[RU]

1. Способ получения содержащей сквален эмульсии масло-в-воде, включающий стадии: (i) образование первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек; (ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который меньше, чем первый средний размер масляных капелек; и (iii) фильтрация второй эмульсии с использованием первого гидрофильного полиэфирсульфонового мембранного слоя, имеющего размер пор ≥0,3 мкм, и второго гидрофильного полиэфирсульфонового мембранного слоя, имеющего размер пор менее 0,3 мкм, с получением посредством этого содержащей сквален эмульсии масло-в-воде.

2. Способ по п.1, где первый средний размер капелек масла составляет 5000 нм или менее.

3. Способ по любому из пп.1, 2, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, в первой эмульсии составляет 5 ×10 ¹¹ /мл или менее.

4. Способ по любому из пп.1-3, где второй средний размер капелек масла составляет 500 нм или менее.

5. Способ по любому из пп.1-4, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии составляет 5 ×10 ¹⁰ /мл или менее.

6. Способ получения содержащего сквален вакцинного адъюванта в виде эмульсии масло-в-воде, включающий стадии: (i) образование содержащей сквален эмульсии, имеющей средний размер масляных капелек 500 нм или менее; (ii) фильтрация содержащей сквален эмульсии с использованием гидрофильной двуслойной полиэфирсульфоновой мембраны с первым слоем, имеющим размер пор ≥0,3 мкм, и вторым слоем, имеющим размер пор менее 0,3 мкм, с получением посредством этого вакцинного адъюванта.

7. Способ по любому из пп.1-6, где средний размер капелек масла после фильтрации составляет менее чем 220 нм.

8. Способ по любому из пп.1-7, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, после фильтрации составляет 5 ×10 ⁸ /мл или менее.

9. Способ по любому из пп.1-8, где на стадии фильтрации используют двуслойный фильтр.

10. Способ по любому из пп.1-9, где первый гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой является асимметричным и/или пористым.

11. Способ по любому из пп.1-10, где второй гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой является асимметричным и/или пористым.

12. Способ по любому из пп.1-11, где первый гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой и, необязательно, второй гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой содержит полимерный опорный материал.

13. Способ по любому из пп.1-12, где вторая эмульсия имеет объем ≥20 л.

14. Способ получения вакцинной композиции, включающий получение эмульсионного адъюванта в соответствии с любым из пп.1-13 и объединение эмульсионного адъюванта с антигеном.

15. Способ получения вакцинного набора, включающий получение эмульсионного адъюванта в соответствии с любым из пп.1-13 и упаковку эмульсионного адъюванта в набор в качестве компонента набора вместе с антигенным компонентом.

16. Способ по п.15, где компоненты набора находятся в отдельных флаконах.

17. Способ по п.16, где используют флаконы, изготовленные из боросиликатного стекла.

18. Способ по любому из пп.15-17, где эмульсионный адъювант имеет объем более 20 л, и способ включает выделение стандартных доз из основного количества адъюванта для упаковки в качестве компонентов набора.

19. Способ по любому из пп.14-18, где антиген представляет собой антиген вируса гриппа.

20. Способ по п.19, где комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию, где вакцинная композиция включает примерно 15 мкг, примерно 10 мкг, примерно 7,5 мкг, примерно 5 мкг, примерно 3,8 мкг, примерно 3,75 мкг, примерно 1,9 мкг или примерно 1,5 мкг гемагглютинина на штамм вируса гриппа.

21. Способ по п.19 или 20, где комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию, где вакцинная композиция содержит консервант тиомерсал и/или 2-феноксиэтанол.

22. Способ по любому из пп.1-21, в котором эмульсия масло-в-воде включает приблизительно 5 об.% сквалена, приблизительно 0,5 об.% полисорбата 80 и приблизительно 0,5 об.% сорбитан триолеата.

23. Применение гидрофильного двуслойного полиэфирсульфонового фильтра с первым мембранным слоем, имеющим размер пор ≥0,3 мкм, и вторым мембранным слоем, имеющим размер пор менее 0,3 мкм, для фильтрации содержащей сквален эмульсии масло-в-воде, содержащей водный компонент, масло и поверхностно-активное вещество, причем эмульсия масло-в-воде содержит от 2 до 20 об.% масла.

24. Применение по п.23, в котором эмульсия масло-в-воде включает приблизительно 5 об.% сквалена, приблизительно 0,5 об.% полисорбата 80 и приблизительно 0,5 об.% сорбитан триолеата.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ получения содержащей сквален эмульсии масло-в-воде, включающий стадии: (i) образование первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек; (ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который меньше, чем первый средний размер масляных капелек; и (iii) фильтрация второй эмульсии с использованием первого гидрофильного полиэфирсульфонового мембранного слоя, имеющего размер пор ≥0,3 мкм, и второго гидрофильного полиэфирсульфонового мембранного слоя, имеющего размер пор менее 0,3 мкм, с получением посредством этого содержащей сквален эмульсии масло-в-воде.

2. Способ по п.1, где первый средний размер капелек масла составляет 5000 нм или менее.

3. Способ по любому из пп.1, 2, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, в первой эмульсии составляет 5 ×10 ¹¹ /мл или менее.

4. Способ по любому из пп.1-3, где второй средний размер капелек масла составляет 500 нм или менее.

5. Способ по любому из пп.1-4, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии составляет 5 ×10 ¹⁰ /мл или менее.

6. Способ получения содержащего сквален вакцинного адъюванта в виде эмульсии масло-в-воде, включающий стадии: (i) образование содержащей сквален эмульсии, имеющей средний размер масляных капелек 500 нм или менее; (ii) фильтрация содержащей сквален эмульсии с использованием гидрофильной двуслойной полиэфирсульфоновой мембраны с первым слоем, имеющим размер пор ≥0,3 мкм, и вторым слоем, имеющим размер пор менее 0,3 мкм, с получением посредством этого вакцинного адъюванта.

7. Способ по любому из пп.1-6, где средний размер капелек масла после фильтрации составляет менее чем 220 нм.

8. Способ по любому из пп.1-7, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, после фильтрации составляет 5 ×10 ⁸ /мл или менее.

9. Способ по любому из пп.1-8, где на стадии фильтрации используют двуслойный фильтр.

10. Способ по любому из пп.1-9, где первый гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой является асимметричным и/или пористым.

11. Способ по любому из пп.1-10, где второй гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой является асимметричным и/или пористым.

12. Способ по любому из пп.1-11, где первый гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой и, необязательно, второй гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой содержит полимерный опорный материал.

13. Способ по любому из пп.1-12, где вторая эмульсия имеет объем ≥20 л.

14. Способ получения вакцинной композиции, включающий получение эмульсионного адъюванта в соответствии с любым из пп.1-13 и объединение эмульсионного адъюванта с антигеном.

15. Способ получения вакцинного набора, включающий получение эмульсионного адъюванта в соответствии с любым из пп.1-13 и упаковку эмульсионного адъюванта в набор в качестве компонента набора вместе с антигенным компонентом.

16. Способ по п.15, где компоненты набора находятся в отдельных флаконах.

17. Способ по п.16, где используют флаконы, изготовленные из боросиликатного стекла.

18. Способ по любому из пп.15-17, где эмульсионный адъювант имеет объем более 20 л, и способ включает выделение стандартных доз из основного количества адъюванта для упаковки в качестве компонентов набора.

19. Способ по любому из пп.14-18, где антиген представляет собой антиген вируса гриппа.

20. Способ по п.19, где комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию, где вакцинная композиция включает примерно 15 мкг, примерно 10 мкг, примерно 7,5 мкг, примерно 5 мкг, примерно 3,8 мкг, примерно 3,75 мкг, примерно 1,9 мкг или примерно 1,5 мкг гемагглютинина на штамм вируса гриппа.

21. Способ по п.19 или 20, где комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию, где вакцинная композиция содержит консервант тиомерсал и/или 2-феноксиэтанол.

22. Способ по любому из пп.1-21, в котором эмульсия масло-в-воде включает приблизительно 5 об.% сквалена, приблизительно 0,5 об.% полисорбата 80 и приблизительно 0,5 об.% сорбитан триолеата.

23. Применение гидрофильного двуслойного полиэфирсульфонового фильтра с первым мембранным слоем, имеющим размер пор ≥0,3 мкм, и вторым мембранным слоем, имеющим размер пор менее 0,3 мкм, для фильтрации содержащей сквален эмульсии масло-в-воде, содержащей водный компонент, масло и поверхностно-активное вещество, причем эмульсия масло-в-воде содержит от 2 до 20 об.% масла.

24. Применение по п.23, в котором эмульсия масло-в-воде включает приблизительно 5 об.% сквалена, приблизительно 0,5 об.% полисорбата 80 и приблизительно 0,5 об.% сорбитан триолеата.

---

Евразийское 025622 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201270519
(22) Дата подачи заявки
2010.12.03
(51) Int. Cl. A61K 9/107 (2006.01) A61K39/12 (2006.01) A61K39/39 (2006.01)
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОДЕРЖАЩЕЙ СКВАЛЕН ЭМУЛЬСИИ МАСЛА
(31) 61/283,517
(32) 2009.12.03
(33) US
(43) 2012.12.28
(86) PCT/IB2010/003273
(87) WO 2011/067669 2011.06.09
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
НОВАРТИС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Краус Готтфрид, Эскес Роберт (DE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) WO-A1-2006100110 US-A1-2009263422 WO-A1-2006008504 US-B1-6168718 US-A1-2006148776 WO-A1-2009155401
По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 61/283517, поданной 3 декабря 2009 г, полное содержание которой включено в настоящее описание во всех аспектах путем ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области получения эмульсионных адъювантов масло-в-воде для вакцин, например, микрофлюидизацией.
Предшествующий уровень техники
Вакцинный адъювант, известный как "MF59" [1-3], представляет собой субмикронную эмульсию масло-в-воде сквалена, полисорбата 80 (также известного как Твин 80) и сорбитана триолеата (также известного как Спан 85). Он может также включать ионы цитрата, например 10 мМ буфера цитрата натрия. Композиция эмульсии по объему может представлять собой примерно 5% сквалена, примерно 0,5% Твин 80 и примерно 0,5% Спан 85. Этот адъювант и о получение более подробно описаны в главе 10 ссылки [4], главе 12 ссылки [5] и главе 19 ссылки [6].
Как описано в ссылке [7], MF59 получают в промышленном масштабе диспергированием Спан 85 в скваленовой фазе и Твин 80 в водной фазе с последующим высокоскоростным смешиванием для образования грубой эмульсии. Эту грубую эмульсию затем повторно пропускают через микрофлюидизатор для получения эмульсии, имеющей однородный размер масляных капелек. Как описано в ссылке [6], затем микрофлюидизированную эмульсию фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм для удаления любых крупных масляных капелек, и средний размер капелек полученной в результате эмульсии остается неизменным по меньшей мере в течение 3 лет при 4°С. Содержание сквалена в конечной эмульсии может быть измерено, как описано в ссылке [8].
В различных документах (например, ссылках [9-12]) указано, что MF59 может быть получен мик-рофлюидизацией с последующей фильтровой стерилизацией через полисульфоновый фильтр с размером пор 0,22 мкм. Полисульфоны представляют собой полимеры, содержащие сульфоновые группы (SO2) в основной цепи полимера, и полисульфоновые фильтры являются хорошо известными гимдрофобными фильтрами.
Целью изобретения является разработка дополнительных и усовершенствованных способов получения микрофлюидизированных эмульсий масло-в-воде (таких как MF59), в частности способов, которые подходят для использования в промышленном масштабе и в которых используется фильтрация.
Описание изобретения
Изобретение относится к способу получения эмульсии масло-в-воде, содержащей сквален, где способ включает стадии:
(i) получение первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек, также известной как предварительная эмульсия или преэмульсия;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который меньше, чем первый средний размер масляных капелек; и
(iii) фильтрация второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны.
Изобретение также относится к способу получения эмульсии масло-в-воде, включающему стадии:
(i) получение первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек 5000 нм или менее, также известной как предварительная эмульсия или преэмульсия;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который меньше, чем первый средний размер масляных капелек; и
(iii) фильтрация второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны.
Изобретение также относится к способу получения эмульсии масло-в-воде, включающему стадии:
(i) получение первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек, также известной как предварительная эмульсия или преэмульсия;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который меньше, чем первый средний размер масляных капелек; и
(iii) фильтрация второй эмульсии с использованием гидрофильной полиэфирсульфоновой мембра-
ны.
Необязательно, первая эмульсия может быть получена с использованием гомогенизатора, как описано ниже.
Как подробнее описано ниже, первая эмульсия может иметь средний размер масляных капелек 5000 нм или менее, например средний размер от 300 до 800 нм. Число масляных капелек в первой эмульсии с размером более 1,2 мкм может составлять 5х10п/мл или менее, как описано ниже. Масляные капельки размером более 1,2 мкм имеют недостатки, поскольку они могут вызвать неустойчивость эмульсии вследствие агломерации и слияния капелек [14].
После образования, первая эмульсия может затем подвергаться по меньшей мере одному прохождению микрофлюидизации для образования второй эмульсии, имеющей уменьшенный средний размер масляных капелек. Как описано ниже, средний размер масляных капелек второй эмульсии составляет 500 нм или менее. Число масляных капелек во второй эмульсии, имеющих размер более 1,2 мкм, может
составлять 5х1011/мл или менее, как описано ниже. Для достижения этих характеристик может быть необходимым пропускание компонентов эмульсии через устройство микрофлюидизации множество раз, например 2, 3, 4, 5, 6, 7 раз.
Вторая эмульсия может затем фильтроваться через гидрофильную мембрану, например гидрофильную полиэфирсульфоновую мембрану, для получения эмульсии масло-в-воде, которая может подходить для использования в качестве вакцинного адъюванта. Средний размер масляных капелек эмульсии мас-ло-в-воде, полученной после фильтрации, может составлять 220 нм или менее, например от 135 до 175 нм, от 145 до 165 нм или примерно 155 нм. Число масляных капелек во второй эмульсии, имеющих размер более 1,2 мкм, присутствующих в эмульсии масло-в-воде, полученной после фильтрации, может составлять 5х108/мл или менее, 5х107/мл или менее, 5х106/мл или менее, 2х106/мл или менее, 5х105/мл или менее.
Конечная эмульсия масло-в-воде, образованная после фильтрации, может иметь по меньшей мере в 102 меньше масляных капелек, имеющих размер более 1,2 мкм, по сравнению с первой эмульсией, а идеально по меньшей мере в 103 меньше (например, в 104 меньше).
В некоторых вариантах осуществления более чем один цикл стадий (i) и (ii) используется перед стадией (iii). Аналогичным образом, могут использоваться множественные повторения отдельных стадий (i) и (ii).
Изобретение может также использоваться для получения адъювантов в виде эмульсии масло-в-воде без использования микрофлюидизации, например для способов, которые основываются на альтернативных технологиях, таких как термообратимость [40]. В этих вариантах осуществления изобретение относится к способу получения эмульсии масло-в-воде, содержащей сквален, где способ включает стадии:
(i) получение эмульсии, имеющей средний размер масляных капелек менее 1 мкм (например, менее 500 нм, менее 250 нм, менее 200 нм, менее 150 нм, менее 100 нм); и
(ii) фильтрация второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны.
Таким образом, в этих вариантах осуществления используется преимущество пригодности гидрофильной мембраны для получения содержащих сквален адъювантов в виде эмульсии масло-в-воде, но без необходимости заранее использовать микрофлюидизацию.
Аналогичным образом, изобретение относится к применению гидрофильной мембраны для получения адъюванта в виде эмульсии масло-в-воде. Другие признаки мембраны и эмульсионного адъюванта обсуждаются ниже.
В целом, способы по изобретению выполняются при температуре от 20 до 60°C, а в идеале - при 40±5°C. Хотя первый и второй эмульсионные компоненты могут быть относительно устойчивыми даже при более высоких температурах, термическое разрушение некоторых компонентов может все же происходить, и поэтому, предпочтительны более низкие температуры.
Компоненты эмульсии.
Средний размер масляных капелек (т.е. среднечисловой диаметр масляных капелек эмульсии) можно измерить с использованием методики динамического рассеивания света, как описано в ссылке [13]. Примером аппарата для измерения динамического рассеивания света является анализатор размера субмикронных частиц Nicomp 380 Submicron Particle Size Analyzer (выпускаемый компанией Particle Sizing Systems).
Число частиц, имеющих размер более 1,2 мкм, можно измерить с использованием такого счетчика частиц, как Accusizer(tm) 770 (выпускаемый компанией Particle Sizing Systems).
Способы по изобретению используются для получения эмульсий масло-в-воде. Эти эмульсии включают три сердцевинных ингредиента; масло; водный компонент и поверхностно-активное вещество.
Поскольку эмульсии предназначены для фармацевтического применения, то масло обычно является биоразлагаемым (метаболизируемым) и биосовместимым.
Используемое масло может содержать сквален, масло акульей печени, которое представляет собой разветвленный, ненасыщенный терпеноид (C30H50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен; CAS RN 7683-64-9). Сквален особенно предпочтителен для использования в настоящем изобретении.
Масло по настоящему изобретению может содержать смесь (или комбинацию) масел, например, включающую сквален и по меньшей мере еще одно масло.
Предпочтительнее, чем (или в дополнение к) использованию сквалена, эмульсия может содержать масло (масла), включая масла, например из животного (такого как рыба) или растительного источника. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло, являющиеся наиболее общедоступными, иллюстрируют ореховые масла. Может использоваться, например, масло жожоба, полученное из бобов жожоба. Масла семян включают масло сафлора, масло семян хлопка, кунжутное масло и т.п. В зерновой группе наиболее общедоступным является кукурузное масло, но может также использоваться масло других злаковых зерен, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и т.п. Сложные эфиры жирных кислот глицерола и 1,2-пропандиа с 6-10 атомами углерода, хотя они не встречаются в естественных условиях в маслах се
мян, могут быть получены гидролизом, сепарацией и эстерификацией соответствующих материалов, исходящих из ореховых и семенных масел. Жиры и масла из молока млекопитающих являются метаболи-зируемыми и, таким образом, могут использоваться. Процедуры сепарации, очистки, сапонификации и других средств, необходимых для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в данной области.
Большинство рыб содержат метаболизируемые масла, которые могут быть легко извлечены. Например, масло печени трески, масло печени акулы и масло кита, такое как спермацеты, иллюстрируют несколько рыбьих жиров, которые могут использоваться в настоящем изобретении. Ряд разветвленно-цепочечных масел синтезируются биохимически в изопреновые звенья с 5 атомами углерода и в целом именуются терпеноидами. Может также использоваться сквалан, насыщенный аналог сквалена. Рыбьи жиры, включая севален и сквалан, легкодоступны из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в данной области.
Другими полезными маслами являются токоферолы, в частности, в комбинации со скваленом. Когда масляная фаза эмульсии включает токоферол, то может использоваться любой из а, р, у, 5, е или Z токоферолов, но предпочтительных а-токоферолы. Может использоваться и D-а-токоферол и DL-а-токоферол. Предпочтительным а-токоферолом является DL-а-токоферол. Токоферол может принимать несколько форм, наприме, различных солей и/или изомеров. Соли включают органические соли, такие как сукцинат, ацетат, никотинат и т.д. Если предстоит использование соли этого токоферол, то предпочтительной солью является сукцинат. Может использоваться комбинация масел, включающая сквален и токоферол (например, DL-а-токоферол).
Водный компонент может представлять собой простую воду (например, воду для инъекций) или может включать другие компоненты, например растворенные вещества. Например, он может включать соли для образования буфера, например цитраты или фосфаты, такие как соли натрия. Типичные буферы включают фосфатный буфер; трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер или цитратный буфер. Буферы обычно включают в диапазоне от 5 до 20 мМ.
Поверхностно-активное вещество предпочтительно является биоразлагаемым (метаболизируемым) и биосовместимым.
Поверхностно-активные вещества могут классифицироваться их "HLB" (гидрофиль-ным/липофильным балансом), где HLB в диапазоне 1-10 в целом означает, что поверхностно-активное вещество больше растворимо в масле, чем в воде, a HLB в диапазоне 10-20 больше растворимы в воде, чем в масле. Эмульсии предпочтительно включают по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, которое имеет HLB по меньшей мере 10, например по меньшей мере 15 или предпочтительно по меньшей мере 16.
Изобретение может использоваться с поверхностно-активными веществами, включающими без ограничения, поверхностно-активные вещества в виде сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно именуемые Твинами), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропи-леноксида (РО) и/или бутиленоксида (ВО), выпускаемые под товарным наименованием DOWFAX(tm), такие как линейные блок-сополимеры ЕО/РО; октоксинолы, которые могут варьироваться по числу повторяющихся (окси-1,2-этандиильных) групп, причем особый интерес представляет октоксинол-9 (Тритон Х-100 или т-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); простые эфиры жирных кислот поли-оксиэтилена, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известных как поверхностно-активные вещества "Бридж"), такие как простой монолауриловый эфир триэтиленгли-коля (Бриж 30); полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и сложные эфиры сорбитана (обычно известные как SPAN), такие как сорбитан триолеат (Спан 85) и сорбитан монолаурат. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются полисорбат 80 (Твин 80; полиоксиэти-лен сорбитан моноолеат), Спан 85 (сорбитан триолеат), лецитин и Тритон Х-100. В эмульсию могут быть включены смеси поверхностно-активных веществ, например, смеси Твин 80/Спан 85 или смеси Твин 80/Тритон Х-100. Подходит также комбинация полиоксиэтилен-9-лаурилового эфира, такого как полиок-сиэтилен сорбитан моноолеат (Твин 80) и октоксинола, такого как т-октилфенокси-полиэтоксиэтанол (Тритон Х-100). Другая полезная комбинация включает лаурет 9 плюс сложный полиоксиэтиленсорбита-новый эфир и/или октоксинол. Пригодные смеси могут включать поверхностно-активное вещество с величиной HLB в диапазоне от 10 до 20 (например, Твин 80 с HLB 15,0) и поверхностно-активное вещество с величиной HLB в диапазоне от 1 до 10 (например, Спан 85 с HLB 1,8).
Образование первой эмульсии.
Перед стадией микрофлюидизации компоненты эмульсии могут смешиваться для образования первой эмульсии.
Капельки масла в первой эмульсии могут иметь средний размер 5000 нм или менее, например 4000 нм или менее, 3000 нм или менее, 2000 нм или менее, 1200 нм или менее, 1000 нм или менее, например средний размер от 800 до 1200 нм или от 300 до 800 нм.
В первой эмульсии число капелек масла размером более 1,2 мкм может составлять 5х1011/мл или менее, например 5х 1010/мл или менее или 5х 109/мл или менее.
Затем первая эмульсия может микрофлюидизироваться для образования второй эмульсии, имеющей более низкий средний размер капелек масла, чем первая эмульсия, и/или меньшее число капелек размером более 1,2 мкм.
Средний размер капелек масла в первой эмульсии может быть достигнут смешиванием компонентов первой эмульсии в гомогенизаторе. Например, как показано на фиг. 1, они могут комбинироваться в смешивающемся сосуде (12), и затем объединенные компоненты могут быть внесены (13) в механический гомогенизатор, такой как роторно-статорный гомогенизатор (1).
Гомогенизаторы могут работать вертикальным и/или горизонтальным образом. Для удобства, в промышленной компоновке предпочтительны гомогенизаторы, встроенные в производственную линию.
Компоненты вводятся в роторно-статорный гомогенизатор и сталкиваются с быстро вращающимся ротором, содержащим щели или отверстия. Компоненты центробежными силами отбрасываются кнаружи подобным насосу образом и проходят через щели/отверстия. В некоторых вариантах осуществления гомогенизатор включает множественные комбинации роторов и статоров, например концентрическое расположение колец в виде зубьев расчески, как показано обозначениями (3) и (4); (5) и (6) и (7) и (8) на фиг. 1 и 2. Роторы в полезных крупномасштабных гомогенизаторах могут иметь расположение колец в виде зубьев расчески на краю горизонтально ориентированного многолопаточного импеллера (например, обозначение (9) на фиг. 1), совмещенного при жестком допуске с сочетающимися зубьями в статическом хвостовике. Первая эмульсия образуется посредством комбинации турбулентности, кавитации и механического сдвига, происходящего в пределах зазора между ротором и статором. Компоненты могут вводиться в направлении, параллельном оси ротора.
Важным функциональным параметром в роторно-статорных гомогенизаторах является скорость головки ротора (периферическая скорость). Этот параметр представляет собой функцию и скорости вращения, и диаметра ротора. Может использоваться скорость головки по меньшей мере 10 м/с, а в идеале быстрее, например > 20 м/с, > 30 м/с, > 40 м/с и т.д. Скорость головки 40 м/с может быть легко достигнута при 10000 об/мин небольшим гомогенизатором или при более низких скоростях вращения (например, 2000 об/мин) крупным гомогенизатором. Подходящие гомогенизаторы с высоким усилием сдвига имеются в продаже.
Для получения в промышленном масштабе гомогенизатор должен в идеале иметь скорость потока по меньшей мере 300 л/ч, например > 400 л/ч, > 500 л/ч, > 600 л/ч, > 700 л/ч, > 800 л/ч, > 900 л/ч, > 1000 л/ч, > 2000 л/ч, > 5000 л/ч или даже > 10000 л/ч. Подходящие high-capacity гомогенизаторы имеются в продаже.
Предпочтительный гомогенизатор обеспечивает скорость сдвига от 3х105 до 1х106 с-1, например от 3х105 до 7х105 с-1, от 4х105 до 6х105 с-1, в частности примерно 5х105 с-1.
Хотя роторно-статорные гомогенизаторы генерируют относительно мало тепла во время работы, гомогенизатор может охлаждаться во время использования. В идеале, температура первой эмульсии поддерживается ниже 60°C во время гомогенизации, например ниже 45°C.
В некоторых вариантах осуществления компоненты первой эмульсии могут гомогенизироваться множество раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 или более раз). Во избежание потребности в длинной веренице контейнеров и гомогенизаторов компоненты эмульсии могут вместо этого циркулировать (например, обозначение (11) на фиг. 1). В частности, первая эмульсия может быть образована путем циркуляции компонентов первой эмульсии через гомогенизатор множество раз (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 раз и т.д.). Однако слишком много циклов может быть нежелательно, поскольку это может вызвать повторное слияние, как описано в ссылке [14]. Таким образом, размер капелек масла может контролироваться, если циркуляция в гомогенизаторе используется для проверки того, достигнут ли желательный размер капелек и/или что повторное слияние не происходит.
Циркуляция через гомогенизатор имеет преимущество, потому что она может уменьшить средний размер капелек масла в первой эмульсии. Циркуляция также имеет преимущество, потому что она может уменьшить число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, в первой эмульсии. Эти уменьшения среднего размера частиц и числа капелек более 1,2 мкм в первой эмульсии могут обеспечить преимущества ниже по ходу технологического процесса (процессов). В частности, циркуляция компонентов первой эмульсии через гомогенизатор может привести к улучшенному процессу микрофлюидизации, что может в дальнейшем привести к уменьшенному числу капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии, т.е. после микрофлюидизации. Улучшенное выполнение фильтрации может привести к меньшим потерям содержимого во время фильтрации, наприме, потерям сквалена, Твин 80 и Спан 85, когда эмульсия масло-в-воде представляет собой MF59.
Два конкретных типа циркуляции именуются в настоящем описании "типом I" и "типом II". Циркуляция I типа иллюстрируется на фиг. 5, тогда как циркуляция II типа иллюстрируется на фиг. 6.
Циркуляция компонентов первой эмульсии может включать циркуляцию I типа переноса компонентов первой эмульсии между контейнером первого премикса и гомогенизатором. Контейнер первого премикса может иметь размер от 50 до 500 л, например от 100 до 400 л, от 100 до 300 л, от 200 до 300 л,
250 или 280 л. Контейнер первого премикса может быть изготовлен из нержавеющей стали. Циркуляция
I типа может продолжаться в течение от 10 до 60 мин, например, от 10 до 40 или 20 мин.
Циркуляция компонентов первой эмульсии может включать циркуляцию II типа переноса компонентов первой эмульсии из контейнера первого премикса, через первый гомогенизатор в контейнер второго премикса (необязательно, имеющий такие же свойства, как контейнер первого премикса) и затем через второй гомогенизатор. Второй гомогенизатор обычно является таким же, как первый гомогенизатор, но в некоторых конструкциях первый и второй гомогенизаторы являются различными. После прохождения компонентов первой эмульсии через второй гомогенизатор компоненты первой эмульсии могут переноситься назад в контейнер первого премикса, например, если предстоит повторить процесс циркуляции II типа. Таким образом, компоненты эмульсии могут перемещаться по маршруту в форме цифры восемь между контейнерами первого и второго премикса через один гомогенизатор (см. фиг. 6). Циркуляция II типа может проводиться один раз или множество раз, например 2, 3, 4, 5 раз и т.д.
Циркуляции II типа имеет преимущества, по сравнению с циркуляцией I типа, потому что она может помочь обеспечить, чтобы все компоненты первой эмульсии прошли через гомогенизатор. Опорожнение контейнера первого премикса означает, что все содержимое эмульсии прошло через гомогенизатор в контейнер второго премикса. Аналогичным образом, содержимое контейнера второго премикса может опорожняться, снова обеспечивая то, чтобы все оно прошло через гомогенизатор. Таким образом, конструкция II типа может подходяще обеспечить гомогенизацию всех компонентов эмульсии по меньшей мере дважды, что может уменьшить и средний размер капелек масла и число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, в первой эмульсии. Таким образом, идеальная циркуляция II типа включает опорожнение контейнера первого премикса и пропускание, по существу, всего содержимого через гомогенизатор во второй контейнер премикса с последующим опорожнением контейнера второго премикса и повторным пропусканием, по существу, всего его содержимого через гомогенизатор назад в контейнер первого премикса. Таким образом, все частицы проходят через гомогенизатор по меньшей мере дважды, тогда как это трудно достичь при I типе циркуляции.
В некоторых вариантах осуществления используется комбинация циркуляции I типа и II типа, и эта комбинация может обеспечить получение первой эмульсии с хорошими характеристиками. В частности, эта комбинация может в значительной степени уменьшить число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, в первой эмульсии. Эта комбинация может включать любой порядок циркуляции I типа и
II типа, например I тип с последующим II типом, II тип с последующим I типом, I тип с последующим II
типом снова с последующим I типом и т.д. В одном варианте осуществления комбинация включает
20 мин циркуляции I типа с последующим одним II типом циркуляции, т.е. перенос циркулирующих
компонентов первой эмульсии из контейнера первого премикса, через первый гомогенизатор в контейнер
второго премикса, и затем однократно через второй гомогенизатор.
Контейнеры первого и второго премикса могут удерживаться в атмосфере инертного газа, например азота, например, при давлении до 0,5 бар. Это может предотвратить окисление компонентов эмульсии, что имеет особые преимущества, если один из компонентов эмульсии представляет собой сквален. Это может обеспечить увеличение устойчивости эмульсии.
Как указано выше, первоначальный ввод в гомогенизатор может представлять собой не гомогенизированную смесь компонентов первой эмульсии. Эта смесь может быть получена смешиванием отдельных компонентов первой эмульсии индивидуально, но в некоторых вариантах осуществления множественные компоненты могут объединяться перед этим смешиванием. Например, если эмульсия включает поверхностно-активное вещество с HLB ниже 10, то это поверхностно-активное вещество может комбинироваться с маслом перед смешиванием. Аналогичным образом, если эмульсия включает поверхностно-активное вещество с HLB ниже 10, то это поверхностно-активное вещество может комбинироваться с водным компонентом перед смешиванием. Буферные соли могут комбинироваться с водным компонентом перед смешиванием или могут добавляться отдельно.
Способы по изобретению могут использоваться в большом масштабе. Таким образом, способ может включать получение первой эмульсии, объем которой больше чем 1 л, например > 5 л, > 10 л, > 20 л, > 50 л, > 100 л, > 250 л и т.д.
Первая эмульсия после ее образования может быть микрофлюидизирована или может храниться в ожидании микрофлюидизации.
В некоторых вариантах осуществления, в частности в тех, где используются множественные циклы стадий (i) и (ii), ввод в гомогенизатор представляет собой вывод из микрофлюидизатора, так что первая эмульсия микрофлюидизируется и затем снова подвергается гомогенизации.
Микрофлюидизация.
Первая эмульсия после ее образования микрофлюидизируется для уменьшения среднего размера ее капелек масла и/или уменьшения числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм.
Инструменты микрофлюидизации уменьшают средний размер капелек масла проталкиванием потоков вводимых компонентов через геометрически фиксированные каналы под высоким давлением и высокой скоростью. Давление на входе в камеру взаимодействия (также называемое "первым давлением")
может быть существу постоянным (т.е. ±15%; например ±10, ±5, ±2%) в течение по меньшей мере 85% времени, в течение которого компоненты подаются в микрофлюидизатор, например по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99 или 100% времени в течение которого эмульсия подается в микрофлюидизатор.
В одном варианте осуществления первое давление составляет 1300 бар ±15% (18 тыс.фунтов/дюйм2 (~87884 кг/м3) ±15%), т.е. от 1100 до 1500 бар (от 15 тыс.фунтов/дюйм2 (~73236 кг/м3) до 21 тыс.фунтов/дюйм2 (~102531 кг/м3) в течение 85% времени, в течение которого эмульсия подается в микрофлюидизатор. Два подходящих профиля давления показаны на фиг. 3. На фиг. 3А давление является, по существу, постоянным в течение по меньшей мере 85% времени, тогда как на фиг. 3В давление непрерывно остается, по существу, постоянным.
Аппарат микрофлюидизации обычно включает по меньшей мере один усиливающий насос (предпочтительно, два насоса, которые могут быть синхронными) и камеру взаимодействия. Усиливающий насос, который в идеале имеет электрогидравлический привод, обеспечивает высокое давление (т.е. первое давление) для принуждения эмульсии к поступлению в камеру взаимодействия и через нее. Синхронная природа усиливающих насосов может использоваться для обеспечения, по существу, постоянного давления обсужденной выше эмульсии, и это значит, что все капельки эмульсии подвержены, по существу, одинаковому уровню сил сдвига во время микрофлюидизации.
Одно преимущество использования, по существу, постоянного давления состоит в том, что оно может уменьшить отказы вследствие усталости в устройстве микрофлюидизации, что может привести к более длительному сроку службы устройства. Еще одно преимущество использования, по существу, постоянного давления состоит в том, что параметры второй эмульсии могут улучшаться. В частности, может уменьшиться число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, присутствующих во второй эмульсии. Кроме того, средний размер капелек масла второй эмульсии может быть уменьшено, когда используется, по существу, постоянное давление. Уменьшение среднего размера капелек масла и числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, может обеспечить улучшенное выполнение фильтрации. Улучшенное выполнение фильтрации может привести к меньшим потерям содержимого во время фильтрации, например потерь сквалена, Твин 80 и Спан 85, когда эмульсия представляет собой MF59.
Камера взаимодействия может содержать множество, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д., каналов с фиксированной геометрией, в которые проходит эмульсия. Эмульсия поступает в камеру взаимодействия через линию ввода, которая может иметь диаметр от 200 до 250 мкм. Эмульсия делится на потоки при ее поступлении в камеру взаимодействия и, под высоким давлением, ускоряется до высокой скорости. По мере ее прохождения через каналы силы, создаваемые высоким давлением, могут действовать для уменьшения размера капелек эмульсии и уменьшения числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм. Эти силы могут включать силы сдвига, через деформацию потока эмульсии, возникающую в результате контакта со стенками канала; силы соударения, через столкновения, возникающие, когда высокоскоростные потоки эмульсии сталкиваются друг другом; и силы кавитации, через образование и спадание полостей внутри потока. Камера взаимодействия обычно не включает движущиеся части. Она может включать керамические (например, квасцовые) или алмазные (например, поликристаллические алмазные) поверхности каналов. Другие поверхности могут быть исполнены из нержавеющей стали.
Фиксированная геометрия множества каналов в камере взаимодействия может представлять собой геометрию типа "Y" или геометрию типа "Z".
В камере взаимодействия геометрии типа "Y" один вводимый поток эмульсии расщепляется на первый и второй потоки эмульсии, которые затем повторно объединяются в один выводимый поток эмульсии. Перед повторным объединением каждый из первого и второго потоков может независимо расщепляться на первое и второе множество (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) субпотоков. Когда потоки эмульсии снова объединяются, то первый и второй потоки эмульсии (или их субпотоки) идеально текут, по существу, в противоположных направлениях (например, первый и второй потоки эмульсии или их субпотоки текут, по существу, в одной и той же плоскости (±20°), и направление потока первого потока эмульсии на 180±20° отличается от направления потока второго потока эмульсии). Силы, создаваемые когда потоки эмульсии повторно объединяются, могут действовать для уменьшения размера капелек масла эмульсии и уменьшения числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм.
В камере взаимодействия с геометрией типа "Z" поток эмульсии проходит по множеству (например,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.), по существу, прямоугольных камер (т.е. 90±20°). Фиг. 4 иллюстрирует камеру взаимодействия с геометрией типа "Z" и двумя прямоугольными углами в направлении потока. Во время прохождения по углам вводимый поток эмульсии может расщепляться на множество (например, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) субпотоков и затем вновь объединяются в один выводимый поток эмульсии (например, как показано на фиг. 4, с четырьмя субпотоками (32)). Расщепление и затем повторное объединение (31) может происходить в любой точке между вводом и выводом. Силы, создаваемые, когда эмульсия контактирует со стенками канала при ее прохождении по углам, может действовать для уменьшения размера капелек масла эмульсии и уменьшения числа капелек масла, имеющих размер более
1,2 мкм. Примером камеры взаимодействия типа "Z" является камера взаимодействия E320Z, выпускаемая компанией Microfluidica.
В одном варианте осуществления поток эмульсии проходит по двум, по существу, прямым углам. В точке, где входящий поток эмульсии проходит по первому, по существу, прямому углу, он разделяется на пять субпотоков. В точке, когда субпотоки проходят по второму, по существу, прямому углу, они вновь объединяются в один выходящий поток эмульсии.
В предшествующем уровне техники обычно использовались камеры взаимодействия Y-типа для эмульсий масло-в-воде, подобных эмульсиям по настоящему изобретению. Однако заявители обнаружили, что имеет преимущество использование камеры взаимодействия с геометрией каналов типа "Z" для эмульсий масло-в-воде, потому что это может привести к большему уменьшению числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, присутствующих во второй эмульсии, по сравнению с камерой взаимодействия с геометрией типа "Y". Уменьшение числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии может обеспечить улучшенное выполнение фильтрации. Улучшенное выполнение фильтрации может привести к меньшим потерям содержимого во время фильтрации, например потерям скалена, Твин 80 и Спан 85, когда эмульсия представляет собой MF59.
Предпочтительный аппарат микрофлюидизации работает при давлении от 170 до 2750 бар (приблизительно от 2599 фунтов/дюйм2 (134407 кг/м3) до 40000 фунтов/дюйм2 (2068596 кг/м3), например примерно при 345 бар, примерно 690 бар, примерно 1380 бар, примерно 2070 бар и т.д.
Предпочтительный аппарат микрофлюидизации работает при скорости потока до 20 л/мин, например до 14 л/мин, до 7 л/мин, до 3,5 л/мин и т.д.
Предпочтительный аппарат микрофлюидизации имеет камеру взаимодействия, которая обеспечивает скорость сдвига, превышающую 1х106 с-1, например > 2,5х106 с-1, > 5х106 с-1, > 107 с-1 и т.д.
Аппарат микрофлюидизации может включать множественные камеры взаимодействия, которые используются параллельно, например 2, 3, 4, 5 или более, но полезнее включать одну камеру взаимодействия.
Устройство микрофлюидизации может включать добавочный модуль обработки (АРМ), включающий по меньшей мере один канал. АРМ способствует уменьшению среднего размера капелек масла в эмульсии, пропускаемой через устройство микрофлюидизации, хотя большая доля уменьшения происходит в камере взаимодействия. Как указано выше, компоненты эмульсии вносятся в камеру взаимодействия усиливающего насоса (насосов) под первым давлением. Компоненты эмульсии в целом выходят из АРМ при втором давлении, которое ниже, чем первое давление (например, атмосферное давление). В целом, от 80 до 95% разности давления между первым и вторым давлением падает по прохождении через камеру взаимодействия (например, с P1 до Р2 на фиг. 4) и от 5 до 20% разности давления между первым и вторым давлением падает по прохождении через добавочный модуль обработки, например, камера взаимодействия может обеспечить приблизительно 90% падения давления, в то время как АРМ может обеспечить приблизительно 10% падения давления. Если давление упало по прохождении через камеру взаимодействия и давление упало по прохождении через добавочный модуль обработки не учитывают всю разность давления между первыми вторым давлением, это может быть вызвано конечным падением давлением по прохождению по соединителям между камерой взаимодействия и добавочным модулем обработки.
АРМ обычно не включает подвижных частей. Он может включать керамические (например, квасцовые) или алмазные (например, поликристаллические алмазные) поверхности каналов. Другие поверхности могут быть исполнены из нержавеющей стали.
АРМ в целом расположен ниже по технологической цепочке камеры взаимодействия и может также располагаться вслед за камерой взаимодействия. В предшествующем уровне техники АРМ в целом располагаются ниже по технологической цепочке камеры взаимодействия, включающей каналы типа "Y", для подавления кавитации и, посредством этого увеличения скорости потока в камера типа "Y" на величину до 30%. Кроме того, d предшествующем уровне техники АРМ в целом располагаются выше по технологической цепочке камеры взаимодействия, включающей каналы типа "Z" для уменьшения размера больших агломератов. В последнем случае АРМ только уменьшает скорость потока в камерах типа "Z" на величину до 3%. Однако было обнаружено, что расположение АРМ ниже по технологической цепочке камеры взаимодействия, включающей множество каналов типа "Z", является предпочтительным в данном изобретении, потому что оно может привести к большему уменьшению среднего размера капелек масла и большему уменьшению числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, присутствующих во второй эмульсии. Как обсуждено выше, уменьшение числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии может обеспечить улучшенное выполнение фильтрации. Улучшенное выполнение фильтрации может привести к меньшим потерям содержимого во время фильтрации, например потерям сквалена, Твин 80 и Спан 85, когда эмульсия масло-в-воде представляет собой MF59. Еще одно преимущество этого расположения камеры взаимодействия типа "Z" и расположения АРМ ниже по технологической цепочке состоит в том, что это может привести к более медленному уменьшению давления после камеры взаимодействия. Более медленное уменьшение давления может привести к увеличению устойчивости продукта, потому что имеется меньше газа, заключенного в эмульсию.
АРМ включает по меньшей мере один канал с фиксированной геометрией, в который проходит эмульсия. АРМ может содержать множество, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д., каналов с фиксированной геометрией, в которые проходит эмульсия. Канал или каналы АРМ могут быть линейными или нелинейными. Подходящими нелинейными каналами являются каналы с геометрией типа "Z" или с геометрией типа "Y", которые являются такими же? как каналы, описанные выше, для камеры взаимодействия. В одном варианте осуществления канал или каналы АРМ представляют собой каналы с геометрией типа "Z". Множество каналов типа "Z" делят эмульсию на потоки, когда она поступает в АРМ.
В отличие от рекомендаций производителя, использование АРМ, включающего множество каналов с фиксированной геометрией, имеют преимущества, по сравнению с АРМ с одним каналом с фиксированной геометрией, потому что это может привести к большему уменьшению числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, присутствующих во второй эмульсии. Как обсуждено выше, уменьшение числа капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии может обеспечить улучшенное выполнение фильтрации. Улучшенное выполнение фильтрации может привести к меньшим потерям содержимого во время фильтрации, например потерям скалена, Твин 80 и Спан 85, когда эмульсия представляет собой MF59.
Аппарат микрофлюидизации генерирует тепло во время работы, которое может повысить температуру эмульсии на 15-20°C относительно первой эмульсии. Поэтому преимущественно микрофлюидизи-рованная эмульсия охлаждается как можно быстрее. Температура второй эмульсии может поддерживаться ниже 60°C, например ниже 45°C. Таким образом, выпуск камеры взаимодействия и/или выпуск АРМ могут подаваться в механизм охлаждения, такой как теплообменник или охлаждающий змеевик. Расстояние между выпуском и охлаждающим механизмом должно удерживаться как можно короче для сокращения общего времени путем уменьшения задержек охлаждения. В одном варианте осуществления расстояние между выпуском микрофлюидизатора и охлаждающим механизмом составляет от 20 до 30 см. Охлаждающий механизм особенно полезен, когда эмульсия подвергается множественным стадиям микрофлюидизации для предотвращения перегревания эмульсии.
Результатом микрофлюидизации является эмульсия масло-в-воде, второй эмульсии, в которой средний размер капелек масла составляет 500 нм или менее. Этот средний размер особенно полезен, поскольку он облегчает фильтрационную стерилизацию эмульсии. Особенно полезны эмульсии, в которых по меньшей мере 80% по числу капелек масла имеют средний размер 500 нм или менее, например 400 нм или менее, 300 нм или менее, 200 нм или менее или 165 нм или менее. Кроме того, число капелек масла во второй эмульсии, имеющих размер более 1,2 мкм предпочтительно составляет 5х1010/мл или менее, например 5х 109/мл или менее, 5х 108/мл или менее или 2х 108/мл или менее.
Первоначальным вводом для микрофлюидизации может быть первая эмульсия. Однако в некоторых вариантах осуществления микрофлюидизированная эмульсия снова подвергается микрофлюидизации, так что происходят множественные циклы микрофлюидизации. В частности, вторая эмульсия может образовываться циркуляцией компонентов второй эмульсии через устройство микрофлюидизации множество раз, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз и т.д. Вторая эмульсия может быть образована циркуляцией компонентов второй эмульсии через устройство микрофлюидизации от 4 до 7 раз.
Циркуляция компонентов второй эмульсии может включать циркуляцию I типа переноса компонентов второй эмульсии между контейнером первой эмульсии (необязательно, имеющим такие же свойства как контейнер первого премикса) и устройством микрофлюидизации.
Циркуляция компонентов второй эмульсии может включать циркуляцию II типа переноса компонентов второй эмульсии из контейнера первой эмульсии через первое устройство микрофлюидизации в контейнер второй эмульсии (необязательно, имеющий такие же свойства как контейнер первого премик-са) и затем через второе устройство микрофлюидизации.
Второе устройство микрофлюидизации может быть таким же, как первое устройство микрофлюи-дизации. Альтернативно, второе устройство микрофлюидизации может отличаться от первого устройства микрофлюидизации.
Контейнер первой эмульсии может быть таким же, как контейнер первого премикса. Альтернативно, контейнер первой эмульсии может быть таким же, как контейнер второго премикса.
Контейнер второй эмульсии может быть таким же, как контейнер первого премикса. Альтернативно, контейнер второй эмульсии может быть таким же, как контейнер второго премикса.
Контейнер первой эмульсии может быть таким же, как контейнер первого премикса и контейнер второй эмульсии может быть таким же, как контейнер второго премикса. Альтернативно, контейнер первой эмульсии может быть таким же, как контейнер второго премикса и контейнер второй эмульсии может быть таким же, как контейнер первого премикса.
В качестве альтернативы, контейнеры первой и второй эмульсии могут отличаться от контейнеров первого и второго премикса.
После прохождения компонентов второй эмульсии через второе устройство микрофлюидизации компоненты второй эмульсии могут переноситься назад в контейнер первой эмульсии, например, если предстоит повторить процесс циркуляции II типа. Циркуляции II типа может проводиться один раз или
множество раз, например 2, 3, 4, 5 раз и т.д.
Циркуляции II типа имеет преимущества, так как она обеспечивает прохождение всех компонентов второй эмульсии через устройство микрофлюидизации по меньшей мере 2 раза, что уменьшает средний размер капелек масла и число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии.
Комбинация циркуляции I типа и циркуляции II типа может использоваться во время микрофлюи-дизации. Эта комбинация может включать любой порядок циркуляции I и II типа, например I тип, за которым следует II тип; II тип, за которым следует I тип; I тип, за которым следует II тип, за которым снова следует I тип, и т.д.
Контейнеры первой и второй эмульсии могут удерживаться в атмосфере инертного газа, например до 0,5 бар азота. Это предотвращает окисление компонентов эмульсии, что особенно предпочтительно, если один из компонентов эмульсии представляет собой сквален. Это ведет к увеличению устойчивости эмульсии.
Способы по изобретению могут использоваться в крупном масштабе. Так, способ может включать микрофлюидизацию объема более чем 1 л, например > 5 л, > 10 л, > 20 л, > 50 л, > 100 л, > 250 л и т.д. Фильтрация.
После микрофлюидизации вторая эмульсия фильтруется. Эта фильтрация удаляет любые крупные капельки масла, которые перенесли процедуры гомогенизации и микрофлюидизации. Хотя число этих капель невелико, они могут иметь большой объем и могут действовать в качестве участков нуклеации для агрегации, приводя к деградации эмульсии во время хранения. Кроме того, эта стадия фильтрации может достичь фильтрационной стерилизации.
Конкретная фильтрационная мембрана, подходящая для фильтрационной стерилизации, зависит от жидкостных характеристик второй эмульсии и требуемой степени фильтрации. Характеристики фильтра могут воздействовать на его пригодность для фильтрации микрофлюидизированной эмульсии. Например, могут быть важны его характеристики размера пор и поверхности, особенно при фильтрации эмульсии на основе сквалена.
Размер пор мембран, используемых в изобретении, должен обеспечить возможность прохождения желательных капелек, в то же время удерживая нежелательные капельки. Например, он должен задерживать капельки, которые имеют размер > 1 мкм, в то же время пропуская капельки размером менее 200 нм. Идеальным является фильтр с размером пор 0,2 или 0,22 мкм, и он может также обеспечить достижение фильтрационной стерилизации.
Эмульсия может предварительно фильтроваться, например, через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Префильтрация и фильтрация может осуществляться в одну стадию использованием известных двуслойных фильтров, которые включают первый мембранный слой с более крупными порами и второй мембранный слой с меньшими порами. Двуслойные фильтры особенно полезны для изобретения. Первый слой в идеале имеет размер пор более 0,3 мкм, например от 0,3 до 2 мкм, или от 0,3 до 1 мкм, или от 0,4 до 0,8 мкм, или от 0,5 до 0,7 мкм. Предпочтителен размер пор в первом слое <0,75 мкм. Таким образом, первый слой может иметь размер пор, например, 0,6 или 0,45 мкм. Второй слой в идеале имеет размер пор, который составляет менее чем 75% (и в идеале менее чем половину) размера пор первого слоя, например от 25 до 70% или от 25 до 49% размера пор первого слоя, например от 30 до 45%, например от 1/3 до 4/9 размера пор первого слоя. Таким образом, второй слой может иметь размер пор менее 0,3 мкм, такой как от 0,15 до 0,28 мкм или от 0,18 до 0,24 мкм, например размер пор второго слоя 0,2 или 0,22 мкм. В одном примере первый мембранный слой с более крупными порами обеспечивает фильтра с размером пор 0,45 мкм, в то время как второй мембранный слой с меньшими порами обеспечивает фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Фильтрационная мембрана и/или префильтрационная мембрана могут быть асимметричными. Асимметричная мембрана представляет собой мембрану, в которой размер пор варьируется от одной стороны мембраны к другой, например в которой размер пор больше на входной поверхности, чем на выходной поверхности. Одна сторона асимметричной мембраны может именоваться "поверхностью с грубыми порами", тогда как другая сторона асимметричной мембраны может именоваться "поверхностью с мелкими порами". В двуслойном фильтре один или (в идеале) оба слоя могут быть асимметричными.
Фильтрационная мембрана может быть пористой или гомогенной. Гомогенная мембрана представляет собой обычно плотную пленку в диапазоне от 10 до 200 мкм. Пористая мембрана имеет пористую структуру. В одном варианте осуществления фильтрационная мембрана является пористой. В двуслойном фильтре, оба слоя могут быть пористыми, оба слоя могут быть гомогенными или может быть один пористый и один гомогенный слой. Предпочтительным двуслойным фильтром является фильтр, в котором оба слоя являются пористыми.
В одном варианте осуществления вторая эмульсия предварительно фильтруется через асимметричную, гидрофильную пористую мембрану и затем фильтруется через другую асимметричную, гидрофильную пористую мембрану, имеющую меньшие поры, чем префильтрационная мембрана. В ней может использоваться двуслойный фильтр.
Мембрана (мембраны) фильтра может автоклавироваться перед использованием для обеспечения ее (их) стерильности.
Фильтрационные мембраны обычно изготавливаются из полимерных опорных материалов, таких как PTFE (политетрафторэтилен), PES (полиэфирсульфон), PVP (поливинилпирролидон), PVDFF (поли-винилиденфторид), нейлоны (полиамиды), РР (полипропилен), целлюлозы (включая сложные эфиры целлюлозы), PEEK (полиэфирэфиркетон), нитроцеллюлоза и т.д. (хотя изобретение предпочтительно избегает использования фильтров на основе целлюлозы). Эти опорные материалы имеют варьирующиеся характеристики, причем некоторым подложкам присущи гидрофобные свойства (например, PTFE), а другим присущи гидрофильные свойства (например, ацетаты целлюлозы). Однако эти присущие характеристики могут модифицироваться обработкой поверхности мембраны. Например, известно получение гидрофилизированных и гидрофобизированных мембран обработкой их другими материалами (такими как другие полимеры, графит, силикон и т.д.) для покрытия поверхности мембраны, например, см. раздел 2.1 ссылки [15]. В двуслойном фильтре две мембраны могут быть изготовлены из различных материалов или (в идеале) одного и того же материала.
Идеальный фильтр для использования в изобретении имеет гидрофильную поверхность, в отличие от положений ссылок [9-12], что следует использовать гидрофобные (полисульфоновые) фильтры. Фильтры с гидрофильными поверхностями могут быть образованы из гидрофильных материалов или гидро-филизацией гидрофобных материалов, и предпочтительным фильтром для использования в изобретении является гидрофильная полиэфирсульфоновая мембрана. Известно несколько различных способов для трансформации гидрофобных PES мембран в гидрофильные PES мембраны. Часто это достигается покрытием мембраны гидрофильным полимером. Для обеспечения постоянного прикрепления гидрофильного полимера к PES слой гидрофильного покрытия обычно подвергается или реакции поперечной сшивки, или прививке. В ссылке [15] описан способ модификации поверхностных свойств гидрофобного полимера, имеющего функционализируемые концы цепи, включающий обеспечение контакта полимера с раствором линкерной части для образования ковалентной связи и затем обеспечение контакта подвергнутого реакции гидрофобного полимера с раствором модифицирующего агента. В ссылке [15] описан способ гидрофилизиации PES мембраны непосредственным покрытием мембраны, включающий предварительное смачивание спиртом и затем пропитывание в водном растворе, содержащем гидрофильный мономер, полифункциональный мономер (поперечно сшивающий агент) и инициатор полимеризации. Затем мономер и поперечно сшивающий агент полимеризируются с использованием термической или инициированной УФ-излучением полимеризации для образования покрытия поперечно сшитого гидрофильного полимера на поверхности мембраны. Аналогичным образом, в ссылках [17 и 18] описывается покрытие PES мембраны вымачиванием в водном растворе гидрофильного полимера (полиалкиленокси-да) и по меньшей мере одного полифункционального мономера (поперечно сшивающего агента) и затем полимеризацией PES мембраны реакцией прививки, при которой PES мембрана подвергается обработке низкотемпературной гелиевой плазмы с последующей прививкой гидрофильного мономера ]Ч-винил-2-пирролидона (NVP) на поверхность мембраны.
Дополнительно, такие способы описаны в ссылках [20-26].
В способах, которые не основываются на покрытии, PES может быть растворен в растворителе, смешан с растворимой гидрофильной добавкой и затем смешанный раствор используется для отливки гидрофильной мембраны, например, осаждением или инициацией сополимеризации. Такие способы описаны в ссылках [27-33]. Например, в ссылке [33] описан способ получения гидрофильной модифицированной зарядом мембраны, которая имеет низкое содержание экстрагируемых из мембраны веществ и обеспечивает возможность быстрого восстановления резистивности сверхчистой воды; мембрана имеет образованную сетевую структуру поперечно сшитого взаимопроникающего полимера; способ включает получение полимерного раствора смеси PES, PVP, полиэтиленимина и алифатического простого дигли-цидилового эфира, образующего тонкую пленку раствора и осаждение пленки в виде мембраны. Аналогичный способ описан в ссылке [34].
Могут использоваться гибридные подходы, при которых гидрофильные добавки присутствуют во время образования мембраны и также добавляются позднее в качестве покрытия, например, см. ссылку
[35].
Гидрофилизация PES мембраны может быть также достигнута обработкой низкотемпературными плазмами. В ссылке [36] описана гидрофильная модификация PES мембраны обработкой низкотемпературной С02-плазмой.
Гидрофилизация PES мембраны может быть также достигнута окислением, как описано в ссылке [37]. Этот способ включает предварительное смачивание гидрофобной PES мембраны в жидкости, имеющей низкое поверхностное натяжение, воздействие на влажную PES мембрану водным раствором окислителя и затем нагревание.
Может также использоваться фазовая инверсия, как описано в ссылке [38].
Идеальная гидрофильная PES мембрана может быть получена обработкой PES (гидрофобной) PVP (гидрофильным). Было обнаружено, что обработка PEG (гидрофильным) вместо PVP дает гидрофилизо-ванную PES мембрану, которая легко загрязняется (в частности, при использовании содержащей сквален
эмульсии), а также вызывает нежелательное высвобождение формальдегида во время автоклавирования.
Предпочтительный двуслойный фильтр имеет первую гидрофильную PES мембрану и вторую гидрофильную PES мембрану. Не являются предпочтительными (и могут иногда отклоняться) варианты осуществления, при которых фильтрация сначала происходит через двуслойный фильтр из ацетата целлюлозы, а затем через второй двуслойный фильтр из ацетата целлюлозы, где меньший размер пор первого фильтра больше, чем больший размер пор второго фильтра, и где второй двуслойный фильтр достигает фильтровой стерилизации.
Известные гидрофильные мембраны включают Bioassure (от компании Cuno); полиэфирсульфон EverLUX(tm); полиэфирсульфон STyLUX(tm) (оба от компании Meissner); Millex GV, Milex HP, Millipak 50, Millipak 200 и мембраны Durapore CVGL01TP3 (от компании Millipore); мембрану Fluorodyne(tm) EX EDF, Supor(tm) EAV; Supor(tm) EBV, Supor(tm) EKV (все от компании Pall); Sartopore(tm) (от компании Sartotius); гидрофильная PES мембрана компании Sterlitach; WFPES PES мембрана компании Wolftechnik.
Во время фильтрации эмульсия может поддерживаться при температуре 40°С или менее, например 30°С или менее, для содействия успешной стерилизационной фильтрации. Некоторые эмульсии могут не проходить через стерилизационный фильтр, когда они находятся при температуре больше чем 40°С.
Имеет преимущества проведение стадии фильтрации в пределах 24 ч, например, в пределах 18 ч, в пределах 12 ч, в пределах 6 ч, в пределах 2 ч, в пределах 30 мин после получения второй эмульсии, потому что после этого времени прохождение второй эмульсии через стерилизационный фильтр может быть невозможно без закупорки фильтра, как обсуждается в ссылке [39].
Способы по изобретению могут использоваться в крупном масштабе. Так, способ может включать фильтрацию объема более чем 1 л, например > 5 л, > 10 л, > 20 л, > 50 л, > 100 л, > 250 л и т.д.
Конечная эмульсия.
Результатом микрофлюидизации и фильтрации является эмульсия масло-в-воде, в которой средний размер капелек масла может быть меньше чем 220 нм, например 155+20 нм, 155+10 нм или 155±5 нм, и в которой число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, может составлять 5х108/мл или менее, например 5х 107/мл или менее, 5х 106/мл или менее, 2х 106/мл или менее или 5х 105/мл или менее.
Средний размер капелек масла эмульсии, описанных в настоящем изобретении (включая первую и вторую эмульсии) в целом составляет не менее чем 50 нм.
Способы по изобретению могут использоваться в крупном масштабе. Таким образом, способ может включать получение конечной эмульсии с объемом более чем 1 л, например, > 5 л, > 10 л, > 20 л, > 50 л, > 100 л, > 250 л и т.д.
После образования эмульсии масло-в-воде она может быть перенесена в стерильные стеклянные флаконы. Стеклянные флаконы могут иметь размер 5, 8 или 10 л. Альтернативно, эмульсия масло-в-воде может быть перенесена в стерильный гибкий мешок (flex bag). Гибкий мешок может иметь размер 50, 100 или 250 л. Кроме того, гибкий мешок может быть снабжен одним или более стерильных переходников для соединения гибкого мешка с системой. Использование гибкого мешка со стерильными переходниками имеет преимущества, по сравнению со стеклянными флаконами, потому что гибкий мешок, больше чем стеклянные флаконы, означая, что может не быть необходимости в замене гибкого мешка для хранения всей эмульсии, полученной одной партией. Это может обеспечить стерильную закрытую систему для получения эмульсии, которая может снижать вероятность присутствия примесей в конечной эмульсии. Это может быть особенно важно, если конечная эмульсия используется в фармацевтических целях, например, если конечная эмульсия представляет собой адъювант MF59.
Предпочтительные количества масла (об.%) в конечной эмульсии составляют от 2 до 20%, в частности примерно 10%. В частности, может использоваться содержание сквалена примерно 5 или примерно 10%. В частности, может использоваться содержание сквалена (мас./об.) от 30 до 50 мг/мл, например от 35 до 45 мг/мл, от 3 6 до 42 мг/мл, от 3 8 до 4 0 мг/мл и т.д.
Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (мас.%) в конечной эмульсии составляют: сложных полиоксиэтиленсорбитанэфиров (таких как Твин 80) от 0,02 до 2%, в частности примерно 0,5 или примерно 1%; сложных эфиров сорбитана (таких как Спан 80) от 0,02 до 2%, в частности примерно 0,5 или примерно 1%; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолов (таких как Тритон Х-100) от 0,001 до 0,1%, в частности от 0,005 до 0,02%; простых эфиров полиоксиэтилена (таких как лаурет 9) от 0,1 до 20%, предпочтительно от 0,1 до 10% и, в частности, от 0,1 до 1% или примерно 0,5%. Может использоваться содержание полисорбата 80 (мас./об.) от 4 до 6 мг/мл, например от 4,1 до 5,3 мг/мл. Содержание сорбитана триолеата (мас./об.) от 4 до 6 мг/мл, например от 4,1 до 5,3 мг/мл.
Способ особенно полезен для получения любой из следующих эмульсий масло-в-воде:
Эмульсия, содержащая сквален, полисорбат 80 (Твин 80) и сорбитан триолеат (Спан 85). Композиция эмульсии по объему может представлять собой примерно 5% сквалена, примерно 0,5% полисорбата 80 и примерно 0,5% сорбитана триолеата. В пересчете на массу, эти количества становятся 4,3% сквале-на, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% сорбитана триолеата. Этот адъювант известен как "MF59". Эмульсия MF59 преимущественно включает цитратные ионы, например, 10 мМ буфера цитрата натрия.
Эмульсии, содержащие сквален, а-токоферол (в идеале, DL-а-токоферол) и полисорбат 80. Эти эмульсии могут иметь (по массе) от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% а-токоферола и от 0,3 до 3% поли-сорбата 80, например, 4,3% сквалена, 4,7% а-токоферола, 1,9% полисорбата 80. Массовое отношение сквалена:токоферола составляет предпочтительно <1 (например, 0,90), поскольку это обеспечивает получение более устойчивой эмульсии. Сквален и полисорбат 80 могут присутствовать в объемном отношении примерно 5:2 или массовом отношении примерно 11:5. Одна такая эмульсия может быть получена растворением полисорбата 80 в PBS (солевом растворе с фосфатным буфером) для получения 2% раствора, затем смешиванием 90 мл этого раствора со смесью (5 г DL-а-токоферола и 5 мл сквалена), затем микрофлюидизацией смеси. Полученная эмульсия может иметь субмикронные капельки масла, например, с размером от 100 до 250 нм, предпочтительно примерно 180 нм.
Эмульсия сквалена, а-токоферола и детергента Тритона (например, Тритона Х-100).
Эмульсия может также включать 3-0-деацилированный монофосфорил липид A ("3d-MPL"), хотя эмульсии, содержащие 3d-MPL, не предпочтительны в настоящем изобретении (и могут иногда отклоняться). Эмульсия может содержать фосфатный буфер.
Эмульсия, содержащая сквален, полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Тритон (например, Тритон Х-100) и токоферол (например, а-токоферол сукцинат).
Эмульсия может включать эти три компонента в массовой соотношении 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/мл Тритона Х-100 и 100 мкг/мл а-токоферола сукцината), и эти концентрации должны включать любой вклад этих компонентов из антигенов. Эмульсия может также включать 3d-MPL. Эмульсия может также включать сапонин, такой как QS21. Водная фаза может содержать фосфатный буфер.
Эмульсия, содержащая сквален, водный растворитель, гидрофильное не ионное поверхностно-активное вещество в виде простого алкилового эфира плиоксиэтилена (например, простой цетостералио-вый эфир полиокисэтилена (12)) и гидрофобное не ионное поверхностно-активное вещество (например, сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннида, такой как сорбитан моноолеат или "Спан 80").
Эмульсия является предпочтительно термообратимой и/или имеет по меньшей мере 90% капелек масла (по объему) размером менее чем 200 нм [40]. Эмульсия может также включать один или более из алдитола; криопротективного агента (например, сахара, такого как додецилмальтозид и/или сахарозу) и/или алкилполигликозида. Она может также включать агонист TLR4, такой как агонист, чья химическая структура не включает сахарное кольцо [41]. Такие эмульсии могут быть лиофилизированными.
Композиции этих эмульсий, выраженные выше в процентном пересчете, могут быть модифицированы путем разведения или концентрации (например, на целое число, такое как 2 или 3, или на фракцию, такую как 2/3 или 3/4), при которых их соотношения остаются такими же. Например, концентрированный в 2 раза MF59 имел бы примерно 10% сквалена, примерно 1% полисорбата 80 и примерно 1% сор-битана триолеата. Концентрированные формы могут разбавляться (например, раствором антигена) для получения желательной конечной концентрации эмульсии.
Эмульсии по изобретению в идеале хранятся при температуре от 2 до 8°С. Их не следует замораживать. В идеале, следует избегать попадания на них прямого света. В частности, эмульсии и вакцины по изобретению, содержащие сквален, следует защищать от света во избежание фотохимического разрушения сквалена. Если эмульсии по изобретению хранятся, то это предпочтительно происходит в инертной атмосфере, например N2 или аргона.
Вакцины.
Хотя возможно введение пациентам адъювантов в виде эмульсии масло-в-воде самих по себе (например, для обеспечения адъювантного эффекта для антигена, который отдельно вводился пациенту), обычнее смешивают адъювант с антигеном перед введением для образования иммуногенной композиции, например, вакцины. Смешивание эмульсии и антигена может происходить непосредственно перед введением, во время применения или может происходить во время изготовления вакцины, перед розливом. Способы по изобретению могут использоваться в обеих ситуациях.
Таким образом, способ по изобретению может включать еще одну стадию процесса - смешивания эмульсии с антигенным компонентом. В качестве альтернативы он может включать еще одну стадию -упаковки адъюванта в набор в качестве компонента набора вместе с антигенным компонентом.
Поэтому в целом изобретение может использоваться при получении смешанных вакцин или при получении наборов, включающих антиген и адъювант, готовые для смешивания. Когда смешивание происходит во время изготовления, то объемы основного количества антигена и эмульсии, которые смешиваются, обычно составят более чем 1 л, например > 5 л, > 10 л, > 20 л, > 50 л, > 100 л, > 250 л и т.д. Когда смешивание происходит во время использования, то объемы, которые смешиваются, обычно составят меньше чем 1 мл, например <0,6 мл, <0,5 мл, <0,4 мл, <0,3 мл, <0,2 мл и т.д. В обоих случаях, обычно производится смешивание, по существу, равных объемов эмульсии и раствора антигена, т.е., по существу, 1:1 (например, от 1,1:1 до 1:1,1, предпочтительно от 1,05:1 до 1:1,05, а предпочтительнее от 1,025:1 до 1:1,025). Однако в некоторых вариантах осуществления может использоваться избыток эмульсии или избыток антигена [42]. Когда используется избыточный объем одного компонента, то избыток в целом
составит по меньшей мере 1,5:1, например > 2:1, > 2,5:1, > 3:1, > 4:1, > 5:1 и т.д.
Когда антиген и адъювант представлены в виде отдельных компонентов внутри набора, то они физически отделены друг от друга внутри набора, и это разделение может быть достигнуто различными путями. Например, компоненты могут находиться в отдельных контейнерах, таких как флаконы. Содержимое двух флаконов может затем при необходимости смешиваться, например, удалением содержимого одного флакона и добавлением его в другой флакон или отдельно удалением содержимого обоих флаконов и смешиванием их в третьем контейнере.
В другой компоновке один из компонентов набора представляет собой шприц, а другой находится в контейнере, таком как флакон. Шприц может использоваться (например, иглой) для введения его содержимого во флакон для смешивания, и смесь может затем удаляться в шприц. Смешанное содержимое шприца может затем вводиться пациенту, обычно через новую стерильную иглу. Упаковка одного компонента в шприц устраняет необходимость в использовании отдельного шприца для введения пациенту.
В другой предпочтительной компоновке два компонента набора удерживаются вместе, но раздельно в одном и том же шприце, например двухкамерном шприце, таком как шприцы, описанные в ссылках [43-50] и т.д. Когда шприц приводится в действие (например, во время введения пациенту), то содержимое двух камер смешивается. Эта компоновка позволяет избежать необходимости отдельной стадии смешивания во время применения.
Содержимое различных компонентов набора обычно представлено в жидкой форме. В некоторых компоновках компонент (обычно антигенный компонент, а не эмульсионный компонент) представлен в сухой форме (например, в лиофилизированной форме), причем другой компонент представлен в жидкой форме. Два компонента могут смешиваться для реактивации сухого компонента и предоставления жидкой композиции для введения пациенту. Лиофилизированный компонент обычно находится внутри флакона, а не шприца. Сушеные компоненты могут включать стабилизаторы, такие как лактоза, сахароза или маннит, а также их смеси, например смеси лактозы/сахарозы, смеси сахарозы/маннита и т.д. В одной возможной компоновке используется жидкий эмульсионный компонент в предварительно заполненном шприце и лиофилизированный антигенный компонент во флаконе.
Если вакцины содержат компоненты в дополнение к эмульсии и антигену, то эти дополнительные компоненты могут быть включены в один из указанных двух компонентов набора или могут представлять собой часть третьего компонента набора.
Подходящие контейнеры для смешанных вакцин по изобретению или отдельные компоненты набора включают флаконы и одноразовые шприцы. Эти контейнеры должны быть стерильными.
Когда композиция/компонент содержится во флаконе, то флакон предпочтительно изготовлен из стекла или пластикового материала. Флакон предпочтительно стерилизуется перед добавлением в него композиции. Во избежание проблем с чувствительными к латексу пациентами, флаконы предпочтительно укупорены пробкой, не содержащей латекс, и предпочтительно отсутствие латекса во всем упаковочном материале. В одном варианте осуществления флакон имеет пробку из бутилового каучука. Флакон может включать одну дозу вакцины/компонента или он может включать более чем одну дозу ("многодо-зовый" флакон), например 10 доз. В одном варианте осуществления флакон включает 10х0,25 мл доз эмульсии. Предпочтительные флаконы изготовлены из бесцветного стекла.
Флакон может иметь колпачок (например, люэровский штуцер, приспособленный для того, чтобы предварительно заполненный шприц мог быть вставлен в колпачок, содержимое шприца можно было вытолкнуть во флакон (например, для восстановления влагосодержания в лиофилизированном материале, содержащимся в нем), и содержимое флакона может быть удалено назад в шприц. После удаления шприца из флакона игла может затем быть прикреплена и композиция введена пациенту. Колпачок предпочтительно располагается внутри заглушки или крышки с тем, чтобы нужно было удалить заглушку или крышку перед доступом к колпачку.
Когда композиция/компонент упакован в шприц, то шприц обычно не имеет игла, прикрепленного к нему, хотя отдельная игла может поставляться со шприцем для сборки применения. Предпочтительны безопасные иглы. Обычно используются иглы длиной 1 дюйм (25,4 мм) 23 калибра, 1 дюйм (25,4 мм) 25 калибра и 5/8 дюйма (~16 мм) 25 калибра. Шприцы могут быть обеспечены отклеиваемыми этикетками, на которых могут быть напечатаны номер лота, сезон гриппа и срок годности содержимого для облегчения ведения документации. Поршень в шприце предпочтительно имеет стопор для предотвращения случайного удаления поршня во время аспирации. Шприцы могут иметь колпачок и/или поршень из ла-тексного каучука. Одноразовые шприцы содержат одну дозу вакцины. Шприц в целом имеет концевой колпачок для укупоривания кончика перед присоединением иглы, и концевой колпачок предпочтительно изготовлен из бутилового каучука. Если шприц и игла упакованы отдельно, то игла предпочтительно снабжена защитой из бутилового каучука.
Эмульсия может разбавляться буфером перед упаковкой во флакон или шприц. Обычные буферы включают фосфатный буфер; трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер или цитратный буфер. Разбавление может уменьшить концентрацию компонентов адъюванта, в то же время удерживая их относительные пропорции, например, для представления адъювант "половинной
силы".
Контейнеры могут быть маркированы для обозначения объема половины дозы, например, для облегчения доставки детям. Например, шприц, содержащий дозу 0,5 мл, может иметь маркировку, показывающую объем 0,25 мл.
Когда используется стеклянный контейнер (например, шприц или флакон), то предпочтительно использование контейнера, выполненного из борсиликатного стекла, а не из натриево-кальциево-силикатного стекла.
Различные антигены могут использоваться с эмульсиями масло-в-воде, включая без ограничения вирусные антигены, такие как белки поверхности вирусной частицы; бактериальные антигены, такие как белковые и/или сахаридные антигены; грибковые антигены; паразитарные антигены и опухолевые антигены. Изобретение, в частности, может использоваться для вакцин против вируса гриппа, ВИЧ, анкилостомы, вируса гепатита В, вируса простого герпеса, бешенства, респираторного интерстициального вируса, цитомегаловируса, Staphylococcus aureus, хламидий, коронавируса SARS, вируса опоясывающего лишая, Streptococcus pneumonia, Neiiseria meningitides, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, вируса Эпштейна-Барра, человеческого вируса папилломы и т.д., например:
Антигены вируса гриппа.
Они могут принимать форму живого вируса или инактивированного вируса. Когда используется инактивированный вирус, вакцина может содержать цельный вирион, расщепленный вирион или очищенные поверхностные антигены (включая гемагглютинин и обычно также включая нейраминидазу). Гриппозные антигены могут быть также представлены в форме виросом. Антигены могут иметь любой подтип гемагглютинина, выбранный из H1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, H10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 и/или Н16. Вакцина может включать антиген(ы) из одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, включая вирус гриппа А и/или вирус гриппа В, например моновалентная вакцина A/H5N1 или A/H1N1 или тривалентная вакцина A/H1N1+A/H3N2+B вакцина. Вирус гриппа может представлять собой реассортантный штамм и может быть получен методами обратной генетики (например, [51-55]). Таким образом, вирус может включать один или более сегментов РНК из вируса A/PR/8/34 (обычно, 6 сегментов из A/PR/8/34, причем сегменты HA и N из вакцинного штамма, т.е. реассортанта 6:2). Вирусы, используемые в качестве источника антигенов, могут быть выращены или на яйцах (например, эмбрионированных куриных яйцах), или на клеточных культурах. Когда используется клеточная культура, то клеточный субстрат обычно представляет собой линию клеток млекопитающих, такую как MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; W1-38 и т.д.). Предпочтительные линии клеток млекопитающих для выращивания вирусов гриппа включают клетки MDCK [56-59], происходящие из собачьей почки Madin Darby; клетки Vero [60-62], происходящие из почки африканской макаки, или клетки PER.C6 [63], происходящие из человеческих эмбриональных ретинобластов. Когда вирус выращен на линии клеток млекопитающих, то композиция преимущественно не должна содержать яичные белки (например, овальбумин и овомукоид) и куриную ДНК, посредство этого снижая аллергенность. Единицы доз вакцины обычно стандартизируются ссылкой на содержание гемагглютинина (НА), обычно измеряемое SRID (простой радиальной иммунодиффузией). Существующие вакцины обычно содержат примерно 15 мкг HA на штамм, хотя могут использоваться более низкие дозы, в частности при использовании адъ-юванта. Использовались фракционные дозы, такие как 1/2 (т.е. 7,5 мкг HA на штамм), 1/4 и 1/8 [64,65], как и более высокие дозы (например, дозы 3х или 9х [66, 67]). Таким образом, вакцины могут включать от 0,1 до 150 мкг HA на штамм гриппа, почтительно от 0,1 до 50 мкг, например 0,1-20 мкг, 0,1-15 мкг, 0,1-10 мкг, 0,1-7,5 мкг, 0,5-5 мкг и т.д. Конкретные дозы включают, например, примерно 15, примерно 10, примерно 7,5, примерно 5, примерно 3,8, примерно 3,75, примерно 1,9, примерно 1,5 и т.д. на штамм.
Вирус иммунодефицита человека, включая ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Антиген обычно представляет собой оболочечный антиген.
Поверхностные антигены вируса гепатита В.
Этот антиген предпочтительно получают методами рекомбинантной ДНК, например, после экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerevisae. В отличие от нативного вирусного HBsAg, антиген, экспрес-сируемый рекомбинантными дрожжами, является не гликозилированным. Он может быть в форме, по существу, сферических частиц (средний диаметр примерно 20 нм), включающих липидную матрицу, содержащую фосфолипиды. В отличие от частиц нативного HBsAg, экспрессируемые дрожжами частицы могут включать фосфатидилинозит. HBsAg может быть из любого подтипа ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- и adrq+.
Анкилостома, в частности, наблюдаемая у собак (Ancylostoma caninum).
Этот антиген может представлять собой рекомбинантную Ас-МТР-1 (подобную астацину металло-протеазу) и/или аспарагиновую гемоглобиназу (Ас-APR-!), которая может быть экспрессирована в системе бакуловирус/клетка насекомого в виде секретируемого белка [68, 69]).
Антигены вируса простого герпеса (HSV).
Предпочтительным антигеном HSV для использования в изобретении является мембранный глико-протеин gD. Предпочтительно использовать gD из штамма HSV-2 (антиген "gD2"). В композиции может использоваться форма gD, в которой якорная область С-концевой мембраны была делетирована [70], например, усеченный gD, содержащий аминокислоты 1-306 натурального белка с добавлением аспарагина и глутамина на С-конце. Эта форма белка включает сигнальный пептид, который расщепляется для выхода зрелого белка из 283 аминокислот. Делеция якоря обеспечивает возможность получения белка в растворимой форме.
Антигены вируса папилломы человека (HPV).
Предпочтительные антигены HPV для использования в изобретении являются капсидные белки L1, которые могут собираться для образования структур, известных как вирусоподобные частицы (VLP). VLP могут быть получены рекомбинантной экспрессией L1 в дрожжевых клетках (например, в S.cerevisiae) или в клетках насекомых (например, в клетках Spodoptera, таких как S.frugiperda, или в клетках Drosophila). Для дрожжевых клеток плазмидные векторы могут нести ген(ы) L1; для клеток насекомых бакуловирусные векторы могут нести ген(ы) L1. Предпочтительнее композиция включает L1 VLP из штаммов и HPV-16, и HPV-18. Было показано, что эта бивалентная комбинация высокоэффективна [71]. В дополнение к штаммам HPV-16 и HPV-18, возможно также включение L1 VLP из штаммов HPV-6 и HPV-11. Возможно также использование онкогенных штаммов HPV. Вакцина может включать от 20 до 60 мкг/мл (например, примерно 40 мкг/мл) L1 на штамм HPV.
Антигены сибирской язвы.
Сибирская язва вызывается Bacillus anthracis. Подходящие антигены В^Шиш^ включают А-компоненты (летальный фактор (LF) и фактор отека (EF)), которые оба могут разделять общий В-компонент, известный как защитный антиген (РА). Антигены могут быть необязательно детоксифици-рованы. Дополнительные подробности можно найти в ссылках [72-74].
Антигены S.aureus.
Известны разнообразные антигены S.aureus. Подходящие антигены включают капсулярные сахари-ды (например, из штамма типа 5 и/или типа 8) и белки (например, IsdB, Hla, и т.д.). Капсулярные саха-ридные антигены в идеале конъюгированы с белком-носителем.
Антигены S.pneumoniae.
Известны разнообразные антигены S.pneumoniae. Подходящие антигены включают капсулярные сахариды (например, из одного или более серотипов 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F и/или 23F) и белков (например, пневмолизина, детоксифицированного пневмолизина, полигистидинового триадного белка D (PhtD) и т.д.). Капсулярные сахаридные антигены в идеале конъюгированы с белком-носителем.
Раковые антигены.
Известны разнообразные опухолеспецифические антигены. Изобретение может использоваться с антигенами, которые вызывают иммунотерапевтическую реакцию против рака легких, меланомы, рака молочных желез, рака предстательной железы и т.д.
Раствор антигена обычно смешивается с эмульсией, например, в объемном отношении 1:1. Это смешивание может выполняться или производителем вакцины перед розливом, или может выполняться в точке применения медицинским работником.
Фармацевтические композиции.
Композиции, полученные с использованием способов по изобретению, являются фармацевтически приемлемыми. Они могут включать компоненты в дополнение к эмульсии и необязательному антигену.
Композиция может включать консервант, такой как тиомерсал или 2-феноксиэтанол. Однако предпочтительно, чтобы вакцина, по существу, не содержала (т.е. менее чем 5 мкг/мл) ртутного материала, например не содержала тиомерсал [75, 76]. Более предпочтительны вакцины и компоненты, не содержащие ртуть.
рН композиции в целом составляет от 5,0 до 8,1, более предпочтительно от 6,0 до 8,0, например от 6,5 до 7,5. Способ по изобретению может поэтому включать стадию регулирования рН вакцины перед упаковкой.
Композиция является предпочтительно стерильной. Композиция является предпочтительно непиро-генной, например, содержащей менее 1 EU (эндотоксической единицы, стандартной меры) на дозу. Композиция предпочтительно не содержит клейковину.
Композиция может включать материал для однократной иммунизации или может включать материал для множественных иммунизации (т.е. "многодозовый" набор). Предпочтительно включение в много-дозовые варианты.
Вакцины обычно вводятся в объеме дозировки примерно 0,5 мл, хотя детям может вводиться половина дозы (т.е. примерно 0,25 мл).
Способы лечения и введение вакцины.
Изобретение относится к наборам и композициям, полученным с использованием способов по изобретению. Композиции, полученные в соответствии со способами по изобретению, подходят для введения людям-пациентам, и изобретение относится к способу усиления иммунного ответа у пациента,
включающему стадию введения такой композиции пациенту.
Изобретение также относится к наборам и композициям для применения в качестве лекарственных средств.
Изобретение также относится к применению (i) водного препарата антигена и (ii) эмульсии масло-вводе, полученной в соответствии с изобретением, в получении лекарственного средства для усиления иммунного ответа у пациента.
Иммунный ответ, усиленный указанными способами и применениями, в целом включает реакцию антител, предпочтительно реакцию защитных антител.
Композиции могут вводиться различными путями. Наиболее предпочтительным путем иммунизации является внутримышечная инъекция (например, в верхнюю или нижнюю конечность), но другие доступные пути включают подкожную инъекцию, интраназальный [77-79], пероральный [80], интрадер-мальный [81, 82], чрескожный, трасдермальный [83] пути и т.д.
Вакцины, полученные в соответствии с изобретением, могут использоваться для лечения и детей, и взрослых. Возраст пациентов может быть менее 1 года, 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или по меньшей мере 55 лет. Пациенты могут быть пожилыми (например, их возраст может быть более 50, предпочтительно более 65 лет), молодыми (например, их возраст может быть менее 5 лет), они могут представлять собой госпитализированных пациентов, работников здравоохранения, военнослужащих, беременных женщин, лиц, страдающих хроническими заболеваниями, больных с иммунодефицитом и людей, выезжающих за границу. Однако вакцины подходят не только для указанных групп и могут шире использоваться в популяции.
Вакцины по изобретению могут вводиться пациентам, по существу, одновременно (например, во время одной и той же медицинской консультации или посещения медицинского работника) с другими вакцинами.
Промежуточные процессы.
Изобретение также относится к способу получения композиции масло-в-воде, включающему мик-рофлюидизацию первой эмульсии для образования второй эмульсии и затем фильтрацию второй эмульсии. Первая эмульсия имеет характеристики, описанные выше.
Изобретение также относится к способу получения композиции масло-в-воде, включающему фильтрацию второй эмульсии, т.е. микрофлюидизированной эмульсии. Микрофлюидизированная эмульсия имеет характеристики, описанные выше.
Изобретение также относится к способу получения вакцины, включающему объединение эмульсии с антигеном, где эмульсия имеет характеристики, описанные выше.
Частные варианты осуществления.
Частные варианты осуществления настоящего изобретения включают следующие способы. Способ получения эмульсии масло-в-воде, содержащей сквален, включающий стадии:
(i) образование первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла; и
(iii) фильтрация второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий стадии:
(i) образование первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла 5000 нм или менее;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла; и
(iii) фильтрация второй эмульсии с использованием гидрофильной мембраны.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий стадии:
(i) образование первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла; и
(iii) фильтрация второй эмульсии с использованием гидрофильной полиэфирсульфоновой мембра-
ны.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, содержащей сквален, включающий стадию (i) образования первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла с использованием гомогенизатора, где первая эмульсия образуется циркуляцией компонентов первой эмульсии через гомогенизатор множество раз.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, содержащей сквален, причем способ включает стадию (b) микрофлюидизации первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла, где вторая эмульсия образуется циркуляцией компонентов второй эмульсии переносом компонентов второй эмульсии из контейнера первой эмульсии через первое устройство микрофлюидизации и затем через второе устройство микрофлюидизации, где первое и второе устройства микрофлюидизации являются одинаковыми.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий: пропускание первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла через устройство микрофлюидизации для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла; где устройство микрофлюидизации включает камеру взаимодействия, которая содержит множество каналов типа "Z" и добавочный модуль обработки, включающий по меньшей мере один канал; где добавочный модуль обработки расположен ниже по ходу технологической цепочки камеры взаимодействия.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий стадию пропускания первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла через устройство микрофлюидизации для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла; где устройство микрофлюидизации включает камеру взаимодействия и добавочный модуль обработки, включающий множество каналов.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий стадию пропускания первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла через устройство микрофлюидизации для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла; где устройство микрофлюидизации включает камеру взаимодействия, и где давление компонентов эмульсии на входе в камеру взаимодействия является, по существу, постоянным в течение по меньшей мере 85% времени, в течение которого эмульсия подается в микрофлюидизатор.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий стадию образования первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла, где образование первой эмульсии проводится в атмосфере инертного газа, например азота, например, при давлении до 0,5 бар.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий стадию пропускания первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек масла через устройство микрофлюидизации для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла, где образование второй эмульсии проводится в атмосфере инертного газа, например азота, например, при давлении до 0,5 бар.
Способ получения эмульсии масло-в-воде, включающий стадии:
(i) образование первой эмульсии, имеющей первый средний размер капелек;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер капелек масла, который меньше, чем первый средний размер капелек масла; и
(iii) фильтрация второй эмульсии;
(iv) перенос эмульсии масло-в-воде в стерильный гибкий мешок.
Общие аспекты.
Термин "содержащие" охватывает "включающие", а также "состоящие", например композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может включать некоторые дополнительные компоненты, например X+Y.
Термин "по существу" не исключает "полностью", например композиция, которая "по существу, не содержит" Y, может совсем не содержать Y. При необходимости, термин "по существу" может опускаться из определения изобретения.
Термин "примерно" в отношении числовой величины х является необязательным и означает, например, х±10%.
Пока нет определенных указаний, способ, включающий стадию смешивания двух или более компонентов, не требует никакого определенного порядка смешивания. Таким образом, компоненты могут смешиваться в любом порядке. Когда имеется два компонента, то два компонента могут объединяться друг с другом, а затем комбинация может объединяться с третьим компонентом, и т.д.
Когда используется животный (и, в частности, говяжий) материал в культуре клеток, их следует получать из источников, которые не содержат трансмиссивные спонгиформные энцефалопатии (TSE), в частности не содержат коровью спонгиформную энцефалопатию (BSE).
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан определенный пример гомогенизатора, который может использоваться для образования первой эмульсии.
На фиг. 2 показаны детали ротора и статора, которые могут использоваться в таком гомогенизаторе.
На фиг. 3 показаны два профиля давления для синхронного режима усилительного насоса.
На фиг. 4 показана камера взаимодействия типа "Z".
На фиг. 5 показан I тип циркуляции, тогда как на фиг. 6 показан II тип циркуляции. Контейнеры маркированы буквой "С", тогда как гомогенизатор маркирован буквой "Н". Показаны направление и порядок движений жидкости.
На фиг. 6 гомогенизатор имеет две стрелки впуска и две стрелки выпуска, но в действительности, гомогенизатор имеет один канал впуска и один канал выпуска.
Способы осуществления изобретения
Пример 1.
Микрофлюидизированную эмульсию, содержащую сквален, полисорбат 80, сорбитан триолеат и буфер цитрата натрия, получали в соответствии с настоящим изобретением. Эмульсию микрофлюидизи-ровали до тех пор, пока она не имела средний размер капелек масла 165 нм, и число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, 5х 108/мл или менее.
Эмульсию фильтровали через кассету фильтра стерилизационного типа (фильтр А), имеющую пре-фильтрационную мембрану из гидрофильного асимметричного пористого полиэфирсульфона, имеющую размер пор 0,45 мкм, и концевую мембрану фильтра из гидрофильного асимметричного пористого поли-эфирсульфона, имеющую размер пор 0,2 мкм. Во время фильтрации температура эмульсии поддерживается на уровне 40±5°C.
Описанный выше способ проводится в течение четырех отдельных циклов, и измеренные характеристики фильтрованных эмульсий показаны в табл. 1.
Таблица 1
Тестируемый параметр
Действительная величина
Цикл 1
Цикл 2
Цикл 3
Цикл 4
Средний размер капелек масла
148
144
144
150
Число капелек масла, имеющих размер > 1,2 мкм
0,08Х106
0,08Х106
0,12Х106
0,20Х106
Как показано в табл. 1, фильтр А последовательно уменьшал средний размер капелек масла в эмульсии. Кроме того, фильтр А последовательно уменьшал число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм в эмульсии приблизительно в 103 раз.
Пример 2.
Такую же микрофлюидизированную эмульсию, как использованная в примере 1, фильтровали через кассету другого фильтра стерилизационного типа (фильтр В). Фильтр В имел префильтрационную мембрану из гидрофильного асимметричного пористого полиэфирсульфона и концевую мембрану фильтра из гидрофильного асимметричного пористого полиэфирсульфона, имеющую размер пор 0,2 мкм. Во время фильтрации температура эмульсии поддерживается на уровне 40±5°C. Этот процесс проводили в течение четырех отдельных циклов, и измеренные характеристики фильтрованных эмульсий показаны в табл. 2.
Как показано в табл. 2, фильтр В последовательно уменьшал средний размер капелек масла в эмульсии. Кроме того, фильтр В последовательно уменьшал число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм в эмульсии приблизительно в 103 раз.
Из примеров 1 и 2 видно, что фильтр В приводит к несколько меньшему размеры капелек масла, но несколько большему числу капелек масла, имеющих размер более чем 1,2 мкм. Однако оба фильтра А и В показали превосходные результаты.
Пример 3.
Такую же микрофлюидизированную эмульсию, как использованная в примере 1, фильтровали через кассету другого фильтра стерилизационного типа (фильтра С). Фильтр С имел префильтрационную мембрану из гидрофильного асимметричного пористого полиэфирсульфона, имеющую размер пор 0,45 мкм, и концевую мембрану фильтра из гидрофильного асимметричного пористого полиэфирсульфона, имеющую размер пор 0,2 мкм. Во время фильтрации, температура эмульсии поддерживается на уровне 40±5°C.
Кроме того, такую же микрофлюидизированную эмульсию? как использованная в примере 1, фильтровали через еще одну другую кассету фильтра стерилизационного типа (фильтра D). Фильтр D имел префильтрационную мембрану из гидрофильного асимметричного пористого полиэфирсульфона и концевую мембрану фильтра из гидрофильного пористого полиэфирсульфона PVDF. Во время фильтрации температура эмульсии поддерживается на уровне 40±5°C.
Фильтр С проявил превосходные результаты фильтрации, обеспечивая фильтрованную эмульсию, имеющую средний размер капелек масла 155+20 м и число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, 5х106/мл или менее. Хотя фильтр D обеспечивал получение фильтрованной эмульсии, отвечающей указанным выше критериям, было обнаружено, что он быстрее блокируется, таким образом требуя замены мембраны фильтра D. Таким образом, все полиэфирсульфоновые фильтры превосходили этот фильтр из PVDF.
Пример 4.
Другие гидрофильные мембраны от различных производителей тестировали для фильтрации мик-рофлюидизированной эмульсии, содержащей сквален, полисорбат 80, сорбитан триолеат и буфер цитрата натрия. Эти фильтры были пронумерованы с 1 по 10, как показано в табл. 3 (следует отметить, что фильтр 1 является таким же, как фильтр С в фильтре 3 выше; фильтр 2 представляет собой фильтр D; фильтр 9 представляет собой фильтр А; фильтр 10 представляет собой фильтр В).
Выход эмульсии после фильтрации 50 л эмульсии измеряли для определения того, подходили ли эти фильтры для использования в промышленном масштабе. % вводимой эмульсии, который извлекался после фильтрации, был следующий.
Таблица 3
Низкий % извлечения указывает на то, что фильтр задерживает эмульсию, например, вследствие блокировки. Ясно, что только фильтры 1, 8, 9 и 10 (т.е. фильтры А, В и С из указанных выше плюс один фильтр, который аналогичен фильтру А, но имеет больший размер пор в первом слое) обеспечили выходы > 50%, и что выходы, которые наиболее осуществимы для использования в промышленном масштабе, обеспечивают фильтры 8-10. Все фильтры 1, 8, 9 и 10 представляют собой двуслойные гидрофильные мембраны из PES, полученные тремя различными производителями. Первые слои в этих четырех мембранах имеют размеры пор или 0,45, или 0,6 мкм, а второй слой имеет размер пор 0,2 мкм. Наилучшие результаты наблюдались, когда по меньшей мере один из двух слоев представлял собой асимметричную мембрану.
Следует понимать, что изобретение было описано только в качестве примера, и в него могут быть внесены модификации без отхода от объема и сущности изобретения.
Ссылки
[I] W090/14837
[2] Podda 4 Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197203
[3] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680
[4] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)
[5] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan
[6] New Generation Vaccines (eds. Levine et al.) . 3rd edition, 2004. ISBN 0-8247-4071-8
[7] O'Hagan (2007) Expert Rev Vaccines 6(5):699-710
[8] EP-B-2029170
[9] Baudner et al. (2009) Pharm Res. 26(61:1477-85 [10] Dupuis et al. (1999) Vaccine 18:434-9
[II] Dupuis et al. (2001) Eur J Immunol 31:2910-8
[12] Burke et al. (1994) J Infect Dis 170:1110-9
[13] Light Scattering from Polymer Solutions and Nanoparticle Dispersions (W. Schartl), 2007. ISBN: 978-3-54071950-2
[14]Jafari et al (2008) Food Hydrocolloids 22:1191-1202 [15] W090/04609 [16] US-4,618,533 [17] US-6,193,077 [18] US-6,495,050
[19] Chen et al. (1999) Journal of Applied Polymer Science, 72:1699-1711 [20] US-4,413,074 [21] US-4,432,875 [22] US-4,340,482 [23] uS-4,473,474 [24] US-4,473,475 [25] US-4,673,504 [26] EP-A-0221046 [27] US-4,943,374
US-6,071,406 US-4,705,753 US-5,178,765 US-6,495,043 US-6,039,872 US-5,277,812 US-5,531,893. US-4,964,990
Wavhal & Fisher (2002) Journal of Polymer Science Polymer Physics 40:2473-88 W02006/044463
Espinoza-Gomez et al. (2003) Revista de la Sociedad de Mexico 47:53-57
Lidgate et al (1992) Pharmaceutical Research 863
US-2007/0014805
W02007/080308
W02007/052155
W02005/089837
US 6,692,468
WO00/07647
WO99/17820
US 5,971,953
US 4,060,082
EP-A-0520618
WO98/01174
Hoffmann et al. (2002) Vaccine 20:3165-3170 Subbarao et al. (2003) Virology 305:192-200 Liu et al. (2003) Virology 314:580-590 Ozaki et al. (2004) J. Virol. 78:1851-1857 Webby et al. (2004) Lancet 363:1099-1103 WO97/37000
Brands et al. (1999) Dev Biol Stand 98:93-100 Halperin et al. (2002) Vaccine 20:1240-7 Tree et al. (2001) Vaccine 19:3444-50 Kistner et al. (1998) Vaccine 16:960-8
961-7
304
[61
[62 [63 [64 [65 [66 [67 [68
[69 [70 [71 [72 [73 [74 [75 [76 [77 [78
[79 [80 [81 [82 [83
Kistner et al. (1999) Dev Biol Stand 98:101-110 Bruhl et al. (2000) Vaccine 19:1149-58 Pau et al. (2001) Vaccine 19:2716-21 WO01/22992
Hehme et al. (2004) Virus Res. 103{1-2):163-71 Treanor et al. (1996) J Infect Dis 173:1467-70 Keitel et al. (1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10 Williamson et al. (2006) Infection and Immunity 74:
Loukas et al. (2005) PLoS Med 2(10): e295 EP-A-0139417
Harper et al. (2004) Lancet 364(9447): 1757-65 J Toxicol Clin Toxicol (2001) 39:85-100 Demicheli et al. (1998) Vaccine 16:880-884 Stepanov et al. (1996) J Biotechnol 44:155-160 Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96 WO02/097072
Greenbaum et al. (2004) Vaccine 22:2566-77
Zurbriggen et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:295-
Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (Wash DC). 43:728-30 Mann et al. (2004) Vaccine 22:2425-9
Halperin et al. (1979) Am J Public Health 69 :1247-50 Herbert et al. (1979) J Infect Dis 140:234-8 Chen et al. (2003) Vaccine 21:2830-6
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения содержащей сквален эмульсии масло-в-воде, включающий стадии:
(i) образование первой эмульсии, имеющей первый средний размер масляных капелек;
(ii) микрофлюидизация первой эмульсии для образования второй эмульсии, имеющей второй средний размер масляных капелек, который меньше, чем первый средний размер масляных капелек; и
(iii) фильтрация второй эмульсии с использованием первого гидрофильного полиэфирсульфонового мембранного слоя, имеющего размер пор > 0,3 мкм, и второго гидрофильного полиэфирсульфонового мембранного слоя, имеющего размер пор менее 0,3 мкм, с получением посредством этого содержащей сквален эмульсии масло-в-воде.
2. Способ по п.1, где первый средний размер капелек масла составляет 5000 нм или менее.
3. Способ по любому из пп.1, 2, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, в первой эмульсии составляет 5х 1011/мл или менее.
4. Способ по любому из пп.1-3, где второй средний размер капелек масла составляет 500 нм или менее.
5. Способ по любому из пп.1-4, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, во второй эмульсии составляет 5х 1010/мл или менее.
6. Способ получения содержащего сквален вакцинного адъюванта в виде эмульсии масло-в-воде, включающий стадии:
(i) образование содержащей сквален эмульсии, имеющей средний размер масляных капелек 500 нм или менее;
(ii) фильтрация содержащей сквален эмульсии с использованием гидрофильной двуслойной поли-эфирсульфоновой мембраны с первым слоем, имеющим размер пор > 0,3 мкм, и вторым слоем, имеющим размер пор менее 0,3 мкм, с получением посредством этого вакцинного адъюванта.
7. Способ по любому из пп.1-6, где средний размер капелек масла после фильтрации составляет менее чем 220 нм.
8. Способ по любому из пп.1-7, где число капелек масла, имеющих размер более 1,2 мкм, после фильтрации составляет 5х108/мл или менее.
9. Способ по любому из пп.1-8, где на стадии фильтрации используют двуслойный фильтр.
10. Способ по любому из пп.1-9, где первый гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный
слой является асимметричным и/или пористым.
11. Способ по любому из пп.1-10, где второй гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой является асимметричным и/или пористым.
12. Способ по любому из пп.1-11, где первый гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой и, необязательно, второй гидрофильный полиэфирсульфоновый мембранный слой содержит полимерный опорный материал.
13. Способ по любому из пп.1-12, где вторая эмульсия имеет объем > 20 л.
14. Способ получения вакцинной композиции, включающий получение эмульсионного адъюванта в соответствии с любым из пп.1-13 и объединение эмульсионного адъюванта с антигеном.
15. Способ получения вакцинного набора, включающий получение эмульсионного адъюванта в соответствии с любым из пп.1-13 и упаковку эмульсионного адъюванта в набор в качестве компонента набора вместе с антигенным компонентом.
16. Способ по п.15, где компоненты набора находятся в отдельных флаконах.
17. Способ по п.16, где используют флаконы, изготовленные из боросиликатного стекла.
18. Способ по любому из пп.15-17, где эмульсионный адъювант имеет объем более 20 л, и способ включает выделение стандартных доз из основного количества адъюванта для упаковки в качестве компонентов набора.
19. Способ по любому из пп.14-18, где антиген представляет собой антиген вируса гриппа.
20. Способ по п.19, где комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию, где вакцинная композиция включает примерно 15 мкг, примерно 10 мкг, примерно 7,5 мкг, примерно 5 мкг, примерно 3,8 мкг, примерно 3,75 мкг, примерно 1,9 мкг или примерно 1,5 мкг гемагглютинина на штамм вируса гриппа.
21. Способ по п.19 или 20, где комбинация эмульсии и антигена образует вакцинную композицию, где вакцинная композиция содержит консервант тиомерсал и/или 2-феноксиэтанол.
22. Способ по любому из пп.1-21, в котором эмульсия масло-в-воде включает приблизительно 5 об.% сквалена, приблизительно 0,5 об.% полисорбата 80 и приблизительно 0,5 об.% сорбитан триолеата.
23. Применение гидрофильного двуслойного полиэфирсульфонового фильтра с первым мембранным слоем, имеющим размер пор > 0,3 мкм, и вторым мембранным слоем, имеющим размер пор менее 0,3 мкм, для фильтрации содержащей сквален эмульсии масло-в-воде, содержащей водный компонент, масло и поверхностно-активное вещество, причем эмульсия масло-в-воде содержит от 2 до 20 об.% масла.
24. Применение по п.23, в котором эмульсия масло-в-воде включает приблизительно 5 об.% сквале-на, приблизительно 0,5 об.% полисорбата 80 и приблизительно 0,5 об.% сорбитан триолеата.
11.
0 1 2 3 4 5
Фиг. 3А
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025622
- 1 -
(19)
025622
- 1 -
(19)
025622
- 1 -
(19)
025622
- 1 -
(19)
025622
- 4 -
025622
- 20 -
025622
- 22 -
025622
- 24 -
025622
- 25 -