|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Способ лечения и/или предупреждения нейродегенеративного нарушения или заболевания у субъекта, включающий идентификацию субъекта, страдающего или подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой деменции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона, и введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль  где R a и R b вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5-членное карбоциклическое кольцо; R 2 представляет собой фенил, замещенный одним-тремя атомами фтора; R 3 представляет собой метил или С (1-3) алкил, замещенный NR 8 R 9 ; или R 3 представляет собой Het-С (0-2) алкил, в котором Het представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, имеющее N, и в котором N не замещен или замещен C (1-6) алкилом; R 4 и R 5 вместе образуют составляющую 4-(4-трифторметилфенил)фенил; R 8 и R 9 , которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из группы, состоящей из водорода и С (1-6) алкила; X представляет собой S. 2. Способ по п.1, в котором субъектом является млекопитающее. 3. Способ по п.1, в котором соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой 1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он (SB480848) или его соль. 4. Способ по п.1, дополнительно включающий оценку когнитивной функции указанного субъекта после введения фармацевтической композиции, содержащей агенты, ингибирующие Lp-PLA 2 . 5. Способ по п.1, дополнительно включающий мониторинг лечения путем оценки мозгового кровотока или функционирования гематоэнцефалического барьера. 6. Способ по п.1, дополнительно включающий введение субъекту дополнительных терапевтических средств. 7. Способ по п.6, в котором дополнительными терапевтическими средствами являются донепезил, такрин, ривастигмин, галантамин, противоамилоидная вакцина, понижающие Абета терапии, умственное упражнение или стимуляция. 8. Способ по п.1 или 2, в котором субъектом является человек. 9. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой сосудистую деменцию. 10. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Паркинсона. 11. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Хантингтона. 12. Применение фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения нейродегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой деменции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Способ лечения и/или предупреждения нейродегенеративного нарушения или заболевания у субъекта, включающий идентификацию субъекта, страдающего или подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой деменции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона, и введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль где R a и R b вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5-членное карбоциклическое кольцо; R 2 представляет собой фенил, замещенный одним-тремя атомами фтора; R 3 представляет собой метил или С (1-3) алкил, замещенный NR 8 R 9 ; или R 3 представляет собой Het-С (0-2) алкил, в котором Het представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, имеющее N, и в котором N не замещен или замещен C (1-6) алкилом; R 4 и R 5 вместе образуют составляющую 4-(4-трифторметилфенил)фенил; R 8 и R 9 , которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из группы, состоящей из водорода и С (1-6) алкила; X представляет собой S. 2. Способ по п.1, в котором субъектом является млекопитающее. 3. Способ по п.1, в котором соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой 1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он (SB480848) или его соль. 4. Способ по п.1, дополнительно включающий оценку когнитивной функции указанного субъекта после введения фармацевтической композиции, содержащей агенты, ингибирующие Lp-PLA 2 . 5. Способ по п.1, дополнительно включающий мониторинг лечения путем оценки мозгового кровотока или функционирования гематоэнцефалического барьера. 6. Способ по п.1, дополнительно включающий введение субъекту дополнительных терапевтических средств. 7. Способ по п.6, в котором дополнительными терапевтическими средствами являются донепезил, такрин, ривастигмин, галантамин, противоамилоидная вакцина, понижающие Абета терапии, умственное упражнение или стимуляция. 8. Способ по п.1 или 2, в котором субъектом является человек. 9. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой сосудистую деменцию. 10. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Паркинсона. 11. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Хантингтона. 12. Применение фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения нейродегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой деменции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона.
Евразийское 025527 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2017.01.30
(21) Номер заявки 201400009
(22) Дата подачи заявки 2007.05.11
(51) Int. Cl.
A61K31/513 (2006.01) A61P25/28 (2006.01) A61P25/16 (2006.01) A61P25/14 (2006.01)
(54)
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И НАРУШЕНИЙ
(43) 2014.09.30
(62) 200971050; 2007.05.11
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ТОМАС ДЖЕФФЕРСОН ЮНИВЕРСИТИ; РОУЭН ЮНИВЕРСИТИ (US)
(72) Изобретатель:
Ши И, Нейджел Роберт (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) US-A1-20050004104 US-A1-20050033052
van OIJEN M. et al. Lipoprotein-Associated Phospholipase A2 Is Associated with Risk of Dementia Ann. Neurol., 2006; 59:139-144, особенно реферат, с. 140-141, левая кол., с. 142, правая кол.
(57) Изобретение обеспечивает композиции и способы, применимые для лечения и предупреждения нейродегенеративного заболевания и неврологически родственных нарушений путем ингибирования Lp-PLA2. Композиции и способы применимы для лечения и предупреждения заболеваний и нарушений, связанных с нарушенным функционированием гематоэнцефалического барьера (ВВВ), например нейродегенеративных заболеваний с проницаемым ВВВ, таких как, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и сосудистая деменция.
Область техники
Настоящее изобретение относится в основном к способам лечения и/или предупреждения нейроде-генеративных заболеваний и нарушений, а конкретнее, к лечению и/или предупреждению нейродегене-ративного заболевания, связанного с аномальной проницаемостью гематоэнцефалического барьера, с использованием агентов, ингибирующих экспрессию и/или активность белка Lp-PLA2.
Предпосылки создания изобретения
Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 (Lp-PLA2), также ранее известная в данной области техники как ацетилгидролаза тромбоцит-активирующего фактора (ацетилгидролаза PAF), является членом надсемейства ферментов фосфолипаз А2, которые вовлечены в гидролиз липидов или фосфолипидов липопротеинов. Она секретируется несколькими клетками, которые играют основную роль в системной воспалительной реакции на повреждение, включающими лимфоциты, моноциты, макрофаги, Т-лимфоциты и тучные клетки.
Во время превращения LDL (липопротеина низкой плотности) в его окисленную форму Lp-PLA2 является ответственной за гидролиз образованного по механизму сложного SN-2 эфира окислительно-модифицированного фосфатидилхолина с предоставлением лизофосфатидилхолина и окислительно-модифицированной жирной кислоты. Lp-PLA2 осуществляет гидролиз $п2-положения усеченного фос-фолипида, ассоциированного с окисленным LDL. В результате происходит образование двух участвующих в клеточном хоминге медиаторов воспаления (неэстерифицированных жирных кислот (NEFA) и LYSO PC). Как NEFA, так и LYSO PC являются хемоаттрактантами для циркулирующих в периферической крови моноцитов, играют роль в активации макрофагов и увеличивают окислительный стресс, а также оказывают влияние на функциональные реакции гиперчувствительности немедленного типа Т-лимфоцитов. У людей и свиней Lp-PLA2 связана с молекулой LDL через липопротеин В, и при нахождении в стенке артерии окисленный LDL чувствителен к гидролизу Lp-PLA2.
Оба этих продукта действия Lp-PLA2 являются сильными хемоаттрактантами для циркулирующих моноцитов. Полагают, что как таковой этот фермент ответствен за аккумуляцию клеток, нагруженных холестериновым сложным эфиром, в артериях, являясь причиной характерной "жировой прожилки", ассоциированной с ранними стадиями атеросклероза, и ингибирование фермента Lp-PLA2 может быть полезно для предотвращения формирования этой жировой прожилки (путем ингибирования формирования лизофосфатидилхолина) и применимо для лечения атеросклероза.
Кроме того, было сделано предположение, что Lp-PLA2 играет непосредственную роль в окислении LDL. Это обусловлено тем, что происходящие из полиненасыщенных жирных кислот продукты действия Lp-PLA2 в виде пероксидов липидов вносят вклад и увеличивают общий окислительный процесс. В соответствии с этой идеей ингибиторы Lp-PLA2 ингибируют окисление LDL. Поэтому ингибиторы Lp-PLA2 могут иметь унифицированное применение при любом заболевании, в которое вовлечено пероксидное окисление липидов в сочетании с активностью фермента, например, помимо таких заболеваний, как атеросклероз и диабет, при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит, инфаркт миокарда и реперфузи-онное повреждение.
Прогрессирующий характер дегенеративных, травматических или деструктивных неврологических заболеваний и ограниченная эффективность и серьезные побочные эффекты имеющихся фармакологических агентов делали тщетным клиническое лечение многочисленных неврологических нарушений. Такие заболевания, как болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, тяжелые эпилепсии (например, эпилепсия и семейная дисавтономия) ускользали от самых принятых попыток облегчить или вылечить заболевания с использованием фармакологических агентов.
Деменция, прогрессирующая дисфункция головного мозга, приводит к постепенно увеличивающемуся ограничению повседневной деятельности. Самым широко известным типом деменции является болезнь Альцгеймера. Она поражает приблизительно 10% популяции возрастом свыше 65 лет и приблизительно 40% популяции возрастом свыше 80 лет. Приблизительно 4,5 млн людей в Соединенных Штатах в настоящее время поражено этим нарушением, и ожидают, что это число резко увеличится в грядущие годы, поскольку эта демографическая популяция является сегментом самого быстрого роста в нашем обществе. К 2050, если не станут доступными профилактические лечения, ожидают, что число американцев с болезнью Альцгеймера утроится (с 4,6 до 14 млн), и затраты на уход за людьми с этой болезнью в США превысят 100 миллиардов долларов ежегодно. Эта эпидемия имеет значительные последствия для общества, относительно как страдания людей, так и денежных затрат.
Сосудистую деменцию определяют как утрату когнитивной функции вследствие ишемического, ишемически гипоксического или геморрагического поражений головного мозга в результате сердечнососудистых заболеваний и патологических изменений в сердечно-сосудистой системе. См., например, G.C. Roman, Med. Clin. North. Am., 86, pp. 477-499 (2002). Сосудистая деменция является хроническим и прогрессирующим заболеванием. Симптомы сосудистой деменции включают утрату когнитивной функции, головные боли, инсомнию и потерю памяти. Сосудистая деменция может быть вызвана множественными лакунами и вызывающими недостаточную перфузию повреждениями, такими как инфаркты в краевой зоне и ишемическая перивентрикулярная лейкодистрофия (болезнь Бинсвангера). См. G.C. Roman, выше. В азиатских странах, таких как Китай, Япония и Корея, сосудистая деменция наблюдается у
свыше 60% пациентов с деменцией.
Лечение сосудистой деменции обычно включает контроль факторов риска (т.е. гипертензии, диабета, пищи с высоким содержанием жира, курения, гиперфибриногенемии, гипергомоцистинемии, ортоста-тической гипотензии, аритмий сердца). См., G.C. Roman, выше. Ученые также исследовали, может ли гормонозаместительная терапия и заместительная терапия эстрогенами отсрочить начало деменции у женщин. См. Е. Hogervorst et al., Cochrane Database Syst. Rev., 3, CD 003799 (2002). Однако такая гормо-нозаместительная терапия имеет отрицательные побочные эффекты.
Кроме того, хотя аспирин часто предписывается для сосудистой деменции, существует очень ограниченное доказательство того, что аспирин действительно эффективен при лечении пациентов с сосудистой деменцией. См. P.S. Williams et al., Cochrane Database Syst. Rev., 2, CD 001296 (2000). Нимодипин подразумевался в качестве лекарственного средства, демонстрирующего кратковременную пользу у пациентов с сосудистой деменцией, но был подтвержден в качестве лекарственного средства длительного действия против деменции. См. J.M. Lopez-Arrieta and J. Birks, Cochrane Database Syst. Rev., 3, CD 000147 (2002). Кроме того, клинические данные, касающиеся эффективности пирацетама, не поддерживают использование этого лекарственного средства для лечения деменции и ухудшения когнитивной функции (L. Flicker and G. Irimley Evans, Cochrane Database Syst. Rev., 2, CD 001011 (2001)).
В настоящее время никакое лечение не может предотвратить сосудистую деменцию или остановить болезнь Альцгеймера. У людей на ранней и средней стадиях заболевания существующие в настоящее время лекарственные средства (Когнекс, Арицепт, Экселон, Разадин, Наменда) могут ослабить некоторые симптомы на ограниченное время. Поскольку воспаление головного мозга может вносить вклад в болезнь Альцгеймера, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID, Виокс, Алеве, Целебрекс) были проверены в клинических испытаниях и не продемонстрировали пользы.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способам лечения и/или предупреждения нейродегенеративно-го заболевания и нарушений путем ингибирования Lp-PLA2, например ингибирования экспрессии и/или активности белка Lp-PLA2. В конкретных вариантах осуществления нейродегенеративные заболевания, поддающиеся лечению и/или предупреждению с помощью способов настоящего изобретения, связаны с нарушенным функционированием гематоэнцефалического барьера (ВВВ), например нейродегенератив-ное заболевание с проницаемым ВВВ, и включают, например, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, сосудистую деменцию и т.п.
В одном варианте осуществления раскрытые здесь способы включают введение нуждающемуся в лечении и/или предупреждении нейродегенеративного заболевания субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует Lp-PLA2, например, агент, который ингибирует экспрессию Lp-PLA2 и/или активность белка Lp-PLA2. He предусматривается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной стадией заболевания (например, ранней или запущенной).
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются раскрытые здесь способы предотвращения просачивания через ВВВ путем ингибирования Lp-PLA2, например ингибирования экспрессии Lp-PLA2 и/или ингибирования активности белка Lp-PLA2. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления предусматриваются способы ингибирования Lp-PLA2 путем блокирования ферментативной активности, а в некоторых вариантах осуществления предусматриваются способы ингибирования Lp-PLA2 путем уменьшения экспрессии РНК для Lp-PLA2. В некоторых вариантах осуществления предотвращение и/или уменьшение просачивания через ВВВ или проницаемости ВВВ приводит к предотвращению и/или ослаблению симптомов, сопровождающих нейродегенеративные заболевания или нарушения.
В одном аспекте раскрытые здесь способы предусматривают способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративного нарушения или заболевания у субъекта, включающие введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует активность и/или экспрессию белка Lp-PLA2. В таком варианте осуществления такое нейродегенеративное заболевание или нарушение может быть нейродегенеративным заболеванием или нарушением и может быть, например, но без ограничения, болезнью Альцгеймера, сосудистой деменцией, болезнью Паркинсона и болезнью Хантингтона. В альтернативных вариантах осуществления нейродегенеративное заболевание или нарушение связано с нарушением гематоэнцефалического барьера. В дальнейшем варианте осуществления субъектом, которому вводят агент, который ингибирует активность или экспрессию белка Lp-PLA2, является человек.
В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы лечения и/или предупреждения сосудистой деменции у субъекта или риска развития такой деменции у субъекта, включающие введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует активность и/или экспрессию белка Lp-PLA2, причем ингибирование белка Lp-PLA2 ослабляет или прекращает симптом сосудистой деменции. В некоторых вариантах осуществления сосудистая деменция сопровождается болезнью Альцгеймера.
В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы лечения и/или предупреждения заболевания или нарушения, связанного с нарушением гематоэнцефалического барьера, у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение субъекту фармацевтической компози
ции, содержащей агент, который ингибирует экспрессию и/или активность белка Lp-PLA2. В некоторых вариантах осуществления нарушенным ВВВ является проницаемый гематоэнцефалический барьер, и в дальнейших вариантах осуществления заболеванием или нарушением является нейродегенеративное заболевание или нарушение. Такими нейродегенеративными заболеваниями или нарушениями являются, например, но без ограничения, сосудистая деменция, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и т.п.
В другом варианте осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы уменьшения отложения бета-амилоида, упоминаемого как "Ар", в головном мозге субъекта, включающие введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует экспрессию и/или активность белка Lp-PLA2, причем ингибирование белка Lp-PLA2 ослабляет или прекращает симптом отложения бета-амилоида в головном мозге. В некоторых вариантах осуществления бета-амилоидом является Абета-42.
В некоторых вариантах осуществления агент, который ингибирует Lp-PLA2, может ингибировать экспрессию Lp-PLA2, например ингибировать трансляцию РНК для Lp-PLA2 с получением белка Lp-PLA2. В альтернативных вариантах осуществления агент, который ингибирует Lp-PLA2, может ингиби-ровать активность белка Lp-PLA2. Для применения в раскрытых здесь способах включается любой агент. В некоторых вариантах осуществления агентом может быть малая молекула, нуклеиновая кислота, аналог нуклеиновой кислоты, белок, антитело, пептид, аптамер или их варианты или варианты. В некоторых вариантах осуществления агентом является агент в виде нуклеиновой кислоты, например, но без ограничения, агент для РНК-интерференции, например, но без ограничения, малая интерферирующая РНК, малая шпилечная РНК, микро-РНК, двухцепочечная РНК или рибозим или их варианты.
В некоторых вариантах осуществления агентом, который ингибирует активность белка Lp-PLA2, является малая молекула, например, но без ограничения, обратимый или необратимый ингибитор белка Lp-PLA2 в виде малой молекулы. В некоторых вариантах осуществления такой малой молекулой является молекуле соединения, в основе которого лежит пиримидион. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Lp-PLA2 в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, 1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он (который также известен как SB480848) или его соль. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Lp-PLA2 в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопента-пиримидин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид или его соль. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Lp-PLA2 в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-три-фторметилбифенил-4-илметил)ацетамид или его соль. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Lp-PLA2 в виде малой молекулы является, например, но без ограничения, метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифени-лил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат или его соль.
В некоторых вариантах осуществления, когда следствием нейродегенеративного заболевания является снижение когнитивной функции, например, когда нейродегенеративным заболеванием является, например, болезнь Альцгеймера и/или сосудистая деменция, способ лечения и/или предупреждения заболевания, используя раскрытые здесь способы, может, кроме того, включать оценку когнитивной функции субъекта после введения фармацевтической композиции, содержащей агент, который ингибирует экспрессию и/или активность Lp-PLA2.
В дальнейших вариантах осуществления раскрытые здесь способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний и/или лечения и/или предупреждения нарушенного функционирования ВВВ у субъекта могут, кроме того, включать мониторинг лечения путем оценки мозгового кровотока или функционирования гематоэнцефалического барьера. Такие способы могут быть осуществлены специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники, например, но без ограничения, оценивая присутствие тау и Ар-42 в CSF (цереброспинальной жидкости).
В некоторых вариантах осуществления, когда субъекту вводится фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор Lp-PLA2, способы могут, кроме того, включать введение субъекту дополнительных терапевтических средств, например, но без ограничения, терапевтических средств, используемых для лечения нейродегенеративных нарушений. Например, когда нейродегенеративным нарушением является, например, болезнь Альцгеймера, субъекту можно, кроме того, вводить терапевтические средства для лечения болезни Альцгеймера, например, но без ограничения Арицепт или донепезил, Когнекс или такрин, Экселон или ривастигмин, Реминил или галантамин, противоамилоидную вакцину, понижающие Абета терапии, умственное упражнение или стимуляцию.
В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь способы лечения и/или предупреждении нейродегенеративных заболеваний применимы к субъектам, например, являющимся млекопитающими субъектами. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 демонстрируется доказательство DM/HC-индуцированного кровоизлияния и просачивания через ВВВ. На панели А демонстрируется отсутствие кровоизлияния в контрольном головном мозге по сравнению с головным мозгом животного с DM/HC на панели В, при этом черные стрелки указывают на клетки воспаления вне кровеносного сосуда, а белые стрелки показывают увеличение адгезии клеток воспаления к поверхности эндотелиальных клеток. На панели С демонстрируются отсутствие сосудистой проницаемости и ненарушенный ВВВ у контрольного животного по сравнению с просачиванием через ВВВ в головном мозге животного с DM/НС, как показано на панели D, при этом стрелки на панели С и D показывают границу иммуноглобулин(^)-положительное "затемнение-утечка", окружающую небольшие кровеносные сосуды.
На фиг. 2 демонстрируется, что просочившиеся Ig в головном мозге животных с DM/НС связываются с нейронами и вызывают разрушение дендритов. На левой и правой панелях демонстрируются Ig-положительные нейроны с характерным нарушением дендритов, обнаруживаемым по "спиралеобразной морфологии" дендритных отростков, отходящих от тела нервной клетки.
На фиг. 3 демонстрируется доказательство DM/HC-индуцированной активации астроцитов и демонстрируется иммуноокрашивание GFAP в качестве маркера активированных астроцитов вблизи "больных нейронов" в головном мозге подвергнутых лечению животных с DM/HC.
На фиг. 4 демонстрируется доказательство DM/HC-индуцированной аккумуляции Абета-42 внутри нейронов и в локальной микрососудистой сети головного мозга. На панели А демонстрируются нейроны, которые являются Абета-42-иммуноположительными в значительной степени, и артериолы, демонстрирующие отложение Абета-42 в сосудистом слое гладкомышечных клеток (цереброваскулярный амилои-доз), а на панели В демонстрируется, что Абета-42-иммуноположительные нейроны имеют "спиралеобразные дендриты", являющиеся признаком ретракции дендритов.
На фиг. 5 демонстрируется, что ингибитор Lp-PLA2 предотвращает просачивание через ВВВ и связывание Ig с нейронами. Панели A-F представляют собой репрезентативные изображения нарушения (проницаемости) ВВВ головного мозга животных с DM/НС без лечения (n=6), а панели G-L представляют собой репрезентативные изображения ненарушенного ВВВ в сравнимых областях головного мозга от животных с DM/HC, подвергшихся лечению ингибитором Lp-PLA2, (n=6). На панелях A-F демонстрируется обильная утечка Ig из локальной микрососудистой сети головного мозга в ткань головного мозга и связывание Ig с нейронами по сравнению с панелями G-L.
На фиг. 6 демонстрируется, что ингибитор Lp-PLA2 сохраняет здоровье нейронов у животных с DM/НС путем блокирования утечки компонентов плазмы (в том числе Ig) из кровеносных сосудов. В результате Ig ограничен просветом кровеносных сосудов у животных с DM/НС, подвергшихся лечению ингибитором Lp-PLA2, что делает и стенки артериол, и нейроны отрицательными при иммуноокрашива-нии на Ig.
На фиг. 7 демонстрируется, что ингибитор Lp-PLA2 предотвращает аккумуляцию Абета-42 в нейронах. Панели A-F представляют собой репрезентативные изображения иммуноокрашивания на Абета-42 головного мозга животных с DM/HC без лечения (n=6), а панели G-L представляют собой репрезентативные изображения иммуноокрашивания на Абета-42 в сравнимых областях головного мозга от животных с DM/HC, подвергшихся лечению ингибитором Lp-PLA2, (n=6). Увеличенная иммунореактивность Абета-42, продемонстрированная на панелях А-F, показывает, что Абета-42 связывается с нейронами и аккумулируется в ним, по сравнению с Абета-42-иммуноотрицательными нейронами на панелях G-L.
На фиг. 8 демонстрируется, что ингибитор Lp-PLA2 уменьшал цереброваскулярный амилоидоз. На панели А демонстрируется иммуноокрашивание на Абета-42 в слое гладкомышечных клеток артериол (т.е. цереброваскулярный амилоидоз) в головном мозге животных с DM/НС без лечения, по сравнению с панелью В, на которой демонстрируется незначительное иммуноокрашивание на Абета-42 в артериолах или его отсутствие в сравнимых областях головного мозга от животных с DM/НС, подвергшихся лечению ингибитором Lp-PLA2.
На фиг. 9 демонстрируется репрезентативное изображение головного мозга свиньи, демонстрирующее полностью интактный головной мозг на панели А и полусекционированное после срединной линии на панели В, при этом стрелки указывают на локализацию ствола головного мозга и гиппокапма, а также грид для областей головного мозга, использованных для иммуногистохимического анализа.
Подробное описание изобретения
Как здесь сообщается, авторы настоящего изобретения обнаружили, что животные, подверженные патологическим признакам сосудистой деменции, включающим просачивание и проницаемость ВВВ и кровоизлияние, после лечения ингибитором Lp-PLA2, как установлено, демонстрируют ослабление признаков и симптомов проницаемости ВВВ и редуцирование нарушенного функционирования ВВВ. Например, животные, подвергнутые лечению ингибитором Lp-PLA2, демонстрируют уменьшение проницаемости ВВВ, меньшую активацию глиальных клеток и меньшее повреждение нервных клеток. В частности, животные, подвергнутые лечению ингибитором Lp-PLA2, также имеют меньшее отложение амилоида, например, отложение бета-амилоида (или Абета-42) в головном мозге или сосудистой сети головного мозга. Следовательно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибиторы Lp-PLA2 могут использоваться для лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний и нарушений, в
частности нейродегенеративных заболеваний и нарушений, связанных с нарушенным функционированием гематоэнцефалического барьера, например, нейродегенеративных заболеваний с проницаемостью ВВВ или увеличенной проницаемостью ВВВ. Такие заболевания включают, например, но без ограничения, сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и т.п.
Определения
Для удобства здесь собраны некоторые термины, используемые по всех заявке (в том числе описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения). Кроме случаев, специально оговоренных, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, как и значение, в котором они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники, частью которой является это изобретение.
Используемый здесь термин "нейродегенеративное заболевание" относится к разнообразному выбору нарушений центральной нервной системы, характеризующихся постепенной и прогрессирующей утратой нервной ткани и/или функции нервной ткани. Нейродегенеративное заболевание представляет собой класс неврологического нарушения или заболевания, которое характеризуется постепенной и прогрессирующей утратой нервной ткани и/или изменением функции нервной системы, обычно снижением функции нервной системы в результате постепенной и прогрессирующей утраты нервной ткани. Нейро-дегенеративные заболевания, поддающиеся предупреждению и/или лечению с помощью описанных здесь способов, являются нейродегенеративными заболеваниями, при которых существует нарушенный гематоэнцефалический барьер, например проницаемый гематоэнцефалический барьер. Примеры нейро-дегенеративных заболеваний, при которых существует нарушенный гематоэнцефалический барьер, включают, например, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркин-сона, сосудистую деменцию и т.п.
Термин "сосудистая деменция", также упоминаемая в данной области техники как "мультиинфарк-тная деменция, относится к группе синдромов, вызванных различными механизмами, все из которых приводят к повреждению сосудов головного мозга. Основными подтипами сосудистой деменции являются, например, небольшое ослабление когнитивной функции сосудистой этиологии, мультиинфарктная деменция, сосудистая деменция вследствие одного ключевого инфаркта (поражающего таламус, переднюю мозговую артерию, теменные доли головного мозга или поясную извилину головного мозга), сосудистая деменция вследствие геморрагических повреждений, заболевание небольших сосудов (в том числе, например, сосудистая деменция вследствие лакунарных повреждений или болезнь Бинсвангера) и болезнь Альцгеймера в сочетании с сосудистой деменцией.
Термин "заболевание" или "нарушение" используется здесь взаимозаменяемо и относится к любому изменению состояния организма или некоторых органов, препятствующему или нарушающему выполнение функций и/или вызывающему такие симптомы, как дискомфорт, дисфункция, дистресс или даже смерть пораженного человека или людей, контактирующих с пораженным человеком. Заболевание или нарушение также относится к душевному расстройству, нахождению в болезненном состоянии, недомоганию, болезни, нарушению, заболеванию, расстройству, жалобе, легкому заболеванию или аффектации.
Термины "гематоэнцефалический барьер" или "ВВВ" используются здесь взаимозаменяемо и используются для ссылки на барьер для проницаемости, который существует в кровеносных сосудах, поскольку они проходят через ткань головного мозга, который строго ограничивает и тесно регулирует то, что обменивается между кровью и тканью головного мозга. Компоненты гематоэнцефалического барьера включают эндотелиальные клетки, которые образуют выстилку в крайнем положении в направлении внутрь всех кровеносных сосудов, плотные соединения между соседними эндотелиальными клетками, которые являются структурным аналогом ВВВ, базальную мембрану эндотелиальных клеток и удлиненные отростки-ножки расположенных поблизости астроцитов, которые покрывают почти всю незащищенную внешнюю поверхность кровеносного сосуда. ВВВ препятствует проникновению большинства веществ крови в ткань головного мозга, в том числе большинства больших молекул, таких как Ig, антитела, комплемент, альбумин и лекарственные средства, и малых молекул.
Термин "нарушенный ВВВ" используется для ссылки на дисфункциональный ВВВ, например, когда ВВВ не позволяет проходить молекулам, которые обычно проходят через функциональный ВВВ, например, питательным веществам и сахарам, таким как глюкоза. Нарушенный ВВВ может также упоминаться, когда ВВВ является проницаемым для молекул, проникновение которых нормально функционирующий ВВВ обычно бы не допустил, на что здесь обычно приводится ссылка "проницаемость ВВВ".
Термины "проницаемость ВВВ" или "проницаемый ВВВ" обычно упоминаются специалистами в данной области техники как "просачивание через ВВВ". Термины используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на нарушенную целостность ВВВ и увеличенную сосудистую проницаемость. Например, проницаемый ВВВ позволяет проходить молекулам через ВВВ, которые ненарушенный ВВВ обычно бы не допустил в ткань головного мозга, например, молекулам Ig, белкам комплемента, сывороточному альбумину и многочисленным другим белкам. Анализом для определения присутствия проницаемого ВВВ может быть, например, оценка наличия внесосудистого Ig в ткани головного мозга, который обычно ограничен просветом кровеносных сосудов, когда ВВВ функционирует нормально (т.е. когда ВВВ не является проницаемым).
Термин "агент" относится к любой молекуле, которая обычно не присутствует или не присутствует на вводимых уровнях в клетке. Агент может выбираться из группы, включающей химические продукты, малые молекулы, последовательности нуклеиновых кислот, аналоги нуклеиновых кислот, белки, пептиды, аптамеры, антитела или их фрагменты. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть РНК или ДНК и может быть одноцепочечной или двухцепочечной, и может выбираться из группы, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, олигонуклеотиды, аналоги нуклеиновых кислот, например, пептидо-нуклеиновую кислоту (ПНК), псевдокомплементарную ПНК (pc-PNA), закрытую нуклеиновую кислоту (LNA) и т.п. Такие последовательности нуклеиновых кислот включают, например, но без ограничения, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белки, например, которые действуют в качестве репрессоров транскрипции, антисмысловые молекулы, ри-бозимы, небольшие ингибиторные последовательности нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, молекулу для РНК-интерференции, малую шпилечную РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК, антисмысловые олигонуклеотиды и т.п. Белок и/или пептид или его фрагмент может быть любым представляющим интерес белком, например, но без ограничения, мутированными белками, терапевтическими белками и усеченными белками, причем белок обычно отсутствует или экспрессируется на низких уровнях в клетке. Белки могут также выбираться из группы, включающей мутированные белки, созданные методами генетической инженерии белки, пептиды, синтетические пептиды, рекомбинантные белки, химерные белки, антитела, мидитела, минитела, триатела, гуманизированные белки, гуманизированные антитела, химерные антитела, модифицированные белки и их фрагменты. Альтернативно, агент может быть внутриклеточным в результате введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетки и ее транскрипции, приводящей к продукции нуклеиновой кислоты и/или белка - ингибитора Lp-PLA2 в клетке. В некоторых вариантах осуществления агентом являются какой-либо химический продукт, молекула или составляющая, включающий, без ограничения, синтетические и встречающиеся в природе не-белковоподобные молекулы. В некоторых вариантах осуществления агентом является малая молекула, имеющая химическую составляющую. Например, химические составляющие включают незамещенные или замещенные алкильные, ароматические или гетероциклические составляющие, в том числе макролиды, лептомицины и родственные природные продукты или их аналоги. Известно, что агенты могут обладать желаемой активностью и/или свойством или могут быть выбраны из библиотеки разнообразных соединений.
Используемый здесь термин "ингибирование" означает, что экспрессия или активность белка Lp-PLA2 или его вариантов или гомологов снижается до некоторой степени и/или на период времени, достаточный для вызова желаемого эффекта. Снижение активности может быть обусловлено воздействием на одно или несколько свойств Lp-PLA2, в том числе уменьшением ее каталитической активности или ин-гибированием кофактора Lp-PLA2, или связыванием Lp-PLA2 с такой степенью авидности, что результатом является лечение или предупреждение нейродегенеративного нарушения или нарушенного ВВВ, такого как проницаемый ВВВ. В частности, ингибирование Lp-PLA2 можно определить, используя анализ ингибирования Lp-PLA2, например, но без ограничения, используя описываемый здесь биоанализ белка Lp-PLA2.
Используемый здесь термин "Lp-PLA2" относится к белку-мишени, который ингибируют с помощью раскрытых здесь способов. Lp-PLA2 используется взаимозаменяемо с Lp-PLA2 и липопротеин-ассоциированной фосфолипазой А2, также ранее известной в данной области техники как ацетилгидрола-за тромбоцит-активирующего фактора (ацетилгидролаза PAF). Lp-PLA2 человека кодируется нуклеиновой кислотой, соответствующей № доступа U20157 (SEQ ID NO: 1) или идентификатору эталонной последовательности NM 005084 (SEQ ID NO: 2), или Lp-PLA2 человека соответствует белковой последовательности, соответствующей № доступа NP 005075 (SEQ ID NO: 3), которая описывается в патенте США № 5981252, который полностью включен сюда посредством ссылки.
Как здесь используются, "выключение гена" или "выключенный ген" относительно активности nPHK-интерферирующей молекулы, например малой интерферирующей РНК или микро-РНК, относится к снижению в клетке уровня мРНК для гена-мишени на по меньшей мере приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99%, приблизительно 100% от уровня мРНК, обнаруживаемого в клетке в отсутствие малой интерферирующей РНК или молекулы для РНК-интерференции. В одном предпочтительном варианте осуществления уровни мРНК снижаются на по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99%, приблизительно 100%.
Используемый здесь термин "молекула для РНК-интерференции" относится к любому типу интерферирующей РНК, в том числе, но без ограничения, малой интерферирующей РНК, малой шпилечной РНК, эндогенной микро-РНК и искусственной микро-РНК. Например, он включает последовательности, ранее идентифицированные как малая интерферирующая РНК, независимо от механизма последующего процессинга РНК (т.е. хотя полагают, что малая интерферирующая РНК имеет специфический порядок in vivo процессинга, приводящего к расщеплению мРНК, такие последовательности можно встроить в векторы в соединении с фланкирующими последовательностями, описанными здесь).
Как здесь используется, "малая интерферирующая РНК" относится к нуклеиновой кислоте, которая образует двухцепочечную РНК, которая обладает способностью уменьшать или ингибировать экспрессию гена или гена-мишени, когда малая интерферирующая РНК присутствует или экспрессируется в той же клетке, что и ген-мишень, например, Lp-PLA2. Малая интерферирующая РНК в виде двухцепочечной РНК может быть образована комплементарными цепями. В одном варианте осуществления малая интерферирующая РНК относится к нуклеиновой кислоте, которая может образовать двухцепочечную малую интерферирующую РНК. Последовательность малой интерферирующей РНК может соответствовать полноразмерному гену-мишени или его подпоследовательности. Как правило, длина малой интерферирующей РНК составляет по меньшей мере приблизительно 15-50 нуклеотидов (например, длина каждой комплементарной последовательности двухцепочечной малой интерферирующей РНК составляет приблизительно 15-50 нуклеотидов, а длина двухцепочечной малой интерферирующей РНК составляет приблизительно 15-50 пар оснований, предпочтительно приблизительно 19-30 пар оснований, предпочтительно 20-25 нуклеотидов, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов).
Как здесь используется, "малая шпилечная РНК" (также называемая петлей с ножкой) является типом малой интерферирующей РНК. В одном варианте осуществления эти малые шпилечные РНК состоят из короткой, например, длиной от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов, антисмысловой цепи, за которой следует нуклеотидная петля длиной от приблизительно 5 до приблизительно 9 нуклеотидов и аналогичная смысловая цепь. Альтернативно, смысловая цепь может быть перед нуклео-тидной структурой петли, а затем может следовать антисмысловая цепь.
Термин "микро-РНК" означает эндогенные РНК, некоторые из которых, как известно, регулируют экспрессию кодирующих белки генов на посттранскрипционном уровне. Эндогенные микро-РНК представляют собой малые РНК, природно присутствующие в геноме, которые способны модулировать продуктивное использование мРНК. Термин "искусственная микро-РНК" включает любой тип последовательности РНК, отличный от эндогенной микро-РНК, который способен модулировать продуктивное использование мРНК. Последовательности микро-РНК были представлены в таких публикациях, как Lim et al., Genes & Development, 17, p. 991-1008 (2003), Lim et al., Science 299, 1540 (2003), Lee and Ambros, Science, 294, 862 (2001), Lau et al., Science 294, 858-861 (2001), Lagos-Quintana et al., Current Biology, 12, 735-739 (2002), Lagos Quintana et al., Science 294, 853-857 (2001) и Lagos-Quintana et al., RNA, 9, 175-179 (2003), которые включены посредством ссылки. Множество микро-РНК можно также встроить в молекулу-предшественник. Кроме того, подобные микро-РНК петли с ножками можно экспрессировать в клетке в качестве носителя для доставки искусственной микро-РНК и малых интерферирующих РНК с целью модулирования экспрессии эндогенных генов через пути с участием микро-РНК или молекул для РНК-интерференции.
Как здесь используются, "двухцепочечная РНК" или "дцРНК" относятся к молекулам РНК, которые состоят из двух цепей. Двухцепочечные молекулы включают молекулы, состоящие из одной молекулы РНК, которая спаривается с самой собой с образованием двухцепочечной структуры. Например, структура петли и ножки молекул-предшественников, из которой происходит одноцепочечная микро-РНК, называемая пре-микроРНК (Bartel et al. 2004, Cell 116: 281-297), включает молекулу дцРНК.
Термины "пациент", "субъект" и "индивидуум" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к животному, в частности человеку, которому предоставляется лечение, в том числе профилактическое лечение. Используемый здесь термин "субъект" относится к человеку и не являющимся людьми животным. Термины "не являющиеся людьми животные" и "не являющимся людьми млекопитающие" используются здесь взаимозаменяемо и включают всех позвоночных, например, млекопитающих, таких как не являющиеся людьми приматы (в частности, высшие приматы), овца, собака, грызун (например, мышь или крыса), морская свинка, коза, свинья, кошка, кролики, коровы, и не являющихся млекопитающими животных, таких как куры, земноводные, рептилии и т.п. В одном варианте осуществления субъектом является человек. В другом варианте осуществления субъектом является экспериментальное животное или животное-заместитель в качестве модели заболевания.
Используемый здесь термин "ген" может быть геномным геном, включающим регулирующие транскрипцию, и/или трансляцию последовательности, и/или кодирующую область, и/или нетранслируемые последовательности (например, интроны, 5' - и 3'-нетранслируемые последовательности и регуляторные последовательности). Кодирующая область гена может быть нуклеотидной последовательностью, кодирующей аминокислотную последовательность или функциональную РНК, такую как тРНК, рРНК, каталитическую РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК и антисмысловую РНК. Ген может быть также мРНК или кДНК, соответствующей кодирующим областям (например, экзонам или микро-РНК), необязательно включающей связанные с кодирующими областями 5'- или 3'-нетранслируемые последовательности. Ген может также быть амплифицированной молекулой нуклеиновой кислоты, продуцированной in vitro, включающей целиком или часть кодирующей области и/или связанные с ней 5' - или 3'-нетранслируемые последовательности.
Используемый здесь термин "нуклеиновая кислота" или "олигонуклеотид", или "полинуклеотид" может означать по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных вместе. Как это будет понятно специалистам в данной области техники, изображение одной цепи также определяет последовательность
комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает комплементарную цепь изображенной одной цепи. Также специалистам в данной области техники будет понятно, что множество вариантов нуклеиновой кислоты может использоваться с одной и той же целью в качестве заданной нуклеиновой кислоты. Следовательно, нуклеиновая кислота также включает, по существу, идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементы. Как это будет понятно специалистам в данной области техники, одиночная цепь предусматривает зонд, который может гибридизоваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации.
Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или могут содержать части и двухцепочечной, и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, как геномной, так и кДНК, РНК или гибридом, причем нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включающих урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты можно получить с помощью способов химического синтеза или рекомбинантных способов.
Нуклеиновая кислота будет, как правило, содержать фосфодиэфирные связи, хотя могут быть включены аналоги нуклеиновых кислот, которые могут иметь по меньшей мере одну отличную связь, например, фосфорамидатную, фосфоротиоатную, фосфородитиоатную или О-метилфосфорамидатную связи и пептидонуклеиновые основы и связи. Другие нуклеиновые кислоты-аналоги включают нуклеиновые кислоты с положительно заряженными остовами, неионными остовами и не содержащими рибозу остовами, в том числе те, которые описываются в патентах США № 5235033 и 5034506, которые включены посредством ссылки. Нуклеиновые кислоты, содержащие один или несколько не встречающихся в природе или модифицированных нуклеотидов, также включены в определение нуклеиновых кислот. Модифицированный нуклеотидный аналог может располагаться, например, на 5'-конце и/или 3'-конце молекулы нуклеиновой кислоты. Репрезентативные примеры нуклеотидных аналогов можно выбрать из ри-бонуклеотидов с модифицированным сахаром или образующим остов элементом. Однако следует отметить, что также подходят рибонуклеотиды с модифицированным нуклеиновым основанием, т.е. рибо-нуклеотиды, содержащие вместо встречающегося в природе нуклеинового основания не встречающееся в природе нуклеиновое основание, такое как модифицированные по 5-положению уридины или цитиди-ны, например, 5-(2-амино)пропилуридин, 5-бромуридин,
модифицированные по 8-положению аденозины и гуанозины, например, 8-бромгуанозин, деазанук-леотиды, например, 7-деазааденозин, О- и N-алкилированные нуклеотиды, например, №-метиладенозин. 2'OH-группу можно заменить группой, выбираемой из Н, OR, R, галогена, SH, SR, NH2, NHR, NR2 или CN, где R представляет собой С-С6 алкил, алкенил или алкинил, а галоген представляет собой F, Cl, Br или I. Модификации рибозофосфатного остова можно проводить по множеству причин, например, для увеличения стабильности и полупериода существования таких молекул в физиологических окружающих условиях или в качестве зондов на биочипах. Могут быть приготовлены смеси встречающихся в природе нуклеиновых кислот и аналогов, альтернативно, могут быть приготовлены смеси различных аналогов нуклеиновых кислот и смеси встречающихся в природе нуклеиновых кислот и аналогов.
Используемый здесь термин "вектор" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей начало репликации. Вектор может быть плазмидой, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или дрожжевой искусственной хромосомой. Вектор может быть вектором в виде ДНК или РНК. Вектор может быть или самореплицирующимся экстрахромосомным вектором, или вектором, который интегрируется в геном хозяина.
Используемый здесь термин "лечение" включает уменьшение или ослабление по меньшей мере одного отрицательного действия или симптома состояния, заболевания или нарушения, связанного с проницаемым ВВВ, и/или сосудистой деменции, и/или болезни Альцгеймера. Как здесь используется, термин "лечение" используется для ссылки на ослабление (уменьшение) симптома и/или биохимического маркера болезни Альцгеймера по меньшей мере на 10%. Например, но без ограничения, уменьшение биохимического маркера болезни Альцгеймера, например, уменьшение отложения амилоидных бляшек, на 10% или уменьшение активации глиальных клеток, например, уменьшение клеток, зкспрессирующих GFAP, на 10% могло бы считаться эффективным лечением с помощью раскрытых здесь способов. В качестве альтернативных примеров, ослабление симптома, например, замедление скорости потери памяти, на 10% или остановка ухудшения памяти, или уменьшение утраты памяти на 10%, или улучшение памяти на 10% могло бы также считаться эффективным лечением с помощью раскрытых здесь способов.
Используемый здесь термин "эффективное количество" относится к количеству терапевтического агента фармацевтической композиции, которое ослабляет или прекращает по меньшей мере один симптом заболевания или нарушения, например, симптом или нарушение нарушенного ВВВ или сосудистой деменции. Например, эффективным количеством при использовании раскрытых здесь способов могло бы считаться количество, достаточное для ослабления симптома заболевания или нарушения, например, сосудистой деменции или проницаемости ВВВ, на по меньшей мере 10%. Как здесь используется, эффективное количество могло бы включать также количество, достаточное для предупреждения или отсрочки развития симптома заболевания, изменения течения симптома заболевания (например, но без ог
раничения, замедления прогрессирования симптома заболевания) или реверсирования симптома заболевания.
Используемые здесь термины "назначение" и "введение" используются взаимозаменяемо и имеют отношение к размещению раскрытых здесь агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, в организме субъекта с помощью способа или пути, результатом которого является по меньшей мере частичная локализация агентов в желаемом месте. Соединения настоящего изобретения можно вводить с помощью любого подходящего пути, который приводит к эффективному лечению субъекта.
Термин "векторы" используется взаимозаменяемо с "плазмидой" для ссылки на молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Векторы, способные управлять экспрессией генов и/или последовательности нуклеиновой кислоты, с которой они функционально связаны, упоминаются здесь как "экспрессионные векторы". Как правило, экс-прессионные векторы, применяемые в методах рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме "плаз-мид", которые относятся к кольцевым двухцепочечным петлевым ДНК-фрагментам, которые в своей векторной форме не связаны с хромосомой. В отличных вариантах осуществления настоящего изобретения могут использоваться другие экспрессионные векторы, например, но без ограничения, плазмиды, эписомы, бактериофаги или вирусные векторы, и такие векторы могут интегрироваться в геном хозяина или автономно реплицироваться в конкретной клетке. Можно также использовать другие формы экс-прессионных векторов, известных квалифицированным в данной области техники специалистам, которые выполняют эквивалентные функции. Экспрессионные векторы включают экспрессионные векторы для постоянной или временной экспрессии кодирующей ДНК.
Артикли "а" и "an" используются здесь при упоминании одного или более чем одного (т.е. по меньшей мере одного) грамматического элемента артикля. В виде примера, "an element" означает один элемент или более чем один элемент.
Lp-PLA2: Общая информация
Lp-PLA2, также упоминаемая в данной области техники под альтернативными названиями Lp-PLA2, LDL-PLA2, липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 PLA2G7, фосфолипаза А2 (группы VII) или ацетилгидролаза тромбоцит-активирующего фактора (ацетилгидролаза PAF или PAFAH). Lp-PLA2 человека кодируется нуклеиновой кислотой, соответствующей № доступа в GenBank: U20157 (SEQ ID NO: 1) или идентификатору эталонной последовательности NM 005084 (SEQ ID NO: 2), и Lp-PLA2 человека соответствует белковой последовательности, соответствующей № доступа в GenBank: NP 005075 (SEQ ID NO: 3), которая описывается в патенте США № 5981252, который полностью включен сюда посредством ссылки.
Липопротеин-ассоциированная фосфолипаза А2 (Lp-PLA2), ее последовательность, выделение и очистка, выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие фермент, и рекомбинантные клетки-хозяева, трансформированные ДНК, кодирующей фермент, описываются в заявке WO 95/00649 (SmithKline Bee-cham PLC), которая полностью включена сюда посредством ссылки. Этот фермент далее описывается в последующей публикации той же группы (Tew D. et al., Arterioscler Thromb. Vas. Biol. 1996: 16, 591-599), в которой он упоминается как LDL-PLA2, и в более поздней заявке на патент (WO 95/09921, Icos Corporation) и родственной публикации в Nature (Tjoelker et al., vol. 374, 6 April 1995, 549) описывается фермент PAF-AH, который имеет по существу такую же последовательность, что и Lp-PLA2.
Установлено, что Lp-PLA2 ответственна за превращение фосфатидилхолина в лизофосфатидилхо-лин, во время превращения липопротеина низкой плотности (LDL) в его окисленную форму. Известно, что этот фермент гидролизует образованный по механизму sn-2 сложный эфир окисленного фосфати-дилхолина с предоставлением лизофосфатидилхолина и окислительно-модифицированной жирной кислоты. Оба продукта действия Lp-PLA2 являются биологически активными, при этом лизофосфатидил-холин, в частности, обладает несколькими проатерогенными активностями, приписываемыми ему, включающими хемотаксис моноцитов и индукцию эндотелиальной дисфункции, обе из которых способствуют аккумуляции происходящих из моноцитов макрофагов в стенке артерии.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что животные, подверженные нарушениям, характеризующимся просачиванием через ВВВ, как установлено, демонстрируют ненарушенный ВВВ и уменьшение признаков проницаемости ВВВ после лечения ингибитором Lp-PLA2. Такие животные, подвергнутые лечению ингибитором Lp-PLA2, также демонстрировали уменьшение признаков сосудистой де-менции и уменьшение отложения бета-амилоида в ткани головного мозга и в кровеносных сосудах, проходящих через головной мозг, по сравнению с животными, не подвергнутыми лечению этим ингибитором. Следовательно, ингибиторы Lp-PLA2 могут использоваться для лечения и/или предотвращения заболеваний и нарушений, характеризующихся проницаемостью ВВВ, например, но без ограничения, ней-родегенеративных заболеваний. Примеры нейродегенеративных заболеваний, поддающихся лечению и/или предотвращению, используя раскрытые здесь способы, включают, но без ограничения, сосудистую деменцию, болезнь Алыдгеймера и другие нейродегенеративные заболевания, например, болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона.
Агенты, которые ингибируют Lp-PLA2
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ингибированию Lp-PLA2. В некоторых вариантах осуществления ингибированием является ингибирование транскриптов нуклеиновых кислот, кодирующих Lp-PLA2, например ингибирование информационной РНК (мРНК). В альтернативных вариантах осуществления ингибированием Lp-PLA2 является ингибирование экспрессии и/или ингибирование активности продукта гена Lp-PLA2, например полипептида или белка Lp-PLA2 или его изоформ. Используемый здесь термин "продукт гена" относится к РНК, транскрибированной с гена, или полипептиду, кодированному геном или транслированному с РНК.
В некоторых вариантах осуществления ингибирование Lp-PLA2 осуществляется с помощью агента. Можно использовать любой агент, например, но без ограничения, нуклеиновые кислоты, аналоги нуклеиновых кислот, пептиды, фаг, фагемиды, полипептиды, пептидомиметики, рибозимы, аптамеры, антитела, малые или большие органические или неорганические молекулы или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления агенты, применимые в способах настоящего изобретения, включают агенты, которые функционируют в качестве ингибиторов экспрессии Lp-PLA2, например ингибиторов мРНК, кодирующей Lp-PLA2.
Агенты, применимые в раскрытых здесь способах, могут также ингибировать экспрессию гена (т.е. подавлять экспрессию гена).
Такие агенты упоминаются в данной области техники как "выключатели гена" и широко известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Примеры включают, но без ограничения, последовательность нуклеиновой кислоты, например, РНК, ДНК или аналог нуклеиновой кислоты, которая может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может выбираться из группы, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, аналоги нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, пептидо-нуклеиновую кислоту (ПНК), псевдокомплементарную ПНК, закрытую нуклеиновую кислоту и их производные и т.п. Агенты в виде нуклеиновых кислот также включают, например, но без ограничения, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки, которые действуют в качестве репрессоров транскрипции, антисмысловые молекулы, рибозимы, небольшие ингибиторные последовательности нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, молекулу для РНК-интерференции, малую шпилечную РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК, антисмысловые олигонуклеотиды и т.п.
Как здесь используется, агентами, применимыми в способе настоящего изобретения в качестве ингибиторов экспрессии Lp-PLA2 и/или ингибиторов функции белка Lp-PLA2, могут быть молекулы любого типа, например, но без ограничения, химические продукты, последовательности нуклеиновых кислот, аналоги нуклеиновых кислот, белки, пептиды или их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления агентом является какой-либо химический продукт, молекула или составляющая, включающий, без ограничения, синтетические и встречающиеся в природе небелковоподобные молекулы. В некоторых вариантах осуществления агентом является малая молекула, имеющая химическую составляющую. Например, в некоторых вариантах осуществления химической составляющей является раскрытое здесь соединение, в основе которого лежит пиримидион.
В альтернативных вариантах осуществления агентами, применимыми в раскрытых здесь способах, являются белки и/или пептиды или их фрагменты, которые ингибируют экспрессию гена Lp-PLA2 или функцию белка Lp-PLA2. Такие агенты включают, например, но без ограничения, варианты белка, мутированные белки, терапевтические белки, усеченные белки и фрагменты белков. Белковые агенты могут также выбираться из группы, включающей мутированные белки, созданные методами генетической инженерии белки, пептиды, синтетические пептиды, рекомбинантные белки, химерные белки, антитела, мидитела, минитела, триатела, гуманизированные белки, гуманизированные антитела, химерные антитела, модифицированные белки и их фрагменты.
Альтернативно, агентами, применимыми в раскрытых здесь способах в качестве ингибиторов Lp-PLA2, могут быть химические продукты, малая молекула, большая молекула, или целиком, или ее составляющая, в том числе, без ограничения, синтетические и встречающиеся в природе небелковоподоб-ные молекулы. В некоторых вариантах осуществления агентом является раскрытая здесь малая молекула, имеющая химические составляющие.
Малые молекулы
В некоторых вариантах осуществления агентами, которые ингибируют Lp-PLA2, являются малые молекулы. В способах настоящего изобретения могут использоваться необратимые или обратимые ингибиторы Lp-PLA2.
Необратимые ингибиторы Lp-PLA2 описываются в заявках на патенты WO 96/13484, WO 96/19451, WO 97/02242, WO 97/217675, WO 97/217676, WO 97/41098 и WO 97/41099 (SmithKline Beecham PLC), которые полностью включены сюда посредством ссылки, и в которых описываются, в числе прочего, различные экспериментальные серии соединений 4-тионил/сульфинил/сульфонилазетидинона, которые являются ингибиторами фермента Lp-PLA2. Они являются необратимыми, ацилирующими ингибиторами (Tew et al., Biochemistry, 37, 10087, 1998).
Ингибиторы Lp-PLA2, эффективные для людей, широко известны специалистам со средним уров
нем компетентности и включают ингибиторы, подвергающиеся оценке, например, подвергающиеся пре-клинической и клинической оценке, в том числе клиническим испытаниям фазы II. Ряд заявок был подан и опубликован SmithKline Beecham и его правопреемником GlaxoSmithKline.
Списком релевантных опубликованных заявок, переуступленных ему, является WO 01/60805, WO 02/30904, WO 03/016287, WO 00/66567, WO 03/042218, WO 03/042206, WO 03/042179, WO 03/041712, WO 03/086400, WO 03/087088, WO 02/30911, WO 99/24420, WO 00/66566, WO 00/68208, WO 00/10980 и WO 2005/021002, которые полностью включены сюда посредством ссылки. Кроме того, приводится ссылка на предварительные заявки на патенты США 60/829328 и 60/829327, обе из которых были поданы 13 октября 2006, которые полностью включены сюда посредством ссылки.
Другие ингибиторы Lp-PLA2, применимые в раскрытых здесь способах, описываются в опубликованных заявках на патенты, например, WO 2006063791-А1, WO 2006063811-A1, WO 2006063812-A1, WO 2006063813-A1, все на имя Bayer Healthcare, и ^2006106017-А1, переуступленной Korea Res. Inst. Bioscience & Biotechnology, которые полностью включены сюда посредством ссылки. Ингибиторы Lp-PLA2 также включают известные агенты, например, но без ограничения, включают применение статинов с ниацином (см. www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568) и фенофибратом (см. www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=14817756 &taxid=19).
Все заявки, представленные выше, включены сюда посредством ссылки. Полагают, что любое и все соединения, описанные в этих документах, пригодны для профилактики или лечения нейродегенератив-ных заболеваний и нарушений, в том числе, например, но без ограничения, сосудистой деменции и болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний, описанных в этом документе, при которых встречается нарушенный ВВВ. Описанная здесь модель проницаемости ВВВ и нейродегенеративно-го заболевания на свинье, приведенная в качестве примера в Примерах, может использоваться специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники для определения того, какое из описанных соединений или других ингибиторов Lp-PLA2, например, антител, или молекул для РНК-интерференции, является эффективным для лечения или предупреждения нейродегенеративных заболеваний или нарушений, как здесь заявлено. В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Lp-PLA2, можно оценить в моделях на животных для определения эффекта на облегченную проницаемость ВВВ. Например, можно использовать описанную здесь в примерах модель гипергликемии и ги-перхолестеринемии на свинье, в которой проницаемость ВВВ является аномальной, например, ВВВ является проницаемым, используя которую проницаемость ВВВ можно оценить в присутствии и в отсутствие ингибиторов Lp-PLA2 с помощью способов, широко известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления можно использовать индикаторы функционирования ВВВ, например, как описывается в патенте США № 6884591, который полностью включен посредством ссылки.
В конкретном варианте осуществления ингибиторы Lp-PLA2, описанные в патентах США № 6649619 и 7153861, которые полностью включены сюда посредством ссылки (и международная заявка WO 01/60805), и в патенте США № 7169924, который полностью включен сюда посредством ссылки (и международная заявка на патент WO 02/30911), применимы в раскрытых здесь способах для профилактики или для лечения сосудистой деменции, например болезни Альцгеймера и/или нарушений проницаемости ВВВ. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы Lp-PLA2, описанные в публикации заявки на патент США № 20005/0033052А1, которая полностью включена сюда посредством ссылки, и в международных заявках на патенты WO 02/30904, WO 03/042218, WO 03/042206, WO 03/042179, WO 03/041712, WO 03/086400 и WO 03/87088, являются обратимыми ингибиторами Lp-PLA2.
Формула (I):
где
Ra и Rb вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5-членное карбоциклическое кольцо;
Можно использовать группу обратимых ингибиторов Lp-PLA2, которые описываются в международной заявке WO 01/60805, из которой произошли патенты США № 6649619 и 7153861, которые полностью включены сюда посредством ссылки, полное раскрытие которых включено сюда, как если бы оно было представлено в этом документе. Более узкой группой представляющих интерес соединений являются соединения формулы (I), описанные в WO 01/60805 и заявленные в патентах США № 6649619 и 7153861, а именно
R2 представляет собой фенил, замещенный одним-тремя атомами фтора; R3 представляет собой метил или О^^алкил, замещенный NR8R9; или
R3 представляет собой Het-Qo^^raui, в котором Het представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, имеющее N, и в котором N не замещен или замещен С(1-6)алкилом;
вместе образуют составляющую 4-(4-трифторметилфенил)фенил;
R8 и R9, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из группы, состоящей из водорода и С(1-6)алкила;
X представляет собой S,
или их фармацевтически приемлемая соль.
Еще больший интерес представляют следующие соединения, все из которых подпадают под формулу (I) и описываются в заявке и патентах, отмеченных выше: 1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-
трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-
фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он, использованный в
описанном здесь исследовании на свинье;
1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2- (2,3-дифторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-{4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(3,4-дифторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
1-{N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(2,3,4-трифторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он;
1-(N-(2-диэтиламино)Этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-{2-фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
1-(Ы-метил-N-{4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он;
1-(Ы-(2-(1-пиперидине)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он;
1-(И-(1-этилпиперидин-4-ил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
1-(N-(2-этиламино-2-метилпропил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он,
(Ы-(2-трет-бутиламиноэтил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
1-(N-(1-метилпиперидин-4-ил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он;
1-(N-(1-изопролштиперидин-4-ил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
1-(N-{1-(2-метоксиэтил)пипериДин-4-ил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
1-(N-(2-(этиламино)этил)-Ы-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,б-триметиленпиримидин-4-он;
или
фармацевтически приемлемая соль этих соединений.
Способы приготовления этих соединений описываются в отмеченных документах.
Второй способ получения 1-^-(2-(диэтиламино)этил)^-(4-(4-трифторметилфенил)бен-зил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она можно найти в заявке WO 03/016287 (публикации заявки на патент США № 20050014793А1), которая полностью включена сюда посредством ссылки.
Формула (II):
Дальнейшая группа соединений, которые можно использовать при осуществлении на практике способов настоящего изобретения, описывается в WO 02/30911, патент США № 7169924 соответствует этой международной заявке. И заявка, и патент включены сюда полностью. В этом случае общей формулой, представленной здесь как формула (II), является следующая формула:
где
R1 представляет собой арильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1-6)алкила, С(1-6)алкокси, С(1-6)алкилтио, гидрокси, галогена, CN и от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила;
R2 представляет собой галоген, С(1-3)алкил, С(1-3)алкокси, гидроксиС(1-3)алкил, С(1-3)алкилтио, С(1-3)ал-килсульфинил, аминоС(1-3)алкил, моно- или ди-С(1-3)алкиламиноС(1-3)алкил, С(1-3)алкилкарбониламиноС(1-3)алкил, С(1-3)алкоксиС(1-3)алкилкарбониламиноС(1-3)алкил, С(1-3)алкилсульфониламиноС(1-3)алкил, С(1-3)алкилкарбокси, С(1-3)алкилкарбоксиС(1-3)алкил, и
R3 представляет собой водород, галоген, С(1-3)алкил или гидроксиС(1-3)алкил; или
R2 и R3 вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к
которым они присоединены, образуют сконденированное 5- или 6-членное карбоциклическое коль-
цо; или
R2 и R3 вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденированное бензо- или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из галогена, С(1-4)алкила, циано, С(1-6)алкокси, С(1-6)алкилтио или от монофтор-С(1-3)алкила до перфтор-С(1-4)алкила;
R4 представляет собой водород, С(1-6)алкил, который может быть не замещен или замещен 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из гидрокси, галогена, OR7, COR7, карбокси, COOR7, CONR9R10, NR9R10, NR7COR8, моно- или ди-(гидроксиС(1-6)алкил)амино и N-гидроксиС(1-3)алкил-N-C(1-6)алкиламино; или
R4 представляет собой Нег-О^^алкил, в котором Het представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, включающее N и необязательно О или S, и в котором N может быть замещен COR7, COOR7, CONR9R10 или С(1-6)алкилом, необязательно замещенным 1, 2 или 3 заместителями, и выбраны из гидрокси, галогена, OR7, COR7, карбокси, COOR7, CONR9R10 или NR9R10, например, пиперидин-4-илом, пирролидин-3-илом;
представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1-6)алкила, С(1-6)алкокси, С(1-6)алкилтио, арилС(1-6)алкокси, гидрокси, галогена, CN, COR7, карбокси, COOR7, NR7COR8, CONR9R10, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, от монофтор-С0-4)алкила до перфтор-С0-4)алкила и от моно-фтор-С^1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси;
R6 представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, которое дополнительно необязательно замещено 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, выбираемыми из С(1-18)алкила, С(1-18)алкокси, С(1-6)алкилтио, С^^алкилсульфонила, арилС(1-6)алкокси, гидрокси, галогена, CN, COR7, карбокси, COOR7, CONR9R10, NR7COR8, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила и от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси, или С(5-10)алкил;
представляет собой водород или С(1-12)алкил, например, С(1-4)алкил (например, метил или этил);
представляет собой водород, OC(1-6^raui или С(1-12)алкил, например, С(1-4)алкил (например, метил или этил);
R9 и R10, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают, каждый, из водорода или С(1-12)алкила, или R9 и R10 вместе с азотом, с которому они присоединены, образуют 5-7-членное кольцо, необязательно содержащее один или несколько дополнительных гетероатомов, выбранных из кислорода, азота и серы, и необязательно замещенное одним или двумя заместителями, выбранными из гидрокси, оксо, С(1-4)алкила, С(1-4)алкилкарбокси, арила, например фенила, или аралкила, например бензила, например морфолина или пиперазина; и
X представляет собой С(2-4)алкилен, необязательно замещенный 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из метила и этила, или СН=СН.
В способе лечения настоящего изобретения можно также использовать все соли соединений формулы (II).
Особый интерес представляют соединения формулы (II) здесь, в которых, как отмечено в WO 02/30911 для формулы (I) там, R1 может быть фенильной группой, необязательно замещенной 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, выбранными из галогена, C(1-6)алкила, трифторметила или C(1-6)алкокси. Конкретнее, фенил является незамещенным или замещенным 1, 2, 3 или 4 заместителями-галогенами, в частности 1-3 группами фтора, а конкретнее, R1 является 2,3-дифторфенилом, 2,4-дифторфенилом или 4-фторфенилом.
Дальнейшим вариантом формулы (II) здесь является вариант, в котором X представляет собой
-СН2СН2-. 2
Кроме того, интерес представляют соединения формулы (II), в которых R2 представляет собой водород, по умолчанию, или галоген, С(1-6)алкил, от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-C(1-4)алкила, от мо-нофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси или С(1-6)алкокси, особенно от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила, от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси или С(1-6)алкокси. Особый интерес представляют соединения формулы (II), в которых R2 отличен от водорода, n в (R2)n равно 1, 2 или 3, и характером замены является мета и/или пара, особенно пара, т.е. заместитель в 4-положении. См. также те соединения, в которых R2 является 4-трифторметилом или 4-трифторметокси.
R3 и R4 могут быть одинаковыми или разными и представляют собой метил, этил, н-пропил или н-бутил. Особый интерес представляют соединения формулы (II) здесь, в которых R3 и R4 являются одинаковыми и представляют собой метил или этил, метил представляет особый интерес.
R5 может быть водородом, С(1-6)алкилом, который является неразветвленным или разветвленным. Особый интерес представляет метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, т-бутил, н-пентил или н-гексил.
Будет понятно, что в пределах соединений формулы (II) существует дополнительная подгруппа соединений, в которых
R1 представляет собой 2,3-дифторфенил;
R2 и R3 вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют слитое 5-членное циклопентенильное кольцо;
представляет собой 2-(диэтиламино)этил;
представляет собой фенил; R6 представляет собой фенил, замещенный трифторметилом в 4-положении, или тиен-2-ил, замещенный трифторметилом в 5-положении; и X представляет собой (СН2)2.
Конкретными соединениями формулы (II), представляющими здесь интерес, являются N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-
оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]-ы-(4'-
трифторметилбифенил- 4-илметил)ацетамид;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-{2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 -оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]-N-(4'-трифторыетилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N- <2-зтиламино-2-метилпропил)-2-(2-{2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-{2 -трет-бутиламиноэтил)-2-(2-(2-(2,3 -дифторфенил)этил)
4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-(2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-фтор-2-(трифторметил)фенил)этил)-4-оксо-4, 5,6,7-
тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N- (2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-фтор-З-(трифторметил)фенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-
тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы- (2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(З-хлор-4-фторфенил)этил)-4 оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
(+/-)-N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-фенилпропил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(2,4-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(2,5-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(3,4-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-В-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(2-фторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7 -тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-{4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N- (2-дизтиламиноэтил)-2-(2-(2-(3-фторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(3-хлорфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-{4'
трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-{2-(2-(4-хлорфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-метилфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-И-(4' -трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-(трифторметил)фенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-
тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-метоксифенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4' -трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-(2-(2-(4-(трифторметокси)фенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-
тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил)-N-(4'-трифторметилбифенил-
4-илметил)ацетамида битартрат; или свободное основание любой из солей битартратов, или другая фармацевтически приемлемая
соль.
Кроме того, представляют интерес соединения формулы (III), описанные в WO 02/30904:
где
R1 представляет собой арильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1-6)алкила, С(1-6)алкокси, С(1-6)алкилтио, гидрокси, галогена, CN, от монофтор-C(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила, от монофтор-С(1-4)ал-коксиарила до перфтор-С(1-4)алкоксиарила и арилС(1-4)алкила;
R2 представляет собой галоген, С(1-3)алкил, С(1-3)алкокси, гидроксиС(1-3)алкил, С(1-3)алкилтио, С(1-3)ал-килсульфинил, аминоС(1-3)алкил, моно- или ди-С(1-3)алкиламиноС(1-3)алкил, С(1-3)алкилкарбониламиноС(1-3)-алкил, С(1-3)алкоксиС(1-3)алкилкарбониламиноС(1-3)алкил, С(1-3)алкилсульфониламиноС(1-3)алкил, С(1-3)ал-килкарбокси, С(1-3)алкилкарбоксиС(1-3)алкил, и
представляет собой водород, галоген, С(1-3)алкил или гидроксиС(1-3)алкил; или
R2 и R3 вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5- или 6-членное карбоциклическое кольцо; или
R2 и R3 вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное бензо- или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из галогена, С(1-4)алкила, циано, С(1-3)-алкоксиС(1-3)алкила, С(1-4)алкокси или С(1-4)алкилтио, или от монофтор-C(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)-алкила;
R4 представляет собой водород, С(1-6)алкил, который может быть не замещен или замещен 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из гидрокси, галогена, OR7, COR7, карбокси, COOR7, CONR9R10, NR9R10, NR7COR8, моно- или ди- (гидроксиС(1-6)алкил)амино и N-гидроксиС(1-6)алкил-N-C(1-6)алкиламино; или
R4 представляет собой He^C^^^Mm, в котором Het представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, включающее N и необязательно О или S, и в котором N может быть замещен COR7, COOR7, CONR9R10 или С(1-6)алкилом, необязательно замещенным 1, 2 или 3 заместителями, выбранными из гидрокси, галогена, OR7, COR7, карбокси, COOR7, CONR9R10 или NR9R10, например, пиперидин-4-илом, пирролидин-3-илом;
представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1-6)алкила, С(1-6)-алкокси, С(1-6)алкилтио, арилС(1-6)алкокси, гидрокси, галогена, CN, COR7, карбокси, COOR7, NR7COR , CONR9R10, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, от монофтор-С0-4)алкила до перфтор-С0-4)алкила и от моно
фтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси;
представляет собой арильное или гетероарильное кольцо, которое дополнительно необязательно замещено 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из С(1-6_)-алкила, С(1-6)алкокси, С^^алкилтио, C(1-6)алкилсульфонила, арилС(1-6)алкокси, гидрокси, галогена, CN, COR, карбокси, COOR7, CONR9R10, NR7COR8, SO2NR9R10, NR7SO2R8, NR9R10, от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила и от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси, или C(5-10)алкила;
R7 и R8 независимо представляют собой водород или С(1-12)алкил, например, С(1-4)алкил (например, метил или этил);
R9 и R10, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают, каждый, из водорода или Q1-12> . алкила, или R9 и R10 вместе с азотом, с которому они присоединены, образуют 5-7-членное кольцо, необязательно содержащее один или несколько дополнительных гетероатомов, выбираемых из кислорода, азота и серы, и необязательно замещенное одним или двумя заместителями, выбираемыми из гидрокси, ок-со, С(1-4)алкила, С(1-4)алкилкарбокси, арила, например фенила, или аралкила, например бензила, например морфолина или пиперазина; и
X представляет собой С(2-4)алкиленовую группу (необязательно замещенную 1, 2 или 3 заместителями, выбираемыми из метила и этила), СН=СН, (CH2)nS или (СН2)nO, где n равно 1, 2 или 3;
или их фармацевтически приемлемая соль.
Особый интерес представляют соединения формулы (III), в которых R2 и R3 вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное бензо- или гете-роарильное кольцо, необязательно замещенное 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, выбираемыми из галогена, С(1-4)алкила, циано, С(1-4)алкокси или С(1-4)алкилтио, или от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила. Предпочтительно R1 представляет собой фенил, необязательно замещенный галогеном, С(1-6)алкилом, трифторметилом, C(1-6)алкокси, предпочтительно 1-3 фторами, более предпочтительно R1 является 2,3-дифторфенилом.
Репрезентативные примеры R4 включают пиперидин-4-ил, замещенный в 1-положении метилом, изопропилом, 1-(2-метоксиэтилом), 1-(2-гидроксиэтилом), трет-бутоксикарбонилом или этоксикарбо-нилметилом; этил, замещенный во 2-положении аминоэтилом; 1-этилпиперидинилметил; пиперидин-4-ил; 3-диэтиламинопропил; 4-пирролидин-1-илбутил и 1-этилпирролидин-3-ил. Предпочтительно R4 представляет собой 1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил, 1-метилпиперидин-4-ил или 1-этилпирролидин-3-ил. Репрезентативные примеры R5 включают фенил и пиридил. Предпочтительно R5 представляет собой фенил. Репрезентативные примеры R6 включают фенил, необязательно замещенный галогеном или три-фторметилом, предпочтительно в 4-положении, и гексил. Предпочтительно R6 представляет собой фенил, замещенный трифторметилом в 4-положении. Дополнительные репрезентативные примеры R6 включают фенил, замещенный 1 или несколькими C(1-3)алкилами. Предпочтительно R6 представляет собой фенил, замещенный этилом в 4-положении. Предпочтительно R5 и R6 вместе образуют заместитель 4-(фенил)фенил или 2-(фенил)пиридинил, в котором отдаленное фенильное кольцо может быть необязательно замещено галогеном или трифторметилом, предпочтительно в 4-положении. Предпочтительно X представляет собой С(2-4)алкилен, более предпочтительно С(2-3)алкилен, наиболее предпочтительно (СН2)2 или CH2S.
Будет понятно, что в пределах группы соединений формулы (III) существует подгруппа соединений, в которых
R1 представляет собой 2,3-дифторфенил;
R2 и R3 вместе с атомами углерода пиридонового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденситованное бензо- или пиридокольцо;
представляет собой 1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил; R5 и R6 вместе образуют заместитель 4-(фенил)фенил, в котором отдаленное фенильное кольцо замещено трифторметилом, предпочтительно в 4-положении; и X представляет собой CH2S или (СН2)2. Представляют интерес следующие соединения формулы (III):
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторбензилтио)-4-0KCO-4H-хинолин-1-ил]-N-{4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-OKCO-4H-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-{2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 -оксо- 4 Н-хинолин-1-ил](4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-Н-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбеизилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
М-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 -оксо-4Н-[1,9]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Н-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-этилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[5-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2¦ метил-7-оксо-7Н-тиаэоло[4,5-Ь]пиридин-4-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
(±) N-(1-этилпирролидин-З-ил)-2-[2-(2-(2,3
дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ы-(4 ' -трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
(±) N-(1-зтилпирролидин-З-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио) 4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил}ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбенэилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида лигидрохлорид;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2,3-
дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-
трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида моно пара
толуолсульфонат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2 - [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2- (2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида моногидрохлорид;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида дигидрохлорид;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2- [2-(4-фторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2- [2-(4-фторбензилтио)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2- [2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-5, б-триметиленлиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(4-фторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2- [2-(2-(3,4-дифторфенил)этил)-4-оксо- 4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4
илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2-фторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(3-хлорфенил)зтил)-4-оксо-4 Н-хинолин-1-ил J-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 -OKCO-4H-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 0КСО-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4 Н-хинолин-1-ил]-К-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-пирролидин-1-илэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)зтил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2 - [2-(2 - (2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-пиперидин-1-илэтил)-2 -[2 -(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-7-фтор-4 оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-5-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2-метил-7-оксо-7Н-тиено[3,2-Ь]пиридин-4-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-5,6-диметил-4-оксо-4Н-пиридин-1-ил]-М-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-5-этил-4-оксо-4Н-пиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4
илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-И-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-тиено[3,4-Ь]пиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-{1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2 -(2,3-дифторбензилтио)-4 -оксо- 4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-пирролидин-1-илэтил)-2-[2 -(2,3-дифторбензилтио)-4 -оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-этилпипериДин-4-ил)-2-[б-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 метил-4-оксо-4Н-пиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-К-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-иэопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-ОКСО-4Н-ХИНОЛИН-1-ИЛ]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы- (1-этилпиперидин-4-илметил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил](4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(3-диэтиламинопропил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо 4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(4-пирролидин-1-илбутил)-2- [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил) 4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(3-диэтиламинопропил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-ОКСО-4Н-ХИНОЛИН-1-ил]-М-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(4-пирролидин-1-илбутил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4
илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2- [5-(2,3-дифторбензилтио)-7-оксо-7Н-тиено[3, 2-Ь]пиридин-4-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[5-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 -метил-7-оксо-7Н-тиазоло[4,5-Ь]пиридин-4-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-этилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо- 4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-этилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-изопропилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
И-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо- 4 Н-хинолин-1-ил]-Ы-(4'-изопропилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-этилпиперидин-4-ил)-2 - [2-(2,3-дифторбензилтио)-4-ОКСО-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 -оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-метилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-ХИНОЛИН-1-ил]-N-(4'-метилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этоксикарбонилметилпилеридин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил](4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-Ы-(4'
трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2, 3-дифторбензилтио)-4-оксо-4 Н-хинолин-1-ил]-N-(3',4'-диметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(3',4'-дифторбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[6-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-тиено[2,3-Ь]пиридин-7-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2 - [2-(2-(2,3,4-трифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[6-(2,3-дифторбензилтио)-2-метил-4-оксо-2,4-дигидропиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Н-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[б-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 этил-4-оксо-2,4-дигидропиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[б-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 изопропил-4-оксо-2,4-дигидропиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-N-(4' трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-зтилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-этилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2- [5-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2-метил-7-оксо-7Н-тиазоло[4,5-Ь]пиридин-4-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2- [5- (2- (2,3-дифторфенил)этил)-2-метил-7-оксо-7Н-тиазоло[4,5-Ь]лиридин-4
ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-этилпиперидин-4-ил)-2- 12-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-N-{4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;
Н-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-N-(4' -трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[Б-(2-(2,3-дифторфенил)зтил)-2 метил-7-оксо-2,7-дигидропиразоло[4,3-Ь]пиридин-4-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[5-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-1 метил-7-оксо-1,7-дигидропиразоло[4,3-Ь]пиридин-4-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил}этил)-4 оксо-5,б-триметиленпиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-7 метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-7-метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-7-метил-4-OKCO-4H-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-7-метил-4-оксо-4Н-[1,85 нафтиридин-1-ил]-N- <4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-7-метил-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N
(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-метилпиперидин-4-ил)-2- [2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4 -илметил)ацетамида битартрат;
N-{1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2 -{2,3-дифторбензилтио)-4 -оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-N-{4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-изопропилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;
N-{1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-5,6-триметиленпиридин-1-ил](4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-5,б-тетраметиленпиридин-1-ил]-Ы-(4'-трифторметилбифенил-4 илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Ы-(1-метилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
И-(1-этилпиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4 оксо-4 Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Н-(1-(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2 - [2 - (2- (2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил](4'-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
Н-(1-изопропилперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-хлорбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[6-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-2-метил-4-оксо-4Н-пиразоло[3,4-Ь]пиридин-7-ил]-И-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'
трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-{1-этиллиперидин-4-ил}-2- [6- (2-(2,3-дифторфенил)этил)-2 (2-метоксиэтил)-4-оксо-4Н-пиразоло[3,пиридин-7-ил](4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2- [4-оксо-2- (2-(2,3,4-трифторфенил)зтил)- 4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2- [2-(2-(2,4-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2- [2-(2-(3-фторфенил)этил)-4-оксо-4Н^хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-{пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-{пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
М-(пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-5,б-триметиленпиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(пиперидин-4-ил)-2- [2-(2-{2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4Н-[ 1,81нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
N-(пиперидин-4-ил)-2- [2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-[1,8]нафтиридин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида трифторацетат;
Ы-(2-зтиламинозтил)-2- [2-{2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил](4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(2-этиламиноэтил)-2- [2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо 4 Н-хинолин-1-ил]-N-{4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-(1-(2-гидроксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)зтил)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат;
или их свободное основание или другая фармацевтически приемлемая соль. Формула (IV):
Также представляют интерес соединения формулы (IV)
где
R1 представляет собой арильную группу, незамещенную или замещенную 1, 2, 3 или 4 заместите-
лями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из группы, состоящей из С(1-6)алкила, С(1-6)алкокси, С(1-6)алкилтио, арил-С(1-6)алкокси, гидрокси, галогена, CN, COR6, COOR6, NR6COR7, CONR8R9, SO2NRV, NR6SO2R7, NR8R9, галоген-С^^алкила и галоген-С^алкокси;
W представляет собой СН, а X представляет собой N, или W представляет собой N, а X представляет собой СН, и W, и X представляют собой СН, или и W, и X представляют собой N;
Y представляет собой С^алкил,
R2 представляет собой водород, С^^алкил, С^^алкокси, С^алкилтио, арил-С^^алкокси, гидро
кси, галоген, CN, COR6, карбокси, COOR6, NR6COR7, CONR8R9, SO2NR8R9, NR6SO2R7, NR8R9, от моно-фтор-С(1-6)алкила до перфтор-С(1-6)алкила или от монофтор-С(1-6)алкокси до перфтор-С(1-6)алкокси;
n равно 0-5;
представляет собой С(1-4)алкил; представляет собой С(1-4)алкил;
R5 представляет собой водород, С(1-10)алкил, С(2-10)алкенил, С(2-10)алкинил, галоген-С(1-4)алкил, С(3-8)-циклоалкил, C(3-8)Циклоалкил, С(3-8)Циклоалкил-С(1-4)алкил, С(5-8)Циклоалкенил, С(5-8)Циклоалкенил-С(1-4)-алкил, 3-8-членный гетероциклоалкил, 3-8-членный гетероциклоалкил-С(1-4)алкил, С(6-14)арил, С(6-14)арил-С(1-10)алкил, гетероарил или гетероарил-С(1-10)алкил; причем
каждая группа необязательно замещена один или несколько раз одной и той же и/или отличной группой, которая является С(1-6)алкокси, С(1-6)алкилтио, арил-С(1-6)алкокси, гидрокси, галогеном, CN, NR8R9 или галоген-С(1-4)алкокси;
R6 и R7 независимо представляют собой водород или С(1-10)алкил;
R8 и R9 являются одинаковыми или разными и представляют собой водород или С(1-10)алкил, или R9 и R10 вместе с азотом, к которому они присоединены, образуют 5-7-членное кольцо, необязательно содержащее один или несколько дополнительных гетероатомов, выбираемых из кислорода, азота и серы, и необязательно замещенное одним или двумя заместителями, выбираемыми из группы, состоящей из гид-рокси, оксо, С(1-4)алкила, С(1-4)алкилкарбокси, арила и арил-С(1-4)алкила;
или их фармацевтически приемлемая соль.
Без намерения исключить какие-либо заданные заместители и/или перечисленные радикалы из объема формулы (IV), следующие группы R и ассоциированные радикалы представляют особый интерес.
Что касается R1, он может представлять собой фенильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3 или 4 заместителями, которые могут быть одинаковыми или разными, и выбраны из галогена, С(1-6)-алкила, трифторметила или С(1-6)алкокси. Конкретнее, фенил не замещен или замещен 1, 2, 3 или 4 заместителями - галогенами, в частности 1-3 группами фтора, а конкретнее R1 представляет собой 2,3-дифтор-, 2,4-дифтор- или 4-фторфенил.
Дальнейшим вариантом соединений формулы (I) здесь является вариант, в котором Y представляет собой -СН2СН2-.
Настоящим изобретением также обеспечивается соединение формулы (I), в котором R2 представляет собой водород, по умолчанию, или галоген, С(1-6)алкил, от монофтор-С(1-4)алкила до перфтор-С(1-4)алкила, от мо-нофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси или С(1-6)алкокси, особенно от монофтор-С(1-4)алкила до пер-фтор-С(1-4)алкила, от монофтор-С(1-4)алкокси до перфтор-С(1-4)алкокси или С(1-6)алкокси. Особый интерес представляют соединения, в которых R2 отличен от водорода, n в (R2)n равно 1, 2 или 3, и характером замены является мета и/или пара, особенно пара, т.е. заместитель в 4-положении. Приводимые в качестве примеров соединения включают соединения, в которых R2 является 4-трифторметилом или 4-трифторметокси.
R3 и R4 могут быть одинаковыми или разными и представляют собой метил, этил, н-пропил или н-бутил. Особый интерес представляют соединения формулы (I), в которых R3 и R4 являются одинаковыми и представляют собой метил или этил, метил представляет особый интерес.
R5 может быть водородом, С(1-6)алкилом, который является неразветвленным или разветвленным. Особый интерес представляет метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил или н-гексил.
Любое из описанных здесь выше соединений можно приготовить в кристаллической или некристаллической форме, и, если оно в некристаллической форме, может быть сольватировано, например, в виде гидрата. В объем этого изобретения включены стехиометрические сольваты (например, гидраты).
Некоторые из описанных здесь соединений могут содержать один или несколько хиральных атомов или, иначе, способны существовать в виде двух энантиомеров. Соединения, применимые в описанных здесь способах, включают смеси энантиомеров, а также чистые энантиомеры или энантиомерно обогащенные смеси. В объем настоящего изобретения также включены индивидуальные изомеры соединений, представленных формулами (I)-(IV), а также полностью или частично уравновешенные их смеси. Настоящим изобретением также охватываются индивидуальные изомеры заявленных соединений в виде смесей с их изомерами, в которых один или несколько хиральных центров инвертированы. Понятно, что в объем соединений формул (I)-(IV) также включены любые таутомеры и смеси таутомеров. Различные изомерные формы можно разделить друг от друга с помощью общепринятых способов, или любой данный изомер можно получить с помощью общепринятых способов синтеза или с помощью стереоспеци-фических или асимметрических синтезов.
Синтезы соединений формул (I), (II), (III) и (IV)
Способы приготовления соединений формул (I), (II), (III) и (IV) опубликованы в патентной литературе. Например, способы получения соединений формулы (I) можно найти в WO 01/60805 и WO 03/016287. Способы получения соединений формулы (II) были представлены в WO 02/30911. А способы получения соединений формулы (III) можно найти в WO 02/30904. В этом документе предоставляются способы получения соединений формулы (IV), которые перенесены сюда из предварительных заявок на
патенты США 60/829328 и 60/829327, которые включены сюда посредством ссылки.
Ниже представлены некоторые примеры синтезов. Для проведения различий между несколькими
общими группами соединений в примерах здесь, материалы, относящиеся к формуле (I), будут отмечены
как "Пример метода синтеза и следующие, для формулы (II) - "Пример метода синтеза (II)-1" и сле-
дующие, для формулы (III) - "Пример метода синтеза и следующие, и для формулы (IV) - "При-
мер метода синтеза (IV)-1" и следующие.
Синтез соединений формулы (I).
Соединения формулы (I) можно приготовить по схеме I процессов, как раскрыто в WO 01/60805.
Схема I
где
L3 представляет собой С(1-6)алкильную группу, например метил;
R15 представляет собой С(1-6)алкильную группу, например этил или трет-бутил; и
L1, L2, Ra, Rb, Rc, R2, R3, R4, R5, n, X, Y и Z такие, как определено в WO 01/60805.
Приводимой в качестве примера реакцией для получения представляющего интерес соединения формулы (I) является следующая реакция.
Пример метода синтеза (1)-1(а). 1-(№(2-Диэтиламино)этил)^-(4-(4-трифторметилфе-нил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он
Промежуточный продукт В69 в WO 01/60805 (87,1 г, 9,26 моль) суспендировали в дихлорметане (2,9 л). Добавляли 1-гидроксибензотриазола гидрат (35,2 г, 0,26 моль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (99,7 г, 0,52 моль) и суспензию перемешивали в течение составляющего 45 мин периода времени, по истечении которого получали полное растворение. Добавляли промежуточный продукт А30 в WO 01/60805 (91,2 г, 0,26 моль) в виде раствора в дихлорметане (100 мл) в течение 5 мин и раствор перемешивали в течение 4 ч. Добавляли смесь насыщенный раствор аммония хлори-да:вода (1:1, 1 л) и раствор перемешивали в течение 10 мин. Органическую фазу отделяли и экстрагировали смесью насыщенный раствор аммония хлорида:вода (1:1, 1 л), экстракты имели рН 6. Органическую фазу отделяли и экстрагировали водой (1 л), содержащей уксусную кислоту (10 мл), экстракт имел рН 5. Дихлорметановый слой отделяли и экстрагировали смесью насыщенный раствор натрия карбона-та:вода:насыщенный соляной раствор (1:3:0,2, 1 л), рН 10,5, а затем смесью насыщенный соляной рас-твор:вода (1:1, 1 л). Коричневый раствор сушили над безводным натрия сульфатом в присутствии обесцвечивающего угля (35 г), фильтровали и растворитель удаляли в вакууме с получением темно-коричневого вспененного материала. Вспененный материал растворяли в изопропилацетате (100 мл) и растворитель удаляли в вакууме. Темно-коричневый вязкий остаток растворяли в кипящем изопропил
ацетате (500 мл), охлаждали до комнатной температуры, затравляли и перемешивали в течение ночи. Полученное светло-кремовое твердое вещество отфильтровывали и промывали изопропилацетатом (100 мл). Твердое вещество было осушено с использованием всасывания в агломерат в течение 1 ч, затем рек-ристаллизовано из изопропилацетата (400 мл). После перемешивания в течение ночи образованное твердое вещество отфильтровывали, промывали изопропилацетатом (80 мл) и сушили в вакууме с получением приведенного в заголовке соединения, 110 г, выход: 63,5%.
1H ЯМР (CDCl3, смесь ротамеров приблизительно 1,9:1) 5 0,99 (6Н, т), 2,10 (2Н, м), 2,50 (4Н, кв.),
2,58/2,62 (2Н, 2х т), 2,70/2,82 (2Н, 2х т), 2,86 (2Н, т), 3,28/3,58 (2Н, 2х т), 4,45/4,52 (2Н, 2х с), 4,68/4,70
(2Н, 2х с), 4,93 (2Н, с), 6,95 (2Н, м), 7,31 (2Н, д), 7,31/7,37 (2Н, 2х м), 7,48/7,52 (2Н, д), 7,65 (2Н, м), 7,72 (2Н, м); МС (APCI) (М+Н)+ 667; mp 125°С (согласно ДСК - ассиметричным эндотермам).
Пример метода синтеза (I)-1(b). 1-(№(2-Диэтиламино)этил)-№(4-(4-трифторметил-фенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она битартрат
Приготовлен из промежуточных продуктов А30 и В69 в WO 01/60805 с помощью способа примера 1 в WO 01/60805.
1Н ЯМР (с16-ДМСО, смесь ротамеров приблизительно 1:1) 5 0,92/0,99 (6Н, 2х т), 1,99 (2Н, м), 2,54 (6Н, м), 2,68/2,74 (4Н, м), 3,36 (2Н, м), 4,21 (2Н, с), 4,37/4,44 (2Н, 2х с), 4,63/4,74 (2Н, 2х с), 4,89/5,13 (2Н, 2х с), 7,08/7,14 (2Н, 2х м), 7,36-7,50 (4Н, м), 7,64/7,70 (2Н, 2х д), 7,83 (4Н, м); MS (APCI + ) обнаружила (M+1)=667; C36H38F4N4O2S подразумевает 666.
Пример метода синтеза (!)-1(с). 1-(№(2-Диэтиламино)этил)-^(4-(4-трифторметил-фенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она гидрохлорид
Свободное основание из примера (Г)-1(а) (3,00 г, 0,0045 моль) суспендировали при перемешивании в изопропаноле (30 мл) и нагревали до 45°С с получением прозрачного раствора. Раствор затем охлаждали до температуры окружающей среды и добавляли концентрированную соляную кислоту (0,40 мл, 0,045 моль). Результирующую взвесь затем перемешивали при температуре окружающей среды в течение 35 минут, перед охлаждением до 0°С в течение 35 мин. Взвесь затем фильтровали и промывали изопропа-нолом (10 мл), а затем гептаном (30 мл), перед высушиванием под вакуумом с получением приведенного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (3,00 г, 95%).
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,38 (6Н, т), 2,08 (2Н, м), 2,82 (2Н, т), 2,99 (2Н, т), 3,19 (4Н, м), 3,35 (2Н, м), 3,97
(2Н, с), 4,42 (2Н, с), 4,81 (2Н, с), 4,99 (2Н, с), 6,87 (2Н, т), 7,26 (2Н, т), 7,33 (2Н, д), 7,41 (2Н, д), 7,53 (2Н,
д), 7,71 (2Н, д), 11,91 (1Н, с).
Синтез соединений формулы (II).
Описание того, как получить соединения формулы (II) и примеры промежуточных и конечных продуктов для названных выше соединений, можно найти в опубликованной международной заявке WO 02/30911, которая включена сюда посредством ссылки. Способом последней стадии для получения соединения, применимого в этом изобретении, является пример (II)-1.
Пример метода синтеза (II)-1. №(2-Диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида битартрат
Раствор ^№диэтил-№-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)этан-1,2-диамина (промежуточного продукта D4 в WO 02/30911) (0,50 г, 1,44 ммоль), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (0,56 г, 1,45 ммоль), 1-гидроксибензотриазола гидрата (0,12 г) и 2-(2-[2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапиримидин-1-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1 в WO 02/30911) (0,48 г, 1,44 ммоль) в дихлорметане (10 мл) перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи, затем разбавляли дихлорметаном (30 мл), промывали водным раствором натрия бикарбоната и подвергали выпариванию. Остаток очищали с помощью хроматографии (картриджа с 10 г диоксида кремния, с использованием этилацетата-ацетона) с получением приведенного в заголовке соединения в виде желтого вспененного материала (свободного основания) (0,50 г, 52%).
1Н ЯМР (ДМСО, смесь ротамеров) 5 0,83-0,89 (6Н, м), 1,98 (2Н, м), 2,40 (4Н, м), 2,45-2,82 (10Н, м), 3,02 (2Н, м), 4,64/4,75 (2Н, 2хс), 4,96/5,19 (2Н, 2хс), 7,11-7,40 (5Н, м), 7,65 (2Н, м), 7,84 (4Н, м); MS (APCI+) обнаружила (M+1)=667; C37H39F5N4O2 подразумевает 666.
1-Винную кислоту (0,09 г, 0,60 ммоль) добавляли к раствору свободного основания (0,40 г, 0,60 ммоль) в метаноле (10 мл) при перемешивании. Результирующий раствор подвергали выпариванию для получения соли (0,49 г). 1Н ЯМР (ДМСО, смесь ротамеров) 5 0,85-0,97 (6Н, м), 1,91-2,00 (2Н, м), 2,402,49 (4Н, м), 2,54-2,82 (10Н, м), 3,02-3,46 (2Н, м), 4,20 (2Н, с), 4,64/4,75 (2Н, 2хс), 4,97/5,18 (2Н, 2хс), 7,11-7,40 (5Н, м), 7,65 (2Н, м), 7,84 (4Н, м); MS (APCI+) обнаружила (М+1)=667; C37H39F5N4O2 подразумевает 666.
Следуя этому методу, или альтернативно другим методам, описанным в WO 02/30911, можно приготовить другие названные выше соединения, которые имеют структуру формулы (II).
Синтез соединений формулы (III)
Общий синтез соединений формулы (III) иллюстрируется на следующей схеме III, как представлено в WO 02/30904:
Схема III
Обращаясь к этой схеме, сложный эфир (IV) обычно готовят с помощью Ш-алкилирования (V), используя (VI), в котором R11 определен здесь выше, например, (VI) представляет собой трет-бутилбромацетат или этилбромацетат, в присутствии основания, например, BuLi в TNF или натрия гидрида в N-метилпирролидиноне (№ИР)(стадия с).
Когда X представляет собой CH2S, ключевой промежуточный продукт (IV) можно синтезировать путем осуществления реакции (XX) с диметилоксосульфония метилидом, созданным посредством обработки триметилсульфоксония йодида натрия гидридом при низкой температуре, для получения илида серы (XXII) (стадия q). Последующая обработка (XXII) сероуглеродом в присутствии диизопропилами-на, а затем R1CH2-L4, где L4 является уходящей группой, дает промежуточный продукт (IV) (стадия r).
Альтернативно, когда X представляет собой CH2S, заместитель R1X можно ввести путем замены уходящей группы L2 (например, С1) (стадия е) или на пиридине (VIII), или на пиридине N-оксиде (XIV) для предоставления 2-замещенных пиридинов (VII) и (XV). Преобразование (VII) или (XV) в 4-пиридон (V) осуществляют снятием защитной группы с 4-кислорода (например, используя (Ph3P)3RhCl, когда в водном растворе этанола, когда R12=аллил) (стадия d), а затем для (XVI), удалением замещающей N-оксидной группы, используя водород в присутствии Pd/C в уксусной кислоте (стадия k). Пиридин (VIII) или пиридина N-оксид (XIV) можно приготовить с помощью стадий (i), (h), (g), (f) и (j), на которых:
(j) осуществляют обработку (VIII) м-хлорпербензойной кислотой в дихлорметане;
(f) осуществляют обработку (IX) R12OH (X), в котором R12 представляет собой аллил, и натрия гидридом в DMF;
(g) осуществляют обработку (XI) хлорангидридом фосфорной кислоты;
(h) осуществляют обработку (XII) водным раствором HCl при нагревании;
(i) осуществляют обработку (XIII) (в котором R13 представляет собой О^^алкил, обычно R13=Et)
ди(низший алкил)малонатом и алкоголятом натрия в спирте; и
R1-CH2SH (XIX) обычно готовят из тиоацетата, который образуют из соответствующего алкилбро-мида R1-CH2Br.
Альтернативно, когда X представляет собой CH2S, a R2 и R3 вместе с атомами углерода пиридоно-вого кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное бензокольцо, промежуточный продукт (IV) можно синтезировать из известных исходных материалов с помощью стадий (s), (с) и (v), в которых
(s) осуществляют обработку кислоты Мелдрума (XXIII) натрия гидридом при низкой температуре с последующей реакцией с фенилизотиоцианатом и последующую обработку с использованием R1CH2-L4; (с) как обсуждалось выше;
(v) осуществляют обработку (XXV) трифторуксусной кислотой.
Когда X является алкиленом, предпочтительно использовать стадии (m) и (h) (промежуточные продукты (XVII), (XVIII)) или стадии (n) и (p) (промежуточные продукты (XIX), (XX), (XXI)), в которых
(h) осуществляют преобразование 4-замещенного пиридина в 4-пиридон, например, путем обработки (XVII) R14=Cl водным раствором HCl и диоксаном, или снятием защитной группы с R14=OR12, например, используя условия стадии (d);
(m) осуществляют удлинение цепи 2-алкилпиридина, например, где X=YCH2CH2, обработкой 2-метилпиридина (XVIII) R1-Y-CH2-L4 (XVI), где L4 является уходящей группой, и сильным основанием, таким как BuLi, в THF.
В альтернативном пути 3-эфирную группу удаляют из промежуточного продукта (XIX), где R15=C(1-6)-алкил, путем нагревания в дифенильном эфире, где R15=tBu (стадия n); промежуточный продукт (XIX) образуют из 2,6-диоксо-1,3-оксазина (XX) и сложного эфира (XXI) путем обработки основанием, таким как NaH, в DMF или 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-еном в дихлорметане.
Синтез (XX) из известных исходных материалов можно успешно выполнить через стадии (w) и (с) или стадии (у) и (с), в которых
(w) осуществляют обработку (XXVII) азидотриметилсиланом в THF;
(у) осуществляют обработку (XXVI) фосгеном;
(с) как описывается выше.
См. заявку WO 02/30904, которая включена сюда посредством ссылки, в отношении дополнительных подробностей и объяснения, как получить соединения формулы (III).
Пример метода синтеза N-(1-(2-Метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1-ил]-М-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид
Свободное основание готовили из промежуточного продукта Е1 и промежуточного продукта А42 с помощью способа примера 1 в WO 02/30904, за исключением использования DMF в качестве растворителя вместо дихлорметана. 1,97 г этого материала подвергали кристаллизации из н-бутилацетата (10 мл) для получения приведенного в заголовке соединения (1,35 г).
1H ЯМР (CD3OD) 5 1,7-2,05 (4Н, м), 2,05-2,3 (2Н, 2хт), 2,5-2,65 (2Н, м), 2,95-3,1 (2Н, м), 3,3 (3Н, с), 3,45-3,55 (2Н, м), 3,9-4,05+4,4-4,5 (1Н, 2хм), 4,37+4,48 (2Н, 2хс), 4,71+4,87 (2Н, 2хушир.с), 5,31+5,68 (2Н, 2хс), 6,44+6,52 (1Н, 2хс), 6,95-7,3 (3Н, м), 7,35-7,85 (11Н, м), 8,2-8,35 (1Н, м); MS (APCI+) обнаружила (M+1)=736; C40H38F5N3O3S подразумевает 735.
Синтез соединений формулы (IV)
Следующая схема последовательности операций иллюстрирует метод получения соединений этого изобретения.
Кроме того, читателя отсылают к опубликованной РСТ-заявке WO 03/016297 для химических технологий и продуктов, которые могут быть пригодны для приготовления некоторых промежуточных продуктов, представленных в этой схеме последовательности операций. Эти химические технологии и продукты, в той мере, в которой они применимы в этом случае, включены сюда посредством ссылки, как если бы они были полностью представлены здесь. Кроме того, приводится ссылка на синтезы, представленные в опубликованных РСТ-заявках WO 01/60805, WO 02/30911, WO 02/30904, WO 03/042218, WO 03/042206, WO 03/041712, WO 03/086400 и WO 03/87088 и находящихся одновременно на рассмотрении предварительных заявках на патенты США 60/829328 и 60/829327, обе из которых поданы 13 октября 2006, отмеченных выше. Если читатель желает приготовить соединения формулы (IV), используя промежуточные продукты, реагенты, растворители, периоды времени, температуры и т.п., отличные от тех, которые используются в пути на предшествующей странице, эти опубликованные РСТ-заявки и находящиеся одновременно на рассмотрении заявки на патенты США могут обеспечить полезное руководство. В тех случаях, когда химические технологии и продукты в этих заявках применимы для приготовления соединений настоящего изобретения, эти материалы включаются сюда посредством ссылки.
Промежуточный продукт (Г {[4 '-(Трифторметил) -4 -бифенилил] метил } амин
Приготовление этого соединения описано в WO 02/30911 в виде промежуточного продукта D7. Промежуточный продукт (Г ({4'-[(Трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амина гидрохлорид
F F
Раствор 4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилкарбонитрила (приготовленного из {4-[(трифторме-тил)окси]фенил}бороновой кислоты с помощью способа, аналогичного способу, описанному для 4'-трифторметильного аналога, промежуточного продукта D6 в WO 02/30911) (66,6 г) в этаноле (2000 мл) и концентрированной соляной кислоте (100 мл) гидрировали над катализатором Перлмана (10 г) при давлении 25 фунт/дюйм до полного восстановления. Катализатор удаляли фильтрацией через целит, затем растворитель удаляли в вакууме для получения желаемого продукта.
LCMS (жидкостная масс-спектрометрия) Rt=2,212 минутам; m/z [М+Н]+=251,0.
Промежуточные продукты для получения соединений формулы (IV)
Промежуточный продукт (IV)-A3.
Метил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноат
Смесь метил-2-бром-2-метилпропаноата (80,87 мл, 5 эквивалентов), 4-пиперидона гидрохлорида моногидрата (19,6 г, 1 эквивалент), ацетонитрила (200 мл) и калия карбоната (69,1 г, 4 эквивалента) нагревали в колбе с обратным холодильником в азотной среде при механическом перемешивании в течение 17,5 ч, затем охлаждали в ледяной бане перед добавлением диэтилового эфира (100 мл). Фильтрация через целит с последующей флэш-хроматографией (диоксид кремния, 10-50% этилацетат в гексане) и вы-
Смесь этил-2-бром-2-метилпропаноата (48,3 мл, 5 экв.), 4-пиперидона гидрохлорида моногидрата (100 г, 1 экв.), ацетонитрила (1216 мл) и калия карбоната (353 г, 4 экв.) нагревали в колбе с обратным холодильником в азотной среде при механическом перемешивании в течение 20 ч, затем охлаждали в ледяной бане перед добавлением диэтилового эфира (приблизительно 1400 мл). Смесь фильтровали через целит, подвергали выпариванию в вакууме, затем избыточный бромэфир отгоняли (постоянный уровень температуры 50°С/10 торр). Флэш-хроматография (диоксид кремния, 10-50% этилацетат в гексане) и выпаривание фракций с продуктом дали неочищенный продукт в виде желтого масла. Для удаления некоторых остающихся примесей -сложного бромэфира осуществляли разделением между этилацетатом и 2M водным раствором соляной кислоты. Органический слой отбрасывали, а водный слой превращали в основание с помощью натрия карбоната, насыщали натрия хлоридом и экстрагировали этилацетатом. Сушка и выпаривание органических экстрактов давали желаемый продукт в виде желтого масла (54,7 г).
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,27 (3Н, т), 1,40 (6Н, с), 2,47 (4Н, м), 2,90 (4Н, м), 4,20 (2Н, кв.).
Промежуточный продукт (Г 1,1 - Диметилэтил-2-метил-2-(4-оксо-1 -пиперидинил)пропаноат
Смесь 1,1-диметилэтил-2-бром-2-метилпропаноата (8,0 г, 1,1 экв.), 4-пиперидона гидрохлорида (5 г, 1 эквивалент), ацетона (50 мл) и калия карбоната (13,0 г, 3 экв.) нагревали в колбе с обратным холодильником при перемешивании в течение 24 ч, затем фильтровали и фильтрат подвергали выпариванию. Неочищенный остаток использовали в следующей стадии без очистки.
ES+MS m/z [M+H-tBu]+=186,1.
Промежуточный продукт (IV)-B1.
Метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноат
Смесь метил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноата (промежуточного продукта A3) (14,28 г, 1 экв.), {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амина (промежуточного продукта А1) (19,6 г, 0,85 экв.), DCE (300 мл), уксусной кислоты (3,8 мл, 0,90 экв.) и натрия триацетоксиборгидрида (20,7 г, 1,25 экв.) перемешивали при комнатной температуре в азотной среде в течение 17,5 ч. Водный раствор натрия карбоната (2М раствор, в избытке) добавляли и перемешивали в течение 4 ч, затем смесь экстрагировали смесью диэтилового эфира и THF. Органические экстракты подвергали реэкстракции водой и соляным раствором, сушили над натрия сульфатом и фильтровали через слой силикагеля, который промывали 2,5% метанолом в DCM. После выпаривания в вакууме неочищенный продукт подвергали кристаллизации из эфира/гексана, в конечном счете, при температуре ледяной бани, которая после сушки дала белое твердое вещество (20,9 г).
LCMS Rt=2,070 мин; m/z [M+H] +=435,2.
1H ЯМР (с16-ДМСО) 5 1,15-1,32 (8Н, м), 1,75-1,87 (2Н, м), 1,97-2,12 (2Н, м), 2,27-2,40 (1Н, м), 2,772,90 (2Н, м), 3,60 (3Н, с), 3,76 (2Н, с), 7,46 (2Н, д, J=8,03 Гц), 7,67 (2Н, д, J=8,28 Гц), 7,80 (2Н, д, J=8,53 Гц), 7,88 (2Н, д, J=8,03 Гц).
Промежуточный продукт (IV)-B2.
Этил-2-метил-2-[4-({ [4'-(трифторметил)-4-бифенилил] метил}амино)-1 -пиперидинил] пропаноат
Смесь этил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноата (промежуточного продукта А4) (25,6 г, 1,2 экв.), {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амина (промежуточного продукта А1) (31,1 г, 1 экв.), DCE (400 мл) и уксусной кислоты (6,3 мл, 1,1 эквэ) перемешивали при комнатной температуре в азотной среде. Добавляли натрия триацетоксиборгидрид (33,5 г, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали в течение 19 ч. Водный раствор натрия карбоната (2М раствор, в избытке) добавляли и перемешивали в течение 1,5 ч, затем смесь экстрагировали смесью диэтилового эфира и THF.
Органические экстракты подвергали реэкстракции водой и соляным раствором, фильтровали через слой силикагеля, сушили над натрия сульфатом и подвергали выпариванию в вакууме. Желаемый про-
дукт получали в виде белого твердого вещества (44,2 г), которое использовали без дальнейшей очистки. LCMS Rt=2,194 мин; m/z [M+H]+=449,3.
1H ЯМР (с16-ДМСО) 5 1,06-1,32 (11Н, м), 1,74-1,89 (2Н, м), 1,99-2,14 (2Н, м), 2,25-2,39 (1Н, м), 2,692,89 (2Н, м), 3,75 (2Н, с), 4,01-4,12 (2Н, м), 7,45 (2Н, д, J=7,55 Гц), 7,67 (2Н, д, J=7,81 Гц), 7,79 (2Н, д, J=8,06 Гц), 7,88 (2Н, д, J=8,06 Гц).
Промежуточный продукт (IV)-B3.
Этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}про-паноат
Смесь этил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил)пропаноата (промежуточного продукта А4) (1,09 г, 1,2 экв.), ({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амина гидрохлорида (промежуточного продукта А2) (1,28 г, 1 экв.), DCE (21 мл) и уксусной кислоты (0,27 мл, 1,1 экв.) перемешивали при комнатной температуре в азотной среде. Добавляли натрия триацетоксиборгидрид (1,42 г, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали в течение 3 ч. Водный раствор натрия карбоната (2М раствор, в избытке) добавляли и перемешивали в течение 45 мин, затем смесь разделяли с использованием смеси диэтилового эфира/THF и воды. Органические экстракты подвергали реэкстракции водой и соляным раствором, сушили над натрия сульфатом и подвергали выпариванию в вакууме. Желаемый продукт получали в виде светло-желтого твердого вещества (2,14 г), которое использовали без дальнейшей очистки.
LCMS Rt=2,244 мин; m/z [M+H]+=465,3.
Промежуточный продукт (IV)-B4.
1,1-Диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пипериди-нил] пропаноат
Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-(4-оксо-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта А6) (370 мг, 1,2 экв.), {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амина (промежуточного продукта А1) (397 мг, 1 экв.), натрия триацетоксиборгидрида (400 мг, 1,5 экв.), DCM (10 мл) и уксусной кислоты (0,076 мл, 1 экв.) получали и перемешивали при комнатной температуре до момента подтверждения с помощью LCMS исчезновения исходного материала в виде амина (приблизительно 18 ч). Добавляли водный раствор натрия карбоната и затем осуществляли экстракцию с использованием DCM. Органические экстракты сушили над натрия сульфатом и концентрировали для получения твердого вещества (420 мг), которое использовали без дальнейшей очистки.
LCMS Rt=2,24 минутам; m/z [M+H]+=477,3.
Промежуточный продукт (IV)-C1.
Приготовление этого соединения описано в WO 02/30911 в виде промежуточного продукта С43. Промежуточный продукт (IV)-C2.
[2-[2-(2,3-Дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]уксусная кислота
Приготовление этого соединения описано в WO 02/30904 в виде промежуточного продукта Е21. Промежуточный продукт (IV)-C3.
[2-[2-(2,4-Дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусная кислота
Приготовление этого соединения описано в WO 02/30911 в виде промежуточного продукта С45.
[2-[2-(2,3-Дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусная кислота
Смесь этил-(2,4-диоксо-3,4-дигидропиридо[2,3-1]пиримидин-1(2Н)-ил]ацетата (WO 02/30911, промежуточного продукта B52) (40,8 г, 1,2 экв.) и 3-(2,4-дифторфенил)пропанимидамида (полученного с помощью способов, аналогичных способам, описанным для 2,3-дифторизомера, промежуточных продуктов А1-А3 в WO 02/30911) (30,0 г, 1 экв.) подвергали реакции конденсирования в масляной бане при 150°С в течение 25 мин, затем быстро охлаждали до комнатной температуры в водяной бане. Хроматография (диоксид кремния, неочищенный продукт загружали в DCM и элюировали, используя 50-100% этилацетат в гексане) давала желаемый продукт (43,56 г).
LCMS Rt=2,521 мин; m/z [М+Н]+=374,1.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,31 (3Н, т), 3,13 (2Н, м), 3,26 (2Н, м), 4,28 (2Н, кв.), 5,27 (2Н, с), 6,82 (2Н, м), 7,34 (1Н, м), 7,50 (1Н, м), 8,65 (1Н, м), 8,74 (1Н, м). Промежуточный продукт (IV)-C5.
Приготовление этого соединения описано в WO 02/30911 в виде промежуточного продукта С35. Промежуточный продукт (Г [2-[2-(2,4-Дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-с1]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусная кислота
[2-[2-(2,3 - Дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3 -d] пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусная кислота
Этил-[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетат (промежуточный продукт С1), (32,76 г, 1 экв.) растворяли в этаноле (350 мл) и воде (70 мл), охлаждали на льду, затем добавляли водный раствор лития гидроксида (2M раствор, 43,42 мл, 0,99 экв.). Перемешивание продолжали в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор концентрировали в вакууме и остаток повторно растворяли в воде (700 мл) и насыщенным водном растворе натрия бикарбоната (50 мл), затем промывали этилацетатом (200 мл). Водный слой подкисляли до рН 2 2М соляной кислотой и преципитат отфильтровывали, промывали ледяной водой (50 мл) и сушили в вакууме (50°С, 16 ч) для получения желаемого продукта (23,2 г).
1H ЯМР (4-ДМСО) 5 2,4-2,6 (4Н, м), 5,24 (2Н, с), 7,04 (1Н, м), 7,22 (1Н, м), 7,48 (1Н, м), 7,60 (1Н, м), 8,47 (1Н, м), 8,84 (1Н, м).
Пример (IV)-1.
Метил-2[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (100 мг, 1 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (130 мг, 1,03 экв.), DIPEA (0,1 мл, 3,6 экв.), ацетонитрила (2 мл) и HATU (130 мг, 1,4 экв.) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подвергали выпариванию и вновь растворяли в ацетонитриле. HPLC с обращенной фазой (препаративный метод А) дала метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]аце-тил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат (128 мг).
LCMS Rt=2,686 мин; m/z [M+H]+=761, 3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,33 (3Н, с), 1,36 (3Н, с), 1,83-2,02 (4Н, м), 2,36-2,48 (2Н, м), 2,87-2,91 (1Н, м), 3,06-3,09 (2Н, м), 3,16-3,20 (2Н, м), 3,26-3,29 (1Н, м), 3,71-3,73 (3Н, м), 4,02/4,51 (1Н, 2х ушир.м), 4,74 (1Н, с), 4,92 (1Н, с), 5,12 (1Н, с), 5,56 (1Н, с), 7,00-7,19 (3Н, м), 7,32-7,37 (1Н, м), 7,48-7,62 (5Н, м), 7,727,81 (5Н, м), 8,22-8,28 (1Н, м).
Свободное основание превращали в битартратную соль добавление L-винной кислоты (1,675 г, 1,0 эквивалента) в одной порции и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор концентрировали в вакууме до грязно-белого порошка, который сушили в вакуумной печи при комнатной температуре.
Пример метода синтеза (IV)-2.
Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифтор-метил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат
(соль)
Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С2) (100 мг, 1 экв.), карбонилдиимидазола (50 мг, 1,05 экв.) и диметилацетамида (4 мл) перемешивали при 60°С в течение 30 мин, затем добавляли метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноат (промежуточный продукт В1) (132 мг, 1,05 экв.) и температуру повышали до 80°С на 2 ч. Добавляли дополнительную порцию карбонилдиимидазола (0,5 эквивалента) и перемешивание продолжали при 80°С в течение 15 ч. После охлаждения неочищенную смесь использовали для HPLC с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифени-лил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (99 мг).
LCMS Rt=2,845 мин; m/z [M+H]+=761,3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,28 (3Н, с), 1,31 (3Н, с), 1,73-2,05 (4Н, м), 2,25 (1Н, т), 2,39-2,46 (1Н, м), 2,96-2,99 (1Н, м), 3,00-3,12 (4H, м), 3,19 (1Н, с), 3,68-3,73 (3Н, м), 4,11/4,41 (1Н, 2х ушир.м), 4,73 (1Н, с), 4,97 (1Н, с), 5,51 (1Н, с), 6,29-6,34 (1Н, м), 7,06-7,20 (2Н, м), 7,35-7,41 (1Н, м), 7,48-7,58 (2Н, м), 7,68-7,84 (6Н, м), 8,60-8,68 (1Н, м), 8,87-8,91 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (I).
Пример метода синтеза (IV)-3.
Этил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (115 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (150 мг, 1 экв.), HATU (151 мг, 1,2 экв.), DMF (2,7 мл) и DIPEA (0,17 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь разделяли между этилацетатом/метанолом и водным раствором натрия бикарбоната, затем органический слой промывали соляным раствором и сушили. Флэш-хроматография (диоксид кремния, 3-4% метанол в DCM) дала этил-2[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (190 мг).
LCMS Rt=2,55 мин; m/z [M+H]+=775,3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,18-1,40 (9Н, м), 1,61-2,09 (4Н, м), 2,22-2,45 (2Н, м), 2,75-2,85 (1Н, м), 2,90-3,34 (5Н, м), 3,71/4,66 (1Н, 2х м), 4,12-4,26 (2Н, м), 4,70-4,85 (3Н, м), 5,08 (1Н, с), 6,80-6,88 (1Н, м), 6,95-7,13 (3Н, м), 7,27-7,33 (1Н, м), 7,34-7,52 (3Н, м), 7,56-7,62 (1Н, м), 7,63-7,77 (4Н, м), 8,29-8,44 (2Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (I).
Пример метода синтеза (IV)-4.
Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}({4'-[(трифторме-тил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (124 мг, 1,2 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифени-лил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В3) (139 мг, 1 экв.), DMF (1,2 мл) и DIPEA (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем добавляли HATU (176 мг, 1,5 экв.) и встряхивание продолжали в течение 4 ч. HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (174 мг).
LCMS Rt=2,77 минутам; m/z [M+H]+=791,3.
1Н ЯМР (CDCl3) Характеристические пики: 5 1,21-1,42 (9Н, м), 1,58-2,08 (4Н, м), 2,20-2,48 (2Н, м), 2,71-5,1 (13Н, ушир.м), 6,79-6,87 (1Н, д), 6,92-7,11 (3Н, м), 7,30-7,46 (5Н, м), 7,48-7,63 (5Н, м), 8,26-8,40 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (I).
Пример метода синтеза (IV)-5.
Метил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино]-1 -пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С3) (100 мг, 1 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (130 мг, 1,03 экв.), DIPEA (0,1 мл, 2 экв.), аце-тонитрила (2 мл) и HATU (130 мг, 1,4 экв.) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подвергали выпариванию и вновь растворяли в ацетонитриле. Очистка с помощью HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала метил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино]-1-пиперидинил]-2-метилпро-паноат (126 мг).
LCMS Rt=2,698 мин; m/z [M+H]+=761, 3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,30 (3Н, с), 1,34 (3Н, с), 1,81-2,03 (4Н, м), 2,29-2,35 (1Н, м), 2,39-2,45 (1Н, м), 2,82-2,87 (1Н, м), 3,00-3,14 (4Н, м), 3,19-3,24 (1Н, м), 3,70-3,73 (3Н, м), 4,00/4,51 (1Н, 2х ушир.м), 4,74 (1Н, с), 4,91 (1Н, с), 5,10 (1Н, с), 5,54 (1Н, с), 6,77-6,84 (1Н, м), 6,87-6,98 (1Н, м), 7,28-7,43 (2Н, м), 7,487,61 (5Н, м), 7,73-7,81 (5Н, м), 8,23-8,29 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (I).
Пример метода синтеза (IV)-6.
Этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
продукта С3) (120 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (204 мг, 1,3 экв.), DMF (1,4 мл) и DIPEA (0,183 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре, затем добавляли HATU (206 мг, 1,5 экв.) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 1,5 ч. Добавляли дополнительную порцию промежуточного продукта D5 (12 мг, 0,1 экв.), затем встряхивание продолжали в течение 2 дней. HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метил-пропаноат в виде белого твердого вещества (173 мг).
LCMS Rt=2,751 мин; m/z [M+H]+=775,3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 (смесь ротамеров)
Характеристические пики: 1,22-1,47 (9Н, м), 1,63-2,10 (4Н, м), 2,16-5,11 (15Н, ушир.м), 6,75-6,88 (2Н, м), 7,14-7,80 (12Н, м), 8,26-8,40 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (I).
Пример метода синтеза (IV)-7.
Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}({4'-[(трифторме-тил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С3) (114 мг, 1,1 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В3) (139 мг, 1 экв.), DMF (1,2 мл) и DIPEA (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре, затем добавляли HATU (176 мг, 1,5 экв.) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 30 мин. Добавляли дополнительную порцию промежуточного продукта D5 (21 мг, 0,2 экв.), а затем спустя 1 ч дополнительно HATU (23 мг, 0,2 экв.), затем встряхивание продолжали в течение 18 ч. HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил} ({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (149 мг).
LCMS Rt=2,793 мин; m/z [M+H]+=791, 3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 Характеристические пики: 5 1,20-1,45 (9Н, м), 1,58-2,12 (4Н, м), 2,14-2,48 (2Н, м), 2,620-5,11 (11Н, м), 6,59-6,72 (1Н, м), 6,73-6,90 (2Н, м), 7,16-7,64 (11Н, м), 8,25-8,40 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (I).
Пример метода синтеза (IV)-8.
2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат
Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пипери-динил]пропаноата (промежуточного продукта В4) (1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С2) (1,2 экв.), DIPEA (3 эквивалента) и DMF (1,0 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавляют в одной порции HATU (1,5 экв.) и перемешивают дополнительно 5 мин. Неочищенную реакционную смесь концентрируют, фильтруют через слой диоксида кремния, элюируют ацетоном и подвергают выпариванию для получения неочищенного 1,1-диметилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1,8-нафтиридин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата.
Пропаноат, без выделения в чистом виде, растворяют в смеси (1:1) TFA и DCM и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Выпаривание и препаративная HPLC (способ А) дают приведенное в заголовке соединение.
С помощью обычных способов можно приготовить другие соли. С помощью обычных способов также можно приготовить свободное основание. Пример метода синтеза (IV)-9.
2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилжл]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат
Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пипери-динил]пропаноата (промежуточного продукта В4) (1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]уксусной кислоты (промежуточного продукта С1) (1,2 экв.), DIPEA (3 экв.) и DMF (1,0 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавляют в одной порции HATU (1,5 экв.) и перемешивают дополнительно 5 мин. Неочищенную реакционную смесь концентрируют, фильтруют через слой диоксида кремния, элюируют ацетоном и подвергают выпариванию для получения неочищенного 1,1-диметилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)-хиназолинил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата.
Пропаноат, без выделения в чистом виде, растворяют в смеси (1:1) TFA и DCM и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Выпаривание и препаративная HPLC (способ А) дают приведенное в заголовке соединение.
Пример метода синтеза (IV)-10.
Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]-ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат
Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3ч1]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D1) (20,7 г, 1,3 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (20,0 г, 1,3 экв.), DIPEA (24,0 мл, 3 экв.) и DMF (184 мл) механически перемешивали, затем добавляли в одной порции HATU (27,1 г, 1,5 экв.) и перемешивание продолжали в течение 2 ч. Реакционную смесь разделяли между диэтиловым эфиром/THF (1:1) и натрия карбонатом (1М, в избытке). Органический слой промывали водой и соляным раствором, сушили и подвергали выпариванию. Хроматографию проводили последовательно на трех колонках с диоксидом кремния (с использованием, во-первых, смеси 3: 1 EtOAc/гексаны; во-вторых, 2% МеОН в DCM; в-третьих, смеси 1:1 EtOAc/гексаны до 100% EtOAc). Фракции с продуктом подвергали выпариванию для получения желаемого продукта в виде некристаллического розового твердого вещества (27,5 г).
LCMS Rt=2,702 мин; m/z [M+H]+=762,3.
Кристаллизация:
Смесь метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]аце-тил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (8,0 г) и этанола (200 мл) нагревали до полного растворения. Раствор перемешивали с использованием магнитного устройства в течение 24 ч при комнатной температуре, затем фильтровали и собирали 7,5 г твердого вещества. Эти сольватированные кристаллы помещали в вакуумную печь на 60°С со стравливанием азота для удержания вакуума на уровне приблизительно 630 торр в течение 24 ч для предоставления несольвати-рованного, кристаллического соединения, приведенного в заголовке (7,15 г), точка плавления 150°С.
1H ЯМР (CD3OD) 5 1,25 (3Н, с), 1,30 (3Н, с), 1,63-1,99 (4Н, м), 2,16-2,28 (1Н, м), 2,3-2,43 (1Н, м), 2,89-2,98 (1Н, м), 2,98-3,08 (2Н, м), 3,16-3,30 (3Н, м), 3,66-3,69 (3Н, м), 4,02/4,38 (1Н, 2х ушир.м), 4,69 (1Н, с), 4,87 (1Н, с), 5,4/5,73 (2Н, 2х с), 6,99-7,19 (3Н, м), 7,29-7,35 (1Н, м), 7,50-7,61 (3Н, м), 7,64-7,82 (5Н, м), 8,48-8,57 (1Н, м), 8,80-8,89 (1Н, м). См. фиг. 1 ниже.
Пример метода синтеза (IV)-11.
Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутан-диоат (соль)
Метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат (8,5 г, 1 экв.) суспендировали в метаноле (100 мл) и нагревали до 50°С до растворения твердого вещества. В одной порции добавляли L-винную кислоту (1,675 г, 1,0 экв.) и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор концентрировали в вакууме до получения грязно-белого порошка, который сушили в вакуумной печи при комнатной температуре.
LCMS Rt=2,697 мин; m/z [M+H]+=762,3.
1H ЯМР (16-ДМСО) 5 1,17 (3Н, с), 1,23 (3Н, с), 1,47-1,91 (4Н, м), 1,98-2,41 (1Н, м), 2,16-2,33 (1Н, м), 2,80-3,26 (6Н, м), 3,50-3,67 (3Н, м), 3,95/4,17 (1Н, 2х ушир.м), 4,61 (1Н, с), 4,85 (1Н, с), 5,39/5,69 (2Н, 2х с), 7,08-7,39 (4Н, м), 7,53-7,70 (3Н, м), 7,72-7,97 (5Н, м), 8,42-8,54 (1Н, м), 8,85-8,95 (1Н, м).
Пример метода синтеза (IV)-12.
Этил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3ч1]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D1) (116 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (150 мг, 1 экв.), HATU (151 мг, 1,2 экв.), DMF (2,72 мл) и DIPEA (0,17 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 3,25 ч. Реакционную смесь разделяли между этилацетатом/метанолом и водным раствором натрия бикарбоната, органический слой промывали соляным раствором, сушили и обрабатывали активированным углем (250 мг). Флэш-хроматография (диоксид кремния, 3-4% метанол в DCM) давала этил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (178 мг).
LCMS Rt=2,58 минутам; m/z [M+H]+=776,3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,20-1,40 (9Н, м), 1,56-2,02 (4Н, м), 2,19-2,44 (2Н, м), 2,88-3,20, (4Н, м), 3,22-3,40 (2Н, м), 3,81/4,58 (1Н, 2х м), 4,11-4,27 (2Н, м), 4,69/4,84 (2Н, 2х с), 5,17/5,49 (2Н, 2х с), 6,95-7,14 (3Н, м), 7,25-7,31 (1Н, м), 7,38-7,54 (3Н, м), 7,54, 7,61 (1Н, м), 7,62-7,79 (4Н, м), 8,57-8,75 (2Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-13.
Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}([4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,3ч1]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D1) (114 мг, 1,1 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В4) (139 мг, 1 экв.), DMF (1,2 мл) и DIPEA (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем добавляли HATU (176 мг, 1,5 экв.) и встряхивание продолжали в течение 3 ч. HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксо-1(4Н)хина-золинил]ацетил}([4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпро
паноат в виде белого твердого вещества (166 мг). LCMS Rt=2,87 минутам; m/z [M+H]+=792,3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,18-1,42 (9Н, м), 1,54-2,04 (4Н, м), 2,12-2,46 (2Н, м), 2,86-3,21 (4Н, м), 3,21-3,41 (2Н, м), 3,79/4,57 (1Н, 2х м), 4,10-4,27 (2Н, м), 4,68 (1Н, с), 4,82 (1Н, с), 5,17 (1Н, с), 5,47 (1Н, с), 6,94-7,16
(3Н, м), 7,20-7,36 (3Н, м), 7,37-7,48 (3Н, м), 7,48-7,61 (3Н, м), 8,56-8,76 (2Н, м).
Его превращали в бйтартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-14.
1-Метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]аце-тил} {[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1 -пиперидинил] -2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь 1-метилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пипериди-нил]пропаноата (промежуточного продукта В3) (420 мг, 1 эквивалент), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D1) (300 мг, 1 экв.), HATU (396 мг, 1,2 экв.), DIPEA (0,22 мл, 1,5 экв.) и DMF (3,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для HPLC с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифени-лил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (171 мг).
LCMS Rt=2,837 минутам; m/z [M+H]+=790,3.
1H ЯМР (CD3OD) 5 1,16-1,37 (12Н, м), 1,62-2,01 (4Н, м), 2,27-2,55 (2Н, м), 2,95-3,12 (3Н, м), 3,123,29 (3Н, м), 4,06/4,40 (1Н, 2х ушир.м), 4,71 (1Н, с), 4,89 (1Н, с), 4,92-5,07 (1Н, м), 5,43/5,76 (2Н, 2х с), 7,00-7,21 (3Н, м), 7,29-7,38 (1Н, м), 7,49-7,65 (3Н, м), 7,65-7,87 (5Н, м), 8,48-8,58 (1Н, м), 8,81-8,90 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-15.
1-Метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь 1-метилэтил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пипе-ридинил}пропаноата (промежуточного продукта В5) (80 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридоР^^пиримидин-^Щ-ил^ксусной кислоты (промежуточного продукта D1) (67 мг, 1 экв.), HATU (400 мг, 5 экв.), DIPEA (0,22 мл, 1,5 экв.) и DMF (2,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для HPLC с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата (25 мг).
LCMS Rt=2,952 минутам; m/z [М+Н]+=806,4.
1H ЯМР (ДМСОч16) 5 1,09-1,25 (12Н, м), 1,47-1,91 (4Н, м), 2,05-2,20 (1Н, м), 2,21-2,38 (1Н, м), 2,873,07 (3Н, м), 3,08-3,22 (3Н, м), 3,95/4,17 (1Н, 2х ушир.м), 4,59 (1Н, с), 4,75-4,97 (2Н, м), 5,38/5,68 (2Н, 2х с), 7,90-7,21 (1Н, м), 7,21-7,36 (3Н, м), 7,42-7,55 (3Н, м), 7,55-7-64 (2Н, м), 7,66-7,77 (2Н, м), 7,77-7,85 (1Н, м), 8,43-8,52 (1Н, м), 8,86-8,95 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-16.
Метил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутан-диоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,4ч1]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D2) (100 мг, 1 экв.), метил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В1) (130 мг, 1,03 экв.), DIPEA (0,16 мл, 3 экв.), ацетонитрила (2 мл) и HATU (130 мг, 1,2 экв.) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем подвергали выпариванию и вновь растворяли в ацетонитриле. Очистка с помощью HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала метил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифе-нилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат (145 мг).
LCMS Rt=2,716 мин; m/z [M+H]+=762,3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,27 (3Н, с), 1,33 (3Н, с), 1,69-1,98 (4Н, м), 2,22-2,29 (1Н, м), 2,36-2,43 (1Н, м), 2,96-3,08 (3Н, м), 3,13-3,24 (3Н, м), 3,69-3,72 (3Н, м), 4,04/4,41 (1Н, 2х ушир.м), 4,72 (1Н, с), 4,91 (1Н, с), 5,41/5,73 (2Н, 2х с), 6,84-6,97 (2Н, м), 7,34-7,44 (2Н, м), 7,54-7,63 (3Н, м), 7,69-7,83 (5Н, м), 8,55-8,60 (1Н, м), 8,86-8,91 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-17.
Этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,4ч1]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D2) (120 мг, 1 экв.), этил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]пропаноата (промежуточного продукта В2) (198 мг, 1,3 экв.), DMF (1,4 мл) и DIPEA (0,178 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, затем добавляли HATU (200 мг, 1,5 эквивалента) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 1,5 ч. Добавляли добавочную порцию промежуточного продукта D2 (12 мг, 0,1 экв.), а затем встряхивание продолжали в течение 2 дней. HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифтор-метил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (170 мг).
LCMS Rt=2,827 минутам; m/z [M+H]+=776,3.
1Н ЯМР (CDCl3) Характеристические пики: 5 1,14-1,43 (9Н, м), 1,57-2,05 (4Н, м), 2,10-2,46 (2Н, м), 2,84-3,11 (3Н, м), 3,12-3,34 (3Н, м), 3,65/3,85 (1Н, м), 4,06-4,27 (2Н, м), 4,65/4,85 (2Н, с), 5,15/5,45 (2Н, с), 6,62-6,89 (2Н, м), 7,18-7,34 (1Н, м), 7,37-7,82 (9Н, м), 8,59-8,77 (2Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-18.
Смесь [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил] -4-оксопиридо [2,4ч1]пиримидин-1 (4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D2) (114 мг, 1,1 экв.), этил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В4) (139 мг, 1 экв.л),
Этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1 -пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
DMF (1,2 мл) и DIPEA (0,16 мл, 3 экв.) встряхивали при комнатной температуре, затем добавляли HATU (176 мг, 1,5 экв.) при энергичном перемешивании и встряхивание продолжали в течение 2 ч. HPLC с обращенной фазой (препаративный метод В) дала этил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноат в виде белого твердого вещества (149 мг).
LCMS Rt=2,801 минутам; m/z [M+H]+=792,3.
1H ЯМР (CDCl3) 5 1,18-1,40 (9Н, м), 1,61-2,02 (4Н, м), 2,20-2,44 (2Н, м), 2,83-3,35 (6Н, ушир.м), 3,79/4,57 (1Н, 2х ушир.м), 4,07-4,27 (2Н, м), 4,68/4,81 (2Н, 2х с), 5,14/5,46 (2Н, 2х ушир.м), 6,62-6,90 (2Н, 2х м), 7,18-7,63 (10Н, м), 8,59-8,75 (2Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-19.
1-Метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь 1 -метилэтил-2 -метил-2 -[4-({[4' -(трифторметил) -4 -бифенилил] метил} амино)-1 -пипериди-нил]пропаноата (промежуточного продукта В3) (70 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,4-1]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D2) (52,2 мг, 1 экв.), HATU (69 мг, 1,2 экв.), DIPEA (0,04 мл, 1,5 экв.) и DMF (1,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для HPLC с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифени-лил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата (20 мг).
LCMS Rt=2,910 мин; m/z [М+Н]+=790,4.
1H ЯМР (16-ДМСО) 5 1,08-1,27 (12Н, м), 1,40-1,90 (4Н, м), 2,03-2,35 (2Н, м), 2,85-3,24 (6Н, м), 3,95/4,17 (1Н, 2х ушир.м), 4,61 (1Н, с), 4,80-4,97 (2Н, м), 5,36/5,67 (2Н, 2х с), 6,96-7,10 (1Н, м), 7,13-7,28 (1Н, м), 7,28-7,38 (1Н, м), 7,39-7,54 (1Н, м), 7,54-7,68 (3Н, м), 7,72-7,98 (5Н, м), 8,43-8,52 (1Н, м), 8,86-8, 95 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-20.
1-Метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]аце-тил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата 2,3-дигидроксибутандиоат (соль)
Смесь 1 -метилэтил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси] -4-бифенилил}метил)амино] -1-
пиперидинил}пропаноата (промежуточного продукта В5) (80 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридоР^^пиримидин-^Щ-щ^уксусной кислоты (промежуточного продукта D2) (57 мг, 1 экв.), HATU (76 мг, 1,2 экв.), DIPEA (0,04 мл, 1,5 экв.) и DMF (1,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для HPLC с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения 1-метилэтил-2-{4-[{[2-[2-(2,4-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-1]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата (47 мг).
LCMS Rt=2,909 мин; ra/z [M+H]+=806,4.
1H ЯМР (16-ДМСО) 5 1,09-1,27 (12H, м), 1,50-1,90 (4H, м), 2,03-2,17 (1H, м), 2,20-2,37 (1H, м), 2,883,18 (6H, м), 3,94/4,17 (1H, 2х м), 4,60 (1H, с), 4,74-4,96 (2H, м), 5,36/5,66 (2H, 2х ушир.с), 6,96-7,09 (1H, м), 7,14-7,32 (2H, м), 7,39-7,55 (4H, м), 7,55-7,66 (2H, м), 7,66-7,87 (3Н, м), 8,43-8,54 (1Н, м), 8,85-8,96 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-21.
Метил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата дигидроксибу-тандиоат (соль)
Смесь метил-2-метил-2-{4-[({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пипериди-нил}пропаноата (промежуточного продукта В6) (145 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил) этил]-4-оксопиридо [2,3-d] пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D1) (122 мг, 1 экв.), DIPEA (0,084 мл, 1,5 экв.) и DMF (2,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. В одной порции добавляли HATU (160 мг, 1,3 эквивалента) и перемешивали в течение дополнительного 1 ч в азотной среде. Неочищенную реакционную смесь использовали непосредственно для HPLC с обращенной фазой (препаративный метод А) для получения метил-2-{4-[{[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}({4'-[(трифторметил)окси]-4-бифенилил}метил)амино]-1-пиперидинил}-2-метилпропаноата (116 мг).
LCMS Rt=2,721 мин; m/z [M+H]+=778,3.
1H ЯМР (CDCl3) Характеристические пики: 5 1,53-1,62 (6H, м), 3,46-5,99 (22Н, м), 7,01-7,21 (3Н, м), 7,30-7,43 (3Н, м), 7,50-7,78 (6Н, м), 8,54-8,60 (1Н, м), 8,86-8,94 (1Н, м).
Его превращали в битартратную соль с помощью способа, аналогичного способу, описанному для примера метода синтеза (II).
Пример метода синтеза (IV)-22.
2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифтор-метил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат
Смесь 1,1-диметилэтил-2-метил-2-[4-({[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пипери-динил]пропаноата (промежуточного продукта В7) (150 мг, 1 экв.), [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3^]пиримидин-1(4Н)-ил]уксусной кислоты (промежуточного продукта D1) (130 мг, 1,2 экв.), DIPEA (0,164 мл, 3 экв.) и DMF (1,0 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавляли в одной порции HATU (180 мг, 1,5 экв.) и перемешивали дополнительно 5 мин. Неочищенную реакционную смесь концентрировали, фильтровали через слой диоксида кремния, элюировали ацетоном и подвергали выпариванию для получения неочищенного 1,1-диметилэтил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифени-лил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата.
LCMS Rt=2,823 мин; m/z [M+H]+=804,4.
Этот промежуточный продукт, без выделения в чистом виде, растворяли в смеси (1:1) TFA и DCM и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Выпаривание и препаративная HPLC (способ А) давали желаемый 2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропановой кислоты трифторацетат (70 мг).
LCMS Rt=2,554 мин; m/z [M+H]+=748,2.
1H ЯМР ^6-ДМСО) 5 1,44 (3Н, с), 1,51 (3Н, с), 1,70-2,30 (4Н, м), 2,41-2,56 (2Н, м), 2,94-3,54 (6Н, м),
4,44-4,95 (3Н, м), 5,42/5,76 (2Н, 2х ушир.с), 7,07-7,38 (4Н, м), 7,54-7,75 (3Н, м), 7,76-7,99 (5Н, м), 8,428,54 (1Н, м), 8,85-8,98 (1Н, м).
С помощью обычных способов можно приготовить другие соли. С помощью обычных способов также можно приготовить свободное основание.
В некоторых вариантах осуществления соединениями, пригодными в качестве ингибиторов Lp-PLA2 в раскрытых здесь способах, являются 1-(М-(2-диэтиламино)этил)-Ы-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он, также упоминаемый как "SB480848" или под названием USAN "дарапладиб", который представляет со
бой соединение, в основе которого лежит пиримидинон, и является обратимым ингибитором Lp-PLA2, и используется в приведенных здесь примерах;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопентапи-римидин-1-ил]-N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид;
N-( 1 -(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1 -ил] -N-(4'-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамид и
метил-2-[4-({[2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноат.
Фармацевтически приемлемые соли 1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметил-фенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она, АКА SB480848, используемые в приведенных здесь примерах;
N-(2-диэтиламиноэтил)-2-[2-(2-(2,3-дифторфенил)этил)-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидроциклопента-пиримидин-1 -ил] -N-(4 '-трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида;
N-( 1 -(2-метоксиэтил)пиперидин-4-ил)-2-[2-(2,3-дифторбензилтио)-4-оксо-4Н-хинолин-1 -ил] -N-(4'-
трифторметилбифенил-4-илметил)ацетамида и метил-2-[4-({ [2-[2-(2,3-дифторфенил)этил]-4-
оксопиридо[2,3-d]пиримидин-1(4Н)-ил]ацетил}{[4'-(трифторметил)-4-бифенилил]метил}амино)-1-пиперидинил]-2-метилпропаноата также применимы в качестве ингибиторов Lp-PLA2 для применения в раскрытых здесь способах. Ингибиторы Lp-PLA2 в виде нуклеиновых кислот В некоторых вариантах осуществления агенты, которые ингибируют Lp-PLA2, являются нуклеиновыми кислотами.
Ингибиторами Lp-PLA2 в виде нуклеиновых кислот являются, например, но без ограничения, индуцирующие РНК-интерференцию молекулы, например, но без ограничения, малая интерферирующая РНК, дцРНК, малая временная РНК, малая шпилечная РНК и их модифицированные варианты, причем молекула для РНК-интерференции выключает экспрессию гена Lp-PLA2. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Lp-PLA2 в виде нуклеиновой кислоты является антисмысловой олигонуклеотид или аналог нуклеиновой кислоты, например, без ограничения, ДНК, РНК, пептидонуклеиновая кислота (ПНК), псевдокомплементарная ПНК или закрытая нуклеиновая кислота и т.п. В альтернативных вариантах осуществления нуклеиновой кислотой является ДНК или РНК и аналоги нуклеиновых кислот, например, ПНК, псевдокомплементарная ПНК и закрытая нуклеиновая кислота. Нуклеиновая кислота может быть одно- или двухцепочечной и может быть выбрана из группы, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок, олигонуклеотиды, ПНК и т.п. Такие последовательности нуклеиновых кислот включают, например, но без ограничения, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белки, которые действуют в качестве репрессоров транскрипции, антисмысловые молекулы, рибозимы, небольшие ингибиторные последовательности нуклеиновых кислот, например, но без ограничения, молекулу для РНК-интерференции, малую шпилечную РНК, малую интерферирующую РНК, микро-РНК, антисмысловые олигонуклеотиды и т.п.
В некоторых вариантах осуществления для образования молекулы для РНК-интерференции может использоваться одноцепочечная РНК (оцРНК), форма РНК, эндогенно обнаруживаемая в эукариотиче-ских клетках. Клеточные молекулы оцРНК включают информационные РНК (и предшественник пре-мРНК), малые ядерные РНК, малые ядрышковые РНК, транспортные РНК и рибосомальные РНК. Двух-цепочечные РНК (дцРНК) индуцируют зависимый от их размера иммунный ответ, так что превышающая 30 п.о. дцРНК активирует ответ с продукцией интерферонов, в то время как более короткие дцРНК вводятся в эндогенный аппарат РНК-интерференции клетки, находящийся в прямом направлении от дайсер фермента.
Lp-PLA2 можно уменьшить ингибированием экспрессии полипептида Lp-PLA2 или с помощью способов "выключения гена", широко известных специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники.
РНК-интерференция обеспечивает мощный способ ингибирования экспрессии выбранных полипептидов-мишеней. Для РНК-интерференции используются дуплексы малых интерферирующих РНК, которые делают информационную РНК, кодирующую полипептид-мишень, мишенью избирательной деградации. Зависимое от малых интерферирующих РНК посттранскрипционное выключение экспрессии гена включает разрезание молекулы мРНК-мишени в месте, в которое нацелена малая интерферирующая
РНК.
РНК-интерференция является эволюционно консервативным процессом, посредством которого экспрессия или введение РНК с последовательностью, которая идентична гену-мишени или в высокой степени схожа с таким геном, приводит к последовательность-специфической деградации информационной РНК (мРНК), транскрибируемой с этого сделавшегося мишенью гена, или последовательность-специфическому посттранскрипционному выключению гена (PTGS) (см. Coburn, G. and Cullen, В. (2002) J. of Virology 76(18): 9225), что приводит, тем самым, к ингибированию экспрессии гена. В одном варианте осуществления РНК является двухцепочечной РНК (дцРНК). Этот процесс был охарактеризован у растений, беспозвоночных и в клетках млекопитающих. В природе РНК-интерференция инициируется дцРНК-специфической эндонуклеазой дайсер, которая активирует процессивное расщепление длинной дцРНК на двухцепочечные фрагменты, называемые малыми интерферирующими РНК. Малые интерфе
рирующие РНК включаются в белковый комплекс (называемый "комплекс для РНК-индуцированного выключения" или "RISC"), который распознает и расщепляет мРНК-мишени. РНК-интерференцию можно также инициировать введением молекул нуклеиновых кислот, например, синтетических малых интерферирующих РНК или РНК-интерферирующих агентов, для ингибирования или выключения экспрессии генов-мишеней. Как здесь используется, "ингибирование экспрессии гена-мишени" включает любое уменьшение экспрессии или активности белка или уровня гена-мишени или белка, кодируемого геном-мишенью, по сравнению с ситуацией, при которой РНК-интерференция не была индуцирована. Уменьшение может составлять по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 99% или более по сравнению с экспрессией гена-мишени или активности или уровня белка, кодируемого геном-мишенью, который не сделался мишенью РНК-интерферирующего агента.
"Короткую интерферирующую РНК", также упоминаемую здесь как "малая интерферирующая РНК", определяют как агент, который функционирует для ингибирования экспрессии гена-мишени, например, путем РНК-интерференции. Малую интерферирующую РНК можно химически синтезировать, можно продуцировать с помощью in vitro транскрипции, или можно продуцировать внутри клетки-хозяина . В одном варианте осуществления малая интерферирующая РНК является молекулой двухцепо-чечной РНК (дцРНК) длиной от приблизительно 15 до приблизительно 40 нуклеотидов, предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 28 нуклеотидов, более предпочтительно от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов и более предпочтительно приблизительно 19, 20, 21, 22 или 23 нук-леотида и может содержать 3'- и/или 5'-концевую избыточность на каждой цепи, имеющую длину, составляющую 0, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов. Длина концевой избыточности является автономной между двумя цепями, т.е. длина концевой избыточности на одной цепи не зависит от длины концевой избыточности на второй цепи. Предпочтительно малая интерферирующая РНК способна активировать РНК-интерференцию через деградацию мишени-информационной РНК (мРНК) или специфическое посттранскрипционное выключение гена (PTGS).
Малая интерферирующая РНК также включает малую шпилечную РНК (также называемую петлей с ножкой). В одном варианте осуществления эти малые шпилечные РНК состоят из короткой (например, от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов) антисмысловой цепи, за которой следует нук-леотидная петля длиной от приблизительно 5 до приблизительно 9 нуклеотидов и аналогичная смысловая цепь. Альтернативно, смысловая цепь может быть перед нуклеотидной структурой петли, а затем может следовать антисмысловая цепь. Эти малые шпилечные РНК могут содержаться в плазмидах, рет-ровирусах и лентивирусах и экспрессироваться, например, с промотора pol III U6 или другого промотора (см., например, Stewart et al. (2003) RNA Apr. 9(4): 493-501, документ, который полностью включен сюда посредством ссылки).
Ген-мишень или последовательность РНК-интерферирующего агента может быть клеточным геном или геномной последовательностью, например, последовательностью Lp-PLA2. Малая интерферирующая РНК может быть по существу гомологична гену-мишени или геномной последовательности-мишени, или их фрагменту. Используемый в этом контексте термин "гомологичная" определяют как являющаяся по существу идентичной, достаточно комплементарной или схожей с мРНК-мишенью, или ее фрагментом, для осуществления РНК-интерференции в отношении мишени. Кроме того, встречающиеся в природе молекулы РНК, РНК, подходящие для ингибирования экспрессии последовательности-мишени или внесение в нее помех, включают производные и аналоги РНК. Предпочтительно малая интерферирующая РНК идентична своей мишени.
Предпочтительно малая интерферирующая РНК нацелена только на одну последовательность. Каждый из РНК-интерферирующих агентов, таких как малые интерферирующие РНК, можно подвергнуть скринингу на возможные эффекты вне цели, например, с помощью анализа профиля экспрессии. Такие способы известны квалифицированному в данной области техники специалисту и описываются, например, Jackson и др. в Nature Biotechnology 6: 635-637, 2003. Помимо анализа профиля экспрессии потенциальные последовательности-мишени можно также подвергнуть скринингу на схожие последовательности в базе данных последовательностей для идентификации потенциальных последовательностей, которые могут иметь эффекты вне цели. Например, в соответствии с Jackson и др. (там же) 15 или, возможно, минимально 11 непрерывных нуклеотидов идентичности последовательностей достаточно для прямого выключения транскриптов, не являющихся мишенью. Следовательно, можно сначала подвергнуть скринингу предполагаемые малые интерферирующие РНК для исключения возможного выключения не мишеней, используя анализ идентичности последовательностей с помощью любых известных способов сравнения последовательностей, таких как BLAST.
Молекулы малых интерферирующих РНК не должны ограничиваться теми молекулами, которые содержат только РНК, но, например, также включают химически модифицированные нуклеотиды и не-нуклеотиды, а также включают молекулы, в которых молекула сахара рибозы заменена на другую молекулу сахара или молекулу, которая выполняет схожую функцию. Кроме того, можно использовать неприродную связь между остатками нуклеотидов, такую как фосфоротиоатная связь. Например, в качестве РНК-интерферирующих молекул в соответствии с настоящим изобретением может использоваться малая интерферирующая РНК, содержащая D-арабинофуранозильные структуры вместо встречающихся
в природе D-рибонуклеозидов, обнаруживаемых в РНК (патент США № 5177196). Другие примеры включают молекулы РНК, содержащие О-связь между сахаром и гетероциклическим основанием нук-леозида, которая придает устойчивость к нуклеазам и обеспечивает прочное связывание комплементарных цепей с молекулами олигонуклеотидов, схожих с олигонуклеотидами, содержащими 2'-О-метилрибозу, арабинозу и, особенно, -D-арабинозу (патент США № 5177196).
Из цепи РНК можно получить производные, используя реакционноспособную функциональную группу репортерной группы, такой как флуорофор. Особенно полезные производные модифицированы на конце или концах цепи РНК, обычно на 3'-конце смысловой цепи. Например, можно легко и избирательно модифицировать 2'-гидроксил на 3'-конце рядом групп.
Другие полезные производные РНК включают нуклеотиды, имеющие модифицированные углеводные составляющие, такие как 2'-О-алкилированные остатки или содержащие 2'-О-метилрибозил производные и содержащие 2'-О-фторрибозил производные. Основания РНК могут также быть модифицированы. Можно использовать любое модифицированное основание, пригодное для ингибирования экспрессии последовательности-мишени или внесения в нее помех. Например, можно включить галогенизиро-ванные основания, такие как 5-бромурацил и 5-йодурацил. Основания могут быть также алкилированы, например, 7-метилгуанозин можно включить вместо остатка гуанозина. Можно также включить неприродные основания, которые дают успешное ингибирование.
Наиболее предпочтительные модификации малых интерферирующих РНК включают 2'-дезокси-2'-фторуридин или нуклеотиды закрытых нуклеиновых кислот и дуплексы РНК, содержащие или сложный фосфодиэфир, или варьирующие числа фосфоротиоатных связей. Такие модификации известны квалифицированному в данной области техники специалисту и описываются, например, Braasch и др. в Biochemistry, 42: 7987-7975, 2003. Наиболее полезные модификации в молекулах малых интерферирующих РНК можно ввести, используя химические продукты и технологии, широко известные для технологии антисмысловых олигонуклеотидов. Предпочтительно модификации включают минимальную 2'-О-метильную модификацию, предпочтительно они исключают такую модификацию. Модификации также предпочтительно исключают модификации свободных 5-гидроксильных групп малой интерферирующей
РНК.
Молекулы малых интерферирующих РНК и микроРНК, имеющие различные "хвосты", ковалентно присоединенные или к их 3'-концам, или к их 5'-концам, или к обоим концам, также известны в данной области техники и могут использоваться для стабилизации молекул малых интерферирующих РНК и микроРНК, доставляемых с использованием способов настоящего изобретения. Вообще говоря, интерка-лирующие группы, различные виды репортерных групп и липофильные группы, присоединенные к 3'-или 5'-концам молекул РНК, хорошо известны квалифицированному в данной области техники специалисту и применимы в соответствии со способами настоящего изобретения. Описания синтезов 3'-холестерин- или 3'-акридин-модифицированных олигонуклеотидов, применимых для приготовления модифицированных молекул РНК, применимых в соответствии с настоящим изобретением, можно найти, например, в статьях: Gamper H.B., Reed M.W., Сох Т., Virosco J.S., Adams A.D., Gall A., Scholler J.K. and Meyer, R.B. (1993) Facile Preparation and Exonuclease Stability of 3'-Modified Oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 21 145-150; Reed M.W., Adams A.D., Nelson J.S., and Meyer R.B., Jr. (1991) Acridine and Choles-terol-Derivatized Solid Supports for Improved Synthesis of 3'-Modified Oligonucleotides. Bioconjugate Chem. 2: 217-225 (1993).
Другие малые интерферирующие РНК, применимые для нацеливания на экспрессию Lp-PLA2, можно легко сконструировать и проверить. Соответственно, малые интерферирующие РНК, применимые для описанных здесь способов, включают молекулы малых интерферирующих РНК длиной от приблизительно 15 до приблизительно 40 или от приблизительно 15 до приблизительно 28 нуклеотидов, которые гомологичны гену Lp-PLA2. Предпочтительно, направленные на Lp-PLA2 молекулы малых интерферирующих РНК имеют длину, составляющую от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов. Более предпочтительно, направленные на Lp-PLA2 молекулы малых интерферирующих РНК имеют длину, составляющую 19, 20, 21 или 22 нуклеотида. Молекулы малых интерферирующих РНК, направленные на Lp-PLA2, могут также включать 3'-гидроксильную группу. Молекулы малых интерферирующих РНК, направленные на Lp-PLA2, могут быть одноцепочечными или двухцепочечными; такие молекулы могут быть с тупыми концами или включать липкие концы (например, 5', 3'). В конкретных вариантах осуществления молекула РНК является двухцепочечной и либо с тупыми концами, либо с липкими концами. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна цепь направленной на Lp-PLA2 молекулы РНК имеет 3'-концевую избыточность длиной от приблизительно 0 до приблизительно 6 нуклеотидов (например, содержащих пиримидиновые основания нуклеотидов, содержащих пуриновые основания нуклеотидов). В других вариантах осуществления длина 3'-концевой избыточности составляет от приблизительно 1 до приблизительно 5 нуклеотидов, от приблизительно 1 до приблизительно 3 нуклеотидов и от приблизительно 2 до приблизительно 4 нуклеотидов. В одном варианте осуществления направленная на Lp-PLA2 молекула РНК является двухцепочечной, при этом одна цепь имеет 3'-концевую избыточность, а другая цепь может быть цепью с тупым концом или иметь концевую избыточность. В варианте осуществления, в котором направленная на Lp-PLA2 молекула РНК является двухцепочечной, и обе
цепи содержат концевые избыточности, длины концевых избыточностей могут быть одинаковыми или различными для каждой цепи. В конкретном варианте осуществления РНК настоящего изобретения включает приблизительно 19, 20, 21 или 22 нуклеотида, которые спариваются и которые имеют концевые избыточности длиной от приблизительно 1 до приблизительно 3, в частности, приблизительно 2, нуклеотидов на обоих 3'-концах РНК. В одном варианте осуществления 3'-концевую избыточность можно сделать устойчивой к деградации. В предпочтительном варианте осуществления РНК делают устойчивой включением содержащих пуриновые основания нуклеотидов, таких как содержащих аденозин или гуанозин нуклеотидов. Альтернативно, замена пиримидиновых нуклеотидов модифицированными аналогами, например, 3'-концевого нуклеотида 2-уридин, имеющего "липкие" концы, 2'-дезокситимидином, является допустимой и не оказывает влияния на эффективность малых интерферирующих РНК. Отсутствие 2'-гидроксила значительно усиливает устойчивость к нуклеазам концевой избыточности в среде для культивирования тканей.
мРНК для Lp-PLA2 была успешно превращена в мишень, используя малые интерферирующие РНК, и такие малые интерферирующие РНК или векторы для их приготовления имеются в продаже, например, от Invitrogen. В некоторых вариантах осуществления оценку экспрессии и/или уничтожения белка Lp-PLA2, используя такие направленные на Lp-PLA2 малые интерферирующие РНК, можно осуществить, используя имеющиеся в продаже наборы, например, но без ограничения, анализ PLAC от diaDexus. Другие средства могут быть без труда приготовлены квалифицированными в данной области техники специалистами на основе известной последовательности мРНК-мишени. Во избежание сомнений, предоставляется последовательность кДНК Lp-PLA2 человека, например, № доступа в GenBank: U20157 (SEQ ID NO: 1) или NM 005084 (SEQ ID NO: 2). Последовательность с № доступа U20157 является следующей последовательностью (SEQ ID NO: 1):
1 gctggtcgga ggctcgcagt gctgtcggcg agaagcagtc gggtttggag cgcttgggtc
61 gcgttggegc gcggtggaac gcgcccaggg aocccagtto ccgcgagcag ctccgegccg 121 egccfcgagag actaagctga aaotgctgct cagctcceaa gatggtgcca cccaaattgc 131 atgtgctttt ctgcctctgc ggctgcctgg ctgtggttta tccttttgac tggcaataca 241 taaatcctgt tgcccatatg aaatcateag catgggtcaa caaaatacaa gtactgatgg 301 ctgctgcaag ctttggccaa actaaaatcc cccggggaaa tgggccttat tccgttggtt 361 gtacagactt aatgtttgat cacactaata agggcacctt cttgcgttta tattacccat 421 cccaagataa tgatcgcctt gacacccttt ggatcocaaa taaagaatat ttttggggtc 481 ttagcaaatt tcttggaaca oactggctta tgggcaacat tttgaggtta ctctttggtt 541 caatgacaac toctgcaaac tggaattccc ctctgaggcc tggtgaaaaa tatccacttg 601 ttgtttttto tcatggtctt ggggcattca ggacacttta ttctgctatt ggcattgaec 661 tggcatctca tgggtttata gttgctgctg tagaacacag agatagatct gcafcctgcaa 121 cttactattt caaggaccaa tqtgctgcag aaatagggga caagtcttgg ctctacctta 731 gaaccccgaa acaagaggag gagacaeata tacgaaatga goaggtacgg caaagagcaa 841 aagaatgttc ccaagctctc agtctgattc ctgacattga tcatggaaag ccagtgaaga 901 at'gcattaga tttaaagttt gatatggaac aactgaagga ctctattgat agggaaaaaa 961 tagcagtaat tggacattct tttggtggag caacggttat tcagsctett agtgaagatc 1021 agagattcag atgtggtatt gccctggatg eatggatgtt tccactgggt gatgaagtat 1081 attccagaat tcctcagccc ctccttttta tcaactctga atatttccaa tatcctgcta 1141 atatcataaa aatgaaaaaa tgctactcac ctgataaaga aagasagatg attaeaatca 1201 ggggtccagt ccaccagaat tttgctgact tcacttttgc aactggcaaa ataattggac 1261 acatgetcaa attaaaggga gacatagatt eaaatgtagc tattgatctt agcaaceaag 1321 cttcattagc attcttacaa aagcatttag gacttcataa agattttgat cagtgggact 13B1 gcttgattga aggagatgat gagaatctta ttccagggac caacattaac acaaccaatc 1441 aacacatcat gttacagaac tcttcaggaa tagagaaata caattaggat taaaataggt 1501 ttttt
Последовательности малых интерферирующих РНК выбирают так, чтобы максимизировать внедрение антисмысловой (направляющей) цепи малой интерферирующей РНК в RISC и, тем самым, максимизировать способность RISC делать мРНК Lp-PLA2 человека мишенью деградации. Это можно успешно выполнить путем отбора последовательностей, которые имеют наименьшую свободную энергию связывания на 5'-конце антисмысловой цепи. Низкая свободная энергия приводит к усилению раскручивания 5'-конца антисмысловой цепи дуплекса малой интерферирующей РНК, тем самым, обеспечивая внедрение антисмысловой цепи в RISC и непосредственное последовательность-специфическое расщепление мРНК Lp-PLA2 человека.
В предпочтительном варианте осуществления малая интерферирующая РНК или модифицированная малая интерферирующая РНК доставляется в фармацевтически приемлемом носителе. В фармацевтически приемлемый носитель могут быть добавлены дополнительные агенты-носители, такие как липо-сомы.
В другом варианте осуществления малая интерферирующая РНК доставляется путем доставки вектора, кодирующего малую шпилечную РНК, в фармацевтически приемлемом носители в клетки органа индивидуума. Малые шпилечные РНК превращаются клетками после транскрипции в малую интерферирующую РНК, способную к нацеливанию, например, на Lp-PLA2. В одном варианте осуществления вектор может быть регулируемым вектором, таким как тетрациклин-индуцибельный вектор.
В одном варианте осуществления РНК-интерферирующие агенты, используемые в описанных здесь способах, активно поглощаются клетками in vivo после внутривенной инъекции, например, гидродинамической инъекции, без применения вектора, что иллюстрирует эффективную in vivo доставку РНК-интерферирующих агентов, например, малых интерферирующих РНК, используемых в способах на
стоящего изобретения.
Могут также использоваться другие стратегии для доставки РНК-интерферирующих агентов, например, малых интерферирующих РНК или малых шпилечных РНК, используемых в способах настоящего изобретения, такие как, например, доставка с помощью вектора, например, плазмидного или вирусного вектора, например, лентивирусного вектора. Такие векторы можно использовать, как описано, например, Xiao-Feng Qin и др. в Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188. Другие способы доставки включают доставку РНК-интерферирующих агентов, например, малых интерферирующих РНК или малых шпилечных РНК настоящего изобретения, используя основный пептид, путем конъюгации или смешивания РНК-интерферирующего агента с основным пептидом, например, фрагментом пептида ТАТ, смешивания с катионными липидами или формулирования в частицы.
Как отмечено, дцРНК, такие как малая интерферирующая РНК или малая шпилечная РНК, могут быть доставлены, используя индуцибельный вектор, такой как тетрациклин-индуцибельный вектор. Можно использовать способы, описанные, например, Wang и др. в Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5103-5106, используя векторы pTet-On (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). В некоторых вариантах осуществления вектор может быть плазмидным вектором, вирусным вектором или любым другим подходящим носителем, приспособленным к встраиванию чужеродной последовательности и к введению в эукарио-тические клетки. Вектор может быть экспрессионным вектором, способным управлять транскрипцией ДНК-последовательности молекулы нуклеиновой кислоты-агониста или антагониста в РНК. Вирусные экспрессионные векторы можно выбрать из группы, включающей, например, ретровирусы, лентивирусы, вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы крупного рогатого скота, векторы на основе аденовируса и аденоассоциированного вируса и гибридный вирус любых из вышеперечисленных. В одном варианте осуществления вектор является эписомным. Использование подходящего эписомного вектора обеспечивает способ сохранения молекулы нуклеиновой кислоты-антагониста у субъекта в большом числе копий вне хромосомной ДНК, исключая, тем самым, возможные эффекты интеграции в хромосому.
Молекулы для РНК-интерференции и ингибиторы в виде нуклеиновых кислот, применимые в раскрытых здесь способах, можно получить, используя любые известные методы, такие как прямой химический синтез, через процессирование более длинных двухцепочечных РНК путем подвергания воздействию рекомбинантного дайсер белка или лизатов зародышей дрозофилы, благодаря in vitro системе, полученной из клеток S2, используя РНК-полимеразу фага, РНК-зависимую РНК-полимеразу, и основанные на ДНК векторы. Использование клеточных лизатов или in vitro процессирование может, кроме того, включать последующее выделение коротких, например, длиной приблизительно 21-23 нуклеотидов, малых интерферирующих РНК из лизата и т.п. К химическому синтезу обычно приступают с получения двух одноцепочечных РНК-олигомеров, за которым следует отжиг двух одноцепочечных олигомеров в двухцепочечную РНК. Другие примеры включают способы, раскрытые в WO 99/32619 и WO 01/68836, в которых приводятся наставления в отношении химического и ферментативного синтеза малой интерферирующей РНК. Кроме того, для конструирования и производства специфических малых интерферирующих РНК имеются многочисленные коммерческие системы обеспечения (см., например, QIAGEN Inc., Valencia, СА и AMBION Inc., Austin, TX).
В некоторых вариантах осуществления агентом является белок или полипептид или агент для РНК-интерференции, который ингибирует экспрессию Lp-PLA2 и/или активность белка Lp-PLA2. В таких вариантах осуществления клетки можно модифицировать (например, с помощью гомологичной рекомбинации) для обеспечения увеличенной экспрессии такого агента, например, путем замены, полной или частичной, встречающегося в природе промотора полным гетерологичным промотором или его частью из условия, чтобы клетки экспрессировали природный агент-ингибитор Lp-PLA2, например, ингибитор Lp-PLA2 в виде белка или микроРНК, на высоких уровнях. Гетерологичный промотор встраивают так, чтобы он был функционально связан с желаемой нуклеиновой кислотой, кодирующей агент. См., например, публикацию международной РСТ-заявки WO 94/12650 (Transkaryotic Therapies, Inc.); публикацию международной РСТ-заявки WO 92/20808 (Cell Genesys, Inc.) и публикацию международной РСТ-заявки WO 91/09955 (Applied Research Systems). Можно также разработать клетки, экспрессируюшие эндогенный ген, включающий агент, под контролем индуцибельных регуляторных элементов, в случае которых регуляторные последовательности эндогенного гена можно заменить с помощью гомологичной рекомбинации. Методы активации генов описываются в патенте США № 5272071, выданном Chappel; в патенте США № 5578461, выданном Sherwin и др.; в заявке PCT/US92/09627 (WO 93/09222) Selden и др., и в заявке PCT/US90/06436 (WO 91/06667) и др. Агент можно приготовить культивированием трансформированных клеток-хозяев в условиях культивирования, подходящих для экспрессии микроРНК.
Результирующий экспрессированный агент можно затем очистить из такой культуры (т.е. среды для культивирования клеток или клеточных экстрактов), используя известные способы очистки, такие как гель-фильтрация и ионообменная хроматография. Очистка ингибитора Lp-PLA2-агента в виде пептида или нуклеиновой кислоты может также включать аффинную колонку, содержащую агенты, которые будут связывать белок; одну или несколько стадий колоночной хроматографии на таких смолах для связывания по сродству, как конканавалин А-агароза, heparin-toyopearl(tm) или сефароза Cibacrom blue 3GA; одну или несколько стадий, включающих хроматографию на основе гидрофобных взаимодействий, ис
пользуя такие смолы, как фениловый эфир, бутиловый эфир или пропиловый эфир; иммуноаффинную хроматографию или аффинную хроматографию с использованием комплементарной кДНК.
В одном варианте осуществления ингибиторы Lp-PLA2 в виде нуклеиновых кислот можно получить синтетически, например, путем химического синтеза нуклеиновой кислоты любым способом синтеза, известным квалифицированному специалисту. Являющиеся ингибиторами Lp-PLA2, синтезированные нуклеиновые кислоты затем можно очистить с помощью любого способа, известного в данной области техники. Способы химического синтеза нуклеиновых кислот включают, но без ограничения, in vitro химический синтез, используя фосфотриэфирную, фосфатную или фосфорамидитную технологию и твердофазные методы, или через промежуточные продукты дезоксинуклеозид-Н-фосфонаты (см. патент
США № 5705629, выданный Blongle).
В некоторых случаях, например, когда желательна увеличенная устойчивость к нуклеазам, предпочтительными могут быть нуклеиновые кислоты, включающие аналоги нуклеиновых кислот и/или имеющие модифицированные межнуклеозидные связи. Нуклеиновые кислоты, содержащие модифицированные межнуклеозидные связи, можно также синтезировать, используя реагенты и способы, которые широко известны в данной области техники. Например, в данной области техники широко известны способы синтеза нуклеиновых кислот, содержащих фосфонатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфорамидатные, метоксиэтилфосфорамидатные, формацетальные, тиоформацетальные, диизопропил-силильные, ацетамидатные, карбаматные, диметиленсульфидные (-CH2-S-CH2), диметиленсульфоксид-ные (-Or[2-SO-CH2), диметиленсульфонные (-CH2-SO2-CH2), 2'-О-алкильные и 2'-дезокси-2'-фтор-фосфоротиоатные межнуклеозидные связи (см. Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90: 543-584; Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31: 335 и приведенные там ссылки). В патентах США № 5614617 и 5223618, выданных Cook и др., № 5714606, выданном Acevedo и др., № 5378825, выданном Cook и др., № 5672697 и 5466786, выданных Buhr и др., № 5777092, выданном Cook и др., № 5602240, выданном De Mesmacker и др., № 5610289, выданном Cook и др., и № 5858988, выданном Wang, также описываются аналоги нуклеиновых кислот для усиления устойчивости к нуклеазам и поглощения клетками.
Синтетические молекулы малых интерферирующих РНК, включающие молекулы малых шпилечных РНК, можно получить, используя ряд методов, известных квалифицированным в данной области техники специалистам. Например, молекулы малых интерферирующих РНК можно химически синтезировать или рекомбинантно продуцировать, используя известные в данной области техники способы, такие как использование соответствующим образом защищенных рибонуклеозид-фосфорамидитов и обычного ДНК/РНК синтезатора (см., например, Elbashir S.M. et al. (2001) Nature 411: 494-498; Elbashir S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15: 188-200; Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557-4565; Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8012-8017; Tuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13: 3191-3197). Альтернативно, имеется несколько коммерческих поставщиков услуг, связанных с синтезом РНК, включающих, но без ограничения, Proligo (Hamburg, Германия), Dharmacon Research (Lafayette, CO, США), Pierce Chemical (часть Perbio Science, Rockford, IL, США), Glen Research (Sterling, VA, США), ChemGenes (Ashland, MA, США) и Cruachem (Glasgow, Соединенное Королевство). Как таковые, молекулы малых интерферирующих РНК не слишком трудно синтезировать и легко обеспечить с качеством, подходящим для РНК-интерференции. Кроме того, дцРНК можно экс-прессировать в виде структур петель с ножками, кодируемых плазмидными векторами, ретровирусами и лентивирусами (Paddison, P.J. et al. (2002) Genes Dev. 16: 948-958; McManus M.T. et al. (2002) RNA 8: 842850; Paul, C.P. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 505-508; Miyagishi M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 497500; Sui G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 5515-5520; Brummelkamp T. et al. (2002) Cancer Cell 2: 243; Lee N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 500-505; Yu J.Y. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 6047-6052; Zeng Y. et al. (2002) Mol. Cell 9: 1327-1333; Rubinson D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33: 401-406; Stewart S.A., et al. (2003) RNA 9: 493-501). Эти векторы обычно имеют промотор polIII в области upstream дцРНК, и могут экспрессировать смысловую и антисмысловную РНК-цепи отдельно и/или в виде шпилечных структур. Внутри клеток дайсер процессирует малую шпилечную РНК в эффективную малую интерферирующую РНК.
Наведенную на цель область молекулы малой интерферирующей РНК настоящего изобретения можно выбрать из установленной последовательности гена-мишени, например, кодирующей Lp-PLA2 последовательности, начиная с приблизительно 25 по 50 нуклеотид, с приблизительно 50 по 75 нуклео-тид или с приблизительно 75 по 100 нуклеотид в области downstream инициирующего кодона. Нуклео-тидные последовательности могут содержать 5' или 3' UTR и области, расположенные поблизости от инициирующего кодона. Один способ конструирования молекулы малой интерферирующей РНК настоящего изобретения включает идентификацию состоящего из 23 нуклеотидов элемента последовательности AA(N19)TT (где N может быть любым нуклеотидом) и отбор вариантов с содержанием G/C, составляющим по меньшей мере 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75%. Часть последовательности "ТТ" является необязательной. Альтернативно, если такая последовательность не выявляется, поиск можно продолжить, используя элемент NA(N21), где N может быть любым нуклеотидом. В этом случае 3'-конец смысловой малой интерферирующей РНК можно превратить в ТТ для того, чтобы сделать возможным образование симметричного дуплекса относительно состава последовательностей смысловой и
антисмысловой 3'-концевых избыточностей. Антисмысловую молекулу малой интерферирующей РНК можно затем синтезировать в виде комплемента нуклеотидов в положениях с 1 по 21 состоящего из 23 нуклеотидов элемента последовательности. Использование симметричных 3'-концевых избыточностей "ТТ" может быть полезным для обеспечения того, чтобы малые интерферирующие рибонуклеопротеино-вые частицы образовывались в приблизительно равных соотношениях этих частиц, расщепляющих смысловую и антисмысловую РНК-мишени (Elbashir et al. (2001), выше, и Elbashir et al. (2001), выше). Анализ баз данных последовательностей, включающих, но без ограничения, NCBI, BLAST, Derwent и Gen-Seq, а также имеющееся в продаже программное обеспечение для олигосинтеза, такое как Oligoengine(r), могут также использоваться для отбора последовательностей малых интерферирующих РНК из библиотек EST для гарантии того, что только один ген станет мишенью.
Доставка РНК-интерферирующих агентов
Способы доставки РНК-интерферирующих агентов, например, малой интерферирующей РНК, или векторов, содержащих РНК-интерферирующий агент, в клетки-мишени (например, клетки головного мозга или другие желаемые клетки-мишени, например клетки центральной и периферической нервной системы) могут включать, например, (i) инъекцию композиции, содержащей РНК-интерферирующий агент, например, малую интерферирующую РНК; или (ii) приведение клетки, например, клетки головного мозга, в непосредственный контакт с композицией, содержащей РНК-интерферирующий агент, например, малую интерферирующую РНК. В другом варианте осуществления РНК-интерферирующие агенты, например малую интерферирующую РНК, можно вводить непосредственно в какой-либо кровеносный сосуд, такой как вена, артерия, венула или артериола, посредством, например, гидродинамической инъекции или катетеризации. В некоторых вариантах осуществления направленные на Lp-PLA2 агенты, такие как направленная на Lp-PLA2 малая интерферирующая РНК, могут доставляться в конкретные органы, например, печень, костный мозг, или системно.
Введение может быть однократной инъекцией или с использованием двух или более инъекций. РНК-интерферирующий агент доставляется в фармацевтически приемлемом носителе. Один или несколько РНК-интерферирующих агентов могут использоваться одновременно. РНК-интерферирующие агенты, например малые интерферирующие РНК, направленные на мРНК Lp-PLA2, могут доставляться отдельно или в комбинации с другими РНК-интерферирующими агентами, например, малыми интерферирующими РНК, такими как, например, малые интерферирующие РНК, направленные на другие клеточные гены. Направленные на Lp-PLA2 малые интерферирующие РНК могут также вводиться вместе с другими фармацевтическими агентами, которые используются для лечения или профилактики нейроде-генеративных заболеваний или нарушений.
В одном варианте осуществления мишенями РНК-интерференции являются специфические клетки, ограничивающие возможные побочные эффекты РНК-интерференции, вызванные неспецифическим наведением на цель РНК-интерференции. В способе может использоваться, например, комплекс или слитая молекула, включающие направленную на клетку составляющую и связывающую молекулу для РНК-интерференции составляющую, которые используются для эффективной доставки молекул для РНК-интерференции в клетки. Например, слитый белок антитело-протамин после смешивания с малой интерферирующей РНК связывается с малой интерферирующей РНК и избирательно доставляет малую интерферирующую РНК в клетки, экспрессирующие распознаваемый антителом антиген, что приводит к выключению экспрессии гена только в тех клетках, которые экспрессируют антиген. Составляющая, связывающая малую интерферирующую РНК или индуцирующую РНК-интерференцию молекулу, является белком или связывающим нуклеиновую кислоту доменом или фрагментом белка, и связывающая составляющая сконденсирована с частью направляющей составляющей. Местонахождение направляющей составляющей может быть или на карбоксильном конце, или на аминоконце конструкции или в середине слитого белка.
Для доставки малых интерферирующих РНК в клетки in vitro и in vivo может использоваться механизм опосредованной вирусами доставки, описанный Xia, H. и др. (2002) в Nat. Biotechnol. 20(10): 1006. Для доставки малых шпилечных РНК в клетки in vitro и in vivo могут также использоваться механизмы опосредованных плазмидами или вирусами доставок малых шпилечных РНК, описанные Rubinson, D.A. и др. (2003) в Nat. Genet. 33: 401-406 и Stewart, S.A. и др. (2003) в RNA 9: 493-501.
РНК-интерферирующие агенты, например, малую интерферирующую РНК, можно также вводить в клетки через сосудистую и внесосудистую циркуляцию, кровеносную или лимфатическую систему и спинномозговую жидкость.
Доза конкретного РНК-интерферирующего агента будет составлять количество, необходимое для осуществления РНК-интерференции, например, посттрансляционного выключения гена (PTGS) конкретного гена-мишени, что, тем самым, приводит к ингибированию экспрессии гена-мишени или ингибиро-ванию активности или уровня белка, кодируемого геном-мишенью.
Также известно, что молекулы для РНК-интерференции не должны полностью соответствовать их последовательности-мишени. Предпочтительно, однако, когда 5' и срединная часть антисмысловой (направляющей) цепи малой интерферирующей РНК полностью комплементарна мишени-последовательности нуклеиновой кислоты.
Соответственно, молекулами для РНК-интерференции, функционирующими в качестве ингибиторов Lp-PLA2 в виде нуклеиновых кислот в настоящем изобретении, являются, например, но без ограничения, немодифицированные или модифицированные двухцепочечные РНК-молекулы, включающие малую временную РНК, малую интерферирующую РНК, малую шпилечную РНК, микроРНК, двухцепо-чечную РНК (дцРНК) (см., например, Baulcombe, Science 297: 2002-2003, 2002). Молекулы дцРНК, например, малая интерферирующая РНК, также может содержать 3'-концевые избыточности, предпочтительно 3'-концевые избыточности UU или ТТ. В одном варианте осуществления молекулы малых интерферирующих РНК настоящего изобретения не включают молекулы РНК, которые включают оцРНК, превышающую приблизительно 30-40 оснований, приблизительно 40-50 оснований, приблизительно 50 оснований или больше. В одном варианте осуществления молекулы малых интерферирующих РНК настоящего изобретения являются двухцепочечными на протяжении более чем приблизительно 25%, более чем приблизительно 50%, более чем приблизительно 60%, более чем приблизительно 70%, более чем приблизительно 80%, более чем приблизительно 90% их длины. В некоторых вариантах осуществления ингибитором Lp-PLA2 в виде нуклеиновой кислоты является любой агент, который связывается с мРНК для Lp-PLA2 и ингибирует ее экспрессию, причем ингибированию подвергается экспрессия мРНК для Lp-PLA2 или продукта транскрипции нуклеиновой кислоты, кодируемой SEQ ID NO: 1 или 2.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибирующими Lp-PLA2 агентами являются конструкции каталитических нуклеиновых кислот, такие как, например, рибозимы, которые способны к расщеплению РНК-транскриптов и, тем самым, предотвращению продукции белка дикого типа. Рибозимы направлены на конкретную последовательность и подвергаются с ней отжигу благодаря двум районам последовательности, комплементарным мишени, фланкирующим каталитический сайт рибози-ма. После связывания рибозим расщепляет мишень сайт-специфическим образом. Конструирование и проверку рибозимов, которые специфически распознают и расщепляют описанные здесь последовательности продуктов гена, например, Lp-PLA2, или их гомологи или варианты, можно успешно выполнить с помощью методов, хорошо известных квалифицированным в данной области техники специалистам (например, Lleber and Strauss (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 540-551, раскрытие этого документа включено сюда посредством ссылки).
Ингибиторы Lp-PLA2 в виде белков и пептидов
В некоторых вариантах осуществления агентами, которые ингибируют Lp-PLA2, являются ингибиторы в виде белков и/или пептидов или фрагменты ингибиторов Lp-PLA2, например, но без ограничения, мутированные белки, терапевтические белки и рекомбинантные белки. Ингибиторы в виде белков и пептидов могут также включать, например, мутированные белки, генетически модифицированные белки, пептиды, синтетические пептиды, рекомбинантные белки, химерные белки, антитела, гуманизированные белки, гуманизированные антитела, химерные антитела, модифицированные белки и их фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления агентами, которые ингибируют Lp-PLA2, являются доминантно-отрицательные варианты Lp-PLA2, например нефункционирующий вариант Lp-PLA2.
Антитела
В некоторых вариантах осуществления применимые в способах настоящего изобретения ингибиторы генов и/или продуктов генов включают, например, антитела, в том числе моноклональные, химерные, гуманизированные и рекомбинантные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления в качестве ингибиторов фермента Lp-PLA2 можно использовать нейтрализующие антитела. Антитела легко индуцировать у животных, таких как кролики или мыши, иммунизацией антигеном. Иммунизированные мыши особенно полезны для обеспечения источников В-клеток для производства гибридом, которые в свою очередь культивируют для получения больших количеств монокло-нальных антител.
В одном варианте осуществления этого изобретения ингибитором определенных здесь продуктов генов может быть молекула антитела или эпитопсвязывающая составляющая молекулы антитела и т.п. Антитела предусматривают высокую авидность связывания и уникальную специфичность в отношении широкого ряда мишеней - антигенов и гаптенов. Моноклональные антитела, пригодные для осуществления на практике настоящего изобретения, включают целое антитело или его фрагменты, и их создают согласно общепринятым методам, таким как синтез гибридом, методы рекомбинантных ДНК и синтез белков.
Применимые моноклональные антитела и фрагменты могут происходить из любого вида (в том числе людей) или могут быть созданы в виде химерных белков, в которых используются последовательности из более чем одного вида. В соответствии с настоящим изобретением также используются моно-клональные антитела человека или "гуманизированные" мышиные антитела. Например, мышиное моно-клональное антитело может быть подвергнуто "гуманизации" путем генетического рекомбинирования нуклеотидной последовательности, кодирующей Fv-область мыши (т.е. содержащую антигенсвязываю-щие сайты) или ее определяющие комплементарность участки, с нуклеотидной последовательностью, кодирующей область константных доменов человека и Fc-область. Признается, что гуманизированные направляющие составляющие уменьшают иммунореактивность антитела или полипептида в реципиенте-хозяине, делая возможными увеличение полупериода существования и уменьшение возможности небла
гоприятных иммунных реакций образом, схожим с тем, который описан в заявке на европейский патент № 0411893 А2. Антигенсвязывающую активность определяют по последовательностям и конформации аминокислот шести определяющих комплементарность участков (CDR), которые находятся в легкой и тяжелой цепях (по три CDR в каждой из этих цепей) вариабельной части (Fv) антитела. Молекула одно-цепочечного Fv (scFv) с М.м. 25 кДа, состоящая из вариабельной области (VL) легкой цепи и вариабельной области (VH) тяжелой цепи, соединенных через последовательность короткого пептидного спейсера, является наименьшим фрагментом антитела, разработанным на данное число. Были разработаны методы для дисплея молекул scFv на поверхности нитчатых фагов, которые содержат ген для scFv. Молекулы scFv с широким выбором антигенных специфичностей могут присутствовать в одном большом пуле библиотеки scFv-фагов. Некоторые примеры моноклональных антител и их химерных производных с высокими аффинностями, применимых в способах настоящего изобретения, описываются в заявке на европейский патент ЕР 186833; РСТ-заявке на патент WO 92/16553 и в патенте США № 6090923.
Химерные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулинов, характеризующиеся двумя или более сегментами или частями, происходящими из различных видов животных. Как правило, вариабельная область химерного антитела происходит из антитела не являющегося человеком млекопитающего, такого как мышиное моноклональное антитело, а константная область иммуноглобулина происходит из молекулы иммуноглобулина человека. Предпочтительно, обе области и их комбинация имеют низкую иммуногенность, определяемую в заведенном порядке.
Одним из ограничений молекул scFv является их одновалентное взаимодействие с антигеном-мишенью. Одним из самых легких способов улучшения связывания scFv с его мишенью-антигеном является увеличение его функциональной аффинности через создание мультимера. Объединение идентичных молекул scFv с образованием диател, триател и тетрател может включать ряд идентичных модулей Fv. Эти реагенты, поэтому, являются поливалентными, но моноспецифическими. Объединение двух различных модулей scFv, при этом каждый модуль включает VH- и VL-домены, происходящие из различных исходных Ig, будет приводить к образованию полностью функционального биспецифического диатела. Уникальным применением биспецифических scFv является связывание двух сайтов одновременно на одной и той же молекуле-мишени благодаря двум (соседним) поверхностным эпитопам. Эти реагенты обеспечили значительное преимущество в авидности относительно одноцепочечных scFv или Fab-фрагментов. Был разработан ряд поливалентных структур, основанных на scFv, включающих, например, миниантитела, димерные миниантитела, минитела, (scFv)2, диатела и триатела. Эти молекулы охватывают ряд валентностей (от двух до четырех сайтов связывания), размеров (от 50 до 120 кДа), гибкости и легкости продукции. В большинстве случаев одноцепочечные Fv-фрагменты антител (scFv) являются предоминантными мономерными, когда VH- и VL-домены соединены с помощью полипептидных линкеров из по меньшей мере 12 остатков. Во всех условиях термодинамически стабильным является мономерный scFv с линкерами длиной 12 и 25 аминокислот. Молекулы нековалентных диател и триател легко сконструировать, и их получают путем укорочения пептидного линкера, который соединяет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи молекулы одноцепочечного scFv. Димеры scFv соединены с помощью амфипатических спиралей, которые придают высокую степень гибкости, и структуру миниантитела можно модифицировать с созданием димерного биспецифического (DiBi) ми-ниантитела, которое содержит два миниантитела (четыре молекулы scFv), соединенных через двойную спираль. Сконденсированные на уровне гена или связанные через дисульфидную связь димеры scFv предусматривают промежуточную степень гибкости и создаются методами непосредственного клонирования с добавлением С-концевой последовательности Gly4Cys. Минитела scFv-СЮ состоят из двух молекул scFv, соединенных с СН3-доменом IgG или напрямую (LD-минитело), или через очень гибкую шарнирную область (Flex-минитело). Эти двухвалентные конструкции с молекулярной массой, составляющей приблизительно 80 кДа, способны к значительному связыванию с антигенами. Flex-минитело проявляет впечатляющую локализацию в опухолях мышей. Би- и триспецифические мультимеры могут быть образованы путем объединения различных молекул scFv. Увеличения функциональной аффинности можно достичь, когда Fab- или одноцепоченые Fv (scFv)-фрагменты антител подвергают комплексному соединению в димеры, тримеры или большие агрегаты. Самым важным преимуществом поливалентных scFv над одновалентными scFv- и Fab-фрагментами является увеличение функциональной аффинности связывания (авидности) с антигенами-мишенями. Для высокой авидности требуется, чтобы мультимеры scFv были способны к связыванию одновременно с различными антигенами-мишенями. Увеличение функциональной аффинности у диател из scFv по сравнению с мономерами scFv является значительным и главным образом проявляется в уменьшенных скоростях диссоциации, что является следствием множественного связывания с двумя или более антигенами-мишенями и приводит к повторному связыванию, когда один Fv подвергается диссоциации. Когда такие молекулы scFv объединяются в мультимеры, можно осуществить конструирование их или с высокой авидностью в отношении одного антигена-мишени, или со множеством специфичностей в отношении различных антигенов-мишеней. Множественное связывание с антигенами зависит от надлежащего расположения и ориентации Fv-модулей. Для полной авидности в целевом поливалентном scFv антигенсвязывающие сайты должны быть ориентированы в одном и том же направлении. Если множественное связывание стерически невозможно, тогда
видимые увеличения функциональной аффинности, вероятно, обусловлены эффектом увеличения повторного связывания, которое зависит от скоростей диффузии и концентрации антигена. Для настоящего изобретения также предусматриваются антитела, конъюгированные с составляющими, которые улучшают их свойства. Например, для настоящего изобретения можно использовать конъюгаты антитела с PEG, который увеличивает их полупериод существования in vivo. Иммунные библиотеки готовят подвергани-ем амплификации с помощью ПЦР генов, кодирующих вариабельные фрагменты антител, из В-лимфоцитов неиммунизированных или иммунизированных животных или пациентов. Используют комбинации олигонуклеотидов, которые являются специфичными для генов иммуноглобулинов или семейств генов иммуноглобулинов. Гены иммуноглобулинов зародышевой линии можно использовать для приготовления наборов полусинтетических антител, при этом определяющий комплементарность участок вариабельных фрагментов амплифицируют с помощью ПЦР, используя вырожденные праймеры. Преимуществом таких библиотек одной совокупности является то, что фрагменты антител против большого числа антигенов можно выделить из одной единственной библиотеки. Для увеличения аффинности фрагментов антител можно использовать метод фагового дисплея, при этом новые библиотеки готовят из уже существующих фрагментов антител с помощью случайного мутагенеза, мутагенеза со смещением кодонов или сайт-направленного мутагенеза, путем перетасовки цепей отдельных доменов с цепями фрагментов из первичных наборов или путем использования бактериальных штаммов-мутаторов.
Альтернативно, для продуцирования антител или их фрагментов можно использовать мышь SCID-hu, например, модель, разработанную Genpharm. В одном варианте осуществления предусматривается новый тип связывающейся с высокой авидностью молекулы, названной пептатело, созданной путем использования в максимальной мере эффекта множественного взаимодействия. Короткий пептидный ли-ганд конденсируют через полужесткую шарнирную область с доменом с биспиральной сборкой олиго-мерного матриксного белка хряща, что дает в результате пентамерную молекулу с поливалентным связыванием. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения лиганды и/или химерные ингибиторы могут быть нацелены на ткане- или опухолевоспецифические мишени путем использования биспецифических антител, например, полученных с помощью химического соединения антитела (A^ Ab) против лиганда и Ат, направленного против специфической мишени. Во избежание ограничений химических конъюгатов молекулярные конъюгаты антител можно использовать для продукции реком-бинантных биспецифических одноцепочечных Ат, направляющих лиганды и/или химерные ингибиторы к молекулам клеточной поверхности. Альтернативно, можно вводить два или более активных агентов и/или ингибиторов, присоединенных к направляющим составляющим, причем каждый конъюгат включает направляющую составляющую, например, другое антитело. Каждое антитело является реакционно-способным в отношении другого эпитопа-сайта мишени (ассоциированного с одним и тем же или другим антигеном-мишенью). Различные антитела с присоединенными агентами аккумулируются аддитивно в желаемом сайте-мишени. Для доставки лиганда или ингибитора в сайт-мишень можно использовать направляющие составляющие на основе антител или не на их основе. Предпочтительно для этой цели используют природный агент, связывающий нерегулируемый или специфичный для болезни антиген. Биоанализ для идентификации ингибиторов Lp-PLA2 Скринирование на ингибирование белка Lp-PLA2
В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения имеют отношение к применению ингибиторов Lp-PLA2 для лечения сосудистой деменции, например, болезни Альцгеймера и/или лечения нарушений, связанных с проницаемостью ВВВ. Если необходимо, проводят оценку агентов, которые ингибируют белок Lp-PLA2, используя биоанализ, описанный в патенте США № 5981252, который полностью включен сюда посредством ссылки. Одним таким анализом является проверка действия агента на рекомбинантный белок Lp-PLA2. В одном анализе, например, рекомбинантный Lp-PLA2 очищают до гомогенности из инфицированных бакуловирусом клеток Sf9, используя колонку, заполненную цинк-хелатной смолой, аффинную хроматографию на "голубой" сефорозе и колонку для анионооб-менной хроматографии. После очистки и ультрафильтрации фермент хранят при 6 мг/мл при 4°С. Буфер для анализа включает Tris-HCl (50 мМ), NaCl (150 мМ) и 1 мМ CHAPS, pH 7,4 при комнатной температуре. Активность определяют по увеличению эмиссии при 535 нм при гидролизе N-((6-(2,4-динитрофенил)амино)гексаноил)-2-(4,4-дифтор-5,7-диметил-4-бора-3а,4а-диаза-s-индацен-3-пентаноил)-1-гексадеканоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, триэтиламмонийной соли (PED6, индекс в каталоге Molecular Probes - D-23739), в качестве субстрата, используя флуорометрическое считывающее устройство для планшетов. Реакцию инициируют добавлением фермента (приблизительно 400 пМ в итоге по весу) и субстрата (5 мкМ в итоге) к ингибитору в общем объеме, составляющем 10 мкл.
Раскрытые здесь соединения, например, соединения, раскрытые в разделах, озаглавленных "Примеры синтеза", были проверены, и, как обнаружено, имеют значения IC50 в диапазоне от 0,1 до 10 нМ. Применение агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, для лечения нейродегенеративных
заболеваний или нарушений Нарушения, связанные с проницаемостью ВВВ
Не желая ограничиваться какой-либо теорией, ВВВ, функциональный, а также анатомический барьер, имеет большое значение для сохранения постоянной среды для оптимального функционирования центральной нервной системы. Большинство метаболических субстратов (т.е. сахара и аминокислоты) являются гидрофильными и проходят через ВВВ только с помощью специфических, опосредованных носителями транспортных систем, которые экспрессируются как на люминальной, так и аблюминальной сторонах эндотелиальных клеток ВВВ. Отмечены апикальные/базальные различия в распределении носителей и ферментов, которое позволяет проводить различие между специализированным эндотелием ВВВ и периферическим эндотелием. Был сделан значительный прогресс в понимании патофизиологии и механизмов, вовлеченных в облегчение проницаемости ВВВ. Клиническое последствие "больного ВВВ" встречается при многих заболеваниях, которые поражают головной мозг, при этом ВВВ становится нарушенным или измененным таким образом, что существует драматическое увеличение сосудистой проницаемости. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, существует несколько способов, с помощью которых различные молекулы могут проходить через эндотелий. Они включают межклеточные пути, везикулярный перенос или прямое чресклеточное проникновение через поврежденный эндотелий.
Нарушенный ВВВ или дисфункция ВВВ может быть причиной или следствием конкретного патологического процесса, например, нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Заболевания, при которых подтверждена увеличенная проницаемость ВВВ, включают неоплазию, ишемию, гипертензию, деменцию, эпилепсию, инфекцию, рассеянный склероз и травму. Эффект заболевания на функционирование ВВВ будет вторично влиять на кровоток в головном мозге и тонус сосудов головного мозга, что будет оказывать дальнейшее влияние на перенос через ВВВ.
Как здесь раскрыто, ингибирование Lp-PLA2 с использованием раскрытых здесь агентов применимо для лечения нарушений или заболеваний, при которых возникает проницаемость ВВВ и/или происходит нарушение ВВВ. Ингибирование Lp-PLA2 с использованием агентов, например раскрытых здесь агентов, применимо для лечения или предупреждения нарушений или заболеваний, при которых желательно сохранение ненарушенного ВВВ.
В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, ингибирующие Lp-PLA2, применимы для предупреждения и лечения нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Примеры неврологических заболеваний и нейродегенеративных заболеваний и нарушений включают, но без ограничения, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, сосудистую деменцию, старение и легкую степень ухудшения когнитивной функции.
В других вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, ингибирующие Lp-PLA2, применимы для предупреждения и лечения заболеваний, при которых, как установлено или может быть установлено, играет роль проницаемость ВВВ, таких как, но без ограничения, осмотическая гипертония, кислотный рН, ожоговая энцефалопатия, свинцовая энцефалопатия, аутоиммунный энцефалит, рассеянный склероз, постишемическая реперфузия, острая гипертензия, СВЧ-облучение, печеночная энцефалопатия, пароксизмы, опухоли, рост, гиперволемия, гипотермия, состояние после облучения, гипербарические состояния, менингит, лимфостатическая энцефалопатия, диабет, синдром Вернике-Корсакова, семейная олигофрения и боковой амиотрофический склероз.
Субъекты, поддающиеся лечению раскрытыми здесь агентами, ингибирующими Lp-PLA2, включают субъектов, подверженных риску развития заболевания, но не демонстрирующих симптомы (например, бессимптомных субъектов), а также субъектов, демонстрирующих в данный момент симптомы. В случае болезни Альцгеймера практически любой подвержен риску страдания болезнью Альцгеймера, если он или она живут достаточно долго. Следовательно, способы настоящего изобретения могут назначаться профилактически всей популяции без какой-либо оценки риска у пациента-субъекта. Раскрытые здесь способы особенно полезны для индивидуумов, которые подвержены известному наследственному риску развития болезни Альцгеймера. Такие индивидуумы включают индивидуумов, имеющих родственников, которые были подвержены этому заболеванию, или индивидуумов, риск развития этого заболевания у которых определен с помощью анализа генетических или биохимических маркеров, как здесь описано.
Заболевания в виде сосудистой деменции
Сосудистая деменция состоит из ряда гетерогенных патологических состояний, которые являются следствием ишемических или геморрагических повреждений головного мозга, а также повреждений, которые развиваются во время продолжительной гипоперфузии.
Субкортикальная ишемическая форма сосудистой деменции является часто встречающимся типом ухудшения когнитивной функции сосудистой этиологии и сосудистой деменции и одной из основных причин снижения когнитивной функции у пожилых людей. Субкортикальная ишемическая сосудистая деменция является, главным образом, следствием заболевания небольших сосудов, которое является
причиной лакун и обширных повреждений белого вещества, и может быть сопоставима с крупнососудистой деменцией или кортикальной сосудистой деменцией (Roman GC, Neurology, 1993, 43: 250-260; Roman GC Lancet Neurol. 2002, 1: 426-436). Ишемические повреждения при субкортикальной ишемической сосудистой деменции особенно затрагивают фронтальные-субкортикальные участки, наблюдение, которое объясняет основные когнитивные и клинические неврологические последствия сосудистой деменции (Ishii N., Neurology 986, 36: 340-345; Cummings JL, Arch. Neurol. 1993, 50: 873-880). Причиной субкортикальной ишемической сосудистой деменции также является устойчивая гипертензия (de Leeuw FE, Brain, 2002, 125: 765-772) и гипоперфузия вследствие застойной сердечной недостаточности (Roman GC, Neurol. Res. 2004, 26: 454-458), фибрилляции предсердий (de Leeuw FE, Neurology 2000, 54: 1795-1801) и синдрома обструктивного апноэ во сне (Kamba M., J. Neurosurg. Psychiatry. 2001, 71: 334-339).
Ишемические повреждения белого вещества, часто встречающееся повреждение у пожилых людей, являются характерными патологическими изменениями при субкортикальной ишемической сосудистой деменции и ухудшении когнитивной функции, и когнитивные дисфункции связаны с тяжестью поражения (Hachinski VC, Arch. Neurol. 1987; 4: 21-23; Pantoni L., Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 1999, 13 (suppl 3): S49-S54; de Groot JC, Neurology 2001; 56: 1539-1545). Повреждения белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии составляют основную патологию в нескольких типах сосудистой демен-ции, таких как болезнь Бинсвангера, церебральная амилоидная ангиопатия и наследуемая по аутосо-мально-доминантному типу церебральная артериопатия с субкортикальными инфарктами и лейкодист-рофией (CADASIL). Причиной этих повреждений белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии является хроническая церебральная гипоперфузия, которая является следствием сильного стеноза нескольких артерий или артериол, главным образом, в глубоко расположенном белом веществе (Pantoni L., Stroke 1997, 28: 652-659; de Groot JC, Neurology 2001, 56: 1539-1545, Roman GC, Neurol. Res.
2004, 26: 454-458; Capizzano AA, Am. J. Neuroradiol. 2000, 21: 621-630).
Болезнь Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим заболеванием, приводящим к сенильной деменции. См. в основном Selkoe, TINS 16, 403-409 (1993); Hardy et al., WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropa-thol. Exp. Neurol. 53, 438-447 (1994); Duff et al., Nature 373, 476-477 (1995); Games et al., Nature 373, 523 (1995). Вообще говоря, заболевание делится на два класса: заболевание с поздним началом, которое возникает в престарелом возрасте (свыше 65 лет), и заболевание с ранним началом, которое развивается задолго до старческого периода, т.е. между 35 и 60 годами. При обоих типах заболевания патология является одной и той же, но р-патологии имеют тенденцию быть более тяжелыми и распространенными в случаях начала в более раннем возрасте. На макроскопическим уровне заболевание характеризуется значительным сморщиванием головного мозга вдали от свода черепа, наблюдаемым при магнитно-резонансной томографии, являющимся прямым результатом утраты нейронов, и двумя типами макроскопических повреждений головного мозга, сенильными бляшками и нейрофибриллярными клубками. Сенильные бляшки представляют собой зоны, включающие дезорганизованные нейрональные отростки вплоть до 150 мкм в поперечном направлении и внеклеточные амилоидные отложения, которые обычно сконцентрированы в центре и видны при микроскопическом анализе срезов ткани головного мозга. Ней-рофибриллярные клубки являются внутриклеточными отложениями белка тау, состоящими из двух фи-ламентов, закрученных вокруг друг друга попарно.
Основной составной частью бляшек является пептид, называемый Ap или р-амилоидным пептидом. Пептид Ар является внутренним фрагментом из 39-43 аминокислот белка-предшественника, называемого белком-предшественником амилоида (АРР). С наличием болезни Альцгеймера было увязано несколько мутаций в белке АРР. См., например, Goate et al., Nature 349, 704 (1991) (замена валина717 изолейци-ном); Chartier Harlan et al., Nature 353, 844 (1991)) (замена валина717 глицином); Murrell et al., Science 254, 97 (1991) (замена валина717 фенилаланином); Mullan et al. Nature Genet. 1, 345 (1992) (двойная мутация с заменой лизина595-метионина596аспарагином595 лейцином596). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера путем увеличения или изменения процессирования АРР в Ар, в частности, процесси-рования АРР в увеличенные количества удлиненных форм Ар (т.е. Ар 1-42 и Ар 1-43). Полагают, что мутации в других генах, таких как гены пресенилинов, PS1 и PS2, косвенно влияют на процессирование АРР с созданием увеличенных количеств удлиненных форм Ар (см. Hardy, TINS 20, 154 (1997)).
Эти наблюдения указывают на то, что Ар, и особенно его удлиненная форма, является причинным элементом при болезни Альцгеймера.
Ар, также известный как р-амилоидный пептид, или А4-пептид (см. патент США № 4666829; Glen-ner & Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120. 1131 (1994)) представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, является основным компонентом характерных для болезни Альцгеймера бляшек. Ар образуется при процессировании большого белка АРР двумя ферментами, называемыми р- и у-секретазами (см. Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Известные мутации в АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, встречаются очень близко к сайту расщепления р- или у-секретазами или в пределах Ар. Например, положение 717 является очень близким к сайту расщепления у-секретазой АРР при его процессировании в Ap, а положения 670/671 являются очень близкими к сайту расщепления р-секретазой. Полагают, что
мутации вызывают болезнь Альцгеймера путем такого влияния на реакции расщепления, с помощью которых образуется Ар, при котором увеличивается количество образуемой формы из 42/43 аминокислот
Ар.
Ар обладает необычной способностью к установлению и активированию как классического, так и альтернативного пути активации комплемента. В частности, он связывается с Ciq и, в конечном счете, с C3bi. Это связывание способствует связыванию с макрофагами, что приводит к активации В-клеток. Кроме того, С3Ы распадается далее и затем связывается с CR2 на В-клетках зависимым от Т-клеток образом, что приводит к 10000-увеличению активации этих клеток. Этот механизм является причиной того, что Ар вызывает иммунный ответ, превышающий иммунный ответ на другие антигены.
Большинство стратегий лечения болезни Альцгеймера направлено на уменьшение или устранение отложения Ар42 в головном мозге, как правило, через уменьшение образования Ар42 из АРР и/или некоторые способы снижения существующих уровней Ар42 в источниках, которые вносят непосредственный вклад в отложение этого пептида в головном мозге (De Felice and Ferreira, 2002). Неполный список ассоциированных со старением причинных факторов в развитии спорадической болезни Альцгеймера включает смещение баланса между продукцией пептида Ар и его выведением из нейронов, что способствует внутриклеточной аккумуляции, увеличенную секрецию пептидов Ар нейронами в окружающее экстраклеточное пространство, увеличенные уровни окислительного повреждения этих клеток и общую гипоперфузию головного мозга и связанные компенсаторные метаболические сдвиги в поврежденных нейронах (Cohen et al., 1988; Higgins et al., 1990; Kalaria, 2000; Nalivaevaa et al., 2004; Teller et al., 1996;
Wen et al., 2004).
Ap42, который откладывается внутри нейронов и бляшек, мог бы также возникнуть вне нейронов (экзогенный Ар42) при патогенезе болезни Альцгеймера. Известно, что уровни растворимых пептидов Ар в крови намного выше, чем в интерстициальной ткани и CSF мозга здоровых индивидуумов (Seubert et al., 1992), при этом кровь является источником экзогенных пептидов Ар, которые, в конечном счете, откладываются в головном мозге при болезни Альцгеймера (Zlokovic et al., 1993). Однако за исключением ничтожных количеств Ар, которые активно переносятся через эндотелиальные клетки, хорошо известно, что доступ переносимых кровью пептидов Ар к ткани головного мозга у нормальных здоровых индивидуумов эффективно заблокирован при целостности гематоэнцефалического барьера (ВВВ) (Kan-dimalla et al., 2005; Poduslo et al., 1999). BBB является сложной структурой, состоящей из церебральных эндотелиальных клеток, опирающихся на базальную мембрану, которая дополнительно поддерживается отростками-ножками локальных астроцитов (Gloor et al., 2001; Risau et al., 1998). Он тесно регулирует проход компонентов крови в ткань головного мозга и является в высокой степени непроницаемым для почти всех белков и других макромолекул, хотя, в то же самое время, он делает возможным избирательное вхождение существенных молекул (Mayhan, 2001). Множество данных выявило, что старение связано с дегенеративными изменениями в кровеносных сосудах, которые могут поставить под угрозу целостность ВВВ. Например, ряд относительно часто встречающихся нейродегенеративных заболеваний у пожилых людей, включающих сосудистую деменцию и болезнь Альцгеймера, возникают, по меньшей мере, отчасти в результате цереброваскулярных патологий, которые развиваются в микроциркуляторном русле головного мозга (Breteler, 2000; Buee et al., 1997; de la Torre, 1997; Esiri et al., 1999; Kalaria et al., 1996). Хорошо известным фактом является связь между нервно-сосудистой сетью и нейродегенератив-ным заболеванием, заключающаяся в том, что патология болезни Альцгеймера, в том числе амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки, развивается впоследствии поблизости от повреждений при ударе
(Jellinger, 2002; Kalaria, 1996; Kalaria, 2002; Natte et al., 1998).
Генетические маркеры риска развития болезни Альцгеймера включают мутации в гене АРР, в частности мутации в положении 717 и положениях 670 и 671, упоминаемые как мутация Hardy и шведские мутации, соответственно (см., Hardy, TINS, выше). Другими факторами риска являются мутации в генах пресенилинов, PS1 и PS2, и АроЕ4, семейный анамнез болезни Альцгеймера, гиперхолестеринемия или атеросклероз. Субъектов, страдающих в настоящее время болезнью Альцгеймера, можно распознать по характерной деменции, а также наличию описанных выше факторов риска. Кроме того, для идентификации субъектов, имеющих болезнь Альцгеймера, имеется ряд диагностических анализов. Они включают измерение уровней тау и Ар42 в CSF. Увеличенные уровни тау и Ар42 являются признаком наличия болезни Альцгеймера. Болезнь Альцгеймера у индивидуумов можно также диагностировать по критериям MMSE или ADRDA. Образцом ткани для анализа обычно является кровь, плазма, сыворотка, слизь или спинномозговая жидкость пациента. Образец анализируют по шкале иммунного ответа на любые формы пептида Ар, обычно Ар42. Иммунный ответ можно определить по наличию, например, антител или Т-клеток, которые специфически связываются с пептидом Ар. Способы ELISA выявления антител, специфичных для Ар, описываются в разделе "Примеры".
Лечение пациентов, у которых не обнаруживаются симптомы заболевания, можно начинать в любом возрасте (например, 10, 20, 30). Однако обычно нет необходимости начинать лечение до достижения пациентом возраста 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение, как правило, включает в себя множество доз в тече
ние периода времени. Лечение можно контролировать с помощью исследования присутствия пептида Ар в CSF или проницаемости ВВВ с течением времени. Если пептид Ар все еще присутствует в CSF или ВВВ остается проницаемым или нарушенным, рекомендуется дополнительное лечение раскрытыми здесь агентами, ингибирующими Lp-PLA2, и/или лечение дополнительными терапиями для болезни Алыдгеймера. В случае пациентов с возможным синдромом Дауна лечение можно начинать внутриутробно путем введения терапевтического агента матери или вскоре после рождения.
В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, ингибирующие Lp-PLA2, также применимы для лечения других нейродегенеративных нарушений и нарушений когнитивных функций в общем, например, деменции, депрессии, спутанности сознания, болезни Крейтцфельда-Якоба или коровьего бешенства, болезни Хантингтона, утраты моторной координации, рассеянного склероза, болезни Паркинсона, болезни Пика и других болезней накопления в головном мозге (например, амилоидоза, ган-глиозидоза, болезней липидного накопления, мукополисахаридоза), обморока и сосудистой деменции. Таким образом, лечение может быть направлено на субъекта, пораженного без проявления симптомов нейродегенеративным заболеванием, оно может улучшить когнитивную функцию. Эффективность лечения можно определить с помощью контролирования мозгового кровотока (CBF) и/или функционирования гематоэнцефалического барьера (ВВВ), например, определения наличия тау или Ар в CSF. В некоторых вариантах осуществления можно использовать индикаторы функционирования ВВВ, например, описанные в патенте США № 6884591, который полностью включен посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления функционирование ВВВ можно контролировать, используя методы формирования изображения, известные специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники, например, используя магнитно-резонансный томограф (MRI) с высокой контрастностью. В таких вариантах осуществления выполняют сосудистое введение специфических контрастирующих агентов для МР-томографии непосредственно перед МР-томографией, причем контрастирующий агент остается внутри кровеносных сосудов у субъектов с нормальным ВВВ, в то время как у индивидуумов с проницаемым ВВВ контрастирующий агент проникает в ткань головного мозга и обнаруживается в виде "затемнения" при магнитно-резонансной томографии. Используя этот способ, можно провести количественные измерения локализации и степени нарушения ВВВ, используя программное обеспечение для МР-томографии. Соответственно, эффективность лечения ингибитором Lp-PLA2 можно определить по выявлению измеряемого уменьшения "затемнения" и/или уменьшения степени нарушения ВВВ после введения ингибиторов Lp-PLA2 по сравнению с нарушением до введения, как здесь описано.
Некоторые способы включают в себя определение значения исходного уровня, например, уровня бета-амилоида в CSF субъекта до введения дозы агента, и сравнение его со значением бета-амилоида в CSF после лечения. Снижение, например, снижение на 10%, уровня бета-амилоида в CSF служит признаком положительного результата лечения (т.е. введением агента добились уменьшения бета-амилоида в CSF, или усилили такое уменьшение). Если значение уровня бета-амилоида в CSF значительно не изменяется или увеличивается, это служит признаком отрицательного результата лечения. Как правило, предполагается, что субъекты, подвергаемые первоначальному курсу лечения агентом, будут демонстрировать снижение уровня бета-амилоида в CSF при использовании последовательных доз агента, как здесь описано.
В других способах определения эффективности лечения определяют контрольное значение (т.е. среднее и среднеквадратическое отклонение) бета-амилоида для контрольной популяции. Как правило, индивидуумы в контрольной популяции не получали предварительное лечение и не страдают болезнью Альцгеймера. Определенные значения бета-амилоида в CSF у субъекта после введения агента-ингибитора Lp-PLA2, раскрытого здесь, затем сравнивают с контрольным значением. Снижение бета-амилоида в CSF субъекта по сравнению с контрольным значением (т.е. снижение по меньшей мере на 10% бета-амилоида у субъекта) является сигналом положительного результата лечения. Отсутствие значительного снижения является сигналом отрицательного результата лечения.
В других способах определяют контрольное значение, например, бета-амилоида в CSF для контрольной популяции субъектов, которые были подвергнуты лечению терапевтическим агентом, который является эффективным в снижении бета-амилоида в CSF. Определенные значения бета-амилоида в CSF субъекта сравнивают с контрольным значением.
В других способах у субъекта, который в настоящее время не получает лечения раскрытыми здесь агентами, которые ингибируют Lp-PLA2, но был подвергнут предшествующему курсу лечения, контролируют бета-амилоид в CSF для определения того, требуется ли возобновление лечения. Определенное у испытуемого субъекта значение бета-амилоида в CSF можно сравнить с уровнем бета-амилоида в CSF, ранее достигнутым у субъекта после предшествующего курса лечения. Значительное снижение бета-амилоида в CSF касательно предшествующего измерения (т.е. снижение на по меньшей мере 10%) является признаком того, что лечение можно возобновить. Альтернативно, уровень бета-амилоида в CSF субъекта можно сравнить с контрольным уровнем бета-амилоида в CSF, определенным в популяции субъектов после подвергания курсу лечения. Альтернативно, уровень бета-амилоида в CSF субъекта можно сравнить с контрольным значением в популяциях подвергнутых профилактическому лечению
субъектов, которые остаются без симптомов заболевания, в частности, без симптомов проницаемости ВВВ, или популяциях подвергнутых терапевтическому лечению субъектов, которые демонстрируют ослабление интенсивности симптомов заболевания.
Способы идентификации субъектов, подверженных риску развития болезни Альцгеймера или
имеющих это заболевание
В состав субъектов, поддающихся лечению с использованием раскрытых здесь способов, входят субъекты, подверженные риску развития нейродегенеративного заболевания, например болезни Альц-геймера, но не демонстрирующие симптомы, а также субъекты, демонстрирующие симптомы нейродеге-неративного заболевания, например, субъекты с симптомами болезни Альцгеймера.
Можно провести скрининг субъектов на вероятность наличия или развития у них болезни Альцгей-мера, основываясь на ряде биохимических и генетических маркеров.
У субъекта можно также диагностировать повышенный риск развития болезни Альцгеймера, используя генетические маркеры болезни Альцгеймера. У небольшого числа семей прослеживалось генетическое отклонение от нормы на хромосоме 21 (St. George-Hyslop et al., Science 235: 885-890, 1987). Одним из генетических маркеров являются, например, мутации в гене АРР, в частности, мутации в положении 717 и положениях 670 и 671, упоминаемые как мутация Hardy и шведские мутации, соответственно (см., Hardy, TNINS, выше). Другими факторами риска являются мутации в генах пресенилинов, PS1 и PS2, и АроЕ4, семейный анамнез болезни Альцгеймера, гиперхолестеринемия или атеросклероз. В высокой степени вероятно, что у субъектов с мутациями в АРР, PS1 или PS2 будет развиваться болезнь Альц-геймера. АроЕ4 является геном подверженности заболеванию, и субъекты с е4-изоформой АроЕ (изо-формой АроЕ4) подвержены увеличенному риску развития болезни Альцгеймера. Проверка субъектов с изоформой АроЕ4 описывается в патенте США № 6027896, который полностью включен сюда посредством ссылки. Другие генетические связи были увязаны с повышенным риском развития болезни Альц-геймера, например, вариации в нейронном сортилин-подобном рецепторе SORL1 могут увеличить вероятность развития болезни Альцгеймера с поздним началом (Rogaeva et al., Nat. Genet. 2007 Feb; 39(2): 168-177). Другие потенциальные гены подверженности болезни Альцгеймера включают, например, АСЕ, CHRNB2, CST3, ESR1, GAPDHS, IDE, MTHFR, NCSTN, PRNP, PSEN1, TF, TFAM и TNF и используются для идентификации субъектов с повышенным риском развития болезни Альцгеймера (Bertram et al., Nat. Genet. 2007 Jan; 39(1): 17-23), а также вариации в гене альфа-Т-катенина (VR22) (Bertram et al., J. Med. Genet. 2 0 07 Jan; 44(1); 363) и в инсулин-деградирующем ферменте (IDE) (Kim et al., J. Biol. Chem. 2007;
282: 7825-7832).
У субъекта можно также диагностировать повышенный риск развития болезни Альцгеймера на основе простой проверки глаз, причем по наличию катаракты и/или Абета в хрусталике выявляют повышенный риск развития болезни Альцгеймера у субъекта. Способы выявления болезни Альцгеймера включают использование устройства для квазиупругого рассеивания света (Goldstein et al., Lancet. 2003; 12, 361: 1258-1265) от Neuroptix, использование квазиупругого рассеивания света (QLS) и сканирования с использованием флуоресцентных лигандов (FLS) и устройства для сканирования Neuroptix(tm) QEL, для того чтобы сделать возможными неинвазивные количественные определения амилоидных агрегатов в глазу, исследовать и определить отложения в специфических областях хрусталика в качестве ранней диагностики болезни Альцгеймера. Способ диагностирования у субъекта риска развития болезни Альцгей-мера с использованием такого способа неинвазивной проверки глаз описывается в патенте США № 7107092, который полностью включен сюда посредством ссылки.
Индивидуумов, страдающих в настоящее время болезнью Альцгеймера, можно распознать по характерной деменции, а также наличию описанных выше факторов риска. Кроме того, для идентификации индивидуумов, имеющих болезнь Альцгеймера, имеется ряд диагностических анализов. Они включают измерение уровней тау и Ах3р242 в CSF. Повышенные уровни тау и пониженные уровни Ах3р242 являются признаком наличия болезни Альцгеймера.
Существуют два альтернативных критерия, которые используются для клинического диагностирования болезни Альцгеймера: критерий DSM-IIIR и критерий NINCDS-ADRDA (акроним National Institute of Neurological and Communicative Disorder and Stroke (NINCDS) и Alzheimer's Disease and Related Disorders Association (ADRDA), см. McKhann et al., Neurology 34: 939-944, 1984). Вкратце, критерии диагностирования болезни Альцгеймера согласно DSM-IIIR включают: (1) деменцию, (2) протекающее без явных симптомов начало с обычно прогрессирующим течением с ухудшением и (3) исключение всех других специфических причин деменции с помощью анамнеза физического обследования и лабораторных тестов. В контексте критерия DSM-IIIR подразумевается, что деменция включает "многогранную утрату интеллектуальных способностей, таких как память, суждение, абстрактное мышление и другие высшие кортикальные функции, и изменения личности и поведения" (DSM-IIR, 1987).
В противоположность, критерий NINCDS-ADRDA определяет три класса болезни Альцгеймера, включающие "вероятную", "возможную" и "установленную" болезнь Альцгеймера. Клиническое диагностирование "возможной" болезни Альцгеймера можно провести на основе синдрома деменции, в отсутствие других неврологических, психиатрических или системных нарушений, достаточных для вызова
деменции. Критерии клинического диагностирования "вероятной" болезни Альцгеймера включают: (а) деменцию, установленную с помощью клинического исследования и подтвержденную доказательствами с использованием такого теста, как минипсихиатрический тест (Foldstein et al., J. Psych. Res. 12: 189-198, 1975); (b) недостаток в двух или более областях познания; (с) прогрессирующее ухудшение памяти и других когнитивных функций; (d) отсутствие нарушения сознания; (е) начало в возрасте от 40 до 90 лет, наиболее часто в возрасте после 65 лет; и (f) отсутствие системных нарушений или других заболеваний головного мозга, которые могли бы явиться причиной деменции. Критерии диагностирования установленной болезни Альцгеймера включают гистопатологические данные, полученные биопсическим методом, или после аутопсии. Поскольку для подтверждения установленной болезни Альцгеймера требуется гистологическое исследование взятого биопсическим методом образца головного мозга (который трудно получить), его редко используют для ранней диагностики болезни Альцгеймера.
Можно также использовать невропатологическое диагностирование болезни Альцгеймера, при котором анализируют ряд бляшек и клубков в коре головного мозга (лобных, височных и теменных долях), гиппокампе и миндалевидном теле (Khachaturian, Arch. Neurol. 42: 1097-1105; Esiri. "Anatomical Criteria for the Biopsy diagnosis of Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 239-252, 1990).
Можно также использовать количественный электроэнцефалографический анализ (EEG) для диагностирования болезни Альцгеймера. В этом способе используется анализ Фурье бета, альфа, зета и дельта полос (Riekkinen et al., "EEG in the Diagnosis of Early Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 159-167, 1990) для диагностирования болезни Альцгеймера.
Можно также диагностировать болезнь Альцгеймера с помощью количественного определения степени амиотрофии, поскольку такая атрофия обычно признается следствием болезни Альцгеймера. Примеры этих способов включают компьютерное томографическое сканирование (СТ) и магнитно-резонансную томографию (MRI) (Leedom and Miller, "CT, MRI, and NMR Spectroscopy in Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 297-313,
1990).
Можно также диагностировать болезнь Альцгеймера с помощью оценки уменьшенного мозгового кровотока или метаболизма в коре задней височно-теменной области головного мозга путем определения уменьшенного кровотока или метаболизма с помощью позитрон-эмиссионной томографии (PET) (Parks and Becker, "Positron Emission Tomography and Neuropsychological Studies in Dementia", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 315-327, 1990), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) (Mena et al., "SPECT Studies in Alzheimer's Type Dementia Patients", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 315-327, 1990) и способов ингаляции ксенона (Jagust et al., Neurology 38: 909-912; Prohovnik et al., Neurology 38: 931-937; Waldeman et al., Senile Dementias: II International Symposium, pp. 399-407, 1988).
Болезнь Альцгеймера можно также диагностировать иммунологически (Wolozin "Immunochemical Approaches to the Diagnosis of Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 217-235, 1990). Wolozin и сотрудники (Wolozin et al., Science 232: 648650, 1986) продуцировали моноклональное антитело "Alz50", которое взаимодействует с белком с М.м. 68 кДа "А68", который экспрессируется в бляшках и нейронных клубках пациентов с болезнью Альц-геймера. При использовании антитела Alz50 и анализа Вестерн-блоттингом А68 был обнаружен в спинномозговой жидкости (CSF) некоторых пациентов с болезнью Альцгеймера, но не в CSF нормальных пожилых пациентов (Wolozin and Davies, Ann. Neurol. 22: 521-526, 1987).
Болезнь Альцгеймера можно также диагностировать, используя нейрохимические маркеры для болезни Альцгеймера.
Нейрохимические маркеры, которые были ассоциированы с болезнью Альцгеймера, включают пониженные уровни ацетилхолинэстеразы (Giacobini and Sugaya, "Markers of Cholinergic Dysfunction in Alzheimer's Disease", Alzheimer's Disease, Current Research in Early Diagnosis, Becker and Giacobini (eds.), pp. 137-156, 1990), пониженный уровень соматостатина (Tamminga et al., Neurology 37: 161-165, 1987), обратная зависимость серотонина от 5-гидроксииндолуксусной кислоты (Volicer et al., Arch. Neurol. 42: 127-129, 1985), большее повышение гомованилиновой кислоты, индуцированное пробенецидом (Gibson et al., Arch. Neurol. 42: 489-4 92, 1985), и пониженный уровень нейронноспецифической энолазы (Cutler et al., Arch. Neurol. 43: 153-154, 1986).
Способы идентификации субъектов, подверженных риску развития деменции или имеющих ее,
и/или способы оценки памяти
Для диагностирования различных типов деменции и после диагностирования, контроля прогресси-рования заболевания в течение продолжительного периода времени можно использовать стандартную врачебную практику, используемую в настоящее время. Один такой способ включает по меньшей мере следующее: (i) оценку памяти, (ii) экстенсивное нейропсихологическое исследование, (iii) осмотр неврологом-гериатром и (iv) магнитно-резонансную томографию головного мозга.
Прогрессирование заболевания подтверждается по изменениям этих параметров с течением време
ни. В некоторых вариантах осуществления изменения параметров по меньшей мере одной из этих оценок можно использовать для оценки эффективности ингибитора Lp-PLA2 у субъекта в течение периода времени.
Можно использовать оценку памяти, например, программу UMDNJ New Jersey Institute for Successful Aging. Взрослые пациенты с жалобой на короткую память и/или снижение когнитивной функции находятся в программе оценки памяти, включающей оценку гериатрическими неврологическими, нейроп-сихологическими и социальными службами. Пациенты могут или сами обращаться, или направляться местными клиницистами или врачами при подозрении на возможное или вероятное нарушение памяти или деменцию. При такой оценке памяти во время первоначальной оценки все оценки, такие как: (i) оценка памяти, (ii) экстенсивное нейропсихологическое исследование, (iii) осмотр неврологом-гериатром и (iv) магнитно-резонансная томография головного мозга проводят в один и тот же день. Нейропсихоло-гическая оценка охватывает широкий список когнитивных функций, который помогает определить ряд и тяжесть нарушений. Она включает оценки суждения, адекватной самооценки, поведения, ориентации, контроля исполнения, общей умственной деятельности, зрительно-пространственной функции, памяти и способности к обучению. Определяют депрессию, если имеется. Неврологическая оценка охватывает анамнез изменения когнитивной функции, а также общий анамнез, и обычно проводят полный неврологический осмотр. Неврологическая оценка также может включать лабораторные исследования для исключения обратимых причин деменции, включающие витамин В12, фолат, основной метаболический профиль, СВС, TSH, ALT, AST, С-реактивный белок, сывороточный гомоцистеин и RPR. Изображения головного мозга предусматривают изображения структуры головного мозга, такие как магнитно-резонансная томография головного мозга, хотя могут использоваться другие способы получения изображения головного мозга, известные специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники. Для вынесения диагноза используют таблицу данных, касающихся анамнеза, нейропсихологи-ческих тестов, неврологического исследования, лабораторных исследований и изображения головного мозга.
Диагностирование деменции может основываться на руководствах в отношении практического параметра American Academy of Neurology, опубликованных в 2001 г. Диагностирование болезни Алыд-геймера может основываться на критерии NINDS-ADRDA. Диагностирование сосудистой деменции может основываться на критериях диагностических и лечебных центров штата Калифорния, AD. При последующей встрече можно сообщить заключительный диагноз пациенту и семье. Если в заключительном диагнозе указывается на то, что пациент или субъект имеет или, вероятно, имеет деменцию и/или потерю памяти, клиницист может уведомить о назначении лечения с использованием эффективного количества агента-ингибитора Lp-PLA2, раскрытого здесь. Часто присутствие социального работника при последующей встрече может также оказать пациенту и его семье помощь в текущих и будущих потребностях и ориентировать их в таких потребностях.
Другие способы диагностирования пациента, подверженного риску развития нейродегенеративного заболевания или нарушения, такого как сосудистая деменция или болезнь Альцгеймера, или имеющего такое заболевание, включают определение активности и/или экспрессии Lp-PLA2, используя раскрытые здесь способы, например, используя анализ PLAC, коммерчески доступный от diaDexus.
Способы идентификации субъектов, подверженных риску нарушения ВВВ или проницаемости ВВВ или имеющих такое нарушение и такую проницаемость
Прямое выявление нарушения ВВВ можно осуществить, используя магнитно-резонансную томографию и иъецирование контрастирующего агента. Для выявления проницаемости ВВВ можно использовать улучшения в разрешении МР-томографии и использовании специальных контрастирующих агентов. При одном способе субъектам вводят контрастирующий агент непосредственно перед получением изображения головного мозга, такого как изображение, полученное с помощью МР-томографии. В случае ненарушенного ВВВ контрастирующие агенты ограничиваются кровеносными сосудами головного мозга, в то время как у субъектов с нарушенным ВВВ контрастирующий агент "распыляется" в ткани головного мозга, что можно визуализировать. Таким образом, локализации в головном мозге, размер нарушения ВВВ и степень угрозы нарушения ВВВ, например степень просачивания сосудов, у субъектов можно непосредственно и количественно оценить согласно поддающимся измерению параметрам проницаемости ВВВ. Кроме того, такие способы можно использовать для оценки любых улучшений этих параметров, являющихся следствием лечения субъекта агентом, который ингибирует Lp-PLA2. Прямая визуализация нарушения ВВВ и связанного с ним просачивания сосудов в головном мозге применима в раскрытых здесь способах для контроля благоприятных эффектов лечения субъекта с проницаемостью ВВВ ингибиторами ВВВ. Улучшение по меньшей мере одного поддающегося измерению параметра проницаемости ВВВ, такого как локализация, размер нарушения ВВВ и степень просачивания сосудов, у субъектов, которым назначали ингибитор Lp-PLA2, служит признаком положительного результата назначения ингибитора Lp-PLA2. Параметры проницаемости ВВВ можно контролировать путем прямой визуализации и определять количественно с помощью анализа изображения, получаемого при МР-томографии, и они применимы в раскрытых здесь способах.
Оценка ингибиторов Lp-PLA2 в моделях сосудистой деменции и болезни Альцгеймера
В некоторых вариантах осуществления ингибирующие Lp-PLA2 агенты можно подвергнуть в моделях на животных оценке их эффекта на облегченную проницаемость ВВВ. Например, можно использовать модель гипергликемии и гиперхолестеринемии (HG/HC) на свинье, описанную здесь, в которой проницаемость ВВВ является нарушенной, например ВВВ является проницаемым, используя которую проницаемость ВВВ можно оценить в присутствии и в отсутствие ингибиторов Lp-PLA2 с помощью способов, широко известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления можно использовать маркеры функционирования ВВВ, описанные, например, в патенте США № 6884591, который полностью включен сюда посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления ингибирующие Lp-PLA2 агенты можно подвергнуть оценке в моделях на животных сосудистой деменции, позволяющих проанализировать эффекты ингибирующих Lp-PLA2 агентов на развитие и лечение сосудистой деменции, а также оценить дозы лекарственного средства, оказывающие эффект на развитие, прогноз сосудистой деменции и излечение от нее.
Модели сосудистой деменции на животных включают, например, окклюзию сонных артерий у крыс. См., например, Sard et al., Persistent impairment of gait performances and working memory after bilateral common carotid artery occlusion in the adult Wistar rat, BEHAVIORAL BRAIN RESEARCH 136: 13-20 (2002). Таким образом, повреждения белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии можно экспериментально индуцировать в головном мозге крысы вследствие хронической гипоперфузии мозга. Эту модель создают с помощью долговременной окклюзии обеих общих сонных артерий у крыс. Например, крыс Wistar можно подвергнуть анестезии, билатеральные общие сонные артерии обнажают благодаря срединному разрезу в области шеи и дважды перевязывают, используя шелковые нитки, билатерально. Затем после перевязывания мозговой кровоток (CBF) сначала уменьшается на приблизительно 30-50% от контроля. Позже, от приблизительно 1 недели до приблизительно 1 месяца, значения CBF находятся в диапазоне от 40 до 80% от контроля. Также наблюдались нарушения гематоэнцефалического барьера, а также увеличенная активность матриксных металлопротеиназ в повреждениях белого вещества. Эти изменения имеют очень схожий вид с изменениями в повреждениях белого вещества головного мозга цереброваскулярной этиологии у людей. Кроме того, эти результаты говорят о том, что в патогенезе изменений белого вещества играют роль воспалительные и иммунологические реакции.
Такие физиологические изменения коррелируют с проблемами обучения и памяти в модели окклюдированных сонных артерий на крысе. Поэтому динамика ходьбы крыс с окклюдированными сонными артериями снижается с течением времени по сравнению с исходной динамикой, например, на 90 день, у крыс с окклюзией билатеральных общих сонных артерий снижались функции распознавания объекта и выполнение теста на спонтанное изменение горизонтального перемещения по лабиринту по сравнению с крысами с симуляцией операции. Таким образом, эта модель на крысе экспериментальной хронической церебральной гипоперфузии в результате долговременной окклюзии билатеральных общих сонных артерий пригодна в качестве модели значительного ухудшения обучения вместе с разрежением белого вещества. Эта модель является полезным инструментом для оценки действенности агентов, ингибирующих Lp-PLA2, на патофизиологию хронической церебральной гипоперфузии и для предоставления данных для определения оптимальных доз и схем введения доз для предупреждения ухудшения когнитивных функций и повреждений белого вещества у пациентов с цереброваскулярным заболеванием.
Эффективность агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, для лечения или предупреждения сосудистой деменции можно, следовательно, определить с помощью наблюдения за динамикой ходьбы, памятью, способностями к обучению и частотой и тяжестью повреждений белого вещества у крыс с окклюзией сонных артерий. Схожим образом, дозу и схему назначения ингибиторов Lp-PLA2 можно устанавливать согласно памяти и способностям к обучению пациентов-людей, подвергаемых лечению в связи с сосудистой деменцией.
В некоторых вариантах осуществления оптимальной дозой агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, является доза, которая приводит к уменьшению активности и/или экспрессии Lp-PLA2, например, уменьшенной экспрессии нуклеиновой кислоты, например, мРНК, кодируемой геном Lp-PLA2, или уменьшенной экспрессии или активности белка Lp-PLA2. В других вариантах осуществления оптимальной дозой агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, является доза, которая создает максимальный защитный эффект для профилактики нейродегенеративного заболевания или нарушения или ослабляет симптом нейродегенеративного заболевания или нарушения.
В других вариантах осуществления оптимальной дозой агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, является доза, которая создает максимальный благоприятный эффект на ткань с повреждением, вызванным окклюзией артерий. Эффективная доза вызывает, по меньшей мере, статистически или клинически значительное ослабление по меньшей мере одного маркера, симптома или характеристики в виде гистологических данных сосудистой деменции. Маркеры, симптомы и характеристика в виде гистологических данных сосудистой деменции включают потерю памяти, спутанность сознания, нарушения в аксональ-ном транспорте, демиелинизацию, индукцию металлопротеиназ (ММР), активацию глиальных клеток, инфильтрацию лимфоцитов, отек и иммунологические реакции, которые приводят к повреждению ткани и дальнейшему повреждению сосудов. Стабилизация симптомов или уменьшение повреждения ткани в
условиях, в которых у контрольных пациентов или животных наблюдается ухудшение симптомов или повреждение ткани, является одним из индикаторов эффективности супрессивной терапии.
Другие нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся проницаемостью ВВВ
В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Lp-PLA2 при использовании раскрытых здесь способов, применимы для предупреждения и лечения нейродегенеративных заболеваний и нарушений. Дополнительные примеры неврологических заболеваний и нейродегенеративных нарушений включают, например, опосредованные повтором в виде полиглутамина заболевания, такие как болезнь Хантингтона, спинально-церебеллярные атаксии (например, типа 1, 2, 3, 6, 7 и 17), болезнь Макадо-Джозефа, спинальная и бульбарная мышечная атрофия (SBMA или синдром Кеннеди), Дентато-рубро-паллидо-льюисова атрофия (DRPLA) и другие неврологические заболевания, являющиеся результатом удлинения полиглутамина, или заболевания, являющиеся результатом удлинения повторов некодирую-щих ДНК, такие как X-синдром ретардации психического развития, определяемая ломкостью Х-хромосомы (ХЕ) ретардация психического развития, наследственная атаксия Фридрейха, миотоническая дистрофия, спинально-церебеллярные атаксии (типов 8, 10 и 12), или другие нейродегенеративные заболевания, такие как спинальная мышечная атрофия (болезнь Верднига-Хоффмана, болезнь Кугельберга-Веландера), болезнь Пика и губкообразная энцефалопатия.
Дополнительные нейродегенеративные заболевания, для которых применимы раскрытые здесь агенты, ингибирующие Lp-PLA2, включают, например, возрастное ухудшение памяти, деменцию с аги-рофильными частицами, Гуамский комплекс паркинсонизм-деменция, аутоиммунные заболевания (например, синдром Гийома-Барре, обыкновенную волчанку), болезнь Бисвангера, опухоли головного и спинного мозга (в том числе неврофиброматоз), церебральные амилоидные ангиопатии (Journal of Alzheimer's Disease vol. 3. 65-73 (2001)), центральный паралич, синдром хронической усталости, кортикоба-зальную дегенерацию, заболевания вследствие связанной с развитием дисфункции паренхимы ЦНС, заболевания вследствие связанной с развитием дисфункции сосудистой сети головного мозга, мультиин-фарктную деменцию, субкортикальную деменцию, деменцию с тельцами Леви, деменцию, индуцированную вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), деменцию без четкой гистологии, боксерскую демен-цию, плотные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, заболевания глаза, уха и вестибулярной системы, в которые вовлечена нейродегенерация (в том числе дегенерация желтого пятна и глаукома), синдром Дауна, дискинезии (пароксизмальные), дистонии, эссенциальное дрожание, синдром Фара, лоб-но-височную деменцию и паркинсонизм, связанный с хромосомой 17 (FTDP-17), дегенерацию лобно-височных долей, деменцию лобного типа, печеночную энцефалопатию, наследственную параплегию, гидроцефалию, ложную опухоль головного мозга и другие состояния, в которые вовлечены дисфункция CSF, болезнь Гоше, болезнь Халлервордена-Шпатца, синдром Корсакова, небольшое ослабление когнитивной функции, одночленную амиотрофию, боковой амиотрофический склероз, множественную системную атрофию, рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания (например, лейкодист-рофии), миалгический энцефаломиелит, миоклонус, нейродегенерацию, индуцированную химическими веществами, лекарственными средствами и токсинами, неврологические проявления СПИД, в том числе деменцию при СПИД, неврологические/когнитивные проявления и последствия бактериальных и/или вирусных инфекций, в том числе, но без ограничения, энтеровирусов, болезнь Ниманна-Пика, негуам-ский боковой амиотрофический склероз с нейрофибриллярными клубками, некетотическую гиперглици-мию, оливомостомозжечковую атрофию, окулофарингеальную мышечную дистрофию, неврологические проявления полиомиелита, в том числе непаралитического полиомиелита и постполиомиелитный синдром, первичный боковой склероз, прионовые болезни, в том числе болезнь Крейтцфельда-Якоба (в том числе вариантную форму), куру, спорадическую фатальную инсомнию, болезнь Герстманна-Штреусслера-Шейнкера и другие трансмиссивные губкообразные энцефалопатии, церебральную амилоидную ангиопатию прионовой этиологии, постэнцефалитный паркинсонизм, прогрессирующую мышечную атрофию, прогрессирующий бульбарный синдром, прогрессирующий субкортикальный глиоз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, синдром усталых ног, синдром Ретта, болезнь Сандгоффа, мышечную спастичность, спорадические лобно-височные деменции, стриатонигральную дегенерацию, подострый склерозирующий панэнцефалит, недостаток сульфитоксидазы, хорею Сиденгама, деменцию только с клубками, болезнь Тея-Сакса, синдром Туретта, сосудистую деменцию и болезнь Вильсона.
Дополнительные нейродегенеративные заболевания, для которых применимы раскрытые здесь агенты, ингибирующие Lp-PLA2, включают другие деменции, не перечисленные выше, такие как, но без ограничения, другую смешанную деменцию, лобно-височную деменцию, болезнь Пика, прогрессирующий супрануклеарный паралич (PSP), болезнь Паркинсона, сопровождаемую деменцией, кортикобазаль-ную дегенерацию, множественную системную атрофию, ВИЧ-индуцированную деменцию, деменции, сопровождаемые повреждением белого вещества, небольшое ослабление когнитивной функции (MCI).
В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Lp-PLA2, при использовании раскрытых здесь агентов, применимы для предупреждения и лечения проницаемости ВВВ у субъекта. Дополнительные примеры заболеваний и нарушений, при которых встречается проницаемость ВВВ, включают, например, рассеянный склероз (ALS), церебральную амилоидную ангиопатию, диабетическую ретинопатию, прионовые болезни, боковой амиотрофический склероз, синдром скованного человека, спи
нально-церебеллярную атаксию, наследственную атаксию Фридрейха, атаксию-телеангиэктазию, буль-боспинальную атрофию (синдром Кеннеди), спинальную мышечную атрофию, болезни накопления в нейронах (липофусцинозы), митохондриальную энцефаломиопатию, лейкодистрофии, неврологические остаточные явления после спинального шока/тупой травмы, цереброваскулярную гипертоническую болезнь, такую как лакунарные инфаркты, кровоизлияния с порезами, гипертоническая энцефалопатия. Проницаемость ВВВ также встречается при опухолях головного мозга, таких как опухоли с "синусоидальным" (иначе называемым высокопитательным) кровоснабжением.
Проницаемость ВВВ также встречается при неврологических остаточных явлениях, связанных со стрептококковыми инфекциями, аутоиммунных психоневрологических нарушениях, связанных со стрептококковыми инфекциями, у детей (PANDAS), синдроме Туретта, обсессивно-компульсивном расстройстве (OCD).
Проницаемость ВВВ также встречается при следующих заболеваниях и нарушениях: посленаркоз-ной нейропсихологической дисфункции и психоневрологических нарушениях, связанных с васкулопати-ей (например, обыкновенной волчанкой, гипертензией и т.п.). Проницаемость ВВВ может также встречаться у субъектов с заболеваниями, вызванными инфекционными агентами (или проникающими в центральную нервную систему, размножающимися в пределах ЦНС, или покидающими ЦНС при укоренении инфекции), например, ВИЧ, третичным сифилисом, нейроборрелиозом (болезнью Лима), вирусом простого герпеса типа 1 (HSV-1)/вирусом простого герпеса типа 2 (HSV-2), вирусом ветряной оспы (опоясывающим герпесом), цитомегаловирусом, полиомиелитом, бешенством, прогрессирующей множественной лейкодистрофией, подострым склерозирующим панэнцефалитом (после кори), болезнью, передаваемой простейшими микроорганизмами (токсоплазмозом, амебиазом и трипаносомозом), риккетсиоз-ными инфекциями (эпидемическим сыпным тифом и пятнистой лихорадкой Скалистых гор), болезнями, передаваемыми многоклеточными организмами, малярией и энцефалитом/менингитом. В некоторых вариантах осуществления энцефалит/менингит является следствием сепсиса.
В некоторых вариантах осуществления агенты, ингибирующие Lp-PLA2 при использовании раскрытых здесь способов, применимы для предупреждения и/или лечения проницаемости ВВВ, встречающейся у субъектов с аутизмов или субъектов, подверженных риску развития аутизма. Аутизм является, в основном, наследственным заболеванием, отличительными признаками которого являются недостаточное социальное взаимодействие и общение, речевые отклонения и ограниченное, повторяющееся поведение (American Psychiatric Association, 1994). Представленные данные невропатологических исследований и исследований изображений головного мозга говорят об увеличенном размере и весе головного мозга (Bailey et al., 1998, Kemper and Bauman, 1998, Sparks et al., 2002; Herbert et al., 2003; Palmen et al., 2004). Представленные данные многих исследований головного мозга больных аутизмом говорят об общем уменьшении размера клетки или увеличенной плотности клеточной упаковки, особенно в гиппо-кампе, основании и миндалевидном теле (Kemper and Bauman, 1993), что указывает на то, что нейроны-резиденты имеют небольшие дендритные деревья и характеризуются возможным неполным созреванием или приостановленным развитием.
В патогенез аутизма может вносить вклад аутоиммунность, причем связывание аутоантител с нейронами приводит к нарушению нормального характера развития мозга на критических стадиях. Были сообщения о специфичных для головного мозга аутоантителах у детей, страдающих аутизмом (Singh et al., 1988), и нескольких аутоиммунных факторах, включающих специфичные для головного мозга ауто-антитела (Gupta et al., 1996; Singh and Rivas, 2004), аномальное функционирование лимфоцитов (Warren et al., 1996), аномальную регуляцию цитокинов и связи с вирусами (Singh, 2001). Singh и Rivas (2004) продемонстрировали, что в сыворотке страдающих аутизмом детей скапливаются специфичные для головного мозга аутоантитела, и у 68 страдающих аутизмом детей возрастом от 4 до 12 лет антитела против хвостатого ядра, коры головного мозга и мозжечка были выявлены у 49, 18 и 9%, соответственно, страдающих аутизмом детей, но не у нормальных детей.
В другом исследовании было показано, что дети с синдромом Туретта имеют антитела против полосатого тела, и экспериментальная инфузия этих антител в полосатое тело крысы вызывала нейрональ-ную дисфункцию, схожую с синдромом Туретта, у крыс (Hallet et al., 2000). Устойчивая связь между наличием аутоантител против нейронов и неврологическим заболеванием была продемонстрирована наиболее ясно у людей в случаях, следующих за стрептокковыми инфекциями, таких как обсессивно-компульсивное расстройство (OCD), хорея Сиденгама, синдром Туретта, аутоиммунные психоневрологические нарушения, связанные со стрептококковыми инфекциями, у детей (PANDAS), паранеоплазия, и у пожилых пациентов с системной красной волчанкой, у которых демонстрируется как утрата когнитивной функции, так и потеря памяти (Swedo et al., 1989; Kalurae et al., 2004, Tanaka et al., 2004).
Доступ аутоантител против нейронов в головной мозг мог бы естественным образом быть ограничен целостностью гематоэнцефалического барьера (ВВВ), по меньшей мере, у нормальных здоровых индивидуумов. Для получения доступа антител к нейронам головного мозга гематоэнцефалический барьер может быть или нарушенным, или иметь замедленное развитие. Сцепление образования ВВВ в возрасте шесть месяцев или близко к этому возрасту, развития нормального иммунного спектра у новорожденного с нарушениями в развитии мозга может, в конечном счете, привести к аутизму. Во время позд
него эмбрионального периода и нескольких первых месяцев жизни создаются и уточняются критические нейронные пути, контролирующие рецепцию сигналов окружающей среды, и индивидуальные и соответствующие пути ответа на эти сигналы. Отсрочка развития или дефект в формировании ВВВ в это время может сделать возможным подвергание нейронов воздействию переносимых кровью аутоантител против нейронов, которые могли бы нарушить нормальный характер межсоединения нейронов, приводя к аутизму.
Оценка ингибиторов Lp-PLA2 на моделях нейродегенеративных заболеваний и/или
проницаемости ВВВ
Пригодность ингибитора Lp-PLA2 для лечения нейродегенеративного заболевания можно оценить в любой из ряда моделей нейродегенеративного заболевания на животных. Например, известны мыши, трансгенные по гену мутантного белка атаксина-1 с удлиненным повтором в виде полиглутамина, у которых развивается атаксия, типичная для спинально-церебеллярной атаксии типа 1 (SCA-1) (Burright et al., 1995, Cell 82: 937-948; Lorenzetti et al., 2000, Hum. Mol. Genet. 9: 779-787; Watase, 2002, Neuron 34: 905-919), и их можно использовать для определения эффективности агента-ингибитора Lp-PLA2 для лечения или предупреждения нейродегенеративного заболевания.
Дополнительные модели на животных, например, болезни Хантингтона (см., например, Mangiarini et al., 1996, Cell 87: 493-506, Lin et al., 2001, Hum. Mol. Genet. 10: 137-144), болезни Альцгеймера Hsiao, 1998, Exp. Gerontol. 33: 883-889; Hsiao et al., 1996, Science 274: 99-102), болезни Паркинсона (Kim et al., 2002, Nature 418: 50-56), амиотрофического бокового склероза (Zhu et al., 2002, Nature 417: 74-78), болезни Пика (Lee & Trojanowski, 2 001, Neurology 5 6 (Suppl. 4): S26-S30) и губкообразной энцефалопатии (He et al., 2003, Science 299; 710-712) можно использовать для оценки эффективности раскрытых здесь агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, аналогичным образом.
Модели на животных не ограничиваются моделями на млекопитающих. Например, род Drosophilia обеспечивает приемлемые модели для ряда нейродегенеративных нарушений (представленные в обзорах Fortine & IBonini, 2000, Trends Genet. 16: 161-167; Zoghbi & Botas, 2002, Trends Genet. 18: 463-471). Эти модели включают не только мушек, несущих мутированные гены мушки, но также мушек, несущих трансгены человека, необязательно с намеченными мутациями. Среди моделей на дрозофилах имеются, например, модели спинально-церебеллярной атаксии (например, SCA-1 (см., например, WO 02/058626), SCA-3 (Warrick et al., 1998, Cell 93: 939-949)), болезни Хантингтона (Kazemi-Esfarjani & Benzer, 2000, Science 287: 1837-1840)), болезни Паркинсона (Feany et al., 2000, Nature 404: 394-398; Auluck et al., 2002, Sciences 295: 809-810), возрастной нейродегенерации (Genetics, 2002, 161: 4208), болезни Альцгеймера (Selkoe et al., 1998, Trends Cell Biol. 8: 447-453; Ye et al., 1999, J. Cell Biol. 146: 1351-1364), амиотрофического бокового склероза (Parkes et al., 1998, Nature Genet. 19: 171-174) и адренолейкодистрофии.
Доказано, что использование дрозофилы в качестве модельного организма является важным инструментальным средством для оценки нейродегенеративных путей у человека, поскольку геном дрозофилы содержит много релевантных человеческих ортологов, функция которых очень хорошо сохранена (Rubin G.M., et al., Science 287: 2204-2215 (2000). Например, Drosophila melanogaster несет ген, который гомологичен АРР человека, который вовлечен в функционирование нервной системы. Ген, подобный АРР (APPL), идентичен на приблизительно 40% АРР695, нейронной изоформе (Rosen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 2478-2489)), и, подобно АРР695 человека, экспрессируется исключительно в нервной системе. Мушки с нехваткой гена APPL демонстрируют нарушения поведения, которое можно восстановить с помощью гена АРР человека, что говорит о том, что два гена имеют схожие функции в двух организмах (Luo et al., Neuron 9: 595-605 (1992)). Модели болезни Альцгеймера на дрозофиле описываются в заявках на патенты США 2004/0244064, 2005/0132425, 2005/0132424, 2005/0132423, 2005/0132422, 2005/0132421, 2005/0108779, 2004/0255342, 2004/0255341, 2004/0250302, которые полностью включены сюда посредством ссылки.
Кроме того, были созданы модели на дрозофилах опосредованных повтором в виде полиглутамина заболеваний (Jackson G.R., et al., Neuron 21: 633-642 (1998); Kazemi-Esfarani P. and Benzer S., Science 287: 1837-1840 (2000); Fernander-Funez et al., Nature 408: 101-106 (2000)), болезни Паркинсона (Feany M.B. and Bender W.W., Nature 404; 394-398l (2000)) и других заболеваний, которые близко воспроизводят состояние заболевания у людей на клеточном и физиологическом уровнях, и эти модели были успешно использованы для идентификации других генов, которые причастны к этим заболеваниям. Трансгенные мушки демонстрируют прогрессирующую нейродегенерацию, которая может приводить ко множеству измененных фенотипов, включающих опорно-двигательные фенотипы, поведенческие фенотипы (например, аппетит, поведение при спаривании и/или время жизни) и морфологические фенотипы (например, форму, размер или расположение клетки, органа или придатка, или размер, форму или скорость роста мушки).
Оценку симптомов животных, которым вводили соединения, проводят относительно симптомов животных, которым не вводили соединения. Измеряемое изменение тяжести симптома (т.е. ослабление по меньшей мере одного симптома, т.е. ослабление на 10% или больше) или отсрочка в возникновении симптома у животных, повергнутых лечению ингибитором Lp-PLA2, в сравнении с животными, не подвергнутыми лечению, служит признаком эффективности терапии.
Можно оценить память или обучение животных, например, выполняя поведенческий тест. Можно
использовать любой поведенческий тест на память и обучение, широко известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, например, но без ограничения, тест в водном лабиринте Морриса для моделей на являющихся грызунами животных. Измеряемое увеличение способности выполнять тест в водном лабиринте Морриса у животных, которым вводили ингибитор Lp-PLA2, в сравнении с животными, не подвергнутыми лечению, служит признаком эффективности терапии.
Пригодность ингибитора Lp-PLA2 для лечения заболевания или нарушения ВВВ можно оценить в любой из ряда моделей на животных, в которых имеет место нарушение ВВВ и/или проницаемость ВВВ. Одним из способов, который можно использовать, является оценка способности переносимых кровью компонентов, таких как Ig или пептиды амилоиды-бета (АР), к пересечению ВВВ и взаимодействию с нейронами головного мозга. В одном из способов, применимом в раскрытых здесь способах, для оценки способности переносимых кровью компонентов, таких как Ig или пептиды амилоиды-бета (АР), к пересечению ВВВ используется флуоресцентно меченный Абета42, и этот способ описывается Clifford и др., 2007, в Brain Research 1142: 223-236, документе, который полностью включен сюда посредством ссылки. В этом способе способность переносимых кровью пептидов АР пересекать нарушенный ВВВ оценивали, используя меченные флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) Ар42 и Ар40, вводимые посредством инъекции в хвостовую вену мышей с ВВВ, ставшим проницаемым с помощью обработки коклюшным токсином. Установлено, что как Ар40, так и Ар42 пересекают ВВВ с аномальной проницаемостью и связываются избирательно с некоторыми подтипами нейронов, но не с глиальными клетками, при этом через 48 ч после инъекции в головном мозге АР42-положительные нейроны широко распространены. В качестве контроля, животные с ненарушенным ВВВ (контроли с введением солевого раствора) блокировали проникновение переносимых кровью пептидов АР в головной мозг. Такую модель на животном можно использовать для оценки способности ингибитора Lp-PLA2 предупреждать или лечить нарушение ВВВ или проницаемость ВВВ с помощью определения АР42-положительных нейронов в головном мозге через 48 ч после инъекции коклюшного токсина и FITC-меченного Ар42 в присутствии или в отсутствие ингибитора Lp-PLA2. Уменьшение Ар42-положительных нейронов в головном мозге животных, которым вводили ингибитор Lp-PLA2, по сравнению с животными, которым не вводили ингибитор Lp-PLA2, указывает на то, что ингибитор Lp-PLA2 является эффективным в лечении и/или предупреждении проницаемости ВВВ.
Можно также использовать другие микромолекулы в моделях на животных проницаемости ВВВ. В ткани головного мозга можно выявить меченые, переносимые кровью компоненты, например, флуорес-
35 125 35
центно меченные или S-меченные пептиды Абета, I- или S-меченный иммуноглобулин (Ig), перок-сидазу хрена (HRP), Эванс голубой, флуоресцентные или магнитные микрошарики (Molecular Probes) и декстраны различной молекулярной массы.
Известно, что коклюшный токсин, происходящий из Bordetella pertussis, эффективно увеличивает проницаемость ВВВ у мышей уже через 24 ч после инъекции и в течение периода, составляющего вплоть до нескольких недель (Amiel, 1976; Bruckener et al., 2003), и, вероятно, вовлечен в проявление связанных с коклюшем, неврологических последствий, которые связаны с нарушением целостности ВВВ в эпителии хориоидного сплетения и/или эндотелии капилляров головного мозга. Коклюшный токсин также использовали для усиления развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), широко используемой модели на мыши рассеянного склероза (Ben-Nun et al., 1997; Linthicum et al., 1982;
Yong et al., 1993).
Составы композиций
Соединения, например раскрытые здесь агенты, ингибирующие Lp-PLA2, могут использоваться в качестве лекарственного средства или использоваться для приготовления фармацевтических композиций с использованием одного или нескольких раскрытых здесь средств обеспечения. Их можно вводить in vitro в клетки культуры, in vivo в клетки организма или ex vivo в клетки вне индивидуума, которые позже возвращают в организм того же самого индивидуума или другого индивидуума. Такие клетки могут быть дезагрегированы или предоставлены в виде солидной ткани.
Соединения, например, раскрытые здесь агенты, ингибирующие Lp-PLA2, могут использоваться для приготовления лекарственного средства или других фармацевтических композиций. Применение инги-бирующих Lp-PLA2 агентов, дополнительно включающих фармацевтически приемлемый носитель, и композиций, дополнительно содержащих компоненты, пригодные для доставки композиции индивидууму, известно в данной области техники. Добавление таких носителей и других компонентов к раскрытым здесь агентам не выходит за пределы уровня знаний в этой области техники.
Фармацевтические композиции можно вводить в виде композиции, адаптированной к прохождению через гематоэнцефалический барьер или прямому контакту с эндотелием. В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить в виде композиции, адаптированной для системного введения. В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить в виде композиции, адаптированной для доставки в конкретные органы, например, но без ограничения, печень, костный мозг, или для системной доставки.
Альтернативно, фармацевтические композиции можно добавлять в среду для культивирования кле
ток ex vivo. Помимо активного соединения такие композиции могут содержать фармацевтически приемлемые носители и другие ингредиенты, о которых известно, что они облегчают введение и/или усиливают поглощение, (например, солевой раствор, диметилсульфоксид, липид, полимер, системы направленной доставки к специфическим клеткам, основанной на сродстве). Композиция может быть включена в гель, тампон или другую проницаемую матрицу (например, сформированную в виде шариков или диска) и размещена поблизости от эндотелия для непрерывного, местного высвобождения. Композиция может назначаться в однократной дозе или в многократных дозах, которые вводят в различные периоды времени.
Фармацевтические композиции могут вводиться с использованием любого известного пути. В качестве примера композицию можно вводить через слизистую оболочку, с использованием легочного, местного или другого пути введения в строго определенное место или системного пути (например, энтераль-ного или парентерального). Используемые здесь выражения "парентеральное введение" и "вводимый парентерально" означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно с помощью инъекции, и включают, но без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартери-альную, подоболочечную, внутрижелудочковую, внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердеч-ную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, интрацереброспинальную и надчревную инъекцию, инфузию и другие методы инъекции или инфузии, без ограничения. Используемые здесь выражения "системное введение", "вводимый системно", "периферическое введение" и "вводимый периферически" означают введение раскрытых здесь агентов так, что они поступают в систему животного и, следовательно, подвергаются метаболизму и другим подобным процессам, например, подкожное введение.
Выражение "фармацевтически приемлемый" используется здесь для ссылки на такие соединения, материалы, композиции и/или лекарственные формы, которые, в рамках обоснованной оценки лечения, являются подходящими для применения для приведения в контакт с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соответствующими допустимому отношению польза/риск.
Используемое здесь выражение "фармацевтически приемлемый носитель" означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, инертный наполнитель, растворитель или инкапсулирующий материал, вовлеченные в перенос или транспортировку рассматриваемых агентов от одного органа, или части тела, в другой орган, или часть тела. Каждый носитель должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции, например, носитель не должен уменьшать эффект агента на лечение. Другими словами, носитель является фармацевтически инертным.
Соответствующие выборы количеств и назначений по времени доз, композиции и путей введения можно осуществить с целями достижения благоприятного эффекта у субъекта с сосудистой деменцией, например, субъекта с болезнью Альцгеймера или субъекта, подверженному риску развития такого заболевания (т.е. эффективности), и избегания чрезмерной токсичности или другого вреда субъекту (т.е. безопасности). Следовательно, "эффективные" относятся к таким выборам, которые включают обычное манипулирование условиями для достижения желаемого эффекта.
Общепринятой схемой введения доз является болюсное введение композиции индивидууму в течение короткого периода времени один раз в день. Альтернативно, эффективную суточную дозу можно разделить на множество доз для введения, например от двух до двенадцати доз в день. Уровни доз активных ингредиентов в фармацевтической композиции можно также изменять для достижения неустойчивой или устойчивой концентрации соединения или его производного у индивидуума, особенно в эндотелии сосудов головного мозга или вокруг него, и вызова желаемого терапевтического ответа или защиты. Но начало с доз на уровнях, которые ниже уровней, требуемых для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенное увеличение дозы до достижения желаемого эффекта также находится в пределах знаний в данной области техники.
Вводимое количество ингибирующих Lp-PLA2 агентов зависит от факторов, известных квалифицированному в данной области техники специалисту, таких как биоактивность и биодоступность соединения (например, полупериод существования в организме, стабильность и метаболизм), химические свойства соединения (например, молекулярная масса, гидрофобность и растворимость), путь и схема введения и т.п. Будет также понятно, что конкретный уровень дозы, который должен быть достигнут для какого-либо конкретного индивидуума, может зависеть от множества факторов, включающих возраст, пол, состояние здоровья, анамнеза, вес, сочетание с одним или несколькими другими лекарственными средствами и тяжесть заболевания.
Термин "лечение", относительно лечения сосудистой деменции, или болезни Альцгеймера, или заболевания, связанного с нарушенным ВВВ, относится, среди прочего, к предупреждению развития заболевания или изменению течения заболевания (например, но без ограничения, замедлению прогрессиро-вания заболевания), или реверсированию симптома заболевания или ослаблению одного или нескольких симптомов и/или одного или нескольких биохимических маркеров у субъекта, предотвращению ухудше
ния или прогрессирования одного или нескольких симптомов, инициированию возврата в прежнее состояние или улучшению прогноза, и/или предупреждению заболевания у субъекта, не имеющего его, а также замедлению или уменьшению прогрессирования существующего заболевания. Для данного субъекта ослабление симптома, его ухудшение, регрессию или прогрессирование можно определить по объективному или субъективному критерию. Например, можно определить изменение одного или нескольких биохимических маркеров, например, проницаемости, наличия Ig вне сосудов в головном мозге или бета-амилоида в CSF.
В некоторых вариантах осуществления можно определить эффективность лечения как уменьшение заболеваемости или смертности (т.е. удлинение кривой выживаемости для выбранной популяции). Профилактические способы (например, предотвращение или уменьшение частоты рецидива) также считаются лечением.
В некоторых вариантах осуществления лечение может также включать комбинацию с другими существующими способами лечения, например, существующими агентами для лечения болезни Альцгей-мера, например, но без ограничения, Арисептом или донепезилом, Когнексом или такрином, Экселоном или ривастигмином, Реминилом или галантамином, противоамилоидной вакциной, понижающими Абета терапиями, умственным упражнением или стимуляцией; см. обзор Zlokovic, Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 1533-1660, 2002.
В некоторых вариантах осуществления раскрытые здесь агенты, которые ингибируют Lp-PLA2, можно комбинировать с другими агентами, например терапевтическим агентом для предупреждения и/или лечения нейродегенеративных заболеваний. Такими агентами могут быть любые агенты, используемые в настоящее время или разрабатываемые для лечения и/или предупреждения нейродегенератив-ного заболевания или нарушения, причем агент может оказывать профилактический и/или лечебный эффект и/или ослаблять симптом нейродегенеративного нарушения или заболевания.
В тех вариантах осуществления, в которых раскрытые здесь агенты-ингибиторы Lp-PLA2 используются для предупреждения и/или лечения болезни Альцгеймера и/или сосудистой деменции, раскрытые здесь агенты-ингибиторы Lp-PLA2 можно использовать в комбинации с лекарственными средствами, широко известными специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, которые, как заявлено, являются полезными для симптоматических лечений деменции. Примеры таких лекарственных средств включают, но без ограничения, агенты, которые, как известно, модифицируют хо-линергическую передачу, такие как агонисты или аллостерические модуляторы мускариновых рецепторов Ml, антагонисты мускариновых рецепторов M2, ингибиторы ацетилхолинэстеразы (такие как тетра-гидроаминоакридин, донепезил, галантамин и ривастигмин), агонисты или аллостерические модуляторы никотиновых рецепторов (такие как агонисты или аллостерические модуляторы а7 или агонисты или аллостерические модуляторы а4р2), агонисты активируемых пролифератом пероксисом рецепторов (PPAR) (такие как агонисты PPARy), частичные агонисты рецептора 5-НТ4, антагонисты и обратные агонисты гистамина Н3, антагонисты рецептора 5-НТ6 или антагонисты рецептора 5НТ1А, позитивные модуляторы АМРА (альфа-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионат, подтип глутаматных рецепторов) и антагонисты или модуляторы рецептора ^метил^-аспарагиновой кислоты (такие как меман-тин).
В тех вариантах осуществления, в которых раскрытые здесь агенты-ингибиторы Lp-PLA2 используются для лечения болезни Альцгеймера, раскрытые здесь агенты-ингибиторы Lp-PLA2 можно использовать в комбинации с вышеупомянутыми лекарственными средствами, которые, как заявлено, являются полезными для симптоматических лечений деменции и/или в качестве модифицирующих заболевание агентов. Модифицирующие заболевание агенты включают, но без ограничения, ингибиторы и модуляторы гамма-секретазы и ингибиторы бета-секретазы человека (ВАСЕ). Модифицирующими заболевание агентами также являются, например, но без ограничения, ингибиторы и модуляторы гамма-секретазы, ингибиторы бета-секретазы (ВАСЕ) и любые другие антиамилоидные подходы, включающие активную и пассивную иммунизацию, например агенты, идентифицированные с использованием способов, раскрытых в заявке на патент США 2005/0170359, а также агенты, раскрытые в международных заявках на патенты WO 05/07277, WO 03/104466 и WO 07/028133 и в патентах США № 6866849 и 6913745, которые полностью включены сюда посредством ссылки.
Таким образом, на практике может осуществляться лечение комбинацией одного или нескольких агентов, которые ингибируют Lp-PLA2, с одной или несколькими другими лечебными процедурами.
Кроме того, лечение может также включать множество агентов для ингибирования экспрессии или
активности Lp-PLA2. Например, другие агенты включают применение статинов с ниацином (см.
http://www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568) и фенофибратом (см.
http://www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=14817756 &taxid= 19).
Аналогично, диагностирование в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять на практике с использованием других диагностических способов. Например, изменение профилей экспрессии генов в эндотелии сосудистой системы, головном или спинном мозге (например, кровеносных или лептоменингеальных сосудах) можно проанализировать, используя специфичные для заболевания набо
ры для молекулярной диагностики (например, выполненные по заказу ранжированные ряды, мультиплексную количественную ПЦР, ранжированные ряды для мультиплексного протеомного анализа). Кроме того, для увеличения точности и/или чувствительности диагностики в комбинации можно использовать неинвазивный способ диагностирования (например, CAT, MRI, SPECT или PET). Ранняя и надежная диагностика особенно полезна для лечений, которые эффективны только для болезни Альцгеймера от легкой до средней степени тяжести или только для отсрочки ее прогрессирования.
Вводимым субъекту количеством предпочтительно является количество, которое не вызывает токсические эффекты, которые перевешивают пользу, которую приносит их введение. Дальнейшими целями являются уменьшение числа симптомов заболевания у индивидуума, уменьшение их тяжести и/или иное уменьшение страдания от них по сравнению с признанными стандартами лечения.
Получение соединений в соответствии с существующими в настоящее время правилами надлежащей лабораторной практики (GLP) и надлежащей производственной практики (GMP) будет контролироваться государственными органами (например, Администрацией по контролю за продуктами питания и лекарствами). Для этого необходимо точное и полное ведение записей, а также контролирование обеспечения/контроля качества. Также предусматривается контроль подписанных пациентами протоколов органами и основными группами лиц для гарантии того, что информированное согласие получено, безопасность, биоактивность, соответствующая доза и эффективность продуктов исследуются пофазно; результаты являются статистически значимыми; и придерживаются этических правил. Необходим аналогичный контроль протоколов, в которых используются модели на животных, а также применения токсических химических веществ и соблюдения правил.
Дозы, составы, объем доз, схемы введения доз и способы анализа результатов, направленных на ин-гибирование экспрессии и/или активности Lp-PLA2, могут варьировать. Таким образом, минимальная и максимальная эффективные дозы варьируют в зависимости от способа введения. Блокирование клинических и гистологических изменений, сопровождающих сосудистую деменцию, может происходить в конкретном диапазоне доз, который, однако, варьирует в зависимости от организма, в который вводится доза, пути введения, того, вводятся ли агенты, которые ингибируют Lp-PLA2, в соединении с другими кос-тимулирующими молекулами, и конкретной схемы введения ингибитора Lp-PLA2. Например, обычно при назальном введении требуются меньшие дозы, чем при пероральном, энтеральном, ректальном или вагинальном введении.
Для оральных или энтеральных композиций для применения в настоящем изобретении могут быть изготовлены таблетки в соответствии с общепринятыми способами, в которых используются твердые носители, широко известные в данной области техники. Капсулы, используемые для оральных композиций, используемых в способах настоящего изобретения, могут быть изготовлены из любого фармацевтически приемлемого материала, такого как желатин или производные целлюлозы. Также предусматриваются системы для пероральной доставки с непрерывным высвобождением и/или энтеросолюбильные покрытия для вводимых перорально лекарственных форм, такие как те, которые описаны в патенте США № 4704295 "Enteric Film-Coating Compositions", выданном 3 ноября 1987, в патенте США № 4556552 "Enteric Film-Coating Compositions", выданном 3 декабря 1985, в патенте США № 4309404 "Sustained Release Pharmaceutical Compositions", выданном 5 января 1982, и в патенте США № 4309406 "Sustained Release Pharmaceutical Compositions", выданном 5 января 1982.
Примеры твердых носителей включают крахмал, сахар, бентонит, диоксид кремния и другие широко используемые носители. Дальнейшие неограничивающие примеры носителей и разбавителей, которые можно использовать в композициях настоящего изобретения, включают физиологический раствор, сироп, декстрозу и воду.
Композиция с энтеросолюбильным покрытием
Что касается композиций для введения малых химических молекул-ингибиторов Lp-PLA2 типа, подобного формулам (I)-(IV), раскрытых здесь, одним особенно полезным вариантом осуществления является композиция в форме таблетки, содержащая ингибитор Lp-PLA, с энтеросолюбильной полимерной оболочкой. Пример такого препарата можно найти в WO 2005/021002. Активный материал в сердцевине может присутствовать в. микронизированной или солюбилизированной форме. Помимо активных материалов сердцевина может содержать добавки, принятые в области спрессованных таблеток. Соответствующие добавки в такой таблетке могут включать разбавляющие вещества, такие как безводная лактоза, лактозы моногидрат, кальция карбонат, магния карбонат, дикальция фосфат или их смеси; связующие вещества, такие как микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипро-пилцеллюлоза, поливинилпирролидон, прежелатинизированный крахмал или аравийская камедь или их смеси, дезинтегрирующие агенты, такие как сшитый с микрокристаллической целлюлозой (выполняющей как функцию связующего вещества, так и функцию дезинтегратора) поливинилпирролидон, натрий-крахмалгликолят, натрия кроскармеллоза или их смеси; смазывающие вещества, такие как магния стеа-рат или стеариновая кислота, вещества, способствующие скольжению, или средства для текучести, такие как коллоидный раствор диоксида кремния, тальк или крахмал, и стабилизаторы, такие как обезвоживающий аморфный диоксид кремния, красящие вещества, корригенты и т.п. Предпочтительно таблетка содержит лактозу в качестве разбавляющего вещества. Когда связующее вещество присутствует, им
предпочтительно является гидроксипропилметилцеллюлоза. Предпочтительно таблетка содержит магния стеарат в качестве смазывающего вещества. Предпочтительно таблетка содержит натрия кроскармеллозу в качестве дезинтегрирующего агента. Предпочтительно таблетка содержит микрокристаллическую целлюлозу.
Разбавляющее вещество может присутствовать в диапазоне 10-80 вес.% сердцевины. Смазывающее вещество может присутствовать в диапазоне 0,25-2 вес.% сердцевины. Дезинтегрирующий агент может присутствовать в диапазоне 1-10 вес.% сердцевины. Микрокристаллическая целлюлоза, если присутствует, может находиться в диапазоне 10-80 вес.% сердцевины.
Предпочтительно вес активного ингредиента (рассчитанный как эквивалент свободного основания) составляет от 10 до 50 вес.% сердцевины, более предпочтительно от 15 до 35 вес.% сердцевины (рассчитанный как эквивалент свободного основания). Сердцевина может содержать любой терапевтически подходящий уровень дозы активного ингредиента, но предпочтительно содержит вплоть до 150 мг активного ингредиента в виде свободного основания. Особенно предпочтительно, когда сердцевина содержит 20, 30, 40, 50, 60, 80 или 100 мг активного ингредиента в виде свободного основания. Активный ингредиент может присутствовать в виде свободного основания или любой фармацевтически приемлемой соли. Если активный ингредиент присутствует в виде соли, вес регулируют, с тем чтобы таблетка содержала желаемое количество активного ингредиента, рассчитанное как свободное основание соли. Предпочтительно активный ингредиент присутствует в виде соли гидрохлорида.
Сердцевина может быть изготовлена из спрессованной смеси ее компонентов. Компоненты можно подвергнуть непосредственному прессования или можно подвергнуть гранулированию перед прессованием. Такие гранулы можно создать с помощью общепринятого способа гранулирования, известного в данной области техники. В альтернативном варианте осуществления гранулы можно индивидуально покрыть энтеросолюбильной оболочкой, а затем заключить в стандартную капсульную оболочку.
Сердцевину окружают оболочкой, которая включает энтеросолюбильный полимер. Примерами эн-теросолюбильных полимеров являются целлюлозы ацетат фталат, целлюлозы ацетат сукцинат, метил-целлюлозы фталат, этилгидроксицеллюлозы фталат, поливинилацетат фталат, поливинилбутират ацетат, сополимер винилацетата с малеиновым ангидридом, сополимер стирола с моноэфиром малеиновой кислоты, сополимер метилакрилата с метакриловой кислотой или сополимер метакрилат-метакриловая ки-слота-октилакрил. Их можно использовать или по отдельности, или в комбинации, или вместе с полимерами, отличными от вышеупомянутых полимеров. Оболочка может также включать нерастворимые вещества, которые не разлагаются, не растворяются в живом организме, такие как производные алкилцел-люлозы, такие как этилцеллюлоза, сшитые полимеры, такие как сополимер стирола с дивинилбензолом, полисахариды, имеющие гидроксильные группы, такие как декстран, производные целлюлозы, которые обрабатывают бифункциональными сшивающими агентами, такими как эпихлоргидрин, дихлоргидрин или 1,2-,3,4-диэпоксибутан. Оболочка может также включать крахмал и/или декстрин.
Предпочтительными энтеросолюбильными покровными материалами являются имеющиеся в продаже, энтеросолюбильные полимеры Eudragit(r), такие как Eudragit(r) L, Eudragit(r) S и Eudragit(r) NE, используемые отдельно или с пластификатором. Такие покрытия обычно наносят, используя жидкую среду, и природа пластификатора зависит от того, является ли среда водной или неводной. Пластификаторы для использования с водной средой включают пропиленгликоль, триэтилцитрат, ацетилтриэтилцитрат или Citroflex(r) или Citroflex(r) A2. Неводные пластификаторы включают эти пластификаторы, а также диэтил- и дибутилфталат и дибутилсебакат. Предпочтительным пластификатором является триэтилцит-рат. Включаемое количество пластификатора будет выявлено квалифицированными в данной области специалистами.
Оболочка может также включать препятствующее прилипанию вещество, такое как тальк, диоксид кремния или глицерилмоностеарат. Предпочтительно препятствующим прилипанию веществом является глицерилмоностеарат. Как правило, оболочка может включать приблизительно 5-25 вес.% пластификатора и вплоть до приблизительно 50 вес.% препятствующего прилипанию вещества, предпочтительно 110 вес.%. препятствующего прилипанию вещества.
Если желательно, можно включить поверхностно-активное вещество для содействия в формировании суспензии полимера в воде. Квалифицированному в данной области техники специалисту известно множество примеров возможных поверхностно-активных веществ. Предпочтительными примерами поверхностно-активных веществ являются полисорбат 80, полисорбат 20 или натрия лаурилсульфат. Если присутствует, поверхностно-активное вещество может составлять 0,1-10% оболочки, предпочтительно 0,2-5% и особенно предпочтительно 0,5-2%.
В одном варианте осуществления между сердцевиной и энтеросолюбильным покрытием включен защитный слой. Защитный слой представляет собой покровный материал, который может использоваться для защиты энтеросолюбильной оболочки от возможного химического разъедания какими-либо щелочными ингредиентами в сердцевине. Защитный слой может также обеспечить более сглаженную поверхность, тем самым делая возможным более легкое присоединение энтеросолюбильной оболочки. Квалифицированный в данной области техники специалист знает о подходящих покрытиях. Предпочти
тельно защитный слой изготовлен их покровного материала Опадри (Opadry) и особенно предпочтительно, когда он представляет собой Опадри белый OY-S-28876.
В одном варианте осуществления фармацевтически активным ингредиентом является 1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он или его соль.
Один пример такой композиции с энтеросолюбильным покрытием, описанный в WO 2005/021002, включает варьирующие количества 1-(№(2-диэтилшино)этил)-№(4-(4-трифторметилфенил)бен-зил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-она (называемого "активным" в этом примере) в виде соли гидрохлорида.
В этом примере лактозы моногидрат, микрокристаллическую целлюлозу, активный ингредиент, гидроксипропилметилцеллюлозу и половину кроскармеллозы натрия помещали в смеситель на 10 л с большим усилием сдвига Fielder (мог быть использован любой смеситель с большим усилием сдвига) и смешивали в течение 5 мин при 300 об./мин с выключенным прерывателем. Смесь затем гранулировали при добавлении приблизительно 750 мл воды при продолжении смешивания. Гранулы сушили в сушилке с псевдоожиженным слоем Glatt 3/5, помещали с использованием Comil в бункерный смеситель на 5 л Pharmatec и затем смешивали с любой заданной формулой безводной лактозой плюс остальная часть кроскармеллозы натрия в течение 5 мин при 20 об./мин. Магния стеарат помещали в смеситель и процесс смешивания продолжали в течение дополнительной 1 мин при 10 об./мин. Смесь с добавленным смазочным веществом подвергали прессованию, используя роторный таблеточный пресс Riva Piccolla, оснащенный 9,5 мм круглыми нормально выпуклыми пробивными штампами (можно было использовать любой подходящий таблеточный пресс). Защитный слой и впоследствии энтеросолюбильное покрытие наносят напылением водной суспензии ингредиентов покровных слоев в установке для нанесения покрытия Manesty 10, используя параметры процесса покрытия, рекомендуемые производителями покровных полимеров (снова любая подходящая установка для нанесения покрытия могла бы использоваться).
Используя эти материалы или их эквиваленты, квалифицированный в данной области техники специалист может приготовить другие препараты с энтеросолюбильным покрытием этого сорта.
Примеры
Представленные здесь примеры относятся к способам и композициям для предупреждения и/или лечения нейродегенеративных нарушений, например, но без ограничения, сосудистой деменции и нарушений гематоэнцефалического барьера, например болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона, путем ингибирования Lp-PLA2. По всей этой заявке приводятся ссылки на различные публикации. Полное раскрытие всех публикаций и приведенных в них ссылок, тем самым, включено посредством ссылки в эту заявку для того, чтобы более полно описать уровень области техники, к которой относится это изобретение. Не подразумевается, что следующие примеры ограничивают объем формулы настоящего изобретения, а скорее подразумевается, что они приведены в качестве примеров некоторых вариантов осуществления. Подразумевается, что любые варианты приведенных в качестве примеров способов, осуществленные квалифицированным специалистом, находятся в объеме настоящего изобретения.
Способы
Модель на животном:
Была разработана модель диабета/диабетической гиперхолестеринемии (DM/НС) на свинье, которая воспроизводит атеросклероз типа, подобного человеческому. Диабет у сельскохозяйственных свиней весом 25-30 кг и возрастом ~4 месяца вызывали с помощью одной внутривенной инъекции 125 мг/кг стрептозотоцина (Sicor Pharmaceuticals, Irvine, CA). После стабилизации в течение 1-2 недель животные с повышенными уровнями глюкозы в плазме (> 150 мг/дл) находились на атерогенной (с высоким содержанием жира) диете, как показано в табл. 1 (Animal Specialties, Quakertown, PA) для достижения уровня холестерина, составляющего приблизительно 250-800 мг/дл.
Сохранение уровня холестерина определяли по схеме, представленной в табл. 2. Таблица 1. Компоненты диеты с содержанием холестерина, составляющим 2,0%, являются
Компонент
В весовом отношении
Фермерский корм для свиней Purina*
47,5%
Лярд
25, 0%
Казеин
11,1%
Сухое цельное молоко
7,9%
Арахисовое масло
2,37%
Холестерин
2,0%
Солевая смесь Вессона
2,37%
Витаминная смесь Purina*
1,58%
Натрия холат
1,58%
Кальция карбонат
0,4%
Холина хлорид
0,2%
Корма Purina*, LLC, Checkerboard Square, St. Louis, Missouri, 63164, США. Эти корма были приготовлены производителем "Специальный ассортимент и оборудование для животных", LLC, Quakertown, PA USA.
Для диеты с содержанием холестерина, составляющим 0,5%, компоненты были схожими за исключением 0,5% холестерина и 20% лярда. Животными были белые свиньи йоркширской породы, которые были кастрированными самцами возрастом 3-5 месяцев и были получены из Archer Farms, Darlington, MD. Эти корма были приготовлены производителем "Специальный ассортимент и оборудование для животных", LLC, Quakertown, PA USA.
В дни 1-2 животных кормили нормальной пищей, а затем в дни 3-14 животные находились на диете с содержанием холестерина 0,5% и содержанием лярда 2%, и на 14 день определяли уровни холестерина, и диету изменяли соответствующим образом с увеличением содержание холестерина и лярда до 2 и 10%, соответственно, если уровень холестерина составлял <300 мг/дл.
После индукции DM/НС холестерин измеряли до стабилизации холестерина на уровнях между 300 и 800 мг/дл, а после стабилизации уровней холестерина холестерин измеряли ежемесячно. Если уровни холестерина не были стабильными после стадии первоначальной стабилизации, контроль диеты животного снова проводили по первоначальной схеме измерения каждые две недели. Ежемесячно определяли уровни холестерина, в том числе уровни общего холестерина, LDL, HDL, VLDL и триглицеридов. Установку диеты животного на обеспечение стабильного уровня холестерина определяли по схемам, представленным в табл. 2.
300-800
ыг/дл
Без изменения
Обычный график
> еоо мг/дл
Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%
через 2 недели
> 1000 мг/дл
Смесь (25:75) диета с содержанием лярда 10%
через 2 недели
> 1500 мг/дл
Нормальный корм
через 2 недели
800-1000 мг/дл
Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%: и нормальный корм
через 2 недели
<300 мг/дл
Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм
через 2 недели
300-300
мг/дл
Без изменения в диете. Смесь (50:50) с диетой с содержанием лярда 10%
через 2 недели
> 800 мг/дл
Переход на смесь 25:75 (10% лярда)
через 2 недели
> 1000
мг/дл
Переход на смесь 25:75 (10% лярда)
через 2 недели
> 1500
мг/дл
Нормальный корм
через 2 недели*
> 1000 мг/дл
Смесь (25:7 5) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм
через 2 недели
<300 мг/дл
Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм
через 2 недели
300-800 мг/дл
Без изменения в
диете. Смесь (25:75) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм
через 2 недели
=¦800 мг/дл
Без изменения в диете
через 2 недели
> юоо
ыг/дл
Нормальный корм
через 2 недели*
> 1500
мг/дл
Нормальный корм
через 2 недели*
> 1500 мг/дл
Нормальный диетический корм
через 2 недели
<300 мг/дл
Переход на 100% диету с содержанием лярда 10%
через 2 недели
300-300 мг/дл
Переход на смесь (50:50) диета с содержанием лярда 10%:нормальный корм
через 2 недели
> 800 мг/дл
Нормальный корм
через 2 недели*
> 1000 мг/дл
Нормальный корм
через 2 недели*
> 1500 мг/дл
Нормальный корм
через 2 недели*
Через месяц после стабилизации холестерина на уровне 250-800 мг/дл животных рандомизировали в две экспериментальные группы, группу DM/НС (гипергликемии и гиперхолестеринемии), не подвергаемую лечению, и группу DM/НС, подвергаемую лечению (10 мг/кг/день SB-480848, также упоминаемого как 1 -(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он. Животных умерщвляли на 6 месяц после рандомизации. Протокол опыта на животных был утвержден комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию University of Pennsylvania.
Оценивали две группы с диабетом/гиперхолестеринемией:
1) группу DM/НС и 2) животных с DM/НС, получающих ингибиторы Lp-PLA2. В эксперименты были включены контрольная группа (группа DM/НС - 17 свиней) и экспериментальная группа (животные DM/HC, получающие ингибиторы Lp-PLA2 - 20 свиней). Кроме того, уровни холестерина в крови поддерживали на уровне от 300 до 800 мг/дл у экспериментальных животных, при этом этот диапазон, как было определено, обеспечивает лучшую модель для испытания. Уровни холестерина в крови контролировали у всех животных по схеме два раза в месяц, как представлено в табл. 4, и вносили соответствующие изменения в содержание жира в корме, как представлено в табл. 2. Процент холестерина и лярда находился в диапазоне 0,5-2% и 10-25%, соответственно, и все животные получали корм, в котором концентрация холестерина и лярда находился в этом диапазоне. Образцы крови получали в исходном состоянии через 1, 3 и 6 месяцев. Каждый раз получали менее 1 мл/кг крови. При проводимых два раза в месяц исследованиях уровней холестерина в крови исследовали уровни общего холестерина, LDL, HDL, VLDL и триглицеридов, глюкозы в крови и стволовых клеток костного мозга (РВМС) (см. табл. 4).
Количествами животных, выбранными для подтверждения соответствия минимальному условию
для статистической достоверности, были следующие две группы животных в каждом эксперименте: 1) контрольная группа (n=17); животные с диабетом и гиперлипидемией; 2) экспериментальная группа (n=20), животные с диабетом и гиперлипидемией, получающие 10 мг/кг ингибитора Lp-PLA2, как представлено в табл. 3.
Домашних свиней для сельского хозяйства, боровов йоркширской породы, весом в диапазоне 25-35 кг покупали в местной ферме и помещали внутрь помещения под наблюдение ветеринара. Их кастрировали за 3-5 дней до даты начала исследования. Диабет у испытуемых свиней вызывали с помощью инфу-зии одной дозы стрептозоцина (125 мг/кг) внутривенно за период, составляющий 30 мин. Если у животных диабет не развивался, вводили вторую дозу (50 мг/кг). Во избежание возможного возникновения первоначальной гипогликемии, в корм добавляли 20 г порошкообразной глюкозы в течение первых 2 дней. Уровень глюкозы в крови определяли, используя глюкометр, каждый день перед кормлением в течение первых 14 дней и затем один раз в неделю.
Испытуемых животных содержали отдельно от контрольных животных во избежание переноса лекарственного средства между животными вследствие копрофагии. Все животные находились на атеро-генной диете, предоставляемой дважды в день, с неограниченным доступом к воде. Изготовленная по заказу диета, компоненты которой представлены в табл. 1, содержала 0,5 и 2% холестерина и 10 и 25% лярда.
Lp-PLA2 (замороженная сыворотка-EDTA)
РВМС
Получение тканей
Введение суточной дозы начинали в день 29, когда каждое испытуемое животное получало суточную дозу 10 мг/кг SB-480848 (вводимую как болюсный эквивалент в пище для собак). Перед этим животные ничего не получали через рот ночью с полуночи. Животных подвергали эвтаназии в день 196 и немедленно получали ткани.
Приготовление ткани головного мозга
В пределах одного часа после эвтаназии животных извлекали целый головной мозг. Правое полушарие фиксировали в 10% формалине в течение по меньшей мере одной недели. Затем делали срезы тканей головного мозга и заливали их в парафин. От каждого животного было создано всего -11 групп тканей (см. иллюстрацию) для иммуногистохимии (IHC). Из левого полушария были сохранены кора головного мозга (из множества мест), гиппокамп и ствол головного мозга для анализа РНК и белкового анализа.
Полученная после смерти ткань головного мозга человека, использованная для сравнения с тканью головного мозга свиньи. Гиппокамп и энториальную область коры головного мозга от пациентов с клинически диагностированной, спорадической AD (болезнь Альцгеймера) (n=21, возрастной диапазон - 7284) и контрольные ткани от нормальных, подобранных по возрасту, неврологически нормальных индивидуумов (n=13, возрастной диапазон = 69-81) получали из Harvard Brain Tissue Resource Center (Belmont, CA) и Cooperative Human Tissue Network (Philadelphia, PA). Интервалы между получениями после смерти этих головных мозгов составляли <24 ч, и патологическое подтверждение AD для каждого образца головного мозга проводили в соответствии с критериями, определенными National Institute on Aging и группой, работающей над диагностическими критериями для неврологической оценки болезни Альцгеймера, Reagan Institute (1997). Используя те же критерии, отбирали образцы головного мозга по
добранных по возрасту контролен. Ткани характеризовали иммуногистохимически на присутствие старческих (амилоидных) бляшек и нейрофибриллярных клубков, описанных ранее (D'Andrea et al., 2001; Nagele et al., 2002). В контрольных тканях не выявлялась тяжелая патология или выявлялась минимальная, локализованная, микроскопическая, напоминающая AD невропатология. Ткани обрабатывали с использованием обычной заливки в парафин и получения срезов в соответствии с широко известными протоколами. Последовательно делали срезы толщиной пять микрометров, размещали на предметных стеклах SuperFrost Plus+ (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) и сушили в течение ночи.
Гистология и иммуногистохимия (IHC) ткани головного мозга человека и свиньи
Иммуногистохимию проводили на залитый в парафин тканях, как ранее описано (D'Andrea et al., 2001; Nagele et al., 2002). Вкратце, после удаления парафина с помощью ксилола и восстановления влаго-содержания благодаря ступенчато изменяющемуся ряду увеличивающихся концентраций этанола анти-генность белков усиливали с помощью помещения срезов в целевом буфере (Dako, Carpenturia, CA) в микроволновую печь на 2 мин. Альтернативно, замороженные срезы обрабатывали в течение 2 мин ацетоном и снова сушили на воздухе. После инкубации в течение 30 мин в 0,3 Н2О2 срезы обрабатывали в течение 30 мин нормальной сывороткой для блокирования и затем инкубировали с первыми антителами в соответствующих разведениях в течение 1 ч при комнатной температуре. После тщательной промывки в PBS использовали второе, меченное биотином антитело в течение 30 мин. Иммунологические реакции обрабатывали комплексом авидин-меченный пероксидазой биотин (ABC, Vector Labs, Foster City, CA) и визуализировали с помощью обработки срезов 3-3-диаминобензидина тетрагидрохлоридом (DAB)/H2O2 (Biomeda, Foster City, CA). Срезы подвергали легкому контрастирующему окрашиванию гематоксилином, восстановлению влагосодержания благодаря ступенчато изменяющемуся ряду увеличивающихся концентраций этанола, очищали в ксилоле и заключали в пермаунт. Контроли состояли из срезов головного мозга, обработанных или неиммунной сывороткой, подвергнутым предварительной абсорбции антителом, или в отсутствие первого антитела. Образцы исследовали и фотографировали с использованием микроскопа Nikon FXA, и цифровые изображения записывали, используя цифровую камеру Nikon DXM1200F, и обрабатывали, используя программное обеспечение для изображений Image Pro Plus (Phase 3 Imaging, Glen Mills, PA).
Последовательные гистологические срезы из лобной области коры головного мозга окрашивали следующим образом: гематоксилин и эозин (Н &Е) для выявления сосудистой системы и кровоизлияния; IHC для выявления просачивания через ВВВ (иммуноглобулина свиньи в качестве индикатора просачивания сосудов и проницаемости ВВВ), активации астроцитов (глиального фибриллярного кислого белка) и морфологического вида и структурной целостности нейронов (ассоциированного с микротрубочками белка-2), амилоидной бляшки (Абета-42).
Пример 1.
Ингибирование активности Lp-PLA2 предотвращает сосудистую деменцию и болезнь Альцгеймера. Индуцированное DM/НС кровоизлияние в головной мозг и нарушение гематоэнцефалического
барьера (ВВВ)
Основной функцией ВВВ является поддержание в силе точного контроля над веществами, которые проникают в головной мозг или покидают его, для того чтобы окружающая среда, в которой функционируют нейроны, оставалась гомеостатической. При нарушении ВВВ компоненты крови, проникновение которых обычно запрещено, могли бы проникать в ткань головного мозга, создавать помехи в функционировании нейронов, инициировать иммунный ответ и вызывать воспаление мозга, все из которых вносят вклад в сосудистую деменцию и развитие болезни Альцгеймера. Как продемонстрировано на фиг. 1, в противоположность контрольному сосуду (слева) в головном мозге свиньи с DM/НС отмечались кровоизлияние (верхняя панель справа, Н &Е 200х) и просачивание через ВВВ (нижняя панель справа, IHC для иммуноглобулина свиньи 100х). Черные стрелки указывают на клетки воспаления вне кровеносного сосуда (сверху) и вокругсосудистые затемнения-утечки (нижняя панель справа, BV: кровеносный сосуд). Кроме того, наблюдается увеличение адгезии клеток воспаления к поверхности эндотелиальных клеток (белая стрелка, верхняя панель справа). IHC использовали для (i) выявления просачиваний сосудов, являющихся следствием нарушенного ВВВ, и (ii) прослеживания "судьбы" просочившегося материала в ткани головного мозга. Подобно тому, что наблюдается в головном мозге человека с болезнью Альцгей-мера (AD), просочившиеся иммуноглобулины (Ig) связываются с нейронами и вызывают разрушение дендритного дерева, что демонстрируется отходом назад и скручиванием основных дендритных отростков (т.е. "спиралеобразным дендритным" видом (фиг. 2).
В течение периода исследования наблюдали, что животные, которым вводили ингибитор Lp-PLA2, больше реагировали на внешние стимулы, демонстрировали увеличенную активность в клетке и имели тенденцию к более активной реакции на кормление и манипулирование по сравнению с контрольными животными, не подвергшимися лечению. Также, несмотря на схожие уровни глюкозы и холестерина в сыворотке, животные, подвергшиеся лечению ингибитором Lp-PLA2, демонстрировали увеличение веса по сравнению с контрольными животными (62,5 кг в сравнении с 50,9 кг для контрольных животных) с веса в исходном состоянии, составляющего 26,9 кг и 30,3 кг соответственно. Вес животных, которым вводили ингибитор Lp-PLA2, является прямым отражением их общего благополучия, поскольку более
больные животные (т.е. контрольные, не подвергшиеся лечению животные) не едят. Наблюдали, что ин-гибирование воспаления ингибитором Lp-PLA2 приводит к большему благополучию и здоровью при установлении системного воспаления. Пример 2.
Животные с DM/НС демонстрировали патологию болезни Альцгеймера на ранней стадии.
Было установлено, что активация астроцитов и внутриклеточная аккумуляция Ар42 внутри нейронов являются ранними и ключевыми явлениями в патогенезе болезни Альцгеймера (AD), и они были полностью подтверждены доказательствами в головном мозге пациентов с AD. Как продемонстрировано на фиг. 3, уже через 7 месяцев после воздействия сосудистых факторов риска DM/НС индуцировали активацию астроцитов, на что указывает увеличенная экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). Астроциты, демонстрирующие сильное иммуноокрашивание на GFAP, наблюдались в непосредственной близости от нейронов, демонстрирующих аномальную морфологию. Кроме того, нейроны и гладкомышечные клетки (SMC) сосудов демонстрировали увеличенную иммунореактивность с антителами против Ар42 (фиг. 4). Стоит отметить, что астроциты демонстрировали отрицательную иммуноре-активность с антителами против Ар42, показывая, что аккумуляция Ар42 происходит относительно избирательно в нейронах и SMC сосудов. Эти данные демонстрируют, что нейроны и SMC сосудов являются клетками, которые в наибольшей степени подвержены аккумуляции Ар42, что сопоставимо с тем, что наблюдается в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера на ранней стадии. Важно отметить, что Ар 42-положительные нейроны также проявляют свойства больных нейронов, при этом некоторые из них демонстрируют "спиралеобразные дендритные отростки", индикатор того, что дендритное дерево нейронов находится в процессе разрушения (фиг. 5). В противоположность Ар42(+)-нейронам, Ар 42-отрицательные нейроны выглядели здоровыми.
Пример 3.
Ингибирование активности Lp-PLA2 уменьшало DM/HC-индуцированное просачивание через ВВВ Как продемонстрировано на фиг. 5, DM/НС индуцировали обширное просачивание через ВВВ у всех 6 животных, в то время как животные, подвергшиеся лечению ингибитором Lp-PLA2, продемонстрировали незначительное просачивание через ВВВ. Коричневое окрашивание указывает на то, что компоненты крови (в этом случае Ig) просочились из мелких артерий в окружающую ткань головного мозга, и на экстенсивное связывание Ig с нейронами. В противоположность, у подвергшихся лечению животных нет просачивания Ig из кровеносных сосудов, нет связывания Ig с нейронами и нет разрушения ден-дритов (фиг. 5 и фиг. 6). Пример 4.
Ингибирование активности Lp-PLA2 предотвращало DM/HC-индуцированную аккумуляцию Абета-42 в нейронах и минимизировало цереброваскулярный амилоидоз.
Животные с DM/НС продемонстрировали непостоянную степень аккумуляции Абета в нейронах, а также повреждение нейронов (фиг. 7, левая панель), в то время как животные, подвергшиеся лечению ингибитором Lp-PLA2 (фиг. 7, правая панель), не продемонстрировали иммунореактивность с антителами против Абета-42 в нейронах. Кроме того, больные нейроны редко наблюдались у подвергшихся лечению животных по сравнению с животными, не подвергшимися лечению. Равно, ингибитор Lp-PLA2 также предотвращал аккумуляцию Абета42 в SMC сосудов и, тем самым, минимизировал цереброваскуляр-ный амилоидоз (фиг. 8).
В заключение, ингибирование Lp-PLA2 предотвращает индуцированное метаболическими факторами риска нарушение ВВВ, связывание Ig с нейронами и аккумуляцию Абета42 в нейронах. Ингибирова-ние Lp-PLA2 также уменьшало активацию глиальных клеток (например, активацию астроцитов) и минимизировало отложение Абета42 в кровеносных сосудах головного мозга (т.е. цереброваскулярный ами-лоидоз).
Ссылки
Ссылки, приведенные здесь и во всех разделах данной заявки, включены сюда посредством ссылки.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения и/или предупреждения нейродегенеративного нарушения или заболевания у субъекта, включающий идентификацию субъекта, страдающего или подверженного риску развития ней-родегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой демен-ции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона, и введение нуждающемуся в этом субъекту фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль
где
Ra и Rb вместе с атомами углерода пиримидинового кольца, к которым они присоединены, образуют сконденсированное 5-членное карбоциклическое кольцо;
R2 представляет собой фенил, замещенный одним-тремя атомами фтора; R3 представляет собой метил или С(1-3)алкил, замещенный NR8R9; или
R3 представляет собой Het-Qo^^iom, в котором Het представляет собой 5-7-членное гетероциклическое кольцо, имеющее N, и в котором N не замещен или замещен C(1-6)алкилом;
вместе образуют составляющую 4-(4-трифторметилфенил)фенил;
R8 и R9, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из группы, состоящей из водорода и С(1-6)алкила;
X представляет собой S.
2. Способ по п.1, в котором субъектом является млекопитающее.
3. Способ по п.1, в котором соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой
1-(N-(2-диэтиламино)этил)-N-(4-(4-трифторметилфенил)бензил)аминокарбонилметил)-2-(4-фторбензил)тио-5,6-триметиленпиримидин-4-он (SB480848) или его соль.
4. Способ по п.1, дополнительно включающий оценку когнитивной функции указанного субъекта после введения фармацевтической композиции, содержащей агенты, ингибирующие Lp-PLA2.
5. Способ по п.1, дополнительно включающий мониторинг лечения путем оценки мозгового кровотока или функционирования гематоэнцефалического барьера.
6. Способ по п.1, дополнительно включающий введение субъекту дополнительных терапевтических средств.
7. Способ по п.6, в котором дополнительными терапевтическими средствами являются донепезил, такрин, ривастигмин, галантамин, противоамилоидная вакцина, понижающие Абета терапии, умственное упражнение или стимуляция.
8. Способ по п.1 или 2, в котором субъектом является человек.
9. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой сосудистую деменцию.
10. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Паркинсона.
11. Способ по п.1, в котором нейродегенеративное заболевание или нарушение представляет собой болезнь Хантингтона.
12. Применение фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) по п.1 или его фармацевтически приемлемую соль, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения нейродегенеративного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из сосудистой деменции, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона.
4.
10.
10.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
025527
025527
- 1 -
- 1 -
(19)
025527
025527
- 1 -
- 1 -
(19)
025527
025527
- 1 -
- 1 -
(19)
025527
025527
- 1 -
- 1 -
(19)
025527
025527
- 4 -
- 3 -
025527
025527
- 12 -
025527
025527
- 15 -
- 15 -
025527
025527
- 16 -
- 16 -
025527
025527
- 18 -
- 18 -
025527
025527
- 26 -
- 26 -
025527
025527
- 32 -
025527
025527
- 35 -
- 35 -
025527
025527
- 36 -
025527
025527
- 39 -
- 39 -
025527
025527
- 73 -
- 73 -
025527
025527
- 74 -
- 74 -
025527
025527
- 79 -
- 79 -
025527
025527
- 81 -
- 81 -
|
