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюировали 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирали фракции, содержащие ПСК-рф-VIII и подвергали ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на 30 кДа мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, Millipore). Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и хромо-генной активности Ф-VIII. Конъюгат ПСК-рф-VIII проявлял удельную активность > 70% в сравнении с нативным рф-VIII. Способ 2.
58 мг рекомбинантного фактора VIII (рф-VIII), полученного при процессе ADVATE в буфере Hepes (50 мМ HEPES, ~350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,1% Полисорбата 80, рН 7,4) растворяют в реакционном буфере (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный рф-VIII далее очищают анионообменной хроматографией на EMD TMAE (M) (Merck). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 6,5) до получения проводимости 5 мсм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1,0 М NaCl, рН 7,0). Затем окисленный рф-VIII элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминооксиполисиаловой кислоты (ПСК-ONH^ в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-VIII в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПСК-рф-VIII очищают гидрофобной хроматографией (HIC) с использованием смолы Phenyl Sepharose FF low sub resin (GE Healthcare), заполненной в колонку производства GE Healthcare с высотой слоя (h) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь добавляют аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Hepes, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. Данную смесь загружают в HIC колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Hepes, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата ПСК-рф-VIII в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Hepes, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера. (20 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъю-гата ПСК-рф-VIII отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-VIII от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 30 кДа (88 см2, Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывали путем измерения общего содержания белка, хромогенной активности Ф-VIII и определяли степени полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином). Для полученного конъюгата были определены удельная активность > 50% и степень ПСК > 5,0.
Способ 3.
50 мг рф-VIII перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакция спаривания проводилась в течение 2 ч в темноте при комнатной тем
пературе и при осторожном встряхивании. Затем реакцию остановили цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (конечная концентрация: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси поднимали до 130 мСм/см добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружали в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюировали 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирали фракции, содержащие ПСК-рф-VIII и подвергали ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на 30 кДа мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, Millipore). Препарат был аналитически исследован измерением общего содержания белка (Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-VIII. Конъюгат ПСК-рф-VIII проявлял удельную активность > 70% в сравнении с нативным рф-VIII. Способ 4.
50 мг рекомбинантного фактора VIII (рф-VIII), полученного при процессе ADVATE в 50 мМ буфере Hepes (50 мМ HEPES, ~350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,1% Полисорбата 80, рН 7,4) растворяли в реакционном буфере (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляли к этому раствору рф-VIII в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляли водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец добавляли 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубировали 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании.
Затем реакцию останавливали добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-рф-VIII очищали гидрофобной хроматографией (HIC) с использованием смолы Phenyl Sepharose FF low sub resin (GE Healthcare), заполненной в колонку производства GE Healthcare с высотой слоя (h) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносили аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Hepes, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивали с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводили до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. Данную смесь загружали в HIC колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняли этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняли второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Hepes, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняли элюирование очищенного конъюгата рф-VIII в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Hepes, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПСК-рф-VIII отслеживали на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирали в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводили с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-VIII от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрировали ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 30 кДа
(88 см2, Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывали путем измерения общего содержания белка, хромогенной активности Ф-VIII и определяли степени полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Аналитические данные (среднее 6 последовательных серий):
Выход процесса (Bradford): 58,9%;
Выход процесса (хром. Ф-VIII): 46,4%;
Удельная активность (хром. Ф-\ТП/мг белка): 4148 МЕ/мг;
Удельная активность (% исходного материала): 79,9%;
Степень ПСК (моль/моль): 8,1.
Пример 13.
Пегилирование рф-VIII с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
рф-VIII пегилируют с использованием линейного 20. кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 14,7 мг рф-VIII растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют 296 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (10,9 мл), содержащий окисленный рф-VIII смешивают с 2,94 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив амино-окси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-рф-VIII очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4 содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны 30 кДа (50 см2, Millipore). Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (Coo-massie, Брэдфорд) и хромогенной активности Ф-VIII, ожидается, что конъюгат ПЭГ-рф-VIII будет обладать удельной активностью > 70% относительно нативного рф-VIII.
Способ 2.
рф-VIII пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную массу или концентрацию рф-VIII растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный рф-VIII далее очищают анионообменной хроматографией на EMD ТМАЕ (M) (Merck). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 6,5) до получения проводимости 5 мсм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1,0 М NaCl, рН 7,0). Затем окисленный рф-VIII элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-VIII в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-рф-VIII очищают гидрофобной хроматографией (HIC) с использованием смолы Phenyl Sepharose FF low sub resin (GE Healthcare), заполненной в колонку производства GE Healthcare с высотой слоя (h) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Hepes, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. Данную смесь загружают в HIC колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Hepes, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-VIII в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Hepes, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20
мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПЭГ-рф-VIII отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-VIII от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 30 кДа (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 3.
рф-VIII пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 7,84 мг рф-VIII, растворенного в б мл буфера Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) смешивают с 314 мкл водного раствора периодата натрия (10 мМ) и 1,57 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл 1 М водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-рф-VIII очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4 содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны 30 кДа (88 см2, Millipore). Аналитическая характеризация конъюгата путем определения хромогенной активности Ф-VIII и определения общего содержания белка (Брэдфорд) показала удельную активность в > 60% в сравнении с исходным материалом рф-VIII.
Способ 4.
рф-VIII пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу рф-VIII переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг рф-ЛТП/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до конечной концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описанный выше) до достижения 20-кратного молярного избытка. После доведения рН до 6,0, смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-VIII удаляют при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Свободный рф-VIII элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9; с использованием анти-хаотропических солей, таких, как аммония ацетат, аммония сульфат и т.д.) и загружали в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9). Свободный ПЭГ-реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтраци-ей/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности по известным способам.
Пример 14.
Полисиалирование рф-VIIa с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклео-фильного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию или массу рекомбинантного фактора VIIa (рф-VIIa) переносят или растворяют в реакционном буфере (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 50 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (I M) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный рф-VIIa далее очищают анионообменной хроматографией на EMD TMAE (M) (Merck). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 6,5) до получения проводимости 5 мсм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1,0 M NaCl, pH 7,0). Затем окисленный рф-VIIa элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONEy в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-VIIa в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПСК-рф-VIIa очищают гидрофобной хроматографией (HIC) с использованием смолы Phenyl Sepharose FF low sub resin (GE Healthcare), заполненной в колонку производства GE Healthcare с высотой слоя (h) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь добавляют аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Hepes, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. Данную смесь загружают в HIC колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Hepes, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-VIIa в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Hepes, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПСК-рф-VIIa отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-VIIa от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (например, 10 кДа MWCO, 88 см2, Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 2.
Начальную массу или концентрацию рф-VIIa растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора
NaOH.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONEy в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору рф-VIIa в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 150 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М)
до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-рф-VIIa очищают гидрофобной хроматографией (HIC) с использованием смолы Phenyl Sepharose FF low sub resin (GE Healthcare), заполненной в колонку производства GE Healthcare с высотой слоя (h) 15 см и итоговым объемом колонки (OK) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Hepes, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. Данную смесь загружают в HIC колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Hepes, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-VIIa в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Hepes, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПСК-рф-VIIa отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат собирали в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-VIII от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 15.
Пегилирование рф-IX с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
рф-IX пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную массу или концентрацию рф-IX растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный рф-VIII далее очищают анионообменной хроматографией на EMD TMAE (M) (Merck). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см. Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость потока: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1,0 М NaCl, рН 7,0). Затем окисленный рф-IX элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-IX в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-рф-IX очищают гидрофобной хроматографией (HIC) с использованием смолы Phenyl Sepharose FF low sub resin (GE Healthcare), заполненной в колонку производства GE Healthcare с высотой слоя (h) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Hepes, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. Данную смесь загружают в HIC колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Hepes, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-IX в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Hepes, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПЭГ-рф-IX отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат собирают в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-IX от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 10 кДа (88 см2, Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
рф-IX пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу рф-IX переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг рф-КУмл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до конечной концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описанный выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0, смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-IX удаляют при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Свободный рф-IX элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9; с использованием анти-хаотропических солей, таких, как аммония ацетат и т.д.) и загружали в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9). Свободный аминоокси-ПЭГ реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтраци-ей/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности по известным способам.
Пример 16.
Пегилирование рф-VIIa с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
рф-VIIa пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную массу или концентрацию рф-VIIa растворяют или переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 50 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный рф-VIIa далее очищают анионообменной хроматографией на EMD TMAE (M) (Merck). Смесь разбавляют буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 6,5) до получения проводимости 5 мСм/см.
Полученный раствор загружают в ионообменную колонку (высота слоя: 5,4 см) с объемом колонки 10 мл с использованием скорости потока 1,5 см/мин. Колонку впоследствии промывают (скорость: 1,5 см/мин) 5 ОК смеси 92:8 (м/м) буфера А и буфера В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1,0 М NaCl, pH 7,0). Затем окисленный рф-VIIa элюируют смесью 50:50 (м/м) буфера А и буфера В с постэлюировочным этапом в 5 ОК буфера В. Этапы элюирования проводят со скоростью потока 1,0 см/мин.
После этого реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный рф-VIIa в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-рф-VIIa очищают гидрофобной хроматографией (HIC) с использованием смолы Phenyl Sepharose FF low sub resin (GE Healthcare), заполненной в колонку производства GE Healthcare с высотой слоя (h) 15 см и итоговым объемом колонки (ОК) 81 мл.
В реакционную смесь вносят аммония ацетат добавлением 50 мМ буфера Hepes, содержащего 350 мМ натрия хлорида, 8 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Два объема реакционной смеси смешивают с 1 объемом аммония ацетата, содержащего буферную систему, величину рН доводят до рН 6,9 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора NaOH. Данную смесь загружают в HIC колонку со скоростью потока 1 см/мин, после чего выполняют этап отмывания с использованием > 3 ОК уравновешивающего буфера (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 2,5 М аммония ацетата, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9).
Для удаления побочных продуктов реакции и антихаотропической соли выполняют второй этап отмывания с > 5 ОК отмывочного буфера 1 (50 мМ Hepes, 3 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) в режиме восходящего потока со скоростью потока 2 см/мин. Затем выполняют элюирование очищенного конъюгата рф-VIIa в нисходящем режиме со ступенчатым градиентом 40% отмывочного буфера 2 (50 мМ Hepes, 1,5 М натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9) и 60% элюирующего буфера (20 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5) со скоростью потока 1 см/мин. Элюирование конъюгата ПЭГ-рф-VIIa отслеживают на УФ 280 нм и элюат, содержащий конъюгат, собирают в пределах < 4 ОК. Пост-элюировочный этап проводят с > 3 ОК элюирующего буфера в тех же условиях для отделения мало прореагировавшего и/или немодифицированного рф-VIIa от основного продукта.
Наконец, очищенный конъюгат концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с отсечением молекулярной массы в 10 кДа (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
рф-VIIa пегилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для пегилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу рф-VIIa переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг рф-VIIa/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описанный выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0, смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Свободный рф-VIIa удаляют при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Реакционную смесь разбавили достаточными количествами буфера А (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,5) для корректировки проводимости растворов и величины рН перед загрузкой в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюировали буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 7,5). Свободный рф-VIIa элюировали ступенчатым градиентом с использованием 25% буфера В, что дало проводимость в пределах 12-25 мСм/см в полученной фракции, и конъюгат с использованием ступенчатого градиента 50% буфера В, что дало проводимость в пределах 27-45 мСм/см в конъюгатной фракции. Проводимость конъюгат-содержащей фракции затем поднимали буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9; с использованием анти-хаотропических солей, таких, как аммония ацетат) и загружали в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут; или в аналогичную среду для гидрофобной хроматографии), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, 5 мМ CaCl2, рН 6,9). Свободный ПЭГ-реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюировали 100% буфера Е (50 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией
(УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50
мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7, 5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности по известным способам. Пример 17.
Полисиалирование рф-IX в присутствии о-аминобензойной кислоты. Способ 1.
8,2 мг рф-IX растворяют в 4,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют 82 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 4 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 6 10 кДа для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (6,5 мл), содержащий окисленный рф-IX, смешивают с 1,-64 мл водного раствора о-аминобензойной кислоты (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Дальнейшую очистку конъюгата производят так, как описано здесь. Способ 2.
Был приготовлен раствор 1 мг рф-IX в 0,65 мл натрийфосфатного буфера, рН 6,0, содержащего 5-кратный молярный избыток аминоокси-ПСК реактива с ММ 20 кДа (описан выше). Затем добавляли 333 мкл водного раствора о-аминобензойной кислоты (30 мМ) в качестве нуклеофильного катализатора до конечной концентрации 10 мМ. Последовательно добавляли 20 мкл водного раствора NaIO4 (5 мМ) до конечной концентрации 100 мкМ. Процесс связывания производили в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном встряхивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 мкл 1 М водного раствора цистеина (1 М). Дальнейшую очистку конъюгата производят так, как описано здесь.
Пример 18.
Полисиалирование ЭПО с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофиль-ного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию эритропоэтина (ЭПО) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный ЭПО элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают ЭПО-содержащие фракции. Было определено содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М HCl.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток реактива аминоокси-ПСК удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ЭПО и подвергали ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Номинальный порог отсечения 10 кДа, 50 см2, Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом.
10 мг ЭПО растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). За
тем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный ЭПО, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный ЭПО удаляют при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюи-руют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюируют 100% буфера Е (50 мМ Hepes, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтра-цией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-ЭПО проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным ЭПО. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803 в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободного ЭПО.
Способ 2.
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ЭПО, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ЭПО в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ЭПО, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Эритропоэтин (ЭПО) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Phe-nyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ
Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ЭПО и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Номинальный порог отсечения 10 кДа, 88 см2, Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. 10 мг ЭПО растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию останавливают в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный ЭПО удаляют при помощи анионообменной хроматографии (АЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюи-руют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до -190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюируют 100% буфера Е (50 мМ Hepes, рН 7,4). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтра-цией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-ЭПО проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным ЭПО.
Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803 в описанных ранее условиях (Ko-larich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободного ЭПО.
Способ 4.
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ЭПО в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-ЭПО очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ЭПО и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Номинальный порог отсечения 10 кДа, 88 см2, Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 19.
Полисиалирование Anq-2 с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклео-фильного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию ангиопоэтина-2 (Ang-2) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, гасителя и побочных продуктов, или, альтернативно, пропускают через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный Ang-2 элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают Ang-2-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М HCl по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Ang-2 и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Ангиопоэтин-2 (Ang-2) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Наконец, собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Ang^ и подвергают ультра-фильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Mil-lipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Ang-2 переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный Ang-2 далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Ang-2, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисйаловой кислоты (ПСК-ONH^ в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Ang-2 в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Ang^ далее очищают ионообменной хроматографией.
Фракции, содержащие конъюгат ПСК-Ang-2, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Ангиопоэтин-2 (Ang-2) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Phe-nyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Ang^ и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Ангиопоэтин-2 (Ang-2) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Ang^ и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Ang-2 растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору Ang-2 в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат ПСК-Ang^ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-Ang-2, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 20.
Полисиалирование VEGF с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклео-фильного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновеше
на буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный VEGF элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают VEGF-содержащие фракции. Было определено содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 добавлением по каплям 0,5 М NaOH.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-VEGF и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-VEGF и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
VEGF переносят или растворяют. в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный VEGF далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный VEGF, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный VEGF в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-VEGF далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-VEGF, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентра
ция: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-VEGF и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарак-теризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-VEGF и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Способ 4.
VEGF растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору VEGF в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат VEGF очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-VEGF и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 21.
Полисиалирование ФРЭ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофиль-ного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию фактора роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaC^/рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный ФРЭ элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают ФРЭ-содержащие фракции. Было определено содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М HCl.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРЭ и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Фактора роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФРЭ и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
ФРЭ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют, до. 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРЭ, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРЭ в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ФРЭ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ
натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРЭ и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Фактор роста эпидермиса (ФРЭ) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
ФРЭ растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH^ в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ФРЭ в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат ФРЭ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ФРЭ и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 22.
Полисиалирование ФРН с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофиль-ного катализатора Способ 1.
Начальную концентрацию фактора роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов, или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Затем окисленный ФРН элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают ФРН-содержащие фракции. Было определено содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 капельным добавлением 0,5 М HCl.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония
ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРН и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 1 производят следующим образом. Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию останавливают цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФРН и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
ФРН переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРН, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ФРН, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Phe-nyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7,5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФРН и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготов
ленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном воплощении способ 3 производят следующим образом. Фактор роста нервов (ФРН) переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описана выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Затем собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФРН и подвергают ультра-фильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Mil-lipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
ФРН растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ФРН в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат ФРН очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ФРН и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на мембране, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 23.
Полисиалирование ГРЧ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофиль-ного катализатора. Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
Начальную концентрацию гормона роста человека (ГРЧ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергается ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропускают через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфера А. Окисленный ГРЧ элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Собирают ГРЧ-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Coomassie, Брэдфорд) и доводят его до 1 мг/мл реакционным буфером, и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М HCl по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция
хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащим 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ГРЧ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с исользованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники. ГРЧ переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие ПСК-ГРЧ, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в области техники.
ГРЧ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ГРЧ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ГРЧ в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ГРЧ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в области техники.
Гормон роста человека (ГРЧ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5
мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9) и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepha-rose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ГРЧ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют in vitro способами, известными в области техники. ГРЧ переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Затем собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ГРЧ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в области техники.
ГРЧ растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ГРЧ в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном встряхивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубирюют 60+5 мин.
Полученный конъюгат ГРЧ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ГРЧ, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 24.
Полисиалирование ФНО-альфа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора.
Начальную концентрацию фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный ФНО-альфа элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Собирают ФНО-альфа-содержащие фракции. Было определено содержание белка (Coomassie, Брэдфорд) и оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером, и доведено до рН 6,0 добавлением по каплям 0,5 М HCl.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащим 5 мМ CaCl.2 Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
ФНО-альфа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0), чтобы получить конечную концентрацию белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФНО-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФНО-альфа, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте, при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-ФНО-альфа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином
в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Фактор некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-ФНО-альфа, и подвергают ульт-рафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) на с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
ФНО-альфа растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору ФНО-альфа в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата, чтобы получить концентрацию 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Полученный конъюгат ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-ФНО-альфа, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 25.
Полисиалирование инсулина с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклео-фильного катализатора Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в области техники. Начальную концентрацию инсулина перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный инсулин элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают инсулин-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Coomassie, Брэдфорд) и доводят его до 1 мг/мл реакционным буфером, и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М HCl по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-инсулин и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в области техники. Инсулин переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цисте ином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-инсулин, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в области техники.
Инсулин переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный инсулин, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный инсулин, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-инсулин, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы
внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в области техники.
Инсулин переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ -20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюи-руют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-инсулин, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в области техники.
Инсулин переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaICu (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-инсулин, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в области техники.
Инсулин растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору инсулина в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Полученный конъюгат инсулина очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-инсулин, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 26.
Полисиалирование интерферона-альфа с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию интерферона-альфа перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1
мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеи-ном (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный интерферон-альфа элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают интерферон-альфа-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М HCl по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащего 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-интерферон-альфа и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Интерферон-альфа переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-интерферон-альфа, и подвергают ульт-рафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Интерферон-альфа перенесли или растворили в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 капельным добавлением 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный интерферон-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-гамма, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-интерферон-альфа, собирают и концентрируют ульт-ра/диафильтрацией (УФ/ДФ). с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы
с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore). Способ 3.
Интерферон-альфа переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего добавляют м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepha-rose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-интерферон-альфа, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовы-вают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Интерферон-альфа переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-интерферон-альфа, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 4.
Интерферон-альфа растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору интерферона-альфа в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Полученный конъюгат интерферона-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-интерферон-альфа, и концентрируют способом ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 27.
Полисиалирование интерферона-гамма с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора. Способ 1.
10 мг интерферона-гамма растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и кнкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный интерферон-гамма, смешивают с 2 мл
водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Свободный интерферон-гамма удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элю-ируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали 5 ОК буфером D. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Hepes, pH 6,9). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Mil-lipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-интерферон-гамма проявлял удельную активность > 50% в сравнении с нативным ин-терфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма.
Способ 2.
10 мг интерферона-гамма растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный интерферон-гамма удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элю-ируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, pH 6,9) и загружают в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10. (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Hepes, pH 6,9). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПСК-интерферон-гамма определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма.
Способ 3.
10 мг интерферона-гамма растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный интерферон-гамма удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, pH 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Свободный интерферон-гамма элю-ируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, pH 6,9) и
загружают в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, pH 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Hepes, pH 6,9). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Конъюгат ПСК-интерферон-гамма проявлял удельную активность > 50% в сравнении -с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма Способ 4.
Интерферон-гамма растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплях 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору интерферона-гамма в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22±2°С при осторожном перемешивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубировали 60+5 мин.
Полученный конъюгат интерферона-гамма очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-интерферон-гамма, и концентрируют способом ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 28.
Полисиалирование Г-КСФ с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклео-фильного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию гранулоцит-колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD TMAE (M)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный Г-КСФ элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают Г-КСФ-содержащие фракции. Определяют содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М HCl по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащим 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлю
лозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Гранулоцит-колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных, фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Г-КСФ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Г-КСФ, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Г-КСФ, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании.
Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-Г-КСФ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определения степени полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Гранулоцит-колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеи-ном в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Гранулоцит
колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Г-КСФ, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Способ 4.
Г-КСФ растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору Г-КСФ в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Полученный конъюгат Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-Г-КСФ, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 29.
Полисиалирование Humira с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклео-фильного катализатора. Способ 1.
Начальную концентрацию Humira перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный Humira элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, pH 7,0). Далее собирают Humira -содержащие фракции. Было определено содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем оно было доведено до 1 мг/мл реакционным буфером и доведено до рН 6,0 добавлением по каплям 0,5 М HCl.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащим 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Humira, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Humira переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Потом раствор подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов. Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи ионообменной хроматографии. Собирают фракции, содержащие ПСК-Humira, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 2.
Humira переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный Humira далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Humira, собирают и используют для реакции конъюгации.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Humira, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат ПСК-Humira далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПСК-Humira, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Humira переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Humira, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Humira переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклео-фильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ).
Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной, температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеиномв течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ) и конъюгат далее очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат ПСК-Humira, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Способ 4.
Humira растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору Humira в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Полученный конъюгат Humira очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-Humira, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 30.
Полисиалирование Prolia с использованием аминоокси-ПСК и м-толуидина в качестве нуклеофиль-ного катализатора Способ 1.
Начальную концентрацию Prolia перенесли в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавили до получения концентрации белка 1 мг/мл. К этому раствору добавляют NaIO4 до конечной концентрации 200 мкМ. Окисление проводят при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте, осторожно встряхивая. Затем реакцию гасят цистеином (конечная концентрация: 10 мМ) в течение 60 мин при комнатной температуре.
Затем раствор подвергли ультрафильтрации/диафильтрации на центрифужных фильтраторах Vi-vaspin для удаления избытка периодата, замедлителя и их побочных продуктов или, альтернативно, пропустили через ионообменную колонку с объемом 20 мл (Merck EMD ТМАЕ (М)), которая была уравновешена буфером А (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, рН 7,0). Колонку уравновешивают 5 ОК буфером А. Затем окисленный Prolia элюируют буфером В (20 мМ Hepes, 5 мМ CaCl2, 1 М NaCl, рН 7,0). Далее собирают Prolia -содержащие фракции. Определяют содержание белка (Coomassie, Брэдфорд), затем его доводят до 1 мг/мл реакционным буфером и доводят до рН 6,0 добавлением 0,5 М HCl по каплям.
Был добавлен 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Избыток аминоокси-реагента удаляют при помощи гидрофобной хроматографии. Проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную 80 мл Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes с рН 7,5, содержащим 5 мМ CaCl2. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Prolia, и подвергают ультрафильтра-ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. 10 мг Prolia растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтра
ции/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный Prolia, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Свободный Prolia удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 6,5). Свободный Prolia элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, рН 6,9) и загружают в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, рН 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюируют 100% буфера Е (50 мМ Hepes, рН 6,9). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали уль-трафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа, Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПСК-Prolia определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным Prolia. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77).
Показано, что в препарате не содержится свободный Prolia.
Способ 2.
Prolia переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный Prolia далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Prolia, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH2) в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Prolia в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин при рН 6,0 в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании (концентрация белка: 1 мг/мл).
Полученный конъюгат Prolia далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат Prolia, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Способ 3.
Prolia переносят в реакционный буфер (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и разбавляют до получения концентрации белка 1 мг/мл. Добавляют 50-кратный молярный избыток реактива аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше), после чего был добавлен м-толуидин в качестве нуклеофильного катализатора (конечная концентрация: 10 мМ) и NaIO4 (конечная концентрация: 400 мкМ). Реакцию спаривания проводят в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре и при осторожном встряхивании. Затем реакцию гасят цистеином в течение 60 мин при комнатной температуре (концентрация цистеина: 10 мМ). Затем проводимость реакционной смеси корректируют добавлением буфера, содержащего аммония ацетат (50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 8 М аммония ацетата, рН 6,9), и загружают в колонку, заполненную Phenyl Sepharose FF (GE Healthcare, Фэй-рфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную 50 мМ Hepes, 2,5 М аммония ацетата, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, 0,01% Твин-80, рН 6,9. Затем конъюгат элюируют 50 мМ Hepes, 5 мМ кальция хлорида, рН 7.5. Наконец, собирают фракции, содержащие ПСК-Prolia, и подвергают ульт-рафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содер
жания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. 10 мг Prolia растворяют в 8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПСК с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Свободный Prolia удаляют при помощи катионообменной хроматографии (СЕС). Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 М NaCl, pH 6,5). Свободный Prolia элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Проводимость конъюгат-содержащих фракций затем поднимают до ~190 мСм/см буфером С (50 мМ Hepes, 5 М NaCl, pH 6,9) и загружают в 20 мл колонку HiPrep Butyl FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером D (50 мМ Hepes, 3 М NaCl, pH 6,9). Свободный ПСК-реагент вымывали в 5 ОК буфера D. Затем конъюгат элюируют 100% буфером Е (50 мМ Hepes, pH 6,9). Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПСК-Prolia определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным Prolia. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77).
Показано, что в препарате не содержится свободный Prolia.
Способ 4.
Prolia растворяют или переносят в реакционный буфер (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl.
После этого реактив аминоокси-полисиаловой кислоты (ПСК-ONH^ в 50-кратном молярном избытке добавляют к этому раствору Prolia в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Наконец, добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 400 мкМ.
Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Полученный конъюгат Prolia очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие ПСК-Prolia, и концентрируют способом ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (Millipore).
Конъюгаты, приготовленные по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка, биологической активности, в соответствии со способами, известными в области техники, и определяют степень полисиалирования, измеряя содержание ПСК (анализ с резорцином).
Пример 31.
Полисиалирование других терапевтических белков.
Реакции полисиалирования, которые проводятся в присутствии альтернативных нуклеофильных катализаторов типа м-толуидина или о-аминобензойной кислоты, как описано здесь, могут быть распространены на другие терапевтические белки. К примеру, в различных аспектах изобретения описанные выше реакции полисиалирования или ПЭГилирования с ПСК-аминоокси или ПЭГ-аминоокси реагентами повторяются с терапевтическими белками, такими, как те белки, которые описаны здесь.
Пример 32.
ПЭГилирование ЭПО с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
Эритропоэтин (ЭПО) ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирова-ния, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ЭПО растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и ин
кубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ЭПО, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией (например, Q Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4 содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ЭПО ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 10 мг ЭПО растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильт-рации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный ЭПО, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, pH 7,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники. Для конъюгата ПЭГ-ЭПО определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным ЭПО. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный ЭПО.
Способ 2.
ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония).
ЭПО переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ЭПО, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ЭПО в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ЭПО далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содер
жащие конъюгат ПЭГ-ЭПО, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в области техники.
Способ 3.
ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ЭПО растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ЭПО ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 10 мг ЭПО растворяют в ~8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 7,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep QFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, pH 7,5). Свободный ЭПО элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 7,2, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-ЭПО определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным ЭПО. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный ЭПО.
Способ 4.
ЭПО ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ЭПО переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 2 мг ЭПО/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ЭПО очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ.) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически исследуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам. Пример 33.
ПЭГилирование Ang-2 с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-ле.офильного катализатора. Способ 1.
Ang-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Ang-2 растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Ang-2, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Ang^ очищают ионообменной хроматографией (например, на Q Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Ang-2 ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Ang-2 растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультра-фильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий, окисленный Ang-2, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Ang^ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюа-та, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически оха-рактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Ang-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония).
Ang-2 переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный Ang-2 далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Ang-2, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ- 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Ang-2, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре
(Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Ang^ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-Ang^, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Ang-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Ang-2 растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Ang^ очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Ang-2 ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Ang-2 растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цис-теина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Ang^ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюа-та, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Ang-2 ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Ang-2 переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6.0) до конечной концентрации белка 2 мг Ang-2/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ,
Конъюгат ПЭГ-Ang^ очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам.
После этого свободный Ang-2 удаляют при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъю-гат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ).
Пример 34.
ПЭГилирование VEGF с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
VEGF ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). VEGF растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный VEGF, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-VEGF очищают ионообменной хроматографией (например, на Q Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. VEGF ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). VEGF растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультра-фильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный VEGF, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-VEGF очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюа-та, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически оха-рактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
VEGF ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония).VEGF переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный VEGF далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный VEGF, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный VEGF, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-VEGF далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-VEGF, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молеку
лярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
VEGF ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). VEGF растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминсюкси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-VEGF очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. VEGF ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). VEGF растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цис-теина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-VEGF очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюа-та, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
VEGF ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу VEGF переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг VEGF/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-VEGF очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам. Пример 35.
ПЭГилирование ФРЭ с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15
мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРЭ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают ионообменной хроматографией (например, на Q Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ФРЭ ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультра-фильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРЭ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически оха-рактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРЭ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРЭ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФРЭ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФРЭ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м
толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ФРЭ ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРЭ растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цис-теина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
ФРЭ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ФРЭ переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ФРЭ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФРЭ очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам. Пример 36.
ПЭГилирование ФРН с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРН растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРН, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией (например, на Q-Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH
7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassre, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ФРН ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРН растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультра-фильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФРН, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюа-та, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически оха-рактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРН переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФРН, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФРН, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФРН далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФРН, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРН растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка
(Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ФРН ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФРН растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цис-теина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФРН очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
ФРН ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ФРН переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ФРН/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФРН очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности согласно известным способам. Пример 37.
ПЭГилирование ГРЧ - с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого, типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ГРЧ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией (например, на Q Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано
здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ГРЧ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически оха-рактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ГРЧ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ГРЧ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ГРЧ, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ГРЧ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФРН, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4,
содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники. ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ГРЧ растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором перио-дата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность гормона роста человека (ГРЧ) сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки ГРЧ глико-зилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
ГРЧ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ГРЧ переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ГРЧ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени в 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ГРЧ очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами. Пример 38.
ПЭГилирование ФНО-альфа с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора. Способ 1.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФНО-альфа, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией (например, на Q-Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ
CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминоок-сигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный ФНО-альфа, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФНО-альфа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный ФНО-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный ФНО-альфа, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида/5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной облас
ти техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминоок-сигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ФНО-альфа растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
ФНО-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу ФНО-альфа переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг ФНО-альфа/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-ФНО-альфа очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами. Пример 39.
ПЭГилирование инсулина с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора. Способ 1.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники. Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Инсулин растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный инсулин, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулин очищают ионообменной хроматографией (например, на Q-Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по мень
шей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники. Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sun-bright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Инсулин растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периода-та натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный инсулин, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулин очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования,- содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Инсулин переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию гасят добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный инсулин, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный инсулин, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-инсулин далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-инсулин, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Инсулин растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-инсулин очищают ионообменной хроматографией на Q Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ
натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники. Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sun-bright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Инсулин растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором перио-дата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат инсулина очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ). Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Как описано здесь, аминокислотную последовательность инсулина сначала модифицируют, чтобы внедрить по меньшей мере один сайт гликозилирования. После очистки инсулин гликозилируют in vitro способами, известными в данной области техники.
Инсулин ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) СА серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу инсулина переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг инсулина/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия пе-риодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоок-си-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-инсулин очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами. Пример 40.
ПЭГилирование интерферона-альфа с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора. Способ 1.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный интерферон-альфа, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив амино-окси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией (например, на Q-Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ)
с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный интерферон-альфа, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив амино-окси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Интерферон-альфа переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный интерферон-альфа, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-альфа, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа, собирают и концентрируют ульт-ра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Интерферон-альфа растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Интерферон-альфа ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу интерферона-альфа переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг интерферона-альфа/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании,-затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-интерферон-альфа очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5
мМ CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами. Пример 41.
ПЭГилирование интерферона-гамма с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нуклеофильного катализатора. Способ 1.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 10 мг интерферона-гамма растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный интерферон-гамма, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма очищают ионообменной хроматографией на SP Sepha-rose FF. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, pH 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания
белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-интерферон-гамма определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзи-онной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма. Способ 2.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Интерферон-гамма переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректировали до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 M) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный интерферон-гамма далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный интерферон-гамма, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный интерферон-гамма, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма, собирают и концентрируют ульт-ра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Конъюгат, приготовленный по этой процедуре, аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 3.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 10 мг интерферона-гамма растворяют в ~8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма очищают ионообменной хроматографией на SP-Sepharose FF. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SP FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 6,5). Свободный интерферон-гамма элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-интерферон-гамма определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным интерфероном-гамма. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзи-онной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный интерферон-гамма
Способ 4.
Интерферон-гамма ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу интерферона-гамма переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг интерферона-гамма/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного рас
твора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6, 0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат ПЭГ-интерферон-гамма очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5
мМ CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами. Пример 42.
ПЭГилирование Г-КСФ с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Г-КСФ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией (например, на Q-Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации
(УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomass-ie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Г-КСФ ПЭГи-лируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминоокси-группу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Г-КСФ, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Г-КСФ переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0±0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После
этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30±5 мин при температуре (Т) Т=+22±2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22±2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60±5 мин.
Окисленный Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Г-КСФ, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Г-КСФ, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Г-КСФ далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-Г-КСФ, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Способ 3.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Г-КСФ ПЭГи-лируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминоокси-группу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Г-КСФ растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Г-КСФ очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Г-КСФ ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Г-КСФ переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг Г-КСФ/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат Г-КСФ очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами. Пример 43.
ПЭГилирование Humira с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора Способ 1.
Humira ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Humira растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Humira, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Humira очищают ионообменной хроматографией (например, на Q-Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, pH 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Humira ПЭГи-лируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминоокси-группу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Humira растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Humira, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Humira очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции элюата, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 2.
Humira ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Humira переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 минт.
Окисленный Humira далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Humira, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Humira, в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Humira далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-Humira, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молекулярной массы (Millipore).
Способ 3.
Humira ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Humira растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Humira очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом. Humira ПЭГи-лируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминоокси-группу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Humira растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Humira очищают ионообменной хроматографией. Собирают фракции, содержащие конъюгат, и подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
Способ 4.
Humira ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Humira переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг Humira/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат Humira очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами. Пример 44.
ПЭГилирование Prolia с использованием реактива аминоокси-ПЭГ и м-толуидина в качестве нук-леофильного катализатора. Способ 1.
Prolia ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Prolia растворяют в 7,0 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2). Затем добавляют водный раствор периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение
15 мин при комнатной температуре добавлением 7,5 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат, содержащий окисленный Prolia, затем смешивают с водным раствором м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Prolia очищают ионообменной хроматографией (например, на Q-Sepharose FF). К примеру, 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны с подходящим порогом отсечения по молекулярной массе. Далее препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Coomassie, Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 1 выполняют следующим образом. Prolia ПЭГили-руют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 10 мг рф-IX растворяют в 5 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 100 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и инкубируют реакционную смесь в течение 1 ч в темноте при 4°С и осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 50 мкл 1 М водного раствора цистеина. Потом смесь подвергают ультрафильт-рации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием центрифужных фильтраторов Vivaspin 15R 10 кДА для удаления избытка периодата, гасителя и их побочных продуктов.
Ретентат (приблизительно 7 мл), содержащий окисленный Prolia, смешивают с 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ) и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Эту смесь инкубируют 2,5 ч при комнатной температуре в темноте при осторожном перемешивании.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Prolia очищают ионообменной хроматографией на SP Sepharose FF. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, рН 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SP FF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, рН 6,5). Свободный Prolia элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-Prolia определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным Prolia. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный Prolia.
Способ 2.
Prolia ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Prolia переносят или растворяют в реакционном буфере (например, 50 мМ Hepes, 350 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 1,0+0,25 мг/мл. Затем рН раствора корректируют до 6,0 добавлением по каплям 0,5н. водного раствора HCl. После этого в течение 10 мин добавляют 40 мМ водный раствор натрия периодата до концентрации 200 мкМ. Реакцию окисления проводят в течение 30+5 мин при температуре (Т) Т=+22+2°С. Затем реакцию останавливают добавлением водного раствора L-цистеина (1 М) в течение 15 мин при Т=+22+2°С до конечной концентрации 10 мМ в реакционной смеси и инкубируют 60+5 мин.
Окисленный Prolia далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции элюата, содержащие окисленный Humira, собирают и используют для реакции конъюгации.
Реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа в 50-кратном молярном избытке добавляют к элюату, содержащему очищенный окисленный Prolia в течение максимального периода времени (t) 15 мин при осторожном перемешивании. Затем добавляют водный раствор м-толуидина (50 мМ) в течение 15 мин до конечной концентрации 10 мМ. Реакционную смесь инкубируют 120+10 мин в темноте при температуре (Т) Т=+22+2°С, при осторожном встряхивании.
Полученный конъюгат ПЭГ-Prolia далее очищают ионообменной хроматографией. Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-Prolia, собирают и концентрируют ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы с подходящим отсечением молеку-
лярной массы (Millipore). Способ 3.
Prolia ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). ЭПО растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) и смешивают с водным раствором периодата натрия (10 мМ) и с водным раствором м-толуидина (50 мМ). Затем добавляют аминоокси-реактив до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 8 мкл водного раствора цистеина (1 М).
Наконец, конъюгат ПЭГ-Prolia очищают ионообменной хроматографией на Q-Sepharose FF. 1,5 мг белка/мл геля загружают в колонку, предварительно уравновешенную 50 мМ буфером Hepes, рН 7,4, содержащим 5 мМ CaCl2. Конъюгат элюируют 50 мМ буфером Hepes, содержащим 5 мМ CaCl2 и 500 мМ натрия хлорида, рН 7,4, а затем подвергают ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) с использованием мембраны. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В альтернативном варианте воплощения способ 3 выполняют следующим образом.
Prolia ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). 10 мг Prolia растворяют в ~8 мл гистидинового буфера, рН 6,0 (20 мМ L-гистидина, 150 мМ NaCl). Затем добавляют 200 мкл водного раствора периодата натрия (5 мМ) и 2 мл водного раствора м-толуидина (50 мМ). После этого добавляют реактив аминоокси-ПЭГ с ММ 20 кДа (описан выше) до достижения 5-кратного молярного избытка реактива. Смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 100 мкл 1 М водного раствора цистеина.
Наконец, конъюгат ПЭГ-Prolia очищают ионообменной хроматографией на SP-Sepharose FF. Реакционную смесь разбавляют 20 мл буфера А (50 мМ Hepes, pH 6,5) и загружают в 20 мл колонку HiPrep SPFF 16/10 (GE Healthcare, Фэйрфилд, Коннектикут), предварительно уравновешенную буфером А. Затем колонку элюируют буфером В (50 мМ Hepes, 1 M NaCl, pH 6,5). Свободный Prolia элюируют, промывая колонку 25% буфером В, конъюгат - 50% буфером В. Конъюгат-содержащие фракции концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ). с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против гистидинового буфера, рН 6,9, содержащего 150 мМ NaCl. Препарат аналитически охарактеризовывают путем измерения общего содержания белка (Брэдфорд) и биологической активности в соответствии со способами, известными в данной области техники. Для конъюгата ПЭГ-Prolia определили характерную активность > 50% в сравнении с нативным Prolia. Конъюгат дополнительно характеризуют аналитически эксклюзионной ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Agilent 1200, оснащенной колонкой Shodex KW 803, в описанных ранее условиях (Kolarich et al., Transfusion 2006; 46:1959-77). Показано, что в препарате не содержится свободный Prolia.
Способ 4.
Prolia ПЭГилируют с использованием линейного 20 кДа реактива для ПЭГилирования, содержащего аминооксигруппу. Примером этого типа реактивов служит Sunbright(r) CA серий от NOF (NOF Corp., Токио, Япония). Начальную концентрацию или массу Humira переносят или растворяют в буфере Hepes (50 мМ Hepes, 150 мМ натрия хлорида, 5 мМ кальция хлорида, рН 6,0) до конечной концентрации белка 2 мг Prolia/мл. После этого в течение 15 мин добавляют 5 мМ водный раствор натрия периодата
до концентрации 100 мкМ, затем добавляют 50 мМ водного раствора м-толуидина до получения конечной концентрации в 10 мМ в течение периода времени 30 мин. Затем добавляют реактив аминоок-си-ПЭГ с ММ 20 кДа (описано выше) до достижения 20-кратного молярного избытка реактива. После доведения рН до 6,0 смесь инкубируют в течение 2 ч в темноте при комнатной температуре, при осторожном перемешивании, затем реакцию гасят в течение 15 мин при комнатной температуре добавлением 1 М водного раствора L-цистеина до конечной концентрации 10 мМ.
Конъюгат Prolia очищают при помощи ионообменной хроматографии (IEC). Конъюгат-содержащие фракции элюата концентрировали ультрафильтрацией/диафильтрацией (УФ/ДФ) с использованием 10 кДа мембраны, изготовленной из регенерированной целлюлозы (88 см2, порог отсечения 10 кДа/Millipore). Конечный этап диафильтрации проводили против буфера Hepes (50 мМ Hepes, 5 мМ
CaCl2, рН 7,5).
Препарат аналитически характеризуют измерением общего содержания белка (процедура Брэдфорд и ВСА) и биологической активности известными способами.
Пример 45.
ПЭГилирование терапевтического белка при помощи разветвленного ПЭГ.
ПЭГилирование терапевтического белка согласно изобретению может осуществляться также и с разветвленным или линейным реагентом для ПЭГилирования, который приготовлен из альдегида и подходящего сшивающего агента, содержащего активную аминооксигруппу.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию;
указанный водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG(r), полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пул-лулана, хитозана, гиалуроновой кислоты хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбокси-метил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрило-илморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазе-на, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МРС);
указанный углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO4), тетраацетата свинца (Pb(OAc)4) и перрутената калия (KRuO4);
причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь;
при этом образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, таким как м-толуидин.
2. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые позволяют конъюгацию;
упомянутый терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозу-маба (Prolia);
упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG(r), полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пул-лулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбок-симетил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакро-лоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфа-зена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеино-вым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);
причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь;
причем образование упомянутой оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, который представляет собой м-толуидин.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что величина рН раствора, содержащего исходную концентрацию терапевтического белка от 0,3 до 3,0 мг/мл, доводится до величины от 5,0 до 8,0 перед контактированием с активированным водорастворимым полимером.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка равна 1,0 мг/мл, а рН равен 6,0.
5. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтический белок контактирует с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, причем избыточная концентрация составляет от 1- до 300-молярного избытка.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что избыточная концентрация равна 50-кратному молярному избытку.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что терапевтический белок инкубируют с активированным
водорастворимым полимером в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что условия включают период времени 120 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
9. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация нуклеофильного катализатора составила от 1,0 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что итоговая концентрация нуклеофильного катализатора равна 10 мМ, а условия включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
11. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислитель добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация окислителя составила от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что итоговая концентрация окислителя равна 400 мкМ, а условия включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
13. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгацию водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, натрия метабисульфита (Na2S2O5), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гасителем является L-цистеин.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что L-цистеин добавляют до итоговой концентрации 10 мМ, а условия включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.
16. Способ по п.2, отличающийся тем, что включает:
а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический
белок, до уровня рН от 5,0 до 8,0, при этом концентрация терапевтического белка составляет от 0,3 до 3,0
мг/мл;
б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтиче-
ском белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой кон-
центрации от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; темпе-
ратуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорас-
творимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация со-
ставляет от 1-молярного избытка до 300-молярного избытка, в условиях, включающих период времени
от 0,5 до 24 ч, температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или
без него;
г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному
на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая
концентрация составила от 1 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин;
температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым
полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного
водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтиче-
ского белка, в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при
наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окислен-
ных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем до-
бавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина,
Na2S2O5 (натрия метабисульфита), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, ими-
дазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется, чтобы итоговая концентрация гасителя состави-
ла от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до
37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.
17. Способ по п.2, отличающийся тем, что он включает:
а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический
белок, до уровня рН, равного 6,0, где исходная концентрация терапевтического белка равна 1 мг/мл;
б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтиче-
ском белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой концентрации 400 мкМ, в условиях, которые включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание;
в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорас-
творимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация со-
ставляет 50-молярный избыток, в условиях, включающих период времени 15 мин, температуру 22°С,
отсутствие света и перемешивание;
г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному
на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая
концентрация составила 10 мМ, в условиях, которые включают период времени 15 мин, температуру
22°С, отсутствие света и перемешивание;
д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым
полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного
водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтиче-
ского белка, в условиях, которые включают период времени 2 ч, температуру 22°С, отсутствие света и
перемешивание; и
е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окислен-
ных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем до-
бавления гасителя, представляющего собой L-цистеин, при этом L-цистеин добавляется до итоговой
концентрации в 10 мМ, а условия на шестом этапе включают период времени 60 мин, температуру 22°С,
отсутствие света и перемешивание.
18. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.
19. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПЭГ.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК содержит 10-300 единиц сиаловой кислоты.
21. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-IX.
22. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIIa.
23. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIII.
24. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислителем является натрия периодат (NaIO4).
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что окисленный углеводный фрагмент терапевтического белка расположен в активационном пептиде белка системы свертывания крови.
26. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК подготавливают путем взаимодействия активированного аминооксисшивающего агента с окисленной ПСК;
при этом аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из: а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина формулы
при этом ПСК окислена путем инкубирования с окислителем для образования терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве аминооксисшивающего агента используют 3-оксапентан-1,5-диоксиамин.
28. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве окислителя используют NaIO4.
29. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор вводится в концентрации 150 мМ.
30. Способ по п.2, отличающийся тем, что м-толуидин находится при реакции конъюгирования в концентрации 10 мМ.
31. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап восстановления оксимной связи в конъюгированном терапевтическом белке путем инкубирования конъюгированного терапевтического белка в буфере, содержащем восстановитель, выбранный из группы, состоящей из цианоборогид-рида натрия (NaCNBH3), аскорбиновой кислоты (витамина С) и NaBH3.
32. Способ по п.31, отличающийся тем, что в качестве восстановителя используют цианоборогид-рид натрия (NaCNBH3).
33. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап очистки конъюгированно-го терапевтического белка.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищается способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
27.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), ионообменной хроматографии (IEC), эксклюзионной хроматографии (SEC), аффинной хроматографии и обратно-фазовой хроматографии.
36. Способ по п.35, отличающийся тем, что на хроматографическом этапе загрузки и хроматогра-фическом этапе промывания используют антихаотропическую соль.
37. Способ по п.35, отличающийся тем, что хроматографию выполняют в колонке.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что в колонке содержится хроматографическая смола, выбранная из группы, состоящей из фенил-сефарозы FF и бутил-сефарозы FF.
39. Способ по п.38, отличающийся тем, что в колонке находится слой смолы высотой от 5 до 20 см.
40. Способ по п.39, отличающийся тем, что высота слоя составляет 10 см.
41. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов отмывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин.
42. Способ по п.41, отличающийся тем, что скорость потока составляет 2 см/мин.
43. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от 0,1 до 6,7 см/мин.
44. Способ по п.43, отличающийся тем, что скорость потока составляет 1 см/мин.
45. Способ по п.33, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюги-рованного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).
46. Способ по п.33, отличающийся тем, что итоговая концентрация терапевтического белка составляет от 0,5 до 3 мг/мл.
47. Способ по п.33, отличающийся тем, что терапевтический белок включает 5-11 фрагментов водорастворимого полимера.
48. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищают при помощи хроматографии; при этом на этапе загрузки и на этапе промывки используют антихаотропиче-скую соль; при этом способ включает один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин, и один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин; и дополнительно включает концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультра/диафильтрацией
(УФ/ДФ).
49. Способ по п.48, отличающийся тем, что хроматография является хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC); при этом скорость потока на одном или более этапов промывки равна 2 см/мин; и при этом скорость потока на одном или более этапов элюирования равна 1 см/мин.
50. Модифицированный терапевтический белок, получаемый способом по п.2.
51. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруп-пу, включающий этапы:
а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого
белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацета-
та (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);
б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического
белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в при-
сутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной
связи;
при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG(r), полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, по-лиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, по-лифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
52. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруп-пу, включающий этапы:
а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого
белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацета-
та (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);
б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического
белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в при-
сутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной
связи;
при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозу-маба (Prolia);
при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG(r), полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, по-лиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, по-лифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
53. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразид-ную группу, включающий этапы:
а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого
белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацета-
та (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);
б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтическо-
го белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу в
присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразо-
новой связи;
при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG(r), полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, по-лиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, по-лифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
54. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразид-ную группу, включающий этапы:
а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого
белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацета-
та (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);
б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтическо-
го белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, в
присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразо-
новой связи;
при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозу-маба (Prolia);
при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG(r), полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, по-лиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, по-лифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);
при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.
55. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную ами-нооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активирован-
ным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образова-
ние стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным
аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2
до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водо-
растворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
б) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, вы-
бранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
56. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную ами-нооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активирован-
ным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образо-
вание стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным
аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2
до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водо-
растворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную ами-
нооксигруппу, введенную на этапе а), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образо-
вание стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активиро-
ванным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; темпера-
туру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, вы-
бранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
57. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную ами-нооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активирован-
ным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образо-
вание стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным
аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2
до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водо-
растворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную ами-
нооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают
период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при
перемешивании или без него;
в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, вы-
бранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
58. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную ами-нооксигруппу, изготавливают способом, включающим:
а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активирован-
ным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образо-
вание стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным
аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2
до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водо-
растворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;
б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную ами-
нооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают
период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при
перемешивании или без него;
в) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную ами-
нооксигруппу, введенную на этапе б), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образо-
вание стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активиро-
ванным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; темпера-
туру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;
г) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, вы-
бранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.
59. Способ по п.55, отличающийся тем, что окисленный водорастворимый полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG(r), полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пул-лулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбокси
59.
метил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрило-илморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазе-на, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС), при этом упомянутый водорастворимый полимер окисляется путем инкубирования с окислителем с образованием терминальной альдегидной группы на невосстанавли-вающем конце водорастворимого полимера.
60. Способ по п.59, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.
61. Способ по п.59, отличающийся тем, что окислителем является NaIO4.
62. Способ по п.55, отличающийся тем, что аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из:
а) сшивающего агента 3-оксапентан-1,5-диоксиамина формулы
63. Способ по п.56, отличающийся тем, что восстановитель выбирают из группы, состоящей из натрия цианоборогидрида (NaCNBH3), аскорбиновой кислоты (витамин С) и NaBH3.
64. Способ по п.63, отличающийся тем, что восстановителем является натрия цианоборогидрид (NaCNBH3).
65. Способ по п.57, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы дать итоговую концентрацию от 1,0 до 50 мМ нуклеофильного катализатора.
66. Способ по п.55, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюги-рованного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).
67. Модифицированный терапевтический белок, полученный способом по п.1, где терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia).
68. Модифицированный терапевтический белок по п.67, где белок выбран из группы, состоящей из фактора Ф-VIIa, фактора Ф-VIII и фактора Ф-IX, и где водорастворимый полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полисалициловой кислоты (ПСК).
63.
63.
63.
63.
63.
63.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025738
- 1 -
025738
- 2 -
025738
- 4 -
025738
- 57 -
025738
- 57 -
025738
- 139 -
025738
- 140 -
025738
- 141 -