|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Применение 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-НАА) для лечения гиперлипидемии или профилактики сердечно-сосудистых осложнений гиперлипидемии. 2. Применение по п.1, где указанную гиперлипидемию выбирают из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии и комбинированной (формы) гиперлипидемии. 3. Применение по п.1 или 2, где указанная гиперлипидемия ассоциирована с низким уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме. 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является образование атеросклеротических бляшек. 5. Применение по любому из пп.1-3, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является клиническая манифестация образования атеросклеротических бляшек, указанную клиническую манифестацию выбирают из инфаркта миокарда и/или сердечной недостаточности. 6. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики стенокардии. 7. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики ишемического инсульта и/или транзиторных ишемических атак. 8. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики периферической ишемии, гангрены, поражения почек, аневризмы аорты и/или критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом. 9. Применение по п.1 или 2, где осложнением гиперлипидемии являются ксантомы.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Применение 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-НАА) для лечения гиперлипидемии или профилактики сердечно-сосудистых осложнений гиперлипидемии. 2. Применение по п.1, где указанную гиперлипидемию выбирают из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии и комбинированной (формы) гиперлипидемии. 3. Применение по п.1 или 2, где указанная гиперлипидемия ассоциирована с низким уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме. 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является образование атеросклеротических бляшек. 5. Применение по любому из пп.1-3, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является клиническая манифестация образования атеросклеротических бляшек, указанную клиническую манифестацию выбирают из инфаркта миокарда и/или сердечной недостаточности. 6. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики стенокардии. 7. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики ишемического инсульта и/или транзиторных ишемических атак. 8. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики периферической ишемии, гангрены, поражения почек, аневризмы аорты и/или критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом. 9. Применение по п.1 или 2, где осложнением гиперлипидемии являются ксантомы.
(19)
Евразийское
патентное
ведомство
023954
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201490380
(22) Дата подачи заявки
2012.07.13
(51) Int. Cl.
A61K31/196 (2006.01) A61P3/06 (2006.01)
(54) ТЕРАПИЯ 3-ГИДРОКСИАНТРАНИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ (3-HAA) ДЛЯ
ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ И ЕЕ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ
(31) SE 1150728-2
(32) 2011.07.29
(33) SE
(43) 2014.06.30
(86) PCT/SE2012/050835
(87) WO 2013/019156 2013.02.07
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ХАНССОН ЙЕРАН К (SE)
(72) Изобретатель:
Ханссон Йеран К, Кетельхутх Даниэль (SE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(56) Zhang, Lei et al. "The tryptophan metabolite 3-hydroxyanthranlic acid lowers plasma lipids and decreases atherosclerosis in hypercholesterolaemic mice" European Heart Journal (2012) 33, 2025-2034 (published online 18 June 2012); whole document; abstract
Pawlak, Krystyna et al. "3-hydroxyanthranilic acid is independently associated with monocyte chemoattractant protein-1 (CCL2) and macrophage inflammatory protein 1-beta (CCL4) in patients with chronic kidney disease" Clinical Biochemistry (2010), 43, 1101-1106; page 1103, column 2 - page 1105, column 2
Allegri Graziella et al. "Tryptophan metabolism along the kynurenine pathway in diet-induced and genetic hypercholesterolemic rabbits" Clinica Chimica Acta (2004), 350, 41-49; whole document; abstract; page 47, column 2, line 13 - line 25; page 47, column 2, line 36 - page 48, column 1, line 23
Ragazzi Eugenio et al. "Enzyme activities along the tryptophan-nicotinic acid pathway in alloxan diabetic rabbits" Biochimica et Biophysica Acta (2002), 1571, 9-17; abstract
Rudzite, V. et al.; "Changes in membrane fluidity induced by thryptophan and its metabolites" Advances in experimental medicine and biology (1999), 467(Tryptophan, Serotonin and Melatonin), 353-367; whole document; abstract; page 355, line 16 - line 23; page 364, line 3 - line 22
Thomas, Shane R.; Stocker, Roland; "Antioxidant activities and redox regulation of interferon-gamma-induced tryptophan metabolism in human monocytes and macrophages" Advances in experimental medicine and biology (1999), 467(Tryptophan, Serotonin and Melatonin), 541-552; whole document; abstract
Darlington, L Gail et al. "On the biological importance of the 3-hydroxyanthranilic acid:anthranilic acid ratio" International Journal of Tryptophan Research (2010), 3, 51-59; whole document; abstract
Brouns, Raf. et al." The role of tryptophan catabolism along the kynurenine pathway in acute ischemic stroke" Neurochemical Research (2010), 35(9), 1315-1322; whole document; abstract; page 1320, column 2 - page 1321, column 2
Gregory Giles I. et al.; "Electrochemical and in vitro evaluation of the redox-properties of kynurenine species" Biochemical and Biophysical Research
Communications (2003), 300(3), 719-724 CODEN:
BBRCA9; ISSN: 0006-291X; whole document; abstract
Darlington, L.G. et al. "Altered kynurenine metabolism correlates with infarct volume in stroke" European Journal of Neuroscience (2007), 26, 221-2221; whole document; abstract
Область изобретения
Изобретение относится к применению метаболита триптофана 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-НАА) или ее функционального аналога для лечения гиперлипидемии. В частности изобретение включает: применение 3-НАА или ее функционального аналога, как таковой или вместе с подходящим носителем, в качестве гиполипидемической терапии для профилактики и/или лечения гиперлипидемии и сердечнососудистых осложнений, ассоциированных с гиперлипидемией, в частности, образования атеро-склеротических бляшек, инфаркта миокарда, ишемического инсульта и транзиторных ишемических атак, поражения почек, аневризмы аорты и критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом.
Предшествующий уровень техники изобретения
Сердечно-сосудистые заболевания ((ССЗ) (CVD)), преимущественно вызванные образованием ате-росклеротических бляшек в артериях, являются основной причиной смерти в Западном мире и также нарастают в развивающихся странах1. Однако прогресс в профилактике гиперлипидемии с использованием гиполипидемических лекарственных препаратов, например статинов, обладает доказанным преимуществом в выживаемости в случае первичной профилактики (т.е. у лиц без клинических признаков ССЗ) и вторичной профилактики (т.е. у пациентов с установленными ССЗ)2-4. Кроме того, другие классы лекарственных средств, например фибраты, которые повышают уровень ЛПВП, показали уменьшение прогрессирования ишемической болезни в клинических исследованиях56 и снижение частоты сердечнососудистых событий в исследованиях исходов78.
Атеросклероз представляет собой хроническое воспалительное состояние, опосредованное захватом и накоплением аполипопротеин В100 (ApoB100)-содержащих липопротеинов, в частности липопро-теинов низкой плотности (ЛПНП), в стенке артерий, приводящим к неадекватным ответам макрофагов и Т-клеток и образованию атеросклеротических бляшек в артериях910. Следовательно, снижение циркулирующих липопротеинов ApoB100 может обладать другими полезными эффектами в добавление к снижению вероятности накопления липидов в артериальной стенке.
Высокие уровни ЛПНП и их частиц предшественников, липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП (VLDL)), ассоциированы с повышенным риском инфаркта миокарда, инсульта и других осложнений атеросклеротических бляшек. Повышенные уровни ЛПНП и ЛОНП отражаются высокими уровнями холестерина и триглицеридов в образцах сыворотки крови или плазмы. Такие повышенные уровни липидов крови представляют собой состояние гиперлипидемии, которое, как упомянуто, ассоциировано с повышенным риском инфаркта миокарда, инсульта и других атеросклеротических осложнений.
Гиперлипидемические уровни определяются критериями SCORE Европейского Общества Кардиологов, которые также определяют целевые уровни, которые необходимо достичь гиполипидемической терапией11. Сердечно-сосудистый риск, обусловленный высоким холестерином ЛПНП или общим холестерином, снижается, когда уровень холестерина ЛПВП высокий, что подчеркнуто в той же публикации. Наоборот, низкий уровень ЛПВП увеличивает сердечно-сосудистый риск повышенного общего холестерина или холестерина ЛПНП. Существующие уровни гиперлипидемии, как определяют Swedish Medical Products Agency (Lakemedelsverket) представляют собой: общий холестерин > 5 ммоль/л, холестерин ЛПНП > 3 ммоль/л, и холестерин ЛПВП <1 ммоль/л12.
Частицы ЛПВП проявляют свой защитный эффект в отношении артерий, опосредуя удаление холестерина из клеток. После включения в ЛПВП молекулы холестерина переносятся в печень, преобразуются в желчные кислоты и удаляются через кишечник.
В существующей терапии гиперлипидемии доминирует группа лекарственных средств, называемых статинами. Указанные соединения обладают хорошими эффектами в отношении холестерина ЛПНП у большинства пациентов, но только минимальными эффектами в отношении ЛПВП13. Более того, некоторые пациенты не переносят статины или другие гиполипидемические препараты. По указанным причинам существует необходимость в разработке новых гиполипидемических препаратов.
Модифицированные фосфолипиды ЛПНП, такие как лизофосфатидилхолин и 1-пальмитоил-2-(5'-оксовалероил)-sn-глицеро-3-фосфохолин (POVPC), могут стимулировать эндотелиальные клетки, глад-комышечные клетки и макрофаги 1415. В настоящее время известно, что такие атерогенные липиды запускают естественный иммунный ответ посредством активации Toll-подобных рецепторов16-18. Более того холестерин, накапливающийся в макрофагах, которые интернализируют частицы ЛПНП, может образовывать микрокристаллы, которые непосредственно активируют инфламмасому, приводя к продукции провоспалительного цитокина, интерлейкина-1 бета18. В общем, представленные данные показывают, что модификация ЛПНП дает эндогенные лиганды, которые запускают активацию естественного иммунного ответа, которая может запускать образование атеросклеротических бляшек.
Адаптивный иммунитет также играет ключевую роль в развитии атеросклеротических бляшек. Ан-тиген-представляющие клетки встречаются с и интернализуют антигены в интиме, включая частицы ЛПНП, которые интернализуются посредством фагоцитарных рецепторов19. После протеолиза фрагменты белка ApoB100 ЛПНП ассоциируются внутриклеточно с белками МНС класса II, переносятся к поверхности клеток и представляются Т клеткам. Последнее событие приводит к активации Т клеток и
продукции цитокинов, которые запускают и поддерживают местное воспаление .
В добавление к эффектам в отношении местного патологического процесса иммунные клетки и ме
диаторы модулируют метаболизм липидов на системном уровне. Таким образом, провоспалительный цитокин фактор некроза опухоли (TNF) ингибирует липопротеинлипазу, ключевой фермент в метаболизме триглицеридов, приводя к гипертриглицеридемии 21. Другой TNF-подобный белок LIGHT ингибирует другую липазу, печеночную липазу, действуя в печени 2223. Это приводит к сниженному катаболизму триглицеридов и накоплению в крови крупных липопротеинов, которые содержат триглицериды и холестерин. В качестве третьего примера гиполипидемические препараты класса статинов проявляют существенные иммуномодулирующие эффекты, снижая активацию Т-клеток и ингибируя некоторые аутоиммунные заболевания 2425.
Все представленные данные демонстрируют сложную взаимосвязь между иммунной и метаболической системами и предполагают возможность лечения гиперлипидемии и предотвращения образования атеросклеротических бляшек с использованием путей, зависимых от иммунных клеток.
Последние данные показывают, что IDO (индолеамин 2,3-диоксигеназа) и IDO-катализируемый метаболизм триптофана играют критическую роль в индукции иммуносупрессии и переносимости (описано в 26). IDO кодируется геном IDO1 (кодируемым у людей 10 экзонами в хромосоме 8, 8р12-р11). Фермент метаболизирует L-триптофан (L-Trp) в N-формилкинуренин, продукт, который быстро преобразуется формамидазой в L-кинуренин (KYN), который в свою очередь может или выходить в кровоток или дополнительно метаболизироваться до нижележащих кинуренинов (Kyns). Такие Kyns включают 3-гидроксикинуренин (3-НК), 3-гидроксиантраниловую кислоту (3-НАА) и хинолиновую кислоту (QUIN)27.
Было показано, что нижележащие метаболиты триптофана, такие как 3-гидроксиантраниловая кислота (3-НАА, фиг. 1), могут ингибировать функцию Th1 и Th2 клеток и увеличивать процент регуля-торных Т клеток (Tregs). Кроме того, было показано, что введение 3-НАА снижает воспаление, индуцированное Th17 клетками, и защищает мышей от аутоиммунного энцефалита 2829. Действительно, данные предполагают, что 3-НАА может регулировать аутоиммунность в результате непосредственного воздействия на Т клетки или посредством непрямых эффектов при помощи изменения презентации антигена на дендритных клетках и макрофагах 30.
Сущность изобретения
Гиперлипидемия представляет собой состояние патологически повышенного уровня липидов крови, в частности холестерина и триглицеридов, переносимых в липопротеинах плазмы ЛПНП и ЛОНП. За высоким уровнем липидов следует суб-эндотелиальное удержание и накопление ЛПНП в артериальной стенке; это приводит к хроническому неадекватному воспалительному ответу макрофагов и Т-клеток и образованию атеросклеротических бляшек. В указанном контексте профилактика гиперлипидемии с использованием гиполипидемических лекарственных средств, например статинов и фибратов, доказала снижение количества сердечно-сосудистых событий и повышение выживаемости пациентов с риском ССЗ или установленными ССЗ 2-4,7,8.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что иммуномодулирующее соединение 3-НАА демонстрирует неожиданный сильный эффект в отношении гиперлипидемии и в ряде экспериментов достоверно снижает уровень общего холестерина и триглицеридов плазмы. Кроме того, 3-НАА достоверно повышает уровень ЛПВП и снижает соотношения ЛОНП/ЛПВП и ЛПНП/ЛПВП. Таким образом, полезные изменения липидов плазмы сопровождались достоверным уменьшением развития атеросклеротиче-ских бляшек. Следовательно, 3-НАА и ее функциональные аналоги могут расцениваться как новый класс гиполипидемических средств для профилактики и лечения гиперлипидемии и ее сердечно-сосудистых осложнений, т.е. образования атеросклеротических бляшек, инфаркта миокарда, ишемического инсульта и транзиторных ишемических атак, поражения почек, аневризмы аорты и критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом.
Следовательно, настоящее изобретение относится к применению 3-НАА или ее функциональных аналогов в лечении гиперлипидемии или в профилактике сердечнососудистых осложнений гиперлипи-демии.
Под функциональными аналогами 3-НАА предусматриваются продукты окисления и восстановления 3-НАА и замещенные варианты 3-НАА, которые сохраняют тот же или практически тот же эффект на метаболизм липидов, как 3-НАА.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения гиперлипидемию выбирают из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии и комбинированной (формы) ги-перлипидемии. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гиперлипидемия ассоциирована с низким уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения сердечно-сосудистым осложнением ги-перлипидемии является образование атеросклеротических бляшек.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является клиническая манифестация образования атеросклеротических бляшек.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения 3-НАА или ее функциональный аналог используют для профилактики инфаркта миокарда и/или сердечной недостаточности.
В одном варианте осуществления изобретения 3-НАА или ее функциональный аналог предназначе
ны для профилактики стенокардии.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения 3-НАА предназначена для применения в профилактике ишемического инсульта и/или транзиторных ишемических атак.
В другом варианте осуществления изобретения 3-НАА или ее функциональный аналог предназначены для профилактики периферической ишемии, гангрены, поражения почек, аневризмы аорты и/или критической ишемии конечностей.
В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, осложнением гиперли-пидемии является дерматологическое осложнение гиперлипидемии.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения дерматологическим осложнением гиперлипидемии является ксантома.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Молекулярное изображение 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-НАА). Молекулярная формула: C7H7NO3. Молярная масса 153,14 г/моль. IIUPAC наименование: 2-амино-3-оксибензойная кислота.
Фиг. 2. Поглощение FITC-окЛПНП перитонеальными макрофагами.
Перитонеальные макрофаги от мышей Ldlr-/-, которым вводили 3-HAA (200 мг/кг) или PBS (8 недель лечения), инкубировали с FITC-окЛПНП в концентрации 20 мкг белка/мл в течение 2 ч при 37°C. Поглощение оценивали количественно поточной цитометрией. (А) Заданными значениями являются MFI FITC-окЛПНП, среднее ± SE трех ячеек для каждой мыши (n=5 и 6, для 3-НАА или PBS соответственно) (В) График показывает репрезентативные гистограммы перитонеальных макрофагов от мышей/ получавших 3-НАА или PBS. **) Р <0/01.
Фиг. 3. Анализ липидов плазмы.
Уровни общего холестерина (А) и триглицеридов (В) оценивали в плазме мышей, получавших 3-НАА или PBS (8 недель лечения). (С) Гранулометрический анализ профилей липопротеинов плазмы мышей, получавших 3-НАА или PBS. Концентрации холестерина в каждой фракции (ось y) наносили на график относительно номера удержанной фракции (ось x); кривые показывают средние ± SEM для мышей, получавших 3-НАА и PBS. Значения выражены как среднее ± SEM (n=5 и 6, для 3-НАА или PBS соответственно). **) Р <0,01.
Фиг. 4. 3-НАА уменьшает развитие атеросклеротических бляшек.
Мышам Ldlr-/- в возрасте двадцати недель давали 3-НАА или PBS в качестве контроля. Мышей умерщвляли после 8 недель на западном питании. Иссеченные дуги окрашивали Судан IV анфас и % площади поражения всей сосудистой области рассчитывали с использованием программного обеспечения анализа изображений Image J (NIH, Bethesda, MD). Аддитивную площадь всех атеросклеротических бляшек в конкретной дуге аорты рассчитывали как процент всей площади поверхности дуги. (n=7 и 10, для 3-НАА или PBS соответственно). ***) Р <0,001.
Эксперименты
Методика.
Предположили, что индукция защитного иммунитета, который влияет на метаболизм и воспаление, может быть достигнута путем введения 3-НАА (200 мг/кг) интраперитонеально, 3 раза в неделю, в течение 8 недель. Мышам Ldlr-/- в возрасте двадцати недель давали 3-НАА или PBS в качестве контроля. Мышей кормили питанием с высоким содержанием жира, начиная через 2 дня после первой инъекции до умерщвления через 8 недель с помощью CO2.
Холестерин и триглицериды плазмы измеряли с использованием ферментативных колориметрических наборов в соответствии с протоколом производителя. Иссеченные дуги аорты окрашивали Судан IV анфас и рассчитывали % площади поражения общей сосудистой области. Кроме того, действие 3-НАА на поглощение окЛПНП оценивали в культурах перитонеальных макрофагов от мышей, получавших 3-
НАА или PBS.
Материалы и методы
Животные и лечение животных.
Мышей Ldlr-/- выводили и помещали в Экспериментальный блок для животных в центре Молекулярной Медицины, больница Университета Каролины. Мыши (n=7-10 на группу) получали 3 интрапери-тонеальных инъекции PBS (200 мкл) или 3-НАА (2 00 мг/кг в PBS) в неделю в течение 6 недель и 1 инъекцию в неделю в течение следующих двух недель (всего 24 инъекции) и их умерщвляли CO2. Мышей кормили питанием с высоким содержанием жира (кукурузный крахмал, масло какао, казеин, глюкоза, сахароза, целлюлозная мука, минералы и витамины; 17,2% белка, 21% жира (62,9% насыщенных, 33,9 ненасыщенных и 3,4% полиненасыщенных), 0,15% холестерина, 43% углеводов, 10% Н2О и 3,9% волокон целлюлозы; R638 Lantmannen, Sweden), начиная через 2 дня после начала лечения.
Выделение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП).
ЛПНП (d=1,019-1,063 г/мл) выделяли из собранной плазмы здоровых доноров путем ультрацентрифугирования, как описано в 31. 2 мМ бензамидина, 0,5 мМ PMSF и 0,1 ЕД/мл апротинина добавляли непосредственно после получения плазмы и ЛПНП активно диализировали относительно PBS после выде
ления. Одно-миллимолярную ЭДТА добавляли к аликвоте ЛПНП для предотвращения модификации частиц ЛПНП.
Получение меченных FITC (флуоресцеин изотиоцианат) окисленных ЛПНП (FITC-окЛПНП).
ЛПНП метили с использованием модификации ранее описанного метода 32. Коротко, ЛПНП (1,5-2 мг/мл) диализировали в течение ночи относительно 500 мМ NaHCO3 рН 9,5. Затем, 50 мкг FITC (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, USA), растворенного в DMSO (1 мг/мл), добавляли на каждый мг белка в ЛПНП и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. После инкубации конъюгаты отделяли от свободного флуорохрома путем гель-фильтрации с использованием колонки PD10 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) и PBS для элюции. FITC конъюгат оценивали абсорбционной спектроскопией относительно стандартной кривой FITC при 495 нм. Концентрацию белка определяли анализом Bradford (Biorad, CA, USA). Окисленные FITC-ЛПНП (FITC-окЛПНП) получали путем инкубации 1 мл FITC-ЛПНП (1 мг/мл) в присутствии 20 мкМ CuSO4 в течение 18 ч при 37°C. Выраженность окисления оценивали анализом
TBARS, как описано 33.
Поглощение окЛПНП перитонеальными макрофагами.
Через двадцать четыре часа после последней инъекции 3-НАА или PBS, перитонеальные макрофаги выделяли от мышей Ldlr-/-посредством перитонеального лаважа с помощью PBS. После 2-3 ч в PBS, макрофагов помещали в 96-луночные планшеты с плотностью 1х105 клеток на ячейку с 20 мкг/мл FITC-окЛПНП в среде RPMI 1640, содержащей 1% FCS. После 2 ч инкубации при 37°C клетки дважды промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в PBS. Клетки анализировали на поточном цитометре CyAn(tm) ADP (Dako, Glostrup, Denmark).
Анализ липидов плазмы.
Холестерин и триглицериды плазмы измеряли с использованием ферментативных колориметрических наборов (Randox Lab. Ltd. Crumin, UK) в соответствии с протоколом производителя. Профили липопротеинов.
Профили холестерина липопротеинов плазмы определяли с использованием модификации метода Okazaki et al 34. Коротко, образцы плазмы (50 мкл) от мышей, получавших 3-НАА или PBS, фракционировали с использованием колонки HR10/30 Superose 6 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) и Discovery BIO GFC-500 в качестве пре-колонки (5 смх7,8 i.d.; Supelco(r),Sigma-Aldrich, PA, USA) соединенной с системой Prominence UFLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) и уравновешивали с помощью Tris-буферного солевого раствора, рН 7,4. Фракции по 200 мкл собирали с использованием коллектора фракций Foxy Jr(r) (Tele-dyne Isco Inc, NE, USA) и общий холестерин определяли в каждой фракции с использованием ферментативного колориметрического набора (Randox Lab. Ltd. Crumin, UK).
Анализ поражений.
Накопление липидов анфас определяли в дуге аорты от мышей, получавших 3-НАА и PBS, с использованием окрашивания Судан IV. Коротко, иссеченные дуги фиксировали в 4% нейтральном буферном формалине. Затем образцы разрезали продольно и подвергали окрашиванию Судан IV (красный цвет). Изображения фиксировали с использованием камеры Leica DC480, соединенной со стереомикро-скопом Leica MZ6 (Leica, Wetzlar, Germany). Суммарную площадь всех атеросклеротических бляшек в заданной дуге аорты рассчитывали как процент общей площади поверхности дуги (не включая ответвляющиеся сосуды). Количественное определение атеросклеротических бляшек проводили с использованием программного обеспечения Image J (NIH, Bethesda, USA).
Статистический анализ.
Значения выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), если не указано иначе. Непараметрический критерий Манн-Уитни U использовали для сравнений между группами. Различия расценивали достоверными при значениях Р ниже 0,05.
Результаты
3-Гидроксиантраниловая кислота ингибирует поглощение окЛПНП.
Поглощение флуоресцентных FITC-окЛПНП оценивали количественно поточной цитометрией, как описано в разделе Методы. Как показано на фиг. 2, перитонеальные макрофаги от мышей, получавших 3-НАА, показали приблизительно 79% снижение поглощения FITC-окЛПНП. Следовательно, 3-НАА ин-гибирует поглощение модифицированных частиц ЛПНП, ключевое событие в образовании пенистых клеток.
3-Гидроксиантраниловаяя кислота обладает сильным гиполипидемическим эффектом.
Неожиданно для иммуномодулирующего соединения введение 3-НАА мышам Ldlr-/- было ассоциировано с заметным, статистически достоверным снижением общего холестерина плазмы (приблизительно 50%) и триглицеридов (приблизительно 72%) (фиг. 3). Кроме того, 3-НАА эффективно повышает уровень ЛПВП и снижает ЛОНП/ЛПВП (4,0±0,55 и 1,410,31/ среднее ± SEM мышей, получавших PBS и 3-НАА соответственно; Р <0,01) и соотношения ЛПНП/ЛПВП (2,3±0,24 и 1,4±0/16, среднее 1 SEM мышей, получавших PBS и 3-НАА соответственно; Р <0,05). Полученные данные подтверждают 3-НАА как новое гиполипидемическое средство. Введение 3-НАА не оказывало эффекта на массу тела (данные не показаны).
Снижение липидов плазмы, индуцированное 3-гидроксиантраниловой кислотой, приводит к уменьшению образования атеросклеротических бляшек.
Наконец, авторы исследовали, может ли 3-НАА влиять на образование бляшек. Мышам Ldlr-/-, у которых развились атеросклеротические поражения при получении питания с высоким содержанием жира, вводили 3-НАА в течение 8 недель. Существенное снижение уровня общего холестерина плазмы и триглицеридов приводило к приблизительно 90% снижению площади атеросклеротических поражений в анфас препаратах дуги аорты (фиг. 4).
Ссылки:
1. Rosamond И, Flegal К, Friday G, Furie К, Go А, Greenlund К, Haase N, Ho M, Howard v, Kissela в, Kittner S, Lloyd-Jones D, McDermott M, Meigs J, Moy C, Nichol G, O'Donnell CJ, Roger V, Rumsfeld J, Sorlie P, Steinberger J, Thorn T, Wasserthiel-Smoller S, Hong Y. Heart disease and stroke statistics-2007 update: A report from the american heart association statistics committee and stroke statistics subcommittee. Circulation. 2007; 1 15:e69-171
2. Baigent C, Keech A, Kearney PM, Blackwell L, Buck G, Pollicino C, Kirby A, Sourjina T, Peto R, Collins R, Simes R. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: Prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. lancet. 2005; 366: 1267-1278
3. Cannon CP, Steinberg BA, Murphy SA, Mega JL, Braunwald E. Metaanalysis of cardiovascular outcomes trials comparing intensive versus moderate statin therapy. J Am Coll Cardiol. 2006; 48:438-445
4. Leeper NJ, Ardehali R, deGoma EM, Heidenreich PA. Statin use in patients with extremely low low-density lipoprotein levels is associated with improved survival. Circulation. 2007; 116:613-618
5. Ruotolo G, Ericsson CG, Tettamanti C, Karpe F, Grip L, Svane B, Nilsson J, de Faire U, Hamsten A. Treatment effects on serum lipoprotein lipids, apolipoproteins and low density lipoprotein particle size and relationships of lipoprotein variables to progression of coronary artery disease in the bezafibrate coronary atherosclerosis intervention trial (becait). J Am Coll Cardiol. 1998; 32: 1648-1656
6. Ericsson CG, Nilsson J, Grip L, Svane B, Hamsten A. Effect of bezafibrate treatment over five years on coronary plaques causing 20% to 50% diameter narrowing (the bezafibrate coronary atherosclerosis intervention trial [becait]). Am J Cardiol. 1997; 80:1125-1129
7. Boden WE. High-density lipoprotein cholesterol as an independent risk factor in cardiovascular disease: Assessing
1.
the data from framingham to the veterans affairs high-density lipoprotein intervention trial. Am J Cardiol. 2000; 86: 19L-22L
8. Rubins HB, Robins SJ, Collins D, Fye CL, Anderson JW,
Elam MB, Faas FH, Linares E, Schaefer EJ, Schectman G, Wilt TJ,
Wittes J. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary
heart disease in men with low levels of high-density
lipoprotein cholesterol. Veterans affairs high-density
lipoprotein cholesterol intervention trial study group. N Engl
J Med. 1999; 341:410-418
9. Tabas I, Williams KJ, Boren J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: Update and therapeutic implications. Circulation. 2007; 116: 1832-1844
10. Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. The New England journal of medicine. 2005; 352: 1685-1695
11. Reiner Z, Catapano AL, De Backer G, Graham I, Taskinen MR, Wiklund 0, Agewall S, Alegria E, Chapman MJ, Durrington P, Erdine S, Halcox J, Hobbs R, Kjekshus J, Filardi PP, Riccardi G, Storey RF, Wood D, Bax J, Vahanian A, Auricchio A, Baumgartner H, Ceconi C, Dean V, Deaton C, Fagard R, Filippatos G, Funck-Brentano C, Hasdai D, Hoes A, Kearney P, Knuuti J, Kolh P, McDonagh T, Moulin C, Poldermans D, Popescu BA, Sechtem U, Sirnes PA, Tendera M, Torbicki A, Vardas P, Widimsky P, Windecker S, Reviewers D, Berkenboom G, De Graaf J, Descamps 0, Gotcheva N, Griffith K, Guida GF, Gulec S, Henkin Y, Huber K, Kesaniemi YA, Lekakis J, Manolis AJ, Marques-Vidal P, Masana L, McMurray J, Mendes M, Pagava Z, Pedersen T, Prescott E, Rato Q, Rosano G, Sans S, Stalenhoef A, Tokgozoglu L, Viigimaa M, Wittekoek ME, Zamorano JL. Esc/eas guidelines for the management of dyslipidaemias: The task force for the management of dyslipidaemias of the european society of cardiology (esc) and the european atherosclerosis society (eas). Eur Heart J. 2011; 32:1769-1818
12. Lakemedelsverket. Forebyggande av aterosklerotisk hjartkarlsjukdom. Information fran lakemedelsverket. 2006; 3
9.
13. Barter P, Gotto AM, LaRosa JC, Maroni J, Szarek M, Grundy SM, Kastelein JJ, Bittner V, Fruchart JC. Hdl cholesterol, very low levels of Idl cholesterol, and cardiovascular events. N Engl J Med. 2007; 357: 1301 -1310
14. Watson AD, Leitinger N, Navab M, Faull KF, Horkko S, Witztum JL, Palinski W, Schwenke D, Salomon RG, Sha W, Subbanagounder G, Fogelman AM, Berliner JA. Structural identification by mass spectrometry of oxidized phospholipids in minimally oxidized low density lipoprotein that induce monocyte/endothelial interactions and evidence for their presence in vivo. J Biol Chem. 1997; 272: 13597-13607
15. Gharavi NM, Alva JA, Mouillesseaux KP, Lai C, Yeh M, Yeung W, Johnson J, Szeto WL, Hong L, Fishbein M, Wei L, Pfeffer LM, Berliner JA. Role of the jak/stat pathway in the regulation of interleukin-8 transcription by oxidized phospholipids in vitro and in atherosclerosis in vivo. The Journal of biological chemistry. 2007; 282:31460-31468
16. Seimon ТА, Nadolski MJ, Liao X, Magallon J, Nguyen M, Feric NT, Koschinsky ML, Harkewicz R, Witztum JL, Tsimikas S, Golenbock D, Moore KJ, Tabas I. Atherogenic lipids and lipoproteins trigger cd36-tlr2-dependent apoptosis in macrophages undergoing endoplasmic reticulum stress. Cell metabolism. 2010; 12:467-482
17. Stewart CR, Stuart LM, Wilkinson K, van Gils JM, Deng J, Halle A, Rayner KJ, Boyer L, Zhong R, Frazier WA, Lacy-Hulbert A, El Khoury J, Golenbock DT, Moore KJ. Cd36 ligands promote sterile Inflammation through assembly of a toll-like receptor 4 and 6 heterodimer. Wat Immunol. 2010; 11: 155-161
18. Duewell P, Kono H, Rayner KJ, Sirois CM, Vladimer G, Bauernfeind FG, Abela GS, Franchi L, Nunez G, Schnurr M, Espevik T, Lien E, Fitzgerald KA, Rock KL, Moore KJ, Wright SD, Hornung V, Latz E. Nlrp3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 2010; 464: 1357-1361
19. Andersson J, Libby P, Hansson GK. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 2010; 134:33-46
9.
20. Libby P, Ridker PM, Hansson GK. Progress and
challenges in translating the biology of atherosclerosis.
Nature. 2011; 473:317-325
21. Beutler B, Greenwald D, Hulmes JD, Chang M, Pan YC, Mathison J, Ulevitch R, Cerami A. Identity of tumour necrosis factor and the macrophage-secreted factor cachectin. Nature. 1985; 316:552-554
22. Lo JC, Wang Y, Tumanov AV, Bamji M, Yao Z, Reardon CA, Getz GS, Fu YX. Lymphotoxin beta receptor-dependent control of lipid homeostasis. Science. 2007; 316:285-288
23. Hansson GK. Medicine. Light hits the liver. Science. 2007; 316:206-207
24. Youssef S, Stuve 0, Patarroyo JC, Ruiz PJ, Radosevich JL, Hur EM, Bravo M, Mitchell DJ, Sobel RA, Steinman L, Zamvil SS. The hmg-coa reductase inhibitor, atorvastatin, promotes a th2 bias and reverses paralysis in central nervous system autoimmune disease. Nature. 2002; 420:78-84
25. McCarey DW, Mclnnes IB, Madhok R, Hampson R, Scherbakov O, Ford I, Capell HA, Sattar N. Trial of atorvastatin in rheumatoid arthritis (tara): Double-blind, randomised placebo-controlled trial. Lancet. 2004; 363:20152021
26. Grohmann U, Bronte V. Control of immune response by amino acid metabolism. Immunological reviews. 2010; 236:243-264
27. Stone TW, Darlington LG. Endogenous kynurenines as targets for drug discovery and development. Wat Rev Drug Discov. 2002; 1:609-620
28. Platten M, Ho PP, Youssef S, Fontoura P, Garren H, Hur EM, Gupta R, Lee LY, Kidd BA, Robinson WH, Sobel RA, Selley ML, Steinman L. Treatment of autoimmune neuroinflammation with a synthetic tryptophan metabolite. Science. 2005; 310:850-855
29. Yan YP, Zhang GX, Gran B, Fallarino F, Yu S, Li HM, Cullimore ML, Rostami A, Xu H. Ido upregulates regulatory t cells via tryptophan catabolite and suppresses encephalitogenic t cell responses in experimental autoimmune encephalomyelitis.
Journal Of Immunology. 2010; 185:5953-5961
30. Munn DH, Mellor AL. Indoleamine 2,3-dioxygenase and
tumor-induced tolerance. Journal of Clinical Investigation. 2007; 117: 1147-1154
31. Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 1955; 34:1345-1353
32. Schmitz G, Wulf G, Bruning T, Assmann G. Flow-cytometric determination of high-density-lipoprotein binding sites on human leukocytes. Clin Chem. 1987; 33:2195-2203
33. Puhl H, Waeg G, Esterbauer H. Methods to determine oxidation of low-density lipoproteins. Methods Enzymol. 1994; 233:425-441
34. Okazaki M, Ohno Y, Нага I. Rapid method for the quantitation of cholesterol in human serum lipoproteins by high performance liquid chromatography. Journal of biochemistry. 1981; 89:879-887
31.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-НАА) для лечения гиперлипидемии или профилактики сердечно-сосудистых осложнений гиперлипидемии.
2. Применение по п.1, где указанную гиперлипидемию выбирают из группы, состоящей из гиперхо-лестеринемии, гипертриглицеридемии и комбинированной (формы) гиперлипидемии.
3. Применение по п.1 или 2, где указанная гиперлипидемия ассоциирована с низким уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме.
4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является образование атеросклеротических бляшек.
5. Применение по любому из пп.1-3, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипи-демии является клиническая манифестация образования атеросклеротических бляшек, указанную клиническую манифестацию выбирают из инфаркта миокарда и/или сердечной недостаточности.
6. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики стенокардии.
7. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики ишемического инсульта и/или транзиторных
ишемических атак.
8. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики периферической ишемии, гангрены, поражения почек, аневризмы аорты и/или критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом.
9. Применение по п.1 или 2, где осложнением гиперлипидемии являются ксантомы.
NH2 он
***
I 1
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023954
- 1 -
023954
- 1 -
023954
- 1 -
023954
- 1 -
023954
- 4 -
023954
- 6 -
023954
- 9 -
023954
- 10 -
|
