|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Соединение формулы  в которой n представляет собой число 0, 1, 2 или 3; R 1 представляет собой водород, метил, этил, н-пропил или изопропил; R 2 представляет собой линейный или разветвленный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой, или его сольваты. 2. Соединение по п.1, которое отличается тем, что n представляет собой число 1 или 2; R 1 представляет собой водород или метил; R 2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой. 3. Соединение по любому из пп.1 и 2, которое отличается тем, что n представляет собой число 1 или 2; R 1 представляет собой водород; R 2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой. 4. Способ получения соединения формулы (I) или его сольватов по п.1, которое отличается тем, что соединение формулы (II)  в которой n и R 1 , каждый, имеют значение, как указано в п.1, вступает в реакцию с соединением формулы (III)  в которой R 2 имеет значение, как указано в п.1. 5. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, которые могут подвергаться терапии адреномедуллином. 6. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний. 7. Лекарственное средство, обладающее активностью адреномедуллина, содержащее соединение по любому из пп.1-3 в сочетании с инертным нетоксичным фармацевтически пригодным эксципиентом. 8. Лекарственное средство по п.7 для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний. 9. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемического и/или геморрагического инсульта, гипертонии, легочной гипертензии, окклюзионного заболевания периферических артерий, преэклампсии, хронической обструктивной болезни легких, астмы, острого и/или хронического отека легких, нейрогенного отека легких, острых и/или хронических легочных проявлений, вызванных радиацией, острых и/или хронических интерстициальных заболеваний легких, острого повреждения легких/острого респираторного дистресс-синдрома (ОПЛ/ОРДС) у взрослого или ребенка, включая новорожденных, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к пневмонии и сепсису, аспирационной пневмонии и ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к аспирации, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к вдыханию коптильного газа, синдрому острого посттрансфузионного повреждения легких (СОППЛ), ОПЛ/ОРДС или острой легочной недостаточности после операции, травмы и/или ожогов, вентиляторного повреждения легких (ВПЛ), повреждения легких, следующего за аспирацией мекония, легочного фиброза, горной болезни, гломерулонефрита, острого повреждения почек, лимфедемы, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, септического шока, синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) неинфекционного происхождения, анафилактического шока и/или крапивницы.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Соединение формулы в которой n представляет собой число 0, 1, 2 или 3; R 1 представляет собой водород, метил, этил, н-пропил или изопропил; R 2 представляет собой линейный или разветвленный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой, или его сольваты. 2. Соединение по п.1, которое отличается тем, что n представляет собой число 1 или 2; R 1 представляет собой водород или метил; R 2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой. 3. Соединение по любому из пп.1 и 2, которое отличается тем, что n представляет собой число 1 или 2; R 1 представляет собой водород; R 2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой. 4. Способ получения соединения формулы (I) или его сольватов по п.1, которое отличается тем, что соединение формулы (II) в которой n и R 1 , каждый, имеют значение, как указано в п.1, вступает в реакцию с соединением формулы (III) в которой R 2 имеет значение, как указано в п.1. 5. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, которые могут подвергаться терапии адреномедуллином. 6. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний. 7. Лекарственное средство, обладающее активностью адреномедуллина, содержащее соединение по любому из пп.1-3 в сочетании с инертным нетоксичным фармацевтически пригодным эксципиентом. 8. Лекарственное средство по п.7 для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний. 9. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемического и/или геморрагического инсульта, гипертонии, легочной гипертензии, окклюзионного заболевания периферических артерий, преэклампсии, хронической обструктивной болезни легких, астмы, острого и/или хронического отека легких, нейрогенного отека легких, острых и/или хронических легочных проявлений, вызванных радиацией, острых и/или хронических интерстициальных заболеваний легких, острого повреждения легких/острого респираторного дистресс-синдрома (ОПЛ/ОРДС) у взрослого или ребенка, включая новорожденных, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к пневмонии и сепсису, аспирационной пневмонии и ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к аспирации, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к вдыханию коптильного газа, синдрому острого посттрансфузионного повреждения легких (СОППЛ), ОПЛ/ОРДС или острой легочной недостаточности после операции, травмы и/или ожогов, вентиляторного повреждения легких (ВПЛ), повреждения легких, следующего за аспирацией мекония, легочного фиброза, горной болезни, гломерулонефрита, острого повреждения почек, лимфедемы, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, септического шока, синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) неинфекционного происхождения, анафилактического шока и/или крапивницы.
Евразийское 025631 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201400528
(22) Дата подачи заявки
2012.10.30
(51) Int. Cl.
A61K 47/48 (2006.01) A61K38/23 (2006.01) A61P 9/00 (2006.01) A61P29/00 (2006.01)
A61P 11/00 (2006.01)
(54) ПРОЛЕКАРСТВО АДРЕНОМЕДУЛЛИНА НА ОСНОВЕ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 11187735.3
(32) 2011.11.03
(33) EP
(43) 2014.10.30
(86) PCT/EP2012/071507
(87) WO 2013/064508 2013.05.10
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БАЙЕР ФАРМА
АКЦИЕНГЕЗЕЛЬШАФТ; БАЙЕР ИНТЕЛЛЕКТЧУАЛ ПРОПЕРТИ ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Фламме Инго, Кёбберлинг Иоганнес, Лерхен Ханс-Георг, Грибенов Нильс, Шоэ-Лоп Рудольф, Виттрок Свен, Кёлльнбергер Мария, Вундер Франк, Редлих Горден, Кнорр Андреас (DE), Марли Джули, Притчард Айан (GB)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(56) NAGAYA N. ET AL.: "Adrenomedullin in the treatment of pulmonary hypertension", PEPTIDES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 25, no. 11, 1 November 2004 (2004-11-01), pages 2013-2018, XP004610743, ISSN: 0196-9781, DOI: 10.1016/ J.PEPTIDES.2004.07.007, cited in the application, the whole document
CALICETI P. ET AL.: "Pharmacokinetic and Biodistribution Properties of Poly(ethylene glycol)-Protein Conjugates", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, ELSEVIER BV,
AMSTERDAM, NL, vol. 55, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 1261-1277, XP003001867, ISSN: 0169-409X, DOI: 10.1016/
S0169-409X(03)00108-X, cited in the application, the whole document
EP-A2-0296811
(57) Изобретение относится к новому пролекарству адреномедуллина на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ), к способам его получения, к его применению для лечения и/или профилактики заболеваний, и к его применению для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний, особенно сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний.
Изобретение относится к новому пролекарству адреномедуллина на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ), к способам его получения, к его применению для лечения и/или профилактики заболеваний, и к его применению для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний, особенно сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний.
52-аминокислотный пептидный гормон адреномедуллин (ADM) вырабатывается в надпочечниках, легких, почках, сердечной мышце и других органах. Уровни в плазме ADM находятся в нижнем пикомо-лярном диапазоне. ADM является членом кальцитонина ген-связанного пептида (CGRP) семьи пептидов и как таковой связывается с гетеродимерным рецептором G-белка, который состоит из CRLR и RAMP 2 или 3 (рецептор подобный рецептору кальцитонина и рецептор, модифицирующий активность белка 2 или 3).
Активация рецептора ADM приводит к внутриклеточному повышению аденозин-3',5'-циклического монофосфата (цАМФ) в клетках, несущих рецептор. Рецепторы ADM присутствуют на различных типах клеток в практически всех органах, включая эндотелиальные клетки. ADM, как полагают, метаболизиру-ется нейтральной эндопептидазой и преимущественно очищается в легких, где ADM-рецепторы экспрес-сируются на высоком уровне [см. Gibbons С., Dackor R., Dunworth W., Fritz-Six K., Caron K.M., Mol. Endocrinol. 21(4), 783-796 (2007)].
Экспериментальные данные из литературы показывают, что ADM участвует в различных функциональных ролях, которые включают, в частности, регулирование кровяного давления, бронходилатацию, функции почек, секрецию гормона, рост клеток, дифференцировку, нейротрансмиссию и модуляцию иммунной реакции. Кроме того, ADM играет важную роль в качестве аутокринного фактора во время пролиферации и регенерации эндотелиальных клеток [см. Garcia M.A., Martin-Santamaria S., de Pascual-Teresa В., Ramos A., Julian M., Martinez A., Expert Opin Ther Targets, 10(2), 303-317 (2006)].
Существует обширная совокупность доказательств из литературы, что показывает, что ADM является необходимым условием для функции невредимости эндотелиального барьера и что введение ADM сверхфизиологическим уровням оказывает сильное противоотечное и противовоспалительное действие при различных воспалительных заболеваниях у экспериментальных животных, включая сепсис, острое повреждение легких и воспаление кишечника [см. Temmesfeld-Wollbruck В., Hocke A.C, Suttorp N., Hip-penstiel S., Thromb Haemost; 98, 944-951 (2007)].
Клинические испытания ADM до сих пор проводились при сердечно-сосудистых показаниях с измеримой гемодинамической конечной точкой, такой как легочная гипертензия, гипертензия, сердечная недостаточность и острый инфаркт миокарда. ADM продемонстрировал гемодинамическое действие в несколько исследованиях у пациентов, страдающих от вышеупомянутых состояний. Тем не менее, эффект был только краткосрочным и сразу заканчивался после окончания введения. Эти выводы хорошо коррелируют с известным фармакокинетическим профилем ADM. Фармакодинамическое действие включало, среди прочего, понижение системного и легочного артериального давления и увеличение минутного объема сердца [Troughton R.W., Lewis L.K., Yandle T.G., Richards A.M., Nicholls M.G., Hypertension, 36(4), 588-93 (2000); Nagaya N., Kangawa K., Peptides,. 25(11), 2013-8 (2004); Kataoka Y., Miyazaki S., Yasuda S., Nagaya N., Noguchi Т., Yamada N., Morii I., Kawamura A., Doi K., Miyatake K., Tomoike H., Kangawa K., J. Cardiovasc Pharmacol, 56(4), 413-9 (2010)].
Таким образом, на основе полученных из обилия экспериментальных данных при клинических испытаниях с животными и первых клинических испытаниях с повышением человеческого ADM для сверхфизиологических уровней может рассматриваться как целевой механизм для лечения различных болезненных состояний у людей и животных. Тем не менее, основные ограничения применения ADM в качестве терапевтического средства являются неудобной применимостью непрерывной инфузионной терапии, что исключает возможность его использования для большинства потенциальных показаний и потенциально ограниченных пределов безопасности по отношению к гипотонии, которые могут возникнуть в результате болюсных введений ADM.
Заданием настоящего изобретения является обеспечение новых соединений, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, в частности, сердечно-сосудистых, отечных и воспалительных заболеваний.
Многие терапевтически активные пептиды или белки страдают от высокого клиренса в естественных условиях. Существуют несколько подходов для формирования инъекционных депо таких препаратов, которые предусматривают использование макромолекул.
Полимерные матрицы, которые содержат молекулу лекарства в не ковалентно-связанном состоянии являются хорошо известными. Они также могут быть введены, как гидрогели, микрочастицы или мицеллы. Кинетики высвобождения таких лекарственных средств могут быть весьма ненадежными с высокой изменчивостью среди пациентов. Производство таких полимеров может нанести вред чувствительному веществу лекарства или может подвергаться побочным реакциям с полимером во время его деградации (D.H. Lee et al., J. Contr. Rel., 2003, 92, 291-299).
Постоянное ПЭГилирование пептидов или белков для повышения их растворимости, снижения им-муногенности и увеличения периода полураспада и за счет снижения почечного клиренса является хорошо известной концепцией с начала 1980-х годов (Caliceti P.,Veronese F.M., Adv. Drug Deliv. Rev.2003,
55, 1261-1277). Для нескольких препаратов это использовалось с успехом, но с большим количеством примеров ПЭГилирование снижает эффективность лекарственного вещества до такой степени, что это понятие больше не является пригодным (Т. Peleg-Shulman et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 4897-4904).
Подходящей альтернативой являются пролекарства на основе полимера. Нынешние определения для пролекарств в соответствии с МСТПХ (IUPAC) утверждены следующими терминами (International Union of Pure and Applied Chemistry and International Union of Biochemistry: GLOSSARY OF TERMS USED в MEDICINAL CHEMISTRY (Recommendations 1998); в Pure & Appl. Chem. vol. 70, No. 5, 1998, p.
1129-1143).
Пролекарство. Пролекарство является любым соединением, которое подвергается биотрансформации перед проявлением его фармакологических эффектов. Пролекарства, таким образом, можно рассматривать как лекарственные средства, содержащие специализированные нетоксичные защитные группы, используемые переходным образом для изменения или устранения нежелательных свойств в исходной молекуле.
Пролекарство, связанное с носителем (пролекарство носитель). Связанное с носителем пролекарст-во является пролекарством, которое содержит временную связь заданного активного вещества с переходной группой носителя, которая производит улучшенные физико-химические или фармакокинетиче-ские свойства и которые могут быть легко удалены в естественных условиях, как правило, путем гидролитического расщепления.
Каскадное пролекарство. Каскадное пролекарство является пролекарством, для которого расщепление группы носителя становится эффективным только после демаскирования активирующей группы.
Некоторые примеры пролекарств носителя на основе ПЭГ существуют, большинство из них с необходимостью ферментативной активации линкера между активным лекарственным средством и носителем, в основном, инициированной посредством ферментативного гидролиза. Поскольку сложные эфиры расщепляются очень легко и непредсказуемо в естественных условиях, прямые эфирные линкеры для лекарства носителя имеют ограничения к их применимости (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug
discovery, 2008, 7, 255-270).
Часто используемые альтернативные подходы представляют собой каскадные линкеры, присоединенные к функциональности амина в пептиде или белке. В каскадных линкерах маскирующая группа должна быть удалена, как стадия ограничения скорости в каскаде. Это активизирует разложение линкера во втором положении, чтобы освободить пептид или белок. Обычно маскирующая группа может быть удалена с помощью ферментативного механизма (R.B. Greenwald et al. в WO 2002/089789, Greenwald, et al., J. Med. Chem. 1999, 42, 3657-3667, F.M.H. DeGroot et al. в WO 2002/083180 и WO 2004/043493, и D. Shabat et al. в WO 2004/019993).
Альтернатива, которая не полагается на ферментативную активацию является концепцией У. Хер-сель и соавт. в WO 2005/099768. в их подходе маскирующая группа на феноле удаляется чисто рН-зависимым образом путем атаки внутреннего нуклеофила. Это активизирует линкер для дальнейшего разложения.
Как отмечено У. Херселем и соавт. в WO 2005/099768, "Недостаток в вышеуказанных системах пролекарств, описанный Гринвальдом, ДеГрутом и Шабатом, является высвобождением потенциально токсичных ароматических малых молекул боковых продуктов, таких как хинонметиды, после расщепления временной связи. Потенциально токсичные вещества высвобождаются в 1:1 стехиометрии с лекарством и могут предполагать высокие концентрации в естественных условиях". Та же проблема также относится и к системе по У. Херсель и соавт.
Для небольших органических молекул существует множество различных подходов пролекарствен-ных (J. Rautio et al., Nature Reviews Drug discovery, 2008, 7 255-270). Подход, используемый У. Херселем и соавт. как механизм высвобождения для их маскировочной группы, был использован в качестве проле-карственного подхода для фенольных групп малых молекул, начиная с конца 1980-х годов (W.S. Saari в ЕР 0296811 и W.S. Saari et al., J. Med. Chem. 1990, vol. 33, No 1, p. 97-101).
Альтернативная пролекарственная система на основе амина базируется на медленном гидролизе бис-гидроксиэтил глицина в качестве каскадного пролекарства. Гидроксигруппы бис-гидроксиэтил глицина замаскированы с помощью сложных эфиров, которые склонны к гидролизу эстераз (R. Greenwald et al., J. Med. Chem. 2004, 47, 726-734 и D. Vetter et al. в WO 2006/136586).
Меченые производные адреномедуллина для использования в качестве изображения, а также терапевтического агента, являются известными (J. Depuis et al. в СА 2567478 и WO 2008/138141). В этих производных ADM комплексообразующая клетка, как молекулярная структура, способная связывать радиоактивные изотопы, была присоединена к N-концу ADM непосредственным образом или через спейсерс-ную область потенциально также короткие ПЭГ спейсеры. Диагностическая или терапевтическая ценность этих лекарств возникает из целевой доставки радиоактивной молекулы.
В отличие от пролекарственных подходов, перечисленных выше, которые все основываются на маскировке функциональных аминов, настоящее изобретение основано на маскировке фенольной группы тирозина в ADM. Используется связанное с носителем пролекарство, основанное на поддержке внутреннего нуклеофила расщепления карбамата на этой фенольной группе. Ключевым преимуществом дру
гих классов пролекарств, упомянутых выше, является токсикологическая безвредность линкерного продукта разложения, циклической мочевины, прочно прикрепленной к носителю. Кроме того, разложение пролекарства не зависит от ферментативных механизмов, которые могут вызвать высокую изменчивость кинетики расщепления среди пациентов. Механизм расщепления исключительно зависит от рН в качестве внутреннего амина, который протонируется, когда кислый рН активируется, когда более высокий (нейтральный) рН действует в качестве нуклеофила, атакующего фенольный карбамат на основе тирозина.
В контексте настоящего изобретения соединения описаны как те, которые действуют как ADM-пролекарства медленного высвобождения с расширенной продолжительностью фармакологического действия по сравнению с ADM и которые на основании этого конкретного механизма действия - после парентерального введения - в естественных условиях демонстрируют устойчивые антивоспалительные и гемодинамические эффекты, такие как стабилизация функции эндотелиального барьера, и снижение артериального давления соответственно.
Настоящее изобретение обеспечивает соединения формулы
где n представляет собой число 0, 1, 2 или 3;
R1 представляет собой водород, метил, этил, н-пропил или изопропил;
R2 представляет собой линейный или разветвленный ПЭГ 20-80 кДа, эндкепированный метокси-группой,
и их соли, их сольваты и их сольваты солей.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением представляют собой соединения формулы (I) и их соли, их сольваты и их сольваты солей, соединения, которые охватывает формула (I) и являются соединениями формул, которые указаны ниже и их солями, сольватами и сольватами солей, и соединения которые охватывает формула (I) и которые указаны ниже в качестве рабочих примеров и их соли, сольваты и сольваты солей, если соединения, которые охватывает формула (I) и которые указаны ниже, не являются еще солями, сольватами и сольватами солей.
В зависимости от их структуры, соединения в соответствии с настоящим изобретением могут существовать в стереоизомерных формах (энантиомеры, диастереомеры). Таким образом, изобретение охватывает энантиомеры или диастереомеры и их особые смеси. Стереоизомерно однородные компоненты могут быть выделены известным способом из таких смесей энантиомеров и/или диастереомеров.
Если соединения в соответствии с настоящим изобретением могут существовать в таутомерных формах, настоящее изобретение охватывает все таутомерные формы.
В контексте настоящего изобретения предпочтительными солями являются физиологически приемлемые соли соединений в соответствии с настоящим изобретением. Также включены соли, которые не подходят как таковые для фармацевтической промышленности, но, например, могут быть использованы для выделения или очистки соединений в соответствии с настоящим изобретением.
Физиологически приемлемые соли соединений в соответствии с настоящим изобретением включают кислотно-аддитивные соли минеральных кислот, карбоновые кислоты и сульфоновые кислоты, например соли соляной кислоты, бромисто-водородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, бензолсульфоно-вой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропио-новой кислотой, молочной кислотой, винной кислотой, малеиновой кислотой, лимонной кислотой, фу-маровой кислоты, малеиновой кислоты и бензойной кислоты.
Физиологически приемлемые соли соединений в соответствии с настоящим изобретением также включают соли стандартных оснований, например и предпочтительно соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли щелочно-земельных металлов (например, соли магния и кальция) и соли аммония, полученные из аммиака или органических аминов, содержащих от 1 до 16 атомов углерода, например и предпочтительно этиламин, триэтиламин, диэтиламин, этилдиизопропиламин, моноэтанола-мин, диэтаноламин, триэтаноламин, дициклогексиламин, диметиламиноэтанол, прокаин, дибензиламин, N-метилморфолин, аргинин, лизин, этилендиамин и N-метилпиперидин.
В контексте данного изобретения сольваты относятся к тем формам соединений в соответствии с настоящим изобретением, которые, в твердом или жидком состоянии, образуют комплекс по координации с молекулами растворителя. Гидраты представляют собой специфическую форму сольватов, где происходит координация с водой. Предпочтительными сольватами в контексте настоящего изобретения являются гидраты.
В контексте данного изобретения эндкепированная указанная в R2 метоксигруппа значит, что поли-этиленгликоль (ПЭГ) является замещенным с помощью метоксигруппы на конце, который не присоединен к кислороду, т.е. ПЭГ 40 кДа-ОМе.
Предпочтение отдается соединениям формулы (I), в которой
n представляет собой число 1 или 2;
R1 представляет собой водород или метил;
R2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа, эндкепированный метоксигруппой. Предпочтение также отдается соединениям формулы (I), в которой n представляет собой число 1 или 2; R1 представляет собой водород;
R2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа, эндкепированный метоксигруппой.
Предпочтение также отдается соединениям формулы (I), в которой n представляет собой число 1.
Предпочтение также отдается соединениям формулы (I), в которой R1 представляет собой водород.
Предпочтение также отдается соединениям формулы (I), в которой атом углерода, к которому заместитель -NHR1 присоединен, имеет S конфигурацию.
Предпочтение также отдается соединениям формулы (I), в которой R2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа, эндкепированный метоксигруппой.
Предпочтение также отдается соединениям формулы (I), которые имеют структуру формулы (1а)
где n, R1 и R2, каждый, имеют значение, указанное выше, и их соли, их сольваты и их сольваты солей.
Конкретные определения радикалов, приведенные в конкретных комбинациях или предпочтительных комбинациях радикалов, независимо от конкретной комбинации указанного радикала, также является замененным каким-либо из определений радикала других комбинаций.
Особое предпочтение отдается комбинациям двух или более из вышеуказанных предпочтительных
в которой n и R1, каждый, имеют значение, указанное выше, поддают реакции с соединениями формулы (III)
в которой R2 имеет значение, указанное выше.
Реакцию обычно осуществляют в инертных растворителях, предпочтительно в диапазоне темпера-
диапазонов.
тур от 0 до 50°С при нормальном давлении.
Инертные растворители представляют собой, например, цитратные буферы, глицин-гидрохлоридные буферы, фталатовые буферы или ацетатные буферы со значением рН от 3 до 5, предпочтение отдается цитратному буферу со значением рН 4.
Соединение формулы (III) является известным и может быть синтезировано с помощью известных методик из соответствующих исходных соединений.
Соединения формулы (II) являются известными или могут быть получены с помощью реакции с соединениями формулы (IV)
и на второй стадии с кислотой.
Реакцию на первой стадии, как правило, осуществляют в среде инертных растворителей, в присутствии дегидратирующего реагента, необязательно в присутствии основания, предпочтительно в диапазоне температур от комнатной температуры до 70°С при нормальном давлении.
Инертные растворители представляют собой, например, галогенированные углеводороды, такие как дихлорметан, трихлорметан или 1,2-дихлорэтан, простые эфиры, такие как диоксан, тетрагидрофуран или 1,2-диметоксиэтан, или другие растворители, такие как ацетон, диметилформамид, диметилацета-мид, 2-бутанон или ацетонитрил. В равной степени возможно использовать смеси растворителей. Предпочтение отдается диметилформамиду.
Пригодными дегидратирующими реагентами в данном контексте являются, например, карбодиими-ды, например, N, N'-диэтил-, ^№-дипропил-, ^№-диизопропил, ^№-дициклогексилкарбодиимид, N-(3-диметиламиноизопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC), №циклогексилкарбодиимид-№-пропилоксиметилполистирол (PS- карбодиимид), или карбонильные соединения, такие как карбонил-диимидазол, или 1,2-оксазолийные соединения, такие как 2-этил-5- фенил-1,2-оксазолий 3-сульфат или 2- трет-бутил-5-метилизоксазолий перхлорат, или соединения ациламино, такие как 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин, или пропанфосфорный ангидрид, или изобутил хлорформиата, или бис-(2-оксо-3-оксазолидинил) фосфорилхлорид или бензотриазолилокситри(диметиламино)фосфоний, или О-(бензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетраметилуроний гексафторфосфат (HBTU), бензотриазол-1-ил-№ тетраметилуроний тетрафторборат (TBTU), 2-(2-оксо-1-(2Н)-пиридил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетраф-торборат (TPTU) или О-(7-азабензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетраметилуроний гексафторфосфат (HATU), или 1-гидроксибензотриазол (HOBt), или бензотриазол-1-илокситрис-(диметиламино)фосфоний гексафторфосфат (ВОР), или бензотриазол-1-илокситрис-(пирролидино)фосфоний гексафторфосфат (PYBOP), или N-гидроксисукцинимид, или их смеси с основаниями.
Основаниями являются, например, карбонаты щелочных металлов, например, карбонат натрия или карбонат калия, углеводороды натрия или калия, или органические основания, таких как триалкиламины, например, триэтиламин, N-метилморфолин, N-метилпиперидин, 4-диметиламинопиридин или N,N-диизопропилэтиламин, предпочтение отдается ^^диизопропилэтиламину.
Предпочтительно конденсацию осуществляют с TBTU в присутствии ^^диизопропилэтиламина.
Реакцию второй стадии необязательно осуществляют в среде инертных растворителей, предпочтительно в диапазоне температур от комнатной температуры до 60°С при нормальном давлении.
Инертные растворители представляют собой, например, галогенированные углеводороды, такие как
дихлорметан, трихлорметан, тетрахлорид углерода или 1,2-дихлорэтан, или простые эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан, предпочтение отдается дихлорметану.
Кислоты представляют собой, например, трифторуксусную кислоту или водород хлорид в диокса-не, предпочтение отдается концентрированной трифторуксусной кислоте. Концентрированная трифто-руксусная кислота может быть использована с добавлением очистителей, таких как вода, фенол, тиоани-зол и 1,2-этандиол. Предпочтение отдается 1 до 5% каждого из этих очистителей.
Соединение формулы (V) является известным и может быть синтезировано с помощью известных методик из соответствующих исходных соединений (пример 14А).
Соединения формулы (IV) являются известными и могут быть получены посредством реакции с соединениями формулы (VI)
в которой n и R1, каждый, имеют значение, указанное выше, с источником палладия(0) восстанавливающего агента.
Реакцию обычно осуществляют в инертных растворителях, необязательно в присутствии слабого основания, предпочтительно в диапазоне температур от 0 до 50°С при нормальном давлении.
Инертные растворители представляют собой, например, галогенированные углеводороды, такие как дихлорметан, трихлорметан или 1,2-дихлорэтан, простые эфиры, такие как диоксан, тетрагидрофуран или 1,2-диметоксиэтан, или другие растворители, такие как ацетон, диметилформамид, диметилацета-мид, 2-бутанон или ацетонитрил. В равной степени возможно использовать смеси растворителей. Предпочтение отдается тетрагидрофурану.
Источники палладия(0), например, представляют собой тетракис-(трифенилфосфин)палладий(0), трис-(дибензилиденацетон)дипалладий(0) или источники палладия(П), которые восстанавливаются in situ, до палладия(0) в процессе реакции, предпочтение отдается тетракис-(трифенилфосфин)палладию(0).
Восстановителями являются, например, муравьиная кислота или триэтилсилан, предпочтение отдается муравьиной кислоте.
Основами являются, например, триэтиламин, ^^диизопропилэтиламин или раствор фосфата калия, предпочтение отдается триэтиламину.
в которой n и R1, каждый, имеют значение, указанное выше, с соединением формулы (VIII)
Соединения формулы (VI) являются известными и могут быть получены с помощью реакции соединений формулы (VII)
Реакцию обычно осуществляют в инертных растворителях, в присутствии дегидратирующего реагента, необязательно в присутствии основания, предпочтительно в диапазоне температур от комнатной температуры до 70°С при нормальном давлении.
Инертные растворители представляют собой, например, галогенированные углеводороды, такие как, дихлорметан, трихлорметан или 1,2-дихлорэтан, простые эфиры, такие как диоксан, тетрагидрофу-ран или 1,2-диметоксиэтан, или другие растворители, такие как, ацетон, диметилформамид, диметилаце-тамид, 2-бутанон или ацетонитрил. В равной степени возможно использовать смеси растворителей. Предпочтение отдается дихлорметану.
Пригодными дегидратирующими агентами в данном контексте являются, например, карбодиимиды, например ^№-диэтил-, ^№-дипропил-, ^№-диизопропил, N,N'-дицикло гексилкарбодиимид, N-(3-диметиламиноизопропил)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC), №циклогексилкарбодиимид-№-пропилоксиметилполистирол (PS-карбодиимид), или карбонильные соединения, такие как карбонилдии-мидазол, или 1,2-оксазолийные соединения, такие как 2-этил-5-фенил-1,2-оксазолий 3-сульфат или 2-трет-бутил-5-метилизоксазолий перхлорат, или ациламино соединения, такие как 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин, или пропанфосфоновый ангидрид, или изобутил хлорформиат, или бис-(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфорилхлорид или бензотриазолилокситри(диметиламино)фосфоний гексафторфосфат, или О-(бензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетраметилуроний гексафторфосфат (HBTU), бензотриазол-1-ил-N-тетраметил-уроний тетрафторборат (TBTU), 2-(2-оксо-1-(2Н)-пиридил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборат (TPTU) или О-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний гексафторфосфат (HATU), или 1-гидроксибензотриазол (HOBt), или бензотриазол-1-илокситрис-(диметиламино)фосфоний гексафторфосфат (ВОР), или бензотриазол-1-илокситрис-(пирролидино)фосфоний гексафторфосфат (PYBOP), или N-гидроксисукцинимид, или их смеси с основаниями.
Основаниями являются, например, карбонаты щелочных металлов, например карбонат натрия или карбонат калия, или гидрокарбонат натрия или калия, или органические основания, такие как триалки-ламины, например, триэтиламин, N-метилморфолин, N-метилпиперидин, 4-диметиламинопиридин или ^^диизопропилэтиламин, предпочтение отдается N,N-диизопропилэтиламину.
Предпочтительно конденсацию осуществляют с HATU в присутствии ^^диизопропилэтиламина.
Соединения формулы (VII) и (VIII) являются известными или могут быть синтезированы известными методиками из соответствующих исходных соединений.
Получение соединений в соответствии с настоящим изобретением можно проиллюстрировать следующей схемой синтеза.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением демонстрируют непредвиденный полезный спектр фармакологической активности.
Соответственно, они являются пригодными для использования в качестве лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний, в организме человека и животных.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением отличаются как специфические пролекарст-ва, которые выделяют адреномедуллин (ADM).
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ использования соединений в соответствии с настоящим изобретением для лечения и/или профилактики заболеваний, особенно сердечнососудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний.
Для настоящего изобретения термин "лечение" или "терапия" включает ингибирование, задержку, освобождение, смягчение, прекращение, уменьшение, или вызов регрессии болезни, расстройства, заболевания, или состояния, их развития и/или прогрессирования, и/или их симптомов. Термин "предупреждение" или "предотвращение" включает снижение риска иметь, заразиться или испытывать, болезнь, расстройство, заболевание, или состояние, их развитие и/или прогрессирование, и/или их симптомы. Термин предупреждение включает профилактику. Лечение или предупреждение болезни, расстройства, заболевания, или состояния может быть частичным или полным.
На основе их фармакологических свойств соединения в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, в частности сердечной недостаточности, особенно хронической и острой сердечной недостаточности, диастоли-ческой и систолической (застойная) сердечной недостаточности, острой декомпенсированной сердечной недостаточности, сердечной слабости, ишемической болезни сердца, стенокардии, инфаркта миокарда, травмы ишемии/реперфузии, ишемического и геморрагического инсульта, артериосклероза, атеросклероза, гипертензии, особенно гипертонической гипертензии, злокачественной гипертонической гипертензии, вторичной гипертензии, вазоренальной артериальной гипертензии и гипертензии вторичной по отношению к почечным и эндокринным расстройствам, гипертонической болезни сердца, гипертонического заболевания почек, легочной гипертензии, в особенности, вторичной легочной гипертензии, легочной гипертензии следующей за легочной эмболией с и без острого легочного сердца, первичной легочной гипертензии, и окклюзионного заболевания периферических артерий.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики гестационного [вызванного беременностью] отека и протеинурии с и без гипертонии (преэклампсии).
Соединения в соответствии с настоящим изобретением являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики заболеваний легких, таких как хроническая обструктивная болезнь легких, бронхиальная астма, острый и хронический отек легких, аллергический альвеолит и пневмонит, вызванный вдыхаемыми органической пыли и частицами грибков актиномицетного или иного происхождения, острый химический бронхит, острый и хронический химический отек легких (например, после вдыхания фосгена, окиси азота), нейрогенный отек легких, острые и хронические легочные проявления, вызванные
радиацией, острые и хронические межтканевые болезни легких (например, но не ограничиваясь ими, межтканевые болезни легких, вызванные наркотиками, например, вторичные по отношению к лечению с помощью блеомицина), острое повреждение легких/острый респираторный дистресс-синдром (ОПЛ/ОРДС) у взрослого или ребенка, включая новорожденных, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к пневмонии и сепсису, аспирационная пневмония и ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к аспирации (например, но не ограничиваясь, аспирационная пневмония из-за выплюнутого содержимого желудка), ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к вдыханию коптильного газа, синдром острого посттрансфузион-ного повреждения легких (СОППЛ), ОПЛ/ОРДС или острая легочная недостаточность после операции, травмы или ожогов, вентиляторное повреждение легких (ИВЛ), повреждение легких, следующее за аспирацией мекония, легочный фиброз и горная болезнь.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики хронического заболевания почек (этапы 1-5), почечной недостаточности, диабетической нефропатии, гипертонического хронического заболевания почек, гломерулонефрита, быстро прогрессирующего и хронического почечного синдрома, неспецифического почечного синдрома, нефро-тического синдрома, наследственной нефропатии, острого и хронического тубуло-интерстициального нефрита, острого повреждения почек, острой почечной недостаточности, посттравматической почечной недостаточности, травматического и послеоперационного повреждения почек, кардиоренального синдрома, и для защиты и улучшение функции трансплантатов почек.
Соединения являются также пригодными для лечения и/или профилактики сахарного диабета и его последовательных симптомов, таких как, например, диабетическая макро- и микроангиопатия, диабетическая нефропатия и нейропатия.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут также быть использованы для лечения и/или профилактики заболеваний центральной и периферической нервной системы, таких как вирусный и бактериальный менингит и энцефалит (например, лишайный энцефалит), черепно-мозговая травма, первичные или вторичные [метастазы] злокачественные новообразования головного мозга и спинного мозга, радикулит и полирадикулит, синдром Гийена-Барре [острый (пост-) инфекционный полиневрит, синдром Миллера-Фишера], боковой амиотрофический склероз [прогрессивная спинная атрофия мышц], болезнь Паркинсона, острые и хронические полиневропатии, боль, отек мозга, болезнь Альцгей-мера, дегенеративные заболевания нервной системы и демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы, такие как, но не ограничиваясь, рассеянный склероз.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики портальной гипертензии и фиброза печени [цирроз] и его осложнений, таких как варикозное расширение вен пищевода и асцит, для лечения и/или профилактики плевральных выпотов вторичных по отношению к злокачественным опухолям или воспалений и для лечения и/или профилактики лимфедемы и отека, вторичного по отношению к варикозному расширению вен.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как, воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, и токсичные расстройства кишок.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики сепсиса, септического шока, синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) неинфекционного происхождения, геморрагического шока, сепсиса или ССВР с органной дисфункцией или полиорганной недостаточностью (MOF), травматического шока, токсического шока, анафилактического шока, крапивницы, аллергий, связанных с кусающими и жалящими насекомыми, отека Квинке [гигантская крапивница, отек Квинке], острого ларингита и трахеита, и острого обструктивного ларингита [круп] и эпиглоттита.
Соединения являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики заболеваний ревматического типа и других форм болезни, которые считаются аутоиммунными заболеваниями, таких как, но не ограничиваясь, полиартрит, красная волчанка, склеродермия, пурпура и васкулит.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением являются, кроме того, пригодными для лечения глазной гипертензии (глаукома), диабетической ретинопатии и макулярного отека.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут кроме того быть использованы для лечения и/или профилактики связанных с операциями состояний ишемии и его последовательных симптомов после хирургических вмешательств, в частности вмешательств на сердце с использованием аппарата искусственного кровообращения (например, операции с отключением, имплантаты клапана сердца), вмешательств на сонных артериях, вмешательств на аорте и вмешательств с инструментным открытием или проникновением черепного свода.
Соединения являются, кроме того, пригодными для общего лечения и/или профилактики в случае хирургических вмешательств с целью ускорения заживления раны и сокращения времени реконвалес-ценции. Они также подходят для улучшения заживления ран.
Соединения являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики расстройств плотности костной ткани и структуры, таких как, но не ограничиваясь, остеопороз, остеомаляция и болезни костей, связанные с гиперпаратиреозом.
Соединения являются, кроме того, пригодными для лечения и/или профилактики сексуальных дисфункций, в частности эректильной дисфункции у мужчин.
Предпочтительные соединения являются пригодными для лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, ишемического и/или геморрагического инсульта, гипертонии, легочной гипертензии, окклюзионного заболевания периферических артерий, преэклампсии, хронической обструктивной болезни легких, астмы, острого и/или хронического отека легких, аллергического альвеолита и/или пневмонита, вызванного вдыханием органической пыли или частиц грибков ак-тиномицетного или иного происхождения, и/или острого химического бронхита, острого и/или хронического химического отека легких, нейрогенного отека легких, острых и/или хронических легочных проявлений, вызванных радиацией, острых и/или хронических интерстициальных заболеваний легких, острого повреждения легких/острого респираторного дистресс-синдрома (ОПЛ/ОРДС) у взрослого или ребенка, включая новорожденных, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к пневмонии и сепсису, аспирационной пневмонии и ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к аспирации, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к вдыханию коптильного газа, синдрома острого посттрансфузионного повреждения легких (СОППЛ), ОПЛ/ОРДС или острой легочной недостаточности после операции, травмы и/или ожогов, вентиляторного повреждения легких (ИВЛ), повреждения легких, следующего за аспирацией мекония, легочного фиброза и горной болезни, хронических заболеваний почек, гломерулонефрита, острого повреждения почек, кардиоренального синдрома, лимфедемы, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, септического шока, синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) неинфекционного происхождения, анафилактического шока, воспалительного заболевания кишечника и/или крапивницы.
Более предпочтительные соединения являются пригодными для лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, гипертонии, легочной гипертензии, астмы, острого и/или хронического химического отека легких, острого повреждения легких/острого респираторного дистресс-синдрома (ОПЛ/ОРДС) у взрослых или детей, включая новорожденных, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к пневмонии и сепсису, аспирационной пневмонии и ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к аспирации, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к вдыханию коптильного газа, синдрома острого посттрансфузион-ного повреждения легких (СОППЛ), ОПЛ/ОРДС и/или острой легочной недостаточности после операции, травмы и или ожогов, и/или вентиляторного повреждения легких (ИВЛ), повреждения легких, следующего за аспирацией мекония, сепсиса, септического шока, синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) неинфекционного происхождения, анафилактического шока, воспалительного заболевания кишечника и/или крапивницы.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ использования соединений в соответствии с настоящим изобретением для лечения и/или профилактики заболеваний, в частности, нарушений, упомянутых выше.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ использования соединений в соответствии с настоящим изобретением для приготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, в частности, нарушений, упомянутых выше.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ для лечения и/или профилактики заболеваний, в частности, нарушений, упомянутых выше, с использованием активного количество соединений, в соответствии с настоящим изобретением.
Кроме того, изобретение обеспечивает лекарственные средства, содержащие соединение в соответствии с изобретением и один или более дополнительный активный компонент, в частности, для лечения и/или профилактики расстройств, указанных выше. Примерными и предпочтительными комбинациями активных компонентов являются:
Ингибиторы АПФ, антагонисты рецепторов ангиотензина, агонисты рецептора бета-2, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты рецептора глюкокортикоидов, диуретики, или рекомбинантный ангиотен-зин, превращающий энзим-2 или ацетилсалициловую кислоту (аспирин).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединения в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации с ингибитором АПФ, таким как, в качестве приведения примера и для выражения предпочтения, эналаприл, хинаприл, каптоприл, лизиноприл, рамиприл, делаприл, фози-ноприл, периндоприл, цилазаприл, имидаприл, беназеприл, моэксиприл, спираприл или трандоприл.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединения в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации с антагонистом рецепторов ангиотензина, таким как, в качестве приведения примера и для выражения предпочтения, лозартан, кандесартан, валсартан, телмисартан или эм-бусартан.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединения в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации с агонистом бета-2 рецепторов, таким как, в качестве приведения примера и для выражения предпочтения, сальбутамол, пирбутерол, сальметерол, тербуталин, фенотерол, тулобутерол, кленбутерол, репротерол или формотерол.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединения в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации с ингибитором фосфодиэстеразы (ФДЭ), таким как, в качестве приведения примера и для выражения предпочтения, милринон, амринон, пимобендан, цилостазол, силде
нафил, варденафил или тадалафил.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединения в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации с агонистом рецепторов глюкокортикоидов, таким как, в качестве приведения примера и для выражения предпочтения, кортиозол, кортизон, гидрокортизон, преднизон, преднизолон метил-преднилиден, дефлазакорт, флуокортолон, триамцинолон, дексаметазон или бетаме-тазон.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения соединения в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации с диуретиками, такими как, в качестве приведения примера и для выражения предпочтения, фуросемид, торасемид и гидрохлортиазид.
Настоящее изобретение также относится к лекарственным средствам, которые содержат по меньшей мере одно соединение в соответствии с изобретением, обычно вместе с одним или более инертным, нетоксичным, фармацевтически пригодным носителем, и к их применению для вышеуказанных целей.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут действовать системно и/или местно. Для этой цели они могут быть введены подходящим образом, например, парентеральным, легочным, назальным, подъязычным, язычным, буккальным, кожным, трансдермальным, конъюнктивальным, глазным путем, или в виде имплантата или стента.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут быть введены в лекарственных формах, пригодных для этих путей введения.
Парентеральное введение может происходить с избеганием стадии абсорбции (например, внутривенно, внутриартериально, внутрисердечно, интраспинально или интралюмбально) или с включением абсорбции (например, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, чрескожно или внутрибрюшинно). Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают препараты для инъекций и инфузий в виде растворов, суспензий, эмульсий, лиофилизатов или стерильных порошков.
Пригодными для других путей введения являются, например, лекарственные формы для ингаляции (в том числе порошковые ингаляторы, распылители), капли в нос, глазные капли, растворы или спреи; пленки/брикеты или водные суспензии (лосьоны, встряхиваемые смеси), липофильные суспензии, мази, кремы, трансдермальные терапевтические системы (например, пластыри), молоко, пасты, пены, присыпки, имплантаты или стенты.
Парентеральное введение является предпочтительным, особенно внутривенное введение.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут быть превращены в указанные лекарственные формы. Это может осуществляться известным способом путем смешивания с инертными, нетоксичными, фармацевтически пригодными наполнителями. Эти наполнители включают носители (например, микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, маннит), растворители (например, жидкие полиэтилен гликоли), эмульгаторы и диспергаторы или смачиватели (например, додецилсульфата натрия, поли-оксисорбитан олеат), связующие вещества (например, поливинилпирролидон), синтетические и природные полимеры (например, альбумин), стабилизаторы (например, антиоксиданты, например, аскорбиновая кислота), красители (например, неорганические пигменты, например, оксиды железа) и маскирующие ароматы и/или запахи вещества.
Оказалось выгодным, в случае парентерального введения, введение количеств, примерно от 0.001 до 5 мг/кг, предпочтительно примерно от 0.01 до 1 мг/кг веса тела для достижения эффективных результатов.
Тем не менее, в некоторых случаях может быть необходимо отклоняться от указанных количеств, в частности, в зависимости от веса тела, пути введения, индивидуальной реакции на активный компонент, характера получения и времени или интервала, за который осуществляется введение. Например, меньше указанного выше минимального количества может быть недостаточно в некоторых случаях, причем в других случаях заявленный верхний предел должен быть превышен. В случае введения больших количеств, может быть желательно разделить эти на множество индивидуальных доз в течение дня.
Следующие рабочие примеры иллюстрируют изобретение. Изобретение не ограничивается этими примерами.
Проценты в следующих тестах и примерах представляют собой, если не указано иное, проценты по весу; части представляют собой части по весу. Соотношения растворителей, коэффициенты разбавления и данные концентрации для жидкости/жидких растворов - все зависят от объема.
А. Примеры.
Сокращения:
АА - аминокислота;
Acm - ацетамидометил;
ADM - адреномедуллин (человека);
ADM(2-52) - пептидная последовательность ADM АА 2 - АА 52, включая дисульфидную связь и С-концевой амид;
Boc - трет-бутилоксикарбонил; CDI - карбонилдиимидазол; д - день(дни);
d - дуплет (в ЯМР);
ТСХ - тонкослойная хроматография;
DCI - прямая химическая ионизация (в МС);
dd - дуплет дуплетов (в ЯМР);
DIEA - ^^диизопропилэтиламин;
DMAP - 4-диметиламинопиридин;
ДМФА - ^^диметилформамид;
ДМСО - диметилсульфоксид;
от теор. - от теории (выход);
экв. - эквивалент(ы);
ESI - ионизация электрораспылением (в МС); Fmoc - (9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил; ч - час(ы);
HATU - О-(7-азабензотриазол-1-ил)-^^№,№-тетршетилуроний гексафторфосфат;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография при высоком давлении;
ЖХ-МС - жидкостная хроматография с масс-спектрометрией;
m - мультиплет (в ЯМР);
мин - минута(ы);
МС - масс-спектрометрия;
ЯМР - спектроскопия ядерного магнитного резонанса;
pbf - 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
RP - обращенная фаза (в ВЭЖХ);
КТ - комнатная температура;
Rt - время удерживания (вВЭЖХ);
s - синглет (в ЯМР);
TBTU - бензотриазол-1-ил-^тетраметил-уроний тетрафторборат;
tBu - трет-бутил;
ТФУ - трифторуксусная кислота;
ТГФ - тетрагидрофуран;
Trt - тритил.
Номенклатура аминокислот и пептидных последовательностей в соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии и Международным союзом биохимии: Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (Recommendations 1983). B: Pure & Appl. Chem. 56, Vol. 5, 1984,
p. 595-624.
Тривиальное Символ Однобуквенный
название символ
Алании Ala А
Аргинин Arg R
Аспарагин Asn N
Аспарагиновая Asp D
кислота
Цистеин Cys С
Gin
Gly
His
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Глутаминовая GIu Е кислота Глутамин Глицин Гистидин Изолейцин Лейцин Лизин Метионин Фенилаланин Пролин Серии Треонин Триптофан Тирозин Валин
ЖХ-МС и МС способы.
Способ 1 (ЖХ-МС). Тип устройства: Waters ACQUITY SQD UPLC System; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 мкм 50 ммх1 мм; мобильная фаза А: 1 л воды + 0.25 мл 99%-ной муравьиной кислоты, мобильная фаза Б: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл 99%-ной муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 90% А 1.2 мин 5% А - 2.0 мин 5% А; печь: 50°С; поток: 0.40 мл/мин; УФ-детектирование: 210-400 нм.
Способ 2 (ЖХ-МС). МС тип устройства: Waters (Micromass) Quattro Micro; ВЭЖХ тип устройства: Agilent 1100 series; колонка: Thermo Hypersil GOLD 3 мкм 20 ммх4 мм; мобильная фаза А: 1 л воды + 0.5 мл 50%-ной муравьиной кислоты, мобильная фаза Б: 1 л ацетонитрила + 0.5 мл 50%-ной муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 100% А - 3.0 мин 10% А - 4.0 мин 10% А; печь: 50°С; поток: 2.0 мл/мин; УФ-детектирование: 210 нм.
Способ 3 (ВЭЖХ). Тип устройства: HP 1200 Series; УФ DAD; колонка: Phenomenex Luna 5 мкм С5 100 А, 150 ммх4.6 мм; мобильная фаза А: 1 л воды + 0.5 мл 50%-ной муравьиной кислоты, мобильная фаза Б: 1 л ацетонитрила + 0.5 мл 50%-ной муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 95% А - 5 мин 5% А; - 5.8 мин 95% А - 6.2 мин 95% А; скорость потока: 2.5 мл/мин; печь: КТ; УФ-детектирование:
210 нм.
Способ 4 (ВЭЖХ). Тип устройства: HP 1200 Series; УФ DAD; колонка: Merck Chromolith Fast градиент RP18 50 ммх2 мм; мобильная фаза А: 1 л воды + 0.5 мл 50%-ной муравьиной кислоты, мобильная фаза Б: 1 л ацетонитрила + 0.5 мл 50%-ной муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 95% А - 2.9 мин 5% А - 3.2 мин 5% А; скорость потока: 3 мл/мин; печь: КТ; УФ-детектирование: 210 нм.
Способ 5 (ДХИ МС). Тип устройства: Thermo Fisher-Scientific DSQ; химическая ионизация; реагент газообразный аммиак; температура источника: 200°С; энергия ионизации 70 эВ.
Способ 6 (МАЛДИ МС). Тип устройства Kratos PC-Kompact SEQ V1.2.2 MALDI TOF MS, режим положительной ионизации, линейный высокий, мощность: 75.
Микроволновой синтезатор: Biotage Emrys Initiator II синтезатор, с переменным размером флакона до 20 мл объема реакции и "Robot 60" процессор образца.
рН 4 цитратный буфер: Fluka No 82566; цитратный буфер рН 4, стабилизированный с композицией азида натрия:лимонная кислота ~0.056 М; азид натрия ~0.05%; хлорид натрия ~0.044 М; гидроксид натрия ~0.068 М.
40 кДа метоксиполи(этиленгликоль)малеимидопропионамид (линейный 40k мПЭГ малеимид);
CAS No 724722-89-8; фирмы Dr. Reddys Inc., Lot No 233101301; вес - средняя молекулярная масса, Mw (GPC) 40500 Да; полидисперсность (GPC) 1.08. Исходные соединения. Пример 1А.
Аллил-М-(трет-бутоксикарбонил)-0-[(4-нитрофенокси)карбонил]-Ь-тирозинат
36.7 г (114.3 ммоль) сложного эфира N-Boc-L-тирозин аллила, 23.0 г (114.3 ммоль) 4-нитрофенил хлорформиата, 17.5 мл (125.7 ммоль) триэтиламина и 1.40 г (11.4 ммоль) 4-диметиламино пиридина объединяли в 1000 мл дихлорметана и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь выделяли с помощью приблизительно 500 мл воды и с помощью приблизительно 250 мл солевого раствора и сушили над приблизительно 100 г сульфата натрия. Растворитель удаляли с помощью роторного упаривания (приблизительно 40°С, приблизительно 200 мбар, приблизительно 30 мин) и продукт растворяли в теплом диэтиловом эфире и кристаллизировали в течение ночи при 4°С. Кристаллы отфильтровывали, промывали с помощью холодного диэтилового эфира и сушили в высоком вакууме (приблизительно 0.1 мбар, 18 ч). Выход составил 29.86 г (59.6 ммоль, 52% от теории) желаемого вещест-
ва.
ЖХ-МС (способ 1): R = 1.23 мин, m/z = 487 (М+Н)+. Пример 2А.
(2S)-4-{[(4-{(2S)-3-(аллилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-оксопропил}фенокси)-карбонил] амино } -2 -[(трет-бутоксикарбонил)амино] бутановая кислота
4.0 г (8.22 ммоль) соединения из примера 1А растворяли в 60 мл дихлорметана. 1.795 (8.22 ммоль) (2S)-4-амино-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]бутановой кислоты и 1.43 мл (8.22 ммоль) N,N-диизопропилэтиламина добавляли. Реакционную смесь разделяли на 3 порции. Порции нагревали в течение 30 мин в закупоренной трубке при 75°С в микроволновом синтезаторе. Из объединенной реакционной смеси растворитель удаляли с помощью роторного упаривания (приблизительно 40°С, приблизительно 200 мбар, приблизительно 30 мин). Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане и хромато-графировали над приблизительно 600 мл силикагеля. Используемыми растворителями были дихлорме-тан/этилацетат 4/1, дихлорметан/этилацетат 1/1, дихлорметан/метанол 4/1 и дихлорметан/метанол 1/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 4.02 г (6.54 ммоль, 80% от теории) желаемого вещества.
ЖХ-МС (способ 1): R = 1.07 мин, m/z = 564 (М-Н)-.
2.50 г (4.42 ммоль) соединения из примера 2А растворяли в 100 мл дихлорметана. 1.602 г (4.42 ммоль) S-тритил-L-цистеинамида, 0.77 мл (4.42 ммоль) ^^диизопропилэтиламина и 1.68 г (4.42 ммоль) HATU добавляли. Реакционную смесь разделяли на 5 порций. Порции нагревали в течение 30 мин в закупоренной трубке при 60°С в микроволновом синтезаторе. Из объединенной реакционной смеси растворитель удаляли с помощью роторного упаривания (приблизительно 40°С, приблизительно 200 мбар, приблизительно 30 мин). Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане и хроматографировали над приблизительно 600 мл силикагеля. Используемыми растворителями были дихлорметан/этилацетат 2/1, дихлорметан/этилацетат 1/1, дихлорметан/метанол 20/1 и дихлорметан/метанол 10/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 4.12 г (3.30 ммоль, 75% от теории, 73% чистоты) желаемого вещества.
ЖХ-МС (способ 1): R = 1.36 мин, m/z = 911 (М+Н)+.
Пример 4А.
O-({(3S)-4-{[(2R)-1-амино-1-оксо-3-(тритилсульфанил)пропан-2-ил]амино}-3-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-4-оксобутил}карбамоил)-М-(трет-бутоксикарбонил)-Ь-тирозин
4.14 г (4.55 ммоль) соединения из примера 3А растворяли в 90 мл тетрагидрофурана. 3.17 мл (22.8 ммоль) триэтиламина, 0.86 мл (22.8 ммоль) муравьиной кислоты и 0.526 г (0.455 ммоль) тетракис-(трифенилфосфин)палладия(0) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию разбавляли с помощью приблизительно 100 мл воды и дважды выделяли с помощью приблизительно 100 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы выделяли с помощью солевого раствора, сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха при сниженном давлении. Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане и хроматографировали над приблизительно 500 мл силикагеля. Используемыми растворителями были дихлорметан, дихлорметан/метанол 20/1 и ди-хлорметан/метанол 1/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 2.62 г неочищенного продукта с чистотой 94.5%. Продукт далее был очищен с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ на С18 с помощью градиента вода/метанол с выходом 2.35 г (2.70 ммоль, 59% от теории) чистого продукта.
ЖХ-МС (способ 1): R = 1.22 мин, m/z = 871 (М+Н)+.
1Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-dfo 5/м.д.): 5 = 7.92 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.28-7.35 (m, 12H), 7.25-7.28 (t, 3Н), 7.15-7.20 (m, 4Н), 6.95 (d, 2H), 4.29 (q, 1H), 4.00 (m, 1Н), 3.92 (m, 1Н), 3.11 (m, 3Н), 2.90 (m, 1Н), 2.36 (m, 2Н), 1.84 (m, 1Н), 1.68 (m, 1H), 1.34 (d, 18H).
Соединение синтезировали в соответствии с Alberico, Dino; Paquin, Jean-Francois; Lautens, Mark; Tetrahedron, 2005, vol. 61, p. 6283-6297.
5.18 г (25.7 ммоль) трет-бутил(тетрагидро-2-оксо-3-фуранил)карбамата, 4.81 мл (77.2 ммоль) йод-метана растворяли в 100 мл сухого диметилформамида. Раствор охлаждали до 0°С и 1.34 г (60% в минеральном масле, 33.5 ммоль) гидрид натрия добавляли. Реакцию нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь добавляли к приблизительно 400 мл воды и смесь выделяли три раза с помощью приблизительно 300 мл этилацетата. Объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 8.70 г (25.7 ммоль, 100% от теории, 63% чистоты) желаемого вещества.
Аналитические данные были в соответствии с литературой. Продукт был использован в следующей стадии синтеза без дополнительной очистки.
Пример 6А.
2-[(трет-Бутоксикарбонил)(метил)амино] -4-( 1,3-диоксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)бутановая кислота
8.70 г (приблизительно 25 ммоль, приблизительно 63% чистоты) соединения из примера 5А растворяли в 560 мл диметилформамиде. 8.23 г (44.4 ммоль) калий офталимида добавляли и реакционную смесь нагревали до 150°С в течение 7 ч. Приблизительно 400 мл растворителя удаляли с помощью роторного упаривания (приблизительно 60°С, приблизительно 10 мбар, приблизительно 30 мин). Реакционную смесь выливали в смесь приблизительно 100 мл воды, 200 г льда и 15 мл уксусной кислоты. После того, как оставшийся лед растаял, реакционную смесь фильтровали и фильтрат выделяли 3 раза с помощью приблизительно 100 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха при сниженном давлении. Неочищенный продукт растворяли в ди-хлорметане и хроматографировали над приблизительно 70 мл силикагеля. Используемыми растворителями были от дихлорметан/этилацетат 9/1 до дихлорметан/этилацетат 6/4. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 2.39 г (6.04 ммоль, 24% от теории) продукта.
ЖХ-МС (способ 1): Rt = 0.92 мин, m/z = 363 (М+Н)+.
Пример 7А.
4-Амино-2-[(трет-бутоксикарбонил)(метил)амино]бутановая кислота
11.8 г (32.6 ммоль) соединения из примера 6А растворяли в приблизительно 640 мл этанола и 23.8 мл (488 ммоль) гидразин гидрата добавляли к реакционной смеси. После перемешивания в течение ночи реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали досуха при сниженном давлении. Неочищенный продукт растворяли в этаноле и приблизительно 50 г силикагеля добавляли, растворитель удаляли при сниженном давлении. Оставшееся твердое вещество добавляли на колонку с приблизительно 500 г силикагеля и хроматографировали. Используемыми растворителями были от дихлорметан/метанол 9/1 до дихлорметан/метанол 1/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 2.98 г (12.8 ммоль, 39% от теории) продукта.
ЖХ-МС (способ 2): Rt = 0.21 мин, m/z = 233 (М+Н)+.
ДХИ МС (способ 5): m/z = 233 (М+Н)+.
Пример 8А.
4-{ [(4-{(2S)-3 -(аллилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино] -3 -оксопропил}фенокси)карбонил]амино}-2-[(трет-бутоксикарбонил)(метил)амино]бутановая кислота
сн3 о сн.
0.931 г (1.92 ммоль) соединения из примера 1А растворяли в 30 мл дихлорметана. 0.455 г (1.92 ммоль) соединения из примера 7А добавляли. Реакционную смесь разделяли на 2 порции. Порции нагревали в течение 30 мин в закупоренной трубке при 80°С в микроволновом синтезаторе. Из объединенной реакционной смеси растворитель удаляли при сниженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ на С18 колонке с градиентом вода/метанол от 9/1 до 1/9. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 0.523 г (0.85 ммоль, 44% от теории) желаемого вещества в виде смеси двух диастереомеров.
ЖХ-МС (способ 1): R = 1.08 и 1.11 мин, m/z = 578 (М-Н)-.
Пример 9А.
Аллил O-[(4-{ [(2R)-1 -амино-1-оксо-3 -(тритилсульфанил)пропан-2-ил] амино}-3 -[(трет-
бутоксикарбонил)(метил)амино]-4-оксобутил)карбамоил]-М-(трет-бутоксикарбонил)-Ь-тирозинат
2.24 г (3.86 ммоль) соединения из примера 8А растворяли в 100 мл дихлорметана. 1.401 г (3.86 ммоль) S-тритил-1-цистеинамида, 0.67 мл (3.86 ммоль) М,]Ч-диизопропилэтиламина и 1.47 г (3.86 ммоль) HATU добавляли. Реакционную смесь разделяли на 5 порции. Порции нагревали в течение 30 мин в закупоренной трубке при 60°С в микроволновом синтезаторе. Из объединенной реакционной смеси растворитель удаляли с помощью роторного упаривания (приблизительно 40°С, приблизительно 200 мбар, приблизительно 30 мин). Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ на С18 колонке с градиентом вода/метанол от 9/1 до 1/9. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 3.26 г (2.75 ммоль, 71% от теории, 78% чистоты) желаемого вещества в виде смеси диастереомеров.
ЖХ-МС (способ 1): R = 1.41 и 1.43 мин, m/z = 924 (М+Н)+.
2.2 г (2.38 ммоль) соединения из примера 9А растворяли в 48 мл тетрагидрофурана. 1.66 мл (11.9 ммоль) триэтиламина, 0.45 мл (11.9 ммоль) муравьиной кислоты и 0.275 г (0.238 ммоль) тетракис-(трифенилфосфин)палладия(0) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию разбавляли с помощью приблизительно 50 мл воды и дважды выделяли с помощью приблизительно 50 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы выделяли с помощью солевого раствора, сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха при сниженном давлении. Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане и хроматографировали над приблизительно 100 г си-ликагеля. Используемыми растворителями были дихлорметан, дихлорметан/метанол 50/1 и дихлорме-тан/метанол 4/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 1.44 г (1.61 ммоль, 68% от теории) продукта в виде смеси диастереомеров.
ЖХ-МС (способ 1): Rt = 1.20 и 1.24 мин, m/z = 884 (М+Н)+.
1Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-dfe 5/м.д.): 5 = 8.00 (m, 1Н), 7.65-7.90 (m, 4Н), 7.18-7.35 (m, 18Н), 7.10 (m, 2Н), 6.96 (m, 4Н), 4.60 (m, 1H), 4.46 (m, 1Н), 4.30 (m, 2Н), 4.05 (m, 2Н), 3.00 (m, 4Н), 2.75 (m, 6Н), 2.36 (m, 3Н), 2.00 (m, 2Н), 1.82 (m, 2Н), 1.40 (m, 3Н), 1.35 (s, 18H).
Пример 11А.
N5-[(4-{(2S)-3-(аллилокси)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-3-оксопропил}фенокси)карбонил]-N2-(трет-бутоксикарбонил)-Ь-орнитин
6.00 г (12.33 ммоль) соединения из примера 1А растворяли в 120 мл дихлорметана. 2.57 г (12.33 ммоль) ^-(трет-бутоксикарбонил)^-орнитина добавляли. Реакционную смесь разделяли на 6 порции. Порции нагревали в течение 90 мин в закупоренной трубке при 75°С в микроволновом синтезаторе. Объединенную реакционную смесь выделяли с помощью приблизительно 100 мл насыщенного раствора хлорида аммония. Водную фазу дважды снова выделяли с помощью приблизительно 30 мл дихлорметана каждый раз. Объединенные органические фазы выделяли с помощью приблизительно 50 мл солевого раствора и сушили над сульфатом натрия. Растворитель удаляли при сниженном давлении. Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане и хроматографировали над приблизительно 600 мл силикагеля. Используемыми растворителями были дихлорметан, дихлорметан/метанол 40/1 - дихлорметан/метанол 1/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 2.63 г (4.06 ммоль, 33% от теории, 89% чистоты) желаемого вещества.
ЖХ-МС (способ 1): Rt = 1.03 мин, m/z = 578 (М-Н)-.
сн3 о сн.
1.20 г (2.07 ммоль) соединения из примера 11А растворяли в 48 мл дихлорметана. 0.750 г (2.07 ммоль) S-тритил-Ь-цистеинамида, 0.36 мл (2.07 ммоль) ^^диизопропилэтиламина и 0.787 г (2.07 ммоль) HATU добавляли. Реакционную смесь разделяли на 3 порции. Порции нагревали в течение 30 мин в закупоренной трубке при 60°С в микроволновом синтезаторе. Из объединенной реакционной смеси растворитель удаляли с помощью роторного упаривания (приблизительно 40°С, приблизительно 200 мбар, приблизительно 30 мин). Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане и хроматографирова-ли над приблизительно 400 мл силикагеля. Используемыми растворителями были дихлорме-тан/этилацетат 2/1, дихлорметан/этилацетат 1/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 1.30 г (1.5 ммоль, 56% от теории, 82% чистоты) желаемого вещества.
ЖХ-МС (способ 1): R = 1.35 мин, m/z = 924 (М+Н)+.
Пример 13А.
N2-(трет-бутоксикарбонил)-N5-[(4-{(2S)-2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]-2-карбоксиэтил} фенокси)карбонил] -Ь-орнитил-8 -тритил-Ь-цистеинамид
сн, о
3.06 г (2.33 ммоль) соединения из примера 12А растворяли в 46 мл тетрагидрофурана. 1.63 мл (11.6 ммоль) триэтиламина, 0.44 мл (11.6 ммоль) муравьиной кислоты и 0.265 г (0.233 ммоль) тетракис-(трифенилфосфин)палладия(0) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию разбавляли с помощью приблизительно 50 мл воды и дважды выделяли с помощью приблизительно 50 мл дихлорметана. Объединенные органические фазы выделяли с помощью солевого раствора, сушили над сульфатом натрия и концентрировали досуха при сниженном давлении. Неочищенный продукт растворяли в дихлорметане и хроматографировали над приблизительно 500 мл силикагеля. Используемыми растворителями были дихлорметан, дихлорметан/метанол 40/1 и дихлорме-тан/метанол 1/1. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали досуха при сниженном давлении. Это обеспечило 1.40 г неочищенного продукта 86% чистоты. Продукт далее был очищен с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ на С18 колонке с помощью градиента вода/метанол с выходом в 2 фракции: 0.93 г продукта (45% от теории).
ЖХ-МС (способ 1): Rt = 1.18 мин, m/z = 885 (М+Н)+.
1Н-ЯМР (400 МГц, ДМСО-dfe 5/м.д.): 5 = 7.89 (d, 1H), 7.65 (t, 1H), 7.25-7.35 (m, 12Н), 7.20-7.25 (m, 6Н), 7.10-7.20 (m, 3Н), 6.95 (d, 2Н), 4.29 (m, 1H), 4.05 (m, 1Н), 3.88 (m, 1H), 3.11 (d, 1H), 3.00 (m, 4H), 2.75 (m, 2H), 2.36 (m, 3H), 1.64 (m, 1H), 1.51 (m, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.32 (s, 9H).
Пептид собирали ступенчато на амидной смоле на основе тентагеля на автоматическом пептидном синтезаторе (Protein Technologies Inc. Symphony). 8 поли-пропиленовых реакционных сосудов использовали, параллельно осуществляя одинаковую химическую реакцию. В каждый сосуд загружали 0.05 ммоль смолы Ринка на основе тентагеля для общего размера партии 0.4 ммоль.
Каждую аминокислоту добавляли в 8-кратном молярном подходе в отношении загрузки смолы. Аминокислоты были защищены Fmoc как N-концевой защитной группой и защитные группы указанные ниже были использованы для боковой цепи функциональных возможностей. Также 188 мг (0.59 ммоль, 7.8 экв.) TBTU и 0.21 мл (1.2 ммоль, 16 экв.) DIEA добавляли. Реакции проводили в ДМФА в качестве растворителя, причем ДМФА использовали в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания. Время реакции для аминокислоты составило приблизительно 1 ч. Расщепление защитных групп Fmoc было достигнуто с помощью 20% пиперидина/ДМФА, причем 20% пипери-дин/ДМФА использовали в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания.
Последовательность сочетания была следующей:
Tyr(tBu)
(Tyr
= Y
= A A 52 человеческого ADM)
Gly
(Gly
= G
= AA 51 человеческого ADM)
Gln(Trt)
(Gin
= Q
= AA 50 человеческого ADM)
Pro
(Pro
= P
= AA 49 человеческого ADM)
Ser(tBu)
(Ser
= s =
= AA 48 человеческого ADM)
lie
(He =
= 1 =
AA 47 человеческого ADM)
Lys(Boc)
(Lys
= к
= A A 46 человеческого ADM)
Ser(tBu)
(Ser
= s =
= AA 45 человеческого ADM)
Arg(pbf)
(Arg
= R
= AA 44 человеческого ADM)
10.
Pro
(Pro
= p =
= AA 43 человеческого ADM)
11.
Ala
(Ala
= A
= AA 42 человеческого ADM)
12.
Val
(Val
= V
= AA 41 человеческого ADM)
13.
Asn(Trt)
(Asn
= N
= AA 40 человеческого ADM)
14.
Asp(OtBu)
(Asp
= D
= AA 39 человеческого ADM)
15.
Lys(Boc)
(Lys
= К
= AA 38 человеческого ADM)
16.
Asp(OtBu)
(Asp
= D
= AA 37 человеческого ADM)
17.
Lys(Boc)
(Lys
= K
= AA 36 человеческого ADM)
18.
Asp(OtBu)
(Asp
= D
= AA 35 человеческого ADM)
19.
Thr(tBu)
(Thr
= T:
= A A 34 человеческого ADM)
20.
Phe
(Phe
= F:
= A A 33 человеческого ADM)
21.
Gln(Trt)
(Gin
= Q
= AA 32 человеческого ADM)
22.
Tyr(tBu)
(Tyr;
= Y
= AA 31 человеческого ADM)
23.
(lie =
1 =
AA 30 человеческого ADM)
24.
Gln(Trt)
(Gin
= Q
= AA 29 человеческого ADM)
25.
His(Trt)
(His^
= H
= A A 28 человеческого ADM)
26.
Ala
(Ala =
= AA 27 человеческого ADM)
27.
Leu
(Leu =
= AA 26 человеческого ADM)
28.
Lys(Boc)
(Lys =
= AA 25 человеческого ADM)
29.
Gln(Trt)
(Gln =
= AA 24 человеческого ADM)
30.
Val
(Val =
= AA 23 человеческого ADM)
31.
Thr(tBu)
(Thr =
T =
= AA 22 человеческого ADM)
32.
Cys(Trt)
(Cys =
= A A 21 человеческого ADM)
33.
Thr(tBu)
(Thr =
= AA 20 человеческого ADM)
34.
Giy
(Gly =
г =
= AA 19 человеческого ADM)
35.
Phe
(Phe =
F =
= A A 18 человеческого ADM)
36.
Arg(pbf)
(Arg =
= AA 17 человеческого ADM)
37.
Cys(Acm)
(Cys =
= AA 16 человеческого ADM)
38.
Gly
(Gly =
г =
; AA 15 человеческого ADM)
39.
Phe
(Phe =
F =
= A A 14 человеческого ADM)
40.
Ser(tBu)
(Ser =
S =
= AA 13 человеческого ADM)
41.
Arg(pbf)
(Arg =
= A A 12 человеческого ADM)
42.
Leu
(Leu =
= AA 11 человеческого ADM)
43.
Gly
(Gly =
г =
= AA 10 человеческого ADM)
44.
Gln(Trt)
(Gln =
= AA 9 человеческого ADM)
45.
Phe
(Phe =
= AA 8 человеческого ADM)
46.
Asn(Trt)
(Asn =
= AA 7 человеческого ADM)
47.
Asn(Trt)
(Asn =
= AA 6 человеческого ADM)
48.
Met
(Met =
= M
= AA 5 человеческого ADM)
49.
Ser(tBu)
(Ser =
s =
= AA 4 человеческого ADM)
50.
Gln(Trt)
(Gin-
= AA 3 человеческого ADM)
51.
Arg(pbf)
(Arg =
= AA 2 человеческого ADM)
Окисление на смоле было достигнуто с помощью Cys(Trt) и Cys(Acm) защиты с сопутствующим расщеплением защитных групп и окисления до дисульфидной связи, используя йод (8 эквивалентов йода плюс 8 эквивалентов DIEA, с временем реакции 30 мин). Окисление было подтверждено образцом расщепления и анализом с использованием ВЭЖХ и МАЛДИ-МС.
8 партий были объединены для дальнейшего использования.
Пример 15А.
О-{ [(3 S)-3 -амино-4-{ [(2R)-1-амино-1-оксо-3 -сульфанилпропан-2-ил]амино } -4-оксобутил] -карбамоил}-Ь-тирозил-адреномедуллин(2-52)
К 0.075 ммоль соединения примера 14А 520 мг (0.6 ммоль, 8 экв.) соединения примера 4А добавляли. Также 188 мг (0.59 ммоль, 7.8 экв.) TBTU и 0.21 мл (1.2 ммоль, 16 экв.) DIEA добавляли. Реакцию осуществляли с помощью ДМФА в качестве растворителя, причем ДМФА использовали в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания. Время реакции представляло собой приблизительно 1 ч при комнатной температуре. Пептид отщепляли от смолы с сопутствующим глобальным снятием защиты с использованием концентрированного ТФУ в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания, причем ТФУ содержит акцепторы (1-5% каждого из воды, фенола, тиоанизола и 1,2-этандиола), со временем реакции, которое составляет 2!/!> ч. Твердый продукт лиофилизировали и очищали с помощью ОФ-хроматографии, используя 0.1% ТФУ в воде и 0.1%
ТФУ в ацетонитриле в качестве мобильных фаз для того, чтобы обеспечить, чтобы значение рН оставалось ниже 4 каждый раз во время процесса очистки или лиофилизации. Все фракции, содержащие нужный ион по анализу МАЛДИ-МС, объединяли. Выход составил 44.0 мг частично очищенного пептида (приблизительно 0.0035 ммоль, приблизительно 4.7% от теории; оцененная чистота: приблизительно 50%, основная примесь: ADM(2-52)).
МАЛДИ МС (способ 6): m/z = 6275 (М+Н)+ и 5866 (примесь: (ADM(2-52)+H)+).
Пример 16А.
О-{ [4-{ [(2R)-1 -амино-1 -оксо-3 -сульфанилпропан-2-ил]амино}-3 -(метиламино)-4-оксобутил] -карбамоил}-Ь-тирозил-адреномедуллин(2-52)
К 0.075 ммоль соединения примера 14А 530 мг (0.6 ммоль, 8 экв.) соединения примера 10А добавляли. Также 188 мг (0.59 ммоль, 7.8 экв.) TBTU и 0.21 мл (1.2 ммоль, 16 экв.) DIEA добавляли. Реакцию осуществляли с помощью ДМФА в качестве растворителя, причем ДМФА использовали в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания. Время реакции представляло собой приблизительно 1 час при комнатной температуре. Пептид отщепляли от смолы с сопутствующим глобальным снятием защиты с использованием концентрированного ТФУ в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания, причем ТФУ содержит акцепторы (1-5% каждого из воды, фенола, тиоанизола и 1,2-этандиола), со временем реакции, которое составляет 2! ч. Твердый продукт лиофилизировали и очищали с помощью ОФ-хроматографии используя 0.1% ТФУ в воде и 0.1% ТФУ в ацетонитриле в качестве мобильных фаз для того, чтобы обеспечить, чтобы значение рН оставалось ниже 4 каждый раз во время процесса очистки или лиофилизации. Все фракции, содержащие нужный ион по анализу МАЛДИ-МС объединяли. Выход составил 34.0 мг частично очищенного пептида (приблизительно 0.0026 ммоль, приблизительно 3.5% от теории; оцененная чистота: приблизительно 50%, основная примесь: ADM(2-52)).
МАЛДИ МС (способ 6): m/z = 6289 (M+H)+ и 5866 (примесь: (ADM(2-52)+ff)+).
Пример 17А.
О-{[(4R)-4-амино-5-{[(2R)-1-амино-1-оксо-3-сульфанилпропан-2-ил]амино}-5-оксопентил]-карбамоил}-Ь-тирозил-адреномедуллин(2-52)
К 0.075 ммоль соединения примера 14А 530 мг (0.6 ммоль, 8 экв.) соединения примера 13А добавляли. Также 188 мг (0.59 ммоль, 7.8 экв.) TBTU и 0.21 мл (1.2 ммоль, 16 экв.) DIEA добавляли. Реакцию осуществляли с помощью ДМФА в качестве растворителя, причем ДМФА использовали в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания. Время реакции представляло собой приблизительно 1 час при комнатной температуре. Пептид отщепляли от смолы с сопутствующим глобальным снятием защиты с использованием концентрированного ТФУ в количестве достаточном для набухания смолы и ее свободного взбалтывания, причем ТФУ содержит акцепторы (1-5% каждого из воды, фенола, тиоанизола и 1,2-этандиола), со временем реакции, которое составляет 2! ч. Твердый продукт лиофилизировали и очищали с помощью ОФ-хроматографии используя 0.1% ТФУ в воде и 0.1% ТФУ в ацетонитриле в качестве мобильных фаз для того, чтобы обеспечить, чтобы значение рН оставалось ниже 4 каждый раз во время процесса очистки или лиофилизации. Все фракции, содержащие нужный ион по анализу МАЛДИ-МС объединяли. Выход составил 47 мг частично очищенного пептида (приблизительно 0.0037 ммоль, приблизительно 5.0% от теории; оцененная чистота: приблизительно 50%, основная примесь: ADM(2-52)).
МАЛДИ МС (способ 6): m/z = 6289 (M+H)+ и 5866 (примесь: (ADM(2-52)+ff)+).
Рабочие примеры. Пример 1.
О-{[(3S)-3-амино-4-({(2R)-1-амино-3-[(2,5-диоксо-1-{3-оксо-3-[(2-{ю-метоксиполиоксиэтилен [40 кДа]}этил)амино]пропил}пирролидин-3-ил)сульфанил]-1-оксопропан-2-ил}амино)-4-оксобутил]карбамоил}-Ь-тирозил-адреномедуллин(2-52)
44 мг неочищенного пептида примера 15А перемешивали с 426 мг (10.5 мкмоль, 1.5 экв., полученные от Dr. Reddys) 40 кДа метоксиполи(этиленгликоль)малеимидопропионамида в 9 мл цитратного буфера рН 4 в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь вводили в две порциях на препаративную ВЭЖХ систему с Phenomenex Luna 10мк 100А Proteo C5 AXIA 250 ммх21.2 мм колонка и хроматографировали с помощью градиента вода/ацетонитрил (оба с 0.1% ТФУ). Фракции собирали в пробирки по 20 мл на автоматизированном коллекторе фракций. Для обеспечения достаточной кислотности каждый флакон был заполнен 0.5 мл уксусной кислоты до сбора.
ADM(2-52), который является побочным продуктом примера 15А и который не подвергали ПЭГи-лированию в этой реакции, а также непрореагировавший ПЭГ были удалены полностью.
Все фракции, содержащие пример 1, объединяли. Ацетонитрил частично удаляли на роторном испарителе при температуре воды в ванне 30°С и приблизительно 50 мбар в течение приблизительно 30 мин.
После добавления 0.5 мл уксусной кислоты полученный раствор лиофилизовали. Общий выход примера 1 составил 109 мг (2.35 мкмоль, 33% от теории). ВЭЖХ (способ 3): Rt = 4.23-4.30 мин. Пример 2.
O-{[(3-N-метил-амино-4-({(2R)-1-амино-3-[(2,5-диоксо-1-{3-оксо-3-[(2-{ю-метоксиполиоксиэтилен[40 кДа]}этил)амино]пропил}пирролидин-3-ил)сульфанил]-1-оксопропан-2-ил}амино)-4-оксобутил]карбамоил}-Ь-тирозил-адреномедуллин(2-52)
15 мг неочищенного пептида примера 16А перемешивали с 145 мг (3.58 мкмоль, 1.5 экв., полученные от Dr. Reddys) 40 кДа метоксиполи(этиленгликоль)малеимидопропионамида в 5 мл цитратного буфера рН 4 в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь вводили на препаративную ВЭЖХ систему с Phenomenex Luna 10мк С18 300А 250 ммх21.2 мм колонка и хроматографировали с помощью градиента вода/ацетонитрил (оба с 0.1% ТФУ). Фракции собирали в пробирки по 20 мл на автоматизированном коллекторе фракций. Для обеспечения достаточной кислотности каждый флакон был заполнен 0.5 мл уксусной кислоты до сбора.
ADM(2-52), который является побочным продуктом примера 16А и который не подвергали ПЭГи-лированию в этой реакции, а также непрореагировавший ПЭГ были удалены полностью.
Все фракции, содержащие пример 2, объединяли. Ацетонитрил частично удаляли на роторном испарителе при температуре воды в ванне 30°С и приблизительно 50 мбар в течение приблизительно 30 мин.
После добавления 0.5 мл уксусной кислоты полученный раствор лиофилизовали. Общий выход примера 2 составил 50 мг (1.08 мкмоль, 43% от теории).
15 мг неочищенного пептида примера 17А перемешивали с 145 мг (3.58 мкмоль, 1.5 экв., полученные от Dr. Reddys) 40 кДа метоксиполи(этиленгликоль)малеимидопропионамида в 5 мл цитратного буфера рН 4 в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенную реакционную смесь вводили на препаративную ВЭЖХ систему с Phenomenex Luna 10 мкм Proteo 90A AXIA 250 ммх21.2 мм колонка и хроматографировали с помощью градиента вода/ацетонитрил (оба с 0.1% ТФУ). Фракции собирали в пробирки по 20 мл на автоматизированном коллекторе фракций. Для обеспечения достаточной кислотности каждый флакон был заполнен 0.5 мл уксусной кислоты до сбора.
ADM(2-52), который является побочным продуктом примера 17А и который не подвергали ПЭГи-лированию в этой реакции, а также непрореагировавший ПЭГ были удалены полностью.
Все фракции, содержащие пример 3, объединяли. Ацетонитрил частично удаляли на роторном испарителе при температуре воды в ванне 30°С и приблизительно 50 мбар в течение приблизительно 30 мин.
После добавления 0.5 мл уксусной кислоты, полученный раствор лиофилизовали. Общий выход примера 3 составил 19.5 мг (0.42 мкмоль, 17% от теории). ВЭЖХ (способ 3): R = 2.02 - 2.08 мин. Б. Оценка фармакологической активности.
Пригодность соединений в соответствии с настоящим изобретением для лечения заболеваний может быть продемонстрирована с использованием следующих систем анализа: 1) Описание испытаний (in vitro).
1a) Испытания на рекомбинантной клетке репортера рецептора адреномедуллина.
Активность соединений в соответствии с настоящим изобретением количественно оценивали с помощью рекомбинантной клеточной линии яичника китайского хомячка (СНО), которая несет адреноме-дуллин - рецептор человека. Активация рецептора лигандами может быть измерена экворин люминесценцией. Конструкция клеточной линии и процедура измерения были описаны в деталях [Wunder F., Rebmann A., Geerts A., and Kalthof В., Mol. Pharmacol., 73, 1235-1243 (2008)]. Вкратце: клетки высевали на непрозрачные 384-луночные планшеты для микротитрования при плотности 4000 клеток/лунка и выращивали в течение 24 ч. После удаления культуральной среды клетки загружали в течение 3 ч с 0.6 мкг/мл коэлентеразина в раствор Тироде без Са2+ (130 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида калия, 20 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), 1 мМ хлорида магния, и 4.8 мМ гидрокарбоната натрия, рН 7.4) с добавлением 0.2 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) в инкубаторе для клеточных культур. Соединения добавляли в течение к 6 мин в раствор Тироде без Са2+, содержащий 0.1% бычьего сывороточного альбумина. Непосредственно перед добавлением Са + в конечной концентрации 3 мМ измерение экворин люминесценцией запускали с использованием подходящего люмино-метра. Свечение измеряли в течение 60 с. В типичном эксперименте соединения тестируют в концентрации от 1х10-13 до 3х10-6 М.
Для того чтобы определить высвобождение активного адреномедуллина из соединений в соответствии с настоящим изобретением, соединения инкубировали при различных концентрациях для различных промежутков времени до 24 ч в растворе Тироде, дополненным фетальной телячьей сывороткой, клеточной культуральной средой или плазмой из различных видов при рН 7.4. Содержание Са2+ в соответствующей инкубационной среде буферизировали добавлением 4 мМ ЭДТА (этилендиамин тетрауксусной кислоты) перед добавлением образцов к клетке репортера рецептора адреномедуллина.
После соответствующей предварительной инкубации, примеры осуществления активируют клетку-репортер рецептора адреномедуллина более сильно, чем перед предварительной инкубацией. На это указывает тот факт, что значения ЕС50 определяются с коэффициентом до 10 меньше после предварительной инкубации, чем раньше, и объясняется высвобождением активного адреномедуллина из соединений.
Типичные значения ЕС50 для примеров осуществления перед и после инкубации в течение 24 ч в буфере с добавлением 2.5% фетальной телячьей сыворотки приведены в следующей таблице.
Пример Кг
ЕС50 Т = 0 ч |нМ1
ЕС50 Т = 24 ч [нМ1
ADM
0.5
2.5
8.4
> 1000
161
124
12.3
1б) Анализы трансцеллюлярного электрического сопротивления в эндотелиальных клетках.
Активность соединений в соответствии с настоящим изобретением характеризуется в in vitro тестах на проницаемость в клетках пупочной вены человека (HUVEC, Lonza). За счет использования аппарата ECIS (ECIS: Electric Cell-substrate Impedance Sensing; Applied Biophysics Inc; Troy, NY) изменения тран-сэндотелиального электрического сопротивления (TEER) над эндотелиальным монослоем, постоянно измеряются с использованием небольшого золотого электрода, на который клетки были высеяны. HU-VEC выращивали на 96-луночных сенсорных электродных планшетах (96W1E, Ibidi GmbH, Martinsried) для сливания монослоев и проницаемость может быть вызвана воспалительными стимулами, такими как тромбин, TNF-a, IL-1P, VEGF, гистамин и водород пероксид, которые были продемонстрированы, как те, что вызывают разрыв контактов эндотелиальных клеток и сокращение TEER. Тромбин использовали в конечной концентрации 0.5 ед./мл. Испытуемые соединения добавляли до или после добавления тромбина. В типичном эксперименте соединения тестируют в концентрации от 1х10-10 до 1х10-6 М.
Примеры осуществления ингибируют тромбин индуцированную проницаемость в этом испытании при концентрациях < 10-6 М.
1в) Анализ проницаемости in vitro в эндотелиальных клетках.
В другой модели in vitro эндотелиальной проницаемости активность соединений в соответствии с настоящим изобретением рассматривается в отношению к модуляции макромолекулярной проницаемости. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECS) выращивают до сливания на покрытых фибронектином фильтр мембранах Transwell(r) (24-луночные планшеты, 6.5-мм вставки с 0.4 мкМ поликарбонатной мембраны; Costar #3413), которые отделяют верхний из нижней камеры культуры ткани с эндотелиальные клетки, растущими на нижней части верхней камеры. Среда верхней камеры дополняется 250 мкг/мл 40 кДа FITC-декстрана (инвитроген, D1844). Повышенную проницаемость монослоя индуцировали с добавлением тромбина до конечной концентрации 0.5 ед./мл. Образцы среды собирали из нижней камеры каждые 30 мин и относительную флуоресцентность в качестве параметра для изменения макромолекулярной проницаемости с течением времени измеряют в подходящем флуориметре. Стимулирование тромбином вызывает почти удвоение перехода FITC-декстрана через эндотелиальные монослои. В типичном эксперименте соединения тестируют в концентрации от 1х 10-10 до 1х 10-6 М.
Примеры осуществления ингибируют тромбин индуцированную проницаемость в этом испытании при концентрациях < 10-6 М.
2) Описание испытаний (in vivo).
2а) Измерение кровяного давления и сердечного ритма у телеметрических крыс Вистар с нормальным артериальным давлением.
Сердечно-сосудистые эффекты, вызванные соединениями в соответствии с настоящим изобретением, исследуются у свободно двигающихся самок крыс Вистар в сознании (масса тела > 200 г) путем радиотелеметрических измерений кровяного давления и частоты сердечных сокращений. Вкратце, телеметрическая система (DSI Data Science International, MN, USA) состоит из 3 основных элементов: имплантируемые передатчики (ТА11РА-С40), приемники (RA1010) и программное обеспечение на основе компьютера для сбора данных (Dataquest(tm) A.R.T. 4.1 для Windows). Крыс оснащали имплантатами давления для постоянного использования по крайней мере за 14 дней до экспериментов. Сенсорный катетер связан с 4-0 швом несколько раз, чтобы получить пробку 0.5 см от кончика катетера. Во время имплантации катетера крыс анестезировали с помощью пентобабитала (нембутал, санофи: 50 мг/кг внутрибрю-шинно). После бритья кожи с брюшка по средней линии живота делали разрез и заполненный жидкостью сенсорный катетер вставляли вверх по потоку в открытую нисходящую аорту между подвздошной бифуркацией и почечными артериями. Катетер связывали несколько раз возле пробки. Кончик телеметрического катетера находится именно каудально в отношении почечных артерий и закреплен с помощью тканевого клея. Корпус передатчика прикреплен к внутренней стенке брюшины перед закрытием брюшной полости. Двухслойная укупорка брюшного разреза используется с индивидуальным сшиванием брюшины и мышечной стенки с последующим закрытием внешней обшивки. Для послеоперационной защиты от инфекций и боли вводили одну дозу антибиотика (окситетрациклин 10% R, 5.0 мл/кг подкожно, beta-pharma GmbH &Co, Germany) и обезболивающего (римадил R, 5.0 мл/кг подкожно, Pfizer, Germany). Аппаратная конфигурация была оборудована для 24 животных. Каждая клетка с крысой находилась на верхней части индивидуальной принимающей платформы. После активации имплантированных передатчиков, система сбора данных он-лайн отбирает образцы и преобразует телеметрические сигналы давления в мм рт. ст. Показатель атмосферного давления необходим в связи с отношением абсолютного
давления (по отношению к вакууму) к окружающему атмосферному давлению. Программное обеспечение сбора данных предопределено, чтобы отбирать гемодинамические данные в течение 10 интервалов с интервалом каждые 5 мин. Сбор данных в файл запускают за 2 ч до введения испытуемых соединений и заканчивают после завершения 24-часовых циклов. В типичном эксперименте тестируемые соединения вводят в виде болюса или подкожно или внутривенно в дозе от 1 до 1000 мкг/кг веса тела (как указано для пептидного компонента).
Дикий тип адреномедуллина (Bachem, H-2932) индуцирует снижение кровяного давления в этом исследовании с длительностью < 4 ч при испытании при дозах < 300 мкг/кг веса тела [фиг. 1].
Фиг. 1: 24-часовые профили среднего артериального кровяного давления (САКД), записывали у телеметрических нормотензивных самок крыс Вистар после подкожного введения ADM или наполнителя, как указанно (пунктирная линия). Точки данных были построены в качестве среднего значения ± РЭМ усредненных 30 мин интервалов от 4 животных на группу. Через 1 ч после введения животным, получавшим ADM, было показано среднее снижение САКД почти на 20% на пике (зарисованные кружки). Примерно через 3.5 ч САКД вернулись к уровням базовой линии и были в диапазоне, как у животных, которым вводили наполнитель (незарисованные кружки).
В этом тесте вещества в соответствии с настоящим изобретением вызывают снижение кровяного давления до 10 ч в дозах < 500 мкг/кг массы тела (в отношении пептидного компонента) [фиг. 2].
Фиг. 2: 24-часовые профили среднего артериального кровяного давления (САКД), записывали у телеметрических нормотензивных самок крыс Вистар после подкожного введения примера 1 или наполнителя, как указанно (пунктирная линия). Точки данных были построены в качестве среднего значения ± РЭМ усредненных 30 мин интервалов от 6 животных на группу. Введение примера 1 в дозе 150 мкг/кг (в отношении пептидного компонента) снизило САКД примерно на от 15 до 19% до 6 ч после введения (зарисованные кружки). Между 6 ч и 14 ч после введения САКД постепенно вернулось к исходным значениям и, наконец, было в диапазоне, как у животных, которым вводили наполнитель (незарисованные кружки).
2б) Пропотевание жидкости из сосудов через кожу у крыс.
Внутрикожно тест со стимулированием гистамином используется для оценки влияния соединений в соответствии с настоящим изобретением на барьерную функцию сосудов у здоровых животных. Самцов крыс Спрага-Доули (масса тела> 200 г) анестезировали с помощью изофлурана (2-3% в атмосферном воздухе) и приводили в положение лежа на спине. Брюшки брили и вставляли катетер в бедренную вену. Только наполнитель (0.5 мл PBS + 0.1% бычий сывороточный альбумин) или тестируемые соединения в соответствующих дозах вводили внутривенно в качестве болюсных инъекций. После 15 мин вторую инъекцию 100 мкл/кг 2% раствора голубого Эванса (Sigma) вводили и сразу же после этого 100 мкл раствора гистамина соответствующих концентраций (например, для 0-2.5 - 5 - 10-20-40 мкг/мл) вводили внутрикожно в кожу живота. Эванс голубой является сильным красителем связи белка плазмы и поэтому используется в качестве индикатора для богатой белком экстравазационной жидкости и утечки сосудов. Через 30 мин после этой процедуры крыс умерщвляли передозировкой изофлурана и последовательной дислокацией шеи и кожу живота вырезали. Волдыри вырезали путем использования 8 мм дерматома, образцы тканей взвешивали и передавали к формамиду в течение 48 ч в целях извлечения Эванса голубого. Образцы оценивали при 620 и 750 нМ длине волны на подходящем фотометре и содержание голубого Эванса в образцах корректировали для гема пигментов в соответствии с формулой А620 (исправлено) = А620 - (1.426 X А750 + 0.030), и рассчитывали по стандартной кривой [способ адаптирован из Wang L.F., Patel M., Razavi H.M., Weicker S., Joseph M.G., McCormack D.G., Mehta S., Am. Respir Crit Care Med, 165(12), 1634-9 (2002)].
Вещества в соответствии с настоящим изобретением снижают экстравазацию плазменной жидкости, обогащенной белком, вызванную гистамином в этом тесте. 2в) Введение ЛПС у трахею у мышей.
Тест со стимулированием липополисахаридом (ЛПС) внутри трахеи использовали для изучения влияния соединений в соответствии с настоящим изобретением на острое повреждение легких. Самцы популяции мышей BALB/c (средний вес животных 20-23 г) анестезировали изофлураном (7%) и ЛПС от Е. coli (например, серотип 055:В5; Sigma) вводили в 100 мкл физиологического раствора путем использования микропипетки. Типичные дозы ЛПС, используемые для теста, составляют от 1 до 10 мг/кг массы тела. В разные моменты времени до и после испытания испытуемые соединения вводили подкожно. Типичные дозы составляли от 1 до 300 мкг/кг массы тела. В этом тесте типичными временными точками введения испытуемых соединений являлись 15 мин до или через 1 ч после инъекции ЛПС. Через 48 ч после введения ЛПС мышей глубоко анестезировали изофлураном и умерщвляли путем дислокации шеи. После пункции осуществляли лаваж трахеи бронхоальвеолярного пространства с помощью 0.5 мл ледяного солевого раствора. Легкие были подготовлены и взвешены. Клетки в ЖБЛ (жидкость бронхоальве-олярного лаважа) подсчитывали на цитометре (Cell Dyn 3700, Abbott). В этом тесте вес легких в качестве меры отека легких воспроизводимо установлен, как увеличенный примерно на 50% или более по сравнению с фиктивными контролями через 48 ч после инъекции ЛПС. Поскольку вес легких показывает толь
ко очень низкую изменчивость в самых группах, абсолютный вес легких используется в качестве параметра. Счетчики для белых кровяных клеток всегда установлены, как значительно увеличенные по контролю ЖБЛ после ЛПС.
Введение веществ в соответствии с настоящим изобретением привело к значительно сниженному весу легких и количеству белых кровяных клеток в ЖБЛ после 48 ч при болюсном введении в дозах < 300 мкг/кг массы тела (в отношении пептидного компонента).
2г) Индукция острого повреждения легких у мини-свиней.
Острое повреждение легких индуцируется у анестезированных мини-свиней с использованием ли-пополисахарида (ЛПС) или олеиновой кислоты в качестве стимула. В деталях: самки минипигов Геттин-ген от 3.5 до 5.5 кг массы тела (Ellegaard, Denmark) держали под наркозом с помощью непрерывной внутривенной инфузии летаветом(r), дормикумом(r) и панкуронием(r) после премедикации с помощью внутримышечной инъекцией кетавета(r)/стреснила(r). После внутритрахеальные интубации животным искусственно насыщали кровь кислородом с помощью педиатрического респиратора (Sulla 808V; Drager, Germany) с помощью воздушной смеси кислорода дыхательным объемом от 30 до 50 мл и постоянной частоте 25 мин-1. Артериальное РаСО2 доводят до около 40 мм рт. ст., регулируя часть вдыхаемого кислорода (FiO2) через отношение кислорода воздушной смеси. По стандартной методике следующие сердечно-сосудистые и респираторные параметры измеряли после размещения необходимых зондов и катетеров, установленные на соответствующих датчиков давления и записывающем оборудовании: центральное венозное давление (через левую яремную вену), артериальное кровяное давление и частота сердечных сокращений (АКД и ЧСС; через левую сонную артерию), давление в левом желудочке (ДЛЖ; используя катетер Миллара [FMI, Mod.:SPC-340S, REF: 800-2019-1, 4F], введенный в левый желудочек через правую сонную артерию), давление в легочной артерии (ДЛА; с помощью ангиографического баллонного катетера ARROW Berman [REF.: AI-07134 4 Fr. 50 см], помещенного в легочную артерию через левую яремную вену), минутный объем сердца (МОС) и индекс внесосудистой воды легких (ИВВЛ) с применением системы PiCCO (Pulsion, Germany), подсоединенной к Pulsion 4F-катетеру термодилюции (PV2014L08N), помещенному в правую бедренную артерию. Катетеры для измерения ЦВД, АКД, ЧСС, ДЛЖ и ДЛА установлены на системы записи Ponemah. Анализ газа артериальной крови выполняется для определения РаО^Ю2. В соответствии с Американо-Европейской конценсусной конференцией по ОРДС РаО2Я7Ю2 < 300 мм рт. ст. рассматривается как указывающий на наличие острого повреждения легких. В зависимости от длительности задействованного протокола длительность экспериментов варьировалась от 4 и 5 ч после введения стимула, вызывающего травму легких. В конце эксперимента свиней умерщвляют путем обескровливания и жидкость бронхоальвеолярного лаважа (ЖБЛ) собирали из легких. Клеточное содержание ЖБЛ определяли с использованием цитометра клеток крови (Cell DYN 3700).
В типичной установке острое повреждение легких индуцируется введением в трахею липополиса-харида (ЛПС; E.coli 0111:В4; Sigma L2630) в солевом растворе в дозе 5 мг/кг массы тела в каждое легкое через интубационную трубку. ДЛА и ИВВЛ увеличились, a PaO2/FiO2 снизились ниже 300 мм рт. ст. в ответ на стимулирующее вещество. Клеточное содержание ЖБЛ значительно увеличилось. Введение соединения 1 по данному изобретению, в качестве внутривенной инъекции болюса за 15 мин до введения ЛПС уменьшило или помешало изменениям, вызванных ЛПС.
В другом протоколе олеиновую кислоту (OK; Sigma-Aldrich, 01008) разбавленную с помощью ета-нола (1:1) вводили внутривенно в течение более 15 мин в конечной дозе 100 мг/кг массы тела. Стимулирование с помощью ОК привело к увеличению ДЛА и ИВВЛ и снижению PaO2/FiO2 ниже 300 мм рт. ст. Изменения уменьшили или предотвратили путем введения соединения 1 по настоящему изобретению за 15 мин до начала инфузии ОК.
Дозы примера 1 < 30 мкг/кг массы тела (в отношении пептидного компонента) оказались активными в описанных тест-системах.
В. Примеры осуществления фармацевтических композиций.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут быть превращены в фармацевтические препараты посредством следующих способов: Раствор для введения внутривенно.
Соединение в соответствии с настоящим изобретением растворяли в концентрации ниже растворимости насыщения в физиологически приемлемом растворителе (например, буферы с рН от 4 до 7, изотонический раствор хлорида натрия, раствор глюкозы 5% и/или ПЭГ 400 раствор 30%). Раствор стерилизовали с помощью фильтрации и заполняли стерильные и апирогенные контейнеры инъекций.
Раствор для введения подкожно.
Соединение в соответствии с настоящим изобретением растворяли в концентрации ниже растворимости насыщения в физиологически приемлемом растворителе (например, буферы с рН от 4 до 7, изотонический раствор хлорида натрия, раствор глюкозы 5% и/или ПЭГ 400 раствор 30%). Раствор стерилизовали с помощью фильтрации и заполняли стерильные и апирогенные контейнеры инъекций.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
в которой n представляет собой число 0, 1, 2 или 3;
R1 представляет собой водород, метил, этил, н-пропил или изопропил;
R2 представляет собой линейный или разветвленный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой, или его сольваты.
2. Соединение по п.1, которое отличается тем, что n представляет собой число 1 или 2;
R1 представляет собой водород или метил;
R2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой.
3. Соединение по любому из пп.1 и 2, которое отличается тем, что n представляет собой число 1 или 2;
R1 представляет собой водород;
R2 представляет собой линейный ПЭГ 40 кДа с концевой метоксигруппой.
4. Способ получения соединения формулы (I) или его сольватов по п.1, которое отличается тем, что
соединение формулы (II)
2 52
"RQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIVQFTDKDKDNVAPRSKISPQGV-NH;
do.
в которой R2 имеет значение, как указано в п.1.
5. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, которые могут подвергаться терапии адреномедуллином.
6. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний.
7. Лекарственное средство, обладающее активностью адреномедуллина, содержащее соединение по любому из пп.1-3 в сочетании с инертным нетоксичным фармацевтически пригодным эксципиентом.
8. Лекарственное средство по п.7 для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, отечных и/или воспалительных заболеваний.
9. Применение соединения по любому из пп.1-3 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемического и/или геморрагического инсульта, гипертонии, легочной гипертензии, окклюзионного заболевания периферических артерий, преэклампсии, хронической обструктивной болезни легких, астмы, острого и/или хронического отека легких, нейрогенного отека легких, острых и/или хронических легочных проявлений, вызванных радиацией, острых и/или хронических интерстициальных заболеваний легких, острого повреждения легких/острого респираторного дистресс-синдрома (ОПЛ/ОРДС) у взрос
5.
лого или ребенка, включая новорожденных, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к пневмонии и сепсису, аспирационной пневмонии и ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к аспирации, ОПЛ/ОРДС вторично по отношению к вдыханию коптильного газа, синдрому острого посттрансфузионного повреждения легких (СОППЛ), ОПЛ/ОРДС или острой легочной недостаточности после операции, травмы и/или ожогов, вентиляторного повреждения легких (ВПЛ), повреждения легких, следующего за аспирацией мекония, легочного фиброза, горной болезни, гломерулонефрита, острого повреждения почек, лимфедемы, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, септического шока, синдрома системной воспалительной реакции (ССВР) неинфекционного происхождения, анафилактического шока и/или крапивницы.
[п = 6 животных]
Фиг. 2
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025631
025631
- 1 -
- 1 -
(19)
025631
025631
- 1 -
- 1 -
(19)
025631
025631
- 1 -
- 1 -
(19)
025631
025631
- 4 -
- 3 -
(19)
(VIII).
025631
025631
- 7 -
- 6 -
025631
025631
- 9 -
- 9 -
025631
025631
- 28 -
- 28 -
025631
025631
- 28 -
- 28 -
|
