EA 025732B9 20170929 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/025732 Полный текст описания [**] EA201170490 20090924 Регистрационный номер и дата заявки US61/100,541 20080926 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2009/058169 Номер международной заявки (PCT) WO2010/036771 20100401 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB9 Код вида документа [PDF] eab21709 Номер бюллетеня [GIF] EAB9\00000025\732BS000#(1273:803) Основной чертеж [**] РЕЗИСТЕНТНЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ AHAS-МУТАНТЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Название документа [8] C12N 9/88, [8] C12N 15/60, [8] C12N 15/82, [8] A01H 5/00, [8] A01H 5/10 Индексы МПК [US] Битхэм Питер, [US] Карлсон Дейл, [US] Гоукал Грег, [US] Мак Элвер Джон, [US] Пирс Джеймс, [US] Шопке Кристиан, [US] Сингх Биджай, [US] Уолкер Кит Сведения об авторах [NL] БАСФ АГРОКЕМИКАЛ ПРОДАКТС Б.В. Сведения о патентообладателях [NL] БАСФ АГРОКЕМИКАЛ ПРОДАКТС Б.В. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000025732b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Рекомбинантная или подвергнутая мутагенезу молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот III (AHASLIII) Brassica napus, содержащая замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, причем кодируемый белок AHASL III Brassica napus является резистентным к ингибированию имидазолиноновым гербицидом, где указанный белок AHASL III проявляет синергетический уровень резистентности к ингибированию имидазолиноновым гербицидом по сравнению с аддитивными уровнями белка AHASL III Brassica napus, имеющего единичную мутацию А122Т, и белка AHASL III Brassica napus, имеющего единичную мутацию S653N, причем AHASL III белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21 или ее зрелую форму, где положения 122 и 653 последовательности SEQ ID NO:23 соответствуют положениям 104 и 635 соответственно последовательности SEQ ID NO:21.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:16.

3. Экспрессирующий вектор, содержащий изолированную молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

4. Растение Brassica, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, где растение Brassica является резистентным по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду.

5. Растение Brassica по п.4, выбранное из В. napus, В. rapa и В. juncea.

6. Растение Brassica по п.4, представляющее собой Brassica napus, которое является нетрансгенным.

7. Растение Brassica по п.4, содержащее вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID NO:21.

8. Семя растения Brassica, полученное из растения Brassica по п.4.

9. Семя по п.8, где растение Brassica выбрано из В. napus, В. rapa и В. juncea.

10. Семя по п.9, где растение Brassica представляет собой Brassica napus, которое является нетрансгенным.

11. Семя по п.8, обработанное имидазолиноновым гербицидом.

12. Семя по п.11, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.

13. Семя, полученное из растения Brassica по п.7.

14. Способ борьбы с сорняками, растущими вблизи растения Brassica, где указанный способ включает применение эффективного количества по меньшей мере одного имидазолинонового гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, где растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

15. Способ по п.14, где растение Brassica выбрано из В. juncea, В. napus, В. rapa, В. carinata, В. oleracea и В. nigra.

16. Способ по п.14, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.

17. Способ по п.14, где растение Brassica является нетрансгенным.

18. Способ по п.14, где растением Brassica является Brassica napus.

19. Способ по п.14, где растение Brassica дополнительно содержит вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID NO:21.

20. Растительная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, где растительная клетка является устойчивой по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду.

21. Растительная клетка по п.20, представляющая собой растительную клетку растения Brassica.

22. Растительная клетка по п.20, которая является нетрансгенной клеткой растения Brassica napus.

23. Растительная клетка по п.20, дополнительно содержащая вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL.

24. Способ борьбы с сорняками, включающий контактирование семян растения Brassica, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 перед посевом и/или после предварительного проращивания с имидазолиноновым гербицидом.

25. Способ по п.24, где растение дополнительно содержит вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID NO:21.

26. Способ по п.24, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.

27. Способ идентификации молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в биологическом образце, включающий получение смеси растительного биологического образца (i), содержащего ДНК, и набора праймеров нуклеиновых кислот (ii), включающего по меньшей мере один первый и второй праймер, способный амплифицировать молекулу нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1, где по меньшей мере один из указанных праймеров содержит любую последовательность из SEQ ID NO:1-10; обеспечение взаимодействия смеси компонентов в условиях, которые позволяют в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировать молекулу нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 с использованием первого и второго праймера; и выявление наличия или отсутствия амплифицированной молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1.

28. Способ идентификации молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в биологическом образце, содержащий получение смеси растительного биологического образца (i), содержащего ДНК, и зонда молекулы нуклеиновой кислоты (ii), способного специфично гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1; обеспечение взаимодействия смеси компонентов в условиях, которые позволяют зонду молекулы нуклеиновой кислоты специфично гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1; выявление гибридизации зонда молекулы нуклеиновой кислоты с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в образце, где наличие гибридизации указывает на присутствие указанной молекулы нуклеиновой кислоты AHASL.

29. Рекомбинантная или подвергнутая мутагенезу молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот III (AHASLIII) Brassica, содержащая замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, причем указанный белок AHASL является резистентным к ингибированию имидазолиноновым гербицидом, где указанный белок AHASL проявляет синергетический уровень резистентности к ингибированию имидазолиноновым гербицидом по сравнению с аддитивными уровнями белка AHASL III Brassica, имеющего единичную мутацию А122Т, и белка AHASL III Brassica, имеющего единичную мутацию S653N, причем указанный AHASL III белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21 или ее зрелую форму или последовательность SEQ ID NO:21, дополнительно содержащую консервативную аминокислотную замену, где положения 122 и 653 последовательности SEQ ID NO:23 соответствуют положениям 104 и 635 соответственно последовательности SEQ ID NO:21.

30. Способ борьбы с сорняками, растущими вблизи растения Brassica, где указанный способ включает применение эффективного количества по меньшей мере одного имидазолинонового гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, где растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.29.

31. Способ борьбы с сорняками, включающий контактирование семян растения Brassica, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты по п.29, с имидазолиноновым гербицидом перед посевом и/или после предварительного проращивания.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Рекомбинантная или подвергнутая мутагенезу молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот III (AHASLIII) Brassica napus, содержащая замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, причем кодируемый белок AHASL III Brassica napus является резистентным к ингибированию имидазолиноновым гербицидом, где указанный белок AHASL III проявляет синергетический уровень резистентности к ингибированию имидазолиноновым гербицидом по сравнению с аддитивными уровнями белка AHASL III Brassica napus, имеющего единичную мутацию А122Т, и белка AHASL III Brassica napus, имеющего единичную мутацию S653N, причем AHASL III белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21 или ее зрелую форму, где положения 122 и 653 последовательности SEQ ID NO:23 соответствуют положениям 104 и 635 соответственно последовательности SEQ ID NO:21.

2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:16.

3. Экспрессирующий вектор, содержащий изолированную молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

4. Растение Brassica, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, где растение Brassica является резистентным по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду.

5. Растение Brassica по п.4, выбранное из В. napus, В. rapa и В. juncea.

6. Растение Brassica по п.4, представляющее собой Brassica napus, которое является нетрансгенным.

7. Растение Brassica по п.4, содержащее вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID NO:21.

8. Семя растения Brassica, полученное из растения Brassica по п.4.

9. Семя по п.8, где растение Brassica выбрано из В. napus, В. rapa и В. juncea.

10. Семя по п.9, где растение Brassica представляет собой Brassica napus, которое является нетрансгенным.

11. Семя по п.8, обработанное имидазолиноновым гербицидом.

12. Семя по п.11, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.

13. Семя, полученное из растения Brassica по п.7.

14. Способ борьбы с сорняками, растущими вблизи растения Brassica, где указанный способ включает применение эффективного количества по меньшей мере одного имидазолинонового гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, где растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

15. Способ по п.14, где растение Brassica выбрано из В. juncea, В. napus, В. rapa, В. carinata, В. oleracea и В. nigra.

16. Способ по п.14, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.

17. Способ по п.14, где растение Brassica является нетрансгенным.

18. Способ по п.14, где растением Brassica является Brassica napus.

19. Способ по п.14, где растение Brassica дополнительно содержит вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID NO:21.

20. Растительная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, где растительная клетка является устойчивой по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду.

21. Растительная клетка по п.20, представляющая собой растительную клетку растения Brassica.

22. Растительная клетка по п.20, которая является нетрансгенной клеткой растения Brassica napus.

23. Растительная клетка по п.20, дополнительно содержащая вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL.

24. Способ борьбы с сорняками, включающий контактирование семян растения Brassica, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п.1 перед посевом и/или после предварительного проращивания с имидазолиноновым гербицидом.

25. Способ по п.24, где растение дополнительно содержит вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID NO:21.

26. Способ по п.24, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.

27. Способ идентификации молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в биологическом образце, включающий получение смеси растительного биологического образца (i), содержащего ДНК, и набора праймеров нуклеиновых кислот (ii), включающего по меньшей мере один первый и второй праймер, способный амплифицировать молекулу нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1, где по меньшей мере один из указанных праймеров содержит любую последовательность из SEQ ID NO:1-10; обеспечение взаимодействия смеси компонентов в условиях, которые позволяют в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировать молекулу нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 с использованием первого и второго праймера; и выявление наличия или отсутствия амплифицированной молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1.

28. Способ идентификации молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в биологическом образце, содержащий получение смеси растительного биологического образца (i), содержащего ДНК, и зонда молекулы нуклеиновой кислоты (ii), способного специфично гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1; обеспечение взаимодействия смеси компонентов в условиях, которые позволяют зонду молекулы нуклеиновой кислоты специфично гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1; выявление гибридизации зонда молекулы нуклеиновой кислоты с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в образце, где наличие гибридизации указывает на присутствие указанной молекулы нуклеиновой кислоты AHASL.

29. Рекомбинантная или подвергнутая мутагенезу молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот III (AHASLIII) Brassica, содержащая замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, причем указанный белок AHASL является резистентным к ингибированию имидазолиноновым гербицидом, где указанный белок AHASL проявляет синергетический уровень резистентности к ингибированию имидазолиноновым гербицидом по сравнению с аддитивными уровнями белка AHASL III Brassica, имеющего единичную мутацию А122Т, и белка AHASL III Brassica, имеющего единичную мутацию S653N, причем указанный AHASL III белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21 или ее зрелую форму или последовательность SEQ ID NO:21, дополнительно содержащую консервативную аминокислотную замену, где положения 122 и 653 последовательности SEQ ID NO:23 соответствуют положениям 104 и 635 соответственно последовательности SEQ ID NO:21.

30. Способ борьбы с сорняками, растущими вблизи растения Brassica, где указанный способ включает применение эффективного количества по меньшей мере одного имидазолинонового гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, где растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.29.

31. Способ борьбы с сорняками, включающий контактирование семян растения Brassica, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты по п.29, с имидазолиноновым гербицидом перед посевом и/или после предварительного проращивания.


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
025732
(13) B9
(12) ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(15) Информация об исправлении
Версия исправления: 1 (W1 B1) исправления в формуле: п.19, 21, 22
(48) Дата публикации исправления
2017.09.29, Бюллетень №9'2017
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201170490
(22) Дата подачи заявки
2009.09.24
(51) Int. Cl.
C12N 9/88 (2006.01) C12N15/60 (2006.01) C12N15/82 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01) A01H 5/10 (2006.01)
(31) 61/100,541
(32) 2008.09.26
(33) US
(43) 2011.12.30
(86) PCT/US2009/058169
(87) WO 2010/036771 2010.04.01
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАСФ АГРОКЕМИКАЛ ПРОДАКТС Б.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Битхэм Питер, Карлсон Дейл, Гоукал Грег, Мак Элвер Джон, Пирс Джеймс, Шопке Кристиан, Сингх Биджай, Уолкер Кит (US)
(74) Представитель:
Беляева Е.Н. (BY)
(56) TAN SIYUAN et al., Imidazolinone-tolerant crops: history, current status and future, Pest Manag Sci, 2005, 61, pp. 246-257, особенно с. 248-250 US-A-5767361
KOLKMAN JUDITH M. et al., "Acetohydroxyacid synthase mutations conferring resistanse to imidazolinone or sulfonylurea herbicides in sunflower", Theor Appl Genet, 2004, 109, pp. 1147-1159
LI D. ET Al.: "A mutation at the Ala122 position of acetohydroxyacid synthase (AHAS) located on chromosome 6D of wheat: improved resistance to imidazolinone and a faster assay for marker assisted selection". MOLECULAR BREEDING, vol. 22, 21 March 2008 (2008-03-21), pages 217-225, XP002557654, the whole document
WO-A2-2007005581
TAN S. ET Al.: "IMIDAZOLINONE-TOLERANT CROPS: HISTORY, CURRENT STATUS AND FUTURE''. PEST MANAGEMENT SCIENCE, WILEY & SONS, BOGNOR REGIS, GB, vol. 61, no. 3, 1 January
2005 (2005-01-01), pages 246-257, XP009058795, ISSN:
1526-498X, page 249-250; figure 2; table 2
US-B2-7355098
RAY K. ET Al.: "Mutant acetol actate synthase gene is an efficient in vitro selectable marker for the genetic transformation of Brassica juncea (oil seed mustard)". JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, FISCHER, STUTTGART, DE, vol. 161, no. 9, 20 September 2004 (2004-09-20), pages 1079-1083, XP004955445, ISSN: 0176-1617, the whole document
US-B1-6613963
WO-A2-0125460
BOUTSALIS PETER ET Al.: "Molecular basis of resistance to acetol actate synthase-inhibiting herbicides in Sisymbrium orientale and Brassica tournefortii". PESTICIDE SCIENCE, vol. 55, no. 5, May 1999 (1999-05), pages 507-516, XP002571860, ISSN: 0031-613X, the whole document
HATTORI J. ET Al.: "AN ACETOHYDROXY ACID SYNTHASE MUTANT REVEALS A SINGLE SITE INVOLVED IN MULTIPLE HERBICIDE RESISTANCE".
MOLECULAR AND GENERAL GENETICS, SPRINGER
VERLAG, BERLIN, DE, vol. 246, 1 January 1995 (1995-01-01), pages 419-425, XP002008914, ISSN:
0026-8925, the whole document US-A-5013659
DUGGLEBY ET Al.: "Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase". PLANT
PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY, GAUTHIER-
VILLARS, PARIS, FR, vol. 46, no. 3, 14 January
2008 (2008-01-14), pages 309-324, XP022550175, ISSN:
0981-9428, the whole document WO-A2-2008124495
WO-A1-2009046334 WO-A2-2009031031
(57) Изобретение относится к трансгенным или нетрансгенным растениям с повышенными уровнями устойчивости к AHAS-ингибирующим гербицидам. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим мутанты большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHAS),
к экспрессирующим векторам, к растениям, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие субъединицы AHASL, содержащие одну, две или большее количество мутаций, к растениям, содержащим такие мутантные нуклеиновые кислоты субъединицы AHASL, к способам их получения и применения и к способам борьбы с сорняками.
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка притязает на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 61/100541, поданной 26 сентября 2008 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в виде ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к резистентным к гербицидам растениям Brassica и к новым по-линуклеотидным последовательностям, которые кодируют резистентные к AHAS-ингибирующим гербицидам белки большой субъединицы синтезы ацетогидроксикислот Brassica, семенам таких растений и способам применения таких растений.
Уровень техники
Синтаза ацетогидроксикислот (AHAS; ЕС 4.1.3.18, также известная как ацетолактатсинтаза или ALS) является первым ферментом, который катализирует биохимический синтез, аминокислот с разветвленной цепью, валина, лейцина и изолейцина (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleu-cine", in Plant Amino Acid, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp.227-247). AHAS является местом действия пяти структурно разнообразных семейств гербицидов, включая сульфонилмо-чевины (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626; 'LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161), имидазолиноны (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546), триазолопиримидины (Subramanian and Gerwick (1989) "Inhibition of acetolac-tate synthase by triazolopyrimidines", in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E. eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp.277-288); Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626); и сульфониламинокарбонилтриазолиноны (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626); и N-сульфониламинокарбонилы. Гербициды на основе имидазолинона и сульфонилмочевины широко применяют в современном сельском хозяйстве вследствие их эффективности при очень низких нормах внесения и относительной нетоксичности для животных. Благодаря ингибированию AHAS, такие семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие чувствительных растений, включая многие виды сорняков.
Для того чтобы обеспечить фермерам возможность большей гибкости в применении разных типов и норм внесения гербицидов на основе имидазолинона и сульфонилмочевины, часто требуются большая устойчивость к гербицидам. Также селекционеры растений, которые создают устойчивые к гербицидам сорта, нуждаются в работе с мутантами, которые обеспечивают большую устойчивость к гербицидам, создавая большую гибкость в выборе исходной идиоплазме, которую они используют для создания своих сортов. Для получения таких резистентных к AHAS-ингибирующим гербицидам сортов селекционеры растений нуждаются в создании дополнительных селекционных линий, предпочтительно с повышенной резистентностью к AHAS-ингибирующим гербицидам. Таким образом, необходимы дополнительные резистентные к AHAS-ингибирующим гербицидам селекционные линии и сорта сельскохозяйственных культур, а также способы и композиции для получения и применения резистентных к AHAS-ингибирующим гербицидам селекционных линий и сортов.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белок большой субъединицы (AHASL), содержащий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23.
В другом варианте настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, содержащим изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) Brassica, содержащий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23.
В еще одном варианте настоящее изобретение относится к растениям Brassica, содержащим подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую устойчивый к гербицидам белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) Brassica, содержащий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23.
В следующем варианте настоящее изобретение относится к семенам Brassica, способным продуцировать растение Brassica, содержащее подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) Brassica, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23.
В другом варианте настоящее изобретение относится к емкостям с семенами Brassica, при этом емкость содержит по меньшей мере 10% семян, способных продуцировать растения Brassica, содержащие мутантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок большой субъединицы синтазы ацето-гидроксикислот (AHASL) Brassica, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122
последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способам борьбы с сорняками, растущими рядом с растением Brassica, при этом указанный способ включает в себя применение эффективного количества AHAS-ингибирующего гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, и при этом растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну копию подвергнутой мутагенезу молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей большую субъединицу синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), которая кодирует резистентный к гербициду белок AHASL, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23.
Настоящее изобретение также относится к способу селекции растения Brassica, при этом способ включает в себя: скрещивание первой линии Brassica со второй линией Brassica, где первая линия Bras-sica представляет собой растение Brassica, полученное в результате выращивания из семени мутантной линии Brassica; и получение семян. Такие мутантные линии Brassica включают BnCL120С7, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9278; BnCL131А1, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9279; BnCL140B3, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9402; и BnCL140С7, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9403.
Также предлагаются семена мутантных линий растений Brassica, названных BnCL120C7, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9278; BnCL131А1, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9279; BnCL140B3, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9402; BnCL140С7, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9403; РМ1РМ2/BnCL131А1, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-10321.
Настоящее изобретение также относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) Brassica, имеющий треонин в положении, соответствующем положению 122 последовательности SEQ ID NO:23.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к растениям Brassica, содержащим мутантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) Brassica, имеющий треонин в положении, соответствующем положению 122 последовательности SEQ ID NO:23.
Кроме того, настоящее изобретение относится к семени Brassica, способному продуцировать растение Brassica, содержащее мутантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL) Brassica, имеющий треонин в положении, соответствующем положению 122 последовательности SEQ ID NO:23.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам селекции растения Brassica, при этом способ включает в себя: скрещивание первой линии Brassica со второй линией Brassica, где первая линия Brassica представляет собой растение Brassica, полученное в результате выращивания из семени мутант-ной линии BnCL131A1, образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-9279; и получение семян.
Настоящее изобретение также относится к нетрансгенным растениям Brassica, содержащим подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AHAS, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23.
Также предлагаются способы получения нетрансгенного растения Brassica, которое устойчиво, по меньшей мере, к одному AHAS-ингибирующему гербициду, включающие в себя: (а) введение в клетки растения Brassica олигонуклеотидов для репарации генов с целенаправленной мутацией в гене AHAS, чтобы получить растительные клетки с мутантным геном AHAS, который экспрессирует белок AHAS, который является мутантным в одном или более положениях аминокислот, при этом указанные положения соответствуют положению, выбранному из группы, состоящей из положений А122, R199, Т203, S653 и G654 последовательности SEQ ID NO:23; (b) идентификацию растительной клетки, имеющей по существу нормальный рост по сравнению с соответствующей растительной клеткой дикого типа в присутствии AHAS-ингибирующего гербицида; и (с) регенерацию нетрансгенного устойчивого к гербицидам растения Brassica, имеющего мутантный ген AHAS, из указанной растительной клетки.
Кроме того, предлагаются способы получения семени гибрида F1 Brassica, включающие в себя скрещивание первого растения Brassica, имеющего подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую устойчивый к гербицидам белок большой субъединицы синтазы ацетогидрокси-кислот (AHASL) Brassica, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, со вторым растением Brassica; и получение семян.
Также предлагаются клетки растений, содержащие подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок AHAS, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653
последовательности SEQ ID NO:23.
Также предлагаются способы повышения резистентности к гербицидам растения, включающие в себя скрещивание первого растения Brassica со вторым растением Brassica, при этом первое растение Brassica содержит в своем геноме, по меньшей мере, одну копию подвергнутой мутагенезу молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей большую субъединицу синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), которая кодирует устойчивый к гербицидам белок AHASL, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23; и получение семян в результате такого скрещивания.
Кроме того, предлагаются растения Brassica, которые содержат подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую устойчивый к гербицидам белок AHASL Brassica, содержащий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, и по меньшей мере, одну дополнительную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок.
Кроме того, предлагаются способы борьбы с сорняками, растущими вблизи растения Brassica, при этом способ включает в себя применение эффективного количества, по меньшей мере, одного AHAS-ингибирующего гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, где растение Brassica содержит в своем геноме, по меньшей мере, одну копию первой молекулы нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL, имеющий мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положениям А122 и S653 последовательности SEQ ID NO:23, и по меньшей мере одну вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй резистентный к гербицидам белок AHASL, имеющий мутацию, выбранную из группы, состоящей из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N и их сочетаний.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено схематичное изображение активности AHAS в экстрактах проростков Bras-
sica.
На фиг. 2 представлены результаты анализы опрыскивания гербицидами растений Brassica дикого типа и примера растения Brassica, содержащего мутантную молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
На фиг. 3 показано выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот между молекулами нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению (SEQ ID NOS 11-16, соответственно, в указанном порядке).
На фиг. 4 показано выравнивание аминокислотных последовательностей между белками AHAS согласно настоящему изобретению (SEQ ID NOS 17-21, соответственно, в указанном порядке).
На фиг. 5 показана последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность белка AHASL Arabidopsis thaliana, имеющего аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 5. Последовательность ДНК указана в виде SEQ ID NO:22 и аминокислотная последовательность указана в виде SEQ ID NO:23.
Подробное описание изобретения
Настоящее описание относится к изолированным нуклеотидам, кодирующим мутантные белки син-тазы ацетогидроксикислот (AHAS), из резистентных к AHAS-ингибирующим гербицидам растений и к имеющим к ним отношение способам. В одном варианте изолированные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют белки AHAS, имеющие одну или более аминокислотных замен по сравнению с последовательностью AHAS Brassica napus дикого типа (т.е. немутантной). Описание также относится к рекомбинант-ным векторам, содержащим такие молекулы нуклеиновой кислоты, а также трансгенным растениям, содержащим такие векторы и молекулы нуклеиновой кислоты.
Настоящее описание также относится к нетрансгенным растениям, содержащим мутантную последовательность, кодирующую AHAS, например, подвергнутую мутагенезу последовательность, кодирующую AHAS III, имеющую две или более аминокислотных замен по сравнению с последовательностью дикого типа. Мутантная кодирующая AHAS последовательность может иметь аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 122, и в положении, соответствующем положению 653 в последовательности белка AHAS Arabidopsis (фиг. 5; SEQ ID NO:23). Также предлагаются способы получения таких растений и способы селекции с использованием таких растений.
В некоторых вариантах растения, семена, способы и композиции согласно настоящему изобретению основаны на использовании молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белки AHAS, имеющие мутации, которые приводят к экспрессии белков AHAS, имеющих замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению 122, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 (также иногда называемых в настоящем описании CLB-1). В других вариантах растения, семена, способы и композиции согласно настоящему изобретению основаны на использовании молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белки AHAS, имеющие мутации, которые приводят к экспрессии белков AHAS, имеющих аминокислоту, выбранную из аргинина, глутамина, фенилаланина, тирозина, триптофана, лизина, глицина, гистидина, серина, пролина, глутаминовой кислоты, аспарагино
вой кислоты, цистеина, метионина, лейцина, аспарагина, изолейцина и валина, замещенную в положении, соответствующем положению 122, и аминокислоту, выбранную из аргинина, глутамина, фенилала-нина, тирозина, триптофана, лизина, глицина, гистидина, аланина, пролина, глутаминовой кислоты, ас-парагиновой кислоты, цистеина, метионина, лейцина, треонина, изолейцина и валина, замещенную в положении, соответствующем положению 653.
Также предлагаются способы борьбы с сорняками с использованием трансгенных и нетрансгенных растений, содержащих мутантные последовательности AHAS, которые предлагаются в настоящем изобретении.
Кроме того, изобретение относится к резистентным к гербицидам линиям Brassica, называемым в настоящем описании BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3, BnCL140C7, а также семенам, потомству и их производным, которые получены с использованием способов мутагенеза, которые подробно описаны ниже.
Настоящее изобретение также относится к повышенной устойчивости к гербицидам и способам получения повышенной устойчивости к гербицидам, которая достигается в случае сочетания мутаций AHAS в одной AHAS-кодирующей последовательности. В одном примере растения, сочетающие в себе мутации, соответствующие положениям А122 и S653 последовательности белка AHAS Arabidopsis (фиг. 5; SEQ ID NO:23), проявляют такую повышенную устойчивость к гербицидам. Полученная в результате устойчивость к гербицидам значимо повышена, например, имеет место синергетический эффект, по сравнению с уровнем устойчивости, который наблюдается, когда уровни устойчивости, полученные у растений, содержащих любую одну из мутаций, соответствующих положениям А122 или S653, по отдельности, складывают вместе.
Перед более подробным описанием изобретения сначала будут определены следующие термины.
Определения
"Устойчивое к гербицидам" или "резистентное к гербицидам" растение относится к растению, которое устойчиво или резистентно по меньшей мере к одному AHAS-ингибирующему гербициду на уровне, которое обычно может убивать или ингибировать рост нормального растения или растения дикого типа, у которого нет мутантной молекулы нуклеиновой кислоты AHAS. Под "резистентной к гербицидам молекулой нуклеиновой кислоты AHAS" подразумевают молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую одну или более мутаций, которые приводят к одной или более аминокислотным заменам, по сравнению с немутантным белком AHAS, при этом результатом мутаций является экспрессия резистентного к гербицидам белка AHAS. Под "устойчивым к гербицидам белком AHAS" или "резистентным к гербицидам белком AHAS" подразумевают, что такой белок AHAS обладает более высокой активностью AHAS по сравнению с активностью AHAS белка AHAS дикого типа в присутствии, по меньшей мере, одного гербицида, который, как известно, препятствует проявлению активности AHAS, и при концентрации или уровне гербицида, который, как известно, ингибирует активность AHAS белка AHASL дикого типа. Кроме того, активность AHAS такого устойчивого к гербицидам или резистентного к гербицидам белка AHASL может быть названа в настоящем описании "устойчивой к гербицидам" или "резистентной к гербицидам" активностью AHAS.
Для настоящего изобретения термины "устойчивый к гербицидам" и "резистентный к гербицидам" используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон использования. Подобным образом, термины "устойчивость к гербицидам" и "резистентность к гербицидам" используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон. Подобным образом, термины "резистентный к имидазоли-нонам" и "резистентность к имидазолинонам" используют взаимозаменяемо, и подразумевается, что термины имеют эквивалентное значение и эквивалентный диапазон как и термины "устойчивый к имидазо-линонам" и "устойчивость к имидазолинонам" соответственно. "Резистентность к гербицидам" или "устойчивость к гербицидам" может быть измерена в результате сравнения активности AHAS, полученной в экстрактах клеток из растений, содержащих подвергнутую мутагенезу последовательность AHAS, и из растений, в которых отсутствует подвергнутая мутагенезу последовательность AHAS, в присутствии ингибитора AHAS, такого как имазамокс, с использованием способов, описанных в Singh, et al. Anal. Bi-ochem., (1988), 171:173-179. В одном варианте в случае резистентных или устойчивых растений наблюдают более чем 25% отсутствие ингибирования с применением способов, описанных в публикации Singh с соавторами (1988), при анализе с использованием 100 мкМ имазамокса.
"Изолированная" или "очищенная" молекула нуклеиновой кислоты или белка или его биологически активная часть в значительной степени или, по существу, не содержит компонентов, которые обычно сопровождают или взаимодействуют с молекулой нуклеиновой кислоты или белком и обнаружены в его природном окружении. Таким образом, изолированная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты или белка по существу не содержит другого клеточного вещества или культуральной среды при получения основанными на рекомбинации способами, или по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. В одном варианте "изолированная" нуклеиновая кислота, по существу, не содержит последовательностей (предпочтительно кодирующих белок последовательностей), которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей,
расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого нуклеиновая кислота получена. Например, в различных вариантах изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать меньше, чем примерно 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой нуклеиновая кислота получена. В некоторых вариантах изолированная молекула нуклеиновой кислоты фланкирована природными геномными последовательностями, которые регулируют ее экспрессию в клетке, например, нативный промотор или нативная 3'-нетранслируемая область. Белок, который, по существу, не содержит клеточного материала, включает препараты белка, содержащие менее чем примерно 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (сухой массы) загрязняющего белка. В том случае, когда белок согласно изобретению или его биологически активную часть получают способами на основе рекомбинации, предпочтительно культуральная среда составляет менее чем примерно 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (сухой массы) химических предшественников или химических веществ, отличных от представляющего интерес белка.
Термин "дикий тип" используют по отношению к молекуле нуклеиновой кислоты или белку, которые могут быть найдены в природе, которые отличны от полученных человеком искусственно или в результате мутагенеза. В одном варианте последовательность нуклеиновой кислоты AHAS "дикого типа" относится к последовательности нуклеиновой кислоты BN-02, показанной на фиг. 3. Подобным образом растение Brassica дикого типа относится к растению Brassica, имеющему последовательность нуклеиновой кислоты BN-02, показанную на фиг. 3. Термин также используют по отношению к растениям, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты AHAS BN-02, показанную на фиг. 3. Использование термина "дикий тип" не означает, что при этом обязательно подразумевают, что растение, растительная ткань, растительная клетка или другая клетка-хозяин не содержит рекомбинантной ДНК в своем геноме и/или не обладает признаками резистентности к гербицидам, которые отличаются от признаков резистентности, описанных в настоящей публикации.
"Подвергнутая мутации" молекула или "мутантная молекула" или "подвергнутая мутагенезу" молекула, такая как молекула нуклеиновой кислоты или молекула аминокислоты, относится к молекуле нуклеиновой кислоты или полипептида, имеющей одну или более замен, делеций или трансверсий нуклеиновой кислоты или аминокислот по сравнению с нуклеиновой кислотой или аминокислотой в эквивалентном положении в немутантной молекуле или молекуле дикого типа. Термины относятся к молекуле нуклеиновой кислоты или молекуле полипептида, которая модифицирована по сравнению со своей на-тивной формой или формой дикого типа в результате намеренной обработки человеком и не содержит природных последовательностей.
В используемом в настоящем описании смысле термины "синергия", "синергетический" и их производные, такие как "синергетический эффект", относятся к таким случаям, в которых биологическая активность сочетания двух или более мутантных полипептидов AHAS и/или сочетания мутаций в одной кодирующей последовательности, такой как молекула нуклеиновой кислоты AHAS, кодирующая полипептид AHAS, имеющий мутации в положениях, соответствующих положениям А122 и S653, по меньшей мере, на 10% выше, чем сумма биологических активностей полипептидов AHAS, имеющих отдельные мутации. Биологическая активность полипептидов AHAS может быть измерена посредством сравнения степени повреждения растений, содержащих подвергнутые мутагенезу молекулы согласно настоящему изобретению, с суммарной степенью повреждения растений, содержащих соответствующие мутации, через 15 дней после обработки AHAS-ингибирующим гербицидом, таким как имазамокс.
"Эквивалентное положение" или "соответствующее положение" относится к положению, которое находится в пределах той же самой консервативной области, что и положение эталонной аминокислоты. Например, по отношению к последовательности белка AHAS положения аминокислот, указанные в настоящем описании, соответствуют положениям аминокислот в белке AHASL Arabidopsis thaliana, имеющем аминокислотную последовательность, указанную на фиг. 5 (фиг. 5; SEQ ID NO:23). Если в описании не указано иное, конкретные аминокислотные положения относятся к соответствующему положению такой аминокислоты в полноразмерной аминокислотной последовательности AHASL A. thaliana, указанной на фиг. 5 (SEQ ID NO:23). Кроме того, фактические положения аминокислот могут варьировать в зависимости от того, добавляют или удаляют аминокислоты, например, на N-конце аминокислотной последовательности, однако эквивалентное положение все же можно определить посредством выравнивания с эталонной последовательностью, такой как последовательность на фиг. 5 (SEQ ID NO:23). Таким образом, изобретение охватывает аминокислотные замены в указанном положении или эквивалентном положении (например, в "положении 653 или эквивалентном положении").
"Фрагмент" относится к части нуклеотидной последовательности, кодирующей белок AHASL или к части аминокислотной последовательности белка AHAS согласно изобретению. Фрагмент нуклеотидной последовательности AHASL согласно изобретению может кодировать биологически активную часть белка AHASL или может представлять собой фрагмент, который может быть использован в качестве зонда для гибридизации или праймера ПЦР с использованием описанных ниже способов. Фрагмент полипептида AHAS может охватывать биологически активный фрагмент белка AHAS.
Термин "биологически активные фрагменты и варианты" относится к фрагментам и вариантам при
веденных в качестве примеров молекул нуклеиновой кислоты и полипептидов, которые обладают или кодируют активность AHAS.
Термин "регуляторный элемент" в используемом в настоящем описании смысле относится к нуклеиновой кислоте, которая способна регулировать транскрипцию и/или трансляцию оперативно связанной нуклеиновой кислоты. Регуляторными элементами без ограничения являются промоторы, энхансе-ры, интроны, 5'-UTR и 3'-UTR. Термин "оперативно связанный" относится к функциональной связи между регуляторным элементом и второй нуклеиновой кислотой, при этом последовательность регуляторно-го элемента вовлечена в регуляцию экспрессии второй последовательности нуклеиновой кислоты, например, инициирует и/или опосредует транскрипцию и/или трансляцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. В общем, "оперативно связанные" означает, что последовательности нуклеиновых кислот, которые связаны, являются смежными, и при необходимости связать две кодирующие белок области являются смежными и находятся в одной и той же рамке считывания.
В используемом в настоящем описании смысле термин "трансгенный" относится к любой клетки, ткани, растению, растительной клетке, каллусу, растительной ткани или части растения, которые содержат всю или часть по меньшей мере одной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты.
Молекулы нуклеиновых кислот
В одном аспекте изобретение относится к изолированным молекулам нуклеиновых кислот, родственным последовательностям большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот (AHASL), которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие мутации по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты дикого типа (т.е. природной), из которой они получены, а также к фрагментам таких последовательностей, содержащих такие мутации. Такие изолированные последовательности нуклеиновых кислот включают последовательности, указанные на фиг. 3 и 4. В другом аспекте описание относится к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки AHASL, имеющие мутации по сравнению с белком дикого типа, которые способны обеспечивать устойчивость или повышенные уровни резистентности к AHAS-ингибирующим гербицидам, и к таким мутантным белкам AHASL. В одном варианте, кодирующая последовательность AHASL представляет собой мутантную кодирующую последовательность AHASL Brassica, например, кодирующую последовательность AHAS III Brassica napus, которая содержит две мутации по сравнению с последовательностью дикого типа. В другом варианте изобретение относится к выделению и нуклео-тидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей резистентный к гербицидам белок AHASL III Brassica, из резистентного к гербицидам растения Brassica, которое получено в результате мутагенеза растений Brassica дикого типа.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены из любого источника, такого как растительные или бактериальные источники. В одном варианте молекулы нуклеиновых кислот получают из растительного источника, такого как растение Brassica. Молекулы нуклеиновых кислот, полученные из растения Brassica, могут быть получены из любого вида Brassica, включая В. napus, В. rapa или В. juncea. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть получены из любых кодирующих последовательностей AHAS, таких как AHAS I, AHAS II или AHAS III. В одном варианте молекулы нуклеиновых кислот содержат мутации в последовательности нуклеиновой кислоты в положениях, которые соответствуют последовательностям кодонов для аминокислот в положениях 122 (например, GCT ACT) и/или 653 (например, AGT - AAT) от стартового кодона ATG кодирующей последовательности AHASL. Однако может быть получена любая мутация в положениях, соответствующих положениям аминокислот 122 и 653, входящая в объем настоящего изобретения.
Кроме того, мутации в положениях 122 и 653 последовательности AHAS могут приводить к экспрессии белка AHAS с любой аминокислотой, отличной от аланина, в положении, соответствующем положению 122, или любой аминокислотой, отличной от серина, в положении, соответствующем положению 653. В одном варианте мутации в положениях, соответствующих положениям 122 и 653, могут представлять собой консервативные аминокислотные замены, тогда как в других вариантах замены могут представлять собой консервативные замены треонина или аспарагина в положениях 122 и 653, соответственно. В другом варианте мутации в положении, соответствующем положению 122, приводят к экспрессии аминокислоты в таком положении, выбранной из группы, состоящей из треонина и валина. В другом варианте мутации в положении, соответствующем положению 653, приводят к экспрессии аминокислоты аспарагина. В одном варианте белки AHAS, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот согласно изобретению, содержат замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 (например, S653N) гена AHASL (на основании нумерации для Arabidopsis thaliana) и замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению 122 (например, А122Т). Однако может быть получена любая аминокислотная замена, включая консервативные аминокислотные замены, в таких положениях в рамках объема настоящего изобретения. Изобретение, кроме того, относится к выделению и нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AHASL Bras-sica дикого типа.
В некоторых вариантах молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению коди
руют белки AHAS, имеющие мутации, которые приводят к экспрессии белков AHAS, имеющих замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению 122, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653. В других вариантах молекулы нуклеиновых кислот кодируют белки AHAS, имеющие мутации, которые приводят к экспрессии белков AHAS, имеющих аминокислоту, выбранную из аргинина, глутамина, фенилаланина, тирозина, триптофана, лизина, глицина, ги-стидина, серина, пролина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, цистеина, метионина, лейцина, аспарагина, изолейцина и валина, в качестве заменяющих аминокислот в положении, соответствующем положению 122, и аминокислоту, выбранную из аргинина, глутамина, фенилаланина, тирозина, триптофана, лизина, глицина, гистидина, аланина, пролина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, цистеина, метионина, лейцина, треонина, изолейцина и валина, в качестве заменяющей аминокислоты в положении, соответствующем положению 653.
Подвергнутые мутагенезу последовательности полипептида AHAS согласно настоящему изобретению могут проявлять резистентность или устойчивость к любому AHAS-ингибирующему гербициду. Такие подвергнутые мутагенезу последовательности полипептида AHAS могут быть резистентными или устойчивыми, по меньшей мере, к одному AHAS-ингибирующему гербициду. В одном варианте подвергнутые мутагенезу последовательности полипептида AHAS согласно настоящему изобретению проявляют резистентность или устойчивость к AHAS-ингибирующему гербициду, выбранному из группы, состоящей из имидизолиноновых гербицидов и сульфонилмочевинных гербицидов. В другом варианте подвергнутые мутагенезу последовательности полипептида AHAS согласно настоящему изобретению проявляют резистентность или устойчивость к имидизолиноновым гербицидам.
В некоторых вариантах подвергнутые мутагенезу последовательности AHAS, имеющие мутации в положениях, соответствующих положениям А122 и S653, обеспечивают синергетические уровни устойчивости к гербицидам. В одном варианте уровни устойчивости к гербицидам, полученные у растений, содержащих последовательность AHAS с двойной мутацией согласно настоящему изобретению, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или больше выше, чем аддитивные уровни устойчивости, наблюдаемые у растений, содержащих последовательность AHAS, имеющую соответствующую отдельную мутацию. Такие синергетические уровни гербицидной устойчивости также могут быть получены у растений, имеющих подвергнутые мутагенезу последовательности AHAS, содержащие мутации в положениях аминокислот, соответствующих положениям А122 и S653, в сочетании с одной или более дополнительными подвергнутыми мутагенезу или рекомбинантными последовательностями AHAS, кодирующими устойчивый к AHAS-ингибиторам белок AHAS.
Также описаны мутантные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белок AHAS III В. Napus, имеющий замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению 122 (А122Т). В одном варианте такие молекулы нуклеиновых кислот также содержат вторую мутацию в последовательности нуклеиновой кислоты, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению 653 (S653N).
В описании также предлагаются изолированные молекулы нуклеиновых кислот, имеющие последовательности нуклеиновых кислот BN02-120 или BN02-131, которые представлены на фиг. 3 и 4, а также их фрагменты и варианты.
В описании также предлагаются изолированные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки AHASL Brassica, имеющие одну или более замен в нуклеиновой кислоте, которые приводят к экспрессии белка AHAS, имеющего одну или более аминокислотных замен. Например, изобретение относится к изолированным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим: нуклеотидную последовательность BN02-120 или BN02-131, представленные на фиг. 3 и 4, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок AHASL, содержащий аминокислотную последовательность, которая названа BN02-102 или BN02-131, представленную на фиг. 4, нуклеотидные последовательности, представленные на фиг. 3, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок AHASL, содержащий аминокислотную последовательность, указанную как BN02-120 или BN02-131 на фиг. 4, и фрагменты и варианты таких нуклео-тидных последовательностей, которые кодируют функциональные белки AHASL.
Подвергнутые мутагенезу последовательности AHAS согласно настоящему изобретению включают в себя последовательности, имеющие любое количество мутаций в дополнение к мутациям, соответствующим положениям 122 и/или 653. Например, подвергнутая мутагенезу последовательность AHAS может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше дополнительных мутаций, которые могут либо представлять собой молчащие мутации, либо обеспечивать резистентность или устойчивость к тому же самому или к другим классам AHAS-ингибирующих гербицидов.
В другом варианте настоящее изобретение относится к изолированным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности, показанные на фиг. 3 и 4, а также их фрагментам и вариантам, которые кодируют полипептиды, обладающие активностью AHAS. Кроме того, предлагаются полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, описанной в настоящей публикации, например, нуклеотидными последовательностями, указанными на фиг. 3 и 4 (обозначенными BN02-120 или BN02-131), и их фрагментами и вариантами, которые кодируют полипептиды, обладаю
щие активностью AHAS.
Настоящее изобретение также относится к белкам AHASL с аминокислотными заменами в указанных положениях аминокислот в консервативных областях белков AHASL Brassica, описанным в настоящей публикации.
Изобретение охватывает композиции изолированных или в значительной степени очищенных нуклеиновых кислот или белков.
Настоящее изобретение относится к изолированным полипептидам, включающим в себя мутантные белки AHAS. Изолированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности BN02-120 или BN02-131, указанной на фиг. 4, аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью BN02-120 или BN02-131, указанной на фиг. 3, аминокислотной последовательности и функциональных фрагментов и вариантов указанных аминокислотных последовательностей, которые кодируют полипептид AHAS, обладающий активностью AHAS.
Описанные молекулы нуклеиновых кислот можно использовать в конструкциях нуклеиновых кислот для трансформации растений, например, культурных растений, таких как растения Brassica. В одном варианте такие конструкции нуклеиновых кислот, содержащие молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, можно применять для получения трансгенных растений, чтобы обеспечить резистентность к гербицидам, таким как гербициды, которые, как известно, ингибируют активность AHAS, таким как имидазолиноновые гербициды. Конструкции нуклеиновых кислот можно использовать в кассетах экспрессии, экспрессирующих векторах, векторах для трансформации, плазмидах и тому подобном. Трансгенные растения, полученные после трансформации такими конструкциями, проявляют повышенную резистентность к AHAS-ингибирующим гербицидам, таким как, например, имидазолино-новые и сульфонилмочевинные гербициды.
Таким образом, настоящее изобретение охватывает молекулы нуклеиновых кислот AHASL и их фрагменты и варианты. Молекулы нуклеиновых кислот, которые представляют собой фрагменты таких нуклеотидных последовательностей, также входят в объем настоящего изобретения. В одном варианте фрагмент содержит по меньшей мере одну мутантную последовательность по сравнению с соответствующей последовательностью из последовательности дикого типа. Биологически активная часть белка AHAS может быть получена выделением части одной из нуклеотидных последовательностей AHAS согласно изобретению, экспрессирующей кодируемую часть белка AHAS (например, в результате основанной на рекомбинации экспрессии in vitro), и оценкой активности кодируемой части белка AHAS. Молекулы нуклеиновой кислоты, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности AHAS, содержат, по меньшей мере, примерно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или 900 нуклеотидов или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в полноразмерной нуклеотидной последовательности, описанной в настоящей публикации, в зависимости от предполагаемого применения.
Фрагмент нуклеотидной последовательности AHAS, который кодирует биологически активную часть белка AHAS согласно изобретению, будет кодировать, по меньшей мере, примерно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 или 250 следующих друг за другом аминокислот или вплоть до общего количества аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке AHAS согласно изобретению. Фрагменты нуклеотидной последовательности AHAS, которые применимы в качестве зондов для гибридизации, для ПЦР-праймеров, обычно не обязательно кодируют биологически активную часть белка AHAS. В одном варианте фрагменты последовательности AHAS включают в себя одну или более мутаций, описанных в настоящей публикации.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые являются вариантами нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящей публикации, также входят в объем настоящего изобретения. К "вариантам" нук-леотидных последовательностей AHAS согласно изобретению относятся последовательности, которые кодируют белки AHAS, описанные в настоящей публикации, но которые имеют консервативные отличия вследствие вырожденности генетического кода. Такие встречающиеся в природе аллельные варианты могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и способы гибридизации, которые описаны ниже. Варианты нуклеотидных последовательностей также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, которые были созданы, например, с использованием сайт-специфичного мутагенеза, но которые все еще кодируют белок AHAS, раскрытый в настоящем изобретении, как обсуждается ниже. Обычно варианты нуклеотидных последовательностей согласно изобретению будут, по меньшей мере, примерно на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны конкретной нуклеотидной последовательности, раскрытой в настоящем описании. Вариант нуклеотидной последовательности AHAS будет, соответственно, кодировать белок AHAS, который имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности белка AHAS, раскрытого в настоящем описании.
Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что изменения могут быть введены в ре
зультате мутации в нуклеотидные последовательности согласно изобретению, с получением таким образом изменений в аминокислотной последовательности кодируемых белков AHAS без изменения биологической активности белков AHAS. Таким образом, изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AHAS, имеющий последовательность, которая отличается от последовательности BN02-120 или BN02-131, указанной на фиг. 3, может быть создана введением одной или более нуклео-тидных замен, добавлений или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, описанную в настоящей публикации, так что одна или более аминокислотных замен, добавлений или делеций вводится в кодируемый белок. Мутации могут быть введены стандартными способами, такими как сайт-специфичный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез и способами, описанными в настоящей публикации. Такие варианты нуклеотидных последовательностей также входят в объем настоящего изобретения.
Например, в одном варианте консервативные аминокислотные замены могут быть осуществлены в одном или более вычисленных несущественных аминокислотных остатках. "Несущественным" аминокислотным остатком является остаток, который может быть изменен по сравнению с последовательностью дикого типа белка AHAS (например, последовательностью, показанной на фиг. 5 (SEQ ID NO:23)) без изменения биологической активности, тогда как "существенный" аминокислотный остаток необходим для биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, в случае которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Такие семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глу-таминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глута-мин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фени-лаланин, триптофан, гистидин). Такие замены не могут быть осуществлены в случае консервативных аминокислотных остатков или в случае аминокислотных остатков, находящихся в консервативном мотиве.
Белки согласно изобретению могут быть изменены различными путями, включая аминокислотные замены, делеции и инсерции. Способы таких обработок, в общем, известны в данной области. Например, варианты аминокислотных последовательностей белков AHAS могут быть получены в результате мутаций в ДНК. Способы мутагенеза и изменений нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области. См., например, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; патент США № 4873192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) и приведенные в указанных публикациях ссылки. Инструкции по поводу соответствующих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес белка, можно найти в описании модели Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включенном в настоящее описание в виде ссылки.
Предпочтительными могут быть консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные свойства.
Альтернативно варианты нуклеотидных последовательностей AHAS могут быть получены в результате случайного введения мутаций на протяжении всей или части кодирующей последовательности AHAS, например, с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу в отношении активности AHAS, чтобы идентифицировать мутанты, которые сохраняют активность AHAS, включая резистентную к гербицидам активность AHAS. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован рекомбинантно, и активность белка может быть определена стандартными способами анализа.
Таким образом, нуклеотидные последовательности согласно изобретению включают последовательности, раскрытые в настоящем описании, а также их фрагменты и варианты. Нуклеотидные последовательности AHASL согласно изобретению и их фрагменты и варианты могут быть использованы в качестве зондов и/или праймеров. Такие зонды могут быть использованы для выявления транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих одинаковые или идентичные белки.
Таким образом, способы, такие как ПЦР, гибридизация и тому подобные, могут быть использованы для идентификации таких последовательностей, имеющих значительную идентичность с последовательностями согласно изобретению. См., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) и Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). Нуклеотидные последовательности AHASL, выделенные на основе идентичности их последовательности с нуклеотидными последовательностями AHAS, указанными в настоящем описании, или их фрагменты и варианты входят в объем настоящего изобретения.
В способе гибридизации вся или часть известной нуклеотидной последовательности AHAS может
быть использована для скрининга библиотек кДНК или геномных библиотек. Способы конструирования таких библиотек кДНК и геномных библиотек, в общем, известны в данной области и описаны в Sam-brook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Зонды для гибридизации могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и их можно метить регистрируемой группой, такой как 32Р или любым другим регистрируемым маркером, таким как другие радиоизотопы, флуоресцирующее соединение, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены мечением синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной нуклеотидной последовательностью AHAS, описанной в настоящей публикации. Кроме того, могут быть использованы вырожденные праймеры, сконструированные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в известной нуклеотидной последовательности AHAS или кодируемой аминокислотной последовательности. Зонд обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях, по меньшей мере, примерно с 12, предпочтительно примерно с 25, более предпочтительно примерно с 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800 или 900 следующих друг за другом нуклеотидов нуклеотидной последовательности AHAS согласно изобретению или ее фрагмента или варианта. Получение зондов для гибридизации в общем известно в данной области и описано в публикации Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), включенной в настоящее описание в виде ссылки.
Например, полная мутантная последовательность нуклеиновой кислоты AHAS, описанная в настоящей публикации, или одна или более из ее частей могут быть использованы в качестве зонда, способного специфично гибридизоваться с соответствующими последовательностями AHAS и матричными РНК. Способы гибридизации включают основанный на гибридизации скрининг посеянных на чашках библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; см., например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Гибридизацию таких последовательностей можно осуществлять в определенных условиях жесткости. Под "условиями жесткости" или "условиями жесткости гибридизации" подразумевают условия, в которых зонд будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью в регистрируемой более высокой степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере, в 2 раза выше фона). Условия жесткости зависят от последовательности, и будут отличаться в разных случаях.
Обычно условия жесткости могут представлять собой условия, при которых концентрация соли меньше, чем примерно 1,5 М иона Na, обычно концентрация составляет примерно от 0,01 до 1,0 М ионов Na (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, и температура составляет, по меньшей мере, примерно 30°С в случае коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, примерно 60°С в случае длинных зондов (например, больше 50 нуклеотидов). Условий жесткости также можно достичь с помощью добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Примеры условий низкой жесткости включают гибридизацию с использованием буферного раствора, содержащего от 30 до 35% форма-мида, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия), при 37°С и промывку в 1Х-2Х SSC (20X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M цитрат тринатрия) при 50-55°С. Примеры условий умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°С и промывку в 0,5Х-1Х SSC при 55-60°. Примеры условий высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°С и промывку в 0,1Х SSC при 60-65°С. Необязательно буферы для промывки содержат примерно от 0,1% до примерно 1% SDS. Продолжительность гибридизации обычно составляет менее чем примерно 24 часа, обычно примерно от 4 до примерно 12 ч.
Специфичность обычно зависит от промывок после гибридизации, при этом решающими факторами являются ионная сила и температура конечного раствора для промывки. В случае гибридов ДНК-ДНК Tm может быть аппроксимирована из уравнения, описанного в публикации Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC)-0,61 (% form) - 500/L; где М означает молярность одновалентных катионов, %GC означает процентное содержание гуанозиновых и цитозино-вых нуклеотидов в ДНК, % form означает процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и L означает длину гибрида в парах нуклеотидов. Tm означает температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной последовательности-мишени гибридизуется с идеально совпадающим зондом. Tm снижают примерно на 1°С для каждого 1% ошибочных спариваний; таким образом, Tm, условия гибридизации и/или промывки можно корректировать для последовательностей, имеющих требуемую идентичность. Например, если необходимо найти последовательности с > 90% идентичностью, то Tm может быть снижена на 10°С. Обычно условия жесткости выбирают так, чтобы температура была на 5°С ниже, чем температура точки плавления (Tm) для конкретной последовательности и ее комплемента при определенной ионной силе и рН. Однако при очень жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем температура точки плавления (Tm); в случае умеренно жестких условий можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем температура точки плавления (Tm) ; в случае условий низкой жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем температура точки плавления (Tm). При использовании уравнения, со
ставов для гибридизации и промывки и требуемой Tm специалистам в данной области будет понятно, что варианты жесткости растворов для гибридизации и/или промывки, по сути, описаны. Если требуемая степень ошибочного спаривания приводит к Tm менее чем 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор формамида), то предпочтительно увеличить концентрацию SSC так, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Всестороннее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено в публикации Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); и Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). См. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).
Молекулы нуклеиновых кислот и белки согласно изобретению охватывают молекулы нуклеиновых кислот и белки, содержащие нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая в достаточной степени идентична нуклеотидной последовательности BN02-120 или BN02-131, указанной на фиг. 3 и 4. Термин "в значительной степени идентичный" используют в настоящем описании по отношению к первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая содержит достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью) аминокислотных остатков или нуклеотидов по сравнению со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью, так что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности имеют общий структурный домен и/или обладают общей функциональной активностью. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, которые содержат общий структурный домен, имеющие, по меньшей мере, примерно 45%, 55% или 65% идентичность, предпочтительно 75% идентичность, более предпочтительно 85%, 95% или 98% идентичность, определяют в настоящем описании как идентичные в достаточной степени.
Чтобы определить идентичность в процентах двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения. Идентичность в процентах между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, имеющихся в последовательностях (т.е. идентичность в процентах = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений) х 100). В одном варианте две последовательности имеют одинаковую длину. Идентичность в процентах между двумя последовательностями может быть определена с помощью способов, подобных способам, описанным ниже, с учетом или без учета пробелов. При расчете идентичности в процентах обычно подсчитывают точные совпадения.
Определение идентичности в процентах между двумя последовательностями можно осуществить, используя математический алгоритм. Предпочтительным не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм, описанный в публикации Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, модифицированный, как описано в Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Поиски нуклеотидов BLAST могут быть осуществлены с использованием программы NBLAST, счет = 100, длина слова = 12, чтобы получить нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам нуклеиновых кислот согласно изобретению. Поиски белков BLAST могут быть осуществлены с использованием программы XBLAST, счет = 50, длина слова = 3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам белков согласно изобретению. Чтобы получить выравнивания с пробелами в целях сравнения, можно использовать Gapped BLAST, который описан в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389.
Альтернативно можно использовать PSI-Blast, чтобы осуществить итерационный поиск, который позволяет выявлять отдаленные взаимосвязи между молекулами. См. Altschul et al. (1997) выше. В случае применения программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм, описанный в Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета компьютерных программ для выравнивания последовательностей GCG. В случае применения программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать матрицу весов остатков РАМ120, штраф за длину пробела 12 и штраф за пробел 4. Выравнивание также можно осуществлять вручную с помощью просмотра.
Если не указано иное, значения идентичности/сходства последовательностей, приведенные в настоящем описании, относятся к значению, полученному с использованием полноразмерных последовательностей согласно изобретению и с использованием множественного выравнивания с помощью алгоритма Clustal W (Nucleic Acid Research, 22(22):4673-4680, 1994), с применением программы AlignX, входящей в пакет компьютерных программ Vector NTI Advance 10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с параметрами по умолчанию; или любой эквивалентной программы. Под "эквивалентной программой" подразумевают любую программу для сравнения последовательностей, которая в случае любых двух рассматриваемых последовательностей осуществляет выравнивание, дающее идентичные совпадения нуклеоти
дов или аминокислотных остатков и одинаковую идентичность последовательностей в процентах в сравнении с соответствующим выравниванием, осуществляемым с помощью AlignX, входящей в пакет компьютерных программ Vector NTI Advance 10.
Мутантные белки AHASL согласно изобретению охватывают описанные белки, а также их варианты и модифицированные формы. Такие варианты продолжают обладать требуемой мутантной активностью AHAS. В одном варианте такие мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующие вариант белка, не должны выводить последовательность из рамки считывания и предпочтительно не будут создавать комплементарные области, которые могут вызывать образование вторичной структуры мРНК. См. заявку на выдачу патента ЕР № 75444.
В одном варианте последовательности согласно настоящему изобретению кодируют белки, обладающие активностью AHAS. Такую активность можно оценить в результате скрининга активности AHAS, например, как описано в публикации Singh с соавторами (1988) Anal. Biochem. 171:173-179, включенной в настоящее описание в виде ссылки.
Варианты нуклеотидной последовательности и белки также охватывают последовательности и белки, полученные с помощью способов мутагенеза и рекомбинации, таких как перетасовка ДНК. В случае такого способа одну или более разных кодирующих последовательностей AHASL можно подвергнуть обработки, чтобы создать новый белок AHASL, обладающий требуемыми свойствами. Таким образом создают библиотеки рекомбинантных нуклеиновых кислот из популяции родственных последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих области последовательности, которые обладают значимой идентичностью последовательностей и могут быть подвергнуты гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с использованием указанного способа мотивы последовательности, кодирующие представляющий интерес домен, могут быть перетасованы между геном AHASL согласно изобретению и другими известными генами AHASL, чтобы получить новый ген, кодирующий белок с улучшенным представляющим интерес свойством, таким как повышенный Km в случае фермента. Методики такой перетасовки ДНК известны в данной области. См., например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; и патенты США № 5605793 и 5837458.
Нуклеотидные последовательности согласно изобретению могут быть использованы для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, в частности, из других растений, более конкретно других двудольных растений. Таким образом, способы, такие как ПЦР, гибридизация и тому подобные, могут быть использованы для идентификации таких последовательностей на основе гомологии их последовательностей с последовательностями, указанными в настоящем описании. Последовательности, выделенные на основе идентичности их последовательностей с полными последовательностями AHASL, указанными в настоящем описании, или с их фрагментами, входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, изолированные последовательности, которые кодируют белок AHASL и которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностью, описанной в настоящей публикации, или с ее фрагментами, входят в объем настоящего изобретения.
В случае применения способа ПЦР могут быть сконструированы олигонуклеотидные праймеры для использования в реакциях ПЦР, чтобы амплифицировать соответствующие последовательности ДНК из кДНК или геномной ДНК, экстрагированной из любого представляющего интерес растения. Способы конструирования праймеров для ПЦР и ПЦР-клонирования, в общем, известны в данной области и описаны в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). См. также Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); and Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Известные способы ПЦР включают без ограничения способы с использованием спаренных праймеров, вложенных праймеров, отдельных специфичных праймеров, вырожденных праймеров, специфичных для гена прай-меров, специфичных для вектора праймеров, частично ошибочно спариваемых праймеров и тому подобных.
Конструкции
Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению можно использовать для получения конструкций рекомбинантных нуклеиновых кислот. В одном варианте молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению можно использовать для получения конструкций нуклеиновых кислот, например, кассет экспрессии для экспрессии в представляющем интерес растении.
Кассета экспрессии может содержать регуляторные последовательности, оперативно связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты AHASL согласно изобретению. Кассета дополнительно может содержать по меньшей мере один дополнительный ген, который необходим для котрансформации организма. Альтернативно дополнительный ген (гены) может находиться в кассетах для множественной экспрессии.
Конструкции нуклеиновых кислот могут быть снабжены множеством сайтов рестрикции для ин-серции последовательности нуклеиновой кислоты AHASL под транскрипционным контролем регулятор
ных областей. Конструкции нуклеиновых кислот дополнительно могут содержать молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гены селектируемых маркеров.
В одном варианте кассета экспрессии содержит в 5'-3'-направлении транскрипции область инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность нуклеиновой кислоты AHASL согласно изобретению и область терминации транскрипции и трансляции (т.е. область терминации), функционирующие в растениях.
Для получения конструкций нуклеиновых кислот можно использовать любой промотор. Промотор может быть нативным или аналогичным или чужеродным или гетерологичным по отношению к растению-хозяину и/или последовательности нуклеиновой кислоты AHASL согласно изобретению. Кроме того, промотор может представлять собой природную последовательность или альтернативно синтетическую последовательность. В том случае, когда промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" по отношению к растению-хозяину, подразумевается, что промотор не встречается в нативном растении, в которое вводят промотор. В том случае, когда промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты AHASL согласно изобретению, подразумевается, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для оперативно связанной последовательности нуклеиновой кислоты AHASL согласно изобретению. В используемом в настоящем описании смысле химерный ген содержит кодирующую последовательность оперативно, связанную с областью инициации транскрипции, которая является гетерологичной по отношению к кодирующей последовательности.
Хотя предпочтительно можно экспрессировать молекулы нуклеиновых кислот AHASL согласно изобретению с использованием гетерологичных промоторов, можно использовать нативные промотор-ные последовательности при получении конструкций. Такие конструкции могут изменять уровни экспрессии белка AHASL в растении или растительной клетке. Таким образом, изменяется фенотип растения или растительной клетки.
Можно использовать любой промотор при получении конструкций для регуляции экспрессии кодирующей последовательности AHAS, такой как промоторы, предлагаемые для конститутивной, предпочтительной для определенной ткани, индуцируемой экспрессии, или другие промоторы для экспрессии в растениях. Конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 и другие конститутивные промоторы, описанные в WO 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); промотор актина риса (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); убиквитина (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 и Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); промотор ALS (патент США № 5659026) и тому подобные. Другие конститутивные промоторы включают, например, промоторы, описанные в патентах США № 5608149, 5608144, 5604121, 5569597,5466785, 5399680,5268463,5608142 и 6177611.
Предпочтительные для ткани промоторы могут быть использованы для обеспечения целенаправленной экспрессии AHASL в конкретной растительной ткани. Такие предпочтительные для ткани промоторы включают без ограничения предпочтительные для листьев промоторы, предпочтительные для корней промоторы, предпочтительные для семян промоторы и предпочтительные для стебля промоторы. Предпочтительные для ткани промоторы включают промоторы, описанные в Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 1 12(3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 1 12(2): 525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112 (2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23 (6): 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90 (20): 9586-9590; and Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505.
Конструкции нуклеиновых кислот также могут содержать области терминации транскрипции. В случае использования областей терминации транскрипции можно использовать любую область термина-ции при получении конструкций нуклеиновых кислот. Например, область терминации может быть на-тивной по отношению к области инициации транскрипции, может быть нативной по отношению к оперативно связанной представляющей интерес последовательности AHASL, может быть нативной по отношению к растению-хозяину или может быть получена из другого источника (т.е. быть чужеродной или гетерологичной по отношению к промотору, представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты AHASL, растению-хозяину или любому их сочетанию). Примеры областей терминации, которые доступны для применения в конструкциях согласно настоящему изобретению, включают области терминации из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как области терминации октопинситазы и нопалинсинтазы. См. также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:96279639.
В некоторых вариантах нуклеиновые кислоты могут быть оптимизированы для повышенной экспрессии в трансформированном растении. То есть, нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные белки
AHASL, могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для растения кодонов для повышенной экспрессии. См., например, публикацию Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11, в которой обсуждается предпочтительное для хозяина использованием кодонов. В данной области имеются способы синтеза предпочтительных для растения генов. См., например, патенты США № 5380831 и 5436391 и публикацию Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, включенные в настоящее описание в виде ссылки.
Кроме того, могут быть осуществлены дополнительные модификации последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящей публикации, Например, известно, что дополнительные модификации последовательностей усиливают экспрессию генов в клетке-хозяине. Такие модификации включают исключение последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы сайтов экзон-интронного сплайсинга, подобные транспозонам повторы, и других хорошо охарактеризованных последовательностей, которые могут вредить экспрессии генов. Содержание G-C в последовательности можно корректировать до средних уровней для данной клетки-хозяина, которые рассчитывают на основании известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Кроме того, последовательность может быть модифицирована так, чтобы избежать образования предполагаемых вторичных структур мРНК в виде шпилек.
Другие последовательности нуклеиновых кислот также можно использовать при получении конструкций согласно настоящему изобретению, например, для усиления экспрессии кодирующей последовательности AHAS. К таким последовательностям нуклеиновых кислот относятся интроны гена AdhI intron1 кукурузы (Callis et al. Genes and Development 1:1183-1200, 1987) и лидерные последовательности (W-последовательность) из вируса мозаики табака (TMV), вируса хлоротической пятнистости кукурузы и вируса мозаики люцерны (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 и Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Показано, что первый интрон из локуса shrunkent-1 кукурузы увеличивает экспрессию генов в химерных генных конструкциях. В патентах США № 5424412 и 5593874 раскрыто применение специфичных интронов в экспрессирующих генных конструкциях, и в публикации Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) также показано, что интроны применимы для регуляции экспрессии генов на тканеспецифичной основе. Чтобы дополнительно усилить или оптимизировать экспрессию гена большой субъединицы AHAS, экспрессирующие векторы растений согласно изобретению также могут содержать последовательности ДНК, содержащие области прикрепления к матриксу (MAR). Растительные клетки, трансформированные такими модифицированными системами экспрессии, затем могут осуществлять сверхэкспрессию или конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности согласно изобретению.
Конструкции нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению дополнительно могут содержать 5'-лидерные последовательности в конструкции кассеты экспрессии. Такие лидерные последовательности могут действовать, усиливая трансляцию. Лидеры трансляции известны в данной области и включают: лидеры пикорнавирусов, например, лидер EMCV (5'-некодирующая область энцефаломио-кардита) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); лидеры потивирусов, например, лидер TEV (вируса гравировки табака) (Gallie et al. (1995) Gene 165 (2):233-238), лидер MDMV (вируса карликовой мозаики кукурузы) (Virology 154:9-20) и белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); нетранслируемый лидер из мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); лидер вируса мозаики табака (TMV) (Gallie et al. (1989) в Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp.237256); и лидер вируса хлоротической пятнистости кукурузы (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Также см. Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Также можно использовать другие способы, которые, как известно, усиливают трансляцию, например, с использованием интронов и тому подобного.
При получении конструкций нуклеиновых кислот можно подвергать обработке различные фрагменты ДНК так, чтобы получить последовательности ДНК в правильной ориентации и, в соответствующем случае, в правильной рамке считывания. Для этой цели можно использовать адаптеры и линкеры, чтобы связать фрагменты ДНК, или можно использовать другие манипуляции, чтобы ввести подходящие сайты рестрикции, удалить избыточную ДНК, удалить сайты рестрикции или тому подобное. Для указанной цели можно использовать мутагенез in vitro, репарацию с праймерами, рестрикцию, отжиг, повторные замены, например, транзиции и трансверсии.
Экспрессирующие конструкции согласно настоящему изобретению также могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, способные направлять экспрессию последовательности AHAS в мишень - хлоропласт. Такие последовательности нуклеиновых кислот включают в себя направляющие в хлоропласт последовательности, которые кодируют транзитный пептид хлоропласта, для того, чтобы направить продукт представляющего интерес гена в хлоропласты растительных клеток. Такие транзитные пептиды известны в данной области. Что касается направляющих в хлоропласт последовательностей, то "оперативно связанная" означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая транзитный пептид (т.е. направляющая в хлоропласт последовательность), связана с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL согласно изобретению так, что две последовательности непосредственно следуют
друг за другом и находятся в одной и той же рамке считывания. См., например, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; и Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Хотя белки AHASL согласно изобретению включают в себя натив-ный транзитный пептид хлоропласта, любой транзитный пептид хлоропласта, известный в данной области, может быть слит с аминокислотной последовательностью зрелого белка AHASL согласно изобретению посредством оперативного связывания направляющей в хлоропласт последовательности с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый белок AHASL согласно изобретению.
Направляющие в хлоропласт последовательности известны в данной области и включают малую субъединицу рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы хлоропласта (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 (5):3335-3342); 5-(енолпирувил)шикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6) :789-810); триптофансинтазу (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(11): 6081-6087); пластоцианин (Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (33) 20357-20363); хоризматсинтазу (Schmidt et al. (1993) J. Biol Chem. 268 (36) :27447-27457) и светособирающий хлорофилл a/b-связывающий белок (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). См. также Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
В другом варианте конструкции нуклеиновых кислот могут быть получены для управления экспрессией мутантной кодирующей последовательности AHAS из хлоропластов растительных клеток. Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. См., например, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBOJ. 12:601-606. Способ основан на использовании пушки для частиц для доставки ДНК, содержащей селектируемый маркер, и целенаправленном встраивании ДНК в геном пластид с помощью гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформация пластид может быть осуществлена посредством трансактивации молчащего трансгена, который несут пластиды, в результате тканеспеци-фичной экспрессии кодируемой в ядре и направленной в пластиды РНК-полимеразы. Такая система описана в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
Представляющие интерес нуклеиновые кислоты, которые необходимо направить в хлоропласт, могут быть оптимизированы для экспрессии в хлоропласте с учетом различий в использовании кодонов между ядром растения и данным органоидом. Таким образом, представляющие интерес нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с использованием предпочтительных для хлоропластов кодонов. См., например, патент США № 5380831, включенный в настоящее описание в виде ссылки.
Конструкции нуклеиновых кислот можно применять для трансформации растительных клеток и регенерации трансгенных растений, содержащих мутантные кодирующие последовательности AHAS. Доступны многочисленные трансформирующие растения векторы и способы для трансформации растений. См., например, патент США № 6753458, An, G. et al. (1986) Plant Physiol., 81:301-305; Fry, J. et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-774; Hinchee et al. (1990) Stadler. Genet. Symp.203212.203-212; Cousins et al. (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P. P. and Sligh-tom, J. L. (1992) Gene.118:255-260; Christou et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin et al.
(1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir et al. (1992) Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216; Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124; Davies, et al.
(1993) Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. and Mc Hughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148; Franklin, С. I. and Trieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167; Golovkin et al. (1993) Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres N. M. and Park, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo et al. (1994) Plant. J. 5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman et al. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325; and Wan, Y. С and Lemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748. Конструкциями также можно трансформировать растительные клетки, используя гомологичную рекомбинацию.
Описанные конструкции, содержащие последовательности AHASL согласно настоящему изобретению, можно применять в различных способах получения трансгенных клеток-хозяев, таких как бактерии, дрожжи, и для трансформации растительных клеток и в некоторых случаях для регенерации трансгенных растений. Например, способы получения трансгенного культурного растения, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный AHASL, согласно настоящему изобретению, когда экспрессия нуклеиновой кислоты (кислот) в растении приводит к устойчивости к гербицидам по сравнению с растениями дикого типа или с растениями с AHAS известного мутантного типа, включают в себя: (а) введение в растительную клетку экспрессирующего вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую му-тантный AHASL согласно настоящему изобретению, и (Ь) создание из растительной клетки трансгенного растения, которое устойчиво к гербицидам.
Растительные клетки для применения в способах согласно настоящему изобретению включают без ограничения протопласты, клетки, продуцирующие гаметы, и клетки, которые регенерируют в целое
растение. Во многих случаях, вся или часть рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты стабильно интегрируется в хромосому или стабильный внехромосомный элемент, так что она передается последующим поколениям.
Настоящее изобретение можно применять для трансформации любого вида растения, включая без ограничения однодольные и двудольные растения. Примеры представляющих интерес видов растений включают без ограничения кукурузу (Zea mays), виды Brassica (например, В. napus, В. rapa, В. juncea), в частности, виды Brassica, применимые в качестве источников масла, получаемого из семян, люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, просо африканское (Pennisetum glaucum), просо обыкновенное (Panicum miliaceum), просо итальянское (Setaria italica), элевзине (Eleusine coracana)), подсолнечник (Helianthus annuus), сафлор (Car-thamus tinctorius), пшеницу (Triticum aestivum, T. Turgidum ssp. durum), сою (Glycine max), табак (Nico-tiana tabacum), картофель (Solanum tuberosum), арахис (Arachis hypogaea), хлопчатник (Gossypium bar-badense, Gossypium hirsutum), батат (Ipomoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофе (Coffea spp.), кокос (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусовые деревья (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia sinensis), бананы (Musa spp.), авокадо (Persea americana), смоковницу (Ficus casica), гуаву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), оливу (Olea europaea), папайю (Carica papaya), кешью (Ana-cardium occidentale), макадамию (Macadamia integrifolia), миндаль (Prunus amygdalus), сахарную свеклу (Beta vulgaris), сахарный тростник (Saccharura spp.), овес (Avena sativa), ячмень (Hordeum vulgare), овощи, декоративные растения и хвойные. Предпочтительно растения согласно настоящему изобретению представляют собой сельскохозяйственные растения (например, подсолнечник, виды Brassica, хлопчатник, сахарную свеклу, сою, арахис, люцерну, сафлор, табак, кукурузу, рис, пшеницу, рожь, ячмень, тритикале, сорго, просо и т.д.).
Мутантные молекулы нуклеиновой кислоты AHASL, кодирующие полипептиды AHASL согласно изобретению, также можно использовать в качестве селектируемых маркеров, например, чтобы идентифицировать трансгенные клетки, содержащие введенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутантные полипептиды AHASL. В одном варианте изобретение относится к способу идентификации или отбора трансформированной растительной клетки, растительной ткани, растения или его части, включающему в себя: а) получение трансформированной растительной клетки, растительной ткани, растения или его части, при этом трансформированная растительная клетка, растительная ткань, растение или его часть содержит изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид AHASL согласно изобретению, которая описана выше, при этом полипептид используют в качестве селектируемого маркера, и при этом трансформированная растительная клетка, растительная ткань, растение или его часть могут необязательно содержать дополнительную представляющую интерес изолированную нуклеиновую кислоту; b) осуществление контакта трансформированной растительной клетки, растительной ткани, растения или его части по меньшей мере с одним ингибитором AHAS или соединением, ингибирующим AHAS; с) определение того, подвергается ли растительная клетка, растительная ткань, растение или его часть влиянию ингибитора или ингибирующего соединения; и d) идентификацию или отбор трансформированной растительной клетки, растительной ткани, растения или его части.
Изобретение также реализовано в очищенных белках AHASL, которые содержат мутации, описанные в настоящей публикации, которые применимы в исследованиях по молекулярному моделированию с целью дополнительного повышения устойчивости к гербицидам. Способы очистки белка хорошо известны и легко могут быть осуществлены с использованием коммерчески доступных продуктов или специально разработанных способов, которые указаны, например, в Protein Biotechnology, Walsh and Headon
(Wiley, 1994).
Настоящее изобретение относится к растениям, растительным тканям, растительным клеткам и клеткам-хозяевам, которые резистентны или устойчивы по меньшей мере к одному AHAS-ингибирующему гербициду, такому как имидазолиноновый или сульфонилмочевинный гербицид. В некоторых вариантах растения, растительные ткани, растительные клетки и клетки-хозяева проявляют повышенную резистентность или повышенную устойчивость по меньшей мере к одному AHAS-ингибирующему гербициду. Термин "повышенная" относится к увеличению резистентности или устойчивости в большей степени, чем ожидается. Предпочтительное количество или концентрация гербицида является "эффективным количеством" или "эффективной концентрацией". "Под эффективным количеством" и "эффективной концентрацией" подразумевают количество и концентрацию, соответственно, которые достаточны для того, чтобы убить или ингибировать рост сходного растения дикого типа, растительной ткани, растительной клетки, микроспоры или клетки-хозяина, но такое указанное количество не убивает или не ингибирует так сильно рост резистентного к гербицидам растения, растительной ткани, растительных клеток, микроспор и клеток-хозяев согласно настоящему изобретению. Обычно эффективное количество гербицида представляет собой количество, которое обычно используют в системах производства сельскохозяйственного производства, чтобы убить представляющие интерес сорняки. Такое количество известно специалистам в данной области или может быть легко определено способами, известными в данной области. Кроме того, понятно, что эффективное количество гербицида в системах производства сельскохозяйственной продукции может в значительной степени отличаться от эффектив
ного количества гербицида для системы культивирования растений, такой как, например, система культивирования микроспор.
Гербициды согласно настоящему изобретению представляют собой гербициды, которые препятствуют проявлению активности фермента AHAS, например, активность AHAS снижается в присутствии гербицида. Такие гербициды также могут быть названы в настоящем описании "AHAS-ингибирующими гербицидами" или просто "ингибиторами AHAS". В используемом в настоящем описании смысле "AHAS-ингибирующий гербицид" или "ингибитор AHAS" не означает ограничение одним гербицидом, который препятствует проявлению активности фермента AHAS. Таким образом, если не указано или не очевидно из контекста иное, "AHAS-ингибирующий гербицид" или "ингибитор AHAS" может означать один гербицид или смесь двух, трех, четырех или более гербицидов, каждый из которых препятствует проявлению активности фермента AHAS.
В используемом в настоящем описании смысле и если четко не указано иное термин "растение" означает растение на любой стадии развития, а также любую часть или части растения, которые могут быть не отделены или отделены от целого интактного растения. Такие части растения включают без ограничения органы, ткани и клетки растения, включая каллусы растений, скопления растительных клеток, протопласты растений и культуры растительных клеток, из которых растения могут быть регенерированы. Примеры конкретных частей растения включают стебель, лист, корень, соцветие, цветок, цветок компактного соцветия, плод, цветоножку, плодоножку, тычинку, пыльник, рыльце, столбик, завязь, лепесток, чашелистик, плодолистик, кончик корня, корневой чехлик, корневой волосок, листовой волосок, волосок семени, пальцевое зерно, микроспору, зародыш, семяпочку, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему, флоэму, паренхиму, эндосперм, клетку-спутницу, замыкающую клетку и любые другие известные органы, ткани и клетки растения. Кроме того, понятно, что семя относится к понятию "растение".
Растения согласно настоящему изобретению включают как нетрансгенные растения, так и трансгенные растения.
Подразумевается, что "нетрансгенное растение" означает растение, не имеющее рекомбинантной ДНК в своем геноме, но содержащее мутантную молекулу нуклеиновой кислоты в геноме растительной клетки, которая стала мутантной в результате использования способа мутагенеза, такого как химический мутагенез, или способами мутагенеза, описанными в настоящей публикации. Нетрансгенные растения не охватывают растения, имеющие мутантные последовательности, возникшие в результате природных процессов. Подразумевают, что "трансгенное растение" означает растение, содержащее рекомбинантную ДНК в своем геноме. Такое трансгенное растение может быть получено введением рекомбинантной ДНК в геном растения. В том случае, когда такую рекомбинантную ДНК вводят в геном трансгенного растения, потомство растения также может содержать рекомбинантную ДНК. Растение-потомок, которое содержит по меньшей мере часть рекомбинантной ДНК по меньшей мере одного трансгенного растения-предка, также является трансгенным растением.
Настоящее изобретение также относится к растениям, резистентным к AHAS-гербицидам, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, описанные в настоящей публикации. Растения, резистентные к AHAS-гербицидам могут быть нетрансгенными или трансгенными устойчивыми к гербицидам растениями, содержащими молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид AHASL, который описан в настоящей публикации. Растения, резистентные к AHAS-гербицидам, могут быть получены в результате перекрестного опыления первого растения со вторым растением и обеспечения возможности продуцирования растением, являющимся акцептором пыльцы, (таким растением может быть либо первое, либо второе растение) семени в результате такого перекрестного опыления. Семена и полученные из них растения-потоки могут иметь мутации, попадающие при скрещивании в геном семени и/или растений-потомков. Растением-акцептором пыльцы может быть либо первое, либо второе растение. Первое растение содержит первую молекулу нуклеиновой кислоты кодирующую по меньшей мере один мутантный полипептид AHASL, который описан в настоящей публикации. Вторым растением может быть любое совместимое растение, и такое растение может содержать вторую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такой же или другой мутантный полипептид AHASL. Первый и второй му-тантные полипептиды AHASL могут содержать одну и ту же или разные аминокислотные замены по сравнению с полипептидом AHASL дикого типа. Могут быть отобраны семена или растения-потомки, полученные в результате скрещивания, которые содержат одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид AHASL, или две молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие два му-тантных полипептида AHASL.
Когда первое и второе растения являются гомозиготными по первой и второй молекулам нуклеиновой кислоты, соответственно, каждое их полученных растений-потомков содержит одну копию первой молекулы нуклеиновой кислоты и одну копию второй молекулы нуклеиновой кислоты, и стадию селекции можно пропустить. Когда, по меньшей мере, одно из растений: первое или второе, является гетерозиготным, в результате селекции могут быть отобраны растения-потомки, содержащие обе молекулы нуклеиновой кислоты, например, в результате анализа ДНК растений-потомков, чтобы идентифицировать растения-потомки, содержащие и первую и вторую молекулы нуклеиновой кислоты, или в результате тестирования растений-потомков в отношении повышенной устойчивости к гербицидам.
В некоторых вариантах растения, содержащие последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, могут быть получены с использованием нетрансгенных способов, таких как способы сайт-специфичного мутагенеза, включая способы, описанные, например, в международной заявке PCT/US00/23457 или в патентах США № 6271360, 6479292 и 7094606. В одном варианте такие способы могут заключаться в применении опосредованной специфичными олигонуклеотидами репарации генов с целью введения точечных мутаций в геном клетки-хозяина и могут включать в себя использование однонитевых олигонуклеотидов, таких как олигонуклеиновые основания для репарации генов (см. патенты США № 6870075 и 5565350). Олигонуклеиновое основание представляет собой полимер, который содержит нуклеиновые основания, и такой полимер может гибридизоваться благодаря спариванию оснований Уотсона-Крика с ДНК, имеющей комплементарную последовательность. Нуклеиновые основания включают в себя основание, которое представляет собой пурин, пиримидин или их производное или аналог. Нуклеиновые основания включают в себя пептидонуклеиновые основания, субъединицы пептидонуклеиновых кислот и морфолиновые нуклеиновые основания, а также нуклеозиды и нуклеоти-ды. Нуклеозиды являются нуклеиновыми основаниями, которые содержат остаток пентозофуранозила, например, необязательно замещенный рибозид или 2'-дезоксирибозид. Нуклеозиды могут быть связаны одним из нескольких связывающих остатков, которые могут содержать или могут не содержать фосфора. Нуклеозиды, которые связаны незамещенными фосфодиэфирными связями, называют нуклеотидами. Цепь олигонуклеиновых оснований имеет отдельные 5'- и 3'-концы, которые представляют собой конечные нуклеиновые основания. Конкретная олигонуклеиновая цепь может содержать нуклеиновые основания всех типов. Олигонуклеиновое соединение представляет собой соединение, содержащее одну или более олигонуклеиновых цепей, которые являются комплементарными и гибридизуются благодаря спариванию оснований Уотсона-Крика. Нуклеиновые основания являются либо дезоксирибо-типа, либо ри-бо-типа. Нуклеиновые основания рибо-типа являются нуклеиновыми основаниями, содержащими пенок-тозофуранозил, где 2'-углерод представлен метиленом, замещенным гидроксилом, алкоксигруппой или галогеном. Нуклеиновые основания дезоксирибо-типа представляют собой нуклеиновые основания, отличные от нуклеиновых оснований рибо-типа, и включают все нуклеиновые основания, которые не содержат остатка пентозофуранозила.
Однонитевые олигонуклеотидные мутагенизирующие векторы (SSMOV) могут быть получены для введения мутаций в кодирующую последовательность AHAS. SSMOV могут быть получены согласно международной заявке на выдачу патента PCT/US 00/23457 и патентам США № 6271360, 6479292 и 7094606. Последовательность SSOMV может быть основана на таких же принципах, как в случае мута-
генизирующих векторов, описанных в патентах США № 5565350, 5731181, 5756325, 5871984, 5760012,
5888983, 5795972, 5780296, 5945339, 6004804 и 6010907 и в международных публикациях № WO
98/49350, WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702 и WO 99/40789. В одном варианте последовательность SSOMV содержит две области, которые гомологичны последовательности-мишени, разделенные областью, которая содержит требуемое генетическое изменение, называемой мутаторной областью. Му-таторная область может иметь последовательность, которая имеет такую же длину, как и последовательность, которая разделяет гомологичные области в последовательности-мишени, но имеет другую последовательность. Такая мутаторная область может вызывать замену. Альтернативно, гомологичные области в SSOMV могут непрерывно следовать друг за другом, тогда как области в гене-мишени, имеющие такую же последовательность разделены одним, двумя или большим количеством нуклеотидов. Такой SSOMV вызывает делецию из гена-мишени нуклеотидов, которые отсутствуют в SSOMV. Наконец, последовательность гена-мишени, которая идентична гомологичным областям, может быть расположена рядом в гене-мишени, но отделена одним, двумя или большим количеством нуклеотидов в последовательности SSOMV. Такой SSOMV вызывает инсерцию в последовательность гена-мишени.
В некоторых вариантах нуклеотиды SSOMV представляют собой дезоксирибонуклеотиды, которые связаны немодифицированными фосфодиэфирными связями, за исключением того, что 5'-концевая и/или 3'-концевая межнуклеотидная связь или альтернативно две 5'-концевые и/или 3'-концевые межнуклео-тидные связи могут быть фосфоротиоатными или фосфоамидатными. В используемом в настоящем описании смысле межнуклеотидная связь представляет собой связь между нуклеотидами SSOMV и не включает связь между 5'-концевым нуклеотидом или 3'-концевым нуклеотидом и блокирующим заместителем. В одном конкретном варианте длина SSOMV составляет от 21 до 60 дезоксинуклеотидов, и области гомологии, соответственно, имеют общую длину по меньшей мере 20 дезоксинуклеотидов и по меньшей мере две области гомологии должны иметь длины по меньшей мере 8 дезоксинуклеотидов каждая.
SSOMV могут быть сконструированы так, чтобы они были комплементарными либо кодирующей, либо не кодирующей нити гена-мишени. Когда требуемая мутация представляет собой замену одного основания, предпочтительно, чтобы мутаторный нуклеотид был пиримидиновым. В тех пределах, которые согласуются с достижением требуемого функционального результата, предпочтительно, чтобы и мутаторный нуклеотид и нуклеотид, являющийся мишенью, в комплементарной нити были пиримидино-выми. В одном варианте SSOMV, которые кодируют мутации трансверсии, т.е. нуклеотид мутатора С или Т ошибочно спаривается, соответственно, с нуклеотидом С или Т в комплементарной нити.
Кроме олигодезоксинуклеотида SSOMV может содержать 5'-блокирующий заместитель, который
связан с 5'-концевыми атомами углерода через линкер. Химическая природа линкера может быть любой, и она имеет длину, по меньшей мере, 6 атомов, и линкер предпочтительно является гибким. Можно использовать множество нетоксичных заместителей, таких как биотин, холестерин или другие стероиды или не интеркалирующий катионный флуоресцирующий краситель. Примерами реагентов для получения SSOMV являются реагенты, продаваемые как Су3(tm) и Су5(tm), Glen Research, Sterling Va. (в настоящее время GE Healthcare), которые являются блокированными фосфороамидитами, которые при включении в олигонуклеотид дают 3,3,3',3'-тетраметил-^№-изо1гоопил-замещенные индомонокарбоцианиновые и индодикарбоцианиновые красители соответственно. В одном варианте реагентом является Су3. Когда индокарбоцианин является N-оксиалкил-замещенным, он может быть просто связан с 5'-концом олигоде-зоксинуклеотида фосфодиэфирной связью с 5'-концевым фосфатом. Химическая природа линкера для красителя между красителем и олигодезоксинуклеотидом не является решающей, и линкер выбирают так, чтобы он был удобным для синтеза. Когда используют коммерчески доступный фосфорамидит Су3, как указано, полученная в результате 5'-модификация состоит из блокирующего заместителя и линкера, которые вместе представляют собой N-гидроксипропил-N'-фосфатидилпропил-3,3,3',3'-тетраметилин-домонокарбоцианин.
В одном варианте индокарбоцианиновый краситель является тетразамещенным в 3- и 3'-положениях индольных циклов. Без ограничения какой-либо теорией такие замещения препятствуют тому, что краситель станет интеркалирующим красителем. Конкретные заместители в таких положениях не являются решающими. SSOMV, кроме того, может иметь 3'-блокирующий заместитель. И также химическая природа 3'-блокирующего заместителя не является решающей.
Изменение, вводимое в ген AHAS, может быть осуществлено в любой области последовательности нуклеиновой кислоты, включая кодирующие и не кодирующие области. В одном варианте изменение, вводимое в ген-мишень (AHAS), кодируется гетерологичной областью. Изменение, вводимое в ген, может представлять собой изменение в одном или более основаниях последовательности гена (т.е. замену) или добавление или делецию одного или более оснований.
Настоящее изобретение также относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, которую в настоящем описании называют BnCL120C7. Депонирование по меньшей мере 2500 семян линии Brassica BnCL120C7 в депозитарии для нужд патентования Американской коллекции типов культур (АТСС), Ma-nassas, VA 20110 USA осуществлено 23 июня 2008, и патентуемому депозиту присвоен номер АТСС РТА-9278. Настоящее изобретение также относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, которую в настоящем описании называют BnCL131А1. Депонирование по меньшей мере 2500 семян линии Brassica BnCL131A1 осуществлено 23 июня 2008, и патентуемому депозиту присвоен номер АТСС РТА-9279. Настоящее изобретение также относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, которую называют в настоящем описании BnCL140B3. Депонирование по меньшей мере 2500 семян линии Bras-sica BnCL140B3 в депозитарии для нужд патентования Американской коллекции типов культур (АТСС), Manassas, VA 20110 USA, осуществлено 27 августа 2008, и патентуемому депозиту присвоен номер АТСС РТА-9402. Настоящее изобретение также относится резистентной к гербицидам линии Brassica, которая в настоящем описании названа BnCL140C7. Депонирование по меньшей мере 2500 семян линии Brassica BnCL140C7 в депозитарии для нужд патентования Американской коллекции типов культур (АТСС) , Manassas, VA 20110 USA осуществлено 27 августа 2008, и патентуемому депозиту присвоен номер АТСС РТА-9403. Настоящее изобретение также относится к резистентной к гербицидам линии Brassica, которая в настоящем описании названа РМ1РМ2/BnCL131А1. Депонирование по меньшей мере 2500 семян линии Brassica PM1PM2/BnCL131A1 в депозитарии для нужд патентования Американской коллекции типов культур (АТСС), Manassas, VA 20110 USA осуществлено 9 сентября 2009, и патентуемому депозиту присвоен номер АТСС РТА-10321. Депозит будет храниться по условиям Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Депозит линий Brassica BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3, BnCL140C7 и РМ1РМ2/BnCL131А1 помещен на срок по меньшей мере 30 лет и будет храниться по меньшей мере 5 лет с момента последнего запроса о выдаче образца депозита, полученного АТСС. Кроме того, заявители удовлетворили все требования статьи 37 C.F.R. § 1.801-1.809, включая предоставление свидетельства о жизнеспособности образца.
Мутантные резистентные к гербицидам линии Brassica BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3 и BnCL140C7, приведенные в качестве примера в настоящем изобретении, получали с использованием методики сайт-специфичного мутагенеза, как описано в примерах. Однако настоящее изобретение не ограничено резистентными к гербицидам растениями Brassica, которые получены такими способами. Любой способ мутагенеза, известный в данной области, может быть использован для получения резистентных к гербицидам растений Brassica согласно настоящему изобретению. Такие способы мутагенеза могут включать в себя, например, использование любого одного или более из следующих мутагенов: излучения, такого как рентгеновское излучение, гамма-излучение (например, кобальт-60 или цезий-137), нейтроны (например, продукт деления ядра урана-235 в атомном реакторе), бета-излучение (например, испускаемое радиоактивными изотопами, такими как фосфор-32 или углерод-14) и ультрафиолетовое излучение (предпочтительно от 250 до 290 нм), и химических мутагенов, таких как этилметансульфонат
(EMS), аналоги оснований (например, 5-бромурацил), родственные соединения (например, 8-эток-сикофеин), антибиотики (например, стрептонигрин), алкилирующие агенты (например, сернистый иприт, азотистый иприт, эпоксиды, этиленамины, сульфаты, сульфонаты, сульфоны, лактоны), азид, гидрокси-ламин, азотистая кислота или акридины. Резистентные к гербицидам растения также могут быть получены с использованием способов культивирования тканей, чтобы отобрать растительные клетки, содержащие мутации резистентности к гербицидам, и затем из них регенерировать резистентные к гербицидам растения. См., например, патенты США № 5773702 и 5859348, которые включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. Дополнительные подробности мутационной селекции можно найти в публикации "Principals of Cultivar Development", Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, содержание которой включено в настоящее писание в виде ссылки. Кроме того, можно использовать сайт-специфичный мутагенез, чтобы получить мутантные последовательности AHASL в растительной клетке-хозяине, которые описаны в настоящей публикации.
Растения Brassica согласно изобретению дополнительно включают растения, которые содержат, по сравнению с белком AHASL дикого типа, аспарагин в положении аминокислоты 653 (номенклатура для A. thaliana), треонин в положении аминокислоты 122 (номенклатура для A. thaliana) и одну или более дополнительных аминокислотных замен в белке AHASL по сравнению с белком AHASL дикого типа, при этом такое растение Brassica обладает повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду по сравнению с растением Brassica дикого типа.
Растения и способы селекции
Резистентный к AHAS-гербицидам растения и потомство таких растений согласно настоящему изобретению, такие как резистентные к AHAS-гербицидам растения Brassica, можно применять в способах получения резистентных растений, растений, обладающих повышенной устойчивостью к AHAS-гербицидам, и семян таких растений. Таким образом, например, растения Brassica, описанные в настоящей публикации, могут быть использованы в программах селекции, чтобы создать дополнительные устойчивые к гербицидам растения, такие как коммерческие сорта В. napus (например, канола). В соответствии с такими способами первое родительское растение может быть использовано в скрещиваниях со вторым родительским растением, при этом по меньшей мере одно из указанных двух родительских растений, первое или второе, содержит, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты AHASL согласно настоящему изобретению, например, молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид AHASL, имеющий мутацию А122Т и мутацию S653N. Одним из применений способа является применение для получения гибридных растений F1. Другой важный аспект такого способа заключается в том, что способ может быть использован для создания новых родительских дигаплоидных или инбредных линий. Например, линия растения, которая описана в настоящей публикации, может быть скрещена с любым вторым растением, и полученное гибридное потомство подвергнуто самоопылению и/или скрещиванию между сибсами в течение примерно 5-7 поколений или большего количества поколений, с получением таким образом большого количества отдельных родительских линий. Затем указанные родительские линии могут быть скрещены с другими линиями, и полученное гибридное потомство может быть подвергнуто анализу в отношении наличия полезных свойств. Таким образом могут быть идентифицированы новые линии, придающие требуемые свойства. В указанных способах можно использовать различные методики селекции, включая гаплоидию, способ отбора ''педигри'', способ отбора одного семени в потомстве, модифицированный способ отбора одного семени в потомстве, повторяющийся отбор и возвратное скрещивание.
В некоторых вариантах у растений и их потомства наблюдают синергетический эффект, а не аддитивный эффект в отношении устойчивости к гербицидам, при этом уровень устойчивости к гербицидам у растений и их потомства, содержащих множественные мутации, выше, чем суммарный уровень устойчивости к гербицидам растений, содержащих белок AHASL с единичной мутацией.
Линии растений, содержащих молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, можно скрещивать, используя любые естественные или механические методики. Механическое опыление может быть осуществлено посредством контролирования типов пыльцы, которая может быть перенесена на рыльце, либо ручным опылением.
Растения-потомки можно оценивать в отношении молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению любым способом, чтобы определить присутствие мутантной нуклеиновой кислоты или полипептида AHASL. Такие способы включают фенотипическую оценку, генотипическую оценку или их сочетания. Потомство растений можно оценить в последующих поколениях в отношении резистентности к гербицидам и других требуемых свойств. Резистентность к ингибирующим AHAS гербицидам можно оценить, подвергая растения воздействию одного или более подходящих ингибирующих AHAS гербицидов и оценивая повреждение гербицидами. Некоторые свойства, такие как устойчивость к полеганию и высота растения, можно оценивать посредством визуального осмотра растений, тогда как способность к раннему созреванию, можно оценить в результате визуального осмотра семян в стручках. Другие свойства, такие как процентное содержание масла, процентное содержание белка и общее содержание глюкозинолатов в семенах, могут быть оценены с использованием таких методик, как спектроскопия в ближней инфракрасной области и/или жидкостная хроматография и/или газовая хроматография.
Растения согласно настоящему изобретению также могут быть идентифицированы с использованием любого способа генотипического анализа. Генотипическая оценка растений включает в себя применение таких методик, как электрофорез изоферментов, оценка полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), оценка случайно амплифицированных полиморфных ДНК (RAPD), случайно прай-мируемая полимеразная цепная реакция (AP-PCR), аллель-специфичная ПЦР (AS-PCR), фингерпринтинг амлифицированной ДНК (DAF), оценка амплифицированной области с охарактеризованной последовательностью (SCAR), полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLP), оценка повторов простых последовательностей (SSR), которые также называют "микросателлитами".
Дополнительные композиции и способы анализа генотипа растений, предлагаемых в настоящем изобретении, включают способы, описанные в публикации патента США № 2004/0171027, публикации патента США № 2005/02080506 и публикации патента США № 2005/0283858, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.
Оценка и обработка (посредством воздействия одного или более подходящих AHAS-инги-бирующих гербицидов) может быть осуществлена на протяжении нескольких поколений. Эффективность новых линий можно оценить, используя объективные критерии в сравнении с контрольными сортами. Линии, обладающие требуемыми сочетаниями свойств, либо скрещивают с другой линией, либо подвергают самоопылению, чтобы получить семена. Самоопыление относится к переносу пыльцы с одного цветка на тот же самый цветок или другой цветок на том же растении. Растения, которые были подвергнуты самоопылению и отбору в отношении типа в течение многих поколений, становятся гомозиготными почти по всем генным локусам и дают однородную популяцию потомства при селекции гомозигот.
Любой способ селекции можно использовать в способах согласно настоящему изобретению. В одном примере резистентные к гербицидам растения согласно настоящему изобретению можно разводить, используя способ на основе гаплоидов. В таких способах родителей, имеющих генетическую базу для требуемого комплементирования свойств, скрещивают, используя простое или сложное скрещивание. Скрещивание (или перекрестное опыление) относится к переносу пыльцы с одного растения на другое растение. Потомство от скрещивания выращивают и микроспоры (незрелые пыльцевые зерна) отделяют и фильтруют, используя методики, известные специалистам в данной области [(например, Swanson, E. В. et al.,(1987) Plant Cell Reports, 6:94-97, "Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos in Brassica napus"; и Swanson, E. В., (1990) Microspore culture in Brassica, pp.159-169 in Methods in Molecular Biology, vol.6, Plant Cell and Tissue Culture, Humana Press]. В указанных микроспорах наблюдается расщепление генов. Микроспоры культивируют в присутствии подходящего AHAS-ингибирующего гербицида, такого как имазетапир (например, PURSUIT(tm)) или имазамокс (например, SOLO(tm), BEYOND(tm) и RAPTOR(tm)) или смесь 50/50 имазетапира и имазамокса (например, ODYSSEY(tm)), который убивает микроспоры, в которых отсутствуют мутации, ответственные за резистентность к гербициду. Микроспоры, несущие гены, ответственные за резистентность к гербициду, выживают и дают зародыши, которые образуют гаплоидные растения. Затем их хромосомы удваивают, получая удвоенные гаплоиды.
Другие способы селекции также используют согласно настоящему изобретению. Например, отбор способом "педигри" можно использовать для улучшения в основном самоопыляющихся культур, таких как Brassica и канола. Селекцию "педигри" начинают со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может иметь одно или более требуемых свойств, которые отсутствуют в другом или которые дополняют другое свойство. Если два исходных родителя не обеспечивают всех требуемых свойств, то в план скрещиваний можно включать дополнительных родителей.
Таких родителей можно скрещивать в виде простого или сложного скрещивания, чтобы получить простые или сложные гибриды F1. Популяцию F2 получают из F1 в результате самоопыления одного или более растений F1 или взаимного скрещивания двух растений F1 (т.е. скрещивания между сибсами). Отбор наилучших особей можно начинать в F2-поколении, и начиная с F3, отбирают лучшие семьи, и наилучших представителей в наилучших семьях. Повторное тестирование семей можно начинать в
Fzi-поколении, чтобы повысить эффективность селекции в отношении свойств с низкой наследуемостью. На поздней стадии инбридинга (т.е. F6 и F7) наилучшие линии или смеси фенотипически сходных линий можно тестировать в отношении возможного выпуска новых сортов. Однако способ селекции пе-дигри более трудоемок, чем способ на основе гаплоидии, для создания улучшенных растений, резистентных к AHAS-гербицидам, поскольку растения дают расщепление в течение нескольких поколений, и выход требуемых свойств является относительно низким.
Способ отбора одного семени в потомстве (SSD) также можно использовать для селекции улучшенных сортов. Способ SSD в строгом смысле относится к посадке сегрегирующей популяции, сбора образца в виде одного семени от растения и использование популяции из одиночных семян для посадки с целью получения следующего поколения. Когда популяция будет доведена от F2 до требуемого уровня инбридинга, каждое из растений, из которых получены линии, можно будет проследить до разных особей F2. Количество растений в популяции снижается в каждом поколении вследствие неспособности не
которых семян прорасти или неспособности некоторых растений дать, по меньшей мере, одно семя. В результате не все растения, образцы которых были исходно взяты в популяции F2, будут представлены потомством, когда продвижение поколений будет завершено.
В случае способа, основанного на использовании нескольких семян, селекционеры канолы обычно собирают один или более стручков с каждого растения в популяции и обмолачивают их вместе, получая общую массу. Часть общей массы используют для посадки следующего поколения, а часть откладывают в запас. Способ был назван модифицированным способом отбора одного семени в потомстве или способом отбора семян одного стручка в потомстве. Способ отбора нескольких семян использовали для того, чтобы уменьшить трудозатраты на сбор. Значительно быстрее обмолотить стручки машиной, чем извлекать одно семя из каждого стручка вручную в случае способа отбора одного семени в потомстве. Способ отбора нескольких семян также позволяет высаживать одинаковое количество семян в популяции каждого поколения при инбридинге. Собирают достаточное количество семян, чтобы компенсировать растения, которые не прорастают или не дают семян.
Возвратное скрещивание можно использовать для переноса гена или генов в случае легко и в высокой степени наследуемого признака от исходного сорта или линии (родителя-донора) в другой требуемый культурный сорт или инбредную линию (рекуррентного родителя). После начального скрещивания особи, имеющие фенотип родителя-донора, отбирают и повторно скрещивают (подвергают возвратному скрещиванию) с рекуррентным родителем. Ожидается, что после выполнения возвратного скрещивания полученное растение будет обладать признаками рекуррентного родителя и требуемым свойством, перенесенным от родителя-донора.
В результате повторяющегося отбора также могут быть созданы улучшенные сорта. В данном способе генетически разнообразную популяцию гетерозиготных особей либо идентифицируют, либо создают в результате взаимного скрещивания нескольких разных родителей. Наилучшие растения отбирают на основании их индивидуального превосходства, выдающегося потомства или превосходной способности к скрещиванию. Отобранные растения подвергают взаимному скрещиванию, получая новую популяцию, в которой продолжают последующие циклы селекции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения растения, обладающего резистентностью к AHAS-ингибирующим гербицидам, включающему в себя: (а) скрещивание первой линии растения со второй линией растения, чтобы получить сегрегирующую популяцию, при этом первая или вторая линия растения представлена резистентным к AHAS-ингибирующим гербицидам растением, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению; (b) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к AHAS-ингибирующим гербицидам, в отношении присутствия молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению или в отношении обоих признаков; и (с) отбор одного или более представителей популяции, имеющих повышенную резистентность AHAS по сравнению с растением дикого типа или содержащих молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Первое или второй растение содержит молекулу нуклеиновой кислоты AHASL согласно настоящему изобретению. В одном варианте растения для применения в данном способе являются растениями Brassica.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу интрогрессии признака резистентности к AHAS-ингибирующим гербицидам, в растение, включающему в себя: (а) скрещивание, по меньшей мере, первой линии растений, резистентной к AHAS-ингибирующим гербицидам, со второй линией растений с получением сегрегирующей популяции; (b) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к AHAS-ингибирующим гербицидам; и (с) отбор по меньшей мере одного представителя популяции, обладающего повышенной резистентностью к AHAS-ингибирующим гербицидам. В одном варианте растения для применения в данном способе являются растениями Brassica.
Альтернативно в другом аспекте изобретения и первое и второе родительские растения Brassica могут быть резистентными к AHAS-ингибирующим гербицидам растениями Brassica, которые описаны в настоящей публикации. Таким образом, любое растение Brassica, полученное с использованием растения Brassica, обладающего повышенной резистентностью к AHAS-ингибирующим гербицидам, которое описано в настоящей публикации, составляет часть изобретения. В используемом в настоящем описании смысле скрещивание может означать самоопыление, скрещивание сибсов, возвратное скрещивание, скрещивание с другой или той же самой родительской линией, скрещивание с популяциями и тому подобное.
Настоящее изобретение также относится к способам получения резистентного к гербицидам растения, в частности резистентного к гербицидам растения Brassica, посредством обычной селекции растений, основанной на половом размножении. Способы включают в себя скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое не является резистентным к гербициду. Первое растение может быть любым резистентным к гербицидам растением согласно настоящему изобретению, включая, например, растения Brassica, содержащие, по меньшей мере, одну из молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, которые кодируют резистентную к гербицидам AHASL, и нетрансгенные растения Brassica, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам растения Brassica BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3 или BnCL140C7. Второе растение
может быть любым растением, которое способно давать жизнеспособное потомство (т.е. семена) при скрещивании с первым растением. Обычно, но не обязательно, первое и второе растения относятся к одному и тому же виду. Например, мутантная последовательность AHASL в геноме А растения В. napus может быть при селекции перенесена в растения Brassica, которые также имеют геном А, посредством скрещивания растения В. napus, например, с растением В. juncea. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя одно или более поколений возвратного скрещивания растений-потомков от первого скрещивания с растением такой же линии или генотипа, как и первое или второе растение. Альтернативно, потомство от первого скрещивания или любого последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое является растением другой линии или другого генотипа, чем в случае первого или второго растения. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя отбор растений, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам первого растения.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам повышения резистентности к гербицидам растения, в частности, резистентного к гербицидам растения Brassica, посредством обычной селекции растений, основанной на половом размножении. Способы включают в себя скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое может являться или не являться резистентным к гербициду или может быть резистентным к другому гербициду или гербицидам, отличным от гербицида, к которому резистентно первое растение. Первое растение может представлять собой любое резистентное к гербицидам растение согласно настоящему изобретению, включая, например, трансгенные или нетрансгенные растения, содержащие по меньшей мере одну из молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, которые кодируют резистентную к гербициду AHASL, и нетрансгенные растения Brassica, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам растения Brassica BnCL120C7, BnCL131A1, BnCL140B3 или BnCL140С7. Вторым растением может быть любое растение, которое способно давать жизнеспособные растения-потомки (т.е. семена) при скрещивании с первым растением. Обычно, но не обязательно, первое и второе растения относятся к одному и тому же виду; а также первое и второе растения могут относиться к разными видам, но в пределах одного рода (пример: Brassica juncea х Brassica napus, Brassica juncea x Brassica rapa, Brassica juncea x Brassica oleracea, Brassica juncea x Brassica nigra и т.д.), а также первое и второе растения относятся к разным родам (пример: Brassica х Sinapis). Растения-потомки, полученные таким способом согласно настоящему изобретению, обладают повышенной резистентностью к гербициду по сравнению либо с первым, либо со вторым растением, либо с обоими растениями. В том случае, когда первое и второе растения резистентны к разным гербицидам, растения-потомки будут обладать комбинированными свойствами резистентности к гербицидам первого и второго растений. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя одно или более поколений возвратного скрещивания растений-потомков от первого скрещивания с растением такой же линии или генотипа, как и первое или второе растение. Альтернативно, потомство от первого скрещивания или любого последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое является растением другой линии или другого генотипа, чем в случае первого или второго растения. Способы согласно изобретению дополнительно могут включать в себя отбор растений, которые обладают свойствами резистентности к гербицидам первого растения, второго растения или обоих растений.
Растения согласно настоящему изобретению могут быть трансгенными или нетрансгенными. Примером нетрансгенного растения Brassica, обладающего повышенной резистентностью к имидазолиноно-вым и/или сульфонилмочевинным гербицидам является растение Brassica BnCL131Al, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 или РМ1РМ2/BnCL131А1; или мутантное, рекомбинантное или генетически сконструированное производное растения BnCL131A1, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 или PM1PM2/BnCL131Al; или любое потомство растения BnCL131A1, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 или РМ1РМ2/BnCL131А1; или растение, которое является потомком любого из указанных растений; или растение, которое обладает свойствами резистентности к гербицидам растения BnCL131А1, BnCL120C7, BnCL140B3, BnCL140C7 или PM1PM2/BnCL131A1.
Настоящее изобретение также относится к растениям, органам растения, растительным тканям, растительным клеткам, семенам и клеткам-хозяевам, отличным от клеток человека, которые трансформированы по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кассетой экспрессии или вектором для трансформации согласно изобретению. Такие трансформированные растения, органы растений, растительные ткани, растительные клетки, семена и клетки-хозяева, отличные от клеток человека, обладают повышенной устойчивостью или резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, при использовании уровней гербицида, которые убивают или ингибируют рост нетрансформированного растения, растительной ткани, растительной клетки или клетки-хозяина, отличной от клетки человека, соответственно. В одном варианте трансформированные растения, растительные ткани, растительные клетки и семена согласно изобретению представляют собой растения Brassica и сельскохозяйственные растения.
Настоящее изобретение также относится к семени растения, устойчивого к AHAS-ингибирующим гербицидам, способного давать растение, обладающее резистентностью к AHAS-ингибирующему гербициду, полученному от растений, которые получены способами согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к растению, выращенному из семени растения, обладающего резистентностью к AHAS-ингибирующему гербициду, полученного от растений, выращенных из семени, обладающего свойством резистентности к гербицидам, а также частям растений и культурам тканей из таких растений.
Также в настоящем изобретении предлагается емкость с семенами растения, при этом семена способны производить резистентное к AHAS-ингибирующему гербициду растение. Емкость с семенами может содержать любое количество, массу или объем семян. Например, емкость может содержать, по меньшей мере или больше чем примерно 10, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или больше семян. Альтернативно емкость может содержать, по меньшей мере или больше чем примерно 1 унцию (28,3 г), 5 унций (141,5 г), 10 унций (283 г), 1 фунт (0,453 кг), 2 фунта (0,906 кг), 3 фунта (1,359 кг), 4 фунта (1,812 кг), 5 фунтов (22665 кг) или большую массу семян.
Емкости с семенами Brassica могут представлять собой любую емкость, имеющуюся в данной области. В качестве не ограничивающего примера емкость может представлять собой коробку, мешок, пакет, сумку, ленточный рулон, ведро, фольгу или пробирку.
В другом аспекте семена, находящиеся в емкостях с семенами, могут представлять собой обработанные или необработанные семена. В одном аспекте семена могут быть обработаны для улучшения прорастания, например, с помощью проращивания семян, или посредством дезинфекции, чтобы защитить против имеющихся в семенах патогенов. В другом аспекте семена могут быть покрыты любым доступным покрытием, чтобы улучшить, например, посев, прорастание семян и защиту от патогенов, имеющихся на семенах. Покрытие семян может представлять собой любую форму покрытия для семян, включая без ограничения дражирование, пленочное покрытие и инкрустацию.
Кроме того, растения Brassica можно применять в способах селекции для получения растений, обладающих дополнительными представляющими интерес свойствами в сочетании с устойчивостью к AHAS-ингибитору (также называемыми "суммируемыми свойствами" или "суммированием свойств"), такими как сочетания резистентности к дополнительным гербицидам, таким как глифосат, глюфосинат и/или дикамба. Кроме того, растения Brassica можно применять в способах селекции, чтобы получить растения Brassica, имеющие несколько последовательностей, кодирующих резистентность к AHAS-ингибирующим гербицидам. Также, описанные растения можно применять в способах селекции для получения растений, обладающих свойством устойчивости к AHAS-ингибирующему гербициду в сочетании с другими агрономически важными свойствами, такими как резистентность к заболеваниям и патогенам, такими как свойство, придаваемое геном Bt, резистентность к "черной ножке".
Описанные способы селекции включают способы селекции резистентных к AHAS-ингибирующим гербицидам растений Brassica, при этом способ включает в себя стадии (а) скрещивания растение Bras-sica, содержащего подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую устойчивый к гербицидам белок AHAS, имеющий мутацию в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и мутацию в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, со вторым растением Brassica; и (b) получение семени в результате такого скрещивания. Полученные семена могут быть подвергнуты скринингу, чтобы идентифицировать семена, которые содержат подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты. Такие способы могут дополнительно включать в себя получение образца ДНК из семени от скрещивания и анализ образца в отношении наличия или отсутствия подвергнутой мутагенезу молекулы нуклеиновой кислоты. Альтернативно семена могут быть подвергнуты скринингу в отношении устойчивости к AHAS-ингибирующему гербициду, чтобы идентифицировать семена или потомство, которое экспрессирует нуклеиновую кислоту устойчивой к гербицидам AHAS.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения растения Brassica, обладающего резистентностью к AHAS-ингибирующим гербицидам, включающему в себя: (а) скрещивание первой линии Brassica со второй линией Brassica с образованием сегрегирующей популяции, при этом первая линия Brassica представлена резистентным к AHAS-ингибирующим гербицидам растением, содержащим подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS согласно настоящему изобретению; (b) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к AHAS-ингибирующим гербицидам; и (с) отбор одного или более представителей популяции, имеющих повышенную резистентность AHAS по сравнению с растением Brassica дикого типа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу интрогрессии признака резистентности к AHAS-ингибирующим гербицидам, в растение Brassica, включающему в себя: (а) скрещивание, по меньшей мере, первой линии Brassica, резистентной к AHAS-ингибирующим гербицидам, со второй линией Brassica с получением сегрегирующей популяции; (b) скрининг популяции в отношении повышенной резистентности к AHAS-ингибирующим гербицидам; и (с) отбор по меньшей мере одного представителя популяции, обладающего повышенной резистентностью к AHAS-ингибирующим гербицидам.
Альтернативно в другом аспекте изобретения и первое и второе родительские растения Brassica могут быть резистентными к AHAS-ингибирующим гербицидам растениями Brassica, которые описаны в настоящей публикации. Таким образом, любое растение Brassica, полученное с использованием растения
Brassica, имеющего подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS, которая описана в настоящей публикации, составляет часть изобретения. В используемом в настоящем описании смысле скрещивание может означать самоопыление, скрещивание сибсов, возвратное скрещивание, скрещивание с другой или той же самой родительской линией, скрещивание с популяциями и тому подобное.
В некоторых вариантах подвергнутая мутагенезу молекула нуклеиновой кислоты AHAS согласно изобретению может быть сконструирована в виде молекулярного блока с молекулой нуклеиновой кислоты, которая придает резистентность ко второму гербициду, такому как глифосат или глюфосинат. В других вариантах молекулярный блок дополнительно содержит, по меньшей мере, одну дополнительную молекулу нуклеиновой кислоты, которая придает устойчивость к третьему гербициду. В одном варианте последовательность придает устойчивость к глюфосинату и в конкретном варианте последовательность составляет часть изобретения.
В других вариантах растение Brassica согласно изобретению обладает одним или более представляющими интерес признаками, и в некоторых вариантах подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS компонуют с любым сочетанием последовательностей молекул нуклеиновых кислот, чтобы создать растения с требуемым сочетанием признаков. Признак в используемом в настоящем описании смысле относится к фенотипу, полученному благодаря конкретной последовательности или группе последовательностей. Например, молекулы нуклеиновых кислот, определяющих устойчивость к гербицидам, могут быть скомпонованы с любыми другими молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими полипептиды, обладающие пестицидной и/или инсектицидной активностью, такие как токсичные белки Bacillus thuringiensis (описанные в патентах США № 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881; Geiser et al. (1986) Gene 48:109-118; Lee et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:4648-4657 (Vip3A); Galitzky et al. (2001) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 57:1101-1109 (Cry3Bb1); and Herman et al. (2004) J. Agric. Food Chem. 52:2726-2734 (Cry1F)), lectins (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825-830, пентин (описанный в патенте США № 5981722) и тому подобные. Создаваемые сочетания также могут включать в себя множественные копии любой одной из представляющих интерес молекул нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS можно компоновать с другими признаками устойчивости к гербицидам, чтобы создать растение Brassica согласно изобретению с дополнительными улучшенными свойствами. Другие молекулы нуклеиновой кислоты, определяющие устойчивость к гербицидам, которые можно использовать в таких вариантах, включают молекулы, придающие устойчивость к глифосату или к ингибиторам AHAS с другим механизмом действия, такие как, например, ген, который кодирует фермент глифосатоксидоредуктазу, который более полно описан в патентах США № 5776760 и 5463175. Другие признаки, которые можно сочетать с подвергнутой мутагенезу молекулой нуклеиновой кислоты AHAS, включают признаки, которые обусловлены молекулами нуклеиновых кислот, которые придают растению способность продуцировать высокий уровень 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS), которые более полно описаны, например, в патентах США № 6248876В1, 5627061, 5804425, 5633435, 5145783, 4971908, 5312910, 5188642, 4940835,
5866775, 6225114В1, 6130366, 5310667, 4535060, 4769061, 5633448, 5510471, Re. 36449, RE 37287 Е и 5491288 и международных публикациях WO 97/04103, WO 00/66746, WO 01/66704 и WO 00/66747. Другие признаки, которые можно сочетать с подвергнутыми мутагенезу молекулами нуклеиновых кислот AHAS, включают молекулы, которые придают признаки устойчивости к сульфонилмочевине и/или ими-дазолинону, которые более полно описаны, например, в патентах США № 5605011, 5013659, 5141870, 5767361, 5731180, 5304732, 4761373, 5331107, 5928937 и 5378824 и международной публикации WO
96/33270.
Таким образом, предлагаются растения Brassica, которые содержат подвергнутые мутагенезу молекулы нуклеиновой кислоты AHAS согласно настоящему изобретению в сочетании (т.е. "скомпонованные") с другими мутантными или рекомбинантными нуклеиновыми кислотами, кодирующими представляющие интерес гены, такими как молекулы нуклеиновых кислот, определяющие устойчивость к AHAS-ингибиторам. В одном примере дополнительные молекулы нуклеиновых кислот, определяющие устойчивость к AHAS-ингибиторам, которые можно использовать в таких сочетаниях, могут содержать любую мутацию по сравнению с последовательностью AHAS дикого типа, например, белки AHAS, имеющие мутации P197S, A205V, S653N, W574L и/или А122Т и их сочетания (например, последовательность AHAS с двойной или тройной мутацией). В одном примере предлагаются растения Brassica, которые объединяют в себе устойчивый к гербицидам белок AHASL, содержащий аминокислотные мутации в положениях А122 и S653, с другим устойчивым к гербицидам белком AHASL, содержащим аминокислотную мутацию в положении W574, и устойчивым к гербицидам белком AHASL, содержащим аминокислотную мутацию в положении S653. Также предлагаются семена таких мутантных линий растений Brassica, например, линии, называемой PM1PM2/BnCL131A1. Образец указанного семени депонирован в АТСС с номером доступа РТА-10321.
Кроме того, мутантные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, комбинируемые с нуклеиновыми кислотами устойчивости к AHAS-ингибиторам, могут быть локализованы в любом из геномов Brassica и давать гетерозиготные или гомозиготные сочетания. Таким образом, представляющие интерес
нуклеиновые кислоты для применения в сочетаниях, могут быть в одном и том же или в разных геномах в виде нуклеиновой кислоты с двойной мутацией устойчивости к AHAS-ингибиторам согласно настоящему изобретению. Например, предлагаются растения Brassica napus (содержащие геном ААСС), содержащие подвергнутую мутагенезу AHAS согласно настоящему изобретению в сочетании с молекулами нуклеиновых кислот, определяющими устойчивость к имидазолинону, локализованными, например, в геноме "А", с получением гетерозиготного сочетания, или в геноме "С", с получением гомозиготного сочетания. В другом примере предлагаются растения Brassica juncea (содержащие геном ААВВ), содержащие подвергнутую мутагенезу AHAS согласно настоящему изобретению в сочетании с молекулами нуклеиновых кислот, определяющими устойчивость к имидазолинону, локализованными, например, в геноме "А", с получением гетерозиготного сочетания, или в геноме "В", с получением гомозиготного сочетания. В еще одном примере предлагаются растения Brassica rapa (содержащие геном АА), содержащие подвергнутую мутагенезу AHAS согласно настоящему изобретению в сочетаниях с молекулами нуклеиновых кислот, определяющих устойчивость к имидазолинону, локализованными, например, в геноме "А" с получением гетерозиготного сочетания.
Примерами таких растений Brassica являются растения Brassica napus, которые содержат подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS согласно настоящему изобретению в сочетании с РМ2, которая представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты AHASL из генома А, содержащую одну мутацию, W574L (см., например, WO 2004/040011), и в некоторых вариантах в дополнительном сочетании с РМ1, которая представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты AHASL из последовательности генома С, содержащую одну мутацию S653N (см., например, WO 2004/040011). Другим примером являются растения Brassica juncea, содержащие подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS согласно настоящему изобретению в сочетании с bR, которая представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты AHASL из генома В, содержащую одну мутацию S653N (например, публикации патентов США № 2005/0283858 и 2009/0013424). Другими примерами являются растения Brassica, содержащие подвергнутые мутагенезу молекулы нуклеиновой кислоты AHAS согласно настоящему изобретению в сочетании с РМ1.
В некоторых вариантах сочетания устойчивых к AHAS-ингибиторам нуклеиновых кислот могут обеспечивать любой уровень устойчивости к AHAS-ингибитору, например аддитивные эффекты или синергетические эффекты.
В некоторых вариантах подвергнутые мутагенезу молекулы нуклеиновой кислоты AHAS можно компоновать, например, с гидроксифенилпируватдиоксигеназами, которые представляют собой ферменты, которые катализируют реакцию, в которой парагидроксифенилпируват (НРР) превращается в гомо-гентизат. Молекулы, которые ингибируют такой фермент и которые связываются с ферментом, чтобы ингибировать превращение НРР в гомогентизат, применимы в качестве гербицидов. Признаки, придающие устойчивость к таким гербицидам, у растений описаны в патентах США № 6245968 В1, 6268549 и 6069115, и в международной публикации WO 99/23886. Другие примеры подходящих признаков устойчивости к гербицидам, которые можно сочетать с подвергнутыми мутагенезу последовательностями AHAS, включают молекулы нуклеиновой кислоты диоксигеназы арилоксиалканоата (которые, как сообщают, придают устойчивость к 2,4-D и другим феноксиауксиновым гербицидам, а также к арилоксифе-ноксипропионатным гербицидам, которые описаны, например, в WO 2005/107437) и молекулы нуклеиновой кислоты, придающие устойчивость к дикамбе, которые описаны, например, в Herman et al. (2005)
J. Biol. Chem. 280:24759-24767.
Другие примеры признаков устойчивости к гербицидам, которые можно сочетать с подвергнутыми мутагенезу молекулами нуклеиновой кислоты AHAS согласно настоящему изобретению, включают признаки, придаваемые молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими экзогенную ацетилтрансферазу
фосфинотрицина, которые описаны в патента США № 5969213, 5489520, 5550318, 5874265, 5919675,
5561236, 5648477, 5646024, 6177616 и 5879903. Растения, содержащие экзогенную ацетилтрансферазу фосфинотрицина, могут проявлять повышенную устойчивость к глюфосинатным гербицидам, которые ингибируют фермент глутаминсинтазу. Другие примеры признаков устойчивости к гербицидам, которые можно сочетать с подвергнутыми мутагенезу последовательностями AHAS, включают признаки, придаваемые молекулами нуклеиновых кислот, обеспечивающими измененную активность протопорфинино-геноксидазы (протокса), которые описаны в патентах США № 6288306 В1, 6282837 В1 и 5767373, и в международной публикации WO 01/12825. Растения, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот, могут проявлять повышенную устойчивость к любому из множества гербицидов, мишенью которых является фермент протоке (также называемых "ингибиторами протокса").
Другие примеры генов устойчивости к гербицидам, которые можно сочетать с подвергнутыми мутагенезу молекулами нуклеиновых кислот AHAS, включают гены, придающие устойчивость к гербициду дикамба. Такие гены известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 7022896 и публикации патента США № 2008/0015110.
Другими примерами признаков устойчивости к гербицидам, которые можно сочетать с подвергнутыми мутагенезу молекулами нуклеиновых кислот AHAS согласно настоящему изобретению, являются признаки, придающие устойчивость, по меньшей мере, к одному гербициду у такого растения, например,
как растение Brassica. Устойчивые к гербицидам растения Brassica известны в данной области, как, например, растения, которые обладают варьирующей устойчивостью к конкретным гербицидам. См., например, патент США № 5627061. Признак (признаки), ответственный за такую устойчивость, можно сочетать, используя селекцию или другие способы, такие как трансгенные способы, с подвергнутыми мутагенезу молекулами нуклеиновой кислоты AHAS, чтобы получить растение согласно изобретению, а также осуществить способы его применения.
Подвергнутые мутагенезу молекулы нуклеиновых кислот AHAS также можно сочетать, по меньшей мере, с одним другим признаком, чтобы получить растения согласно настоящему изобретению, которые дополнительно обладают сочетанием нескольких требуемых признаков, включая без ограничения признаки, необходимые при получении кормов для животных, такие как высоко содержание масла (например, патента США № 7238856, 7268276), аминокислотный состав, содержание белка, улучшенное усвоение или измененные составы жирных кислот.
Подвергнутые мутагенезу молекулы нуклеиновых кислот AHAS также можно сочетать с другими требуемыми признаками, такими как, например, гены авирулентности и резистентности к заболеваниям (Jones et al. (1994) Science 266:789-793; Martin et al. (1993) Science 262:1432-1436; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089-1099), и признаками, необходимыми для обработки и получения таких продуктов, как модифицированные масла (например, гены десатуразы жирных кислот (патент США № 5952544, WO 94/11516)), и полимеры или биопластики (например, патент США № 5602321, бета-кетотиолаза, поли-гидроксибутиратсинтаза и ацетоацетил-СоА-редуктаза (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) способствуют экспрессии полигидроксиалканоатов (PHA)). Также можно сочетать устойчивые к гербицидам молекулы нуклеиновых кислот с молекулами нуклеиновых кислоты, обеспечивающими любые агрономические признаки.
Блоки сочетаний могут быть созданы любым способом, включая без ограничения селекцию растений любым известным способом или генетическую трансформацию или сочетания способов. Если последовательности компонуют с помощью генетической трансформации растений, то последовательности представляющих интерес молекул нуклеиновых кислот можно сочетать в любой момент времени и в любом порядке. Признаки могут быть введены одновременно при использовании протокола котрансформа-ции с представляющими интерес молекулами нуклеиновых кислот, представленных в любом сочетании в кассетах для трансформации. Например, если будут введены две последовательности, то две последовательности могут находиться в отдельных кассетах для трансформации (транс) или находиться в одной и той же кассете для трансформации (цис). Экспрессией последовательностей может управлять один и тот же промотор или разные промоторы. В некоторых случаях может быть желательным введение кассеты для трансформации, которая будет супрессировать экспрессию представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты. Кассету можно сочетать с любым сочетанием других супрессирующих кассет или сверхэкспрессирующими кассетами, чтобы создать требуемое сочетание признаков растения. Кроме того, понятно, что молекулы нуклеиновой кислоты могут быть скомпонованы в требуемой геномной локализации с использованием сайт-специфичной системы рекомбинации. См., например, публикации WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 и WO 99/25853, которые все включены в настоящее описание в виде ссылки.
Способы регистрации
Также предлагаются способы и композиции для идентификации растения, содержащего подвергнутые мутагенезу молекулы нуклеиновых кислот и полипептиды AHAS, включая потомство и производные. Такие способы применимы для идентификации и/или выявления растений, содержащих такие подвергнутые мутагенезу последовательности в любом биологическом материале. Такие способы включают, например, способы подтверждения чистоты семян и способы скрининга семян в партии семян в отношении подвергнутых мутагенезу последовательностей согласно настоящему изобретению. В одном варианте предлагается способ идентификации подвергнутых мутагенезу последовательностей AHAS в биологическом образце, который включает в себя образование смеси биологического образца и праймеров первой и второй нуклеиновых кислот, способных амплифицировать подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS; взаимодействие в смеси в условиях, которые позволяют праймерам первой и второй нуклеиновых кислот амплифицировать подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS; и выявление наличия или отсутствия амплифицированной подвергнутой мутагенезу последовательности молекулы нуклеиновой кислоты AHAS.
Амплифицированная молекула нуклеиновой кислоты (ампликон) может быть любой длины, которая позволяет выявлять подвергнутую мутагенезу последовательность AHAS. Например, ампликон может иметь длину примерно 10, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 100, 2000, 3000, 4000, 5000 нуклеотидов или больше.
Также предлагаются способы идентификации или выявления подвергнутой мутагенезу последовательности AHAS в биологическом образце, включающие в себя создание смеси, содержащей биологический образец, который содержит ДНК Brassica, и зонд молекулы нуклеиновой кислоты, который способен гибридизоваться с подвергнутой мутагенезу молекулой нуклеиновой кислоты, взаимодействие в смеси в условиях, которые позволяют зонду молекулы нуклеиновой кислоты гибридизоваться с подверг- 27
нутой мутагенезу молекулой нуклеиновой кислоты AHAS, и выявление того, гибридизуется ли зонд молекулы нуклеиновой кислоты с подвергнутой мутагенезу молекулой нуклеиновой кислоты AHAS в образце, при этом наличие гибридизации свидетельствует о присутствии подвергнутой мутагенезу молекулы нуклеиновой кислоты AHAS. Трансгеника
Настоящее изобретение также относится к способам повышения активности AHAS в растении, включающим в себя трансформацию растения конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей промотор, оперативно связанный с полинуклеотидом AHASL согласно изобретению. Способы включают в себя введение конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению, по меньшей мере, в одну растительную клетку и регенерацию растения из такой клетки. Конструкция нуклеиновой кислоты содержи по меньшей мере один полинуклеотид, который кодирует резистентной к гербицидам белок AHASL согласно изобретению, в частности, нуклеотидные последовательности BN02-120 или BN02-131, указанные на фиг. 3 и 4, и их фрагменты и варианты. Способы дополнительно включают в себя применение промотора, который способен управлять экспрессией генов в растительной клетке. В одном варианте такой промотор является конститутивным промотором или предпочтительным для ткани промотором. Растение, полученное таким способом, содержит повышенную активность AHAS, в частности устойчивую к гербицидам активность AHAS, по сравнению с нетрансформированным растением. Таким образом, способы применимы для усиления или повышения резистентности растения, по меньшей мере, к одному гербициду, который препятствует каталитической активности фермента AHAS, в частности к имидазолиноно-вому гербициду.
В одном варианте способы получения резистентного к гербицидам растения включает в себя трансформацию растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, оперативно связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке, и регенерацию трансформированного растения из указанной трансформированной растительной клетки. Нуклеотидную последовательность выбирают из нуклеотидных последовательностей, которые кодируют резистентные к гербицидам белки AHASL согласно изобретению, в частности, нук-леотидных последовательностей BN02-120 или BN02-131, указанных на фиг. 3 и 4, и их фрагментов и вариантов. Резистентное к гербицидам растение, полученное таким способом, обладает повышенной резистентностью, по сравнению с нетрансформированным растением, по меньшей мере, к одному гербициду, в частности, к гербициду, который препятствует активности фермента AHAS, такому как, например, имидазолиноновый гербицид или сульфонилмочевинный гербицид.
Резистентность к гербицидам и борьба сорняками
Резистентные к AHAS-ингибирующим гербицидам растения согласно изобретению применимы в способах борьбы с сорняками. Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу борьбы с сорняками, растущими рядом с резистентным к гербицидам растением, таким как растение Brassica, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты AHAS согласно изобретению. Способ включает в себя нанесение эффективного количества AHAS-ингибирующего гербицида на сорняки и резистентное к гербициду растение, при этом растение обладает резистентностью по меньшей мере к одному AHAS-ингибирующему гербициду, такому как имидазолиноновый или сульфонилмочевинный гербицид, по сравнению с растением дикого типа. В таких способах можно использовать любые растения, имеющие последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. В одном варианте резистентными к гербицидам растениями согласно изобретению являются сельскохозяйственные растения Brassica, включая без ограничения Brassica napus, Brassica rapa и Brassica juncea.
Благодаря получению растений, обладающих повышенной резистентностью к AHAS-инги-бирующим гербицидам, таким как имидазолиноновые и сульфонилмочевинные гербициды, можно использовать широкое множество препаратов для защиты растений от сорняков, для того чтобы ускорить рост растений и снизить конкуренцию за питательные вещества. Гербицид можно использовать отдельно для довсходовой, послевсходовой, предпосевной и осуществляемой при посеве борьбы с сорняками на площадях, окружающих растения, описанные в настоящей публикации, или можно использовать препарат AHAS-ингибирующего гербицида, который содержит другие добавки. Гербицид также можно применять для обработки семян. Эффективную концентрацию или эффективное количество гербицида или композиции, содержащей эффективную концентрацию или эффективное количество гербицида, можно вносить непосредственно в семена перед или во время посева семян. Добавки, имеющиеся в препарате или композиции AHAS-ингибирующего гербицида, включают другие гербициды, детергенты, адъюван-ты, средства для распыления, склеивающие средства, стабилизаторы или тому подобное. Гербицидный препарат может представлять собой влажный или сухой препарат, и такие препараты включают без ограничения сыпучие порошки, эмульгируемые концентраты и жидкие концентраты. Гербицид и герби-цидные препараты можно применять согласно обычным способам, например, опрыскиванием, орошением, опылением, нанесением покрытия и тому подобными способами.
AHAS-ингибирующий гербицид для применения в способах, предлагаемых в настоящем описании, можно применять, используя любой способ, известный в данной области, включая без ограничения обработку семян, обработку почвы и внекорневую обработку.
Настоящее изобретение относится к способам повышения устойчивости или резистентности растения, растительной ткани, растительной клетки или другой клетки-хозяина, по меньшей мере, к одному гербициду, который препятствует проявлению активности Фермента AHAS. Предпочтительно такой AHAS-ингибирующий гербицид является имидазолиноновым гербицидом, сульфонилмочевинным гербицидом, триазолопиримидиновым гербицидом, пиримидинилоксибензоатным гербицидом, сульфони-ламинокарбонилтриазолиноновым гербицидом или их смесью. Более предпочтительно такой гербицид является имидазолиноновым гербицидом, сульфонилмочевинным гербицидом или их смесью. В случае настоящего изобретения имидазолиноновые гербициды включают без ограничения PURSUIT(r) (имазе-тапир), CADRE(r) (имазапик), RAPTOR(r) (имазамокс), SCEPTER(r) (имазахин), ASSERT(r) (имазетабенз), ARSENAL(r) (имазапир), производное любого из вышеназванных гербицидов и смесь двух или более из вышеназванных гербицидов, например, имазапир/имазамокс (ODYSSEY(r)). Более конкретно имидазоли-ноновый гербицид может быть выбран из группы, без ограничения состоящей из 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидиазолин-2-ил)никотиновой кислоты, [2-(4-изопропил)-4-][метил-5-оксо-2-имидазо-лин-2-ил)-3-хинолинкарбоновой]кислоты, [5-этил-2-(4-изопропил-]-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислоты, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)нико-тиновой кислоты, [2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-]имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновой кислоты и смеси метил[6-(4-изопропил-4-]метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил[2-(4-изопропил-4-метил-5-]оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата. Применение 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-ими-дазолин-2-ил)никотиновой кислоты и [2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-]ил)-5-(метокси-метил)никотиновой кислоты является предпочтительным. Особенно предпочтительным является применение [2-(4-изопропил-4]метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты.
В случае настоящего изобретения к сульфонилмочевинным гербицидам относятся без ограничения хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, трифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлу-сульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флузасуль-фурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, эток-сисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфуронметил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфу-рон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, производное любого из вышеуказанных гербицидов и смесь двух или более из вышеуказанных гербицидов. Триазолопиримидиновые гербициды согласно изобретению включают без ограничения клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пенокссулам. Пиримидинилоксибензоатные гербициды согласно изобретению включают без ограничения биспирибак, пиритиобак, пириминобак, пири-бензоксим и пирифталид.
Сульфониламинокарбонилтриазолиноновые гербициды включают без ограничения флукарбазон и пропоксикарбазон.
Понятно, что пиримидинилоксибензоатные гербициды являются близко родственными пиримиди-нилтиобензоатным гербицидам, и Американским научным обществом по исследованию сорняков указанным гербицидам присвоено одно общее последнее название. Соответственно к гербицидам согласно настоящему изобретению дополнительно относятся пиримидинилтиобензоатные гербициды, включая без ограничения пиримидинилоксибензоатные гербициды, описанные выше.
Настоящее изобретение также относится к сельскохозяйственным композициям для применения по отношению к описанным растениям Brassica. Такие композиции могут включать в себя гербициды, фунгициды, бактерицидные средства, удобрения и тому подобное. В одном варианте сельскохозяйственные композиции представляют собой гербицидные композиции, содержащие один или более гербицидов или сочетаний одного или более гербицидов с другой сельскохозяйственной композицией, такой как фунгицид, бактерицидная композиция, удобрение и тому подобное.
Любой гербицид можно применять на сельскохозяйственной культуре, части культурного растения или определенной площади культивирования, на которой находится растение Brassica, содержащее устойчивую к AHAS-ингибитору последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
Классификация гербицидов (т.е. группирование гербицидов по классам и подклассам) хорошо из-
вестна в данной области и включает классификацию согласно HRAC (комитет действий по резистентно-
сти к гербицидам) и WSSA (Американское научное общество по сорнякам). Классификация HRAC дос-
тупна во всем мире, например, на вебсайте hracglob-
al.com/Publications/ClassificationofHerbicideModeofAction/tabid/222/Default.aspx.
В некоторых вариантах настоящее изобретение относится к способам, которые заключаются в применении по меньшей мере одного AHAS-ингибирующего гербицида, выбранного из группы, состоящей из имидазолиноновых гербицидов, сульфонилмочевинных гербицидов, триазолопиримидиновых гербицидов, пиримидинилоксибензоатных гербицидов, сульфониламинокарбонилтриазолиноновых гербицидов и их смесей. В указанных способах AHAS-ингибирующий гербицид можно вносить любым способом, известным в данной области, включая без ограничения обработку семян, обработку почвы и обра
ботку листьев.
В некоторых вариантах AHAS-ингибирующий гербицид можно сочетать с одной или более дополнительными сельскохозяйственными композициями, такими как дополнительные гербицидные, фунги-цидные, бактерицидные, противовирусные композиции или их сочетания. Дополнительные гербициды для применения в таких сочетаниях представляют собой любой гербицид, включая сульфамидные гербициды, фосфорорганические гербициды и бензотиадиазиноновые гербициды. Сульфамидные гербициды включают без ограничения сафлуфенацил.
Фосфорорганические гербициды включают без ограничения глифосат и глюфосинат. Бензотиадиа-зиноновые гербициды включают без ограничения бентазон. Фунгициды для применения в таких сочетаниях включают без ограничения пираклостробин.
Гербициды, ингибирующие оксидазу протопорфириногена [IX] (РРО), также применимы в композициях согласно настоящему изобретению. РРО-ингибирующие гербициды известны в данной области и включают без ограничения гербициды на основе дифенилового эфира (включая гербициды на основе нитрофенилового эфира), такие как ацифлуорфен (5-[2-хлор-4-(трифторметил)фенокси]-2-нитробензой-ная кислота), бифенокс (метил-5-(2,4-дихлорфенокси)-2-нитробензоат), DPEI (5-[2-хлор-4-(трифтор-метил)фенокси]-2-нитроацетофеноноксим-о-уксусной кислоты (метиловый эфир)), DPEII (5-[2-хлор-4-(трифторметил)фенокси]-3-метоксифталид), этоксифен ((]^)-1-карбоксиэтил-2-хлор-5-[2-хлор-4-(три-фторметил)фенокси]бензоат), фомесафен (5- [2-хлор-4-(трифторметил)фенокси]^-(метилсульфонил)-2-нитробензамид), лактофен (этил-О-[5-(2-хлор-a,a,a,-трифтор-п-толилокси)-2-нитробензоил]-DL-лактат) и оксифлуорфен (2-хлор-1-(З-этокси-4-нитрофенокси)-4-(трифторметил)бензен). РРО-ингибирующие гербициды также включают дикарбоксимидные гербициды, такие как N-фенилфталимиды флумиклорак ([2-хлор-5-(циклогекс-1-ен-1,2-дикарбоксимидо)-4-фторфенокси]уксусная кислота), флумиоксазин (N-(7-фтор-3,4-дигидро-3 -оксо-4-проп-2-инил-2Н-1,4-бензоксазин-6-ил)циклогекс-1 -ен- 1,2-дикарбоксамид). РРО-ингибирующие гербициды дополнительно включают триазолиноновые гербициды, такие как кар-фентразон (а,2-дихлор-5-[4-(дифторметил)-4,5-дигидро-3-метил-5-оксо-1Н-1,2,4-триазол-1-ил]-4-фтор-бензолпропионовая кислота) и сульфентразон (N-[2,4-дихлор-5-[4-(дифторметил)-4,5-дигидро-3-метил-5-оксо-1Н-1,2,4-триазол-1-ил]фенил]метансульфонамид). РРО-ингибирующие гербициды также включают фенилпиразоловые гербициды, включая без ограничения нипираклофен (1-[2,6-дихлор-4-(три-фторметил)фенил]-4-нитро-1Н-пиразол-5-амин) и пирафлуфен (2-хлор-5-(4-хлор-5-дифторметскси-1-метилпиразол-3-ил)-4-фторфеноксиуксусную кислоту). РРО-ингибирующие гербициды также включают оксадиазолоновые гербициды, такие как оксадиазон (3-[2,4-дихлор-5-(1-метилэтокси)фенил]-5-(1,1-диметилэтил)-1,3,4-оксадиазол-2(3Н)-он) и оксадиаргил (5-трет-бутил-3-[2,4-дихлор-5-(проп-2-инилок-си)фенил]-1,3,4-оксадиазол-2(ЗН)-он). РРО-ингибирующие гербициды дополнительно включают тиадиа-золоновые гербициды, такие как флутиацет ([[2-хлор-4-фтор-5-[(тетрагидро-3-оксо-1Н,3Н-[1,3,4]ти-адиазоло[3,4-а]пиридазин-1-илиден)амино]фенил]тио]уксусная кислота); а также гербициды, описанные в разделе III.4 US 2008254985, (Zagar and Sievernich, публикация включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме).
Ауксиновые гербициды также применимы в композициях согласно настоящему изобретению. Аук-синовые гербициды включают гербициды, содержащие гербицидно активные ингредиенты, которые действуют как миметики ауксина или ингибиторы ауксина (антиауксины). Примеры ауксиновых гербицидов включают без ограничения пиклорам (4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновую кислоту); дикамбу (3,6-дихлор-2-метоксибензойную кислоту); клофибриновую кислоту ((п-хлорфенокси)изомасляную кислоту); 2-(4-хлорфенокси)-2-метилпропионовую кислоту); беназолин (4-хлор-2-оксо-3-бензотиазолуксусную кислоту; 4-хлор-2-оксобензотиазолин-3-илуксусную кислоту); TIBA (2,3,5-трийодбензойную кислоту); 2,3,6-ТВА (2,3,6-трихлорбензойную кислоту); триклопир (3,5,6-трихлор-2-пиридилоксиуксусную кислоту); квинклорак (3,7-дихлорхинолин-8-карбоновую кислоту); и имитирующие ауксин или блокирующие ауксин феноксигербициды, например, гербициды на основе феноксиуксусной, феноксипропионовой и феноксимасляной кислот, включая: 2,4-D ((2,4-дихлорфенокси)уксусную кислоту), МСРА ((4-хлор-2-метилфенокси)уксусную кислоту), 2,4-DB (4-(2,4-дихлорфенокси)масляную кислоту), 2,4-DEP (трис[2-(2,4-дихлорфенокси)этил]фосфат), 4-СРА (4-хлорфеноксиуксусную кислоту), 2,4,5-Т ((2,4,5-три-хлорфенокси)уксусную кислоту), дихлорпроп (2-(2,4-дихлорфенокси)пропионовую кислоту), фенопроп (2-(2,4,5-трихлорфенокси)пропионовую кислоту) и мекопроп (2-(2-метил-4-хлорфенокси)пропионовую кислоту).
Примеры сочетаний сельскохозяйственных композиций согласно настоящему изобретению включают: имазапир и имазапик; имазапир и бентазон; имазапир, имазапик и бентазон; имазапир и пиракло-стробин; имазапир, имазапик и пираклостробин; имазапир и сафлуфенацил; имазапир, имазапик и саф-луфенацил; имазапик, сафлуфенацил и глифосат; имазапир, имазапик, сафлуфенацил и глифосат; имаза-пик и глифосат; имазапир и глифосат; имазапир, сафлуфенацил и глифосат; и сафлуфенацил и глифосат.
Перед применением AHAS-ингибирующий гербицид может быть превращен в обычные препараты, например растворы, эмульсии, суспензии, пылевидные препараты, порошки, пасты и гранулы. Форма применения зависит от конкретной предполагаемой цели; в каждом случае она должна гарантировать
тонкодисперсное и равномерное распределение соединения согласно изобретению.
Препараты могут быть приготовлены известным способом (см., например обзор в US 3060084, ЕРА 707 445 (жидкие концентраты), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 and et seq. WO 91/13546, US 4172714, US 4144050, US 3920442, US 5180587, US 5232701, US 5208030, GB 2095558, US 3299566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 and Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 07514-0443-8), например, посредством приготовления активного соединения вместе с вспомогательными средствами, подходящими для приготовления агрохимикатов, такими как растворители и/или носители, при необходимости эмульгаторы, поверхностно-активные вещества и диспергирующие агенты, консерванты, противопенные средства, антифризы, в случае препарата для обработки семян также необязательно красители и/или связывающие средства и/или гелеобразующие средства.
Примерами растворителей, подходящих для применения в таких препаратах, являются вода, ароматические растворители (например, продукты Solvesso, ксилен), парафины (например, фракции минерального масла), спирты (например, метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, цик-логексанон, гамма-бутиролактон), пирролидоны (NMP, NOP), ацетаты (гликольдиацетат), гликоли, диме-тиламиды жирных кислот, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот. Также можно использовать смеси растворителей.
Примерами носителей, подходящих для применения в препаратах согласно настоящему изобретению, являются измельченные природные минералы (например, каолины, глины, тальк, мел) и измельченные синтетические минералы (например, высокодисперсный диоксид кремния, силикаты).
Подходящими эмульгаторами для применения в препаратах согласно настоящему изобретению являются неионные и анионные эмульгаторы (например, эфиры полиоксиэтилена и жирных спиртов, ал-килсульфонаты и арилсульфонаты).
Примерами диспергирующих средств для применения в препаратах согласно настоящему изобретению являются лигнин-отработанный сульфитный щелок и метилцеллюлоза.
Подходящими поверхностно-активными веществами для применения в препаратах согласно настоящему изобретению являются соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов и аммония и лигносульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, фенолсульфоновой кислоты, дибутилнаф-талинсульфоновой кислоты, алкиларилсульфонаты, алкилсульфаты, алкилсульфонаты, сульфаты жирных спиртов, сульфатированные гликолевые эфиры жирных спиртов и жирных кислот, а также конденсаты сульфонированного нафталина и производных нафталина с формальдегидом, конденсаты нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленоктилфеноловый эфир, этоксилированный изооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, эфиры алкилфенолполигликоля, эфир трибутилфенилполигликоля, эфир тристеарилфенилполигликоля, алкиларилполиэфирные спирты, конденсаты этиленоксида со спиртами и жирными спиртами, этоксилированное касторовое масло, поли-оксиэтиленалкиловые эфиры, этоксилированный полиоксипропилен, ацеталь полигликолевого эфира лаурилового спирта, сложные эфиры сорбита, лигносульфитный отработанный щелок и метилцеллюлоза.
Веществами, которые подходят для получения непосредственно разбрызгиваемых растворов, эмульсий, паст или масляных дисперсий, являются фракции минерального масла с точкой кипения от среднего до высокого значения, такие как керосин или соляровое масло, кроме того, каменноугольные смолы и масла растительного или животного происхождения, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например, толуол, ксилол, парафин, тетрагидронафталин, алкилированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогенсанол, циклогексанон, изофорон, высоко полярные растворители, например, диметилсульфоксид, N-метилпирролидон или вода.
Также в препарат могут быть добавлены антифризы, такие как глицерин, этиленгликоль, пропи-ленгликоль и бактерицидные средства.
Подходящими противопенными средствами для применения в препаратах согласно настоящему изобретению являются, например, противопенные средства на основе кремния или стеарата магния.
Подходящими консервантами для применения в препаратах согласно настоящему изобретению являются, например, дихлорфенол и полуформальдегид бензилового спирта.
Препараты для обработки семян согласно настоящему изобретению дополнительно могут содержать связывающие средства и необязательно красители.
Связывающие средства могут быть добавлены к описанным препаратам для обработки семян для улучшения адгезии активных вещества на семенах после обработки. Подходящими связывающими средствами являются поверхностно-активные вещества на основе блок-сополимеров ЕО/РО, а также поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, полиакрилаты, полиметакрилаты, полибутены, полиизобути-лены, полистирол, полиэтиленамины, полиэтиленамиды, полиэтиленимины (Lupasol(r), Polymin(r)), полиэфиры, полиуретаны, поливинилацетат, тилоза и сополимеры, полученные из таких полимеров.
Необязательно в препарат также могут быть включены красители. Подходящими красителями для
препаратов, используемых для обработки семян, являются родамин В, C.I. пигмент красный 112, C.I. растворитель-красный 1, пигмент синий 15:4, пигмент синий 15:3, пигмент синий 15:2, пигмент синий 15:1, пигмент синий 80, пигмент желтый 1, пигмент желтый 13, пигмент красный 112, пигмент красный 48:2, пигмент красный 48:1, пигмент красный 57:1, пигмент красный 53:1, пигмент оранжевый 43, пигмент оранжевый 34, пигмент оранжевый 5, пигмент зеленый 36, пигмент зеленый 7, пигмент белый 6, пигмент коричневый 25, основной фиолетовый 10, основной фиолетовый 49, кислый красный 51, кислый красный 52, кислый красный 14, кислый синий 9, кислый желтый 23, основной красный 10, основной красный
108.
Примером подходящего гелеобразующего средства является карраген (Satiagel(r)).
Порошки, вещества для рассеивания и распыляемые продукты могут быть получены смешиванием или совместным измельчением активных веществ с твердым носителем.
Гранулы, например, гранулы с покрытием, гранулы с пропиткой и гомогенные гранулы, могут быть получены связыванием активных соединений с твердыми носителями. Примерами твердых носителей являются минералы, такие как силикагели, силикаты, тальк, каолин, аттапульгит, известняк, известь, мел, железистая известковая глина, лесс, глина, доломит, диатомовая земля, сульфат кальция, сульфат магния, оксид магния, измельченные синтетические материалы, удобрения, такие как, например, сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевины, и продукты растительного происхождения, такие как мука из злаков, мука из древесной коры, древесная мука и мука из ореховой скорлупы, целлюлозные порошки и другие твердые носители.
В общем, препараты содержат от 0,01 до 95 мас.%, предпочтительно от 0,1 до 90 мас.% AHAS-ингибирующего гербицида. В данном случае применяют AHAS-ингибирующие гербициды с чистотой от 90 до 100 мас.%, предпочтительно от 95 до 100 мас.% (согласно ЯМР-спектру). В целях обработки семян соответствующие препараты можно разбавить в 2-10 раз, получая концентрации в готовых к применению препаратах от 0,01 до 60 мас.% активного соединения, предпочтительно от 0,1 до 40 мас.%.
AHAS-ингибирующий гербицид может быть использован как таковой, в форме препаратов или в виде полученных из них форм для применения, например в форме непосредственно разбрызгиваемых растворов, порошков, суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, распыляемых продуктов, веществ для рассеивания или гранул, с помощью разбрызгивания, распыления, опыливания, рассеивания или заливки. Формы для применения полностью зависят от предполагаемых целей; они должны в каждом случае гарантировать наилучшее распределение AHAS-ингибирующего гербицида согласно изобретению.
Применяемые водные формы могут быть получены из концентратов эмульсий, паст или смачиваемых порошков (распыляемых порошков, масляных дисперсий) посредством добавления воды. Чтобы получить эмульсии, пасты или масляные дисперсии вещества как таковые или растворенные в масле или растворителе могут быть гомогенизированы в воде с использованием увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергирующего средства или эмульгатора. Однако также можно получать концентраты, состоящие из активного вещества, увлажнителя, вещества для повышения клейкости, диспергирующего средства или эмульгатора, и в соответствующем случае растворителя или масла, и такие концентраты являются подходящими для разбавления водой.
Концентрации активного соединения в готовых к применению препаратах могут варьировать в относительно широких диапазонах. В общем, они составляют от 0,0001 до 10%, предпочтительно от 0,01 до 1 мас.%.
AHAS-ингибирующий гербицид также можно успешно применять в способе, основанном на использовании сверхмалых объемов (ULV), и при этом можно применять препараты, содержащие более 95 мас.% активного соединения, или даже применять активное соединение без добавок.
Далее приведены примеры препаратов:
1. Продукты для разбавления водой в случае внекорневой обработки. В целях обработки семян такие продукты можно наносить на семена разбавленными или неразбавленными.
A) Растворимые в воде концентраты (SL, LS)
Десять частей по массе AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 90 массовых частях воды или водорастворимого растворителя. В качестве альтернативы добавляют увлажнители или другие вспомогательные вещества. AHAS-ингибирующий гербицид растворяется при разбавлении водой, при этом получают препарат, содержащий 10% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
B) Диспергируемые концентраты (DC)
Двадцать массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 70 массовых частях циклогексанона с добавлением 10 массовых частей диспергирующего агента, например поливинилпир-ролидона. Разбавление водой дает дисперсию, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
C) Эмульгируемые концентраты (ЕС)
Пятнадцать массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 7 массовых частях ксилена с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае по 5 массовых частей). Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают препарат, содер
жащий 15% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
D) Эмульсии (EW, ЕО, ES)
Двадцать пять массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида растворяют в 35 массовых частях ксилена с добавлением с добавлением додецилбензолсульфоната кальция и этоксилата касторового масла (в каждом случае по 5 массовых частей).
Полученную смесь вводят в 30 массовых частей воды с помощью эмульгирующего устройства (например, Ultraturrax) и получают гомогенную эмульсию. Разбавление водой дает эмульсию, при этом получают препарат, содержащий 25% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
E) Суспензии (SC, OD, FS)
Во встряхиваемой шаровой мельнице измельчают 20 массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида с добавлением 10 массовых частей диспергирующих средств, увлажнителей и 70 массовых частей воды или органического растворителя, получая тонкодисперсную суспензию AHAS-ингибирующего гербицида.
Разбавление водой дает стабильную суспензию AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
F) Диспергируемые в воде гранулы и водорастворимые гранулы (WG, SG)
Пятьдесят массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида тонко измельчают с добавлением 50 массовых частей диспергирующих средств и увлажнителей и получают в виде диспергируемых в воде или водорастворимых гранул с помощью технических устройств (например, с помощью экструзии, скруббера с разбрызгивающим устройством, псевдоожиженного слоя).
Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 50% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
G) Диспергируемые в воде порошки и водорастворимые порошки (WP, SP, SS, WS)
Семьдесят пять массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида измельчают в роторно-статорной мельнице с добавлением 25 массовых частей диспергирующих средств, увлажнителей и сили-кагеля. Разбавление водой дает стабильную дисперсию или раствор AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 75% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
I) Гелевый препарат (GF)
Во встряхиваемой шаровой мельнице измельчают 20 массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида с добавлением 10 массовых частей диспергирующих средств, 1 массовой части гелеобразующего средства и 70 массовых частей воды или органического растворителя, получая тонкодисперсную суспензию AHAS-ингибирующего гербицида. Разбавление водой дает стабильную суспензию AHAS-ингибирующего гербицида, при этом получают препарат, содержащий 20% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида. Указанный гелевый препарат подходит для применения при обработке семян.
2. Продукты, применяемые неразбавленными для некорневых обработок. В целях обработки семян такие продукты можно наносить на семена разбавленными.
A) Распыляемые порошки (DP, DS)
Пять массовых частей AHAS-ингибирующего гербицида тонко измельчают и тщательно смешивают с 95 массовыми частями тонкодисперсного каолина. При этом получают распыляемый продукт, содержащий 5% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида.
B) Гранулы (GR, FG, GG, MG)
Половину массовой части AHAS-ингибирующего гербицида тонко измельчают и объединяют с 95,5 массовыми частями носителей, при этом получают препарат, содержащий 0,5% (мас./мас.) AHAS-ингибирующего гербицида. Используют имеющиеся в настоящее время способы экструзии, сушки с распылением или ожиженного слоя. При этом получают гранулы, которые используют неразбавленными при внекорневой обработке.
Обычные препараты для обработки семян включают, например, текучие концентраты FS, растворы LS, порошки для сухой обработки DS, диспергируемые в воде порошки для обработки взвесями WS, растворимые в воде порошки SS и эмульсии ES и ЕС и гелевый препарат GF. Такие препараты можно использовать для обработки семян разбавленными или неразбавленными. Обработку семян осуществляют перед посевом или непосредственно наносят на семена.
В одном варианте для обработки семян используют препарат FS. Обычно препарат FS может содержать 1-800 г/л активного ингредиента, 1-200 г/л поверхностно-активного вещества, от 0 до 200 г/л антифриза, от 0 до 400 г/л связывающего средства, от 0 до 200 г/л пигмента и до 1 литра растворителя, предпочтительно воды.
Настоящее изобретение относится к нетрансгенным и трансгенным семенам резистентных к гербицидам растений Brassica согласно настоящему изобретению. Такие семена включают, например, не-трансгенные семена Brassica, обладающие признаками резистентности к гербицидам растения BnCL120C7 или BnCL131А1, и трансгенные семена, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая кодирует резистентный к гербицидам белок AHASL.
В случае обработки семян семена резистентных к гербицидам растений согласно настоящему изо
бретению обрабатывают гербицидами, предпочтительно гербицидами, выбранными из группы, состоящей из AHAS-ингибирующих гербицидов, таких как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, пира-зосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, три-бенурон, трифтоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имаза-пик, имазапир, имазахин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пенокссулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритиобак и их смеси, или препаратом, содержащим AHAS-ингибирующий гербицид.
Термин "обработка семян" включает в себя все подходящие способы обработки семян, известные в данной области, такие как протравливание семян, дражирование семян, опудривание семян, намачивание семян и пеллетирование семян.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения дополнительным объектом изобретения является способ обработки почвы, в частности внесением в рядовую сеялку: либо гранулярного препарата, содержащего AHAS-ингибирующий гербицид, в виде композиции/препарата, например, гранулярного препарата, необязательно с одним или более твердыми или жидкими приемлемыми для сельского хозяйства носителями и/или необязательно с одним или более приемлемыми для сельского хозяйства поверхностно-активными веществами. Такой способ преимущественно применяют, например, для обработки почвы, приготовленной для посева зерновых, кукурузы, хлопчатника и подсолнечника.
Настоящее изобретение также относится к семенам, покрытым или содержащим препарат для обработки семян, включающий в себя по меньшей мере один AHAS-ингибитор, выбранный из группы, состоящей из амидосульфурона, азимсульфурона, бенсульфурона, хлоримурона, хлорсульфурона, цино-сульфурона, циклосульфамурона, этаметсульфурона, этоксисульфурона, флазасульфурона, флупирсуль-фурона, форамсульфурона, галосульфурона, имазосульфурона, йодсульфурона, мезосульфурона, мет-сульфурона, никосульфурона, оксасульфурона, примисульфурона, просульфурона, пиразосульфурона, римсульфурона, сульфометурона, сульфосульфурона, тифенсульфурона, триасульфурона, трибенурона, трифтоксисульфурона, трифлусульфурона, тритосульфурона, имазаметабенза, имазамокса, имазапика, имазапира, имазахина, имазетапира, клорансулама, диклосулама, флорасулама, флуметсулама, метосу-лама, пенокссулама, биспирибака, пириминобака, пропоксикарбазона, флукарбазона, пирибензоксима, пирифталида, пиритиобака.
Термин "семя" охватывает семена и участвующие в размножении части растений всех видов, включая без ограничения настоящие семена, кусочки семян, корневые отпрыски, клубнелуковицы, луковицы, плоды, клубни, зерно, черенки, отрезки и тому подобное, и в предпочтительном варианте термин означает настоящие семена.
Термин "покрытый и/или содержащий", в общем, означает, что активный ингредиент главным образом находится на поверхности продукта размножения во время применения, хотя большая или меньшая часть ингредиента может проникать в продукт размножения, в зависимости от способа применения. Когда указанный продукт размножения снова высевают, он может поглощать активный ингредиент.
Проведение обработки семян AHAS-ингибирующим гербицидом или препаратом, содержащим AHAS-ингибирующий гербицид, осуществляют опрыскиванием или опудриванием семян перед посевом растений и перед всходами растений.
При обработке семян соответствующие препараты применяют в виде обработки семян эффективным количеством AHAS-ингибирующего гербицида или препарата, содержащего AHAS-ингибирующий гербицид. В данном случае нормы внесения обычно составляют от 0,1 г до 10 кг активного ингредиента (или смеси активного ингредиента или препарата) на 100 кг семян, предпочтительно от 1 г до 5 кг на 100 кг семян, в частности, от 1 г до 2,5 кг на 100 кг семян. В случае конкретных сельскохозяйственных культур, таких как салат-латук, норма может быть выше.
Любой гербицидный препарат, применяемый на растениях Brassica согласно настоящему изобретению, может быть приготовлен в виде композиции в виде "баковой смеси". В таких вариантах каждый ингредиент или сочетание ингредиентов можно хранить отдельно друг от друга. Затем ингредиенты могут быть смешаны друг с другом перед внесением. Обычно такое смешивание осуществляют незадолго до внесения. При использовании способа на основе баковых смесей каждый ингредиент перед смешиванием обычно находится в воде или подходящем органическом растворителе. Способы и руководства по приготовлению таких препаратов известны в данной области.
Кроме того, способы позволяют разрабатывать сочетания гербицидов, необходимые для применения на растениях Brassica согласно настоящему изобретению. В таких способах оценивают условия окружающей среды на площади культивирования. Условия окружающей среды, которые можно оценивать, включают без ограничения проблемы загрязнения грунтовых и поверхностных вод, предполагаемое применение сельскохозяйственной культуры, устойчивость культуры, почвенных остатков, сорняков, имеющихся на площади культивирования, структуры почвы, рН почвы, количества органических веществ в почве, оборудования для внесения и приемов механической обработки. После оценки условий
окружающей среды можно применять эффективное количество сочетания гербицидов по отношению к культурному растению, части культурного растения, семени культурного растения или площади культивирования.
В некоторых вариантах гербицид, применяемый на растениях Brassica согласно настоящему изобретению, служит для предотвращения инициации роста чувствительных сорняков или нежелательных растений и/или служит для повреждения сорняков или нежелательных растений, которые растут на представляющей интерес площади. В некоторых вариантах гербицид или смесь гербицидов оказывают такое влияние на сорняки или нежелательные растения, наносящие ущерб культурным растениям, которые затем высевают на представляющей интерес площади (т.е. на поле или площади культивирования). В таких способах применение сочетания гербицидов не обязательно осуществляют в одно и то же время. При условии, что на поле, на котором выращивают культурное растение, имеются регистрируемые количества первого гербицида, а второй гербицид применяют в определенный момент времени в течение периода культивирования культурного растения на данной площади, считают, что культурное растение обработано смесью гербицидов согласно изобретению. Таким образом, предлагаемые способы включают в себя внесение гербицида, которое является "довсходовым", "послевсходовым", "предпосевным внесением" и/или которое заключается в обработке семян перед посевом.
Кроме того, предлагаются способы покрывания семян Brassica согласно настоящему изобретению. Способы включают в себя покрывание семени эффективным количеством гербицида или сочетания гербицидов (которые описаны в настоящей публикации). Затем семена можно выращивать на площади культивирования. Кроме того, предлагаются семена Brassica, имеющие покрытие, содержащее эффективное количество гербицида или сочетания гербицидов (которые описаны в настоящей публикации).
"Довсходовый" относится к гербициду, который применяют на представляющей интерес площади (например, поле или площади культивирования) до видимого появления растений из почвы и/или перед прорастанием семени. "Послевсходовый" относится к гербициду, который вносят на площади после видимого появления растений из почвы. В некоторых случаях термины "довсходовый" и "послевсходовый" используют по отношению к сорняку или нежелательному растению на представляющей интерес площади, а в некоторых случаях указанные термины используют по отношению к культурному растению на представляющей интерес площади. При использовании по отношению к сорняку или нежелательному растению указанные термины можно применять только к конкретному типу сорняка или виду сорного или нежелательного растения, которое присутствует или предположительно присутствует на представляющей интерес площади. Хотя для довсходовой и/или послевсходовой обработки можно применять любой гербицид, известно, что некоторые гербициды являются более эффективными в борьбе с сорняком или сорняками или нежелательными растениями в случае применения либо до всходов, либо после всходов. Например, римсульфурон обладает как довсходовой, так и послевсходовой активностью, тогда как другие гербициды преимущественно обладают довсходовой (метолахлор) или послевсходовой (гли-фосат) активностью. Указанные свойства конкретных гербицидов известны в данной области и легко могут быть определены специалистом в данной области. Кроме того, специалист в данной области легко может выбрать подходящие гербициды и время внесения для применения в случае трансгенных растений согласно изобретению и/или на площадях, на которых необходимо выращивать трансгенные растения согласно изобретению. "Предпосевное внесение" заключается во внесении соединений в почву перед посевом.
Таким образом, предлагаются улучшенные способы выращивания культурного растения и/или борьбы с сорняками или нежелательными растениями, такие как, например, "сжигание дотла перед посевом", когда площадь обрабатывают одним или более гербицидами перед посевом представляющей интерес культуры, чтобы лучше контролировать сорняки или нежелательные растения.
Кроме того, предлагаются способы выращивания культурного растения и/или борьбы с сорняками или нежелательными растениями, которые осуществляют "без вспашки" или при "неглубокой вспашке" (также называемой "минимальной обработкой земли"). В таких способах почву не подвергают культивации или культивируют менее часто в ходе цикла выращивания по сравнению с традиционными способами; такие способы могут экономить затраты, тогда как в противном случае затраты могут быть связаны с дополнительной культивацией, включая затраты на рабочую силу и топливо.
Способы охватывают применение одновременного и/или последовательного внесения нескольких классов гербицидов. В некоторых вариантах способы включают в себя обработку растения согласно изобретению и/или представляющей интерес площади (например, поля или площади культивирования) и/или сорняка и/или нежелательного растения только одним гербицидом или другим химическим веществом, таким как, например, имидазолиноновый гербицид.
Время внесения гербицида на представляющей интерес площади (и по отношению к любым растениям на этой площади) может иметь важное значение для оптимизации борьбы с сорняками или нежелательными растениями. Время внесения гербицида можно определить в зависимости от размера растений и/или стадии роста и/или развития растений на представляющей интерес площади, например, культурных растений или сорняков или нежелательных растений, растущих на такой площади. Стадии роста и/или развития растений известны в данной области. Таким образом, например, момент времени, когда
гербицид или другое химическое средство вносят на представляющей интерес площади, на которой выращивают растения, может представлять собой такой момент времени, когда некоторые или все растения на конкретной площади достигают, по меньшей мере, конкретного размера и/или стадии роста и/или развития, или момент времени, когда некоторые или все растения на конкретной площади еще не достигли конкретного размера и/или стадии роста и/или развития.
В некоторых вариантах растения Brassica согласно настоящему изобретению проявляют повышенную устойчивость к послевсходовым гербицидным обработкам. Например, растения Brassica согласно настоящему изобретению могут быть устойчивы к более высоким дозам гербицида, устойчивы к более широкому диапазону гербицидов (т.е. устойчивость к большему количеству химических ингибиторов AHAS), и/или могут быть устойчивы к дозам гербицидов, применяемым в более ранний или более поздний периоды развития по сравнению с соответствующим контрольным растением.
Разные химические средства, такие как гербициды, имеют разные "остаточные" эффекты, т.е. разные периоды времени, в течение которых обработка химическим средством или гербицидом продолжает оказывать влияние на растения, растущие на обрабатываемой площади. Такие эффекты могут быть желательными или нежелательными, в зависимости от требуемого назначения в будущем обрабатываемой площади (например, поля или площади культивирования). Таким образом, схема севооборота может быть выбрана на основе остаточных эффектов обработок, которые будут использованы для каждой культуры, и их влияния на культуру, которую затем будут выращивать на той же самой территории. Специалисту в данной области известны методики, которые можно применять для оценки остаточного эффекта гербицида; например, гербициды, которые действуют, ингибируя AHAS, варьируют по уровням своей остаточной активности. Остаточные активности различных гербицидов известны в данной области, и также известно, что они варьируют в зависимости от различных факторов окружающей среды, таких как, например, уровни влажности почвы, температура, рН и состав почвы (структура и органическое вещество). Растения Brassica согласно настоящему изобретению особенно применимы в способах выращивания культурного растения, когда полезна повышенная устойчивость к остаточной активности гербицида.
Кроме того, растения Brassica согласно настоящему изобретению обеспечивают повышенную устойчивость к обработке дополнительными химическими средствами, используемыми для культурных растений вместе с гербицидными обработками, такими как антидоты, адъюванты, такие как сульфонат аммония, и маслянистый концентрат для культурных растений и тому подобные. Кроме того, предлагаемые способы могут включать в себя применение AHAS-ингибирующего гербицида или смеси гербицидов, а также одного или более других инсектицидов, фунгицидов, нематоцидов, бактерицидных средств, акарицидов, регуляторов роста, химических стерилизаторов, семиохимических средств, репеллентов, аттрактантов, феромонов, стимуляторов питания или других биологически активных соединений или энтомопатогенных бактерий, вируса или грибов с образованием многокомпонентной смеси, обеспечивающей еще более широкий спектр защиты сельскохозяйственных культур. Примеры таких защитных сельскохозяйственных средств, которые можно использовать в способах включают: инсектициды, такие как абамектин, ацефат, ацетамиприд, амидофлумет (S-1955), авермектин, азадирахтин, азинфос-метил, бифентрин, бифеназат, бупрофезин, карбофуран, картап, хлорфенапир, хлорфлуазурон, хлорпирифос, хлорпирифос-метил, хромафенозид, клотианидин, цифлуметофен, цифлутрин, бета-цифлутрин, цигалот-рин, лямбда-цигалотрин, циперметрин, циромазин, дельтаметрин, диафентиурон, диазинон, диелдрин, дифлубензурон, димефлутрин, диметоат, динотефуран, диофенолан, эмамектин, эндосульфан, эсфенва-лерат, этипрол, фенотиокарб, феноксикарб, фенпропатрин, фенвалерат, фипронил, флоникамид, флубен-диамид, флуцитринат, тау-флувалинат, флуфенерим (UR-50701), флуфеноксурон, фонофос, галофенозид, гексафлумурон, гидраметилнон, имидаклоприд, индоксакарб, изофенфос, луфенурон, малатион, метаф-лумизон, метальдегид, метамидофос, метидатион, метомил, метопрен, метоксихлор, метофлутрин, моно-кротофос, метоксифенозид, нитенпирам, нитиазин, новалурон, новифлумурон (XDE-007), оксамил, пара-тион, паратион-метил, перметрин, форат, фосалон, фосмет, фосфамидон, пиримикарб, профенофос, про-флутрин, пиметрозин, пирафлупрол, пиретрин, пиридалил, пирипрол, пирипроксифен, ротенон, риано-дин, спинссад, спиродиклофен, спиромезифен (BSN 2060), спиротетрамат, сульпрофос, тебуфенозид, тефлубензурон, тефлутрин, тербуфос, тетрахлорвинфос, тиаклоприд, тиаметоксам, тиодикарб, тиосуль-тап-натрий, тралометрин, триазамат, трихлорфон и трифлумурон; фунгициды, такие как ацибензолар, алдиморф, амисульбром, азаконазол, азоксистробин, беналаксил, бенсмил, бентиафаликарб, бентиавали-карб-изопропил, биномиал, бифенил, битертанол, бластицидин-S, бордосская смесь (трехосновный сульфат меди), боскалид/никобифен, бромуконазол, бупиримат, бутиобат, карбоксин, карпропамид, кап-тафол, каптан, карбендазим, хлорнеб, хлорталонил, хлозолинат, клотримазол, оксихлорид меди, соли меди, такие как сульфат меди и гидроксид меди, циазофамид, цифлунамид, цимоксанил, ципроконазол, ципродинил, дихлофлуанид, диклоцимет, дикломезин, диклоран, диэтофенкарб, дифеноконазол, димето-морф, димоксистробин, диниконазол, диниконазол-М, динокап, дискостробин, дитианон, додеморф, до-дин, эконазол, этаконазол, эдифенфос, эпоксиконазол, этабоксам, этиримол, этридиазол, фамоксадон, фенамидон, фенаримол, фенбуконазол, фенкарамид, фенфурам, фенгексамид, феноксанил, фенпиклонил, фенпропидин, фенпропиморф, ацетат фентина, гидроксид фентина, фербам, ферфуразоат, феримзон, флуазинам, флудиоксонил, флуметовер, флуопиколид, флуоксастробин, флуквинконазол, флуквинкона
зол, флузилазол, флусульфамид, флутоланил, флутриафол, фолпет, фосетил-алюминий, фуберидазол, фуралаксил, фураметапир, гексаконазол, гимексазол, квазатин, имазалил, имибенконазол, иминоктадин, йодикарб, ипконазол, ипробенфос, ипродион, ипроваликарб, изоконазол, изопротиолан, казугамицин, крезоксим-метил, манкозеб, мандипропамид, манеб, мапанипирин, мефеноксам, мепронил, металаксил, метконазол, метасульфокарб, метирам, метоминостробин/феноминостробин, мепанипирим, метрафенон, миконазол, миклобутанил, неоазоцин (метанарсонат железа), нуаримол, октилинон, офурак, оризастро-бин, оксадиксил, оксолиновая кислота, окспоконазол, оксикарбоксин, паклобутразол, пенконазол, пенци-курон, пентиопирад, перфуразоат, фосфоновая кислота, фталид, пикобензамид, пикоксистробин, полиок-син, пробеназол, прохлораз, процимидон, пропамокарб, гидрохлорид пропамокарба, пропиконазол, про-пинеб, проквиназид, протиоконазол, пираклостробин, приазофос, пирифенокс, пириметанил, пирифе-нокс, пиролнитрин, пироквилон, хинконазол, хиноксифен, хинтозен, силтиофам, симеконазол, спирокса-мин, стрептомицин, сера, тебуконазол, техразен, техлофталам, текназен, тетраконазол, тиабендазол, тиф-лузамид, тиофанат, тиофанат-метил, тирам, тиадинил, толклофос-метил, толифлуанид, триадимефон, триадименол, триаримол, триазоксид, тридеморф, тримопрамид, трициклазол, трифлоксистрсбин, три-форин, тритиконазол, униконазол, валидамицин, винклозолин, зинеб, зирам и зоксамид; нематоциды, такие как альдикарб, оксамил и фенамифос; бактерицидные средства, такие как стрептомицин; акарици-ды, такие как амитраз, хинометионат, хлордензилат, цигексатин, дикофол, диенохлор, этоксазол, феназа-хин, оксид фенбутатина, фенпропатрин, фенпироксимат, гекситиазокс, пропаргит, пиридабен и тебуфен-пирад; и биологические средства, включая энтомопатогенных бактерий, таких как подвид Bacillus thur-ingiensis Aizawai, подвид Bacillus thuringiensis Kurstaki, и инкапсулированные дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis (например, Cellcap, MPV, MPVII); энтомопатогенные грибы, такие как зеленый мускар-диновый гриб; и энтомопатогенный вирус, включая бакуловирус, вирус ядерного полиэдроза (NPV), такой как HzNPV, AfNPV; и вирус гранулеза (GV), такой как CpGV. Массовые доли таких различных партнеров в смеси с другими композициями (например, гербицидами), используемые в указанных способах обычно составляют от 100:1 до 1:100 или от 30:1 до 1:30, от 10:1 до 1:10 или от 4:1 до 1:4.
Кроме того, предлагаются композиции, содержащие биологически эффективное количество представляющего интерес AHAS-ингибирующего гербицида или смеси гербицидов, и эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного биологически активного соединения или средства, которые дополнительно могут содержать по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, твердый разбавитель или жидкий разбавитель. Примерами таких биологически активных соединений или средств являются: инсектициды, такие как абамектин, ацефат, ацетамиприд, амидофлумет (S-1955), авермектин, азадирахтин, азинфос-метил, бифентрин, бинфеназат, бупрофезин, карбофуран, хлорфенапир, хлорфлуа-зурон, хлорпирифос, хлорпирифос-метил, хромафенозид, клотианидин, цифлутрин, бета-цифлутрин, ци-галотрин, лямбда-цигалотрин, циперметрин, циромазин, дельтаметрин, диафентиурон, диазинон, дифлу-бензурон, диметоат, диофенолан, эмамектин, эндосульфан, эсфенвалерат, этипрол, фенотикарб, фенок-сикарб, фенпропатрин, фенвалерат, фипронил, флоникамид, флуцитринат, тау-флувалинат, флуфенерим (UR-50701), флуфеноксурон, фонофос, галофенозид, гексафлумурон, имидаклоприд, индоксакарб, изо-фенфос, луфенурон, малатион, метальдегид, метамидофос, метидатион, метомил, метопрен, метокси-хлор, монокротофос, метоксифенозид, нитиазин, новалурон, новифлумурон (XDE-007), оксамил, парати-он, паратион-метил, перметрин, форат, фосалон, фосмет, фосфамидон, пиримикарб, профенофос, пимет-розин, пиридалил, пирипроксифен, ротенон, спиносад, спиромезифен (BSN 2060), сульпрофос, тебуфе-нозид, тефлубензурон, тефлутрин, тербуфос, тетрахлорвинфос, тиаклоприд, тиаметоксам, тиодикарб, тиосультап-натрий, тралометрин, трихлорфон и трифлумурон; фунгициды, такие как ацибензолар, азок-систробин, беномил, бластицидин-S, бордосская смесь (трехосновный сульфат меди), бромуконазол, карпропамид, каптафол, каптан, карбендазим, хлорнеб, хлорталонил, оксихлорид меди, соли меди, циф-луфенамид, цимоксанил, ципроконазол, ципродинил, ^)-3,5-дигидро^-(3-хлор-1-этил-1-метил-2-оксопропил)-4-метилбензамид (RH 7281), диклоцимет (S-2900), дикломезин, диклоран, дифеноконазол, (S)-3,5-дигидро-5-метил-2-(метилтио)-5-фенил-3-(фениламино)-4Н-имидазол-4-он (RP 407213), димето-морф, димоксистробин, диниконазол, диниконазол-М, додин, эдифенфос, эпоксиконазол, фамоксадон, фенамидон, фенаримол, фенбуконазол, фенкарамид (SZX0722), фенпиклонил, фенпропидин, фенпропи-морф, ацетат фентина, гидроксид фентина, флуазинам, флудиоксонил, флуметовер (RPA 403397), флу-морф/флуморлин (SYP-L190), флуоксастробин (НЕС 5725), флуквинконазол, флузилазол, флутоланил, флутриафол, фолпет, фосетил-алюминий, фуралаксил, фураметапир (S-82658), гексаконазол, ипконазол, ипробенфос, ипродион, изопротиолан, казугамицин, крезоксим-метил, манкозеб, манеб, мефеноксам, мепронил, металаксил, метконазол, метоминостробин/феноминостробин (SSF-126), метрафенон (АС375839), миклобутанил, неоазоцин (метанарсонат железа), никобифен (BAS 510), оризастробин, ок-садиксил, пенконазол, пенцикурон, пробеназол, прохлораз, пропамокарб, пропиконазол, проквиназид (DPX-KQ926), протиоконазол (JAU 6476), пирифенокс, пираклостробин, пириметанил, пироквилон, хи-ноксифен, спироксамин, сера, тебуконазол, тетраконазол, тиабендазол, тифлузамид, тиофанат-метил, тирам, тиадинил, триадимефон, триадименол, трициклазол, трифлоксистробин, тритиконазол, валидами-цин и винклозолин; нематоциды, такие как альдикарб, оксамил и фенамифос; бактерицидные средства, такие как стрептомицин; акарициды, такие как амитраз, хинометионат, хлордензилат, цигексатин, дико
фол, диенохлор, этоксазол, феназахин, оксид фенбутатина, фенпропатрин, фенпироксимат, гекситиазокс, пропаргит, пиридабен и тебуфенпирад; и биологические средства, включая энтомопатогенных бактерий, таких как подвид Bacillus thuringiensis Aizawai, подвид Bacillus thuringiensis Kurstaki, и инкапсулированные дельта-эндотоксины Bacillus thuringiensis (например, Cellcap, MPV, MPVII); энтомопатогенные грибы, такие как зеленый мускардиновый гриб; и энтомопатогенный вирус, включая бакуловирус, вирус ядерного полиэдроза (NPV), такой как HzNPV, AfNPV; и вирус гранулеза (GV), такой как CpGV. Способы также могут включать в себя применение растений, генетически трансформированных для экспрессии белков, токсичных для беспозвоночных вредителей (такие как дельта-эндотоксины Bacillus thur-ingiensis). В таких вариантах экзогенно применяемые соединения для борьбы с беспозвоночными вредителями могут влиять синергетически с экспрессируемыми белками-токсинами.
Таким образом, в способах можно применять AHAS-ингибирующий гербицид или сочетание AHAS-ингибирующих гербицидов, и дополнительно можно использовать инсектициды и/или фунгициды, и/или другие сельскохозяйственные химикаты, такие как удобрения. Применение таких комбинированных обработок может расширять спектр активности против дополнительных видов сорняков и подавлять пролиферацию любых резистентных биотипов.
Настоящее изобретение относится к способу борьбы с нежелательной растительностью или борьбы с сорняками, включающему в себя осуществление контакта семян резистентных растений согласно настоящему изобретению перед посевом и/или после предварительного проращивания с AHAS-ингибирующим гербицидом. Способ дополнительно может включать в себя посев семян, например, в почву на поле или в среду для горшечных культур в теплице. Способ особенно применим для борьбы с нежелательной растительностью или борьбы с сорняками, находящимися в непосредственной близости с семенами.
Подразумевается, что борьба с нежелательными растениями означает уничтожение сорняков и/или иным образом замедление или ингибирование нормального роста сорняков. Подразумевают, что сорняки в широком смысле означают все растения, которые растут с тех местах, где они нежелательны.
Сорняки согласно настоящему изобретению включают, например, двудольные и однодольные сорняки. К двудольным сорнякам без ограничения относятся сорняки родов: Sinapis, Lepidium, Galium, Stel-laria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus и Taraxacum. К однодольным сорнякам без ограничения относятся сорняки родов: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus и Apera.
Кроме того, сорняки согласно настоящему изобретению могут включать, например, культурные растения, которые растут в нежелательном месте. Например, самосевное растение кукурузы, которое находится на поле, на котором преимущественно растут растения сои, можно считать сорняком, если растение кукурузы нежелательно на поле с растениями сои.
Упоминание слов в единственном числе используют в настоящем описании по отношению к одному или больше чем одному (т.е. по меньшей мере к одному) грамматическому объекту в описании. В качестве примера, "элемент" означает один или более элементов.
В используемом в настоящем описании смысле слово "содержащие" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий" следует понимать как означающее включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Следующие примеры предлагаются в целях иллюстрации, но не в целях ограничения.
Пример 1. Получение мутантных последовательностей AHAS
Перед созданием мутантных последовательностей полные кодирующие последовательности AHAS I и III Brassica napus амплифицировали, используя BnALS3 (5'-CTAACCATGGCGGCGGCAAC (SEQ ID NO:1)) и BnALS02 (5'-AGTCTGGGAACAAACCAAAAGCAGTACA (SEQ ID NO:2)) и BnALS03 (5'-CGTCTGGGAACAACCAAAAGTAGTACAA (SEQ ID NO:3)) соответственно, клонировали и секвениро-вали из линий BN-02 (фиг. 3 и 4), линии 97 (BN-02 с S653N в AHAS III, фиг. 3 и 4) и BN-11, которые служили в качестве эталонных последовательностей в целях сравнения.
1А. Конструирование олигонуклеотида для репарации генов (GRON)
На основе полученной последовательности нуклеиновой кислоты AHAS III конструировали серию олигонуклеотидов для репарации генов (GRON, показанных в табл. 1), чтобы специфично ввести мутацию нуклеиновой кислоты в кодирующую область AHAS, которая приводит к аминокислотной замене аланина на треонин, соответствующей положению 122 в кодируемом белке AHAS III на основе нумерации аминокислот для AHAS Arabidopsis. GRON конструировали, чтобы ввести замену нуклеотидов GCT на ACT в AHAS III. При использовании таких последовательностей GRON только последовательность нуклеиновой кислоты AHAS III является мишенью для такой замены.
1B. Описание работы с культурой клеток
1В.1 Эксперименты по введению олигонуклеотидов для репарации генов (GRON), целью которых является мутация А122Т в гене AHAS III линии яровой канолы 97
Линию канолы 97 получали в результате проведенных ранее экспериментов с применением системы быстрого развития признака (Rapid Trait Development System(tm) (Cibus LLC, San Diego, CA, "RTDS(tm)")), используя протопласты листовой ткани из гаплоидных, полученных из микроспор проростков сорта Brassica, известного как BN-02. Линия 97 содержит мутацию в положении, соответствующем положению аминокислоты 653 в белке AHAS III. Мутация кодируется в результате замены кодона AGT на ААТ и приводит к замене серина на аспарагин, которая придает устойчивость к имазетапир. Добавление мутации А122Т в тот же самый ген приводит к значительно повышенной Imi-устойчивости по сравнению с одиночной мутацией.
Эксперименты RTDS(tm) осуществляли с целью введения дополнительной мутации в ген AHAS III линии 97. Линию 97 регенерировали из полученного из протопластов каллуса, который отбирали, используя 0,5 и 0,2 мкМ Imi. Двойную мутацию A122T; S653N отбирали при концентрации 10 мкМ Imi. Протокол, который использовали для таких экспериментов, описан в разделах 1В.2-1В.6.
IB.2 Размножение материала для выделения листовых протопластов
Гаплоидные побеги, полученные из происходящих из микроспор зародышей, размножали в стерильных условиях in vitro. Черенки пересаживали каждые 2-4 недели и культивировали в чашках Петри (90 мм х 20 мм), которые содержат 40-45 мл среды RS (Довженко А., 2001). Чашки герметично закрывали пленкой Micropore (3М Company). Молодые листья срезали и использовали для выделения протопластов.
1В.3. Выделение и очистка протопластов
Примерно 600 мг ткани листа с 2-3-недельных побегов in vitro нарезали не маленькие полоски скальпелем в чашку Петри с 5 мл среды В (Pelletier et al., 1983), рН доводили до 5,8. Через 1 ч среду В заменяли 12 мл стерилизованного фильтрованием раствора ферментов, состоящего из среды В, в которой растворяли 0,5% целлюлазы YC и 0,75% мацерозима R10 (оба из Karlan Research Products, Cottonwood, Arizona), 1 г/л бычьего сывороточного альбумина и 1 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты. Раствор ферментов пропускали через вакуумный фильтр и затем чашку с кусочками листа в растворе ферментов инкубировали в течение 16-18 ч при 25°С в темноте. Очистку протопластов осуществляли, используя градиент плотности йодиксанола. После центрифугирования в градиенте плотности полосу с очищенными протопластами извлекали вместе примерно с 5 мл среды W5. Выход протопластов определяли, используя гемоцитометр, и протопласты хранили в течение 2 ч при 4°С.
18.4 Введение олигонуклеотидов для репарации генов (GRON)
Суспензию протопластов смешивали с равным объемом холодной среды W5, переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугировали в течение 10 мин при установке наименьших параметров клинической центрифуги (примерно 50 х g). Надосадок удаляли и заменяли средой ТМ (Klaus, S. 2003), доводя плотность протопластов до 5 х 106/мл. Аликвоты по 500 мкл, каждая из которых содержала 2,5 х 106 протопластов, распределяли по центрифужным пробиркам объемом 50 мл. GRON (например, BnALS1122/C/41/5'Cy3/3' idC; см. табл. 1) доставляли к протопластам посредством их смешивания с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и перемешиванием на вращающем устройстве на льду. Использовали примерно 12-300 мкг GRON на 500 мкл обрабатываемого объема. Затем протопласты собирали, используя центрифугирование и хранили в течение ночи при 4°С в темноте.
18.5 Заключение протопластов в альгинат кальция
Затем протопласты заключали в гель (например, агарозу, альгинат) способом, описанным Довженко (2001). Показано, что заключение протопластов в гелевые основы повышает жизнеспособность протопластов и увеличивает частоту деления полученных из протопластов клеток. Через день после обработки ПЭГ-GRON протопласты, полученные из одного обработанного образца, переносили в центрифужную пробирку объемом 50 мл и давали возможность достичь комнатной температуры. Пробирку центрифугировали в течение 10 мин, используя наименьшие параметры установки (примерно 50 х g) клинической центрифуги. Осадок ресуспендировали в 2,75 мл среды В (концентрация дигидрата хлорида кальция снижена до 131 мг/л) и смешивали с 2,75 мл 2,8% (мас./об.) раствора альгината натрия в такой же среде В с пониженным содержанием кальция в V-образной чашке для реагентов объемом 60 мл. Суспензию
протопластов и альгината собирали многоканальной пипеткой (используя предварительно срезанные наконечники для обеспечения более широкого отверстия), и аликвоты по 40 мкл раскапывали в 50 мл среды Са-А.
18.6 Культивирование протопластов и отбор устойчивых к Imi каллусов
Устойчивые к имидазолинону каллусы отбирали, используя последовательные субкультуры альги-натных шариков в средах, подобных средам, описанным в Pelletier et al. (1983) Mol. Gen. Genet. 191:244250 (см. табл. 2). Отбор начинали через одну неделю после обработки ПЭГ/GRON при концентрации Imi 10 мкМ. Добавление гербицида в культуральную среду не давало немедленного эффекта. В начале все микроколонии, которые были образованы в ранней фазе культивирования без имидазолинона, продолжали расти, гл медленнее, чем контроли без добавления гербицида. Через одну-две недели после начала отбора рост большинства колоний замедлялся или останавливался.
Клетки и микроколонии высвобождали из альгината через три недели после заключения в него протопластов, обрабатывая их в течение 30-45 мин культуральной средой, содержащей 50 мМ цитрата натрия. После высвобождения большинство колоний либо были мертвыми, либо состояли из зеленоватого центра, покрытого наружными слоями мертвых клеток. После переноса на отвержденную среду Е для селекции большая часть микрокаллусов, которые еще содержали живые клетки, переставали расти и становились коричневатыми. Ограниченный рост отдельных каллусов продолжался, но все неустойчивые каллусы в конце концов становились коричневыми. Через две-три недели после переноса на отвержден-ную среду для селекции (иногда раньше) появлялись активно растущие каллусы на фоне коричневатых клеток и микрокаллусов.
Таблица 2. Протокол отбора устойчивых к имазетапиру каллусов, начиная с одного обработанного ПЭГ/GRON образца, содержащего 2,5 х 106 протопластов
День
Стадия
Листья в растворе ферментов
Очистка протопластов и обработка ПЭГ/GRON в течение ночи в среде В при 4°С
Заключение протопластов в альгинат; культивирование по 4 0 мкл шариков из примерно 5 мл в 20 мл среды В в чашках Петри размером 20 мм х 150 мм.
Замена половины жидкой среды средой С; добавление 10 мкМ Imi
Замена жидкой среды свежей средой С, содержащей
10 мкМ Imi
Высвобождение клеток из альгината; культивирование в свежей среде С, содержащей 10 мкМ Imi
Замена жидкой среды свежей средой С, содержащей 10 мкМ Imi
Перенос клеток/ьликрокаллусов в агаризованную среду Е, 10 мкМ Imi, в чашку Петри размером 145x20 мм
50-57
Идентификация растущих клеток, снова перенос в агаризованную среду Е, 10 мкМ Imi
3-4 недели спустя
Идентификация растущих каллусов для субкультивирования и анализа; удаление не растущих каллусов
IB. 7 Регенерация растений из полученных из протопластов устойчивых к Imi каллусов, содержащих двойную мутацию A122T; S653N в гене AHAS III
Устойчивые к Imi каллусы, которые развивались на отвержденной среде для отбора и которые, как было подтверждено, имели целенаправленную мутацию (см. пример 1С ниже), переносили в не содержащую гербицидов среду Е, чтобы ускорить развитие. Отдельные линии каллусов варьировали по скорости роста и морфологии. В общем, развитие до регенерации побега проходило следующие стадии:
Недифференцированный зеленый каллус каллус с темно-зелеными областями развитие корней развитие инициалей побегов - развитие замедленно растущих побегов с содержащими избыточное количество влаги (стекловидными) листьями.
Развитие отдельной линии каллусов варьировало, но в ходе длительного субкультивирования и размножения на среде Е или модификациях среды Е с более низкими концентрациями NAA изменения
событий образования побегов возрастали.
После образования побегов на среде Е и образования трех-четырех листьев их переносили в среду RS (Довженко, 2001). На указанной среде с течение времени развивалась новообразованная ткань побега и листьев, которая была морфологически ''нормальной'' (т.е. не содержит избытка влаги). Затем использовали стандартные протоколы для закаливания проростков и переноса в теплицу.
1С. Молекулярный скрининг
Проводили скрининг геномной ДНК из каллуса, проявляющего устойчивость к имазетапиру, в отношении наличия введенной мутации А122Т. Геномную ДНК экстрагировали, используя способ Edwards с соавторами ((1991) Nucleic Acids Research 19(6):1349). Так как AHAS I и III не содержат никаких ин-тронов, то возможная ПЦР с геномной ДНК. Специфичные для генов (GS) праймеры BnALS3 (5'-CTAACCATGGCGGCGGCAAC (SEQ ID NO:1)) и BnALS9 (5'-CCCATCAACGTACTCGCACCA (SEQ ID NO:6)) использовали для амплификации области, содержащей положение А122 в AHAS III. После очистки полученного в результате ампликона и его количественной оценки полученный ампликон использовали в качестве матрицы для аллель-специфичной (AS) ПЦР-реакции. Смесь трех праймеров (BnALS0F5 (5'-GTCAATGTCGCACCTGAAAAAACCGACA (SEQ ID NO:7)), BnALSOR8 (5'-
GCTAACCCGCTGACGAGGTTGGTAGCT (SEQ ID NO:8)) и BnALSIR2A (5'-
AAGGCTTGGTGGATCTCCATGGACGT (SEQ ID NO:9)) - основная смесь 40) использовали для выявления наличия мутации А122Т. Внутренний праймер (BnALSIR2 А) конструировали так, чтобы он мог отжигаться и образовывать продукт, спариваясь с BnALSOF5, если только присутствует кодон ACT (треонин).
Специфичную для гена ПЦР повторяли для всех каллусов, имеющих замену А122Т, используя такую же матрицу геномной ДНК, которую использовали в скрининге AS-ПЦР. На этот раз ампликон очищали из геля, содержащего 1% трис-ацетат EDTA, и секвенировали на протяжении области А122, подтверждая замену. После подтверждения готовили независимый образец геномной ДНК из ткани каллуса и снова секвенировали область А122.
После того, как для двух независимых образцов из данного каллуса было подтверждено наличие мутации А122Т, гены AHAS I и III секвенировали полностью, чтобы проверить в отношении каких-либо других непредусмотренных одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP). Полноразмерные гены амплифицировали, используя BnALS3 (5'-CTAACCATGGCGGCGGCAAC (SEQ ID NO:1)) с BnALSOR2 (5'-AGTCTGGGAACAAACCAAAAGCAGTACA (SEQ ID NO:2)) (в случае гена III) и BnALSOR.3 (5'-
CGTCTGGGAACAACCAAAAGTAGTACAA (SEQ ID NO:3)) (в случае гена I), и клонировали в
TopoPCR2.1 (Invitrogen). Четыре клона каждого гена секвенировали, чтобы отличить ошибку ПЦР от истинного SNP.
Геномную ДНК экстрагировали, используя устройство Bio-sprint (Qiagen), из ткани растений, регенерированных из отобранных при скрининге каллусов, и снова подвергали скринингу, чтобы подтвердить наличие мутаций. Специфичную для гена ПЦР (GS-ПЦР) осуществляли, используя праймеры для амплификации областей, содержащих А122Т (BnALS3 (5'-CTAACCATGGCGGCGGCAAC (SEQ ID NO:1)) и BnALS9 (5'-CCCATCAACGTACTCGCACCA (SEQ ID NO:6)) и S653N (BnALS10 (5'-
GAGGCTTTCGCTAGCAGGGCTCAA (SEQ ID NO:10)) и BnALSOR2 (5'-AGTCTGGGAACAAACCAAAAGCAGTACA (SEQ ID NO:2)) в последовательностях растений с фоном
линии 97, чтобы подтвердить их присутствие в гене III.
Всего идентифицировали 18 линий каллусов, в которых присутствие мутации А122Т и мутации S653N было подтверждено секвенированием гена AHAS III. Из двенадцати таких линий каллусов регенерировали побеги. За исключением одной линии остальные линии с двойными мутациями были гомозиготными (т.е. гаплоидными или гомозиготными диплоидными) по обеим мутациям А122Т и S653N в AHAS III. Наиболее успешно развивающаяся линия, BnCL131А1, дала несколько грамм семян. Выход на растение сравним с выходом для диплоидного растения, что означает, что в определенной точке во время отбора/регенерации произошла спонтанная диплоидизация. Пыльцу с такой линии использовали для опыления завязей двух сортов озимых сортов масличного рапса (WOSR), BN-11 и BN-19. Кроме того, семена линии BnCL131A1 депонировали в АТСС с номером доступа РТА-9279. Две дополнительных линии, BnCL140B3 и BnCL140C7, которые обе содержали подвергнутую мутагенезу молекулу нуклеиновой кислоты AHAS, кодирующую мутации А122Т и S653N в AHAS III, также депонировали в номерами доступа: РТА-9402 и РТА-9403 соответственно.
Также идентифицировали другую линию Brassica, содержащую только одну мутацию А122Т в последовательности AHAS III. Семена такой линии, BnCL120С7, также депонировали в АТСС с номером
доступа РТА-9278.
Пример 2. Ферментативная активность AHAS в экстрактах растений и целых растениях В. napus Растения линий BN02 (дикого типа), РМ1/РМ2 (гены с двумя мутациями, см., например, патент США № 7355098), B^CL^^ (двойной мутант AHAS III A122T S653N) и BnCL120C7 (одиночный мутант AHAS III A122T) выращивали из семени до стадии 3-4 листьев перед сбором. Клеточные экстракты оценивали в трех повторах в отношении активности AHAS согласно инструкциям Singh с соавторами (1988 Assay of Acetohydroxyacid Synthase, Analytical Biochemistry 171, 173-179) в отсутствие или в при
сутствии 8 серийных разведений имазамокса в диапазоне 100-0,78 мкМ. Активность выражали в процентах от неингибированной активности (без имазамокса) (фиг. 1). На графике, показанном на фиг. 1, изображены средние результаты в процентах от неингибированной активности для каждой концентрации имазамокса, полученные для трех дат посева, каждый раз с 2-3 повторами, всего в 7 независимых анализах экстрактов. Отрезки, изображающие погрешности, означают ± две стандартных ошибки среднего значения.
Кроме того, растения В. napus (в стадии 3-4 листьев), содержащие двойную мутацию, анализировали в отношение ответа на обработку имазамоксом по сравнению с растениями дикого типа. Линии BN02 (дикого типа) и BnCL131A1 (двойной мутант AHAS III A122T:S653N) либо обрабатывали 210 г активного ингредиента/га имазамокса с добавлением 0,5% об./об. Merge путем опрыскивания листьев, либо оставляли без опрыскивания в качестве контролей. Обработанные растения оценивали через три (3) недели после обработки, и результаты представлены на фиг. 2. На фиг. 2 представлены результаты для растений BN02 (верхний ряд) и BnCL131А1 (нижний ряд). Как можно видеть на фиг. 2 растения BN-02 дикого типа почти совсем не переносили внесение 210 г активного ингредиента/га имазамокса, тогда как линия BnCL131A1 была почти полностью устойчивой к такому внесению.
Растения В. napus, содержащие двойную мутацию, также тестировали в отношении повреждения растений вследствие применения имидазолинонового гербицида. Растения В. napus линий BN02 (дикого типа), BnCL131A1 (двойной мутант AHAS III A122T:S653N), BnCL120C7 (одиночный мутант AHAS III A122T), BnCL97 (одиночный мутант AHAS III S653N), РМ1/РМ2 (коммерческий, два контрольных гена), РМ1 (одиночный мутант AHAS I S653N) и РМ2 (одиночный мутант AHAS III W574L) выращивали из семян до стадии 3-4 листьев, затем либо оставляли без опрыскивания, либо опрыскивали 35, 70 или 210 г активного ингредиента/га имазамокса с добавлением 0,5% об./об Merge. Повреждение гербицидом оценивали через 2 недели после обработки (DAT) на 8-24 растениях из линии, используя шкалу от 0 до 9, где 0 означает отсутствие повреждения и 9 означает гибель растения. Результаты представлены в виде среднего повреждения ± одна стандартная ошибка среднего в табл. 3 ниже. Представленные результаты охватывают два независимых посева и опрыскивания для всех линий, за исключением BnCL97. В таблице также показаны значения ± одна стандартная ошибка среднего.
Таблица 3
Норма опрыскивания [г активного ингредиента/га]
Линия
210
BN-02 (дикий тип)
0,06
9, 00
9,00
9, 00
+ 0,06
±0, 00
±0,00
±0, 00
BnCL131Al (BnAHAS III
0, 00
0,76
2,53
3,22
A122T:S653)
+0, 00
±0,33
±0,24
±0, 33
ВПСЫ20С7 (BnAHASIII
0, 17
4,19
5, 43
6, 65
A122T)
±0, 08
±0, 39
±0,24
±0, 30
BnCL97 (BnAHASIII
0, 17
4, 08
8, 58
8, 00
S653N)
+0, 11
+ 0,15
+ 0, 15
+ 0,23
PM1/PM2
0,07
1,21
4,13
4, 93
±0, 07
±0,33
±0,36
±0, 53
PM2 (BnAHASIII W574L)
0, 30
1,81
4,14
6, 17
±0, 15
±0,25
±0,23
±0,22
PM1 (BnAHASI S653N)
0, 11
7,22
8, 61
9, 00
+ 0, 07
±0, 18
±0, 12
±0, 00
Пример 3. Оценка повреждения гербицидом растений Brassica napus, обработанных имазамоксом Оценка повреждения гербицидом растений Brassica napus, обработанных имазамоксом. Растения линий BNO2 (дикого типа), двух линий BnCL131A1 (двойной мутант AHAS III А122Т S653N; B^CL^^^ и BnCLB1A1.18), РМ1/РМ2 (коммерческая, контроль двух генов: AHAS I S653N и AHAS III W574L), выращивали из семян до стадии 3-4 листьев, затем либо оставляли без опрыскивания, либо опрыскивали 35, 70 или 210 г активного ингредиента/га имазамокса с добавлением 0,5% об./об Merge. Повреждение гербицидом оценивали через 2 недели после опрыскивания, используя по 12 растений из каждой линии. Результаты представлены в виде среднего повреждения ± одна стандартная ошибка среднего в табл. 4 ниже. Результаты охватывают один посев и опрыскивание для всех линий, и также показаны значения ± две стандартных ошибки среднего.
Таблица 4
Норна опрыскивания [г активного ингредиента/га]
Линия
210
420
BN-02 (дикий тип)
0, 17 ±0, 11
8, 92 ±0, 08
9,00 ±0, 00
9, 00 ±0, 00
9, 00 ±0, 00
РМ1/РМ2
0, 17 ±0, 17
0, 50 ±0, 19
1,83 + 0,21
2, 00 + 0,23
3,83 ±0,21
ВпСЫ31А1.0
0, 00 ±0, 00
0, 90 + 0, 28
1, 20 ±0,29
1,45
±0,28
3,20 ±0, 20
BnCL131Al.18
0, 08 ±0, 08
0, 64 ±0,20
0, 91 ±0,21
1,89 ±0, 20
2,27 ±0,14
Пример 4. Оценка повреждения гербицидом имазамоксом в полевых испытаниях растений Brassica napus Растения В. napus из следующих яровых линий масличного рапса: BN-02 (дикого типа), BN-T (дикого типа), BnCL131А1 на фоне генотипа BN-02 (двойной мутант AHAS III A122T S653N), BnCL120G7 на фоне генотипа BN-02 (BnAHAS III A122T), BnCL97 на фоне генотипа BN-02 (BnAHASIII S653N), РМ1/РМ2 на фоне BN-T (контроль двух генов: AHAS I S653N и AHAS III W574L), РМ1 на фоне BN-T (контроль одного гена: AHAS I S653N) и РМ2 на фоне BN-T (контроль одного гена: AHAS III W574L) подвергали испытаниям на поле, расположенном вблизи Майнота, Северная Дакота. Линии высевали на однорядковых делянках длиной 5 м и распределяли согласно двухфакторному плану расщепленных делянок с 3 повторами и 4 обработками (0 г активного ингредиента/га имазамокса, 50 г активного ингредиента/га имазамокса, 100 г активного ингредиента/га имазамокса и 200 г активного ингредиента/га имаза-мокса). Растения опрыскивали на стадии 2-4 листьев, используя описанные выше обработки имазамоксом. Продукт имазамокс (Beyond 120 г/л жидкий концентрат + 0,25% (об./об.) неионогенного поверхностно-активного вещества) разбавляли в 20 галлонах на акр (или 200 л/га) и вносили, используя трактор, оборудованный стрелой.
Повреждение гербицидом оценивали через 15 дней после обработки (DAT) на основе делянок, используя шкалу от 0 до 100%, где 0 означал отсутствие повреждения, и 100% означало полную гибель растений. Оценку повреждений анализировали статистически, используя ANOVA, и результаты представлены в табл. 5.
Таблица 5. Оценка повреждения полевых культур линий В. napus через 15 дней после обработки имазамоксом
Линия с двойной мутацией, BnCL131A1 (BN-02) (AHAS III А122Т, S653N), проявляла намного более высокую устойчивость к гербициду, чем линии с отдельными мутациями BnCL97 (BN-02) (AHASIII S653N) и BNCL120C7 (BN-02) (AHASIII A122T) в сумме. Количественное значение устойчивости, проявляемой линией с двойной мутацией (А122Т + S653N) при использовании 200 г активного ингредиента/га имазамокса составляет 62% (100%-38% повреждения культуры). Количественное значение устойчивости, наблюдаемой в случае одиночной мутации А122Т при использовании 200 г активного ингредиента/га, составляет 20% (100%-80% повреждения культуры). Количественное значение устойчивости, наблюдаемой в случае одиночной мутации S653N при использовании 200 г активного ингредиента/га, составляет 17% (100%-83% повреждения культуры). Если бы устойчивость была аддитивной, то ожидаемая устойчивость от сочетания мутации А122Т с мутацией S653N, составляла бы 37%. Вместо этого наблюдаемая устойчивость двойного мутанта составляла 62%. Следовательно, уровень гербицидной устойчивости, наблюдаемой в линии с двойной мутацией BNCL131A1 (BN-02) является синергетическим по отношению к уровню, наблюдаемому в двух линиях с одиночными мутациями, BNCL97 (BN-02) и BNCL120C7 (BN-02).
Пример 5. Растения Brassica, содержащие сочетанные признаки AHAS, и оценки повреждения гербицидом имазамоксом Растения Brassica napus, содержащие сочетанные резистентные к AHAS-ингибитору молекулы нуклеиновых кислот, получали обычными способами селекции, скрещивая резистентную к AHAS-ингибитору линию, гомозиготную по CLB-1 (AHASL1A-А122(At)T-S653(At)N) с резистентной к AHAS-ингибитору линией, гомозиготной по AHASL1A-W574(At)L (PM2) + AHASL1C-S653(At)N (РМ1).
В теплице в результате искусственного скрещивания получали гибриды между двумя устойчивыми к IMI родительскими яровыми линиями Brassica napus: "BnCL131A1" (гомозиготная по мутации устойчивости к IMI в геноме A AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N) и "РМ1РМ2" (гомозиготная по мутации устойчивости к AHAS-ингибитору в геноме A AHASL1A-W574(At)L(РМ2) плюс по мутации устойчивости в AHAS-ингибитору в геноме С AHASL1C-S653(At)N(PM1)). Полученная в результате искусственного скрещивания гетерозиготная гибридная линия "PM1PM2/BnCL131A1" (гетерозиготная по сочетанным мутациям: AHASL1A-A122(At)Т-S653(At)N, AHASL1A-W57 4(At)L(PM2), AHASL 1C-S653 (At)N(PM 1)) испытывали на поле вместе с линиями, каждая из которых содержала только одну мутацию устойчивости к AHAS-ингибитору (гомозиготную или гетерозиготную) и несколькими контролями яровых растений Brassica napus.
Испытания в трех повторах проводили в Симкое, Северная Дакота, и использовали план с рандоми-
зированными расщепленными блоками. Целью испытания было измерение фитотоксичности в процентах
(% повреждения культуры) для разных объектов при 5 разных нормах обработки имидазолиноновым
гербицидом. Растения опрыскивали на стадии 2-4 листьев с объемным расходом 100 л/га. Использовали
следующие нормы внесения имидазолинонового гербицида (имазамокс = BEYOND(tm) 120 г/л, жидкий
концентрат (BAS 7200 IH); NIS = INDUCE(tm) 90 (90% неионогенное поверхностно-активное вещество;
Helena Chemical Co., Collierville, TN):
№ обработки
Норна обработки
35 г активного ингредиента/га имазамокса + 0,25% (об./об.) NIS
7 0 г активного ингредиента/га имазамокса + 0,25% (об./об.) NIS
140 г активного ингредиента/га имазамокса + 0,25% (об./об.) NIS
210 г активного ингредиента/га имазамокса + 0,25% (об./об.) NIS
Полученная при искусственном скрещивании гибридная линия РМ1РМ2ЛЕ!П0^31А1 содержала 3 гетерозиготных устойчивых к AHAS-ингибитору мутантных аллеля: AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N AHASL1A-W574(At)L
AHASL1C-S653(At)N
линия для сравнения BnCL131A1 (He) содержала 1 гетерозиготный устойчивый к AHAS-ингибитору мутантный аллель:
AHASL1A-A122(At)T-S653(At)N
линия для сравнения РМ2(AHASL1A-PM2) содержала 1 гомозиготный устойчивый к AHAS-ингибитору мутантный аллель:
AHASL1A-W574(At)L
и линия для сравнения РМ1(AHASL1C-PM1) содержала 1 гомозиготный устойчивый к AHAS-ингибитору мутантный аллель:
AHASL1C-S653(At)N.
Оценки повреждения культуры определяли на поле, оценивая каждую делянку в испытании в отношении уровня фитотоксичности (повреждение культуры в процентах) по шкале от 0 до 100% на 18 день после обработки. Средние значения для каждого объекта из трех повторов и их статистическая значимость (ANOVA) представлены в таблице 6 (Но - гомозиготный; Не = гетерозиготный). Каждое значение, указанной в таблице 6, означает среднее значение из трех повторов.
Результаты
Оценки фитотоксичности в процентах (% повреждения культуры) переводили в оценки устойчивости к гербициду путем вычитания оценки повреждения культуры в процентах (табл. 6) для каждой линии из 100%, чтобы получить устойчивость к гербициду в процентах (табл. 7) (Но = гомозиготный; Не = гетерозиготный).
Таблица 7. Средняя устойчивость к гербициду в процентах, наблюдаемая на 18 день после обработки (транспонированная из табл. 1: фитотоксичность в процентах, табл. 1)
Аддитивная устойчивость к гербициду в % =
Наблюдаемая устойчивость к гербициду в % =
20,0
26,7 1
16,7
20,0
8,3
8,3
45,0
55,0
78,3
85,0
Чтобы понять, приводит ли сочетание трех гетерозиготных мутаций в PM1PM2/BNCL131A1 к аддитивному или синергетическому эффекту в отношении устойчивости к гербицидам, складывали средние значения устойчивости к гербициду BnCL131M (Не), РМ1 (AHASL1C-PM1) и РМ2 (AHASL1A-PM2), чтобы получить ожидаемую устойчивость к гербициду в процентах (табл. 7). Отмечается, что линии РМ1 и РМ2, используемые в данном эксперименте, были гомозиготными в отношении устойчивой к AHAS-ингибитору мутации.
Другая контрольная линия могла бы представлять собой гетерозиготную устойчивую к IMI линию РМ1 и гетерозиготную устойчивую к IMI линию РМ2, но так как такой материал был недоступен, использовали их гомозиготные аналоги. В предыдущих исследованиях было показано, что такие линии,
содержащие гетерозиготную устойчивую к IMI мутацию, всегда менее устойчивы к обработкам имида-золиноновым гербицидом, чем линии, содержащие гомозиготную устойчивую к AHAS-ингибитору мутацию (данные не показаны). Ожидаемая аддитивная устойчивость к гербициду в процентах трех отдельных линий ^CLmA^^) + PM1 (AHASL1C-РМ1) + РМ2 (AHASL 1A-PM2) ) при использовании 140 г активного ингредиента/га имазамокса составляла 45%, тогда как наблюдаемая устойчивость к гербициду в процентах линии РМШМ^ПСТ^П^! (содержащей все 3 мутации в гетерозиготном состоянии) составляла 78,3%. Сходный результат наблюдали в случае более высокой нормы обработки 210 г активного ингредиента/га, при этом ожидаемая аддитивная устойчивость к гербициду в процентах составляла 55%, тогда как наблюдаемая устойчивость к гербициду в процентах РМ1РМ2/BnCL131А1 составляла 85% (табл. 7).
В заключение, в линии с сочетанными мутациями РМ1РМ2/BnCL131А1, имеющей гетерозиготные устойчивые к AHAS-ингибитору мутации, наблюдали синергетический эффект в отношении устойчивости к гербициду, приводящий к неожиданно высокому уровню устойчивости к имидазолиноновым гербицидам, что приводило к значительно более высокой устойчивости, чем устойчивость в случае одиночных гомозиготных устойчивых к AHAS-ингибитору мутаций.
Хотя вышеупомянутое изобретение описано подробно с целью иллюстрации и в качестве примера для более ясного понимания, будет очевидно, что на практике могут быть осуществлены некоторые изменения и модификации в объеме прилагаемой формулы изобретения.
Список последовательностей
cttcgcttat cccggaggta cttccatgga gatccaccaa gcc
<210> 5 <2ll> 43 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 5
gcttggtgga tctccatgga agtacctccg ggataagcga age
<210> 6 <211> 21 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 6
cccatcaacg tactcgcacc а 2
<210> 1 <211> 28 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<,22Ъ> Описание искусственной последовательности; синтетический праймер
<400> 7 gtcaatgtcg >
acctgaaaa aaccgaca
<210> 8
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер
<400> 8
gctaacccgc tgacgaggtt ggtagct 2
<210> 9
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 9
aaggcttggt ggatctccat ggacgt
<211> 24 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 10
gaggctttcg ctagcagggc tcaa 2
<210> 11 <211> 2033 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <400> 11
tctctcctct aaccatggcg geggcaacat cgtcttctcc gatctcctta accgctaaac 60
cttcttccaa atcccctcta cccatttcca gattctccct tcccttctcc ttaaccccac 120
agaaagactc ctcccgtctc caccgtcctc tcgccatctc cgccgttctc aactcacccg 180
teaatgtege acctccttcc cctgaaaaaa ccgacaagaa caagactttc gtctcccgct 240
acgctcccga cgagccccgc aagggtgctg atatcctcgt cgaagccctc gagegtcaag 300
gegtcgaaac egtctttget tatcceggag gtgettccat ggagatccac caagecttga 360
ctcgctcctc caccatccgt aacgtccttc cccgtcacga acaaggagga gtcttcgccg 420
ccgagggtta cgctcgttcc tccggcaaac egggaatctg catagccact tcgggtcccg 480
gagctaccaa cctcgtcagc gggttagcag aegegatget tgacagtgtt cctcttgtcg 540
ccattacagg acaggtccct cgccggatga teggtactga cgccttccaa gagacaccaa 600
tcgttgaggt aacgaggtct attacgaaac ataactattt ggtgatggat gttgatgaca 660
tacctaggat cgttcaagaa gctttctttc tagctacttc cggtagaccc ggaccggttt "720
tggttgatgt tcctaaggat attcagcagc agettgegat tcctaactgg gatcaaccta 780
tgcgcttacc tggctacatg tctaggttgc ctcagcctcc ggaagtttct cagttaggtc 340
agategttag gttgatctcg gagtctaaga ggcctgtttt gtacgttggt ggtggaagct 900
tgaactcgag tgaagaactg gggagatttg tcgagcttac tgggatcccc gttgcgagta 960
ctttgatggg gcttggctct tatccttgta acgatgagtt gtccctgcag atgcttggca 1020
tgeaegggae tgtgtatgct aactaegctg tggagcatag tgatttgttg ctggcgtttg 1080
gtgttaggtt tgatgaccgt gtcacgggaa agctcgaggc tttegctage agggctaaaa 1140
ttgtgcacat agacattgat tetgetgaga ttgggaagaa taagacacct cacgtgtctg 1200
tgtgtggtga tgtaaagctg gcttCgcaag ggatgaacaa ggttcttgag aacegggegg 1260
aggagctcaa gcttgatttc ggtgtttgga ggagtgagtt gagegagcag aaacagaagt 1320
tccctttgag
cttcaaaacg
tttggagaag
ccattcctcc
gcagtacgcg
attcagatcc
tcgacgagct
aaccgaaggg
aaggcaatta
tcagtactgg
tgttggacag
catcagatgt
gggcggcgca
gttttacaag
tacaggaagc
cgagacagtg
gctgtcgtca
tcaggcctcg
gagctatggg
ttttggactt
cctgctgcga
ttggagcgt с
tgtggcgaac
cctgatgcga
ttgttgtgga
tattgacggt
gatggaagct
tcataatgaa
cgttcaagag
ctggccacaa
tccgtgtaga
gaatcttcct
gtgaagatac
tcttgttaaa
caaccagcat
cttgggatgg
tcatgcaatg
ggaagatcgg
ttctacaaag
ctaacagagc
tcacacttat
ctcggggacc
cggcaaggga
gaacgagatc
ttccctaaca
tgctgcagtt
tgcaggagct
tgcgggatt с
cagctgcgag
agtgacgaag
aaagaagaac
tccgagaagc
tattcagaca
atgctggata
caccaggacc
atacctgttg
gatgtgatat
gtccgcacca
agaacatgtg
ttaccgatga
tcccaagtgg
tggcactttc
aaagatgtaa
taacagaagg
ggatggtcgc
actaagtact
gagagatgaa
gctggtgatc
gatcatatgg
taaaagactt
agtttcagtt
tec
1330 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1300 i860 1920 1980 2033
<210> 12 <211> 2041 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетический полинуклеотид <400> 12
tctctcattt ctctctctct ctcatctaac catggcggcg geaacategt cttctccgat 60
ctccttaacc gctaaacctt cttccaaatc ccctctaccc atttccagat tctcccttcc 120
cttctcctta accccacaga aaccctcctc ccgtctccac cgtccactcg ccatctccgc 180
cgttctcaac tcacccgtca atgtcgcacc tgaaaaaacc gacaagatca agactttcat 24 0
ctcccgctac gctcccgacg agccccgcaa gggtgctgat atcctcgtgg aagccctcga 300
gegtcaagge gtcgaaaccg tettegctta teceggaggt gcctccatgg agatccacca 360
agecttgact cgctcctcca ccatccgtaa cgtcctcccc cgtcacgaac aaggaggagt 420
cttcgccgcc gagggttacg ctcgttcctc cggcaaaccg ggaatctgea tagccacttc 480
gggtcccgga gctaccaacc tegtcagegg gttagecgae gcgatgcttg acagtgttcc 540
tctcgtcgcc atcacaggac aggtccctcg ceggatgate ggtactgacg cgttccaaga 600
gacgccaatc gttgaggtaa cgaggtctat tacgaaacat aactatctgg tgatggatgt 660
tgatgacata cctaggatcg ttcaagaagc attctttcta gctacttccg gtagaccegg 720
accggttttg gttgatgttc ctaaggatat tcagcagcag ettgegatte ctaactggga 780
tcaacctatg cgcttgcctg gctacatgtc taggctgect cagccaccgg aagtttctca 840
gttaggccag atcgttaggt tgatctcgga gtctaagagg cctgttttgt acgttggtgg 900
tggaagcttg aactcgagtg aagaactggg gagatttgtc gagcttactg ggatccctgt 960
tgcgagtacg ttgatggggc ttggctctta tccttgtaac gatgagttgt ccctgcagat 1020
gcttggcatg caegggactg tgtatgctaa ctacgctgtg gagcatagtg atttgttgct 1080
ggcgtttggt gttaggtttg atgaccgtgt caegggaaag etcgaggegt ttgcgagcag 1140
ggctaagatt gtgeacatag acattgattc tgctgagatt gggaagaata agacacctca 1200
cgtgtctgtg tgtggtgatg taaagctggc tttgcaaggg atgaacaagg ttcttgagaa 1260
cegggeggag gagctcaagc ttgatttegg tgtttggagg agtgagttga gcgagcagaa 1320
acagaagttc ccgttgagct teaaaaegtt tggagaagee attcctccgc agtacgegat 1380
tcaggtccta gacgagctaa cccaagggaa ggcaattatc agtactggtg ttggacagca 1440
tcagatgtgg gcggcgcagt tttacaagta caggaagecg aggcagtggc tgtcgtcctc 1500
aggactegga gctatgggtt tcggacttcc tgetgegatt ggagcgtctg tggcgaaccc 1560
tgatgegatt gttgtggaca ttgacggtga tggaagcttc ataatgaacg ttcaagagct 1620
ggccacaatc cgtgtagaga atcttcctgt gaagatactc ttgttaaaca accagcatct 1680
tgggatggtc atgcaatggg aagatcggtt ctacaaagct aacagagctc acacttatct 1740
cggggacccg gcaagggaga acgagatctt ccctaacatg ctgcagtttg caggagcttg 1800
egggattcca getgegagag tgacgaagaa agaagaactc cgagaagcta ttcagacaat 1860
gctggataca cctggaccgt acctgttgga tgtcatctgt ccgcaccaag aacatgtgtt 1920
accgatgatc ccaagtggtg gcactttcaa agatgtaata accgaagggg atggtcgcac 1980
taagtactga gagatgaagc tggtgatcca tcatatggta aaagacttag tttcagtttt 2040
с 2041
<210> 13 <211> 2024 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид
tctctcatct aaccatggcg geggcaacat cgtcttctcc gatctcctta accgctaaac 60
cttcttccaa atcccctcta cccatttcca gattctccct tcccttctcc ttaaccccac 120
agaaaccctc ctcccgtctc caccgtcctc tcgccatctc cgccgttctc aactcacccg 180
teaatgtege acctgaaaaa accgacaaga tcaagacttt catctcccgc tacgctcccg 240
acgagccccg caagggtget gatatcctcg tggaagcect egagegtcaa ggcgtcgaaa 300
ccgtcttcgc ttatcccgga ggtgcttcca tggagatcca ccaagccttg actcgctcct 360
ccaccatccg taacgtcctc ccccgtcacg aacaaggagg agtcttcgcc gecgagggtt 420
acgctcgttc
ctccggcaaa
ccgggaat ct
gcatagccac
ttcgggtccc
ggagctacca
480
acctcgtcag
cgggttagcc
gacgcgatgc
ttgacagtgt
tcctctcgtc
gccatcacag
540
gacaggtccc
tcgccggatg
atcggtactg
acgcgttcca
agagacgcca
atcgt tgagg
600
taacgaggtc
tattacgaaa
cataactatc
tggtgatgga
tgttgatgac
atacctagga
660
tcgttcaaga
agctttcttt
ctagctactt
ccggtagacc
cggaccggtt
ttggttgatg
720
ttcctaagga
tattcagcag
cagcttgcga
ttcctaactg
ggatcaacct
atgcgcttgc
780
ctggctacat
gtctaggctg
cctcagccac
cggaagtttc
tcagttaggt
cagatcgtta
840
ggttgatctc
ggagtctaag
aggcctgttt
tgtacgttgg
tggtggaagc
ttgaactcga
900
gtgaagaact
ggggagattt
gtcgagctta
ctgggatccc
tgttgcgagt
acgttgatgg
960
ggcttggctc
ttatccttgt
aacgatgact
tgtccctgca
gatgcttggc
atgcacggga
1020
ctgtgtatgc
taactacgct
gtggagcata
gtgatttgtt
gctggcgttt
ggtgttaggt
1080
ttgatgaccg
tgtcacggga
aagctcgagg
cgtttgcgag
cagggctaag
attgtgcaca
1140
tagacattga
ttctgctgag
attgggaaga
ataagacacc
tcacgtgtct
gtgtgtggtg
1200
atgtaaagct
ggctttgcaa
gggatgaaca
aggttcttga
gaaccgggcg
gaggagctca
1260
agcttgattt
cggtgtttgg
aggagtgagt
tgagcgagca
gaaacagaag
ttcccgttga
1320
gcttcaaaac
gtttggagaa
gccattcctc
cgcagtacgc
gattcaggtc
ctagacgagc
1380
taacccaagg
gaaggcaat t
atcagtactg
gtgttggaca
gcat cagatg
tgggcggcgc
1440
agttttacaa
gtacaggaag
ccgaggcagt
ggctgtcgtc
ctcaggactc
ggagctat gg
1500
gtttcggact
tcctgctgcg
attggagcgt
ctgtggcgaa
ccctgatgcg
attgttgtgg
1560
acattgacgg
tgatggaagc
ttcataatga
acgttcaaga
gctggccaca
atccgtgtag
1620
agaatcttcc
tgtgaagata
ctcttgttaa
acaaccagca
tcttgggatg
gtcatgcaat
1680
gggaagatcg
gttctacaaa
gctaacagag
ctcacactta
tctcggggac
ccggcaaggg
1740
agaacgagat
cttccctaac
atgctgcagt
ttgcaggagc
ttgcgggatt
ccagctgcga
1800
gagtgacgaa
gaaagaagaa
ctccgagaag
ctattcagac
aatgctggat
acacctggac
1860
cgtacctgtt
ggatgtcatc
tgtccgcacc
aagaacatg t
gttaccgatg
atcccaagtg
1920
gtggcacttt
caaagatgta
ataaccgaag
gggatggtcg
cactaagtac
tgagagatga
1980
agctggtgat
cgatcatatg
gtaaaagact
tagtttcagt
tttc
2024
<210> 14 <211> 2024 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 14
tctctcatct aaccatggcg gcggcaacat cgtcttctcc gatetectta accgctaaac ctt cttccaa atcccctcta cccatttcca gattctccct tcccttctcc ttaaccccac agaaaccctc ctcccgtctc caccgtcctc tcgccatctc cgccgttctc aactcacccg tcaatgtcgc acctgaaaaa accgacaaga tcaagacttt catctcccgc tacgctcccg acgagccccg caagggtgct gatatcctcg tggaagccct cgagcgtcaa ggcgtcgaaa ccgtcttcgc ttatcccgga ggtgcttcca tggagatcca ccaagccttg actcgctcct ccaccatccg taacgtcctc ccccgtcacg aacaaggagg agtcttcgcc gccgagggtt acgctcgttc ctccggcaaa ccgggaatct gcatagccac ttcgggtccc ggagctacca acctcgtcag cgggttagcc gacgcgatgc ttgacagtgt tcctctcgtc gccatcacag gacaggtccc tcgccggatg atcggtactg acgcgttcca agagacgcca atcgttgagg taacgaggtc tattacgaaa cataactatc tggtgatgga tgttgatgac atacctagga tcgttcaaga agctttcttt ctagctactt ccggtagacc cggaccggtt ttggttgatg ttcctaagga tattcagcag cagcttgcga ttcctaactg ggatcaacct atgcgcttgc ctggctacat gtctaggctg cctcagccac cggaagtttc tcagttaggt cagatcgtta ggttgatctc ggagtctaag aggcctgttt tgtacgttgg tggtggaagc ttgaactcga gtgaagaact ggggagattt gtcgagctta ctgggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggcttggctc ttatccttgt aacgatgact tgtccctgca gatgcttggc atgcacggga ctgtgtatgc taactacgct gtggagcata gtgatttgtt gctggcgttt ggtgttaggt ttgatgaccg tgtcacggga aagctcgagg cgtttgcgag cagggctaag attgtgcaca tagacattga ttctgctgag attgggaaga ataagacacc tcacgtgtct gtgtgtggtg atgtaaagct ggctttgcaa gggatgaaca aggttcttga gaaccgggcg gaggagctca agcttgattt cggtgtttgg aggagtgagt tgagcgagca gaaacagaag ttcccgttga gcttcaaaac gtttggagaa gccattcctc cgcagtacgc gattcaggtc ctagacgagc taacccaagg gaaggcaatt atcagtactg gtgttggaca gcatcagatg tgggcggcgc agttttacaa gtacaggaag ccgaggcagt ggctgtcgtc ctcaggactc ggagctatgg gtttcggact tcctgctgcg attggagcgt ctgtggcgaa ccctgatgcg attgttgtgg acattgacgg tgatggaagc ttcataatga acgttcaaga gctggccaca atccgtgtag agaatcttcc tgtgaagata ctcttgttaa acaaccagca tcttgggatg gtcatgcaat gggaagatcg gttctacaaa gctaacagag ctcacactta tctcggggac ccggcaaggg agaacgagat cttccctaac atgctgcagt ttgcaggagc ttgcgggatt ccagctgcga gagtgacgaa gaaagaagaa ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acacctggac cgtacctgtt ggatgtcatc tgtccgcacc aagaacatgt gttaccgatg atcccaaatg
gtggcacttt caaagatgta ataaccgaag gggatggtcg cactaagtac tgagagatga 1980 agctggtgat cgatcatatg gtaaaagact tagtttcagt tttc 2024
<210> 15 <211> 2024 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Описание искусственной последовательности; синтетический полинуклеотид <400> 16
tctctcatct aaccatggcg gcggcaacat cgtcttctcc gatetectta accgctaaac 60
cttcttccaa atcccctcta cccatttcca gattctccct tcccttctcc ttaaccccac 120
agaaaccctc ctcccgtctc caccgtcctc tcgccatctc cgccgttctc aactcacccg 180
tcaatgtcgc acctgaaaaa accgacaaga tcaagacttt catctcccgc tacgctcccg 240
acgagccccg caagggtgct gatatcctcg tggaagcect egagegtcaa ggcgtcgaaa 300
ccgtcttcgc ttatcccgga ggtacttcca tggagatcca ccaagccttg actcgctcct 360
ccaccatccg taacgtcctc ccccgtcacg aacaaggagg agtcttcgcc gecgagggtt 420
acgctcgttc ctccggcaaa cegggaatet gcatagccac ttcgggtccc ggagctacca 480
acctcgtcag egggttagee gacgcgatgc ttgacagtgt tcctctcgtc gccatcacag 540
gacaggtccc tegceggatg atcggtactg acgcgttcca agagacgcca ategttgagg 600
taacgaggtc tattacgaaa cataactatc tggtgatgga tgttgatgac atacctagga 660
tcgttcaaga agctttcttt ctagctactt ccggtagacc cggaccggtt ttggttgatg 720
ttcctaagga tattcagcag cagcttgcga ttcctaactg ggatcaacct atgcgcttgc 780
ctggctacat gtctaggctg cctcagccac cggaagtttc tcagttaggt cagatcgtta 840
ggttgatctc ggagtctaag aggcctgttt tgtacgttgg tggtggaagc ttgaactcga 900
gtgaagaact ggggagattt gtcgagctta ctgggatccc tgttgcgagt acgttgatgg 960
ggcttggctc ttatccttgt aacgatgact tgtccctgca gatgcttggc atgcacggga 1020
ctgtgtatgc taactacgct gtggagcata gtgatttgtt gctggcgttt ggtgttaggt 1080
ttgatgaccg tgtcacggga aagctcgagg cgtttgcgag cagggctaag attgtgcaca 1140
tagacattga ttctgctgag attgggaaga ataagacacc tcacgtgtct gtgtgtggtg 1200
atgtaaagct ggctttgcaa gggatgaaca aggttct tga gaaccgggcg gaggagctca 1260
agcttgattt cggtgtttgg aggagtgagt tgagcgagca gaaacagaag ttcccgttga 1320
gcttcaaaac gtttggagaa gccattcctc cgcagtacgc gattcaggtc ctagacgagc 1380
taacccaagg gaaggcaatt atcagtactg gtgttggaca gcatcagatg tgggcggcgc 14 40
agttttacaa gtacaggaag ccgaggcagt ggctgtcgtc ctcaggactc ggagctatgg 1500
gtttcggact tcctgctgcg attggagcgt ctgtggcgaa ccctgatgcg attgttgtgg 1560
acattgacgg tgatggaagc ttcataatga acgttcaaga gctggccaca atccgtgtag 1620
agaatcttcc tgtgaagata ctcttgttaa acaaccagca tcttgggatg gtcatgcaat 1680
gggaagatcg gttctacaaa gctaacagag ctcacactta tctcggggac ccggcaaggg 1740
agaacgagat cttccctaac atgctgcagt ttgcaggagc ttgcgggatt ccagctgcga 1800
gagtgacgaa gaaagaagaa ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acacctggac 1860
cgtacctgtt ggatgtcatc tgtccgcacc aagaacatgt gttaccgatg atcccaaatg 1920
gtggcacttt caaagatgta ataaccgaag gggatggtcg cactaagtac tgagagatga 1980
agctggtgat cgatcatatg gtaaaagact tagtttcagt tttc 2024
<210> 17 <211> 652 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 17
Met Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Pro lie Sec Leu Thr Ala Lys Pro
Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro lie Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser
20 25 30
Leu Thr Pro Gin Lys Pro Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala lie
Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Glu Lys Thr Asp
Lys lie Lys Thr Phe lie Ser Arg Tyr Ala Pro Asp Glu Pro Arg Lys
Gly Ala Asp lie- Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly Val Glu Thr
<400> 22
atggcggcgg саасаасаас aacaacaaca tcttcttcga tctccttctc caccaaacca 60
tctccttcct cctccaaatc accattacca atctccagat tctccctccc attctcccta 120
aaccccaaca aatcatcctc ctcctcccgc cgccgcggta tcaaatccag ctctccctcc 180
tccatctccg ccgtgctcaa cacaaccacc aatgtcacaa ccactccctc tccaaccaaa 240
cctaccaaac ccgaaacatt catctcccga ttcgctccag atcaaccccg caaaggcgct 300
gatatcctcg tcgaagcttt agaacgtcaa ggcgtagaaa ccgtattcgc ttaccctgga 360
ggtgcatcaa tggagattca ccaagcctta acccgctctt cctcaatccg taacgtcctt 420
cctcgtcacg aacaaggagg tgtattcgca gcagaaggat acgctcgatc ctcaggtaaa 480
ccaggtatct gtatagccac ttcaggtccc ggagctacaa atctcgttag cggattagcc 540
gatgcgttgt tagatagtgt tcctcttgta gcaatcacag gacaagtccc tcgtcgtatg 600
attggtacag atgcgtttca agagactccg attgttgagg taacgcgttc gattacgaag 660
cataactatc ttgtgatgga tgttgaagat atccctagga ttattgagga agctttcttt 720
ttagctactt ctggtagacc tggacctgtt ttggttgatg ttcctaaaga tattcaacaa 780
cagcttgcga ttcctaattg ggaacaggct atgagattac ctggttatat gtctaggatg 840
cctaaacctc cggaagattc tcatttggag cagattgtta ggttgatttc tgagtctaag 900
aagcctgtgt tgtatgttgg tggtggttgt ttgaattcta gcgatgaatt gggtaggttt 960
gttgagctta cggggatccc tgttgcgagt acgttgatgg ggctgggatc ttatccttgt 1020
gatgatgagt tgtcgttaca tatgcttgga atgcatggga ctgtgtatgc aaattacgct 1080
gtggagcata gtgatttgtt gttggcgttt ggggtaaggt 11gatgateg tgtcacgggt 114 0
aagcttgagg ettttgetag tagggctaag attgttcata ttgatattga cteggctgag 1200
attgggaaga ataagactcc tcatgtgtct gtgtgtggtg atgttaagct ggctttgcaa 1260
gggatgaata aggttcttga gaaccgagcg gaggagctta agcttgattt tggagtttgg 1320
aggaatgagt tgaaegtaca gaaacagaag tttccgttga gctttaagac gtttggggaa 1380
gctattcctc cacagtatgc gattaaggtc cttgatgagt tgactgatgg aaaagecata 1440
ataagtactg gtgtcgggca acatcaaatg tgggcggcgc agttctacaa ttacaagaaa 1500
ccaaggcagt ggctatcatc aggaggcett ggagctatgg gatttggact tcctgctgcg 1560
attggagcgt ctgttgctaa ccctgatgcg atagttgtgg atattgaegg agatggaagc 1620
tttataatga atgtgcaaga gctagccact attcgtgtag agaatcttcc agtgaaggta 1680
cttttattaa acaaccagca tcttggcatg gttatgcaat gggaagatcg gttctacaaa 1740
gctaaccgag ctcacacatt tcteggggat ccggctcagg aggacgagat attcccgaac 1800
atgttgctgt ttgeagcage ttgcgggatt ccagcggcga gggtgacaaa gaaagcagat 1860
ctccgagaag ctattcagac aatgctggat acaccaggac cttacctgtt ggatgtgatt 1920
tgtccgcacc aagaacatgt gttgccgatg atcccgagtg gtggcacttt caacgatgtc 1980
ataaeggaag gagatggccg gattaaatac tga 2013
<210> 23 <211> 670 <212> БЕЛОК
<213> Arabidopsis thaliana <400> 23
Met Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ser He Ser Phe
Ser Thr Lys Pro Ser Pro Ser Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro He Ser
20 25 30
Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser Leu Asn Pro Asn Lys Ser Ser Ser Ser
35 40 45
Ser Arg Arg Arg Gly He Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser He Ser Ala
50 55 60
Val Leu Asn Thr Thr Thr Asn Val Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Lys
65 70 75 80
Pro Thr Lys Pro Glu Thr Phe He Ser Arg Phe Ala Pro Asp Gin Pro
85 90 95
Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gin Gly Val
100 105 110
Glu Thr Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu He His Gin
115 120 125
Ala Leu Thr Arg Ser Ser Ser He Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu
130 135 140
Gin Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Lys
145 150 155 160
Pro Gly He Cys He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val
165 170 175
Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala He
180 185 190
Thr Gly Gin Val Pro Arg Arg Met He Gly Thr Asp Ala Phe Gin Glu
195 200 205
Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His Asn Tyr Leu
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантная или подвергнутая мутагенезу молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая бе- 59
лок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот III (AHASLIII) Brassica napus, содержащая замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, причем кодируемый белок AHASL III Brassica napus является резистентным к инги-бированию имидазолиноновым гербицидом, где указанный белок AHASL III проявляет синергетический уровень резистентности к ингибированию имидазолиноновым гербицидом по сравнению с аддитивными уровнями белка AHASL III Brassica napus, имеющего единичную мутацию А122Т, и белка AHASL III Brassica napus, имеющего единичную мутацию S653N, причем AHASL III белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21 или ее зрелую форму, где положения 122 и 653 последовательности SEQ ID NO:23 соответствуют положениям 104 и 635 соответственно последовательности SEQ ID NO:21.
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:16.
3. Экспрессирующий вектор, содержащий изолированную молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
4. Растение Brassica, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, где растение Brassica является резистентным по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду.
5. Растение Brassica по п.4, выбранное из В. napus, В. rapa и В. juncea.
6. Растение Brassica по п.4, представляющее собой Brassica napus, которое является нетрансгенным.
7. Растение Brassica по п.4, содержащее вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID NO:21.
8. Семя растения Brassica, полученное из растения Brassica по п.4.
9. Семя по п.8, где растение Brassica выбрано из В. napus, В. rapa и В. juncea.
10. Семя по п.9, где растение Brassica представляет собой Brassica napus, которое является нетранс-генным.
11. Семя по п.8, обработанное имидазолиноновым гербицидом.
12. Семя по п.11, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.
13. Семя, полученное из растения Brassica по п.7.
14. Способ борьбы с сорняками, растущими вблизи растения Brassica, где указанный способ включает применение эффективного количества по меньшей мере одного имидазолинонового гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, где растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.
15. Способ по п.14, где растение Brassica выбрано из В. juncea, В. napus, В. rapa, В. carinata, В. ol-eracea и В. nigra.
16. Способ по п.14, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.
17. Способ по п.14, где растение Brassica является нетрансгенным.
18. Способ по п.14, где растением Brassica является Brassica napus.
19. Способ по п.14, где растение Brassica дополнительно содержит вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности
SEQ ID NO:21.
20. Растительная клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1, где растительная клетка является устойчивой по меньшей мере к одному имидазолиноновому гербициду.
21. Растительная клетка по п.20, представляющая собой растительную клетку растения Brassica.
22. Растительная клетка по п.20, которая является нетрансгенной клеткой растения Brassica napus.
23. Растительная клетка по п.20, дополнительно содержащая вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL.
24. Способ борьбы с сорняками, включающий контактирование семян растения Brassica, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п. 1 перед посевом и/или после предварительного проращивания с имидазолиноновым гербицидом.
25. Способ по п.24, где растение дополнительно содержит вторую молекулу нуклеиновой кислоты AHASL, которая кодирует второй устойчивый к имидазолиноновому гербициду белок AHASL, имеющий по крайней мере одну замену, выбранную из А122Т, P197S, A205V, W574L, S653N последовательности SEQ ID NO:23, соответствующих положениям 104, 179, 187, 556 и 635 последовательности SEQ ID
NO:21.
26. Способ по п.24, где имидазолиноновый гербицид выбран из имазамокса, имазапика, имазапира, имазетапира и их смесей.
27. Способ идентификации молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в биологическом образце, включающий
26.
получение смеси растительного биологического образца (i), содержащего ДНК, и набора праймеров нуклеиновых кислот (ii), включающего по меньшей мере один первый и второй праймер, способный ам-плифицировать молекулу нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1, где по меньшей мере один из указанных праймеров содержит любую последовательность из SEQ ID NO:1-10;
обеспечение взаимодействия смеси компонентов в условиях, которые позволяют в результате по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировать молекулу нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 с использованием первого и второго праймера; и
выявление наличия или отсутствия амплифицированной молекулы нуклеиновой кислоты AHASL
III по п.1.
28. Способ идентификации молекулы нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в биологическом образце, содержащий
получение смеси растительного биологического образца (i), содержащего ДНК, и зонда молекулы нуклеиновой кислоты (ii), способного специфично гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты
AHASL III по п.1;
обеспечение взаимодействия смеси компонентов в условиях, которые позволяют зонду молекулы нуклеиновой кислоты специфично гибридизоваться с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1;
выявление гибридизации зонда молекулы нуклеиновой кислоты с молекулой нуклеиновой кислоты AHASL III по п.1 в образце, где наличие гибридизации указывает на присутствие указанной молекулы нуклеиновой кислоты AHASL.
29. Рекомбинантная или подвергнутая мутагенезу молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок большой субъединицы синтазы ацетогидроксикислот III (AHASLIII) Brassica, содержащая замену аланина на треонин в положении, соответствующем положению А122 последовательности SEQ ID NO:23, и замену серина на аспарагин в положении, соответствующем положению S653 последовательности SEQ ID NO:23, причем указанный белок AHASL является резистентным к ингибированию имидазо-линоновым гербицидом, где указанный белок AHASL проявляет синергетический уровень резистентности к ингибированию имидазолиноновым гербицидом по сравнению с аддитивными уровнями белка AHASL III Brassica, имеющего единичную мутацию А122Т, и белка AHASL III Brassica, имеющего единичную мутацию S653N, причем указанный AHASL III белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21 или ее зрелую форму или последовательность SEQ ID NO:21, дополнительно содержащую консервативную аминокислотную замену, где положения 122 и 653 последовательности SEQ ID NO:23 соответствуют положениям 104 и 635 соответственно последовательности SEQ ID NO:21.
30. Способ борьбы с сорняками, растущими вблизи растения Brassica, где указанный способ включает применение эффективного количества по меньшей мере одного имидазолинонового гербицида по отношению к сорнякам и растению Brassica, где растение Brassica содержит в своем геноме по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.29.
31. Способ борьбы с сорняками, включающий контактирование семян растения Brassica, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты по п.29, с имидазолиноновым гербицидом перед посевом и/или после предварительного проращивания.
04 , , . . , . . . . , . . . . , . . . . 1
О 25 50 75 1 100
Концентрация имазамокса (мкМ)
Активность AHAS в экстрактах проростков Brassica
Z11524_AHASL1C S11526_AHASL1A BM02_AHASL1A BNQ2-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
2501 2550
TCTCTCCT CTAAC CATGGCGGCG GCAACATCGT
TCTCTCATTT CTCTCTCTCT CTCATCTAAC CATGGCGGCG GCAACATCGT
TCTCTCAT , CTAAC CATGGCGGCG GCAACATCGT
TCTCTCAT. . . - CTAAC CATGGCGGCG GCAACATCGT
TCTCTCAT CTAAC CATGGCGGCG GCAACATCGT
TCTCTCAT CTAAC CATGGCGGCG GCAACATCGT
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BNO 2_AHAS L 1A BNQ2-97_AHASL1A ВЫО 2-12 0_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
2551
CTTCTCCGAT CTTCTCCGAT CTTCTCCGAT CTTCTCCGAT CTTCTCCGAT CTTCTCCGAT
CTCCTTAACC CTCCTTAACC CTCCTTAACC CTCCTTAACC CTCCTTAACC CTCCTTAACC
GCTAAACCTT GCTAAACCTT GCTAAACCTT GCTAAACCTT GCTAAACCTT GCTAAACCTT
CTTCCAAATC CTTCCAAATC CTTCCAAATC CTTCCAAATC CTTCCAAATC CTTCCAAATC
2600 CCCTCTACCC CCCTCTACCC CCCTCTACCC CCCTCTACCC CCCTCTACCC CCCTCTACCC
Z11524_AHASL1C Z11526~AHAS:L1A BN02_AffASLlA BNQ2-97~AHASL1A BN02-120_AHASL1A BNQ2-131~AHASL1A
2601
ATTTCCAGAT ATTTCCAGAT ATTTCCAGAT ATTTCCAGAT ATTTCCAGAT ATTTCCAGAT
TCTCCCTTCC TCTCCCTTCC TCTCCCTTCC TCTCCCTTCC TCTCCCTTCC TCTCCCTTCC
CTTCTCCTTA CTTCTCCTTA CTTCTCCTTA CTTCTCCTTA CTTCTCCTTA CTTCTCCTTA
ACCCCACAGA ACCCCACAGA ACCCCACAGA ACCCCACAGA ACCCCACAGA ACCCCACAGA
2650 AAGACTCCTC AACCCTCCTC AACCCTCCTC AACCCTCCTC AACCCTCCTC AACCCTCCTC
311524 AHASL1C 2U526~AHASiAA BN02_AHASL1A BNQ2-97_AHASL1A ВИ02-120_AHASL1 A BN02-131 AHASL1A
2651
CCGTCTCCAC CCGTCTCCAC CCGTCTCCAC CCGTCTCCAC CCGTCTCCAC CCGTCTCCAC
CGTCCTCTCG CGTCCACTCG CGTCCTCTCG CGTCCTCTCG CGTCCTCTCG CGTCCTCTCG
CCATCTCCGC CCATCTCCGC CCATCTCCGC CCATCTCCGC CCATCTCCGC CCATCTCCGC
CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC CGTTCTCAAC
2700 TCACCCGTCA TCACCCGTCA TCACCCGTCA TCACCCGTCA TCACCCGTCA TCACCCGTCA
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BNO 2 _AHASL1A ВИ02-57_AHASL1A BN 02-12 0_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
2701 2750
ATGTCGCACC TCCTTCCCCT GAAAAAACCG ACAAGAACAA GACTTTCGTC
ATGTCGCACC T GAAAAAACCG ACAAGATCAA GACTTTCATC
ATGTCGCACC T GAAAAAACCG ACAAGATCAA GACTTTCATC
ATGTCGCACC T GAAAAAACCG ACAAGATCAA GACTTTCATC
ATGTCGCACC T GAAAAAACCG ACAAGATCAA GACTTTCATC
ATGTCGCACC T GAAAAAACCG ACAAGATCAA GACTTTCATC
Z11524_AHASL1C Z1152 6_AHASL1A BNO 2 ~AHASL1A BN02-97 AHASL1A BN02-120~AHASL1A BNG2-131 AHASL1A
2751
TCCCGCTACG TCCCGCTACG TCCCGCTACG TCCCGCTACG TCCCGCTACG TCCCGCTACG
CTCCCGACGA CTCCCGACGA CTCCCGACGA CTCCCGACGA CTCCCGACGA CTCCCGACGA
GCCCCGCAAG GCCCCGCAAG GCCCCGCAAG GCCCCGCAAG GCCCCGCAAG GCCCCGCAAG
GGTGCTGATA GGTGCTGATA GGTGCTGATA GGTGCTGATA GGTGCTGATA GGTGCTGATA
2800 TCCTCGTCGA TCCTCGTGGA TCCTCGTGGA TCCTCGTGGA TCCTCGTGGA TCCTCGTGGA
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02~AHASL1A BNQ2-97_AHASL1A BN02-12 0_AHASL1A BN02-131 AHA5L1A
2801
AGCCCTCGAG AGCCCTCGAG AGCCCTCGAG AGCCCTCGAG AGCCCTCGAG AGCCCTCGAG
CGTCAAGGCG CGTCAAGGCG CGTCAAGGCG CGTCAAGGCG CGTCAAGGCG CGTCAAGGCG
TCGAAACCGT TCGAAACCGT TCGAAACCGT TCGAAACCGT TCGAAACCGT TCGAAACCGT
CTTTGCTTAT CTTCGCTTAT CTTCGCTTAT CTTCGCTTAT CTTCGCTTAT CTTCGCTTAT
2850" CCCGGAGGTG CCCGGAGGTG CCCGGAGGTG CCCGGAGGTG CCCGGAGGTA CCCGGAGGTA
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02~AHASL1A BHQ2-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BH02-131~AHASL1A
2651
CTTCCATGGA CCTCCATGGA CTTCCATGGA CTTCCATGGA CTTCCATGGA CTTCCATGGA
GATCCACCAA GATCCACCAA GATCCACCAA GATCCACCAA GATCCACCAA GATCCACCAA
GCCTTGACTC GCCTTGACTC GCCTTGACTC GCCTTGACTC GCCTTGACTC GCCTTGACTC
GCTCCTCCAC GCTCCTCCAC GCTCCTCCAC GCTCCTCCAC GCTCCTCCAC GCTCCTCCAC
2900 CATCCGTAAC CATCCGTAAC CATCCGTAAC CATCCGTAAC CATCCGTAAC CATCCGTAAC
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A ВЫ 0 2 _AHAS L1A BN02-97~AHASL1A BN02-12C_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
2901
GTCCTTCCCC GTCCTCCCCC GTCCTCCCCC GTCCTCCCCC GTCCTCCCCC GTCCTCCCCC
GTCACGAACA GTCACGAACA GTCACGAACA GTCACGAACA GTCACGAACA GTCACGAACA
AGGAGGAGTC AGGAGGAGTC AGGAGGAGTC AGGAGGAGTC AGGAGGAGTC AGGAGGAGTC
TTCGCCGCCG TTCGCCGCCG TTCGCCGCCG TTCGCCGCCG TTCGCCGCCG TTCGCCGCCG
2950 AGGGTTACGC AGGGTTACGC AGGGTTACGC AGGGTTACGC AGGGTTACGC AGGGTTACGC
Z11524__AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BNQ2-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A ВН02-1Э1 AHASL1A
2951
TCGTTCCTCC TCGTTCCTCC TCGTTCCTCC TCGTTCCTCC TCGTTCCTCC TCGTTCCTCC
GGCAAACCGG GGCAAACCGG GGCAAACCGG GGCAAACCGG GGCAAACCGG GGCAAACCGG
GAATCTGCAT GAATCTGCAT GAATCTGCAT GAATCTGCAT GAATCTGCAT GAATCTGCAT
AGCCACTTCG AGCCACTTCG AGCCACTTCG AGCCACTTCG AGCCACTTCG AGCCACTTCG
3000 GGTCCCGGAG GGTCCCGGAG GGTCCCGGAG GGTCCCGGAG GGTCCCGGAG GGTCCCGGAG
Z11524_AHASL1C ZU526_AHASL1A BNO2 AHASL1A BN02-97~AHASL1A BNO2-120_AKASLlA BN02-131 AHASL1A
3001
CTACCAACCT CTACCAACCT CTACCAACCT CTACCAACCT CTACCAACCT CTACCAACCT
CGTCAGCGGG CGTCAGCGGG CGTCAGCGGG CGTCAGCGGG CGTCAGCGGG CGTCAGCGGG
TTAGCAGACG TTAGCCGACG TTAGCCGACG TTAGCCGACG TTAGCCGACG TTAGCCGACG
CGATGCTTGA CGATGCTTGA CGATGCTTGA CGATGCTTGA CGATGCTTGA CGATGCTTGA
3050 CAGTGTTCCT CAGTGTTCCT CAGTGTTCCT CAGTGTTCCT CAGTGTTCCT CAGTGTTCCT
211524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02.AHASL1A BNO2-97 AHASL1A BH02-120^AHASL1A ВЫ02-131 APASLIA
3051
CTTGTCGCCA CTCGTCGCCA CTCGTCGCCA CTCGTCGCCA CTCGTCGCCA CTCGTCGCCA
TTACAGGACA TCACAGGACA TCACAGGACA TCACAGGACA TCACAGGACA TCACAGGACA
GGTCCCTCGC GGTCCCTCGC GGTCCCTCGC GGTCCCTCGC GGTCCCTCGC GGTCCCTCGC
CGGATGATCG CGGATGATCG CGGATGATCG CGGATGATCG CGGATGATCG CGGATGATCG
3100 GTACTGACGC GTACTGACGC GTACTGACGC GTACTGACGC GTACTGACGC GTACTGACGC
S11524_AHASL1C Z11S26_AHASL1A BMO 2_AHASL1 A BNO 2-9 7_AHASL1A BNO2-12O^AHASLlA BN02-131 AHASL1A
3101
CTTCCAAGAG GTTCCAAGAG GTTCCAAGAG GTTCCAAGAG GTTCCAAGAG GTTCCAAGAG
ACACCAATCG ACGCCAATCG ACGCCAATCG ACGCCAATCG ACGCCAATCG ACGCCAATCG
TTGAGGTAAC TTGAGGTAAC TTGAGGTAAC TTGAGGTAAC TTGAGGTAAC TTGAGGTAAC
GAGQTCTATT GAGGTCTATT GAGQTCTATT GAGGTCTATT GAGGTCTATT GAGGTCTATT
3150 ACGAAACATA ACGAAACATA ACGAAACATA ACGAAACATA ACGAAACATA ACGAAACATA
211524 AHASL1C Z11526~AHASL1A BN02_AHASL1A ВЫ02-97 AHASL1A BN02-12 0~AHASLlA BN02-131 AHASL1A
3151 3200 ACTATTTGGT GATGGATGTT GATGACATAC CTAGGATCGT TCAAGAAGCT ACTATCTGGT GATGGATGTT GATGACATAC CTAGGATCGT TCAAGAAGCA ACTATCTGGT GATGGATGTT GATGACATAC CTAGGATCGT TCAAGAAGCT ACTATCTGGT GATGGATGTT GATGACATAC CTAGGATCGT TCAAGAAGCT ACTATCTGGT GATGGATGTT GATGACATAC CTAGGATCGT TCAAGAAGCT ACTATCTGGT GATGGATGTT GATGACATAC CTAGGATCGT TCAAGAAGCT
311524_AiiASHC Z11526_AHASL1A BNO 2__AJiAS Ы A BN02-97~AHASLlA BN02-120_AHASLlA ВЙ02 -13l_AHASLlA
3201
TTCTTTCTAG TTCTTTCTAG TTCTTTCTAG TTCTTTCTAG TTCTTTCTAG TTCTTTCTAG
CTACTTCCGG CTACTTCCGG CTACTTCCGG CTACTTCCGG CTACTTCCGG CTACTTCCGG
TAGACCCGGA TAGACCCGGA TAGACCCGGA TAGACCCGGA TAGACCCGGA TAGACCCGGA
CCGGTTTTGG CCGGTTTTGG CCGGTTTTGG CCGGTTTTGG CCGGTTTTGG CCGGTTTTGG
3250 TTGATGTTCC TTGATGTTCC TTGATGTTCC TTGATGTTCC TTGATGTTCC TTGATGTTCC
311524_AHABL1C 211526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-12 0~AHASL1A BN02-131 AHASL1A
3251
TAAGGATATT TAAGGATATT TAAGGATATT TAAGGATATT TAAGGATATT TAAGGATATT
CAGCAGCAGC CAGCAGCAGC CAGCAGCAGC CAGCAGCAGC CAGCAGCAGC CAGCAGCAGC
TTGCGATTCC TTGCGATTCC TTGCGATTCC TTGCGATTCC TTGCGATTCC TTGCGATTCC
TAACTGGGAT TAACTGGGAT TAACTGGGAT TAACTGGGAT TAACTGGGAT TAACTGGGAT
3300 CAACCTATGC CAACCTATGC CAACCTATGC CAACCTATGC CAACCTATGC CAACCTATGC
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BNO 2 _AHASL 1A BM02-97_AHASL1A BM02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
3301
GCTTACCTGG GCTTGCCTGG GCTTGCCTGG GCTTGCCTGG GCTTGCCTGG GCTTGCCTGG
CTACATGTCT CTACATGTCT CTACATGTCT CTACATGTCT CTACATGTCT CTACATGTCT
AGGTTGCCTC AGGCTGCCTC AGGCTGCCTC AGGCTGCCTC AGGCTGCCTC AGGCTGCCTC AGCCTCCGGA AGCCACCGGA AGCCACCGGA AGCCACCGGA AGCCACCGGA AGCCACCGGA
3350 AGTTTCTCAG AGTTTCTCAG AGTTTCTCAG AGTTTCTCAG AGTTTCTCAG AGTTTCTCAG
Z11524_AHASL1C Z115262AHASL1A BN 0 2 ~AHASL 1A BN02-97_AHASL1A BN02-12O^AHASLIA BN02-131~AHASL1A
3351
TTAGGTCAGA TTAGGCCAGA TTAGGTCAGA TTAGGTCAGA TTAGGTCAGA TTAGGTCAGA
TCGTTAGGTT TCGTTAGGTT TCGTTAGGTT TCGTTAGGTT TCGTTAGGTT TCGTTAGGTT
GATCTCGGAG GATCTCGGAG GATCTCGGAG GATCTCGGAG GATCTCGGAG GATCTCGGAG
TCTAAGAGGC TCTAAGAGGC TCTAAGAGGC TCTAAGAGGC TCTAAGAGGC TCTAAGAGGC
3400 CTGTTTTGTA CTGTTTTGTA CTGTTTTGTA CTGTTTTGTA CTGTTTTGTA CTGTTTTGTA
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BM02-97_AHASLlA BN02-12 alAHASLlA BNQ2-131 AHASL1A
3401
CGTTGGTGGT CGTTGGTGGT CGTTGGTGGT CGTTGGTGGT CGTTGGTGGT CGTTGGTGGT
GGAAGCTTGA GGAAGCTTGA GGAAGCTTGA GGAAGCTTGA GGAAGCTTGA GGAAGCTTGA
ACTCGAGTGA ACTCGAGTGA ACTCGAGTGA ACTCGAGTGA ACTCGAGTGA ACTCGAGTGA
AGAACTGGGG AGAACTGGGG AGAACTGGGG AGAACTGGGG AGAACTGGGG AGAACTGGGG
3450 AGATTTGTCG AGATTTGTCG AGATTTGTCG AGATTTGTCG AGATTTGTCG AGATTTGTCG
Z11524_AHASU.C Z11S26~AHASL1A BH02_AHASL1A BM02-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131_AHASL1A
3451
AGCTTACTGG AGCTTACTGG AGCTTACTGG AGCTTACTGG AGCTTACTGG AGCTTACTGG
GATCCCCGTT GATCCCTGTT GATCCCTGTT GATCCCTGTT GATCCCTGTT GATCCCTGTT
GCGAGTACTT GCGAGTACGT GCGAGTACGT GCGAGTACGT GCGAGTACGT GCGAGTACGT TGATGGGGCT TGATGGGGCT TGATGGGGCT TGATGGGGCT TGATGGGGCT TGATGGGGCT
3500 TGGCTCTTAT TGGCTCTTAT TGGCTCTTAT TGGCTCTTAT TGGCTCTTAT TGGCTCTTAT
Z11524_AHASL1C S11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BK02-12 0_AHA3L1A BN02-131 AHASL1A
3501
CCTTGTAACG CCTTGTAACG CCTTGTAACG CCTTGTAACG CCTTGTAACG CCTTGTAACG
ATGAGTTGTC ATGAGTTGTC ATGACTTGTC ATGACTTGTC ATGACTTGTC ATGACTTGTC
CCTGCAGATG CCTGCAGATG CCTGCAGATG CCTGCAGATG CCTGCAGATG CCTGCAGATG
CTTGGCATGC CTTGGCATGC CTTGGCATGC CTTGGCATGC CTTGGCATGC CTTGGCATGC
3550 ACGGGACTGT ACGGGACTGT ACGGGACTGT ACGGGACTGT ACGGGACTGT ACGGGACTGT
211524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BNO 2_AHASL1A BN 02-9 7_AHASL1A BWO 2-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
3551
GTATGCTAAC GTATGCTAAC GTATGCTAAC GTATGCTAAC GTATGCTAAC GTATGCTAAC
TACGCTGTGG TACGCTGTGG TACGCTGTGG TACGCTGTGG TACGCTGTGG TACGCTGTGG
AGCATAGTGA AGCATAGTGA AGCATAGTGA AGCATAGTGA AGCATAGTGA AGCATAGTGA
TTTGTTGCTG TTTGTTGCTG TTTGTTGCTG TTTGTTGCTG TTTGTTGCTG TTTGTTGCTG
3600 GCGTTTGGTG GCGTTTGGTG GCGTTTGGTG GCGTTTGGTG GCGTTTGGTG GCGTTTGGTG
ailЈ24_AHASLlC Z11526__AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-9 7_AHASL1A BNO 2-12 O^AHASblA BN02-13I"AHASL1A
3601
TTAGGTTTGA TTAGGTTTGA TTAGGTTTGA TTAGGTTTGA TTAGGTTTGA TTAGGTTTGA
TGACCGTGTC TGACCGTGTC TGACCGTGTC TGACCGTGTC TGACCGTGTC TGACCGTGTC
ACGGGAAAGC ACGGGAAAGC ACGGGAAAGC ACGGGAAAGC ACGGGAAAGC ACGGGAAAGC
TCGAGGCTTT TCGAGGCGTT TCGAGGCGTT TCGAGGCGTT TCGAGGCGTT TCGAGGCGTT
3650 CGCTAGCAGG TGCGAGCAGG TGCGAGCAGG TGCGAGCAGG TGCGAGCAGG TGCGAGCAGG
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BNQ2_AHASL1A BN 0 2-9 7_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131~AHASL1A
3651
GCTAAAATTG GCTAAGATTG GCTAAGATTG GCTAAGATTG GCTAAGATTG GCTAAGATTG
TGCACATAGA TGCACATAGA TGCACATAGA TGCACATAGA TGCACATAGA TGCACATAGA
CATTGATTCT CATTGATTCT CATTGATTCT CATTGATTCT CATTGATTCT CATTGATTCT
GCTGAGATTG GCTGAGATTG GCTGAGATTG GCTGAGATTG GCTGAGATTG GCTGAGATTG
3700 GGAAGAATAA GGAAGAATAA GGAAGAATAA GGAAGAATAA GGAAGAATAA GGAAGAATAA
S11524_AHASL1C Z1152 6_AHASL1A BNO 2_AHASL 1A BN02-97_AHASL1A BW02-120_AHASLlA BH02-131 AHASL1A
3701
GACACCTCAC GACACCTCAC GACACCTCAC GACACCTCAC GACACCTCAC GACACCTCAC
GTGTCTGTGT GTGTCTGTGT GTGTCTGTGT GTGTCTGTGT GTGTCTGTGT GTGTCTGTGT
GTGGTGATGT GTGGTGATGT GTGGTGATGT GTGGTGATGT GTGGTGATGT GTGGTGATGT
AAAGCTGGCT AAAGCTGGCT AAAGCTGGCT AAAGCTGGCT AAAGCTGGCT AAAGCTGGCT
3750 TTGCAAGGGA TTGCAAGGGA TTGCAAGGGA TTGCAAGGGA TTGCAAGGGA TTGCAAGGGA
Z11524_AHASL1C Z11S26_AHASL1A BM02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BNQ2-12 0_AHASL1A BWO 2-131_AHASL1A
3751
TGAACAAGGT TGAACAAGGT TGAACAAGGT TGAACAAGGT TGAACAAGGT TGAACAAGGT
TCTTGAGAAC TCTTGAGAAC TCTTGAGAAC TCTTGAGAAC TCTTGAGAAC TCTTGAGAAC
CGGGCGGAGG CGGGCGGAGG CGGGCGGAGG CGGGCGGAGG CGGGCGGAGG CGGGCGGAGG
AGCTCAAGCT AGCTCAAGCT AGCTCAAGCT AGCTCAAGCT AGCTCAAGCT AGCTCAAGCT
3800 TGATTTCGGT TGATTTCGGT TGATTTCGGT TGATTTCGGT TGATTTCGGT TGATTTCGGT
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASLlA BN02~AHASLIA BN02-97~AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
3801
GTTTGGAGGA GTTTGGAGGA GTTTGGAGGA GTTTGGAGGA GTTTGGAGGA GTTTGGAGGA
GTGAGTTGAG GTGAGTTGAG GTGAGTTGAG GTGAGTTGAG GTGAGTTGAG GTGAGTTGAG
CGAGCAGAAA CGAGCAGAAA CGAGCAGAAA CGAGCAGAAA CGAGCAGAAA CGAGCAGAAA
CAGAAGTTCC CAGAAGTTCC CAGAAGTTCC CAGAAGTTCC CAGAAGTTCC CAGAAGTTCC
3850 CTTTGAGCTT CGTTGAGCTT CGTTGAGCTT CGTTGAGCTT CGTTGAGCTT CGTTGAGCTT
211524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BNO 2_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
3851
CAAAACGTTT CAAAACGTTT CAAAACGTTT CAAAACGTTT CAAAACGTTT CAAAACGTTT
GGAGAAGCCA GGAGAAGCCA GGAGAAGCCA GGAGAAGCCA GGAGAAGCCA GGAGAAGCCA
TTCCTCCGCA TTCCTCCGCA TTCCTCCGCA TTCCTCCGCA TTCCTCCGCA TTCCTCCGCA
GTACGCGATT GTACGCGATT GTACGCGATT GTACGCGATT GTACGCGATT GTACGCGATT
3900 CAGATCCTCG CAGGTCCTAG CAGGTCCTAG CAGGTCCTAG CAGGTCCTAG CAGGTCCTAG
Z11524_AHASL1C Z11526 AHASL1A BN02~AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-12 0_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
3901
ACGAGCTAAC ACGAGCTAAC ACGAGCTAAC ACGAGCTAAC ACGAGCTAAC ACGAGCTAAC
CGAAGGGAAG CCAAGGGAAG CCAAGGGAAG CCAAGGGAAG CCAAGGGAAG CCAAGGGAAG
GCAATTATCA GCAATTATCA GCAATTATCA GCAATTATCA GCAATTATCA GCAATTATCA
GTACTGGTGT GTACTGGTGT GTACTGGTGT GTACTGGTGT GTACTGGTGT GTACTGGTGT
3950 TGGACAGCAT TGGACAGCAT TGGACAGCAT TGGACAGCAT TGGACAGCAT TGGACAGCAT
Z11524_AHASL1C Z11526~AHASL1A BNO 2_AHASL1A BM02-97~AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131~AHASL1A
3951
CAGATGTGGG CAGATGTGGG CAGATGTGGG CAGATGTGGG CAGATGTGGG CAGATGTGGG
CGGCGCAGTT CGGCGCAGTT CGGCGCAGTT CGGCGCAGTT CGGCGCAGTT CGGCGCAGTT
TTACAAGTAC TTACAAGTAC TTACAAGTAC TTACAAGTAC TTACAAGTAC TTACAAGTAC
AGGAAGCCGA AGGAAGCCGA AGGAAGCCGA AGGAAGCCGA AGGAAGCCGA AGGAAGCCGA
4000 GACAGTGGCT GGCAGTGGCT GGCAGTGGCT GGCAGTGGCT GGCAGTGGCT GGCAGTGGCT
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN 0 2_AHAS L1A BH02-97_AHASL1A BM02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
4001
GTCGTCATCA GTCGTCCTCA GTCGTCCTCA GTCGTCCTCA GTCGTCCTCA GTCGTCCTCA
GGCCTCGGAG GGACTCGGAG GGACTCGGAG GGACTCGGAG GGACTCGGAG GGACTCGGAG
CTATGGGTTT CTATGGGTTT CTATGGGTTT CTATGGGTTT CTATGGGTTT CTATGGGTTT
TGGACTTCCT CGGACTTCCT CGGACTTCCT CGGACTTCCT CGGACTTCCT CGGACTTCCT
4050 GCTGCGATTG GCTGCGATTG GCTGCGATTG GCTGCGATTG GCTGCGATTG GCTGCGATTG
Z11524_AHASL1C 21152$_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BH02-120_AHASL1A BN02-131~AHASL1A
4051
GAGCGTCTGT GAGCGTCTGT GAGCGTCTGT GAGCGTCTGT GAGCGTCTGT GAGCGTCTGT
GGCGAACCCT GGCGAACCCT GGCGAACCCT GGCGAACCCT GGCGAACCCT GGCGAACCCT
GATGCGATTG GATGCGATTG GATGCGATTG GATGCGATTG GATGCGATTG GATGCGATTG
TTGTGGATAT TTGTGGACAT TTGTGGACAT TTGTGGACAT TTGTGGACAT TTGTGGACAT
4100 TGACGGTGAT TGACGGTGAT TGACGGTGAT TGACGGTGAT TGACGGTGAT TGACGGTGAT
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02_AHASblA BNQ2-97_AHASL1A BH02-12olAHASLlA BNQ2-131 AHASL1A
4101
GGAAGCTTCA GGAAGCTTCA GGAAGCTTCA GGAAGCTTCA GGAAGCTTCA GGAAGCTTCA
TAATGAACGT TAATGAACGT TAATGAACGT TAATGAACGT TAATGAACGT TAATGAACGT
TCAAGAGCTG TCAAGAGCTG TCAAGAGCTG TCAAGAGCTG TCAAGAGCTG TCAAGAGCTG
GCCACAATCC GCCACAATCC GCCACAATCC GCCACAATCC GCCACAATCC GCCACAATCC
4150 GTGTAGAGAA GTGTAGAGAA GTGTA GAGAA GTGTAGAGAA GTGTAGAGAA GTGTAGAGAA
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BNQ2-120_AHASL1A BNO 2-131~AKASL1A
4151
TCTTCCTGTG TCTTCCTGTG TCTTCCTGTG TCTTCCTGTG TCTTCCTGTG TCTTCCTGTG
AAGATACTCT AAGATACTCT AAGATACTCT AAGATACTCT AAGATACTCT AAGATACTCT
TGTTAAACAA TGTTAAACAA TGTTAAACAA TGTTAAACAA TGTTAAACAA TGTTAAACAA
CCAGCATCTT CCAGCATCTT CCAGCATCTT CCAGCATCTT CCAGCATCTT CCAGCATCTT
4200 GGGATGGTCA GGGATGGTCA GGGATGGTCA GGGATGGTCA GGGATGGTCA GGGATGGTCA
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BH02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BNO 2-131_AHASL1A
4201
TGCAATGGGA TGCAATGGGA TGCAATGGGA TGCAATGGGA TGCAATGGGA TGCAATGGGA
AGATCGGTTC AGATCGGTTC AGATCGGTTC AGATCGGTTC AGATCGGTTC AGATCGGTTC
TACAAAGCTA TACAAAGCTA TACAAAGCTA TACAAAGCTA TACAAAGCTA TACAAAGCTA
ACAGAGCTCA ACAGAGCTCA ACAGAGCTCA ACAGAGCTCA ACAGAGCTCA ACAGAGCTCA
4250 CACTTATCTC CACTTATCTC CACTTATCTC CACTTATCTC CACTTATCTC CACTTATCTC
ZU524_AHASL1C 211526_AHASL1A BN02_AHASL1A BNQ2-97_AHASL1A BM02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
4251 430Q GGGGACCCGG CAAGGGAGAA CGAGATCTTC CCTAACATGC TGCAGTTTGC GGGGACCCGG CAAGGGAGAA CGAGATCTTC CCTAACATGC TGCAGTTTGC GGGGACCCGG CAAGGGAGAA CGAGATCTTC CCTAACATGC TGCAGTTTGC GGGGACCCGG CAAGGGAGAA CGAGATCTTC CCTAACATGC TGCAGTTTGC GGGGACCCGG CAAGGGAGAA CGAGATCTTC CCTAACATGC TGCAGTTTGC GGGGACCCGG CAAGGGAGAA CGAGATCTTC CCTAACATGC TGCAGTTTGC
Z11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN 0 2 _AHASL1A BNQ2-97_AHASL1A BNO2-120_AHASLIA BN02-131 AHASLIA
4301
AGGAGCTTGC AGGAGCTTGC AGGAGCTTGC AGGAGCTTGC AGGAGCTTGC AGGAGCTTGC
GGGATTCCAG GGGATTCCAG GGGATTCCAG GGGATTCCAG GGGATTCCAG GGGATTCCAG
CTGCGAGAGT CTGCGAGAGT CTGCGAGAGT CTGCGAGAGT CTGCGAGAGT CTGCGAGAGT
GACGAAGAAA GACGAAGAAA GACGAAGAAA GACGAAGAAA GACGAAGAAA GACGAAGAAA
4350 GAAGAACTCC GAAGAACTCC GAAGAACTCC GAAGAACTCC GAAGAACTCC GAAGAACTCC
Z11S24_AHASL1C Z11526_AHASL1A BNO 2_AHASL1A ВИ02-97~AHASL1A BN02-120IAHASL1A BN02-131_AHASL1A
4351
GAGAAGCTAT GAGAAGCTAT GAGAAGCTAT GAGAAGCTAT GAGAAGCTAT GAGAAGCTAT
TCAGACAATG TCAGACAATG TCAGACAATG TCAGACAATG TCAGACAATG TCAGACAATG
CTGGATACAC CTGGATACAC CTGGATACAC CTGGATACAC CTGGATACAC CTGGATACAC
CAGGACCATA CTGGACCGTA CTGGACCGTA CTGGACCGTA CTGGACCGTA CTGGACCGTA
4400 CCTGTTGGAT CCTGTTGGAT CCTGTTGGAT CCTGTTGGAT CCTGTTGGAT CCTGTTGGAT
S11524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BM02_AHASLlA BN02-S7_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASLIA
4401
GTGATATGTC GTCATCTGTC GTCATCTGTC GTCATCTGTC GTCATCTGTC GTCATCTGTC
CGCACCAAGA CGCACCAAGA CGCACCAAGA CGCACCAAGA CGCACCAAGA CGCACCAAGA
АСА TG TGTTA ACATGTGTTA ACATGTGTTA ACATGTGTTA ACATGTGTTA ACATGTGTTA
CCGATGATCC CCGATGATCC CCGATGATCC CCGATGATCC CCGATGATCC CCGATGATCC
* 4450 CAAGTGGTGG CAAGTGGTGG CAAGTGGTGG CAAATGGTGG CAAGTGGTGG CAAATGGTGG
Zll524_AHASLlC ZllS26__AHASLlA BH02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-120_AHASLIA BNO 2-13l'AHAS L1A
4451
CACTTTCAAA CACTTTCAAA CACTTTCAAA CACTTTCAAA CACTTTCAAA CACTTTCAAA
GATGTAATAA GATGTAATAA GATGTAATAA GATGTAATAA GATGTAATAA GATGTAATAA
CAGAAGGGGA CCGAAGGGGA CCGAAGGGGA CCGAAGGGGA CCGAAGGGGA CCGAAGGGGA
TGGTCGCACT TGGTCGCACT TGGTCGCACT TGGTCGCACT TGGTCGCACT TGGTCGCACT
4500 AAGTACTGAG AAGTACTGAG AAGTACTGAG AAGTACTGAG AAGTACTGAG AAGTACTGAG
ZU524_AHASL1C Z11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHAS LIA BN02-120_AHASL1A BND2-131~AHASL1A
4501
AGATGAAGCT AGATGAAGCT AGATGAAGCT AGATGAAGCT AGATGAAGCT AGATGAAGCT
GGTGATCGAT GGTGATCCAT GGTGATCGAT GGTGATCGAT GGTGATCGAT GGTGATCGAT
Фиг. 3
CATATGGTAA CATATGGTAA CATATGGTAA CATATGGTAA CATATGGTAA CATATGGTAA
AAGACTTAGT AAGACTTAGT AAGACTTAGT AAGACTTAGT AAGACTTAGT AAGACTTAGT
4550 TTCAGTTTCC TTCAGTTTTC TTCAGTTTTC TTCAGTTTTC TTCAGTTTTC TTCAGTTTTC
1 50
MAAATSSSPI SLTAKPSSKS PLPISRFSLP FSLTPQKPSS RLHRPLAISA
MAAATSSSPI SLTAKPSSKS PLPISRFSLP FSLTPQKPSS RLHRPLAISA
MAAATSSSPI SLTAKPSSKS PLPISRFSLP FSLTPQKPSS RLHRPLAISA
MAAATSSSPI SLTAKPSSKS PLPISRFSLP FSLTPQKPSS RLHRPLAISA
MAAATSSSPI SLTAKPSSKS PLPISRFSLP FSLTPQKPSS RLHRPLAISA
S11526_AHASL1A BNQ2~AHASL1A BN02-97_AHASL1A BNO 2-12 Q_AHASL1A BNO 2-131~AHASL1A
51 100
VLNSPVNVAP EKTDKIKTFI SRYAPDEPRK GATJILVEALE RQGVETVFAY
VLNSPVNVAP EKTDKIKTFI SRYAPDEPRK GADILVEALE RQGVETVFAY
VLNSPVNVAP EKTDKIKTFI SRYAPDEPRK GADILVEALE RQGVETVFAY
VLNSPVNVAP EKTDKIKTFI SRYAPDEPRK GADILVEALE RQGVETVFAY
VLNSPVNVAP EKTDKIKTFI SRYAPDEPRK GATjILVEALE RQGVETVFAY
311526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BNO 2-12 0_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
101* 150 FGGASMEIHQ ALTRSSTIRN VLPRHEQGGV FAAEGYARSS QKPGICIATS PGGASMEIHQ ALTRSSTIRN VLPRHEQGGV FAAEGYARSS GKPGICIATS FGGASMEIHQ ALTRSSTIRN VLPRHEQGGV FAAEGYARSS GKPGICIATS PGGTSHEIHQ ALTRSSTIRN VLPRHEQGGV FAAEGYARSS GKPGICIATS PGGTSMEIHQ ALTRSSTIRN VLPRHEQGGV FAAEGYARSS GKPGICIATS
Z11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN0 2-97_AHASL1A BN02-120~AHASL1A BNO 2-131~AHASL1A
151 200 GPGATNLVSG LADAMLDSVP LVAlTGQVPR RMIGTDAFQE TPIVEVTRSI GPGATNLVSG LADAMLDSVP LVAlTGQVPR RMIGTDAFQE TPIVEVTRSI GPGATNLVSG LADAMLDSVP LVAlTGQVPR RMIGTDAFQE TPIVEVTRSI GPGATNLVSG LADAMLDSVP LVAlTGQVPR RMIGTDAFQE TPIVEVTRSI GPGATNLVSG LADAMLDSVP LVAlTGQVPR RMIGTDAFQE TPIVEVTRSI
Z11526_AHASL1A BNQ2_AKASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
201 250 TKHNYLVMDV DDIPRIVQEA FFLATSGRPG PVLVDVPKDI QQQLAIPNWD TKHNYLVMDV DDIPRIVQEA FFLATSGRPG PVLVDVPKDI QQQLAIPNWD TKHNYLVMDV DDIPRIVQEA FFLATSGRPG PVLVDVPKDI QQQLAIPNWD TKHNYLVMDV DDIPRIVQEA FFLATSGRPG PVLVDVPKDI QQQLAIPNWD TKHNYLVMDV DDIPRIVQEA FFLATSGRPG PVLVDVPKDI QQQLAIPNWD
Z11S26 AHASL1A BN02~AHASL1A BN02-97_AHASL1A BNQ2-12Q_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
251 300 QPMRLPGYMS RLPQPPEVSQ LGQIVRLISE SKRPVLYVGG GSLNSSEELG QPMRLPGYMS RLPQPPEVSQ LGQIVRLISE SKRPVLYVGG GSLNSSEELG QPMRLPGYMS RLPQPPEVSQ LGQIVRLISE SKRPVLYVGG GSLNSSEELG QPMRLPGYMS RLPQPPEVSQ LGQIVRLISE SKRPVLYVGG GSLNSSEELG QPMRLPGYMS RLPQPPEVSQ LGQIVRLISE SKRPVLYVGG GSLNSSEELG
Z11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A Bbf02^j20_AHASLlA BN02-131 AHASL1A
301 350
RFVELTGIPV ASTLMGLGSY PCNDELSLQM LGMHGTVYAN YAVEHSDLLL
RFVELTGIPV ASTLMGLGSY PCNDDLSLQM LGMHGTVYAN YAVEHSDLLL
RFVELTGIPV ASTLMGLGSY PCNDDLSLQM LGMHGTVYAN YAVEHSDLLL
RFVELTGIPV ASTLMGLGSY PCNDDLSLQM LGMHGTVYAN YAVEHSDLLL
RFVELTGIPV ASTLMGLGSY PCNDDLSLQM LGMHGTVYAN YAVEHSDLLL
Z11526_AHASL1A BNO 2_AHAS LIA BNO2-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BNQ2-131 AHASL1A
351 400 AFGVRFDDRV TGKLEAFASR AKIVHIDIDS AEIGKNKTPH VSVCGDVKLA AFGVRFDDRV TGKLEAFASR AKIVHIDIDS AEIGKNKTPH VSVCGDVKLA AFGVRFDDRV TGKLEAFASR AKIVHIDIDS AEIGKNKTFH VSVCGDVKLA AFGVRFDDRV TGKLEAFASR AKIVHIDIDS AEIGKNKTPH VSVCGDVKLA AFGVRFDDRV TGKLEAFASR AKIVHIDIDS AEIGKNKTPH VSVCGDVKLA
Z11526_AHASL1A SN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASLIA
401
LQGMNKVLEH RAEELKLDFG LQGMNKVLEH RAEELKLDFG LQGMNKVLEN RAEELKLDFG LQGMNKVLEM EABELKLDFG LQGMNKVLEM EABELKLDFG
VWRSELSEQK QKFPLSFKTF VWRSELSEQK QKFPLSFKTF VWRSELSEQK QKFPLSFKTF VWRSELSEQK QKFPLSFKTF VWRSELSEQK QKFPLSFKTF
450
GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI GEAIPPQYAI
Z11526_ABASL1A BB02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASL1A
451 500
QVLDELTQGK AIISTGVGQH QMWAAQFYKY RKPRQWLSSS GLGAMGFGLP
QVLDELTQGK AIISTGVGQH QMWAAQFYKY RKPRQWLSSS GLGAMGFGLP
QVLDELTQGK AIISTGVGQH QMWAAQFYKY RKPRQWLSSS GLGAMGFGLP
QVLDELTQGK AIISTGVGQH QMWAAQFYKY RKPRQWLSSS GLGAMGFGLP
QVLDELTQGK AIISTGVGQH QMWAAQFYKY RKPRQWLSSS GLGAMGFGLP
Z11526_AHASL1A BN02_AHASL1A BN02-97_AHASL1A BN02-120_AHASL1A BN02-131 AHASLIA
501
AAIGASVANP AAIGASVAMP AAI GAS VAMP AAIGASVANP AAIGASVANP
DAIWDIDGD DAIWDIDGD DAIWDIDGD DAIWDIDGD DAIWDIDGD
GSFIMNVQEL GSFIMNVQEL GSFIMNVQEL GSFIMNVQEL GSFIMNVQEL
ATIRVENLPV ATIRVENLPV ATIRVENLPV ATIRVENLPV ATIRVENLPV 550
KILLLNNQHL KILLLNNQHL KILLLNNQHL KILLLNNQHL KILLLNNQHL
Z11526_AHASL1A BN02~AHASL1A BN02-97_AHABL1A BN02-120~AHASL1A BN02-131~AHASL1A
551 600 GMVMQWEDRF YKANRAHTYL GDPARENEIF PNMLQFAGAC GIPAARVTKK GMVMQWEDRF YKANRAHTYL GD PARENS IF PNMLQFAGAC GIPAARVTKK GMVMQWEDRF YKANRAHTYL GDPARENEIF PNMLQFAGAC GIPAARVTKK GMVMQWEDRF YKANRAHTYL GDPARENEIF PNMLQFAGAC GIPAARVTKK GMVMQWEDRF YKANRAHTYL GDPARENEIF PNMLQFAGAC GIPAARVTKK
601 * 650
EELREAIQTM LDTPGPYLLD VICPHQEHVL PMIPSGGTFK DVITEGDGRT EELREAIQTM LDTPGPYLLD VICPHQEHVL PMIPSGGTFK DVITEGDGRT EELREAIQTM LDTPGPYLLD VICPHQEHVL PMIPNGGTFK DVITEGDGRT EELREAIQTM LDTPGPYLLD VICPHQEHVL PMIPSGGTFK DVITEGDGRT EELREAIQTM LDTPGPYLLD VICPHQEHVL PMIPNGGTFK DVITEGDGRT
Фиг. 4
кДНК AHAS Arabidopsis thaliana (AtAHASL) (2013 пл.)
ATGGCGGCGGCAACAACAACAACAACAACATCTTCTTCGATCTCCTTCTCCACCAAACCATCTC
CTTCCTCCTCCAAATCACCATTACCAATCTCCAGATTCTCCCTCCCATTCTCCCTAAACCCCAAC
AAATCATCCTCCTCCTCCCGCCGCCGCGGTATCAAATCCAGCTCTCCCTCCTCCATCTCCGCCGT
GCTCAACACAACCACCAATGTCACAACCACTCCCTCTCCAACCAAACCTACCAAACCCGAAAC
ATTCATCTCCCGATTCGCTCCAGATCAACCCCGCAAAGGCGCTQATATCCTCOTCGAAGCTTTA
GAACGTCAAGCCGTAGAAACCGTATTCGCTTACCCTGGAGGTGCATCAATGGAGATTCACCAA
GCCTTAACCCGCTCTTCCTCAATCCGTAACGTCCTTCCTCGTCACGAACAAGGAGGTGTA7TCGC
AGCAGAAGGATACGCTCGATCCTCAGGTAAACCAGGTATCTGTATAGCCACTTCAGGTCCCGG
AGCTACAAATCTCGTTAGCGGATTAGCCGATGCGTTGTTAGATAGTGTTCCTCTTGTAGCAATC
ACAGGACAAGTCCCTCGTCGTATGATTGGTACAGATGCGTTTCAAGAGACTCCGATTGTTGAGG
TAACGCGTTCGATTACGAAGCATAACTATCTTGTGATGGATGTTGAAGATATCCCTAGGATTAT
TGAGGAAGCTTTCTTrrTAGCTACTTCTGGTAGACCTGGACCTGTTTTGGTTGATGTTCCTAAAG
ATATTCAACAACAGCTTGCGATTCCTAATTGGGAACAGGCTATGAGATTACCTGGTTATATGTC
TAGGATGCCTAAACCTCCGGAAGATTCTCATTTGGAGCAGATTGTTAGGTTGATTTCTGAGTCT
AAGAAGCCTGTGTTGTATGTTGGTGGTGGTTGTTTGAATTCTAGCGATGAATTGGGTAGGTTTG
TTGAGCTTACGGGGATCCCTGTTGCGAGTACGTTGATGGGGCTGGGATCTTATCCTTGTGATGA
TGAGTTGTCGTTACATATGCTTGGAATGCATGGGACTGTGTATGCAAATTACGCTGTGGAGCAT
AGTGATTTGTTGTTGGCGTTTGGGGTAAGGTTTGATGATCGTGTCACGGGTAAGCTTGAGGCTT
TTGCTAGTAGGGCTAAGATTGTTCATATTGATATTGACTCGGCTGAGATTGGGAAGAATAAGAC
TCCTCATGTGTCTGTGTGTGGTGATGTTAAGCTGGCTTTGCAAGGGATGAATAAGGTTCTTGAG
AACCCAGCGGAGGAGCTTAAGCTTGATTTrGGAGTTrGGAGGAATGAGTTGAACGTACAGAAA
CAGAAGTTrCCGTTGAGCTTTAAGACGTTTGGGGAAGCTATTCCTCCACAGTATGCGATTAAGG
TCCTTGATGAGTTGACTGATGGAAAAGCCATAATAAGTACTGGTGTCGGGCAACATCAAATGTG
GGCGGCGCAGTTCTACAATTACAAGAAACCAAGGCAGTGGCTATCATCAGGAGGCCTTGGAGC
TATGGGATTTOGACTTCCTGCTGCGATTGGAGCGTCTGTTGCTAACCCTGATGCGATAGTTGTG
GATATTGACGGAGATGGAAGCTTTATAATGAATGTGCAAGAGCTAGCCACTATTCGTGTAGAG
AATCTTCCAGTOAAGGTACTTTTATTAAACAACCAGCATCTTGGCATGGTTATGCAATOGGAAG
ATCGGTTCTACAAAGCTAACCGAGCTCACACATTTCTCGGGGATCCGGCTCAGGAGGACOAGA
TATTCCCGAACATGTTGCTGTTTGCAGCAGCTTGCGGGATTCCAGCGGCGAGGGTGACAAAGAA
AGCAGATCTCCGAGAAGCTATTCAGACAATGCTGGATACACCAGGACCTTACCTGTTGGATGTG
ATTTGTCCGCACCAAGAACATGTGTTGCCGATGATCCCGAGTGGTGGCACTTTCAACGATGTCA
TAACGGAAGGAGATGGCCGGATTAAATACTGA
кДНК последовательность белка AHAS Arabidopsis thaliana (670 аминокислот)
MAAATTTTTTSSSISFSTKJSPSSSKSPLPISRFSLPFSLNPNKSSSSSRJUIGIKSSSPSSISAVLNTTT
NVTTTPSPTKPTKPETFISRFAPDQPRKGADILVEALERQGVETVFAYPGGASMEfflQALTRSSSIRNV
LPRHEQGGVFAAEGYARSSGKPGIC1ATSGPGATNLVSGLADALLDSVPLVAITGQVPRRMIGTDAF
QETPWEVTRSITKHNYLVMDVEDIPRIIEEAFFLATSGRPGPVLVDVPKDIQQQLAIPNWEQAMRLP
GYMSRMPKPPEDSHLEQrVRLISESKKPVLYVGGGCLNSSDELGRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCD
DELSLHMLGMHGTVYANYAVEHSDLLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKTP
HVSVCGDVKLALQGMNKVLENRAEELKLDFGVWRNELNVQKQKFPLSFKTFGEAIPPQYADCVLD
ELTDGKAnSTGVGQHQMWAAQFYNYKKPRQWLSSGGLGAMGFGLPAAIGASVANPDAIVVDroG
DGSFIMNVQELATIRVENLPVKVLLLNNQHLGMVMQWEDRFYKANRAHTFLGDPAQEDEIFPNML
LFAAACGlPAARVTKKADLREAIQTMLDTPGPYLLDVrCPHQEHVLPMIPSGGTFNDVITEGDGRIKY
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
025732
025732
- 4 -
- 1 -
025732
025732
- 26 -
025732
025732
- 29 -
- 29 -
025732
025732
- 45 -
- 45 -
025732
025732
- 45 -
- 45 -
025732
025732
- 47 -
- 47 -
025732
025732
- 47 -
- 47 -
025732
025732
- 47 -
- 47 -
025732
025732
- 58 -
025732
025732
- 58 -
025732
025732
- 61 -
- 61 -
025732
025732
- 62 -
- 62 -