(57) Реферат / Формула:
1. Применение синтетического пептида общей формулы H 2 N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH в качестве ранозаживляющего средства, обладающего иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами.
Евразийское 025690 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201400777
(22) Дата подачи заявки 2014.07.15
(51) Int. Cl.
A61K38/06 (2006.01) A61P37/04 (2006.01) A61P39/06 (2006.01)
(57) Изобретение относится к медицине (травматологии, хирургии) и ветеринарии и может быть использовано для стимуляции заживления кожных ран. Изобретение заключается в применении пептида, имеющего формулу H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH, отличающегося от тимогена H2N-L-Glu-L-Trp-COOH наличием дополнительной аминокислоты (D-аланина) возле N-конца пептида. Пептид вводили один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно или внутрикожно) в эквимолярной с тимогеном разовой дозе (H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH - 1,2 мкг/кг, тимоген - 1 мкг/кг массы). При парентеральном введении пептида в течение 10 дней с момента возникновения кожной раны у экспериментальных животных (крысы Вистар) наблюдалась стимуляция репаративной регенерации кожи (повышалось число фибробластов) и активировалась функция нейтрофилов крови. Также в этих условиях пептид H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH обладал антиоксидантным действием, о чем свидетельствовало повышение активности супероксиддисмутазы при внутрибрюшинном и внутрикожном введениях, а также снижался уровень малонового диальдегида при внутрикожном введении этого пептида. Таким образом, синтетический пептид общей формулы H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH может быть использован в качестве средства, стимулирующего заживление кожных ран, иммунную и антиоксидантную защиту организма.
Изобретение относится к медицине (фармакологии, травматологии, хирургии), ветеринарии и может быть использовано в качестве средства, стимулирующего заживление кожных ран и иммунную функцию организма.
Известны репаранты, стимулирующие заживление кожных ран: метилурацил, пентоксил, бетаме-цил, декспантенол и другие. Однако при травмах многие из них влияют только на отдельные звенья патогенеза (Регистр лекарственных средств России (РЛС) Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 1155-1156). В связи с этим, часто приходится использовать комплексную терапию. Однако такой подход к лечению ран и травм может иметь непредсказуемые последствия взаимодействия препаратов при по-липрагмазии. Одновременно с этим многие препараты данной группы имеют побочные эффекты, которые ограничивают их применение (Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. М.: Универсум паблишинт, 1997, 532 с.).
Известны также регуляторные пептиды, обладающие репаративным и ранозаживляющим действием (Pickart, L. The human tri-peptide GHK and tissue remodeling//! Biomater Sci. Polym. Ed. 2008. Vol. 19, № 8. P. 969-988). Преимуществом пептидных средств является тот факт, что они инактивируются путем протеолиза и распадаются до обычных аминокислот, которые не являются чужеродными (ксенобиотиками) для организма и, следовательно, не обладают побочными эффектами (Белоусов Ю.Б., Кукес В.Г., Лепахин В.К., Петров В.И. Клиническая фармакология. Национальное руководство. М. Гэотар-Медиа,
2009, 965 с.).
Известный пептидный препарат - тимоген (дипептид H^N-L-Glu-L-Trp-СООН) является иммуномо-дулятором, но при этом часто используется как репарант для стимуляции заживления ран, а также для лечения травм различной этиологии (Регистр лекарственных средств России (РЛС). Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 849-850). В качестве аналога того же назначения может быть приведен пример использования тимогена для стимуляции заживления кожных ран и активации функции нейтрофилов крови (Синергичное иммунотропное и репаративное действие тимогена, даларгина и регуляторного пептида GLY-HIS-LYS при экспериментальной травме кожи/В.Ю. Чердаков, М.Ю. Смахтин, Г.М. Дубровин, И.И. Бобынцев//Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". 2013. № 1. С. 38-42). Но к недостаткам этого препарата можно отнести быструю инактивацию под действием протеолитиче-ских ферментов (протеаз), уровень которых особенно высок в зоне воспаления (Robson, M.C. Wound infection: a failure of wound healing caused by an imbalance of bacteria / M.C. Robson//Surg. Clin. North. Am. 1997. Vol. 77. P. 637-650). Протеазам достаточно разрушить только одну пептидную связь между двумя аминокислотами, что объясняет малое время полужизни этого пептида (J.A. Bergeon, Y.N. Chan, B.G. Charles, I. Toth Oral absorption enhancement of dipeptide L-Glu-L-Trp-OH by lipid and glycosyl conjugation// Biopolymers. 2008. T. 90, № 5. P. 633-643). Поэтому этот препарат может иметь недостаточную эффективность, особенно при местном применении (Saidakhmedova, Z.T. Immunomodulating activity of thymo-gen in acute pancreatitis/Z.T. Saidakhmedova//Vopr. Pitan. 2000. T. 69, № 6. P. 35-36).
Все вышеперечисленное обуславливает необходимость поиска новых пептидных репаративных средств, обладающих более высокой биологической активностью.
Технический результат изобретения заключается в создании нового синтетического ранозажив-ляющего средства с более высокой биологической активностью.
Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве ранозаживляющего средства применяют пептид общей формулы H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH.
Благодаря введению в молекулу пептида с N-конца аминокислоты D-Ala (D-аланина) усиливается ранозаживляющая активность, вероятно за счет того, что введение D-аминокислот повышает их устойчивость к действию протеаз (Greven H.M., De Wied D. Influence of peptides structurally related to ACTH and MSH on active avoidance in rats//Frontiers of Hormone research. 1977, v. 4, p. 140-152).
Предлагаемый в качестве ранозаживляющего средства пептид получают путем химического синтеза из отдельных аминокислот. Пептид может быть синтезирован в любой лаборатории синтеза пептидов. Нами был использован препарат, синтезированный в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета. В качестве препарата сравнения был использован тимоген, имеющий формулу H2N-L-Glu-L-Trp-СООН, который является общедоступным фармацевтическим средством и производится фирмой МБНПК ЦИТОМЕД ЗАО (Россия).
Выявление эффектов препарата проводили на крысах Вистар массой 180-220 г. Раневой процесс моделировали под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно). При этом полнослойные раны стандартного размера (1 см2) наносили на холке животных (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хо-тинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. М., 1981. 157 с.).
Пептиды вводили один раз в сутки парентерально (внутрибрюшинно или внутрикожно): тимоген в рекомендованной терапевтической дозе 1 мкг на 1 кг массы тела (Регистр лекарственных средств России (РЛС). Энциклопедия лекарств, 2004, 11 выпуск, с. 849-850), а аналог тимогена (пептид с общей формулой H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH) вводили в эквимолярной разовой дозе - 1,2 мкг/кг. Соответствующую навеску пептида растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 ч между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 ч до вывода животных из эксперимента. Крысам контрольной
группы вводили изотоничный раствор хлорида натрия в эквивалентном объеме в течение того же периода времени.
Для оценки активности заживления кожных ран проводили их гистологическое исследование. Материал, взятый для исследования, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После обезвоживания и заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм, которые затем окрашивали гематоксилин-эозином. При морфометрии на световом микроскопе Leica CME определяли процентное соотношение фибробластов, как известно, непосредственно участвующих в процессе ранозаживления, в со-сочковом слое кожи на 100 клеток (Савостьянов Г.А. Основы структурной гистологии. Пространственная организация эпителиев. СПб.: Наука, 2005. 375 с.).
Важную роль в ранозаживлении также играет иммунная функция и особенно активность нейтрофи-лов. Как известно, они первыми из фагоцитов приходят в очаг воспаления и от их активности существенно зависит вероятность нагноения раны, а следовательно, длительность раневого процесса (Фрейдлин И.С, Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. СПб. Наука, 2001. 390 с.). Фагоцитарную активность ней-трофилов крови исследовали после их инкубации с латексом (Медведев, А.Н. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза//Лаб. дело. 1991. № 2. С. 19-20), определяя фагоцитарное число (ФЧ) (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) в мазках, окрашенных по Романовскому. В каждом мазке просчитывали 100 нейтрофилов. (Фримель Г. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. 472 с.). Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) с использованием Multiscan МС 400 (Labsystems, Финляндия) (Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма ней-трофильных гранулоцитов человека//Клин. лаб. диагност. 2004. № 8. С. 26-29).
Повреждение тканей и органов вызывает развитие окислительного стресса с повышенным образованием активных форм кислорода (В.К. Казимирко, В.И. Мальцев, В.Ю. Бутылин, Н.И. Горобец. Сво-боднорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. Морион, 2004. 160 с.). Поэтому при травмах также важным является выявление эффектов новых лекарственных субстанций в отношении активности свободнорадикальных реакций и антиоксидантной системы организма.
Для выявления антиоксидантных эффектов определяли активность супероксиддиссмутазы (СОД) (Костюк В.А., Потапов А.Н., Ковалева Ж.В. (1990). Вопр.мед. химии № 2) и уровень малонового диаль-дегида (МДА) в крови (Mihara, M. Thiobarbituric acid value on fuch homogenate of rat as parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication and vitamin E definienes/M. Mihara, M. Uchiama//Biochem. Med. 1980. Vol. 23, № 3. P. 302-311) с использованием спектрофотометра Apel 330 PD (Япония).
Пример конкретного выполнения.
Пример 1. Эффекты пептида H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH при внутрибрюшинном введении.
Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см2) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. М., 1981. 157 с.). Пептид с общей формулой H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в обьеме 0,1 мл внутрибрюшинно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 ч между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 ч до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.
Выявленные эффекты представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1
Примечание: * показывает достоверные отличия, р <0,05, а рядом стоящая цифра -номера групп сравнения; n - количество животных в группе.
В условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении пептид H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH повышает число фибробластов в коже, что свидетельствует о его ранозаживляющей активности (табл. 1).
В условиях кожных ран при внутрибрюшинном введении пептид H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH стимулирует функцию нейтрофилов (ФЧ, НСТ) крови и повышает активность СОД, что свидетельствует о его иммуностимулирующей и антиоксидантной активности. При этом он обладает более выраженными эффектами по сравнению с тимогеном (табл. 2).
Пример 2. Эффекты пептида H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH при внутрикожном (местном) введении.
Крысам Вистар (10 животных) под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг внутрибрюшинно) на холке моделировали полнослойные раны стандартного размера (1 см2) (Амирасланов Ю.А., Матасов В.М., Хотинян В.Ф. Лечение ран в управляемой абактериальной среде. М., 1981. 157 с.). Пептид с общей формулой H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH растворяли в стерильном изотоничном растворе хлорида натрия и вводили животным в объеме 0,1 мл внутрикожно в разовой дозе 1,2 мкг/кг массы десятикратно (один раз в сутки) с интервалом в 24 ч между инъекциями. Последнее введение препаратов осуществляли за 12 ч до вывода животных из эксперимента. На следующий день после последнего введения крыс забивали обескровливанием под хлоралгидратным наркозом. Объектами исследования служили кровь и ткани кожи.
Выявленные эффекты представлены в табл. 3 и 4.
Таблица 3
В условиях кожных ран при внутрикожном введении пептид H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH повышает число фибробластов в коже, что свидетельствует о его ранозаживляющей активности. При этом он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном (табл. 3).
При внутрикожном введении пептид H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH стимулирует функцию ней-трофилов (ФЧ, НСТ) крови, повышает активность СОД и снижает уровень МДА, что свидетельствует о его иммуностимулирующей и антиоксидантной активности. При этом в отношении уровня МДА он обладает более выраженным действием по сравнению с тимогеном (табл. 4).
Таким образом, пептид, имеющий формулу HN-D-Ala-L-Glu-L-Trp-СООН, стимулирует процессы заживления ран, и при этом он обладает иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами как при внутрибрюшинном, так и при внутрикожном (местном) введениях.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Применение синтетического пептида общей формулы H2N-D-Ala-L-Glu-L-Trp-COOH в качестве ра-нозаживляющего средства, обладающего иммуностимулирующим и антиоксидантным эффектами.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025690
- 1 -
(19)
025690
- 1 -
(19)
025690
- 4 -
(19)
