|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] 1. Пептид, включающий последовательность SEQ ID NO: 8 (SPQYSWRINGIPQQHT), который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 100 аминокислотами. 2. Пептид по п.1, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 30 аминокислотами. 3. Пептид по п.1 или 2, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II. 4. Пептид по любому из пп.1-3, где пептид состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8. 5. Пептид по любому из пп.1-4, где указанный пептид включает непептидные связи. 6. Пептид по любому из пп.1-5, где пептид является частью слитого белка, содержащего N-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ii) HLA-DR. 7. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид в соответствии с любым из пп.1-6. 8. Нуклеиновая кислота по п.7, которая представляет собой ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинации или вектор экспрессии, где данный вектор функционально связан с данной нуклеиновой кислотой. 9. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с п.7 или 8, которая является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой, где указанная клетка представляет собой нечеловеческую эмбриональную стволовую клетку. 10. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, включающий контактирование ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточный для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом в соответствии с любым из пп.1-6. 11. Активированный цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ), полученный с помощью способа в соответствии с п.10, который селективно распознает клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в любом из пп.1-4. 12. Применение пептида в соответствии с любым из пп.1-6, нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии в соответствии с п.7 или 8, клетки в соответствии с п.9 или активированного цитотоксического Т-лимфоцита в соответствии с п.11 в качестве лекарственного средства для лечения рака. 13. Применение по п.12, где рак представляет собой глиобластому, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак почки или рак желудка. 14. Применение по п.12 или 13, где указанное лекарственное средство является вакциной.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
1. Пептид, включающий последовательность SEQ ID NO: 8 (SPQYSWRINGIPQQHT), который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 100 аминокислотами. 2. Пептид по п.1, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 30 аминокислотами. 3. Пептид по п.1 или 2, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II. 4. Пептид по любому из пп.1-3, где пептид состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8. 5. Пептид по любому из пп.1-4, где указанный пептид включает непептидные связи. 6. Пептид по любому из пп.1-5, где пептид является частью слитого белка, содержащего N-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ii) HLA-DR. 7. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид в соответствии с любым из пп.1-6. 8. Нуклеиновая кислота по п.7, которая представляет собой ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинации или вектор экспрессии, где данный вектор функционально связан с данной нуклеиновой кислотой. 9. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с п.7 или 8, которая является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой или антигенпрезентирующей клеткой, где указанная клетка представляет собой нечеловеческую эмбриональную стволовую клетку. 10. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, включающий контактирование ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточный для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом в соответствии с любым из пп.1-6. 11. Активированный цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ), полученный с помощью способа в соответствии с п.10, который селективно распознает клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в любом из пп.1-4. 12. Применение пептида в соответствии с любым из пп.1-6, нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии в соответствии с п.7 или 8, клетки в соответствии с п.9 или активированного цитотоксического Т-лимфоцита в соответствии с п.11 в качестве лекарственного средства для лечения рака. 13. Применение по п.12, где рак представляет собой глиобластому, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак почки или рак желудка. 14. Применение по п.12 или 13, где указанное лекарственное средство является вакциной.
Евразийское
патентное
ведомство
023928
(13) B1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201300322
(22) Дата подачи заявки 2008.07.25
(51) Int. Cl.
C07K14/705 (2006.01) C12N15/63 (2006.01) A61K39/00 (2006.01) A61K38/16 (2006.01)
(54)
КОМПОЗИЦИЯ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ И ОТНОСЯЩАЯСЯ К НИМ ПРОТИВОРАКОВАЯ ВАКЦИНА
(31) EP07014796.2; 60/953,109; 60/981,241
(32) 2007.07.27; 2007.07.31; 2007.10.19
(33) EP; US; US
(43) 2013.10.30
(62) 201000208; 2008.07.25
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Сингх Харпрет, Шор Оливер, Траутвайн Клаудиа, Хильф Норберт, Вайншенк Тони, Вальтер Штеффен, Левандровски Петер (DE)
(74) Представитель:
Дементьев В.Н., Клюкин В.А., Угрюмов В.М., Лыу Т.Н., Гизатуллина Е.М., Карпенко О.Ю. (RU)
(56) Database GenBank, AAA51972.1, 01.11.1994 RUIZ MARTA et al.: Identification and Characterization of a T-Helper Peptide from Carcinoembryonic Antigen. Clinical Cancer Research, 2004, Vol. 10, p. 2860-2867, особенно, с. 2860, с. 2862, табл. 1, с. 2864-2866
MARGARET VON MEHREN. Colorectal Cancer Vaccines: What We Know and What We Don't Yet Know. Seminars in Oncology, 2005, Vol. 32, p. 76-84, особенно, с. 76, 78, табл. 2, с. 79 WO-A1-2006114307
(57) Изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против колоректального рака.
Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим пептидам и их применению в иммунотерапии, в частности иммунотерапии рака. Настоящее изобретение раскрывает опухолеассоциирован-ные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассо-циированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В особенности композиция пептидов настоящего изобретения может быть использована в вакцинных композициях для инициации противоопухолевых иммунных ответов против колоректального рака.
В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.
Уровень техники
Колоректальная карцинома.
По данным Американского общества по борьбе с раком колоректальный рак (КРР) занимает третье место по частоте распространения в США, это заболевание поражает ежегодно более 175000 новых пациентов. В США, Японии, Франции, Германии, Италии, Испании и Великобритании оно поражает более 480000 пациентов. Это одна из наиболее частых причин смертности от рака в развитых странах.
Исследователи предполагают, что возникновение колоректального рака является результатом взаимодействия между наследственными факторами и факторами окружающей среды. В большинстве случаев появляются аденоматозные полипы, становясь предшественниками колоректальных опухолей, хотя процесс их перехода в опухоль может занять многие годы. Первостепенный фактор риска для заболевания колоректальным раком - это возраст, в 90% случаев диагноз был поставлен в возрасте более 50 лет. Другие факторы риска заболевания колоректальным раком по данным Американского общества по борьбе с раком включают употребление алкоголя, питание с высоким содержанием жиров и/или сырого мяса и неадекватное потребление фруктов и овощей. Число новых случаев продолжает расти, в особенности на территории таких стран, как Япония, где виновником может быть внедрение западных образцов питания с избыточным потреблением жира и мяса и снижение потребления волокнистой пищи. Несмотря на это частота заболеваемости растет не так быстро, как раньше, что может быть связано с увеличением количества скринингов и удалением полипов, предотвращая, таким образом, прогрессирование заболевания и переход полипов в рак.
Как и при большинстве солидных опухолей, терапия первого ряда - операция, однако только пациенты на ранней стадии могут получить от этого пользу, значительной же доле пациентов диагноз ставится лишь на поздних стадиях заболевания. В химиотерапии колоректального рака на поздних стадиях стандартом лечения являются лечебные схемы, основанные на фторурациле. Большинство данных лечебных схем представляют собой так называемые курсы лечения "FOLFOX" (вливание 5-РИ/лейковорин плюс оксалиплатин) и "FOLFIRI" (иринотекан, лейковорин, болюсное и продолжительное вливание 5-FU).
Внедрение цитотоксических препаратов третьего поколения, таких как иринотекан и оксалиплатин, увеличило надежду на значительное улучшение эффективности, однако прогнозы до сих пор относительно безнадежные. Срок выживаемости при метастатической болезни, как правило, составляет приблизительно 20 месяцев и, в результате этого, остается высокой беспомощность медицины при данном заболевании.
Недавно стало доступным новое поколение медикаментов, действующих на молекулярные мишени, таких как Авастин (бевацизумаб) и Эрбитукс (цетуксимаб), а около 40 соединений находятся на поздней стадии клинических исследований для лечения различных стадий колоректального рака. Комбинации из нескольких таких соединений повышают число потенциальных возможностей лечения, ожидаемых в будущем. Подавляющее большинство веществ находятся на 2-й фазе исследований, при этом данные соединения более часто, чем другие разрабатываемые медикаменты против колоректального рака, адресованы против EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), что связано с тем фактом, что у ~80% пациентов с колоректальным раком наблюдается повышенная экспрессия EGFR.
На данный момент проводятся клинические исследования с пациентами II стадии с комбинацией химиотерапии с одобренными недавно моноклональными антителами (mAbs) (цетуксимаб+иринотекан или FOLFOX4; бевацизумаб в качестве монотерапии или вместе с FOLFOX4). Для получения статистически достоверных результатов по данным исследованиям необходимы 3-4-годичные периоды наблюдения.
Моноклональные антитела (mAbs), используемые в настоящее время в онкологии, в целом имеют превосходные шансы на то, что они не будут создавать помех активной иммунотерапии. Действительно, имеются доклинические данные, предполагающие, что элиминация фактора роста эндотелия сосудов VEGF (в случае бевацизумаба) вносит положительный вклад в опосредованную ДК (дендритные клетки) активацию Т-клеток.
На данный момент в около 16 исследованиях проверяется безопасность и потенциал новых имму-нотерапевтических подходов для лечения КРР.
Иммунотерапевтические подходы в лечении.
Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.
Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опу-холь-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993, 690:101-112; Zeh H.J., Perry-Lalley D., Dudley M.E., Rosenberg S.A., Yang J.C.; J. Immunol. 1999, 162 (2):989-94; High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy). В частности, CD8-положительные Т-клетки (TCD8+), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованными из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIPS) (Schubert U., Anton L.C., Gibbs J., Nor-bury C.C., Yewdell J.W., Bennink J.R.; Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779):770-774), находящихся в цитозоли, играют важную роль при этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA).
Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться на большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся из протеолитиче-ского расщепления эндогенных белков DRIPS и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и пре-зентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и молекулы МНС класса I распознаются CD8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами с соответствующим ТКР (Т-клеточный рецептор), комплексы из пептида и молекулы МНС класса II распознаются CD4-положительными хелперными Т-клетками с соответствующим ТКР.
CD4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов, и поэтому идентификация CD4-положительных Т-клеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (Kobayashi, Н., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J.J. Lasarte, M. Herraiz, В. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from car-cinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 2002, 8:3219-3225, Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jager, M. Matsuo,
A. Selvakumar, N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, and L.J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100 (15): 8862-7); CD4+ T- клетки могут приводить к локальному повышению уровня IFNy (Qin Z., Schwartzkopff J., Pradera F., Kammertoens T., Seliger B., Pircher H., Blankenstein T.; A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells; J. Cancer Res; 2003, 63(14):4095-4100).
На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (т.е. CD8-положительных Т-лимфоцитов), CD4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирующего проявления опухолей посредством инги-бирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (IFNy) (Qin, Z. and Т. Blankenstein. CD4+ T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686). К тому же было показано, что CD4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентиро-ванные молекулами HLA класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (Ab) (Kennedy, R.C., М.Н. Shearer, A.M. Watts, and R.K. Bright. 2003. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. 2003, 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами HLA класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число лигандов класса II опухолеассоции-рованных антигенов (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de).
Так как конститутивная экспрессия молекул HLA класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Mach, В., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 1996, 14: 301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Тем не менее, изобретателям недавно удалось идентифицировать ряд эпитопов МНС класса II напрямую из опухолей (ЕР 1642905, ЕР 1760088; Dengjel J., Nastke M.D., Gouttefangeas C., Gitsioudis G., Schoor О., Altenberend F., Muller M., Kramer B., Missiou A., Sauter M., Hennenlotter J., Wernet D., Stenzl A., Rammensee H.G., Klingel K., Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163
4170).
При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например, моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам. Неожиданным образом у пациентов с опухолевыми заболеваниями было обнаружено, что клетки опухолей экспрессируют молекулы МНС II класса (Dengjel J., Nastke M.D., Gouttefangeas C., Gitsioudis G., Schoor О., Altenberend F., Muller M., Kramer B., Missiou A., Sauter M., Hennenlotter J, Wernet D., Stenzl A., Rammensee H.G., Klingel K., Stevanovic S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170).
Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков в длину и обычно содержат два консервативных остатка ("якорь") в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет "соединительный элемент", определяющий, какие пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Rammensee H.G., Bachmann J., Ste-vanovic S. МНС ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997).
В зависящей от МНС I класса иммунной реакции пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС I класса, экспрессируемыми опухолевыми клетками, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими Т-клеточные рецепторы (ТКР).
Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими Т-лимфоцитами, т.е. их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены, например, могут быть представлены также только в опухолевых клетках, например, как продукты мутировавших генов. Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как антигены СТ ("раковый тестикул"), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника.
Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем, много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифи-ческие антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозина-зой для меланомы, PSA (простата-специфический антиген) и PSMA (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными кроссоверами (транслокации), такими как bcr/abl в лимфоме. Тем не менее, многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей, и некоторые, такие как онкогенные белки и/или гены-супрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Linehan W.M., Walther M.M., Zbar В. The genetic basis of cancer of the kidney. J. Urol. 2003 Dec. 170 (6Ptl):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (который является примером гена-супрессора опухоли), ras, c-met, myc, pRB, VHL, и HER-2/neu, могут аккумулировать мутации, приводящие к повышенной экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (McCartey et al. Cancer Research 1998, 15:58, 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994, 187:198-211). Эти мутантные белки также могут быть мишенью опухолеспецифиче-ского иммунного ответа при многих видах рака.
Иммунотерапия больных раком направлена особенно на активацию клеток иммунной системы, в особенности, т.н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известные как "киллерные клетки", известные также как CD8-положительные Т-клетки) против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных белков. Молекулы HLA презентируют наружу на клеточной поверхности клеточное содержимое, таким образом, давая возможность цитотоксическим Т-клеткам отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются, затем, к молекулам HLA и презентируются на клеточной поверхности (Rammensee, H.G., Falk, K., and Rotzschke, О.; Peptides naturally presented by MHC class I molecules, Annu. Rev. Immunol., 1993, 11,213-244). Пептиды, представленные на опухолевых клетках, а не или в намного меньшей степени на здоровых клетках организма, называются опухолеассоциированными пептидами (TUMAPs).
Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифи-ческого или ассоциированного антигена, и чтобы они могли использоваться в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в сравнительно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в каком-либо виде опухоли, но и также имел высокую концентрацию (т.е. число копий соответствующего пептида на клетку). Опухолеспецифи-ческие и опухолеассоциированные антигены часто бывают образованы из белков, напрямую задейство
ванных в трансформации нормальной клетки в опухолевую, в связи с функцией, например, при контроле клеточного цикла или апоптозе. В дополнение также мишени белков нисходящего каскада реакций, напрямую являющихся причиной трансформации, могут быть представлены в повышенном количестве и, таким образом, косвенно опухолеассоциированными. Такие косвенно опухолеассоциированные антигены могут также быть мишенями вакцинационного подхода. В обоих случаях необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид ("иммуногенный пептид"), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести in vitro или in vivo к Т-клеточному ответу.
В основном любой пептид, способный связываться с молекулой МНС, может выполнять функцию Т-клеточного эпитопа. Предварительным условием для индукции Т-клеточного ответа in vitro или in vivo является присутствие Т-клетки с соответствующим ТКР и отсутствие толерантности к данному конкретному эпитопу. Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа ТН1, поддерживают эффекторные функции CD8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опу-холеассоциированные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухоле-ассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухоле-ассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.
Так как оба вида ответов, зависящие от CD8 и от CD4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и усиливая друг друга, то идентификация и характеристика опухолеассоциированных антигенов, распознаваемых как CD8+ ЦТЛ (молекула МНС I класса), так и CD4-положительными ЦТЛ (молекула МНС II класса) являются важными при разработке противоопухолевых вакцин. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение композиций пептидов, которые содержат пептиды, связывающиеся с комплексами МНС любого класса.
Первые клинические испытания с использованием опухолеассоциированных пептидов были начаты в середине 1990 г. Буном (Boon) и коллегами, в основном, для показания меланома. Клинические ответы в лучших попытках достигали от 10 до 30%. О серьезных побочных эффектах или сильной аутоиммун-ности не сообщалось ни в одном клиническом исследовании с использованием основанной на пептидах вакцинной монотерапии. Сообщалось о слабых формах витилиго у некоторых пациентов, проходивших лечение меланома-ассоциированными пептидами.
Тем не менее, прайминга одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры для избегания узнавания ЦТЛ. Для контратаки по механизмам уклонения опухоли от ударов для вакцинации использовались различные специфические пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ, действовавшим синхронно. Так могут быть снижены шансы опухоли на ускользание от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. С всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по меньшей мере три различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабильность заболевания (Banchereau, J., Palucka, A.K., Dhodapkar, M., Burkeholder, S., Taquet, N., Rolland, A., Taquet, S., Coquery, S., Wittkowski, K.M., Bhardwaj, N., Pineiro, L., Steinman, R., and Fay, J.; Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34 (+) progenitor-derived dendritic cell vaccine, Cancer Res., 2001, 61, 6451-6458), а также увеличение выживаемости (личные беседы с J. Banchereau), в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее трех Т-клеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания.
Исследование кандидатов демонстрировало похожий эффект, если пациенты, страдавшие от почеч-но-клеточной карциномы, проходили курс лечения с вакциной, составленной из 13 различных пептидов (Н. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P.Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017; M.
Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017).
Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является, поэтому, не только идентификация и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов, но и комбинирование различных эпитопов для увеличения вероятности ответа на более чем один эпитоп для каждого пациента. Поэтому целью настоящего изобретения является обеспечение комбинаций аминокислотных последовательностей таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса I (HLA класса I) или II (HLA класса II). Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение эффективной противораковой вакцины, которая основана на комбинации этих пептидов.
В настоящем изобретении изобретатели изолировали и охарактеризовали пептиды, связывающиеся с молекулами HLA класса I или II, напрямую из опухолей млекопитающих, т.е. колоректальных карцином.
Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (HLA) II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности CD4-положительных Т-лимфоцитов, в особенности CD4-положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа TH1.
Настоящее изобретение обеспечивает также пептиды, которые образованы из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и имеют способность связываться в достаточной мере с молекулами МНС (HLA) I класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности CD8-положительных цитотоксических Т-лимфоцитов, в равной степени как и комбинации обоих, которые особенно полезны для вакцинации пациентов, страдающих от рака.
В соответствии с настоящим изобретением поставленная задача решена обеспечением фармацевтической композиции, включающей по крайней мере два пептида, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 7, и/или содержащих вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична последовательностям с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 7, и/или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 7 или вариантную аминокислотную последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению в дальнейшем могут включать по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 по SEQ ID NO: 15, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% идентична последовательностям с SEQ ID NO: 8 по SEQ ID NO: 15, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 8 по SEQ ID NO: 15 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды могут иметь общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, и особенно предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами. Пептиды могут также иметь непептидные связи.
Как будет описано далее, пептиды, формирующие основу настоящего изобретения, были все идентифицированы как презентируемые несущими клетками МНС I или II класса. Таким образом, эти конкретные пептиды так же, как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т.е. дериваты пептидов), все вызывают специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами и отдельными пациентами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в пептидах. Специалист данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться для определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу.
Предпочтительным образом, варианты по изобретению будут индуцировать Т-клеточную перекрестную реакцию с соответствующим пептидом по изобретению.
Процентная доля гомологии между аминокислотной последовательностью пептида или последова-
тельностью нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, и вариантом может быть подсчитана с помощью
алгоритмов, хорошо известных из уровня техники. В настоящем изобретении термин "гомологичный"
относится к степени идентичности между последовательностями двух аминокислотных последователь-
ностей, т.е. пептидных или полипептидных последовательностей. Упомянутая ранее "гомология" опре-
деляется при сравнении двух последовательностей, сопоставляемых в оптимальных условиях со сравни-
ваемыми последовательностями. Сравниваемые здесь аминокислотные или нуклеинокислотные последо-
вательности могут иметь дополнение или делецию (например, разрыв и т.п.) в оптимальном противопос-
тавлении двух последовательностей. Такая гомология последовательности может быть подсчитана с по-
мощью создания противопоставления, например, по алгоритму ClustalW (Nucleic Acid Res., 22(22): 4673,
4680 (1994). Также может быть использовано широко распространенное программное обеспечение для
анализа последовательностей, в частности, Vector NTI, GENETYX или аналитические инструменты, пре-
доставляемые общественными банками данных, такие как, например,
http://restools.sdsc.edu/biotools/biotools16.html.
Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и обычно представляют собой жидкости, в которых приготавливается активное терапевтическое вещество. Носитель обычно не обеспечивает состав никакой фармакологической активностью, хотя он может обеспечивать химическую и/или биологическую стабильность, характеристики высвобождения и т.п. Примеры составов рассматриваются, например, у Alfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000 и включают, но не ограничиваются, раствором натрия хлорида, водой, буферной водой, 0,3% глицином, гиалуроновой кислотой, декстрозой и т.п. Недавно было обнаружено, что определенные жировые эмульсии, которые в течение многих лет использовались для внутри
венного питания пациентов (людей), могут также выступать в роли наполнителя для пептидов. Два примера таких эмульсий представляют собой имеющиеся в продаже жировые эмульсии, известные как Ин-тралипид (Intralipid) и Липофундин (Lipofundin). "Intralipid" является зарегистрированной торговой маркой фирмы Kabi Pharmacia, Швеция, для жировой эмульсии для внутривенного питания и описывается в патенте США U.S. Pat. No. 3169094. "Lipofundin" - это зарегистрированная торговая марка фирмы В. Braun Melsungen, Германия. Обе эмульсии в качестве жира содержат масло соевых бобов (100 или 200 г на 1000 мл дистиллированной воды: 10% или 20% соответственно).
Фосфолипиды яичного желтка используются в качестве эмульгатора в Интралипиде (12 г/л дистиллированной воды) и лецитин яичного желтка - в Липофундине (12 г/л дистиллированной воды). Изото-ничность является результатом добавления глицерола (25 г/л) как в Интралипид, так и в Липофундин.
Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциирован-ных антигенов с функциями, например, в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани и т.д. В табл. 1 представлены пептиды и функция белка, из которого они образованы.
Открытая рамка считывания 42 хромосомы 20.
C20orf42 является белком фокальной адгезии, задействованным в присоединении актинового цито-скелета к плазменной мембране и в опосредованных интегрином клеточных процессах. Дефицит C20orf42 как результат мутаций с потерей функции приводит к синдрому Киндлера, аутосомальному рецессивному генодерматозу, характеризующемуся образованием волдырей на коже, прогрессивной атрофией кожи, светочувствительностью и, изредка, к канцерогенезу (Herz, С., Aumailley, M., Schulte, С., Schlotzer-Schrehardt, U., Bruckner-Tuderman, L., and Has, C.; Kindlin-1 is a phosphoprotein involved in regulation of polarity, proliferation, and motility of epidermal keratinocytes, J. Biol Chem., 2006, 281, 3608236090). Недавно сообщалось о серьезном поражении желудочно-кишечного тракта с гемоколитом у пациента с мутацией с потерей функции (Sadler, E., Klausegger, A., Muss, W., Deinsberger, U., Pohla-Gubo, G., Laimer, M., Lanschuetzer, C., Bauer, J.W., and Hintner, H.; Novel KINDI gene mutation in Kindler syndrome with severe gastrointestinal tract involvement, Arch. Dermatol., 2006, 142, 1619-1624).
В контексте раковых заболеваний C20orf42 описывался в исследованиях, занимающихся изучением экспрессии генов в окружении, имеющем отношение к раку. Как было обнаружено, он был гиперэкс
прессирован в 70% случаев рака толстой кишки и 60% случаев рака легких (n=10). Нормальная тканевая экспрессия при нозерн-блоттинге (Northern Blot) была ограничена нейромышечными тканями (Weinstein, E.J., Bourner, M., Head, R., Zakeri, H., Bauer, С., and Mazzarella, R.; URP1: a member of a novel family of PH and FERM domain-containing membrane-associated proteins is significantly over-expressed in lung and colon carcinomas, Biochim. Biophys. Acta, 2003, 1637, 207-216). Кроме того, C20orf42 был идентифицирован как ген, участвующий в TGF-p-опосредованной клеточной миграции и опухолевой инвазии (Kloeker, S., Major, M.B., Calderwood, D.A., Ginsberg, M.H., Jones, D.A., and Beckerle, M.C.; The Kindler syndrome protein is regulated by transforming growth factor-beta and involved in integrin-mediated adhesion, J. Biol. Chem., 2004,
279, 6824-6833).
NADPH-оксидазы гомолог-1 (NOX1).
NOX1 является чувствительным к факторам роста ферментом, который катализирует образование реактивных форм кислорода, высшего оксида (О2-) и перекиси водорода (H2O2). Его экспрессия была первоначально выявлена в толстой кишке, простате, матке и пролиферирующих васкулярных гладкомы-шечных клетках (Sun, YA. et al. Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Moxl. Nature 1999, 401, 79-82). Его экспрессия связана с рядом биологических реакций, включая клеточную пролиферацию, ангиогенез и активацию клеточных сигнальных путей (Harper, R.W., Xu, С., Soucek, K., Setiadi, H. and Eiserich, J.P. A reappraisal of the genomic organization of human Noxl and its splice variants. Arch. Biochem.
Biophys. 2005, 435, 323-330).
NOX1 высокоэкспрессирован в толстой кишке, но его функция в кишечной физиологии или патологии до сих пор плохо изучена. В нормальных тканях экспрессия NOX1 была низкой в подвздошной кишке, средней в восходящей ободочной кишке и высокой в нисходящей ободочной кишке. Статистических различий по экспрессии NOX1 не наблюдалось между пробами, взятыми из аденом, хорошо или плохо дифференцированных аденокарцином толстой кишки. NOX1 был высокоэкспрессирован в эпителиальных клетках толстой кишки, как в криптах, так и на люминальной поверхности. В заключение, NOX1 является ферментом, который конститутивно экспрессирован в эпителии толстой кишки и не ассоциирован напрямую с генезом опухоли (Szanto, I. et al. Expression of NOX1, a superoxide-generating NADPH oxidase, in colon cancer and inflammatory bowel disease. J. Pathol. 2005, 207, 164-176).
Иммуногистохимия показала, что NOX1 был конститутивно экспрессирован в поверхности слизистых клеток. Аденомы и хорошо дифференцированные аденокарциномы повышали уровень экспрессии NOX1. Ядерный фактор (NF)-kappaB был преимущественно активирован в клетках аденомы и аденокар-циномы, экспрессирующих в избытке NOX1, приводя к предположению, что NOX1 может стимулировать NF-карраВ-зависимые антиапоптотические каскады реакций в опухолях толстой кишки (Fukuyama, M. et al. Overexpression of a novel superoxide-producing enzyme, NADPH oxidase 1, in adenoma and well differentiated adenocarcinoma of the human colon. Cancer Lett. 2005, 221, 97-104).
Сигнальные реакции с Wnt3a/beta-катенином, как было описано, индуцируют экспрессию NOX1 (Petropoulos, H. & Skerjanc, I. S. Beta-catenin is essential and sufficient for skeletal myogenesis in P19 cells. J.
Biol Chem. 2002, 277, 15393-15399).
Недавно предполагалось, что реактивные формы кислорода индуцируют эндотелиальный апоптоз, который впоследствии индуцирует экспрессию различных адгезивных молекул для опухолевых клеток. Это указывает на то, что при остановке выделения ROS (активные формы кислорода) препятствование рецидиву опухоли на отдаленных участках может быть обоснованным (Ten, K.M., van der Wal, J.B., Sluit-er, W., Hofland, L.J., Jeekel, J., Sonneveld, P., and van Eijck, C.H.; The role of superoxide anions in the development of distant tumour recurrence, 2006, Br.J Cancer).
Орнитин-декарбоксилаза 1 (ODC1).
ODC1 - это ограничивающий количество фермент при реакциях биосинтеза полиаминов, который катализирует орнитин в путресцин. Уровень активности фермента варьируется в зависимости от способствующих росту стимулов и проявляет высокую интенсивность обмена веществ по сравнению с другими белками млекопитающих.
Метаболизм полиаминов является неотъемлемым компонентом механизма канцерогенеза в эпителиальных тканях. Увеличения ODC1 часто ассоциируются с началом роста нормальных клеток и с продолжительным ростом опухолевых клеток. Ингибиторы ODC1 подавляют образование опухоли в экспериментальных моделях канцерогенеза мочевого пузыря, груди, толстой кишки и кожи. Гиперэкспрессия активности ODC1 - это хорошо известная черта многих видов рака, и ODC1 считался протоонкогеном (Auvinen, M., Paasinen, A., Andersson, L. С. and Holtta, E. Ornithine decarboxylase activity is critical for cell transformation. Nature 1992, 360, 355-358).
Мутации в линиях гоноцитов в гене аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС) являются одной из наиболее явно выраженных наследственных предрасположенностей к раку толстой кишки.
Мутации АРС вызывают значительное увеличение уровней свободного р-катенина, который перемещается в ядро, где формирует комплекс с членами семейства лимфоидно-усиливающих факторов (LEF)/Т-клеточных факторов (Tcf) последовательность-специфических факторов транскрипции. Онкоген c-myc является одним из генов-мишеней Tcf (Не, Т.С. et al. Identification of c-MYC as a target of the APC
pathway Science 281, 1509-1512 (1998). c-Myc РНК и белок гиперэкспрессированы как на ранних, так и на поздних стадиях онкогенеза колоректального рака). ODC является геном-мишенью с-Мус.
Потеря функции АРС приводит к увеличению количества ODC1 (Gemer, E.W. and Meyskens, F.L., Jr., Polyamines and cancer: old molecules, new understanding, Nat. Rev. Cancer, 2004, 4, 781-792), и гиперэкспрессия наблюдается часто при колоректальной карциноме (Hu, RY. et al. Ornithine decarboxylase gene is overexpressed in colorectal carcinoma, World J. Gastroenterol. 2005, 11, 2244-2248; Kitahara, 0. et al. Alterations of gene expression during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser-capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia; Cancer Res. 2001, 61, 3544-3549; Nemoto, Т., Kubota, S., Ishida, H., Murata, N. and Hashimoto, D. Ornithine decarboxylase, mitogen-activated protein kinase and matrix metalloproteinase-2 expressions in human colon tumors. World J. Gastroenterol. 2005, 11, 30653069).
ODC1 обладает проангиогенными свойствами, действуя в качестве супрессора эндостатина (Nemo-to, Т., Hori, H., Yoshimoto, М., Seyama, Y. & Kubota, S. Overexpression of ornithine decarboxylase enhances endothelial proliferation by suppressing endostatin expression. Blood 2002, 99, 1478-1481).
Инфекция клеточной линии НТ-29 КРР аденовирусом, кодирующим антисмысловую РНК для ODC1 и S-аденосилметионин декарбоксилазу (другой важный фермент при реакциях биосинтеза полиаминов), приводит к снижению уровня CCND1 и блокировке клеточного цикла. Более того, ядерная транслокация бета-катенина была также ингибирована (Gong, L., Jiang, С., Zhang, В., Hu, H., Wang, W., and Liu, X.; Adenovirus-mediated Expression of Both Antisense Ornithine Decarboxylase and S-adenosylmethionine Decarboxylase Induces G(l) Arrest in HT-29 Cells, J. Biochem. Mol. Biol, 2006, 39, 730736). Аденовирус индуцировал также регрессию опухоли уже сформировавшихся опухолей у "голых" мышей (Zhang, В., Liu, X.X., Zhang, Y., Jiang, C.Y., Hu, H.Y., Gong, L., Liu, M., and Teng, Q.S.; Polyamine depletion by ODC-AdoMetDC antisense adenovirus impairs human colorectal cancer growth and invasion in
vitro and in vivo, 2006, J. Gene Med, 8, 980-989).
Специфическим и необратимо действующим ингибитором ODC1 является 2-дифтормегилорнитин (DMFO, Eflornithine (Sanofi- Aventis)). Он применяется для лечения сонной болезни (вызываемой трипа-носомами) и является активным ингредиентом крема для удаления волос "Vaniga".
Что касается раковых заболеваний, DMFO широко использовался в преклинических моделях и проявил многообещающие антиопухолевые эффекты при снижении уровней полиамина (Gerner, E.W. and Meyskens, F.L., Jr.; Polyamines and cancer: old molecules, new understanding, Wat. Rev. Cancer, 2004, 4, 781792). Клинические исследования проводились для нескольких видов рака, и некоторые реализуются сейчас для КРР. Однако данные исследования представляют собой, в основном, комбинированные подходы, проводящиеся в профилактических целях для пациентов, особенно восприимчивых к КРР (аденоматоз-ные полипы).
Иммуногенный ODC-пептид ODC-001 был идентифицирован ранее (М. Diehl, PhD Thesis, University of Tubingen, 1998).
Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA).
PCNA был обнаружен в ядре и является кофактором ДНК-полимеразы дельта. Кодируемый белок выступает в качестве гомотримера и помогает увеличить процессивность синтеза ведущей нити во время репликации ДНК. Поэтому он экспрессирован во всех пролиферирующих клетках, в особенности опухолевых клетках, и используется в качестве маркера для детекции пролиферации.
Индексы пролиферации в неопластической и смежной нормальной слизистой оболочке, как установлено при иммуногистохимическом анализе PCNA, на протяжении долгого времени известны как независимые прогностические факторы рецидива и низкой выживаемости пациентов с колоректальным раком (al-Sheneber, I.F., Shibata, H.R., Sampalis, J., and Jothy, S.; Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen expression in colorectal cancer, Cancer, 1993, 71, 1954-1959; Mayer, A., Takimoto, M., Fritz, E., Schellander, G., Kofler, K., and Ludwig, H.; The prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen, epidermal growth factor receptor, and mdr gene expression in colorectal cancer, Cancer, 1993, 71, 2454-2460; Nakamura, T., Tabuchi, Y., Nakae, S., Ohno, M., and Saitoh, Y.; Serum carcinoembryonic antigen levels and proliferating cell nuclear antigen labeling index for patients with colorectal carcinoma. Correlation with tumor progression and survival, Cancer, 1996, 77, 1741-1746).
ДНК-топоизомераза II (TOP2).
TOP2A и ТОР2В кодируют изоформы ДНК-топоизомеразы, фермента, который контролирует и меняет топологическое состояние ДНК во время транскрипции. Данный ядерный фермент задействован в таких процессах, как конденсация хромосом, сепарация хроматид и снятие торсионного напряжения, которое возникает во время транскрипции и репликации ДНК. Он катализирует временный разрыв и воссоединение двух нитей дуплекса ДНК, который позволяет нитям пройти сквозь друг друга, меняя тем самым топологию ДНК. Две изоформы данного фермента существуют, как предполагается, как продукты явления дупликации гена. Ген, кодирующий альфа-форму, локализован в хромосоме 17, а бета-ген локализован в хромосоме 3.
ТОР2А является мишенью для нескольких противораковых агентов, а ряд мутаций в этом гене был ассоциирован с развитием резистентности к лекарственным средствам.
Ген ТОР2А расположен смежно с онкогеном HER-2, наиболее часто амплифицируемым онкогеном при раке груди, на хромосомной локализации 17q12-q21, и либо амплифицирован, либо делетирован, с одинаковой частотой, в почти 90% случаев первичных опухолей груди с амплификацией HER-2 (Jarvinen, Т.А. and Liu, Е.Т.; Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer-more common than anticipated, Cytopathology, 14, 309-313). Более того, об амплификациях ТОР2А сообщалось и в связи с другими видами рака. Недавние экспериментальные, а также многочисленные, крупные, муль-тицентровые клинические исследования позволяют сделать предположение, что амплификация (и/или делеция) ТОР2А может сказываться как в чувствительности, так и резистентности к используемым обычно цитотоксическим лекарственным препаратам, т.е. ингибиторам топоизомеразы-II (антрациклины и т.д. Kellner, U., Sehested, M., Jensen, P.B., Gieseler, F., and Rudolph, P.; Culprit and victim-DNA topoisom-erase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243), в зависимости от специфического генетического дефекта на ло-кусе ТОР2А (Jarvinen, ТА and Liu, ET; Simultaneous amplification of HER-2 (ERBB2) and topoisomerase II alpha (TOP2A) genes-molecular basis for combination chemotherapy in cancer, Curr.Cancer Drug Targets.,
2006, 6, 579-602).
Без ТОР2А невозможны репликация ДНК и деление клетки. Поэтому он стал основной мишенью многих лечебных схем при лечении опухолей, хотя точный механизм уничтожения клеток остается неясным (Kellner, U., Sehested, M., Jensen, P.B., Gieseler, F., and Rudolph, P.; Culprit and victim - DNA topoisomerase II, Lancet Oncol., 2002, 3, 235-243). Успех данного подхода ограничивается возникновением спонтанной резистентности, и индуцированное медикаментами повреждение ДНК может увеличить злокачественность.
Внимание исследований рака не было в такой степени сконцентрировано на ТОР2В, втором потенциальном белковом источнике для ТОР-001, потому что он находится в хромосомном регионе (3р24), известном по частой амплификации при опухолях. Однако ТОР2В по первичной структуре сходен с ТОР2А и имеет практически идентичные каталитические свойства (Leontiou, С., Lightowlers, R., Lakey, J.H., and Austin, C.A.; Kinetic analysis of human topoisomerase Ilalpha and beta DNA binding by surface plas-mon resonance, FEBS Lett., 2003, 554, 206-210). В другом исследовании было показано, что обе изоформы могут заменять друг друга (Sakaguchi, A. and Kikuchi, A.; Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase, J. Cell Sci., 2004, 117, 1047-1054).
В настоящем изобретении изобретатели обеспечивают неопровержимую очевидность того, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами HLA I класса, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные CD8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами человека, демонстрируя также, что заявленные пептиды пригодны для инициации ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток.
Аналогично было обнаружено, что опухолеассоциированные пептиды, в достаточной мере связывающиеся с молекулами HLA II класса, в особенности с такими аллелями HLA II класса, которые генетически закодированы локусом HLA DR человеческого генома, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные CD4-положительными Т-клетками человека. CD4-положительные Т-клетки были изолированы из периферической крови человека, демонстрируя, что заявленные пептиды пригодны для инициации Т-клеточных ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пепти-домы опухолевых клеток. Как поясняется далее на примере с пептидом из TGFBI-004, этот связывающийся с HLA-DR опухолеассоциированный пептид, как было обнаружено, распознается CD4-положительными Т-клетками.
Так как пептиды могут быть синтезированы химическим путем и могут быть использованы в качестве активных фармацевтических ингредиентов в фармацевтических препаратах, то пептиды, обеспечиваемые настоящим изобретением, могут быть использованы для иммунотерапии, предпочтительно для иммунотерапии рака.
В другом аспекте фармацевтическая композиция в дальнейшем включает по крайней мере один дополнительный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 по SEQ ID NO: 15, или содержащий вариантную аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 80% гомологична последовательностям с SEQ ID NO: 8 по SEQ ID NO: 15, или полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую SEQ ID NO: 8 по SEQ ID NO: 15 или вариантную аминокислотную последовательность. Пептиды с SEQ ID NO: 8 по SEQ ID NO: 13 и 15 являются иммуногенными пептидами, идентифицированными ранее, и связываются с молекулами МНС I класса и МНС II класса (см. табл. 2).
Было показано, что данные пептиды вызывают Т-клеточные ответы in vivo у пациентов, страдающих от почечно-клеточной карциномы (ПКК) (Н. Singh-Jasuja, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, P.Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Ramraensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; ASCO Meeting 2007 Poster # 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P.Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C.G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immu-nogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Poster # 3017). Так как материнские белки гиперэкспрессированы не только в ПКК, но и также в КРР и других видах рака, эти пеп-
Карциномоэмбриональная, родственная антигену молекула клеточной адгезии 5.
Карциномоэмбриональный антиген (СЕА=СЕАСАМ5), 180 кДа, является обильно гликозилирован-ным мембранным белком, состоящим из трех С2 Ig-подобных повторяющихся звеньев, примыкающих к N-концевому Ig V-подобному участку и С-концевому участку, который включает участок сцепления гликофосфатидилинозитола (Hegde, P., Qi, R., Gaspard, R., Abernathy, K., Dharap, S., Earle-Hughes, J., Gay, C., Nwokekeh, N.U., Chen, T., Saeed, Al, Sharov, V., Lee, N.H., Yeatman, T.J., and Quackenbush, J.; Identification of tumour markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray, Cancer Res., 2001, 61, 7792-7797).
Являясь онкофетальным антигеном, СЕА экспрессируется во время эмбрионального развития, но и также, на низком уровне, в желудочно-кишечном эпителии взрослых. Однако СЕА гиперэкспрессирован в высокой степени в опухолях человека, включая 90% случаев желудочно-кишечного, колоректального рака и рака поджелудочной железы, 70% клеток немелкоклеточного рака легких и 50% случаев рака груди (Thompson, J.A., Grunert, F., and Zimmermann, W.; Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives, J. Clin Lab Anal, 5, 344-366, 2005). Из-за своего высокого уровня экспрессии в опухолевых клетках и секреции в сыворотку СЕА широко использовался в качестве опухолевого маркера (Sikorska, H., Shuster, J., and Gold, P.; Clinical applications of carcinoembryonic antigen, Cancer Detect. Prev., 12, 321-355, 1988) и является стандартным сывороточным маркером для мониторинга колорек-тального рака (Locker, G.Y., Hamilton, S., Harris, J., Jessup, J.M., Kemeny, N., Macdonald, J.S., Somerfield, M.R., Hayes, D.F., and Bast, R.C., Jr.; ASCO 2006 update of recommendations for the use of tumour markers in gastrointestinal cancer, J. Clin Oncol, 24, 5313-5327, 2006).
Несмотря на гиперэкспрессию СЕА в опухолевых клетках, раковые пациенты обычно не дают иммунного ответа на данный антиген (Orefice, S, Fossati, G, Pietrojusti, E, and Bonfanti, G; Delayed cutaneous hypersensitivity reaction to carcinoembryonic antigen in cancer patients, Tumouri, 1982, 68, 473-475). Иммунная система обычно становится толерантной к СЕА, потому что он в нормальном случае экспрессирован в организме на низком уровне. Однако в сериях клинических исследований вакцин была продемонстрирована иммуногенность СЕА (Sarobe, P., Huarte, E., Lasarte, J.J., and Borras-Cuesta, F.; Carcinoembryonic antigen as a target to induce anti-tumour immune responses, Curr. Cancer Drug Targets., 2004, 4, 443-454), в особенности при колоректальном раке (КРР) (Mosolits, S., Ullenhag, G., and Mellstedt, H.; Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. A review of immunological and clinical results, Ann.Oncol., 2005, 16, 847-862), и СЕА является опухолеассоциированным антигеном (ТАА) с обширным количеством вакцин, протестированных на данном виде опухоли (von Mehren, M.; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin. Oncol., 2005, 32, 76-84).
Несколько цитотоксических и хелперных Т-клеточных эпитопов были описаны для СЕА (Crosti, M., Longhi, R., Consogno, G., Melloni, G., Zannini, P., and Protti, M.P.; Identification of novel subdominant epitopes on the carcinoembryonic antigen recognized by CD4+ T-cells of lung cancer patients, J. Immunol., 2006, 176, 5093-5099; Novellino, L., Castelli, C., and Parmiani, G.; A listing of human tumour antigens recognized by T-cells: March 2004 update, Cancer Immunol. Immunother., 2004, 54, 187-207; Ruiz, M., Kobayashi, H., La
sarte, J.J., Prieto, J., Borras-Cuesta, F., Celis, E., and Sarobe, P.; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867), позволяющих проведение ряда основанных на пептидах клинических исследований вакцин против КРР (Babatz, J., Rollig, С., Lobel, В., Folprecht, G., Haack, M., Gunther, H., Kohne, C.H., Ehninger, G., Schmitz, M., and Bornhauser, M.; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with metastatic tumours after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2006, 55, 268276; Fong, L., Hou, Y., Rivas, A., Benike, C., Yuen, A., Fisher, G.A., Davis, M.M., and Engleman, E.G.; Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumour immunotherapy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 8809-8814; Liu, K.J., Wang, C.C., Chen, L.T., Cheng, A.L., Lin, D.T., Wu, Y.C., Yu, W.L., Hung, Y.M., Yang, H.Y., Juang, S.H., and Whang-Peng, J.; Generation of carcinoembryonic antigen (CEA)-specific T-cell responses in HLA-A*0201 and HLA-A*2402 late-stage colorectal cancer patients after vaccination with dendritic cells loaded with CEA peptides, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2645-2651; Matsuda, K., Tsunoda, T., Tanaka, H., Umano, Y., Tanimura, H., Nukaya, I., Takesako, K., and Yamaue, H.; Enhancement of cytotoxic T-lymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother., 2004, 53, 609-616; Ueda, Y., Itoh, T., Nukaya, I., Kawashima, I., Okugawa, K., Yano, Y., Yamamoto, Y., Naitoh, K., Shimizu, K., Imura, K., Fuji, N., Fujiwara, H., Ochiai, T., Itoi, H., Sonoyama, T., Hagiwara, A., Takesako, K., and Yamagishi, H.; Dendritic cell-based immunotherapy of cancer with carcinoembryonic antigen-derived, HLA-A24-restricted CTL epitope: Clinical outcomes of 18 patients with metastatic gastrointestinal or lung adenocarcinomas, Int. J. Oncol., 2004, 24, 909-917; Weihrauch, M.R., Ansen, S., Jurkiewicz, E., Geisen, C., Xia, Z., Anderson, K.S., Gracien, E., Schmidt, M., Wittig, B., Diehl, V., Wolf, J., Bohlen, H., and Nadler, L.M.; Phase I/II combined chemoimmuno-therapy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res., 2005, 11, 5993-6001). Данные и другие клинические исследования на данный момент продемонстрировали безопасность вакцинаций с СЕА и доказательства для индукции иммунного ответа против данного антигена (von Mehren, M; Colorectal cancer vaccines: what we know and what we don't yet know, Semin.Oncol., 2005,
32, 76-84).
Вариант СЕА-006 был опубликован ранее (Ruiz, M., Kobayashi, Н., Lasarte, J.J., Prieto, J., Borras-Cuesta, F., Celis, E., and Sarobe, P.; Identification and characterization of a T-helper peptide from carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res., 2004, 10, 2860-2867). CEA-005 является мутантом с единственной аминокислотной заменой, о котором сообщалось, что он преодолевает центральную иммунную толерантность (Zaremba, S., Barzaga, E., Zhu, M., Soares, N., Tsang, K.Y., and Schlom, J.; Identification of an enhancer agonist cytotoxic T lymphocyte peptide from human carcinoembryonic antigen, Cancer Res., 1997, 57, 45704577).
Трансформирующий фактор роста, бета-индуцированный (TGFBI).
TGFBI был первым геном, идентифицированным в качестве TGF-бета-индуцированного, в клеточной линии человеческой аденокарциномы легких. Он кодирует секретируемый внеклеточный матричный белок, который, как предполагается, задействован в присоединении клеток и формировании внеклеточной матрицы.
Как было показано, TGFBI находится среди генов с наиболее значительно повышенным уровнем при колоректальном раке, и он также экспрессирован на высоком уровне в аденомах. Результаты количественной ПЦР демонстрируют сильное повышение, как в неочищенных опухолях, так и очищенных эпителиальных клетках опухоли. Соответственно проведенные in situ эксперименты по гибридизации показали, что TGFBI экспрессирован во многих видах клеток, как в стромальных, так и эпителиальных ком-партментах (Buckhaults, P., Rago, С., St, C.B., Romans, K.E., Saha, S., Zhang, L., Vogelstein, B., and Kinzler, K.W.; Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumours, Cancer Res., 2001, 61, 6996-7001).
При мега-анализе исследований, изучающих экспрессию генов при колоректальном раке, было установлено, что TGFBI является одним из всего девяти генов, которые были описаны как содержащиеся многократно в повышенном количестве (4 исследования для TGFBI) (Shih, W., Chetty, R., and Tsao, M.S.; Expression profiling by microarrays in colorectal cancer, Oncol.Rep., 2005, 13, 517-524).
В человеческих тканях поджелудочной железы наблюдалось повышение уровня TGFBI мРНК в 32,4 раза при раке поджелудочной железы в сравнении с нормальными контрольными тканями. Гибриди-зационный анализ in situ показывает, что TGFBI mPPIK был экспрессирован, в основном, в раковых клетках внутри опухолевой массы поджелудочной железы (Schneider, D., Kleeff, J., Berberat, P.O., Zhu, Z., Korc, M., Friess, H., and Buchler, M.W.; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells, Bio-chim.Biophys.Acta, 2002, 1588, 1-6).
В модели in vitro было установлено, что TGFBI является геном, способствующим ангиогенезу. К тому же резко повышенный уровень экспрессии TGFBI был обнаружен в нескольких видах опухолей. Антисмысловые олигонуклеотиды к TGFBI блокировали как экспрессию генов, так и образование эндо-телиальных трубок in vitro, позволяя предположить, что TGFBI может играть ведущую роль во взаимодействиях в эндотелиальной клеточной матрице (Aitkenhead, M., Wang, S.J., Nakatsu, M.N., Mestas, J.,
Heard, C., and Hughes, C.C.; Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angio-genesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM, Microvasc. Res., 2002, 63, 159-171).
Муцин-1 (MUC1).
Муцины - это высокомолекулярные эпителиальные гликопротеины с высоким содержанием кластерных олигосахаридов, соединенных о-гликозидной связью с пептидами тандемного повтора, богатыми треонином, серином и пролином. Существуют два класса муцинов, различающихся по структуре и функциям: трансмембранные муцины, к которым относится MUC1, и секретируемые гелеобразующие муцины. Муцины рака толстой кишки имеют различия в углеводных структурах, которые исследуются как диагностические и прогностические маркеры, а также как мишени для противораковых вакцин.
Внеклеточный домен белка MUC1 образован из высококонсервативных повторов 20 аминокислот, фактическое число варьируется между 25 и 100 в зависимости от аллеля. Каждый тандемный повтор содержит пять потенциальных сайтов гликозилирования, а между дублетами треонинов и серинов находится иммунодоминантный участок, содержащий эпитопы, распознаваемые различными антителами ан-ти-MUO (Taylor-Papadimitriou, J., Burchell, J., Miles, D.W., and Dalziel, M.; MUC1 and cancer, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1455, 301-313).
В сравнении с большинством других эпителиев MUC1 толстого кишечника более сильно гликози-лирован, тем самым маскируя белок MUC1 от иммуногистохимического окрашивания MUC1-специфическими антителами. В колоректальных аденокарциномах MUC1 менее гликозилирован, позволяя осуществление иммунодетекции.
Аберрантно гликозилированный MUC1 предоставляет новые связующие способности и может одновременно опосредовать и блокировать связывание с адгезивными молекулами с некоторой молекулярной специфичностью, тем самым играя двойственную роль в метастатическом распространении опухолевых клеток (McDermott, K.M., Crocker, P.R., Harris, A., Burdick, M.D., Hinoda, Y., Hayashi, T., Imai, K., and Hollingsworth, M.A.; Overexpression of MUC1 reconfigures the binding properties of tumor cells, Int. J. Cancer, 2001, 94, 783-791).
Как было установлено иммунологическим путем MUC1 имеет повышенный уровень при экспрессии при раке толстой кишки, что соотносится с худшим прогнозом (Byrd, J.C. and Bresalier, R.S.; Mucins and mucin binding proteins in colorectal cancer, Cancer Metastasis Rev., 2004, 23, 77-99), указывая на то, что повышенный уровень MUC1 может быть вовлечен в прогрессирование КРР. Рак толстой кишки с метастазами экспрессирует MUC1 более сильно, чем рак без метастазов (Nakamori, S., Ota, D.M., Cleary, K.R., Shirotani, K, and Irimura, T; MUC1 mucin expression as a marker of progression and metastasis of human colorectal carcinoma, Gastroenterology, 1994, 106, 353-361), и окрашивание MUC1 было положительным при всех видах колоректального рака с поражением печени в рамках одного исследования (Matsuda, K., Ma-saki, T., Watanabe, T., Kitayama, J., Nagawa, H., Muto, T., and Ajioka, Y.; Clinical significance of MUC1 and MUC2 mucin and p53 protein expression in colorectal carcinoma, Jpn. J. Clin Oncol., 2000, 30, 89-94). Во время недавнего исследования у 462 пациентов с колоректальным раком было обнаружено, что экспрессия MUC1 является независимым прогностическим маркером плохого прогноза (Duncan, T.J., Watson, N.F., Al-Attar, А.Н., Scholefield, J.H., and Durrant, L.G.; The role of MUC1 and MUC3 in the biology and prognosis of colorectal cancer, World J. Surg. Oncol, 2007, 5, 31).
Существует патофизиологическая значимость циркулирующих антител анти-MUO при КРР: антитела анти-MUO были обнаружены у 5 из 31 (16,1%) здоровых субъектов и у 27 из 56 (48,2%) пациентов с колоректальным раком (Nakamura, H., Hinoda, Y., Nakagawa, N., Makiguchi, Y., Itoh, F., Endo, T., and Imai, K.; Detection of circulating anti-MUC1 mucin core protein antibodies in patients with colorectal cancer, J. Gastroenterol., 1998, 33, 354-361).
Помимо своей роли в качестве мишени для антител MUC1 является также хорошо известной мишенью для цитотоксических Т-клеток. В некоторых сообщениях демонстрируется, что цитотоксические нерестриктированные по МНС Т-клетки из опухолей яичника, груди, поджелудочной железы и множественной миеломы могут распознавать эпитопы центральной части белка MUC1, находящейся в тандем-ном повторе (Apostolopoulos, V. and McKenzie, I.F.; Cellular mucins: targets for immunotherapy, Crit Rev. Immunol., 1994, 14, 293-309; Finn, O.J., Jerome, K.R., Henderson, R.A., Pecher, G., Domenech, N., Magarian-Blander, J., and Barratt-Boyes, S.M.; MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and cancer vaccines, Immunol. Rev., 1995, 145, 61-89; Barnd, D.L., Lan, M.S., Metzgar, R.S., and Finn, O.J.; Specific, major histocom-patibility complex-unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 7159-7163; Takahashi, T., Makiguchi, Y., Hinoda, Y., Kakiuchi, H., Nakagawa, N., Imai, K., and Yachi, A.; Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient, J. Immunol., 1994, 153, 2102-2109; Noto, H., Takahashi, T., Makigu-chi, Y., Hayashi, T., Hinoda, Y., and Imai, K.; Cytotoxic T lymphocytes derived from bone marrow mononu-clear cells of multiple myeloma patients recognize an underglycosylated form of MUC1 mucin, Int. Immunol., 1997, 9, 791-798). Однако были также идентифицированы рестриктированные по HLA-A*02 T-клеточные эпитопы, образованные из белка MUC1 (Apostolopoulos, V., Karanikas, V., Haurum, J.S., and McKenzie, I.F.; Induction of HLA-A2-restricted CTLs to the mucin 1 human breast cancer antigen, J. Immunol., 1997, 159, 5211-5218; Brossart, P., Heinrich, K.S., Stuhler, G., Behnke, L., Reichardt, V.L., Stevanovic, S., Muhm, A.,
Rammensee, H.G., Kanz, L., and Brugger, W.; Identification of HLA-A2-restricted T-cell epitopes derived from the MUC1 tumor antigen for broadly applicable vaccine therapies, Blood, 1999, 93, 4309-4317). Одним из этих пептидов является MUC-001. Он образован из участка тандемного повтора белка MUC1. Индукция ответов цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo после вакцинаций пациентов с распространенным раком груди или яичника дендритными клетками с введенным импульсным методом пептидом, используя пептиды MUC1, была успешной (Brossart, P., Wirths, S., Stuhler, G., Reichardt, V.L., Kanz, L., and Brugger, W.; Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells, Blood, 2000, 96, 3102-3108; Wierecky, J., Mueller, M., and Brossart, P.; Dendritic cell-based cancer immuno-therapy targeting MUC-1, Cancer Immunol. Immunother., 2005 Apr. 28: 288-94). Более того, такие вакцинации успешно индуцировали клинические ответы у пациентов с почечно-клеточной карциномой (Wie-recky, J., Muller, M.R., Wirths, S., Halder-Oehler, E., Dorfel, D., Schmidt, S.M., Hantschel, M., Brugger, W., Schroder, S., Horger, M.S., Kanz, L., and Brossart, P.; Immunologic and clinical responses after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells in metastatic renal cancer patients, Cancer Res., 2006, 66, 5910-5918).
Повышенный уровень иммунореактивного MUC1 при колоректальном раке в большинстве случаев не основан на гиперэкспрессии мРНК, но скорее вызван его пониженным гликозилированием, что разоблачает эпитопы для распознавания антителами, в особенности на участке тандемного повтора MUC1. Данная дегликозиляция обеспечивает, в то же самое время, возможность для генерирования Т-клеточных эпиотопов при измененном процессинге антигенов в опухолевых клетках, чему в нормальных клетках препятствует гликозилирование. Данный механизм может объяснить исключительные черты MUC-001 в качестве опухолеассоциированного Т-клеточного эпитопа, несмотря на отсутствие сильной гиперэкспрессии мРНК. Некоторая очевидность того, что изменения в гликозилировании могут действительно повлиять на процессинг антигенов, возникает из недавнего наблюдения, что измененное гликозилирова-ние MUC1 при колоректальном раке может быть действительно обнаружено антигенпрезентирующими клетками с помощью рецептора, специфически распознающего опухолевые гликоформы (Saeland, E., van
Vliet, S.J., Backstrom, M., van, dB, V., Geij tenbeek, Т.В., Meijer, G.A., and van, KY; 2006, The C-type lectin MGL expressed by dendritic cells detects glycan changes on MUC1 in colon carcinoma, Cancer Immunol. Im-munother., 2007, 56(8): 1225-36). Специфическое поглощение и процессинг опухолевых гликоформ анти-генпрезентирующими клетками может также объяснить тот факт, что MUC-001-специфические Т-клетки наблюдались в естественных условиях (без иммунизации) у пациентов с раком груди (Rentzsch, С., Kay-ser, S., Stumm, S., Watermann, I., Walter, S., Stevanovic, S., Wallwiener, D., and Guckel, B.; Evaluation of pre-existent immunity in patients with primary breast cancer: molecular and cellular assays to quantify antigen-specific T lymphocytes in peripheral blood mononuclear cells, Clin Cancer Res., 2003, 9, 4376-4386) и коло-ректальным раком (Dittmann, J., Keller-Matschke, K., Weinschenk, T., Kratt, T., Heck, T., Becker, H.D., Stevanovic, S., Rammensee, H.G., and Gouttefangeas, C.; CD8+ T-cell response against MUC1-derived peptides in gastrointestinal cancer survivors, Cancer Immunol. Immunother., 2005, 54, 750-758). Для этих пациентов не было заявлено об аутоиммунных эффектах. Это демонстрирует естественную роль MUC-001 как опухо-леассоциированного пептида, индуцирующего специфические Т-клетки, и позволяет предположить, что введение MUC-001 может считаться безопасным, хотя для антигена MUC1 не может быть обнаружена гиперэкспрессия на уровне мРНК.
Met-протоонкоген (рецептор фактора роста гепатоцитов) (с-Met).
Белковый продукт протоонкогена МЕТ является рецептором фактора роста гепатоцитов. Он содержит домен тирозинкиназы, который активирует сигнальные пути, задействованные в клеточной пролиферации, подвижности, адгезии и инвазии (Trusolino, L and Comoglio, PM; Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth, Nat. Rev. Cancer, 2002, 2, 289-300).
В исследованиях различных видов опухолей было продемонстрировано несколько механизмов для активации c-Met, включая аутокринную петлю HGF/c-Met, активирующую точечные мутации, белок слияния TPR-Met и неспособность расщепления с-Met на а- и р-цепи (Di Renzo, M.F., Olivero, M., Mar-tone, T., Maffe, A., Maggiora, P., Stefani, A.D., Valente, G., Giordano, S., Cortesina, G., and Comoglio, P.M.; Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas, Oncogene, 2000, 19, 1547-1555; Ebert, M., Yokoyama, M., Friess, H., Buchler, M.W., and Korc, M.; Coexpres-sion of the c-met proto-oncogene and hepatocyte growth factor in human pancreatic cancer, Cancer Res., 1994, 54, 5775-5778; Mondino, A., Giordano, S., and Comoglio, P.M.; Defective posttranslational processing activates the tyrosine kinase encoded by the MET proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor), Mol. Cell Biol., 1991, 11, 6084-6092; Olivero, M., Valente, G., Bardelli, A., Longati, P., Ferrero, N., Cracco, C., Terrone, C., Rocca-Rossetti, S., Comoglio, P.M., and Di Renzo, M.F.; Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family, Int. J. Cancer, 1999, 82, 640-643; Park, M., Dean, M., Cooper, C.S., Schmidt, M., O'Brien, S.J., Blair, D.G., and Vande Woude, G.F.; Mechanism of met oncogene activation, Cell, 1986, 45, 895-904; Park, W.S., Dong, S.M., Kim, S.Y., Na, E.Y., Shin, M.S., Pi, J.H., Kim, B.J., Bae, J.H., Hong, Y.K., Lee, K.S., Lee, S.H., Yoo, N.J., Jang, J.J., Pack, S., Zhuang, Z., Schmidt, L., Zbar, B., and Lee, J.Y.; 1999, Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas, Cancer Res., 59, 307-310; Rahimi, N., Tremblay, E., McAdam, L., Park, M., Schwall, R., and Elliott, B.; 1996, Identification of a hepatocyte growth factor autocrine loop in a murine mam
mary carcinoma, Cell Growth Differ., 7, 263-270; Schmidt, L., Duh, F.M., Chen, F., Kishida, T., Glenn, G., Choyke, P., Scherer, S.W., Zhuang, Z., Lubensky, I., Dean, M., Allikmets, R., Chidambaram, A., Bergerheim, U.R., Feltis, J.T., Casadevall, C., Zamarron, A., Bernues, M., Richard, S., Lips, C.J., Walther, M.M., Tsui, L.C., Geil, L., Orcutt, M.L., Stackhouse, T., Lipan, J., Slife, L., Brauch, H., Decker, J., Niehans, G., Hughson, M.D., Moch, H., Storkel, S., Lerman, M.I., Linehan, W.M., and Zbar, B.; 1997, Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas, Nat.Genet., 16, 68-73;
Schmidt, L., Junker, K., Weirich, G., Glenn, G., Choyke, P., Lubensky, I., Zhuang, Z., Jeffers, M., Vande, W.G.,
Neumann, H., Walther, M., Linehan, W.M., and Zbar, B.; 1998, Two North American families with hereditary papillary renal carcinoma and identical novel mutations in the MET proto-oncogene, Cancer Res., 58, 17191722). Как свойственно механизму, гиперэкспрессия c-Met кооперирует с онкогенной мутацией Ki-ras с усилением канцерогенности раковых клеток толстой кишки in vivo (Long, I.S., Han, K., Li, M., Shirasawa, S., Sasazuki, T., Johnston, M., and Tsao, M.S.; Met receptor overexpression and oncogenic Ki-ras mutation cooperate to enhance tumorigenicity of colon cancer cells in vivo, Mol. Cancer Res., 2003, 1, 393-401).
Интересно, что существует некоторая очевидность для взаимодействия сигнальных реакций МЕТ с каскадом реакций Wnt/бета-катенина, зачастую представленного в повышенном количестве при раке толстой кишки. МЕТ может активироваться иростагландином Е2 (PGE2), и РОЕ2-активированный c-Met ассоциируется с р-катенином, увеличивая его тирозиновое фосфорилирование, тем самым индуцируя инвазивность раковых клеток при раке толстой кишки (Pai, R., Nakamura, T., Moon, W.S., and Tarnawski, A.S.; Prostaglandins promote colon cancer cell invasion; signaling by cross-talk between two distinct growth factor receptors, FASEB J, 2003, 17, 1640-1647). Недавно была описана совместная активация МЕТ и бета-катенина, приводящая к положительному контуру обратной связи между этими двумя ключевыми игроками при колоректальном онкогенезе (Rasola, A., Fassetta, M., De, B.F., D'Alessandro, L., Gramaglia, D., Di Renzo, M.F., and Comoglio, P.M.; A positive feedback loop between hepatocyte growth factor receptor and beta-catenin sustains colorectal cancer cell invasive growth, Oncogene, 2007, 26, 1078-1087).
Уровень экспрессии c-Met мРНК в первичных опухолях КРР (n=36) является важным предсказывающим маркером для инвазии на ранних стадиях и региональных метастазов заболевания, таким образом, находясь в прямом соотношении со стадией рака толстой кишки (Takeuchi, H., Bilchik, A., Saha, S., Turner, R., Wiese, D., Tanaka, M., Kuo, C., Wang, H.J., and Hoon, D.S.; c-MET expression level in primary colon cancer: a predictor of tumor invasion and lymph node metastases, Clin Cancer Res., 2003, 9, 1480-1488). Другой анализ экспрессии c-Met в 130 пробах КРР показал гиперэкспрессию (T/N> 2,0) c-Met в 69% случаев первичного КРР и значительно повышенные уровни c-Met при КРР с поражением кровеносных сосудов (Р=0,04) и на поздней стадии (Р=0,04), подтверждая роль c-Met в прогрессировании и распространении метастазов при КРР человека (Zeng, Z., Weiser, M.R., D'Alessio, M., Grace, A., Shia, J., and Paty, P.B.; Immunoblot analysis of c-Met expression in human colorectal cancer: overexpression is associated with advanced stage cancer, Clin Exp. Metastasis, 2004, 21, 409-417). В другом исследовании в 69% и 48% из 60 аденокарцином толстой кишки было установлено повышение c-Met мРНК в более чем 2 и более чем 10 раз, соответственно, по сравнению со смежной нормальной слизистой оболочкой (Kammula, U.S., Kuntz, E.L., Francone, T.D., Zeng, Z., Shia, J., Landmann, R.G., Paty, P.B., and Weiser, M.R.; Molecular co-expression of the c-Met oncogene and hepatocyte growth factor in primary colon cancer predicts tumor stage and clinical outcome, Cancer Lett., 2007, 248, 219-228). Таким образом, увеличение передачи сигналов с-Met является широко распространенным явлением на ранней стадии КРР, но и проявляющееся даже с еще большей экспрессией на поздних стадиях и при метастатической болезни.
Циклин D1 (CCND1).
CCND1 относится к высококонсервативному семейству циклинов, члены которого характеризуются исключительной периодичностью наличия белков в течение клеточного цикла. Циклины выполняют функцию регуляторов CDK (циклинзависимые киназы). Различным циклинам свойственна разная экспрессия и способы деградации, которые содействуют временной координации каждого этапа митоза. Этот циклин формирует комплекс с - и функционирует как - регуляторная субъединица CDK4 или CDK6, активность которой требуется для клеточного цикла перехода G1/S. Мутации, амплификация и гиперэкспрессия этого гена, который изменяет прогрессию клеточного цикла, часто наблюдались в различных опухолях и могут благоприятствовать онкогенезу (Fu, М., Wang, С., LI, Z., Sakamaki, Т., and Pes-tell, R.G.; Minireview: Cyclin D1: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447).
Распространенный однонуклеотидный полиморфизм A/G (A870G) приводит к двум различным изоформам мРНК: а и b. Попеременно сплайсированная изоформа b кодирует "усеченный" белок, который был связан с более высокой заболеваемостью опухолевыми заболеваниями, включая рак легких, рак толстой кишки и другие виды рака (Fu, M., Wang, С., LI, Z., Sakamaki, T., and Pestell, R.G.; Minireview: Cyclin Dl: normal and abnormal functions, Endocrinology, 2004, 145, 5439-5447).
Гиперэкспрессия CCND1 на уровне мРНК и белковом уровне была многократно описана для коло-ректального рака (Sutter, T., Doi, S., Camevale, K.A., Arber, N., and Weinstein, IB; Expression of cyclins DI and E in human colon adenocarcinomas, J. Med, 1997, 28, 285-309; Mermelshtein, A., Gerson, A., Walfisch, S., Delgado, B., Shechter-Maor, G., Delgado, J., Fich, A., and Gheber, L.; Expression of D-type cyclins in colon cancer and in cell lines from colon carcinomas, Br. J. Cancer, 2005, 93, 338-345; Balcerczak, E., Pasz-Walczak,
G., Kumor, P., Panczyk, M., Kordek, R., Wierzbicki, R., and Mirowski, M.; Cyclin DI protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer, Eur. J. Surg.Oncol., 2005, 31, 721-726; Bondi, J., Husdal, A., Bukholm, G., Nesland, J.M., Bakka, A., and Bukholm, I.R.; Expression and gene amplification of primary (A, B1, D1, D3, and E) and secondary (C and H) cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patient outcome, J. Clin Pathol., 2005, 58, 509-514; Perez, R., Wu, N., Klipfel, A.A., and Beart, R.W., Jr.; A better cell cycle target for gene therapy of colorectal cancer: cyclin G, J. Gastrointest. Surg., 2003, 7, 884-889; Wong, N.A., Morris, R.G., McCondochie, A., Bader, S., Jodrell, D.I., and Harrison, D.J.; Cyclin DI overexpression in colorectal carcinoma in vivo is dependent on beta-catenin protein dysregulation, but not k-ras mutation, J. Pathol., 2002,197, 128-135; McKay, J.A., Douglas, J.J., Ross, V.G., Curran, S., Murray, G.I., Cassidy, J., and McLeod, H.L.; Cyclin DI protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer. Aberdeen Colorectal Initiative, Int. J. Cancer, 2000, 88, 77-81; Bartkova, J., Lukas, J., Strauss, M., and Bartek, J.; The PRAD-1/cyclin D1 oncogene product accumulates aberrantly in a subset of colorectal carcinomas, Int. J. Cancer, 1994, 58, 568-573).
Это может быть объяснено хорошо обоснованным фактом, что CCND1 является геном-мишенью сигнального пути р-катенин-TCF/LEF, зачастую представленного в повышенном количестве при коло-ректальном раке (Shtutman, M., Zhurinsky, J., Simcha, I., Albanese, С., D'Amico, M., Pestell, R., and Ben-Ze'ev, A.; The cyclin D1 gene is a target of the beta-catenin/LEF-1 pathway, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 5522-5527; Tetsu, О. and McCormick, F.; Beta-catenin regulates expression of cyclin DI in colon carcinoma cells, Nature, 1999,398, 422-426).
Повышенная экспрессия CCND1 была связана с более высокими стадиями опухоли, метастазами и снижению выживаемости (Balcerczak, E., Pasz-Walczak, G., Kumor, P., Panczyk, M., Kordek, R., Wierzbicki, R., and Mirowski, M.; Cyclin D1 protein and CCND1 gene expression in colorectal cancer, Eur. J. Surg. Oncol., 2005, 31, 721-726; Bahnassy, A.A., Zekri, A.R., El-Houssini, S., El-Shehaby, A.M., Mahmoud, M.R., Abdallah, S., and El-Serafi, M.; Cyclin A and cyclin D1 as significant prognostic markers in colorectal cancer patients, BMC. Gastroenterol, 2004, 4, 22; McKay, J.A., Douglas, J.J., Ross, V.G., Curran, S., Murray, G.I., Cassidy, J., and McLeod, H.L.; Cyclin D1 protein expression and gene polymorphism in colorectal cancer. Aberdeen Colo-rectal Initiative, Int. J. Cancer, 2000, 88, 77-81; Maeda, K., Chung, Y., Kang, S., Ogawa, M., Onoda, N., Nishi-guchi, Y., Ikehara, T., Nakata, B., Okuno, M., and Sowa, M.; Cyclin Dl overexpression and prognosis in colo-rectal adenocarcinoma, Oncology, 1998, 55, 145-151).
Матричная металлопротеиназа 7 (матрилизин, утерин) (ММР7).
Матричные металлопротеиназы (MMPs) являются крупным семейством структурно родственных цинк-зависимых протеиназ, описываемых типично как способные приводить к деградации компонентов внеклеточной матрицы. Были идентифицированы отдельные ММР, которые проявляют повышенную экспрессию при опухолях, и большинство опухолей демонстрировало усиленную активность ММР (Cur-ran, S and Murray, GI; 1999, Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis, J. Pathol., 189, 300308; Curran, S and Murray, GI; 2000, Matrix metalloproteinases: molecular aspects of their roles in tumour invasion and metastasis, Eur.J Cancer, 36, 1621-1630).
Базальная мембрана и внеклеточная матрица представляют собой два физических барьера для инвазии злокачественных заболеваний, и их разрушение ММР играет ключевую роль в прогрессировании опухоли и распространении метастазов (Johnsen, М., Lund, L.R., Romer, J., Almholt, K., and Dano, K.; 1998, Cancer invasion and tissue remodeling: common themes in proteolytic matrix degradation, Curr.Opin.Cell Biol., 10, 667-671; Nelson, A.R., Fingleton, B., Rothenberg, M.L., and Matrisian, L.M.; 2000, Matrix metallo-proteinases: biologic activity and clinical implications, J. Clin Oncol., 18, 1135-1149; Wang, F.Q., So, J., Reier-stad, S., and Fishman, D.A.; 2005, Matrilysin (MMP-7) promotes invasion of ovarian cancer cells by activation of progelatinase, Int. J. Cancer, 114, 19-31). Помимо данной функции на данный момент обсуждается участие ММР в развитии и прогрессировании опухоли, включая роли в апоптозе, клеточной пролиферации и дифференциации. Данные функции связаны с ММР-опосредованным протеолизом нематричных белков и действий, отличающихся от их ферментативной активности (Egeblad, M. and Werb, Z.; 2002, New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression, Nat.Rev.Cancer, 2, 161-174; Leeman M.F., Cur-ran, S., and Murray, G.I.; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression, J. Pathol., 201, 528-534).
Недавние исследования показали, что несколько матричных металлопротеиназ, в особенности мат-рилизин (ММР7), взаимодействуют со специфическими молекулярногенетическими и сигнальными путями, задействованными в развитии колоректального рака. В частности, матрилизин активируется на ранней стадии колоректального онкогенеза сигнальными путями бета-катенина (Brabletz, T., Jung, A., Dag, S., Hlubek, F., and Kirchner, T.; 1999, beta-catenin regulates the expression of the matrix metallopro-teinase-7 in human colorectal cancer, Am. J. Pathol., 155, 1033-1038; Leeman, M.F., Curran, S., and Murray, G.I.; 2003, New insights into the roles of matrix metalloproteinases in colorectal cancer development and progression, J.Pathol., 201, 528-534; Zucker, S. and Vacirca, J.; 2004, Role of matrix metalloproteinases (MMPs) in colorectal cancer, Cancer Metastasis Rev., 23, 101-117).
MMP7 гиперэкспрессирована как в доброкачественных, так и злокачественных колоректальных опухолях (Ishikawa, T., Ichikawa, Y., Mitsuhashi, M., Momiyama, N., Chishima, T., Tanaka, K., Yamaoka, H., Miyazakic, K., Nagashima, Y., Akitaya, T., and Shimada, H.; 1996, Matrilysin is associated with progression of
colorectal tumor, Cancer Lett., 107, 5-10; McDonnell, S, Navre, M, Coffey, RJ, Jr., and Matrisian LM; 1991, Expression and localization of the matrix metalloproteinase pump-1 (MMP-7) in human gastric and colon carcinomas, Mol.Carcinog., 4, 527-533; Miyazaki, K, Hattori, Y, Umenishi, F, Yasumitsu, H, and Umeda, M; 1990, Purification and characterization of extracellular matrix-degrading metalloproteinase, matrin (pump-1), secreted from human rectal carcinoma cell line, Cancer Res., 50, 7758-7764; Nagashima, Y, Hasegawa, S, Koshikawa, N, Taki, A, Ichikawa, Y, Kitamura, H, Misugi, K, Kihira, Y, Matuo, Y, Yasumitsu, H, and Miyazaki, K; 1997, Expression of matrilysin in vascular endothelial cells adjacent to matrilysin-producing tumors, Int. J. Cancer, 72, 441-445; Newell, KJ, Witty, JP, Rodgers, WH, and Matrisian, LM; 1994, Expression and localization of matrix-degrading metalloproteinases during colorectal tumorigenesis, Mol.Carcinog., 10, 199-206; Yoshimoto, M, Itoh, F, Yamamoto, H, Hinoda, Y, Imai, K, and Yachi, A; 1993, Expression of MMP-7(PUMP-1) mRNA in human colorectal cancers, Int. J. Cancer, 54, 614-618). MMP7 является одной из немногих ММР, которая фактически секретируется опухолевыми клетками (Overall, CM and Kleifeld, О; 2006, Tumour microenvironment -opinion: validating matrix metalloproteinases as drug targets and anti-targets for cancer therapy, Nat.Rev.Cancer, 6, 227-239). Кроме того, уровни экспрессии ММР7 мРНК соотносятся со стадией про-грессирования КРР (Ishikawa, T, Ichikawa, Y, Mitsuhashi, M, Momiyama, N, Chishima, T, Tanaka, K, Yama-oka, H, Miyazakic, K, Nagashima, Y, Akitaya, T, and Shimada, H; 1996, Matrilysin is associated with progression of colorectal tumor, Cancer Lett., 107, 5-10; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Cancer, 75, 1516-1519). При метастазах при КРР ММР7 играет также центральную роль (Adachi, Y, Yamamoto, H, Itoh, F, Hinoda, Y, Okada, Y, and Imai, K; 1999, Contribution of matrilysin (MMP-7) to the metastatic pathway of human colorectal cancers, Gut, 45, 252-258; Mori, M, Barnard, GF, Mimori, K, Ueo, H, Akiyoshi, T, and Sugimachi, K; 1995, Overexpression of matrix metalloproteinase-7 mRNA in human colon carcinomas, Cancer,
75, 1516-1519).
Повышенные уровни сыворотки ММР7 ассоциируются с плохим прогнозом для пациентов с коло-ректальным раком на поздних стадиях (Maurel, J, Nadal, С, Garcia-Albeniz, X, Gallego, R, Carcereny, E, Almendro, V, Marmol, M, Gallardo, E, Maria, AJ, Longaron, R, Martinez-Fernandez, A, Molina, R, Castells, A, and Gascon, P; 2007, Serum matrix metalloproteinase 7 levels identifies poor prognosis advanced colorectal cancer patients, Int. J. Cancer, Published Online: 8 May 2007), а гиперэкспрессия у пациентов с КРР, ассоциирующаяся опять же с сокращением выживаемости, как предполагалось способствует ускользанию от иммунологического надзора путем расщепления Fas на опухолевых клетках (Wang, WS, Chen, PM, Wang, HS, Liang, WY, and Su, Y; 2006, Matrix metalloproteinase-7 increases resistance to Fas-mediated apoptosis and is a poor prognostic factor of patients with colorectal carcinoma, Carcinogenesis, 27, 1113-1120).
Белки по изобретению могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.
Пептид корового антигена вируса гепатита В, HBV-001, получен не из эндогенного опухолеассо-циированного антигена человека, а из корового антигена вируса гепатита В. Во-первых, это позволяет количественные сравнения интенсивности Т-клеточных ответов, индуцированных TUMAP, и, следовательно, позволяет сделать важные выводы о способности вызывать противоопухолевые ответы. Во-вторых, он функционирует как важный положительный контроль в случае недостатка каких-либо Т-клеточных ответов у пациента. И, в-третьих, он также позволяет сделать заключение о статусе иммуно-компетентности пациента.
Инфицирование вирусом гепатита В (HBV) является одной из самых распространенных причин заболевания печени, поражающим примерно 350 млн человек по всему миру (Rehermann, В and Nascimbeni, M; Immunology of hepatitis В virus and hepatitis С virus infection, Nat.Rev.Immunol., 2005, 5, 215-229). В связи с простотой горизонтального и вертикального переноса и наличием потенциала для хронического заболевания это может привести к циррозу печени и гепатоклеточной карциноме, поэтому HBV наносит сильный удар по системам здравоохранения многих стран мира. Геном HBV (Previsani, N and Lavanchy, D; 2002, Hepatitis В, (Epidemic and Pandemic Alert and Response, World Health Organization, Geneva, 2002)) включает частично двухнитевую кольцевую ДНК. В вирионах HBV она окружена коро-вым белком НВс и другими белками, формируя нуклеокапсид, который защищен внешней оболочкой, содержащей липиды и поверхностные белки семейства HBs (называемые также оболочечными белками). Антигенные детерминанты, ассоциированные с НВс и HBs, обозначаются как HBcAg и HBsAg соответственно. Эти антигены ассоциированы с серологической реакцией, т.е. ответами антител, обнаруженными в крови пациента, и находятся среди клинически наиболее применимых систем антиген-антитело для диагноза инфекции HBV. НВс будет представлять новый чужеродный антиген у всех индивидов без предшествующей истории инфекции HBV. Так как для этого антигена хорошо известны иммуногенные
пептиды (Bertoletti, A, Chisari, FV, Penna, A, Guilhot, S, Galati, L, Missale, G, Fowler, P, Schlicht, HJ, Vi-
tiello, A, Chesnut, RC, and; 1993, Definition of a minimal optimal cytotoxic T-cell epitope within the hepatitis В virus nucleocapsid protein, J.Virol., 67, 2376-2380; Livingston, BD, Crimi, C, Grey, H, Ishioka, G, Chisari, FV, Fikes, J, Grey, H, Chesnut, RW, and Sette, A; 1997, The hepatitis В virus-specific CTL responses induced in humans by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection, J.Immunol., 159, 1383-1392), то в рамках исследований IMA из HBcAg в качестве антигена для положительного контроля
был выбран один пептид из 10 аминокислот. Индукция пептид-специфических ЦТЛ НВс будет, затем, использоваться как маркер иммунокомпетентности пациента и успешности вакцинации.
Фармацевтическая композиция в дальнейшем может содержать дополнительные пептиды и/или наполнители для большей эффективности, как это будет пояснено ниже.
"Вариантной аминокислотной последовательностью" данной аминокислотной последовательностью изобретатели обозначают, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой HLA по существу таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если, не улучшит, способность взаимодействовать и связываться с подходящей молекулой МНС, такой как HLA-A или -DR, и так что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как определено в аспектах данного изобретения. Как может быть извлечено из базы данных, некоторые позиции связывающихся с HLA-A пептидов являются типичными "якорными" остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу HLA-связывающей бороздки.
Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, чье включение, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с релевантным МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности или их участок или их вариант, как дано.
В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы "коровой последовательностью", имеющей конкретный HLA-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). N- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину, например, от 1 до 10 аминокислот соответственно. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но, в основном, они могут иметь молекулярный вес меньше чем 100000, предпочтительно меньше чем 50000, более предпочтительно меньше чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также композиции из пептидов и их вариантов, в которых пептид или вариант имеет общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.
В соответствии с этим, варианты, которые индуцируют Т-клеточную перекрестную реакцию с пептидом по изобретению, часто являются вариантами по длине.
Если пептид, который длиннее, чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС II класса, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному HLA- связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС II класса или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности, если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.
Также возможно, чтобы эпитопы МНС I класса, хотя они обычно имеют длину между 8-10 аминокислотами, генерировались при процессинге пептидов из более длинных пептидов или белков, включающих истинный эпитоп. Аналогично с эпитопами МНС II класса предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к связывающему региону, по существу, не влияли на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС I класса или презентировать пептид ЦТЛ и не маскировали сайты для протеолитического расщепления, необходимые для выявления истинного эпитопа во время процессинга.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает также пептиды и варианты эпитопов МНС I класса, имеющие общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30, наиболее предпочтительно между 8 и 16, а именно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.
Разумеется, пептид или вариант в соответствии с настоящим изобретением будет обладать способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) I или II класса. Связывание пептида или варианта с комплексом МНС может быть проверено методами, известными из уровня техники, например, теми, что описываются в примерах настоящего изобретения или в литера
туре для различных аллелей МНС II класса (e.g. Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB 1*1501 molecules delineated from self-peptides; J. Immunol. 1994; 153 (4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J. Immunol. 1994; 153(3): 1141-1149; Manici S, Stumiolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J. Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; J. Exp Med. 1995, 181(5): 1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoroimmunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J. Immunol Methods. 1993; 163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Lon-dei M, Kalbacher H, Haider T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid de-carboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998
(12):1765-1776).
Дополнительные фрагменты аминокислот, находящиеся на N-и/или С-конце, не являющиеся обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как эпитоп для молекул МНС, могут, тем не менее, быть важны для обеспечения эффективного введения пептида в соответствии с настоящим изобретением в клетки. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению является белком слияния, который включает, например, 80 N-терминальных аминокислот HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем "Ii"), как взятая из банка данных NCBI, инвентарный номер - GenBank Accession-number X00497 (Strubin, M., Mach, В. and Long, E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual trans-
membrane polarity EMBOJ. 3 (4), 869-872 (1984)).
Предпочтительной является фармацевтическая композиция, в которой пептиды имеют общую длину между 8 и 100, предпочтительно между 8 и 30 и особенно предпочтительно между 8 и 16 аминокислотами.
Кроме того, пептид или вариант может быть модифицирован в дальнейшем для улучшения стабильности и/или связывания с молекулами МНС в целях получения более сильного иммунного ответа. Методы для такой оптимизации пептидной последовательности хорошо известны из уровня техники и включают, например, введение обратных пептидных или непептидных связей.
Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, в которой по крайней мере один пептид или вариант включает непептидные связи.
В пептидах с обратной связью аминокислотные остатки присоединены не пептидными связями (-CO-NH-), но пептидная связь является обратной. Такие ретро-обратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Meziere et al. (1997), J. Immunol. 159-3237, включенной сюда путем ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, но не ориентацию боковых цепей. Meziere et al. (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны для ответов МНС и Т-хелперных клеток. Ретро-обратные пептиды, содержащие связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, намного более устойчивы к протеолизу.
Непептидной связью, является, например, -CH2-NH, -CH2S-, -СН2СН2-, -СН=СН-, -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -CH2SO-. Патент США № 4897445 обеспечивает метод твердофазного синтеза непептидных связей (-CH2-NH) в полипептидных цепях, что включает полипептиды, синтезированные с использованием стандартной методики, и непептидную связь, синтезированную при реакции аминоальдегида и аминокислоты в присутствии NaCNBH3.
Пептиды, включающие последовательности по изобретению, описанные выше, могут быть синтезированы с дополнительными химическими группами, находящимися на их аминном и/или карбоксильном концах, для увеличения, например, стабильности, биологической доступности и/или аффинности пептидов. Например, гидрофобные группы, такие как карбобензоксильные, данзильные или трет-бутилоксикарбонильные группы, могут быть добавлены к аминным окончаниям пептидов. Подобным образом, ацетильная группа или 9-фторенилметокси-карбонильная группа может быть введена в амин-ные окончания пептидов. Кроме того, гидрофобная группа, трет-бутилоксикарбонильная или амидная группа может быть, например, добавлена к карбоксильным окончаниям пептидов.
Далее, все пептиды по изобретению могут быть синтезированы в целях изменения их пространственной конфигурации. Например, D-изомер одного или более аминокислотных остатков пептида может быть использован скорее, чем обычный L-изомер. Более того, по крайней мере один из аминокислотных остатков пептидов по изобретению может быть замещен одним из хорошо известных не встречающихся в природе аминокислотных остатков. Изменения, такие как данные, могут служить для повышения стабильности, биологической доступности и/или связывающих свойств пептидов по изобретению.
Подобным образом, пептид или вариант по изобретению может быть модифицирован химическим способом посредством реакции специфических аминокислот как до, так и после синтеза пептида. При- 18
меры таких модификаций хорошо известны из уровня техники и обобщаются, например, в работе R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, которая включена сюда путем ссылки. Химическая модификация аминокислот включает, но не ограничивается, модификацией с помощью ацилирования, амидирования, пиридоксилирования лизина, восстановительного алкилирова-ния, тринитробензилирования аминных групп 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), амидной модификацией карбоксильных групп и сульфгидрильной модификации с помощью окисления надмуравьиной кислотой цистеина до цистеиновой кислоты, образованием ртутных производных, образованием смешанных дисульфидов с другими тиоловыми соединениями, реакцией с малеимидом, кар-боксиметилированием йодоуксусной кислотой или йодацетамидом и карбамоилированием цианатом при щелочном уровне рН, хотя не ограничиваясь ими. В этой связи специалист данной области может проконсультироваться с главой 15 раздела "Current Protocols" в журнале "Protein Science", Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000) для получения более обширной информации о методах, связанных с химической модификацией белков.
Вкратце, модификация, например, остатков аргинила в белках часто основана на реакции вици-нальных дикарбонильных соединений, таких как фенилглиоксаль, 2,3-бутандион и 1,2-циклогександион для формирования аддукта. Другим примером является реакция метилглиоксаля с остатками аргинина. Цистеин может быть модифицирован без сопутствующей модификации других нуклеофильных сайтов, таких как лизин и гистидин. В результате для модификации цистеина доступно большое число реагентов. На веб-сайтах фирм Pierce Chemical Company, Sigma-Aldrich и других опубликована информация о специфических реагентах.
Также распространена селективная редукция дисульфидных связей в белках. Дисульфидные связи могут быть образованы и оксидированы во время тепловой обработки биофармацевтических средств.
К-реагент Вудворда может использоваться для модификации специфических остатков глютамино-вой кислоты. ^(3-(диметилшино1гоопил)^'-этилкарбодиимид может использоваться для формирования внутримолекулярных поперечных связей между остатком лизина и остатком глютаминовой кислоты.
Например, диэтилпирокарбонат является реагентом для модификации остатков гистидила в белках. Гистидин может также быть модифицирован при использовании 4-гидрокси-2-ноненала.
Реакция остатков лизина и других а-аминных групп полезна, например, при связывании пептидов с поверхностями или перекрестном связывании (кросс-линкинг) белков/пептидов. Лизин является сайтом присоединения поли(этилен)гликоля и основным сайтом модификации при гликировании белков.
Остатки метионина в белках могут быть модифицированы с помощью, например, йодацетамида, бромэтиламина, хлорамина Т.
Тетранитрометан и N-ацетилимидазол могут быть использованы для модификации остатков тиро-зила. Кросс-линкинг через образование дитирозина может быть произведен с ионами перекиси водорода/меди.
В последних исследованиях по модификации триптофана используются N-бромсукцинимид, 2-гидрокси-5-нитробензилбромид или 3-бром-3-метил-2-(2-нитрофенилмеркапто)-3Н-индол (BPNS-скатол).
Успешная модификация терапевтических белков и пептидов с PEG-полиэтиленгликолем часто ассоциируется с увеличением циркуляторного полураспада, в то время как кросс-линкинг белков с глута-ральдегидом, полиэтиленгликоль-диакрилатом и формальдегидом используется для приготовления гидрогелей. Химическая модификация аллергенов для иммунотерапии часто достигается при карбамоили-ровании цианатом калия.
В целом пептиды и варианты (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы, к примеру, Fmoc-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Lu и соавторов (1981), J. Org. Chem. 46, 3433-3436 и в прилагающихся ссылках.
Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник как рекристаллизация, эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием, к примеру, градиентного разделения ацетонитрил/вода.
Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, электрофореза, в частности капиллярного электрофореза, твердофазной экстракции (ТФЭ), обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (FAB), а также масс-спектрометрический анализ MALDI и ESI-Q-TOF.
Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид или вариант по изобретению. Полинуклеотид может быть, к примеру, ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК, как одно-, так и/или двухнитевыми; натуральными или стабилизированными формами полинуклеотидов, таких как, к примеру, полинуклеотиды с фосфоротиоатным остовом или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Разумеется, только пептиды, содержащие встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные
природными пептидными связями, могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением. Векторы экспрессии для различных видов клеток хорошо известны из уровня техники и могут быть выбраны без проведения излишних экспериментов.
Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину стандартными способами.
С руководством можно ознакомиться, к примеру, в работе Sambrook и соавторов (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
В особенно предпочтительном воплощении изобретения, однако, фармацевтическая композиция включает по крайней мере два пептида, состоящих из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 1 по SEQ ID NO: 15.
Оптимальное количество каждого пептида, включаемого в вакцину, и оптимальная схема дозировки может быть определена специалистом данной области без проведения излишних экспериментов. Например, пептид или его вариант может приготавливаться для внутривенной (i.v.) инъекции, подкожной (s.c.) инъекции, внутрикожной (i.d.) инъекции, внутрибрюшной (i.p.) инъекции, внутримышечной (i.m.) инъекции.
Предпочтительные пути введения пептидной инъекции - s.c, i.d., i.p., i.m. и i.v. Предпочтительными путями введения инъекции ДНК являются i.d., i.m., s.c, i.p. и i.v. Вводиться могут дозы, к примеру, между 1 и 500 мг, 50 мкг и 1,5 мг, предпочтительно от 125 мкг до 500 мкг пептида или ДНК и будут зависеть от соответствующего пептида или ДНК. Дозы в данных пределах успешно использовались в предыдущих клинических исследованиях (Brunsvig P.F., Aamdal S., Gjertsen M.K., Kvalheim G., Markowski-Grimsrud C.J., Sve I., Dyrhaug M., Trachsel S., Tvteller M., Eriksen J.A., Gaudernack G.; Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P.Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C.G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, ASCO meeting 2007; Abstract No 3017).
Фармацевтическая композиция по изобретению может быть составлена так, что выбор, номер и/или количество пептидов, присутствующих в композиции является/являются ткане-, раково- и/или пациент-специфической(ими). Например, руководством для точного отбора пептидов могут служить образцы экспрессии родительских белков в данной ткани во избежание побочных эффектов. Выбор может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от HLA-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.
Для композиции, предназначенной для использования в качестве вакцины против КРР, например, будут избегаться пептиды, родительские белки которых экспрессированы в больших количествах в нормальных тканях, или они будут присутствовать в малых количествах в композиции по изобретению. С другой стороны, если известно, что опухоль пациента экспрессирует большие количества конкретного белка, то соответствующая фармацевтическая композиция для лечения данного вида рака может быть представлена в больших количествах и/или может включать более одного пептида, специфического для данного особенного белка или сигнального пути данного белка.
Специалист данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток in vitro в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональных свойств Т-клеток, например, при анализе выработки IFN-y (см. также примеры ниже). Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются, затем, в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.
Подходящая вакцина будет предпочтительно содержать между 1 и 20 пептидами, более предпочтительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 различных пептидов, в дальнейшем предпочтительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 различных пептидов и, наиболее предпочтительно, 14 различных пептидов. Длина пептида для применения в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности, он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 7-, или 8-, или 10-, или 11-мерным пептидом или 12-, 13-, 14- или 15-мером. Более длинные пептиды могут быть также подходящими; 9-мерные или 10-мерные пептиды, как описано в табл. 1 и 2, являются предпочтительными для пептидов МНС класса I, в то время как 12-ти - 15-меры предпочтительны для пепти
дов МНС класса II.
Пептид(ы) формирует(ют) вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.
Пептид может быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъю-вантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептид может быть также конъюгиро-ван в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker et al. (1993), Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют CD4 или CD8 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой Т-клетками, положительными для противоположного CD. Таким образом, для эпитопов МНС II класса, которые стимулируют CD4 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD8-положительные Т-клетки. С другой стороны, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют CD8 ЦТЛ, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопы, которые стимулируют CD4-положительные Т-клетки. CD4- и CD8-стимулирующие эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были идентифицированы в настоящем изобретении.
Чтобы вызвать иммунный ответ, обычно необходимо включить наполнители, что приводит к большей иммуногенности композиции. Таким образом, в предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция включает далее по крайней мере один подходящий адъювант.
Адъюванты - это вещества, которые неспецифически усиливают или потенцируют иммунный ответ (например, иммунные ответы, опосредованные ЦТЛ или хелперными Т-клетками (TH) на антиген, и могут, таким образом, рассматриваться как полезные в медикаменте настоящего изобретения. Подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются, 1018 ISS, соли алюминия, Amplivax, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Имиквимод, ImuFact IMP321, IS Patch, ISS, IS-COMATRIX, JuvImmune, LipoVac, MF59, монофосфорил липид А, Монтанид IMS 1312, Монтанид ISA 206, Монтанид ISA 50V, Монтанид ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, векторная система PepTel(r), микрочастицы PLG, резиквимод, SRL172, вирусомы и другие вирусоподобные частицы, YF-17D, VEGF trap, R848, Бета-глюкан, Pam3Cys, стимулон Aquila's QS21 (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA) который получают из сапонина, микобактериальные экстракты и синтетические имитации бактериальных клеточных стенок и другие запатентованные адъюванты, такие как Ribi's Detox, Quil или Super-fos. Предпочтительными адъювантами являются такие, как неполный адъювант Фрейнда или ГМ-КСФ. Несколько иммунологических адъювантов (например, MF59), специфических для дендритных клеток, и их приготовление были описаны ранее (Dupuis M, Murphy TJ, Higgins D, Ugozzoli M, van Nest G, Ott G, McDonald DM; Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection; Cell Immunol. 1998; 186(1): 18-27; Allison AC; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand. 1998; 92:3-11). Также могут использоваться цитокины. Несколько цитокинов были присоединены напрямую для оказания влияния на миграцию дендритных клеток к лимфоидным тканям (например, TNF-a), ускоряя созревание дендритных клеток до эффективных, презентирующих антиген Т-лимфоцитам, клеток (например, ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ИЛ-4) (патент США № 5849589, специфически включенный сюда в его целостности путем ссылки) и действуя как иммуноадъюванты (например, ИЛ-12) (Gabrilovich D1, Cunningham HT, Carbone DP; IL-12 and mutant P53 peptide-pulsed dendritic cells for the specific immunotherapy of cancer; J. Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418).
Об иммуностимулирующих олигонуклеотидах CpG также сообщалось, что они усиливают эффекты адъювантов в составе вакцин. Теоретически не связанные, CpG- олигонуклеотиды при активации врожденной (неадаптивной) иммунной системы действуют с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR), в основном TLR9. Вызванная CpG активация TLR9 усиливает антиген-специфические гуморальные и клеточные ответы на широкий спектр антигенов, включая пептидные или белковые антигены, живые или убитые вирусы, вакцины из дендритных клеток, аутологичные клеточные вакцины и полисахаридные конъюгаты как в профилактических, так и терапевтических вакцинах. Более важно то, что улучшается созревание и дифференциация дендритных клеток, приводя к улучшенной активации TH1-клеток и интенсивной генерации цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) даже при отсутствии помощи CD4 Т-клеток. Отклонение в сторону ТН1, вызванное стимуляцией TLR9, сохраняется даже в присутствии вакцинных адъювантов, таких как квасцы или неполный адъювант Фрейнда (IFA), которые обычно способствуют отклонению в сторону ТН2. CpG-олигонуклеотиды проявляют даже большую адъювантную активность, если они входят в состав или вводятся вместе с другими адъювантами или в таких составах как микрочастицы, наночастицы, липидные эмульсии или подобных составах, которые в особенности необходимы для инициации сильного ответа, если антиген относительно слаб. Они также ускоряют иммун
ную реакцию и позволяли снизить дозы антигена на приблизительно два порядка величины с ответами антитела, сравнимыми с полной дозой вакцины без CpG в некоторых экспериментах (Arthur M. Krieg, Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation, Nature Reviews, Drug Discovery, 2006, 5, 471-484). В патенте США № 6406705 B1 описывается комбинированное применение CpG-олигонуклеотидов, адъю-вантов, не включающих нуклеиновые кислоты, и антигена для вызывания антиген-специфического иммунного ответа. Имеющимся в продаже антагонистом CpG TLR9 является dSLIM (контурный иммуно-модулятор двойного действия) компании "Mologen" (Берлин, Германия), который является предпочтительным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения. Также могут быть использованы другие молекулы, связывающиеся с TLR, такие как РНК, связывающаяся с TLR 7, TLR 8
и/или TLR 9.
Другие примеры полезных адъювантов включают, но не ограничиваются химически модифицированными CpG (например, CpR, Idera), Poly(I:Q (например, polyI:C12U), не-CpG бактериальной ДНК или РНК, а также иммуноактивными малыми молекулами и антителами, такими как имидазохинолины, цик-лофосфамид, сунитиниб, бевацизумаб, целебрекс, NCX-4016, силденафил, тадалафил, варденафил, сора-фениб, XL-999, СР-547632, пазопаниб, ZD2171, AZD2171, ипилимумаб, тремелимумаб и SC58175, которые могут действовать терапевтически и/или как адъювант. Количества и концентрации адъювантов и вспомогательных веществ, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом без проведения излишних экспериментов.
Предпочтительными адъювантами являются dSLIM, BCG, OK432, имиквимод, PeviTer, и JuvIm-mune.
В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из колониестимулирующих факторов, таких как гранулоцитар-но-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ, сарграмостим).
В предпочтительном воплощении фармацевтической композиции в соответствии с изобретением адъювантом является имиквимод.
Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды и факультативно другие молекулы растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Ed., 2000, изд. "American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press". Композиция может применяться для предупреждения, профилактики и/или лечения аденоматозных или раковых заболеваний, предпочтительно КРР.
Цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) распознают антиген в форме пептида, связанного с молекулой МНС скорее, чем интактный чужеродный антиген сам по себе. Сама молекула МНС находится на клеточной поверхности антигенпрезентирующей клетки. Так, активация ЦТЛ возможна, только если имеется в наличии тримерный комплекс из пептидного антигена, молекулы МНС и АПК. Соответственно, иммунный ответ может быть усилен, если для активации ЦТЛ использован не только пептид, а если, кроме того, добавлены АПК с соответствующей молекулой МНС.
Поэтому в предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку.
Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС I или II класса на своей поверхности и в одном воплощении является, по существу, не способной самостоятельно нагружать на молекулу МНС I или II класса выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС I или II класса может быть легко нагружена выбранным антигеном in vitro.
Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, RMA-S и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена.
Нагружающая пептидом дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, США под каталоговым № CRL 1992; клеточная линия дрозофилы линия Schneider 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № CRL 19863; клеточная линия мыши RMA-S описывается у Karre и Ljunggren (1985), J. Exp. Med. 162, 1745. Данные клеточные линии могут быть использованы в качестве АПК, и из-за недостатка ТАР практически все пептиды, презентируемые МНС I класса, будут пептидами при тщательной проверке, использованными для загрузки извне пустых молекул МНС I класса этих клеточных линий, следовательно, все эффекты будут отчетливо относиться к использованным пептидам.
Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Подходящим образом, дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим ан
тигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеас-социированного антигена раскрывается у Murphy и соавторов (1996), The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al. (1997), The Prostate 32, 272-278.
Так, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения в фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одну антигенпрезентирующую клетку, введен импульсным методом или погружен пептид, к примеру, методом примера 4.
В качестве альтернативы антигенпрезентирующая клетка включает модель экспрессии, кодирующей пептид. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом, и, предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом, приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.
Как правило, нуклеиновая кислота по изобретению может быть включена в вирусный полинуклео-тид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антиген-специфический противоопухолевый иммунитет по отношению к MUC1 (см. Gong et al. (1997), Gene Ther. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, Wan et al. (1997), Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (Specht et al. (1997), J. Exp. Med. 186-1221 и Szabolcs et al. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Tuting et al. (1997), Eur. J. Immunol. 27-2707); а также может быть использована РНК (Ashley et al. (1997), J. Exp. Med. 186, 1182).
В целом фармацевтическая композиция по изобретению, содержащая (а) нуклеиновую(ые) кисло-ту(ы) по изобретению, может вводиться подобным образом, как и те, что содержат пептид(ы) по изобретению, например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшно, внутримышечно, внутрикожно, внутрь опухоли, орально, дермально, назально, буккально, ректально, вагинально, с помощью ингаляции или посредством топического введения.
По причине действия механизмов уклонения опухоль часто вырабатывает резистентность к медикаменту, которым она лечится. Резистентность к медикаменту может появиться во время лечения, и она проявляется в метастазах и рецидивировании опухоли. Во избежание таковой медикаментозной резистентности опухоль обычно лечат комбинацией медикаментов, и для лечения метастазов и опухоли, возвращающейся повторно после периода ремиссии, часто требуется комбинация, отличающаяся от первой. Поэтому, в одном аспекте изобретения фармацевтическая композиция вводится в соединении со вторым противораковым веществом. Второе противораковое вещество может вводиться до, после или одновременно с фармацевтической композицией по изобретению. Одновременное введение может быть достигнуто, например, при смешивании фармацевтической композиции по изобретению со вторым противораковым веществом, при условии совместимости их химических свойств. Другая возможность для одновременного введения - это введение композиции и противоракового вещества в один и тот же день, независимо от способа введения, так что фармацевтическая композиция по изобретению может быть, например, инъецирована, в то время как второе противораковое вещество вводится, например, орально. Фармацевтическая композиция и второе противораковое вещество могут также вводиться в рамках одного и того же курса лечения, но в разные дни и/или в рамках отдельных курсов лечения.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает метод для лечения или предупреждения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества любой из фармацевтических композиций по изобретению.
Терапевтически эффективным количеством будет количество, достаточное для вызывания иммунного ответа, в частности, активации субпопуляции ЦТЛ. Специалист данной области может легко определить, будет то или иное количество эффективным, при использовании стандартных иммунологических методов, таких как те, что приводятся в примерах к настоящей спецификации. Другим способом мониторинга эффекта от конкретного количества фармацевтической композиции является наблюдение роста обработанной опухоли и/или ее рецидива.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения фармацевтическая композиция применяется в качестве противораковой вакцины.
Композиция, содержащая пептиды или кодирующие пептиды нуклеиновые кислоты, может также формировать вакцину против опухоли или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту.
Композиция по изобретению может использоваться в методе лечения или в качестве вакцины против рака. Рак может быть раком ротовой полости и глотки, раком пищеварительного тракта, раком толстой кишки, прямой кишки и анального отверстия, раком дыхательных путей, раком груди, раком шейки матки, влагалища и наружных половых органов, раком тела матки и яичника, раком мужских половых путей, раком мочевыводящих путей, раком костной и мягкой ткани и саркомой Капоши, меланомой ко
жи, меланомой глаза и немеланомным раком глаза, раком головного мозга и центральной нервной системы, раком щитовидной железы и других эндокринных желез, лимфомой Ходжкина, лимфомой не-Ходжкина и миеломой, предпочтительно раком почки, колоректальным раком, раком легкого, раком груди, раком поджелудочной железы, раком простаты, раком желудка, раком головного мозга, гастроин-тестинальной стромальной опухолью (GIST) или глиобластомой.
В наиболее предпочтительном воплощении метода лечения или вакцины в соответствии с изобретением вакцина является комплексной пептидной противоопухолевой вакциной для лечения колорек-тального рака. Предпочтительно, чтобы вакцина включала комплекс опухолеассоциированных пептидов, выбранных из последовательностей SEQ ID NO: 1 по 15, которые локализованы и были идентифицированы на первичных клетках колоректального рака. Этот комплекс включает пептиды HLA класса I и II. Пептидный комплекс может также содержать по крайней мере один пептид, например, из корового антигена HBV, используемый в качестве пептида положительного контроля, служащего как антигенный маркер для проверки эффективности внутрикожного введения. В одном особенном воплощении вакцина состоит из 14 отдельных пептидов (в соответствии с SEQ ID NO: 1 по 15) с весом каждого пептида от около 1500 мкг до около 75 мкг, предпочтительно от около 1000 мкг до около 750 мкг и, более предпочтительно, от около 500 мкг до около 600 мкг и, наиболее предпочтительно, около 578 мкг, которые все могут быть очищены на ВЭЖХ и ионообменной хроматографии и получены в виде белого до серовато-белого порошка. Лиофилизат предпочтительно растворяют в гидрокарбонате натрия и используют для внутрикожной инъекции в течение 30 мин после восстановления при комнатной температуре. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные количества пептидов могут варьироваться между около 0,1 и 100 мг, предпочтительно между около 0,1 до 1 мг и, наиболее предпочтительно, между около 300 мкг до 800 мкг на 500 мкл раствора. Термин "около" подразумевает здесь ±10% процентов заданного объема, если не указано другое. Специалист данной области будет способен установить фактическое количество пептида для использования, исходя из нескольких факторов, таких как, например, иммунный статус отдельного пациента и/или количество TUMAP (опухолеассоциированный пептид), который пре-зентируется в конкретном виде рака. Пептиды настоящего изобретения могут обеспечиваться в других подходящих формах (стерильные растворы и т.д.) вместо лиофилизата.
Фармацевтический препарат по настоящему изобретению, содержащий пептиды и/или нуклеино-вую(ые) кислоту(ы) в соответствии с изобретением, водится пациенту, страдающему аденоматозным или раковым заболеванием, ассоциированным с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован иммунный ответ, опосредованный Т-клетками.
Предпочтительна фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением, в которой количество (в особенности опухолеассоциированного(ых)) пептида(ов), нуклеиновых(ой) кислот(ы) в соответствии с изобретением или вектора(ов) экспрессии в соответствии с изобретением, как присутствующие в указанной композиции, являе(ю)тся ткане-, раково- и/или пациент-специфическим.
В другом предпочтительном воплощении изобретения вакцина является вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Она может вводиться непосредственно пациенту, в пораженный орган или систематично, или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки in vitro, то может быть полезно, чтобы клетки были трансфецированными, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2 или ГМ-КСФ (GM-CSF). Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может/могут быть, по существу, чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как те, что описывались выше для пептидных вакцин. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта.
Полинуклеотид может быть, по существу, чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки. Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством "ген-пистолета". Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом из столбнячного токсина, который стимулирует CD4-положительные Т-клетки.
Соответственно, любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. "Обнаженная" ДНК может вводиться внутримышечно или внутрикожно или подкожно. Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть также доставлена в липо-соме или как часть системы доставки вирусного вектора. Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой
кислоты, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу, тогда как пептидные вакцины предпочтительно вводятся s.c. или i.d. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу.
Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида профессиональными антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут не быть трансфецированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированный пептид из трансфеци-рованных клеток в ткани ("кросс-прайминг", например, Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, Huang LQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specific CD8(+) T-cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by antigen-presenting cells in vaccinated pancreatic cancer
patients. J. Exp Med. 2004 Aug 2; 200(3):297-306).
Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Сопгу и соавторов (1996), Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al. (1996), Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong et al. (1997), Nature Medicine 3,558-561; Zhai et al. (1996), J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al. (1996), Int J. Cancer 65, 664-670; и Burchell et al. (1996), с. 309-313 В: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al. (eds), John Libbey Eurotext, которые все включены в описание путем ссылки.
Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например, в анти-генпрезентирующие клетки либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента с введением ex vivo пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у Zhou и соавторов (1995), Blood 86, 3295-3301; Roth et al. (1996), Scand. J. Immunology 43, 646651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.
Наконец, вакцина в соответствии с изобретением может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени, как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от HLA-гаплотипа пациента. В дальнейшем вакцина в соответствии с изобретением может содержать индивидуализированные компоненты, соответствующие личным потребностям отдельного пациента. Примерами являются различные количества пептидов в соответствии с экспрессией связанных с ними ТАА у конкретного пациента, нежелательными побочными эффектами в связи с аллергиями или другими лечениями и согласованием для вторичного лечения, следующего за первым циклом или схемой лечения.
Кроме того, пептиды настоящего изобретения полезны не только для лечения рака, но и также в качестве диагностических средств. Так как пептиды были получены из глиобластомы, и так как было определено, что данные пептиды не присутствуют в нормальных тканях, то эти пептиды могут быть использованы для постановки диагноза о наличии рака.
Присутствие пептидов настоящего изобретения на тканевых биоптатах может помочь патологу в постановке диагноза рака. Детекция конкретных пептидов настоящего изобретения с помощью антител, масс-спектрометрии или других методов, известных из уровня техники, может дать знать патологу, что ткань поражена злокачественным или воспалительным или же заболеванием общего порядка. Присутствие групп пептидов настоящего изобретения может сделать возможной классификацию или субклассификацию пораженных заболеванием тканей.
Детекция пептидов настоящего изобретения на образцах пораженной заболеванием ткани может позволить принять решение о преимуществах от терапии, воздействующей на иммунную систему, в особенности, если Т-лимфоциты, как известно или ожидается, задействованы в механизме действия. Отсутствие экспрессии МНС является хорошо описанным механизмом, при котором инфицированные или злокачественные клетки уклоняются от иммунного надзора. Так, присутствие пептидов настоящего изобретения показывает, что данный механизм не используется проанализированными клетками.
Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для анализа ответов лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения, таких как ответы Т-клеток или ответы антител на пептиды настоящего изобретения или пептиды настоящего изобретения в комплексе с молекулами МНС. Данные иммунные ответы лимфоцитов могут использоваться в качестве прогностических маркеров для принятия решения о дальнейших этапах терапии. Данные иммунные ответы могут также использоваться в качестве суррогатных маркеров в иммунотерапевтических подходах, направленных на индуцирование ответов лимфоцитов с помощью различных средств, как, например, вакцинации белком, нуклеиновыми кислотами, ауто-логичными материалами, адаптивного переноса лимфоцитов. При генной терапии ответы лимфоцитов на пептиды настоящего изобретения могут быть рассмотрены в рамках оценки побочных эффектов. Мониторинг ответов лимфоцитов может также быть ценным инструментом для последующих обследований в случае трансплантации, к примеру, для детекции реакций "хозяин против трансплантата" и "трансплантат против хозяина".
Пептиды настоящего изобретения могут использоваться для генерации и разработки специфических антител к комплексам МНС/пептид. Они могут быть использованы в терапии, нацеливающей токсины или радиоактивные вещества на пораженную ткань. Другим видом использования данных антител может быть "нацеливание" радионуклидов на пораженную ткань в целях визуализации, такой как PET
(позитронно-эмиссионная томография). Это может помочь в обнаружении небольших метастазов или в определении размера и точного расположения пораженных тканей. Кроме того, пептиды могут быть использованы для верификации диагноза патолога, поставленного на основании биоптата.
В другом его аспекте настоящее изобретение относится к комплекту, включающему (а) контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, описанную выше, в виде раствора или в лиофилизованной форме; (b) опционально, второй контейнер, содержащий разбавитель или восстанавливающий раствор для лиофилизованного состава; и (с) опционально, инструкции по (i) применению раствора или (ii) восстановителя, и/или по применению лиофилизованного состава. В дальнейшем оборудование может включать один или более (iii) буфер, (iv) разбавитель, (v) фильтр, (vi) иглу или (vii) шприц. Контейнер является, предпочтительно, флаконом, ампулой, шприцем или пробиркой; и он также может быть контейнером многоразового использования. Фармацевтическая композиция предпочтительно лиофилизова-на.
Вспомогательное оборудование настоящего изобретения предпочтительно включает лиофилизо-ванный состав настоящего изобретения в подходящем контейнере и инструкции для ее восстановления и/или по ее применению. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы (например, двухкамерные ампулы), шприцы (такие как двухкамерные шприцы) и пробирки. Контейнер может быть сделан из разнообразных материалов, таких как стекло или пластик. Предпочтительным образом, вспомогательное оборудование и/или контейнер содержит инструкции для, или связанные с контейнером, которые дают указания для восстановления и/или применения. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизованный состав должен восстанавливаться до пептидных концентраций, как те, что описаны выше. На этикетке в дальнейшем может быть указано, что состав применяется или предназначается для подкожного введения.
Контейнер с составом может быть ампулой многоразового использования, которая позволяет повторное введение (например, от 2-6 введений) восстановленного состава. Вспомогательное оборудование может включать в дальнейшем второй контейнер, включающий подходящий разбавитель (например, раствор бикарбоната натрия).
При смешивании разбавителя и лиофилизованного состава окончательная концентрация пептида в восстановленном составе составляет предпочтительно по крайней мере 0,15 мг/мл/пептид (=75 мкг) и предпочтительно не более чем 3 мг/мл/пептид (=1500 мкг). Вспомогательное оборудование может в дальнейшем включать другие материалы, желательные с коммерческой и с точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и упаковочные вкладыши с инструкциями по применению.
Вспомогательное оборудование настоящего изобретения может иметь один контейнер, который содержит состав фармацевтических композиций в соответствии с настоящим изобретением с или без других компонентов (например, других соединений или фармацевтических композиций этих других соединений) или может иметь отдельные контейнеры для каждого компонента.
Вспомогательное оборудование по изобретению предпочтительно включает состав по изобретению, укомплектованный для применения в комбинации с ковведением второго соединения (такого как адъю-ванты (например, ГМ-КСФ), химиотерапевтического средства, натурального продукта, гормона или антагониста, средства против ангиогенеза или ингибитора; апоптоз-индуцирующего средства или хелатора) или их фармацевтической композиции. Компоненты вспомогательного оборудования до введения пациенту могут предварительно быть организованы в комплекс, или же каждый компонент может находиться в отдельном отличном контейнере. Компоненты вспомогательного оборудования могут обеспечиваться одним или несколькими жидкостными растворами, предпочтительно, водным раствором, более предпочтительно, стерильным водным раствором. Компоненты вспомогательного оборудования могут также обеспечиваться твердой формой, которая может быть превращена в жидкости при добавлении подходящих растворителей, которые, предпочтительным образом, предоставляются в другом, отличном, контейнере.
Контейнер терапевтического оборудования может быть ампулой, пробиркой, колбой, флаконом, шприцем или любыми другими средствами, заключающими в себе твердое вещество или жидкость. Обычно, если имеются более одного компонента, оборудование содержит вторую ампулу или другой контейнер, который позволяет отдельную дозировку. Оборудование может также содержать другой контейнер для фармацевтически приемлемой жидкости. Терапевтическое оборудование будет предпочтительно содержать приспособление (например, одну или более иглу, шприцы, пипетки для глаз, пипетки и т.д.), которое позволяет введение веществ по изобретению, которые являются компонентами настоящего оборудования.
Фармацевтический состав настоящего изобретения подходит для введения пептидов любым приемлемым способом, таким как оральный (энтеральный), назальный, офтальный, подкожный, внутрикож-ный, внутримышечный, внутривенный или трансдермальный. Предпочтительно, чтобы введение было s.c, и, наиболее предпочтительно, i.d. Введение может производиться инфузионным насосом.
Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответственной комбинации, как было показано, но и также по
отдельности без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.
Теперь изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие фигуры, список последовательностей и примеры. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Тетрамерный анализ стимулированной микросферой пролиферации ODC-001 и NOX-001-специфических CD8+ лимфоцитов из периферической крови. ПК, обогащенные на лунку 1х106 CD8+ здорового донора HLA-A*0201+HD100 стимулировались еженедельно микросферами, связанными с ан-ra-CD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A*0201/ODC-001 (верхняя секция) или анти-CD28 плюс опухолевый антиген высокой плотности A*0201/NOX-001 (нижняя секция). После трех стимуляций in vitro все клетки были окрашены антителом CD8 FITC плюс тетрамеры A*0201/NOX-001 РЕ и A*0201/ODC-001 APC. Клетки высаживаются в популяцию лимфоцитов или CD8+ лимфоцитов (правая секция), и числа показывают процентную долю тетрамера+ внутри лимфоцитов CD8+.
Фиг. 2. Иммуногенность in vitro TGFBI-004, обнаруженного IFN-y ELISPOT после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали и стимулировали повторно TGFBI-004, а затем инкубировали с релевантным TGFBI-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом соответственно. Анализ после IFN-y ELISPOT был произведен на ELISPOT-ридере (CTL, Cleveland, США). ФГА-иономицин служил положительным контролем. Числа указывают на количество положительных точек.
Фиг. 3. Иммуногенность in vitro TGFBI-004, обнаруженного методом ICS после пяти циклов стимуляции. Клетки примировали аутологичными ДК с нагруженным TGFBI-004 и рестимулировали аутоло-гичными МПК плюс TGFBI-004. Для считывания клетки инкубировали с релевантным TGFBI-004 (лунки 1, 2, 3 и 4) и нерелевантным (отриц. контроль) пептидом соответственно. В дополнение к внутриклеточному окрашиванию IFN-y, клетки были также окрашены антителами CD4-FITC и CD8-PerCP. Анализ проводили на четырехцветном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, Германия).
Фиг. 4. Анализ ELISPOT выработки IFN-y линиями Т-клеток при рестимуляции in vitro пептидом NOX-001. А. Т-клеточная линия 7+ донора НВС-154 (отсортированы CD8+ NOX-001 тетрамер+); В. Т-клеточная линия 7- донора НВС-154 (отсортированы CD8+ NOX-001 тетрамер-). Отсортированные клетки CD8+ NOX-001 тетрамер+ (А.) и CD8+ NOX-001 тетрамер- (В.) анализировали методом IFN-yyyy ELISPOT после рестимуляции нерелевантным (MLA-001) (верхние лунки) и релевантным (NOX-001) (нижние лунки) пептидом (10 мкг/мл). Числа указывают на количество положительных точек.
Фиг. 5. Частотность СЕА-004-специфических CD8+ Т-клеток у 4 HLA-A2 здоровых доноров после стимуляции in vitro CEA-004, как было определено проточным цитометрическим анализом.
Фиг. 6. Афинность пептидов HLA I класса по изобретению к молекуле МНС, закодированной алле-лем HLA-A*0201.
Примеры
1. Синтез и структура.
Пептиды были синтезированы стандартным и общепринятым методом твердофазного синтеза с использованием способа Fmoc. После очистки на препаративной ВЭЖХ проводилась ионообменная процедура для внедрения физиологически совместимых противоионов (ацетат или хлорид). Наконец, после лиофилизации были получены белые или серовато-белые твердые вещества. Все пептиды TUMAP вводят в виде солей ацетата за исключением IMA-CCN-001, который применяется в виде соли хлорида - это обусловлено техническими причинами во время процесса производства.
Особенно важно, что принадлежность и чистота пептидов могут быть легко определены, причем с высокой точностью, с помощью масс-спектрометрии, аминокислотного анализа и аналитической ВЭЖХ. Как показали аналитические результаты все пептиды, использованные для вакцины IMA910, обладают правильной структурой с чистотой > 95%.
Измерение распределения размеров частиц и формы частиц, полученных после восстановления, производили при получении прямого изображения каждой отдельной частицы в диапазоне от 0,25 до 100 мкм с последующим анализом изображений. В результате большинство (> 95%) частиц находилось в диапазоне от 0,25 до 2,7 мкм. Итак, не наблюдалось существенных различий по размеру и распределению формы в течение 1, 2 или 3 ч после восстановления.
2. Компоненты на примере фармацевтической композиции IMA910.
IMA910 составлена из "коктейля" синтетических опухолеассоциированных пептидов (TUMAPs), большинство из которых было выявлено на первичных клетках колоректального рака. Пептиды TUMAP включают 10 пептидов, связывающихся с HLA I класса, со способностью активировать цитотоксические Т-клетки (CD8+ Т-клетки) и 3 пептида, связывающиеся с HLA II класса, со способностью активировать хелперные Т-клетки (CD4+ Т-клетки). Хелперные Т-клетки играют центральную роль при поддержке функции цитотоксических Т-клеток при высвобождении цитокинов, которые усиливают киллерную функцию CD8+ Т-клеток и могут также напрямую выступать против опухолевых клеток (Knutson, KL and Disis, ML; Augmenting T helper cell immunity in cancer, Curr.Drug Targets.Immune.Endocr. Metabol. Disord., 2005, 5, 365-371). В дополнение к этому данные 13 TUMAP-пептидов IMA910 содержат один вирусный контрольный пептид.
Пробы хирургически удаленной злокачественной и нормальной ткани пациентов с КРР и кровь здоровых доноров были проанализированы поэтапно:
Сначала для определения гиперэкспрессированных генов в злокачественной ткани по сравнению с диапазонами показателей для нормальных органов и тканей применялся анализ экспрессии мРНК всего генома с помощью микрочипов.
На втором этапе лиганды HLA злокачественного материала идентифицировались с помощью масс-спектрометрии.
Затем, идентифицированные лиганды HLA сравнивали с данными по генной экспрессии. Пептиды, кодируемые выборочно экспрессированными или гиперэкспрессироваными генами, выявленными на этапе 1, считались подходящими TUMAP-кандидатами для мультипептидной вакцины.
Был произведен поиск литературы для выявления дополнительных свидетельств, подтверждающих релевантность идентифицированных в качестве TUMAP пептидов.
Наконец, периферические CD8+ Т-клетки здоровых индивидов тестировали на реактивность по отношению к опухолеассоциированным лигандам HLA посредством нескольких иммунных анализов (in vitro Т-клеточные анализы).
3. Презентация эпитопов, содержащихся в IMA910, в опухолевых пробах. Получение.
Хирургически удаленные тканевые препараты были предоставлены Университетской клиникой общей, висцеральной и трансплантационной хирургии г. Тюбинген (Германия) после получения формы информированного согласия от каждого пациента.
Изоляция пептидов HLA из проб тканей.
Пептидные пулы HLA из подвергнутых шоковой заморозке проб тканей были получены методом иммунопреципитации из плотных тканей в соответствии с незначительно измененным протоколом (Falk, К., Rotzschke, О., Stevanovic, S., Jung, G. & Rammensee, H.G. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 1991, 351, 290-296; Seeger, F.H. et al. The HLA-A*6601 peptide motif: prediction by pocket structure and verification by peptide analysis. Immunogenetics 1999, 49, 571-576) при использовании ^^^'^-специфического антитела ВВ7.2 или HLA-A, -В, -С-специфического антитела W6/32, CNBr-активированной сефарозы, кислотной обработки и ультрафильтрации.
Детекция пептидов TUMAPs масс-спектрометрическим анализом с ESl-жидкостной хроматографией (ESJ-LCMS).
Проводили систематический поиск эпитопов, содержащихся в IMA910, на пробах колоректальных опухолей с помощью масс-спектрометрии. Полученные пулы пептидов HLA были разделены в соответствии с гидрофобностью обратнофазной хроматографией (CapLC, Waters), и элюированные пептиды анализировали на гибридном квадрупольном времяпролетном тандемном масс-спектрометре с ортогональным ускорением ионов (Q-TOF Ultima, Waters), снабженном источником ESI. Пептидные пулы наносили на предколонку С18 для концентрирования и опреснения. После нанесения предколонку помещали в линию для разделения с помощью микрокапиллярной колонки из плавленого кварца (75 мкм i.d. x250 мм) с обратнофазным материалом С18 в 5 мкм (Dionex). Растворителем А был ацетат аммония/вода, 4 мМ. Растворителем В были 2 мМ ацетата аммония в 80% ацетонитрил/вода. В обоих растворителях был установлен уровень рН в 3,0 муравьиной кислотой. Был сформирован бинарный градиент от 15% до 60% В в течение 90 минут, с применением скорости потока в 5 мкл/мин, сниженного до приблизительно 200 нл/мин с помощью распределительной системы. Позолоченный стеклянный капилляр (PicoTip, New Objective) использовали для введения в источник микро-ESI. Временем интеграции для TOF-анализатора было 1,9 сек с временем задержки между измерениями в 0,1 с. Для детекции дефинированных пептидов в рамках данного вида экспериментов ESI-LCMS проводили высокочувствительный скрининг на основе известных молекулярных масс и времени удерживания пептидов в хроматографической системе. Поэтому прилагаемый список значений m/z предварительно идентифицированных пептидов (одно- и/или двух-зарядные) применялся для выбора предшественников. Затем определяли последовательность анализом индуцированного столкновением (CID) масс-спектра (ESI-LCMS/MS).
Последовательность пептида TUMAP подтверждали сравнением генерированного фрагментационного образца естественного пептида TUMAP с фрагментационным образцом синтетического контрольного пептида с идентичной последовательностью. Оценку выхода пептида HLA после очистки и воспроизводимость аналитической системы, включая время удерживания, производили с использованием интенсивности и времени удерживания избыточного эндогенного пептида HLA-A*02 (YLLPAIVHI из DDX5) в качестве внутреннего стандарта. Поэтому критерий включения пробы КРР для детекции предварительно идентифицированного пептида TUMAP в данных экспериментах был установлен на уровне минимальной интенсивности в 650 импульсов на измерение внутреннего двухзарядного стандартного сигнала (YLLPAIVHI) в эксперименте LCMS/MS в целях подтверждения успешной изоляции пептида HLA и правильности работы аналитической системы.
В табл. 5 представлены результаты анализа проб при раке толстой и прямой кишки на различных стадиях, а также метастазов, возникающих из одного или другого первичного участка опухоли. Все пептиды HLA-A*02 TUMAP были обнаружены на большинстве проб. Частота повторной детекции пептидов HLA-DR TUMAP была, в основном, ниже. Этого можно ожидать, так как для пептидов HLA II класса могут существовать несколько вариантов длин для каждой коровой последовательности.
n.a. не проанализировано
4. Иммуногенность in vitro для пептидов IMA910, презентируемых МНС I класса.
Для получения информации об иммуногенности пептидов, включенных в IMA910 нами были проведены исследования с использованием хорошо известных методов стимуляции, уже описанных у (Walter, S., Herrgen, L., Schoor, O., Jung, G., Wernet, D., Burning, H.J., Rammensee, H.G., and Stevanovic, S.; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 171, 4974-4978). Таким способом мы могли представить положительные данные по иммуногенности для 10 из 10 проанализированных пептидов, рестриктированных по HLA-A*0201 и содержащихся в вакцине IMA910, демонстрируя, что эти пептиды являются Т-клеточными эпитопами, против которых у человека существуют CD8+ Т-клетки-предшественники. Только один другой пептид HLA I класса, содержащийся в IMA910 (MUC-001), не мог быть проанализирован данным методом из-за относительно низкой аффинности к А*0201 данного пептида TUMAP.
Недавно полученные свидетельства ставят под сомнение пригодность СЕА-005 для противораковой вакцины. В недавнем всестороннем исследовании (Iero, M., Squarcina, P., Romero, P., Guillaume, P., Scarselli, E., Cerino, R., Carrabba, M., Toutirais, О., Parmiani, G., Rivoltini, L.; Low TCR avidity and lack of tumor cell recognition in CD8(+) T cells primed with the CEA-analogue CAP1-6D peptide, Cancer Immunol Immunother. 2007 Dec; 56(12): 1979-91) авторы впервые систематически охарактеризовали эффекторные функции СЕА-005-примированных Т-клеток против природной последовательности СЕА-004. Наблюдалось, что в многочисленных пробах крови пациентов с КРР и здоровых доноров прайминг Т-клеток с СЕА-005 достоверно способствует образованию низкоаффинных Т-клеток с недостатком способности по распознаванию клеток колоректального рака, экспрессирующих СЕА и презентирующих природную последовательность. Такое неэффективное низкоаффинное кросс-распознавание природных последовательностей может стать основной проблемой в курсах вакцинации с использованием измененных пептидных лигандов, как это было подтверждено недавно обнародованными похожими результатами для другого пептида СЕА и его измененных агонистов (Alves, P.M., Viatte, S., Fagerberg, Т., Michielin, О., Bri-card, G., Bouzourene, H., Vuilleumier, H., Kruger, T., Givel, J.C., Levy, F., Speiser, D.E., Cerottini, J.C., Romero, P.; Immunogenicity of the carcinoembryonic antigen derived peptide 694 in HLA-A2 healthy donors and colorectal carcinoma patients, Cancer Immunol. Immunother., 2007, 56, 1795-1805). Кроме того, такие же результаты были обнародованы для природной последовательности хорошо известного меланомного антигена Melan-A/MART-1 и его агониста (D. Speiser, personal communication).
В общем, несмотря на обычно улучшенную иммуногенность измененных пептидов-агонистов, недавно полученные свидетельства заставляют предположить, что природные пептиды могут быть более привлекательными кандидатами для вакцины в связи с неэффективным кросс-распознаванием природной последовательности Т-клетками, простимулированными измененными агонистами. Это предполагает, что предпочтение должно отдаваться СЕА-004 (САР1), а не его агонистам, описанным в патенте WO9919478A1, таким как СЕА-005 (CAP1-6D) или CAP1-6D,7I.
Действительно, обширные данные демонстрируют значительную иммуногенность in vivo самой природной последовательности СЕА-004. Среди раковых пациентов, но не здоровых доноров, в нескольких исследованиях наблюдались спонтанно индуцированные Т-клеточные ответы против этого пептида (Nagorsen, D., Keilholz, U., Rivoltini, L., Schmittel, A., Letsch, A., Asemissen, A.M., Berger, G., Buhr, H.J., Thiel, E., Scheibenbogen, C.; Natural T-cell response against MHC class I epitopes of epithelial cell adhesion molecule, her-2/neu, and carcinoembryonic antigen in patients with colorectal cancer, Cancer Res. 2000, 60, 4850-4854; Weihrauch, M.R., Ansen, S., Jurkiewicz, E., Geisen, C., Xia, Z., Anderson, K.S., Gracien, E., Schmidt, M., Wittig, B., Diehl, V., Wolf, J., Bohlen, H., Nadler, L.M.; Phase I/II combined chemoimmunother-apy with carcinoembryonic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res. 2005, 11, 5993-6001; Babatz, J., Rollig, C., Lobel, B., Folprecht, G., Haack, M., Gunther, H., Kohne, C.H., Ehninger, G., Schmitz, M., Bornhauser, M.; Induction of cellular immune responses against carcinoembryonic antigen in patients with me-tastatic tumors after vaccination with altered peptide ligand-loaded dendritic cells, Cancer Immunol. Immunother. 2006, 55, 268-276). Кроме того, способы вакцинации пациентов с КРР с использованием СЕА-004 или белка СЕА продемонстрировали эффективную стимуляцию Т-клеточных ответов против СЕА-004 (Tsang, K.Y., Zaremba, S., Nieroda, C.A., Zhu, M.Z., Hamilton, J.M., Schlom, J.; Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen epitopes from patients immunized with re-combinant vaccinia-CEA vaccine, J. Natl. Cancer Inst. 1995, 87, 982-990; Morse, M.A., Deng, Y., Coleman, D., Hull, S., Kitrell-Fisher, E., Nair, S., Schlom, J., Ryback, M.E., Lyerly, H.K.; A Phase I study of active immuno-therapy with carcinoembryonic antigen peptide (CAP-1)-pulsed, autologous human cultured dendritic cells in patients with metastatic malignancies expressing carcinoembryonic antigen, Clin Cancer Res. 1999, 5, 13311338; Zhu, M.Z., Marshall, J., Cole, D., Schlom, J., Tsang, K.Y.; Specific cytolytic T-cell responses to human CEA from patients immunized with recombinant avipox-CEA vaccine, Clin Cancer Res. 2000, 6, 24-33; Wei-hrauch, M.R., Ansen, S., Jurkiewicz, E., Geisen, C., Xia, Z., Anderson, K.S., Gracien, E., Schmidt, M., Wittig, B., Diehl, V.,Wolf, J., Bohlen, H., Nadler, L.M.; Phase I/II combined chemoimmunotherapy with carcinoembry-onic antigen-derived HLA-A2-restricted CAP-1 peptide and irinotecan, 5-fluorouracil, and leucovorin in patients with primary metastatic colorectal cancer, Clin Cancer Res. 2005, 11, 5993-6001).
Прайминг in vitro CD8+ Т-клеток.
Для проведения стимуляций in vitro искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-CD28, мы сначала изолировали МПК (моноциты периферической крови) из свежей лейкоцитарной пленки HLA-A*02+ с использованием стандартной среды для градиентного разделения (РАА, Colbe, Германия). Лейкоцитарные пленки были получены либо из банка крови г. Тюбинген, либо из госпиталя "Katharinenhospital" г. Штутгарта. Изолированные МПК инкубировали в течение ночи для прайминга человеческого материала in vitro в Т-клеточной среде (ТСМ), состоящей из RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Германия) с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ (РАА, Colbe, Германия), 100 U/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина (Cambrex, Verviers, Бельгия), 1 мМ пирувата натрия (СС Pro, Neus-tadt, Германия) и 20 мкг/мл гентамицина (Cambrex). Лимфоциты CD8+ были изолированы с использова
нием CD8+ MACS - оборудования для положительного отбора (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Германия) в соответствии с указаниями производителя. Полученные CD8+ Т-клетки инкубировали до использования в ТСМ с добавлением 2,5 нг/мл ИЛ-7 (PromoCell, Heidelberg, Германия) и 10 U/мл ИЛ-2 (Chiron, Munich, Германия). Получение покрытых гранул рМНС/анти-CD28, Т-клеточные стимуляции и считывание производили, как описывалось ранее (Walter, S., Herrgen, L., Schoor, O., Jung, G., Wernet, D., Buhring, H.J., Rammensee, H.G., and Stevanovic, S.; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978) с минимальными модификациями. Вкратце, биотинилированные рекомбинантные молекулы HLA-A*0201, в которых не хватает трансмембранного домена, и которые были биотинилированы на карбоксильном конце тяжелой цепи, были получены в соответствии с методом, описанным у (Altman, J.D., Moss, P.A., Goulder, P.J., Barouch, D.H., Heyzer-Williams, M.G., Bell, J.I., McMichael, A.J., and Davis, M.M.; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96). Очищенный костимулированный мышиный IgG2a к антителам человека CD28 Ab 9.3 (Jung, G., Ledbetter, J.A., and Muller-Eberhard, H.J.; Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1987, 84, 4611-4615) был химически биотинилирован с использованием сульфо-N-гидроксисукцинимидобиотина, как рекомендуется изготовителем (Perbio, Bonn, Германия).
Использованные гранулы были покрытыми стрептавидином полистироловыми частицами величиной 5, 60 мкм (Bangs Laboratories, Illinois/США). рМНС, использованные в качестве положительных и отрицательных контролей, были A*0201/MLA-001 (пептид ELAGIGILTV из модифицированного Melan-A/MART-1) и A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI из DDX5) или A*0201/HBV-001 (FLPSDFFPSV) соответственно.
800000 гранул/200 мкл были покрыты в 96-луночном планшете в присутствии 600 нг биотина анти-CD28 и 200 нг релевантного биотин-рМНС (высокоплотные гранулы) или 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (библиотека рМНС) МНС (низкоплотные гранулы). Стимуляции были инициированы в 96-луночных планшетах при коинкубации 1х106 CD8+ Т-клеток с 2х105 промытых покрытых гранул в 200 мкл ТСМ с добавлением 5 нг/мл ИЛ-12 (PromoCell) в течение 3-4 дней при 37°С. Половина среды была заменена на свежую ТСМ с добавлением 80 U/мл ИЛ-2, и инкубация была продолжена в течение 34 дней при 37°С. Данный цикл стимуляций проводили всего три раза. В заключение проводили тетра-мерные анализы с флуоресцирующими тетрамерами МНС (полученными, как описывается у (Altman, J.D., Moss, P.A., Goulder, P.J., Barouch, D.H., Heyzer-Williams, M.G., Bell, J.I., McMichael, A.J., and Davis, M.M.; Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 1996, 274, 94-96)) с антителом CD8-FITC клона SKI (BD, Heidelberg, Германия) на четырехцветном цитометре FACSCalibur (BD). Пептид-специфические клетки были подсчитаны как процентная доля всех CD8+ Т-клеток. Оценку тетрамерного анализа проводили с помощью программы FCS Express (De Novo Software). Прайминг in vitro специфических лимфоцитов тетрамерн+ CD8+ детектировался установкой подходящего гейта и при сравнении со стимуляциями негативного контроля. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаружено, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной in vitro лунке одного здорового донора содержалась специфическая CD8+ Т-клеточная линия после стимуляции in vitro (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди CD8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем).
Иммуногенность in vitro для 10 пептидов IMA910.
Для 10 из 10 проанализированных пептидов HLA I класса, иммуногенность in vitro могла быть продемонстрирована генерированием пептид-специфических Т-клеточных линий.
Репрезентативное окрашивание, выявляющее образование Т-клеточных линий, специфических для NOX-001 и ODC-001, представлено на фиг. 1. Результаты обобщены в табл. 6. Только один другой пептид HLA I класса, содержащийся в IMA910 (MUC-001), не мог быть проанализирован данным методом из-за относительно низкой аффинности к А*0201 данного пептида TUMAP, тем самым делая методологически невозможным проведение стимуляций in vitro с использованием мономеров рМНС.
Здесь обобщены результаты экспериментов по иммуногенности in vitro, проведенных фирмой "Im-matics" для 10 из 11 пептидов HLA I класса, включенных в вакцину IMA910. Приводимые результаты были получены при стимуляции клеток CD8+ высокоплотными гранулами. Так как различные партии человеческой сыворотки могут сильно влиять на результаты по иммуногенности, то вместе оценивались только те анализы, в которых была использована одна и та же партия сыворотки.
IMA-CEA-004 премированные in vitro Т-клетки.
4 из 6 доноров подлежали оценке. У всех четырех доноров мы могли успешно продемонстрировать индукцию СЕА-004-направленного Т-клеточного ответа in vitro при стимуляции СЕА-004 (см. Таблицу и Фигуру). Таким образом, было подтверждено, что пептид СЕА-004 является сильным индуцирующим фактором человеческих CD8+ Т-клеточных ответов in vitro. Особенно важно, что СЕА-004 был достоверно способен вызывать более высокую частотность СЕА-004-специфических Т-клеточных ответов в сравнении с СЕА-005 (83% лунок в сравнении с 64% лунок, см. табл. 4). Частотности СЕА-004-специфических клеток внутри отдельных положительных лунок были также выше после прайминга СЕА-004 в сравнении с праймингом СЕА-005 (см. фиг. 5).
Пептид-специфический CD8+ Т-клеточный ответ in vitro 4 здоровых доноров HLA-A*02, определенный проточным цитометрическим анализом.
CD8+ Т-клетки примировали искусственными антигенпрезентирующими клетками с СЕА-004, СЕА-005 или нерелевантным пептидом (IMA-RSL-001) соответственно. После трех циклов стимуляции детекция пептид-реактивных клеток производилась двойным окрашиванием тетрамерами СЕА-004 плюс СЕА-005 (табл. 7А) и СЕА-004 плюс нерелевантный А*0201-тетрамер (табл. 7В). Числа, указанные в таблице, представляют собой процентные доли лунок, содержащих СЕА-004+ или СЕА-005+ ЦТЛ. Номер партии человеческой сыворотки, использованной во всех экспериментах, С02104-0167.
CD8+ Т-клетки изолировали из МПК, примировали in vitro искусственными антигенпрезентирую-щими клетками с СЕА-004, RSL-001 или пептидом DDX5-001 соответственно. После трех циклов стимуляции детекция пептид-реактивных клеток производилась окрашиванием СЕА-004- и нерелевантным А*0201-тетрамерами. Значения, указанные выше, представляют собой процентные доли СЕА-004- специфических клеток каждой простимулированной лунки. Стимуляции RSL-001 и DDX5-001 служили в
качестве негативных контролей. На фиг. 5 представлены частотности СЕА-004-специфических CD8+ Т-клеток у 4 HLA-A2 здоровых доноров после стимуляции in vitro с СЕА-005, как было определено проточным цитометрическим анализом. Пороговые значения для положительных лунок указаны для каждого донора отдельно (-) и были дефинированы как 10-кратное среднее значение отрицательных контролей и по крайней мере 1%. Лунки с процентной долей свыше порогового значения (> 1%) рассматривались как положительные, и они представлены розовыми ромбами, в то время как отрицательные лунки представлены черными ромбами.
5. Иммуногенность in vitro для пептидов IMA910, презентируемых МНС II класса.
Хелперные Т-клетки играют важную роль в содействии ЦТЛ при активации и поддержке иммунных ответов против опухолевых клеток. Поэтому пептиды МНС II класса были включены в вакцину IMA910. TGFBI-004, один из трех пептидов II класса, содержащийся в IMA910, был проверен на его иммуноген-ный потенциал in vitro и подтвержден в качестве индуцирующего фактора как для специфических CD4 +, так и CD8+ Т-клеток. Генерация CD4 + и функциональных CD8+ Т-лимфоцитов показана в экспериментах с использованием стимуляций, проведенных в аутологичной системе.
Принципы теста.
Прайминг и экспансия специфических человеческих CD4 + и CD8+ клеток были проанализированы in vitro посредством прайминга МПК с пониженным содержанием моноцитов аутологичными DC и повторной стимуляции аутологичными МПК. Вкратце, чтобы генерировать антигенспецифические CD4+ Т-клетки, МПК с пониженным содержанием моноцитов одного здорового донора (HLA-генотип класса I: A1/A25/B8/B18 и класса II: DQB1*02/DQB1*06/DRB1*03/DRB1*15/DRB3/DRB5) были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом пептидом и рестимулированы аутологичными МПК с пептидом. В качестве системы считывания выработку IFNy при кратковременной рестимуляции анализировали по методике ELISPOT и проточной цитометрии. Т-клетки были проанализированы после восьми стимуляций по методике ELISPOT и внутриклеточным окрашиванием IFN-y плюс CD4-FITC и CD8-PerCP для определения процентного выражения IFNy-вырабатывающих клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. В этом эксперименте клетки, простимулированные пептидом TGFBI-004 из различных лунок, были объединены и инкубировались с нерелевантным пептидом для считывания и выступали в качестве негативных контролей.
Получение дендритных клеток (ДК).
Человеческие дендритные клетки были получены из моноцитов, культивированных в среде ДК, состоящей из RPMI 1640-Glutamax/25 mM Hepes (Invitrogen, Германия) с добавлением 10% аутологичной плазмы//100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Сначала были получены лейкоцитарные пленки и плазма при центрифугировании крови здорового донора (Банк крови г. Тюбинген). МПК были изолированы из лейкоцитарной пленки стандартным градиентным разделением (Lymphocyte Separation Medium, РАА, Австрия) и ресуспендировались в среде ДК для определения общего числа клеток. 100-120 млн. МПК были промыты, ресуспендированы в 15 мл среды X-Vivo 20 (BioWhittaker, Бельгия) и перенесены в колбу с клеточной культурой. После 2 ч при 37°С удаляли среду, содержащую лейкоциты периферической крови (ЛПК), адгезивные моноциты промывали дважды 10 мл PBS и культивировали 6 дней в 10 мл среды ДК с 100 нг/сл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 (ImmunoTools, Германия) или 20 нг/мл (R &D systems, Германия). На 3-й и 5-й день добавляли 100 нг/мл ГМ-КСФ и 30 нг/мл ИЛ-4 (Immunotools) или 20 нг/мл ИЛ-4 (R &D Systems, Германия). На 7-й день незрелые ДК активировали 10 нг/мл TNF-a (R &D Systems, Германия) и 20 мкг/мл poly (IC) (Sigma Aldrich, Германия) или 100 нг/мл LPS на 24 ч. Оставшиеся МПК и полученные ЛПК аликвотировали и замораживали.
Прайминг in vitro специфических Т-клеток.
Для получения CD4+ Т-клеток 3 млн. МПК/ЛПК были простимулированы 2х105 аутологичными ДК. ДК были собраны на 8-й день (см. раздел 3.1, Получение дендритных клеток (ДК)). В этих целях использовался PBS с 5 мМ EDTA, чтобы набрать как можно больше клеток (включая адгезивные клетки). После промывки средой ДК определяли число клеток. Для погрузки пептида ДК ресуспендировали в 1 мл среды ДК и инкубировали с 25 мкг/мл пептида в течение 2 ч при 37°С. Пептидами, использованными для введения импульсным способом в ДК, были TGFBI-004, Posmix (смесь пептидов, относящихся к EBV и CMV), Padre и CMV. Аутологичные МПК/ЛПК размораживали, промывали средой ДК (по меньшей мере, дважды) и высеивали в 24-луночный планшет с плотностью 3 млн. клеток/мл в 1 мл. Затем добавляли ДК с введенным пептидом (как 1 мл суспензии, содержащей пептид) в высеянные МПК/ЛПК и инкубировали в течение 7 дней при 37°С. После прайминга полученные ЦТЛ сначала рестимулировали криоконсервированными аутологичными МПК, нагруженными пептидом, которые были облучены (30 Gy; Gammacell 1000 Elite, Nordion International, Канада). В этих целях добавляли 5х105 ЦТЛ и 2,5х106 МПК на лунку. Введение импульсным методом пептида в МПК было проведено, как упоминалось ранее (для ДК). На первый день после первой стимуляции добавляли ИЛ-2 (R &D Systems, Германия) и ИЛ-7 до окончательной концентрации 2 нг/мл и 5 нг/мл соответственно. После этого на каждый 2-й и каждый 7-й день в среду добавляли ИЛ-2 и ИЛ-7. Вторую рестимуляцию проводили 7 дней спустя, но на этот раз пептид добавлялся в культивируемые ЦТЛ отдельно (без МПК). Рестимуляции проводили каждые 7 дней
с нагруженными пептидом МПК и пептидом отдельно, добавляемом альтернативно. Анализы проводили после восьмой стимуляции с помощью внутриклеточного окрашивания IFN-y и методики IFN-y
ELISPOT.
Результаты.
Было возможно примировать CD4 + Т-клеточные линии, специфически реагирующие на интересующий пептид (фиг. 2 и 3). Т-клеточные ответы могли быть детектированы с помощью методики ELIS-POT в 2 из 4 Т-клеточных линий, тогда как в 3 из 4 Т-клеточных линиях TGFBI-004-специфические IFN-y-вьгоабатывающие CD4+ и/или CD8+ клетки были установлены с помощью ICS.
Таким образом, TGFBI-004 был способен вызывать CD4+ и CD8+ Т-клеточные ответы у одного донора, подвергнутого анализу по описанной выше экспериментальной системе. В соответствии с этим многообещающим результатом данный пептид, скорее всего, является иммуногенным и имеет потенциал для индуцирования Т-клеточных ответов.
6. Функциональное подтверждение на примере NOX-001 и TGFBI-001.
Иммуногенность пептидов, включенных в вакцину IMA910, была продемонстрирована in vitro при использовании методики валидации для пептидов TUMAP фирмы "immatics". Индукция специфических Т-клеток является индикатором способности пептидов успешно активировать иммунную систему. Так как получение эффективного противоопухолевого иммунного ответа возможно только в том случае, если активированные Т-клетки имеют высокую авидность и функциональность, то мы исследовали далее TUMAPs в целях прайминга высокоавидных, функциональных Т-лимфоцитов с их способностью вырабатывать IFNy или убивать опухолевые клеточные линии. Два пептида, NOX-001 и TGFBI-001, были выбраны для более тщательной валидации из-за их способности индуцировать высокоавидные ЦТЛ in vitro. Нам удалось доказать, что у человека существуют высокоавидные Т-клетки-предшественники, направленные против обоих пептидов, и что с помощью NOX-001 могут быть генерированы функциональные CD8+ Т-клеточные линии.
Принципы теста.
Чтобы глубже проникнуть в сущность иммуногенности пептидов IMA910 и свойства специфических Т-клеток, два пептида, NOX-001 и TGFBI-001, были выбраны для дальнейшей оценки. Эксперименты для этих целей проводились на фирме "Immatics" (сортировку клеток проводили в Университете г. Тюбинген, лаб. Dr. Buhring).
В зависимости от их способности активироваться антигеном высокой или низкой плотности Т-клеточные линии могут быть разделены на высоко- или низкоавидные. Как было продемонстрировано ранее (Walter, S., Herrgen, L., Schoor, O., Jung, G., Wernet, D., Buhring, H.J., Rammensee, H.G., and Stevano-vic, S.; Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J. Immunol., 2003, 171, 4974-4978), человеческие высокоавидные ЦТЛ могут быть успешно индуцированы, если для активации использовать меньше пептида, чем для низкоавидных CD8+ Т-клеток. Также было продемонстрировано, что обогащенные таким способом клетки являются более эффективными для распознавания экспрессирующих антиген клеточных линий опухоли, тем самым представляя собой, возможно, важнейший инструмент в разработке терапевтических стратегий.
Чтобы можно было определить способность пептидов к генерации высокоавидных линий ЦТЛ, изолированные человеческие клетки CD8+ примировали и обогащали посредством повторяемых стимуляций in vitro гранулами, покрытыми низкоплотным рМНС (комплекс пептид-МНС) и антителом анти-CD28 в присутствии ИЛ-12 и ИЛ-2. После трех стимуляций фракция примированных in vitro T-клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена цитометрическим анализом. Тетрамер-положительные клетки каждого донора были, затем, объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-CD8-FITC и, в заключение, подвергнуты сортировке FACS на сортере FACSAria. Отсортированные клетки культивировали и обогащали в присутствии облученных питающих клеток, цитокинов и митогена. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антиген-специфических клеток проводили окрашивание рМНС-тетрамером. Для определения их функциональности проводили анализ выработки IFN-y по методике ELISPOT и исследовали уничтожение опухолевых клеточных линий с использованием цитотоксического анализа, основанного на живом/мертвом окрашивании после рестимуляции клеток соответствующим пептидом и опухолевыми клеточными линиями.
Получение специфических CD8+ Т-клеточных линий.
Стимуляции in vitro с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (аАРС), нагруженных комплексом пептид-МНС (рМНС) и антителом анти-CD28, проводили, как было подробно описано выше. Единственным отличием от описанного метода был тот факт, что стимуляции проводили с гранулами, нагруженными 2 нг релевантного и 200 нг нерелевантного (рМНС) МНС из библиотеки (низкоплотные гранулы) вместо 200 нг релевантного МНС (высокоплотные гранулы). Таким образом, были получены высокоавидные Т-клетки для более детальной валидации пептидов. После трех стимуляций фракция примированных in vitro Т-клеток была окрашена рМНС-тетрамером и обнаружена цитомет-рическим анализом. Иммуногенность для заданного антигена была детектирована, если было обнаруже
но, что по крайней мере в одной подлежащей оценке простимулированной in vitro лунке одного здорового донора содержалась специфическая CD8+ Т-клеточная линия после стимуляции in vitro (т.е. данная лунка содержала по крайней мере 1% специфического тетрамера+ среди CD8+ Т-клеток и процентная доля специфических клеток тетрамера+ была по крайней мере в 10 раз выше среднего значения стимуляций с негативным контролем). Тетрамер-положительные клетки каждого донора были, затем, объединены в соответствии с антигенной специфичностью, окрашены соответствующим рМНС-тетрамером и человеческим антителом анти-CDS-FITC, клон SK1, и, в заключение, подвергнуты сортировке FACS на сортере FACSAria (BD Biosciences, Германия). Отсортированные клетки культивировали в Т-клеточной среде (RPMI-Glutamax с добавлением 10% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки АВ, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия и 20 мкг/мл гентамицина) в присутствии 5х105 клеток/мл облученных свежих аллогенных MIIK, 5х104 клеток/мл облученных клеток LG2-EBV, 150 U/мл IL-2 (Chiron, Munich, Германия) и 0,5 мкг/мл PHA-L (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Экспансия данных клеток происходила в Т-клеточной среде, содержащей 150 U/мл ИЛ-2. В качестве рамки считывания для генерирования примированных высокоавидных антиген-специфических клеток проводили окрашивание рМНС-тетрамером, как было описано выше, и анализировали на четырехцветном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, Германия). Проверка функциональности.
Для определения их функциональности проводили анализ выработки IFNy по методике ELISPOT (IFN-y ELISPOT Set, BD, Германия) после рестимуляции клеток соответствующим пептидом. Кроме того, опосредованную клетками цитотоксичность специфических ЦТЛ исследовали на примере уничтожения опухолевых клеточных линий с использованием оборудования для определения опосредованной клетками цитотоксичности "LIVE/DEAD cell-mediated cytotoxicity Kit" (L7010, Invitrogen, Германия). Оба анализа проводились в соответствии с указаниями производителей, если не указано иное.
Результаты.
Оба пептида, NOX-001 и TGFBI-001, обладали иммуногенностью in vitro, как показано на примере успешного прайминга низкоплотным рМНС АПК. Как для NOX-001, так и для TGFBI-001 могли быть установлены специфические Т-клеточные линии методом FACS, тем самым демонстрируя, что высоко-авидные CD8+ Т-клеточные предшественники имеются у здоровых доноров.
Кроме того, для NOX-001 могла быть установлена одна Т-клеточная линия, которая также была подтверждена как функциональная методом ELISPOT, так как она специфически экспрессировала IFN-y после рестимуляции этим пептидом (фиг. 4).
7. Связывание пептидов по изобретению, рестриктированных по HLA класса I, с NLA-A*0201.
Целью данного анализа была оценка аффинности пептидов HLA класса I по отношению к молекуле МКС, закодированной аллелем HLA-A*0201, так как это является важным параметром для способа действия IMA910. Степень аффинности к HLA-A*0201 была высокой для 9 из 10 пептидов в IMA910, рест-риктированных по HLA класса I, константы диссоциации (KD) находились в диапазоне от 0,001 до 0,2 нМ. Также и пептид вирусного маркера IMA-HBV-001 проявил сильное связывание. Аффинность для IMA-MUC-001 была приблизительно на фактор 102 слабее. Данные результаты подтверждают сильную аффинность связывания 9 из 10 пептидов HLA класса I из вакцины-кандидата IMA910 к молекулам
МНС.
Принципы теста.
Стабильные комплексы HLA/пептид состоят из трех молекул: тяжелой цепи HLA, бета-2 микроглобулина (b2m) и пептидного лиганда. Активность денатурированных рекомбинантных молекул HLA-A*0201 с тяжелой цепью сама по себе может быть сохранена, делая их функциональными эквивалентами "пустых молекул HLA-А*0201". Если они растворены в водном буфере, содержащем b2m и подходящий пептид, то данные молекулы быстро и эффективно сворачиваются в полной зависимости от пептида. Наличие данных молекул использовалось в анализе, основанном на методике ELISA, для измерения аффинности взаимодействия между пептидом и молекулой HLA класса I (Sylvester-Hvid et al., 2002).
Очищенные рекомбинантные молекулы HLA-A*0201 инкубировали вместе с b2m и ступенчатыми дозами интересующего пептида.
Количество новообразовавшихся комплексов HLA/пептид определялось количественным методом ELISA. Константы диссоциации (значения KD) вычислялись с использованием стандартной калибровочной кривой, записанной с титров комплекса калибровки HLA/пептид.
Результаты.
Результаты представлены на фиг. 6. Более низкое значение KD отражает более высокую аффинность к HLA-A*0201. Большинство из пептидов IMA910 и вирусный контрольный пептид IMA-HBV-001 имели похожие и сильные аффинности к HLA-A*0201 в диапазоне от 0,001 (IMA-TGFBI-001) до 0,2 нМ (IMA-ODC-001). Аффинность IMA-MUC-001 была на фактор 102 до 103 ниже по сравнению с большинством включенных пептидов. Однако вакцинация IMA-MUC-001 приводила к иммунным ответам у пациентов с почечно-клеточной карциномой в проведенном ранее фирмой "Immatics" клиническом исследовании, таким образом, низкая аффинность связывания IMA-MUC-001 не дает повода для беспокойства.
Перечень последовательностей
<110> ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ
<400> 5
Lys Val Phe Ala Gly lie Pro Thr Val 1 5
<210> 6 <2U> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 6
Gin Gin Ser Asp Tyr Ser Ala Ala Leu
1 5
<210> 7
<211> 9
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Thr Gin Asp Asp Tyr Val Leu Glu Val
1 5
<210> 8 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 8
Gin His Glu Gly Thr Val Asn He Phe 1 5
<210> 9
<2U> 12
<212 > PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Ser Val Phe Gly Asp Asp Asn Lys Ala Leu Ser Lys
15 10
<210> 10 <211> 14 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Glu He Gly Trp Ser Tyr Thr Gly Ala Leu Asn Gin Lys Asn 15 10
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептид, включающий последовательность SEQ ID NO: 8 (SPQYSWRINGIPQQHT), который индуцирует Т-клеточную перекрестную реакцию с указанным пептидом, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 100 аминокислотами.
2. Пептид по п.1, где указанный пептид или его вариант имеет общую длину между 16 и 30 аминокислотами.
3. Пептид по п.1 или 2, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гисто-совместимости человека (МНС) класса II.
4. Пептид по любому из пп.1-3, где пептид состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 8.
5. Пептид по любому из пп.1-4, где указанный пептид включает непептидные связи.
6. Пептид по любому из пп.1-5, где пептид является частью слитого белка, содержащего N-терминальные аминокислоты антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ii) HLA-DR.
7. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид в соответствии с любым из пп.1-6.
8. Нуклеиновая кислота по п.7, которая представляет собой ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинации или вектор экспрессии, где данный вектор функционально связан с данной нуклеиновой кислотой.
9. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту или вектор экспрессии в соответствии с п.7 или 8, которая является антигенпрезентирующей клеткой, в частности дендритной клеткой или антиген-презентирующей клеткой, где указанная клетка представляет собой нечеловеческую эмбриональную стволовую клетку.
10. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) in vitro, включающий контактирование ЦТЛ in vitro с нагруженными антигеном молекулами человека МНС I или II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточный для активации указанных ЦТЛ антиген-специфическим образом, где указанный антиген является пептидом в соответствии с любым из пп.1-6.
11. Активированный цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ), полученный с помощью способа в соответствии с п.10, который селективно распознает клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в любом из пп.1-4.
12. Применение пептида в соответствии с любым из пп.1-6, нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии в соответствии с п.7 или 8, клетки в соответствии с п.9 или активированного цитотоксического Т-лимфоцита в соответствии с п.11 в качестве лекарственного средства для лечения рака.
13. Применение по п.12, где рак представляет собой глиобластому, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак почки или рак желудка.
14. Применение по п.12 или 13, где указанное лекарственное средство является вакциной.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023928
023928
- 1 -
- 1 -
023928
023928
- 1 -
- 1 -
023928
023928
- 1 -
- 1 -
023928
023928
- 1 -
- 1 -
023928
023928
- 1 -
- 1 -
023928
023928
- 1 -
- 1 -
023928
023928
- 1 -
- 1 -
023928
023928
- 4 -
- 3 -
023928
023928
- 17 -
023928
023928
- 20 -
- 20 -
023928
023928
- 38 -
- 38 -
023928
023928
- 39 -
- 39 -
023928
023928
- 41 -
- 41 -
023928
023928
- 42 -
- 42 -
|
