EA 025546B1 20170130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/025546 Полный текст описания [**] EA201391554 20120419 Регистрационный номер и дата заявки US61/477,319 20110420 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок IB2012/051977 Номер международной заявки (PCT) WO2012/143888 20121026 Номер публикации международной заявки (PCT) EAB1 Код вида документа [PDF] eab21701 Номер бюллетеня [**] СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИХ ДЕПСИПЕПТИДОВ И НОВЫХ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ Название документа [8] C07K 11/02 Индексы МПК [CH] Асемоглу Мурат, [DE] Хелльштерн Хериберт, [CH] Колльмер Феликс, [CH] Лопес Джон, [CH] Шрайбер Роберт, [CH] Шпрехер Кристиан, [CH] Штеттлер Ханс Сведения об авторах [CH] НОВАРТИС АГ Сведения о патентообладателях [CH] НОВАРТИС АГ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea000025546b*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Способ получения циклического депсипептидного соединения формулы I где A 1 представляет собой двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой и связан с правой стороны в формуле I через карбонил с остальной частью молекулы или представляет собой C 1-8 -алканоил или фосфорилированный гидрокси-С 1-8 -алканоил; X связан через N фрагмента А 1 и представляет собой ацил, выбранный из ацетила или изобутирила, или отсутствует, если А 1 представляет собой C 1-8 -алканоил или фосфорилированный гидрокси-C 1-8 -алканоил; R 2 представляет собой С 1-8 -алкил; R 3 представляет собой боковую цепь лейцина, изолейцина или валина; R 5 представляет собой боковую цепь фенилаланина или изолейцина; R 6 представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты; R 7 представляет собой боковую цепь изолейцина или валина; Y представляет собой водород или С 1-8 -алкил; или его соли; причем указанный способ включает селективное удаление защитных групп из соединения формулы II где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * соответствуют значениям X, A 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 6 и R 7 в формуле I соответственно, но при условии, что реакционноспособные функциональные группы у указанных фрагментов присутствуют в защищенной форме, по меньшей мере, если они могут принимать участие в нежелательных побочных реакциях, с получением в результате соединения формулы III где X*, А 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют указанные выше значения; взаимодействие свободной гидроксильной группы в условиях окисления с получением соединения формулы IV и удаление оставшихся защитных групп с получением соединения формулы I, или его соли.

2. Способ по п.1, где свободное основание соединения формулы I превращают в соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в другую соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в свободное основание соединения формулы I.

3. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают взаимодействием соединения формулы VI где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, с кислотой формулы VII или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты формулы VII; где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X* и где X* и А 1 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и, если X** представляет собой аминозащитную группу, осуществляют удаление указанной аминозащитной группы Х** для получения H вместо X* и осуществляют реакцию сочетания полученной аминогруппы с группой ацила X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты Х*-ОН.

4. Способ по п.3, где соединение формулы VI получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы VIII где Prot* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, и которая остается стабильной на стадиях удаления защитных групп во время синтеза указанного линейного пептида-предшественника, и R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы VI в п.3, с последующим удалением in situ указанной защитной группы Prot* и получением соединения формулы VI; где Prot* выбирают из группы, состоящей из C 3 -C 8 -алк-2-енилоксикарбонильных групп.

5. Способ по п.4, где указанный линейный пептид-предшественник формулы VIII синтезируют из соответствующих аминокислот, используя твердофазный пептидный синтез и последующее отщепление полученного пептида от используемого твердого носителя.

6. Способ по п.5, где соединение формулы VIII получают в варианте а) сочетанием аминокислоты формулы IX где R 3 * имеет значения, указанные выше для соединения формулы II в п.1, и Prot** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить на смоле без разрушения других связей или реакционноспособного производного указанной аминокислоты, через кислород с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES; удалением указанной защитной группы Prot**; сочетанием полученной аминокислоты, связанной со смолой и представленной формулой X где RES и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы IX, n представляет собой натуральное число и L представляет собой отщепляемый линкер, с аминокислотой формулы XI где Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, R 2 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, осуществляя реакцию сочетания связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII где Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, R 2 * и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, через свободную гидроксигруппу с аминокислотой формулы XIII где Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, R 7 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**; или, в варианте b), сочетанием дипептида формулы XXVII где R 3 * и Prot** имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, или реакционноспособного производного указанного дипептида, с аминоацильным фрагментом, связанным через кислород, с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES, формулы X который получают, как раскрыто в варианте а), где RES и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и удаление указанной защитной группы Prot**; после осуществления реакции по варианту а) или по варианту b) осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XIV где R 2 *, R 3 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.5, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения фюрмулы X, с аминокислотой формулы XV где R 6 * и Y имеют значения, указанные для соединения формулы II по п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**; осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XVI где Y, R 2 *, R 3 *, R 7 * и R 6 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с аминокислотой формулы XVII где R 5 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**; осуществляют реакцию сочетания полученного соединения формулы XVIII где Y, R 2 *, R 3 *, R 7 *, R 6 * и R 5 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с синтоном формулы XIX где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с активированным производным указанного синтона, и удаление защитной группы Prot** с получением соединения формулы XX где Prot, Y, R 2 *, R 3 *, R 7 *, R 6 * и R 5 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X; отщепляют связанный с твердой фазой пептид формулы XX от указанной твердой фазы L-RES с получением соответствующего соединения формулы VIII; где реакционноспособные производные аминокислот IX, XI, XIII, XXVII, XV, XVII и XIX представляют собой независимо их хлорангидриды, фторангидриды, ангидриды или нитрофениловые эфиры; где Prot представляет собой силильную защитную группу, Prot* выбирают из группы, состоящей из C 3 -C 8 -алк-2-енилоксикарбонильных групп, и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

7. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы XXV где X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 *, R 7 * и Prot имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1.

8. Способ по п.7, где соединение формулы XXV получают расщеплением соединения формулы XXIV где X*, A 1 *, R 2 * ; R 3 *, R 5 *, R 6 *, R 7 * и Prot имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число и Prot** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить без одновременного удаления указанной защитной группы Prot, причем продукт остается на смоле, и удаляют защитную группу Prot**, перед отщеплением, одновременно с ним или после него, с получением указанного соединения формулы XXV; где Prot представляет собой силильную защитную группу и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

9. Способ по п.8, где соединение формулы XXIV получают сочетанием аминокислоты формулы XIX где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы XXIV в п.8, или активированного производного указанной аминокислоты, которое представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIX, с соединением формулы XXIII где X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число.

10. Способ по п.9, где соединение формулы XXIII получают сочетанием аминокислоты формулы XVII* где R 5 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты с соединением формулы XXII где X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты XVII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XVII*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

11. Способ по п.10, где соединение формулы XXII получают сочетанием аминокислоты формулы XV* где R 6 * и Y имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты с соединением формулы XXI где X*, А 1 *, R 2 *, R 3 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты XV* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XV*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

12. Способ по п.11, где соединение формулы XXI получают осуществлением взаимодействия аминокислоты формулы XIII* где Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и R 7 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты с гидроксильной группой соединения формулы XXVI где X, A 1 *, R 2 * и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число; удаляют указанные защитные группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты XIII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIII*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

13. Способ по п.12, где соединение формулы XXVI получают сочетанием связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII* где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено в п.1, причем продукт остается при этом на смоле, R 2 * и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, после удаления указанной защитной группы Prot**** через полученную таким образом свободную аминогруппу, с кислотой формулы VII где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, где X* и А 1 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной кислоты; и если X** представляет собой аминозащитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** до получения H вместо X* и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с ацильной группой X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособное производное указанной кислоты; где реакционноспособное производное аминокислот VII* или Х*-ОН представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты VII* или Х*-ОН соответственно; где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

14. Способ по п.13, где соединение формулы XII получают сочетанием связанной со смолой аминокислоты, представленной формулой X где R 3 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, с аминокислотой формулы XI* где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и R 2 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты; где реакционноспособное производное аминокислоты XI* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XI*; где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

15. Способ по п.14, где связанную со смолой аминокислоту формулы X получают сочетанием аминокислоты формулы IX* где R 3 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить селективно, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты формулы IX, с гидроксигруппой, связанной через отщепляемый линкер L, который связан с твердой смолой RES, и удаление указанной защитной группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты IX* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты IX*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

16. Способ по любому из пп.1-15, где указанные символы А 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 6 , R 7 X и Y или соответствующие незащищенные или защищенные фрагменты R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 *, R 7 *, X* и Y 3 выбирают таким образом, что в полученном соединении формулы I или в его соли A 1 представляет собой двухвалентный радикал L-глутамина, связанный через карбонил его α-карбоксигруппы с аминогруппой справа от A 1 в формуле I и через его α-аминогруппу с X, или представляет собой 2S-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил; R 2 представляет собой метил; R 3 представляет собой изобутил; R 5 представляет собой втор-бутил или бензил; R 6 представляет собой 4-гидроксибензил; R 7 представляет собой изопропил или втор-бутил; X представляет собой ацетил или изобутирил или отсутствует, если A 1 представляет собой 2S-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил; Y представляет собой метил.

17. Соединение формулы 6

18. Соединение формулы 7


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

1. Способ получения циклического депсипептидного соединения формулы I где A 1 представляет собой двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой и связан с правой стороны в формуле I через карбонил с остальной частью молекулы или представляет собой C 1-8 -алканоил или фосфорилированный гидрокси-С 1-8 -алканоил; X связан через N фрагмента А 1 и представляет собой ацил, выбранный из ацетила или изобутирила, или отсутствует, если А 1 представляет собой C 1-8 -алканоил или фосфорилированный гидрокси-C 1-8 -алканоил; R 2 представляет собой С 1-8 -алкил; R 3 представляет собой боковую цепь лейцина, изолейцина или валина; R 5 представляет собой боковую цепь фенилаланина или изолейцина; R 6 представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты; R 7 представляет собой боковую цепь изолейцина или валина; Y представляет собой водород или С 1-8 -алкил; или его соли; причем указанный способ включает селективное удаление защитных групп из соединения формулы II где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * соответствуют значениям X, A 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 6 и R 7 в формуле I соответственно, но при условии, что реакционноспособные функциональные группы у указанных фрагментов присутствуют в защищенной форме, по меньшей мере, если они могут принимать участие в нежелательных побочных реакциях, с получением в результате соединения формулы III где X*, А 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют указанные выше значения; взаимодействие свободной гидроксильной группы в условиях окисления с получением соединения формулы IV и удаление оставшихся защитных групп с получением соединения формулы I, или его соли.

2. Способ по п.1, где свободное основание соединения формулы I превращают в соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в другую соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в свободное основание соединения формулы I.

3. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают взаимодействием соединения формулы VI где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, с кислотой формулы VII или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты формулы VII; где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X* и где X* и А 1 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и, если X** представляет собой аминозащитную группу, осуществляют удаление указанной аминозащитной группы Х** для получения H вместо X* и осуществляют реакцию сочетания полученной аминогруппы с группой ацила X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты Х*-ОН.

4. Способ по п.3, где соединение формулы VI получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы VIII где Prot* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, и которая остается стабильной на стадиях удаления защитных групп во время синтеза указанного линейного пептида-предшественника, и R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы VI в п.3, с последующим удалением in situ указанной защитной группы Prot* и получением соединения формулы VI; где Prot* выбирают из группы, состоящей из C 3 -C 8 -алк-2-енилоксикарбонильных групп.

5. Способ по п.4, где указанный линейный пептид-предшественник формулы VIII синтезируют из соответствующих аминокислот, используя твердофазный пептидный синтез и последующее отщепление полученного пептида от используемого твердого носителя.

6. Способ по п.5, где соединение формулы VIII получают в варианте а) сочетанием аминокислоты формулы IX где R 3 * имеет значения, указанные выше для соединения формулы II в п.1, и Prot** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить на смоле без разрушения других связей или реакционноспособного производного указанной аминокислоты, через кислород с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES; удалением указанной защитной группы Prot**; сочетанием полученной аминокислоты, связанной со смолой и представленной формулой X где RES и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы IX, n представляет собой натуральное число и L представляет собой отщепляемый линкер, с аминокислотой формулы XI где Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, R 2 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, осуществляя реакцию сочетания связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII где Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, R 2 * и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, через свободную гидроксигруппу с аминокислотой формулы XIII где Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, R 7 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**; или, в варианте b), сочетанием дипептида формулы XXVII где R 3 * и Prot** имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, или реакционноспособного производного указанного дипептида, с аминоацильным фрагментом, связанным через кислород, с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES, формулы X который получают, как раскрыто в варианте а), где RES и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и удаление указанной защитной группы Prot**; после осуществления реакции по варианту а) или по варианту b) осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XIV где R 2 *, R 3 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.5, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения фюрмулы X, с аминокислотой формулы XV где R 6 * и Y имеют значения, указанные для соединения формулы II по п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**; осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XVI где Y, R 2 *, R 3 *, R 7 * и R 6 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с аминокислотой формулы XVII где R 5 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**; осуществляют реакцию сочетания полученного соединения формулы XVIII где Y, R 2 *, R 3 *, R 7 *, R 6 * и R 5 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с синтоном формулы XIX где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с активированным производным указанного синтона, и удаление защитной группы Prot** с получением соединения формулы XX где Prot, Y, R 2 *, R 3 *, R 7 *, R 6 * и R 5 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X; отщепляют связанный с твердой фазой пептид формулы XX от указанной твердой фазы L-RES с получением соответствующего соединения формулы VIII; где реакционноспособные производные аминокислот IX, XI, XIII, XXVII, XV, XVII и XIX представляют собой независимо их хлорангидриды, фторангидриды, ангидриды или нитрофениловые эфиры; где Prot представляет собой силильную защитную группу, Prot* выбирают из группы, состоящей из C 3 -C 8 -алк-2-енилоксикарбонильных групп, и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

7. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы XXV где X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 *, R 7 * и Prot имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1.

8. Способ по п.7, где соединение формулы XXV получают расщеплением соединения формулы XXIV где X*, A 1 *, R 2 * ; R 3 *, R 5 *, R 6 *, R 7 * и Prot имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число и Prot** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить без одновременного удаления указанной защитной группы Prot, причем продукт остается на смоле, и удаляют защитную группу Prot**, перед отщеплением, одновременно с ним или после него, с получением указанного соединения формулы XXV; где Prot представляет собой силильную защитную группу и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

9. Способ по п.8, где соединение формулы XXIV получают сочетанием аминокислоты формулы XIX где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы XXIV в п.8, или активированного производного указанной аминокислоты, которое представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIX, с соединением формулы XXIII где X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число.

10. Способ по п.9, где соединение формулы XXIII получают сочетанием аминокислоты формулы XVII* где R 5 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты с соединением формулы XXII где X*, A 1 *, R 2 *, R 3 *, R 6 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты XVII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XVII*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

11. Способ по п.10, где соединение формулы XXII получают сочетанием аминокислоты формулы XV* где R 6 * и Y имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты с соединением формулы XXI где X*, А 1 *, R 2 *, R 3 * и R 7 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты XV* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XV*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

12. Способ по п.11, где соединение формулы XXI получают осуществлением взаимодействия аминокислоты формулы XIII* где Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и R 7 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты с гидроксильной группой соединения формулы XXVI где X, A 1 *, R 2 * и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число; удаляют указанные защитные группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты XIII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIII*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

13. Способ по п.12, где соединение формулы XXVI получают сочетанием связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII* где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено в п.1, причем продукт остается при этом на смоле, R 2 * и R 3 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, после удаления указанной защитной группы Prot**** через полученную таким образом свободную аминогруппу, с кислотой формулы VII где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, где X* и А 1 * имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной кислоты; и если X** представляет собой аминозащитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** до получения H вместо X* и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с ацильной группой X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособное производное указанной кислоты; где реакционноспособное производное аминокислот VII* или Х*-ОН представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты VII* или Х*-ОН соответственно; где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

14. Способ по п.13, где соединение формулы XII получают сочетанием связанной со смолой аминокислоты, представленной формулой X где R 3 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, с аминокислотой формулы XI* где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и R 2 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты; где реакционноспособное производное аминокислоты XI* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XI*; где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

15. Способ по п.14, где связанную со смолой аминокислоту формулы X получают сочетанием аминокислоты формулы IX* где R 3 * имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить селективно, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты формулы IX, с гидроксигруппой, связанной через отщепляемый линкер L, который связан с твердой смолой RES, и удаление указанной защитной группы Prot***; где реакционноспособное производное аминокислоты IX* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты IX*; где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.

16. Способ по любому из пп.1-15, где указанные символы А 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 6 , R 7 X и Y или соответствующие незащищенные или защищенные фрагменты R 2 *, R 3 *, R 5 *, R 6 *, R 7 *, X* и Y 3 выбирают таким образом, что в полученном соединении формулы I или в его соли A 1 представляет собой двухвалентный радикал L-глутамина, связанный через карбонил его α-карбоксигруппы с аминогруппой справа от A 1 в формуле I и через его α-аминогруппу с X, или представляет собой 2S-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил; R 2 представляет собой метил; R 3 представляет собой изобутил; R 5 представляет собой втор-бутил или бензил; R 6 представляет собой 4-гидроксибензил; R 7 представляет собой изопропил или втор-бутил; X представляет собой ацетил или изобутирил или отсутствует, если A 1 представляет собой 2S-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил; Y представляет собой метил.

17. Соединение формулы 6

18. Соединение формулы 7


(19)
Евразийское
патентное
ведомство
025546
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201391554
(22) Дата подачи заявки
2012.04.19 (51) Int. Cl. C07K11/02 (2006.01)
(54)
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИХ ДЕПСИПЕПТИДОВ И НОВЫХ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
(31) 61/477,319
(32) 2011.04.20
(33) US
(43) 2014.11.28
(86) PCT/IB2012/051977
(87) WO 2012/143888 2012.10.26
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
НОВАРТИС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Аеемоглу Мурат (CH), Хелльштерн Хериберт (DE), Колльмер Феликс, Лопес Джон, Шрайбер Роберт, Шпрехер Кристиан, Штеттлер Ханс
(CH)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) YOKOKAWA F. ET AL.: "Synthetic studies of the cyclic depsipeptides bearing the 3-amino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp) unit. Total synthesis of the proposed structure of micropeptin T-20", TETRAHEDRON, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 61, no. 6, 7 February 2005 (2005-02-07), p. 1459-1480, XP027860763, ISSN: 0040-4020 [retrieved on 2005-02-07], Scheme: 1, 6, 9, 10,11,12; 2. Synthetic strategy; compounds 2, 32-34, 44, 45, 46, 51
YOKOKAWA F. ET AL.: "Total synthesis of somamide A, an Ahp (3-amino-6-hydroxy-2-piperidone)-containing cyclic depsipeptide", TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 43, no. 48, 25 November 2002 (2002-11-25), p.
8673-8677, XP004390459, ISSN: 0040-4039, DOI:
10.1016/50040-4039(02)02178-0, Scheme 5; compounds 1,
4, 24, 25
YOKOKAWA F. ET AL.: "Synthetic studies of micropeptin T-20, a novel 3-amino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp)-containing cyclic depsipeptide", TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 42, no. 34, 20 August 2001 (2001-08-20), p.
5903-5908, XP004295953, ISSN: 0040-4039, DOI:
10.1016/50040-4039(01)01136-4; Schemes; compounds 15,
16, 20, 21, 28
SARA C. STOLZE ET AL.: "Solid phase total synthesis of the 3-amino-6-hydroxy-2-piperidone (Ahp) cyclodepsipeptide and protease inhibitor Symplocamide A", CHEMICAL COMMUNICATIONS, vol. 46, no. 46, 1 January 2010 (2010-01-01), p. 8857, XP55033621, ISSN: 1359-7345, DOI: 10.1039/c0cc02889d, the whole document
SARA C. STOLZE ET AL.: "Development of a Solid-Phase Approach to the Natural Product Class of Ahp-
Containing Cyclodepsipeptides", EUROPEAN JOURNAL
OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 2012, no. 8, 23 January 2012 (2012-01-23), p. 1616-1625, XP55033623, ISSN: 1434-193X, DOI: 10.1002/ejoc.201101757, the whole document
WO-A1-2009024527
LINE BOUREL-BONNET ET AL.: "Solid-Phase Total Synthesis of Kahalalide A and Related Analogues", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 48, no. 5, 1 March 2005 (2005-03-01), p. 1330-1335, XP55033736, ISSN: 0022-2623, DOI: 10.1021/jm049841x; Scheme 1
STAWIKOWSKI M. ET AL.: "A novel strategy for the solid-phase synthesis of
cyclic lipodepsipeptides", TETRAHEDRON LETTERS,
ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 47, no. 48, 27 November 2006 (2006-11-27), p. 8587-8590, XP025003510, ISSN: 0040-4039, DOI: 10.1016/ J.TETLET.2006.09.116 [retrieved on 2006-11-27]; Scheme 1; p. 8578, left-hand column, paragraph 3
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения макроциклических депсипептидов, к новым промежуточным соединениям и их получению, так же, как к соответствующим вариантам изобретения.
Предшествующий уровень техники
Циклические депсипептиды находят многочисленные применения в фармакологии. Так, например, депсипептиды, раскрытые в WO 2009/024527, можно использовать для лечения различных заболеваний. Например, указанное соединение формулы II, упомянутое в WO 2009/024527, можно использовать для лечения и профилактики воспалительных и/или гиперпролиферативных и сопровождаемых зудом заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз, пустулезный псориаз, розацеа, келоиды, гипертрофические шрамы, угри, синдром Нетертона или других сопровождающихся зудом дерматозов, таких как узелковая почесуха, неспецифический зуд в старческом возрасте, также как других заболеваний с дисфункцией эпителиального барьера, таких как старая кожа.
Ностопептин BN920, ранее выделенный из цианобактерий Nostoc, был выделен также из водорослей микроцистис. Ностопептин BN920 ингибирует химотрипсин со значением ИК50=31 нМ (см. J. Nat. Prod. 68(9), 1324-7 (2005)).
Указанные соединения можно получить путем ферментации (используя chondromyces croactus, миксобактерии) вместе с другими депсипептидами, включающими так называемые ahp-субструктуры (ahp: 3-амино-6-гидрокси-пиперидин-2-он) и соответствующие дегидро-ahp-субструктуры (дегидро-ahp: 3-амино-3,4-дигидро-1Н-пиридин-2-он), здесь называемые "дегидратами" соответственно. Поэтому выход процесса ферментации, касающийся любого одного из указанных соединений, весьма низок.
Настоящее изобретение относится к способам, которые позволяют получать такие циклические де-псипептиды с повышенным выходом и/или высокого качества.
Учитывая многочисленные риски, такие как эпимеризация, таутомеризация и т.п., при синтезе сложных молекул с множеством возможных изомеров, оказалось возможным найти процесс производства, предпочтительно включающий комбинацию твердофазного пептидного синтеза и жидкофазного синтеза, что обеспечивает получение циклических депсипептидов формулы I с хорошим выходом и/или необходимой стереоизомерной степенью чистоты, особенно и того, и другого вместе. Авторам до сих пор не встречалось использование твердофазного пептидного синтеза в рассматриваемой области.
Настоящее изобретение относится к способу получения циклического депсипептидного соединения формулы I
где A1 представляет собой двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой, и связан с правой стороны в формуле I через карбонил с остальной частью молекулы; или представляет собой 01-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-01-8-алканоил;
X связан через N фрагмента А1 и представляет собой ацил, выбранный из ацетила или изобутирила, или отсутствует, если A1 представляет собой 01-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-01-3-алканоил;
R2 представляет собой 01-8-алкил;
R3 представляет собой боковую цепь лейцина, изолейцина или валина; R5 представляет собой боковую цепь фенилаланина или изолейцина; R6 представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты; R7 представляет собой боковую цель изолейцина или валина; Y представляет собой водород или 01-8-алкил; или его соли;
причем указанный способ включает селективное удаление защитных групп из соединения формулы
где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и X*, A1*, R2*, R3*, R5*, R6* и R7* соответствуют значениям X, А1, R2, R3, R5, R6 и R7 в формуле I соответственно, но при условии, что реакционноспособные функциональные группы у указанных фрагментов присутствуют в защищенной форме, по меньшей мере, если они могут принимать участие в нежелательных побочных реакциях, с получением в результате соединения формулы III
где X*, А1*, R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют указанные выше значения;
взаимодействие свободной гидроксильной группы в условиях окисления с получением соединения формулы IV
и удаление оставшихся защитных групп с получением соединения формулы I, или его соли.
Необязательно, свободное основание соединения формулы I превращают в соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в другую соль соединения формулы I; или соль соединения формулы I превращают в свободное основание соединения формулы I.
В качестве подходящих условий для окисления соединения формулы III обычно используют IBX в ДМСО (J. Org. Chem. 1995, 60, 7272-7276); пиридинийдихромат или пиридинийхлорхромат (Tetrahedron Lett. 1979, 5, 399-402); оксалилхлорид, диметилсульфоксид и третичный амин (J. PEPTIDE Sci. 2006, 12, 140-146), соли оксоаммония (J. Org. Chem. 1985, 50, 1332-1334); гипохлориты щелочей, катализируемые солями оксоаммония (J. Org. Chem. 1989, 54, 2970-2972); соли оксоаммония (Tetrahedron Lett. 1988, 29, 5671-5672), RuCl2 (PPh3)3 (Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1605-1608); TEMPO (1 моль%) в присутствии гипо-хлорита натрия (Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2177-2180); NaIO4, TEMPO, NaBr (Tetrahedron 2006, 62, 89288932); оксида ванадия (IV) и t-BuOOH на подложке SiO2 (Advanced Synthesis & Catalysis 2007, 349, 846848). Предпочтительно вести реакцию, используя IBX в ДМСО, или предпочтительно в инертном растворителе, таком как тетрагидрофуран, в присутствии ДМСО, при температуре между 0-50°С, предпочтительно между 20-25°С.
где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II выше, с кислотой формулы VII
или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты формулы VII,
где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, и где X* и A1* имеют значения, указанные для соединения формулы II выше; и, если X** представляет собой аминоза-щитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** для получения Н вместо X*, и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с группой ацила X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II выше, или ее реакционно-способным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофе-ниловые эфиры кислоты Х*-ОН.
Предпочтительно соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного, т.е. еще не циклического, пептида-предшественника соединения формулы VI, содержащего N-концевую аминогруппу и С-концевую карбоксигруппу, в таких условиях реакции, которые обеспечивают образование амидной связи из указанных амино- и карбоксигрупп, предпочтительно используя жидкофазную технологию.
Лактамизацию в растворах обычно осуществляют при очень низких концентрациях субстрата, чтобы избежать процессов олигомеризации и полимеризации. Проведение таких реакций требует больших количеств растворителей и очень больших реакторов. Например, макролактамизацию олигопептида осуществляют при концентрации 2 ммоль/л в ссылке Yokokawa et al., Tetrahedron 2005, 61, 1459-1480. Указанные затруднения можно обойти, растворяя третичное основание и связующий реагент и контролируемым образом добавляя раствор олигопептида к полученному раствору. Контролируемое, особенно медленное добавление олигопептидного раствора создает постоянно низкие концентрации активированного олигопептида в растворе, и таким образом предотвращает олигомеризацию и полимеризацию. Скорость добавления олигопептидного раствора можно устанавливать в соответствии со скоростью реакции для макроциклизации: если указанная макроциклизация является быстрой реакцией, раствор олигопеп-тида можно добавлять быстро. Если макроциклизация происходит медленно, добавление раствора должно происходить медленно, чтобы обеспечить постоянно низкую концентрацию активированного олиго-пептида. Таким образом, контролируемое добавление олигопептида позволяет работать с гораздо меньшими количествами растворителя, все еще поддерживая концентрацию активированного олигопептида ниже 10-3 мМ, например в интервале от 10-4 до 10-6 мМ или еще ниже. Представленный вариант контролируемого добавления олигопептида к раствору связующего реагента является вариантом настоящего изобретения.
где Prot* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, и которая остается стабильной на стадиях удаления защитных групп во время синтеза указанного линейного пептида-предшественника, и R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют значения, указанные выше для соединения формулы VI, с последующим удалением in situ указанной защитной группы Prot* и получением соединения формулы VI;
где Prot* выбирают из группы, состоящей из C3-C8-алк-2-енилоксикарбонильных групп.
Указанный линейный пептид-предшественник формулы VIII предпочтительно синтезируют из соответствующих аминокислот, используя твердофазный пептидный синтез и последующее отщепление полученного пептида от используемого твердого носителя.
Так, соединение формулы VIII получают в варианте а) сочетанием аминокислоты формулы IX
где R3* имеет значения, указанные выше для соединения формулы II, и Prot** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить на смоле без разрушения других связей, или реакцион-носпособного производного указанной аминокислоты, через кислород с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES, и удалением указанной защитной группы Prot**;
сочетанием полученной аминокислоты, связанной со смолой и представленной формулой X
где RES и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы IX, n представляет собой натуральное число, и L представляет собой отщепляемый линкер, с аминокислотой формулы XI
где Prot* имеет значения, указанные выше для соединения формулы VIII, и R2* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, осуществляя реакцию сочетания связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII
где Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, R2* и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы II, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, через свободную гидроксигруппу с аминокислотой формулы XIII
где Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, и R7* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**;
или, в варианте Ь), сочетанием дипептида формулы XXVII
где R3* и Prot** имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, или реакционноспособного производного указанного дипепти-да, с аминоацильным фрагментом, связанным через кислород с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES, формулы X
который можно получить, как раскрыто в варианте а), где RES и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы IX; и
значения L и RES только что определены; и удаление указанной защитной группы Prot**;
и, после осуществления реакции по варианту а) или по варианту b), осуществление реакции сочетания получаемого соединения формулы XIV
где R6* и Y имеют значения, указанные для соединения формулы II, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**;
осуществление реакции сочетания получаемого соединения формулы XVI
где Y, R2*, R3*, R7* и R6* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с аминокислотой формулы XVII
где R5* имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**;
и, наконец, осуществление реакции сочетания полученного соединения формулы XVIII
где Y, R2*, R3*, R7*, R6* и R5* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с синтоном формулы XIX
Prot**
XIX
где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с активированным производным указанного сиитона, и удаление защитной группы Prot** с получением соединения формулы XX
где Prot, Y, R2*, R3*, R7*, R6* и R5* имеют значения, указанные для соединения формулы II, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X;
и отщепление связанного с твердой фазой пептида формулы XX от указанной твердой фазы L-RES с получением соответствующего соединения формулы VIII;
где реакционноспособные производные аминокислот IX, XI, XIII, XXVII, XV, XVII и XIX представляют собой независимо их хлорангидриды, фторангидриды, ангидриды или нитрофениловые эфиры;
где Prot представляет собой силильную защитную группу, Prot* выбирают из группы, состоящей из C3-C8-алк-2-енилоксикарбонильных групп, и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил) этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
Согласно другому предпочтительному варианту настоящего изобретения соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы XXV
лы II.
где X*, Aj*, R2*, R3*, R5*, R6*, R7* и Prot имеют значения, указанные выше для соединения форму.
Соединение формулы XXV предпочтительно получают расщеплением соединения формулы XXIV
где X*, Aj*, R2*, R3*, R5*, R6*, R7* и Prot имеют значения, указанные для соединения формулы II, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число и Prot** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить без одновременного удаления указанной защитной группы Prot, причем продукт остается на смоле, и (перед отщеплением, одновременно с ним. или после него) удаление защитной группы Prot** с получением ука
занного соединения формулы XXV;
где Prot представляет собой силильную защитную группу, и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
Указанное выше соединение формулы XXIV предпочтительно получают сочетанием аминокислоты формулы XIX
где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы XXIV, или активированного производного указанной аминокислоты, которое представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIX, с соединением формулы XXIII
где X*, Aj*; R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II, L представляет собой отшепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения соединение формулы XXIII получают сочетанием аминокислоты формулы XVII*
Prot***-NH с *
где R5* имеет значения, указанные для соединения формулы II, и Prot*** представляет собой ами-нозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты, с соединением формулы XXII
где X*, Aj*, R2*, R3*, R6* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты XVII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XVII*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
Предпочтительно соединение формулы XXII получают сочетанием аминокислоты формулы XV*
О Prot***
где R6* и Y имеют значения, указанные для соединения формулы II, и Prot*** представляет собой
аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие
где X*, Aj*, R2*, R3* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты XV* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XV*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения соединение формулы XXI получают осуществлением взаимодействия аминокислоты формулы XIII*
XXVI
где X*, Aj*, R2* и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы II, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное
число;
и удаление указанной защитной группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты XIII* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIII*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
В следующем предпочтительном варианте настоящего изобретения соединение формулы XXVI получают сочетанием связанного со смолой дипептида, представленного формулой XII*
где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено выше, причем продукт остается при этом на смоле, R2* и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы II, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, и n представляет собой натуральное число, после удаления указанной защитной группы Prot**** через полученную таким образом свободную аминогруппу, с кислотой формулы VII
где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, и где X* и Aj* имеют значения, указанные для соединения формулы II, или с реакционноспособным производным указанной кислоты;
и, если X** представляет собой аминозащитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** до получения Н вместо X* и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с ацильной группой X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или реакционноспособное производное указанной кислоты;
где реакционноспособное производное аминокислот VII* или Х*-ОН представляет собой хлоран-гидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты VII* или Х*-ОН соответственно;
где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
где R3* имеет значения, указанные для соединения формулы II, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, и n представляет собой натуральное число; с аминокислотой формулы XI*
Предпочтительно соединение формулы XII получают сочетанием связанной со смолой аминокислоты, представленной формулой X
где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и R2* имеет значения, указанные для соединения формулы II, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты;
где реакционноспособное производное аминокислоты XI* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XI*;
где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения вязанную со смолой аминокислоту формулы X получают сочетанием аминокислоты формулы IX*
нозащитную группу, которую можно удалить селективно, не затрагивая остальные присутствующие за-
щитные группы, причем продукт при этом остается на смоле; или реакционноспособного производного указанной аминокислоты формулы IX, с гидроксигруппой, связанной через отщепляемый линкер L, который связан с твердой смолой RES, и удаление указанной защитной группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты IX* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты IX*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к способу, где указанные символы Аь R2, R3, R5, R <5, R7, X и Y или соответствующие незащищенные или защищенные фрагменты R2*, R3*, R5*, R6*, R7*, X* и Y3 выбирают таким образом, что в полученном соединении формулы I, или в
его соли;
А] представляет собой двухвалентный радикал L-глутамина, связанный через карбонил его а-карбоксигруппы с аминогруппой справа от Aj в формуле I и через его а-аминогруппу с X, или представляет собой 2S-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил;
R2 представляет собой метил;
R3 представляет собой изобутил;
R5 представляет собой втор-бутил или бензил;
R <5 представляет собой 4-гидроксибензил;
R7 представляет собой изопропил или втор-бутил;
X представляет собой ацетил или изобутирил или отсутствует, если А1 представляет собой 2S-(2-гидрокси-3 -фосфоноокси)пропионил; Y представляет собой метил.
представленному на схеме 3.
Настоящее изобретение также относится к соединению 7
Настоящее изобретение также относится к соединению 6
Следующие определения (или также определения, уже включенные в вышеизложенное) могут заменять более общие термины, используемые ранее и далее в вариантах изобретения для определения дальнейших вариантов настоящего изобретения, с одним, двумя или более общими терминами, которые
можно заменить более конкретными терминами для определения таких вариантов изобретения:
Двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой представляет собой предпочтительно альфа-карбамоил или карбоксил-С1-8-замещенную аминокислоту, особенно двухвалентный фрагмент аспарагина или глутамина, и связан со своей правой стороны в формуле I через карбонил (предпочтительно карбонил его а-карбоксильной группы) с остальной частью молекулы.
С1-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-С1-8-алканоил (С1-8-алканоил, содержащий как гидроксил, так и фосфоногруппу (-O-P(=O)(OH)2)Ab представляет собой, например, 2,3-дигидроксипропаноил (предпочтительно в S-форме) или 2-гидрокси-3-фосфонопропаноил (предпочтительно в S-форме).
R2 и R2* представляют собой С1-8-алкил, особенно метил, где бы ни были упомянуты.
R3 представляет собой боковую цепь аминокислоты, особенно природной аминокислоты. Предпочтительно, чтобы он представлял собой С1-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным. Особенно предпочтителен С1-8-алкил, который представляет собой н-(2-метил)пропил(изобутил), н-(1-метилпропил(втор-бутил) или метил, т.е., чтобы аминокислотой фрагмента был лейцин, изолейцин или валин.
R3* представляет собой соответствующую боковую цепь в защищенной форме, если присутствует функциональная группа, которую следует защитить от участия в реакции. Предпочтительно, чтобы это был С1-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным, особенно, как определено в предшествующем пункте.
"Боковую цепь аминокислоты" можно выбрать из любого фрагмента, например моно- или полициклического, линейного, насыщенного, ненасыщенного (например, с сопряженными двойными связями) или частично насыщенного органического фрагмента, например содержащего вплоть до 20 атомов углерода и 0-5 гетероатомов в основной структуре, независимо выбранных из N, О и S и заменяющих соответствующее число атомов углерода, и она может быть замещена вплоть до тремя фрагментами, выбранными из амино, имино, гидрокси, карбокси, карбамоила, сульфгидрила, амидино, гуанидино, О-фосфоно (-О-Р(=0)(ОН)2). Предпочтительно указанные боковые цепи выбирают из указанных 20 стандартных альфа-аминокислот: аргинин, гистидин, лизин, аспарагиновая кислотя, глутаминовая кислотя, серии, треонин, аспарагин, глутамин, цистеин, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин и дополнительно пролин (в этом случае с внутренней циклизацией, включающей альфа-аминогруппу).
Для указанных аминокислот в рассматриваемом описании используют или их названия, или обычные трехбуквенные коды в соответствии со следующей таблицей:
Аминокислота
Трехбуквенный код
Алании
Ala
Аргинин
Arg
Аспарагин
Asil
Аспарагиновая кислота
Asp
Аспарагин или аспарагиновая кислота
ASX
Цистеин
Cys
Глутаминовая кислота
Glu
Глутамин
Gin
Глутамин или глутаминовая кислота
Glx
Глицин
Gly
Гистидин
His
Изолейцин
lie
Лейцин
Leu
Лизин
Lys
Метионин
Met
Фенилаланин
Phe
Пролин
Pro
Серии
Ser
Треонин
Thr
Триптофан
Try
Тирозин
Tyr
Валин
Val
R5 представляет собой боковую цепь аминокислоты, предпочтительно стандартной аминокислоты. Предпочтительно, если он представляет собой С1-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным и который незамещен или замещен фенилом. Наиболее предпочтительны бензил, н-(2-метил)пропил, изононил или метил, т.е. фрагменты, содержащие такие аминокислоты, как фенила-ланин, лейцин, изолейцин или валин.
R6 представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты, особенно тирозина.
R7 представляет собой боковую цепь аминокислоты, особенно природной аминокислоты. Предпочтительно, чтобы он представлял собой С1-8-алкил, который может быть неразветвленным или разветвленным. Наиболее предпочтительны н-(2-метил)пропил(изобутил), н-(1-метил)пропил(втор-бутил) или метил, т.е. фрагменты, содержащие такие аминокислоты, как лейцин, изолейцин или валин.
С1-8-алкил может быть неразветвленным или разветвленным один или более раз; например, он может представлять собой н-(2-метил)пропил, н-(1-метил)пропил или метил.
Все соединения, в которых присутствуют солеобразующие группы, такие как основные группы, например амино- или имино-, или кислотные группы, например карбоксил или фенольный гидроксил, можно использовать в свободной форме, или в виде соли, или в виде смесей солей и свободных форм. Т.е. в случае, если упомянуто любое соединение, оно включает все указанные варианты. Например, основные группы могут образовывать соли с кислотами, такими как галогеноводородные кислоты, например НС1, серная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, тогда как кислотные группы могут образовывать соли с положительными ионами, например с аммонием, алкилам-монием, катионами солей щелочных или щелочноземельных металлов, например с катионами Са, Mg, Na, K или Li или т.п.
Выражения "или т.п." или "и т.п.", используемые в рассматриваемом описании, относятся к тому факту, что другие альтернативы упомянутых ранее выражений известны специалистам в данной области и могут быть добавлены к конкретно указанным выражениям; в других вариантах выражения "или т.п." и "и т.п." можно исключить в одном или более, или во всех вариантах изобретения.
Указанные защитные группы Prot, Prot*, Prot**, Prot***, Prot**** и любые другие защитные группы, присутствующие во фрагментах A*, R2*, R3*, R5*, R6*, R7*, X*, где бы они ни были указаны во всем описании и в формуле изобретения, выбирают таким образом, чтобы они обеспечивали возможность ортогональной защиты.
Ортогональная защита представляет собой стратегию, которая обеспечивает удаление нескольких защитных групп (одной или более, но не всех) в нужный момент времени, в соответствии с указанными условиями реакций, но при этом не затрагиваются остальные группы или связи со смолой, например через линкеры на твердых смолах. Другими словами: указанная стратегия использует различные классы защитных групп, которые можно удалять, используя различные химические механизмы, также используя соответствующие линкеры в случае твердофазного пептидного синтеза (где указанную связь линкер-смола вместе можно рассматривать как карбоксизащитную группу).
Предпочтительно указанные защитные группы выбирать следующим образом.
Защитную группу Prot предпочтительно выбирают такой, чтобы не происходило удаления любых других используемых или присутствующих защитных групп в процессе синтеза депсипептида способом по настоящему изобретению, например под действием слабых оснований (см. Prot*), но которую можно удалить, используя ион фтора (особенно в безводных условиях), например Bu4N+F- (также, если образуется in situ, например при использовании Bu4N+Q- с KF H20, KF с 18-краун-6, LiBr с 18-краун-6, BF3•диэтиловый эфир, пиридин-HF, HF в мочевине, Et3N(HF)3 (где Et представляет собой этил) или т.п., где растворитель, например, выбирают из группы, состоящей из ^^диметилформамида, ацетонитрила, хлороформа и тетрагидрофурана.
Предпочтительно Prot представляет собой эфирную защитную группу, особенно, выбранную из группы, состоящей из силильных защитных групп, в которых силильный фрагмент содержит вплоть до трех органических фрагментов, связанных через углерод (необязательно через другой атом Si), таких как трет-бутилдифенилсилил, триметилсилил, триизопропилсилил, трет-бутилдиметилсилил, трифенилси-лил, дифенилметилсилил, три-трет-бутилдиметилсилил, трет-бутилметоксифенилсилил, трис-(триметилсилил)силил или т.п.
Prot* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая ос-
тальные присутствующие защитные группы, и также не затрагивая депсипептидную сложноэфирную
связь или линкер со смолой RES, и которая является стабильной на стадиях удаления защитных групп во
время процесса синтеза линейного пептида-предшественника (например, удаления аллилоксикарбонила);
он предпочтительно представляет собой защитную группу, удаляемую специфическими трифенилфос-
финовыми комплексами в присутствии гидридов металлов или других восстановителей, например
(PH3P)4Pd, предпочтительно в комбинации с гидридом ди-н-бутилолова или гидридом три-н-бутилолова,
фенилсиланом, боргидридом натрия или димедоном, в соответствующем растворителе, например в тет-
рагидрофуране, и предпочтительно не отщепляется в условиях, которые обеспечивают, например, удале-
ние защитной группы Prot**; и Prot* выбирают из группы, состоящей из С3-С8-алк-2-
енилоксикарбонильных фрагментов, например аллилоксикарбонила (Alloc),
1-изспропилаллилоксикарбонила, 4-нитроциннамилоксикарбонила и З-(З'-пиридил) проп-2-енилоксикарбонила.
Prot** представляет собой защитную группу, которую можно удалить на смоле без разрушения других связей (без отщепления аминокислоты или пептидной связи через ее карбонил (особенно а-карбоксильной группы для связывания через линкер L, упомянутый далее; также без отщепления защитной группы Prot, если она присутствует), особенно защитную группу, удаляемую без разрушения слож-ноэфирной (вместо амидной) связи в депсипептиде или предшественнике депсипептида, и в условиях, отличающихся от тех, которые используют для указанных защитных групп Prot* и Prot, сохраняя при этом связывание через линкер со смолой RES, если присутствует; предпочтительно, чтобы ее можно было удалить слабым основанием, например пиперидином, морфолином, дициклогексиламином, п-диметиламинопиридином, диизопропиламином, пиперазином, трис-(2-аминоэтил)амином, в соответствующем растворителе, например ^^диметилформамиде, метиленхлоиде; Prot**, например, выбирают из группы, состоящей из флуорен-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2'- или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
Prot*** (аминозащитная группа, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле) и Prot**** (защитная группа, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено выше и далее, причем продукт при этом остается на смоле) представляют собой предпочтительно защитные группы, которые можно удалить Prot**, и которые, например, выбирают из групп, которые указаны для R**, например флуорен-9-илметоксикарбонила (Fmoc).
В предпочтительном способе ортогонального синтеза в данном случае используют способ с использованием Fmoc, который общеизвестен для пептидного синтеза с использованием твердофазного пептидного синтеза, комбинированного с жидкофазной макролактамизацией, и дальнейших химических превращений,
Альтернативно, например, Вос-защитную группу можно использовать вместо Fmoc Prot**, Prot***
и Prot****.
Однако такой вариант потребует других защитных групп для боковых цепей, а также понадобится другим способом защищать гидроксигруппу в N-метил-Tyr для сохранения ортогональности защитных групп.
Другие присутствующие защитные группы, также как линкеры, связывающие со смолой RES, если присутствуют, предпочтительно не удаляются в условиях, в которых можно удалить Prot* и Prot**, например в А*, амид может быть N-защищен, например, тритилом (трифенилметилом) (удаление, например, трифторуксусной кислотой (TFA); в R6* гидрокси тирозина может быть защищен как трет-бутиловый эфир, или защищен трет-бутилдиметилсилилом, метоксиметилом, Вос-(трет-бутоксикарбонилом) или арилацетатом (удаление с использованием TFA).
Соответствующие защитные группы хорошо известны специалистам в данной области, также как способы их введения и удаления. Например, защитные группы, способы их введения и удаления можно выбрать из тех, что раскрыты в стандартных учебниках, таких как "Protective Groups in Organic Synthesis", 3rd ed., T.W. Green and P.G.M. Wuts (Eds.). J. Wiley & Sons, Inc., New York etc. 1999.
Таким образом, указанные защитные группы Prot, Prot*, Prot**, Prot***, Prot**** и другие защитные группы не ограничены перечисленными выше-скорее, они должны соответствовать условиям, которые делают их подходящими для ортогональной защиты, например, как раскрыто выше или далее.
Рекомендуется избегать слишком щелочных условий (хотя основания, раскрытые для удаления Fmoc, такие как пиперидин, обычно считаются приемлемыми), чтобы избежать разрушения депсипеп-тидной (сложноэфирной) связи.
Среди возможных твердых носителей для твердофазного пептидного синтеза (Solid Phase Пептид Synthesis (SPPS)) можно указать следующие:
носители гелевого типа со спейсерами или без них: Оки представляют собой сильно сольватиро-ванные полимеры с равномерным распределением функциональных групп. Указанный тип носителей является наиболее общепринятым и включает
полистирол: стирол поперечносшитый, например 1-2% дивинилбензолом; полиакриламид или по-лиметакриламид: в качестве гидрофильной альтернативы полистиролу; полиэтиленгликоль (PEG): PEG-полистирол (PEG-PS) более стабилен, чем полистирол и отделяет сайт синтеза от основной цепи полимера; носители на основе PEG: состоят из сетки PEG-полипропиленгликоля или PEG с полиамидом или полистиролом (они уже включены в спейсер, PEG);
носители поверхностного типа: материалы, созданные для функционализации поверхностей, включая стекло с контролируемым размером пор, целлюлозные волокна и полистирол с высокой степенью сетчатости сруктуры;
композиты: полимеры гелевого типа, нанесенные на жесткие матрицы.
Обычно указанные гели содержат реакционноспособные группы, с которыми может быть связан линкер L, как указано выше и далее, для различных предшественников. Например, такие группы включают аминометильные группы, группы полиэтиленгликоля с концевыми гидрокси, и т.п.
Любой из указанных носителей можно использовать в вариантах настоящего изобретения.
Носители гелевого типа используют в других специальных вариантах настоящего изобретения. Среди них, полистирол (поперечносшитый дивинилбензолом); полиакриламидные и
полиметакриламидные смолы особенно предпочтительны. Среди возможных линкеров можно использовать все общеизвестные и соответствующие.
Примерами возможных вариантов настоящего изобретения служат 2-метокси-4-бензилоксибензиловый спирт линкер (Sasrin-линкер, Sasrin-обозначение для смолы, суперчувствительной к кислоте, связывает аминокислоты или пептиды через спиртовую группу ОН); семейство тритиль-ных линкеров (например, тритил, 2С1-тритил, которые связывают аминокислоты или пептиды через ОН); 4-(2,4-диметоксифенилгидроксиметил)феноксиметил-линкер (кислота Ринка-линкер, связывает аминокислоты или пептиды через ОН); или линкеры трис-(алкокси)бензилового эфира (HAL-линкер, связывает аминокислоты или пептиды через ОН).
В случаях, где указаны реакционноспособные производные кислот, особенно аминокислот, или пептидов, например дипептиды, они могут образоваться in situ, или они могут быть использованы как таковые.
Реакционноспособные (или активные) производные, используемые как таковые, включают ацилга-логениды, например ацилхлориды, ацилфториды или ацилнитрофениловые эфиры, например 2,4-динитрофениловые эфиры, или ангидриды кислот (симметричные или, например, с уксусной кислотой) карбоксильных групп кислот подлежащих реакции.
Для in situ активации аминокислот можно использовать обычные сочетающие агенты. Такие реа-
генты хорошо известны специалистам в данной области, и их можно получить из многих источников,
например от Aldrich ChemFi1es-Peptide Synthsis (Aldrich Chemica1 Co., Inc., Sigma-Aldrich Corporation,
Milwaukee, Wl, USA) Vol. 7 No. 2, 2007 (см.
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Aldrich/Brochure/al_chemfile v7_n2. Par. 0001. File.
tmp/al_chemfile_v7 n2.pdf). Среди возможных сочетающих агентов для синтеза амидных и сложно-
эфирных связей можно указать следующие.
Триазолы, производные урония или гексафторфосфония, например 1-гидрокси-бензотриазол
(HOBt), 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt), этил 2-циано-2-(гидроксиимино)ацетат, 2-(1Н-7-
азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат метанаминий (HATU), бензотриазол-1-
ил-окситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат (РуВОР), бензотриазол-1-илокси-трис-
(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат (ВОР), 1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазол
(MSNT), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат (HBTU), 2-(1Н-
бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний-гексафторборат (TBTU), 2-сукцинимидо-1,1,3,3-
тетраметилуронийтетрафторборат (TSTU), 2-(5-норборнен-2,3-дикарбоксимидо)-1,1,3,3-
тетраметилуронийтетрафторборат (TNTU), 0-[(циано(этоксикарбонил)метилиден)амино] -1,1,3,3-
тетраметилуронийтетрафторборат (TOTU), 0-(бензотриазол-1 -ил) -1,3 -диметил-1,3-
диметиленуронийгексафторфосфат (HBMDU), 0-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-бис-
(тетраметилен)уронийгексафторфосфат (HBPyU), 0-(бензотриазол-1-ил)-1, 1,3,3-бис-
(пентаметилен)уронийгексафторфосфат (HBPipU), 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазин
(HODhbt), 1-гидрокси-7-азабензотриазол и их соответствующие соли урония или фосфония, обозначае-
мые HAPyU и АОР, 1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси-
диметиламиноморфолинокарбенийгексафторфосфат (COMU), хлортрипирролидинофосфонийгекса-
фторфосфат (PyCloP) или т.п.
Карбодиимиды, например дициклогексилкарбодиимид, ^(3-диметиламинопропил)-№-
этилкарбодиимид, 1-трет-бутил-3-этилкарбодиимид, N-циклогексил-N'-2-морфолиноэтил) карбодиимид
или диизопропилкарбодиимид (особенно для образования сложного эфира через образование
O-ацилмочевины карбоксильной группы); или агенты, образующие активные сложные эфиры, например
2-меркаптобензотиазол (2-МВТ), азидобразующие агенты, например дифенилфосфорилазид, ангидриды
кислот, такие как ангидрид пропанфосфоновой кислоты, агенты галогенирования кислот, например
1 -хлор-N,N,2-триметил-1 -пропениламин, хлор-^^№,№-бис-
(тетраметилен)формамидинийтетрафторборат или гексафторфосфат, хлор-^^№,№-
тетраметилформамидинийгексафторфосфат, фтор-N,N',N',N'-тетраметилформамидинийгексафторфосфат, фтор-N,N,N',N'-бис-(тетраметилен)формамидинийгексафторфосфат или т.п., или смеси двух или более таких агентов.
Также для осуществления реакции сочетания сложного эфира соединений формул XII или XIIA с соединениями формул XIII или XIIIA соответственно, или соединений формул XIII* или XIIIA* с соединениями формул XXVI или XXVIA соответственно, соответствующие реакционноспособные карбоксильные соединения можно использовать или образовать их in situ. Здесь особенно предпочтителен MSNT в качестве сочетающего агента, так как он позволяет поддерживать высокую стереоспецифич-ность.
Указанную реакцию можно вести, если возможно, в присутствии слабого основания (например N-метилморфолина, триалкиламина, например этилдиизопропиламина, ди(алкил)аминопиридина, такого как ^^диметилшинопиридин, или т.п. (позаботясь о том, чтобы условия не оказались столь основными, чтобы позволить протекать гидролизу сложноэфирной группы, например указанной депсипептидной сложноэфирной группы, присутствующей в соединениях-предшественниках формулы I), где соответствует или требуется в присутствии соответствующего растворителя или смеси растворителей, например ^№,циалкилформамида, такого как диметилформамид, галогенированного углеводорода, например ди-хлорметана, N-алкилпирролидонов, таких как N-метилпирролидон, нитрилов, например ацетонитрила, или других ароматических углеводородов, например толуола, или смеси двух или более их них, где, при условии избытка присутствующего сочетающего агента может также присутствовать вода. Температуры могут быть комнатными или ниже или выше комнатных температур, например в интервале от -20 до 50°С.
Аминокислоты формул IX, IXA, XI, XIA, XIII, XIIIA, XV, XVA, XVII, XVIIA, XXVII (полученные, например, Solution Phase синтезом), XVII*, XVIIA*, XV*, XVA*, XIII*, XIIIA*, XI*, XIA*, IX* и IXA*
известны или их можно синтезировать хорошо известными специалистам в данной области способами, они коммерчески доступны или их можно синтезировать аналогичными известным специалистам способами.
Кроме того, остальные исходные материалы, например указанные кислоты формулы XIX или VII, или дипептиды формул XXVII или XXVIIA, известны или их можно синтезировать, используя известные специалистам способы, они коммерчески доступны и/или их можно синтезировать по аналогии с известными специалистам способами.
Например, синтон формулы XIX можно получить способом из примера 1А(4) (который представляет собой специфический вариант настоящего изобретения) или аналогичным ему способом. Синтез промежуточного соединения 1 (схема 1) раскрыт в Tetrahedron 61, 1459-1480 (2005).
В реакциях сочетания для получения дипептидов используют соответствующие карбоксильные группы аминокислот в свободной форме или в активированной форме.
Примеры.
Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, не ограничивая его объем.
Сокращения:
Aq. - водный;
Вос/ВОС - трет-бутоксикарбонил;
Brine - раствор хлорида натрия в воде (насыщенный при комнатной температуре); Bzl - бензил;
COMU - 1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси-
диметиламиноморфолинокарбенийгексафторфосфат; DCM - дихлорметан; DIPEA - ^^диизопропилэтиламин; DMAP - 4-диметиламинопиридин; DMF (ДМФ) - N,N-диметилформамид; Fmoc/FMOC - 9-флуоренилметоксикарбонил; Et - этил;
HATU - 2-(1Н-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат метанаминий; HFIP - гексафторизопропанол;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
HR-MS (HR-MC) - масс-спектроскопия высокого разрешения;
IPA - изопропилацетат;
IPC - контроль в процессе получения;
IR (ИК) - инфракрасная спектроскопия;
IT - внутренняя температура;
тест Кайзера - тест с использованием нингидрина для контроля за удалением защитных групп в SPPS (см. Е. Kaiser, R. L. Colescott, С. D. Bossinger, P. I. Cook, Analytical Biochemistry 1970, 34 595); если результат указан как OK, это означает успешное удаление защитных групп;
me - метил;
MS (MC) - масс-спектроскопия;
MSNT - 1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1,2,4-триазол;
NMR (ЯМР) - спектроскопия ядерного магнитного резонанса;
РуВОР - бензотриазол-1-илокситрипирролидинофосфонийгексафторфосфат;
ВОР - бензотриазол-1-илокси-трис-(диметиламино)фосфонийгексафторфосфат;
RP - обращенная фаза;
RT/rt - комнатная температура;
SPPS - твердофазный пептидный синтез;
ТВМЕ - трет-бутилметиловый эфир;
TFA - трифторуксусная кислота;
TEMPO - 2,2,6,6-тетраметил-1-пиперидинилокси, свободный радикал; RBF - круглодонная колба.
Сокращения для аминокислот см. в приведенной выше таблице. Названия соединений.
Названия олигопептидов с открытой цепью приведены в соответствии с рекомендациями Joint Commission on Biochemical Nomenclature ("International Union Pure and Applied Chemistry" и "International Union of Biochemistry"), опубликованными в Pure & Appl. Chem. 1984, 56, 595-624. Ранее, для указанных соединений использовали конвенцию для наименований простых пептидов. Более ранние названия приводятся в скобках.
Пример 1. Синтез соединения А.
1А. Синтез синтона 1.
(i) Альтернатива 1.
Схема реакции 1:
1А(1) Получение соединения 1.
(S)-бензил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-5-гидроксипентаноат.
Соединение 1 получают способом, аналогичным способу, раскрытому R. K. Olson, K. Ramasamy, Т. Emery, J. Org. Chem. 1984, 49, 3527. BOC-Glu-OBzl (50 г, 148,2 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране: (800 мл) и добавляют триэтиламин (47,3 г, 467,4 ммоль). Полученный раствор охлаждают до внутренней температуры = -10°С. Медленно добавляют этилхлорформиат (51,8 г, 98% чистоты, 467,8 ммоль), поддерживая при этом внутреннюю температуру в интервале от -10 до -15°С. Полученную таким образом суспензию перемешивают еще в течение часа. Данные IPC (ВЭЖХ) указывают на исчезновение исходного материала. Реакционную смесь оставляют нагреваться до 0°С и добавляют воду (800 мл) при 0-5°С в течение 25-30 мин. Становится видным разделение полученной смеси на две фазы. При интенсивном перемешивании добавляют 10 порциями боргидрид натрия (11,8 г, 299,4 ммоль) при температуре 0-5°С. Предпринимают предосторожности, так как во время добавления боргидрида натрия происходит выделение водорода. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 5 мин при температуре 0-5°С, и затем температуру повышают до 20-25°С в течение 30 мин. Требуется осторожность, так как водород продолжает выделяться при повышении температуры. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 15 мин при температуре 20-25°С перед окончательной обработкой.
Для окончательной обработки к. реакционной смеси добавляют воду (1250 мл), затем добавляют этилацетат (1250 мл). Образовавшиеся фазы разделяют, и водную фазу экстрагируют этилацетатом (600 мл). Органические слои объединяют и промывают солевым раствором (2x600 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом магния, растворитель выпаривают при пониженном давлении и 40-45°С, получая 50,8 г сырого продукта. Степень чистоты по данным: ВЭЖХ: 94 а%. Полученный сы
рой продукт очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле, смесь фракция гекса-на/этилацетат (с 7:3 до 1:1) в качестве подвижной фазы.
Выход: 40,85 г (85,2%). Степень чистоты: 98% (ВЭЖХ). Данные МС и ЯМР подтверждают предполагаемую структуру.
1А(2) Получение соединения 2.
(S)-бензил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-5-((трет-бутилдифенилсилил)окси)пентаноат.
Спирт (соединение 1), полученный на предшествующей стадии, (40,3 г, 124,6 ммоль) растворяют в диметилформамиде (200 мл) и добавляют имидазол (12,8 г, 99,5% степень чистоты, 186,9 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре, до тех пор, пока не образуется раствор (5-10 мин). Трет-бутил-дифенилсилилхлорид (41,9 г, 98% степень чистоты, 14 9,5 ммоль) добавляют по каплям в течение 10 мин, и перемешивание продолжают в течение еще 15 мин при комнатной температуре. IPC (ВЭЖХ) свидетельствует об исчезновении исходного материала (спирта). Для окончательной обработки к реакционной смеси добавляют изопропилацетат (400 мл), с последующим медленным добавлением полунасыщенного водного раствора бикарбоната натрия (400 мл). Добавление осуществляют осторожно, так как добавление процесс экзотермический и сопровождается выделением газа. Образовавшиеся фазы разделяют, и водную фазу экстрагируют изопропилацетатом (400 мл). Органические слои объединяют и экстрагируют водой (400 мл). Органический слой сушат над сульфатом магния, и растворитель выпаривают при температуре 40-45°С при пониженном давлении. Остаток сушат в течение ночи в вакууме при температуре 25°С, получая 83,25 г сырого продукта в виде бесцветного масла. Данные ВЭЖХ свидетельствуют о присутствии 81 а% нужного продукта и 18,6 а% соответствующего силанола. Полученный сырой продукт используют без дополнительной очистки на следующей стадии. Данные ЯМР и HR-MC очищенного образца подтверждают предполагаемую структуру. HR-MC: Рассчитано для C33H43NO5Si: [М+Н]+: 562,29833; [M+NH4]+: 579,32488; [M+Na]+: 584,28027. Найдено: [М+Н]+: 562,29848; [M+NH4]+: 579,32489; [M+Na]+: 584,27995.
1А(3) Получение соединения 4.
(S)-бензил-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-5-((трет-бутилдифенилсилил)окси)пентаноат.
83,25 г сырого продукта с предшествующей стадии (соответствует 70 г теоретического выхода соединения 2, 124,6 ммоль) растворяют в дихлорметане (650 мл) и по каплям добавляют трифторуксусную кислоту (358,8 г, 99% степень чистоты, 3115 ммоль) к интенсивно перемешиваемому раствору. IPC (по данным ВЭЖХ) через 30 мин свидетельствует о полном удалении ВОС-защитной группы. Полученную реакционную смесь (прозрачный раствор) переносят в 6-л 4-горлую колбу с механической мешалкой и разбавляют 1000 мл дихлорметана. Полунасыщенный водный раствор карбоната натрия (1800 мл) медленно добавляют к интенсивно перемешиваемому раствору. Предпринимают предосторожности, так как во время добавления карбоната натрия наблюдается интенсивное выделение газа. рН водной фазы после завершения добавления: 9-10. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 15 мин, и образовавшиеся фазы разделяют. Водную фазу экстрагируют дихлорметаном (1000 мл), и органические слои объединяют, получая раствор продукта в дихлорметане. Полученный раствор концентрируют при температуре 40-45°С при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 650 мл для следующей стадии. По данным ВЭЖХ в растворе присутствует 80,5% соединения 3 и 19,5 а% силанола.
Для FMOC-илирования насыщенный водный раствор бикарбоната натрия (650 мл) медленно добавляют к интенсивно перемешиваемому раствору соединения 3, затем добавляют FMOC-хлорид (36,55 г, 97% степень чистоты, 137 ммоль). Предпринимают предосторожности, так как во время добавления FMOC-Cl происходит выделение газа. Перемешивание продолжают в течение 15 мин при комнатной температуре. IPC (ВЭЖХ) органического слоя свидетельствует об исчезновении промежуточного соединения 3 и полном превращении в соединение 4. Для окончательной обработки слои разделяют, и водную фазу экстрагируют дихлорметаном (650 мл). Органические слои объединяют и экстрагируют водой (650 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель удаляют при температуре 40-45°С при пониженном давлении, получая 112,6 г сырого продукта.
Полученный сырой продукт суспендируют в смеси этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 2400 мл), и порученную суспензию нагревают до внутренней температуры 50°С, получая раствор. Полученный раствор охлаждают до 45°С, добавляют затравочные кристаллы, и температуру продолжают снижать до 20-25°С в течение 1 ч. Кристаллизация начинается при приблизительно 40°С. Полученную суспензию перемешивают при 20-25°С в течение ночи, затем охлаждают до внутренней температуры 0-5°С в течение 30 мин, и перемешивание продолжают в течение дополнительно 2 ч при температуре 0-5°С. Полученный продукт выделяют фильтрованием, фильтровальную лепешку промывают смесью эта-нол/изопропанол/вода (89:5:6; 240 мл) и сушат при пониженном давлении, получая чистое соединение 4 (100 а% степень чистоты по данным ВЭЖХ). Выход: 66г (77,4%). Полученный продукт полностью охарактеризован по данным МС и ЯМР HR-MC: Рассчитано для C43H45NO5Si: [М+Н]+: 684,31398;
[M+NaH4]+: 701,34053; [M+Na]+: 706,29592. Найдено: [М+Н]+: 684,31392; [M+NH4]+: 701,34021; [M+Na]+:
706,29539. Маточный раствор дает (по данным ВЭЖХ) 30,6 г пены, включающей 30 а% продукта и 29
а% силанола.
1А(4) Получение синтона 1 из соединения 4.
(S)-2-((((9Н-флуорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-5-((трет-бутилдифенилсилил)окси)пентановая кислота.
Соединение 4 (66 г, 96,6 ммоль) суспендируют в смеси этанол/изопропиловый спирт/вода (89:5:6; 3000 мл), и полученную суспензию нагревают до внутренней температуры 45°С, получая раствор. Полученный раствор охлаждают до внутренней температуры 30°С. После обработки аргоном палладиевый катализатор (10% на сульфате бария; 6,6 г) добавляют к полученному раствору в потоке аргона. Полученный продукт затем гидрируют при давлении водорода несколько выше атмосферного давления и при температуре 30-35°С. Гидрирование завершается через 1,5 ч по данным ВЭЖХ. Полученную реакционную смесь фильтруют через целлюлозный фильтр (Cellflock 40; фильтр на основе целлюлозы), и фильтр промывают смесью этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 600 мл). После выпаривания растворителя при пониженном давлении при 45-50°С получают 59,58 г пены в виде сырого продукта. Полученный сырой продукт очищают, используя хроматографию на силикагеле, двумя порциями (2x 1 кг силикагеля 60), используя дихлорметан/метанол 95:5 до 80:20 в качестве подвижной фазы. Выход: 52 г (90,6%). Полученный продукт полностью охарактеризован по данным МС и ЯМР. HR-MC: Рассчитано для C36H39NO5Si: [M+H]+: 594,26703; [M+NH4]+: 611,29358; [M+Na]+: 616,24897; Найдено: [М+Н]+: 594,26743; [M+NH4]+: 611,29385; [M+Na]+: 616,24900.
(ii) Альтернатива 2.
Схема реакции 2:
4 СиИТОН 1
1А(5) Получение соединения 4 из Fmoc-Glu-OBzl через соединение 5 в одном реакторе.
Fmoc-Glu-OBzl (5 г, 10,88 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (80 мл) и добавляют триэтиламин (3,3 г, 32,6 ммоль). Полученный раствор охлаждают до -15°С, и к полученному раствору добавляют этилхлорформиат (7,3 г, 67,27 ммоль) в течение 30 мин при температуре -12°С. Полученную таким образом суспензию перемешивают еще в течение часа при температуре от -10 до -15°С, и температуру повышают до 0°С. К реакционной смеси по каплям добавляют воду (80 мл), поддерживая температуру при 0°С. Тремя порциями добавляют боргидрид натрия (всего 0,805 г, 21,27 ммоль) (по 1 порции каждые 10 мин) при 0°С, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительно 1 ч при 0°С. Предпринимают предосторожности, так как происходит выделение водорода. Полученную реакционную смесь разбавляют водой (100 мл) и экстрагируют изопропилацетатом (150 мл), после чего слои разделяют. Водную фазу снова экстрагируют изопропилацетатом (100 мл), и органические слои объединяют. Объединенную органическую фазу промывают полунасыщенным раствором хлорида натрия (2x50 мл), и полученный раствор концентрируют при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 50 мл. Концентрированный раствор тщательно фильтруют, и остаток на фильтре промывают изопропил-ацетатом (20 мл). Полученный таким образом раствор соединения 5 переносят в круглодонную колбу и добавляют имидазол (1,49 г, 21,89 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре и добавляют трет-бутилдифенилсилилхлорид (4,45 г, 16,19 ммоль), Полученную
реакционную смесь перемешивают в течение 15 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную суспензию разбавляют изопропилацетатом (20 мл) и экстрагируют водой (3x50 мл). Органический слой отделяют, и растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая 9,95 г сырого продукта. Полученный сырой продукт очищают, используя колоночную хроматографию на сили-кагеле и смесь изопропилацетат/гексан (2:8) в качестве подвижной фазы, получая 6,5 г твердого вещества, которое суспендируют в гексане и перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок выделяют фильтрованием и сушат при 50°С при пониженном давлении, получая 5,6 г соединения 4. Выход: 75% за две стадии. HR-MC: Рассчитано для C43H45NO5Si: [M+H]+: 684,31398; [M+NH4]+: 701,34053; [M+Na]+: 706,29592. Найдено: [М+Н]+: 684,31430; [M+NH4]+: 701,34073; [M+Na]+: 706,29577.
1А(6) Альтернативное получение в одном реакторе соединения 4 из Fmoc-Glu-OBzl через соединение 5, используя изопропилхлорформиат вместо этилхлорформиата.
Fmoc-Glu-OBzl (60 г, 130,579 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (550 мл) и добавляют триэти-ламин (40,8 г, 403,202 ммоль). Получают мутный раствор с некоторым количеством осадка. Полученную смесь мутный раствор/суспензия переносят в капельную воронку и добавляют к предварительно охлажденному раствору изобутилхлорформиата (54,96 г, 402,41 ммоль) в тетрагидрофуране (300 мл) в 4,5-л реакторе при температуре от -35 до -30°С, поддерживая указанную температуру вс время добавления. Остатки в капельной воронке промывают дополнительным количеством тетрагидрофурана (50 мл), и полученную реакционную смесь перемешивают при температуре от -35 до -30°С в течение дополнительно двух часов. К реакционной смеси добавляют воду (960 мл) в течение 45 мин, позволяя температуре повыситься до 0°С. Образуется суспензия. Боргидрид натрия (14,4 г, 380,625 ммоль) добавляют 20 порциями в течение 1 ч при температуре 0°С, и полученную реакционную смесь перемешивают еще в течение часа при 0°С. Предпринимают предосторожности, так как происходит выделение водорода. Полученную суспензию выливают в трет-бутилметиловый эфир (600 мл), и реакционную колбу промывают водой (600 мл), которую добавляют к смеси полученных продуктов (2 фазы). Образовавшиеся фазы разделяют, водную фазу экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром (600 мл), и органические фазы объединяют. Органическую фазу промывают водой (2x600 мл), сушат над безводным сульфатом магния (200 г), и растворитель удаляют при пониженном давлении до конечного объема 1 л. Полученный раствор разбавляют диметилформамидом (600 г), и растворитель выпаривают при пониженном давлении до конечного объема 400 мл. Полученный таким образом раствор соединения 5 переносят в круглодонную колбу. Имидазол добавляют (14,4 г, 211,524 ммоль) к раствору соединения 5 в DMF, и полученную смесь перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем по каплям добавляют TBDPS-Cl (39,6 г, 144,07 ммоль) в течение 20 мин при температуре 20-25°С, и полученную реакционную смесь перемешивают еще в течение часа при указанной температуре.
Полученную реакционную смесь выливают в этилацетат (1200 мл), и полученную смесь экстрагируют водой (700 мл). Слои разделяют, и органический слой промывают водой (3x300 мл). В результате выпаривания растворителя при пониженном давлении получают 106 г сырого продукта.
Полученный сырой продукт (106 г) растворяют в смеси этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 1200 мл) при температуре 40-50°С и добавляют затравочные кристаллы (0,5 г соединения 4). Полученную смесь оставляют охлаждаться до комнатной температуры и перемешивают в течение 17 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию охлаждают до -20°С и перемешивают в течение 2 ч при -20°С. Полученный продукт Е.ыделяют фильтрованием, фильтровальную лепешку промывают смесью растворителей этанол/изопропанол/вода (89:5:6; 3x200 мл) и сушат при 40°С при пониженном давлении, получая 66,5 г соединения 4 (74,6% выход за 2 стадии). По данным ВЭЖХ степень чистоты полученного продукта > 99 а%.
Дополнительное количество продукта можно выделить из маточного раствора (34 г после выпаривания растворителя), который содержит приблизительно 30 а% соединения 4 по данным ВЭЖХ. 1В Синтез пептида-предшественника 1 с использованием SPPS.
Пептид-предшественник 1: изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-синтон 1-H)-Leu-OH
Пептид-предшественник 1
Пептид-предшественник 1 получают, используя 2 различных твердых носителя. Оборудование.
Реактор твердофазного синтеза с фильтрующей тканью или пластиной пористого стеклянного фильтра на дне. Азотный коллектор позволяет отводить содержимое реактора через фильтрующую ткань или пластину пористого стеклянного фильтра и нижний клапан.
1В(1) Присоединение тритил-линкера к твердому носителю.
200 г аминометилполистирольной смолы (сшитой 1% дивинилбензолом, содержание аминометиль-ных групп 1 ммоль/г) (поставщик: Senn Chemicals AG, Dielsdorf/Switzerland) перемешивают поочередно с несколькими порциями диметилформамида (1600 мл) и изопропанола (1600 мл). После двух конечных промывок диметилформамидом смолу обрабатывают приготовленным заранее раствором 4-гидроксидифенилметилбензойной кислоты (91,3 г, 300 ммоль), моногидратом 1-гидроксибензотриазола (45,9 г, 300 ммоль) и диизопропилкарбодиимидом (75,7 г, 600 ммоль) в диме-тилформамиде (1600 мл). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч, и проводят нингидриновый тест. Результаты теста все еще свидетельствуют о наличии свободных аминогрупп, и поэтому добавляют диизопропилкарбодиимид (7,6 г, 60 ммоль), и реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Следующий нингидриновый тест утром оказывается отрицательным, и полученную реакционную смесь отфильтровывают. Полученную смолу поочередно промывают диметилформамидом и изопропанолом. Смолу сушат в вакууме, получая в результате 257 г сухой линкер-смолы. Полученный материал используют на следующей стадии синтеза без дальнейших анализов.
1В(2) Присоединение Fmoc-Leu-OH.
Получение Fmoc-Leu-линкер-смолы.
Осуществляют набухание линкер-смолы (190 г, 147,8 ммоль), перемешивая ее в толуоле (1400 мл). Растворитель отфильтровывают и заменяют раствором толуола (1400 мл) и ацетилхлорида (53 мл, 1478 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 2 ч, отфильтровывают, заменяют идентичной смесью и перемешивают в течение еще 2 ч перед тем, как отфильтровывают. Хлорированную смолу дважды промывают толуолом и трижды дихлорметаном.
В круглодонной колбе приготавливают раствор Fmoc-Leu-OH (104,8 г, 296 ммоль) и N-метилморфолина (49 мл, 444 ммоль) в дихлорметане (600 мл). Полученный раствор добавляют к смоле и перемешивают в течение ночи. Утром полученный раствор отфильтровывают, и смолу промывают поочередно дихлорметаном и изопропанолом. Полученную смолу сушат в вакууме и получают в результате 234,7 г сухой Fmoc-Leu-линкер-смолы. Содержание Fmoc-групп определяют как 0,787 ммоль/г, что приводит к выходу 185 ммоль (125% от теоретического). Аминокислотный анализ на выходе подтверждает наличие <0,1% D-Leu энантиомера.
1В(3) Присоединение Fmoc-Thr-OH.
Получение Fmoc -Thr-Leu-линкер-смолы.
Осуществляют набухание Fmoc-Leu-линкер-смолы (140 г, 109 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1100 мл) в течение 30 мин в каждой.
Fmoc защитную группу удаляют в результате двух последовательных промывок 20% пиперидином в диметилформамиде в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Добавляют фенолфталеин и воду к образцу раствора конечной промывки. Отсутствие розовой окраски подтверждает успешное удаление пиперидина.
Полученную смолу трижды промывают тетрагидрофураном (1200 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.
В круглодонной колбе получают раствор Fmoc-Thr-OH (112,1 г, 328 ммоль), моногидрата гидрокси-бензотриазола (51,25 г, 334 ммоль) и диизопропилкарбодиимида (51 мл, 655 ммоль) в тетрагидрофуране (600 мл). Полученный раствор добавляют к смоле и сразу проверяют значение рН (рН=6,5). Полученную
реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметилформамидом и изопропанолом. Небольшой образец полученной смолы сушат и отправляют на аминокислотный анализ (0,13% D-Leu, <0,1% D-Thr, <0,1% L-allo-Thr, <0,1% D-allo-Thr), остальной материал отправляют на следующую стадию без дополнительной сушки.
1В(4) Присоединение Fmoc-G1n(Trt)-ОН.
Получение Fmoc-G1n(Trt)-Thr-Leu-линкер-смольI.
Осуществляют набухание Fmoc-Thr-Leu-линкер-смолы с предшествующей стадии путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1100 мл) по 30 мин каждое.
Fmoc защитную группу удаляют в результате: двух последовательных промывок 20% пиперидином в диметилформамиде в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски доказывает успешное удаление пиперидина.
Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (1100 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.
В круглодонной колбе приготавливают раствор Fmoc-G1n(Trt)-ОН (138,6 г, 226 ммоль), HATU (86,2 г, 226 ммоль) и этилдиизопропиламина (58,4 г, 452 ммоль) в диметилформамиде (400 мл).
Полученный раствор добавляют к смоле и немедленно проверяют рН (рН=10). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч до тех пор, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу поочередно промывают диметилформамидом и изопропанолом.
Полученную смолу сушат в вакууме и получают в результате 170 г сухой Fmoc-Gln (Trt)-Thr-Leu-линкер-смолы. Содержание Fmoc-групп определяют как 0,60 ммоль/г, что соответствует выходу 102 ммоль (94% от теоретического в расчете на последние две стадии). Аминокислотный анализ на выходе дает следующие значения: (0,13% D-Leu, <0,1% D-Thr, <0,1% L-allo-Thr, <:0,1% D-allo-Thr, <0,8%
D-Gln).
1B(5) Присоединение изомасляной кислоты. Получение изобутирил-G1n(Trt)-Thr-Leu-линкер-смолы.
Осуществляют набухание Fmoc-G1n(Trt)-Thr-Leu-линкер-смолы (169 г, 101 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1300 мл) в течение 30 мин каждое.
Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (1300 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски доказывает успешное удаление пиперидина.
Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (1100 мл) для подготовки к следующей стадии присоединения.
В круглодонной колбе приготавливают раствор изомасляной кислоты (17,9 г, 203 ммоль), РуВОР (105,5 г, 203 ммоль) и этилдиизопропиламина (52,4 г, 406 ммоль) в диметилформамиде (550 мл).
Полученный раствор добавляют к смоле и немедленно контролируют рН (рН=9,5). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 ч до тех пор, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают ди-метилформамидом и изопропанолом.
Полученный продукт непосредственно передают на следующую стадию без дополнительной сушки и дополнительных анализов.
1В(6) Присоединение Fmoc-Ile-OH (получение сложного эфира).
Получение изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Fmoc)-Leu-линкер-смолы.
Осуществляют набухание изобутирил-Gln (Trt)-Thr-Leu-линкер-смолы (влажной с предшествующей стадии, 101 ммоль) путем перемешивания в трех последующих порциях дихлорметана (1200 мл) в течение 20 мин каждое. Растворитель отфильтровывают и MSNT (88 г, 297 ммоль) и Fmoc-Ile-OH (105 г, 297 ммоль) добавляют в твердом виде. Дихлорметан (500 мл) добавляют также как раствор N-метилимидазола (18,2 г, 223 ммоль) и этилдиизопропиламина (51,2 г, 396 ммоль) в дихлорметане (100 мл). Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч до тех пор, пока по данным ВЭЖХ реакция не завершается. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают последовательно тремя порциями дихлорметана, тремя порциями диметилформамида и тремя порциями изопропанола. Полученную смолу сушат в вакууме, и в результате получают 172 г сухой изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Fmoc)-Leu-линкер-смолы. Количество Fmoc определяют как 0,418 ммоль/г, что дает вывод в 72 ммоль (71% за последние две стадии).
1В(7) Присоединение Fmoc-N-метил-Tyr(tBu)-ОН.
Получение изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-линкер-смол^I (Предыдущее название: изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-N-me-Tyr(tBu)-Fmoc)-Leu-линкер-смола).
Осуществляют набухание изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Fmoc)-Leu-линкер-смолы (172 г, 72 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1300 мл) в течение 30 мин каждое. Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (1400 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски подтверждает успешное удаление пиперидина.
Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (1100 мл) для подготовки в следующей стадии присоединения.
Приготавливают раствор Fmoc-N-метил-Tyr(tBu)-ОН (68,7 г, 144 ммоль) и HATU (55,1 г, 144 ммоль) в диметилформамиде (700 мл) и добавляют к пептид-смоле, затем добавляют раствор этил-диизопропиламина (37,5 г, 289 ммоль) в диметилформамиде (100 мл) при перемешивании. рН контролируют немедленно после добавления сочетающего раствора и после 1 ч реакции получают тот же самый результат (рН 10). Полученный раствор перемешивают в течение 2 ч до тех пор, пока нингидриновый тест не свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметилформамидом и изопропанолом.
Полученный продукт непосредственно передают на следующую стадию реакции без сушки и дополнительных анализов.
1В(8) Присоединение Fmoc-Ile-OH.
Получение изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-Fmoc)-Leu-линкер-смол^I. (Использовавшееся ранее название: изобутирил-G1n(Trt)-Thr(1ie-N-me-Tyr(tBu)-I1e-Fmoc)-Leu-линкер-смола).
Осуществляют набухание влажной изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-линкер-смолы (72 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (1200 мл и 1300 мл) в течение 30 мин каждое. Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (1400 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.
Полученную смолу трижды промывают диметилформам:идом (1100 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.
В круглодонной колбе приготавливают раствор Fmoc-Ile-OH (103,9 г, 294 ммоль), COMU (125,9 г, 294 ммоль) и этилдиизопропиламина (76 г, 588 ммоль) в дихлорметане (440 мл) и диметилформамиде
(440 мл).
Полученный раствор добавляют к смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 20 ч. После этого времени проводят нингидриновый тест, который свидетельствует о завершении реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметил-формамидом и изопропанолом.
Полученную смолу сушат в вакууме, получая 185,5 г сухой изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-1ie-Fmoc)-Leu-линкер-смолы. Содержание Fmoc групп определяют как 0,40 ммоль/г. Таким образом получают количественный выход 74 ммоль.
1В (9) Присоединение синтона 1 и окончательное удаление Fmoc защитных групп.
Получение изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-синтон 1 -Н)-Leu-линкер-смолы.
(Использовавшееся раньше название: изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-N-me-Tyr-Ие-синтон ЬЩ-Leu-линкер-смола).
Осуществляют набухание изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-Fmoc)-линкер-смолы (30 г, 12 ммоль) путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (240 мл и 250 мл) в течение 30 мин каждое.
Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в диметилформамиде (250 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом. Фенолфталеин и воду добавляют к образцу конечного промывочного раствора. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.
Полученную смолу трижды промывают диметилформамидом (250 мл) для подготовки к следующей стадии сочетания.
В круглодонной колбе приготавливают раствор синтона 1 (14,6 г, 24,6 ммоль), РуВОР (12,85 г, 24,6 ммоль) и этилдиизопропиламина (6,4 г, 49,2 ммоль) в диметилформамиде (120 мл).
Полученный раствор добавляют к смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч. К этому времени нингидриновый тест подтверждает завершение реакции. Полученный раствор отфильтровывают, и полученную смолу промывают поочередно диметилформамидом и изопропанолом.
Осуществляют набухание полученного продукта пептид-смола путем перемешивания в двух последовательных порциях диметилформамида (250 мл) в течение 30 мин каждое.
Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные промывки 20% пиперидином в
диметилформамиде (250 мл) в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную пептид-смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок диметилформамидом и изопропанолом.
И наконец, пептид-смолу трижды промывают дихлорметаном (250 мл), подготавливая к отщеплению пептида.
1В(10) Отщепление пептида-предшественника 1 от твердого носителя.
Получение изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-синтон 1-H)-Leu-OH (=пептид-предшественник 1).
(Используемое раньше название: изобутирил-C1n(Trt)-Thr(I1e-N-me-Tyr(tBu)-I1e-синтон 1-Н)-Leu-
OH).
К влажной изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-синтон 1-Н)-Leu-линкер-смоле добавляют смесь уксусной кислоты (125 мл) и дихлорметана (125 мл), и полученную суспензию перемешивают в течение 2 ч. Полученную суспензию фильтруют, и полученный фильтрат собирают в круглодонную колбу (фильтрат 1). Полученную смолу дважды промывают дихлорметаном (250 мл), и полученные промывки объединяют с фильтратом 1.
Полученную смолу обрабатывают свежей порцией уксусной кислоты (125 мл) и дихлорметана (125 мл) в течение последующих 2 ч. Полученную суспензию фильтруют, и полученный фильтрат собирают в круглодонную колбу (фильтрат 2). Полученную смолу дважды промывают дихлорметаном (250 мл), и полученные промывки объединяют с фильтратом 2.
К смоле добавляют уксусную кислоту (200 мл) и дихлорметан (50 мл), и полученную суспензию перемешивают в течение ночи. Полученную суспензию фильтруют, и полученный фильтрат собирают как фильтрат 3.
Все три фильтрата обрабатывают отдельно для оценки эффективности способа отщепления. Полученные фильтраты концентрируют в роторном испарителе, и остатки уксусной кислоты удаляют, используя азеотропную перегонку с тремя порциями толуола (100 мл). Затем маслянистые остатки сушат в высоком вакууме, используя лиофилизатор. Выход: фильтрат 1: 12,5 г, фильтрат 2: 2,1 г, фильтрат 3:
0,3 г.
Сырой материал пептид-предшественника 1, очищают, используя RP-хроматографию, фракции концентрируют в роторном испарителе, и полученный концентрат сушат вымораживанием. Степень чистоты: 98,8% Выход: 8,5 г (48% для последних двух стадий). Полученный продукт характеризуют, используя 1Н-ЯМР, 13С-ЯМР и HR-MC Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру. ЯМР-спектры свидетельствуют о присутствии нескольких конформаций.
HR-MC: рассчитано для C85H116N8O13Si: [M+H]+: 1485,85039. Найдено: [М+Н]+;: 1485,84929.
Второй SPPS-синтез пептид-предшественника 1 с использованием хлорированной смолы
1В(11) Иммобилизация первой аминокислоты (Fmoc-Leu-OH).
Осуществляют набухание 2-хлортритилхлоридной смолы (30 г, L=1,2 ммоль/r; Merck Novabiochem 855017), используя 240 мл сухого DCM, в течение 10 мин, и затем растворитель сливают, твердофазный реакт, в круглодонной колбе смешивают Fmoc-Leu-OH (42,6 г, 120,8 ммоль) и 100 мл сухого 1,4-диоксана. Растворитель выпаривают в вакууме при 45°С, затем добавляют вторую порцию 1,4-диоксана. Растворитель снова выпаривают в вакууме при 45°С до тех пор, пока не получают бесцветный маслянистый остаток. К полученному маслянистому остатку затем добавляют последовательно сухой DCM (155 мл) и DIPEA (40,4 мл), полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей смоле и затем через 5 мин добавляют вторую порцию DIPEA (16,5 мл). Полученную суспензию перемешивают в течение 2 ч, и реакционную среду сливают. Для погашения потенциально непро-реагировавшего хлорида добавляют 240 мл гасящего раствора DCM/MeOH/DIPEA (70/15/15, об/об) и полученную смесь перемешивают в течение 10 мин. Измеряют загрузку 0,95 ммоль/г.
Общая схема удаления Fmoc.
К предварительно набухшей смоле добавляют 240 мл раствора 25% пиперидина в DMF, полученную суспензию перемешивают в течение 5 мин, и затем полученную реакционную смесь удаляют фильтрованием. Затем добавляют вторую порцию того же самого раствора пиперидина, полученную суспензию перемешивают в течение 15 мин, и затем растворитель удаляют фильтрованием. Смолу промывают и высушивают.
Полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (6x2 мин); 250 мл IPA (3x2 мин);
250 мл ТВМЕ (6x2 мин).
Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 35,7 г Н-Leu-смолы. 1В(12): SPPS-синтез H-Thr-Leu-смолы.
Осуществляют набухание Н-Leu-смолы (30 г) с предшествующей стадии, используя 270 мл DMF, в течение 30 мин, затем растворитель сливают.
В круглодонной колбе (RBF) смешивают Fmoc-Thr-OH (25,0 г, 73,2 ммоль), ВОР (40,4 г, 91,5 ммоль) и DMF (250 мл). Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют DI-
PEA (18,9 г, 146,4 ммоль). Полученную таким образом смесь добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 ч. Тест Кайзера оказывается положительным, и поэтому осуществляют второе присоединение в соответствии с раскрытыми выше условиями. Через 1,0 час тест Кайзера оказывается отрицательным, и поэтому считают, что реакция прошла полностью, и реакционную среду удаляют фильтрацией. Полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (4x2 мин); 250 мл IPA (3x2 мин);
250 мл ТВМЕ (5x2 мин).
Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 52,2 г Fmoc-Thr-Leu-смолы, подготовленной для удаления Fmoc. Удаление Fmoc.
Полученную смолу (52,2 г) суспендируют в 272 мл DMF и перемешивают в течение 1,0 ч, затем растворитель удаляют фильтрованием.
Fmoc защитную группу удаляют тем же способом, что раскрыт для 1В(11), и полученную пептид-смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (6x2 мин); 250 мл IPA (3x2 мин);
250 мл ТВМЕ (6x2 мин).
Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 39,9 г H-Thr-Leu-смолы. 1В(13): SPPS-синтез H-G1n(Trt)-Thr-Leu-смолы.
Осуществляют набухание H-Thr-Leu-смолы с предшествующей стадии (39,9 г), используя 270 мл DMF, в течение 30 мин, затем растворитель сливают.
В RBF смешивают Fmoc-G1n(Trt)-ОН (44,7 г, 73,2 ммоль), ВОР (40,4 г, 91,5 ммоль) и 250 мл DMF. Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют DIPEA [18,9 г, 14 6,4 ммоль). Полученную смесь добавляют одной порцией к предварительно набухшей H-Thr-Leu-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,5 ч, тест Кайзера оказывается отрицательным, поэтому считают, что реакция завершилась, и реакционную среду удаляют фильтрованием. Полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (4x2 мин); 250 мл IPA (3x2 мин); 250 мл DMF (4x2 мин).
Влажную пептид-смолу используют для стадии удаления Fmoc без каких-либо дополнительных манипуляций.
Удаление Fmoc.
Fmoc защитную группу удаляют в соответствии со способом:, раскрытым для стадии 1В(11). Затем полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (4x2 мин); 250 мл IPA (3x2 мин);
250 мл ТВМЕ (5x2 мин).
Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 54,4 г H-G1n(Trt)-Thr-Leu-смолы.
1B(14): SPPS-синтез изобутирил-G1n(Trt)-Thr-Leu-смолы.
Осуществляют набухание пептид-смолы с предшествующей стадии (54,4 г), используя 270 мл DMF, в течение 30 мин, затем растворитель сливают.
В RBF смешивают изомасляную кислоту (6,4 г, 7 3,2 ммоль), РуВор (38,1 г, 73,2 ммоль) и 230 мл DMF. Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют DIPEA (28,3 г, 219,6 ммоль). Полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч. Тест Кайзера оказывается отрицательным, поэтому реакцию считают завершенной, и реакционную среду удаляют фильтрованием. Полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (4x2 мин); 250 мл IPA (3x2 мин);
250 мл ТВМЕ (5x2 мин).
Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 55,8 г изобутирил-C1n(Trt-)-Thr-Leu-смолы.
1В(15): SPPS-синтез изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-H)-Leu-смолы.
Пептид-смолу с предшествующей стадии (55,8 г) суспендируют в 250 мл сухого DCM в течение 1,0 ч. Затем растворитель удаляют фильтрованием, и влажную пептид-смолу хранят в умеренном потоке азота при температуре 0-5°С.
В RBF смешивают Fmoc-Ile-OH (51,7 г, 146,4 ммоль) и 150 мл сухого диоксана. Растворитель выпа
ривают в вакууме при 45°С до тех пор, пока не образуется маслянистый остаток. Процесс дистилляции повторяют, и затем к остатку добавляют 150 мл сухого DCM, полученный раствор охлаждают до -10°С и добавляют MSNT (43,3 г, 146,4 ммоль), полученную суспензию перемешивают в течение 3 мин и затем добавляют N-метилимидазол (14,2 г, 173 ммоль). Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин, и полученный раствор добавляют по каплям за 10 мин к полученной ранее пептид-смоле. После завершения добавления полученную суспензию перемешивают в атмосфере азота в течение 2,0 ч. Полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMC (4x2 мин); 250 мл DMF (3x2 мин).
Влажную пептид-смолу используют на стадии удаления Fmoc без каких-либо дополнительных манипуляций.
Удаление Fmoc.
Fmoc защитную группу удаляют в соответствии со схемой, раскрытой для 1В(11). После удаления Fmoc полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (5x2 мин) 250 мл IPA (3x2 мин)
250 мл ТВМЕ (5x2 мин).
Полученную смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 57,2 г тобут^^^^^)-Thr(0-I1e-H)-Leu-смолу.
1В(16): SPPS-синтез изобутирил-G1n(Trt)-Thr(0-I1e-Tyr(tBu)MeN)-Leu-смол^I.
Пептид-смолу с предшествующей стадии (57,2 г) суспендируют в 250 мл DMF в течение 30 мин для набухания, затем растворитель удаляют фильтрованием.
В RBF смешивают Fmoc-NMeTyr(tBu)-ОН (52,0 г, 109,8 ммоль), HATU (41,7 г, 109,8 ммоль) и 230 мл DMF, и полученную смесь перемешивают в течение 2 мин. Затем добавляют DIPEA (28,3 г, 219,6 ммоль) и полученный раствор перемешивают в течение 2,0 мин. Полученный раствор затем добавляют к предварительно набухшей пептид-смоле.
Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 1,0 ч и проводят тест Кайзера. Тест Кайзера оказывается отрицательным. Поэтому реакцию считают прошедшей полностью, и реакционную среду удаляют фильтрованием.
Полученную пептид-смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (4x2 мин);
250 мл IPA (1x2 мин).
Влажную пептид-смолу используют на стадии удаления Fmoc без каких-либо дополнительных манипуляций.
Удаление Fmoc.
Fmoc защитную группу удаляют в соответствии с общей схемой, которую используют для 1В(11). После удаления Fmoc полученную смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (5x2 мин);
250 мл IPA (1x2 мин);
250 мл DMF (5x2 мин).
Полученную изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-H)-Leu-смолу используют на следующей стадии без сушки.
1В(17): SPPS-синтез изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-H)-Leu-смол^I.
Осуществляют набухание изобутирил-Gln (Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-H)-Leu-смолы с предшествующей стадии, используя 270 мл DMF в течение 30 мин, затем растворитель сливают.
В круглодонной колбе смешивают Fmoc-Ile-OH (38,8 г, 109,8 ммоль), HATU (41,7 г, 109,8 ммоль) и DMF (250 мл). Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют DIPEA (28,3 г, 219,6 ммоль). Полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,0 ч. Хлораниловый тест оказывается положительным, и затем осуществляют второе присоединение Fmoc-I1e-OH. Через 3 ч после второй реакции сочетания продукт пептид-смолу выделяют фильтрованием.
Продукт пептид-смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (4x2 мин); 250 мл IPA (3x2 мин); 250 мл DMF (4x2 мин).
Влажную пептид-смолу используют на стадии удаления Fmoc без каких-либо дополнительных манипуляций.
Удаление Fmoc.
Fmoc защитную группу удаляют тем же способом, что раскрыт для 1В(11) и пептид-смолу промывают следующим образом:
250 мл DMF (5x2 мин);
250 мл IPA (3x2 мин);
250 мл ТВМЕ (4x2 мин).
Полученную пептид-смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 67,0 г изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-H)-Leu-смолы.
1В(18): SPPS-синтез изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr (tBu) Me-Ile-синтон 1-H)-Leu-смолы.
Изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-H)-Leu-смолу с предшествующей стадии (33,5 г) суспендируют в 150 мл DMF в течение 30 мин, затем растворитель сливают. В RBF смешивают Fmoc-синтон 1-ОН (34,3 г, 57,8 ммоль), РуВор (30,0 г, 57,7 ммоль) и 113 мл DMF, Полученную смесь перемешивают в течение 2 мин и затем добавляют DIPEA (14,9 г, 115,2 ммоль). Полученный раствор добавляют одной порцией к предварительно набухшей пептид-смоле, и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 2,0 ч. Реакционную среду удаляют фильтрованием. Полученную пептид-смолу промывают следующим образом:
150 мл DMF (4x2 мин);
150 мл IPA (3x2 мин);
150 мл DMF (4x2 мин).
Влажную пептид-смолу используют на стадии удаления Fmoc без каких-либо дополнительных манипуляций.
Удаление Fmoc.
Fmoc защитные группы удаляют тем же способом, что и в 1В(11), но используя 150 мл пипериди-нового раствора, и полученную пептид-смолу промывают следующим образом: 150 мл DMF (5x2 мин); 150 мл IPA (3x2 мин); 150 мл ТВМЕ (4x2 мин).
Полученную пептид-смолу сушат в течение ночи в вакууме при 40°С, получая 36,0 г изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-синтон 1 -H)-Leu-смолы.
1В(19): Альтернативный SPPS-синтез: отщепление пептида от твердого носителя.
Изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-синтон 1-H)-Leu-смолу с предшествующей стадии (29,75 г) обрабатывают 350 мл сухого DCM в течение 1,0 ч, растворитель удаляют фильтрованием и затем добавляют 350 мл раствора 30% об/об HFIP в DCM. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин, и затем растворитель удаляют фильтрованием и отставляют в сторону. К полученной влажной смоле добавляют вторую порцию того же самого HFIP раствора, и полученный раствор перемешивают в течение 10 мин, затем растворитель удаляют фильтрованием и объединяют с полученным ранее раствором. Полученную смолу трижды промывают DCM (350 мл), и полученные промывки объединяют с растворами, использованными при отщеплении.
Объединенный раствор концентрируют в вакууме до образования маслянистого остатка и затем добавляют 200 мл толуола, растворитель выпаривают при пониженном давлении при 45°С до образования маслянистого остатка. Добавляют 350 мл гексана и полученную суспензию перемешивают в течение 2 ч. Растворитель удаляют фильтрованием, и фильтровальную лепешку промывают гексаном (50 мл), влажную фильтровальную лепешку сушат в течение ночи в вакууме при 35°С, получая 19,24 г сырого пептида-предшественника 1 (=изобутирил-G1n(Trt)-Thr(I1e-Tyr(tBu)Me-I1e-синтон 1-H)-Leu-OH).
Часть сырого пептида-предшественника 1 (6,0 г) очищают, используя RP-хроматографию, фракции полученного продукта концентрируют в роторном испарителе, концентрат сушат вымораживанием, получая 2,2 г чистого пептида-предшественника 1 со степенью чистоты 99,3%а. Содержащие продукт побочные фракции обрабатывают аналогичным образом, получая дополнительно 1,25 г менее чистого пептида-предшественника со степенью чистоты 71,4%а. Если экстраполировать к полному количеству сырого пептида-предшественника 1 (19,24 г), это будет соответствовать 7,05 г чистого пептида-предшественника 1 из основной фракции и дополнительно 4,01 г пептида-предшественника 1 (со степенью чистоты 71,4%а) из побочных фракций.
1С Жидкофазный синтез соединения 8.
Схема реакции 3:
1С(1) Синтез соединения 6.
(S)-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-3,9-ди((S)-втор-бутил)-12-(3-((трет-бутилдифенилсилил)окси)цропил)-15-изобутил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-1-окса-4,7,10,13,16 -пентаазацикло нонадекан-18 -ил) -2 -изобутирамидо -N5 -тритилпентандиамид.
Мутный раствор/суспензию пептида-предшественника 1 (1,9 г, 1,28 ммоль) в ацетонитриле (120 мл) добавляют в течение 90 мин к перемешиваемой смеси HATU (972 мг, 2,56 ммоль) и DMAP (468,6 мг, 3,84 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) при 35°С. Капельную воронку промывают ацетонитрилом (30 мл). Анализ IPC (ВЭЖХ) после добавления полученной суспензии свидетельствует об отсутствии пептида-предшественника и о завершении циклизации. Для окончательной обработки растворитель выпаривают при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 50 мл? и остаток разбавляют изопро-пилацетатом (250). Органическую фазу экстрагируют водой (2x100 мл) и растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая 2,3 г сырого продукта. Полученный сырой продукт очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле и этилацетат в качестве подвижной фазы, получая 1,79 г (1,22 ммоль) соединения 6 в виде пены. Выход: 95%. Полученный продукт характеризуют, используя 1Н-ЯМР, 13С-ЯМР и HR-MC. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру. ЯМР-спектры свидетельствуют о присутствии нескольких конформаций.
HR-MC: Рассчитано для C85H114N8O12Si: [M+H]+: 1467,83983; [M+NH4]+: 1484,86637; [M+Na]+: 1489,82177. Найдено: [М+Н]+: 1467,83984; [M+NH4]+: 1484,86555; [M+Na]+: 1489,82073.
Второй пример синтеза соединения 6 (в масштабе 15 г).
Раствор пептида-предшественника 1 (15,0 г) в трет-бутилметиловом эфире (750 мл) медленно добавляют в течение 1,5 ч к предварительно охлажденному раствору DMAP (2,80 г) и HATU (5,87 г) в аце-тонитриле (375 мл) при 0°С. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение дополнительных 30 мин при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь затем разбавляют трет-бутилметиловым эфиром (7 50 мл) и выливают в полунасыщенный водный раствор NaC1 (1500 мл). Образовавшиеся фазы разделяют, и органическую фазу снова экстрагируют полунасыщенным водным рас
твором NaC1 (1500 мл). Органический слой отделяют, и растворитель частично выпаривают при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 175 мл.
Полученный раствор фильтруют через силикагель (колонка с 225 г силикагеля), используя трет-бутилметиловый эфир в качестве подвижной фазы. В результате выпаривания растворителя: и сушки в вакууме при температуре 40-45°С получают соединение 6 со степенью чистоты 97,53% по данным ВЭЖХ. Выход: 14,19 г (95,7%).
1С(2) Синтез соединения 7.
(S)-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-3,9-ди((S)-втор-бутил)-12-(3-гидроксипропил)-15-изобутил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-1-окса-4, 7, 10, 13, 16-пентаазациклононадекан-18-ил)-2-изобутирами,цо-N5-тритилпентандиамид.
Соединение 6 (1,79 г, 1,22 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (60 мл) и добавляют Et3N(HF)3 (6,62 г, 41,1 ммоль) при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 8,5 ч, затем разбавляют изопропилацетатом (200 мл), и полученный раствор/суспензию медленно добавляют к интенсивно перемешиваемому насыщенному водному раствору NaHCO3. Органическую фазу выделяют и экстрагируют водой (100 мл). В результате выпаривания растворителя при пониженном давлении получают 1,86 г сырого продукта, который очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле и этилацетат/изопропанол (95:5) в качестве подвижной фазы, получая 1,24 г (1,00 ммоль) соединения 7. Выход: 82%.
Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.
HR-MC: Рассчитано для C69H96N8O12: [М+Н]+: 1229,72205; [M+NH4]+: 1246,74860; [M+Na]+:
1251,70399. Найдено: [М+Н]+: 1229,72128; [M+NH4]+: 1246,74780; [M+Na]+: 1251,70310.
Второй пример получения соединения 7 (в масштабе 14 г).
Соединение 6 (14,0 г, 9,537 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (220 мл) и добавляют трет-бутилметиловый эфир (116 мл). Полученный раствор обрабатывают Et3N(HF)3 (23,05 г) медленным добавлением в течение 10 мин. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную реакционную смесь разбавляют трет-бутилметиловым эфиром (570 мл), и полученную смесь выливают в полунасыщенный водный раствор NaHCO3 (632 мл). Двухфазную смесь перемешивают в течение 30 мин, и образовавшиеся фазы разделяют. Органическую фазу экстрагируют водой (280 мл). Обе водные фазы экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром (380 мл), и органические фазы объединяют. Органическую фазу сушат над безводным MgSO4 (8,0 г), и растворитель частично выпаривают при пониженном давлении до конечного объема приблизительно 100 мл. Добавляют толуол (140 мл), и растворитель снова выпаривают до конечного объема 80 мл. Полученный раствор разбавляют трет-бутилметиловым: эфиром (70 мл), и полученный продукт осаждают, медленно добавляя гептаны (140 мл) в течение 30 мин. Образовавшуюся суспензию нагревают до 50-55°С и перемешивают в течение 30 мин при указанной температуре. Полученную суспензию затем охлаждают до 0°С в течение 30 мин, перемешивают при 0°С в течение 2 ч, и полученный продукт выделяют фильтрованием. Полученный продукт, осадок белого цвета, сушат в вакууме, получая 11,08 г соединения 7. (94,5% выход). ВЭЖХ продукта свидетельствует о степени чистоты 97 а%.
1С(3) Синтез соединения 8 (см. структуру на схеме реакции 4).
(S)-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-3,9-ди((S)-втор-бутил)-15-изобутил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-12-(3-оксопропил)-1-окса-4,7,10,13,16-пентаазациклононадекан-18 -ил) -2 -изобутирамидо -N5 -тритилпентандиамид.
Соединение 7 (1,2 г, 0,98 ммоль) растворяют в смеси тетрагидрофурана (190 мл) и диметилсульфок-сида (62 мл). Добавляют 1-гидрокси-1,2-бензиодоксол-3(1Н)-он 1-оксид (IBX) (2,42 г, 45% г/г, 3,9 ммоль), и полученный раствор перемешивают в течение приблизительно 4,5 ч, после указанного времени по данным ВЭЖХ регистрируется исчезновение исходного материала (соединение 7). Полученную реакционную смесь затем выливают в насыщенный водный раствор NaHCO3 (300 мл) и экстрагируют дихлорметаном (2x300 мл). Органические слои объединяют и промывают водой (2x300 мл). В результате выпаривания растворителя при пониженном давлении получают 2,31 г сырого продукта в виде пены. Полученный сырой продукт очищают, используя флэш-хроматографию на силикагеле и этилаце-тат/изопропанол в качестве подвижной фазы (95:5), получая 1,16 г смеси продуктов, включающую по меньшей мере 2 продукта с необходимыми массами по данным ЖХ-МС. Полученную смесь продуктов используют, как она есть, на следующей стадии.
HR-MC (основной изомер): Рассчитано для C69H94N8O1: [M+H]+: 1227,70640; [M+NH4]+: 1244,73295; [M+Na]+: 1249,68834. Найдено: [М+Н]+: 1227,70599; [M+NH4]+: 1244,73200; [M+Na]+: 1249,68733.
HR-MC (неосновной изомер): Рассчитано для C69H94N8O12: [М+Н]+: 1227,70640; [M+NH4]+:
1244,73295; [M+Na]+: 1249,68834. Найдено: [М+Н]+: 1227,70598; [M+NH4]+: 1244,73198; [M+Na]+: 1249,68751.
Второй пример синтеза соединения 8 (в масштабе 10 г).
Соединение 7 (10,0 г, 8,13 ммоль) растворяют в тетрагидрофуране (127 мл) и диметилсульфоксиде (42 мл). К полученному раствору добавляют 1-гидрокси-1,2-бензиодоксол-3(1Н)-он 1-оксид (IBX) (15,18
г, 45% г/г, 24,4 ммоль) при интенсивном перемешивании при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь выливают в водный раствор NaHCO3 (500 мл) и добавляют этилацетат (250 мл). Полученную двухфазную смесь перемешивают в течение 30 мин, и слои разделяют. Органическую фазу промывают полунасыщенным водным раствором NaC1 (250 мл), и образовавшиеся слои разделяют. Водные слои экстрагируют этилацетатом (250 мл), и органические фазы объединяют. Объединенные органические фазы сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель частично выпаривают, получая приблизительно 50 г раствора. Полученный раствор обрабатывают, используя флэш-хроматографию на колонке с силикаге-лем (100 г силикагеля), используя этилацетат/метанол (98:2 об/об) в качестве подвижной фазы. Полученный таким образом раствор продукта (537,4 г) обрабатывают толуолом (135 мл), и полученный раствор концентрируют до 112 г конечной массы путем частичного выпаривания растворителя при 45°С при пониженном давлении. Полученный раствор охлаждают до 0°С и добавляют гептаны (135 мл) в течение 30 мин. Полученную таким образом суспензию перемешивают в течение 1 ч при 0°С, полученный продукт выделяют фильтрованием и промывают гептанами (2x30 мл). В конце полученный продукт сушат в вакууме при температуре 45°С в течение ночи, получая 8,824 г смеси соединения 8 и его гемиаминаль-ных изомеров. Выход: 88,4%. 1D Синтез соединения А.
(S)-N1-((2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2,8-ди-(S)-втор-бутил-21-гидрокси-5-(4-гидроксибензил)-15-изобутил-4,11-диметил-3,6,9,13,16,22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17-пентаазабицикло[16.3.1]докозан-12-ил)-2-изобутирамидопентандиамид.
Схема реакции 4:
Соединения 8 (2,0 г) растворяют в дихлорметане (400 мл) и полученный раствор охлаждают до 0°С. Трифторуксусную кислоту (115,9 г) добавляют к перемешиваемому раствору при 0°С и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч при 0°С. Дихлорметан (400 мл) добавляют при указанной температуре, затем добавляют воду (20 г). Полученную реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры, и перемешивание продолжают в течение дополнительно 5 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную реакционную смесь выливают в перемешиваемый раствор ацетата натрия (165,1 г) в воде (800 мл) и добавляют этилацетат (400 мл) для получения раствора. Верхний слой (водную фазу) удаляют, и нижнюю органическую фазу (дихлорметановую фазу) промывают водой (2x 200 мл). Водные слои экстрагируют этилацетатом (200 мл) и органические слои объединяют. Растворитель удаляют при пониженном давлении, получая сырое соединение А в виде смеси 5-и 6-кольцевых изомеров (см. схему реакции 5), в сопровождении тритилового спирта и других побочных продуктов указанной реакции.
Полученный сырой продукт очищают, используя хроматографию с обращенной фазой на силикаге-ле марки Silica Kromasil 100-10-С8, используя градиентное элюирование смесью ацетонитрил/вода, в качестве подвижной фазы. Фракции, содержащие полученный продукт выпаривают для удаления ацето-нитрила, осадок растворяют в этилацетате, и растворитель удаляют при пониженном давлении, получая 0,895 г соединения А; выход: 59,1%. Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ЯМР и МС, и спектры продукта оказываются идентичными спектрам соединения А, полученным ферментацией.
HR-MC: Рассчитано для C46H72O12N8: [M+H]+: 929,53425; [М+гШ^: 946,56080; [M+Na]+: 951,51619. Найдено: [М+Н]+: 929,53445; [M+NH4]+: 946,56129; [M+Na]+: 951,51624.
1H-ЯМP (600 МГц, с16-ДМСО) 5Н: -0,11 (3Н, Д, J=6,2 Гц), 0,64 (4Н, м), 0,77 (3Н, д, J=6,2 Гц), 0,81 (3Н, т, J=7,3 Гц), 0,84 (3Н, д, J=7,0 Гц), 0,88 (3Н, д, J=6, 6 Гц), 1,02 (3Н, д, J=6,7 Гц), 1,02 (1Н, м), 1,03 (3Н, д, J=6,7 Гц), 1,09 (1Н, м), 1,20 (3Н, д, J=6,2 Гц), 1,24 (1Н, м), 1,39 (1Н, м), 1,51 (1Н, м), 1,75 (6Н, м), 1,83 (1Н, м), 1,92 (1Н, м), 2,12 (2Н, м), 2,47 (1Н, м), 2,58 (1Н, м), 2,67 (1Н, м), 2,71 (3Н, с), 3,16 (1Н, д, J=14,2 Гц), 4,30 (1Н, м), 4,34 (1Н, м), 4,42 (1Н, д, J=10,6 Гц), 4,45 (1Н, м), 4,61 (1Н, д, J=9,2 Гц), 4,71 (1Н, дд, J=9,5, 5,5 Гц), 4,93 (1Н, с), 5,05 (1Н, дд, J=11,4, 2,6 Гц), 5,48 (1Н, м), 6,07 (1Н, д, J=2,6 Гц), 6,64 (2Н, д, J=8,4 Гц), 6,73 (1Н, с), 6,99 (2Н, д, J=8,4 Гц), 7,25 (1Н, с), 7,35 (1Н, д, J=9,2 Гц), 7,64 (1Н, д, J=9,5 Гц), 7,73 (1Н, д, J=9,2 Гц), 8,01 (1Н, д, J=7,7 Гц), 8,42 (1Н, д, J=8,8 Гц), 9,17 (1Н, с).
13С-ЯМР (150 МГц, а6-ДМСО) 5С: 10,35, СН3; 11,21, СН3; 13,85, СН3; 16,00, СН3; 17,68, СН3; 24,21, СН; 19,52, 2xСН3; 20,89, СН3; 21,75, СН2; 23,30, СН3; 23,74, СН2; 24,21, СН; 24,48, СН2; 27,35, СН2; 29,78, СН2; 30,08, СН3; 31,49, СН2; 33,18, СН; 33,24, СН2; 33,76, СН, 37,41, СН; 39,23, СН2; 48,84, СН; 50,69, СН; 52,11, СН; 54,17, СН; 54,70, СН; 55,31, СН; 60,66, СН; 71,89, СН; 73,97, СН; 115,32, 2xQI; 127,34, Cq; 130,37, 2xOT; 156,27, Cq; 169,12, Cq; 169,29, Cq; 169,37, Cq; 169,79, Cq; 170,65, Cq; 172,40, Cq; 172,53, Cq; 173,87, Cq; 176,38 Cq.
Второй пример синтеза соединения А (в масштабе 8,5 г) Соединение 8 (8,5 г, 6,924 ммоль) растворяют в дихлорметане (595 мл), и полученный раствор охлаждают до 0°С. К холодному раствору добавляют раствор трифторуксусной кислоты (127,5 мл) в дихлорметане (127,5 мл), поддерживая температуру при 0-5°С. Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 5,5 ч при 0°С и разбавляют ди-хлорметаном (850 мл) с последующим добавлением воды (42,5 мл). Полученную реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение 17,5 ч при комнатной температуре. Для окончательной обработки полученную реакционную смесь выливают в перемешиваемую двухфазную смесь водного ацетата натрия (169 г ацетата натрия в 722 г воды) и этилацетата (700 мл). Образовавшиеся фазы разделяют, и органическую фазу снова промывают водным раствором ацетата натрия (169 г ацетата натрия в 722 г воды). Образовавшиеся слои разделяют, и органическую фазу промывают водой (2x 850 мл). Индивидуальные водные фазы экстрагируют этилацетатом (700 мл), и органические слои объединяют. Органический слой сушат над безводным сульфатом магния, и растворитель частично выпаривают при 40-45°С при пониженном давлении, получая 187 г жидкой суспензии. В течение 15 мин добавляют гептан (187 г) и образовавшуюся суспензию охлаждают до 0°С. Полученную суспензию перемешивают в течение 1 ч при 0°С, и полученный продукт выделяют фильтрованием. Полученный сырой продукт сушат в вакууме при температуре 40°С, получая 5,65 г сырого соединения А. Выход (сырой продукт): 87,8%.
0,96 г полученного сырого продукта очищают, используя хроматографию с обращенной фазой на силикагеле марки Si1ica Kromasi1 100-10-C8, используя градиент смеси ацетонитрил/вода в качестве подвижной фазы. Фракции, содержащие полученный продукт, выпаривают для удаления ацетонитрила, осадок растворяют в этилацетате, и растворитель частично удаляют при пониженном давлении, получая 40 г раствора. К перемешиваемому раствору добавляют гептан (40 г) в течение 30 мин при комнатной температуре, и полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение дополнительно 2 ч. Полученный продукт выделяют фильтрованием и промывают смесью этилацетат/гептан (1:1, 2x10 мл). Полученный продукт сушат в вакууме при температуре 40-45°С в течение 16 ч, получая 0,702 г соединения А. Выход после RP-хроматографии и осаждения: 64%.
Пример 2.
Синтез соединения В (Ностопептин BN920) ^^-ацетамидо-^-
((1S,2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2-бензил-21-гидрокси-5-(4-гидроксибензил)-15-изобутил-8-изопропил-4,11-диметил-3, 6, 9,13,16, 22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17-пентаазабицикло[16.3.1]докозан-12-ил)пентандиамид.
Реакционная схема 5:
Соединение В (Ностопептин BN920)
2А Синтез пептида-предшественника 2 с помощью SPPS: Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-Tyr(tBu)Me-Phe-синтон 1-H)-Leu-OH.
Оборудование: пептидный синтезатор, снабженный 250 мл стеклянным реактором с фриттой и устройством для автоматической доставки растворителя, встряхивания и отсоса реагентов. 2А(1) Синтез Fmoc-Thr-Leu-Trt-Tentage1-S.
Осуществляют набухание Fmoc-Leu-Trt-Tentagel-S-смолы (18,7 г загрузка 0,37 ммоль/г (поставщик Rapp Polymere GmBH, Tubingen/Germany)) в DMF путем встряхивания в течение 30 мин.
Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидинолом в DMF в течение 5 мин и 15 мин соответственно. После промывки смолы с использованием нескольких чередующихся промывок DMF и изопропанолом полное удаление оснований проверяют по отсутствию розовой окраски после добавления фенолфталеина и воды на последней стадии промывки.
4,7 г Fmoc-Thr-OH, 5,26 г HATU и 1,8 г DIPEA растворяют в 50 мл DMF. После 5 мин перемешивания дополнительно добавляют 1,8 г DIPEA. После проверки величины рН (> 11) полученную смесь добавляют к смоле с удаленными защитными группами и встряхивают в течение 2 ч. Данные проведенного теста Кайзера оказываются ОК, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся
промывок DMF и изопропанолом. После сушки масса полученной смолы равна 19,01 г. Отделяют небольшой образец и исследуют с помощью ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.
2А(2) Синтез Fmoc-G1n(Trt)-Thr-Leu-Trt-Tentage1-S.
19,01 г Fmoc-Thr-Leu-Trt-Tentagel-S-смолы (6,6 ммоль) предварительно набухает в DMF, и Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в DMF в течение 5 мин и 15 мин соответственно. После промывки смолы с использованием нескольких чередующихся промывок DMF и изопропанолом полное удаление оснований контролируют по отсутствию розовой окраски после добавления фенолфталеина и воды на последней стадии промывки.
8,07 г Fmoc-G1n(Trt)-ОН, 5,01 г HATU и 3,4 г DIPEA растворяют в 50 мл DMF. После проверки значения рН (> 11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 1,5 ч. Проведенный тест Кайзера оказался OK, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, только небольшой образец отбирают и анализируют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.
2А(3) Синтез Ac-G1n(Trt)-Thr-Leu-Trt-Tentage1-S Снова осуществляют набухание смолы Fmoc-G1n(Trt)-Thr-Leu-Trt-Tentage1-S из полученной выше в DMF путем встряхивания в DMF в течение 10 мин. Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в DMF в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. К образцу конечного промывочного раствора добавляют фенолфталеин и воду. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.
0,774 г уксусной кислоты, 6,707 г РуВОР и 3,33 г DIPEA растворяют в 50 мл DMF. После проверки рН (> 11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2,5 ч. Проведенный тест Кайзера оказывается OK, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и проверяют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик демонстрирует успешное превращение.
2А(4) Синтез Ac-G1n (Trt)-Thr(Va1-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S (использовавшееся ранее название: Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S) (превращение в сложный эфир боковой цепи).
Снова осуществляют набухание полученной выше Ac-G1n(Trt)-Thr-Leu-Trt-Tentage1-S смолы в DMF путем встряхивания в DMF в течение 10 мин.
8,7 г Fmoc-Va1-OH и 8,3 г DIPEA растворяют в 25 мл DCM. Параллельно 2,76 г MSNT растворяют в других 25 мл DCM. Оба раствора объединяют, и после 3 мин предварительной активации переносят к пептидной смоле и встряхивают в течение 2 ч. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и проверяют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик подтверждает успешное превращение.
2А(5) Синтез Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S (использовавшееся ранее название: Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-N-me-Tyr(tBu)-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S).
Осуществляют повторное набухание полученной выше Ас-G1n(Trt)-Thr(Va1-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S смолы в DMF путем встряхивания в DMF в течение 10 мин.
Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в DMF в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. К образцу конечного промывочного раствора добавляют фенолфталеин и воду. Отсутствие розовой окраски доказывает успешное удаление пиперидина.
6,1 г Fmoc-N-Me-Tyr(tBu)-ОН, 4,8 г HATU и 3,3 г DIPEA растворяют в 50 мл DMF. После проверки значения рН (> 11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2,5 ч. Проведенный тест Кайзера оказывается OK, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. Полученную смолу используют непосредственно на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и анализируют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.
2А(6) Синтез Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-Tyr(tBu)Me-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S (использовавшееся ранее название: Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-N-me-Tyr(tBu)-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S).
Осуществляют повторное набухание полученной выше Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-Tyr(tBu)Me-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S смолы в DMF путем встряхивания в DMF в течение 10 мин.
Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в DMF в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. К образцу конечного промывочного раствора добавляют фенолфталеин и воду. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.
9,66 г Fmoc-Phe-OH, 9,48 г HATU и 6,4 г DIPEA растворяют в 100 мл DMF. После проверки значе
ния рН (> 11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2 ч. Проведенный тест Кайзера дает OK, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. Полученную смолу непосредственно используют на следующей стадии, представленной далее, и только небольшой образец отбирают и проверяют, используя ВЭЖХ. Единственный основной пик свидетельствует об успешном превращении.
2А(7) Синтез Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-Tyr(tBu)Me-Phe-синтон 1-H)-Leu-0H (использовавшееся ранее название: Ac-G1n(Trt)-Thr(Va1-N-me-Tyr(tBu)-Phe-синтон 1-H)-Leu-OH) (=пептид-предшественник 2).
Осуществляют повторное набухание полученной выше Ас-G1n(Trt)-Thr(Va1-Tyr(tBu)Me-Phe-Fmoc)-Leu-Trt-Tentage1-S смолы в DMF путем встряхивания в DMF в течение 10 мин.
Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в DMF в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. К образцу конечного промывочного раствора добавляют фенолфталеин и воду. Отсутствие розовой окраски свидетельствует об успешном удалении пиперидина.
6,77 г синтона 1, 5,9 г РуВОР и 2,95 г DIPEA растворяют в 100 мл DMF. После проверки значения рН (> 11) полученную смесь добавляют к смоле, у которой удалены защитные группы, и встряхивают в течение 2 ч. Проводят тест Кайзера, который дает OK, и полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. После того, как отбирают небольшой образец для анализа с помощью ВЭЖХ, Fmoc защитную группу удаляют, используя две последовательные обработки 20% пиперидином в DMF в течение 5 мин и 15 мин соответственно. Полученную смолу промывают, используя несколько чередующихся промывок DMF и изопропанолом. В конце полученную смолу дважды промывают DCM. Отщепление синтезированного пептида от полученной смолы осуществляют путем встряхивания в смеси 80% уксусной кислоты в DCM в течение ночи. Полученный пептидный раствор отфильтровывают, и полученную смолу дважды промывают DCM. Объединенные фильтраты выпаривают и окончательно очищают, используя RP-хроматографию, используя систему градиентного элюи-рования. Собранные фракции анализируют, используя ВЭЖХ, и чистые фракции объединяют, выпаривают и в конце лиофилизируют.
Выход: 3,54 г (42%) пептида-предшественника 2.
HR-MC: Рассчитано для C85H108N8O13Si: [М+Н]+=1477, 78779; Найдено: [М+Н]+=1477,78691. 2В Синтез соединения В.
(S)-2-ацетамидо-N1-((1S,2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2-бензил-21-гидрокси-5-(4-гидроксибензил)-15-изобутил-8-изопропил-4,11-диметил-3,6,9,13,16,22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17-пентаазабицикло[16.3.1]докозан-12-ил)пентандиамид.
2В(0) Синтез соединения 9.
^Н-ацетамидо-^Ч^, 6S, 9S,12S,15S, 18S, 19R)-9-бензил-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-12-(3-((трет-бутилдифенилсилил)окси)пропил)-15-изобутил-3-изопропил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-1-окса-4,7,10,13, 16-пентаазациклононадекан- ^-ил^^-тритилпентандиамид.
Лактамизацию пептида-предшественника 2 до получения соединения В осуществляют в условиях, аналогичных условиям, раскрытым для получения соединения 6. Полученный продукт, соединение 9, полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.
HR-MC: Рассчитано для C85H106N8O12Si: [М+Н]+: 1459,77723; [M+NH4]+: 1476,80377. Найдено: [М+Н]+: 1459,77719; [M+NH4]+: 1476,80291. 2В(1) Синтез соединения 10.
(S)-2-ацетамидо-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-9-бензил-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-12-(3-гидроксипропил)-15-изобутил-3-изопропил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-1-окса-4,7,10,13,16-пентаазациклононадекан- 18-ил)-N5-тритилпентандиамид.
Реакцию десилилирования для получения соединения 10 осуществляют в условиях, аналогичных условиям, раскрытым для получения соединения 7. Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.
HR-MC: Рассчитано для C69H88N8O12: [M+H]+: 1221,65945; [M+NH4]+: 1238,6860; [M+Na]+:
1243,64139. Найдено: [М+Н]+: 1221,65894; [M+NH4]+: 1238,68518; [M+Na]+: 1243,64001.
2В(2) Синтез соединения 11 (альдегид).
(S)-2-ацетамидо-N1-((3S,6S,9S,12S,15S,18S,19R)-9-бензил-6-(4-(трет-бутокси)бензил)-15-изобутил-3-изопропил-7,19-диметил-2,5,8,11,14,17-гексаоксо-12-(3-оксопропил)-1-окса-4,7,10,13,16-пентаазациклононадекан- ^-ил^^-тритилпентандиамид.
Окисление соединения 10 с получением соединения 11 осуществляют в условиях, аналогичных условиям, раскрытым для получения соединения 8. ЖХ-МС анализ демонстрирует несколько пиков с искомыми массами, что указывает на присутствие смеси альдегида, 5-кольцевого-гемиаминала и 6-кольцевого-гемиаминала. Полученную смесь используют, как она есть, на следующей стадии. HR-MC (основной пик): Рассчитано для C69H86N8O12 [М+Н]+: 1219,64380; [М+NH4]+: 1236,67035; [M+Na]+: 1241,62574. Найдено: [М+Н]+: 1219,64404; [M+NH4]+: 1236,67053; [M+Na]+: 1241,62524.
2В(3) Синтез соединения В (Ностопептина BN920) из соединения 11.
(S)-2-ацетамидо-N1-((1S,2S,5S,8S,11R,12S,15S,18S,21R)-2-бензил-21-гидрокси-5-(4-гидроксибензил)-15-изобутил-8-изопропил-4,11-диметил-3, 6, 9,13,16, 22-гексаоксо-10-окса-1,4,7,14,17-пентаазабицикло[16.3.1]докозан-12-ил)пентандиамид.
Соединение (соединения) 11 (1,0 г, 0,82 ммоль) растворяют в дихлорметане (200 мл). Добавляют трифторуксусную кислоту (57,8 г) при температуре от 15 до 25°С в течение 10 мин и полученную реакционную смесь перемешивают в течение 45 ч при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь затем разбавляют дихлорметаном (200 мл) и добавляют воду (10 мл). Перемешивание продолжают в течение дополнительных 24 ч при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь выливают в насыщенный водный раствор NaHCO3 (7 00 мл) в течение 20 мин и добавляют последовательно ди-хлорметан (500 мл), изопропанол (50 мл) и воду (500 мл). Образовавшиеся слои разделяют, и водный слой экстрагируют раствором изопропанола (50 мл) в дихлорметане (500 мл). Образовавшиеся слои снова разделяют, и водный слой экстрагируют несколько раз дихлорметаном (5x300 мл). Органические слои объединяют, и растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая сырую смесь продуктов (1,0 г), включающую искомый Ностопептин BN920 наряду с тритиловым спиртом и другими побочными продуктами реакции. Полученный сырой продукт счищают, используя хроматографическую обработку на силикагеле и дихлорметан/изопропанол в качестве подвижной фазы, получая чистый Ностопептин BN920 (212 мг, 97% (А) степень чистоты). Сбор менее чистых фракций дает дополнительно 402 мг продукта степени чистоты 90% (А). Выход из всех фракций: 614 мг (81%). Полученный продукт полностью охарактеризован по данным ИК, ЯМР и МС. Полученные спектры подтверждают предполагаемую структуру.
HR-MC: Рассчитано для C46H64N8O12: [М+Н]+: 921,47165; [M+NH4]+: 938,49820; [M+Na]+: 943,45359. Найдено: [М+Н]+: 921,47167; [M+NH4]+: 938,49861; [M+Na]+: 943,45337.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения циклического депсипептидного соединения формулы I
где A1 представляет собой двухвалентный фрагмент аминокислоты с концевой карбоксильной или карбамоильной группой и связан с правой стороны в формуле I через карбонил с остальной частью молекулы или представляет собой С1-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-С1-8-алканоил;
X связан через N фрагмента А1 и представляет собой ацил, выбранный из ацетила или изобутирила, или отсутствует, если А1 представляет собой С1-8-алканоил или фосфорилированный гидрокси-С1-8-алканоил;
R2 представляет собой С1-8-алкил;
R3 представляет собой боковую цепь лейцина, изолейцина или валина; R5 представляет собой боковую цепь фенилаланина или изолейцина; R6 представляет собой боковую цепь гидроксиаминокислоты; R7 представляет собой боковую цепь изолейцина или валина; Y представляет собой водород или С1-8-алкил; или его соли;
причем указанный способ включает селективное удаление защитных групп из соединения формулы
где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и X*, A1*, R2*, R3*, R5*, R6* и R7* соответствуют значениям X, A1, R2, R3, R5, R6 и R7 в формуле I соответственно, но при условии, что реакционноспособные функциональные группы у указанных фрагментов присутствуют в защищенной форме, по меньшей мере, если они могут принимать участие в нежелательных побочных реакциях, с получением в результате соединения формулы III
где X*, А1*, R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют указанные выше значения;
взаимодействие свободной гидроксильной группы в условиях окисления с получением соединения формулы IV
и удаление оставшихся защитных групп с получением соединения формулы I, или его соли.
2. Способ по п.1, где свободное основание соединения формулы I превращают в соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в другую соль соединения формулы I, или соль соединения формулы I превращают в свободное основание соединения формулы I.
3. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают взаимодействием соединения формулы VI
2.
где Prot представляет собой силильную защитную группу, Y имеет значения, указанные для соединения формулы I, и R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, с кислотой формулы VII
или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты формулы VII;
где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X* и где X* и А1* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и, если X** представляет собой аминоза-щитную группу, осуществляют удаление указанной аминозащитной группы Х** для получения H вместо X* и осуществляют реакцию сочетания полученной аминогруппы с группой ацила X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или ее реакционноспособным производным, представляющим собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры кислоты Х*-ОН.
4. Способ по п.3, где соединение формулы VI получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы VIII
где Prot* представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, и которая остается стабильной на стадиях удаления защитных групп во время синтеза указанного линейного пептида-предшественника, и R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы VI в п.3, с последующим удалением in situ указанной защитной группы Prot* и получением соединения формулы VI;
где Prot* выбирают из группы, состоящей из С3-С8-алк-2-енилоксикарбонильных групп.
5. Способ по п.4, где указанный линейный пептид-предшественник формулы VIII синтезируют из
соответствующих аминокислот, используя твердофазный пептидный синтез и последующее отщепление
полученного пептида от используемого твердого носителя.
6. Способ по п.5, где соединение формулы VIII получают в варианте а)
сочетанием аминокислоты формулы IX
акционноспособного производного указанной аминокислоты, через кислород с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES;
удалением указанной защитной группы Prot**;
сочетанием полученной аминокислоты, связанной со смолой и представленной формулой X
где Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, R2* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, осуществляя реакцию сочетания связанного со смолой дипептида, представленного формулой
XII
где Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, R2* и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, через свободную гидроксигруппу с аминокислотой формулы XIII
где Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, R7* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**;
или, в варианте b),
сочетанием дипептида формулы XXVII
0 XXVII
где R3* и Prot** имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, или реакционноспособного производного указанного ди-пептида, с аминоацильным фрагментом, связанным через кислород, с отщепляемым линкером L, который связан с твердой смолой RES, формулы X
который получают, как раскрыто в варианте а), где RES и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы IX, и удаление указанной защитной группы Prot**;
после осуществления реакции по варианту а) или по варианту b) осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XIV
XIV
где R2*, R3* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.5, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения фюрмулы X, с аминокислотой формулы XV
о Prot"
где R6* и Y имеют значения, указанные для соединения формулы II по п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**;
осуществляют реакцию сочетания получаемого соединения формулы XVI
где Y, R2*, R3*, R7* и R6* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с аминокислотой формулы XVII
"и XVII
где R5* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты, и удаление указанной защитной группы Prot**;
осуществляют реакцию сочетания полученного соединения формулы XVIII
где Y, R2*, R3*, R7*, R6* и R5* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X, с синтоном формулы XIX
Prot*'
где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы IX, или с активированным производным указанного синтона, и удаление защитной группы Prot** с получением соединения формулы XX
где Prot, Y, R2*, R3*, R7*, R6* и R5* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, Prot* имеет значения, указанные для соединения формулы VIII в п.4, и n, L и RES имеют значения, указанные для соединения формулы X;
отщепляют связанный с твердой фазой пептид формулы XX от указанной твердой фазы L-RES с получением соответствующего соединения формулы VIII;
где реакционноспособные производные аминокислот IX, XI, XIII, XXVII, XV, XVII и XIX представляют собой независимо их хлорангидриды, фторангидриды, ангидриды или нитрофениловые эфиры;
где Prot представляет собой силильную защитную группу, Prot* выбирают из группы, состоящей из С3-С8-алк-2-енилоксикарбонильных групп, и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
7. Способ по п.1 или 2, где соединение формулы II получают циклизацией в условиях лактамизации линейного пептида-предшественника соединения формулы XXV
где X*, A1*, R2*, R3*, R5*, R6*, R7* и Prot имеют значения, указанные для соединения формулы II в
п.1.
8. Способ по п.7, где соединение формулы XXV получают расщеплением соединения формулы
XXIV
где X*, A1*, R2*; R3*, R5*, R6*, R7* и Prot имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число и Prot** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить без одновременного удаления указанной защитной группы Prot, причем продукт остается на смоле, и удаляют защитную группу Prot**, перед отщеплением, одновременно с ним или после него, с получением указанного соединения формулы XXV;
где Prot представляет собой силильную защитную группу и Prot** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
9. Способ по п.8, где соединение формулы XXIV получают сочетанием аминокислоты формулы
XIX
где Prot имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot** имеет значения, указанные для соединения формулы XXIV в п.8, или активированного производного указанной аминокислоты, которое представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIX, с соединением формулы XXIII
где X*, A1*, R2*, R3*, R5*, R6* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число.
10. Способ по п.9, где соединение формулы XXIII получают сочетанием аминокислоты формулы
XVII*
где X*, A1*, R2*, R3*, R6* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты XVII* представляет собой хлорангидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XVII*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
11. Способ по п.10, где соединение формулы XXII получают сочетанием аминокислоты формулы
собой аминозащитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутст-
XV*
где X*, А1*, R2*, R3* и R7* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, и удаление указанной защитной группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты XV* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XV*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
12. Способ по п.11, где соединение формулы XXI получают осуществлением взаимодействия аминокислоты формулы XIII*
XXVI
где X, A1*, R2* и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число;
удаляют указанные защитные группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты XIII* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XIII*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
13. Способ по п.12, где соединение формулы XXVI получают сочетанием связанного со смолой ди-пептида, представленного формулой XII*
XII*
где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные защитные группы, присутствующие в соединении формулы II, как определено в п.1, причем продукт остается при этом на смоле, R2* и R3* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, после удаления указанной защитной группы Prot**** через полученную таким образом свободную аминогруппу, с кислотой формулы VII
где X** представляет собой аминозащитную группу или представляет собой X*, где X* и А1* имеют значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной кислоты; и
если X** представляет собой аминозащитную группу, удаление указанной аминозащитной группы X** до получения H вместо X* и осуществление реакции сочетания полученной аминогруппы с ациль-ной группой X*, используя соответствующую кислоту Х*-ОН, где X* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или реакционноспособное производное указанной кислоты;
где реакционноспособное производное аминокислот VII* или Х*-ОН представляет собой хлоран-гидрид, фторангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты VII* или Х*-ОН соответственно;
где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
14. Способ по п.13, где соединение формулы XII получают сочетанием связанной со смолой аминокислоты, представленной формулой X
где R3* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, L представляет собой отщепляемый линкер, RES представляет собой твердую смолу, n представляет собой натуральное число, с аминокислотой формулы XI*
где Prot**** представляет собой защитную группу, которую можно селективно удалить, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, и R2*
имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, или с реакционноспособным производным указанной аминокислоты;
где реакционноспособное производное аминокислоты XI* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты XI*;
где Prot**** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
15. Способ по п.14, где связанную со смолой аминокислоту формулы X получают сочетанием аминокислоты формулы IX*
где R3* имеет значения, указанные для соединения формулы II в п.1, и Prot*** представляет собой аминозащитную группу, которую можно удалить селективно, не затрагивая остальные присутствующие защитные группы, причем продукт при этом остается на смоле, или реакционноспособного производного указанной аминокислоты формулы IX, с гидроксигруппой, связанной через отщепляемый линкер L, который связан с твердой смолой RES, и удаление указанной защитной группы Prot***;
где реакционноспособное производное аминокислоты IX* представляет собой хлорангидрид, фто-рангидрид, ангидрид или нитрофениловые эфиры аминокислоты IX*;
где Prot*** выбирают из группы, состоящей из флуоренил-9-илметоксикарбонила (Fmoc); 2-(2' или 4'-пиридил)этоксикарбонила и 2,2-бис-(4'-нитрофенил)этоксикарбонила.
16. Способ по любому из пп.1-15, где указанные символы А1, R2, R3, R5, R6, R7 X и Y или соответствующие незащищенные или защищенные фрагменты R2*, R3*, R5*, R6*, R7*, X* и Y3 выбирают таким образом, что в полученном соединении формулы I или в его соли
A1 представляет собой двухвалентный радикал L-глутамина, связанный через карбонил его а-карбоксигруппы с аминогруппой справа от A1 в формуле I и через его а-аминогруппу с X, или представляет собой 2S-(2-гидрокси-3-фосфоноокси)пропионил;
R2 представляет собой метил;
R3 представляет собой изобутил;
R5 представляет собой втор-бутил или бензил;
R6 представляет собой 4-гидроксибензил;
R7 представляет собой изопропил или втор-бутил;
X представляет собой ацетил или изобутирил или отсутствует, если A1 представляет собой 2S-(2-гидрокси-3 -фосфоноокси)пропионил; Y представляет собой метил.
17. Соединение формулы 6
17.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025546
025546
- 1 -
- 3 -
025546
025546
- 4 -
- 2 -
025546
025546
соединение формулы IV предпочтительно представляет соединение формулы IVA
- 12 -
соединение формулы IV предпочтительно представляет соединение формулы IVA
- 12 -
025546
025546
соединение формулы XII предпочтительно представляет соединение формулы XIIA
- 13 -
соединение формулы XII предпочтительно представляет соединение формулы XIIA
- 13 -
025546
025546
соединение формулы XVII предпочтительно представляет соединение формулы XVIIA
- 14 -
соединение формулы XVII предпочтительно представляет соединение формулы XVIIA
- 14 -
025546
025546
соединение формулы XXI предпочтительно представляет соединение формулы XXIA
- 16 -
- 15 -
025546
025546
соединение формулы XXI предпочтительно представляет соединение формулы XXIA
- 16 -
- 17 -
025546
025546
- 18 -
- 18 -
025546
025546
- 51 -
- 51 -