[RU]

1. Полимер с молекулярными отпечатками, синтезированный с применением микотоксинового шаблона, представляющего собой N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланин.

2. Полимер по п.1, отличающийся тем, что указанный полимер с молекулярными отпечатками получен путем обеспечения N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона и одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов и приведения указанного шаблона в контакт с указанным одним или более мономерами и указанным одним или более сшивающими агентами в условиях, обеспечивающих возможность полимеризации указанного одного или более мономеров и указанного одного или более сшивающих агентов в присутствии шаблона.

3. Полимер по п.2, отличающийся тем, что указанные один или более мономеров выбраны из группы, состоящей из 2-винилпиридина, 2-гидроксиэтилметакрилата и метакриловой кислоты.

4. Полимер по п.2, отличающийся тем, что указанные один или более сшивающих агентов включают этиленгликоля диметакрилат.

5. Способ получения полимера с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4, включающий: а) обеспечение: i) N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона и ii) одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов; b) приведение указанного N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона в контакт с указанным одним или более мономерами и указанным одним или более сшивающими агентами в условиях, обеспечивающих возможность полимеризации указанного одного или более мономеров и указанного одного или более сшивающих агентов в присутствии указанного N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона.

6. Способ секвестрации микотоксина из материала, включающий: а) обеспечение: i) материала, содержащего микотоксины; и ii) композиции, содержащей полимер с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4; и b) приведение указанной композиции, содержащей полимер с молекулярными отпечатками, в контакт с указанным материалом, содержащим микотоксины, в условиях, обеспечивающих возможность связывания указанного полимера с молекулярными отпечатками с указанным микотоксином.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает секвестрацию охратоксина А из указанного материала.

8. Применение полимера с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4 для секвестрации микотоксина из материала.

9. Применение по п.8, отличающееся тем, что указанный материал, содержащий микотоксины, выбран из группы, состоящей из напитка, пищевого продукта, корма для животных, фармацевтической композиции, нутрицевтической композиции, косметической композиции.

(57) Реферат / Формула:

1. Полимер с молекулярными отпечатками, синтезированный с применением микотоксинового шаблона, представляющего собой N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланин.

2. Полимер по п.1, отличающийся тем, что указанный полимер с молекулярными отпечатками получен путем обеспечения N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона и одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов и приведения указанного шаблона в контакт с указанным одним или более мономерами и указанным одним или более сшивающими агентами в условиях, обеспечивающих возможность полимеризации указанного одного или более мономеров и указанного одного или более сшивающих агентов в присутствии шаблона.

3. Полимер по п.2, отличающийся тем, что указанные один или более мономеров выбраны из группы, состоящей из 2-винилпиридина, 2-гидроксиэтилметакрилата и метакриловой кислоты.

4. Полимер по п.2, отличающийся тем, что указанные один или более сшивающих агентов включают этиленгликоля диметакрилат.

5. Способ получения полимера с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4, включающий: а) обеспечение: i) N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона и ii) одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов; b) приведение указанного N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона в контакт с указанным одним или более мономерами и указанным одним или более сшивающими агентами в условиях, обеспечивающих возможность полимеризации указанного одного или более мономеров и указанного одного или более сшивающих агентов в присутствии указанного N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-L-фенилаланинового шаблона.

6. Способ секвестрации микотоксина из материала, включающий: а) обеспечение: i) материала, содержащего микотоксины; и ii) композиции, содержащей полимер с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4; и b) приведение указанной композиции, содержащей полимер с молекулярными отпечатками, в контакт с указанным материалом, содержащим микотоксины, в условиях, обеспечивающих возможность связывания указанного полимера с молекулярными отпечатками с указанным микотоксином.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает секвестрацию охратоксина А из указанного материала.

8. Применение полимера с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4 для секвестрации микотоксина из материала.

9. Применение по п.8, отличающееся тем, что указанный материал, содержащий микотоксины, выбран из группы, состоящей из напитка, пищевого продукта, корма для животных, фармацевтической композиции, нутрицевтической композиции, косметической композиции.

---

Евразийское ои 024530 (13) В9
патентное
ведомство
(12) ИСПРАВЛЕННОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(15) Информация об исправлении (51) Int. Cl. G01N33/00 (2006.01)
Версия исправления: 1 (W1 В1)
исправления в описании: стр.31, 32, 33 (48) Дата публикации исправления
2017.02.28, Бюллетень №2'2017 (45) Дата публикации и выдачи патента
2016.09.30
(21) Номер заявки
201290061
(22) Дата подачи заявки
2010.08.27
(31) 61/237,549
(32) 2009.08.27
(33) US
(43) 2012.11.30
(86) PCT/US2010/047032
(87) WO 2011/031562 2011.03.17
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ОЛТЕК, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Йянникурис Александрос,
Квятковски Стефан, Кудуподже
Манодж Боджаппа, Мэтни Клэйтон
(US)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(56) WO-A1-2003101580
JODLBAUER et al. Towards ochratoxin A selective molecularly imprinted polymers for solidphase extraction. J Chromatogr A. 2002, 945(1): 45-63, p. 47, fig 1, p. 49, fig 3, p. 58, fig 5
BAGGIANI et al. A molecular imprinted polymer with recognition properties towards the carcinogenic mycotoxin ochratoxin A. Bioseparation 2001, 10(6): 389-394, p. 392, fig 1
EL-SAYED et al. Synthesis of some new 5-chloro- and 3,5-dichlorosalicylamino acid, ester, amide, hydrazide and tripeptide derivatives with expected biological activities. Proc Ind Nat Sci Acad Part A, 1997, 63(3): 259-268, p. 260, illustration, p.
262, table 1
(57) Настоящее изобретение, в целом, относится к полимерам с молекулярными отпечатками (ПМО). В частности, настоящее изобретение относится к подходящим для повторного применения экологически чистым ПМО, которые можно получить в сравнительно больших количествах, способам получения указанных полимеров и способам применения указанных полимеров (например, для секвестрации и/или адсорбции целевых соединений (например, микотоксинов)). Полимеры и способы согласно настоящему изобретению находят применение в различных областях, включая диетическое питание, терапию, профилактику, производство и переработку пищи и напитков, а также в области исследований, контроля качества и отслеживания.
Примечание: библиография отражает состояние при переиздании
Перекрестная ссылка на родственную заявку
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/237549, поданной 27 августа 2009 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение, в целом, относится к полимерам с молекулярными отпечатками (ПМО). В частности, настоящее изобретение относится к подходящим для многократного применения экологически чистым ПМО, способам получения указанных полимеров и способам применения указанных полимеров (например, для секвестрации и/или адсорбции целевых объектов (например, микотоксинов)). Полимеры и способы согласно настоящему изобретению находят применение в различных областях, включая диетическое питание, терапию, профилактику, производство и переработку пищевых продуктов и напитков, а также в области исследований и контроля качества.
Уровень техники
Микотоксины представляют собой вторичные метаболиты, секретируемые рядом грибов, зачастую вырабатываемые в зернах хлебных злаков, а также кормовых растений до, во время и после уборки урожая. Кормовые растения и хлебные злаки в естественных условиях контактируют со спорами грибов. Заражение растений грибами и биосинтез токсинов зависят от состояния растения перед уборкой урожая, погодных условий, способа уборки урожая, задержек и гидротермических условий, предшествующих стабилизации для консервации и переработки. В зависимости от вида грибов, на рост грибов влияет ряд физико-химических параметров, включая количество свободной воды (aw), температуру, присутствие кислорода, природу субстрата и рН среды. Микотоксины распространяются как до уборки урожая, так и при хранении после уборки урожая.
Некоторые грибы вырабатывают токсины только при определенном уровне влажности, определенной температуре или содержании кислорода. Действие микотоксинов сильно варьируется по степени тяжести. Некоторые микотоксины смертельны, некоторые вызывают определенные заболевания или проблемы со здоровьем, некоторые ослабляют иммунную систему, не вызывая характерных для указанного микотоксина симптомов, некоторые действуют как аллергены или раздражители, а некоторые не оказывают какого-либо известного воздействия на животных и человека. Во время Второй мировой войны русские солдаты страдали от тяжелого некроза кожи, кровотечения и разрушения костного мозга из-за употребления в пищу заплесневелого зерна, которое было заражено Fusarium. Однако только после 1960-х, когда в Великобритании более 100000 индеек погибло от смертельной болезни печени ("заболевание X" индеек), научное сообщество признало, что негативные последствия связаны с микотоксинами (см., например, Trenholm H.L., Charmley L.L., and Prelusky D.B., 1996. Mycotoxin binding agents: An update on what we know. II Biotechnology in the Feed Industry (Lyons T.P. and Jacques K.A eds.) Nottingham University Press, Loughborough, Leics, UK, pp. 327-349). Согласно недавним докладам Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (FAO) около 25% всего производимого в мире зерна заражено микотоксинами. Заражение микотоксинами с экономической точки зрения негативно сказывается на производителях пищевых продуктов и кормов, в частности зерна и птицы.
Микотоксины могут появляться в пищевой цепи в результате заражения грибами растительных продуктов (например, фуража, зерна, растительного белка, побочных продуктов переработки зерна, грубых кормов и мелассовых продуктов), и могут либо непосредственно употребляться в пищу человеком, либо поступать вместе с зараженным зерном, кормом для скота или других животных. Микотоксины весьма стойки к разложению в процессе пищеварения, поэтому они остаются в пищевой цепи в продуктах питания (например, мясе, рыбе, яйцах и молочных продуктах) или в форме метаболитов исходного токсина, попавшего в организм. Температурная обработка, такая как тепловая обработка пищи и замораживание, не являются подходящими способами уменьшения распространения микотоксинов. Таким образом, существует потребность в композициях и/или способах уменьшения вредного воздействия и/или устранения присутствия микотоксинов в пище и/или пищевых цепях.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к полимерам с молекулярными отпечатками (ПМО). В частности, настоящее изобретение относится к подходящим для многократного применения экологически чистым ПМО, способам получения указанных полимеров и способам применения указанных полимеров (например, для секвестрации и/или адсорбции целевых объектов (например, микотоксинов)). Полимеры и способы согласно настоящему изобретению находят применение в различных областях, включая диетическое питание, терапию, профилактику, производство и переработку пищевых продуктов и напитков, а также в области исследований и контроля качества.
Соответственно, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложен полимер с молекулярными отпечатками, синтезированный с использованием микотоксинового шаблона. Настоящее изобретение не ограничено микотоксиновым шаблоном, применяемым для создания полимера с молекулярными отпечатками. Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации мико-токсиновый шаблон представляет собой ОТА. Согласно некоторым вариантам реализации охратоксино-вый шаблон представляет собой №(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенилаланин. Однако настоящее
изобретение не ограничено указанным охратоксиновым шаблоном.
Согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ получения полимера с молекулярными отпечатками, включающий
обеспечение
микотоксинового шаблона и одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов;
осуществление контакта микотоксинового шаблона с одним или более мономерами и одним или более сшивающими агентами в условиях, обеспечивающих полимеризацию одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов в присутствии микотоксинового шаблона.
Согласно некоторым вариантам реализации микотоксиновый шаблон представляет собой N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенилаланин. Настоящее изобретение не ограничено применяемыми микотоксиновыми шаблонами. Действительно, в качестве микотоксинового шаблона можно применять множество синтетических молекул, причем синтетическая молекула имитирует одну или более структур, форм и/или других химических характеристик природных микотоксинов. Аналогично, настоящее изобретение не ограничено применяемыми типами мономеров. Например, специалистам в данной области техники известно множество мономеров, включая, без ограничения, 2-винилпиридин, 2-гидрокси-этилметакрилат и метакриловую кислоту. Аналогично, настоящее изобретение не ограничено применяемыми типами сшивающих агентов. Например, специалистам в данной области техники известно множество сшивающих агентов, включая, без ограничения, этиленгликольдиметакрилат. Согласно некоторым из вариантов реализации полимеризацию инициируют путем генерирования свободных радикалов в органическом растворителе при температуре от 55 до 110°С, хотя можно применять как более низкие температуры (например, 50, 45, 40, 35, 30°С или ниже), так и более высокие температуры (например, 115, 120, 125, 130°С или выше). Согласно некоторым из вариантов реализации свободные радикалы генерируют при помощи термически инициируемого разложения азобисизобутиронитрила (АИБН). Настоящее изобретение не ограничено типом применяемого органического растворителя. Согласно некоторым из вариантов реализации органический растворитель представляет собой толуол, циклогексан, ацетонитрил, раствор поливинилового спирта (ПВС) в воде, и смесь одного или более растворителей, выбранных из толуола, циклогексана, ацетонитрила и раствора ПВС в воде. Согласно некоторым из вариантов реализации температура составляет от 55 до 75°С. Согласно некоторым из вариантов реализации микотоксино-вый шаблон удаляют из полимера с молекулярными отпечатками после полимеризации одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов. Согласно некоторым из вариантов реализации применяют одну или более промывок раствором для удаления микотоксинового шаблона из полимера с молекулярными отпечатками. Настоящее изобретение не ограничено типом раствора, применяемого для промывки. Согласно некоторым из вариантов реализации указанный раствор представляет собой органический растворитель, буферный раствор, воду или комбинацию указанных растворителей. Настоящее изобретение не ограничено типом применяемого органического растворителя. Согласно некоторым из вариантов реализации органический растворитель представляет собой этиловый спирт, метиловый спирт, ацетонитрил, толуол и/или смеси указанных веществ. Согласно некоторым из вариантов реализации буферный раствор представляет собой буферный раствор, полученный при взаимодействии гидроксида натрия, лимонной кислоты, янтарной кислоты и уксусной кислоты. Согласно некоторым из вариантов реализации вода представляет собой деионизированную воду. Согласно некоторым из вариантов реализации полимер с молекулярными отпечатками сушат после одной или более промывок. Согласно некоторым из вариантов реализации при сушке полимер с молекулярными отпечатками подвергают действию температуры от 20 до 90°С (например, от 60 до 80°С; от 75 до 80°С), хотя можно применять и более низкие или более высокие температуры.
Согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ секвестрации микотоксина из материала, включающий
обеспечение материала, содержащего микотоксины; и полимера с молекулярными отпечатками, полученного путем полимеризации одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов в присутствии микотоксинового шаблона; и
осуществление контакта полимера с молекулярными отпечатками с материалом, содержащим ми-котоксины, в условиях, обеспечивающих возможность связывания микотоксина полимером с молекулярными отпечатками.
Настоящее изобретение не ограничено типом секвестрируемого из материала микотоксина (т. е. мишени для секвестрации). Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации секвестрируемый из материала микотоксин представляет собой охратоксин А. Согласно некоторым из вариантов реализации материал, содержащий микотоксины, представляет собой напиток, продукт питания, корм для животных, фармацевтическую композицию, нутрицевтическую композицию, косметическую композицию, вещество, необходимое для поддержания жизни, или другой материал. Согласно некоторым из вариантов реализации вещество, необходимое для поддержания жизни, представляет собой среду для применения в аквакультуре и газообразный образец, содержащий кислород. Согласно некоторым из вариантов реализации полимер с молекулярными отпечатками, связанный с микотоксином, не отделяют от
материала, содержащего микотоксины. Согласно некоторым из вариантов реализации способ секвестрации микотоксина из материала дополнительно включает отделение полимеров с молекулярными отпечатками, связанных с микотоксином, от материала, содержащего микотоксины. Согласно некоторым из вариантов реализации отделение включает экстракцию, концентрирование и выделение полимеров с молекулярными отпечатками, связанных с микотоксином, от материала, содержащего микотоксины. Согласно некоторым из вариантов реализации отделение проводят в хроматографической или разделительной колонне или картридже. Согласно некоторым из вариантов реализации после отделения микотоксин, связанный с полимером с молекулярными отпечатками, удаляют из полимера с молекулярными отпечатками путем промывки. Согласно некоторым из вариантов реализации проводят качественный и количественный анализ микотоксинов после удаления их полимера с молекулярными отпечатками. Согласно некоторым из вариантов реализации качественный и количественный анализ применяют для обеспечения возможности отслеживания (например, для идентификации и/или взаимосвязывания хронологии, местонахождения и/или применения объекта (например, местонахождения, типа и количества обнаруженного микотоксина) при помощи документально зафиксированной идентификации). Согласно некоторым из вариантов реализации полимер с молекулярными отпечатками, из которого был удален микоток-син, повторно применяют для секвестрации микотоксина из материала, содержащего микотоксины. Согласно некоторым из вариантов реализации полимер с молекулярными отпечатками адсорбирует в 1-10 раз больше (например, в 1-5 раз больше, в 1-2 раза больше) воды по сравнению со своей массой. Согласно некоторым из вариантов реализации два или более различных полимеров с молекулярными отпечатками вступают в контакт с материалом, содержащим микотоксины, для секвестрации двух или более определенных микотоксинов из материала.
Краткое описание чертежей На фиг. 1 показаны охратоксин А и №(3,5-дихлор-2-гидроксибензоил)-Ь-фенилаланин (шаблон
OTA).
На фиг. 2 показан путь синтеза №(3,5-дихлор-2-гидроксибензоил)^-фенилаланина (шаблона ОТА). На фиг. 3 показана эффективность секвестрации ОТА с использованием ПМО-ОТА для нескольких величин включения.
На фиг. 4 показан ПМО-ОТА, наблюдаемый в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S-4300 при увеличении х 15000 и при 3,0 кэВ.
На фиг. 5 показана секвестрационная аффинность ПМО (синтезированных в смеси толуол-цикло-гексан) по отношению к 3-м различным концентрациям ОТА для 5 различных уровней включения.
На фиг. 6 показана активность секвестрации ОТА при помощи ПМО, синтезированных из стирола и 2-винилпиридина в качестве функциональных мономеров, полимеризованных при помощи термического инициирования или воздействия УФ-излучения при низкой температуре. Показаны значения начальной адсорбции и остаточной адсорбции после промывки цитратным буферным раствором (рН 4,0) и после промывки 100% метанолом.
На фиг. 7 приведена активность секвестрации полифенолов и 3-индолилуксусной кислоты при помощи ПМО, синтезированных из стирола и 2-винилпиридина в качестве функциональных мономеров и полимеризованных при помощи воздействия УФ-излучения при низкой температуре. Показаны значения начальной адсорбции.
На фиг. 8 показаны фотографии сетки из стекловолокна, покрытого ПМО-ОТА и использованного в пробирке Falcon объемом 50 мл для секвестрации ОТА в вине.
На фиг. 9 показаны результаты испытаний на секвестрацию для трех содержаний ПМО-ОТА, нанесенных на сетку из стекловолокна, с использованием четырех различных условий полимеризации и испытанных на белом вине, содержащем добавленный ОТА в концентрациях 50, 100, 200 частей на миллиард.
На фиг. 10 показаны результаты испытания на секвестрацию для трех значений ПБО, нанесенных на сетку из стекловолокна, с использованием трех условий полимеризации и испытанных на белом вине, содержащем добавленный ОТА в концентрациях 50, 100, 200 частей на миллиард.
На фиг. 11 показан хроматографический профиль стандартных растворов ОТА, записанный при помощи флуоресцентного детектора и выбора градиента, использованного для оптимизации времени удержания микотоксина.
Определения
В настоящем описании термин "полимер с молекулярными отпечатками" или "ПМО" относится к синтетическим полимерам, которые селективно связывают конкретное соединение. Согласно предпочтительным вариантам реализации полимеры с молекулярными отпечатками синтезируют в присутствии целевых соединений, также называемых шаблонными соединениями, создавая ПМО с высокой степенью сродства к конкретному целевому соединению (например, микотоксинам). В общем случае, полимеры создают при помощи шаблонов (например, синтетически полученной молекулы/лиганда/шаблона (например, синтетического микотоксинового шаблона)), которые имитируют структуру, форму и/или другие химические особенности природной мишени (например, природных микотоксинов), и других компонентов, таких как мономеры и/или сшивающие агенты. Например, шаблонные соединения включают в
преполимерную смесь и дают им возможность образовать ассоциаты с мономерами. Затем смесь подвергают полимеризации вместе с присутствующими в ней шаблонными соединениями. После образования полимера шаблонные соединения удаляют, при этом остаются комплементарные полости, обладающие сродством к шаблону (или другим композициям, напоминающим шаблон (например, встречающимся в природе микотоксинам)). Указанные области (например, полости или другие области) специально приспособлены для связывания будущих целевых соединений и обуславливают высокое сродство к таким соединениям.
Следует отметить, что при применении конкретных целевых соединений для создания полимеров с молекулярными отпечатками полученные полимеры могут иметь высокое сродство к классу соединений, отличающихся, но похожих на целевое соединение. Например, полимер с молекулярными отпечатками может связывать ряд соединений, которые похожи по форме, плотности заряда, геометрии или другим физическим или химическим свойствам на шаблонное соединение (например, синтетический микоток-синовый шаблон).
В настоящем описании термин "полимер" относится к молекуле (макромолекуле), состоящей из повторяющихся структурных единиц, обычно соединенных посредством ковалентных химических связей с образованием сетки.
В настоящем описании термин "шаблонное соединение" или "целевое соединение" относится к соединению, которое образует комплекс с лигандами (например, мономерами), который впоследствии по-лимеризуется с образованием полимера с молекулярными отпечатками. Шаблонные соединения включают органические соединения (например, микотоксины, пептиды и белки), а также неорганические соединения (например, минералы и тяжелые металлы). В настоящем описании термин "микотоксиновый шаблон" относится к синтетически созданной молекуле, которая имитирует структуру, форму и/или другие химические характеристики природного микотоксина (например, охратоксин). Настоящее изобретение не ограничено типом применяемого микотоксинового шаблона.
В настоящем описании термин "мономер" относится к молекуле, которая может образовывать химические связи с другими мономерами с образованием полимера.
В настоящем описании термины "поперечная сшивка" и "сшивающий агент" относятся к молекулам, содержащим две, три или четыре двойных связи, способные присоединять два или более мономеров с образованием полимерной сетки.
В настоящем описании термин "структурная единица" относится к структурному блоку полимерной цепи и связан с повторяющимся звеном.
В настоящем описании термин "анионный" или "анион" относится к иону, имеющему отрицательный заряд.
В настоящем описании термин "катионный" или "катион" относится к иону, имеющему положительный заряд. Указанный термин может относиться к полимерным соединениям, таким как полимеры с молекулярными отпечатками, содержащим положительный заряд.
В настоящем описании термин "кислота" относится к любому химическому соединению, которое может являться донором протона (протонов) и/или акцептором электрона (электронов). В настоящем описании термин "основание" относится к любому химическому соединению, которое может являться акцептором протона (протонов) и/или донором электрона (электронов) или гидроксид-ионов. В настоящем описании термин "соль" относится к соединениям, которые могут быть получены из неорганических или органических кислот и оснований.
В настоящем описании термин "вымывание" относится к оставшейся части шаблона, все еще связанной с ПМО после нескольких стадий промывки ПМО, которая продолжает диссоциировать из ПМО и влиять на его активность поглощения.
В настоящем описании термин "порообразующий/порообразователь" относится к веществу, молекуле, буферному раствору, растворителю (например, толуолу, ксилолу, этилбензолу), применяемому для изменения размера полостей в полимере (например, полостей в ПМО), причем отношение полимера к порообразователю прямо коррелирует со значением пористости конечной структуры.
В настоящем описании термин "пористость" относится к мере свободного пространства в материале (например, полости ПМО), которое может содержать газ или жидкость или обеспечивать их прохождение.
В настоящем описании термин "полимеризация" относится к процессу взаимодействия молекул мономера между собой в химической реакции с образованием трехмерных сеток или полимерных цепей.
В настоящем описании термин "осаждение" относится к образованию твердого вещества в растворе в ходе химической реакции. Когда происходит реакция, образованное твердое вещество называют осадком, а оставшуюся над твердым веществом жидкость называют надосадочной жидкостью.
В настоящем описании термин "центрифугирование" относится к процессу разделения молекул по размеру или плотности с использованием центробежной силы, генерируемой вращающимся ротором, который придает объекту вращение вокруг неподвижной оси, прикладывая силу перпендикулярно оси. Центрифуга работает по принципу седиментации, при этом центростремительно ускорение применяют, чтобы легко распределить вещества большей и меньшей плотности по слоям различной плотности.
В настоящем описании термин "концентрация" относится к количеству вещества в определенном пространстве. Концентрацию обычно выражают в единицах массы на единицу объема. Для разбавления раствора необходимо добавить больше растворителя или уменьшить количество растворенного вещества (например, при помощи избирательного отделения, выпаривания, сушки распылением, сушки замораживанием). Напротив, для концентрирования раствора необходимо уменьшить количество растворителя.
В настоящем описании термин "слой" относится к обычно горизонтальному отложению, сформированному в слой материала, образующий вышележащую часть или сегмент, полученному после разделения путем центрифугирования или седиментации согласно плотностным свойствам материала.
В настоящем описании термин "очищенный" или "очищать" относится к удалению посторонних компонентов из образца. При употреблении в химическом контексте, "очищенный" или "очищать" относится к физическому отделению целевого химического вещества от посторонних, нежелательных или загрязняющих веществ. Обычно применяемые способы очистки органических молекул включают, без ограничения, следующие: аффинная очистка, механическая фильтрация, центрифугирование, выпаривание, экстракция примесей, растворение в растворителе, в котором нерастворимы другие компоненты, кристаллизация, адсорбция, перегонка, фракционирование, возгонка, переплавка, рафинирование, электролиз и диализ.
В настоящем описании термин "сушка" относится к любому типу процесса, который уменьшает или устраняет содержание жидкости в веществе.
В настоящем описании термин "сушка распылением" относится к способу сушки вещества, содержащего жидкость, с использованием горячего газа для испарения жидкости с целью уменьшения или устранения содержания жидкости в веществе. Другими словами, материал сушат путем распыления или разбрызгивания в потоке нагретого сухого воздуха.
В настоящем описании термин "сухой свободно текучий порошок" относится к сыпучему сухому порошку.
В настоящем описании термин "измельчение" относится к уменьшению размера частиц при помощи удара, сдвига или трения.
В настоящем описании термин "промывка" относится к удалению или очистке (например, с использованием любого типа растворителя (например, дистиллированной воды, буферного раствора, или растворителя, или смеси) примесей или растворимых нежелательных компонентов препарата (например, ПМО можно промывать для удаления шаблонных компонентов из образца).
В настоящем описании термин "аналит" относится к атому, молекуле, веществу или химическому компоненту. В общем случае "аналит" не измеряют сам по себе, а скорее определяют характеристики или свойства (физические, химические, биологические и т.д.) аналита с использованием аналитической методики, такой как высокоэффективная жидкостная хроматография (сокращенно ВЭЖХ). Например, в общем случае не измеряют "кресло" (анализируемый компонент) само по себе, а измеряют высоту, ширину и т. д., этого кресла. Аналогично, в общем случае не измеряют микотоксин, а измеряют одно или более свойств микотоксина (например, флуоресценцию микотоксина, связанную, например, с его стабильностью, концентрацией или биологической активностью).
В настоящем описании термин "образец" применяют в широком смысле, включая препарат любого происхождения (например, синтетический, биологический и образец окружающей среды). Синтетические образцы включают любой материал, полученный искусственным путем (например, ПМО). Биологические образцы могут быть получены от животных (включая человека) и включают жидкости, твердые вещества, ткани и газы. Биологические образцы включают препараты крови, такие как плазма, сыворотка, и т. п.. Образцы окружающей среды включают материал из окружающей среды, такой как вещество с поверхности, почва, вода, кристаллы и промышленные образцы.
В настоящем описании термин "высокоэффективная жидкостная хроматография" и термин " ВЭЖХ" относятся к форме жидкостной хроматографии для разделения соединений. Указанные соединения растворяют в растворе. Соединения разделяют, помещая образец на колонку, через которую пропускают растворитель или смесь растворителей для элюирования из колонки компонентов смеси. Оборудование для ВЭЖХ включает резервуар для подвижной фазы, насос, инжектор, разделительную колонку и детектор. Присутствие аналитов в выходящем из колонки растворе регистрируют путем количественного детектирования изменения показателя преломления, поглощения УФ или видимого света на заданной длине волны, флуоресценции после возбуждения на подходящей длине волны или электрохимического отклика.
В настоящем описании термин "сигнал" применяют обычно для указания на любой детектируемый процесс, который указывает на то, что реакция имеет место (например, связывание антигена с антителом). Сигналы можно оценивать как качественно, так и количественно. Примеры типов "сигналов" включают, без ограничения, радиоактивные сигналы, флуориметрические сигналы или колориметрические сигналы продукта/реагента.
В настоящем описании термин "сканирующая электронная микроскопия" и термин "СЭМ" относится к типу электронной микроскопии, который создает изображение поверхности образца при помощи луча электронов высокой энергии по схеме растрового сканирования. Электроны взаимодействуют с
атомами, составляющими образец, порождая сигналы, содержащие информацию о топографии поверхности образца, составе и других свойствах, таких как электропроводность.
В настоящем описании термин "фиксирующий агент" относится к химическому соединению, способному фиксировать одно вещество на другом с целью "фиксировать", стабилизировать или иным образом предохранить вещество в его нынешней форме от распада или других изменений. Часто фиксирующие агенты применяют в сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для подготовки образца.
В настоящем описании термин "in vivo" относится к исследованиям и/или экспериментам, проводимым на живом организме, происходящим в биологическом организме.
В настоящем описании термин "in vitro" относится к искусственной среде вне живого организма, и к биологическим процессам или реакциям, которые могли бы обычно протекать в организме, но вынуждены протекать в искусственной среде. Примеры среды in vitro включают пробирки и культуру клеток.
В настоящем описании термин "in situ" подразумевает в условиях реакционной смеси.
В настоящем описании термин "ex vivo" относится к исследованиям и/или экспериментами и/или применению, осуществляемому в или на живой ткани в искусственной среде вне организма с минимальными отклонениями от естественных условий.
В настоящем описании термин "абсорбировать" относится к процессу, при котором материал "впитывает" или "всасывает" другое вещество. Например, "абсорбция" может относиться к процессу поглощения или приема вещества в клетки или сквозь ткани и органы посредством диффузии или осмоса (например, абсорбция питательных веществ пищеварительной системой или абсорбция лекарственных средств в кровоток).
В настоящем описании термин "адсорбировать" или "адсорбция" относится к процессу, который наблюдается, когда материал отделяется и/или аккумулируется (например, на поверхности) композицией (секвестрантом и/или адсорбентом), или к процессу, в котором композиция (например, ПМО) связывает целевую молекулу (например, микотоксины) в образце (например, для удаления целевой молекулы из образца).
В настоящем описании термин "сорбция" относится как к адсорбции, так и к абсорбции.
В настоящем описании термин "секвестрировать" и/или термин "секвестрация" относится к физической ассоциации (например, посредством образования связей (например, водородных связей, ионных связей, ковалентных связей или другого типа связей) двух или более частиц, вступающих в контакт друг с другом (например, с образованием комплекса). Типичные формы ассоциаций включают, без ограничения, водородную связь, координацию и образование ионной пары. Секвестрационные взаимодействия могут включать различно число химических взаимодействий (например, химических связей) в зависимости от стереохимии и геометрии каждой из частиц (например, дополнительно определяя специфичность секвестрации). Если происходит секвестрация двух или более частиц, секвестрация указанных частиц может происходить путем химической связи, но они могут также ассоциироваться посредством зарядного, диполь-дипольного или других типов взаимодействий.
В настоящем описании термины "секвестрационный агент" и/или "секвестрирующий агент" относятся к частице, которая способна к образованию комплекса со второй частицей.
В настоящем описании термин "комплекс" относится к частице, образованной путем ассоциации двух или более отдельных частиц (например, ассоциации между двумя или более частицами, причем указанные частицы одинаковые или разные (например, одинаковые или разные химические соединения)). Ассоциация может осуществляться посредством ковалентной связи или посредством нековалент-ной связи (например, посредством ван-дер-ваальсового взаимодействия, электростатического взаимодействия, взаимодействия зарядов, гидрофобного взаимодействия, дипольного взаимодействия и/или сил водородных связей (например, уретановые связи, амидные связи, сложноэфирные связи, и комбинации указанных взаимодействий)).
В настоящем описании термин "эффективное количество" относится к количеству композиции (например, ПМО), достаточному для получения предпочтительных или желаемых результатов. Эффективное количество можно вводить и/или комбинировать с другим материалом в одном или нескольких введениях, применениях или дозировках, и оно не должно быть ограничено конкретным составом или путем введения.
В настоящем описании термин "животное" относится к представителю царства животных. Указанный термин включает, без ограничения, скот, сельскохозяйственных животных, одомашненных животных, домашних питомцев, морских и пресноводных животных, и диких животных.
В настоящем описании термин "пищевой продукт" относится к материалу (материалам), потребляемому субъектом (например, человеком и/или животным (например, являющимся источником энергии и/или питательных веществ в питании субъекта)). Примеры пищевых продуктов включают, без ограничения, молочные продукты, сок, злаки, фрукты, овощи, мясо, полнорационную смесь (TMR), фураж, гранулы, концентрат (концентраты), копродукт(ы) премикс(ов), зерно, зерновые дробины, патоку, волокна, кормовые растения, траву, сено, косточки, листья, муку, растворимые вещества и добавки.
В настоящем описании термин "пищеварительная система" относится к системе (включая желудочно-кишечный тракт), в которой происходит или может происходить пищеварение.
В настоящем описании термин "пищеварительный" или "пищеварение" относится к превращению пищи, пищевых продуктов или других органических соединений в абсорбируемую форму; размягчение, разложение или распад под действием тепла и влажности или химического воздействия.
В настоящем описании термин "биодоступность" относится к части молекулы или компонента, которая доступна для организма или достигает системного кровотока. Если молекулу или компонент вводят внутривенно, биодоступность составляет 10%. Однако если молекулу или компонент вводят другими путями, (таким как пероральный), его биодоступность уменьшается (из-за неполной абсорбции и метаболизма первого прохождения).
В настоящем описании термин "введение" и термин "вводить" относятся к акту обеспечения поступления вещества, включая лекарственное средство, пролекарство или другой агент, субъекту или терапевтического воздействия на субъект (например, субъект или клетки, ткани и органы in vivo, in vitro или ex vivo). Типичные пути введения могут представлять собой введение через глаза (офтальмический), через рот (пероральный), через кожу (топический или трансдермальный), через нос (назальный), через легкие (ингаляционный), через слизистую оболочку полости рта (трансбуккальный), через ухо, ректальный путь, вагинальный путь, путем инъекции (например, внутривенной, подкожной, внутриопухолевой, внутрибрюшинной и т.д.), и тому подобное.
В настоящем описании термин "совместное введение" и термин "совместно вводить" относятся к введению по меньшей мере двух агентов или видов терапии субъекту и/или в материал (например, пищевой продукт). Совместное введение двух или более агентов или видов терапии может быть одновременным, или первый агент/вид терапии можно вводить перед вторым агентом/видом терапии.
В настоящем описании термин "лечение" относится к улучшению и/или обратному развитию признака или симптома заболевания (например, микотоксикоза). Термин "лечение" относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. Например, субъекты могут получать пользу от лечения композициями и способами согласно настоящему изобретению, включая как субъектов, страдающих заболеванием и/или нарушением (например, микотоксикозом), так и субъектов, у которых предотвращают заболевание и/или нарушение (например, при помощи профилактического лечения согласно настоящему изобретению).
В настоящем описании термин "микотоксин" относится к токсическому и/или канцерогенному соединению (соединениям), вырабатываемому различными видами грибов.
В настоящем описании термин "микотоксикоз" относится к состоянию, при котором микотоксины проникают через барьеры организма человека или животного. Микотоксикозы можно рассматривать или как инфекцию, или как заболевание, и они могут оказывать разрушительное воздействие на пораженного субъекта.
В настоящем описании термины "заболевание", "инфекция" и "патологическое состояние или реакция" относятся к состоянию, признакам и/или симптомам, связанным с нарушением нормального состояния живого субъекта (например, человека и/или животного) или любых его органов или тканей, которые нарушают или изменяют осуществление нормальных функций, и могут представлять собой ответ на воздействие факторов окружающей среды (таких как неполноценное питание, промышленные опасности или климат, включая микотоксикоз), специфические инфекционные агенты (такие как черви, амебы, бактерии, вирусы, прионы и т. д.), на внутренний дефект организма (такой как различные генетические аномалии), или комбинацию этих и других факторов.
В настоящем описании термин "риск развития заболевания" относится к субъекту, предрасположенному к возникновению определенного заболевания. Указанная предрасположенность может быть генетической (например, определенная генетическая склонность к возникновению заболевания, такая как передающиеся по наследству заболевания), или обусловленной другими факторами (например, возраст, масса тела, условия окружающей среды, воздействие вредных соединений (например, присутствующих в окружающей среде и т.д.)).
В настоящем описании термин "страдающий заболеванием" относится к субъекту (например, животному или человеку), испытывающему определенное заболевание, не ограничиваясь конкретными признаками или симптомами, или заболеванием.
В настоящем описании термин "токсический" или "токсичный" относится к любому вредному, разрушительному, опасному, или иному отрицательному воздействию (воздействиям) на субъекта, клетку или ткань, по сравнению с той же клеткой или тканью до контакта или введения токсина/токсиканта.
В настоящем описании термин "фармацевтическая композиция" относится к комбинации активного агента (например, композиция, содержащая ПМО) с носителем, инертным или активным, делающим композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vitro, in vivo или ex vivo.
В настоящем описании термин "фармацевтически приемлемый" и термин "фармакологически приемлемый" относятся к композициям, которые по существу не вызывают больше известных нежелательных реакций, чем известных благоприятных реакций.
В настоящем описании термин "прослеживаемость" относится к свойству результата измерения или величины стандарта, в соответствии с которым его можно связать с заданными нормативами, обычно
национальными или международными стандартами, посредством непрерывной цепи сравнений, все из которых имеют заданные погрешности. Прослеживаемость представляет собой практическое приложение общих принципов метрологии к химическим измерениям, и обеспечивает терминологию, принципы и стратегию подтверждения того, что также возможно сравнение аналитических химических измерений. Она измеряет уникально идентифицируемые единицы способом, поддающимся проверке. Прослеживае-мость измерений применяют, в числе прочего, для установления взаимосвязи хронологии, местоположения и/или применения объекта посредством документально регистрируемой идентификации.
Подробное описание изобретения
Различные группы грибов вырабатывают микотоксины, оказывающие вредное воздействие на здоровье животных. Указанные токсины в основном вырабатывают грибы, относящиеся к родам Aspergillus, Fusarium и Penicillium, когда преобладают благоприятные условия для их образования. Ни один из регионов мира не свободен от микотоксинов и их отрицательного влияния на здоровье человека и животных. Отрицательное действие заражения микотоксинами на урожай зерновых и продуктивность животных являются аномальными и постоянно несут риск здоровью человека. Более теплый климат склонен снижать сопротивление афлатоксинам и фумонизинам, тогда как более прохладные области с большей влажностью подвержены, например, охратоксину.
Микотоксины представляют собой вторичные метаболиты, вырабатываемые плесенью и грибами, заражающими как зерна злаков, так и кормовые растения, плоды, пищу и пищевые продукты, так и окружающую среду (например, почву, воду и воздух посредством микотоксинов, попадающих в аэрозоли и т. д.). Микотоксины имеют опасное действие на здоровье человека и животных. Поскольку микотоксины присутствуют на протяжении пищевой цепи, микотоксины являются субъектом регуляции, что ограничивает избыточное загрязнение пищи/пищевого материала и окружающей среды исходя из токсикологических свойств различных групп токсинов (см. Commission Recommendation of 17 August 2006 on the presence of deoxynivalenol, zearalenone, ochratoxin A, T-2 and HT-2 and fumonisins in products intended for animal feeding. Official Journal of the European Union (2006/576/EC)). С этой точки зрения, различные агентства по безопасности по всему миру установили предельные величины и методики контроля для проверки уровня загрязнения. Указанные требования в настоящее время еще не согласованы между странами и/или континентами и также зависят от политического и экономического состояния рассматриваемой географической области. Указанные требования, при наличии, основаны на неполном числе отчетов, связанных со случаями острого отравления кристаллическими формами микотоксинами в модельных ситуациях. Поскольку понимание продвижения микотоксинов, влияния хронических уровней воздействия, продолжительности воздействия и совместного влияния различных микотоксинов, совместно заражающих пищу/пищевые материалы и окружающую среду, которые могут оказывать синергические токсические действия, может играть важную роль в состоянии здоровья человека и животных и их восприимчивости к различным другим инфекциям, и следовательно иммунного статуса. В описанной перспективе следует рассматривать решения, имеющие дело с нерегулируемыми уровнями токсических соединений, которые попадают в пищевую цепь и присутствуют в окружающей среде. Следовательно, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения, предложен экономичный широкомасштабный способ получения высокоаффинного синтетического сорбента для удаления микотоксинов.
Охратоксин А (сокращенно обозначаемый ОТА) представляет собой микотоксиновый метаболит, в основном вырабатываемый Aspergillus ochraceus и Penicillium verrucosum, которые в числе прочих видов плесени, которые способны расти на неправильно хранящихся пищевых продуктах (см., например, Pfohl-Leszkowicz A., and Manderville R.A., 2007. Molecular Nutrition and Food Research, 51: 61-99), зараженном зерне, бобах кофе (см., например, O'Brien E., and Dietrich DR. 2005. Critical Reviews in Toxicology, 35: 3360), техническом винограде (см., например, Blesa J., Soriano J.M., Molto J.C., Manes J., 2006. Critical Review in Food Science and Nutrition, 46: 473-478) и могут переноситься и заражать жидкости и твердые вещества, употребляемые человеком (например, виноградный сок, вино, пиво, кофе, экстракты какао, а также пищу и корм, в которых применяют зараженное зерно, и мясо и другие продукты, получаемые от животных (например, молоко, яйца и т.д.), которые потребляют зараженное зерно или иным образом подвергаются воздействия микотоксинов), что может быть вредно для человека. ОТА является канцерогеном (Группа 2В; см., например, Clark H.A., and Snedeker S.M., 2006. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B: Critical Reviews, 9: 265-96), нефротоксичным соединением, и может вызывать им-муносупрессию (см., например, Al-Anati L., and Petzinger E., 2006. Journal of Veterinary Pharmocology and Therapeutics, 29: 79-90; Pfohl-Leszkowicz and Manderville, 2007, как указано выше; O'Brien and Dietrich, 2005, как указано выше). ОТА может вызывать изменения функции почек у свиней, включая изменение экскреции и увеличение экскреции глюкозы в мочу, которые были описаны при нефропатии свиней. Цыплята, индейки и утята, питающиеся зерном, содержащим ОТА, имеют плохую конверсию корма и сниженное производство яиц. У человека вызванная ОТА патология была клинически описана как Балканская эпидемическая нефропатия (см., например, Vrabcheva Т., Petkova-Bocharova Т., Grosso F., Nikolov L., Chernozemsky I.N., Castegnaro M., and Dragacci S., 2004. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 2404-2410). Исследования на животных показали, что из-за схожести с фенилаланином, ОТА после абсорбции на уровне желудочно-кишечного тракта может проникать в кишечно-печеночный кровоток и
связываться с альбуминовой фракцией крови, и таким образом сохраняться в тканях животных на продолжительный срок (см., например, Creppy Е.Е., Kane A., Dirheimer G., Lafarge-Frayssinet С., Mousset S., and Frayssinet C., 1985. Toxicology Letters, 28: 29-35).
Избежать заражения микотоксинами невозможно, но с целью уменьшения отрицательных воздействий микотоксинов в сельском хозяйстве в прошлом применяли неорганические материалы, такие как глины, бентониты и алюмосиликаты, или активированный уголь, известные своими адсорбционными свойствами (например, как добавки к корму животных и/или ингредиенты, капсулированные формы, или в качестве фильтрующих устройств). Глины, применяемые в больших количествах, связывают некоторые микотоксины в жидких средах (например, в желудочно-кишечном тракте животных и/или человека) и минимизируют их токсическое действие (см., например, Ramos A.J., and Hernandez E., 1997. Animal Feed Science and Technology, 65: 197-206; Grant P.G., and Phillips T.D., 1998. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46: 599-605). Однако глины препятствуют абсорбции многих полезных питательных веществ, важных для животных и человека, таких как витамины, минеральные вещества и аминокислоты, таким образом уменьшая питательную плотность рациона. Кроме того, глины являются инертным материалом, который необходимо применять (например, скармливать животных) в больших количествах для получения полезного эффекта (например, уменьшения зараженности микотоксинами). Однако глины, скармливаемые животным в больших количествах, могут оказывать отрицательное воздействие на окружающую среду при выделении глины из организма животных. Также применяли широкий спектр других адсорбентов микотоксинов с недостаточной специфичностью к конкретным микотоксинам, включая описанные в патенте США № 6045834.
В целом, полимеры с молекулярными отпечатками (сокращенно обозначаемые ПМО) представляют собой полимеры, образованные в присутствии молекулы, являющейся шаблоном, которую впоследствии извлекают, оставляя таким образом комплементарные полости. Указанные полимеры демонстрируют определенное химическое сродство к исходной молекуле и могут применяться для изготовления датчиков, в катализе или в способах разделения. Первый материал с отпечатками был на основе силиката натрия. Первым экспериментальным применением указанных материалов было разделение красителей в 1949 г. (см., например, Andersson H.S., and Nicholls I.A., 2001. // Molecularly Imprinted Polymers: Man-made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, (Sellergen B., ed.), Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Vol. 23 Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 1-19).
Настоящее изобретение, в целом, относится к полимерам с молекулярными отпечатками (ПМО). В частности, настоящее изобретение относится к подходящим для многократного применения экологически чистым ПМО, способам получения указанных полимеров и способам применения указанных полимеров (например, для секвестрации и/или адсорбции целевых соединений (например, микотоксинов)), и к способам осуществления указанного применения различными путями (например, для детектирования присутствия микотоксинов с целью их отслеживания и для удаления микотоксинов из загрязненного источника). Композиции и способы согласно настоящему изобретению находят применение во многих областях, включая диетическое питание, терапию, профилактику, производство и переработку пищевых продуктов и напитков, фильтрование жидкостей, а также в области исследований и контроля качества.
Соответственно, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены шаблонные соединения (например, при помощи которых синтезируют ПМО), которые придают высокую сорбционную емкость и селективность ПМО в отношении целевых соединений (например, мико-токсинов). Шаблонные соединения можно удалить из ПМО после синтеза ПМО (например, таким образом "активируя" ПМО и обеспечивая ПМО возможность связывать и адсорбировать целевые соединения (например, микотоксины)). Так, согласно настоящему изобретению предложены способы (например, способ синтеза) и материалы, обеспечивающие производство шаблона и ПМО в промышленном масштабе, которое не только экономически выгодно (например, обеспечивает реализуемое широкомасштабное производство экономически достижимым способом), но также использует более доступные реагенты, чем ранее применявшиеся шаблоны ПМО. Согласно настоящему изобретению также предложены, в некоторых из вариантов реализации композиции (например, шаблонные соединения, мономеры, сшивающие агенты, а также ПМО), являющиеся биологически нейтральными (например, не вредящие окружающей среде). Например, согласно некоторым из вариантов реализации мономеры и сшивающие агенты согласно настоящему изобретению способны образовывать высокоаффинные, способные к обратному распаду комплексы с шаблоном (например, с функциональными группами шаблона), с образованием ПМО с высоким сродством к целевым соединениям (например, микотоксинам), и оказывающие положительное воздействие на окружающую среду (например, высокую абсорбционную способность в отношении воды, в соответствии с чем ПМО адсорбирует до 10 раз больше воды по отношению к собственному весу, что способствует гидратации почвы удерживаемой водой). Аналогично, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены ПМО с высоким сродством к целевым соединениям (например, микотоксинам), подходящие для повторного применения (например, которые можно отделить от целевых соединений и использовать повторно).
I. Шаблоны, применяемые для синтеза полимеров с молекулярными отпечатками (ПМО)
Общие схемы синтеза ПМО включают стадии полимеризации и сшивания мономеров в присутствии шаблонных молекул, которые направляют формирование центров связывания в сетке ПМО. Геометрическую специфичность придают центрам связывания ПМО на стадиях, аналогичных применению восковых копий скульптуры для получения отливок в процессе художественной техники литья по выплавляемым моделям. После создания сетки ПМО шаблон удаляют, что делает не содержащий шаблона ПМО способным к секвестрации целевого соединения. Согласно некоторым из вариантов реализации удаление шаблона достигается путем ряда стадий промывки (например, как описано в разделе IV ниже).
Согласно некоторым из вариантов реализации целевое соединение применяют в качестве шаблона. Однако это порождает потенциальную проблему вымывания шаблона, или постепенного выщелачивания оставшегося шаблона в образец. В аналитических применениях вымывание шаблона вызывает ошибочно высокий фон, тогда как в неаналитических применениях (например, секвестрации) вымывание шаблона может искажать результат секвестрации, фактически вводя целевые молекулы в образец. Кроме того, например, при синтезе ПМО, нацеленных на соединения с токсичными и/или канцерогенными свойствами (например, микотоксины), применение менее опасных шаблонных молекул в процессе синтеза может быть предпочтительным с точки зрения безопасности персонала, а также для минимизации опасных отходов. Согласно предпочтительным вариантам реализации шаблонная молекула является неопасной и/или легко разрушаемой, и поэтому не представляет риска для здоровья или окружающей среды. Согласно предпочтительным вариантам реализации шаблон после высвобождения из ПМО используют повторно. Согласно предпочтительным вариантам реализации шаблон можно получать в больших количествах и более безопасным способом, чем можно получать микотоксины.
Соответственно, согласно некоторым из вариантов реализации шаблон, применяемый для синтеза ПМО, может представлять собой то же самое соединение, что и целевое соединение. Согласно некоторым из вариантов реализации шаблон, применяемый для синтеза ПМО, может отличаться от желаемого целевого соединения. Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения, целевое соединение представляет собой микотоксин. Согласно некоторым из вариантов реализации целевое соединение представляет собой ОТА.
Согласно некоторым из вариантов реализации разработку и/или определение шаблонных соединений, не являющихся целевыми соединениями, осуществляют путем тщательного структурного анализа молекулы целевого соединения, структурной минимизации и определения структурных особенностей и функциональных групп, важных для создания эффективного центра связывания ПМО. Способы структурной минимизации известны в данной области техники (см., например, Baggiani С., Giraudi G., and Vanni A., 2002. Bioconjugation, 10: 389-394; полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки). Хотя настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом, и понимание механизма не обязательно для практического применения настоящего изобретения, структурные факторы, которые учитывают при разработке шаблона, включают, без ограничения, хиральность, планарность, устранение чувствительности структуры к нежелательным свойствам молекулы (например, устранение молекулярных детерминантов токсичности) и/или существование подходящей доступной для растворителя поверхности, поверхности электростатического потенциала, и/или липофильной/гидрофильной поверхности шаблонной молекулы и ее возможных взаимодействий с мономерами и сшивающим агентом, а также простоту синтеза шаблона. Согласно некоторым из вариантов реализации применяют методики сверхбыстрого распознавания формы для осуществления возможности рутинного скрининга на соединения, наиболее похожие на молекулу, не только согласно превосходящему по скорости распознаванию двухмерной структуры, но предпочтительно и по одному из самых специфических эталонов, которым является трехмерная форма молекулы (см., например, Balletser P., and Richards W.G., 2007. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 463: 1307-1321).
Согласно одному из неограничивающих примеров шаблоном для Охратоксина А является N-(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенилаланин, как показано на фиг. 1.
Согласно одному из неограничивающих примеров способ синтеза №(2-гидрокси-3,5-дихлор-бензоил)-Ь-фенилаланина начинается с реакции 3,5-дихлорсалициловой кислоты с уксусным ангидридом с образованием 2-ацетокси-3,5-дихлорбензойной кислоты, которую, в свою очередь, превращают в хлорид кислоты под действием оксалилхлорида. Затем хлорид 2-ацетокси-3,5-дихлорбензойной кислоты реагирует in situ с гидрохлоридом этилового эфира фенилаланина в присутствии триэтиламина, с образованием этилового эфира №(2-ацетокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенилаланина. На последней стадии указанного способа синтеза вводят новый и высокоспецифичный гидролиз обеих сложноэфирных функциональных групп этилового эфира №(2-ацетокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенилаланина с образованием шаблона ОТА, ^(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенилаланина (I) с выходом 98%. Описанная реакция синтеза кратко представлена на фиг. 2.
Следовательно, согласно настоящему изобретению предложен способ и материалы для синтеза шаблонов (например, шаблонов ОТА), масштабируемого до больших объемов экономически доступным образом.
II. Мономеры и сшивающие агенты, применяемые при полимеризации ПМО
При выборе мономеров, применяемых для синтеза ПМО, принимают во внимание структурные особенности шаблонной молекулы, чтобы оценить, какой мономер или комбинация мономеров вероятнее всего образует взаимодействия (например, ковалентные, нековалентные, ионные, водородные связи, гидрофобные взаимодействия, ван-дер-ваальсовые взаимодействия) с шаблоном. Согласно одному из неограничивающих примеров, основные структурные особенности шаблона ОТА (I) согласно настоящему описанию (например, №(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенилаланина) включают (i) две кислотных функциональных группы (-ОН и -СО2Н); (ii) одну сильно полярную пептидную группу (-NHCO-); (iii) и несколько низко полярных углеводородных фрагментов структуры шаблона (например, каждый из которых имеет возможность образовывать комплексы с мономерами и молекулами сшивающего агента). В Заявке на патент США № 10/181435, полностью включенной в настоящую заявку посредством ссылки, описаны функциональные мономеры ПМО и способы выбора мономера при помощи расчетов (см., например, Baggiani et al., 2002, как указано ранее).
Классы мономеров и конкретные мономеры (например, применяемые в способах синтеза ПМО согласно настоящему изобретению) включают, без ограничения, следующие классы и производные: акриловая кислота и производные (например, 2-бромакриловая кислота, акрилоилхлорид, N-акрилоил-тирозин, N-акрилоилпирролидон, транс-2-(3-пиридил)-акриловая кислота), акрилаты (например, алки-лакрилаты, аллилакрилаты, гидроксипропилакрилат), метакриловая кислота и производные (например, итаконовая кислота, 2-(трифторметил)пропеновая кислота), метакрилаты (например, метилметакрилат, гидроксиэтилметакрилат, 2-гидроксиэтилметакрилат, 3-сульфопропилметакрилата натриевая соль, эти-ленгликоля монометакрилат), стиролы (например, (2, 3 и 4)-аминостирол, стирол-4-сульфоновая кислота, 3-нитростирол, 4-этилстирол), винилы (например, винилхлорформиат, 4-винилбензойная кислота, 4-винилбензальдегид, винилимидазол, 4-винилфенол, 4-виниламин, акролеин), винилпиридины (например, (2, 3, и/или 4)-винилпиридин, 3-бутен-1,2-диол), бороновые кислоты (например, 4-винилбороновая кислота), сульфоновые кислоты (например, 4-винилсульфоновая кислота, акриламидо-2-метил-1-пропан-сульфоновая кислота), соединения, хелатирующие металлы (например, стиролиминодиуксусная кислота), акриламиды и производные (например, N-метилакриламид), метакриламиды и производные (например, ^^диметилакриламид, N-(3-аминопропил)метакриламид), алкены (например, 4-пентеновая кислота, 3-хлор-1-фенил-1-пропен), ангидрид (мет)акриловой кислоты и производные (например, метакрило-вый ангидрид), кремнийсодержащие мономеры (например, (3-метакрилоксипропил)триметоксисилан, тетраметилдисилоксан), полиены (например, изопрен, 3-гидрокси-3,7,11-триметил-1,6,10-додекатриен), азиды (например, 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензойная кислота), тиолы (например, аллилмеркаптан). Также в вариантах реализации настоящего изобретения можно применять оканчивающиеся акрилатными группами или иным образом ненасыщенные уретаны, карбонаты и эпоксиды, как и кремнийсодержащие мономеры.
Согласно предпочтительным вариантам реализации мономеры и сшивающие агенты, применяемые при синтезе ПМО, нацеленного на шаблон для ОТА (т.е. №(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)-Ь-фенил-аланин), включают 2-винилпиридин, 2-гидроксиэтилметакрилат и/или этиленгликоля диметакрилат. Хотя настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом, и понимание механизма не обязательно для практического применения настоящего изобретения, 2-винилпиридин образует ионные связи с кислотными группами шаблона, и содержит винильную связь в непосредственной близости от основного атома азота пиридинового кольца. Описанное взаимодействие между шаблоном и 2-винилпиридином способствует образованию полимера в непосредственной близости от шаблонной молекулы и обеспечивает возможность прочной связи между ПМО и ОТА в ПМО (например, после удаления шаблонного соединения и обеспечения возможности взаимодействия ПМО с целевыми молекулами ОТА). Хотя настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом, и понимание механизма не обязательно для практического применения настоящего изобретения, гидроксильная группа мономера 2-гидроксиэтилметакрилата образует дополнительные водородные связи с высокополярными пептидными связями шаблона. Дополнительным реагентом является этиленгликоля диметакрилат. Несмотря на то, что настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом, и понимание механизма не обязательно для практического применения настоящего изобретения, этиленгликоля диме-такрилат находит применение в некоторых вариантах реализации в качестве сшивающего агента (см. ниже), как ненасыщенный диэфир, взаимодействующий с низкополярными группами, присутствующими в молекуле шаблона ОТА. Согласно некоторым из вариантов реализации отдельные типы мономеров применяют по отдельности или в комбинации с другими типами мономеров.
При применении, сшивающий агент или агенты будут предпочтительно представлять собой одно или более полимерных или олигомерных соединений, или соединение, предназначенное для расщепления в определенных условиях. Сшивающие агенты, которые придают жесткость рассматриваемым полимерным соединениям, известны специалистам в данной области техники и включают, без ограничения, ди-, три-, тетра- и пентафункциональные акрилаты, метакрилаты, акриламиды, винилы, аллилы и стиро-лы. Конкретные примеры сшивающих агентов включают, без ограничения, пара-дивинилбензол, эти-ленгликоля диметакрилат (сокращенно обозначаемый EGDMA), тетраметилена диметакрилат (сокра
щенно обозначаемый TDMA), ^№-метилен-бис-акриламид (сокращенно обозначаемый MDAA), N,N'-1,3-фенилен-бис(2-метил-2-пропенамид) (PDBMP), 2,6-бис-акрилоиламидопиридин, 1,4-диакрилоилпи-перазин (сокращенно обозначаемый DAP), 1,4-фенилендиакриламид и ^О-бис-акрилоил-Ь-фенилала-нинол. Примеры обратимо расщепляемых сшивающих агентов включают, без ограничения, N,N'-6K;-(акрилоил)цистамин, ^^диаллилтартардиамид, ^^(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид, N1-((Е)-1-(4-винилфенил)метилиден)-4-виниланилин, аллилдисульфид и бис(2-метакрилоилоксиэтил))дисульфид. Согласно предпочтительным вариантам реализации этиленгликоля диметакрилат применяют в качестве сшивающего агента. Хотя предпочтительным сшивающим мономером является этиленгликоля диметак-рилат, варианты реализации настоящего изобретения не ограничены указанным агентом, и можно применять другие сшивающие мономеры, такие как дивинилбензол и триметилолпропана триметакрилат (сокращенно обозначаемый TRIM).
Можно применять любое соотношение простых мономеров и сшивающих агентов, которое обеспечивает структуру ПМО соответствующей целостности, например, которую можно применять в обстоятельствах конечного применения (например, в пищевых или кормовых продуктах, в воде, предназначенной для применения в аквакультуре, in vivo и т.д.). Специалист в данной области техники может выбрать подходящие соотношения мономеров для обеспечения желаемой структурной целостности, которая тесно связана с природой и структурой целевой молекулы и с природой и структурой применяемого шаблона.
В случае полимерных или олигомерных соединений, которые предполагают применять in vivo (например, в качестве терапевтических или диагностических средств, или предназначенных для потребления секвестрационных компонентов кормов для животных или пищевых продуктов для человека), важно выбрать мономеры, которые нетоксичны и обладают подходящей для применения in vivo стабильностью и растворимостью. Предпочтительные примеры включают, без ограничения, акриламиды и метакрилаты. Как вариант, полимер можно подвергать обработке после полимеризации для улучшения растворимости шаблона, например, путем взаимодействия с подходящими органическими или неорганическими реагентами.
Можно применять различные способы полимеризации, включая свободнорадикальную, катионную и анионную полимеризацию. В настоящем описании выбраны и предложены такие условия полимеризации, которые не оказывают отрицательного воздействия на активную конформацию соединения, для которого получают комплементарное полимерное соединение. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации применяют способы свободнорадикальной полимеризации с осаждением (см. Раздел III ниже).
Кроме того, полимеризацию ПМО обычно начинают путем добавления инициирующего агента. Инициирующие агенты включают, без ограничения, азо-бисизобутиронитрил (сокращенно обозначаемый АИБН), азо-бисдиметилвалеронитрил (сокращенно обозначаемый ABDV), диметилацеталь бензила, бензоилпероксид (сокращенно обозначаемый ВРО) и 4,4'-азо(4-циановалериановую кислоту). Согласно предпочтительным вариантам реализации инициирующий агент представляет собой азо-бисизобути-ронитрил.
Согласно предпочтительным вариантам реализации мономеры, сшивающие агенты и/или ПМО имеют положительные свойства безопасности и/или экологичности, такие как пониженная токсичность или отсутствие токсичности, и высокие показатели сорбции и удержания воды. Согласно предпочтительным вариантам реализации ПМО могут быть пригодными для повторного использования и экономически реализуемыми/производимыми.
III. Растворители, применяемые при синтезе ПМО
Выбор растворителя/смеси растворителей, в которых проводят реакцию полимеризации, оказывает сильное влияние на объем, селективность и специфичность связывающей способности ПМО к его целевому соединению. Хотя настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом, и понимание механизма не обязательно для практического применения настоящего изобретения, образованию пористости содействует или обеспечивает порогенный растворитель или смесь растворителей, обладающие следующими свойствами: он растворяется в мономерной смеси, он не активен в реакции полимеризации и не растворяет полученный полимер (ПМО). Подходящие порогенные растворители включают, без ограничения, ароматические углеводороды, такие как толуол, ксилол, этилбензол и ди-этилбензол; неполярные растворители, такие как циклогексан; насыщенные углеводороды, такие как гек-сан, гептан, октан и декан; спирты, такие как изопропиловый и изоамиловый спирты; алифатические га-логенированные углеводороды, такие как дихлорметан, дихлорэтан и трихлорэтан; алифатические или ароматические сложные эфиры, такие как этилацетат, бутилацетат, диметилфталат. Согласно предпочтительным вариантам реализации применяют ароматические углеводородные растворители. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации применяют только толуол. Согласно некоторым из вариантов реализации применяют смесь толуола с другим растворителем. Согласно некоторым из вариантов реализации применяют толуол в комбинации с циклогексаном. Порогенные растворители можно применять по отдельности или в комбинации из двух или более. Количество вводимого порогенного растворителя может варьировать примерно от 10 до 500 мас.% от общего количества мономеров. Хотя на
стоящее изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом, и понимание механизма не обязательно для практического применения настоящего изобретения, полярные растворители (например, вода, ацетонитрил) разрушают тесные комплексы между мономерами и шаблоном, таким образом понижая специфичность ПМО к связыванию с целевой молекулой (например, по сравнению с толуолом и т.д.).
Растворитель или смесь растворителей, применяемые в качестве среды для синтеза ПМО, также влияют на свойства набухания ПМО и на размер пор в трехмерной сетке ПМО. Согласно некоторым из вариантов реализации полярные растворители, такие как ацетонитрил, применяют в качестве растворителя или сорастворителя при полимеризации ПМО, если желательно увеличить набухание ПМО и размер пор в ПМО; как вариант, подобных растворителей избегают, если увеличение набухания ПМО и размера пор в ПМО нежелательно (например, если ПМО предназначен для применения в хроматографической колонке, когда набухание может препятствовать расходу и нарушать элюирование аналитов и способность прибора ВЭЖХ функционировать).
Продуманный выбор системы растворителей может непосредственно влиять на размер пор в ПМО. В неограничивающих примерах, в процессе синтеза ПМО, направленного на шаблон ОТА, самые мелкие частицы (1-20 мкм) получали в низкополярных растворителях, наподобие циклогексана и/или толуола, в то время как значительно более крупные и менее однородные по размеру (1-170 мкм) частицы получали в полярных растворителях, наподобие ацетонитрила или воды, кроме того, при высоких концентрациях мономеров реакция полимеризации дает более крупные сгустки ПМО, легко распадающиеся при измельчении, без образования очень мелких частиц, как это наблюдается при измельчении монолитов ПМО (см. подробное обсуждение в разделе IV ниже). Очень мелкие частицы могут быть нежелательны в таких применениях, например, где ПМО предназначен для применения в качестве смолы для колонки (где мелкие частицы могут препятствовать расходу), или где присутствие мелких частиц препятствует или затрудняет сбор ПМО при центрифугировании или фильтровании, или мешает соответствующему удержанию ПМО при фильтровании, которое, соответственно, регулируется размером пор в определенном фильтре с отверстиями, включающем ПМО, если указанный фильтр должен сохранять содержащееся в нем количество ПМО. Диспергированные сгустки ПМО можно просеивать для получения продукта определенного однородного размера. Следовательно, выбор растворителя для полимеризации, концентрации мономера и способов механической обработки можно осуществить таким образом, чтобы в результате получить оптимальный выход ПМО с заданным размером пор и размером частиц, при этом избегая образования мелких частиц.
Выбор системы растворителей обуславливает физическую форму ПМО, получаемого в процессе полимеризации. Например, некоторые системы растворителей (включая, без ограничения, низкополярные растворители, такие как циклогексан и/или толуол) дают, как описано выше, твердые сгустки ПМО в ходе процесса, называемого полимеризация осаждением. Другие системы растворителей (включая, без ограничения, полярные растворители, такие как поливиниловый спирт в воде) способствуют процессу с отличающейся кинетикой, называемому эмульсионной полимеризацией (Vivaldo-Lima E., Wood P.E., Hamielec A.E., 1997. Industrial and Engineering Chemistry Research, 36: 939-965). В общем, природа полимеризации влияет как на физическую форму сетки ПМО, так и на легкость, с которой полимер можно подвергать дальнейшей переработке (например, необходимость измельчения; однородность по размеру частиц; выход; легкость обмена с буферным раствором или растворителем; стабильность). Обзор процессов полимеризации приведен в Yan H., and Но Row K., 2006. International Journal of Molecular Science, 7: 155-178; полностью включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно предпочтительным вариантам реализации применяют полимеризацию осаждением. Согласно некоторым из вариантов реализации полимеризация осаждением дает ПМО в виде порошка, однородного и легко регулируемого по размеру частиц. В качестве сравнения, другие способы полимеризации, включая, без ограничения, полимеризацию в массе, могут давать большой монолит ПМО, который необходимо раздробить перед дальнейшей переработкой или применением, что приводит к беспорядочным размерам частиц и, следовательно, к меньшей функциональности.
IV. Способы удаления шаблонов из ПМО после синтеза ПМО и физическая переработка ПМО
Методики, применяемые для отщепления шаблона из синтезированного ПМО, в общем случае определяются природой взаимодействия шаблон-ПМО. Например, если между шаблоном и сеткой ПМО образована ковалентная связь, требуется химическое отщепление шаблона от ПМО. Напротив, если взаимодействие между шаблоном и сеткой ПМО является нековалентным, для удаления шаблона может быть достаточно экстракции растворителем (см., например, Yan H., and Но Row K., 2006, как указано ранее, полностью включенном в настоящую заявку посредством ссылки; Sellergren B., 2001. The non-covalent approach to molecular imprinting. II Molecularly Imprinted Polymers: Man-made mimics of antibodies and their application in analytical chemistry, (Sellergen B., ed.), Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry, Vol. 23 Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 113-184). Обработка ПМО после синтеза может также называться активацией ПМО. Согласно предпочтительным вариантам реализации первая стадия активации ПМО включает декантацию, а затем выпаривание (повторное использование) растворителя из материала ПМО, при несколько пониженном давлении (например, при помощи ротационной испарительной системы). Вторая стадия включает измельчение частиц ПМО для получения более мелкого
размера частиц (например, при помощи ступки и пестика, или помольного оборудования). Третья стадия включает многократные промывки частиц ПМО, например, 0,2% мас./об. раствором гидроксида натрия. Согласно вариантам реализации в которых синтезируют ПМО к ОТА, тщательность промывки можно отслеживать по получению отрицательного результата в пробе с раствором FeCl3 для детектирования шаблона (см. с примера 2 по пример 4). Согласно некоторым из вариантов реализации проводят однократную промывку 1% раствором уксусной кислоты и однократную промывку водой, с последующей сушкой готового продукта ПМО (например, при 80°С в сушильном шкафу в течение 6-8 ч) до удаления всех следов растворителя. Наконец, частицы ПМО можно просеять для получения продукта с заданным размером частиц. Согласно предпочтительным вариантам реализации физическая форма ПМО не требует протяженного измельчения перед применением, например, ПМО не образует монолитных блоков, которые требуют раздробления или измельчения для диспергирования. Согласно предпочтительным вариантам реализации основная часть ПМО образует сферы, которые при сушке образуют порошок.
Согласно предпочтительным вариантам реализации стадий промывки достаточно для удаления по меньшей мере 95% молекул шаблона из сетки ПМО. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации стадий промывки достаточно для удаления по меньшей мере 99% молекул шаблона из сетки ПМО. Согласно самым предпочтительным вариантам реализации стадий промывки достаточно для удаления по меньшей мере 99,9% молекул шаблона из сетки ПМО.
V. Применение композиций ПМО
Композиции и способы согласно настоящему изобретению находят применение в различных областях, включая диетическое питание, терапию, профилактику, производство и переработку пищи и напитков, а также в области исследований и контроля качества. Например, согласно некоторым из вариантов реализации синтетические шаблоны (например, полученные при помощи способов согласно настоящему описанию) применяют для синтеза ПМО. Настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным синтетическим шаблоном и/или синтезированным ПМО. Действительно, можно получать и применять различные синтетические шаблоны, включая, без ограничения, шаблон ОТА (например, №(3,5-дихлор-2-гидроксибензоил)-Ь-фенилаланин , см. пример 1). Согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены композиции и способы получения синтетического шаблона (например, для применения в синтезе ПМО к ОТА), содержащего внешние функциональные группы, напоминающие микотоксин (например, если шаблон применяют для получения ПМО в процессе согласно настоящему изобретению и впоследствии удаляют из полимера, ПМО проявляет высокое сродство к микотоксину, похожему по своим функциональным группам). Согласно некоторым из вариантов реализации целевое соединение представляет собой ОТА.
Аналогично, можно получить и применять различные ПМО, включая, без ограничения, ПМО, полученные при помощи любого из перечисленных выше синтетических шаблонов или любой другой органической молекулы в качестве шаблона (например, питательного вещества, такого как витамины, лекарственные средства, антибиотики, загрязнители, гормоны, ферменты, белки и т.д.).
ПМО согласно настоящему описанию находят применение в различных областях. Например, согласно некоторым из вариантов реализации ПМО применяют для очистки жидкостей. Например, согласно некоторым из вариантов реализации ПМО применяют для селективного удаления целевых соединений (например, одного или более микотоксинов) из жидкости. Настоящее изобретение не ограничено целевыми соединениями (например, одним или более микотоксинами), удаляемыми из жидкости. Действительно, можно удалять множество целевых соединений, включая, без ограничения, микотоксины согласно настоящему описанию. Аналогично, настоящее изобретение не ограничено типом жидкости, из которой удаляют целевое соединение. В действительности, множество различных жидких растворов могут содержать одно или более целевых соединений (например, микотоксинов), подлежащих удалению (например, путем введения одного или более различных типов ПМО в раствор), включая, без ограничения, напитки (например, потребляемые человеком (например, сок, вино (например, белое вино, красное вино и т. д.), воду, пиво, чай, кофе и т. д.)), воду (например, применяемую в аквакультуре, питьевую воду и т. д.), жидкости, применяемые в производстве пищевых продуктов (например, пищевых продуктов для человека, животных), биологические жидкости (например, кровь, рубцовая жидкость, желудочный сок и
т.д.).
Например, согласно некоторым из вариантов реализации композиции и способы согласно настоящему изобретению предлагают ПМО, которые селективно удаляют целевые соединения (например, ми-котоксины) из жидкости. Жидкость может представлять собой напиток, воду, биологический образец, источник питьевой воды, кровь, рубцовую жидкость или другой тип жидкости, содержащей целевые соединения. Кроме того, целевые соединения можно удалять из других типов жидкостей. Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО согласно настоящему описанию вступают в контакт (например, смешиваются) с жидкостью в достаточном количестве в течение времени, позволяющего ПМО вступить во взаимодействие и связать целевое соединение (например, микотоксин). Хотя настоящее изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом, и понимание механизма не обязательно для практического применения настоящего изобретения, согласно некоторым из вариантов реализации после того, как жидкости предоставляют возможность вступить в контакт с ПМО, комплексообразующие/связывающие
полости, содержащиеся в ПМО (например, полости, оставшиеся после удаления из ПМО шаблонного соединения), связывают при контакте целевое соединение, эффективно удаляя целевое соединение из жидкости. Жидкость можно далее перерабатывать, упаковывать, или готовить для потребления (например, для потребления человеком, для потребления животными или для среды обитания животных). Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО, полученные и/или предложенные согласно настоящему описанию, обладают жесткой структурой, которая выдерживает физические и химические факторы, связанные с процессом удаления/секвестрации. Например, согласно предпочтительному варианту реализации ПМО, предложенный согласно настоящему изобретению, селективно связывается с целевым соединением, таким образом удаляя целевое соединение из вещества (например, жидкости, твердой поверхности, биологической жидкости (например, крови, рубцовой жидкости и т.д.), вещества, необходимого для поддержания жизни (например, воздух или среда для аквакультуры) и т. д.), и поддерживает ассоциацию с целевым соединением в то время, пока комплекс ПМО-целевое соединение собирают и/или удаляют из вещества (например, прокачивают жидкость через фильтр, выливают жидкость на фильтр, погружают фильтр в жидкость, наносят покрытие ПМО на поверхность контейнера, центрифугируют, наносят покрытие ПМО на поверхность фильтра, происходит выделение кала животными и т.д.).
Согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ удаления целевых соединений из жидкости, содержащей множество различных типов целевых соединений (например, микотоксинов или других органических целевых молекул/соединений (например, питательных веществ, таких как витамины, лекарственные средства, антибиотики, загрязнители, гормоны, ферменты, белки и т. д.)). Согласно некоторым из вариантов реализации способ включает группу различных типов ПМО, разработанных для связывания различных целевых соединений. Например, согласно некоторым из вариантов реализации предложен образец жидкости, в котором проводят испытание с целью идентификации присутствия в жидком образце одного или более целевых соединений. Присутствие специфических микотоксинов можно детектировать с целью определения, какие микотоксины присутствуют. После идентификации одного или более типов целевых соединений, присутствующих в жидком образце (например, когда жидкий образец является образцом характеристик жидкости, из которой взят указанный образец), создают один или более ПМО (например, согласно способам, описанным в настоящей заявке) и/или объединяют, а затем вводят один или более ПМО в жидкий раствор для удаления целевых соединений. Согласно некоторым из вариантов реализации идентификация одного или более типов целевых соединений включает применение колонок и/или фильтров, содержащих один или более ПМО, специфических к целевым соединениям. Согласно некоторым из вариантов реализации после того, как ПМО применяют для удаления целевого соединения из образца (например, жидкого образца), целевое соединение удаляют из ПМО и используют ПМО повторно. Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО утилизируют соответствующим образом. Например, целевые соединения можно удалить из ПМО (например, с целью возможности повторного использования ПМО) путем промывки подходящим растворителем и/или раствором, который можно выбрать из растворителей, применяемых в способах отщепления шаблона от ПМО после завершения реакции синтеза и механической обработки ПМО (например, включая, без ограничения, ацетонитрил, толуол, метанол, гидроксид натрия, уксусную кислоту и т.д.), или тому подобное. Затем восстановленный ПМО возвращают для повторного применения.
Способы удаления целевых соединений из жидкости позволяют производить извлечение с большими выходами вследствие селективной природы ПМО. Согласно некоторым из вариантов реализации способ удаления позволяет выделить примерно от 25% примерно до 99% целевого соединения, присутствующего в жидкости. Согласно некоторым из вариантов реализации способ удаления позволяет выделить примерно от 35% примерно до 99% целевого соединения, присутствующего в жидкости. Согласно некоторым из вариантов реализации способ удаления позволяет выделить примерно от 50% примерно до 99% целевого соединения, присутствующего в жидкости. Согласно некоторым из вариантов реализации способ удаления позволяет выделить примерно от 25% примерно до 99% целевого соединения, присутствующего в жидкости. Согласно другим вариантам реализации способ удаления понижает итоговую концентрацию целевого соединения в жидкости до уровня частей на миллиард (млрд-1, ppb) (например, до концентрации, подходящей для употребления человеком и/или животными). Способы удаления можно адаптировать для получения конкретных уровней концентраций, которые можно найти в актуальных и предлагаемых нормативных проектах, известных специалистам в данной области техники. Согласно некоторым из вариантов реализации способы удаления применяют в жидкостях при конкретных величинах рН. Например, композиции и способы согласно настоящему изобретению можно применять в жидкостях, имеющих величину рН примерно от 1 до 13.
Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО применяют для удаления целевых соединений с поверхности. Например, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены способы уменьшения присутствия целевых соединений (например, микотоксинов) на поверхности, включающий осуществление контакта поверхности с композицией, содержащей ПМО. Согласно конкретным вариантам реализации контакт осуществляют в течение времени, достаточного для того, чтобы ПМО связал и/или секвестрировал целевые соединения. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ удаления загрязнений с поверхности окружающей среды, на
которой скапливаются целевые соединения. Согласно одному из указанных вариантов реализации целевое соединение связано с поверхностью в окружающей среде, и способ включает осуществление контакта поверхности окружающей среды с количеством композиции (например, содержащей ПМО), достаточным для удаления загрязнений с поверхности. Хотя это может быть желательным, удаление загрязнений не обязательно приводит к полному устранению целевого соединения. Согласно некоторым из вариантов реализации композиции (например, содержащие ПМО) и способы дополнительно включают красители, краски и другие маркирующие и идентификационные соединения, для того, чтобы убедиться, что обработанная поверхность была успешно обработана композициями согласно настоящему изобретению.
Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО применяют для предотвращения контакта целевого соединения с поверхностью или другим соединением (например, почвой). Например, некоторые варианты реализации настоящего изобретения рассматривают способы получения композиций, в которых ПМО комбинируют с другими материалами (например, пластмассой или продуктом типа крахмала) и наносят на растительность (например, растущую сельскохозяйственную растительность) для защиты растительности от соединений с поверхности (например, микотоксина) в процессе роста и дополнительного предохранения соединений от загрязнения другими соединениями (например, почвой).
Согласно некоторым из вариантов реализации поверхность (например, внешнюю или внутреннюю поверхность) субъекта (например, человека или животного) обрабатывают (например, наружно или внутренне) полимером с молекулярным отпечатком согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации контакт осуществляют посредством перорального, назального, трансбуккального, ректального, вагинального или топического введения. Если полимер с молекулярным отпечатком согласно настоящему изобретению вводят в виде лекарственных препаратов, предполагают, что полимер с молекулярным отпечатком дополнительно содержит фармацевтически приемлемые добавки, наполнители, стабилизаторы, разбавители, и тому подобное. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложены полимеры с молекулярным отпечатком, дополнительно содержащие дополнительные фармацевтически приемлемые биоактивные молекулы (например, антитела, антибиотики, средства для трансфекции нуклеиновых кислот, витамины, минеральные вещества, кофакторы, факторы, способные связывать и/или секвестрировать микотоксины (например, экстракты клеточных стенок дрожжей (например, экстракты клеточных стенок дрожжей, объединенные с глиняным материалом, и/или экстракт клеточных стенок дрожжей, содержащий глину, и/или частицы глины, интегрированные или чередующиеся в клеточной стенке дрожжей) и т. д.). Согласно некоторым из вариантов реализации субъекту вводят полимер с молекулярным отпечатком согласно настоящему изобретению с целью терапевтического лечения заболевания или состояния (например, грибка стоп). Согласно другим вариантам реализации субъекту вводят полимер с молекулярным отпечатком согласно настоящему изобретению с целью профилактического лечения (например, предотвращения развития признаков или симптомов) заболевания или состояния (например, грибка стоп). Согласно некоторым из вариантов реализации полимеры с молекулярным отпечатком и способы применяют к любому типу площади или поверхности. Например, согласно некоторым из вариантов реализации площадь включает твердую поверхность (например, медицинское приспособление), раствор, поверхность организма (например, внутренняя или внешняя часть организма человека), или пищевой продукт.
Настоящее изобретение не ограничено количеством одного или более ПМО, вводимых (например, смешиваемых) к жидкости или твердому веществу (например, для удаления целевых соединений). Согласно некоторым из вариантов реализации на литр жидкости или твердого вещества вводят примерно 0,10 мг, 0,50 мг, 1,0 мг, 2,0 мг, 5,0 мг, 10,0 мг, 20,0 мг, 50,0 мг, 100,0 мг, 500,0 мг или более ПМО.
Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО согласно настоящему изобретению применяют в способе удаления токсина, таким как гемоперфузия. Гемоперфузия представляет собой методику лечения, при которой большие объемы крови субъекта пропускают через абсорбирующее вещество (например, ПМО) с целью удаления из крови токсических веществ.
Обычно наиболее часто применяемыми при гемоперфузии сорбентами являются смолы и различные формы активированного угля или древесного угля. Однако специфичность связывания у указанных материалов относительно низкая, и иногда они адсорбируют важные компоненты крови наряду с целевыми молекулами. Соответственно, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены для применения ПМО согласно настоящему изобретению как более высокоспецифичные и высокоаффинные сорбенты для целевых молекул.
Гемоперфузию проводят путем откачивания крови через артериальный катетер в колонку или картридж, содержащий сорбирующий материал (например, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложен в качестве применяемого сорбирующего материала ПМО согласно настоящему изобретению). По мере того, как кровь проходит над частицами углерода или смолы в колонке, токсичные молекулы или частицы притягиваются к поверхности частиц сорбента и задерживаются внутри колонки. Кровь вытекает из другого конца колонки и ее возвращают субъекту через трубку, присоединенную к венозному катетеру. Гемоперфузия способна очистить от токсинов больший объем крови, чем гемодиализ или другие способы фильтрации; например, она способна обрабатывать более 300 мл крови в минуту.
ПМО согласно настоящему изобретению можно применять для гемоперфузии. Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО согласно настоящему изобретению применяют для удаления одного или более микотоксинов из крови субъекта при помощи гемоперфузии.
Схемы дозирования можно регулировать для получения оптимальной желаемой реакции (например, терапевтической или профилактической реакции), например, животному можно однократно вводить болюс, содержащий ПМО, несколько отдельных доз можно вводить в течение периода времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, как этого требует острая необходимость в терапевтической ситуации. Выгодно изготавливать парентеральные композиции в виде дозированных лекарственных единиц для легкого введения и единообразной дозировки. Дозировки ПМО согласно настоящему изобретению в общем случае зависят от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического действия, которое необходимо получить, и (б) ограничений, существующих в области составления композиций, таких как активное соединение для лечения чувствительности к микотоксинам у индивидуумов. Вводимая доза будет, несомненно, варьировать в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного агента, и его способ и путь введения; возраст, состояние здоровья и масса тела реципиента; природа и степень выраженности симптомов, вид одновременного лечения, частота лечения, и желаемый эффект.
ПМО согласно настоящему изобретению можно включать в состав фармацевтических композиций, подходящих для введения субъекту. Например, фармацевтическая композиция может содержать ПМО и фармацевтически приемлемый носитель. В настоящем описании "фармацевтически приемлемый носитель" включает растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и тому подобно, которые физиологически совместимы. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или более из следующих: вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстроза, глицерин, этанол, и тому подобное, а также комбинации указанных агентов. Во многих случаях будет предпочтительно включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать малые количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферные агенты, которые увеличивают срок хранения или эффективность ПМО.
Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО согласно настоящему изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или с усваиваемым пищевым носителем. Соединение (и другие ингредиенты, при необходимости) можно также заключить в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессовать в таблетки, или непосредственно включить в рацион субъекта. Для перо-рального терапевтического введения соединение можно включить в наполнители и применять в форме таблеток для проглатывания, таблеток для рассасывания, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток, гранул, и тому подобное. Для введения соединения согласно настоящему изобретению путем, отличным от парентерального введения, может быть необходимо нанести на соединение покрытие, или вводить соединение совместно с материалом, предохраняющим соединение от инактивации.
Дополнительные активные соединения также можно включать в композиции. Согласно некоторым из вариантов реализации ПМО согласно настоящему изобретению включают в состав и/или вводят совместно с одним или более дополнительными терапевтическими агентами.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" ПМО согласно настоящему изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному, в необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени, для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может меняться в зависимости от таких факторов, как тяжесть болезненного состояния, возраст, пол и масса тела индивидуума, и способность наночастицы с отпечатками вызывать у индивидуума желаемую реакцию. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором любые токсические или нежелательные эффекты наночастицы с отпечатками перевешиваются терапевтически благотворными эффектами. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному, в необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени, для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу применяют у субъектов до начала заболевания или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.
Согласно некоторым из вариантов реализации при смешивании с органическим веществом (например, пищевыми продуктами) и/или жидкостью (например, водой, вином или другим напитком), и/или при непосредственном приеме в пищу субъектом, композиции согласно настоящему изобретению уменьшают абсорбцию или всасывание микотоксинов субъектом (например, благодаря этому облегчая сниженную продуктивность, улучшая состояние здоровья и/или уменьшая частоту связанных с микоток-синами заболеваний или патологических реакций у субъекта) и уменьшают и/или предотвращают отложение микотоксинов и/или их метаболитов в мясе, рыбе, яйцах, молоке и других продуктах, предназначенных для поступления в пищевую цепь человека.
Согласно некоторым из вариантов реализации настоящее изобретение применяют для производства разделительных устройств (например, в твердофазной экстракции (сокращенно обозначаемой ТФЭ)), которые применяют для удаления твердых или полутвердых соединений из смеси примесей исходя из их физических и химических свойств, которые отличаются от обычно применяемых доступных разделительных устройств (например, нормально-фазовая, обращенно-фазовая или ионообменная твердофазная экстракция). Согласно некоторым из вариантов реализации разделительные устройства можно включить в картридж, служащий для экстрагирования и последующего очищения специфического соответствующего шаблона и аналогов шаблона полученного ПМО.
Согласно некоторым из вариантов реализации настоящее изобретение может служить для набивки хроматографической колонки, применяемой в жидкостной хроматографии и обеспечивающей возможность специфического элюирования соответствующего шаблона и аналогов шаблона применяемого ПМО. Колонки, полученные с использованием ПМО, обеспечивают более специфическое взаимодействие, чем другие доступные методики и материалы, известные в данной области техники (например, нормально-фазовые, ионообменные, обращенно-фазовые силикагелевые колонки, содержащие гидрофобные алкильные цепи различного размера (-(СН2)П-СН3, где n равно 4, 8, 18, без ограничения), которые взаимодействуют с пептидами и малыми молекулами), но более специфически направлены на соответствующий шаблон и аналоги шаблона полученного ПМО. Согласно некоторым из вариантов реализации для набивки колонки можно применять множество типов ПМО, каждый из которых предназначен для специфического микотоксина или группы микотоксинов.
Согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены материалы для разделения и количественного анализа микотоксинов. Настоящее изобретение можно применять для измерения прослеживаемости корма/пищевого материала или источника жидкости с целью измерения ми-котоксинов, присутствующих в образце и их сравнения с общепринятым эталонным соединением (например, стандартным материалом микотоксина, элюированным с использованием ВЭЖХ, комбинированным с УФ-, флуоресцентным детектором или масс-спектрометрическими детекторами и т.д.).
Согласно некоторым из вариантов реализации прослеживаемости уровня микотоксина можно достичь с использованием одного типа ПМО или множества различных типов ПМО, каждый из которых приспособлен к специфическому микотоксину или группе микотоксинов и применен к детектированию в материалах образцов, состоящих из образца корма или пищи (например, образцы зерна (например, кукуруза, пшеница и т.д.), фрукты (например, яблоко, груши, виноград и т.д.), кофе, чай, какао и т.д.).
Согласно некоторым из вариантов реализации прослеживаемость уровня микотоксина с использованием одного типа ПМО или множества различных типов ПМО, каждый из которых приспособлен к специфическому микотоксину или группе микотоксинов, применяют к аналитическим исследованиям (например, ВЭЖХ) для определения, присутствуют ли микотоксины в образце, и если присутствуют, то какие микотоксины и в каких количествах. Согласно некоторым из вариантов реализации аналитические средства, применяемые для детектирования микотоксинов (например, ВЭЖХ), можно применять для предсказания опасности загрязнения пищи микотоксином. Согласно другим вариантам реализации аналитические средства, применяемые для детектирования микотоксинов, можно применять для определения какой ПМО или комбинацию ПМО необходимо применить к материалу, из которого взят образец, для уменьшения или удаления присутствующего микотоксина (микотоксинов).
Согласно некоторым из вариантов реализации возможность слежения за концентрацией микоток-сина с использованием одного типа ПМО или множества различных типов ПМО, каждый из которых приспособлен к специфическому микотоксину или группе микотоксинов, применяют для детектирования содержания микотоксинов в жидкостях, применяемых для животноводства или в качестве напитков для потребления животными и человеком (например, вода, молоко, соки, вино, пиво и т. д.).
Согласно некоторым из вариантов реализации возможность отслеживания содержания микотокси-нов можно применять в отношении переработки пищи/корма (переработки мяса, переработки свежих продуктов) для исследования на присутствие микотоксинов во время всего технологического процесса для определения, где появляется источник загрязнения и требуется отзыв продукции. Штрих-коды и другие средства отслеживания, все движение продукта и стадии процесса производства должны быть снабжены соответствующими эталонами для обеспечения возможности отслеживания анализируемого образца.
Согласно некоторым из вариантов реализации прослеживаемость концентрации микотоксинов с использованием одного типа ПМО или множества различных типов ПМО, каждый из которых приспособлен к специфическому микотоксину или группе микотоксинов, применяют к детектированию содержания микотоксинов в крови. Например, настоящее изобретение можно применять в практике переливания крови, для облегчения непрерывного контрольного учета, принимающего во внимание местонахождение кровяного продукта и текущий статус с точки зрения обработки, анализа, хранения и т.д., во всех точках от первичного забора у донора непосредственно либо до переливания реципиенту, либо до закладки на хранение, через прослеживаемость концентрации микотоксина.
Согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения применяют ПМО согласно настоящему описанию в комбинации с одним или более способами и/или материалами согласно настоя
щему описанию для применения в композициях и/или способах для уменьшения, устранения и/или удаления микотоксинов (например, физические, смешанные, химические, микробиологические способы согласно настоящему описанию (например, для адсорбирования и/или секвестрации токсинов)). Например, согласно некоторым из вариантов реализации ПМО согласно настоящему описанию применяют с одним или более физическими, смешанными, химическими или микробиологическими способами секвестрации микотоксинов. Можно применять ряд физических средств для уменьшения присутствия микотоксинов, такие как механическая сепарация (см., например, Dickens J.W., and Whitaker T.B., 1975. Peanut Science, 2: 45-50), разделение по плотности (см., например, Huff W.E., and Hagler W.M., 1982. Cereal Chemistry, 59: 152-153), очистка зерна путем промывки водой или раствором карбоната натрия для уменьшения загрязнения кукурузы (например, токсинами Fusarium) сортировка загрязненного зерна (например, путем физической сепарации или флуоресценции для детектирования присутствия микотоксинов), термической инактивации (см., например, Lee L.S., 1989. Journal of American Oil Chemistry Society, 66: 1398-1413), УФ-излучением, рентгеновским излучением или микроволновым излучением (см., например, CAST, 2003. Mycotoxins: Risk inplant, animal, and human systems. II Task Force Report 139 (Niyo K. ed.), Council for Agricultural Science and Technology, Ames, Iowa, USA: pp. 1-199), и экстракцией токсинов растворителем (см., например, Scott P.M., 1998. Review of Veterinary Medicine, 149: 543-548). Для разрушения мико-токсинов в загрязненных кормах, особенно афлатоксинов, применяли различные химические агенты, такие как кислоты, основания (например, аммиак, едкий натр), окислители (например, пероксид водорода, озон), восстановительные агенты (например, бисульфиты), хлорирующие агенты и формальдегид, (см., например, Hagler W.M., Jr., 1991. In Mycotoxins, Cancer and Health. (Bray G. and Ryan D. eds.) Lousi-ana State University Press, Baton Rouge, LN, USA; Phillips T.D., Clement B.A., and Park D.L., 1994. Approaches to reduction ofaflatoxin in foods and feeds. II The toxicology of aflatoxins: Human health, veterinary agriculture significance (Eaton L.D. and Groopman J.D. eds.), Academic Press, New York, NY, USA: pp. 383406;). Фильтры (например, фильтрующие колонны) и аналогичные приспособления можно подобным образом применять для удаления микотоксинов.
Согласно настоящему изобретению также предложены системы и способы обеспечения различных аспектов продукта (например, продукты или компоненты продуктов согласно настоящему изобретению и/или эксплуатация с использованием настоящего изобретения). Согласно настоящему изобретению также предложены системы и способы обеспечения продуктов компании для стороны вне компании, например, система и способ обеспечения покупателя или дистрибьютора продукта продуктом компании, таким как один или более ПМО (например, ПМО, нацеленные на специфические микотоксины). Например, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложена система управления производством, которая может быть отдельно или в комбинации с системой прослеживаемости. Например, образцы материалов можно анализировать для определения, присутствуют или отсутствуют микотоксины в материале; если микотоксины присутствуют, можно идентифицировать специфические микотоксины. Полученную информацию можно использовать для прослеживаемости (например, чтобы показать отсутствие всех или некоторых микотоксинов). Полученную информацию также можно использовать для создания системы управления производством ПМО, в которой можно создавать специфические комбинации ПМО и комбинировать между собой с обеспечением специфического нацеливания на микотоксины, присутствующие в материале образца.
Согласно некоторым из вариантов реализации компания получает входные данные (например, в виде заказа, информации или материалов (например, биологического образца (например, жидкого образца, в котором предполагается наличие целевых соединений)) от стороны вне компании (например, дистрибьютора и/или покупателя) в отдел заказов; и обеспечивает результаты на выходе (например, в виде продукта, доставляемого отделом доставки (например, дистрибьютору и/или покупателю) или в виде отчета данных (например, прослеживаемость в виде услуги аналитической лаборатории)). Согласно некоторым из вариантов реализации организуют систему управления производством для оптимизации получения заказов и доставки (например, экономически выгодным образом) продуктов (например, композиций, содержащих один или более ПМО (например, ПМО, специфичных к микотоксинам)) в сторону вне компании; и для получения платежей за указанный продукт от указанной стороны. Согласно некоторым из вариантов реализации организуют систему управления производством для идентификации штрих-кодами образцов или материалов, принятых на анализ, и доставки (например, экономически выгодным образом) отчета данных (например, уровней некоторых микотоксинов, которые были проанализированы путем применения ПМО-ТФЭ или ВЭЖХ-колонок, изготовленных из ПМО (например, ПМО, специфических к микотоксинам)) стороне вне компании; и для получения платежей за указанные услуги от указанной стороны.
Согласно некоторым из вариантов реализации компания включает производство и администрацию. Композиции согласно настоящему изобретению можно получать на производстве и/или от третьей стороны, и можно хранить раздельно в компании как есть, на складе материалов и/или на складе других компонентов (например, складе продуктов), и/или дополнительно собирать (например, комбинировать (например, один или более ПМО можно комбинировать с одним или более ПМО других типов, и/или с другими компонентами (например, носителями и/или другими биоактивными компонентами согласно
настоящему описанию))) и хранить (например, в устройстве и/или на складе продуктов). Согласно некоторым из вариантов реализации администрация включает другой отдел (например, отдел, получающий ввод в форме заказа на продукт от покупателя и/или дистрибьютора). Отдел заказов может затем производить вывод в форме инструкций отделу перевозок для выполнения заказа (т.е. для отправки заказанных продуктов покупателю или дистрибьютору). Согласно некоторым из вариантов реализации отдел перевозок, кроме выполнения заказа на продукт или услугу, может также предоставлять информацию/данные отделу счетов. Согласно некоторым из вариантов реализации другие компоненты компании могут включать отдел обслуживания покупателей (например, который может получать ввод от покупателя и/или производить вывод в форме обратной связи или информации для покупателя, и/или может получать ввод или производить вывод любому другому компоненту компании). Например, отдел обслуживания покупателей может также получать ввод от покупателя в форме запрошенной технической информации, например, для подтверждения, что продукт и способы согласно настоящему изобретению можно применять для конкретной потребности покупателя, и может производить вывод покупателю в форме ответа на запрошенную техническую информацию.
Так, согласно некоторым из вариантов реализации компоненты компании имеют структуру, подходящую для взаимодействия друг с другом для облегчения транспортировки материалов и частей, устройств, других компонентов, продуктов, таблиц и информации внутри и вне компании. Например, можно применять физический путь для транспортировки продуктов со склада в отдел перевозки при получении соответствующего ввода из отдела заказов, или со склада образцов в аналитический отдел при приеме запроса на срочный анализ. Отдел заказов, для сравнения, может быть связан электронно с другими компонентами компании, например, путем коммуникационной сети (например, компьютерной сети, например интернет и/или интрасеть), и может дополнительно быть организован так, чтобы получать ввод, например, от покупателя при помощи телефонной сети, посредством почты или другой службы связи, или через Интернет.
Согласно некоторым из вариантов реализации система управления производством дополнительно включает одну или более систем сбора данных.
Согласно некоторым из вариантов реализации компания может применять ряд программных приложений для обеспечения компонентов компании информацией и/или для обеспечения части вне компании доступа к одному или нескольким компонентам компании (например, доступа в отдел заказов и/или в отдел обслуживания покупателей, и/или хранилище данных/склад). Указанные программные приложения могут включать коммуникационную сеть, такую как интернет, локальную сеть или интрасеть. Например, в приложении на основе интернет, покупатель может иметь доступ к соответствующему вебсайту и/или веб-серверу, который сотрудничает с отделом заказов, так что покупатель может поместить ввод в форму заказа для отдела заказов. В ответ, отдел заказов может связаться с покупателем для подтверждения, что заказ был получен, и дополнительно связаться с отделом перевозок, произведя ввод, что продукты согласно настоящему изобретению (например, композиции, содержащие один или более различных типов ПМО (например, ПМО, специфические к микотоксинам)) должны быть отгружены покупателю, или с аналитическим отделом, произведя ввод, что следует провести анализы с использованием продуктов согласно настоящему изобретению (например, композиций, содержащих один или более различных типов ПМО (например, ПМО, специфические к микотоксинам), упакованных в разделительные устройства). Так, описанным образом, можно эффективно осуществлять бизнес компании.
Так, согласно некоторым из вариантов реализации в сетевой организации, различные подкомпоненты компании (например, склад, аналитическая лаборатория, отдел платежей и отдел перевозок) могут взаимодействовать между собой при помощи соответствующих компьютерных систем. Согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения, предложены способы обеспечения различных аспектов продукта (например, продуктов и/или компонентов продуктов согласно настоящему изобретению), а также информации, касающейся различных аспектов продукта согласно настоящему изобретению (например, данных о производительности, статистики применения и т.д.) частям (например, покупателям/пользователям, дистрибьюторам, третьим лицам (например, правительственным агентствам (например, национальным учреждениям здравоохранения и/или центрам контроля заболеваний) и т.д.)). Согласно некоторым из вариантов реализации продукт удаляют со склада продуктов, например, при участии отдела перевозок, и высылают запросившей стороне, такой как покупатель или дистрибьютор. Обычно такая перевозка происходит в ответ на то, что участник разместил заказ, который затем обрабатывают (например, пересылают соответствующему участнику) внутри организации и в результате участнику отправляют заказанный продукт или участнику предоставляют услугу. Данные, касающиеся перевозки продукта или бланков данных аналитической услуги участнику, могут быть переданы дополнительно внутри организации, например, из отдела перевозок или аналитического отдела в отдел платежей, который, в свою очередь, может выслать счет участнику, или вместе с продуктом или данными, или после того, как были высланы продукт или данные. Согласно настоящему изобретению также предложены способы предоставления технического обслуживания участникам, использующим продукт и/или компоненты продукта согласно настоящему изобретению. Хотя указанную функцию могут осуществлять индивидуумы, участвующие в исследовании и разработке продукта, запросы, связанные с техническим об
служиванием может в общем случае обрабатывать, выяснять и/или направлять административный отдел организации (например, отдел обслуживания покупателей). Взаимодействие, связанное с техническим обслуживанием (например, решение проблем, связанных с применением продукта или отдельных компонентов продукта), может требовать обмена информацией между пользователем (например, покупателем) и отделом обслуживания покупателей.
Как отмечено выше, любое число вариантов способа обеспечения продуктов (например, продуктов и/или компонентов продуктов согласно настоящему описанию) и/или услуг пользователю возможно, и указанное любое число вариантов входит в объем настоящего изобретения. Следовательно, настоящее изобретение включает способы (например, способы коммерческой деятельности), которые затрагивают (1) производство продуктов (например, продукта и/или компонентов продукта согласно настоящему описанию); (2) получение заказов на указанные продукты; (3) отправку продуктов участникам, разместившим указанные заказы; (4) отправку счетов участникам, обязанным оплатить отправленные им продукты; и/или (5) получение платежей за продукты, отправленные участникам. Например, предложены способы, включающие две или более из следующих стадий: (а) получение частей, материалов и/или компонентов от поставщика; (b) получение одного или более первых продуктов (например, одного или более компонентов согласно настоящему описанию (например, шаблона ПМО согласно настоящему описанию и/или одного или более типов ПМО, полученных с использованием шаблона ПМО)); (с) хранение одного или более первых продуктов, полученных на стадии (b); (d) комбинирование одного или более первых продуктов, полученных на стадии (b), с одним или более другими компонентами для получения одного или более вторых продуктов (например, композиции, содержащей два или более различных типов ПМО); (е) хранение одного или более первых продуктов, полученных на стадии (b), или одного или более вторых продуктов, полученных на стадии (d); (f) получение заказа на первый продукт стадии (b) или на второй продукт стадии (d); (g) отправка или первого продукта стадии (b), или второго продукта стадии (d) участнику, разместившему заказ на стадии (f); (h) отслеживание данных, касающихся суммы денег, причитающихся от участника, которому отправлен продукт на стадии (g); (i) отправка счета участнику, которому отправлен продукт на стадии (g); (j) получение платежа за продукт, отправленный на стадии (g) (обычно, но не обязательно, платеж осуществляет участник, которому был отправлен продукт на стадии (g)); и (к) обмен технической информацией между организацией и участником, обладающим продуктом, отправленным на стадии (d) (обычно, участником, которому был отправлен продукт на стадии (g)).
Покупатель может изъявить желание купить один или множество различных типов ПМО. Согласно некоторым из вариантов реализации композиция, содержащая множество различных типов ПМО, изготавливается по требованиям покупателя (например, на основании информации, касающейся наличия одного или более типов целевых соединений, которые необходимо удалить/отделить). Преимуществом указанного варианта является то, что покупатель может приспособить конкретный продукт к своим потребностям (например, купить композицию, содержащую множество различных типов ПМО, специфичных для каждого из целевых соединений, а не покупать по отдельности композиции, содержащие только один тип ПМО, а затем применять каждую из указанных композиций в комбинации друг с другом).
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены способы, связанные с разработкой продуктов на заказ. Указанные способы включают, например, (1) получение заказа от заказчика на продукт со специфическими подкомпонентами и/или методику эксплуатации указанного продукта, (2) получение продукта со специфическими подкомпонентами и/или методики эксплуатации указанного продукта, (3) и предоставление (например, отправка) продукта (b) заказчику.
Экспериментальная часть
Следующие примеры представлены для демонстрации и дополнительной иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов реализации и аспектов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1
Синтез шаблона охратоксина А
Получение 2-ацетокси-3,5-дихлорбензойной кислоты. Круглодонную трехгорлую колбу объемом 1 л, снабженную механической мешалкой, термометром и капельной воронкой объемом 125 мл с выравниванием давления помещали на водяную баню, температуру которой поддерживали равной 65°С. Следующие реагенты последовательно вводили в колбу при эффективном перемешивании: 250 мл сухого толуола, 2,5 мл концентрированной серной кислоты и 207 г хорошо измельченной твердой 3,5-дихлор-салициловой кислоты, которая образовывала подвижную суспензию. Когда температура при постоянном перемешивании достигала 60°С (поддерживали температуру в водяной бане 65°С), начинали добавлять по каплям 108 г (100 мл) уксусного ангидрида, и завершали добавление в течение 30 мин. В процессе добавления уксусного ангидрида температуре реакционной смеси не позволяли превышать 75°С. После завершения добавления смесь перемешивали и нагревали до 70°С в течение еще 4 ч. После указанного времени перемешивание останавливали и охлаждали реакционную смесь в течение ночи до комнатной температуры. Белые кристаллы, отделенные от смеси, отфильтровывали, промывали 2 х 10 мл ледяного толуола и сушили в вакууме при 50°С, получая 206 г (выход 82,7%) 2-ацетокси-3,5-дихлорбензойной кислоты. Дополнительно 30,6 г продукта (выход 12,3%) выделяли путем концентрирования фильтрата до
Vi начального объема, охлаждения раствора на льдоводяной бане, отфильтровывания кристаллического продукта и сушки в вакууме при 50°С.
Получение in situ хлорида 2-ацетокси-3,5-дихлорбензойной кислоты и его применение для получения этилового эфира №(2-ацетокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланина (для безопасности персонала процесс проводили в вытяжном шкафу).
Систему для получения собирали из реактора объемом 3 л, снабженного эффективной механической мешалкой (Асе Glass Inc., Louisville, KY, cat#13650-12/23), капельной воронкой объемом 250 мл, обратным холодильником с осушительной трубкой, наполненной CaCl2, с выводом, присоединенным к поглотителю кислых паров, вводом сухого азота и термометром, помещенного на водяную баню с температурой 22°С. Один литр сухого толуола, 5 мл диметилформамида и 103 г 2-ацетокси-3,5-дихлор-бензойной кислоты помещали в реактор при перемешивании. По каплям добавляли к реакционной смеси 217 мл (1,05 экв.) 2М раствора оксалилхлорида в метилендихлориде при перемешивании в течение 2,5 ч. Поток смеси токсичных газов: HCl, СО и СО2, получаемый в реакции, поглощали в 1 л 10% раствора гид-роксида натрия, помещенного в ловушку, охлаждаемую водопроводной водой. После окончания добавления оксалилхлорида, сопровождавшегося полным растворением твердых веществ, пропускали сильный поток сухого азота через раствор в течение 1 ч для удаления большей части кислых газов (НС1, СО2), которые оставались растворенными в реакционной смеси. После указанного времени содержимое колбы охлаждали ниже 15°С на льдоводяной бане и добавляли к смеси 95 г (1,0 экв.) твердого этилового эфира L-фенилаланина гидрохлорида. Устанавливали новую капельную воронку объемом 500 мл вместо воронки объемом 250 мл, и наполняли воронку раствором 145 мл триэтиламина (2,55 экв.) в 350 мл толуола. Затем добавляли раствор триэтиламина в течение 2 ч в охлажденную на льдоводяной бане реакционную смесь при перемешивании. В процессе добавления температуру реакционной смеси поддерживали ниже 25°С. Указанную температуру поддерживали в течение 4 ч после окончания добавления три-этиламина, затем отфильтровывали гидрохлорид триэтиламина и промывали белый осадок на фильтре двумя порциями по 100 мл толуола. Затем фильтрат переносили в делительную воронку объемом 3 л и промывали двумя порциями по 500 мл воды и одной порцией 500 мл раствора соли. Затем толуольный слой концентрировали до объема 500 мл и оставляли в течение ночи в холодильнике для кристаллизации. Белые кристаллы собирали на фильтре и промывали один раз 100 мл ледяного толуола, получая 108,7 г (выход 62%) этилового эфира №(2-ацетокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланина.
1H ЯМР (дейтерированный хлороформ (сокращенно обозначаемый CDCl3), м.д.): 7,78 5, J=2,8, 1Н; 7,55 5, J=2,4, 1H; 7,30-7,27 м, 3Н; 7,11 ушир. 5, J 8,0, 1H; 7,08 5кв, J =8,0 и 1,6, 1H; 4,99 кв, J 6,0, 1Н; 4,24 кв, J =7,0, 2Н; 3,29 дд, J =5,6 и 14,4, 1H; 3,21 дд, J =9,2 и 14,0, 1H; 2,11 с, 3Н; 1,31 т, J=7,2, 3Н.
Получение №(3,5-дихлор-2-гидроксибензоил)^-фенилаланина (шаблон ОТА). Сто восемь грамм этилового эфира №(2-ацетокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланина растворяли в 1 л безводного этилового спирта и помещали в круглодонную колбу объемом 2 л, снабженную магнитной мешалкой и помещенную на водяную баню при комнатной температуре. В полученную смесь добавляли за один прием раствор 33,33 г гидроксида натрия в 37,2 мл воды, и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 17 ч (в течение ночи). Затем при перемешивании добавляли 68,6 мл концентрированной соляной кислоты, и продолжали перемешивание еще в течение 2 ч. Выпавший в осадок хлорид натрия отфильтровывали и выпаривали фильтрат досуха при 60°С и давлении 30 торр. Полученный остаток массой 88,9 г (выход 98%) затвердевал после охлаждения с образованием бесцветного стекловидного продукта, хорошо растворимого в толуоле или ацетонитриле, таким образом получали шаблон ОТА (например, для применения при получении ПМО-ОТА). МС: М+ 354 и 356 1H ЯМР (CDCl3, м.д.): 12,2 очень широкий с, 1H; 7,49 д, J =2,4, 1H; 7,35-7,28 м, 3Н; 7,20 д, J= 2,0, 1H; 7,18-7,16 м, 2Н; 6,80 уш. д, J =6,4, 1Н; 6,4 очень широкий с, 1Н; 5,07 дд, 5,2 и 5,2, 1Н; 3,34 дд, J=14,0 и 5,2, 1Н; 3,27 дд, J =13,6 и 5,2, 1H.
Пример 2
Синтез ПМО-ОТА в смеси толуол-циклогексан
Пятьсот миллилитров толуола, 35,42 г (0,1 М) шаблона ОТА, 16,18мл (0,15 М) 2-винилпиридина, 12,13 мл (0,1 М) 2-гидроксиэтилметакрилата, 235,75 мл (1,25 М) этиленгликоля диметакрилата и 2,46 г (15 мМ) азобисизобутиронитрила (АИБН) помещали в четырехгорлую колбу объемом 3 л, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, термометром и вводом/выводом азота. Полученный прозрачный раствор перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном токе азота, пропускаемом через сосуд (например, для удаления кислорода, который может ингибировать полимеризацию). Затем колбу нагревали до 60°С и интенсивно перемешивали смесь. Полимеризация происходила, когда температура раствора повышалась до ~55°С (например, наблюдали по увеличению вязкости раствора). Через пятьдесят мин от начала полимеризации добавляли за один прием 600 мл (1:1) смеси цик-логексан/толуол, чтобы способствовать отделению сферических частиц полимера от раствора. Продолжали энергичное перемешивание смеси и добавляли еще 500 мл толуола через 30 мин для улучшения общего перемешивания еще увеличивающегося объема суспензии твердого ПМО в относительно низком объеме растворителя. Поддерживали температуру 60°С и осуществляли перемешивание еще в течение 5 ч, после чего перемешивание останавливали, чтобы дать возможность осесть сферическим частицам
ПМО. Надосадочную жидкость декантировали и переносили гранулы в колбу ротационного испарителя объемом 2 л для удаления оставшихся растворителей из сферических частиц ПМО при температуре 40°С и пониженном давлении 30 торр. Высушенные сферические частицы измельчали приблизительно до размера 140 меш и промывали 5 раз путем перемешивания с 1,5 л 0,2% мас./об., раствора гидроксида натрия в течение 30 мин и декантации. Конечную порцию сферических частиц ПМО-ОТА смешивали с 1,5 л 0,5% об./об. раствора уксусной кислоты, который также декантировали, и 1,5 л деионизированной воды. Полученные не содержащие шаблона влажные сферы ПМО-ОТА (~1,0 л объемом) сушили в лабораторной печи при 80°С в течение 4 ч, на четырех стеклянных лотках. Полученный порошкообразный ПМО-ОТА весил 248 г (выход 93%). Различные образцы, показанные в табл. 1 ниже, синтезировали использованием описанного способа.
Для этой и последующих методик синтеза ингибиторы полимеризации удаляли и мономеров и сшивающих агентов путем вакуумной перегонки, перед применением дл полимеризации, а растворители, применяемые для полимеризации, имели чистоту соответствующую стандарту ACS. Концентрацию шаблона при последующих промывка получали путем сравнения интенсивности красно-оранжевой окраски комплекса шаблона Fe3+ при длине волны Xmax 385 нм по калибровочной кривой, построенной для концентрации шаблона от 10 мкг/мл до 1 мг/мл.
Таблица 1. Идентификация образцов, синтезированных в смеси толуол/циклогексан
Номер образца
Толуол-циклогексан (мл)
Последняя промывка
Морфология
523-29/30
45/15
Этанол
Сферы, белый порошок
523-31
65/15
Этанол
Сферы, белый порошок
523-34
65/35
Этанол/NaOH
Сферы, белый порошок
523-35
55/22
Эганол/Шз/НЬО
Белый порошок, сгустки
523-36
90/30
NaOH/H20
Белые сгустки
Пример 3
Синтез ПМО ОТА в ацетонитриле
Пятьсот миллилитров ацетонитрила, 17,71 г (50 мМ) шаблона ОТА, 8,1 мл (75 мМ) 2-винилпи-ридина, 6,1мл (50 мМ) 2-гидроксиэтилметакрилата, 117,9 мл (625 мМ) этиленгликоля диметакрилата и 1,23 г (15 мМ) АИБН помещали в четырехгорлую колбу объемом 3 л, снабженную механической мешалкой, капельной воронкой объемом 500 мл с выравниванием давления, термометром и вводом/выводом азота, и нагреваемую электрическим нагревательным кожухом. Полученный прозрачный раствор перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном токе азота, пропускаемом через сосуд (например, для удаления кислорода, который может ингибировать полимеризацию). Затем колбу нагревали до 60°С и интенсивно перемешивали смесь. Полимеризация происходила, когда температура раствора повышалась до ~55°С (например, наблюдали по увеличению вязкости раствора). Через тридцать мин после начала полимеризации (например, при наблюдаемом образовании геля) быстро добавляли 1,5 л ацетонитрила (предварительно нагретого до 55°С и продутого азотом для удаления кислорода), тремя частями по 500 мл через капельную воронку, чтобы избежать образования блока полимера и способствовать отделению полимерных сфер от раствора. Интенсивное перемешивание и нагревание смеси продолжали еще в течение 17 ч (в течение ночи). После этого нагревание и перемешивание отключали и позволяли сферам ПМО осесть. Надосадочную жидкость декантировали и переносили гранулы в колбу ротационного испарителя объемом 2 л для удаления оставшихся растворителей из сферических частиц ПМО при температуре 40°С и пониженном давлении 30 торр. Высушенные сферические частицы измельчали приблизительно до размера 140 меш и промывали 5 раз путем перемешивания с 1,5 л 0,2% масс/об, раствора гидроксида натрия в течение 30 мин и декантации. Конечную порцию сферических частиц ПМО-ОТА смешивали с 1,5 л 0,5% об./об. раствора уксусной кислоты, который также декантировали, и 1,5 л деионизированной воды. Полученные не содержащие шаблона влажные сферы ПМО-ОТА (~1,2 л объемом) сушили в лабораторной печи при 80°С в течение 6 ч, на четырех стеклянных лотках. Белый порошкообразный ПМО-ОТА массой 115 г (выход 86,2%). Различные образцы, показанные в табл. 2 ниже, синтезировали с применением описанного способа.
Пример 4
Крупномасштабный синтез ПМО-ОТА в толуоле
Синтез проводили в ректоре объемом 3 л с четырехгорлой крышкой, снабженном механической мешалкой с двумя пропеллерами, установленными на дне и на половине высоты, кожухом с электрическим подогревом, термометром, капельной воронкой объемом 1,5 л с выравниванием давления и вводом азота, и обратным холодильником, снабженным пузырьковым счетчиком для контроля тока азота. В реактор помещали следующие реагенты: 54,54 г (154 мМ) №(3,5-дихлор-2-гидроксибензоил)-Ь-фенил-аланина (шаблон ОТА), 25 мл (231 мМ) 2-винилпиридина, 18,7 мл (154,0 мМ) этиленгликоля монометак-рилата, 363 г (1,925 М) этиленгликоля диметакрилата, 770 мл толуола и 5,0 г (30,8 мМ) АИБН. Дополнительно 1,5 л толуола помещали в капельную воронку. Реакционную смесь интенсивно перемешивали и удаляли растворенный газ, пропуская сильный ток азота при комнатной температуре в течение 45 мин, вначале через толуол, помещенный в капельную воронку, а позднее через пустой объем реактора. Слабый ток азота поддерживали в течение всего времени полимеризации. Полимеризацию инициировали нагреванием реакционной смеси до 55°С. Через 15 мин вязкость реакционной смеси увеличивалась и перемешивание становилось менее эффективным. В этот момент вводили через капельную воронку дополнительный объем толуола (при комнатной температуре). Добавление производили достаточно быстро, чтобы предотвратить перегрев реакционной смеси по причине экзотермических свойств реакции, и поддерживать вязкость реакционной смеси достаточно низкой для возможности эффективного перемешивания во время образования и отделения сфер полимера. Температуру 60-70°С и перемешивание продолжали в течение следующих 5 ч, а затем оставляли смесь без перемешивания при комнатной температуре до следующего дня. Затем слой толуола объемом 1,75 л декантировали с частиц ПМО, смоченные толуолом частицы ПМО измельчали и переносили в колбу ротационного испарителя объемом 2,0 л. Отгоняли из сфер ПМО большую часть толуола (~0,45 л), захваченного внутри частиц ПМО, при слегка пониженном давлении и температуре ниже 70°С. В конце удаления толуола образующийся порошкообразный продукт проявлял тенденцию к образованию пыли. В этот момент выпаривание прекращали и частицы ПМО промывали 2 порциями этанола по 500 мл каждая. Затем с твердого вещества декантировали около 0,75 л этанола и выпаривали, получая 30 г (55%) регенерированного шаблона ОТА и 700 мл регенерированного этанола. Затем мелкодисперсное белое твердое вещество промывали 4 раза порциями по 0,5 л 0,2% мас./об. раствора NaOH, с последующей одной промывкой 500 мл 1% об./об. уксусной кислоты и одной порцией 500 мл ДИ воды, полученный "влажный" ПМО-ОТА затем сушили в течение 24 ч в лабораторной печи при 80°С. Получали белый порошкообразный продукт массой 411,4 г (выход 96,6%) и фракционировали с использованием стандартных сит. Описанную методику применяли для синтеза различных образцов, указанных в табл. 3. Подробные данные о распределении по размеру представлены в табл. 4.
Таблица 3. Идентификация образцов, синтезированных в толуоле или поливиниловом спирте
Пример 5
Полимеризация/синтез ПМО-ОТА и ИБО, инициируемая УФ при низкой температуре.
Установка для фотохимических реакций. Кварц, погружной фотохимический источник УФ (Асе Glass, Catalogue # 7856-10), снабженный УФ-лампой 450 Вт (АСЕ Glass, Catalogue #7825-34) и источником питания 450 Вт в корпусе (АСЕ Glass, Catalogue #7830-58), присоединенный к циркуляционному охладителю WKL 230 LAUDA (поставляемый Brinkmann Instuments, Inc.), и охлаждающей воде с температурой 4°С, протекающей сквозь кожух источника во время работы УФ-лампы.
Полимеризация (табл. 5). Мономеры, шаблон, инициатор (АИБН) и сшивающий агент помещали в прозрачную полиэтиленовую бутылку (Nalgene(r)style 2105) и пропускали через полученную смесь ток аргона в течение 15 мин для удаления всего кислорода, который, как известно, ингибирует свободнора
дикальную полимеризацию. Затем бутылку закрывали и присоединяли к погружному источнику, на уровне центра УФ-лампы, и вместе с установкой для фотохимической реакции погружали в льдоводяную баню. Через ко5жух лампы пропускали охлаждающую воду, затем включали свет и производили облучение реакционной смеси в течение четырех часов (необходимы очки, защищающие от УФ, в течение всего времени работы УФ-лампы). Добавляли дополнительный лед и сливали избыток воды из бани в течение всей УФ-полимеризации, для поддержания температуры охлаждающей бани 4°С. После завершения полимеризации бутылку открывали, полимер разбивали и измельчали на мелкие кусочки, которые промывали: один раз этанолом, десять раз 0,2% раствором гидроксида натрия, один раз 1% раствором уксусной кислоты и три раза этанолом, для удаления шаблона из полимера и обеспечения максимальной активности ПМО, который в конце сушили в лабораторной печи для удаления остатков этанола. Выходы ПМО-ОТА составляли 56,7 и 49% соответственно для #555-54А и 555-54В.
Таблица 5. Идентификация образцов ПМО-ОТА, синтезированных с использованием
Пример 6
Секвестрационная способность ПМО в отношении микотоксинов - применительно к ОТА
Полимеры ПМО, полученные в толуоле-циклогексане, ацетонитриле или толуоле, испытывали в отношении к микотоксину OTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, USA) для удаления микотоксина ОТА из жидкой или полужидкой среды посредством химического взаимодействия. Полученные ПМО применяли, чтобы показать различия в аффинности секвестрации микотоксина ОТА и чтобы оценить специфичность материала. ПМО в количестве 12,5 г помещали в устройство для ультрацентрифужного фильтрования Amicon (5000 Да). Препарат готовили совместно с нулевым образцом, не содержащим материала ПМО, и с положительным контролем, содержащим только тестируемый токсин ОТА. Испытание секвестрации проводили в цитратном буферном растворе 50 мМ, доведенном до рН 4,0. Все образцы инкубировали в течение 90 мин в орбитальном ротационном шейкере (Brunswick, Champaign, IL, USA) при 150 об/мин, температуру поддерживали 37°С. В системе испытывали три конечных концентрации ОТА, 50, 100, 250 частей на миллиард (млрд-1) в конечном объеме 12,5 мл. После инкубирования микроцентрифужные пробирки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость собирали в силанизированные виалы для ВЭЖХ из желтого стекла, предохраняя от любого взаимодействия микотоксина с виалой, и рассчитывали по данным ВЭЖХ (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) в сочетании сигналов флуориметрического и диодно-матричного детекторов (например, для детектирования количества микотоксина и секвестрированного микотоксина) согласно стандартным способам (см., например, Entwisle A.C., Williams А.С., Mann P.J., Slack P.T., Gilbert J., 1995. Liquid chromatography method with immunoaffinity column cleanup for determination of ochratoxin A in barley: Collaborative study. Journal of АО AC, 83: 1377-1383).
Результаты (см. табл. 5) показали, что оба полимера, ПМО, полученный с шаблоном ОТА, и без шаблона (ПБО - полимер без отпечатков) в концентрации 1,00 г/л имели очень высокое сродство к молекуле микотоксина ОТА при рН 4,0. Согласно способу получения, ПМО, полученный после полимеризации осаждением (обозначенный как # 523-31 синтезированный в толуоле, # 523-34, -35, -36 синтезированные в смеси толуол-циклогексан; и # 523-48 синтезированный в смеси толуол-ацетонитрил) имели эффективность секвестрации выше 98,8%, тогда как ПМО, полученный после эмульсионной полимеризации (обозначенный как # 523-40 и -41 синтезированные в воде и поливиниловом спирте; и 49 синтезированный в ацетонитриле) имели более низкую аффинность, ниже 63%. Молекула ПБО также способна взаимодействовать с эффективностью секвестрации 98,8%. На указанной стадии группа полимеризации осаждением не показала статистических различий между ПБО и ПМО, тогда как группа эмульсионной полимеризации показала значительные различия между ПМО и ПБО, а также между ПМО.
Две последовательных стадии промывки 15% этанолом/гидроксидом натрия, 1% раствором уксусной кислоты, применяли для оценки способности двух групп ПМО предотвращать взаимодействие и для оценки силы секвестрации (см. табл. 6). Группа эмульсионной полимеризации показала сильное выделение ОТА из ПМО, а также выделение оставшегося шаблона OTA, элюируемого вместе с микотоксином ОТА, согласно отрицательному проценту поглощения. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложено, что методика эмульсионной полимеризации не подходит для создания эффективного адсорбента молекул ОТА. Согласно настоящему изобретению также предложено, что группа полимеризации осаждением имеет значительно более высокую аффинность к ОТА, позволяя максимально десор-бироваться только 26,3% молекул ОТА из ПМО, синтезированного в смеси толуола-ацетонитрила, без какого-либо взаимодействия с оставшимся шаблоном.
Пример 7
Титрование количества ПМО для секвестрации охратоксина А
Опыт по титрованию проводили для изучения отношений включения ПМО, от 0,01 г/л до 1,00 г/л (или от 0,001 до 0,1% отношения включения). Препарат готовили совместно с нулевым образцом, не содержащим ПМО, и положительным контролем, содержащим только исследуемый токсин ОТА. Испытание на секвестрацию проводили в цитратном буферном растворе 50 мМ, доведенном до рН 4,0. Все образцы инкубировали в течение 90 мин на орбитальном ротационном шейкере (Brunswick, Champaign, IL, USA) при 150 об/мин, температуру поддерживали 37°С. В системе испытывали три конечных концентрации ОТА, 50, 100, 250 частей на миллиард (млрд-1) в конечном объеме 12,5 мл. После инкубирования микроцентрифужные пробирки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость собирали в силанизированные виалы для ВЭЖХ из желтого стекла, предохраняя от любого взаимодействия микотоксина с виалой, и рассчитывали по данным ВЭЖХ (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) в сочетании сигналов флуориметрического и диодно-матричного детекторов (например, для детектирования количества микотоксина и секвестрированного микотоксина) согласно стандартным способам (см., например, Entwisle et al., 2000 как указано ранее).
Как показано на фиг. 3, при 0,05 г/л оптимальная эффективность была выше 80% величины секвестрации и достигала в среднем 86,4 + 1,5% секвестрации. Влияние уровня включения соединений ПМО оценивали, изучая секвестрационую активность для 0,010, 0,025, 0,050, 0,075, 0,100, 0,50 и 1,00 г/л ПМО #523-34 (синтезированного в смеси толуол-циклогексан) и #523-60 (синтезированного в ацетонитриле) в отношении 50, 100, 200 млрд-1 ОТА в условиях кислотного буферного раствора (рН 4,0). Размер частиц ПМО составлял от 45 до 106 мкм, поскольку указанная фракция показала наилучший результат секвест-рирования и представлена наибольшей долей размеров частиц в сумме синтезированного продукта ПМО.
Каждый ПМО, #523-34 и #523-60, был способен адсорбировать 91,53 + 10,86 и 81.75 + 23,67% ОТА, соответственно, как среднее по всему секвестрированию независимо от уровня включения. Точка отклонения была обнаружена на секвестрационной кривой для уровней включения ПМО 0,05 и 0,10 г/л соответственно для образцов #523-34 и #523-60. Среднее сродство секвестрации для включения от 0,05 до 1,00 и от 0,10 до 1,00 г/л для #523-34 составляло 96,31 +2,23 и 97,39 +0,70% соответственно. Среднее сродство секвестрации для включения от 0,05 до 1,00 г/л и от 0,10 до 1,00 г/л для #523-60 составляло 94,51 + 6,54 и 97.76 + 0,91% соответственно. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложено, что ПМО, синтезированный в смеси толуол-циклогексан был предпочтительным из-за высокого уровня аффинности при секвестрации ОТА для включения 0,01 г/л с отношением аффинности 72,42 + 2,58%, тогда как образец, полученный в ацетонитриле, был менее эффективен с отношением аффинности 47,40 + 6,08 и 84,77 + 1,96 соответственно при включении продукта 0,01 и 0,05 г/л.
Пример 8
Аффинность различных ПМО и ИБО и характеристика специфичности к охратоксину А При разработке вариантов реализации настоящего изобретения проводили эксперименты для оценки аффинности различных ПМО/ПБО, синтезированных в ацетонитриле или в толуоле, в качестве растворителей для полимеризации. Образцы #523-31 (толуол) и #523-59 (ацетонитрил) синтезировали без какого-либо шаблона ОТА (определены как полимер без отпечатков), а образцы #523-34 (смесь толуол-циклогексан) и #523-60 (ацетонитрил) полимеризовали на шаблоне-аналоге ОТА. Затем образцы просеивали с использованием сит с различной границей пропускания по размеру. Испытанные диапазоны размеров частиц были описаны в примере 4. Получение ПМО в основном приводило к получению частиц размером примерно от 45 до 106 мкм в диаметре (как показано на фиг. 4). Препарат готовили совместно с нулевым образцом, не содержащим материала ПМО, и положительным контролем, содержащим только исследуемый токсин ОТА. Испытание на секвестрацию проводили в цитратном буферном растворе 50 мМ, доведенном до рН 4,0. Все образцы инкубировали в течение 90 мин в орбитальном ротационном шейкере (Brunswick, Champaign, IL, USA) при 150 об/мин, температуру поддерживали 37°С. В системе испытывали три конечных концентрации ОТА, 50, 100, 250 частей на миллиард (млрд-1) в конечном объеме 12,5 мл. После инкубирования микроцентрифужные пробирки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость собирали в силанизированные виалы для ВЭЖХ из желтого
стекла, предохраняя от любого взаимодействия микотоксина с виалой, и рассчитывали по данным ВЭЖХ (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) в сочетании сигналов флуориметрического и диодно-матричного детекторов (например, для детектирования количества микотоксина и секвестрированного микотоксина).
Сравнение аффинности к ОТА показало только ограниченные различия в одном акте секвестрации без последующих стадий промывки при трех различных концентрациях токсина (50, 100, 250 млрд-1). Только образец #523-59, изготовленный из ПБО без просеивания, показал более низкие секвестрацион-ные способности при любых рН и концентрации ОТА. Более низкие значения секвестрации были также обнаружены для образца ПМО #523-34 при концентрации ОТА 50 млрд-1, особенно для размеров частиц от 20 до 45, и в меньшей степени от 45 до 106 мкм в диаметре. Так, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложено, что размер частиц ПМО, полученного в соответствии со способами согласно настоящему изобретению оказывает малое влияние на общую аффинность адсорбента к ОТА, при этом аффинность колеблется, в худшем случае, от 78 до 99% долей секвестрации. ПБО имеют меньшую эффективность по своим секвестрационным свойствам, чем ПМО, принимая во внимание специфичность ПМО к взаимодействиям с микотоксином ОТА.
Пример 9
Извлечение введенного в вино ОТА с использованием ПМО и прямая фильтрация введенного охра-токсина А в вине с применением фильтрующего устройства с ПМО наподобие твердофазной экстракции
(ТФЭ)
Испытывали стандартную методику экстракции образца белого вина (Chardonnay 2005 - California) с использованием иммуноаффинной колонки. Экстракцию проводили как в чистом образце вина, так и при введении в образец вина 5, 10, 20 млрд-1 чистого кристаллического ОТА. Средняя начальная концентрация ОТА в вине составляла 1,676 + 0,269 млрд-1 (например, при определении по стандартной методике экстракции). Извлечение введенного образца 5 млрд-1 составляло 100%, и около 77,7% для 10 млрд-1.
Препарат готовили совместно с нулевым образцом, не содержащим материала ПМО, и положительным контролем, содержащим только исследуемый токсин ОТА. Испытание на секвестрацию проводили в цитратном буферном растворе 50 мМ, доведенном до рН 4,0. Все образцы инкубировали в течение 90 мин в орбитальном ротационном шейкере (Brunswick, Champaign, IL, USA) при 150 об/мин, температуру поддерживали 37°С. В системе испытывали три конечных концентрации ОТА, 50, 100, 250 частей на миллиард (млрд-1) в конечном объеме 12,5 мл. После инкубирования микроцентрифужные пробирки центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость собирали в сила-низированные виалы для ВЭЖХ из желтого стекла, предохраняя от любого взаимодействия микотоксина с виалой, и рассчитывали по данным ВЭЖХ (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) в сочетании сигналов флуориметрического и диодно-матричного детекторов (например, для детектирования количества микотоксина и секвестрированного микотоксина).
Секвестрацию ОТА из вина оценивали по стандартной методике секвестрации микотоксина на изначально наиболее производительном ПМО #523-34 (смесь фенол-циклогексан). Секвестрация варьировала в среднем от 43,29 +4,08 до 67,15 +4,94 до 91,75 + 1,59 до 95,612 + 1,201% для уровня включения 0,05, 0,10, 0,50 и 1,00 г/л соответственно. Титрованием ПМО определили оптимальную аффинность при применении уровня включения 0,5 и 1,0 мг/мл (см. фиг. 5).
Так, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены композиции и способы применения указанных композиций для захвата/адсорбции микотоксинов (например, ОТА) из вина (например, частицами ПМО, которые применяют (например, при встряхивании) для эффективного связывания и адсорбции микотоксинов из вина).
Например, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены ПМО (например, полученные в соответствии со способами согласно настоящему описанию) для захвата и/или адсорбции микотоксинов (например, одного или множества различных типов микотоксинов (например, присутствующих в жидких средах или экстракционном растворе из сложной матрицы (например, корма, пищи, растения, животного и т.д.))).
Фильтрующие устройства наподобие устройств твердофазной экстракции (ТФЭ-подобные) изготавливали для эквивалента включения ПМО 0,1 г/л. Требовались виалы из силанизированного стекла, чтобы обеспечить стабильность ОТА в водных растворителях и предотвратить любое неспецифическое взаимодействие между ОТА и стеклянными виалами. Способ силанизирования, который применяли к нейлоновым и ПТФЭ/ПЭ фильтрам и трубкам, основан на способах, обычно применяемых в данной области техники (см., например, Entwisle et al., 2000, как указано ранее). Виалы и фильтры готовили, наполняя или погружая в силанизирующий реагент (SURFASIL). Через 1 мин их промывали один раз толуолом, а затем дважды метанолом, с последующей трехкратной промывкой водой, и сушили. Проводили силанизацию и получали значительное уменьшение взаимодействия материала с молекулами ОТА при осуществлении на практике. Например, наблюдали менее 5% влияния (например, по сравнению с примерно 16-26% влияния без предварительной силанизации материалов при использовании фильтров ПЭ/ПТФЭ). Нейлон не подходил для силанизации. Все полипропиленовые трубки заменяли стеклянны
ми силанизированными трубками.
Создавали ТФЭ-подобные фильтрующие устройства для захвата ОТА из вина после прямой фильтрации образца через колонку. Эффективность ПМО испытывали то устранению ОТА из вина (Chardon-nay 2005 - California) с введенным 5 и 10 млрд-1 ОТА. Полученные результаты показали для 5 и 10 млрд-1 введенного ОТА 55,41 + 5,542 и 56,937 + 5,739% немедленного уменьшения содержания ОТА в вине, соответственно. Следовательно, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены специфичные к микотоксинам ПМО (например, полученные в соответствии со способами согласно настоящему описанию), которые применяют в ТФЭ или ТФЭ-подобных фильтрующих устройствах для удаления микотоксинов из жидкости (например, вина), содержащей микотоксины.
Пример 10
Извлечение охратоксина А с применением ТФЭ-подобных фильтрующих устройств, содержащих ПМО, полученные при термическом инициировании и при низкотемпературном УФ-инициировании, и оценка селективности к основным составляющим вина
Фильтрующие устройства наподобие твердофазной экстракции (ТФЭ-подобные) изготавливали для эквивалента включения ПМО 0,1 г/л. Требовались виалы из силанизированного стекла чтобы обеспечить стабильность ОТА в водных растворителях и предотвратить любое неспецифическое взаимодействие между ОТА и стеклянными виалами. Способ силанизирования, который применяли к нейлоновым и ПТФЭ/ПЭ фильтрам и трубкам, основан на способах, обычно применяемых в данной области техники (см., например, Entwisle et al., 2000, как указано ранее). Виалы и фильтры готовили, наполняя или погружая в силанизирующий реагент (SURFASIL). Через 1 мин их промывали один раз толуолом, а затем дважды метанолом, с последующей трехкратной промывкой водой, и сушили. Проводили силанизацию и получали значительное уменьшение взаимодействия материала с молекулами ОТА при осуществлении на практике. Например, наблюдали менее 5% влияния (например, по сравнению с примерно 16-26% влияния без предварительной силанизации материалов при использовании фильтров ПЭ/ПТФЭ). Нейлон не подходил для силанизации. Все полипропиленовые трубки заменяли стеклянными силанизированными трубками.
Исходные растворы двенадцати соединений, включая полифенолы: кофейную кислоту (Caf А), ка-техина гидрат (СН), эпикатехин (ЕСН), феруловую ксилоту (Fer), транс-3-гидроксикоричную кислоту (3-НСА), 2-гидроксикоричноую кислоту (2-НСА), малвидин-3-галактозид хлорид (Mal), мирицетин (Myr), кверцетина дегидрат (QH), транс-ресвератрол (Res), рутин тригидрат (Rut) и индол-3-уксусную кислоту (IAA) (Sigma, St Louis, МО, USA), готовили путем растворения в метаноле (качества для ВЭЖХ) и добавления воды и 85% ортофосфорной кислоты для понижения рН примерно до 3,0. Надосадочную жидкость собирали в силанизированные виалы для ВЭЖХ из желтого стекла, предотвращая любое взаимодействие аналита с виалой, и рассчитывали по данным ВЭЖХ (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) в сочетании сигналов флуориметрического и диодно-матричного детекторов (например, для детектирования количества микотоксина и секвестрированного микотоксина). Применяли колонку С18 для обра-щенно-фазовой ВЭЖХ Spherisorb ODS 5 мкм, 4,6 мкм х 250 мм (Waters Corp., Milford, MA, USA), термо-статируемую при 30°C. Длины волн возбуждения и испускания устанавливали 225 и 365 нм соответственно. Диодно-матричный детектор УФ-видимого света устанавливали в режим полного сканирования на длинах волн от 210 до 799 нм. Подвижные фазы состояли из воды/фосфорной кислоты (99,5%:0,5% об./об.) и (В) ацетонитрила (качество для ВЭЖХ)/воды/фосфорной кислоты (50%/49,5%/0,5% об./об./об.).
Все ПМО показали хорошую адсорбцию ОТА в буферном растворе, во всех случаях адсорбция была выше 80%. ПМО 555-52 показал наилучшую адсорбцию, близкую к 100%. Интересно, что ОТА оставался адсорбированным во время промывок всех ПМО буферным раствором, но десорбировался в процессе промывки метанолом, особенно из ПМО, полученных термическим инициированием #555-52 и #523-34 и значительно при наивысшей концентрации ОТА. ОТА остается адсорбированным в ПМО, полученных УФ-инициированием при низкой температуре #555-54А и #555-54В при метанольной промывке, в большей степени, чем в термически инициированных ПМО, при этом в среднем сохраняется более 50% адсорбции в ПМО, инициированных УФ при низкой температуре, во время метанольной промывки (см. фиг. 6).
Польза антиоксидантных полифенольных соединений вина для здоровья хорошо подтверждена документально. В стратегии фильтрации микотоксина из жидкости (например, вина), такого как ОТА, также фундаментальным является оценить воздействие секвестрирующего материала на некоторые полезные соединения, такие как полифенолы. Согласно некоторым из вариантов реализации и как документально подтверждено в настоящем описании (см., например, с примера 6 по пример 9), ПМО, полученные путем термически инициированной полимеризации #555-52 и #523-34 были способны эффективно взаимодействовать с микотоксином ОТА, присутствующим в жидкой среде, с уровнями адсорбции выше 95%, тогда как ПМО, полученные путем полимеризации, инициируемой УФ при низкой температуре #555-54 и #555-54Х давали эффективность адсорбции в диапазоне от 80 до 92% от эффективности секвестрации (фиг. 6).
Согласно некоторым из вариантов реализации композиции согласно настоящему изобретению, со
держащие ПМО, полученные путем полимеризации, инициируемой УФ при низкой температуре, показали специфичность к ОТА при оценке в смеси с различными полифенолами, антоцианином и индол-3-уксусной кислотой. В данном случае ПМО #555-54А и #555-54В показали высокую адсорбцию ОТА (выше 80%) и в тоже самое время не производили адсорбцию полифенолов или индол-3-уксусной кислоты (например, что сохраняло органолептические и антиоксидантные характеристики (например, вина)). При исследовании ПМО, полученных путем полимеризации, инициируемой УФ при низкой температуре, время инкубации устраняли, и пропускали образцы вина и промывные жидкости через ПМО или фильтр немедленно. Наблюдалась очень малая адсорбция (фиг. 7). Так, согласно некоторым из вариантов реализации настоящего изобретения предложены ПМО, показывающие специфичность к микотоксину (например, ОТА), и одновременно показывающие малое или отсутствие связывания (например, адсорбции) полезных соединений (например, полифенолов и/или индол-3-уксусной кислоты). Количественное определение мирицетина, ресвератрола и рутина подтвердило недостоверность из-за их присутствия в очень низких концентрациях, близких к пределу обнаружения и пределу количественного определения аналитического инструмента ВЭЖХ, что приводило к большим стандартным отклонениям и отрицательным значениям. Согласно настоящему варианту реализации ПМО, полученные путем полимеризации, инициируемой УФ при низкой температуре, были эффективны при захвате ОТА, и не влияли на содержание полифенолов в жидкой среде вина, демонстрируя специфичность полученного материала ПМО. Пример 11
Нанесение покрытия ПМО на сетку из стекловолокна для применения в качестве фильтрующего устройства
При разработке вариантов реализации настоящего изобретения проводили эксперименты по испытанию нанесения покрытия ПМО-ОТА на сетку из стекловолокна (см. фиг. 8). Применяли различные концентрации ОТА для определения аффинности каждого препарата. Различные изготовленные ПМО показаны в табл. 7 ниже. Три сита из сетки покрывали ПМО при различных концентрациях сшивающего агента, что влияло на хрупкость (растворы мономеров 1, 2, 3 и 1 Н). Сетку, полученную при нанесении покрытия ПМО, нарезали исходя из массы до и после нанесения покрытия ПМО, чтобы получить 50, 100 и 200 мг ПМО по результатам взвешивания по разности. Испытания на секвестрацию проводили при погружении сеток, покрытых ПМО, в пробирки типа "Фалькон" объемом 20 мл, с определением секвест-рационных характеристик к ОТА в винной среде после 90 мин инкубирования в ротационном шейкере. В 1 мл из пробирки, содержащей винный раствор, вносили три различные концентрации ОТА, которые измеряли до и после инкубирования с фильтрующими сетками ПМО-ОТА. Образцы собирали в силани-зированные виалы для ВЭЖХ из желтого стекла, предохраняя от любого взаимодействия микотоксина с виалой, и рассчитывали по данным ВЭЖХ (Alliance, Waters Corp., Milford, MA, USA) в сочетании сигналов флуориметрического и диодно-матричного детекторов (например, для детектирования количества микотоксина и секвестрированного микотоксина). Таблица 7. Описание условий полимеризации для нанесения покрытия ПМО на сетку из стекловолокна
Параметры
Функция
Раствор мономера
Аналог охратоксина А (мг)
Шаблон
1000
S00
250
1000
2-винил пиридин (мкл)
Основание, образующее соль с ОТА
1000
500
250
1000
Этиленгликолядиметакрилат (мл)
Сшивающий агент
2-гидроксиэтилметакрилат |мкл)
Связывающая молекула
S00
400
200
800
Азобисизобутиронитрил (мг)
Инициатор полимеризации
Отверждение (печь)
Д\пя сушки сетки
65 °С
65 °С
65 °С
80-90 °С
Растворитель
Растворение твердых веществ
Нет
Нет
Нет
500 мкл толуола
Полученные результаты показывают, что максимальная секвестрация ОТА зависит от уровня включения ПМО. Максимум секвестрации был получен с 500 мг шаблона, 250 мг винилпиридина и 200 мг гидроксиэтилметакрилата, при этом был получен ПМО, адсорбирующий до 46,5% ОТА при концентрации 100 млрд-1 в вине (см. фиг. 9). Напротив, тот же эксперимент, проведенный с полученным таким же способом ПБО, нанесенным на сетку из стекловолокна, показал менее 15% секвестрации (до 1%) от эффективности секвестрации в зависимости от методики получения (см. фиг. 10), таким образом, показав пример специфичности материала ПМО-ОТА к ОТА.
Пример 12
Хроматографическая емкость удержания ПМО
ПМО #523-34 (синтезированный в смеси толуол-циклогексан) применяли в качестве неподвижной фазы в колонке ВЭЖХ 4,6 х 150 мм после набивки материала с использованием ультразвукового воздействия на водяной бане, а затем применяя в течение ночи непрерывное пропускание ацетонитрила через колонку с расходом 5,0 мл/мин (ПМО с использованием двойного насоса для ВЭЖХ Waters Alliance (Waters Corp, Milford, MA, USA)). Определили, что давление в колонке составляет около 400 фунт/кв. дюйм, что сравнимо с другими условиями ВЭЖХ, описанными в других работах (см., например, Baggiani et al.,
2002 as previously cited; Jodlbauer I., Maier N.M., and Lindner W. Journal of Chromatography A, 945: 45-63; Maier N.M., Buttinger G., Welhartizki S., Gavioli E., Lindner W., 2004. Journal of Chromatography B, 804: 103-11). Колонку стабилизировали при расходе ацетонитрила 1,0 мл/мин в течение 48 ч и сильно промывали метанолом 99% и триэтиламином 1% для удаления из колонки оставшегося шаблона ОТА. Проводили определение характеристик ОТА методом фронтального анализа ВЭЖХ-ДМД-ПИД с применением колонки ПМО.
Долговечность колонки оценивали в условиях различных подвижных фаз и при различных параметрах градиентного потока через колонку, поддерживаемую при постоянной температуре 30 °С. Испытывали несколько градиентов, включая переход от 100% воды к 100% ацетонитрила или 100% метанола и обратно; а также от 1% триэтиламина в метаноле к 100% метанола в течение 60 мин. Колонка сохранялась без каких-либо изменений в неподвижной фазе после повышения давления до 1600 фунт/кв. дюйм, что показывало долговечность колонки при высоких давлениях. Для оценки свободного объема колонки применяли инъекцию ацетона с элюированием анализируемого вещества в течение 2 мин. Элюирование ОТА оценивали в тех же условиях, применяемых для обычного профиля элюирования ODS C18 (85% ацетонитрила). Удержание ОТА оценивали через 5 мин на колонке ПМО с использованием изократиче-ского градиента. Для увеличения времени удержания ОТА обеспечивали градиент, который позволял увеличить время удержания ОТА до 19,5 мин.
Окончательные выбранные условия приведены на фиг. 11, а условия градиента подробно указаны в связанной табл. Наблюдали два пика, первичный пик элюирования ОТА между 17 и 22 мин (при 63% ацетонитрила) и второй пик, связанный с высвобождением фракции оставшегося сильно связанного ОТА при добавлении в колонку 1% триэтиламина.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полимер с молекулярными отпечатками, синтезированный с применением микотоксинового шаблона, представляющего собой ^(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланин.
2. Полимер по п.1, отличающийся тем, что указанный полимер с молекулярными отпечатками получен путем обеспечения №(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланинового шаблона и одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов и приведения указанного шаблона в контакт с указанным одним или более мономерами и указанным одним или более сшивающими агентами в условиях, обеспечивающих возможность полимеризации указанного одного или более мономеров и указанного одного или более сшивающих агентов в присутствии шаблона.
3. Полимер по п.2, отличающийся тем, что указанные один или более мономеров выбраны из группы, состоящей из 2-винилпиридина, 2-гидроксиэтилметакрилата и метакриловой кислоты.
4. Полимер по п.2, отличающийся тем, что указанные один или более сшивающих агентов включают этиленгликоля диметакрилат.
5. Способ получения полимера с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4, включающий:
a) обеспечение:
i) №(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланинового шаблона и
ii) одного или более мономеров и одного или более сшивающих агентов;
b) приведение указанного №(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланинового шаблона в контакт с указанным одним или более мономерами и указанным одним или более сшивающими агентами в условиях, обеспечивающих возможность полимеризации указанного одного или более мономеров и указанного одного или более сшивающих агентов в присутствии указанного №(2-гидрокси-3,5-дихлорбензоил)^-фенилаланинового шаблона.
6. Способ секвестрации микотоксина из материала, включающий:
a) обеспечение:
i) материала, содержащего микотоксины; и
ii) композиции, содержащей полимер с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4; и
b) приведение указанной композиции, содержащей полимер с молекулярными отпечатками, в контакт с указанным материалом, содержащим микотоксины, в условиях, обеспечивающих возможность связывания указанного полимера с молекулярными отпечатками с указанным микотоксином.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный способ обеспечивает секвестрацию охратокси-на А из указанного материала.
8. Применение полимера с молекулярными отпечатками по любому из пп.1-4 для секвестрации ми-котоксина из материала.
9. Применение по п.8, отличающееся тем, что указанный материал, содержащий микотоксины, выбран из группы, состоящей из напитка, пищевого продукта, корма для животных, фармацевтической композиции, нутрицевтической композиции, косметической композиции.
7.
о=\ н о он он
Шаблон
Охратоксин А
Фиг. 1
Q У
о СГ > р"**г
CI о о^^
NH,
NEt3 PhMe
.ОН
Шаблон Охратоксина А(1) Фенилаланинабензамидадиэфир (II)
•с о
БЛОК I IМО
Начальная адсорбция
Стирольный ПМО
Винилпиридиновый ПМО
Полифенолы
Фиг. 7
0 00 5 00
10 00 15 00 20 00
25 00 30 00 35 00 40 00
45 00 50 00
55 00 60 00
Бремя
Рэсдад
1 % тетраэти л аммоний в метаноле
Ацетон игр и п
Н20
2 3 4 5 6 7 S
0,01
го.оо
40,00 41,00 50,00 50,00 61,00 52,00
1,00 1,00 1.00 1,00 1.00 1,00 1,00 0,10
0.0
0,0
0,0 100,0 100,0
0,0
0.0
0,0
0.0 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0.0 0,0
100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0
Фиг. 11
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
024530
- 1 -
024530
- 1 -
024530
- 1 -
024530
- 1 -
024530
- 4 -
024530
- 31 -
024530
- 31 -
024530
- 31 -
024530
- 31 -
024530
- 31 -
024530
- 31 -
024530
- 32 -
024530
- 32 -
024530
- 32 -
024530
- 33 -