[RU]

1. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, где ферментный комплекс получен при комбинации a) ферментного продукта экспрессии, обладающего активностью β-1,4-эндоглюкангидролазы, полученного при ферментации видов микроорганизмов из рода Trichoderma; и b) по меньшей мере одного фермента, полученного из гриба рода Penicillium, выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюгазы (ЕС 3.2.1.4) и β-глюканазы (ЕС 3.2.1.6), и где по меньшей мере приблизительно 61% активности β-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, получают при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, как указано в а).

2. Ферментный комплекс по п.1, где указанный по меньшей мере один фермент, полученный из гриба рода Penicillium, представляет собой ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации указанного гриба рода Penicillium.

3. Ферментный комплекс по любому из пп.1 и 2, где ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации указанного гриба рода Penicillium, содержит ксиланазу.

4. Ферментный комплекс по любому из пп.1-3, содержащий активность по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из эндо-1,4- β-ксиланазы, эндо-1,3(4)- β-глюканазы, целлюлазы, ламинариназы, эндо-1,5- α-L-арабинаназы, β-D-глюкозилглюкогидролазы, β-ксилозидазы, целлобиогидролазы, глюкан-1,4- β-глюкозидазы, специфической для ксилоглюкана экзо- β-1,4-глюканазы и α-N-арабинофуранозидазы.

5. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, полученный при комбинации a) по меньшей мере приблизительно 61% ферментного продукта экспрессии, обладающего активностью β-1,4-эндоглюкангидролазы, полученного при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma; и b) менее чем приблизительно 39% ферментного продукта экспрессии, полученного при ферментации гриба из рода Penicillium, выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюлазы (ЕС 3.2.1.4) и β-глюканазы (ЕС 3.2.1.6); где процентные соотношения основаны на активности β-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе.

6. Ферментный комплекс по любому из пп.1-5, где указанный ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, происходит из микроорганизмов вида Trichoderma reesei.

7. Ферментный комплекс по любому из пп.1-6, где указанный ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации гриба рода Penicillium, происходит из отдельной культуры вида Penicillium funiculosum.

8. Ферментный комплекс по любому из пп.1-7, обладающий активностью фермента по меньшей мере приблизительно 3000, например, по меньшей мере приблизительно 4000, например, по меньшей мере приблизительно 5000, например, по меньшей мере приблизительно 6000, например, по менышей мере приблизительно 7000 ед./г как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, полученного при ферментации рода Trichoderma.

9. Ферментный комплекс по любому из пп.1-8, обладающий общей активностью фермента по меньшей мере приблизительно 4000 ед./г, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе.

10. Способ получения ферментного комплекса по любому из пп.1-9, где способ содержит стадии a) ферментации микроорганизмов рода Trichoderma в среде для получения ферментационного бульона; b) ферментации микроорганизмов рода Penicillium в среде для получения ферментационного бульона; и c) выделения и комбинации каждого ферментного комплекса, полученного на стадиях а) и b), в форме бесклеточного бульона после указанных ферментаций для получения ферментного комплекса, где по меньшей мере приблизительно 61% активности β-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, получают при ферментации рода Trichoderma, полученных в стадии а).

11. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, полученный способом по п.10.

12. Применение ферментного комплекса по любому из пп.1-9 при производстве пивоваренного затора, таком как производство солодового напитка, пива, например солодового пива, и/или в производстве виски, и/или в производстве биотоплива.

13. Применение по п.12 для фильтрации пивного сусла, и/или затора, и/или фильтрации пива.

14. Применение ферментного комплекса по любому из пп.1-9 при производстве фруктового сока, вина, переработке зерна, производстве топливного спирта и питьевого спирта.

(57) Реферат / Формула:

1. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, где ферментный комплекс получен при комбинации a) ферментного продукта экспрессии, обладающего активностью β-1,4-эндоглюкангидролазы, полученного при ферментации видов микроорганизмов из рода Trichoderma; и b) по меньшей мере одного фермента, полученного из гриба рода Penicillium, выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюгазы (ЕС 3.2.1.4) и β-глюканазы (ЕС 3.2.1.6), и где по меньшей мере приблизительно 61% активности β-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, получают при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, как указано в а).

2. Ферментный комплекс по п.1, где указанный по меньшей мере один фермент, полученный из гриба рода Penicillium, представляет собой ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации указанного гриба рода Penicillium.

3. Ферментный комплекс по любому из пп.1 и 2, где ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации указанного гриба рода Penicillium, содержит ксиланазу.

4. Ферментный комплекс по любому из пп.1-3, содержащий активность по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из эндо-1,4- β-ксиланазы, эндо-1,3(4)- β-глюканазы, целлюлазы, ламинариназы, эндо-1,5- α-L-арабинаназы, β-D-глюкозилглюкогидролазы, β-ксилозидазы, целлобиогидролазы, глюкан-1,4- β-глюкозидазы, специфической для ксилоглюкана экзо- β-1,4-глюканазы и α-N-арабинофуранозидазы.

5. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, полученный при комбинации a) по меньшей мере приблизительно 61% ферментного продукта экспрессии, обладающего активностью β-1,4-эндоглюкангидролазы, полученного при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma; и b) менее чем приблизительно 39% ферментного продукта экспрессии, полученного при ферментации гриба из рода Penicillium, выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюлазы (ЕС 3.2.1.4) и β-глюканазы (ЕС 3.2.1.6); где процентные соотношения основаны на активности β-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе.

6. Ферментный комплекс по любому из пп.1-5, где указанный ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, происходит из микроорганизмов вида Trichoderma reesei.

7. Ферментный комплекс по любому из пп.1-6, где указанный ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации гриба рода Penicillium, происходит из отдельной культуры вида Penicillium funiculosum.

8. Ферментный комплекс по любому из пп.1-7, обладающий активностью фермента по меньшей мере приблизительно 3000, например, по меньшей мере приблизительно 4000, например, по меньшей мере приблизительно 5000, например, по меньшей мере приблизительно 6000, например, по менышей мере приблизительно 7000 ед./г как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, полученного при ферментации рода Trichoderma.

9. Ферментный комплекс по любому из пп.1-8, обладающий общей активностью фермента по меньшей мере приблизительно 4000 ед./г, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе.

10. Способ получения ферментного комплекса по любому из пп.1-9, где способ содержит стадии a) ферментации микроорганизмов рода Trichoderma в среде для получения ферментационного бульона; b) ферментации микроорганизмов рода Penicillium в среде для получения ферментационного бульона; и c) выделения и комбинации каждого ферментного комплекса, полученного на стадиях а) и b), в форме бесклеточного бульона после указанных ферментаций для получения ферментного комплекса, где по меньшей мере приблизительно 61% активности β-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4- β-D-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, получают при ферментации рода Trichoderma, полученных в стадии а).

11. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, полученный способом по п.10.

12. Применение ферментного комплекса по любому из пп.1-9 при производстве пивоваренного затора, таком как производство солодового напитка, пива, например солодового пива, и/или в производстве виски, и/или в производстве биотоплива.

13. Применение по п.12 для фильтрации пивного сусла, и/или затора, и/или фильтрации пива.

14. Применение ферментного комплекса по любому из пп.1-9 при производстве фруктового сока, вина, переработке зерна, производстве топливного спирта и питьевого спирта.

---

Евразийское 025703 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201171364
(22) Дата подачи заявки 2010.05.07
(51) Int. Cl.
C12N 9/42 (2006.01) C12N 9/24 (2006.01) C12C 5/00 (2006.01) C12C 7/04 (2006.01) C12C1/00 (2006.01)
(54) ФЕРМЕНТНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПИВОВАРЕННОГО ЗАТОРА
(31) 09159680.9; 61/176,162
(32) 2009.05.07
(33) EP; US
(43) 2012.04.30
(86) PCT/EP2010/056259
(87) WO 2010/128140 2010.11.11
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ДЮПОН НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АТС (DK)
(72) Изобретатель:
Фиш Невилл Маршалл (GB), Миллер Лоне Бренн (DK)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-2005118769 WO-A1-2008023060 WO-A1-2005059084 WO-A1-9742301 WO-A1-2004087889 WO-A2-9957325
UIf brochner sorensen (Danisco): "Danisco's food & beverage enzyme team to launch laminex Super 3G, a new brewing enzyme" danisco press release 7 May 2009 (2009-05-07), pages 1-3, XP2545726 Retrieved from the Internet: URL:http:// www. danisco.com/cms/connect/corporate/media %20relations/news/archive/2009/may/bus inessupdate_289_en.htm [retrieved on 2009-10-05]
(57) Изобретение относится к улучшенному ферментному комплексу, обладающему совокупностью видов активности продукта экспрессии, полученного при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, в сочетании с одним или несколькими ферментами другого штамма гриба.
Область изобретения
Изобретение относится к улучшенному ферментному комплексу, обладающему совокупностью видов ферментативной активности продукта экспрессии, полученного при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, в сочетании с одним или несколькими ферментами из других видов штамма гриба.
Предпосылки изобретения
Использование ферментов в производстве пива хорошо известно. Введение ферментов на стадии затирания для улучшения фильтруемости затора и увеличения выхода экстракта описано в WO 97/42302.
WO 2005118769 и WO 2005059084 относятся к стадии затирания и фильтрации в способе производства пива и к ферментным композициям для использования в таком способе.
WO 1999057325 относится к штаммам Penicillium funiculosum, к новым ферментным смесям, полученным из них, и к последовательности их нуклеиновой кислоты.
Однако, существует необходимость в улучшенных ферментных комплексах, полезных при производстве пищевых продуктов, например, на стадиях затирания, запаривания и фильтрации при производстве алкогольного напитка, такого как пиво или виски.
Цель изобретения
Целью вариантов осуществления по изобретению является предоставление улучшенного ферментного комплекса, обеспечивающего улучшенные способы производства при получении, например, пищевых продуктов, например, на стадиях затирания, запаривания и/или фильтрации при производстве алкогольного напитка, такого как пиво или виски, или биотоплива.
Краткое изложение сущности изобретения
Автор(ы) настоящего изобретения обнаружили, что при комбинации продукта экспрессии, полученного при ферментации видов микроорганизмов из рода Trichoderma и конкретных ферментов из любого другого вида грибов, получают улучшенные свойства ферментного комплекса.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к ферментному комплексу, полученному при комбинации:
a) продукта экспрессии, полученного при ферментации видов микроорганизмов из рода
Trichoderma; и
b) одного или нескольких ферментов из любого другого вида микроорганизмов из царства грибов,
выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюлазы (ЕС 3.2.1.4) и р-глюканазы (ЕС 3.2.1.6); и где по
меньшей мере приблизительно 61% активности р-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено способом
"Анализ 1", как описано в настоящем описании, получают при ферментации микроорганизмов рода
Trichoderma.
Следует понимать, что "любой другой вид из царства грибов" относится к видам, отличающимся от видов из рода Trichoderma в а).
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к ферментному комплексу, полученному при комбинации:
a) по меньшей мере приблизительно 61% продукта экспрессии, полученного при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma; и
b) менее чем приблизительно 39% продукта экспрессии, полученного при ферментации другого гриба из рода Penicillium; где процентные соотношения основаны на активности р-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено способом "Анализ 1", как описано в настоящем описании.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ферментного комплекса, где способ включает в себя стадии:
a) ферментации микроорганизмов рода Trichoderma в среде для получения ферментационного бульона;
b) ферментации микроорганизмов рода Penicillium в среде для получения ферментационного бульона; и
c) выделения и комбинации каждого ферментного комплекса, полученного на стадии а) и b) в форме бесклеточного бульона при указанных ферментациях, для получения ферментного комплекса, где по меньшей мере приблизительно 61% активности р-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено способом "Анализ 1", как описано в настоящем описании, получают при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к использованию ферментного комплекса по изобретению в способе производства пивоваренного затора, например производства солодового напитка, такого как пиво, такого как солодовое пиво, и/или производства виски, и/или производства биотоплива.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к использованию ферментного комплекса по изобретению в производстве фруктового сока, вина, переработке зерна, производстве топливного спирта и питьевого спирта.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к ферментному комплексу, полученному при комбинации:
a) продукта экспрессии, полученного при ферментации видов микроорганизмов из рода
Trichoderma; и
b) одного или нескольких ферментов из любого другого вида из царства грибов, выбранных из се-
мейства ксиланазы 11 (ЕС 3.2.1.8), целлюлазы (ЕС 3.2.1.4) и р-глюканазы (ЕС 3.2.1.6); и где по меньшей
мере приблизительно 61% активности р-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено способом "Анализ 1",
как описано в настоящем описании, получают при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma.
Краткое описание чертежей Фиг. 1. - первое исследование затора в лабораторном масштабе, значения р-глюкана и объема фильтрата сусла.
Фиг. 2. - второе исследование затора в лабораторном масштабе - значения объемов фильтрата, остаточного р-глюкана и вязкости сусла (при 12 сП (МПа-с)).
Фиг. 3. - данные пилотного исследования фильтрации пивного сусла: общее время фильтрации пивного сусла, средняя скорость потока и общее нарастание давления. А - отрицательный контроль, контроль без фермента; В - LAMINEX(r) Super при 0,20 кг/т; С - The LAMINEX(r) XG (LAMINEX(r) Super 1,5+50% дополнительной активности Т. reesei) при 0,133 кг/т.
Подробное описание изобретения
Пиво традиционно обозначают как алкогольный напиток, полученный из солода, например солода, полученного из ячменя, и необязательно, добавок, таких как зерно хлебных злаков, и с добавлением хмеля. В термин "пиво" включено любое ферментированное сусло, полученное посредством пивоварения и брожения содержащего крахмал материала, в основном полученного из зерна хлебных злаков, такого как осоложенный ячмень. Можно использовать также пшеницу, маис и рис.
Как применяют в настоящем документе, термин "солодовый напиток" включает в себя такие пено-образующие ферментированные солодовые напитки, как полностью осоложенное пиво, эль, сухое пиво, безалкогольное пиво, легкое пиво, пиво с низким содержанием алкоголя, низкокалорийное пиво, портер, крепкое темное пиво, стаут, солодовый раствор, безалкогольный солодовый раствор и т. п. Термин "солодовые напитки" включает в себя также непенящееся пиво и альтернативные солодовые напитки, такие как солодовые напитки с добавлением фруктов, например с добавлением цитрусов, например солодовые напитки с добавлением лимона, апельсина, лайма или ягод, солодовые напитки с добавлением алкогольных напитков, например солодовый раствор с добавлением водки, рома или текилы, или солодовые напитки с добавлением кофе, такие как солодовый раствор с добавлением кофеина и т. п.
Пиво можно получать из различных зерен, по существу, одинаковым способом. Все крахмалы зерна представляют собой гомополимеры глюкозы, в которых остатки глюкозы соединены либо альфа-1,4-, либо альфа-1,6-связями, с преобладанием первых.
Способ получения ферментированных солодовых напитков обычно обозначают пивоварением. Принципиальным сырьем, используемым при производстве этих напитков, являются вода, хмель и солод. Кроме того, добавки, такие как обычная кукурузная крупа, очищенная кукурузная крупа, измельченные пивные дрожжи, рис, сорго, очищенный кукурузный крахмал, ячмень, ячменный крахмал, лущеный ячмень, пшеница, пшеничный крахмал, обжаренные злаки, зерновые хлопья, рожь, овес, картофель, тапиока и сиропы, такие как кукурузный сироп, сироп из сахарного тростника, инвертный сахарный сироп, сиропы из ячменя и/или пшеницы и т. п., можно использовать в качестве источника крахмала. Крахмал в конечном итоге превращается в декстрины и сбраживаемые сахара.
По ряду причин солод, который в основном получают из избранных сортов ячменя, оказывает наибольший эффект на общий характер и качество пива. Во-первых, солод является первичным вкусовым веществом пива. Во-вторых, солод предоставляет основную часть сбраживаемого сахара. В-третьих, солод предоставляет белки, вносящие вклад в характер тела и пены пива. В-четвертых, солод обеспечивает необходимую ферментативную активность во время затирания.
Хмель также вносит значительный вклад в качество пива, включая вкус. В частности, хмель (или составляющие хмеля) добавляют желательные придающие горький привкус вещества к пиву. Кроме того, хмель действует как преципитирующие белок средства, предоставляя средства-консерванты и облегчая образование и стабилизацию пены.
Способ производства пива хорошо известен в данной области, но кратко, он включает в себя пять стадий: а) затирания и/или дополнительного запаривания, b) отделения и экстракции сусла, с) кипячения сусла и добавления хмеля в сусло, d) охлаждения, брожения и хранения и е) созревания, переработки и упаковки.
Как правило, на первой стадии размолотый или раздробленный солод смешивают с водой и поддерживают в течение некоторого периода времени при контролируемых температурах, чтобы позволить ферментам, присутствующим в солоде, превращать крахмал, присутствующий в солоде, в сбраживаемые сахара.
На второй стадии затор переносят в "фильтрационный чан" или фильтр для отделения затора, где жидкость отделяют от остатков зерна. Эту сладкую жидкость называют "сусло", и оставшийся осадок зерен называют "пивная дробина". Затор, как правило, подвергают экстракции, которая включает в себя
добавление воды к затору для отделения оставшегося растворимого экстракта от пивной дробины.
На третьей стадии сусло интенсивно кипятят. Это стерилизует сусло и способствует развитию окраски, вкуса и запаха. Хмель добавляют в той же самой точке во время кипячения.
На четвертой стадии сусло охлаждают и переносят в ферментер, который содержит дрожжи, или в который добавляют дрожжи. Дрожжи превращают сахара посредством брожения в спирт и газ диоксид углерода; по окончании брожения ферментер охлаждают или ферментер можно охлаждать для остановки брожения. Дрожжи выпадают в осадок хлопьями, и их удаляют.
На последней стадии пиво охлаждают и сохраняют в течение периода времени, в ходе которого пиво осветляется и развивается его вкус, и любой материал, который может повредить внешнему виду, вкусу и сроку хранения пива, осаждается. Перед упаковкой пиво насыщают углекислым газом и, необязательно, фильтруют и пастеризуют.
После брожения получают напиток, который обычно содержит от приблизительно 2 до приблизительно 10 мас.% спирта. Несбраживаемые углеводы не подвергаются превращению во время брожения и составляют большинство растворенных твердых веществ в конечном пиве.
Этот остаток остается из-за неспособности амилаз солода гидролизовать альфа-1,6-связи крахмала. Несбраживаемые углеводы вносят приблизительно 50 калорий на 12 унций (0,3549 л) пива.
В последнее время происходила широко распространенная популяризация полученных способом пивоварения напитков, называемых легкими видами пива, видами пива с уменьшенным содержанием калорий или низкокалорийными видами пива, в частности, на рынке США. Как определяют в США, эти виды пива содержат на 30% меньше калорий, чем "нормальное" пиво производителя.
Дополнительную информацию по общепринятым способам пивоварения, так же как определения для терминов, используемых в области технологии пивоварения, для использования по настоящему изобретению, можно найти в "Technology Brewing and Malting" Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 2nd revised Edition 1999, ISBN 3-921690-39-0 или 3rd edition (2004):
ISBN 3-921690-49-8.
Определения.
Термин "ферментный комплекс", как применяют в настоящем документе, обозначает в настоящем контексте, по существу, бесклеточную композицию, содержащую несколько ферментов, обладающих различной ферментативной активностью и/или классифицированных под различными номерами Комиссией по ферментам (ЕС номерами). Когда "ферментный комплекс" получен при ферментации, он представляет собой, по существу, бесклеточный ферментационный бульон, необязательно, концентрированный ферментационный бульон, который включен в конечный продукт. Следует понимать, что термин "ферментный комплекс" включает в себя также композицию, содержащую несколько ферментов, полученных посредством двух или более отдельных процессов ферментации, в которых также могут участвовать различные микроорганизмы. В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс представляет собой совместимый с пищевыми продуктами ферментный комплекс, что означает, что его можно использовать для получения пищевых продуктов.
В некоторых аспектах изобретения ферментный комплекс по изобретению обладает побочными видами активности, необходимыми для деградации очень сложных соединений, например в заторе в процессе пивоварения. Термин "побочная активность" относится в настоящем контексте к видам активности фермента по отношению к другим субстратам, не являющимся его главным субстратом, или он относится к другим видам активности, которыми может обладать ферментный комплекс, отличным от его главной активности.
В одном аспекте изобретения ферментный комплекс по изобретению обладает по меньшей мере 5 различными видами побочной активности.
В одном аспекте изобретения ферментный комплекс по изобретению обладает по меньшей мере 10 различными видами побочной активности.
В одном аспекте изобретения ферментный комплекс по изобретению обладает по меньшей мере 15 различными видами побочной активности.
В одном аспекте изобретения ферментный комплекс по изобретению обладает по меньшей мере 20 различными видами побочной активности.
Ксиланазы классифицируют в ЕС 3.2.1.8, ЕС 3.2.1.32, ЕС 3.2.1.136 и ЕС 3.2.1.156.; активность можно измерять, например, как описано в "Анализе 2".
Эндо-1,4-р-ксиланазу классифицируют как ЕС 3.2.1.8. Фермент вызывает эндогидролиз 1,4-p-D-ксилозидиновых связей в ксиланах.
Термин "ксиланаза семейства 11", как применяют в настоящем документе, относится к эндо-1,4-р-ксиланазе, классифицируемой как ЕС 3.2.1.8, которая вызывает эндогидролиз 1,4-р^-ксилозидиновых связей в ксиланах и которую классифицируют как ксиланазу семейства 11 согласно В. Henrissat, A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991), pp. 309-316.
В одном аспекте ферментный комплекс по изобретению обладает активностью эндо-1,4-р-ксиланазы, как измерено в "Анализе 2", как описано ниже под заголовком "Анализы".
"Анализ 2" можно проводить при рН 3,5 или рН 5 и 50°С с использованием ксилана в качестве субстрата, или его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной ха-рактеризации и спецификации ферментов. Активность фермента рассчитывают по увеличению оптической плотности, вызванному ксилозой, при 540 нм на единицу времени.
Одну единицу активности ксиланазы определяют в настоящем документе как количество фермента (нормализованное по общему объему анализируемой смеси), дающее увеличение ДOOD540нм•мин-1 В условиях "Анализа 2" (рН 3,5 и 50°С).
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению обладает активностью ксиланазы по меньшей мере приблизительно 5000, например, по меньшей мере приблизительно 6000, например, по меньшей мере приблизительно 7000, например, по меньшей мере приблизительно 8000, например, по меньшей мере приблизительно 8500 ед./г, как измерено в "Анализе 2".
Ферментный комплекс по изобретению обладает целлюлолитической активностью. Систематическим наименованием целлюлазы является 4-(1,3;1,4)-р^-глюкан-4-глюканогидролаза, и целлюлолитиче-ские ферменты или целлюлазы классифицируют в ЕС 3.2.1.4. Целлюлаза осуществляет эндогидролиз (1-4)-р^-глюкозидных связей, например, в целлюлозе, лихенине и p-D-глюканах злаков, и может также гидролизовать 1,4-связи в p-D-глюканах, содержащих также 1,3-связи. Целлюлаза имеет также другие названия, такие как эндо-1, 4-р^-глюканаза, р-1,4-глюканаза, р-1,4-эндоглюкангидролаза, целлюлаза А, целлюлозин АР, эндоглюканаза D, щелочная целлюлаза, целлюлаза А3, целлюдекстриназа, 9,5 целлюлаза, авицелаза, панцеллаза SS и 1,4-(1,3;1,4)-р^-глюкан-4-глюканогидролаза.
В одном аспекте изобретения активность целлюлазы ферментного комплекса по изобретению измеряют в "Анализе 1", как описано ниже под заголовком "Анализы".
В следующих аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью р-глюканазы, определяемой, как описано в "Анализе 7".
Стандартный анализ проводят при рН 5,0, и его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеризации и спецификации ферментов.
Одну единицу активности эндо-1,3(4)-р-глюканазы определяют как количество фермента, образующее 1 мкмоль глюкозных эквивалентов в минуту в условиях анализа (рН 5,0 (или как указано) и
50°С).
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению обладает активностью р-глюканазы по меньшей мере приблизительно 10000, например, по меньшей мере приблизительно 12000, например, по меньшей мере приблизительно 14000, например, по меньшей мере приблизительно 15000, например, по меньшей мере приблизительно 18000 ед./г, как измерено в "Анализе 7".
" р -глюканаза" или "бета-глюканаза", как применяют в настоящем документе, относится к эндо-1,3(4)-бета-глюканазе ЕС 3.2.1.6. Катализирует эндогидролиз (1-3)- или (1-4)-связей в бета-D-глюканах, когда остаток глюкозы, восстанавливающая группа которого вовлечена в связь, подлежащую гидролизу, сам является замещенным в С-3.
В следующих аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью ламинарина-зы, определенной, как описано в "Анализе 3".
Ламинариназа может представлять собой эндо-1,3(4)-бета-глюканазу, классифицированную в Е.С. 3.2.1.6, или глюкан-эндо-1,3-бета^-глюкозидазу, классифицированную в Е.С. 3.2.1.39. Эндо-1,3(4)-бета-глюканаза с альтернативными наименованиями ламинариназа, эндо-1,3-бета-глюканаза, эндо-1,4-бета-глюканаза классифицирована в Е.С. 3.2.1.6. Субстраты включают в себя ламинарии, лихенин и D-глюканы злаков, и фермент катализирует эндогидролиз (1-3)- или (1-4)-связей в бета^-глюканах, когда остаток глюкозы, восстанавливающая группа которого вовлечена в связь, подлежащую гидролизу, сам является замещенным в С-3. Глюкан-эндо-1,3-бета^-глюкозидаза с альтернативными наименованиями (1-3)-бета-глюкан-эндогидролаза, эндо-1,3-бета-глюканаза и ламинариназа классифицирована в Е.С. 3.2.1.39 и гидролизует (1- 3)-бета^-глюкозидные связи в (1- 3)-бета^-глюканах, например, в таких субстратах, как ламинарии, парамилон и пачиман.
В некоторых аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью арабинаназы. Арабинаназу классифицируют как ЕС 3.2.1.99. Системным наименованием является 5-а^-арабинан-5-а-L-арабинаногидролаза, но она имеет несколько других наименований, таких как арабинан-эндо-1,5-а^-арабинозидаза и эндо-1,5-а^-арабинаназа, эндо-а-^-арабаназа, эндо-арабаназа, 1,5-a-L-арабинан и 1,5-a-L-арабинаногидролаза. Арабиназа осуществляет эндогидролиз (1- 5)-а-арабинофуранозидных связей в (1 -5)-арабинанах. Арабинаназа также действует на арабинан.
В одном аспекте изобретения активность арабиназы ферментного комплекса по изобретению измеряют в "Анализе 4", как описано ниже под заголовком "Анализы". Анализ можно проводить при рН 3,5 и 50° С с использованием арабинана сахарной свеклы в качестве субстрата, и его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной характеризации и спецификации ферментов. Активность фермента рассчитывают по увеличению оптической плотности при 540 нм в единицу времени.
Одну единицу активности арабиназы определяют как количество фермента (нормализованное по общему анализируемому объему), дающее увеличение ДOD540 нм-мин-1 в условиях анализа (рН 3,5 и
50°С).
В некоторых аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью бета-D-глюкозидглюкогидролазы. Бета^-глюкозидглюкогидролаза относится к ферментам Е.С. 3.2.1.21.
В некоторых аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью р-ксилозидазы. "р-ксилозидаза" или "ксилан-1,4-бета-ксилозидаза" относится к ферментам Е.С. 3.2.1.37. р-ксилозидаза катализирует гидролиз (1- 4)-бета^-ксиланов с удалением последовательных остатков D-ксилозы с не-восстанавливающих концов.
В одном аспекте изобретения активность целлобиогидролазы ферментного комплекса по изобретению измеряют в "Анализе 6", как описано ниже под заголовком "Анализы". Стандартный анализ проводят при рН 5,0, и его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеризации и спецификации ферментов.
Одну единицу активности целлобиогидролазы определяют как количество фермента, образующее 1 мкмоль п-нитрофенола из п-нитрофенил-p-D-целлобиопиранозида в минуту в условиях анализа (рН 5,0 (или как указано) и 50°С).
В некоторых аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью целлобиогид-ролазы. "Целлобиогидролаза" или "1,4-бета-целлобиозидаза целлюлозы" относится к ферментам ЕС 3.2.1.91. 1,4-бета-целлобиозидаза целлюлозы катализирует гидролиз 1,4-бета^-глюкозидньгх связей в целлюлозе и целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с невосстанавливающих концов цепей.
В одном аспекте изобретения активность арабинофуранозидазы ферментного комплекса по изобретению измеряют в "Анализе 5", как описано ниже под заголовком "Анализы". Стандартный анализ можно проводить при рН 5,0 и 50°С, и его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной характеризации и спецификации ферментов.
Одну единицу активности a-N-арабинофуранозидазы определяют как количество фермента, образующее 1 мкмоль п-нитрофенола из п-нитрофенил-а^-арабинофуранозида в минуту в условиях анализа (рН 5,0 и 50°С (или как указано)).
В некоторых аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью a-N-арабинофуранозидазы. "a-N-арабинофуранозидаза" или "альфа-^арабинофуранозидаза" относится к ферментам ЕС 3.2.1.55. a-N-арабинофуранозидаза катализирует гидролиз концевых невосстанавливаю-щих остатков альфа^-арабинофуранозида в альфа^-арабинозидах.
В некоторых аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью глюкан-1,4-бета-глюкозидазы. "Глюкан-1,4-бета-глюкозидаза" или "глюкан-1,4-бета-глюкозидаза" относится к ферментам Е.С. 3.2.1.74. Глюкан-1,4-бета-глюкозидаза катализирует гидролиз (1-4)-связей в (1- 4)-бета^-глюканах с удалением последовательных единиц глюкозы.
В некоторых аспектах ферментный комплекс по изобретению обладает активностью, специфической для ксилоглюкана экзо-бета-1,4-глюканазы. "Специфическая для ксилоглюкана экзо-бета-1,4-глюканаза" относится к ферментам Е.С. 3.2.1.155. Специфическая для ксилоглюкана экзо-бета-1,4-глюканаза катализирует экзогидролиз (1- 4)-бета^-глюкозидных связей в ксилоглюкане.
Ферментный комплекс в производственном аспекте можно использовать в способе, включающем в себя уменьшение вязкости водного раствора, содержащего гидролизат крахмала.
Ферментный комплекс можно также использовать в способе, включающем в себя фильтрацию водного раствора, содержащего гидролизат крахмала. В некоторых вариантах осуществления водный раствор, содержащий гидролизат крахмала, представляет собой затор для производства пива, и в других вариантах осуществления водный раствор, содержащий гидролизат крахмала, представляет собой композицию для пищевого продукта.
Альтернативно, ферментный комплекс по настоящему изобретению можно использовать для производства фруктового сока, вина, переработки зерна, производства топливного спирта, такого как биоэтанол, и питьевого спирта.
В некоторых вариантах осуществления биоэтанол производят из сельскохозяйственного исходного сырья, такого как сахарный тростник, картофель, кукуруза, пшеница, сорго и т. д., или из целлюлозного материала, такого как кукурузная солома, просо прутьевидное или другой растительный материал. В обоих случаях сбраживаемые сахара экстрагируют из сырья и сбраживают посредством микроорганизмов до спирта, который подвергают дистилляции и который можно использовать в качестве транспортного топлива. Ферментный комплекс по настоящему изобретению можно использовать в этом производстве биотоплива. Комплекс ферментов можно добавлять, чтобы улучшать экстракцию полисахаридов из сырья, способствовать деградации полисахаридов до сбраживаемых сахаров и/или чтобы улучшать параметры переработки, такие как отделение жидкостей от твердых веществ, характеристики текучести и перекачиваемость.
Способ по изобретению можно использовать в затирании любой крупки. По изобретению крупка может содержать любой растительный материал, содержащий крахмал и/или сахар, который можно по
лучить из любого растения и части растения, включая клубни, корни, стебли, листья и семена.
В некоторых вариантах осуществления крупка содержит зерно, например зерно ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, зернового сорго, пшена и сорго, и более предпочтительно по меньшей мере 10 или более предпочтительно по меньшей мере 15, даже более предпочтительно по меньшей мере 25 или наиболее предпочтительно по меньшей мере 35, например, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 90 или даже 100% мас./мас. крупки сусла получено из зерна.
В некоторых вариантах осуществления крупка содержит осоложенное зерно, такое как ячменный солод. Предпочтительно по меньшей мере 10 или более предпочтительно по меньшей мере 15, даже более предпочтительно по меньшей мере 25 или наиболее предпочтительно по меньшей мере 35, например, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 90 или даже 100% мас./мас. крупки сусла получено из осоложенного зерна.
Термин "ферментация" обозначает в настоящем контексте продукцию веществ, таких как ферменты, посредством выращивания микроорганизмов в культуре.
Как применяют в настоящем документе, термин "солод" понимают как любое осоложенное зерно злаков, таких как ячмень.
Термин "добавка" понимают как часть крупки, которая не является ячменным солодом. Добавка может представлять собой любой богатый углеводами материал.
Термин "затор" понимают как водную суспензию крахмала, включающую, например, размолотый ячменный солод, размолотый ячмень и/или другую добавку или их комбинацию, смешанные с водой для последующего разделения на сусло+пивная дробина.
Термин "разделение затора" понимают как отделение сусла от пивной дробины, например, фильтрацией пивного сусла или фильтрацией затора.
Термин "фильтрация пива" понимают как процесс разделения, при котором клетки дрожжей и другие вызывающие мутность материалы, еще присутствующие в пиве, удаляют, например, способами с использованием микрофильтрации или мембраны.
Препарат ферментного комплекса, например, в форме ингредиента пищевого продукта, полученный по настоящему изобретению, может находиться в форме раствора или в форме твердого вещества в зависимости от использования, и/или способа использования, и/или способа введения. Форма твердого вещества может находиться либо в форме порошка высушенного фермента, либо в форме гранулированного фермента.
В одном аспекте изобретение относится к препарату ферментного комплекса, содержащему ферментный комплекс по изобретению, носитель и, необязательно, стабилизатор и/или консервант для фермента.
В дополнительном аспекте изобретения носитель для фермента выбран из группы, состоящей из глицерина или воды.
В следующем аспекте препарат содержит стабилизатор. В одном аспекте стабилизатор выбран из группы, состоящей из неорганических солей, полиолов, сахаров и их комбинаций. В одном аспекте стабилизатор представляет собой неорганическую соль, такую как хлорид калия. В другом аспекте полиол представляет собой глицерин, пропиленгликоль или сорбит. В другом аспекте сахар представляет собой низкомолекулярный углевод, в частности любой из нескольких сладких на вкус, таких как глюкоза, фруктоза и сахароза.
В дополнительном аспекте препарат содержит консервант. В одном аспекте консервант представляет собой метилпарабен, пропилпарабен, бензоат, сорбат или другие одобренные для применения в пищевых продуктах консерванты или их смесь.
Конкретные варианты осуществления изобретения
Как описано выше, настоящее изобретение относится к ферментному комплексу, полученному при комбинации:
a) продукта экспрессии, полученного при ферментации видов микроорганизмов из рода
Trichoderma; и
b) одного или нескольких ферментов из любого другого вида микроорганизмов из царства грибов,
выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюлазы (ЕС 3.2.1.4) и бета-глюканазы (ЕС 3.2.1.6); и где по
меньшей мере приблизительно 61% активности бета-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено способом
"Анализ 1", как описано в настоящем описании, получают при ферментации микроорганизмов рода
Trichoderma.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 62, например, по меньшей мере приблизительно 63, например, по меньшей мере приблизительно 64, например, по меньшей мере приблизительно 65, например, по меньшей мере приблизительно 66, например, по меньшей мере приблизительно 68, например, по меньшей мере приблизительно 69% активности бета-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено способом "Анализ 1", как описано в настоящем описании, получают при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma.
В некоторых вариантах осуществления не более чем приблизительно 90, например, не более чем приблизительно 85, например, не более чем приблизительно 80, например, не более чем приблизительно
75, например, не более чем приблизительно 70, например, не более чем приблизительно 65% активности бета-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено способом "Анализ 1", как описано в настоящем описании, получают при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько ферментов из различных грибов в ферментном комплексе по изобретению представляет собой продукт экспрессии, полученный при ферментации этих различных грибов.
В некоторых вариантах осуществления различные грибы происходят из рода Penicillium.
В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации различных грибов, содержит ксиланазу, такую как ксиланаза, отличающаяся от ксиланазы, полученной из микроорганизмов рода Trichoderma. В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации различных грибов, содержит ксиланазу семейства 11, такую как ксиланаза семейства 11, отличающаяся от ксиланазы семейства 11, полученной из микроорганизмов рода Trichoderma.
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению обладает активностью одного или нескольких ферментов, выбранных из списка, состоящего из эндо-1,4-р-ксиланазы, эн-до-1,3(4)-р-глюканазы, целлюлазы, ламинариназы, эндо-1,5-а^-арабинаназы, бета-D-глюкозид-глюкогидролазы, р-ксилозидазы, целлобиогидролазы, глюкан-1,4-бета-глюкозидазы, специфической для ксилоглюкана экзо-бета-1,4-глюканазы и a-N-арабинофуранозидазы.
В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации видов микроорганизмов из рода Trichoderma, происходит из одной отдельной культуры микроорганизмов вида Trichoderma reesei.
В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации микроорганизмов видов из рода Penicillium, происходит из одной отдельной культуры микроорганизмов вида Penicillium funiculosum.
В некоторых вариантах осуществления отдельная культура, используемая для ферментации, не является генетически модифицированной.
В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации микроорганизмов видов из рода Trichoderma, получают при глубинной ферментации.
В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, происходит из микроорганизмов вида Trichoderma reesei.
В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации другого гриба, происходит из одной отдельной культуры микроорганизмов вида Penicillium funiculosum.
В некоторых вариантах осуществления продукт экспрессии, полученный при ферментации, происходит из микроорганизмов вида дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления штамм, используемый для получения ферментного комплекса по изобретению, представляет собой Trichoderma reesei, депонированный согласно Будапештскому договору в Американской коллекции типовых культур (АТСС(r)) IP, Licensing and Services, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA с наименованием штамма GC Cellulose A83 GICC 0004, M03000004 и обозначением патентного депонирования в АТСС РТА-1001, от имени Danisco A/S с датой 5 мая 2009 г., или его производное, или потомство. (Депозит тестирован Международным депозитарием: Американская коллекция типовых культур (АТСС(r)), Manassas, VA, USA 14 мая 2009 г. и на эту дату, семена/штамм(ы) являлись жизнеспособными).
В некоторых вариантах осуществления штамм, используемый для получения ферментного комплекса по изобретению, представляет собой Penicillium funiculosum, депонированный согласно Будапештскому договору в Международном микологическом институте под номером IMI 378536, или его производное или потомство.
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению обладает активностью фермента по меньшей мере приблизительно 3000, например, по меньшей мере приблизительно 4000, например, по меньшей мере приблизительно 5000, например, по меньшей мере приблизительно 6000, например, по меньшей мере приблизительно 7000 ед./г как измерено в "Анализе 1", как описано в настоящем описании, полученного при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma.
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению обладает общей активностью ферментов по меньшей мере приблизительно 4000, например, по меньшей мере приблизительно 5000, например, по меньшей мере приблизительно 6000, например, по меньшей мере приблизительно 7000, например, по меньшей мере приблизительно 8000, например, по меньшей мере приблизительно 9000, например, по меньшей мере приблизительно 10000, например, по меньшей мере приблизительно 11000, например, по меньшей мере приблизительно 12000 ед./г, как измерено в "Анализе 1", как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению состоит приблизительно из 3100 ед./г из Penicillium funiculosum и приблизительно 5200 ед./г из Trichoderma reesei, где указанное количество единиц/г определяют в "Анализе 1", как описано в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению состоит приблизи
тельно из 2362 ед./г из Penicillium funiculosum и приблизительно 5315 ед./г из Trichoderma reesei, где указанное количество единиц/г определяют в "Анализе 1", как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс по изобретению обладает спецификациями продукта "LAMINEX(r) XG", как определено в настоящем документе.
В дополнительном аспекте штамм Trichoderma reesei, используемый по изобретению, обладает характеристиками, по существу, идентичными характеристикам Trichoderma reesei, депонированного согласно Будапештскому договору в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с наименованием штамма GC Cellulose A83 GICC 0004, М03000004, депонированного Danisco A/S на дату 5 мая 2009 г.
В следующем аспекте штамм представляет собой штамм Trichoderma reesei, депонированный согласно Будапештскому договору в Американской коллекции типовых культур (АТСС) с наименованием штамма GC Cellulose A83 GICC 0004, М03000004, депонированный Danisco A/S на дату 5 мая 2009 г.
В контексте настоящего изобретения фраза "характеристики, по существу, идентичные" означает, что штамм обладает одной или несколькими (предпочтительно всеми) характеристиками Trichoderma reesei, депонированного согласно Будапештскому договору в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Патентный депозитарий, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 с наименованием штамма GC Cellulose A83 GICC 0004, M03000004, депонированного Danisco A/S на дату 5 мая 2009 г.
Как описано выше, настоящее изобретение относится к использованию ферментного комплекса по изобретению в способе получения затора для пивоварения, например в производстве солодового пива и/или в производстве виски. Следующие варианты осуществления являются, в частности, относящимися к способу получения пивоваренного затора.
В некоторых конкретных вариантах осуществления ферментный комплекс по настоящему изобретению не получают при комбинации продукта экспрессии полученного при ферментации микроорганизмов вида Trichoderma reesei и продукта экспрессии, полученного при ферментации микроорганизмов вида Penicillium funiculosum, где соотношение активности бета-1,4-эндоглюкангидролазы, происходящей из Penicillium funiculosum и из Trichoderma reesei, составляет от приблизительно 0,25/0,75 до 0,37/0,63, например, от приблизительно 0,26/0,74 до 0,36/0,64, например, от приблизительно 0,27/0,73 до 0,35/0,65, например, от приблизительно 0,28/0,72 до 0,34/0,66, например, от приблизительно 0,29/0,71 до 0,33/0,67, например, от приблизительно 0,30/0,70 до 0,32/0,68, например, от приблизительно 0,31/0,69.
В некоторых конкретных вариантах осуществления ферментный комплекс по настоящему изобретению получают при комбинации продукта экспрессии, полученного при ферментации микроорганизмов вида Trichoderma reesei, и продукта экспрессии, полученного при ферментации микроорганизмов видов Penicillium funiculosum, где соотношение активности бета-1,4-эндоглюкангидролазы, полученной из Pen-icillium funiculosum и из Trichoderma reesei, составляет от приблизительно 0,25/0,75 до 0,37/0,63, например, от приблизительно 0,26/0,74 до 0,36/0,64, например, от приблизительно 0,27/0,73 до 0,35/0,65, например, от приблизительно 0,28/0,72 до 0,34/0,66, например, от приблизительно 0,29/0,71 до 0,33/0,67, например, от приблизительно 0,30/0,70 до 0,32/0,68, например, от приблизительно 0,31/0,69.
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс используют в заторе, чтобы способствовать фильтрации пивного сусла, и/или фильтрации затора, и/или фильтрации пива.
В некоторых вариантах осуществления ферментный комплекс используют в заторе, чтобы способствовать разделению затора.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение количества остаточного р-глюкана в сусле, например, уменьшение по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 20 или по меньшей мере на 30% по сравнению с контролем без фермента, или по меньшей мере на 2, 5 или 10% по сравнению с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение вязкости, например вязкости сусла, например уменьшение по меньшей мере на 2,5, по меньшей мере на 5 или по меньшей мере на 7,5% по сравнению с контролем без фермента.
В некоторых вариантах осуществления присутствует увеличение циклов пивоварения/сутки, например увеличение по меньшей мере на 5, например, по меньшей мере на 10, или по меньшей мере на 20% по сравнению с контролем без фермента, или по меньшей мере на 2,5, по меньшей мере на 5, или по меньшей мере на 10% по сравнению с контролем с использованием LAMINEX(r) Super с такой же или сравнимой активностью фермента на основе компонента Penicillium funiculosum.
В некоторых вариантах осуществления присутствует улучшенная фильтруемость.
В некоторых вариантах осуществления присутствует улучшенное разделение затора.
В некоторых вариантах осуществления присутствует увеличенная скорость потока во время разделения затора, например увеличение по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 15, или по меньшей мере на 20% по сравнению с контролем без фермента, или по меньшей мере на 2,5, по меньшей мере на 5 или по меньшей мере на 10% по сравнению с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
Следует понимать, что указанную скорость потока определяют как среднюю скорость потока, рассчитанную по общему времени разделения.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение времени промывания дробины
или экстракции, например уменьшение по меньшей мере на 5, по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 15 или по меньшей мере на 20% по сравнению с контролем без фермента или с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение общего времени фильтрации пивного сусла.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение общего времени разделения затора, например уменьшение по меньшей мере на 5, по меньшей мере на 10, или по меньшей мере на 15% по сравнению с контролем без фермента, или по меньшей мере на 2,5, по меньшей мере на 5 или по меньшей мере на 10% по сравнению с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение среднего ДР через фильтрующий слой во время рециркуляции затора поверх фильтрующего слоя и/или во время процесса фильтрации пивного сусла.
Следует понимать, что ДР относится к падению давления на протяжении слоя.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение среднего ДР через поверхность разделения во время рециркуляции затора поверх фильтрующего слоя и/или во время процесса фильтрации пивного сусла.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение среднего ДР через поверхность разделения во время процесса разделения затора, например уменьшение по меньшей мере на 5, по меньшей мере на 10 или по меньшей мере на 15% по сравнению с контролем без фермента или с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
В некоторых вариантах осуществления не присутствует изменений в мутности сусла.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение количества пентозанов в сусле.
В некоторых вариантах осуществления присутствует улучшенный выход экстракта.
В некоторых вариантах осуществления присутствует увеличенная скорость потока во время фильтрации пива.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение давления, нарастающего через фильтр с течением времени во время фильтрации пива, например уменьшение по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 20 или по меньшей мере на 25% по сравнению с контролем без фермента или с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение помутнения пива, например уменьшение по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 20 или по меньшей мере на 25% по сравнению с контролем без фермента или с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
В некоторых вариантах осуществления не присутствует уменьшения стабильности пены.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение количества р-глюкана в пиве, например уменьшение по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 20 или по меньшей мере на 25% по сравнению с контролем без фермента или с контролем с использованием LAMINEX(r) Super.
В некоторых вариантах осуществления присутствует уменьшение количества пентозанов в пиве, например уменьшение по меньшей мере на 10, по меньшей мере на 20 или по меньшей мере на 25% по сравнению с контролем без фермента.
В некоторых вариантах осуществления менее чем приблизительно 0,5 кг ферментного комплекса на тонну крупки используют в способе получения пивоваренного затора, например для получения солодового пива и/или для получения виски. В некоторых вариантах осуществления используют менее чем приблизительно 0,4 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например используют менее чем приблизительно 0,3 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, используют менее чем приблизительно 0,25 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, используют менее чем приблизительно 0,2 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, используют менее чем приблизительно 0,19 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, используют менее чем приблизительно 0,18 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, менее чем приблизительно 0,17 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, менее чем приблизительно 0,16 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, менее чем приблизительно 0,15 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, менее чем приблизительно 0,14 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, менее чем приблизительно 0,13 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, менее чем приблизительно 0,12 кг ферментного комплекса на тонну крупки, например, менее чем приблизительно 0,11 кг ферментного комплекса на тонну крупки.
Следует понимать, что штамм грибов, используемый по изобретению, может представлять собой культуру вышеупомянутого депонированного штамма, но может также представлять собой штамм, обладающий свойствами, по существу, идентичными свойствам вышеупомянутого выделенного и депонированного штамма. В предпочтительном варианте осуществления штамм представляет собой депонированный штамм или его потомство.
Продукт экспрессии, полученный при ферментации видов микроорганизмов из рода Trichoderma, используемый по настоящему изобретению, может происходить из любого Trichoderma, такого как
Trichoderma reesei, например композиция Celluclast(r), доступная из Novozymes A/S. Celluclast(r) оказывает выраженный эффект уменьшения вязкости на растворимые целлюлозные субстраты. Альтернативно, можно использовать LAMINEX(r) BG, коммерческий препарат целлюлазы, продуцированный Tricho-derma reesei и доступный из Danisco A/S.
Продукт экспрессии, полученный при ферментации видов микроорганизмов из рода Penicillium, используемый по настоящему изобретению, может происходить из любого Penicillium, такого как Penicil-lium funiculosum. В некоторых вариантах осуществления штамм представляет собой Penicillium funiculo-sum, депонированного согласно Будапештскому договору в Международном микологическом институте под номером IMI 378536, или его производное, или потомство. Альтернативно, Penicillium funiculosum является таким, как описано в WO 9957325. В некоторых альтернативных вариантах осуществления LAMINEX(r) C2K (полученный из Danisco A/S), продукт экспрессии, происходящий из Penicillium funicu-losum, используют по изобретению.
LAMINEX(r) Super представляет собой ферментный продукт для пивоварения для использования в заторе, чтобы способствовать фильтрации пивного сусла или фильтрации затора. Продукт LAMINEX(r) Super представляет собой смесь двух различных ферментных продуктов ферментации - целлюлазы Peni-cillium funiculosum и целлюлазы Trichoderma reesei. LAMINEX(r) Super получают из Danisco A/S. Компонент Penicillium funiculosum включают для гидролиза солюбилизированных р-глюканов и ксиланов, уменьшения вязкости сусла и улучшения фильтрации пивного сусла или фильтрации затора; компонент Trichoderma reesei включают для получения низкого уровня, измеренного (способом анализа бета-глюканов со смешанными связями Megazyme) р-глюкана в сусле, и для увеличения скорости фильтрации пива.
LAMINEX(r) BG - продукт(ы) Т. reesei, используемые для улучшения фильтрации пива, полученные из Danisco A/S.
Продукт LAMINEX(r) Super определяют, как полученный из
1575 ед./г (определено в "Анализе 1") из концентрата Penicillium funiculosum;
2362 ед./г (определено в "Анализе 1") из Trichoderma reesei.
Это округляют в меньшую сторону до 3900 ед./г в конечной спецификации продукта LAMINEX(r) Super.
Спецификация LAMINEX(r) Super представляет собой
активность целлюлазы > 3900 ед./г (определено в "Анализе 1") рН 3,7-4,2,
микроорганизмы, спецификации стандартные,
стабилизирован 0,25%-ным бензоатом натрия.
LAMINEX(r) XG определяют, как полученный из ферментного комплекса, полученного при комбинации продукта экспрессии, полученного при ферментации вида Trichoderma reesei, и продукта экспрессии, полученного при ферментации вида Penicillium funiculosum, где соотношение активности бета-1,4-эндоглюкангидролазы, происходящей из Penicillium funiculosum и из Trichoderma reesei, составляет приблизительно от 0,25/0,75 до 0,37/0,63, например ферментный комплекс, где приблизительно 2363 ед./г (активность измерена в "Анализе 1") происходит из концентрата Penicillium funiculosum; и приблизительно 5315 ед./г (активность измерена в "Анализе 1") происходит из Trichoderma reesei. В этом конкретном варианте осуществления продукт LAMINEX(r) XG дает соотношение Penicillium funiculo-sum/Trichoderma 0,31/0,69 на основании единиц активности, как измерено в "Анализе 1", как описано под заголовком "Анализы".
Пример 1. Исследование затора в лабораторном масштабе 1.
Активность ферментов.
Продукт LAMINEX(r) Super, смешанный для этого конкретного эксперимента.
Номинальная активность 3937 CMC ед./г. Измеренная активность 3682 CMC ед./г (активность измерена способом "Анализа 1") в дозе 0,2 кг/т крупки, дающая 736400 CMC ед./т крупки (=0,736 ед./г крупки).
Принимая определение продукта LAMINEX(r) Super 0,40хпродукт P. funiculosum и 0,60хпродукт T. reesei на основании активности CMC, как измерено в "Анализе 1": вклад в активность P. funiculosum 0,295 CMC ед./г крупки, вклад в активность T. Reesei 0,442 CMC ед./г крупки.
LAMINEX(r) Super (0,200 кг/т крупки)+50% активности компонента Г. reesei (LAMINEX(r) XG): 3682 CMC ед./г (активность измерена в "Анализе 1") в дозе 0,2 кг/т крупки+0,09534 г компонента T. reesei (12539 CMC ед./г, по "Анализу 1")/г продукта LAMINEX(r) Super, дающие 975494 CMC ед./т крупки (=0,975 ед./г крупки),
вклад в активность P. funiculosum 0,295 CMC ед./г крупки, вклад в активность T. reesei (0,442+0,239) CMC ед./г=0,681 CMC ед./г крупки. Соотношение вклада P. funiculosum/T. reesei в исследовании затора с LAMINEX(r) XG в лабораторном масштабе 1 0,30/0,70.
Тестирование LAMINEX(r) Super (0,200 кг/т крупки) по сравнению с LAMINEX(r) Super (0,200 кг/т крупки)+50% активности компонента T. reesei в 10% ячменного затора Fawcett (90% солода Fawcett: 10% ячменя Fawcett): - 50 г крупки в общем количестве 250 г воды. Профиль затирания: использовали 50 г смешанной крупки, размолотой до 0,5 мм, и добавляли 190 мл воды при 67°С. Температурный цикл затирания составлял 60 мин при 65°С, затем 10 мин при 72°С. Затем заторы охлаждали, доводили до массы 250 г и фильтровали через гофрированную фильтровальную бумагу (Ederol 12).
По сравнению с продуктом LAMINEX(r) Super для ферментного раствора LAMINEX(r) Super (0,200 кг/т крупки) с добавлением 50% дополнительной активности компонента T. reesei показано
уменьшенное количество остаточного р-глюкана в сусле (см. фиг. 1).
Уменьшенное количество остаточного р-глюкана в сусле указывает на возможность уменьшения вязкости, последующего увеличения разделения/фильтрации сусла и возможность увеличения количества циклов пивоварения/сутки.
Увеличение фильтрации (см. фиг. 1).
Увеличение фильтрации указывает на положительный потенциал увеличения продолжительности циклов фильтрации без прерываний (например, разрыхлений), что, в свою очередь, может уменьшать общее время фильтрации и, таким образом, приводить к увеличению количества циклов пивоварения/сутки.
Пример 2. Исследование затора в лабораторном масштабе 2. Активность ферментов.
LAMINEX(r) Super.
4380 CMC ед./г (активность рассчитана по вкладу отдельного компонента) в дозе 0,2 кг/т крупки, дающая 876000 CMC U/т крупки (=0,876 ед./г крупки).
Компонент P. funiculosum, вносящий вклад 2069 CMC ед./г (по "Анализу 1"), соответствующий 0,414 CMC ед./г крупки.
Компонент T. reesel, вносящий вклад 2311 CMC ед./г (по "Анализу 1"), соответствующий 0,462 CMC ед./г крупки.
Соотношение вклада P. funiculosum/T. reesei в продукт LAMINEX(r) Super в этом исследовании составляет 0,47/0,52.
LAMINEX(r) XG (LAMINEX(r) Super, концентрированный в 1,5 раза+добавление 50% дополнительной активности компонента T. reesei).
8304 CMC ед./г (активность рассчитана по вкладу отдельного компонента) в дозе 0,133 кг/т крупки, дающая 1104432 CMC ед./т крупки (=1,104 ед./г крупки).
Компонент P. funiculosum, вносящий вклад 3104 CMC ед./г (по "Анализу 1"), соответствующий 0,413 CMC ед./г крупки.
Компонент T. reesei, вносящий вклад 5200 CMC ед./г (по "Анализу 1"), соответствующий 0,692 CMC ед./г крупки.
Соотношение вклада P. funiculosum/T. reesei в исследовании затора с LAMINEX(r) XG в лабораторном масштабе 2 0,37/0,63.
Тестирование LAMINEX(r) Super (0,200 кг/т крупки) по сравнению с LAMINEX(r) XG (0,133 кг/т крупки) в смешанной крупке 25,8% солода Spitz и 74,2% солода Pilsner - затор. Профиль затирания: 50 г крупки осолаживали в 150 г воды и следовали программе затирания, приведенной в табл. 1.
В конце затирания 30 мл горячей воды (при 76°С) добавляли к каждому затору, и заторы фильтровали горячими с использованием фильтровальной бумаги Ederol 12.
По сравнению с продуктом LAMINEX(r) Super (в дозе 0,2 кг/т крупки) для ферментного раствора LAMINEX(r) XG (в дозе 0,133 кг/т крупки) показали уменьшение концентраций остаточного р-глюкана в сусле (см. фиг. 2).
Важность уменьшения концентрации р-глюкана в сусле неясна, однако теории связывают уменьшенное содержание р-глюкана в сусле с уменьшенной вязкостью сусла. При том, что разделение затора
является ограничивающим фактором в процессе пивоварения, полученное положительное увеличение может увеличить производительность пивоваренного завода посредством увеличения количества циклов пивоварения/сутки благодаря уменьшению времени, потраченного на разделение затора. Увеличение объемов фильтрации с течением времени (см. фиг. 2).
Более высокие скорости фильтрации положительно уменьшают время, потраченное на фильтрацию, что потенциально приводит к увеличению производительности пивоваренного завода посредством увеличения количества циклов пивоварения/сутки.
Уменьшение вязкости сусла (см. фиг. 2).
Уменьшенная вязкость сусла обладает положительным потенциалом увеличения скоростей фильтрации и, таким образом, увеличения производительности пивоваренного завода. Пример 3. Пилотные исследования пивоварения.
Ферментные композиции, такие же, как в исследовании затора в лабораторном масштабе 2.
Тестирование LAMINEX(r) Super (эквивалент 0,200 кг/т крупки) и LAMINEX(r) XG (LAMINEX(r)
Super, концентрированный в 1,5 раза+добавление 50% дополнительной активности компонента T. reesei) (0,133 кг/т крупки). Пилотное исследование пивоваренного затирания проводили с использованием 31 кг смешанной крупки 25,8% солода Spitz и 74,2% солода Pilsner в объеме затора 110 л. Профиль затирания показан в табл. 2.
Пилотные исследования пивоваренного затирания.
По сравнению с LAMINEX(r) Super добавление LAMINEX(r) XG в процесс затирания приводит к уменьшению времени промывания пивной дробины вплоть до 13% (см. табл. 3). Уменьшение времени промывания пивной дробины вносит положительный вклад в уменьшение времени, затраченного на разделение сусла, и таким образом, обладает потенциалом для увеличения производительности пивоваренного завода посредством увеличения количества циклов пивоварения/сутки.
Уменьшению общего времени фильтрации пивного сусла вплоть до 8% по сравнению с LAMINEX(r) Super и вплоть до 20% по сравнению с водным контролем (без добавления фермента) (см. табл. 3 и фиг. 3).
При том, что процесс фильтрации пивного сусла является ограничивающим фактором в процессе пивоварения, уменьшение времени фильтрации пивного сусла обладает потенциалом для увеличения производительности пивоваренного завода посредством увеличения количества циклов пивоварения/сутки.
Увеличению средней скорости потока, рассчитанной либо как среднее для скоростей потока, измеряемых "непрерывно" в процессе фильтрации пивного сусла, либо как "Общий профильтрованный объем" на "Общее время фильтрации пивного сусла" (см. табл. 3 и фиг. 3).
Увеличение средней скорости потока может положительно уменьшать общее время, затраченное на разделение сусла, и таким образом, потенциально увеличивать производительность пивоваренного завода.
Уменьшению среднего ДР через фильтрующий слой вплоть до 19% в процессе фильтрации пивного сусла (см. табл. 3).
Потенциально, уменьшение среднего ДР через фильтрующий слой может приводить к уменьшению необходимости разрыхления фильтрующего слоя и увеличению объема, профильтрованного с течением времени. Оба фактора обладают положительным потенциалом для уменьшения времени фильтрации пивного сусла и, таким образом, для увеличения производительности пивоваренного завода.
Уменьшению давления, нарастающего во время рециркуляции затора над фильтрующим слоем (вплоть до 22%) и во время фильтрации пивного сусла (вплоть до 24%) (см. табл. 3).
Уменьшение давления, нарастающего во время как рециркуляции, так и фильтрации пивного сусла, обладает потенциалом вносить вклад в увеличение фильтрации, и, таким образом, уменьшение общего времени фильтрации пивного сусла. И снова это может приводить к увеличению производительности пивоваренного завода. Наблюдаемый эффект является особенно сильным, поскольку увеличенная ско
рость фильтрации в норме связана с увеличением давления - и настоящие данные показывают увеличение фильтрации и в то же время уменьшение нарастающего давления. Отсутствию изменений в мутности сусла (см. табл. 3).
Мутность не изменяется, что является положительным, поскольку увеличенная мутность может являться фактором, приводящим к выбору запуска разрыхления. Разрыхление занимает много времени и может увеличивать общее время разделения сусла и, таким образом, уменьшает производительность пивоваренного завода.
Уменьшению "общего нарастающего давления" во время фильтрации пивного сусла вплоть до 24% (см. табл. 3 и фиг. 3).
Уменьшение "общего нарастающего давления" во время разделения сусла может увеличивать скорость фильтрации и, таким образом, увеличивать производительность пивоваренного завода посредством уменьшения времени, затраченного на процесс разделения сусла.
Отсутствию разрыхления фильтрующего слоя, инициированного нарастающим давлением. Как обозначено (1) внизу табл. 3, только обязательное разрыхление вводили при включении LAMINEX(r) XG на стадии затирания (обозначено (1) в табл. 3).
Уменьшение времени промывания пивной дробины вносит вклад в уменьшение общего времени фильтрации пивного сусла и потенциальное увеличение количества циклов пивоварения/сутки.
Таблица 3
Нарастание Р -фильтрование пивного
сусла
(бар и.д. )
555
396
300
Нарастание Р - общее
(бар и.д.)
659
489
373
Разрыхления (Iе сусло + промывания пивной дробины)**
1 + 1
0 + 1
0+(1)
* - по общему объему и общему времени фильтрации пивного сусла;
** - 1 - обозначает разрыхление, инициированное нарастающим давлением, 0 - обозначает отсутствие разрыхления, (1) - обозначает обязательное разрыхление, начатое с ручного управления в начале 2-го промывания пивной дробины, если его не было ранее.
Результат анализа образцов сусла из заторов с добавлением LAMINEX(r) XG в процессе затирания: уменьшение количества р-глюкана в сусле, как измерено способом анализа бета-глюканов со смешанными связями Megazyme (ссылка K-BGLU в каталоге Megazyme, согласующаяся со стандартным методом АОАС 9 95.16) (см. табл. 4). Уменьшение количества остаточного р-глюкана в сусле может приводить к положительному уменьшению вязкости сусла, таким образом увеличивая фильтрацию и производительность пивоваренного завода посредством увеличения количества циклов пивоварения/сутки.
Увеличение количества экстракта вплоть до 2,3% (см. табл. 4).
Увеличение количества экстракта может приводить к положительному увеличению производительности пивоваренного завода - больше продукта производят из такого же количества сырья - иными словами, к увеличению производительности пивоваренного завода более рентабельным образом.
Таблица 4
73 - отрицательный контроль: контроль без фермента; 75 - LAMINEX(r) Super при 0,20 кг/т; 79 - LAMINEX(r) XG при 0,133 кг/т. Пилотная пивоваренная фильтрация пива.
По сравнению с LAMINEX(r) Super добавление LAMINEX(r) XG в процесс затирания приводит к увеличению скорости потока во время фильтрации пива (см. табл. 5).
Увеличение скорости потока во время фильтрации пива оказывает положительный эффект на увеличение фильтрационной емкости и таким образом, потенциально, на уменьшение (ограничение) необходимости в дополнительной емкости буферного танка разлива (ВВТ) (ВВТ представляют собой резервуары под давлением, используемые для хранения пива после фильтрации до разлива. Эти резервуары способны поддерживать стабильное давление, исключая потерю диоксида углерода и предупреждая образование пены).
Значительному уменьшению давления, нарастающего через фильтр с течением времени (см. табл. 5). Уменьшение давления, нарастающего через фильтр с течением времени, положительно увеличивает продолжительность цикла фильтрации между очистками. Это положительным образом ограничивает очистку в затратах пространства, воды и энергии. Уменьшается также количество необходимого фильтрующего материала, что приводит к экономии затрат. Более длительные циклы фильтрации между очистками положительным образом уменьшают потерю пива, возникающую из-за запуска и остановки процесса фильтрации пива.
73 - отрицательный контроль: контроль без фермента; 75 - LAMINEX(r) Super при 0,20 кг/т; 79 - LAMINEX(r) XG при 0,133 кг/т. Анализы пива при пилотном пивоварении.
Анализы пива, полученного из заторов с добавлением LAMINEX(r) XG в процесс затирания, показывают уменьшение количества бета-глюкана в пиве (см. табл. 6).
Уменьшение количества р-глюкана в пиве может положительным образом уменьшать вязкость пива и таким образом, увеличивать цикл фильтрации и уменьшать расход вспомогательного фильтрующего материала и приспособлений (снижение затрат).
Уменьшение мутности пива (см. табл. 6).
Основной вклад в мутность пива может быть связан с не относящимся к бета-глюкану материалом. Уменьшенное количество р-глюкана в пиве может также вносить положительный вклад в уменьшение мутности пива, придавая положительный внешний вид пиву.
Отсутствие уменьшения стабильности пива (см. табл. 6 - значение пеностойкости).
Стабильность пены пива не уменьшалась при использовании "концентрации LAMINEX(r) Super больше в 1,5 раза+добавления 50% дополнительной активности компонента T. reesei". Это является положительным, поскольку может присутствовать фактор риска по отношении к внешнему виду и качеству пива.
Можно ожидать уменьшения количества пентозанов в пиве. Уменьшение количества пентозанов в пиве может вносить положительный вклад в увеличение фильтрации пива.
Таблица 6
на варку (3000 кг ячменя, 6500 кг солода).
Как показано в табл. 7, хорошие результаты наблюдали с LAMINEX(r) XG по отношению к разделению затора. Уменьшение времени фильтрации пивного сусла обладает потенциалом увеличения производительности пивоваренного завода посредством увеличения количества циклов пивоварения/сутки.
Исследование линии 2.
Исследование проводили на композиции 28% ячменной крупки с использованием 12300 кг крупки на варку (3500 кг ячменя, 8800 кг солода).
Как показано в табл. 8, хорошие результаты наблюдали с LAMINEX(r) XG по отношению к фильтрации пива.
Увеличение количества циклов фильтрации пива между очистками обладает потенциалом увеличения производительности пивоваренного завода посредством уменьшения времени, затраченного на очистку, и увеличения количества циклов фильтрации пива, пивоварения/сутки. Кроме того, увеличение количества циклов фильтрации пива приводит к экономии затрат и уменьшенному потреблению энергии, и уменьшает потерю пива, возникающую из-за запуска и остановки процесса фильтрации пива. Уменьшение расхода вспомогательного фильтрующего материала и приспособлений (уменьшение расхода кизельгура) приводит к непосредственному снижению затрат.
Как представлено в табл. 9, анализы пива, полученные для линии 2 с добавлением LAMINEX(r) XG в процесс затирания показали уменьшение количества бета-глюкана в пиве.
Уменьшение количества р-глюкана в пиве может положительным образом уменьшать вязкость пива и таким образом увеличивать количество циклов фильтрации и уменьшать расход вспомогательного фильтрующего материала и приспособлений (снижение затрат).
Можно ожидать уменьшения количества пентозанов в пиве.
Уменьшение количества пентозанов в пиве может вносить положительный вклад в увеличение фильтрации пива посредством уменьшения вязкости. Уменьшение динамической вязкости пива.
Уменьшение динамической вязкости пива может положительным образом увеличивать количество циклов фильтрации и уменьшать расход вспомогательного фильтрующего материала и приспособлений (снижение затрат). Увеличение количества циклов фильтрации может также увеличивать производительность пивоваренного завода посредством увеличения количества циклов фильтрации пива/сутки.
Обобщение - дозы активности фермента, используемые в исследованиях.
Данные приведены в соотношении PF/TR, которое представляет собой только соотношение вклада каждого компонента в общую активность. PF представляет собой вклад, внесенный Penicillium funiculosum, и TR - вклад, внесенный Trichoderma reesei.
Таблица 10
Активности ферментов CMC, используемые в различных исследованиях/примерах
LAMINEX(r) Super
LAMINEX(r) XG
Соотношение PF/TR
Соотношение PF/TR
Исследование затора в лабораторном масштабе 1
0,4/0,6
0,30/0,70
Исследование затора в лабораторном масштабе 2
0,47/0,52
0,37/0,63
Пилотное исследование пивоварения
0,47/0,52
0,37/0,63
Полномасштабное исследование пивоварения, линия 1
0,4/0,6
0,31/0,69
Полномасштабное исследование пивоварения, линия 2
0,4/0,6
0,31/0,69
Анализы.
Анализ 1. Способ активности целлюлазы с DNS (способ с DNS CMC). Систематическое наименование 1,4-(1,3; 1,4)-р^-глюкан-4-глюканогидролаза. Номер IUB ЕС 3.2.1.4. Принцип.
Анализ целлюлазы основан на ферментативном эндогидролизе 1, 4-р^-глюкозидных связей в кар-боксиметилцеллюлозе (CMC), р-1,4-глюкане. Продукты реакции (Р-1,4-глюкановые олигосахариды) определяли колориметрически посредством измерения полученного увеличения количества восстанавливающих групп с использованием реагента 3,5-динитросалициловой кислоты. Активность фермента рассчитывали по связи между концентрацией восстанавливающих групп, в качестве глюкозных эквивалентов, и оптической плотностью при 540 нм.
Анализ проводили при рН 5,0, но его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеризации и спецификации ферментов.
Определение единицы.
Одну единицу активности целлюлазы определяют как количество фермента, образующее 1 мкмоль глюкозных эквивалентов в минуту в условиях анализа (рН 5,0 (или как указано) и 50°С). Материалы.
Карбоксиметилцеллюлоза. Поставщик: Megazyme Ltd. No. продукта: CM-Cellulose. 4М D-глюкоза "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH). No. продукта 10117. M.W. 180,16 Ацетат натрия безводный "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH). No. продукта: 10236. M.W.: 82,03.
Уксусная кислота ("ледяная") "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH). No. продукта 10001. M.W. 60,05. 3,5-динитросалициловая кислота GPR (3,5-динитро-2-гидроксибензойная кислота). Поставщик: Merck
Ltd (BDH). No. продукта 28235.
Гранулы гидроксида натрия "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH). No. продукта: 10252. M.W. 40,00. (+)-тартрат калия-натрия "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH). No. продукта: 10219. M.W. 282,22. 1,5% мас./об. раствор - раствор карбоксиметилцеллюлозы (CMC) в буфере 0,1М ацетате натрия, рН 5,0 (раствор субстрата).
Раствор 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS). 20 г/л DNS в буфере, содержащем 32 г/л гранул гидроксида натрия и 600 г/л (+)-тартрата калия-натрия.
Стандартный раствор глюкозы (0,50 мг/мл). Способ.
Ферментный комплекс разводили с получением образцов и получали стандартную кривую для глюкозы, как показано на фиг. 2, с использованием концентраций глюкозы 0, 0,125, 0,25, 0,375 и 0,5 мг/мл.
0,25 мл раствора фермента смешивали с 1,75 мл раствора субстрата (1,5% мас./об.) при 50°С, и реакцию останавливали через 10 мин добавлением раствора DNS. За этим следовало нагревание до 95°С в течение 5 мин.
Измеряли оптическую плотность различных образцов при 540 НМ (OD540 нм). Расчет.
Активность фермента определяют по стандартной кривой, как показано на фиг. 2. Активность рассчитывали следующим образом:
Т-С . 1 Jrt3 1 1 п
х А х х 10 х - x-xD
. . -1 -к m 180.16 V t
Активность (ед.мл или ед.г )=
где T=AOD540 нм ТЕСТКЮ540 нм ТЕСЛЧЮ540 нм НУЛЬ; m - наклон стандартной кривой (приблизительно 1,0);
с - пересечение оси у стандартной кривой (всегда отрицательное и приблизительно -0,02); 180,16 - молекулярная масса глюкозы; 103 - для перевода в мкмоль; А - анализируемый объем, мл;
V - объем фермента, мл; t - время анализа, мин;
D - действительная кратность разведения фермента (например, для 1 г, разведенного до 1 л,
D=1000).
Анализ 2. Эндо-1,4-р-ксиланаза (способ с DNS и ксиланом древесины березы). Принцип.
Реакция, катализируемая эндо-1,4-р-ксиланазой, включает в себя эндогидролиз 1,4-p-D-ксилозидиновых связей в ксилане (например, ксилане древесины березы или замещенных ксиланах злаков, таких как арабиноксилан пшеницы), образующих р-1,4-ксилановые олигосахариды.
Продукты реакции (р-1,4-ксилановые олигосахариды) определяли колориметрически посредством измерения полученного увеличения количества восстанавливающих групп с использованием реагента 3,5-динитросалициловой кислоты. Активность фермента рассчитывают по связи между концентрацией восстанавливающих групп в качестве ксилозных эквивалентов и оптической плотностью при 540 нм.
Стандартный анализ проводили при рН 3,5, но его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеризации и спецификации ферментов.
Определение единицы.
Одну единицу активности эндо-1,4-р-ксиланазы определяют как количество фермента, образующее 1 мкмоль ксилозных эквивалентов в минуту в условиях анализа (рН 3,5 (или как указано) и 50°С). Материалы.
См. список материалов, приведенный выше для анализа активности целлюлазы. Ксилан древесины березы. Поставщик: Sigma Chemical Co. No. продукта: X 0502. D(+)-ксилоза "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH). No. продукта: 10372 M. W.: 150,13. 1,5% мас./об. раствор - раствор ксилана древесины березы в буфере 0,1 ацетате натрия, рН 4,0 (раствор субстрата).
Стандартный раствор ксилозы (0,50 мг/мл). Способ.
1,75 мл раствора ксилана древесины березы смешивали с 0,25 мл разведенного раствора фермента при 50°С в течение 10 мин, реакцию останавливали добавлением 2 мл раствора DNS с последующим нагреванием до 95°С в течение 5 мин. Измеряли оптическую плотность при 540 нм (OD540 нм).
Стандартную кривую получали для 0,125, 0,250, 0,375, 0,500 мг/мл ксилозы.
Расчет.
Активность рассчитывали следующим образом:
Т-с л 1 лпЪ 1 1 "
х Ах х10 х-х -xD
Активность (ед.мл1 или ед.г_1)= m 150.13 v t
где T=AOD54OHM TECT=OD54O НМ TECT-OD540 НМ НУЛЬ; m - наклон стандартной кривой (приблизительно 1,0);
с - пересечение оси у стандартной кривой (всегда отрицательное и приблизительно -0,02); 150,13 - молекулярная масса ксилозы; 103 - для перевода в мкмоль; А - анализируемый объем, мл;
V - объем фермента, мл;
t - время анализа, мин;
D - действительная кратность разведения фермента (например, для 1 г, разведенного до 1 л,
D=1000).
Анализ 3. Ламинариназа (способ с DNS и ламинарином). Принцип.
Реакция, катализируемая ламинариназой, включает в себя эндогидролиз 1,3-глюкозидных связей в 1,3-р^-глюканах. Субстраты включают в себя ламинарии, парамилон и пачиман. Продукты реакции (Р-1,3-глюкановые олигосахариды) определяют колориметрически посредством измерения полученного увеличения количества восстанавливающих групп с использованием реагента 3,5-динитросалициловой кислоты. Активность фермента рассчитывают по связи между концентрацией восстанавливающих групп в качестве глюкозных эквивалентов и оптической плотностью при 540 нм.
Анализ проводили при рН 5,0 и 50°С, но его можно проводить при различных значениях рН и температуры для дополнительной характеризации и спецификации ферментов.
Определение единицы.
Одну единицу активности ламинариназы определяют как количество фермента, образующее 1 мкмоль глюкозных эквивалентов в мин в условиях анализа (рН 5,0 и 50°С (или как указано)). Материалы.
См. материалы, приведенные выше для анализа активности целлюлазы.
Ламинарии (из Laminaria digit at a). Поставщик: Sigma-Aldrich Co. Ltd., No. продукта: L 9634.
1,00% мас./об. раствор - раствор ламинарина (раствор субстрата в буфере 0,1М ацетате натрия, рН
5,0).
1,75 мл раствора ламинарина смешивали с 0,25 мл разведенного раствора фермента при 50°С в течение 10 мин, и реакцию останавливали добавлением 2 мл раствора DNS.
Стандартную кривую получали с использованием раствора глюкозы 0, 0,125, 0,25, 0,5 и 0,75 мг/мл.
Измеряли оптическую плотность при 540 нм (OD540 нм).
Расчет.
Активность рассчитывали следующим образом:
Т-с , 1 1 1 "
хАх х 10 х - x-xD
Активность (ед.мл1 или ед.г_1)= m 180.16 v t
где T=AOD540 нм TECT=OD54o нм TECT-OD540 нм НУЛЬ; m - наклон стандартной кривой (приблизительно 1,0);
с - пересечение оси у стандартной кривой (всегда отрицательное и приблизительно -0,03);
180,16 - молекулярная масса глюкозы;
103 - для перевода в мкмоль;
А - анализируемый объем, мл;
V - объем фермента, мл;
t - время анализа, мин;
D - кратность разведения фермента (например, для 1 г, разведенного до 1 л, D=1000).
Анализ 4. Анализ арабиназы.
Принцип.
Анализ активности арабиназы основан на колориметрическом определении посредством измерения полученного увеличения количества восстанавливающих групп с использованием реагента 3,5-динитросалициловой кислоты. Активность фермента рассчитывали по связи между концентрацией восстанавливающих групп в качестве арабинозных эквивалентов и оптической плотностью при 540 нм.
Анализ проводили при рН 3,5, но его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеризации и спецификации ферментов.
Определение единицы.
Одну единицу активности арабиназы (арабинаназа (эндо-1,5-альфа^-арабинаназа)) определяют как количество фермента, образующее 1 мкмоль арабинозных эквивалентов в минуту в условиях анализа (рН 3,5 (или как указано) и 50°С).
Материалы.
Арабинан сахарной свеклы Megazyme. Арабиноза Sigma A3131 М. W.: 150,1.
Ацетат натрия безводный "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH), No. продукта: 10236. M.W.: 82,03. Уксусная кислота ("ледяная") "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH), No. продукта: 10001. M.W.:
60,05.
3,5-динитросалициловая кислота GPR (3,5-динитро-2-гидроксибензойная кислота). Поставщик:
Merck Ltd (BDH), No. продукта: 28235.
Гранулы гидроксида натрия "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH), No. продукта: 10252. M.W.: 40,00 (+)-тартрат калия-натрия "чда". Поставщик: Merck Ltd (BDH), No. продукта: 10219. M.W.: 282,22.
1,5% мас./об. раствор - раствор арабинана в буфере 0,1М ацетате натрия, рН 3,5 (раствор субстрата).
Раствор 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS). 20 г/л DNS в буфере, содержащем 32 г/л гранул гидроксида натрия и 600 г/л (+)-тартрата калия-натрия. Стандартный раствор арабиназы (0,50 мг/мл). Способ.
Ферментный комплекс разводили с получением образцов и получали стандартную кривую для глюкозы с использованием концентраций арабиназы 0, 0,125, 0,25, 0,375 и 0,5 мг/мл.
0,25 мл раствора фермента смешивали с 1,75 мл раствора субстрата (1,5% мас./об.) при 50°С, и реакцию останавливали через 10 мин добавлением раствора DNS. За этим следовало нагревание до 95°С в течение 5 мин.
Измеряли оптическую плотность при 540 нм (OD540 нм) различных образцов. Расчет.
Активность фермента рассчитывали следующим образом:
Активность (ед.мл1 или ед.г_1)= т 150.13 V t
где T=AOD540 нм ТЕСТКЮ540 нм ТЕСЛЧЮ540 нм НУЛЬ; m - наклон стандартной кривой (приблизительно 1,0);
с - пересечение оси у стандартной кривой (всегда отрицательное и приблизительно -0,02);
150,13 - молекулярная масса арабиназы;
103 - для перевода, мкмоль;
А - анализируемый объем, мл;
V - объем фермента, мл;
t - время анализа, мин;
D - действительная кратность разведения фермента (например, для 1 г, разведенного до 1 л,
D=1000).
Анализ 5. Анализ арабинофуранозидазы.
Реакция, катализируемая a-N-арабинофуранозидазой, включает в себя гидролиз концевой связи а-L-арабинозидов в невосстанавливающем остатке a-L-арабинофуранозида. Фермент действует на a-L-арабинофуранозиды, a-L-арабинаны, содержащие (1,3)- и/или (1,5)-связи, арбиноксиланы и арабинога-лактаны.
Анализ a-N-арабинофуранозидазы основан на ферментативном гидролизе п-нитрофенил-a-L-арабинофуранозида. Анализ проводят "двухточечным" способом, а не способом "непрерывного монито-рирования". Расчет активности фермента основан на измерениях, полученных только в начале и конце периода инкубации. Продукт реакции, п-нитрофенол, определяют колориметрически (после доведения рН). Активность фермента рассчитывают по связи между концентрацией п-нитрофенола и оптической плотностью при 400 нм.
Получение раствора разведенного фермента:
Получают все растворы ферментов из порошкообразных или жидких препаратов ферментов с помощью дистиллированной в стеклянной посуде воды. Минимизируют ошибки анализа при разведении, исключая большие ступени разведения, включающие малые объемы или массы. При получении разведений ферментов более точным является, даже в случае жидкого образца, взвешивание исходного образца фермента. Если это сделано, в случае жидких образцов, в связи с этим необходимо измерить удельную плотность жидкости при 20°С.
Поскольку анализ проводят "двухточечным" способом, а не способом "непрерывного мониториро-вания", является важным способ обеспечения линейности в пределах периода инкубации с различными ферментными системами и в различных условиях. В условиях анализа, стандартных по отношению к концентрации субстрата, рН, температуре и времени анализа, показано, что анализ является линейным в диапазоне AOD540 нм ТЕСТ (Т)=0,20-1,50. Однако, при надлежащей производственной практике, анализ проводят в определенном диапазоне AOD540 нм ТЕСТ (Т)=0,400-0,800.
Способ.
Для каждого образца фермента исследование включает в себя три анализа: тестовые (ТЕСТ) анализы в двух повторах и анализ в нулевой точке (НУЛЬ). В данном способе описан анализ одного образца фермента.
ТЕСТ
НУЛЬ
Буфер 0,2 М ацетат натрия, рН 5,0
1,0 0 мл
1,00 мл
Дистиллированная в стеклянной посуде вода
1,00 мл
1,00 мл
Раствор п-нитрофенил-a-L-арабинофураноэида
1,00 мл
1,00 мл
0,25 мл раствора разведенного фермента добавляли к растворам при 50°С, реакцию останавливали
через 10 мин добавлением 4 мл раствора 0,4М глицина, рН 10,8 (останавливающий реагент).
Оптическую плотность измеряли при 400 нм при 25°С по сравнению с нулевым значением для воды.
Определение OD400 нм ТЕСТ для измеренных в двух повторах ТЕСТ.
Определение OD400 нм НУЛЬ.
Расчет.
AOD400 нм ТЕСТ (T)=OD400 нм TECT-OD400 нм НУЛЬ Единицы (мкмоль.мин-1)= Ш0° тт *
Единицы - - \ D
Активность (ед.мл-1 или ед.г-1)=
где T=OD400 нм TECT-OD400 нм НУЛЬ;
18300 - молярный коэффициент поглощения для п-нитрофенола (длина пути 1 см); V - 7,25 (общий объем жидкости в тесте в мл), t=10 мин; 1 ед.=1 мкмоль-мин-1;
Е=0,25 (объем разведенного образца фермента в мл);
D - кратность разведения фермента (например, для 1 г, разведенного до 1 л, D=1000).
Анализ 6. Анализ целлобиогидролазы.
Принцип.
Реакция, катализируемая целлобиогидролазой, включает в себя гидролиз 1,4-р^-глюкозидных связей в целлюлозе и целлотетраозе с высвобождением целлобиозы с невосстанавливающих концов цепей.
Анализ целлобиогидролазы основан на ферментативном гидролизе п-нитрофенил-Р-D-целлобиопиранозида. Продукт реакции, п-нитрофенол, определяют колориметрически (после доведения рН). Активность фермента рассчитывают по связи между концентрацией п-нитрофенола и оптической плотностью при 400 нм.
Анализ проводят в пределах определенного линейного диапазона AOD540 HM ТЕСТ (Т)=0,400-0,800. Способ.
Для каждого образца фермента исследование включает в себя три анализа: тестовые (ТЕСТ) анализы в двух повторах и анализ в нулевой точке (НУЛЬ). В данном способе описан анализ одного образца фермента.
ГЕСТ
НУЛЬ
Буфер 0,2 М ацетат натрия, рН 5,0
1,00 мл
1,00 мл
Дистиллированная в стеклянной посуде вода
1,00 мл
1,00 мл
Раствор п-нитрофенил-^-D-целлобиопиранозида
1,00 мл
1,00 мл
0,25 мл раствора разведенного фермента добавляли к тестируемому раствору при 50°С, через 30 мин 4 мл раствора 0,4М глицина, рН 10,8 (останавливающий реагент) добавляли в каждую пробирку.
Оптическую плотность измеряли при 20°С при 400 нм в стеклянной кювете 1 см по сравнению с нулевым значением для воды.
Определение OD400 нм ТЕСТ для измеренных в двух повторах ТЕСТ.
Определение OD400 нм НУЛЬ.
Расчет.
ДСЮ4оо нм ТЕСТ (T)=OD400 нм TECT-OD400 нм НУЛЬ
_J_,JL_ юч!
с , -к 18300 1000 N
Единицы (мкмоль.мин )=
Единицы > - xD Активность (ед.мл-1 или ед.г-1)= * где T=OD400 нм TECT-OD400 нм НУЛЬ;
18300 - молярный коэффициент поглощения для п-нитрофенола (длина пути 1 см);
V=7,25 (общий объем жидкости в тесте в мл);
1000 - для перевода в литры;
106 - для перевода в мкмоль;
t=30 (мин);
1 ед.=1 мкмоль-мин-1;
Е=0,25 (объем разведенного образца фермента в мл);
D - кратность разведения фермента (например, для 1 г, разведенного до 1 л, D=1000).
Анализ 7. Анализ р-глюканазы. Принцип.
Реакция, катализируемая эндо-1,3(4)-р-глюканазой, включает в себя эндогидролиз 1,3- или 1,4-глюкозидных связей в p-D-глюканах, когда остаток глюкозы, восстанавливающая группа которого вовлечена в связь, подлежащую гидролизу, сам является замещенным в С-3. Субстраты включают в себя р-D-глюканы, ламинарии и лихенин злаков. По определению этот фермент отличается от ЕС 3.2.1.39 (эндо-1,3-р-глюканаза или ламинариназа).
Анализ эндо-1,3(4)-р-глюканазы основан на ферментативном гидролизе 1,3- или 1,4-глюкозидных связей в р-глюкане ячменя, Р-1,3 (4)-глюкане. Продукты реакции (Р-1, 3(4)-глюкановые олигосахариды) определяют колориметрически посредством измерения полученного увеличения концентрации восстанавливающих групп с использованием реагента 3,5-динитросалициловой кислоты. Активность фермента рассчитывают по связи между концентрацией восстанавливающих групп в качестве глюкозных эквивалентов и оптической плотности при 540 нм.
В этом анализе после добавления реагента DNS и перемешивания анализируемые пробирки помещали в баню с кипящей водой (минимум 95°С) и инкубировали точно 15 мин. Это отличается от анализов ферментов на основе DNS с другими субстратами, где период инкубации составляет 5 мин. Это изменение влияет также на диапазон значений AOD540 нм ТЕСТ (T), приемлемых для тестирования.
В то время как стандартный анализ проводят при рН 5,0 его можно проводить при различных значениях рН для дополнительной характеризации и спецификации ферментов. В этом случае изменяется только рН буферных растворов (указанных ниже).
Необходимые реагенты.
Во всех случаях, за исключением бета-глюкана, важными являются идентичность и чистота реагентов, а не поставщик.
Бета-глюкан (ячмень; средняя вязкость), Megazyme Ltd, no. продукта P-BGBM, вязкость 20-30 сСт (2-3 х10-5 м2/с).
D-глюкоза "чда", Merck Ltd (BDH), No. продукта 10117, M.W. 180,16.
Ацетат натрия безводный "чда", Merck Ltd (BDH), no. продукта 10236, M.W. 82,03.
Уксусная кислота ("ледяная") "чда", Merck Ltd (BDH), no. продукта 10001, M.W. 60,05.
3,5-динитросалициловая кислота GPR (3,5-динитро-2-гидроксибензойная кислота), Merck Ltd
(BDH), no. продукта 28235.
Гранулы гидроксида натрия "чда", Merck Ltd (BDH), no. продукта 10252, M.W. 40,00. (+)-тартрат калия-натрия "чда", Merck Ltd (BDH), no. продукта 10219, M.W. 282,22. Реагенты.
1,5% мас./об. раствор в буфере 0,1М ацетате натрия рН 5,0 бета-глюкан (ячмень). Раствор 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS): 10 г DNS, 16 г гранул гидроксида натрия, 300 г (+)-тартрата калия-натрия растворяли в 1000 мл дистиллированной в стеклянной посуде воды. Буфер 1М ацетат натрия, рН 5,0. Стандартный раствор глюкозы (1,000 мг/мл). Способ.
Для каждого образца фермента исследование включает в себя три анализа: тестовые (ТЕСТ) анализы в двух повторах и анализ в нулевой точке (НУЛЬ). Необходима также стандартная кривая для глюкозы.
0,25 мл раствора разведенного фермента добавляли к 1,75 раствора бета-глюкана при 50°С, 2 мл раствора DNS добавляли через 10 мин, и пробирки помещали при 95°С минимум на 15 мин. Охлаждали до 25°С в воде.
Добавляли 10 мл дистиллированной в стеклянной посуде воды, и измеряли оптическую плотность при 540 нм (OD540 нм) с использованием кюветы с длиной пути 1 см.
Определение OD540 нм ТЕСТ для измеренных в двух повторах ТЕСТОВ. Определение OD540 нм НУЛЬ.
Определение OD540 нм СТАНДАРТОВ для 0,125, 0,250, 0,500, 0,750 мг/мл глюкозы. СТАНДАРТЫ сравнивали с образцом СТАНДАРТ с 0,00 мг/мл глюкозы (или все сравнивали с водой). Расчет.
Определение AOD540 нм ТЕСТ (T)=OD540 нм ТЕСТ^40 нм НУЛЬ. Активность рассчитывали следующим образом:
Т-С . 1 ,л3 1 1 "
х А х х 10 х - х-хО
Активность (ед.мл1 или ед.г_1)= m 180.16 V t
где T=AOD540 нм TECT=OD540 нм TECT-OD540 нм НУЛЬ; m - наклон стандартной кривой (приблизительно 1,0);
с - пересечение оси у стандартной кривой (всегда отрицательное и приблизительно -0,02); 180,16 - молекулярная масса глюкозы;
103 - для перевода в мкмоль;
А - анализируемый объем в мл, использовали 2,00 мл; V - объем фермента в мл, использовали 0,25 мл; t - время анализа в минутах, использовали 10 мин;
D - кратность разведения фермента (например, для 1 г, разведенного до 1 л, D=1000).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, где ферментный комплекс получен при комбинации
a) ферментного продукта экспрессии, обладающего активностью Р-1,4-эндоглюкангидролазы, полученного при ферментации видов микроорганизмов из рода Trichoderma; и
b) по меньшей мере одного фермента, полученного из гриба рода Penicillium, выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюгазы (ЕС 3.2.1.4) и р-глюканазы (ЕС 3.2.1.6),
и где по меньшей мере приблизительно 61% активности р-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4-р^-глюкозидньгх связей в карбоксиметилцеллюлозе, получают при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, как указано в а).
2. Ферментный комплекс по п.1, где указанный по меньшей мере один фермент, полученный из гриба рода Penicillium, представляет собой ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации указанного гриба рода Penicillium.
3. Ферментный комплекс по любому из пп.1 и 2, где ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации указанного гриба рода Penicillium, содержит ксиланазу.
4. Ферментный комплекс по любому из пп.1-3, содержащий активность по меньшей мере одного фермента, выбранного из группы, состоящей из эндо-1,4-р-ксиланазы, эндо-1,3(4)-р-глюканазы, целлю-лазы, ламинариназы, эндо-1,5-а^-арабинаназы, p-D-глюкозилглюкогидролазы, р-ксилозидазы, целло-биогидролазы, глюкан-1,4-р-глюкозидазы, специфической для ксилоглюкана экзо-р-1,4-глюканазы и а-N-арабинофуранозидазы.
5. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, полученный при комбинации
a) по меньшей мере приблизительно 61% ферментного продукта экспрессии, обладающего активностью р-1,4-эндоглюкангидролазы, полученного при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma; и
b) менее чем приблизительно 39% ферментного продукта экспрессии, полученного при ферментации гриба из рода Penicillium, выбранного из ксиланазы (ЕС 3.2.1.8), целлюлазы (ЕС 3.2.1.4) и р-глюканазы (ЕС 3.2.1.6); где процентные соотношения основаны на активности р-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4-р^-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе.
6. Ферментный комплекс по любому из пп.1-5, где указанный ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации микроорганизмов рода Trichoderma, происходит из микроорганизмов вида Trichoderma reesei.
7. Ферментный комплекс по любому из пп.1-6, где указанный ферментный продукт экспрессии, полученный при ферментации гриба рода Penicillium, происходит из отдельной культуры вида Penicillium funiculosum.
8. Ферментный комплекс по любому из пп.1-7, обладающий активностью фермента по меньшей мере приблизительно 3000, например, по меньшей мере приблизительно 4000, например, по меньшей мере приблизительно 5000, например, по меньшей мере приблизительно 6000, например, по менышей мере приблизительно 7000 ед./г как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4-р^-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, полученного при ферментации рода Trichoderma.
9. Ферментный комплекс по любому из пп.1-8, обладающий общей активностью фермента по меньшей мере приблизительно 4000 ед./г, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4-р^-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе.
10. Способ получения ферментного комплекса по любому из пп.1-9, где способ содержит стадии
a) ферментации микроорганизмов рода Trichoderma в среде для получения ферментационного бульона;
b) ферментации микроорганизмов рода Penicillium в среде для получения ферментационного бульона; и
c) выделения и комбинации каждого ферментного комплекса, полученного на стадиях а) и b), в форме бесклеточного бульона после указанных ферментаций для получения ферментного комплекса, где по меньшей мере приблизительно 61% активности р-1,4-эндоглюкангидролазы, как измерено ферментативным эндогидролизом 1,4-р^-глюкозидных связей в карбоксиметилцеллюлозе, получают при ферментации рода Trichoderma, полученных в стадии а).
11. Ферментный комплекс для получения пивоваренного затора, полученный способом по п.10.
12. Применение ферментного комплекса по любому из пп.1-9 при производстве пивоваренного за
11.
тора, таком как производство солодового напитка, пива, например солодового пива, и/или в производстве виски, и/или в производстве биотоплива.
13. Применение по п.12 для фильтрации пивного сусла, и/или затора, и/или фильтрации пива.
14. Применение ферментного комплекса по любому из пп.1-9 при производстве фруктового сока, вина, переработке зерна, производстве топливного спирта и питьевого спирта.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025703
- 1 -
(19)
025703
- 1 -
(19)
025703
- 1 -
(19)
025703
- 4 -
(19)