[RU]

1. Супрамолекулярная смесь антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, полученная при частичном гидролизе полинуклеотидов с последующим ацилированием или алкилированием аминогрупп нуклеотидных оснований олигонуклеотидов, которая обеспечивает способность олигонуклеотидов связываться со своими немодифицированными предшественниками и мишенями в мРНК раковой клетки посредством ионных и смешанных связей.

2. Супрамолекулярная смесь по п.1, где ацилирование проводят ангидридами ди- и трикарбоновых кислот.

3. Супрамолекулярная смесь по п.1, где алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.

4. Способ получения супрамолекулярной смеси антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, которые способны связываться со своими немодифицированными предшественниками и мишенями в мРНК раковых клеток посредством ионных и смешанных связей, где способ включает частичный гидролиз полинуклеотидов и затем ацилирование или алкилирование аминогрупп нуклеотидных оснований олигонуклеотидов.

5. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой ДНК.

6. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой РНК.

7. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК из дрожжей.

8. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК животного происхождения.

9. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК растительного происхождения.

10. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК микробного происхождения.

11. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК из дрожжей.

12. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК животного происхождения.

13. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК растительного происхождения.

14. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК микробного происхождения.

15. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК из дрожжей.

16. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК животного происхождения.

17. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК растительного происхождения.

18. Способ по п. 4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК микробного происхождения.

19. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой ферментативный гидролиз.

20. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой кислотный гидролиз.

21. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой щелочной гидролиз.

22. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой гидролиз синтетическими нуклеазами.

23. Способ по п.4, где ацилирование проводят янтарным ангидридом.

24. Способ по п.4, где алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.

(57) Реферат / Формула:

1. Супрамолекулярная смесь антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, полученная при частичном гидролизе полинуклеотидов с последующим ацилированием или алкилированием аминогрупп нуклеотидных оснований олигонуклеотидов, которая обеспечивает способность олигонуклеотидов связываться со своими немодифицированными предшественниками и мишенями в мРНК раковой клетки посредством ионных и смешанных связей.

2. Супрамолекулярная смесь по п.1, где ацилирование проводят ангидридами ди- и трикарбоновых кислот.

3. Супрамолекулярная смесь по п.1, где алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.

4. Способ получения супрамолекулярной смеси антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, которые способны связываться со своими немодифицированными предшественниками и мишенями в мРНК раковых клеток посредством ионных и смешанных связей, где способ включает частичный гидролиз полинуклеотидов и затем ацилирование или алкилирование аминогрупп нуклеотидных оснований олигонуклеотидов.

5. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой ДНК.

6. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой РНК.

7. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК из дрожжей.

8. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК животного происхождения.

9. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК растительного происхождения.

10. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК микробного происхождения.

11. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК из дрожжей.

12. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК животного происхождения.

13. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК растительного происхождения.

14. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК микробного происхождения.

15. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК из дрожжей.

16. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК животного происхождения.

17. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК растительного происхождения.

18. Способ по п. 4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК микробного происхождения.

19. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой ферментативный гидролиз.

20. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой кислотный гидролиз.

21. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой щелочной гидролиз.

22. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой гидролиз синтетическими нуклеазами.

23. Способ по п.4, где ацилирование проводят янтарным ангидридом.

24. Способ по п.4, где алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.

---

Евразийское 025625 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201300489
(22) Дата подачи заявки
2010.11.22
(51) Int. Cl.
C07H21/00 (2006.01) A61K31/7088 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) C07B 47/00 (2006.01)
(54) МОДИФИЦИРОВАННЫЕ АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ С ПРОТИВОРАКОВЫМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
(43) 2013.08.30
(86) PCT/RU2010/000691
(87) WO 2012/070965 2012.05.31
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ФАРБЕР БОРИС СЛАВИНОВИЧ; ФАРБЕР СОФЬЯ БОРИСОВНА (RU)
(72) Изобретатель:
Мартынов Артур Викторович (UA), Фарбер Борис Славинович, Фарбер Софья Борисовна (RU)
(74) Представитель:
Васильева Г.С. (RU)
(56) Martynov A. V. et al. New approach to design and synthesis of therapeutic and preventive drugs, taking into account interspecies polymorphism of receptors (method of precision partial modification). Annals of Mechnicov Institute, 2007, №4, p. 5-13 US-A-5854224
Oliver C. Richards et al. Chemical mechanism of sonic, acid, alkaline and enzymic degradation of DNA. J. Mol. Biol, 1965, 11, p. 327-340
Robert Haner et al. The sequence-specific cleavage of RNA by artificial chemical ribonucleases, Antisense & Nucleic acid drug development, 1997, 7:423-430
US-B1-6316426
(57) Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для создания препарата, эффективного для лечения онкологических заболеваний человека и животных. Суть изобретения: модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения, отличающиеся тем, что в качестве олигонуклеотидов используют смесь продуктов гидролиза полинуклеотидов, а модификацию проводят путем изменения на противоположный знак зарядов молекул нуклеотидных оснований, приобретающих при этом антикомплиментарные свойства. Гидролиз полинуклеотидов проводят с применением природных или синтетических нуклеаз, кислотного или щелочного гидролиза, а модификацию структуры -путем ацилирования аминогрупп мононуклеотидов в структуре олигонуклеотидов ангидридами дикарбоновых кислот или путем алкилирования галогенкарбоновыми кислотами. Разработанная смесь обладает способностью селективно связываться с мРНК и останавливать тем самым синтез белка в раковых клетках подобно действию микроРНК. Применение препарата в связи с его способностью адаптироваться к организму позволяет преодолевать привыкание опухоли к препарату. Средство имеет широкий спектр действия, малотоксично и доступно для промышленного производства, эффективно на всех стадиях ракового процесса.
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно к фармации и онкологии, и предназначено для лечения онкологических заболеваний человека.
Предшествующий уровень техники
Среди существующих новых направлений в лечении онкологических заболеваний существует ряд весьма перспективных подходов. Одним из таких подходов можно считать разработку препаратов для генной терапии рака [:]. В данном подходе основным действующим началом являются полинуклеотиды. Генную терапию можно разделить на две большие группы: средства для инактивации генов [2] и средства для внесения генного материала внутрь клетки [3]. Инактиваторы генов еще называют antisense полинуклеотиды [4]. Многочисленные исследования, которые проводятся в данном направлении, реально эффективных in vivo препаратов не выявили. Это связано с целым рядом проблем: синтезированные ДНК (РНК) быстро разрушались нуклеазами крови [5], не проникали внутрь клеток, разрушались системами репарации генома [6]. Иногда in vitro наблюдалась кратковременная блокада экспрессии белков-мишеней, накопление в гепатоцитах [7]. Существуют разные подходы к проектированию antisense олиго-нуклеотидов, но принцип их взаимодействия с мишенями остается один: образование водородных связей между комплементарными нуклеотидами при увеличении степени устойчивости к нуклеазам [8]. В одних случаях разработчики защищали от действия нуклеаз 5'- конец олигонуклеотида, в других - модифицировали 3'- конец [910]. Исследователи из США заменили дезоксирибозильные остатки на фрагменты морфолина с целью создать устойчивые к действию нуклеаз фрагменты ДНК (РНК) [1112]. При этом принцип инактивации генов путем их комплементарного взаимодействия с antisense-нуклеотидами остался прежним - образование водородных связей. Именно эта водородная связь и является основной причиной неэффективности существующих препаратов на основе antisense - ДНК (РНК). Ферменты типа геликаз [13] очень быстро и легко раскручивают гибридизованную с геном-мишенью antisense - ДНК и активность гена снова восстанавливается.
Известны нуклеотидные последовательности, связанные с развитием рака предстательной железы и легких [14]. Механизм действия этих микроРНК связан с подавлением синтеза белка, через блокаду трансляции матричной РНК. Авторы запатентовали последовательности микроРНК, подтвердили их эффекты в клеточных культурах, показали специфичность данных олигонуклеотидов к этим двум видам опухолей. Основными недостатками патента является то, что авторы не показали возможные пути применения данных микроРНК для борьбы с онкологическими заболеваниями, не показали, как можно защитить эти олигонуклеотиды от действия нуклеаз в организме, не показали противоракового эффекта препаратов на основе этих микроРНК.
Наиболее близким прототипом являются олигонуклеотиды содержащие модифицированные и неприродные нуклеотидные основания [15]. Механизм действия запатентованных олигонуклеотидов был аналогичен antisense RNA и micro RNA, а препараты могли применяться в лечении, в том числе онкологических заболеваний. Недостатком патентуемых олигонуклеотидов является применение природного принципа образования связи с РНК-мишенью - водородной связи, чувствительной к нуклеазам и гелика-зам. Кроме того, патентовалась четкая статическая химическая структура, не способная адаптироваться к окружающим условиям. Применение объекта данного патента не было эффективным в экспериментах на моделях животных при онкологических заболеваниях, кроме того, данная разработка применима более для диагностических и скрининговых исследований in vitro, чем создание препаратов для лечения животных и человека в связи с тем, что предлагаемые модификации нуклеотидных оснований являются новыми ксенобиотиками и не подлежат безопасному метаболизму и биодеградации в организме.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставленная задача разработать модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения.
Поставленная задача решается путем получения модифицированных антикомплементарных олиго-нуклеотидов с противораковыми свойствами, отличающимися тем, что в качестве олигонуклеотидов используют смесь (ансамбль) продуктов гидролиза полинуклеотидов, а модификацию проводят путем изменения на противоположный знак зарядов молекул нуклеотидных оснований, приобретающих при этом антикомплиментарные свойства.
Также поставленная задача решается путем разработки способа получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, отличающегося тем, что для их получения сперва проводят частичный гидролиз полинуклеотидов (ДНК, РНК или их смеси) растительного, животного, микробного или грибкового происхождения химическим или биохимическим (ферментативным) путем, а затем проводят процесс химической модификации суммы полученных олигонуклео-тидов с заменой заряда молекул их нуклеотидных оснований на противоположный путем алкилировани-ем монохлоруксусной кислотой или ацилированием янтарным ангидридом и используют в качестве противоракового средства смесь (ансамбль) из полученных антикомплементарных олигонуклеотидов.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А - специфичная гибридизация ацилированных РНК только со своими предшественниками (фиг. 1В - та же реакция с ДНК-плазмидами).
Фиг. 2 - замена водородной связи на ионную при образовании гибридов между антикан и мишенями.
Фиг. 3 - саркома. Окраска гематоксилин - эозин.
Лучший вариант осуществления изобретения
В наших ранних исследованиях при изучении ацилированных полинуклеотидов был выявлен новый феномен: ацилированные по экзоциклическим аминогруппам полинуклеотиды селективно гибридизуют-ся только со своими неацилированными предшественниками. Плазмида pUC18 гибридизовалась только со своим ацилированным производным, а плазмида pBR322 гибридизовалась, соответственно, только с ацилированной pBR322 (фиг. 1А и 1В). При этом образовывались нерастворимые, неплавкие конъюгаты. Именно свойство неплавкости отличало классические двухспиральные ДНК от полученных гибридов. Они не плавились ни при какой температуре и не растворялись ни в чем, кроме концентрированных щелочей. Данное свойство синтезированных ацил-ДНК мы объясняем изменением самого принципа образования связи между цепями ДНК: с водородной на ионную и смешанную.
Такая связь (фиг. 2) абсолютно не предусмотрена природными механизмами репарации. Таким образом, клеточные геликазы и нуклеазы будут неэффективными при образовании гибридов между такими ацил-ДНК (РНК) и их неацилированными предшественниками. Кроме полинуклеотидов, нами была показаны зависимость заряд-активность и в ряду других ацилированных биополимеров: белков, полисахаридов, полинуклеотидов, таннидов, бактериофагов, иммуноглобулинов. На основе этих исследований разработан и внедрен новый ветеринарный противовирусный препарат [16]. Нами было установлено, что определенная прецизионная модификация структуры биополимера способна или увеличить его биологическую активность, полностью изменить свойства или привести к образованию самоорганизующихся структур. Обнаруженные нами закономерности были положены в основу принципа получения мик-роРНК с ацилированными экзоциклическими аминогруппами. Нами использован ансамбль из олигонук-леотидов - продуктов гидролиза полинуклеотидов, но с измененными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии - супра-молекулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т.е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших пространственных структур в живой клетке [1718].
Данный препарат получил название антикан. Ранее нами были изучены липосомальные формы некоторых перспективных препаратов и на основе тех данных разработана лекарственная форма для анти-кан
МикроРНК - это новый класс некодирующих РНК длиной 18-25 нуклеотидов, которые негативно регулируют посттрансляционную экспрессию генов. Механизм действия этих малых фрагментов РНК основан на взаимодействии (гибридизации) микроРНК с матричной РНК прямо в полирибосомальном комплексе. Такая гибридизация приводит к остановке синтеза конкретного белка. Роль микроРНК в он-когенезе и перспективы использования микроРНК в терапии рака представлены в обзоре [19]. Но мик-роРНК не способны самопроизвольно проникать через клеточную мембрану. В настоящий момент ведутся исследования по созданию разнообразных транспортных систем для доставки микроРНК в клетки-мишени. Наиболее перспективными носителями являются липосомы, полимерные наночастицы, самоорганизующиеся полимеры.
Известна способность многих аденокарцином захватывать из межклеточного матрикса посредством пиноцитоза олигонуклеотиды и наночастицы [2021]. При этом здоровые клетки не способны захватывать малые олигонуклеотиды и липосомы [22]. Это обеспечивает селективность накопления антикан в раковых клеток и отсутствие токсичности у препарата. Для получения антикан нами была использована суммарная дрожжевая РНК, фрагментированная панкреатической нуклеазой до фрагментов размерами от 2 до 15 н. Затем экзоциклические аминогруппы этих олигонуклеотидов были модифицированы с заменой заряда. Для усиления накопления антикан в опухоли, он был включен в моноламелярные фосфотидилхо-линовые липосомы. Селективное накопление в раковой клетке антикан приводит к его гибридизации с комплементарными мишенями в матричной РНК раковой клетки и к постепенной остановке синтеза белка, антикан блокирует не только интронные, но экзонные области в матричной РНК, что приводит практически к мгновенной остановке синтеза белка Действие антикан основано на индукции апоптоза через остановку синтеза белка, антикан фактически не влияет на здоровые клетки, блокирует синтез всех клеточных белков, исключает адаптацию раковой опухоли к терапии и селекцию устойчивых клеток.
Молекулярный механизм действия препарата не изучался.
Антикан кроме противораковой активности in vitro, также проявил высокую активность in vivo на моделях бензидиновой саркомы у крыс, асцитной аденокарциномы Эрлиха у мышей (данные представлены в отчете).
Пример 1. Получение ансамбля (смеси) модифицированных олигонуклеотидов (Антикан). Микробная биомасса содержит до 11% нуклеиновых кислот и может служить сырьем для получе
ния микробной РНК, на основе которой возможно получение деринатов, представляющих собой смесь олигонуклеотидов. Объектом исследований данного этапа работы явилась РНК, выделенная из биомассы дрожжей p. Saccharomyces cerevisiae.
Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. Размораживали при комнатной температуре 4 кг прессованных дрожжей, измельчали их и суспендировали в 8 л кипящей воды, содержащей 300 г ДДС-Na. Суспензию кипятили 40 мин при непрерывном перемешивании, затем разливали по стальным центрифужным стаканам, помещали их немедленно в лед и охлаждали до 5°С (~15 мин), после чего центрифугировали на центрифуге 6K15 производства Германии (17000 г, 10 мин, 4°С). Осадок и часть желеобразной интерфазы отбрасывали, а перешедшую в надосадочную жидкость РНК очищали. Для этого к надосадочной жидкости, полученной на предыдущей стадии, добавляли NaCl до конечной концентрации 3М. После растворения соли суспензию выдерживали в течение 1 ч для формирования осадка, который далее отделяли центрифугированием при 17000 г, в течение 10 мин. Осадок промывали двумя порциями по 8 л 3М NaCl, суспендировали в 2 л этанола и оставляли на ночь. На следующий день суспензию центрифугировали при 17000 г, в течение 10 мин. Осадок растворяли в дистиллированной воде до концентрации РНК 450 D260, ед./мл (~1,6 л). Раствор осветляли центрифугированием при тех же условиях, после чего из надосадочной жидкости РНК осаждали, добавляя NaCl до конечной концентрации 0,15 М и равный объем этанола (~2 л). Сформировавшийся осадок отделяли от супернатанта центрифугированием (17000 г, 10 мин), промывали 1 л этанола и высушивали в вакуум - эксикаторе над CaCl. Все операции проводили при 0-4°С.
Выделение высокополимерной РНК из пекарских дрожжей.
День 1 - экстракция РНК. Растворяли 7,5 г ДДС-Na в 300 мл воды в термостойком стеклянном стакане на 1 л, доводили раствор до кипения и высыпали в него в течение 5 мин 30 г сухих дрожжей так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 98°С. Полученную суспензию кипятили 40 мин при непрерывном перемешивании и по мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 300 мл. По окончании экстракции суспензию охлаждали до ~60°С, добавляли в нее свежевскипяченную воду до 450 мл, перемешивали, переносили в мерный цилиндр на 500 мл и ставили отстаиваться при 20°С на 22 ч.
День 2 - высаливание РНК и промывка высоленной РНК 3М NaCl. Отстоявшийся супернатант (280 мл) переносили в мерный стеклянный стакан объемом 500 мл, добавляли в него 81 г NaCl и воду до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19°С на 6 ч. Через 6 ч образовавшуюся интерфазу (250 мл) отбирали, а в разделившуюся на 2 фракции (часть осела, часть всплыла) высоленную РНК добавляли 3М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19°С на ночь.
День 3 - промывка высоленной РНК 3М NaCl.
Интерфазу (300 мл) отбирали, а к высоленной РНК добавляли 3М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19°С на 5 ч. Через 5 ч интерфазу (280 мл) отбирали, а к высоленной РНК добавляли 3М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19°С на 3 ч. Через 3 ч интерфазу (250 мл) отбирали, а к высоленной РНК добавляли 3М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19°С на ночь.
День 4 - промывка высоленной РНК спиртом. Верхнего слоя почти нет. Осадок занимает объем ~100 мл. Супернатант удаляли, а к осадку добавляли этанол до 300 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 18°С на 5 ч. Через 5 ч супернатант сливали, а к осадку (140 мл) добавляли свежую порцию этанола до 320 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19°С на 40 мин, после чего супернатант сливали, а к осадку (120 мл) добавляли 120 мл свежего этанола, перемешивали и через 30 мин отстоя супернатант сливали. К осадку (110 мл) добавляли 110 мл свежего этанола, перемешивали и через 30 мин отстоя супернатант сливали, а суспензию РНК выливали тонким слоем в плоскую ванночку и сушили на воздухе при комнатной температуре до отсутствия запаха спирта. Чистую высокополимерную РНК из высушенного полуфабриката выделяли экстракцией водой в целлофановом диализном мешке.
Ферментативный гидролиз полученной суммы РНК. В качестве нуклеазы была выбрана панкреатическая рибонуклеаза (РНК-аза) с активностью 14000 ед./мг в количестве 0,4% от массы РНК. Гидролиз РНК проводили в течение 4 ч. Гидролизат высушивали в распылительной сушилке.
Химическая модификация олигонуклеотидов гидролизата. Получали 3,5% водный раствор гидроли-зата, добавляляли янтарный ангидрид в количестве от 10 до 45% от сухой массы гидролизата, перемешивали на холоде до полного растворения ангидрида. Полученный раствор стерилизовали 120 мин текучим паром. Готовый раствор далее исследовали на предмет наличия противораковых свойств.
Пример 2. Изучение острой токсичности Антикана.
Было поставлено 36 серий опытов на 220 животных.
Среднесмертельную дозу антикана устанавливали на 3 видах животных: беспородных белых мышах массой 20-22 г, белых крысах массой 190-200 г и морских свинках массой 300-400 г обоего пола при внутривенном введении. С целью сравнения широты терапевтического действия антикана и препарата сравнения - таксотера - мы устанавливали среднесмертельную дозу таксотера также при внутривенном введении.
Расчет среднесмертельной дозы проводили по методу Б.М. Штабского с использованием уравнения:
Y-a
Х = (1)
где Y-% эффективности
а =
Х{-Х2
b =
где X1 и Х2 - значение двух крайних из трех исследованных доз, которые имеют эффект в менее или более 50% животных, третья доза является промежуточной;
Y1 и Y2 - проценты летальности, которые отвечают дозам X1 и Х2; ZY - сумма трех исследованных доз;
количество доз, которые использовались при расчетах, равно 3.
При подстановке к формуле (1) значения Y, которое составляет 50, 84, 16 процентов смертности, рассчитывали LD50, LD84 и LD16. Потом находили 8- среднюю ошибку среднесмертельной дозы, благодаря использованию формулы Миллера-Тейнтера
2 5
т= _____-
~Л/ 2N
-LD84-LDi6;
N - общее количество животных в группах, в которых погибло или выжило хоть одно животное, и устанавливали доверительные интервалы.
Мышам антикан вводили внутривенно медленно (перед использованием готовили векторные липо-сомы к сухому лиофилизированному порошку Антикан, который брали в соответствующих дозах, добавляли раствор 0,9% натрию хлорида) в дозах 1000, 1500, 2000, 2500, 3500 мкг/кг массы животного. Анализ результатов свидетельствует об о том, что среднесмертельная доза препарата для этого вида животных составляет 2780 мкг/кг.
Исследование антикана на крысах в дозах 1000, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 мкг/кг дало возможность рассчитать среднесмертельную дозу для этого вида животных - 2590 мкг/кг. Среднесмертельная доза антикана для для морских свинок составляет 2420 мкг/кг массы.
При внутривенном пути использования таксотера крысам LD 50 = 120 мкг/кг массы тела.
Сравнительная характеристика Антикана и Таксотера приведена в табл. 5.
Таблица 1
Анализ полученных данных, которые показаны в табл. 1, приводит к выводу о том, что антикан в липосомах менее токсичен, чем препарат таскотер, и превосходит препарат сравнения по эффективной дозе. Терапевтический индекс, который характеризует широту терапевтического действия, у антикана в 151,5 раз больше, чем у препарата сравнения благодаря липосомальной форме. Для экстраполяции токсичности антикана на человека мы рассчитали коэффициент видовой чувствительности (КВЧ) по формуле
LD50 (для крыс) 2590
КВЧ= = 0,9
LD50 (для мышей) 2780 Таким образом, антикан не имеет видовой чувствительности или она медленно выражена.
Пример 3. Противораковая активность антикана.
Определение противораковой активности антикана в клеточной культуре проводили в культуре клеток HeLa-2. Для этого к среде 199 добавляли разное количество антикана от 2 до 12 мкг/мл среды. (см.таб 2) Для контроля использовали культуру без антикана. Наблюдение за культурами клеток вели в течение 5 суток с ежедневным просмотром. Минимальной активной дозой (МАД) антикана считали такое его минимальное количество, которое вызывало дегенерацию 90-95% клеток (табл. 2)
Таблица 2
Сравнительная характеристика чувствительности культуры опухолевых клеток HeLa-2 относительно
антикана
Активность антикана при разной кислотности среды 199
1 Цитопатическое действие; ++++ дегенерация 100% клеток; 0 отсутствие дегенерации.
При установлении минимальной концентрации антикана, которая тормозит рост клеток проведено сопоставление количества клеток, которые выжили, и концентрацией антикана в растворе.
Таблица 3
Как видно из табл. 3, эффективная доза антикана находится в пределах между 8-12 мкг/мл раствора.
Антикан приводил к 95% дегенерации опухолевых клеток. Для подтверждения противоопухолевого действия in vivo антикан был исследован на моделях бензидиновой кожной саркомы и перевивной ас-цитной аденокарциномы у барбадосских мышей. На 5 мышах с аденокарциномой также исследовали распределение липосом антикана по организму животных благодаря флуоресцентному зонду, растворенному в фосфолипидной оболочке.
Пример 4. Изучение противораковой активности антикана на модели бензидиновой саркомы
(фиг. 3.).
Перед применением к силикагелю добавляли 7 мл раствору 2% бензидина в 0,9% натрия хлориде до образования опалесцирующей суспензии (1 г силикагеля на 5 мл физ. раствора). Двадцати пяти мышам барбадосской линии массой 18-20 г обоего пола, которых удерживали на рационе вивария через каждых 3 суток подкожно вводили возле шеи иммобилизированные на силикагеле бензидин и форболацетат. Через две недели у 18 животных появились опухоли разных размеров в виде небольшого бугра на шее около силикагелевой грануломы. Каждой группе животных вводили парентерально соответствующее соединение в дозе 100 мкг/кг массы два раза на сутки два недели, начиная с 16 дня после введения канцерогена.
Примечание: n=7, р> 0,05 по сравнению с контролем и предыдущими данными.
Как видно из табл. 4, антикан уменьшал массу подопытных животных на 10 г, при этом у контрольных животных масса тела продолжала расти, и некоторые из них умерли. После анатомического исследования силикагелевой грануломы было установлено, что животные, которых лечили антиканом не имели признаков злокачественного превращения грануломы в саркому.
Сроки гибели животных приведены в табл. 5.
Таблица 5
Примечание: n=10, р> 0,05 по сравнению с контролем и предыдущими данными. Таким образом, ан-тикан увеличивает вдвое против таксотера продолжительность жизни животных.
Пример 5. Исследование противоопухолевого действия Антикана на асцитной аденокарциноме Эр-
лиха.
Противоопухолевое действие композиций исследовали на моделях асцитной карциномы Эрлиха у молодых мышей барбадосской линии обоего пола массой 15-17 г (68 штук), которых выдерживали на рационе вивария.
45 мышам инокулировали от мыши с аденокарциномой инсулиновым шприцем 0,1 мл асцитной жидкости в область печенки. Через 7 суток у 42 мышей появились признаки опухоли (увеличилась масса тела и размеры живота), 2 мыши погибли на второй день, 1 мышь не подала признаки опухоли.
Десяти мышам вводили антикан в липосомальном виде(см. табл. 6) Еще 10 мышам вводили субстанцию антикана, еще десяти - 0,9% раствор натрия хлорида с липином.
Таблица 6
Количественные биологические и статистические характеристики при исследовании противоопухолевой
активности антикана
Средство
Липосомы
Срок гибели животных после первой инъекции. Среднее значение Суток.
Опытные животные
Контрольные животные
антикан
37.4±0,88
3,2±0,44
-//-
18+3,2
3,1 ±0,48
Таксотер
15±0,5
3±0,5
-II-
14±0,12
3±0,6
Примечание: n=10, р> 0,05 в сравнении с контролем и гфедыдущими данными.
Антикан вводили тем мышам, в которых брали кровь. Мыши с аденокарциномой Эрлиха после перевивки опухоли и лечения жили 18 суток при использовании субстанции антикана, что в 6 раз дольше, чем в контроле, и 37 суток при использовании антикана в липосомах, что в 12 раз дольше, чем в контроле. При достоверности больше 99,5% можно утверждать о значительном усилении противораковой активности липосомального антикана против контроля - таксотера. После анатомирования животных при
знаков опухолей и метастазов в органах животных найдено не было.
Пример 6. Исследование распределения липосом Антикана по организму животных.
Для исследования распределения липосом по органам животных использовали биологически инертный 5,6-бензокумарин, который имеет липофыильный характер и флюоресцентные свойства. Последний растворяли в спирте (0,5 М раствор), и добавляли к раствору Фосфолипиду при создании липо-сом в количестве 0,01 мл раствора кумарину на 10 мл раствора фосфолипида. Наибольшая флуоресценция наблюдалась в печени и в асцитной жидкости, которая подтверждает тропность липосом к опухоли. В контроле липосомы распределялись в селезенку, печень и лимфоузлы.
Распределение липосом изучали в организме мышей-опухоленосителей (5 животных) и здоровых крыс (5 животных) после инфузионного введения антикана. Антикан вводили в дозе 100 мкг/кг. Через 5 ч животных забивали, и исследовали интенсивность флюоресценции на флюориметре HP-F-40M.
Таблица 7
Накопление антикана в зависимости от скорости введения
Животные Орган Форма введения анти- Флуоресценция, % *
здоровые крысы
Животные
кана
медленное инфузионное введение
плазма 23.4±0,1
печень 26,1+0,1
легкие 0,5±0,1
селезенка 6,2+0,1
почки 32,2±0,1
кровь 25,6+0,1
быстрое в/в введенние
Орган Форма введения анти- Флуоресценция, % *
кана
мыши с
аденокарцином
-II-
-II-
-II-
-II-
Как видно из табл., при наличии опухоли, накопление антикана идет там, но в зависимости от срока инфузии. Чем быстрее вводится антикан, тем больше его накапливается в печени. Поэтому рациональным является введение антикана в виде медленных инфузий.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а конкретно к онкологии, и может быть использовано в лечение онкологических инфекций животных и человека.
Промышленная применимость
Изобретение относится к медицине и фармации, а именно к онкологии и фармации и может быть использовано для создания новых более эффективных противораковых препаратов, представляющих собой динамические самоадаптирующиеся и самоорганизующиеся системы. Полученные таким образом препараты являются полностью экологически безопасными, биодеградируемыми и полностью метаболи-зируемыми как в организме пациентов, так и в окружающей среде, а технологии их получения относятся к группе полностью безотходных. Производство подобных препаратов осуществимо на существующем оборудовании фармацевтических предприятий и не требует уникального оборудования. Сырьевая база доступна и не требует дополнительных усилий для выращивания или производства.
Использованные источники информации
' Galasso М, Elena Sana М, Volinia S. Non-coding RNAs: a key to future personalized molecular therapy?// Genome Med. 2010Feb 18;2(2):12.
2 Jung J. Solanki A. Memoli KA, Kamei K, Kim H, Drahl MA, Williams LJ, Tseng HR, Lee K. Selective inhibition of human brain tumor cells through multifunctional quantum-dot-based siRNA delivery// Angew Chem Int Ed Engl. 2010;49(l):103-7.
3 Li X, Liu Y, Wen Z, Li C. Lu H. Tian M, Jin K, Sun L, Gao P, Yang E, Xu X, Kan S, Wang Z, Wang Y. Jin N. Potent anti-tumor effects of a dual specific oncolytic adenovirus expressing apoptin in vitro and in vivo// Mol Cancer. 2010 Jan 20;9:10.
* Emmrich S, Wang W, John K, Li W, Piitzer BM. Antisense gapmers selectively suppress individual oncogenic p73 splice isoforms and inhibit tumor growth in vivo// Mol Cancer. 2009 Augll;8:61.
3 Fisher M. Abramov M, Van Aerschot A, Rozenski J, Dixit V, Juliano RL, Herdewijn P. Biological effects of hexitol and altritol-modified siRNAs targeting B-Raf// Eur J Pharmacol. 2009 Mar 15;606(l-3):38-44
6 Czauderna F, Fechtner M. Dames S. Aygun H, Klippel A, Pronk GJ, Giese K, Kaufmann J. Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells// Nucleic Acids Res. 2003 Jun 1;31(U):2705-16.
7 Crooke RM, Graham MJ, Martin MJ, Lemonidis KM, Wyrzykiewiecz T, Cummins LL. Metabolism of antisense oligonucleotides in rat liver homogenates. J Pharmacol Exp Ther. 2000 Jan;292(l): 140-9.
8 Monia BP, Johnston JF, Sasmor H, Cummins LL.Nuclease resistance and antisense activity of modified oligonucleotides targeted to Ha-ras. J Biol Chem. 1996 Jun 14;271(24): 14533-40.
9 Giles RV, Spiller DG, Green J A, Clark RE, Tidd DM. Optimization of antisense oligodeoxynucleotide structure for targeting bcr-abl mRNA. Blood. 1995 Jul 15;86(2):744-54.
10 Xodo L, Alunni-Fabbroni M, Manzini G, Quadrifoglio F. Pyrimidine phosphorothioate
oligonucleotides form triple-stranded helices and promote transcription inhibition. Nucleic
Acids Res. 1994 Aug 25;22(16):3322-30.
11 Sazani P, Weller DL, Shrewsbury SB. Safety pharmacology and genotoxicity evaluation of
AVI-4658.ini J Toxicol. 2010 Mar-Apr;29(2):143-56.
12 Mourich DV, Jendrzejewski JL, Marshall NB, Hinrichs DJ, Iversen PL, Brand RM.
Antisense targeting of cFLIP sensitizes activated T cells to undergo apoptosis and desensitizes
responses to contact dermatitis. J Invest Dermatol. 2009 Aug; 129(8): 1945-53.
Belon CA, Frick DN. Helicase inhibitors as specifically targeted antiviral therapy for hepatitis C. Future Virol. 2009 May l;4(3):277-293 14 Патент США № 7709616 "мнкроРНК и ее использование".
,s Патент США № 7579451 Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
16 http://www.agrovet.com.ua/index.php?id=25
17 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240
18 Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New
York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7)
19 Bagnyukoval T.V., Pogribny I P. Chekhun V.F. MicroRNAs in normal and cancer cells: A
New class of gene expression regulators// Experimental Oncology.-2006, N 28,- P. 263-269
20 Steinhauser I, Langer K, Strebhardt K, Spankuch B. Uptake of plasmid-loaded nanoparticles
in breast cancer cells and effect on Plkl expression. J Drug Target. 2009 Sep;17(8):627-37.
51 Lu JJ, Langer R, Chen J.A novel mechanism is involved in cationic Hpid-mediated functional
siRNA delivery. Mol Pharm. 2009 May-Jun;6(3):763-71. 22 Moreira JN, Santos A, Moura V, Pedroso de Lima MC, Sim6es S. Non-viral lipid-based
nanoparticles for targeted cancer systemic gene silencing. J Nanosci Nanotechnol. 2008
May;8(5):2187-204.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Супрамолекулярная смесь антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, полученная при частичном гидролизе полинуклеотидов с последующим ацилированием или алки-лированием аминогрупп нуклеотидных оснований олигонуклеотидов, которая обеспечивает способность олигонуклеотидов связываться со своими немодифицированными предшественниками и мишенями в мРНК раковой клетки посредством ионных и смешанных связей.
2. Супрамолекулярная смесь по п.1, где ацилирование проводят ангидридами ди- и трикарбоновых кислот.
3. Супрамолекулярная смесь по п.1, где алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.
4. Способ получения супрамолекулярной смеси антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, которые способны связываться со своими немодифицированными предшественниками и мишенями в мРНК раковых клеток посредством ионных и смешанных связей, где способ включает частичный гидролиз полинуклеотидов и затем ацилирование или алкилирование аминогрупп нуклеотидных оснований олигонуклеотидов.
5. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой ДНК.
6. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой РНК.
7. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК из дрожжей.
8. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК животного происхождения.
9. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК растительного происхождения.
10. Способ по п.5, где ДНК представляет собой ДНК микробного происхождения.
11. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК из дрожжей.
12. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК животного происхождения.
13. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК растительного происхождения.
14. Способ по п.6, где РНК представляет собой РНК микробного происхождения.
15. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК из дрожжей.
16. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК животного происхождения.
17. Способ по п.4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК растительного происхождения.
18. Способ по п. 4, где полинуклеотиды представляют собой смесь РНК и ДНК микробного происхождения.
19. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой ферментативный гидролиз.
20. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой кислотный гидролиз.
21. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой щелочной гидро
10.
лиз.
22. Способ по п.4, где частичный гидролиз полинуклеотидов представляет собой гидролиз синтетическими нуклеазами.
23. Способ по п.4, где ацилирование проводят янтарным ангидридом.
24. Способ по п.4, где алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.
22.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025625
- 1 -
(19)
025625
- 1 -
(19)
025625
- 1 -
(19)
025625
- 4 -
(19)
025625
- 7 -
025625
- 7 -
025625
- 7 -
025625
- 11 -