[RU]

1. Мутантная целлобиогидролаза, являющаяся мутантом SEQ ID NO:1, содержащая замену в положении N247(I,F,H,W) согласно SEQ ID NO:1, при этом целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности SEQ ID NO:1 и обладает активностью CBH-I.

2. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N247F.

3. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N247H.

4. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-3, в которой CBH-I имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, а указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа F427, K163, G357, S36, D77 и/или Q232.

5. Мутантная целлобиогидролаза по п.4, которая содержит одну или несколько из следующих замен: F427I, K163N, G357R, S36E, D77M и/или Q232A.

6. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-5, где CBH-I имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким из числа остатков Т52, V101, S192, Т198, Т246, Т344, D346, А375 и/или А376.

7. Мутантная целлобиогидролаза по п.6, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52(G,M,Y,D,H,K,R), V101(T,I,F,H), S192(A,I,F,Q,H), T198(A,C,V,P,D,H), T246(G,A,Y,N,H), T344(A,S,C,L,I,Y,W), D346(P,F,G,R), A375(G,I,W,Y,H,K,R) и/или A376(T,V,L,Y,W,D).

8. Мутантная целлобиогидролаза по п.7, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52(M,D,R), V101(I,F), S192F, Т198(А,Н), T246N, T344(Y,C,L), D346(R,G), A375(Y,H) и/или A376(Y,W).

9. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52D, V101F, S192F, Т198Н, T246N, T344Y, D346G, A375Y и/или A376Y.

10. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-9, которая содержит одну или несколько или делеций в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа А6, Т7, L34, V41,Y47, T48, S99, V144, S171, L177, N194, N195, А196, I200, S205, Т243, Y244, S245, Y249, Р255, Q337, D343, Н350, V367, D372, Т393 и/или V396.

11. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, содержащая замену С, Р, G, А, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, Е, K, R или делецию в любом из положений.

12. Полинуклеотид, кодирующий мутантную целлобиогидролазу по любому из пп.1-11.

13. Нуклеотидная конструкция, содержащая полинуклеотид по п.12.

14. Клетка-хозяин, трансформированная нуклеотидной конструкцией по п.13.

15. Способ получения мутантной СВН, включающий стадии: (a) культивирования трансформированной клетки-хозяина по п.14 в подходящей культуральной среде в условиях, подходящих для получения мутантной целлобиогидролазы; (b) получения указанной продуцируемой мутантной целлобиогидролазы; и при необходимости (c) очистки указанной мутантной целлобиогидролазы для получения очищенной мутантной целлобиогидролазы.

16. Ферментная композиция, содержащая одну или несколько мутантных целлобиогидролаз по любому из пп.1-11 или полученная согласно способу по п.15.

17. Способ деградации лигноцеллюлозного или гемицеллюлозного материала, в котором лигноцеллюлозный или гемицеллюлозный материал приводят в контакт с ферментной композицией по п.16.

18. Способ по п.17, в котором вырабатывается один или несколько сахаров.

19. Способ по п.18, в котором выработанный сахар ферментируют для получения продукта ферментации.

20. Способ по п.19, в котором продукт ферментации является одним или несколькими из числа этанола, бутанола, молочной кислоты, пластика, органической кислоты, растворителя, добавки к кормам для животных, фармацевтического препарата, витамина, аминокислоты, фермента или химического сырья.

(57) Реферат / Формула:

1. Мутантная целлобиогидролаза, являющаяся мутантом SEQ ID NO:1, содержащая замену в положении N247(I,F,H,W) согласно SEQ ID NO:1, при этом целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности SEQ ID NO:1 и обладает активностью CBH-I.

2. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N247F.

3. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N247H.

4. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-3, в которой CBH-I имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, а указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа F427, K163, G357, S36, D77 и/или Q232.

5. Мутантная целлобиогидролаза по п.4, которая содержит одну или несколько из следующих замен: F427I, K163N, G357R, S36E, D77M и/или Q232A.

6. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-5, где CBH-I имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким из числа остатков Т52, V101, S192, Т198, Т246, Т344, D346, А375 и/или А376.

7. Мутантная целлобиогидролаза по п.6, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52(G,M,Y,D,H,K,R), V101(T,I,F,H), S192(A,I,F,Q,H), T198(A,C,V,P,D,H), T246(G,A,Y,N,H), T344(A,S,C,L,I,Y,W), D346(P,F,G,R), A375(G,I,W,Y,H,K,R) и/или A376(T,V,L,Y,W,D).

8. Мутантная целлобиогидролаза по п.7, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52(M,D,R), V101(I,F), S192F, Т198(А,Н), T246N, T344(Y,C,L), D346(R,G), A375(Y,H) и/или A376(Y,W).

9. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52D, V101F, S192F, Т198Н, T246N, T344Y, D346G, A375Y и/или A376Y.

10. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-9, которая содержит одну или несколько или делеций в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа А6, Т7, L34, V41,Y47, T48, S99, V144, S171, L177, N194, N195, А196, I200, S205, Т243, Y244, S245, Y249, Р255, Q337, D343, Н350, V367, D372, Т393 и/или V396.

11. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, содержащая замену С, Р, G, А, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, Е, K, R или делецию в любом из положений.

12. Полинуклеотид, кодирующий мутантную целлобиогидролазу по любому из пп.1-11.

13. Нуклеотидная конструкция, содержащая полинуклеотид по п.12.

14. Клетка-хозяин, трансформированная нуклеотидной конструкцией по п.13.

15. Способ получения мутантной СВН, включающий стадии: (a) культивирования трансформированной клетки-хозяина по п.14 в подходящей культуральной среде в условиях, подходящих для получения мутантной целлобиогидролазы; (b) получения указанной продуцируемой мутантной целлобиогидролазы; и при необходимости (c) очистки указанной мутантной целлобиогидролазы для получения очищенной мутантной целлобиогидролазы.

16. Ферментная композиция, содержащая одну или несколько мутантных целлобиогидролаз по любому из пп.1-11 или полученная согласно способу по п.15.

17. Способ деградации лигноцеллюлозного или гемицеллюлозного материала, в котором лигноцеллюлозный или гемицеллюлозный материал приводят в контакт с ферментной композицией по п.16.

18. Способ по п.17, в котором вырабатывается один или несколько сахаров.

19. Способ по п.18, в котором выработанный сахар ферментируют для получения продукта ферментации.

20. Способ по п.19, в котором продукт ферментации является одним или несколькими из числа этанола, бутанола, молочной кислоты, пластика, органической кислоты, растворителя, добавки к кормам для животных, фармацевтического препарата, витамина, аминокислоты, фермента или химического сырья.

---

Евразийское
патентное
ведомство
023945
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201300876
(22) Дата подачи заявки
2012.01.30
(51) Int. Cl. C12N9/42 (2006.01) C12N 9/24 (2006.01)
(54) МУТАНТНАЯ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗА
(31) 11152691.9; 61/437,804
(32) 2011.01.31
(33) EP; US
(43) 2013.12.30
(86) PCT/EP2012/051416
(87) WO 2012/104239 2012.08.09
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Лан Ван Дер Ян Метске, Схоневелд-Бергманс Маргот Элизабет Франсуаз, Якобс Денисе Ильсе (NL)
(74) Представитель:
Воробьева Е.В. (RU)
(56) GRASSICK ALICE ET AL.: "Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase, CBH IB, and molecular characterization of the cel7 gene from the filamentous fungus, Talaromyces emersonii", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, BLACKWELL PUBLISHING, BERLIN, DE, vol. 271, no. 22, 1 November 2004 (2004-11-01), pages 4495-4506, XP002547329, ISSN: 0014-2956, DOI: DOI:10.1111/ J.1432-1033.2004.04409.X the whole document
US-A1-2009162916
VOUTILAINEN S.P. ET AL.: PROTEIN ENGINEERIN, DESIGN &SELECTION, vol. 23, no. 2, 1 December 2009 (2009-12-01), pages 69-79, XP002642935, cited in the application the whole document
WO-A1-2010122141
TUOHY MARIA G. ET AL.: "Kinetic
parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, ELSEVIER, NL, vol. 1596, no. 2, 29 April 2002 (2002-04-29), pages 366-380, XP002547497, ISSN: 0006-3002 the whole document
MOLONEY A.P. ET AL.: "Isolation of
mutants of Talaromyces emersonii CBS 814.70 with enhanced cellulase activity", ENZYME AND
MICROBIAL TECHNOLOGY, STONEHAM, MA, US, vol. 5, no. 4, 1 January 1983 (1983-01-01), pages 260-264, XP002398223, ISSN: 0141-0229,
DOI: DOI:10.1016/0141-0229(83)90074-1 the whole document
(57) Изобретение относится к мутантной целлобиогидролазе, являющейся мутантом SEQ ID NO:1, которая содержит замены в положении N247(I,F,H,W) в SEQ ID NO:1, которая идентична по меньшей мере на 50% последовательности SEQ ID NO:1 и имеет активность CBH-I.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение направлено на новые мутантные целлобиогидролазы и композиции, содержащие цел-лобиогидролазы, которые имеют улучшенную активность CBHI. В частности, настоящее изобретение относится к семейству целлобиогидролаз из грибов и бактерий, которые родственны продуцируемой Ta-laromyces emersonii CBH-I и содержат определенные мутации.
Предшествующий уровень техники
Целлюлазы являются ферментами, которые способны гидролизовать бета-Б-глюкозидные связи в целлюлозах. Целлюлолитические ферменты традиционно разделялись на три основных класса: эндоглю-каназы, экзоглюканазы или целлобиогидролазы и бета-глюкозидазы (Knowles, J. et al., (1987), TIBTECH 5, 255-261) и известны как продуцируемые большим количеством бактерий, дрожжей и грибов.
Основными среди приложений, которые были разработаны для применения целлюлолитических ферментов, являются те, которые включают деградацию (древесной) целлюлозной пульпы в сахара для выработки (био)этанола, обработки тканей, такой как "стирка с камнями" и "биополировка", и в композициях детергентов.
Таким образом, была продемонстрирована эффективность целлюлаз во многих промышленных процессах. Соответственно в данной области имеет место тенденция, связанная с поиском композиций или компонентов специфических целлюлаз, имеющих особенно эффективные функциональные режимы в отношении одного или большего количества конкретных приложений. В свете этого целлюлазы, вырабатываемые (экспрессируемые) в грибах и бактериях, стали объектом внимания. Например, целлюлазе, вырабатываемой определенными грибами, такими как Trichoderma spp. (особенно Trichoderma longi-brachiatum), уделили много внимания из-за того, что полная целлюлазная система, способная деградировать кристаллические формы целлюлозы, легко производится с помощью процедур ферментации. Этот специфический целлюлазный комплекс был подробно проанализирован для определения природы его специфических компонентов, и способности этих компонентов участвовать в промышленных процессах. Например, Wood et al., "Methods in Enzymology", 160, 25, с. 234 и далее (1988), пишут, что полные системы грибных целлюлаз включают несколько различных классификаций ферментов, включая те, которые идентифицированы как экзоцеллобиогидролазы (ЕС 3.2.1.91) ("СВН"), эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4) ("EG"), и бета-глюкозидазы (ЕС 3.2.1.21) ("BG"). Классификации грибных целлюлаз СВН, EG и BG могут быть дополнительно расширены для включения множества компонентов в пределах каждой классификации. Были предложены некоторые генетические модификации CBH-I. S. P. Voutilainen, P.G. Murray, M.G. Tuohy and A. Koivula, Protein Engineering, Design and Selection, pp. 1-11,2009, описывают экспрессию целлобиогидролазы CEL7A Talaromyces emersonii в Saccharomyces cerevisiae и рациональный мутагенез для улучшения его термостабильности и активности. В этом описании мутант N54C/P191C демонстрировал повышенную термостабильность и улучшенную активность kcat 35,9 мин-1 (табл. II). Однако, эта активность все еще остается относительно низкой.
В WO 2010/122141 описана CBH-I из Talararomyces emersonii, полинуклеотиды, кодирующие CBH-I, и клетки, в которые встроены эти полинуклеотиды. Аминокислотная последовательность CBH-I из WO 2010/122141 в данном документе представлена как SEQ ID NO:1.
Несмотря на знания в данной области, связанные со многими композициями целлюлаз, имеющих применение в некоторых или всех из вышеуказанных областей, существует постоянная потребность в новых композициях целлюлаз, которые обладают улучшенной активностью в условиях преобразования лигноцеллюлозы. Следовательно, существует потребность в улучшении существующей активности CBH-I, отдельно или в комбинации с другими целлюлазами.
Сущность изобретения
Задача данного изобретения заключается в обеспечении композиций с новым вариантом CBH-I или СВН-Ьподобной целлюлазы, обладающим улучшенной активностью CBH-I.
Активность CBH-I измеряется, как описано в примерах. Дополнительная задача изобретения заключается в обеспечении композиций с новым вариантом CBH-I или СВН-Ьподобной целлюлазы, обладающим повышенной эффективностью в условиях термического стресса.
Дополнительная задача изобретения заключается в обеспечении композиций с новым вариантом CBH-I или СВН-Ьподобной целлюлазы, который обеспечит превосходную эффективность при деградации биологического материала, такого как лигноцеллюлоза.
Дополнительная задача изобретения заключается в обеспечении композиции с новым вариантом CBH-I или СВН-Ьподобной целлюлазы, который обладает улучшенными характеристиками в отношении уменьшения биомассы, в качестве добавки к корму для животных, обработки крахмала и хлебопечения.
Одной или нескольких целей добиваются согласно изобретению. Согласно настоящему изобретению предлагается мутантная целлобиогидролаза, являющаяся мутантом SEQ ID NO:1, содержащая замены в положении N247(I,F,H,W) из SEQ ID NO:1, где мутантная целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности SEQ ID NO:1 и имеет активность CBH-I.
В одном из воплощений мутант содержит замену N247F. В другом воплощении мутант содержит
замену N247H.
Краткое описание списка последовательностей
SEQ ID NO:1. В SEQ ID NO:1 представлена аминокислотная последовательность CBH-I из Talaro-myces emersonii, обозначенная как SEQ ID NO:1 в WO2010/122141.
SEQ ID NO:2. В SEQ ID NO:2 представлена сигнальная последовательность для целлобиогидролазы с SEQ ID NO:1.
SEQ ID NO:3. В SEQ ID NO:3 представлена ДНК-последовательность CBH-I (EBA205).
Подробное описание изобретения
Во всем настоящем описании и в сопровождающей формуле изобретения слова "содержать" и "включать" и вариации, такие как "содержит", "содержащий", "включает" и "включающий", должны толковаться включительно. Т.е. эти слова призваны передать идею возможного включения других элементов или чисел специально не перечисленных там, где позволяет контекст. В данном документе слова, употребляемые в единственном числе, также включают и множественное число. К примеру, элемент может обозначать один элемент или более одного элемента.
Мутантная целлобиогидролаза по изобретению, являющаяся мутантом SEQ ID NO:1, содержит замену в положении N247(I,F,H,W) последовательности SEQ ID NO:1, где мутантная целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет активность CBH-I.
В одном из воплощений мутант содержит замену N247F. В другом воплощении мутант содержит
замену N247H.
В дополнительном воплощении CBH-I содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа F445, K163, G357, S36, D77 и/или Q232, саму по себе или в комбинации с ранее упоминаемыми мутациями. Мутации в этих положениях могут быть заменой на С, Р, G, А, V, L, I, M, F, W,Y, H, S, T, N, Q, D, Е, K, R или делецией. В дополнительном воплощении мутант содержит одну или несколько замен из числа F445I, K163N, G357R, S36E, D77M и/или Q232A.
В другом воплощении мутант целлобиогидролазы содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам Т52, V101, S192, Т198, Т344, D346, А375 или А376 из SEQ ID NO:1, саму по себе или в комбинации с ранее упоминаемыми мутациями. Мутации в этих положениях могут быть заменой С, Р, G, А, V, L, I, M, F, W,Y, H, S, T, N, Q, D, Е, K, R или делецией. В дополнительном воплощении мутант содержит одну или большее количество из числа представленных ниже замен: T52(G,M,Y,D,H,K,R), V101(T,I,F,H), S192(A,I,F,Q,H), T198(A,C,V,P,D,H), T246(G,A,Y,N,H),
N247(I,F,W), T344(A,S,C,L,I,Y,W), D346(P,F,G,R), A375(G,I,W,Y,H,K,R) и/или A376(T,V,L,Y,W,D). В
любом из воплощений мутант содержит одну или несколько замен из числа: T52(M,D,R), V101(I,F), S192F, Т198А, N247F, T344(C,L), A375(Y,H), предпочтительно А375Н и/или A376D.
В другом воплощении мутант целлобиогидролазы содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа А6, Т7, L34, V41, Y47, Т48, S99, V144, S171, L177, N194, N195, А196, 1200, S205, Т243, Y244, S245, Y249, Р255, Q337, D343, Н350, V367, D372, Т393 и/или V396, саму по себе или в комбинации с ранее упомянутыми мутациями.
В данном документе целлобиогидролаза (ЕС 3.2.1.91) является любым полипептидом, который способен катализировать гидролиз 1,4-p-D-гликозидных связей в целлюлозе или целлотетраозе, высвобождая целлобиозу с невосстановленных концов цепей. Этот фермент может также называться целлюлазой 1,4-р-целлобиозидазой, 1,4-р-целлобиогидролазой, 1,4-p-D-глюканцеллобиогидролазой, авицелазой, эк-зо-1,4-p-D-глюканазой, экзоцеллобиогидролазой или экзоглюканазой. "Целлобиогидролаза" в данном документе сокращенно называется "СВН". "Целлобиогидролаза-I" в данном документе сокращенно называется "CBH-I". "Мутантная целлобиогидролаза" сокращенно называется "Мутантная СВН" или мутант. "Полинуклеотид мутантной СВН" в данном документе является полинуклеотидом, который кодирует Мутантную СВН.
Последовательность мутантной СВН идентична по меньшей мере на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 97, 98, 99% последовательности SEQ ID NO:1.
В данном документе мутации указаны однобуквенными аминокислотами и положениями этих аминокислот. Например, А6 в данном документе обозначает аминокислоту (однобуквенный код) в определенном положении в SEQ ID NO:1, здесь А (аланин) в положении 6 белка. А6 (L/N/Q/G/V/I/Y/S/E/K) в данном документе указывает на мутации аминокислоты в определенном положении, здесь А (аланин) в положении 6 белка заменен на любую аминокислоту из числа L (лейцин), N (аспарагин), Q (глутамин), V (валин), I (изолейцин), Y (тирозин), S (серин), У (глутаминовая кислота) или K (лизин).
Мутантная СВН изобретения может иметь одну или несколько альтернативных и/или дополнительных активностей, отличных от активности целлобиогидролазы, например одна из целлюлазных активностей, упомянутых в данном документе.
Мутантная СВН по изобретению может модифицировать углеводный материал, модифицируя такой материал химически или физически. Химическая модификация углеводного материала может привести к деградации такого материала, например, гидролизом, окислением или другой химической модификацией, такой как действие лигазы. Физическая модификация может проводиться вместе с химической модификацией или без нее.
Мутант может иметь одну или несколько из числа представленных ниже ферментных активностей
или ферментная композиция, содержащая фермент, мутантную СВН по изобретению, может содержать один или несколько из числа следующих ферментов:
эндо-1,4-р-глюканазы (EG) и экзоцеллобиогидролазы (СВН, например, CBH-I или СВН-II) катализируют гидролиз нерастворимой целлюлозы на целлоолигосахариды (целлобиоза как основной продукт), в то время как р-глюкозидазы (BG) преобразуют олигосахариды, главным образом целлобиозу и целлот-риозу, в глюкозу. Ферментные активности EG, СВН, BG, ксиланазы и пектиназы могут быть активностями мутантной СВН или активностями, присутствующими в других составляющих пептидной композиции, содержащей мутантную СВН.
Ксиланазы вместе с другими вспомогательными ферментами, например с a-L-арабинофуранозидазами, ферулоил- и ацетилксиланэстеразами, глюкуронидазами и р-ксиланазами, катализируют гидролиз гемицеллюлоз.
Пектиназы включают, например, эндополигалактуроназу, пектинметилэстеразу, эндогалактаназу, бета-галактозидазу, пектинацетилэстеразу, эндопектинолиазу, пектатлиазу, альфа-рамнозидазу, экзога-лактуроназу, экзполиглактуронатлиазу, рамноглактуронангидролазу, рамногалактуронанлиазу, рамнога-лактуронанацетилэстеразу, рамноглактуронангалактуроногидролазу, ксилогалактуроназу, a-арабинофуранозидазу.
Как изложено выше, мутантная СВН изобретения, как правило, обладает активностью целлобио-гидролазы. Однако, мутантная СВН изобретения может иметь одну или несколько активностей, изложенных выше, в дополнение к этой активности или в качестве альтернативы к ней. Также описанная здесь композиция с мутантной СВН по изобретению может иметь одну или несколько активностей упомянутых выше в дополнение к той, которая обеспечена мутантом целлобиогидролазы по изобретению, обладающего активностью целлобиогидролазы, или активности могут присутствовать в ферментной композиции, содержащей фермент мутантной СВН по изобретению.
Полинуклеотидная последовательность.
С помощью мутантной СВН и ее аминокислотной последовательностью, описанной в данном документе, специалист может определить подходящие полинуклеотиды, которые кодируют мутантную
СВН.
Следовательно, в изобретении предлагаются полинуклеотидные последовательности, содержащие ген, кодирующий мутантную СВН, а также кодирующую ее последовательность.
Полинуклеотиды изобретения могут быть выделены или синтезированы. Синтетические полинук-леотиды могут быть получены с помощью коммерчески доступных автоматических синтезаторов поли-нуклеотидов.
Полипептиды мутантной СВН и полинуклеотиды мутантной СВН в данном документе могут быть синтетическими полипептидами и соответственно полинуклеотидами. Синтетические полинуклеотиды могут быть оптимизированы по использованию кодонов предпочтительно согласно способам, описанным в WO 2006/077258 и/или РСТ/ЕР 2007/055943, которые включены в данный документ ссылкой. В РСТ/ЕР 2007/055943 рассматривается оптимизация кодоновых пар.
Термин относится к полинуклеотидной молекуле, которая является молекулой рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) либо одно-, либо двухцепочечной. Поли-нуклеотид может либо присутствовать в выделенной форме, или может быть включен в рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или векторы, или может быть включен в клетку-хозяин.
Слово "полипептид" используется в данном документе для цепей, содержащих больше чем 7 аминокислотных остатков. Олигопептидные и полипептидные формулы и последовательности в данном описании пишутся слева направо и в направлении от N-конца к С-концу. Используемый в данном документе однобуквенный аминокислотный код широко известен в данной области.
Под "выделенным" полипептидом или белком понимается полипептид или белок, удаленный из своей естественной среды. Например, рекомбинантно продуцируемые полипептиды и белки, продуцируемые к клетках-хозяевах, рассматриваются как выделенные в целях изобретения, если являются естественными или рекомбинантными полипептидами, которые были в значительной степени очищены любым подходящим методом, таким как, например метод одностадийной очистки, описанный в работе Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
Полинуклеотиды настоящего изобретения, такие как полинуклеотиды, кодирующие мутантную СВН, могут быть выделены или синтезированы с помощью стандартных методов молекулярной биологии, а информация о последовательности представлена в данном документе.
Полинуклеотид, кодирующий мутантную СВН изобретения, может быть амплифицирован с помощью кДНК, мРНК или в ином случае, с помощью геномной ДНК, используемых в качестве матрицы, и подходящих олигонуклеотидных праймеров в соответствии со стандартными методами амплификации ПЦР. Нуклеиновая кислота, амплифицированная таким образом, может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована с помощью анализа последовательности ДНК.
Трансформация.
Полипептид по изобретению может быть экспрессирован в подходящем хозяине. Следовательно,
могут быть использованы стандартные методы трансформации.
Изобретение также относится к нуклеотидному конструкту, содержащему полинуклеотид, описанный ранее, например вектор.
Другой аспект изобретения, таким образом, относится к векторам, включая векторы для клонирования и экспрессии, содержащие полинуклеотид по изобретению, кодирующий белок СВН или его функциональный эквивалент, и к способам выращивания, трансформации или трансфекции таких векторов в подходящую клетку-хозяин, например, в условиях, в которых происходит экспрессия полипептида по изобретению. При использовании в данном документе термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой они связаны.
Полинуклеотиды по изобретению могут быть встроены в рекомбинантный реплицирующийся вектор, например вектор для клонирования или экспрессии. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в подходящей клетке-хозяине. Таким образом, в дополнительном воплощении изобретение обеспечивает способ получения полинуклеотидов по изобретению путем введения полинук-леотида по изобретению в реплицирующийся вектор, путем введения вектора в подходящую клетку-хозяин и путем выращивания клетки-хозяина в условиях, которые приводят к репликации вектора. Вектор может быть выделен из клетки-хозяина. Подходящие клетки-хозяева описаны ниже.
Специалистам в данной области понятно, что конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор траснформируемой клетки-хозяина, желаемый уровень экспрессии белка и т. п. Векторы по изобретению, такие как экспрессирующие векторы, могут быть введены в клетки-хозяева с тем, чтобы продуцировать белки или пептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, описанными в данном документе (например, белки СВН, мутантные формы белков СВН, их фрагменты, варианты или функциональные эквиваленты). Векторы, такие как рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению, могут быть сконструированы для экспрессии белков СВН в прокариотических и эукариотических клетках.
Например, белки СВН могут экспрессироваться в бактериальных клетках, таких как Е. coli, клетках насекомых (с помощью бакуловирсных экспрессирующих векторов), мицелиальных грибах, дрожжевых клетках, или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева дополнительно обсуждаются в книге Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Характерные примеры подходящих хозяев описаны далее в данном документе.
Соответствующие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в данной области.
Для большинства мицелиальных грибов и дрожжей вектор или экспрессирующая конструкция предпочтительно интегрируется в геном клетки-хозяина для получения стабильных трансформантов. Однако, для некоторых дрожжей также доступны подходящие эписомальные векторы, в которые для стабильной и высокоуровневой экспрессии может быть вставлена экспрессирующая конструкция, примеры таких векторов включают векторы, полученные из плазмид 2 ц и pKD1 Saccharomyces и Kluyvero-myces соответственно или векторов, содержащих АМА-последовательности (например, АМА1 из Asper-gillus). В случае, если экспрессирующая конструкция интегрирована в геном клетки-хозяина, конструкции интегрируются либо в случайные локусы в геноме, либо в заранее определенные целевые локусы с помощью гомологичной рекомбинации, в случае которой целевые локусы предпочтительно содержат сильно экспрессируемый ген.
Соответственно полезные в настоящем изобретении экспрессирующие векторы включают векторы, полученные на основе хромосом, эписом и вирусов, например векторы, полученные из бактериальных плазмид, бактериофагов, дрожжевой эписомы, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирусы, паповавирусы, вирусы осповакцины, аденовирусы, вирусы оспы-дифтерии птиц, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, и векторы, полученные на основе их комбинаций, таких как те, что получены из генетических элементов плазмид и бактериофагов, такие как космиды и фагмиды.
Если полипептид по изобретению будет секретироваться клеткой-хозяином в среду для культивирования, то к полипептиду может быть добавлена соответствующая сигнальная последовательность для направления синтезированного de novo полипептида в путь секреции клетки-хозяина. Специалистам в данной области известно, как выбрать подходящую сигнальную последовательность для конкретного хозяина.
Вектор может дополнительно включать последовательности, фланкирующие полинуклеотид, дающий начало РНК, которые содержат последовательности, гомологичные эукариотическим геномным последовательностям или вирусным геномным последовательностям. Это позволяет внедрить полинуклео-тиды по изобретению в геном клетки-хозяина.
Интегрирующий клонирующий вектор может быть интегрирован в случайном или заданном локу-се-мишени в хромосоме(ах) клетки-хозяина, в которую он интегрируется.
Векторная система может быть одиночным вектором, таким как одиночная плазмида, двумя или несколькими векторами, такими как две или несколько плазмид, которые вместе содержат общую ДНК, вводимую в геном клетки-хозяина.
Вектор может содержать полинуклеотид по изобретению, ориентированный в антисмысловом на
правлении для обеспечения продукции антисмысловой РНК.
Векторная ДНК может быть внедрена в прокариотические или эукариотические клетки с помощью обычных методов трансфекции и трансформации. Использованные в данном документе термины "трансформация" и "трансфекция" предназначены для обозначения множества признанных в данной области методов внедрения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяин, включая копре-ципитацию с фосфатом кальция и хлоридом кальция, DEAE-декстран опосредованную трансфекцию, трансдукцию, инфекцию, липофекцию, катионную опосредованную липидами трансфекцию или элек-тропорацию. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd , ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и в других лабораторных руководствах.
Как указано ранее, в изобретении предлагается выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2 с мутациями, указанными в п.1.
Мутантная СВН по изобретению может быть извлечена и очищена из рекомбинантных клеточных культур известными в данной области способами. Наиболее предпочтительно жидкостная хроматография, такая как высокоэффективная жидкостная хроматография ("ВЭЖХ"), используется для очистки, которая может включать, без ограничения перечисленным, применение ионообменной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием, аффинной хроматографии и гель-фильтрации для дальнейшего отделения целевой СВН от основной части белка для извлечения целевой СВН в высоко-очищенном состоянии.
Полипептиды настоящего изобретения включают естественно очищенные продукты, продукты процедур химического синтеза, а также продукты, полученные рекомбинантными методами из прока-риотических или эукариотических хозяев, включая, например, клетки бактерий, дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомби-нантного получения, полипептиды настоящего изобретения могут быть гликозилированы или не глико-зилированы. Кроме того, полипептиды изобретения могут также включать начальный модифицированный остаток метионина или пироглутамат, в некоторых случаях как результат опосредованных хозяином процессов. Пироглутаминовая кислота (также известная как 5-оксопролин, пидолевая кислота или пи-роглутамат в случае ее основной формы) является нераспространенным аминокислотным производным, в котором свободная аминогруппа глутаминовой кислоты циклизуется с образованием лактама. Она обнаружена во множестве белков, включая бактериородопсин.
Изобретение также описывает биологически активные фрагменты полипептида по изобретению.
Также предлагаются клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид или вектор изобретения. Поли-нуклеотид может быть гетерологичным по отношению к геному клетки-хозяина. Термин "гетерологич-ный" обычно по отношению к клетке-хозяину означает, что полинуклеотид не встречается естественным образом в геноме клетки-хозяина или что полипептид не продуцируется клеткой естественным образом.
В другом воплощении в изобретении описаны клетки, например трансформированные клетки-хозяева или рекомбинантные клетки-хозяева, которые содержат нуклеиновую кислоту, охваченную изобретением. "Трансформированная клетка" или "рекомбинантная клетка" является клеткой, в которую (или в предшественник которой) посредством методов рекомбинантных ДНК вводится нуклеиновая кислота по изобретению. К ним относятся как прокариотические, так и эукариотические клетки, например бактерии, грибы, дрожжи и т.п., особенно предпочтительными являются клетки из мицелиальных грибов, в частности Aspergillus niger.
Клетки-хозяева могут быть выбраны таким образом, чтобы модулировать экспрессию внедренных последовательностей или чтобы модификация и процессинг генного продукта прошли специфическим требуемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, гидролиз) белковых продуктов могут облегчить оптимальное функционирование белка.
Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфичными механизмами для посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы, хорошо знакомые специалистам в области молекулярной биологии и/или микробиологии, могут быть выбраны для обеспечения требуемой и корректной модификации и процес-синга продуцируемого чужеродного белка. С этой целью могут использоваться эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточной машинерией для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева хорошо известны в данной области.
При необходимости, описанная выше клетка может быть использована для получения полипептида по изобретению. Такой способ, как правило, включает культивирование клетки-хозяина (например, трансформированной или трансфецированной вектором, таким как экспрессирующий вектор, как описано выше), в условиях, которые позволяют осуществить экспрессию последовательности (вектором), кодирующей полипептид, и, необязательно, извлечение экспрессированного полипептида. Полинуклеотид изобретения может быть встроен в рекомбинантный реплицирующийся вектор, например в экспресси-рующий вектор. Вектор может быть использован для репликации нуклеиновой кислоты в подходящей
клетке-хозяине. Таким образом, в дополнительном воплощении в изобретении предлагается способ получения полинуклеотида изобретения путем введения полинуклеотида изобретения в реплицирующийся вектор, путем введения вектора в подходящую клетку-хозяин и путем выращивания клетки-хозяина в условиях, которые приводят к репликации вектора. Вектор может быть выделен из клетки-хозяина.
Предпочтительно, если полипептид продуцируется в виде секретируемого белка что происходит в случае, когда нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелую форму полипептида в экспресси-рующей конструкции, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность. Предпочтительно, если сигнальная последовательность является естественной (гомологичной) нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид. В ином случае сигнальная последовательность является чужеродной (гетерологичной) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и в этом случае сигнальная последовательность предпочтительно является эндогенной относительно клетки-хозяина, в которой экспрессируется нуклеотидная последовательность по изобретению. Примерами подходящих сигнальных последовательностей для дрожжевых клеток-хозяев являются сигнальные последовательности, полученные из дрожжевых генов a-фактора. Подобным образом, подходящей сигнальной последовательностью для клеток-хозяев из мицелиальных грибов является, например, сигнальная последовательность, полученная из гена амилоглюкозидазы (AG) мице-лиальных грибов, например ген glaA из A. niger. Сигнальная последовательность может быть использована в комбинации с промотором амилоглюкозидазы (также называемой (глюко)амилазой), а также в комбинации с другими промоторами. Гибридные сигнальные последовательности могут также использоваться в контексте настоящего изобретения.
Предпочтительные гетерологичные лидерные последовательности для секреции, таким образом, происходят из гена грибной амилоглюкозидазы (AG) (как 18-, так и 24-аминокислотные версии, например, из Aspergillus), из гена a-фактора (дрожжи, например, Saccharomyces and Kluyveromyces) или из гена a-амилазы (Bacillus).
Векторы могут быть трансформированы или трансфецированы в подходящую клетку-хозяин, как описано выше, для обеспечения экспрессии полипептида изобретения. Этот процесс может включать культивирование клетки-хозяина, трансформированной экспрессирующим вектором, как описано выше, в условиях, которые обеспечивают экспрессию вектором последовательности, кодирующей полипептид.
В данном случае используются стандартные методы выделения, гибридизации, трансформации и клонирования (например, как описано в руководстве Sambrook J., Fritsh Е. F. and Maniatis, Т. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Гомология и идентичность.
Аминокислотные или нуклеотидные последовательность указаны как гомологичные, если они демонстрируют некоторый уровень сходства. Гомологичность двух последовательностей указывает на общее эволюционное происхождение. На то, являются ли две гомологичные последовательности близко или более удаленно родственными, указывает "процент идентичности" или "процент сходства", который является высоким или низким соответственно. Несмотря на спорность указания на "процент идентичности" или "процент сходства", "уровень гомологии" или "процент гомологии" часто используются взаимозаменяемо.
Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с помощью математических алгоритмов. Специалистам известно, что для выравнивания двух последовательностей и определения гомологии между двумя последовательностями доступны несколько различных компьютерных программ (Kruskal J3. (1983) An overview of squence comparison In D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша для сравнения двух последовательностей (Needleman S^. and Wunsch CD. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Алгоритм выравнивает аминокислотные последовательности, а также нуклеотидные последовательности. Алгоритм Нидлмана-Вунша был реализован в компьютерной программе "NEEDLE". Для цели настоящего изобретения была использована программа "NEEDLE" из пакета "EMBOSS" (version 2.8.0 или выше, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice P., Longden I. and Bleasby A. Trends in Genetics 16, (6) pp 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Для белковых последовательностей в качестве подстановочной матрицы использовалась "EBLOSUM62". Для нуклеотидной последовательности использовалась матрица "EDNAFULL". Могут быть указаны другие матрицы. Необязательными параметрами, используемыми для сравнения аминокислотных последовательностей, являются штраф за внесение разрыва, равный 10, и штраф за продолжение разрыва, равный 0,5. Специалист поймет, что все эти различные параметры дадут несколько различающиеся результаты, но общий процент идентичности двух последовательностей не изменится значительно при использовании различных алгоритмов.
Глобальное определение гомологии.
Гомология или идентичность является процентом полных совпадений между двумя полными последовательностями по всей выровненной области, включая любые разрывы или удлинения. Гомологию или идентичность между двумя выровненными последовательностями рассчитывают следующим образом: количество соответствующих позиций в выравнивании, демонстрирующих идентичные аминокислоты в обеих последовательностях, разделенное на общую длину выравнивания, включая разрывы. Идентичность, определенная в данном документе, может быть получена в "NEEDLE" и отмечена в выходных данных программы как "IDENTITY".
Определение наиболее длинной идентичности.
Гомологию или идентичность между двумя выровненными последовательностями рассчитывают следующим образом: количество соответствующих позиций в выравнивании, демонстрирующих идентичные аминокислоты в обеих последовательностях, разделенное на общую длину выравнивания после вычитания общего количества разрывов в выравнивании. Определенная в данном документе идентичность может быть получена в "NEEDLE" с помощью опции "NOBRIEF" и отмечена в выходных данных программы как "longest-identity". Предпочтительно, если для расчета идентичности используется наиболее длинная идентичность.
Клетки-хозяева.
В изобретении, таким образом, предлагаются клетки-хозяева, трансформированные или трансфеци-рованные полинуклеотидом или вектором изобретения. Предпочтительно, если полинуклеотид вводится в вектор для репликации и экспрессии полинуклеотида. Клетки будут отобраны так, чтобы быть совместимыми с указанным вектором и могут, например, быть клетками прокариот (например, бактерий), грибов, дрожжей, или растений.
Также для продукции полипептида изобретения может быть выбран гетерологичный хозяин, в котором полипептид по изобретению продуцируется в форме, которая в значительной степени свободна от ферментов, разрушающих целлюлозу или гемицеллюлозу. Это может быть достигнуто путем выбора хозяина, который обычно не продуцирует такие ферменты.
Изобретение охватывает способы продуцирования полипептида изобретения посредством рекомби-нантной экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид. Для этой цели последовательность ДНК изобретения может быть использована для амлификации гена и/или замены сигналов экспрессии, таких как промоторы, сигнальные последовательности для секреции, с тем, чтобы обеспечить экономически выгодное производство полипептида в подходящей гомологичной или гетерологичной клетке-хозяине. Гомологичная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяин, которая происходит из тех же видов или которая является вариантом в тех же видах, что и виды, из которых получена последовательность ДНК.
Подходящие клетки-хозяева предпочтительно представляют собой прокариотические микроорганизмы, такие как бактерии, или более предпочтительно эукариотические организмы, например грибы, такие как дрожжи или мицелиальные грибы, или растительные клетки. В общем, дрожжевые клетки предпочтительней грибных клеток, потому что с ними легче работать. Однако, некоторые белки либо плохо секретируются из дрожжей, либо в некоторых случаях не процессируются правильно (например, в случае гипергликозилирования в дрожжах). В этих случаях должен быть выбран грибной организм-хозяин.
Клетка-хозяин может сверхэкспрессировать полипептид, и методы для конструирования сверхэкспрессии хорошо известны. Хозяин может, таким образом, иметь две или несколько копий, кодирующих полинуклеотид (и вектор, следовательно, может иметь две или несколько копий соответственно).
Бактерии из рода Bacillus очень подходят в качестве гетерологичных хозяев из-за их способности секретировать белки в культуральную среду. Другими подходящими в качестве хозяев бактериями являются бактерии из родов Streptomyces и Pseudomonas. Предпочтительные дрожжевые клетки-хозяева для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид, происходят из родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia и Schizosaccharomyces.
Более предпочтительно, если дрожжевая клетка-хозяин выбирается из группы, состоящей из видов Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (также известного как Kluyveromyces marxianus var.lactis), Hansenulapolymorpha, Pichiapastoris, Yarrowia lipolytica и Schizosaccharomyces pombe.
Наиболее предпочтительными являются, однако, грибные клетки-хозяева (например, мицелиальных грибов). Предпочтительные клетки-хозяева мицелиальных грибов выбираются из группы, состоящей из родов Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora и Tala-romyces.
Более предпочтительно, если клетка-хозяин мицелиального гриба является видом Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, или видом из группы Aspergillus niger. Она включает, без ограничения перечисленным, Aspergillus niger, Aspergillusawamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae и Aspergillus ficuum, а также состоит из видов Trichoderma reesei/Hypocrea jacorina, Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii, Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri,
Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus и Thielavia terrestris.
Примерами предпочтительных экспрессирующих хозяев в пределах объема настоящего изобретения являются грибы, такие как грибы рода Aspergillus, рода Penicillium и рода Trichoderma; бактерии, такие как бактерии рода Bacillus, например Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefa-ciens, рода Pseudomonas; и дрожжи, такие как дрожжи рода Kluyveromyces, например виды Kluyveromy-ces lactis, и Saccharomyces, например, Saccharomyces cerevisiae.
Клетки-хозяева по изобретению включают растительные клетки, а изобретение, следовательно, распространяется на трансгенные организмы, такие как растения и их части, которые содержат одну или несколько клеток изобретения. Клетки могут гетерологично экспрессировать полипептид изобретения или могут гетерологично содержать один или несколько полинуклеотидов изобретения. Трансгенное (или генетически модифицированное) растение может, следовательно, иметь вставленную (например, стабильно) в его геном последовательность, кодирующую один или несколько полипептидов изобретения. Трансформация растительных клеток может быть осуществлена с помощью известных методов, например с помощью Ti- или Ri-плазмид из Agrobacterium tumefaciens. Плазмида (или вектор) может, таким образом, содержать последовательности, необходимые для инфекции растения, для чего могут быть использованы производные Ti- и/или Ri-плазмид.
В ином случае может быть осуществлена прямая инфекция части растения, такой как лист, корень или стебель. В этом методе инфицируемое растение может быть ранено, например, надрезанием растения бритвой, или прокалыванием растения иглой, или натиранием растения абразивом. Рана затем ино-кулируется Agrobacterium. Затем растение или часть растения могут выращиваться в подходящей куль-туральной среде, что позволяет развиться зрелому растению. Регенерация трансформированных клеток в генетически модифицированных растениях может быть достигнута с помощью известных методов, например с помощью отбора трансформированных корней, антибиотика и субкультивирования корней в среде, содержащей подходящие питательные вещества, растительные гормоны и т.п.
Изобретение также включает клетки, которые были модифицированы для экспрессии целлобиогид-ролазы по изобретению или ее варианта. Такие клетки включают временные или предпочтительно стабильные клеточные линии высших эукариот, такие как клетки млекопитающих или клетки насекомых, клетки низших эукариот, таких как дрожжи и (например, мицелиальные) грибные клетки или прокарио-тические клетки, такие как бактериальные клетки.
Также возможна временная экспрессия белков изобретения в клеточной линии или на мембране, такой как, например, в бакуловирусной системе экспрессии. Такие адаптированные для экспрессии белков по изобретению системы также включены в объем настоящего изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением получение полипептида изобретения может быть осуществлено культивированием клетки-хозяина по изобретению, которая была трансформирована одним или несколькими полинуклеотидами настоящего изобретения, в обычной питательной среде для ферментации.
Изобретение также относится к способу получения мутантной СВН, включающему стадии:
(a) культивирования клетки-хозяина по изобретению в подходящей культуральной среде в подходящих условиях для получения мутантной СВН;
(b) получения указанной продуцируемой мутантной СВН; и необязательно
(c) очистки указанной мутантной СВН для получения продукта с очищенной мутантной СВН.
Изобретение также относится к ферментной композиции, содержащей один или несколько мутант-
ных СВН по изобретению и/или полученной согласно способу изобретения.
Также изобретение относится к способу деградации лигноцеллюлозного или гемицеллюлозного материала, в котором лигноцеллюлозный или гемицеллюлозный материал контактирует с ферментной композицией по изобретению. В любом из воплощений в таком процессе по изобретению вырабатывается один или несколько сахаров. В любом из воплощений выработанный сахар ферментируется для получения продукта ферментации. В любом из воплощений продукт ферментации является одним или несколькими из числа этанола, бутанола, молочной кислоты, пластмассы, органической кислоты, растворителя, добавки к корму для животных, лекарственного средства, витамина, аминокислоты, фермента или химического сырья.
Продукция полипептида/фермента.
Рекомбинантные клетки-хозяева по изобретению могут культивироваться с помощью способов, известных в данной области. Для каждой комбинации промотора и клетки-хозяина доступны культураль-ные условия, которые способствуют экспрессии последовательности ДНК, кодирующей полипептид. После достижения требуемой плотности клеток или титра полипептида рост культуры останавливают, и полипептид выделяют известными способами.
Ферментационная среда может содержать известную культуральную среду, включающую источник углерода (например, глюкозу, мальтозу, патоку, крахмал, целлюлозу, ксилан, пектин, гидролизат лигно-целлюлолитической биомассы и т.п.), источник азота (например, сульфат аммония, нитрат аммония, хлористый аммоний и т.д.), источники органического азота (например, дрожжевой экстракт, солодовый
экстракт, пептон и т.п.), источники неорганических питательных веществ (например, фосфат, магний, калий, цинк, железо и т.п.). Необязательно может быть включен индуктор (например, целлюлоза, пектин, мальтоза, мальтодекстрин или ксилогалактуронан).
Выбор подходящей среды может быть основан на выборе экспрессирующего хозяина и/или на ре-гуляторных требованиях экспрессирующей конструкции. Такие среды известны специалистам в данной области. Среда может, если требуется, содержать дополнительные компоненты, оказывающие благоприятное воздействие на трансформированных экспрессирующих хозяев по сравнению с потенциально кон-таминирующими организмами.
Ферментация может быть осуществлена в течение 0,5-30 дней. Ферментация может быть периодическим процессом, непрерывным процессом, периодическим процессом с добавлением субстрата при соответствующей температуре в диапазоне, например, от около 0 до около 45°С и/или при рН, например, от около 2 до около 10. Предпочтительными условиями ферментации являются температура в диапазоне от около 20 до около 37°С и рН от около 3 до около 9. Соответствующие условия, как правило, выбираются исходя из выбора экспрессирующего хозяина и вырабатываемого белка.
После ферментации, если необходимо, клетки могут быть удалены из ферментационной питательной среды центрифугированием или фильтрацией. После того как ферментация остановится или после удаления клеток, полипептид изобретения может быть извлечен, и если требуется, очищен и выделен обычными средствами.
Ферментные композиции.
В изобретении также предлагается ферментная композиция, содержащая один или большее количество мутантных целлобиогидролаз. В любом из воплощений ферментная композиция содержит одну или большее количество мутантных СВН, одну или несколько из числа целлюлазы и/или гемицеллюлазы и/или пектиназы.
Композиция изобретения может содержать один, два или три или большее количество классов цел-люлаз, например две или все из числа эндо-1,4-р-глюканазы (EG), предпочтительно включая GH61, экзо-целлобиогидролазы (СВН) и р-глюкозидазы (BGL).
Ферментная композиция изобретения может содержать полипептид, который обладает схожей ферментативной активностью, например обладает активностью схожего типа целлюлазы, гемицеллюлазы и/или пектиназы, что и активность, которая обеспечена полипептидом изобретения.
Ферментная композиция изобретения может содержать полипептид, который имеет другой тип целлюлазной активности, и/или гемицеллюлазной активности, и/или пектиназной активности, чем та, которая обеспечена полипептидом изобретения. Например, композиция изобретения может содержать один тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной, и/или пектиназной активности, обеспеченной полипептидом изобретения, и второй тип целлюлазной, и/или гемицеллюлазной, и/или пектиназной активности, обеспеченной дополнительной целлюлазой/гемицеллюлазой/пектиназой.
В данном документе целлюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать целлюлозу. Полипептид, который способен деградировать целлюлозу, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения целлюлозы на более мелкие единицы, либо частично, например, в целлодекстрины, либо полностью в глюкозные мономеры. Целлюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с гемицеллюлазой. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза.
В данном документе гемицеллюлаза является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать гемицеллюлозу. Иначе говоря, гемицеллюлаза может быть способна деградировать или модифицировать один или несколько из числа ксилана, глюкуроноксилана, арабиноксилана, глюкоманнана и ксилоглюкана. Полипептид, который способен деградировать гемицеллюлозу, является ферментом, который способен катализировать процесс разрушения гемицеллюлозы на более мелкие полисахариды, либо частично, например, на олигосахариды, либо полностью на мономеры сахара, например гексозный или пентозный сахарные мономеры. Гемицеллюлаза по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с гемицеллюлазой. Такая деградация будет, как правило, проводиться путем реакции гидролиза.
В данном документе пектиназа является любым полипептидом, который способен деградировать или модифицировать пектин. Полипептид, который способен деградировать пектин, является полипептидом, который способен катализировать процесс разрушения пектина на более мелкие единицы, либо частично, например, в олигосахариды, либо полностью в сахарные мономеры. Пектиназа по изобретению может дать смешанную популяцию олигосахаридов и сахарных мономеров при контакте с пектина-зой. Такая деградация будет, как правило, проводится путем реакции гидролиза.
В данном документе эндо-р-1,4-глюканазой является любой полипептид, который способен катализировать эндогидролиз 1,4-p-D-глюкозидных связей в целлюлозе, лихенине или p-D-глюканах зерновых. Такой полипептид также может быть способен гидролизовать 1,4-связи в p-D-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Этот фермент может также называться целлюлазой, авицелазой, Р-1,4-эндоглюкангидролазой, бета-1,4-глюканазой, карбоксиметилцеллюлазой, целлудекстриназой, эндо-1,4-р-
D-глюканазой, эндо^^р^-глюкащ^и/пролазой, эндо-1,4-р-глюканазой или эндоглюканазой. GH61 эн-доглюканазы (ЕС 3.2.1.4) изначально были классифицированы как ферменты семейства гликозидгидро-лаз на основании измерения очень слабой эндо-1,4-p-D-глюканазной активности у одного представителя семейства. Структура и механизм действия этих ферментов, безусловно, не является каноническим, и они не могут рассматриваться в качестве подлинных гликозидаз. Тем не менее, они хранятся в классификации CAZ на основании их способности повышать распад лигноцеллюлозы при использовании в сочетании с целлюлазой или смесью целлюлаз.
В данном документе р-глюкозидазой (ЕС 3.2.1.21) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз концевых невосстанавливающих остатков p-D-глюкозы с высвобождением р-D-глюкозы. Такой полипептид может обладать широкой специфичностью по отношению к p-D-глюкозидам и может также гидролизовать одно или несколько из числа представленных: p-D-галактозид, a-L-арабинозид, p-D-ксилозид или p-D-фукозид. Этот фермент также может называться амигдалазой, р-D-глюкозидглюкогидролазой, целлобиазой или гентобиазой.
В данном документе р-(1,3)(1,4)-глюканазой (ЕС 3.2.1.73) является любой полипептид, который способен катализировать гидролиз 1,4-p-D-глюкозидных связей в p-D-глюканах, содержащих 1,3- и 1,4-связи. Такие полипептиды могут действовать на лихенин и бета-D-глюканы зерновых, но не на бета-D-глюканы, содержащие только 1,3- или 1,4-связи. Этот фермент может также называться лихениназой, 1,3-1,4-p-D-глюкан-4-глюканогидролазой, р-глюканазой, эндо-р-1,3-1,4-глюканазой, лихеназой или р-глюканазой смешанных связей. Альтернативой для этого типа фермента является ЕС 3.2.1.6, который описан как эндо-1,3(4)-бета-глюконаза. Этот тип фермента гидролизует 1,3- или 1,4-связи в p-D-глюканах, когда остаток глюкозы, чья восстанавливающая группа участвует в образовании гидролизуе-мой связи, самозамещается по С-3. Альтернативные названия включают эндо-1,3-бетаглюканазу, лами-нариназу, 1,3-(1,3;1,4)-бета-D-глюкан 3 (4) глюканогидролазу; субстраты включают ламинарин, лихенин, и бета-D-гликаны зерновых.
Соответственно композиция изобретения может содержать в дополнение к мутантной СВН одну или несколько из любых целлюлаз, например целлобиогидролазу (например, СВН-II), и эндо-р-1,4-глюканазу, р-глюкозидазу или р-(1,3)(1,4)-глюканазу.
Ферментная композиция по изобретению может содержать дополнительно одну или большее количество из числа представленных ниже ферментных активностей:
эндоксиланаза (ЕС 3.2.1.8), р-ксилозидаза (ЕС 3.2.1.37), a-L-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55), a-D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139), ксилан альфа-1,2-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.131), феруоилэстераза (ЕС 3.1.1.73), кумароилэстераза (ЕС 3.1.1.73), a-галактозидаза (ЕС 3.2.1.22), р-галактозидаза (ЕС 3.2.1.23), р-маннаназа (ЕС 3.2.1.78), р-маннозидаза (ЕС 3.2.1.25), эндополигалактуроназа (ЕС 3.2.1.15), пектинмети-лэстераза (ЕС 3.1.1.11), эндогалактаназа (ЕС 3.2.1.89), эндопектинлиаза (ЕС 4.2.2.10), пектатлиаза (ЕС 4.2.2.2), альфа-рамнозидаза (ЕС 3.2.1.40), экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.82), экзогалактуроназа (ЕС 3.2.1.67), экзополигалактуронатлиаза (ЕС 4.2.2.9), рамногалактуронангидролаза, рамногалактуронанлиа-за, рамногалактуронан ацетил, рамногалактуронан галактуроногидролаза, ксилогалактуроназа, a-L-арабинофуранозидаза (ЕС 3.2.1.55), эндоарабинаназа(ЕС 3.2.1.99), протеаза (3.4), липаза, лигниназа, например лигнинпероксидазы (ЕС 1.11.1), марганецпероксидазы (ЕС 1.11.1.13), лакказы (ЕС 1.10.3.2) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73), гексозилтрансфераза (2.4.1-), глюкуронидаза, например р-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.31), гиалуроноглюкуронидаза (ЕС 3.2.1.36), глюкуронозил-дисульфоглюкозамин глюкуронидаза (3.2.1.56), глицирризинат р-глюкуронидаза (3.2.1.128) или a-D-глюкуронидаза (ЕС 3.2.1.139), экспан-син или экспансин-подобный белок, такой как сволленин (см. Salheimo et al., Eur. J. Biohem. 269, 42024211, 2002) или сволленин-подобный белок, скаффолдины и целлюлозоинтегрирующие белки.
Композиция изобретения может состоять из представителей каждого из упомянутых выше классов, нескольких представителей одного полипептидного класса или любой комбинации этих полипептидных классов.
Композиция изобретения может состоять из полипептидов, например ферментов, полученных (1) от коммерческих поставщиков; из (2) клонированных генов, экспрессирующих полипептиды, например ферменты; (3) сложной жидкой питательной среды (такой, которая получается в результате роста микробного штамма в среде, где штаммы секретируют ферменты в среду); (4) клеточных лизатов штаммов, растущих как в (3); и/или (5) растительного материала, экспрессирующего полипептиды, например ферменты. Различные полипептиды, например ферменты, в композиции изобретения могут быть получены из различных источников.
В любом из воплощений CBH-I предлагается в ферментной композиции, которая содержит BG, EG и CBH-II. В любом из ее воплощений, количества ферментов выбираются так, чтобы BG присутствовала в количестве 2-12%, CBH-I - в количестве 10-65%, CBH-II - в количестве 10-40%, EG - в количестве 1270% или в любом из ее воплощений, BG присутствовала в количестве 4-12%, EG - 18-50%, CBH-II - 1035%, а CBH-I -10-60% от общего количества белка (мас./мас.).
Применение полипептидов.
Полипептиды и ферментные композиции по изобретению могут быть использованы в различных применениях. Например, они могут быть использованы для образования ферментируемых сахаров. Ферментируемые сахара затем могут быть преобразованы как часть процесса производства биотоплива в биогаз или этанол, бутанол, изобутанол, 2-бутанол или другие подходящие вещества. В ином случае полипептиды и их композиции могут быть использованы в качестве фермента, например, при производстве продуктов питания, в детергентных композициях, в целлюлозно-бумажной промышленности, в антибактериальных составах, в фармацевтических продуктах, таких как таблетки для рассасывания, зубные пасты и жидкости для полоскания рта. Некоторые из применений подробно будут проиллюстрированы ниже.
В данных применениях и способах, описанных ниже, компоненты композиции, описанные выше, могут быть предоставлены одновременно (т.е. по сути, в виде отдельной композиции) или отдельно, или последовательно.
Изобретение также относится к применению целлобиогидролазы по изобретению и композиций, содержащих такой фермент, в промышленных процессах.
Несмотря на многолетний опыт, накопленный об этих процессах, целлобиогидролаза по изобретению может отличаться множеством значимых преимуществ от используемых в настоящее время ферментов. В зависимости от конкретного применения эти преимущества могут включать такие аспекты, как низкая себестоимость, высокая специфичность к субстрату, пониженная антигенность, пониженная нежелательная побочная активность, повышенный выход при продукции в соответствующем микроорганизме, более подходящие температурные и рН диапазоны, отсутствие ингибирования гидрофобными полученными из лигнина продуктами или меньшее ингибирование продуктом или в случае пищевой промышленности лучшие вкусовые качества или текстуры конечного продукта, а также пищевой и кошерный аспекты.
В принципе, целлобиогидролаза или композиция изобретения могут быть применены в любом способе, в котором требуется обработка материала, содержащего полисахарид. Таким образом, полипептид или композиция изобретения могут быть применены при обработке некрахмального полисахаридного материала. В данном документе полисахаридным материалом является материал, который содержит или состоит существенным образом из одного или, что чаще, более чем одного полисахарида.
Как правило, растения и материал, полученный из них, содержат значительные количества некрахмального полисахаридного материала. Соответственно полипептид изобретения может быть применен при обработке растительного или грибного материала или материала, полученного из него.
Подходящие углеводные материалы.
Некрахмальным углеводом, подходящим для модификации мутантной СВН изобретения, как правило, является лигноцеллюлоза. Основными полисахаридами, содержащими различные лигноцеллюлоз-ные остатки, которые могут рассматриваться как потенциальный возобновляемый источник сырья, являются целлюлоза (глюканы), гемицеллюлозы (ксиланы, гетероксиланы и ксилоглюканы). Кроме того, некоторые гемицеллюлозы могут присутствовать в виде глюкоманнанов, например, в сырье, полученном из древесины. Ферментативный гидролиз этих полисахаридов на растворимые сахара, например глюкозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, фруктозу, маннозу, рамнозу, рибозу, D-галактоуроновую кислоту и другие гексозы и пентозы, происходит под действием различных ферментов, действующих совместно.
Кроме того, пектины и другие пектиновые вещества, такие как арабинаны, могут составить значительную долю сухой массы обычной клеточной стенки тканей недревесного растения (от около четверти до половины сухой массы могут быть пектинами).
Соответственно композиция изобретения может быть адаптирована с учетом определенного сырья (также называемого субстратом), которое будет использоваться. Иными словами, спектр активностей композиции изобретения может варьировать в зависимости от рассматриваемого сырья.
Ферментные комбинации или физические обработки могут быть проведены одновременно, или последовательно, или отдельно. Ферменты могут быть получены экзогенно из микроорганизмов, дрожжей, грибов, бактерий или растений, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае ферменты продуцируют, но не выделяют, и среда ферментации с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома) и т.п. добавляют в сырье. В ином случае сырая клеточная масса, или среда для продуцирования фермента, или растительный материал может быть обработан для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавление антимикробных средств), затем добавляют к сырью. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как, кукурузная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Также растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцел-люлозного сырья и могут добавляться в лигноцеллюлозное сырье.
Лигноцеллюлоза.
Важным компонентом растительного некрахмального полисахаридного материала является лигно-целлюлоза (которая также называется в данном документе лигноцеллюлозной биомассой). Лигноцеллю-лоза является растительным материалом, который состоит из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина.
Углеводные полимеры (целлюлоза и гемицеллюлоза) тесно связаны с лигнином водородными и кова-лентными связями. Соответственно полипептид изобретения может быть применен при обработке лиг-ноцеллюлозного материала. В данном документе лигноцеллюлозным материалом является материал, который содержит лигноцеллюлозу или в основном состоит из лигноцеллюлозы. Таким образом, в способе по изобретению для обработки некрахмального полисахарида некрахмальным полисахаридом может быть лигноцеллюлозный материал/биомасса.
Соответственно в изобретении предлагается способ обработки субстрата, содержащего некрахмальный полисахарид, в котором обработка включает деградацию, и/или гидролиз, и/или модификацию целлюлозы, и/или гемицеллюлозы, и/или пектинового вещества.
Деградация в данном контексте означает, что обработка в результате дает образование продуктов гидролиза целлюлозы, и/или гемицеллюлозы, и/или пектинового вещества, т.е. в результате обработки получаются более короткие олигосахариды, чем присутствуют в аналогичном необработанном некрахмальном полисахариде. Таким образом, деградация в данном контексте может приводить к высвобождению олигосахаридов и/или сахарных мономеров.
Все растения, а также практически все полисахаридные материалы, полученные из растений, содержат некрахмальные полисахариды. Соответственно в способе изобретения для обработки субстрата, содержащего некрахмальный полисахарид, указанный субстрат может быть предоставлен в виде растения или материала, полученного из растений, или материала, содержащего растения, или материала, полученного из растений, например растительную пульпу, растительный экстракт, продукт питания или его ингредиент, ткань, текстильное изделие или предмет одежды.
Лигноцеллюлозная биомасса, подходящая для применения в изобретении, может включать первичную биомассу и/или непервичную биомассу, такую как сельскохозяйственная биомасса, коммерческая органика, строительный и городской мусор, твердые бытовые отходы, макулатура и садовые отходы. Распространенные формы биомассы включают деревья, кустарники и травы, пшеницу, пшеничную солому, жмых сахарного тростника, кукурузу, кукурузную солому, листовую обертку початков кукурузы, стержни кукурузных початков, зерна кукурузы, включая волокна из зерен, продукты и побочные продукты помола зерен, таких как кукуруза, пшеница или ячмень (включая влажный и сухой способы помола), часто называемые "отруби или волокна". Биомасса может также быть, без ограничения перечисленным, травянистым материалом, отходами сельского хозяйства, отходами лесного хозяйства, отходами целлюлозно-бумажного производства. "Сельскохозяйственная биомасса" включает ветки, кусты, тростники, кукурузу и листовую обертку початков кукурузы, энергетические культуры, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, травянистые культуры, листья, кору, иголки, бревна, корни, саженцы, деревянистые структуры культур с коротким циклом, кустарники, просо, деревья, овощи, фруктовые корки, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничную крупку, шелуху овса и твердую и мягкую древесины (не включая древесину с вредными материалами). Кроме того, сельскохозяйственная биомасса включает материалы органических отходов, образованных в ходе сельскохозяйственных процессов, включая фермерскую и лесоводческую активности, особенно включая древесные отходы лесного хозяйства. Сельскохозяйственная биомасса может быть отдельно любой из вышеизложенных или любой их комбинацией или смесью. Дополнительными примерами подходящей биомассы являются садовые обрезки, чапаррель, отходы лесопильного производства, городские древесные отходы, городские отходы, отходы лесозаготовок, отходы, полученные при прореживании леса, деревянистые структуры культур с коротким циклом, индустриальный мусор, пшеничная солома, овсяная солома, рисовая солома, ячменная солома, ржаная солома, льняная солома, соевая шелуха, рисовая шелуха, рисовая солома, кукурузный глютеновый корм, овсяная шелуха, сахарный тростник, кукурузная солома, стебли кукурузы, стержни кукурузных початков, кукурузная шелуха, бородач, трипсакум, лисохвост, свекловичный жом, мякоть цитрусовых плодов, семенные оболочки, целлюлозосодержащие животные отходы, настриг с лужаек, хлопок, морские водоросли, деревья, кустарники, травы, пшеница, пшеничная солома, жмых сахарного тростника, кукуруза, листовые обертки початка кукурузы, кукурузное зерно, волокна из зерна, продукты и побочные продукты помола злаков мокрым или сухим способом, твердые бытовые отходы, макулатура, садовые отходы, травянистый материал, сельскохозяйственные отходы, отходы лесного хозяйства, твердые бытовые отходы, пульпа, отходы бумажного производства, ветки, кустарники, тростники, кукуруза, кукурузная шелуха, энергетическая сельскохозяйственная культура, лесоматериал, фрукты, цветы, зерно, трава, травянистые культуры, листья, кора, иглы, бревна, корни, саженцы, кусты, просо, деревья, овощи, фруктовая кожура, виноград, жом сахарной свеклы, пшеничные отруби, овсяная шелуха, твердое или мягкое дерево, материал органических отходов, полученных в ходе сельскохозяйственного процесса, древесные отходы лесного хозяйства или комбинация любого из двух или нескольких из них.
Помимо первичной биомассы или сырья уже обработанного в пищевой, кормовой или бумажной и целлюлозной отраслях, биомасса/сырье может быть дополнительно обработано тепловой, механической и/или химической модификацией или любой комбинацией таких способов в целях усиления ферментативной деградации.
Предварительная обработка.
Перед ферментативной обработкой лигноцеллюлозный материал можно предварительно обрабо
тать. Предварительная обработка может включать воздействие на лигноцеллюлозный материал кислоты, основания, растворителя, нагревания, пероксида, озона, механического измельчения, дробления, перемалывания или быстрого сброса давления или комбинацией любых двух или нескольких из перечисленного. Данную химическую предварительную обработку часто объединяют с термической предварительной обработкой, например, в диапазоне 150-220°С в течение от 1 до 30 мин.
После стадии предварительной обработки может быть проведена стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания, включающая инкубацию с ферментом или ферментной смесью. Стадия предварительного осахаривания может быть осуществлена при различных температурах, но предпочтительно, если предварительное осахаривание происходит при температуре, наиболее подходящей для тестируемой ферментной смеси или для прогнозируемого ферментного оптимума тестируемых ферментов. Температура стадии предварительного осахаривания может находиться в диапазоне от около 10 до 95°С, от около 20 до около 85°С, от 30 до около 70°С, от около 40 до около 60°С, от около 37 до около 50°С, предпочтительно от около 37 до около 80°С, более предпочтительно около 60-70°С, еще более предпочтительно приблизительно 65°С. рН смеси предварительного осахаривания может находиться в диапазоне от около 2,0 до около 10,0, но предпочтительно от около 3,0 до около 7,0, более предпочтительно от около 4,0 до около 6,0, еще более предпочтительно от около 4,0 до около 5,0. Опять же, рН может быть скорректирована для максимизации активности и может быть скорректирована с добавлением фермента. Сравнение результатов анализов этого теста позволит кому-либо модифицировать способ для лучшего соответствия проходящим тестирование ферментам.
Стадия ожижения/гидролиза или предварительного осахаривания может длиться в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 1 до около 120 ч, предпочтительно от около 2 до около 48 ч, более предпочтительно от около 2 до около 24 ч, наиболее предпочтительно в течение от около 2 до около 6 ч. Обработка целлюлазой может происходить в течение от нескольких минут до нескольких часов, например от около 6 до около 120 ч, предпочтительно от около 12 до около 72 ч, более предпочтительно от около 24 до 48 ч.
Биомассу, таким образом, можно подвергнуть различным предварительным обработка, для того чтобы сделать целлюлозу более доступной ферментативному разрушению (гидролизу) и солюбилизиро-вать сахара гемицеллюлозы. "Features of Promising Technologies for Pretreatment of Lignocellulosic Bio-mass," Bioresource Technology 96(3), 673-86. Yi Zheng, Zhongli Pan, Ruihong Zhang, Overview of biomass pre-treatment for cellulosic ethanol production. Int J Agric & Biol Eng, 2009; 2(3): 51-68.
Осахаривание.
В изобретении предлагается способ получения сахара из лигноцеллюлозного материала, который включает контакт полипептида изобретения в композиции изобретения с лигноцеллюлозным материалом.
Такой способ позволяет получать свободные сахара (мономеры) и/или олигосахариды из лигноцел-люлозной биомассы. Эти способы включают преобразование лигноцеллюлозной биомассы в свободные сахара и малые олигосахариды с помощью полипептида или композиции изобретения.
Процесс преобразования сложного углевода, такого как лигноцеллюлоза, в сахара предпочтительно позволяет преобразовать в ферментируемые сахара. Такой способ может называться "осахариванием". Соответственно способ изобретения может давать в результате высвобождение одного или нескольких гексозных и/или пентозных сахаров, таких как один или несколько из числа глюкозы, целлобиозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, галактуроновой кислоты, глюкуроновой кислоты, маннозы, рамнозы, сахарозы и фруктозы.
Соответственно другой аспект изобретения включает способы, в которых используют композицию, описанную выше, вместе с дополнительными ферментами или физическими обработками, такими как температура и рН, для преобразования лигноцеллюлозной растительной биомассы в сахара и олигосаха-риды.
Хотя композиция обсуждалась в качестве отдельной смеси, следует признать, что ферменты могут быть добавлены последовательно, при этом температура, рН и другие условия могут быть изменены для увеличения активности каждого индивидуального фермента. В ином случае для ферментной смеси могут быть определены оптимальные рН и температура.
Ферменты взаимодействуют с субстратом при любых соответствующих условиях. Например, ферменты можно инкубировать при температуре около 25, около 30, около 35, около 37, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90°С или выше. То есть они могут инкубироваться при температуре от около 20 до около 95°С, например, в буферах с ионной силой от низкой до средней и/или при рН от низкого до нейтрального. Под "средней ионной силой" понимается буфер, который имеет концентрацию ионов около 200 мМ или менее для какого-либо одного ионного компонента. рН может быть в диапазоне от около 2,5, около 3,0, около 3,5, около 4,0, около 4,5, около 5, около 5,5, около 6, около 6,5, около 7, около 7,5, около 8,0, до около 8,5 рН. Как правило, диапазон рН будет от около 3,0 до около 7. Для получения этанола предпочтительна кислая среда, например рН 4, тогда как при выработке биогаза желательно нейтральное значение рН 7. Инкубация комбинаций ферментов в этих условиях в результате дает высвобождение или освобождение значительных количеств
сахара из лигноцеллюлозного материала. Под значительным количеством понимается по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95% или большее количество сахаров.
Полипептиды, такие как ферменты, могут быть получены экзогенно в микроорганизмах, дрожжах, грибах, бактериях или растениях, затем выделены и добавлены к лигноцеллюлозному сырью. В ином случае ферменты продуцируют, но не выделяют, а ферментационную среду с сырой клеточной массой или растительный материал (такой как кукурузная солома или пшеничная солома) и т.п. добавляют, например, в сырье. В ином случае сырая клеточная масса, среда для продукции фермента или растительный материал могут быть обработаны для предотвращения дальнейшего микробного роста (например, нагреванием или добавлением противомикробных средств), а затем добавлены в сырье. Эти сырые ферментные смеси могут включать организм, продуцирующий фермент. В ином случае фермент может быть получен при ферментации, в которой используется сырье (такое как кукурузная солома) для обеспечения питания организма, который продуцирует фермент(ы). Также растения, которые продуцируют ферменты, могут служить в качестве лигноцеллюлозного сырья и могут быть добавлены в лигноцеллюлозное сырье.
Ферментация сахаров.
Поддающиеся ферментации сахара могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, не ограничивающие примеры которых включают аминокислоты, витамины, лекарства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол. В частности, сахара могут быть использованы в качестве сырья для ферментации в химические вещества, пластики, такие как, например, янтарная кислота и (био)топливо, включая этанол, метанол, бутанол, синтетические жидкие топлива и биогаз.
Например, в способе изобретения фермент или комбинация ферментов действует на лигноцеллю-лозный субстрат или на растительную биомассу, выступающую в качестве сырья, с тем чтобы преобразовать этот сложный субстрат в простые сахара и олигосахариды для получения этанола или других полезных продуктов ферментации.
Сахара, высвобождаемые из биомассы, могут быть преобразованы в полезные продукты ферментации, которые включают, без ограничения перечисленным, аминокислоты, витамины, лекарства, кормовые добавки для животных, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластмассы, этанол, включая топливный этанол.
Соответственно в изобретении предлагается способ получения продукта ферментации, который включает:
a. деградацию лигноцеллюлозы с помощью способа, описанного в данном документе; и
b. ферментации полученного материала, с получением посредством этого продукта ферментации. Такая ферментация может быть проведена в аэробных или анаэробных условиях. Предпочтительно,
если способ проводится в микроаэрофильных условиях или условиях с ограниченным кислородом.
Способ анаэробного сбраживания здесь определен как способ сбраживания, запускаемый в отсутствие кислорода или в котором фактически не потребляется кислород, предпочтительно менее чем около 5, около 2,5 или около 1 ммоль/л/ч, и в котором органические молекулы служат как донорами электронов, так и акцепторами электронов.
Процесс ферментации при ограничении кислорода является процессом, в котором потребление кислорода ограничивается переносом кислорода из газа в жидкость. Степень ограничения кислорода определяется количеством и композицией входящего потока газа, а также актуальными свойствами перемешивания/переноса массы в используемом для ферментации оборудовании. Предпочтительно, если процесс проводится в условиях с ограниченным кислородом, и скорость потребления кислорода составляет, по меньшей мере 5,5, более предпочтительно по меньшей мере 6, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 ммоль/л/ч.
Способ получения продукта ферментации может необязательно включать извлечение продукта ферментации.
Ферментация с одновременным осахариванием.
Также ферментация и осахаривание могут быть осуществлены в режиме ферментации с одновременным осахариванием (англ. Simultaneous Saccharification Fermentation, SSF). Одно из преимуществ этого режима заключается в уменьшении ингибирования сахарами ферментативного гидролиза (ингибиро-вание сахарами целлюлаз описано Caminal B &B Vol XXVII Pp 1282-1290).
Продукты ферментации.
Продукты ферментации, которые могут быть получены в соответствии с изобретением, включают аминокислоты, витамины, лекарственные средства, добавки к кормам для животных, химические продукты тонкого химического синтеза, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту, этанол, включая топливный этанол (под термином "этанол" понимается включение этилового спирта или смесей этилового спирта и воды).
Конкретные ценные продукты, которые могут быть получены способами изобретения, включают, без ограничения перечисленным, биотопливо (включая этанол, бутанол и биогаз); молочную кислоту;
пластмассы; химические продукты тонкого органического синтеза; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, итаконовую кислоту и малеиновую кислоту; 3-гидрокси-пропионовую кислоту, акриловую кислоту, уксусную кислоту, 1,3-пропан-диол; этилен, глицерин; растворитель; добавку для питания животных, лекарство, такое как р-лактамные антибиотики или цефалоспорины; витамины, аминокислоты, такие как лизин, метионин, триптофан, треонин, и аспараги-новую кислота; промышленные ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, амилазы, глюканазы, лакта-зы, липазы, лиазы, оксидоредуктазы, трансферазы или ксиланазы, и химическое сырье. Биогаз.
В изобретении также предлагается применение описанных в данном документе полипептида или композиции в способе получения биогаза. Биогаз, как правило, относится, к газу, продуцируемому при биологическом разложении органического материала, например материала, содержащего некрахмальный углевод, в отсутствие кислорода. Биогаз образуется из биогенного материала и является типом биотоплива. Один тип биогаза вырабатывается при анаэробном расщеплении или ферментации биодеградируе-мых материалов, таких как биомасса, навоз, силос или сточные воды, бытовые отходы или энергетические культуры. Этот тип биогаза содержит главным образом метан и диоксид углерода. Газ метан можно сжигать или окислять кислородом. Воздух содержит 21% кислорода. Это высвобождение энергии позволяет использовать биогаз в качестве топлива. Биогаз можно использовать в качестве дешевого топлива в любой стране для любых целей нагревания, таких как приготовление пищи. Он также может быть использован в современных предприятиях по переработке отходов, где он может быть использован для функционирования любого типа тепловых машин, для образования либо механической, либо электрической энергии.
Первая стадия при производстве микробного биогаза состоит в ферментативной деградации полимеров и сложных субстратов (например, некрахмального углевода). Соответственно в изобретении предлагается способ получения биогаза, в котором субстрат, содержащий некрахмальный углевод, контактирует с полипептидом или композицией изобретения, что приводит к получению ферментируемого материала, который может быть преобразован в биогаз организмом, таким как микроорганизм. В таком способе полипептид изобретения может быть предоставлен, к примеру, организмом, например микроорганизмом, который экспрессирует такой полипептид.
Применение ферментов в пищевых продуктах.
Полипептиды и композиции изобретения могут быть использованы в способе обработки растительного материала для деградации или модификации целлюлозных и/или гемицеллюлозных или пектиновых составляющих клеточных стенок растительного или грибного материала. Такие способы могут быть полезны при получении пищевых продуктов. Соответственно в изобретении предлагается способ получения пищевого продукта, который включает введение полипептида или композиции изобретения в ходе приготовления пищевого продукта.
В изобретении также предлагается способ обработки растительного материала, который включает контакт растительного материала с полипептидом или композицией изобретения для деградации или модификации целлюлозы в (растительном) материале. Предпочтительным растительным материалом является растительная пульпа или растительный экстракт, такой как соки.
Настоящее изобретение также относится к способу снижения вязкости, прозрачности и/или фильт-руемости растительного экстракта, который включает контакт растительного экстракта с полипептидом или композицией изобретения в количестве, эффективном при деградации целлюлозы или гемицеллюло-зы или пектиновых веществ, содержащихся в растительном экстракте.
Растительные материалы и материалы, содержащие целлюлозу/гемицеллюлозу/пектиновые вещества, включают растительную пульпу, части растений и растительные экстракты. В контексте этого изобретения экстракт из растительного материала является любым веществом, которое может быть получено из растительного материала экстракцией (механической и/или химической), обработкой или другими методами разделения. Экстрактом может быть сок, нектар, основа или концентраты, сделанные из них. Растительный материал может содержать или может быть получен из овощей, например из моркови, сельдерея, лука, бобов или растений семейства бобовых (сои, соевого боба, гороха) или фруктов, например мясистого семечкового плода или семечкового плода (например, яблока, груши, айвы и т.п.), винограда, помидора, цитрусовых (апельсина, лимона, лайма, мандарина), дыни, сливы, вишни, черной смородины, красной смородины, малины, клубники, клюквы, ананаса и других тропических фруктов, деревьев и их частей (например, пыльцы, из сосны), или зерновых (овса, ячменя, пшеницы, кукурузы, риса). Материал (подвергаемый гидролизу) также может быть отходами сельского хозяйства, такими как жом сахарной свеклы, стержни кукурузных початков, пшеничная, солома, скорлупа (земляного) ореха, или перерабатываемыми материалами, например макулатурой.
Полипептиды изобретения, таким образом, можно применять при обработке растительного материала, включая растительную пульпу и растительные экстракты. Они также могут быть использованы для обработки жидких или твердых пищевых продуктов или съедобных ингредиентов пищевых продуктов или могут быть использованы при экстракции кофе, растительных масел, крахмала или в качестве загустителя в продуктах питания.
Как правило, полипептиды изобретения используют в качестве композиции/ферментного препарата как описано выше. Композиция будет, в целом, добавляться к растительной пульпе, получаемой, например, механической обработкой, такой как дробление или перемалывание растительного материала. Инкубация композиции с растением, как правило, будет проводиться в течение от 10 мин до 5 ч, например от 30 мин до 2 ч, предпочтительно в течение около 1 ч. Температура обработки предпочтительно составляет от около 10 до около 55°С, например от около 15 до около 25°С, оптимально около 20, и можно использовать от около 10 до около 300 г, предпочтительно от около 30 до около 70 г, оптимально около 50 г фермента на тонну обрабатываемого материала.
Все используемые ферменты или их композиции могут быть добавлены в растительную пульпу последовательно или одновременно. В зависимости от композиции ферментного препарата растительный материал вначале может быть мацерирован (например, до однородности) или ожижен. С помощью полипептидов изобретения могут быть улучшены параметры обработки, такие как выход экстракции, вязкость экстракта и/или качество экстракта.
В ином случае или в дополнение к вышеуказанному полипептид изобретения может быть добавлен к сырому соку, полученному прессованием или ожижением растительной пульпы. Обработка сырого сока будет проводиться так же, как и обработка растительного жома, при соответствующих дозировке, температуре и времени выдержки. С другой стороны, могут быть добавлены ферменты, такие как те, что обсуждались ранее. Типичными условиями инкубации являются те, которые описаны в предшествующих абзацах.
Для получения конечного продукта после инкубации сырого сока с полипептидами изобретения сок центрифугируют или (ультра)фильтруют.
После обработки полипептидом изобретения (конечный) продукт может быть обработан термически, например, при около 100°С в течение времени от около 1 мин до около 1 ч, в условиях частично или полностью инактивирующих полипептид(ы) изобретения.
Композиция, содержащая полипептид изобретения, также может быть использована в ходе приготовления фруктовых или овощных пюре.
Полипептид изобретения также может быть использован в пивоварении, изготовлении вина, перегонке или выпечке. Полипептид, следовательно, может быть использован при получении алкогольных напитков, таких как вино и пиво. Например, полипептид может улучшить фильтруемость или прозрачность, например, пива, сусла (например, содержащего ячменный солод и/или солод из сорго) или вина.
Более того, полипептид или композиция изобретения могут быть использованы при обработке использованного при пивоварении зерна, т.е. остатки изготовления пивного сусла, содержащие ячмень или осоложенный ячмень или другие зерновые, с тем чтобы улучшить утилизацию остатков, например, для животных кормов.
Белок может оказывать содействие при удалении растворенных органических веществ из питательной среды или культуральной среды, например, когда отходы перегонки органического происхождения биоконвертируют в микробную биомассу. Полипептид изобретения может улучшить фильтруемость и/или снизить вязкость сиропов глюкозы, таких как те, что получают из зерновых ожижением (например, с помощью а-амилазы).
При выпечке полипептид может улучшить структуру теста, модифицировать его липкость или податливость, улучшить объем буханки и/или структуру мякиша или придать улучшенные текстурные характеристики, такие как разлом, разрезание или качество мякиша.
Приготовление теста хорошо известно в данной области и включает смешивание указанных ингредиентов и технологических добавок в одной или в нескольких стадиях из числа стадий разделывания и, необязательно, ферментации. Приготовление замороженного теста описана Kulp и Lorenz в "Frozen and Refrigerated Doughs and Batters".
Некрахмальные полисахариды (англ. Non-starch polysaccharides, NSP) могут повысить вязкость ди-гесты, которая, в свою очередь, может снизить доступность питательных веществ и ухудшить физиологическое состояние животного. Применение целлобиогидролазы настоящего изобретения может улучшить использование фосфора, а также катионов минеральных веществ и белка в ходе переваривания животным.
Добавление конкретных питательных веществ к корму улучшает пищеварение животного и, тем самым, снижает стоимость кормов. В настоящее время используется множество пищевых добавок, и постоянно разрабатываются новые концепции. Применение конкретных ферментов, подобных ферментам, деградирующим некрахмальные углеводы, может уменьшить энергию высвобождения волокон, а также увеличить перевариваемость полипептидов из-за лучшей доступности полипептида при разрушении волокон. Таким образом, стоимость корма может упасть, а также в корме могут быть снижены уровни полипептидов.
Некрахмальные полисахариды (англ. Non-starch polysaccharides, NSP) также присутствуют практически во всех ингредиентах корма растительного происхождения. NSP являются плохо усваиваемыми и могут при солюбилизации проявлять при переваривании побочные эффекты. Экзогенные ферменты могут внести вклад в улучшенную утилизацию этих NSP и, как следствие, могут уменьшить любые антипи
тательные эффекты. Ферменты настоящего изобретения, деградирующие некрахмальные углеводы, могут быть использованы для этой цели в диетах на основе дробленого зерна для домашней птицы и в меньшей степени для свиней и других видов.
Полипетид/фермент изобретения, деградирующий некрахмальные углеводы (композиция, содержащая полипептид/фермент изобретения), может быть использован в промышленности при изготовлении детергентов, например для удаления пятен на основе углеводов с белья при стирке. Детергентная композиция может содержать полипептид/фермент изобретения и, кроме того, одну или несколько цел-люлаз, гемицеллюлаз, пектиназ, протеаз, липаз, кутиназ, амилаз или карбогидраз.
Применение ферментов в детергентных композициях.
Детергентная композиция, содержащая полипептид или композицию изобретения, может находиться в любом обычном виде, например в виде пасты, геля, порошка или жидкости. Жидкий детергент может быть водным, как правило, содержать вплоть до около 70% воды и от около 0 до около 30% органического растворителя или неводного материала.
Такая детергентная композиция, может быть, например, составлена в виде детергентной композиции для ручной или машинной стирки, включая композицию для добавок для стирки, подходящую для предварительной обработки окрашенной ткани и отмывки добавленной композиции смягчителя ткани, или может быть составлена в качестве детергентой композиции для применения в обычных операциях бытовой очистки твердых поверхностей, или составлена для операций ручной или машинной мойки посуды. В целом, свойства фермента должны быть сравнимыми со свойствами выбранного детергента (например, оптимум рН, совместимость с другими ферментными и/или неферментными ингредиентами и т.п.), и фермент(ы) должен присутствовать в эффективном количестве.
Детергентная композиция может содержать поверхностно-активное вещество, например анионное или неионное поверхностно-активное вещество, детергентный наполнитель или комплексообразующий агент, один или несколько полимеров, отбеливающую систему (например, источник Н2О2) или стабилизатор ферментов. Детергентная композиция также может содержать любой обычный детергентный ингредиент, такой как, например, кондиционер, включая глину, пенообразователь, супрессор стойкой пены, антикоррозийное средство, средство, суспендирующее почву, средство против повторного осаждения почвы, краску, бактерицид, оптический отбеливатель, гидротропы, ингибитор потускнения или отдушку.
Применение ферментов при обработке пульпы и бумаги.
Полипептид или композиция настоящего изобретения могут быть использованы в целлюлозно-бумажной промышленности, помимо прочего в процессе отбеливания для усиления белизны отбеленной пульпы, в связи с чем может быть снижено количество хлора, используемого в стадиях отбеливания, и для увеличения садкости пульпы в способе получения бумаги вторичной переработки (Eriksson, K. Е. L., Wood Science and Technology 24 (1990):79-101; Paice, et al., Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988):235-239 и Pommier et al., Tappi Journal (1989): 187-191). Кроме того, полипептид или композиция изобретения могут быть использованы при обработке лигноцеллюлозной пульпы для улучшения ее белимости. Таким образом, количество хлора, необходимого для получения удовлетворительного отбеливания пульпы, может быть снижено.
Полипептид или композиция изобретения могут быть использованы в способе уменьшения скорости, при которой целлюлозосодержащая ткань становится шершавой, или уменьшения шероховатости целлюлозосодержащей ткани, способ включающий обработку целлюлозосодержащей ткани с полипептидом или композицией, как описано выше. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу обеспечения осветления окраски окрашенной целлюлозосодержащей ткани, где способ включает обработку окрашенной целлюлозосодержащей ткани полипептидом или композицией, как описано выше, и к способу локального изменения цвета окрашенной целлюлозосодержащей ткани, где способ включает обработку окрашенной целлюлозосодержащей ткани полипептидом или композицией, как описано выше. Способы изобретения могут быть осуществлены путем обработки целлюлозосодержащей ткани в ходе отмывки. Однако, при необходимости обработка ткани также может быть проведена в ходе замачивания или полоскания или просто путем добавления полипептида или композиции, описанных выше, к воде, в которую погружена или будет погружена ткань.
Другие применения ферментов.
Кроме того, полипептид или композиция настоящего изобретения также могут быть использованы в противобактериальном составе, а также в фармацевтических продуктах, таких как таблетки для рассасывания, зубные пасты и жидкости для полоскания рта.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение.
Примеры.
Материалы и методы. Манипуляции с ДНК.
Стандартные процедуры с ДНК проводили как описано в других источниках (Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), если не указано иное. ДНК амплифицировали с помощью фермента с корректирующей активностью "Phusion polymerase" (Finnzymes). Ферменты рестрикции были приобретены у "Invitrogen" или
"New England Biolabs".
Были разработаны мутанты, содержащие мутации в положениях 6, 7, 34, 36, 41, 47, 48, 52, 77, 99,
101, 144, 171, 177, 192, 194, 195, 196, 198, 200, 205, 232, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 337, 343, 344,
346, 350, 367, 372, 375, 376, 393 и 396 в CBH-I. Соответствующие гены с оптимизированными кодонами, которые экспрессируют мутантную СВН, были получены синтетически.
С помощью стандартных процедур работы с ДНК для каждого из положений, указанных выше, ко-дон был рандомизирован и было протестировано около 96 клонов, покрывая около 15-17 различных аминокислот. Гены, соответствующие мутантам СВН, трансформировали в A. niger. В целях получения экспрессии мутантов настолько однообразно, насколько это возможно, как вектор, так и протоколы трансформации оптимизировали, для того чтобы направить интеграцию в предпочтительные локусы, которые минимизируют шанс случайной интеграции, а также внедрения множества генов.
Способ определения белка CBH-I.
Количество CBH-I оценивали с помощью ЖХ-МС с использованием экспериментальной процедуры, адаптированной из способа "Absolute Quantification" (AQUA) (Gerber M.W. et al. 2003, Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS, PNAS 100, p 6940-6945). Синтетический внутренний стандарт LYLLQDDETYQI*FK.LLNR, содержащий стабильные тяжелые изотопы, использовали для количественной оценки и разработки способа. Стандарт был приведен к масштабу количественной оценки ЯМР перед экспериментами для гарантии того, что было добавлено корректное абсолютное количество внутреннего стандарта. Оптимизацию способа осуществляли с помощью надоса-дочной жидкости штамма, экспрессирующего CBH-I дикого типа, в которую был внесен внутренний стандарт. Протокол гидролиза оптимизировали, основываясь на участке расщепления трипсином, включенном во внутренний стандарт, отслеживая негидролизованную и гидролизованную версии внутреннего стандарта.
Образцы мутантной CBH-I обрабатывали в новых микротитрационных планшетах с низким связыванием. Для очистки белка осуществляли осаждение ТХУ. БСА добавляли для улучшения осаждения белка. Осажденный белок собирали центрифугированием и удаляли надосадочную жидкость. Осадки белка солюбилизировали в 8М мочевине, содержащей внутренний стандарт. Образцы разводили <2М мочевиной с NH4HCO3 и добавляли трипсин для протеолитического гидролиза.
Образцы анализировали с помощью "Accela-LTQ-Orbitrap". Количественную оценку осуществляли путем определения соотношения ЖХ-МС-площади пептида CBH-I или мутантов CBH-I и ЖХ-МС-площади внутреннего стандарта.
Способ определения активности CBH-I.
Все мутанты СВН подвергали скринингу на активность на отмытой предварительно обработанной кислотой пшеничной соломе при 2% сух. вещ. в ацетатном буфере при рН 4,5, в комбинации с фиксированным количеством бета-глюкозидазы. Бета-глюкозидаза, которая была использована в смеси, происходит из Talaromyces emersonii и была экспрессирована в Aspergillus niger. Концентрированные фильтраты ферментов получали как описано в WO 2004/030468. После выращивания Aspergillus niger, содержащего соответствующие экспрессирующие плазмиды, центрифугированием ферментационной питательной среды при 5000xg в течение 30 мин при 4°С были получены бесклеточные надосадочные жидкости. Необязательно надосадочная жидкость может быть скорректирована до рН 5 с помощью 4N KOH и может быть отфильтрована стерильно через 2|am ("bottle-top") фильтр аспирацией для удаления какого-либо материала грибов. Кроме того, надосадочные жидкости могут быть отфильтрованы через фильтр "GF/A Whatmann Glass microfiber" (150 мм 0) для удаления частиц любого рода. Надосадочные жидкости можно концентрировать и хранить до использования при 4°С или замораживать при -20°С.
Количество BG и CBH-I в этом анализе скрининга составляло 2-3 мг бета-глюкозидазы на г сухого вещества пшеничной соломы и 1-2 г CBH-I на г сухого вещества пшеничной соломы. Инкубации проводили при 65°С в течение периода времени от 4 до 96 ч.
Альтернативный способ мог бы заключаться в тестировании CBH-I в смеси с BG, EG и CBH-II, где диапазоны различных ферментов могут быть выбраны следующим образом: BG 4-12%, EG 18-50%, CBH-II 10-35%, a CBH-I 10-60% от общего количества белка 10 мг на грамм сухого вещества пшеничной соломы. Инкубации проводили в период времени в диапазоне от 4 до 96 ч и сравнивались с холостой пробой в начале инкубации. Реакции останавливали в заданный период времени путем осаждения остатка, пипетирования надосадочной жидкости и замораживания образца до анализа. Способ скрининга улучшенных вариантов не ограничен анализами, представленными выше. Субстрат может быть различного происхождения. Способ проводимой предварительной обработки может отличаться. Условия анализов могут варьировать, например осахаривание при различных рН или при другой температуре. Кроме того, природа BG, EG и CBH-II может быть изменена, также как анализ может содержать один, два или три класса целлюлаз, например одну, две или все из числа эндо-1,4-р-глюканазы (EG), экзо-целлобиогидролазы (СВН) и р-глюкозидазы (BG). Кроме того, могут быть добавлены дополнительные вспомогательные ферменты, такие как, например, гемицеллюлазы и/или пектиназы. Анализ устроен таким образом, чтобы целевой фермент для улучшения являлся ограничивающим фактором по отношению
к эффективности.
Анализ осуществляли с помощью проточного ЯМР. !Н ЯМР-спектры записывали на ЯМР-спектрофотометре "Bruker AVANCE II BEST NMR system", работающем при протонной частоте 500 МГц и температуре зонда 27°С.
Мутанты, демонстрирующие наиболее высокое значение высвобождения глюкозы и/или целлобио-зы, отбирали для дальнейшего описания.
Альтернативный способ скрининга мутантов заключался в инкубации надосадочных жидкостей с искусственным субстратом, таким как пара-интрофенол-бета-целлобиозид, как описано в "Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii, Biochimica et Bio-physica Acta 1596 (2002):366-380.
Пример 1. Активность мутантов CBH-I на pNP-целлобиозиде.
Количество белка CBH-I в фильтрованной надосадочной жидкости ферментаций в перемешиваемых колбах трансформантов, экспрессирующих CBH-I (EBA205 и мутанты), определяли с помощью ЖХ-МС.
Инкубировали образцы, содержащие 0,02 мг/мл белка CBH-I, 3 мМ pNP-целлобиозид и 1 мМ глю-конолактон, при 65°С, рН 4,5 в течение 10 и 30 мин.
Из таблицы ясно, что активность мутантов CBH-I была выше как при измерении через 10 мин, так и при измерении через 30 мин.
Таблица 1
Активность мутантов CBH-I на pNP-целлобиозиде (ед./мг). 1 ед. является количеством фермента, способного высвободить 1 мкмоль pNP в мин/мл в условиях анализа
Активность
CBHI
Активность
CBHI
(Ед./мг) 10 мин.
(Ед./мг) 30 мин.
ЕВА205
0,47
100
0,45
100
N247F
0,58
123
0,52
116
D77M
0,60
128
0,52
116
N247H
0,82
174
0,68
151
G357R
0,58
123
0,52
111
Q232A
0,57
121
0,51
113
S36E
0,70
149
0,61
136
K163N
0,58
123
0,51
113
F427I
0,61
130
0,57
127
Пример 2. Активность мутантов CBH-I на предварительно обработанной пшеничной соломе.
Количество белка CBH-I в фильтрованной надосадочной жидкости, полученной
ферментацией трансформантов, экспрессирующих CBH-I (EBA205 и мутанты), в перемешиваемых колбах определяли с помощью ЖХ-МС.
Инкубировали образцы, содержащие 1,0 мг/мл белка CBH-I при 65°С, рН 4.5 в течение 17 и 70 ч.
Результаты в табл. 2 ясно демонстрируют, что мутанты CBH-I лучше высвобождают глюкозу из предварительно обработанной пшеничной соломы.
Таблица 2
Активность мутантов CBH-I в предварительно обработанной пшеничной соломе. Активность представлена в мМ глюкозы, высвобожденной во временные точки 17 и 20 ч
мМ высвобожденной глюкозы
17ч
70 ч
ЕВА205
3,7
100
7,4
100
N247F
4,4
118
6,5
D77M
4,6
123
6,7
N247H
5,7
152
8,4
115
G357R
4,3
115
6,3
Q232A
5,7
151
8,2
S36E
4,1
111
6,9
K163N
4,7
126
6,4
F427I
4,7
124
6,5
Пример 3. Дозозависимые соотношения мутантов CBH-I в смеси целлюлаз.
Активность мутантов CBH-I в смеси целлюлаз тестировали при различных дозах. Дозу мутанта, способного высвободить такое же количество глюкозы, что ЕВА205 в дозировке 1,5 и 3,0 мг/мл, определили и представили в табл. 3 и 4 соответственно.
Активность мутантов CBH-I тестировали с ферментной смесью, содержащей EG, BG и CBH-II в соотношении 4,1:1:2,8. Ферментную смесь дозировали в концентрации 7,0 мг/г сух. вещ., и добавляли различные дозировки CBH-I.
Дозировка мутантов, способных высвободить такое же количество глюкозы, что и ЕВА205 в дозировке 1,5 и 3,0 мг/мл, определена и представлена в табл. 3 и 4.
В табл. 3 и 4 ясно показано, что мутанты CBH-I позволяют использовать CBH-I в смеси целлюлаз в низкой дозировке.
Таблица 3
Доза мутанта CBH-I для достижения высвобождения глюкозы, сходного с высвобождением глюкозы ЕВА205 в концентрации 1,5 мг/г сух. вещ. в различные временные точки (н.о. - не определено)
Доза мутанта CBH-I для получения высвобождения глюкозы сходного с высвобождением глюкозы ЕВА205 в концентрации 3,0 мг/г сух. вещ. в различные временные точки (н.о. - не определено)
5 часов
22 часа
46 часов
70 ч
ISMMGIC
29 мМ Glc
39 мМ Glc
45 мМ Glc
ЕВА205
3,0
3,0
3,0
3,0
N247F
н.о.
1,5
1,8
1,8
D77M
2,3
1,4
1,9
2,3
N247H
1,4
1,2
1,6
Н.О.
G357R
1,7
1,3
1,6
Н.О.
Q232A
2,1
2,3
1,4
2,3
S36E
1,7
1,5
и.о.
Н.О.
K163N
1,9
2,0
2,2
н.о.
F427I
1,6
2,0
Н.О.
н.о.
Список последовательностей
<110> DSM IP Assets B.V.
<120> MUTANT CELLOBIOHYDROLASE
<130> 28004-WO-PCT
<160> 3
<170> Patentin version 3.5
<210> 1 <211> 437 <212> PRT
<213> Talaromyces emersonii <400> 1
Gin Gin Ala Gly Thr Ala Thr Ala Glu Asn His Pro pro Leu Thr Trp
15 10 15
Gin Glu Cys Thr Ala Pro Gly Ser Cys Thr Thr Gin Asn Gly Ala val
20 25 30
val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Asn val Gly Gly Tyr Thr
35 40 45
Asn cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asn Pro Thr Tyr cys Pro Asp Asp
50 55 60
val Thr cys Ala Glu Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Glu Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Gly val Thr Ser ser Gly ser Glu Leu Arg Leu Asn Phe val
85 90 95
Thr Gly ser Asn Val Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu Gin Asp Asp Glu
100 105 110
Thr Tyr Gin lie Phe Lys Leu Leu Asn Arg Glu Phe Thr Phe Asp val
115 120 125
Asp Val ser Asn Leu Pro cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val
130 135 140
Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly val ser Lys Tyr Pro Asn Asn Lys Ala
145 150 155 160
Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr cys Asp ser Gin cys Pro Arg Asp
165 170 175
Leu Lys Phe lie Asp Gly Glu Gly Asn val Glu Gly Trp Gin Pro Ser
180 185 190
Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly lie Gly Asp His Gly ser cys Cys Ala
His Pro cys Asp Thr Pro Gly Gin Thr Met Cys Asp Gly Asp Asp Cys
225 230 235 240
Gly Gly Thr Tyr ser Thr Asn Arg Tyr Ala Gly Glu Cys Asp Pro Asp
245 250 255
Gly cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Thr ser Phe Tyr Gly
260 265 270
Pro Gly Lys lie lie Asp Thr Thr Gin Pro Phe Thr Val val Thr Gin
275 280 285
Phe Leu Thr Asp Asp Gly Thr Asp Thr Gly Thr Leu Ser Glu lie Lys
290 295 300
Arg Phe Tyr lie Gin Asn Gly Lys Val lie Pro Gin Pro Asn Ser Asp
325
335
305 310 315 320
lie ser Gly val Thr Gly Asn ser He Thr Thr Glu Phe cys Thr Ala
330
370
375
Leu Ala Lys Met Gly Ala Ala Met Gin Gin Gly Met val Leu val Met
355 360 365
Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Ala Gin Met Leu Trp Leu Asp ser Asp
380
Cys Pro Thr Asp Ser Gly Val Pro Ser Gin Val Glu Ser Gin ser Pro
Thr Phe Thr Ala ser 435
<210> 2 <211> 18 <212> PRT
<213> Talaromyces emersonii <400> 2
Met Leu Arg Arg Ala Leu Leu Leu ser ser ser Ala lie Leu Ala val
<210> 3
<211> 1368
<212> DNA
<213> Artificial sequence
tctgccatcc tggccgtcaa ggcccagcag 60
gctggtactg ccactgctga gaaccaccct cccttgacct ggcaggagtg cactgctcct 120
ggttcctgca ccactcagaa cggtgctgtt gtccttgaca gcaactggag atgggttcac 180
aacgtcggtg gttacaccaa ctgctacact ggcaacacct ggaaccccac ctactgcccc 240
gatgatgtca cctgcgctga gaactgcgct cttgacggtg ccgactacga gggtacctac 300
ggtgtcactt cttctggctc tgagctccgt ctgaacttcg tcaccggcag caacgtcggc 360
tctcgtctct acctcctcca ggatgacgag acctaccaga tcttcaagct cctcaaccgt 420
gagttcacct tcgatgttga tgtctccaac cttccttgcg gtctgaacgg tgctctgtac 480
ttcgtcgcca tggatgccga cggtggtgtc tccaagtacc ccaacaacaa ggccggtgcc 540
aagtacggta ctggctactg cgacagccag tgcccccgtg acctcaagtt cattgacggc 600
gagggcaacg tcgagggctg gcagccctcc tccaacaacg ccaacactgg tatcggtgac 660
cacggctctt gctgcgctga gatggatgtc tgggaggcca actccatctc caacgccgtc 720
accccccacc cttgcgacac ccccggccag accatgtgcg atggtgatga ctgcggtggt 780
acctactcca ccaaccgcta cgccggtgag tgcgaccccg atggctgcga cttcaacccc 840
taccgcatgg gcaacacctc cttctacggc cctggcaaga tcattgacac cacccagccc 900
ttcaccgttg tcacccagtt cctgaccgat gacggcaccg acactggtac cctctccgag 960
atcaagcgct tctacatcca gaacggcaag gtcatccccc agcccaactc cgacatctcc 1020
ggtgtcaccg gcaactccat caccactgag ttctgcactg ctcagaagca ggctttcggt 1080
gacaccgatg acttctccca gcacggtggt cttgccaaga tgggtgctgc catgcagcag 1140
ggtatggtcc tggtcatgtc cctctgggat gactacgctg ctcagatgct ctggctcgac 1200
tccgactacc ccaccaacgc ctccgccacc actcctggtg ttgctcgtgg tacctgcccc 1260
accgactctg gtgttcctag ccaggttgag agccagtccc ccaactccta cgtgacctac 1320
tccaacatca agttcggtcc catcaactcc accttcactg catcgtaa 1368
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Мутантная целлобиогидролаза, являющаяся мутантом SEQ ID NO:1, содержащая замену в положении N247(I,F,H,W) согласно SEQ ID NO:1, при этом целлобиогидролаза идентична по меньшей мере на 50% последовательности SEQ ID NO: 1 и обладает активностью CBH-I.
2. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N247F.
3. Мутантная целлобиогидролаза по п.1, которая содержит замену N247H.
4. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-3, в которой CBH-I имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, а указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа F427, K163, G357, S36, D77 и/или Q232.
5. Мутантная целлобиогидролаза по п.4, которая содержит одну или несколько из следующих замен: F427I, K163N, G357R, S36E, D77M и/или Q232A.
6. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-5, где CBH-I имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и указанный мутант содержит замену или делецию в положении, соответствующем одному или нескольким из числа остатков Т52, V101, S192, Т198, Т246, Т344, D346, А375 и/или А376.
7. Мутантная целлобиогидролаза по п.6, которая содержит одну или несколько из числа следующих
замен: T52(G,M,Y,D,H,K,R), V101(T,I,F,H), S192(A,I,F,Q,H), T198(A,C,V,P,D,H), T246(G,A,Y,N,H), T344(A,S,C,L,I,Y,W), D346(P,F,G,R), A375(G,I,W,Y,H,K,R) и/или A376(T,V,L,Y,W,D).
8. Мутантная целлобиогидролаза по п.7, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52(M,D,R), V101(I,F), S192F, Т198(А,Н), T246N, T344(Y,C,L), D346(R,G), A375(Y,H) и/или A376(Y,W).
9. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, которая содержит одну или несколько из числа следующих замен: T52D, V101F, S192F, Т198Н, T246N, T344Y, D346G, A375Y и/или A376Y.
10. Мутантная целлобиогидролаза по любому из пп.1-9, которая содержит одну или несколько или делеций в положении, соответствующем одному или нескольким остаткам из числа А6, Т7, L34, V41,Y47, T48, S99, V144, S171, L177, N194, N195, А196, I200, S205, Т243, Y244, S245, Y249, Р255, Q337, D343, Н350, V367, D372, Т393 и/или V396.
11. Мутантная целлобиогидролаза по п.8, содержащая замену С, Р, G, А, V, L, I, M, F, W, Y, H, S, T, N, Q, D, Е, K, R или делецию в любом из положений.
12. Полинуклеотид, кодирующий мутантную целлобиогидролазу по любому из пп.1-11.
13. Нуклеотидная конструкция, содержащая полинуклеотид по п.12.
14. Клетка-хозяин, трансформированная нуклеотидной конструкцией по п.13.
15. Способ получения мутантной СВН, включающий стадии:
(a) культивирования трансформированной клетки-хозяина по п.14 в подходящей культуральной среде в условиях, подходящих для получения мутантной целлобиогидролазы;
(b) получения указанной продуцируемой мутантной целлобиогидролазы; и при необходимости
(c) очистки указанной мутантной целлобиогидролазы для получения очищенной мутантной целлобиогидролазы.
16. Ферментная композиция, содержащая одну или несколько мутантных целлобиогидролаз по любому из пп.1-11 или полученная согласно способу по п.15.
17. Способ деградации лигноцеллюлозного или гемицеллюлозного материала, в котором лигноцел-люлозный или гемицеллюлозный материал приводят в контакт с ферментной композицией по п.16.
18. Способ по п.17, в котором вырабатывается один или несколько сахаров.
19. Способ по п.18, в котором выработанный сахар ферментируют для получения продукта ферментации.
20. Способ по п.19, в котором продукт ферментации является одним или несколькими из числа этанола, бутанола, молочной кислоты, пластика, органической кислоты, растворителя, добавки к кормам для животных, фармацевтического препарата, витамина, аминокислоты, фермента или химического сырья.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023945
- 1 -
023945
- 1 -
023945
- 1 -
023945
- 1 -
023945
- 4 -
023945
- 20 -
023945
- 21 -
023945
- 21 -