[RU]

1. Супрамолекулярная смесь олигопептидов с антивирусными свойствами, полученная при каталитическом гидролизе смеси разных белков или одного белка с последующим ацилированием или алкилированием аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов, которая обеспечивает способность олигопептидов тормозить попадание вирусной ДНК в клеточное ядро.

2. Супрамолекулярная смесь олигопептидов по п.1, отличающаяся тем, что ацилирование проводят ангидридами ди- и трикарбоновых кислот.

3. Супрамолекулярная смесь олигопептидов по п.1, отличающаяся тем, что алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.

4. Способ получения супрамолекулярной смеси олигопептидов с антивирусными свойствами, которые способны тормозить попадание вирусной ДНК в клеточное ядро, где способ включает каталитический гидролиз смеси разных белков или одного белка и затем ацилирование или алкилирование аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют один белок.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют смесь разных белков.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют смесь белков молока.

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют яичный белок.

9. Способ по п.4, отличающийся тем, что для каталитического гидролиза белков используют ферментативный гидролиз.

10. Способ по п.4, отличающийся тем, что для каталитического гидролиза белков используют синтетические пептидазы.

11. Способ по п.4, отличающийся тем, что ацилирование проводят янтарным ангидридом с массовым соотношением реагентов белок:ангидрид от 1:1 до 1:3.

(57) Реферат / Формула:

1. Супрамолекулярная смесь олигопептидов с антивирусными свойствами, полученная при каталитическом гидролизе смеси разных белков или одного белка с последующим ацилированием или алкилированием аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов, которая обеспечивает способность олигопептидов тормозить попадание вирусной ДНК в клеточное ядро.

2. Супрамолекулярная смесь олигопептидов по п.1, отличающаяся тем, что ацилирование проводят ангидридами ди- и трикарбоновых кислот.

3. Супрамолекулярная смесь олигопептидов по п.1, отличающаяся тем, что алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.

4. Способ получения супрамолекулярной смеси олигопептидов с антивирусными свойствами, которые способны тормозить попадание вирусной ДНК в клеточное ядро, где способ включает каталитический гидролиз смеси разных белков или одного белка и затем ацилирование или алкилирование аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют один белок.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют смесь разных белков.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют смесь белков молока.

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют яичный белок.

9. Способ по п.4, отличающийся тем, что для каталитического гидролиза белков используют ферментативный гидролиз.

10. Способ по п.4, отличающийся тем, что для каталитического гидролиза белков используют синтетические пептидазы.

11. Способ по п.4, отличающийся тем, что ацилирование проводят янтарным ангидридом с массовым соотношением реагентов белок:ангидрид от 1:1 до 1:3.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
025624
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201300487
(22) Дата подачи заявки
2010.11.22
(51) Int. Cl.
C07K2/00 (2006.01) C07K1/12 (2006.01) C12P21/06 (2006.01) A61K 38/01 (2006.01) A61K38/02 (2006.01) A61P31/12 (2006.01)
(54)
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПЕПТИДЫ С АНТИВИРУСНЫМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
(43) 2013.08.30
(86) PCT/RU2010/000701
(87) WO 2012/070975 2012.05.31
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ФАРБЕР БОРИС СЛАВИНОВИЧ; ФАРБЕР СОФЬЯ БОРИСОВНА (RU)
(72) Изобретатель:
Мартынов Артур Викторович (UA), Фарбер Борис Славинович, Фарбер Софья Борисовна (RU)
(74) Представитель:
Васильева Г.С. (RU) (56) OEVERMANN Anna et al., "The antiviral activity of naturally occurring proteins and their peptide fragments after chemical modification", Antiviral Research, 2003, 59, 23-33
LIN Li et al., "Maleic anhydride-modified chicken ovalbumin as an effective and inexpensive anti-HIV microbicide candidate for prevention of HIV sexual transmission", Retro virology, 2010, 7:37, the abstract, tables 1-3, figures 1, 2, 4
US-A-5869457
WOODARD SL et al., "Maize (Zea mays)-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from transgenic plants", Biotechnol Appl Biochem, 2003, Oct; 38(Pt 2): 123-30, the abstract, [found in 29.07.2011], found form PubMed, PMID: 127497069
TAE-GEE LEE et al., "Isolation of HIV-1 Protease-lnhibiting Peptides from Thermolysin Hydrolysate of Oyster Proteins", Biochemical and Biophysical Research communications, 1998, 253, p.
604-608, especially p. 605
(57) Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для создания препарата, эффективного при пероральном использовании в лечении многих вирусных инфекций, таких как грипп, герпес, цитомегаловирус. Суть изобретения: модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения, отличающиеся тем, что в качестве основного действующего вещества выступает смесь (ансамбль) олигопептидов - продуктов гидролиза белков с измененными на противоположный зарядами молекул, и для их получения сперва проводят частичный гидролиз белоксодержащего сырья, а затем проводят процесс химической модификации суммы полученных олигопептидов с заменой заряда их молекул на противоположный и используют в качестве антивирусного средства композицию из полученных олигопептидов. Эта сумма модифицированных олигопептидов способна тормозить активность гетеродимра р-импортина клетки и тормозить репликацию вирусов, репликационный цикл которых зависит от функций ядра. Ансамбль модифицированных олигопептидов на основе динамической самоорганизующейся системы эффективней в лечении вирусных инфекций, таких как грипп, герпес, вирусы болезней животных на всех стадиях развития инфекционного процесса, когда другие препараты неэффективны. Средство имеет широкий спектр действия, малотоксично и доступно для промышленного производства, эффективно на всех стадиях репликационного цикла зависимых от клеточного ядра вирусов.
Область техники
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к вирусологии, и предназначено для лечения вирусных заболеваний человека и животных.
Предшествующий уровень техники
Вирусные болезни составляют более 90% всей зарегистрированной инфекционной патологии. Но внедренных в производство противовирусных средств, очень мало. Такие вещества часто имеют токсичные свойства, небольшой спектр действия, к ним быстро появляется эффект привыкания. Таким образом, разработка противовирусных средств, которые бы не имели токсичных свойств, были эффективными в лечении широкого спектра вирусных инфекций, является актуальной задачей современной медицины. В настоящий момент известно очень мало веществ, которые были бы эффективны на всех этапах вирусной инфекции. Кроме интерферонов и их индукторов еще не известно таких веществ, которые бы одновременно объединяли лечебные и противовирусные свойства относительно широко распространенных вирусных заболеваний - ВИЧ/СПИД, герпеса, гриппа и др. Наиболее известным средством для лечения гриппа является ремантадин. Это вещество, которое блокирует только этап проникновения вируса в клетку и раннюю стадию специфической репродукции, не действует на патогенез заболевания. Долговременное использование этого препарата невозможно, потому что он имеет нейротропные эффекты и может вызывать галлюцинации, нарушать функции мозга благодаря торможению проведению импульса по нервному волокну.
Среди других веществ, эффективных в лечении гриппа, известен лейкоцитарный а-интерферон. Этот белок синтезируется в активированных лейкоцитах человека. Он обладает способностью вызывать резистентность к гриппу у клеток эпителия носоглотки. Но его лечебные свойства очень незначительны. Он малоэффективен на 2-6-й день заболевания гриппом и является профилактическим средством. Реком-бинантные интерфероны имеют большую стоимость и часто приводят к аллергическим реакциям. Кроме того, с развитием заболевания эффективность терапии интерефероном уменьшается, а резистентность вируса к интерферону увеличивается.
Ближайшим прототипом вещества, которое патентуется, являются модифицированные белки и их использование для контроля вирусных инфекций [1]. Это обработанные разными ангидридами и ацили-рующими средствами белки: альбумины, лактоферрин, трансферин, лактальбумин. Авторы запатентовали также механизм действия этих белков - торможение вирусной адгезии. Эти белки должны иметь молекулярную массу больше 60000 с небольшим колебанием. Показано значительное профилактическое антивирусное действие этих белков в опытах на культурах клеток. Вещества проявили активность относительно вирусов ВИЧ (человека и мартышки), гриппа, цитомегаловируса, полиовирусу, вируса леса Селмики, вируса Сендай, парагриппа, Коксаки вируса. Авторы показали, что ацилированные белки нетоксичны и могут защищать животных против инфицирования вирусами.
Прототип имеет ряд недостатков: он является сугубо профилактическим средством (на клетки, которые уже инфицированы вирусом, такие белки лечебного эффекта не оказывали) и не имеет лечебных свойств у инфицированных животных. В связи с тем, что прототип является высокомолекулярным белком, он может быть использован только для парентерального применения, препарат представляет собой индивидуальное соединение и не представляет собой динамической самоорганизующейся системы и соответственно вирусы будут быстро адаптироваться к препарату.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставленная задача синтезировать модифицированные пептиды с противовирусными свойствами и с новым механизмом действия, использование которых позволит значительно увеличить эффективность лечения и сократить сроки лечения вирусных заболеваний, таких как грипп, герпесвирусные инфекции.
Поставленная задача решается путем синтеза модифицированных пептидов с антивирусными свойствами, отличающегося тем, что сначала проводят частичный гидролиз белок-содержащего сырья, а затем проводят процесс химической модификации суммы (ансамбля) полученных олигопептидов с заменой заряда их молекул на противоположный. Для синтеза могут быть использованы такие белки: оваль-бумин (ОА), человеческий сывороточный альбумин (ЛСА), бычий сывороточный альбумин (БСА), смесь молочных белков (СМБ), кроличий сывороточный альбумин (КСА), лизоцим (ЛЦ), лактоальбумин (ЛА), казеин (КЗ), соевый белок (СБ), их смесь, молоко (М), цельный яичный белок (ЦЯБ). Для ферментативного гидролиза могут быть использованы пепсин, трипсин, химотрипсин, папаин, протеиназа К, клост-рипаин, тромбин, термолизин, эластаза. Синтезированные олигопептиды способны тормозить активность гетеродимера а-р-импортинов клетки, которые транспортируют вирусные полинуклеотиды из цитоплазмы в ядро. Соответственно торможение этих транспортных белков приведет к блокаде вирусов, репликация которых зависит от функций ядра клетки. Кроме того, препарат эффективен при пероральном приложении.
В качестве ацилирующих агентов могут быть использованы модификаторы, представленные на фиг. 1.
В эксперименте была подтвержденная эффективность препарата при гриппе, герпесе, на моделях in vivo и in ovo, что описано ниже. Нами использован ансамбль из олигопептидов - продуктов гидролиза
белков и их смесей (яичного, молочного и др.), но с измененными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии - супрамоле-кулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т.е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших пространственных структур в живой клетке [2,3].
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - структуры химических модификаторов, применимых для изменения зарядов молекул оли-гопептидов МП.
Фиг. 2 - фотографии глаз кролей при инфицировании вирусом герпеса 1 типа и после лечения (3). Скарифицированная роговица после внесения вируса гиперемирована с "бельмом" инфицирования (1, 2) (на втором снимке место скарификации контрастировало флюоресцеином). Здоровая роговица после лечения (3): гиперемии нет.
Фиг. 3 - электронные микрофотографии инфицированных вирусом герпеса типа клетки - обработанные (2) и не обработанные (1) МП.
Лучший вариант осуществления изобретения
Пример 1. Получение смеси (композиции) модифицированных пептидов (МП) с антивирусными свойствами, которые способны к самоорганизации на импортинах.
В асептических условиях 500 мг овальбумина растворяют в 50 мл дистиллированной воды, доводят pH до 8,0 1 М раствором гидроксида натрия, добавляют 5 мг трипсина, оставляют раствор на 3-45 ч, наблюдается гидролиз овальбумина с образованием смеси пептидов. К этой смеси добавляют 501-2000 мг янтарного ангидрида, перемешивают при температуре 16-65°C 20 мин. Смесь пропускают через мембранные фильтры с целью стерилизации и разливают в стеклянные флаконы.
Для определения максимально переносимой концентрации (МПК) в токсикологических опытах и изучения антивирусной активности препарата МП использованы следующие виды перевиваемых клеток человеческого и животного происхождения:
ПТ - перевиваемые клетки почки эмбриона крупного рогатого скота;
Tr - перевиваемые клетки трахеи эмбриона крупного рогатого скота;
Hep -2- перевиваемые клетки рака гортани человека;
Hela - перевиваемые клетки рака тела матки;
Эмбрионы куриные.
Клетки выращивали в среде 199 с добавлением 10% бычьей сыворотки и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина). В качестве тест-вирусов использованы вирусы гриппа (H3N2), везикулярного стоматита (Штамм Индиана), коронавирус (X 343/44) и вирус простого герпеса 1 типа (штамм Л-2).
Исследования проводили по методикам, рекомендованным Государственным фармакологическим центром МЗ Украины.
Пример 2. Изучение токсичности и определение МПК препарата МП на культурах клеток и на куриных эмбрионах.
Для определения МПК использовали двухсуточные культуры клеток с хорошо сформированным монослоем клеток. Препарат МП испытан на четырех видах перечисленных выше клеток в 5 повторениях. В каждом опыте для исследования использовали не менее 10 пробирок каждой из культур. После удаления из пробирок ростовой среды вносили 0,2 мл испытуемого раствора и по 0,8 мл поддерживающей питательной среды. Пробирки с клетками инкубировали при 37°C в течение 7-8 дней.
Контролем служили пробирки с культурами клеток, в которые не добавляли препарат.
Учет результатов проводили по наличию или отсутствию цитопатического действия на клетки при просмотре в микроскопе при малом увеличении х10. Степень цитотоксического действия определяли по изменению морфологии клеток (округление и сморщивание клеток, отторжение от стекла дегенериро-ванных клеток) по четырехплюсовой системе от + до ++++.
Максимально переносимую концентрацию определяли по максимальному количеству вещества, не вызывающего цитопатического действия на клетки. Для этого в различных разведениях препарата в дозе 0,2 мл вносили в культуру клеток.
Для изучения токсичности in vivo в различных дозах препарата в объеме 0,2 мл вносили в алланто-исную полость 9-10 дневных куриных эмбрионов (по 5 эмбрионов на разведение МП) по следующей методике: брали 10-11- дневные эмбрионы, овоскопировали, наносили карандашом метку над воздушным мешком на стороне, противоположной расположению эмбриона, где меньше кровеносных сосудов. Отмеченное место обеззараживали спиртовым раствором йода, затем здесь же прокалывали скорлупу и в отверстие вводили туберкулиновым шприцем материал в объеме 0,1 мл. Для попадания в аллантоисную полость иглу шприца вводили на глубину 10-15 мм параллельно продольной оси яйца. После заражения отверстие вновь дезинфицировали спиртовым раствором йода, запечатывали парафином и помещали для инкубации в термостат при температуре 35-37°C на 72 ч. Перед вскрытием эмбрионы помещали на 18-20 ч в холодильник при температуре 4°C для максимального сужения кровеносных сосудов. После этого яйца помещали на лоток тупым концом вверх, скорлупу над воздушным мешком обеззараживали спиртовым раствором йода и 96% этиловым спиртом, затем разбивали и удаляли стерильным пинцетом.
Также удаляли оболочку, выстилающую дно воздушного мешка, предварительно отсепарировав ее от подлежащей хорион-аллантоисной оболочки. Через 24 и 48 ч инкубирования в термостате при 37°C учитывали количество живых и нормально развивающихся эмбрионов. Расчет LD50 и МПД проводили по методу Кербера.
В результате исследований на различных культурах было установлено, что МП нетоксичен для культур клеток в дозе более 50 мг/мл (для повышения концентрации препарат лиофилизировали и затем разводили до 5% концентрации). Результаты изучения токсичности на различных культурах представлены в табл. 1.
Таблица 1
МПК для культур клеток, обработанных МП составляет более 50 мг/мл.
Пример 3. Изучение антивирусного действия препарата МП на вирус гриппа А (H3N2).
Водные растворы МП в различных дозах (десятикратные разведения) вводили 15 куриным эмбрионам в аллантоисную полость в объеме 0,2 мл через 12 ч после внесения вируса в рабочей дозе (100 ТЦД50/0,2 мл).
Каждый опыт сопровождался контролем тест-вируса в рабочей дозе. Зараженные и незараженные (контроль) эмбрионы инкубировали при 36°С в течение 48 ч. Затем производили вскрытие эмбрионов, из которых отсасывали аллантоисную жидкость. Титрование вируса в аллантоисной жидкости проводили по общепринятой методике с 1% эритроцитами 0(1) группы крови человека.
Определили коэффициент защиты (КЗ) согласно [1,2]. Титр вируса в опытной и контрольной группах куриных эмбрионов представлен в табл. 2
Таблица 2
Как видно из табл. 2, минимальная эффективная концентрация МП в отношении вируса гриппа, которая полностью тормозит синтез вируса, равна 0,05 мг/мл. При увеличении разведения препарата, эффективность МП падает и имеет дозозависимый характер. Данный факт свидетельствует о наличии прямого противовирусного эффекта у препарата МП в отношении вируса гриппа H3N2.
Пример 4. Исследование антивирусного действия препарата МП на цитопатические вирусы (вирус везикулярного стоматита, коронавирус, вирус простого герпеса 1 типа).
Противовирусную активность в отношении этой группы вирусов определяли в культуре вышеуказанных клеток. Постановку реакции осуществляли следующим способом: 0,2 мл соответствующего вируса в рабочей дозе (100 ТЦД50/0,2 мл) вносили в объеме 0,2 мл в 2-х суточную отмытую культуру клеток. Добавляли 0,8 мл поддерживающей среды. При появлении в культуре ЦПД вносили препарат МП в различных дозах. В качестве контроля выполняли то же самое с тест-вирусами без препарата. Клетки инкубировали при 37°С в термостате. Учет опыта производили на 3,5,7 день.
Снижение титра вируса под влиянием испытуемого препарата на 2 lg и более в сравнении с контролем оценивали как проявление антивирусной активности.
Как видно из табл. 3, МП обладает антивирусной активностью и способностью подавлять репродукцию всех изученных нами вирусов в концентрации 0,05 мг/мл при МПК = 50 мкг/мл. ХТИ препарата составляет 1000. Кроме того, МП был активен в отношении всех изученных вирусов, тогда как не один препарат сравнения не проявлял подобной активности. Таким образом, препарат не связан с конкретными особенностями вируса или клеточной культуры, а влияет на общие для всех клеток механизмы.
Пример 5. Изучение антивирусного действия МП in vitro на моделях вирусов сельскохозяйственных животных.
Испытания проводили в 96 луночных пластиковых панелях с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) штамм "Д-52" с исходным титром 1040 ТЦД50/МЛ (тканевых цитопатических доз) в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка (ПТП) и вирусом диареи крупного рогатого скота штамм "Орегон" с исходным титром 1070 ТЦЦ50/МЛ в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС).
При испытании вирусстатического (ингибирующего) действия культуры клеток инфицировали вирусами в дозах 100 и 10 ТЦДед/мл и инкубировали в термостате при 37°C. МП в различных дозах вносили в культуры клеток (КК) через 1-1,5 ч после заражения (после периода адсорбции). На каждое разведение брали по 8 лунок. После внесения соединения культуры клеток инкубировали при 37°С в течение 72-144 ч до четкого проявления ЦПД (цитопатогенного действия) в контроле вирусов.
Контролями служили культуры клеток, инфицированные вирусом, инактные КК и КК, куда вносили только различные концентрации МП. Вирусстатическое действие определяли по разнице титров вирусов в опыте и контроле.
При определении вирулицидного (инактивирующего) действия разные дозы раствора соединения смешивали в равных объемах с вируссодержащим материалом и инкубировали в термостате при 37°C в течение 24 ч. Контролем служили вируссодержащий материал, к которому вместо раствора соединения добавляли плацебо (физраствор) и инактные культуры клеток. Смеси после контакта титровали параллельно с контролем. Результаты учитывали через 72-144 ч после инкубирования при 37°C, после четкого проявления ЦПД в контролях вирусов. Вирулицидное действие определяли по разнице титров вирусов в опыте и контроле и выражали в lg ТЦД50.
В результате проведенных исследований установлено, что соединение МП в концентрации 4000 мкг\мл подавляло репродукцию вируса ТГС на 2, 75 lg ТЦД50.МЛ, при заражающей дозе 100 ТЦД50/мл и в той же дозе на 3,75 lg ТЦДед/мл, при заражающей дозе 10 ТЦД50/мл. В дозе 4000 мкг/мл МП инактивировал вирус ТГС на 2,0 lg ТЦД50/МЛ. Соединение МП в дозе 4000 мкг\мл инактивировал вирус диареи КРС на 3,5 lg ТЦД50/МЛ.
При изучении токсичности, установлено, что МП в дозе 4000 мкг\мл не токсичен для обеих культур клеток.
Таким образом, соединение МП обладает вирусстатическим (ингибирующем) и вирулицидным (инактивирующим) действием на вирусы ТГС и диареи КРС, на его основе возможно создание химиоп-репаратов для лечения и профилактики инфекционных болезней вирусной этиологии.
Пример 6. Изучение противовирусной активности МП в эксперименте на животных (герпесвирус-ный керато-конъюнктивит/энцефалит у кролей).
Особенности экспериментальной системы и уровень ее адекватности естественному заболеванию человека несомненно играют решающую роль в оценке влияния антивирусного вещества на течение инфекции. Герпетическая экспериментальная инфекция представляет собой интерес в связи с тем, что заболевания герпетической природы широко распространены и чрезвычайно вариабельны по клиническим проявлениям. Модели экспериментального герпеса на животных находят все более широкое применение в изучении новых противовирусных веществ.
Как известно, одной из клинических форм системного герпеса является герпетический энцефалит, который воспроизводится у морских свинок, хомяков, крыс, мышей, кроликов, собак, обезьян.
Герпетический кератоконъюнктивит у кроликов среднего веса 3,5 кг был получен путем нанесения инфекционного материала (вирус герпеса 1 типа, штамм Л-2) на скарифицированую роговицу (фиг. 3 (1, 2)). Животного фиксировали, анестезию глаза проводили дикаином (закапывали в глаз). Раздвигали веки глаза, наносили несколько царапин на роговицу при помощи иглы шприца. Затем вводили вируссо-держащий материал и, смыкая веки, круговыми движениями втирали его в роговицу. Доза вируса: 0,05 мл. В опыте использовали 16 кролей, из них десятерым вводили МП (ежедневно со второго дня инфицирования - 14 дней в дозе 21 мг/кг (что составляет 7,5 мл 1% раствора на одно животное в сутки), а шестерым - плацебо (0,9% натрия хлорида).
После заражения кролей ВПГ1 ежедневно контролировали состояние роговицы, наличие керато-конъюнктивита, энцефальных нарушений и наличие в лимфоцитах периферической крови антигенов ВПГ1 методом РИФ до и после инфицирования (фиг. 3 (3)). До инфицирования у всех животных в лимфоцитах отсутствовало специфическое свечение, что свидетельствовало об отсутствии в периферической крови антигенов вируса герпеса 1 типа. На 3 день после инфицирования у всех животных в крови определялся антиген ВПГ1, ИФ=70%. Кроме того, у трех кролей (двух - из опытной группы до начала лечения и у одного из контрольной группы) появились энцефальные проявления - судорожный синдром, отсутствие аппетита. У всех животных развился кератоконъюнктивит. На 4 день после инфицирования опытной группе кролей ввели в ушную вену МП в дозе 21 мг/кг веса тела, а контрольной группе ввели 0,9% раствор натрия хлорида. Каждый день в течение двух недель повторяли эту процедуру один раз в день. В опытной группе все животные выжили, а антиген ВПГ1 в крови не определялся на 13-14 день. Кроме того, в опытной группе энцефальные проявления исчезли к 7 дню применения препарата, тогда как в контроле погибло 2 животных. К 14 дню лечения в опытной группе погибло одно животное, тогда как в контроле - 6. Соответственно индекс эффективности был равен 83,3%, что свидетельствует о высокой лечебной эффективности МП на модели герпетического кератоконъюнктивита/энцефалита у кролей. Кроме того, кроли в опытной группе набрали в весе и у всех животных отсутствовали признаки керато-конъюнктивита. Химиотерапевтический индекс для кролей по препарату МП составил 1000, что свидетельствует о перспективности МП как высокоэффективного противовирусного препарата с широким спектром действия и низкой токсичностью.
Пример 7. Подтверждение механизма действия препарата.
Для подтверждения механизма действия МП была использована ДНК вируса герпеса 1 типа штамма Л-2. Выделяли как показано в [5]. Конъюгацию ДНК с частицами золота проводили методом из [6]. Полученный комплекс вводили в липосомы методом [7]. Подробно эксперимент был описан для вируса SV40 в [8]
Такие липосомы сливались с мембранами клеток культуры куриных фибробластов. После объединения липосом с мамбраной клеток ДНК вируса с частицами золота попадала в цитоплазму (фиг. 3 (1)).
Комплекс а-р-импортинов переносил коллоидные частицы с полинуклеотидом к ядерным порам. Если клетки инкубировали в присутствии МП, то накопление частиц коллоидного золота на ядерных порах не наблюдалось (фиг. 3 (2)). Все частицы равномерно распределялись по цитоплазме клеток. В этом случае цитопатического действия вируса герпеса не наблюдалось.
Таким образом, МП тормозит попадание вирусной ДНК в клеточное ядро, что и необходимо было подтвердить.
Пример 8. Влияние препарата МП на бройлеров кросса Кобб-500.
Целью испытаний являлось изучение влияния препарата МП на репродукцию вакцинных штаммов вирусов по редукции титра соответствующих специфических антител. Известно, что многие антивирусные препараты, подавляя репродукцию живых вакцинных штаммов вирусов приводят к угнетению синтеза специфических антивирусных антител. Этот эффект связан с недостаточной интенсивностью вызванного вакциной инфекционного процесса в организме птицы и слабым иммунным ответом. При этом известно, что во многих случаях, например при инфекционной бурсальной болезни, применение живой вакцины приводит к индукции синтеза настолько избыточного титра антител, что истощается бурса, птица становится чувствительной к другим вирусам, наблюдается уменьшение привеса и увеличение падежа. Применение препарата МП должно было показать наличие у него антивирусных свойств по нескольким параметрам: редукции избыточного уровня (титров) антител, уменьшению падежа (сохранность), увеличение привеса.
В эксперимент брали бройлеров на 36 и 41 день по 15 животных в группу. МП выпаивали за сутки до вакцинации живыми вакцинами против ИББ, болезни Гамборо (БГ) и инфекционного бронхита (ИБ). В контроле были птицы, которых не выпаивали МП, но вакцинировали. В табл. 4-5 приведены результаты исследований.
* - против невакцинированного контроля, который принимался за основу; ** - (Р=0,01).
Как видно из табл. 4, в опытной группе привес животных увеличился на (5,2±0,7)% против уменьшения веса в контрольной вакцинированной, но не леченной группе (-1,2+0,3)%. Также в опытной группе наблюдалось увеличение сохранности на (1,1+0,3)%.
В табл. 5 приведены изменения в титрах специфических антивирусных антител в леченной МП вакцинировной группе, вакцинированной нелеченой группе и невакцинированной группе.
Таблица 5
Изменение титра антител против ИББ, БГ и ИБ в вакцинированных группах и невакцинированном кон-
Как видно из табл. 5, МП обладает прямым (не иммуностимулирующим) действием в отношении всех трех вирусов. Наибольший ингибирующий эффект наблюдался в группе с инфекционным бронхитом - редукция титра антител на 1200 единиц. В вакцинированном, но не леченном контроле, титры антител возрастали от 2600 до 3200 единиц, что свидетельствовало об эффективном процессе размножения живой вакцины в организме птицы.
Таким образом, применение МП позволят в среднем на 5% увеличить привес бройлеров и на 1% уменьшить падеж.
МП обладает прямым антивирусным действием, подавляя репродукцию вирусов инфекционной бурсальной болезни, болезни Гамборо и инфекционного бронхита.
МП позволяет умеренно подавлять репликацию вакцинных вирусов, обеспечивая достаточный уровень защитных антител и предотвращая истощение иммунитета птицы и соответствующее уменьшение привеса и увеличение падежа.
Пример 9. Изучение влияния МП на эффективность вакцинации бройлеров живыми вакцинами.
Влияние МП на эффективность вакцинации проводили непосредственно в птицеводческом хозяйстве при выращивании бройлеров. При патологоанатомическом изучении бройлеров наблюдали характерные изменения для колибактериоза, кокцидиоза, а также многочисленные кровоизлияния на слизистых оболочках прямого отдела кишечнику, в участке перехода железистого желудка в мышечный, цока-левих железах. Содержимое железистого желудка было окрашено в зеленый цвет. Гибель бройлеров достигала около 15-20%. При исследовании сывороток крови бройлеров в 38-42 суточном возрасте в реакции задержки гемаглютинаций (РЗГА) обнаруживали специфические титры антител к вирусу болезни Нью-Касла (БНК) выше протективных (1:1024, 1: 2048).
Изучение влияния МП в дозе 0,03 мл/кг живого веса на эффективность вакцинации против БНК. Для этого один из птичников был принят за контроль, другие были опытными (табл. 6).
Таблица 6
Условия досмотра, параметры микроклимата, режим освещенности, плотность посадки, режим кормления был одинаковым во всех группах согласно методических рекомендаций по выращиванию
кросса РОС 308.
Напряженность иммунитета определяли в возрасте 42 суток в РЗГА. Одновременно учитывали клиническое состояние птицы, процент сохранения, приросты и затраты корма.
Результаты проведенных испытаний из определения эффективности МП при проведении вакцинации бройлеров против БНК приведены в табл. 7.
Таблица 7
Примечание: достоверность в сравнении с контролем: * Р <0,05; ** Р <0,01;
*** Р <0,001.
Средние титры специфических антител к вирусу БНК как в контроле, так и опытных группах были на уровне протективных. Однако, при исследовании сывороток бройлеров в 42 суточном возрасте при применении МП установлено достоверное увеличение среднего титра в опытной 3 группе в сравнении с контролем в 6 раз ( < 0,01). В опытных группах (1,2) не установлено достоверной разницы титров антител в сравнении с контролем, однако они были на уровне протективних и обнаружена тенденция к увеличению этого показателя в 1,8 и 4,3 разы. Групповой иммунитет в контроле составлял 75%, тогда как в опытных группах (3,4) 100%, в 1 опытной группе 87,5%. Гибель бройлеров составляла в контроле - 9,8%, тогда как процент гибели уменьшился в опытных группах: в 2,8; 3,3 и 4 раза соответственно в сравнении с контролем. Среднесуточные приросты в опытных группах колебались в пределах 52-54 г, тогда как в контроле - 48 г.
Таким образом, можно сделать вывод, что оптимальной схемой использования МП для бройлеров в регионах со сложной эпизоотической ситуацией с БНК является применение препарата в дозе 0,03 мл/кг живого веса на протяжении 3 суток до вакцинации и через 7-10 суток после вакцинации против БНК. Применение препарата по вышеупомянутой схеме приводит к повышению среднего титра специфических антител к вирусу БНК в 6 раз и уменьшению гибели бройлеров в 4 раза.
Промышленная применимость
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а конкретно к вирусологии, и может быть использовано для созданий новых лекарственных препаратов на основе динамических самоадаптирующихся и самоорганизующихся систем для лечения вирусных инфекций животных и человека. Полученные таким образом препараты являются полностью экологически безопасными, биодеградируемыми и полностью метаболизируемыми как в организме пациентов, так и в окружающей среде, а технологии их получения относятся к группе полностью безотходных. Производство патентуемого средства осуществимо на существующем оборудовании фармацевтических предприятий и не требует разработки нового уникального оборудования, не требует энергозатрат и является безотходным и экологически чистым.
Использованные источники информации
1 Robert Walter Jansen, Dirk Klaas Fokke Meijer, Grietje Molema, Erik Desire Alice De Clercq, Rudi Wil
fried Jan Pauwels, Dominique Schols Modified proteins and their use for controlling viral infection//A61K 3804; A61K 3816, US Patent № 5869457, Reg. 9.02.1999. Appl. Sep 4, 1997.
2 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240.
3 Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995. P. 103 (Chapter 7).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Супрамолекулярная смесь олигопептидов с антивирусными свойствами, полученная при каталитическом гидролизе смеси разных белков или одного белка с последующим ацилированием или алкили-рованием аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов, которая обеспечивает способность олигопептидов тормозить попадание вирусной ДНК в клеточное ядро.
2. Супрамолекулярная смесь олигопептидов по п.1, отличающаяся тем, что ацилирование проводят ангидридами ди- и трикарбоновых кислот.
3. Супрамолекулярная смесь олигопептидов по п.1, отличающаяся тем, что алкилирование проводят монохлоруксусной кислотой.
4. Способ получения супрамолекулярной смеси олигопептидов с антивирусными свойствами, которые способны тормозить попадание вирусной ДНК в клеточное ядро, где способ включает каталитический гидролиз смеси разных белков или одного белка и затем ацилирование или алкилирование аминогрупп остатков лизина и/или гистидина в последовательностях олигопептидов.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют один белок.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют смесь разных белков.
7. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют смесь белков молока.
8. Способ по п.4, отличающийся тем, что гидролизуют яичный белок.
9. Способ по п.4, отличающийся тем, что для каталитического гидролиза белков используют ферментативный гидролиз.
10. Способ по п.4, отличающийся тем, что для каталитического гидролиза белков используют синтетические пептидазы.
11. Способ по п.4, отличающийся тем, что ацилирование проводят янтарным ангидридом с массовым соотношением реагентов белок:ангидрид от 1:1 до 1:3.
10.
Уксусный ангидрид
нэс ^
н3с ^
Пропионовый ангидрид
НзС^с
Н2 \
Бутановый ангидрид
Н2 \
Н2 /
Уксусно-пропионовый ангидрид
н2 /
НзС-нГ'
Уксусно-бутановый ангидрид
НзС-^с_/° Нг \
Н3С-С2-С^ ^\
Янтарный ангидрид
<>
Малеиновый ангидрид
Глутаровый ангидрид
Фталевый ангидрид
Цис- и транс- аконитовый
ангидриды
соон
Лимонный ангидрид
НООС /- ОН \
Изолимонный ангидрид
\ /
ноос ( О
Ацетил хлорид
Ацетилфторид
н3с-^
Пропионилхлорид
Бутироилхлорид
Этоксиоксалилмонохлорид Н3С
Монохлоруксусная кислота
CI соон
Фиг. 1
Контрастированный коллоидным золотом участок ядерной поры в инфицированной, но не леченной клетке. Белые пятна - коллоидное золото в комплексе с ДНК вируса и а-в-импортинами - присутствует как в ядре клетки, так и в цитоплазме. Это свидетельствует о том, что а-в-импортины свободно переносят вирусную ДНК в ядро.
В клетке, леченной МП, не наблюдается накопления частиц гидрозоля золота не на ядерной мембране, не в ядре. Белые пятна частиц золота равномерно распределены только по цитоплазме, что подтверждает
механизм действия препарата - ингибирование сигнального пептида а-в-импортинового комплекса. При этом видно, что через ядерные поры проходят другие белки - на фотографии ядерные поры помечены белыми скобками, а серые конгломераты возле них - немеченые золотом клеточные белки.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025624
- 1 -
025624
- 1 -
025624
- 1 -
025624
- 1 -
025624
- 4 -
025624
- 9 -
025624
- 10 -