EA 023925B1 20160729

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea000023925b*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

1. Пептидный конъюгат, имеющий формулу I R1-Z-L-Y-R2 (I), в которой R1 представляет собой Н, С _1-4 алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; R2 представляет собой ОН или NH ₂ ; Z содержит последовательность Эксендина-4(1-39), имеющую последовательность His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, или его аналога Z _a ; L представляет собой необязательную линкерную группу; и Y содержит последовательность Гастрина-17, имеющую последовательность Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe, в которой Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr или его аналога Y _a .

2. Пептидный конъюгат по п.1, отличающийся тем, что: (i) Z _a имеет до 10 замен в положениях и/или содержит укорочение на С-конце на 1-12 аминокислот по сравнению с последовательностью Эксендина-4; и/или (ii) Y _a имеет до 5 замен в положениях по сравнению с последовательностью Гастрина-17 и/или содержит укорочение на N-конце на 1-13 аминокислот по сравнению с последовательностью Гастрина-17.

3. Пептидный конъюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что Z _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIa His-Z2-Z3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20-Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33-Z34-Z35-Z36-Z37-Z38-Z39 (IIa), в которой Z2 выбран из Gly, Ala, Ser, Aib, Thr, Leu и Ile; Z3 выбран из Glu и Asp; Z9 выбран из Asp и Glu; Z10 выбран из Leu, Val, Ile и Ala; Z11 выбран из Ser и Aib; Z12 выбран из Ser, Gln, Arg, Cys, Lys, Glu и Orn; Z13 выбран из Arg, Ser, Gin, Tyr и Glu; Z14 выбран из Gly, Cys, Phe, Tyr, Trp, Lys, Met, Leu, Nle и Ile; Z16 выбран из Asp, Gly, Aib, Glu, Lys и Cys; Z17 выбран из Glu, Cys, Lys, Ser и Gln; Z18 выбран из Ala и Aib; Z19 выбран из Val, Leu, Ile и Ala; Z20 выбран из Arg, Lys, Cys, Orn и Glu; Z21 выбран из Leu и Glu; Z22 выбран из Phe и Ala; Z23 выбран из Ile и Leu; Z24 выбран из Glu, Cys, Lys, Ala и Arg; Z25 выбран из Trp, Cys, Lys и Phe; Z26 выбран из Leu и Ile; Z27 выбран из Ile, Val, Gln, Lys, Cys, Arg и Orn; Z28 выбран из Asn, Ser, Asp, Aib, Gln, Lys, Cys, Arg, Tyr, bAla, Glu, Orn и Leu или он отсутствует; Z29 выбран из Gly, Aib и bAla или он отсутствует; Z30 выбран из Gly, Cys, Lys и Arg или он отсутствует; Z31 выбран из Pro, Ser и Asp или он отсутствует; Z32 выбран из Ser и Lys или он отсутствует; Z33 представляет собой Ser или он отсутствует; Z34 выбран из Gly и Lys или он отсутствует; Z35 представляет собой Ala или он отсутствует; Z36 представляет собой Pro или он отсутствует; Z37 представляет собой Pro или он отсутствует; Z38 представляет собой Pro или он отсутствует; Z39 представляет собой Ser или он отсутствует; L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIb L1-L2-L3-L4 (IIb), в которой L1 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; Y _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIc Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIc), в которой Y1 представляет собой Gln или он отсутствует; Y2 представляет собой Gly или он отсутствует; Y3 представляет собой Pro или он отсутствует; Y4 представляет собой Trp или он отсутствует; Y5 представляет собой Leu или он отсутствует; Y6 представляет собой Glu или он отсутствует; Y7 представляет собой Glu или он отсутствует; Y8 представляет собой Glu или он отсутствует; Y9 представляет собой Glu или он отсутствует; Y10 представляет собой Glu или он отсутствует; Y11 представляет собой Ala или он отсутствует; Y12 выбран из Ala и Tyr или он отсутствует; Y13 выбран из Gly и Ala, или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, Phe, 1Nal и Met; Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr и Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.

4. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что Z _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIa His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Z20-Leu-Phe-Ile-Z24-Z25-Leu-Z27-Z28 (IIIa), в которой Z9 выбран из Asp и Glu; Z12 выбран из Lys, Arg и Orn; Z13 выбран из Gln и Tyr; Z14 выбран из Met и Leu; Z16 выбран из Glu, Cys и Lys; Z20 выбран из Arg, Lys и Orn; Z24 выбран из Lys и Glu; Z25 выбран из Trp, Lys, Cys и Phe; Z27 выбран из Lys, Arg и Orn; Z28 выбран из Asn и Asp или он отсутствует; L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIb L1-L2-L3-L4 (IIIb), в которой L1 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L2 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L3 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L4 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; Y _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIc Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIIc), в которой Y12 выбран из Tyr и Ala или он отсутствует; Y13 выбран из Gly и Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, 1Nal и Phe; Y15 выбран из Leu, Nle, Thr и Phe и Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.

5. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что Z _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVa His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Gln-Met-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Z27-Z28 (IVa), в которой Z9 выбран из Glu и Asp; Z12 выбран из Lys и Orn; Z16 выбран из Glu и Lys; Z27 выбран из Lys и Orn; Z28 выбран из Asn и Asp или он отсутствует; L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVb L1-L2-L3-L4 (IVb), в которой L1 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L2 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L3 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L4 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; Y _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVc Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IVc), в которой Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует и Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.

6. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что Z _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Va His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Tyr-Leu-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Phe-Leu-Z27-Z28 (Va), в которой Z9 выбран из Glu и Asp; Z12 выбран из Lys и Orn; Z16 выбран из Glu и Lys; Z27 выбран из Lys и Orn; Z28 выбран из Asn и Asp, или он отсутствует; L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Vb L1-L2-L3-L4 (Vb), в которой L1 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L2 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L3 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L4 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; Y _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Vc Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (Vc), в которой Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует; Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.

7. Пептидный конъюгат по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что пептидная последовательность формулы I содержит один или несколько внутримолекулярных мостиков.

8. Пептидный конъюгат по п.7, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик образуется между боковыми цепями двух аминокислотных остатков, которые разделены тремя аминокислотами в линейной последовательности согласно формуле I.

9. Пептидный конъюгат по п.8, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик образуется между боковыми цепями пар остатков х и х+3, х+4 или х+5.

10. Пептидный конъюгат по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик представляет собой лактамное кольцо.

11. Пептидный конъюгат по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик включает пару остатков, в которых: Z12 представляет собой Lys и Z16 представляет собой Glu; Z12 представляет собой Glu и Z16 представляет собой Lys; Z16 представляет собой Glu и Z20 представляет собой Lys; Z16 представляет собой Lys и Z20 представляет собой Glu; Z20 представляет собой Glu и Z24 представляет собой Lys; Z20 представляет собой Lys и Z24 представляет собой Glu.

12. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что Z _a имеет по меньшей мере 75% идентичности с природным эксендином-4, например по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%.

13. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что Y _a имеет по меньшей мере 70% идентичности с природным гастрином, например по меньшей мере 75, 80, 85, 90 или 95%.

14. Пептидный конъюгат по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что пептид формулы I имеет последовательность Эксендин-4(1-39)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(l-39)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-ААА-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-Peg3-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(l-39)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-8Аос-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-K-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-ААА-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-8Аос-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-39)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин- 6, Эксендин-4(1-28)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-Peg3-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(l-28)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-28)-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-K-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-ААА-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-8Аос-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин-6, или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.

15. Пептидный конъюгат по пп.1-11, отличающийся тем, что пептид формулы I имеет последовательность: Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu3]Гастрин-5, Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Ala1,Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Ala2,Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu2]Гастрин-4, [Leu14]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Orn12]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Orn27]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Phe25]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Asp28]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Tyr13]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Orn20]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-27)-[Leu4]Гастрин-11, Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu3]Гастрин-5, Эксендин-4(1-26)-Peg3-[Leu3]Гастрин-5, Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu2]Гастрин-4, [Tyr13,Leu14]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Tyr13,Phe25]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Leu14,Phe25]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Tyr13,Leu14,Phe25]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Боковая цепь-цикло([Lys12,Glu16]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Боковая цепь-цикло([Glu16,Lys20]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Боковая цепь-цикло([Lys20,Glu24]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Lys16]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-Peg3-K-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-[Thr4]Гастрин-6, Эксендин-4(1-28)-[Phe4]Гастрин-6, [Leu14]Эксендин-4(1-28)-[1Nal3,Leu4]Гастрин-6, [Leu14]Эксендин-4(1-28)-[Nle4]Гастрин-6, [Leu14]Эксендин-4(1-28)-[Leu4,[3-(3-пиридил)-Ala]6]Гастрин-6, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4,Phe3]Гастрин-6, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4,Phe3]Гастрин-6, [Arg27,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg12,27,Leu14,Lys16,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg12,27,Leu14,Lys20,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg12,27,Leu14,Lys24,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg12,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-[Leu2]Гастрин-4, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu2]Гастрин-4, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(l-27)-Orn-Peg3-[Leu2]Гастрин-4, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(l-27)-Peg3-Orn-[Leu2]Гастрин-4, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Orn-Orn-[Leu2]Гастрин-4, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-[Leu4]Гастрин-6, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(l-27)-Orn-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(l-27)-Peg3-Orn-[Leu4]Гастрин-6, [Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Orn-Orn-[Leu4]Гастрин-6, или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.

16. Пептидный конъюгат, имеющий формулу VI R1-X-L-Y-R2 (VI), в которой R1 представляет собой Н, С ₁ -С ₄ алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; R2 представляет собой ОН или NH ₂ ; X содержит последовательность GLP-1 (7-36), имеющую последовательность His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg, или ее аналога Х _а , L представляет собой линкер, содержащий до 4 природных или неприродных аминокислот или их комбинацию, или он отсутствует; Y содержит последовательность Гастрина-17, имеющую последовательность Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe, при этом Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr или его аналога Y _a .

17. Пептидный конъюгат по п.16, отличающийся тем, что: (i) X _a имеет до 5 замен в положениях и/или у него отсутствуют 1-2 аминокислоты на С-конце по сравнению с последовательностью GLP-1; и/или (ii) Y _a имеет до 5 замен в положениях по сравнению с последовательностью Гастрина-17 и/или у него отсутствуют 1-13 аминокислот на N-конце по сравнению с последовательностью Гастрина-17.

18. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-17, отличающийся тем, что: X _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIa His-Х8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (VIIa), в которой X8 выбран из Ala, Aib и Gly; X26 выбран из Arg и Lys; X34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys; L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIb L1-L2-L3-L4 (VIIb), в которой L1 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L3 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L4 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; Y _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIc Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (VIIc), в которой Y1 представляет собой Gln или он отсутствует; Y2 представляет собой Gly или он отсутствует; Y3 представляет собой Pro или он отсутствует; Y4 представляет собой Trp или он отсутствует; Y5 представляет собой Leu или он отсутствует; Y6 представляет собой Glu или он отсутствует; Y7 представляет собой Glu или он отсутствует; Y8 представляет собой Glu или он отсутствует; Y9 представляет собой Glu или он отсутствует; Y10 представляет собой Glu или он отсутствует; Y11 представляет собой Ala или он отсутствует; Y12 выбран из Ala, Tyr или он отсутствует; Y13 выбран из Gly, Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, Phe, 1Nal и Met; Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr и Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.

19. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-18, отличающийся тем, что X _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIa His-Х8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (VIIIa), в которой X8 выбран из Ala, Aib и Gly; X26 выбран из Arg и Lys; X34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys; L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIb L1-L2-L3-L4 (VIIIb), в которой L1 выбран из Peg3, Orn, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Orn, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Lys, Ala, Cys, Orn и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Lys, Orn, Ala, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; Y _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIc Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Phe (VIIIc), в которой Y12 выбран из Tyr, Ala или он отсутствует; Y13 выбран из Gly, Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp и Phe; Y15 выбран из Leu, Trp и Phe.

20. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-19, отличающийся тем, что: X _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXa His-Х8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (IXa), в которой X8 выбран из Ala, Aib и Gly; Х26 выбран из Arg и Lys; Х34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys; L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXb L1-L2-L3-L4 (IXb), в которой L1 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; Y _a представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXc Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IXc), в которой Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует; Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.

21. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-20, отличающийся тем, что Х _а имеет по меньшей мере 85% идентичности с природным эксендином-4, например по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5%.

22. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-21, отличающийся тем, что по меньшей мере один из Lys или Cys дополнительно конъюгирован с липофильным заместителем.

23. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-21, отличающийся тем, что пептид формулы VI имеет последовательность GLP-1 (7-36)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-[Leu4]Гастрин-6, GLP-1 (7-36)-K-[Leu4]Гастрин-6, GLP-1 (7-36)-ААА-[Leu4]Гастрин-6, GLP-1 (7-36)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6, GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Leu4]Гастрин-6, GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6 GLP-1 (7-36)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин-6, [Aib8,Arg34]GLP-1 (7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg34]GLP-1 (7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.

24. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-22, отличающийся тем, что пептид формулы VI имеет последовательность [Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)34]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg34,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)26]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg26,34,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)36]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)26]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Arg26,34,Gly8,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)36]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, [Aib8,Arg34,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)26]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.

25. Применение пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-24 в качестве лекарственного средства для индукции у нуждающегося в этом субъекта неогенеза панкреатических островков.

26. Применение пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-24 в качестве лекарственного средства для предотвращения у нуждающегося в этом субъекта апоптоза β-клеток в панкреатических островках.

27. Применение пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.25-26, отличающееся тем, что указанный субъект представляет собой человека.

28. Способ лечения нуждающегося в этом субъекта от заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа, предиабета, синдрома инсулинорезистентности, нарушения толерантности к глюкозе (IGT), болезненных состояний, связанных с повышенным уровнем глюкозы в крови, гипергликемии, гипертензии, атерогенной дислипидемии, артериосклероза (например, атеросклероз), ишемической болезни сердца, заболевания периферических артерий, инсульта, микроангиопатии, желудочного заболевания, метаболического синдрома, рака (например, рака толстой кишки), воспалительной болезни кишечника (ВБК) и синдрома раздраженного кишечника (СРК), указанный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по пп.1-24.

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой человека.

30. Фармацевтическая композиция, содержащая пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по пп.1-24 совместно с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или основой.

31. Способ лечения состояния, вызванного или характеризующегося избыточной массой тела, например, для лечения и/или предотвращения ожирения, патологического ожирения, воспаления, вызванного ожирением, заболевания желчного пузыря, вызванного ожирением, апноэ сна, вызванного ожирением, метаболического синдрома, предиабета, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-24.

32. Применение соединения по любому из пп.1-24 для предотвращения набора веса или обеспечения потери веса у субъекта, который в этом нуждается.

33. Применение соединения по любому из пп.1-24 в способе улучшения уровней глюкозы в периферической крови, переносимости глюкозы и/или уровня холестерина в периферической крови, снижения уровней ЛПНП в периферической крови и/или повышения соотношения ЛПВП/ЛПНП у нуждающегося в этом субъекта.

34. Применение по любому из пп.25-27, 32, 33, отличающееся тем, что соединение вводят как часть комбинированной терапии совместно с агентом для лечения диабета, ожирения, дислипидемии или гипетензии.

35. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения диабета представляет собой метформин, сульфонилмочевину, глинид, ингибитор DPP-IV, глитазон, инсулин или аналог инсулина.

36. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения ожирения представляет собой агонист рецептора глюкагонподобного пептида 1, пептид YY или его аналог, антагонист рецептора каннабиноидов 1, ингибитор липазы, агонист рецептора меланокортина 4 или антагонист рецептора меланинконцентрирующего гормона 1.

37. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения гипертензии представляет собой ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, блокатор рецептора ангиотензина II, диуретик, бета-блокатор или блокатор кальциевых каналов.

38. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения дислипидемии представляет собой статин, фибрат, ниацин и/или ингибитор всасывания холестерина.

39. Способ по любому из пп.28, 29, 31, отличающийся тем, что соединение вводят как часть комбинированной терапии совместно с агентом для лечения диабета, ожирения, дислипидемии или гипертензии.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения диабета представляет собой метформин, сульфонилмочевину, глинид, ингибитор DPP-IV, глитазон, инсулин или аналог инсулина.

41. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения ожирения представляет собой агонист рецептора глюкагонподобного пептида 1, пептид YY или его аналог, антагонист рецептора каннабиноидов 1, ингибитор липазы, агонист рецептора меланокортина 4 или антагонист рецептора меланинконцентрирующего гормона 1.

42. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения гипертензии представляет собой ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, блокатор рецептора ангиотензина II, диуретик, бета-блокатор или блокатор ионов кальция.

43. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения дислипидемии представляет собой статин, фибрат, ниацин и/или ингибитор всасывания холестерина.

44. Способ получения соединения по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что указанный способ включает синтез указанного соединения методикой твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза и выделение конечного продукта пептидного конъюгата с получением соединения по любому из пп.1-24.

45. Применение соединения по любому из пп.1-24 в способе улучшения уровней глюкозы в периферической крови, переносимости глюкозы и/или уровня холестерина в периферической крови, снижения уровней ЛПНП в периферической крови и/или повышения соотношения ЛПВП/ЛПНП у нуждающегося в этом субъекта, при этом используется режим дозирования "лекарственные каникулы".

46. Устройство, содержащее по меньшей мере один пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по пп.1-24, для введения пептидного конъюгата субъекту.

47. Набор, содержащий по меньшей мере один пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по пп.1-24 и также содержащий упаковку и инструкцию по применению.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой человека.

Евразийское ои 023925 (13) В1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201290964
(22) Дата подачи заявки
2011.04.27
(51) Int. Cl. C07K14/575 (2006.01) A61K38/22 (2006.01) C07K14/595 (2006.01) C07K19/00 (2006.01)
(54) ПЕПТИДНЫЕ КОНЪЮГАТЫ АГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРА GLP-1 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(31) PA 2010 00379; 61/395,119; PA 2010 00941; PA 2011 00149; 61/470,170
(32) 2010.04.27; 2010.05.07; 2010.10.15; 2011.03.04; 2011.03.31
(33) DK; US; DK; DK; US
(43) 2013.05.30
(86) PCT/DK2011/050133
(87) WO 2011/134471 2011.11.03
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
ЗИЛЭНД ФАРМА А/С (DK)
(72) Изобретатель:
Неэруп Трине Сковлунд Рюге (DK), Эстерлунд Торбен (SE), Толборг Якоб Линд, Фосгерау Кельд (DK), Мартенссон Ульрика (SE), Брорсон Марианна, Ролстед Камилла (DK)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(56) WO-A1-2008071010 WO-A2-2005072045 WO-A1-2007095737
(57) Настоящее изобретение относится, в частности, к определенным пептидным конъюгатам и применению указанных конъюгатов при лечении разнообразных заболеваний или нарушений, включая диабет (1 и/или 2 типа) и заболевания или расстройства, вызванные диабетом.
Область техники
Настоящее изобретение относится, в частности, к некоторым пептидным конъюгатам и применению указанных конъюгатов при лечении разнообразных заболеваний или нарушений, включая диабет (1 и/или 2 типа) и заболевания или расстройства, вызванные диабетом.
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявкам на патент США № 61/395119 и 61/470170, которые включены в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.
Уровень развития техники
Диабет, в частности диабет 1 и 2 типа, вместе с ожирением, которое считается основным фактором, обуславливающим развитие, в частности, диабета 2 типа, представляет собой растущую и одну из самых серьезных в мире проблему здравоохранения. Заболевания или расстройства, которые могут возникнуть вследствие не вылеченного диабета, включают сердечно-сосудистые заболевания и заболевания периферических артерий, болезни микро- и макрососудов, инсульт и, возможно, некоторые формы рака. Для диабета характерна нарушенная физиологическая регуляция уровня глюкозы в крови, а среди основных условий, которые могут привести к диабету, считаются снижение или потеря массы и функции р-клеток поджелудочной железы с сопутствующим сокращением или потерей выработки эндогенного инсулина и/или резистентностью к инсулину (сниженной чувствительностью к инсулину), т.е. снижение или потеря способности эндогенного инсулина осуществлять адекватную регуляцию уровня глюкозы в крови. В ответ на присутствие и всасывание питательных веществ в кишечнике слизистой оболочкой ЖКТ вырабатываются некоторые гормоны, которые снижают уровень глюкозы в крови. К ним относятся глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1), глюкозозависимый инсулинотропный пептид (GIP) и секретин.
GLP-1 [см., например, 0rskov, Diabetologia 35: 701-711 (1992)] вырабатывается в результате процес-синга в тканях проглюкагона, пептида из 180 аминокислот [см., например, Dracker, Diabetes 47: 159-169 (1998)]. Полная последовательность проглюкагона содержит 29 аминокислотную последовательность глюкагона, 36 или 37 аминокислотную последовательность GLP-1, а также 34 аминокислотную последовательность глюкагонподобного пептида-2 (GLP-2; кишечнотропный пептид). GLP-1 человека (7-37) имеет аминокислотную последовательность HAEGTFTSDVSSYLEGQA-AKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 114).
Отмечено, что GLP-1 выполняет ряд функций. Это гормон, который усиливает глюкозостимулиро-ванную секрецию инсулина у здоровых людей (и, следовательно, принадлежит к группе гормонов, известных как инкретиновые гормоны). Кроме того, GLP-1 снижает концентрацию глюкагона, задерживает опорожнение желудка, стимулирует биосинтез (про)инсулина и повышает чувствительность к инсулину [см., например, Nauck, Horm. Metab. Res. 47: 1253-1258 (1997)]. Также GLP-1 усиливает способность р-клеток поджелудочной железы воспринимать и реагировать (посредством секреции инсулина) на глюкозу у пациентов с нарушенной переносимостью глюкозы [см., например, Byrne, Eur. J. Clin. Invest. 28: 7278 (1998)]. Инсулинотропный эффект GLP-1 у человека увеличивает скорость исчезновения глюкозы и уменьшает эндогенную продукцию глюкозы, отчасти из-за повышения уровня инсулина, а отчасти из-за повышения чувствительности к инсулину [см., например, D'Alessio, Eur. J. Clin. Invest. 28: 72-78 (1994)]. Тем не менее, короткий период полувыведения нативного GLP-1 in vivo составлял основную фармакологическую проблему при попытках использовать гормон в качестве лекарственного средства. У человека и крысы GLP-1 быстро разлагается дипептидилпептидазой-IV (DPP-IV) до GLP-1 (9-36) амида, который выступает эндогенным антагонистом рецептора GLP-1. Были предложены несколько стратегий для преодоления этой проблемы, в одних из которых используются ингибиторы DPP-FV, в то время как в других используются DPP-IV-устойчивые аналоги GLP-1 (7-36) амида.
Так называемые эксендины, которые составляют другую группу пептидов, которые снижают уровень глюкозы в крови, обладают некоторым сходством последовательностей (53%) с GLP-1 (7-36) [см., например, Гок и соавт., J. Biol. Chem. 268: 19650-1 9655 (1993)]. Эксендины были найдены в слюне видов Helodermatidae (ядозубы). Экзендин-3 присутствует в слюне Heloderma horridum (мексиканский ядозуб), в то время как эксендин-4 присутствует в слюне Heloderma suspectum (Gita Monster).Аминокислотная последовательность экзендина-4, которая отличается от экзендина-3 в положениях два и три, представляет собой HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLF!EWLKNGGPSSGAPPPS-NH2 (SEQ ID NO: 115).
Сообщали, что эксендин-4 является мощным агонистом рецептора GLP-1 на модели выделенных клеток инсулиномы крысы [Goke et al., loc. cit.]. В публикации WO 99/07404 описано, что при системном введении эксендина-4 уровень глюкозы в крови снижается на 40% у мышей db/db с диабетом, также сообщали о продолжительном глюкозопонижающем действии при однократной ежедневной инъекции эк-сендина-4 у мышей с диабетом ob/ob [Grieg et al., Diabetologia 42: 45-50 (1999)].
В публикациях US 5424286 и WO 98/05351 описано, что агонисты эксендина-3, эксендина-4 и эк-сендина можно использовать при лечении диабета для снижения двигательной активности желудка и отсрочки опустошения желудка и профилактики гипергликемии, и в публикации WO 98/30231 также описано, что их можно применять для снижения потребления пищи.
Пептидный гормон гастрин секретируется клетками слизистой желудка и G-клетками двенадцатиперстной кишки, и среди главных физиологических функций данного гормона у человека является сти
муляция секреции желудочного сока (т.е. HCl) и способствование перистальтики желудка. Другие обнаруженные действия гастрина включают стимуляцию роста клеток, и также есть показания, что гастрин может играть роль при неогенезе островков, т.е. стимуляции роста инсулинсекретирующих р-клеток островков поджелудочной железы [см., например, Korc, M., J. Clin. Invest., 92: 1113-1114 (1993); Rooman et al. Diabetes 51: 686-690 (2002)], и благодаря этому способствовать регуляции уровня глюкозы в крови.
Гастрин имеет один рецептор с другим пептидным желудочно-кишечным гормоном, холецис-токинином (CCK). Рецепторы CCK-А R и CCK-В R имеют разные аффинности к вариантам гастрина и CCK. CCK-А R (или CCK R1) выступает преимущественно рецептором для сульфатированного CCK, тогда как CCK-В R (или CCK R2) связывает в одинаковой степени хорошо CCK и гастрин. Считается, что CCK-В R представляет собой "рецептор гастрина" из-за более высокого уровня гастрина по сравнению с CCK в плазме [Foucaud et al. Reg. Peptides 145: 17-23 (2008)].
CCK-B R может запускать несколько внутриклеточных путей после связывания лиганда, что считается причиной различных физиологических функций CCK. Ключевыми путем, регулируемым CCK-В R, является путь MAPK (митогенактивированные протеинкиназы) или ERK (внеклеточные регулируемые киназы), который также активируется несколькими гормонами роста. Это является ключевой особенностью функции пролиферации клеток гастрина. Поскольку CCK-В R экспрессируется в поджелудочной железе, гастрин может участвовать в пролиферации клеток и регенерации островков в данной ткани. У людей гастрин встречается в основном в трех формах, а именно Гастрин -34, Гастрин-17 и Гастрин-14 (в зависимости от общего количества аминокислот в рассматриваемой последовательности). Также обнаружили Гастрин-6. Более короткие формы получаются при расщеплении С-концевого амидированного Гастрина-34, таким образом, Гастрин-17 состоит из С-концевых последних 17 остатков Гастрина-34 (соответствующих остаткам прогастрина (55-71), Гастрин-14 из С-концевых последних 14 остатков (соответствующих остаткам прогастрина (58-71) и Гастрин-6 состоит только из С-концевых последних 6 остатков (соответствующих остаткам прогастрина (66-71). Они представляют собой амидированные формы гастрина, которые связываются с высоким сродством с CCK-В R и выполняют функцию пролиферации клеток. В Гастрине-17 человека N-концевой аминокислотный остаток представляет собой остаток пирог-лутаминовой кислоты (PyroGlu). Амидированные С-концевые 6 аминокислот являются ключевыми ре-цепторсвязывающими остатками гастрина.
В публикации WO 2005/072045 описаны, в частности, комбинации "агонистов GLP-1" и "соединений гастрина", предположительно оказывающие благоприятное действие на профилактику и/или лечение состояний и/или заболеваний, при которых было показано терапевтическое действие "агониста GLP-1" или "соединения гастрина". В публикации WO 2007/095737 описаны, между прочим, аналогичные комбинации "агонистов эксендина" и "соединений гастрина", которые также предположительно оказывают благоприятное действие на профилактику и/или лечение состояний и/или заболеваний, при которых было показано терапевтическое действие "агонистов эксендина" или "соединения гастрина".
Данные [получаемые из исследований с применением мышей с диабетом без ожирения (NOD), широко используемых в качестве животной модели диабета человека 1 типа], представленные в публикации WO 2005/072045, по-видимому, указывают на то, что некоторые комбинации "агониста GLP-1" и "соединения гастрина" согласно описанию могут оказывать благоприятное действие по нормализации уровней глюкозы в крови на модели мышей с острым диабетом NOD по сравнению с действием, наблюдаемым при применении рассматриваемого "агониста GLP-1" (или "соединения гастрина") по отдельности. Данные [также полученные в результате исследований с применением диабетических мышей без ожирения (NOD)], представленные в публикации WO 2007/095737, по-видимому, указывают на то, что некоторые комбинации "агонист эксендина"/"соединение гастрина" согласно описанию оказывают благоприятное действие по нормализации уровней глюкозы и инсулина в крови на модели мышей с острым диабетом NOD по сравнению с действием, наблюдаемым при применении рассматриваемого "агониста эксендина" (или "соединения гастрина") по отдельности, и что некоторые комбинации "агонист рецептора GLP-1"/"гастрина" согласно описанию могут оказывать благоприятное действие в отношении индукции регенерации клеток островков по сравнению с действием, наблюдаемым при использовании "агониста рецептора GLP-1" по отдельности.
В публикациях WO 2005/072045 и WO 2007/095737 также описана возможность образования конъ-югатов, содержащих "агонист GLP-1" или "агонист эксендина", соответственно, и "соединение гастри-на", ковалентно спаренные или связанные (т.е. конъюгированных) друг с другом, возможно с помощью промежуточного линкера или спейсера. Подходящим спейсером является моно- или дисахарид, аминокислота, сульфат, сукцинат, ацетат или олигомерный полимерный спейсер или линкер, содержащий одну или несколько таких групп. Также описаны предполагаемые способы, с помощью которых можно получить рассматриваемые типы конъюгатов. Тем не менее, ни в одном из последних рассматриваемых документов не приведены препаративные или другие данные для обоснования того, что любой рассматриваемый тип конъюгата был на самом деле приготовлен и охарактеризован или были проверены его биологические/физиологические свойства или активность - во время подачи соответствующей международной заявки. Также можно отметить, что ни в публикации WO 2005/072045, ни в публикации WO 2007/095737 не приведены данные in vivo, in vitro или другие данные, подтверждающие, что комбинации
"агонист GLP-1"/"соединение гастрина" или "агонист эксендина"/"соединение гастрина", соответственно, согласно описанию и использованные в данном описании, могут быть полезны при лечении, например, диабета 2 типа.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что некоторые конъюгаты, содержащие две ковалентно спаренные или связанные пептидных группы, могут проявлять неожиданно высокую терапевтическую активность при лечении, например, диабета (диабета 1 и/или 2 типа) или различных заболеваний или состояний, вызываемых диабетом, по сравнению с терапевтической активностью комбинации двух отдельных рассматриваемых пептидов.
В более широком аспекте настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат агониста рецептора GLP-1 и гастрина, в частности гастрина с заменой в положении 15, выбранной из Leu, Me, Phe и Thr. Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает пептидные конъюгаты Эксендина-4 и гаст-рина, а также пептидные конъюгаты GLP-1 и гастрина.
Согласно первому аспекту настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает пептидный конъю-гат, имеющий формулу I
R1-Z-L-Y-R2 (I),
в которой
R1 представляет собой Н, С1-4 алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; R2 представляет собой ОН или NH2;
Z содержит последовательность эксендина-4 (1-39), имеющую последовательность His-Gly-Glu-Gly-
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-He-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-
Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 115) или его аналог Za;
L представляет собой необязательную линкерную группу; и
Y содержит последовательность Гастрина-17, имеющую последовательность Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe (SEQ ID NO: 116), в которой Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr
или его аналог Ya.
Также настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором:
(i) Za имеет до 10 замен в положениях и/или содержит укорочение на С-конце на 1-12 аминокислот по сравнению с последовательностью эксендина; и/или
(ii) Ya имеет до 5 замен по сравнению с последовательностью Гастрина-17 и/или содержит укорочение на N-конце на 1-13 аминокислот по сравнению с последовательностью Гастрина-17.
Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIa His-Z2-Z3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20-Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33-Z34-Z35-Z36-Z37-Z38-Z39 (IIa), в которой
Z2 выбран из Gly, Ala, Ser, Aib, Thr, Leu и Ile;
Z3 выбран из Glu и Asp;
Z9 выбран из Asp и Glu;
Z10 выбран из Leu, Val, Ile и Ala;
Z11 выбран из Ser и Aib;
Z12 выбран из Ser, Gln, Arg, Cys, Lys, Glu и Orn; Z13 выбран из Arg, Ser, Gln, Тут и Glu;
Z14 выбран из Gly, Cys, Phe, Tyr, Trp, Lys, Met, Leu, Nle и Ile;
Z16 выбран из Asp, Gly, Aib, Glu, Lys и Cys;
Z17 выбран из Glu, Cys, Lys, Ser и Gln;
Z18 выбран из Ala и Aib;
Z19 выбран из Val, Leu, Ile и Ala;
Z20 выбран из Arg, Lys, Cys, Orn и Glu;
Z21 выбран из Leu и Glu;
Z22 выбран из Phe и Ala;
Z23 выбран из Не и Leu;
Z24 выбран из Glu, Cys, Lys, Ala и Arg;
Z25 выбран из Trp, Cys, Lys и Phe;
Z26 выбран из Leu и Ile;
Z27 выбран из Ile, Val, Gln, Lys, Cys, Arg и Orn;
Z28 выбран из Asn, Ser, Asp, Aib, Gln, Lys, Cys, Arg, Tyr, bAla, Glu, Orn и Leu или он отсутствует; Z29 выбран из Gly, Aib и bAla или он отсутствует; Z30 выбран из Gly, Cys, Lys и Arg или он отсутствует;
Z31 выбран из Pro, Ser и Asp или он отсутствует; Z32 выбран из Ser и Lys или он отсутствует; Z33 представляет собой Ser или он отсутствует; Z34 выбран из Gly и Lys или он отсутствует; Z35 представляет собой Ala или он отсутствует; Z36 представляет собой Pro или он отсутствует; Z37 представляет собой Pro или он отсутствует; Z38 представляет собой Pro или он отсутствует; Z39 представляет собой Ser, или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIb
L1-L2-L3-L4 (IIb),
в которой
L1 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gin или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIc
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIc),
в которой
Y1 представляет собой Gln или он отсутствует; Y2 представляет собой Gly или он отсутствует; Y3 представляет собой Pro или он отсутствует; Y4 представляет собой Trp или он отсутствует; Y5 представляет собой Leu или он отсутствует; Y6 представляет собой Glu или он отсутствует; Y7 представляет собой Glu или он отсутствует; Y8 представляет собой Glu или он отсутствует; Y9 представляет собой Glu или он отсутствует; Y10 представляет собой Glu или он отсутствует; Y11 представляет собой Ala или он отсутствует; Y12 выбран из Ala и Tyr или он отсутствует; Y13 выбран из Gly и Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, Phe, 1 Nal и Met; Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr; и Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.
Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIa His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Z 13 -Z 14-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Z20-Leu-Phe-Ile-
Z24-Z25-Leu-Z27-Z28(IIIa),
в которой
Z9 выбран из Asp и Glu;
Z12 выбран из Lys, Arg и Orn;
Z13 выбран из Gln и Tyr;
Z14 выбран из Met и Leu;
Z16 выбран из Glu, Cys и Lys;
Z20 выбран из Arg, Lys и Orn;
Z24 выбран из Lys и Glu;
Z25 выбран из Trp, Lys, Cys и Phe;
Z27 выбран из Lys, Arg и Orn;
Z28 выбран из Asn и Asp или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIb
L1-L2-L3-L4 (IIIb),
в которой
L1 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gin или он отсутствует; L4 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gin или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIc
Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIIc),
в которой
Y12 выбран из Tyr и Ala или он отсутствует;
Y13 выбран из Gly и Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, 1 Nal и Phe; Y15 выбран из Leu, Nle, Thr и Phe; и Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.
Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVa His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Gln-Met-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-
Trp-Leu-Z27-Z28 (IVa),
в которой
Z9 выбран из Glu и Asp;
Z12 выбран из Lys и Orn;
Z16 выбран из Glu и Lys;
Z27 выбран из Lys и Orn;
Z28 выбран из Asn и Asp или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVb
L1-L2-L3-L4 (IVb),
в которой
L1 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVc
Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IVc),
в которой
Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует; и Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.
Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъ-югат, в котором
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Va His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Tyr-Leu-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-
Phe-Leu-Z27-Z28 (Va),
в которой
Z9 выбран из Glu и Asp; Z12 выбран из Lys и Orn;
Z16 выбран из Glu и Lys; Z27 выбран из Lys и Orn; Z28 выбран из Asn и Asp или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Vb
L1-L2-L3-L4 (Vb),
в которой
L1 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Vc
Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (Vc),
в которой
Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует; и Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.
Более того, настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором пептидная последовательность формулы I содержит один или более внутримолекулярных мостиков.
Также настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, согласно которому указанный внутримолекулярный мостик образуется между боковыми цепями двух аминокислотных остатков, которые разделены тремя аминокислотами, в линейной аминокислотной последовательности согласно формуле I.
Согласно определенному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором внутримолекулярный мостик образуется между боковыми цепями пар остатков х и х+3, х+4, х+5 и т.д.
Согласно другому определенному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором указанный внутримолекулярный мостик представляет собой лактамное кольцо.
Согласно другому определенному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пеп-
тидный конъюгат, в котором указанный внутримолекулярный мостик включает пару остатков, при этом Z12 представляет собой Lys и Z16 представляет собой Glu; Z12 представляет собой Glu и Z16 представляет собой Lys; Z16 представляет собой Glu и Z20 представляет собой Lys; Z16 представляет собой Lys и Z20 представляет собой Glu; Z20 представляет собой Glu и Z24 представляет собой Lys; Z20 представляет собой Lys и Z24 представляет собой Glu.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечивается пептидный конъюгат, имеющий формулу VI
R1-X-L-Y-R2 (VI),
в которой
R1 представляет собой Н, С1-4 алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил;
представляет собой ОН или NH2; X содержит последовательность GLP-1 (7-36), имеющую последовательность His-Ala-Glu-Gly-Thr-
Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg
(SEQ ID NO: 114) или его аналог Ха;
L представляет собой линкер, содержащий до 4 природных или не природных аминокислот или их комбинацию, или он отсутствует;
Y содержит последовательность Гастрина-17, имеющую последовательность Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe.
При этом Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr
или его аналог Ya.
Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором
(i) Xa имеет до 5 замен в положениях и/или имеет укорочение на С-конце на 1-2 аминокислоты по сравнению с последовательностью GLP-1; и/или
(ii) Ya имеет до 5 замен в положениях по сравнению с последовательностью Гастрина-17, и/или содержит укорочение на N-конце на 1-13 аминокислот по сравнению с последовательностью Гастрина-17.
Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором Xa представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIa
His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu -Phe-Ile-Ala-
Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (VIIa),
в которой
X8 выбран из Ala, Aib и Gly; X26 выбран из Arg и Lys; X34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIb
L1-L2-L3-L4 (VIIb),
в которой
L1 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L3 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L4 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIc Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (VIIc), в которой
Y1 представляет собой Gln или он отсутствует; Y2 представляет собой Gly или он отсутствует; Y3 представляет собой Pro или он отсутствует; Y4 представляет собой Trp или он отсутствует; Y5 представляет собой Leu или он отсутствует; Y6 представляет собой Glu или он отсутствует; Y7 представляет собой Glu или он отсутствует; Y8 представляет собой Glu или он отсутствует; Y9 представляет собой Glu или он отсутствует; Y10 представляет собой Glu или он отсутствует; Y11 представляет собой Ala или он отсутствует; Y12 выбран из Ala, Tyr или он отсутствует; Y13 выбран из Gly, Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, Phe, 1 Nal и Met; Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr; и
Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.
Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъ-югат, в котором
Xa представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIa His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-
Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (VIIIa),
в которой
X8 выбран из Ala, Aib и Gly; X26 выбран из Arg и Lys;
X34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIb
L1-L2-L3-L4 (VIIIb),
в которой
L1 выбран из Peg3, Orn, Cys, Lys, Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Orn, Cys, Lys, Gln или он отсутствует; L3 выбран из Lys, Ala, Cys, Orn, Gln или он отсутствует; L4 выбран из Lys, Orn, Ala, Peg3, Cys, Lys, Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIc
Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Phe (VIIIc),
в которой
Y12 выбран из Tyr, Ala или он отсутствует; Y13 выбран из Gly, Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp и Phe; и Y15 выбран из Leu, Thr и Phe.
Согласно определенному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором
Xa представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXa His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-
Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (IXa),
в которой
X8 выбран из Ala, Aib и Gly; X26 выбран из Arg и Lys; X34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXb
L1-L2-L3-L4 (IXb),
в которой
L1 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXc
Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IXc),
в которой
Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует; и Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.
Согласно другому определенному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает пептидный конъюгат, в котором по меньшей мере один из Lys или Cys также конъюгирован с липофильным заместителем.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, имеющему формулу
Эксендин-4(1-39)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (1) Эксендин-4(1 -3 9)-[Gln1 ,Leu15]Гастрин-17, (2) Эксендин-4(1 -3 9)-K-[Gln1 ^^Гастрит-П, (3) Эксендин-4(1 -3 9)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (4) Эксендин-4(1 -3 9)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (5) Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (6) Эксендин-4(1 -3 9)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (7) Эксендин-4(1 -3 9)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (8) Эксендин-4(1 -3 9)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (9) Эксендин-4(1 -3 9)-[Leu4]Гастрин-6, (10) Эксендин-4(l-39)-K-[Leu4]Гастрин-6, (11)
Эксендин-4(1 -3 9)-AAA-[Leu4]Гастрин-6, (12) Эксендин-4(l-39)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (13) Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -SKK-[Leu4]Гастрин-6, (14) Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6, (15) Эксендин-4(1 -3 9)-8Aoc-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (16) Эксендин-4(1 -3 9)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (17) Эксендин-4(1 -3 9)-8Aoc-8Aoc-[Leu4]Гастрин-6, (18) Эксендин-4(1-28)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (19) Эксендин-4(1-28)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (20) Эксендин-4(1-28)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (21) Эксендин-4(1-28)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (22) Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (23) Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]гастрин-17, (24) Эксендин-4(1-28)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (25) Эксендин-4(1 -28)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (26) Эксендин-4(l-28)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (27) Эксендин-4(l-28)-[Leu4]Гастрин-6, (28) Эксендин-4(l-28)-K-[Leu4]Гастрин-6, (29) Эксендин-4(l-28)-AAA-[Leu4]Гастрин-6, (30) Эксендин-4(l-28)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (31) Эксендин-4(l-28)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (32) Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]гастрин-6, (33) Эксендин-4(l-28)-8Aoc-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (34) Эксендин-4(1-28)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (35) Эксендин-4(l-28)-8Aoc-8Aoc-[Leu4]Гастрин-6, (36) GLP-1 (7-36)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (37) GLP-1 (7-36)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (38) GLP-1 (7-36)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (39) GLP-1 (7-36)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (40) GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (41) GLP-1 (7-36)^3^3-^1^15^^101-17, (42) GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (43) GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (44) GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (45) GLP-1 (7-36)-[Leu4]Гастрин-6, (46) GLP-1 (7-36)-K-[Leu4]Гастрин-6, (47) GLP-1 (7-36)-AAA-[Leu4]Гастрин-6, (48) GLP-1 (7-36)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (49) GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (50) GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, (51) GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (52) GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6 (53) или GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Leu4]Гастрин-6, (54).
При этом каждая пептидная группа из Эксендин-4(1-39), Эксендин-4(1-28) и GLP-1 (7-36) кова-лентно присоединена (т.е. связана или спарена) к оставшейся части соответствующей молекуле конъюга-та через ее С-терминальную часть, и каждая пептидная группа из [Gln1,Leu15]Гастрин-17 и [Leu4]Гастрин-6 ковалентно присоединена (т.е. связана или спарена) к оставшейся части соответствующей молекуле конъюгата через ее N-терминальную часть;
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
Согласно определенному аспекту пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению можно получить с помощью стандартных синтетических методов с применением рекомбинантных систем экспрессии или любого другого подходящего метода. Таким образом, конъюгаты можно синтезировать различными путями, включая, например, методы, которые включают:
(а) синтез пептидного конъюгата с помощью стандартной твердофазной или жидкофазной методо-
логии, поэтапно или с помощью сборки фрагментов, и выделение и очистку конечного продукта пептид-
ного конъюгата;
(б) экспрессию конструкции нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептидный конъюгат, в хо-
зяйской клетке и выделение продукта экспрессии или культуры хозяйских клеток; или
(в) осуществление экспрессии in vitro в бесклеточной системе конструкции нуклеиновой кислоты,
которая кодирует пептидный конъюгат, и выделение продукта экспрессии;
Или посредством любой комбинации указанных методов (а), (б) или (в) для получения фрагментов пептидного конъюгата, последующего легирования фрагментов для получения пептидного конъюгата и
выделения пептидного конъюгата.
Среди других аспектов настоящего изобретения находятся способы лечения различных состояний, заболеваний или нарушений (включая диабет (тип 1 и 2) и различных со стояний, заболеваний и расстройств, связанных с диабетом), включающие введение пептидного конъюгата согласно настоящему изобретению (в свободной форме или в виде его фармацевтически приемлемой соли или сольвата), а также фармацевтических композиций, содержащих пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват согласно настоящему изобретению.
Согласно конкретному аспекту пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению также можно использовать в качестве фармацевтических агентов для лечения резистентности к инсулину, непереносимости глюкозы, предиабетов, повышенных уровней глюкозы натощак, диабетов 1 и 2 типов, гипертензии и/или дислипидемии (или комбинации указанных метаболических факторов риска), атеросклероза, артериосклероза, болезни коронарных артерий сердца, болезни периферических артерий и инсульта. Их также можно применять для профилактики увеличения веса, способствования потери веса, снижения избыточной массы тела и/или лечения ожирения (например, благодаря контролю аппетита, питания, потребления пищи, потребления калорий и/или расхода энергии), включая патологическое ожирение, а также связанные с этим заболевания, расстройства и состояния здоровья, включая, но не ограничиваясь ими, воспаление, связанное с ожирением, связанная с ожирением болезнь желчного пузыря и вызванное ожирением апноэ сна. Действие пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению на указанные состояния может быть опосредовано в целом или частично влиянием на массу тела или может не за висеть от этого.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Средняя концентрация в плазме в зависимости от времени (прямо пропорциональная) после внутривенного и подкожного введения мышам 100 нмоль/кг. А: Соединения 33, В: Соединения 1. Данные представлены в виде среднее ± SD, ^3/точка измерения.
Фиг. 2. Средняя концентрация в плазме в зависимости от времени (прямо пропорциональная) после подкожного введения мышам 100 нмоль/кг соединения 33, 74, 76, 77, 78 и 80. n= 2/точка измерения.
На фиг. 3 представлены данные общего содержания панкреатического инсулина (в мкг) у мышей db/db с диабетом после введения (i) трех концентраций (1, 10 и 50 нмоль/кг) Соединения 1 согласно настоящему изобретению [Эксендин-4(1-39)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17; см. ниже], (ii) трех соответствующих концентраций 1:1 аддитивной комбинации пептидов Эксендин-4(1-39) и h[Leu15]Гастрин-17 (1, 10 и 50 нмоль/кг каждого пептида) и (iii) носителя.
Фиг. 4. Д-глюкозы в крови у мышей. Данные обрабатывали с применением критерия Крускала-Уоллиса с последующим множественным сравнением с применением критерия Данна, ***р <0.001. Сравнение Соединения 33, Эксендин-4, комбинации Эксендин-4(1-39) и h[Leu15]Гастрин-17 и носителя соответственно; n = 16-19 в группе.
Фиг. 5. Д-инсулина в плазме у мышей. Данные обрабатывали с применением критерия Крускала-Уоллиса с последующим множественным сравнением с применением критерия Данна, ***р <0.001. Сравнение Соединения 33, Эксендин-4, комбинации Эксендин-4(1-39) и h[Leu15]Гастрин-17 и носителя соответственно; n = 16-19 в группе.
Фиг. 6. Содержание панкреатического инсулина у мышей. Данные обрабатывали с применением критерия Крускала-Уоллиса с последующим множественным сравнением с применением критерия Дан-на, **р <0.01. Сравнение Соединения 33, Эксендин-4, комбинации Эксендин-4(1-39) и h[Leu15]Гастрин-17 и носителя соответственно; n = 16-19 в группе.
Фиг. 7. Д-HbAlc у мышей. Данные обрабатывали с применением критерия Крускала-Уоллиса с последующим множественным сравнением с применением критерия Данна, **р <0.01, ***р <0.001. Сравнение Соединения 33, Эксендина-4, комбинации Эксендин-4(1-39) и h[Leu15]Гастрин-17 и носителя соответственно; n = 16-19 в группе.
Фиг. 8. Д-С-пептида в плазме у мышей. Данные обрабатывали с применением критерия Крускала-Уоллиса с последующим множественным сравнением с применением критерия Данна, *р < 0.05. Сравнение Соединения 33, Эксендин-4, комбинации Эксендин-4(1-39) и h[Leu15]Гастрин-17 и носителя соответственно; n = 16-19 в группе.
Фиг. 9. Влияние подкожного введения Эксендин-4, Лираглутида или Соединения 33 на переносимость глюкозы по результатам измерения площади под кривой (AUC) после на грузки глюкозой мышей db/db. Применяли три режима введения (А) Профилактика, (Б) Лечение или (С) Каникулы. Данные представлены в виде среднего и SEM (n= 8-13/группа). Статистика: Данные сравнивали с применением двух-факторного анализа АНОВА с после дующей поправкой Бонферрони: *р <0.05; **р <0.01; ***р <0.001 против носителя.
Фиг. 10. Влияние подкожного введения Эксендин-4, Лираглутида или Соединения 33 на уровень глюкозы в крови натощак через 8 ч после последнего приема пищи у мышей db/db. Применяли три режима введения (А) Профилактика, (Б) Лечение или (С) Каникулы. Данные представлены в виде среднего и SEM (^8-13/группа). Статистика: данные сравнивали с применением двухфакторного анализа АНОВА
с последующей поправ кой Бонферрони: *р <0.05; "р <0.01; ***р <0.001 против носителя.
Фиг. 11. Влияние подкожного введения Эксендин-4, Лираглутида или Соединения 33 на конечные значения (93 день) уровня (А) С-пептида в плазме, (Б) инсулина в плазме или (С) HbAl с (%).Данные представлены в виде среднего и SEM (^8-13/группа). Статистика: Данные сравнивали с использованием однофакторного анализа АНОВА, теста Крускала-Уоллиса с последующим анализом Данна: ***р <0.001, **р <0.01, *р <0.05 простив носителя.
Подробное описание изобретения
Как уже показано выше, один аспект настоящего изобретения относится к пептидному конъюгату, имеющему формулу
Эксендин-4( 1 -3 9)-Peg3 -Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (1)
Эксендин-4(1 -3 9)-[Gln1 ,Leu15]Гастрин-17, (2)
Эксендин-4(1-39)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (3)
Эксендин-4(l-39)-ААА-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (4)
Эксендин-4(1-39)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (5)
Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (6)
Эксендин-4(1 -3 9)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (7)
Эксендин-4(1 -3 9)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (8)
Эксендин-4(1 -3 9)-8Аос-8Аос-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (9)
Эксендин-4(1-39)-[Leu4]Гастрин-6, (10)
Эксендин-4(1-39)-К-[Leu4]Гастрин-6, (11)
Эксендин-4(1 -3 9)-ААА-[Leu4]Гастрин-6, (12)
Эксендин-4(1 -3 9)-8KK-[Leu4]Гастрин-6, (13)
Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -SKK-[Leu4]Гастрин-6, (14)
Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6, (15)
Эксендин-4(1 -3 9)-8Аос-8KK-[Leu4]Гастрин-6, (16)
Эксендин-4(1 -3 9)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (17)
Эксендин-4(1 -3 9)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин-6, (18)
Эксендин-4(l-28)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (19)
Эксендин-4(l-28)-К-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (20)
Эксендин-4(l-28)-ААА-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (21)
Эксендин-4(1 -28)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (22)
Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (23)
Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]гастрин-17, (24)
Эксендин-4(1-28)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (25)
Эксендин-4(1 -28)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (26)
Эксендин-4(l-28)-8Аос-8Аос-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (27)
Эксендин-4(l-28)-[Leu4]Гастрин-6, (28)
Эксендин-4(l-28)-К-[Leu4]Гастрин-6, (29)
Эксендин-4(l-28)-ААА-[Leu4]Гастрин-6, (30)
Эксендин-4(l-28)-8KK-[Leu4]Гастрин-6, (31)
Эксендин-4(l-28)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (32)
Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]гастрин-6, (33)
Эксендин-4(l-28)-8Аос-8КК-[Leu4]гастрин-6, (34)
Эксендин-4(l-28)-DBF-SKK-[Leu4]]гастрин-6, (35)
Эксендин-4(1-28)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин-6, (36)
GLP-1 (7-36)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (37)
GLP-1 (7-36)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (38)
GLP-1 (7-36)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (39)
GLP-1 (7-36)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (40)
GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (41)
GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (42)
GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (43)
GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (44)
GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, (45)
GLP-1 (7-36)-[Leu4]Гастрин-6, (46)
GLP-1 (7-36)-K-[Leu4]Гастрин-6, (47)
GLP-1 (7-36)-AAA-[Leu4]Гастрин-6, (48)
GLP-1 (7-36)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (49)
GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (50)
GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6, (51)
GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Leu4]Гастрин-6, (52)
GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6 (53) или
GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Leu4]Гастрин-6, (54).
При этом каждая из пептидных групп Эксендин-4(1-39), Эксендин-4(1-28) и GLP-1 (7-36) ковалент-но соединена с оставшейся частью соответствующей молекулой конъюгата через ее С-конец, и каждая из пептидных групп [Gln1,Leu15]Гастрин-17 и [Leu4]Гастрин-6 ковалентно соединена с оставшейся частью соответствующей молекулы конъюгата через ее N-конец;
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к пептидному конъюгату, имеющему формулу
Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu3]Гастрин-5 (55)
Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3-[Ala1,Leu4]гастрин-6 (56)
Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Ala2,Leu4]гастрин-6 (57)
Эксендин-4(l-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (58)
Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu2]гастрин-4 (59)
[Leu14] Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3 -[Leu4]Гастрин-6 (60)
[Orn12] Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3-[Leu4]гастрин-6 (6l)
[ОГП27] Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3-[Leu4]гастрин-6 (62)
[phe25]]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (63)
[Asp28] Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3 -[Leu4]Гастрин-6 (64)
[тyr13]Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (65)
[Orn20] Эксендин-4( 1 -28)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (66)
Эксендин-4(1-28)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (67)
Эксендин-4(l-28)-[Leu4]гастрин-6 (68)
Эксендин-4(l-27)-[Leu4]гастрин-11 (69)
Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (70)
Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leuз]гастрин-5 (71)
Эксендин-4(l-26)-Peg3-[Leu3]гастрин-5 (72)
Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu2]гастрин-4 (73)
[Tyr13 ,Leu14] Эксендин-4(1 -27)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (74)
[тyr13,Phe25]]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]]гастрин-6 (75)
|Leu14,Phe25]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (76)
[тyr13,Leu14,Phe25]Эксендин-4(l-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (77)
Боковая цепь-цикло([Lys12,Glu16]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (78)
Боковая цепь-цикло([Glu16,Lys20]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (79)
Боковая цепь-цикло([Lys20,Glu24]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (80)
[Lys16] Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3 -[Leu4]Гастрин-6 (81)
Эксендин-4(1-28)-Peg3-K-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (82)
Эксендин-4(1-28)-[Т^4]Гастрин-6 (83)
Эксендин-4(l-28)-[phe4]]Гастрин-6 (84)
[Leu14] Эксендин-4(1 -28)-[1Nal3 ,Leu4]Гастрин-6 (85)
[Leu14] Эксендин-4(1 -28)-[Nle4]Гастрин-6 (86)
[Leu14] Эксендин-4(1 -28)-[Leu4, [3 -(3 -пиридил)-Ala]6]Гастрин-6(87)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6(88)
[Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4,Pheз]гастрин-6(89)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4,Phe3]Гастрин-6 (90)
[Arg27,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (9l)
[Arg12,27,Leu14,Lys16,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6(92)
[Arg12,27,Leu14,Lys20,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu4]гастрин-6(9з)
[Arg12,27,Leu14,Lys24,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu4]гастрин-6(94)
[Arg12,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (95)
[Glu9,Leu14,Phe25,TyR13]Эксендин-4(1-27)-[Leu2]Гастрин-4 (96)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu2]Гастрин-4 (97)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Peg3-[Leu2]Гастрин-4 (98)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-Orn-[Leu2]гастрин-4 (99)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Om-[Leu2]Гастрин-4 (100)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-[Leu4]Гастрин-6 (101)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (102)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (103)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-Orn-[Leu4]гастрин-6 (104)
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Om-[Leu4]Гастрин-6 (105)
[Lys(Гексадеканоил-изоGlu)34] GLP-1 (7-37)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (106)
[Arg34,Lys(Гексадеканоил-изоGlu)26] GLP-1 (7-37)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (107)
[Arg26,34,Lys(Гексадеканоил-изоGlu)36]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (108)
[Lys(Гексадеканоил-изоGlu)26] GLP-1 (7-37)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (109) [Arg26,34,Gly8,Lys(Гексадеканоил-изоGlu)36]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (110) [Aib8,Arg34,Lys(Гексадеканоил-изоGlu)26]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (111) [Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (112) [Arg34]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (113) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
Приведенные выше формулы для пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению, которые записаны с использованием традиционных и широко используемых сокращений/обозначений для различных рассматриваемых пептидных групп [т.е. Эксендин-4(1-39), Эксендин-4(1-28) и GLP-1(7-36)] могут быть записаны в виде традиционной полной аминокислотной последовательности, как представлено ниже (линкерные группы выделены жирным шрифтом)
(SEQ ID NO: 1) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-Peg3-Peg3-QGPWLE-EEEEAYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 2) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSQGPWLEEEEEAYG-
WLDF-NH2 (без линкера)
(SEQ ID NO: 3) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-K-QGPWLEEEEE-
AYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 4) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-AAA-QGPWLEEE-
EEAYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 5) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-SKK-QGPWLEEEEE-
AYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 6) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-Peg3-SKK-QGPWLE-
EEEEAYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 7) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-8Aoc-SKK-QGPWLE-
EEEEAYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 8) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-DBF-SKK-QGPWL-
EEEEEAYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 9) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-8Aoc-8Aoc-QGPWL-EEEEEAYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 10) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSYGWLDF-NH2 (без линкера)
(SEQ ID NO: 11) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-K-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 12) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-AAA-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 13) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-SKK-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 14) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-Peg3-SKK-YGW-
LDF-NH2
(SEQ ID NO: 15) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-Peg3-Peg3-YGWL-
DF-NH2
(SEQ ID NO: 16) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-8Aoc-SKK-YGWL-
DF-NH2
(SEQ ID NO: 17) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-DBF-SKK-YGWL-
DF-NH2
(SEQ ID NO: 18) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-8Aoc-8Aoc-YGW-
LDF-NH2
(SEQ ID NO: 19) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNQGPWLEEEEEAYGWLDF-NH2 (без
линкера)
(SEQ ID NO: 20) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-K-QGPWLEEEEEAYGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 21) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-AAA-QGPWLEEEEEAYGWLDF-
NH2
(SEQ ID NO: 22) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-SKK-QGPWLEEEEEAYGWLDF-
NH2
(SEQ ID NO: 23) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-SKK-QGPWLEEEEEAYGW-
LDF-NH2
(SEQ ID NO: 24) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-QGPWLEEEEEAYGW-LDF-NH2
(SEQ ID NO: 25) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-8Aoc-SKK-QGPWLEEEEEAYGW-
LDF-NH2
(SEQ ID NO: 26) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-DBF-SKK-QGPWLEEEEEAYGW-
LDF-NH2
(SEQ ID NO: 27) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-8Aoc-8Aoc-QGPWLEEEEEAYG-WLDF-NH2
(SEQ ID NO: 28) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-YGWLDF-NH2 (без линкера)
(SEQ ID NO: 29) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-K-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 30) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-AAA-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 31) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-SKK-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 32) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-SKK-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 33) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 34) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-8Aoc-SKK-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 35) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-DBF-SKK-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 36) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-8Aoc-8Aoc-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 37) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRQGPWLEEEEEAYGWLDF-NH2
(без линкера)
(SEQ ID NO: 38) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-K-QGPWLEEEEEAYGWLDF-
NH2
(SEQ ID NO: 39) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-AAA-QGPWLEEEEEAYGWLDF-
NH2
(SEQ ID NO: 40) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-SKK-QGPWLEEEEEAYGWLDF-
NH2
(SEQ ID NO: 41) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-Peg3-SKK-QGPWLEEEEE-
AYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 42) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-Peg3-Peg3-QGPWLEEEEEA-
YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 43) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-8Aoc-SKK-QGPWLEEEEEA-
YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 44) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-DBF-SKK-QGPWLEEEEEA-
YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 45) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-8Aoc-8Aoc-QGPWLEEEEE-AYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 46) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRYGWLDF-NH2 (без линкера) (SEQ ID NO: 47) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-K-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 48) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-AAA-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 49) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-SKK-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 50) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-Peg3-SKK-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 51) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 52) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-8AocSKK-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 53) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-DBF-SKK-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 54) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-8Aoc-8Aoc-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 55) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-GWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 56) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-AGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 57) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-YAWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 58) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 59) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-WLDF-NH2 (SEQ ID NO: 60) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 61) H-HGEGTFTSDLS-Orn-QMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 62) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWL-Orn-N-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 63) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEFLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 64) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKD-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 65) H-HGEGTFTSDLSKYMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 66) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAV-Orn-LFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 67) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 68) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNYGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 69) H-HGEGTFTSDLSKQ EEEAVRLFIEWLKEEEEAYGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 70) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 71) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK-Peg3-GWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 72) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWL-Peg3-GWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 73) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK-Peg3-WLDF-NH2
(SEQ ID NO: 74) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFIEWLK-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 75) H-HGEGTFTSDLSKYMEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 76) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 77) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 78) H-HGEGTFTSDLS-K()-QME-E()-EAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 79) H-HGEGTFTSDLSKQME-E()-EAV-K()-LFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 80) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAV-K()-LFI-E()-WLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 81) H-HGEGTFTSDLSKQMEKEAVRLFIEWLKN-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 82) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKN-Peg3-K-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 83) H-HGEGTFTSDLSKQEEEAVRLFIEWLKNYGWTDF-NH2 (SEQ ID NO: 84) H-HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNYGWFDF-NH2
(SEQ ID NO: 85) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNYG-1Nal-LDF-NH2 (SEQ ID NO: 86) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNYGW-Nle-DF-NH2 (SEQ ID NO: 87) H-HGEGTFTSDLSKQLEEEAVRLFIEWLKNYGWLD-[3-(3-пиридил)-aланил]-
NH2
(SEQ ID NO: 88) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 89) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Peg3-YGFLDF-NH2 (SEQ ID NO: 90) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Peg3-YGFLDF-NH2
(SEQ ID NO: 91) H-HGEGTFTSDLSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 92) H-HGEGTFTSDLSRYLEKEAVRLFIEFLR-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 93) H-HGEGTFTSDLSRYLEEEAVKLFIEFLR-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 94) H-HGEGTFTSDLSRYLEEEAVRLFIKFLR-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 95) H-HGEGTFTSDLSRYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 96) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLKWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 97) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-WLDF-NH2
(SEQ ID NO: 98) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Orn-Peg3-WLDF-NH2
(SEQ ID NO: 99) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Orn-WLDF-NH2
(SEQ ID NO: 100) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Orn-Orn-WLDF-NH2
(SEQ ID NO: 101) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLKYGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 102) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 103) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Orn-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 104) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Peg3-Orn-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 105) H-HGEGTFTSELSKYLEEEAVRLFIEFLK-Orn-Orn-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 106) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAA-K(Гексадеканоил-изоGlu)-GRG-Peg3-Peg3-YGW-
LDF-NH2
(SEQ ID NO: 107) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAA-K(Гексадеканоил-изоGlu)-EFIAWLVRGRG-Peg3-
Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 108) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVRG-K(Гексадеканоил-изоGlu)-G-Peg3-
Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 109) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAA-K(Гексадеканоил-изоGlu)-EFIAWLVKGRG-
Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 110) H-HGEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVRG-K(Гексадеканоил-изоGlu)-G-Peg3-
Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 111) H-H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAA-K(Гексадеканоил-изоGlu)-EFIAWLVRGRG-
Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2
(SEQ ID NO: 112) H-H-Aib-EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2 (SEQ ID NO: 113) H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG-Peg3-Peg3-YGWLDF-NH2, при этом сокращения Peg3, 8Aoc, DBF, 1 Nal, bAla, Orn, DPR, Dbu, Gaba и Aib обозначают следующие не встречающиеся в природе аминокислотные группы:
Peg3: -NH-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-C(0)- (получен от 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты); 8Аос: -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)- (получен от 8-аминооктановой кислоты);
DBF:
[получен от 4-(2-аминоэтил)-6-дибензофуранпропановой кислоты];
1 Nal: 1-нафтилаланин
bAla: бета-аланин
Gaba: у-аминобутановая кислота
Aib: а-аминоизобутановая кислота
Dbu: диаминобутановая кислота
DPR: диаминопропионовая кислота
Orn: орнитин
Таким образом, принимая во внимание расположение линкерной группы в пептидном конъюгате согласно настоящему изобретению, линкерная группа -Peg3-Peg3-, например, обозначает следующую химическую группу:
-NH-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-C(0)-,
при этом группа -NH- слева от рассматриваемой линкерной группы, ковалентно присоединенная
к группе, полученной от эксендин-4- или GLP-1-рассматриваемого пептидного конъюгата, и группа... -С(О)- справа от рассматриваемой линкерной группы, присоединенная к группе, полученной от гастрина, рассматриваемого пептидного конъюгата. В оставшихся обозначенных линкерных группах -K- обозначает остаток аминокислоты лизина, -ААА- обозначает трипептидный остаток -Ala-Ala-Ala-, и -SKK- обозначает трипептидный остаток -Ser-Lys-Lys-.
Следует понимать, что в некоторых пептидных конъюгатах согласно настоящему изобретению, перечисленных выше, группа пептидной последовательности GLP-1 (7-36) получается от последовательности GLP-1 человека (hGLP-1) или его аналога. Следует понимать, что в некоторых пептидных конъюга-тах согласно настоящему изобретению, перечисленных выше, группа пептидной последовательности Эксендин-4(1-39) получена от последовательности Эксендин-4 Heloderma suspectum или представляет собой ее аналог.
Аналогично группы [Gln1,Leu15]Гастрин-17 и [Leu4]Гастрин-6 в указанных конъюгатах получены от гастрина человека.
Следует понимать, что SEQ ID NO: 1 равнозначна Соединению 1, SEQ ID NO: 2 равнозначна Соединению 2 и т.д.
Следует понимать, что каждый из указанных выше пептидных конъюгатов 1-54 по от дельности, т.е. соединение 1, или соединение 2, или соединение 3 (и т.д. до соединения 54) и, кроме того, каждый из пептидных конъюгатов 55-113, перечисленных ниже (см. табл. 2 и 3 в примере 2), по отдельности, т.е. соединение 55 или соединение 56 ... (и т.д. до соединения 113) или его фармацевтически приемлемая соль или сольват, составляют также отдельный аспект настоящего изобретения.
В контексте настоящего изобретения, если аминокислоты не обозначены с помощью их полного наименования (например, аланин, аргинин и т.д.), они обозначены с помощью своих традиционных трехбуквенных и/или однобуквенных сокращений (например, Ala или А для аланина, Arg или R для аргинина и т.д.).
Термин "пептидный конъюгат" в контексте настоящего изобретения обозначает молекулу, в которой первая пептидная группа присоединена (т.е. связана или соединена) непосредственно или с помощью линкерной химической группы (т.е. мостика или спейсера) посредством ковалентной химической связи со второй пептидной группой. Соединения согласно настоящему изобретению могут нести один или несколько внутримолекулярных лактамных колец в пептидной последовательности. Каждый такой мостик в соединениях, перечисленных в табл. 2 (обозначенный с помощью приставки "боковая цепь-цикло"), образуется между боковой цепью, содержащей карбоновую кислоту, и другой боковой цепью, содержащей амин. Два аминокислотных остатка обычно разделены тремя аминокислотами в линейной последовательности.
В пептидных конъюгатах согласно настоящему изобретению эксендин-4 или Za может совпадать по меньшей мере на 75% с природным эксендин-4, например, по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95%.
В пептидных конъюгатах согласно настоящему изобретению гастрин или Ya может совпадать по меньшей мере на 70% с природным гастрином, например, по меньшей мере на 75, 80, 85, 90 или 95%. В пептидных конъюгатах согласно настоящему изобретению GLP-1 или Xa может совпадать по меньшей мере на 85% с природным GLP-1, например, по меньшей степени на 90 или 95%.
Согласно одному варианту реализации полипептид согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, представленную на одной из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 и 113 или ее функциональный фрагмент/вариант, который по меньшей мере приблизительно на 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99,5% совпадает с одной или несколькими указанными последовательностями или их функциональными фрагментами/вариантами, которая имеет не более чем 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замену аминокислот по сравнению с одной или несколькими указанными последовательностями, без сигнальной последовательности или с ней, без замены одного или нескольких остатков цистеина на другой остаток, такой как се-рин, или с ней, и их непрерывными сегментам, имеющими по меньшей мере 2 аминокислотных остатка в длину.
Согласно одному варианту реализации полипептид согласно настоящему изобретению (i) совпадает по аминокислотной последовательности по меньшей мере на 99% с одной из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 и 113, или ее частью; или (ii) содержит по меньшей мере 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 непрерывных аминокислот любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,
75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 и 113; или (iii) и то, и другое.
Термин "фармацевтически приемлемая соль" в контексте настоящего изобретения (фармацевтически приемлемая соль пептидного конъюгата согласно настоящему изобретению) обозначает соль, которая является безопасной для пациента или человека, которому вводят указанную соль. Она может представлять собой соль, выбранную из кислотно-аддитивных солей и основных солей. Примеры кислотно-аддитивных солей включают хлориды, цитраты и ацетаты. Примеры основных солей включают соли, в которых катион выбирают среди щелочных металлов, таких как ионы натрия или калия, катионов ще-лочно-земельных металлов, таких как кальций или магний, а также ионы аммония, такие как ионы типа N(R1)(R2)(R3)(R4)+, где Rl, R2, R3 и R4 независимо обычно обозначают водород, возможно замещенный С1-6 алкил или возможно замещенный С2-6 алкенил. Примеры C1-6 алкильных групп включают метил, этил, 1-пропил и 2-пропил. Примеры важных С2-6 алкенильных групп включают винил, 1-пропенил и 2-пропенил. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей описываются в публикации 17 издания "Remington's Pharmaceutical Sciences", Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (и ее более ранних изданиях), в третьем издании "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, и J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977).
Термин "сольват" в контексте настоящего изобретения обозначает комплекс с определен ной стехиометрией, образованный между растворенным веществом (в данном случае, пептидным конъюгатом или фармацевтически приемлемой солью согласно настоящему изобретению) и растворителем. Растворитель в данной связи может представлять собой, например, воду, этанол или другие фармацевтически приемлемые, обычно с малым молекулярным весом органические вещества, такие как, но не ограничиваясь ими, уксусная кислота или молочная кислота. Если рассматриваемый растворитель представляет собой воду, то сольват обычно обозначают термином гидрат.
Другой аспект настоящего изобретения относится к пептидному конъюгату или его фармацевтически приемлемой соли согласно настоящему изобретению, для применения в качестве лекарственного средства. Согласно другому аспекту рассматриваемое лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для применения при излечении пациента, нуждающегося в этом, от одного из следующих заболеваний или нарушений или связанных состояний: сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа, предиабет, синдром инсулинорезистентности, нарушение толерантности к глюкозе (IGT), болезненные состояния, связанные с повышенным уровнем глюкозы в крови, гипергликемия, гипертензия, атерогенная дислипидемия, артериосклероз (например, атеросклероз), ишемическая болезнь сердца, заболевание периферических артерий, инсульт, микроангиопатия, желудочное заболевание, метаболический синдром, рак (например, рак толстой кишки), воспалительная болезнь кишечника (ВБК) и синдром раздраженного кишечника (СРК).
Другие заболевания или нарушения, имеющие возможную актуальность в этой связи, включают ожирение, патологическое ожирение, воспаление, вызванное ожирением, вы званные ожирением заболевания желчного пузыря и апноэ сна, вызванное ожирением. Согласно еще одному аспекту указанное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для применения для индуцирования у пациента, нуждающегося в этом, неогенеза островков поджелудочной железы (например, для содействия формированию новых р-клеток в островках поджелудочной железы).
Согласно еще одному аспекту указанное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для применения для индуцирования у пациента, нуждающегося в этом, выживания р-клеток в островках поджелудочной железы (например, для предотвращения потери р-клеток в островках поджелудочной железы).
Согласно еще одному аспекту указанное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для применения для предотвращения у пациента, нуждающегося в этом, апоптоза р-клеток в островках поджелудочной железы (например, для предотвращения потери р-клеток в островках поджелудочной железы).
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения указанное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для применения для понижения у пациента, нуждающегося в этом, уровней гемоглобина Ь1АС (гликозилированного гемоглобина; HbAlG) в крови.
Согласно еще одному своему аспекту настоящее изобретения относится к пептидному конъюгату согласно настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения пациента, нуждающегося в этом, от одного или нескольких следующих состояний, заболеваний или нарушений: сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа, предиабет, синдром инсулинорезистентности, нарушение толерантности к глюкозе (IGT), болезненные состояния, связанные с повышенным уровнем глюкозы в крови, гипергликемия, гипертензия, атерогенная дислипидемия, артериосклероз (например, атеросклероз), ишемическая болезнь сердца, заболевание периферических артерий, инсульт, микроангиопатия, желудочное заболевание, метаболический синдром, рак (например, рак толстой кишки), воспалительная болезнь кишечника (ВБК) и синдром раздраженного кишечника (СРК).
Пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению можно применять для
изготовления лекарственного средства для индуцирования неогенеза островков поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в этом;
изготовления лекарственного средства для предотвращения апоптоза р-клеток в островках поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в этом; или
изготовления лекарственного средства для снижения уровней гемоглобина HbAc (гликозилирован-ного гемоглобина; HbA1c) в крови пациента, нуждающегося в этом.
Среди других родственных аспектов дополнительные аспекты настоящего изобретения представляют собой соответствующие способы лечения состояний, заболеваний или нарушений, кроме указанных выше. Таким образом, один такой дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу лечения пациента, нуждающегося в этом, от одного или нескольких следующих заболеваний или нарушений:
сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа, предиабет, синдром инсулинорезистентности, нарушение толерантности к глюкозе (IGT), болезненные состояния, связанные с повышенным уровнем глюкозы в крови, гипергликемия, гипертензия, атерогенная дислипидемия, артериосклероз (например, атеросклероз), ишемическая болезнь сердца, заболевание периферических артерий, инсульт, микроан-гиопатия, желудочное заболевание, метаболический синдром, рак (например, рак толстой кишки), воспалительная болезнь кишечника (ВБК) и синдром раздраженного кишечника (СРК),
указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению.
Кроме того, другие возможные актуальные состояния, заболевания или нарушения в контексте способов лечения согласно настоящему изобретению включают ожирение, патологическое ожирение, воспаление, вызванное ожирением, болезнь желчного пузыря, вызванную ожирением, и вызванное ожирением апноэ сна.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу индуцирования неогенеза островков поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в этом, указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу обеспечения выживания р-клеток в островках поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в этом, указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу снижения или предотвращения апоптоза р-клеток в островках поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в этом, указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или фармацевтически приемлемой соли или ее сольвата согласно настоящему изобретению.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу снижения уровней гемоглобина Ь1АС (гликозилированный гемоглобин; HbA1c) в крови пациента, нуждающегося в этом, указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению.
Другие аспекты настоящего изобретения относятся к следующему:
способ лечения пациента, нуждающегося в этом, от болезненного состояния, вызванного повышенными уровнями глюкозы;
способ снижения уровней глюкозы у пациента, нуждающегося в этом; способ стимуляции высвобождения инсулина у пациента, нуждающегося в этом; способ регуляции опорожнения желудка у пациента, нуждающегося в этом; и способ снижения уровней липидов в плазме у пациента, нуждающегося в этом.
В каждом из последних способов согласно настоящему изобретению указанный способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата согласно настоящему изобретению.
Термин "терапевтически эффективное количество" при использовании в контексте описанных выше способов лечения или других терапевтических вмешательств в соответствии с изобретением относится к количеству, достаточному для того, чтобы вылечить, улучшить, облегчить или частично остановить клинические проявления определенного заболевания, расстройства или состояния, которое является объектом лечения или другого рассматриваемого терапевтического вмешательства. Количество, достаточное для достижения этой цели, определяется как терапевтически эффективное количество. Вводимое количество и способ введения можно адаптировать для достижения оптимальной эффективности. Эффективное для данной цели количество будет зависеть, в частности, от тяжести заболевания, расстройства или состояния, которое является объектом определенного лечения или другого терапевтического вмешательства, веса тела и общего состояния рассматриваемого пациента, питания, возможного сопутствующего лечения и от других факторов, хорошо известных специалистам в данной области медицины. Определить
подходящий размер дозы и режим дозирования, наиболее подходящие для введения пептидного конъю-гата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата в соответствии с изобретением человеку, можно, руководствуясь результатами, полученными с помощью настоящего изобретения, и их можно подтвердить в ходе правильно разработанных клинических испытаний. Эффективную дозу и протокол лечения можно определить с помощью традиционных способов, начиная с низкой дозы на лабораторных животных, а затем увеличивая дозу, контролируя при этом эффекты, а также систематически изменяя режим дозирования. Многочисленные факторы могут быть приняты во внимание врачом при определении оптимальной дозировки для данного объекта. Такие соображения хорошо известны специалисту в данной области.
Термины "лечение" и его грамматические варианты (например, "излечиваемый", "лечение", "лечить") при употреблении в данном контексте относятся к подходу для получения полезных или желаемых клинических результатов. Для целей настоящего изобретения, полезные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, облегчение симптомов, снижение степени заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния заболевания, задержку или замедление прогрессирова-ния заболевания, улучшение или временное улучшение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), как заметную, так и незаметную. "Лечение" может также обозначать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни в отсутствие лечения. "Лечение" в некоторых вариантах реализации изобретения может представлять собой вмешательство, которое осуществляется с целью предупреждения развития или изменения патологии состояния, заболевания или расстройства. Соответственно, термин "лечение" может относиться как к терапевтическому вмешательству, так и к профилактическим или превентивным мерам. Субъект (например, человек), нуждающийся в лечении, таким образом, может представлять собой субъекта, который уже страдает от болезни или расстройства, о котором идет речь, или субъекта, у которого следует предотвратить расстройство. Термин "лечение", таким образом, включает подавление или снижение усиления тяжести патологического состояния или симптомов (например, увеличения веса или гипергликемии) по сравнению с отсутствием лечения и не обязательно должно означать полное прекращение соответствующего заболевания, расстройства или состояния.
Термин "агонист" в контексте настоящего изобретения обозначает вещество (лиганд), которое активирует тип рецептора, о котором идет речь.
Термин "агонист рецептора GLP-1" в контексте настоящего изобретения обозначает вещество (ли-ганд) (иногда обозначаемый как "агонист GLP-1"), которое активирует рецептор GLP-1, такой как рецептор GLP-1 человека. Вещества, которые активируют рецептор GLP-1 человека, включают природные пептидные гормоны GLP-1 GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36)амид, оксинтомодулин, эксендин-3, эксендин-4, глюкагон, желудочный ингибиторный полипептид (GIP) и их функциональные аналоги и производные.
Термин "антагонист" при употреблении в контексте настоящего изобретения относится к веществу (лиганду), которое блокирует, нейтрализует или противодействует влиянию другого вещества (лиганда), которое функционирует как агонист по отношению к рассматриваемому типу рецептора.
В контексте настоящего изобретения пациент, который нуждается в определенном лечении или другом терапевтическом вмешательстве, упомянутый в связи с различными аспектами настоящего изобретения, описанными выше, предпочтительно представляет собой млекопитающее и, более точно, человека.
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват согласно настоящему изобретению вместе с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или основой.
Синтез пептидных конъюгатов
Пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены с помощью стандартных методов синтеза, посредством применения систем рекомбинантной экспрессии или с помощью любого другого подходящего метода. Таким образом, конъюгаты можно синтезировать различными способами, включая, например, способ, который включает:
(а) синтез пептидного конъюгата посредством стандартной твердофазной или жидкостно-фазной
методики, как поэтапно, так и с помощью сборки фрагментов и выделения и очистки конечного продукта
пептидного конъюгата;
(б) экспрессию конструкции нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептидный конъюгат, в клет-
ке-хозяине и выделение продукта экспрессии из культуры клеток-хозяина; или
(в) осуществления экспрессии конструкции нуклеиновой кислоты, которая кодирует пептидный
конъюгат, in vitro в бесклеточной системе и очистку продукта экспрессии;
или любую комбинацию способов (а), (б) или (в) для получения фрагментов пептидного конъюгата, последующего лигирования фрагментов для получения пептидного конъюгата и выделения пептидного конъюгата.
Часто может быть предпочтительно синтезировать конъюгаты согласно настоящему изобретению с помощью твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза. В связи с этим можно привести в качестве ссылки публикацию WO 98/11125 или, в том числе, Fields G.B. et al. "Principles and Practice of Solid-
Phase Peptide Synthesis"; в Synthetic Peptides, Gregory A. Grant (ed.), Oxford University Press (2 издание, 2002) и примеры синтеза в них.
Одна или несколько боковых аминокислотных цепей в соединении согласно настоящему изобретению могут быть также конъюгированы с липофильным заместителем. Указанный липофильный заместитель может быть ковалентно связан с атомом в боковой цепи аминокислоты или в другом случае может быть конъюгирован с боковой цепью аминокислоты с помощью спейсера. Аминокислота может представлять собой часть пептида Z или часть пептида Y.
Не желая быть связанным теорией, считается, что липофильный заместитель связывает альбумин в кровотоке, защищая, таким образом, соединения согласно настоящему изобретению от ферментативного разрушения, что повышает период полураспада соединений. Спейсер при наличии используется для обеспечения интервала между соединением и липофильным заместителем.
Указанный липофильный заместитель может быть присоединен к боковой аминокислот ной цепи или спейсеру в виде сложного эфира, сульфонового эфира, тиоэфира, амида или сульфонамида. Соответственно, будет ясно, что предпочтительно липофильный заместитель включает ацильную группу, суль-фонильную группу, атом N, атом О или атом S, который образует часть сложного эфира, тиоэфира, амида или сульфонамида. Предпочтительно ацильная группа в липофильных заместителях образует часть амида или сложного эфира с боковой цепью аминокислоты или спейсером.
Липофильный заместитель может включать углеводородную цепь, включающую 4-30 атомов. Предпочтительно она имеет по меньшей мере 8 или 12 атомов С, и предпочтительно она имеет 24 атомов С или меньше или 20 атомов С или меньше. Углеводородная цепь может быть линейной или разветвленной или может быть насыщенной или ненасыщенной. Будет ясно, что предпочтительно углеводородная цепь замещена на группу, которая образует часть присоединения к боковой цепи аминокислоты или спейсера, например, ацильную группу, сульфонильную группу, атом N, атом О или атом S. Наиболее предпочтительно углеводородная цепь замещена на ацил и соответственно углеводородная цепь может представлять собой часть алкильной группы, например, пальмитил, капроил, лауроил, миристоил или стеароил.
Соответственно, указанный липофильный заместитель может иметь формулу, показанную ниже
Липофильный заместитель может представлять собой, например, ацильную группу, сульфониль-ную группу, NH, N-алкил, атом О или атом S, предпочтительно ацил. n представляет собой целое число от 3 до 29, предпочтительно по меньшей мере 7 или по меньшей мере 11 и предпочтительно 23 или меньше или более предпочтительно 19 или меньше. Углеводородная цепь может быть дополнительно замещена. Например, она может дополнительно иметь до трех заместителей, выбранных из NH2, ОН и СООН. Если углеводородная цепь является дополнительно замещенной, предпочтительно она дополнительно замещена только одним заместителем. В другом случае углеводородная цепь может включать циклоалкан или гетероциклоалкан, например, показанный ниже
Предпочтительно циклоалкан или гетероциклоалкан представляет собой шестичленное кольцо. Более предпочтительно он представляет собой пиперидин.
В другом случае липофильный заместитель может иметь в основе остов циклопентанофенантрена, который может быть частично или полностью ненасыщенным или насыщенным. Каждый атом углерода в остове может быть замещен Me или ОН. Например, липофильный заместитель может представлять собой холил, дезоксихолил или литохолил. Как упомянуто выше, липофильный заместитель может быть конъюгирован с боковой цепью аминокислоты с помощью спейсера. При наличии, спейсер присоединен к липофильному заместителю и к боковой цепи аминокислоты. Спейсер может быть присоединен к ли-пофильному заместителю и боковой цепи аминокислоты независимо в виде сложного эфира, сульфони-лового эфира, тиоэфира, амида или сульфонамида. Соответственно, он может включать две группы, независимо выбранные из ацила, сульфонила, атома N, атома О или атома S. Спейсер может иметь следующую формулу:
При этом каждый из В и D независимо выбирают из ацила, сульфонила, NH, N-алкила, атома О или атома S, предпочтительно из ацила и NH. Предпочтительно n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5. Спейсер может быть возможно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из С0-6 алкила, С0-6 алкиламина, С0-6 гидроксиалкила и С0-6 карбоксиалкила.
В другом случае спейсер может иметь две или несколько повторяющихся единиц согласно формуле выше. Каждый из В, D и п выбирают независимо для каждой повторяющейся единицы. Смежные повторяющиеся единицы могут быть ковалентно соединены друг с другом через их соответствующие В и D группы. Например, группы В и D смежных повторяющихся единиц вместе могут образовывать сложный
эфир, сульфониловый эфир, тиоэфир, амид или сульфонамид. Свободные единицы В и D на каждом конце спейсера присоединены к боковой цепи аминокислоты и липофильному заместителю согласно описанию выше.
Предпочтительно спейсер имеет пять или меньше, четыре или меньше или три или меньше повторяющихся единиц. Более предпочтительно спейсер имеет две повторяющиеся единицы или представляет собой отдельную единицу.
Спейсер (или одна или несколько повторяющихся единиц спейсера, если он имеет повторяющиеся единицы) может представлять собой, например, природную или неприродную аминокислоту. Следует понимать, что в случае аминокислот, имеющих функциональные боковые цепи, В и/или D могут представлять собой группу в боковой цепи аминокислоты. Спейсер может представлять собой природную или неприродную аминокислоту. Например, спейсер (или одна или несколько повторяющихся единиц спейсера, если он имеет повторяющиеся единицы) может представлять собой Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, oc-Glu, y-Glu, Asp, Ser Thr, Gaba, Aib, bAla, 5-аминопента-ноил, 6-аминогексаноил, 7-аминогептаноил, 8-аминооктаноил, 9-аминонаноил или 10-аминолдеканоил.
Например, спейсер может представлять собой одну аминокислоту, выбранную среди y-Glu, Gaba, b-Ala и oc-Gly.
Липофильный заместитель может быть конъюгирован с боковой цепью аминокислоты в соединениях согласно настоящему изобретению. Предпочтительно боковая цепь аминокислоты включает карбок-си-, гидрокси-, тиол-, амидную или аминогруппу для образования сложного эфира, сульфонового эфира, тиоэфира, амида или сульфонамида со спейсером или липофильным заместителем. Например, липо-фильный заместитель может быть конъюгирован с, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Arg, Ser, Thr, Tyr, Trp, Cys или Dbu, Dpr или Orn. Предпочтительно липофильный заместитель конъюгирован с Lys или Cys. Тем не менее, любая аминокислота, обозначенная как Lys в формулах, приведенных в настоящем описании, может быть замещена на Dbu, Dpr или Orn, если добавлен липофильный заместитель. Пример липофильного заместителя и спейсера показан на формуле ниже
На ней Lys из соединения согласно настоящему изобретению (например, от X) ковалентно присоединен к y-Glu (спейсеру) через амидную группу. Пальмитил ковалентно присоединен к спейсеру y-Glu через амидную группу.
Альтернативно или дополнительно одна или несколько боковых цепей аминокислот в соединении согласно настоящему изобретению могут быть конъюгированы с полимерной группой, например, с целью увеличения растворимости и/или периода полураспада in vivo (например, в плазме) и/или биодоступности. Такие модификации, также известно, снижают клиренс (например, почечный клиренс) терапевтических белков и пептидов. Полимерная группа предпочтительно растворима в воде (амфифильная или гидрофильная), нетоксична и фармацевтически инертна. Подходящие полимерные группы включают полиэтиленгликоль (PEG), гомо- или сополимеры PEG, монометилзамещенный полимер PEG (mPEG) или полиоксиэтиленглицерин (POG) (см., например, публикации в Int. J. Hematology 68: 1 (1998); Biocon-jugate Chem. 6: 150 (1995); и Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 9: 249 (1992)).
Другие подходящие полимерные группы включают полиаминокислоты, такие как полилизин, поли-аспарагиновая кислота и полиглутаминовая кислота (см., например, публикации Gombotz, et al. (1995), Bioconjugate Chem., vol. 6: 332-351; Hudecz et al. (1992), Bioconjugate Chem., vol. 3, 49-57; Tsukada et al. (1984), J. Natl. Cancer Inst, vol. 73, 721-729; и Pratesi et al. (1985), Br. J. Cancer, vol. 52: 841-848).
Полимерная группа может быть линейной или разветвленной. Она может иметь молекулярную массу 500-40,000 Да, например, 500-10,000, 1000-5000, 10,000-20,000 или 20,000-40,000 Да.
Соединение может содержать две или более таких групп, в этом случае общая молекулярная масса всех таких групп обычно будет находиться в пределах, указанных выше. Полимерная группа может быть связана (посредством ковалентной связи) с амино, карбокси- или тиолгруппами боковой цепи аминокислоты. Предпочтительными примерами являются тиоловые группы остатков Cys и эпсилон-аминогруппы остатка Lys, и также могут быть использованы карбоксильные группы остатков Asp и Glu.
Специалист будет хорошо осведомлен о подходящих методах, которые могут быть использованы для выполнения реакции конденсации. Например, группа PEG, имеющая метоксигруппу, может быть связана с тиоловой группой Cys посредством малеимидной связи с применением реагентов, коммерчески доступных у Nektar Therapeutics AL (см. также WO 2008/101017 и ссылки, приведенные выше, для более подробного описания подходящей химии).
Терапевтические способы применения
В дальнейшем следует понимать, что ссылки на использование пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению также включают использование их фармацевтически приемлемой соли или соль-вата.
Пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению могут обеспечить привлекательный вариант лечения метаболических заболеваний или нарушений, в том числе сахарного диабета, в частности 1-го типа и/или сахарного диабета 2 типа и, возможно, ожирения.
Сахарный диабет представляет собой группу метаболических заболеваний, характеризующихся гипергликемией, возникающей в результате нарушений в секреции инсулина и/или действия инсулина. Острые симптомы диабета включают чрезмерную выработку мочи, возникающую компенсационную жажду и увеличение потребления жидкости, нарушение зрения, необъяснимую потерю веса, вялость, а также изменения в энергетическом обмене. Хроническая гипергликемия диабета связана с нарушениями макро- и микрососудов, которые могут привести к долгосрочному повреждению, дисфункции и в не которых случаях - в итоге к отказу различных органов, в частности глаз (особенно в виде диабетической ретинопатии), почек (в виде диабетической нефропатии), нервов (в виде диабетической нейропатии), сердца и кровеносных сосудов. Диабет можно разделить на три класса, а именно сахарный диабет 1 типа, сахарный диабет 2 типа и гестационный диабет, на основе их патогенетических особенностей.
Диабет 1 типа составляет 5-10% от всех случаев диабета и вызывается аутоиммунным разрушением инсулинсекретирующих панкреатических р-клеток.
Диабет 2 типа составляет 90-95% случаев диабета и является результатом сложного комплекса метаболических расстройств. Сахарный диабет 2 типа является следствием того, что продукция собственного инсулина и/или чувствительность к инсулину всего организма становится недостаточной для поддержания уровня глюкозы в плазме крови ниже диагностического порога.
Гестационный диабет обозначает любую степень толерантности к глюкозе, выявленную во время беременности.
Также признается существование состояния, известного как предиабет. Оно включает в себя, например, нарушенный уровень глюкозы натощак и нарушенную толерантность к глюкозе и, в целом, относится к тем состояниям, которые возникают, когда уровень глюкозы в крови повышен, но находится ниже уровней, установленных для клинического диагноза сахарного диабета.
Большая доля пациентов с сахарным диабетом 2 типа и предиабетом имеет повышенный риск заболеваемости и смертности в связи с высокой распространенностью дополнительных метаболических факторов риска, включая абдоминальное ожирение (избыточная жировая ткань вокруг внутренних органов брюшной полости), атерогенную дислипидемию (нарушение уровня жиров в крови, включая высокие уровни триглицеридов, низкий уровень холестерина ЛПВП и/или высокие уровни холестерина ЛПНП, что способствует образованию бляшек в стенках артерий), повышенное кровяное давление (гипертония), протромботические состояния (например, высокие уровни фибриногена или ингибитора активатора плазминогена-1 в крови) и провоспалительные состояния (например, повышенный уровень С-реактивного белка в крови).
В свою очередь, ожирение приводит к повышенному риску развития, например, предиабета, диабета 2 типа, некоторых видов рака, обструктивного апноэ сна и заболеваний желчного пузыря.
Дислипидемия связана с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) имеют клиническое значение, так как существует обратная корреляция между концентрациями ЛПВП в плазме и риском атеросклероза. Большая часть холестерина, отложенного в атеросклеротических бляшках, происходит от липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), и, следовательно, повышенные концентрации ЛПНП тесно связаны с атеросклерозом. Соотношение ЛПВП/ЛПНП параметров используется для оценки клинического риска развития атеросклероза и коронарного атеросклероза, в частности.
Без связи с какой-либо конкретной теорией, представляется, что пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению могут неожиданно сочетать физиологическое действие агонистов рецептора GLP-1 с действием пептидов гастрина, см. выше, таким образом, что наблюдаемая активность может быть значительно больше, чем при использовании соответствующей аддитивной комбинации (неконъю-гированных) отдельных пептидных компонентов. Следовательно, считается, что пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению могут быть особенно полезными при лечении предиабета, диабета (особенно сахарного диабета 1 и/или 2 типа) и вызванных диабетом состояний, болезней или расстройств, таких как те, которые рассмотрены выше, включая лечение для обеспечения образования р-клеток панкреатических островков (регенерации островков), и благодаря этому, производство инсулина, что будет полезно в отношении регуляции концентрации глюкозы в крови. Поэтому пептидные конъюга-ты согласно настоящему изобретению могут иметь значение, в частности, для ограничения или торможения прогрессирования заболевания сахарного диабета 1 и/или 2 типа.
Пептиды согласно настоящему изобретению могут дополнительно быть полезны для содействия выживанию и подавлению апоптоза р-клеток в панкреатических островках. Действие GLP-1 и гастрина включает не только воздействие на пролиферацию и созревание р-клеток, но и предотвращение апоптоза
р -клеток и повышение неогенеза, таким образом, действие пептидов согласно настоящему изобретению может включать такое действие эффекты и их влияние на улучшенную регуляцию инсулина и глюкозы. Пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению, таким образом, могут быть полезны в качестве лекарственных средств для лечения резистентности к инсулину, нарушения толерантности к глюкозе, предиабета, повышенного уровня глюкозы натощак, диабета 1 и/или 2 типа, гипертонии и/или дислипи-демии (или комбинации этих метаболических факторов риска), атеросклероза, артериосклероза, ишеми-ческой болезни сердца, заболевания периферических артерий и инсульта. Они также могут быть полезны для предотвращения набора веса, обеспечения снижения веса, снижения избыточной массы тела и/или лечения ожирения (например, контроля аппетита, питание, приема пищи, потребления калорий и/или расхода энергии), включая патологическое ожирение, а также сопутствующих заболеваний, расстройств и состояний здоровья, включая, но не ограничиваясь ими, воспаление, вызванное ожирением, заболевания желчного пузыря, вызванные ожирением, и апноэ сна, вызванное ожирением. Влияние пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению на эти условия может быть опосредовано в целом или частично влиянием на массу тела или может не зависеть от них. Фармацевтически композиции
В описании ниже следует понимать, что включение одного или нескольких пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению в фармацевтическую композицию включает также фармацевтически приемлемую соли или сольват пептидного конъюгата согласно настоящему изобретению.
Пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций, которые подходят для применения с или без хранения и которые обычно содержат терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного пептидного конъюгата согласно настоящему изобретению, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или основой.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые стандартные фармацевтические носители. Фармацевтически приемлемые носители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17-е издание, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985. Например, можно применять стерильный физиологический раствор и фосфатно-солевой буфер при слегка кислых или физиологических значениях рН. Приемлемые рН-буферные агенты могут представлять собой, например, фосфат, цитрат, ацетат, трис-(гидроксиметил)аминометан (TRIS), №трис-(гидроксиметил)метил-3-аминопропан-сульфоновая кислоту (TAPS), бикарбонат аммония, диэтаноламин, гистидин, аргинин, лизин или уксусную кислоту (например, в виде ацетата натрия) или их смеси. Термин также включает любые носители, перечисленные в Фармакопеи США для использования для животных, включая человека.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может находиться в единичной лекарственной форме. В такой форме композиция разделена на единичные дозы, содержащие соответствующие количества активного компонента или компонентов. Единичная лекарственная форма может быть представлена в виде упакованного препарата, при этом упаковка содержит дискретные количества препарата, например, упакованные таблетки, капсулы или порошки во флаконах или ампулах. Единичная лекарственная форма может представлять собой, например, капсулы, облатки или таблетки сами по себе, или она может представлять собой соответствующее количество любой из этих упакованных форм. Единичная лекарственная форма также может быть предоставлена в виде формы для инъекции одной дозы, например в форме ручки, содержащей жидкофазную композицию (обычно водную). Композиции могут быть сформулированы для любого подходящего пути и средства введения. Фармацевтически приемлемые носители или разбавители включают те, которые используются в композициях, подходящих для, например, перорального, интравитреального, ректального, вагинального, назального, местного, энте-рального или парентерального (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное и трансдермальное) введения или введения путем ингаляции. Композиции могут быть представлены в виде единичной лекарственной формы и могут быть получены любым способом из хорошо известных способов в области фармацевтического препарата. Подкожный или трансдермальный способы введения могут быть особенно подходящими для пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к устройствам, лекарственным форм и упаковке, используемым для доставки фармацевтических препаратов данного изобретения. Таким образом, по крайней мере один указанный пептидный конъюгат, или его часть, или вариант в стабильных или консервированных составах или растворах согласно настоящему описанию может быть введен пациенту в соответствии с настоящим изобретением с помощью различных методов, включая подкожные или внутримышечные инъекции; трансдермальный, легочный, трансмукозальный пути введения, имплантацию, осмотический насос, картридж, микронасос или другие средства, известные специалисту в данной области, а также известные в данной области.
Еще один аспект изобретения относится к композициям для орального введения. Препараты для перорального введения могут включать совместное введение вспомогательных веществ (например, резорцинов и неионных поверхностно-активных веществ, такие как полиоксиэтиленолеиловый эфир и н-гексадецилполиэтиленовый эфир), чтобы искусственно повысить проницаемость стенки кишечника, а
также одновременное введение ферментативных ингибиторов (например, ингибиторов трипсина поджелудочной железы, диизопропилфторфосфата (DFF) и тразилола) для подавления деградации ферментами. Активное соединение лекарственной формы твердого типа для перорального введения может быть смешано по меньшей мере с одной добавкой, включая лактозу, целлюлозу, маннит, трегалозу, раффинозу, мальтит, декстран, крахмал, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакант, гуммиарабик, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Эти лекарственные формы могут также содержать другой тип (типы) добавок, например неактивный разбавитель, смазки, такие как стеарат магния, парабены, консерванты, такие как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол, антиоксидант, такие как цистеин, дезинтегратор, связующее вещество, загуститель, буферный агент, подсластитель, ароматизатор, ароматизации агент и т.д. Дозы
Обычная доза пептидного конъюгата согласно настоящему изобретению, использованная в контексте настоящего изобретения, может находиться в диапазоне от 0,001 до 100 мг/кг массы тела в день, например, от примерно 0,01 до примерно 50 мг/кг массы тела в день, например, от около 0,05 до около 10 мг/кг массы тела в сутки, которое вводят в виде од ной или нескольких доз, например, от одной до трех доз. Как уже указывалось в некоторой степени выше, точная используемая доза будет зависеть, в частности, от характера и тяжести заболевания или расстройства, пола, возраста, массы тела и общего состояния субъекта, подлежащего лечению; возможных других сопутствующих заболеваний или расстройств, которые подвергаются лечению или должны подвергнуться лечению, а также других факторов, которые будут известны к врачу специалисту в данной области.
Сочетанная терапия
Как отмечалось выше, следует понимать, что ссылка на следующие пептидные конъюгаты изобретения распространяется также на его фармацевтически приемлемую соль или сольват, а также композицию, содержащую более одного из различных пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению.
Пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению можно вводить как часть комбинированной терапии вместе с другим активным агентом для лечения рассматриваемого заболевания или расстройства, например, сахарного диабета, ожирения, метаболического синдрома, дислипидемии или гипертонии, и в таких случаях два активные агента можно вводить вместе или по отдельности, например, в качестве составляющих в той же фармацевтической композиции или лекарственной форме, или в виде отдельных лекарственных форм.
Таким образом, пептидный конъюгат можно использовать в сочетании с анти диабетическим агентом известного типа, включая, но не ограничиваясь ими, метформин, сульфонилмочевину, глинит, ингибиторы DPP-IV, глитазон или инсулин или аналог инсулина. В предпочтительном варианте реализации изобретения пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с инсулином или его аналогом, ингибитором DPP-IV, сульфонилмочевиной или метформином, в частности сульфо-нилмочевиной или метформином для достижения адекватного контроля гликемии. В более предпочтительном варианте реализации пептидный конъюгат вводят в комбинации с инсулином или аналогом инсулина для достижения адекватного контроля гликемии. Примеры приемлемых аналогов инсулина включают, но не ограничиваются ими, Лантус(tm), Новорапид(tm), Хумалог(tm), НовоМикс(tm), Актрафан(tm) НМ, Левемир(tm), Деглюдек(tm) и Апидра(tm). Другие значимые в данном случае антидиабетические препараты включают агонисты рецептора GLP-1, такие как экзенатид (Буетта(tm); Эксендин-4) и лираглутид (Викто-за(tm)). Пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению также можно применять в сочетании со средством против ожирения известного типа, включая, но не ограничиваясь ими, пептид YY или его аналог, нейропептид Y (NPY) или его аналог, антагонист каннабиноидных рецепторов 1, ингибитор липазы, преостровковый пептид человека (HIP), агонист рецептора меланокортина 4 или антагонист рецептора меланинконцентрирующего гормона 1.
Пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению также можно использовать в сочетании со средством против гипертензии известного типа, включая, но не ограничиваясь ими, ингибитор ангиотен-зинпревращающего фермента, блокатор рецептора ангиотензина II, диуретик, бета-блокатор или блока-тор кальциевых каналов.
Пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению также можно использовать в сочетании со средством против дислипидемии известного типа, включая, но не ограничиваясь ими, статин, фибрат, ниацин и/или ингибитор всасывания холестерина. Пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению также можно использовать в сочетании с ингибитором протонного насоса (т.е. фармацевтическим агентом, имеющим фармакологическую активность в качестве ингибитора H7K+-ATPase) известного типа, включая, но не ограничиваясь ими, агент типа производного бензимидазола или имидазопиридина, например Омепразол(tm), Ланзопразол(tm), Декслансопразол(tm), Эзомепразол(tm), Пантопразол(tm), Рабепразол(tm), Золпидем(tm), Алпидем(tm), Сарипидем(tm) или Некопидем(tm). Пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению, более того, можно использовать в сочетании с противовоспалительным агентом известного типа, включая, но не ограничиваясь ими:
стероиды и кортикостероиды, такие как беклометазон, метилпреднизолон, бетаметазон, преднизо-лон, дексаметазон и гидрокортизон;
нестероидные противовоспалительные средства (NSAID), такие как производные пропионовой кислоты (например, альминопрофен, беноксапрофен, буклоксовая кислота, карпрофен, фенбуфен, фено-профен, флупрофен, флурбипрофен, ибупрофен, индопрофен, кетопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пирпрофен, пранопрофен, супрофен, тиапрофеновая кислота и тиоксапрофен); производные уксусной кислоты (например, индометацин, ацеметацин, алклофенак, клиданак, диклофенак, фенклофе-нак, фенклокислота, фентиазак, фурофенак, ибуфенак, изоксепак, оксипинак, сулиндак, тиопинак, толме-тин и зидометацин зомепирак); фенамовой кислоты (например, флуфенамовая кислоты, меелофенамовая кислота, мефенамовая кислота, нифлумовая кислота и толфенамовая кислота); бифенилкарбоновой кислоты (например, дифлунизал и флуфенизал); оксикамы (например, изоксикам, пироксикам, судоксикам и теноксикам); салицилаты (например, ацетилсалициловая кислота и сульфасалазин) и пиразолоны (например, апазон, безпиперилон, фепразон, мофебутазон, оксифенбутазон и фенилбутазон); ингибиторы ЦОГ II, такие как рофекоксиб и целекоксиб;
препараты интерферона бета (например, интерферон бета-1 или интерферона бета-1б); и
некоторые другие соединения, такие как 5-аминосалициловая кислота и пролекарства и их фармацевтически приемлемые соли.
Было показано, что метформин обладает противовоспалительными свойствами [см. Haffner et al., Diabetes 54: 1566-1572 (2005)] и поэтому также может быть полезен в на стоящем контексте.
Каждая из приведенных публикаций и патентных заявок включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме
Следующие примеры демонстрируют некоторые конкретные варианты осуществления настоящего изобретения. Следующие примеры проводились с использованием стандартных методик, которые хорошо известны специалистам в данной области, за исключением случаев, описанных подробно. Следует понимать, что эти примеры даны только для иллюстрации и ограничивают условия или масштаб изобретения. Поэтому их не следует истолковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
Сокращения, используемые в настоящих примерах, включают
NMP: N-метилпирролидон
DCM: дихлорметан
DMF: ^^диметилформамид
HATU: 2-(7-аза-1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониум гексафторфосфат
DIPEA: диизопропилэтиламин
EtOH: этанол
Et20: диэтил эфир
Peg3: 8-амино-3,6-диоксаоктаноил
8Aoc: 8-аминооктаноил
DBF: 4-(2-аминоэтил)-6-дибензофуранпропаноил TFA: трифторуксусная кислота MeCN: ацетонитрил
ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография
МС: масс-спектрометрия
IBMX: 3-изобутил-1-метилксантин
BSA: бычий сывороточный альбумин
сАМР: циклический аденозинмонофосфат
DMEM: среда Игла в модификации Дульбекко
FCS: фетальная телячья сыворотка
HEPES: №2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота p-ERK: фосфорилированная внеклеточная регулируемая киназа PBS: фосфатно-солевой буфер Boc: t-бутоксикарбонил NEP: N-метилпирролидон
Лираглутид: [Arg34,Lys(Гексадеканоил-изоGlu)26]GLP-1 (7-37) Пример 1. Синтез соединения и свойства пептидов Материалы и методы
Если не указано иначе, реагенты и растворители, использованные ниже, были коммерчески доступны в виде класса стандартных лабораторных реагентов или аналитического класса и использовали без дополнительной очистки.
Общая методика синтеза пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению Твердофазный синтез пептидов осуществляли на СЕМ Liberty Peptide Synthesizer с использованием стандартной химии Fmoc. Смолу TentaGel(tm) S Ram (1 г; 0.25 ммоль/г) вымачивали в NMP (10 мл) перед применением и переносили из пробирки в реакционный сосуд с использованием DCM и NMP. Псевдо
пролины, которые представляют собой дипептиды, используемые для минимизации агрегации во время синтеза пептидов, такие как Fmoc-Phe-Thr(y-Me,Me-Pro)-OH и Fmoc-Asp-Ser(y-Me,Me-Pro)-OH, использовали при необходимости, и искусственные аминокислоты, образующие линкерные группы Peg3, 8Аос и DBF (см. выше), использовали в качестве Fmoc-защищенных аминокислот (т.е. Fmoc-Peg3-OH, Fmoc-8Aoc-OH и Fmoc-DBF-OH соответственно) без изменения общей методики. Конденсация
Аминокислоту-Fmoc в NMP/DMF/DCM (1:1:1; 0.2 М; 5 мл) добавляли к смоле в микроволновой печи СЕМ Discover вместе с HATU/NMP (0.5 М; 2 мл) и DIPEA/NMP (2.0 М; 1 мл). Смесь нагревали до 75°С в течение 5 мин при пропускании пузырьков азота через смесь. Затем смесь промывали NMP (4x10 мл).
Снятие защиты
Пиперидин/NMP (20%; 10 мл) добавляли в смолу для начального снятия защиты и нагревали смесь в микроволновой печи (40°С; 30 с). Осушали реакционный сосуд и добавляли вторую порцию пипериди-на/NMP (20%; 10 мл) и нагревали еще раз (75°С; 3 мин). Смолу затем промывали NMP (6x 10 мл).
Расщепление
Смолу промывали EtOH (3x10 мл) и Et20 (3x10 мл) и высушивали до постоянного веса при комнатной температуре (r.t.). Сырой пептид отщепляли от смолы с помощью обработки TFA/этандитиолом (95/5, 40 мл, 2 ч; r.t.). Большую часть TFA удаляли при пониженном давлении и сырой пептид осаждали, трижды промывали Et20 и высушивали до постоянного веса при комнатной температуре.
Очистка и характеристика
Сырой пептид очищали до степени чистоты более 90% с помощью препаративной обратно-фазовой ВЭЖХ, с использованием рабочей станции PerSeptive BiosysteMC VISION, снабженной соответствующей колонкой и коллектором фракций, и пропускали через нее градиент буфера А (0.1% TFA, водный) и буфера В (0.1% TFA, 90% MeCN, водный). Фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС и соответствующие фракции накапливали и лиофилизировали. Конечный продукт характеризовали
методом ВЭЖХ и МС. Пример синтеза
Эксендин-4(1-39)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17 (Соединение 1) синтезировали на синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Peptide Synthesizer с использованием смолы TentaGel S Ram (0,67 г; 0.23 ммоль/г) и химии Fmoc согласно описанию выше. Использовали Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту и псевдопролины Fmoc-Phe-Thr(y-Me,Me-Pro)-OH и Fmoc-Ser(tBu)-Ser(y-Me,Me-Pro)-OH.
Пептид отщепляли от смолы согласно описанию выше и проводили очистку на колонке Gemini-NX (5x25 см; 10 мкм; С18) при пропускании 35 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 20 до 50% в течение 47 мин и собирали фракции (9 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизировали с получением белого порошка (122 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 58% чистый.
Продукт очищали повторно на колонке Luna (1 x25 см; 5 мкм; С8) при пропускании 4 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 20 до 50% в течение 47 мин и собирали фракции (2 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизировали с получением белого порошка (63 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 82% чистый.
Другую часть Соединения 1 синтезировали с применением смолы TentaGel S Ram (0,70 г; 0.23 ммоль/г) и использовали те же условия для синтеза и отщепления, как описано выше. Очистку проводили на колонке Gemini-NX (5x25 см; 10 мкм; С18) при пропускании 35 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 20 до 50% в течение 47 мин и собирали фракции (9 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизи-ровали с получением белого порошка (113 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 57% чистый.
Продукт очищали повторно на колонке Luna (1 x25 см; 5 мкм; С8) при пропускании 4 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 20 до 55% в течение 47 мин и собирали фракции (2 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизировали с получением белого порошка (29 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 77% чистый.
Продукты первого синтеза (63 мг; 82%) и второго синтеза (29 мг; 77%) объединяли и еще раз очищали на колонке Kromasil (1x25 см; 10 мкм; С8) при пропускании 4 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту бу
фера В от 25 до 65% в течение 47 мин и собирали фракции (2 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизи-ровали с получением белого порошка (33 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 94% чистый. Масса составила 6553.39 Да по результатам МС (рассчитана 6553.06 Да).
Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (Соединение 33) синтезировали на синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Peptide Synthesizer с использованием смолы TentaGel S Ram (0,55 г; 0.23 ммоль/г) и химии Fmoc согласно описанию выше. Использовали Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту и псевдопролин Fmoc-Phe-Thr(y-Me,Me-Pro)-OH. Пептид отщепляли от смолы согласно описанию выше и проводили очистку на колонке Gemini-NX (5x25 см; 10 мкм; С18) при пропускании 35 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 25 до 55% в течение 47 мин и собирали фракции (9 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизировали с получением белого порошка (70 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 90% чистый. Масса составила 4364.08 Да по результатам МС (рассчитана 4364.11 Да).
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-[Leu4]Гастрин-6 (Соединение 101) синтезировали на синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Peptide Synthesizer с использованием смолы TentaGel S Ram (1,15 г; 0.25 ммоль/г) и химии Fmoc согласно описанию выше. Использовали Fmoc-Phe-Thr(y-Me,Me-Pro)-OH. Использовали NEP вместо NMP во время сопряжения и снятия защиты.
Пептид отщепляли от смолы согласно описанию выше и проводили очистку на колонке Gemini-NX (5x25 см; 10 мкм; С18) при пропускании 35 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 20 до 50% в течение 47 мин и собирали фракции (9 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизировали с получением белого порошка (50 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 85% чистый. Масса составила 3952.00.08 Да по результатам МС (рассчитана 3951.97 Да).
GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17 (Соединение 42) синтезировали на синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Peptide Synthesizer с использованием смолы TentaGel S Ram (1,16 г; 0.23 ммоль/г) и химии Fmoc согласно описанию выше. Использовали Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту и псевдопролин Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Psi Me, Me-Pro)-ОН.
Пептид отщепляли от смолы согласно описанию выше и проводили очистку на колонке Gemini-NX (5x25 см; 10 мкм; С18) при пропускании 35 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 25 до 45% в течение 47 мин и собирали фракции (9 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизировали с получением белого порошка (172 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 86% чистый. Масса составила 5664.72 Да по результатам МС (рассчитана 5664.70 Да). [Arg34,Lys(Гек-садеканоил-изоGlu)26]GLP-1 (7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6 (Соединение 107) синтезировали на синтезаторе пептидов СЕМ Liberty Peptide Synthesizer с использованием смолы TentaGel S Ram (1,30 г; 0.25 ммоль/г) и Fmoc-химии согласно описанию выше. NEP использовали вместо NMP во время конденсации и снятия защиты. Использовали Fmoc-8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту и псевдопролин Fmoc-Phe-Thr(^]/-Ме,Ме-Pro)-ОН, а также Fmoc-Lys(Dde)-OH на стадии прикрепления для ацилирования. N-конец пептида, прикрепленного к твердой фазе, защищали Boc с использованием Вос20 (330 мг) и DIPEA (54 мкл) в DCM. Затем защитную группу Dde отщепляли с использованием гидразингидрата/NEP (4%; 2x15 мин), и смолу промывали NEP (8x2 мин), DIEA/NEP (10%; 5x5 мин) и NEP (8x2 мин). Синтез осуществляли на СЕМ Liberty Peptide Synthesizer согласно описанию выше с использованием Fmoc-Glu-OtBu и гексадеканоевой кислоты. NEP использовали вместо NMP во время конденсации и снятия защиты. Пептид отщепляли от смолы согласно описанию выше и проводили очистку на колонке Gemini-NX (5x25 см; 10 мкм; С18) при пропускании 35 мл/мин смеси буфера А (0.1% TFA; водный) и буфера В (0.1% TFA; 90% MeCN; водный). Продукт элюировали по линейному градиенту буфера В от 30 до 70% в течение 47 мин и собирали фракции (9 мл) с помощью коллектора фракций. Соответствующие фракции анализировали методами аналитической ВЭЖХ и МС, накапливали и лиофилизировали с получением белого порошка (60 мг), который по результатам аналитической ВЭЖХ характеризовали как на 88% чистый. Масса составила 4819.95 Да по результатам МС (рассчитана 4819.45 Да).
Пример 2. Активация (ЕС50) рецептора GLP-1 и рецептора Гастрина CCK-В in vitro пептидными конъюгатами согласно настоящему изобретению
Материалы и методы
Анализ эффективности рецептора GLP-1 (GLP-1 R) человека:
In vitro действие пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению оценивали с помощью измерения индукции сАМР после стимуляции рецептора GLP-1 (7-36), эксендин-4(1-39) или исследуемыми конъюгатами согласно настоящему изобретению с использованием набора FlashPlate(tm) сАМР про- 26
изводства Perkin-Elmer. Вкратце, клетки HEK293, экспрессирующие GLP-1 R человека (стабильная клеточная линия, полученная посредством трансфекции кДНК GLP-1 R и отбора стабильных клонов), сеяли в концентрации 40,000 клеток/лунка в 96-луночные микротитровальные планшеты, покрытые 0.01% по-ли^-лизином, и культивировали в течение одного дня в 100 мкл питательной среды [DMEM, 10% FCS, пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл)]. В день проведения анализа удаляли питательную среду и клетки однократно промывали 200 мкл буфера Тирод [соль Тирод (9.6 г/л), 10 мМ HEPES, рН 7.4]. Клетки инкубировали в 100 мкл буфера Тирод, содержащего повышающиеся концентрации исследуемых соединений, 100 мкМ IB MX и 0.1% BSA в течение 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл 0.5 М HCl и инкубировали на льду в течение 60 мин. Для получения деталей методологии смотрите публикацию WO 2008/152403.
Анализ эффективности CCK-В рецептор (CCK-В R)
Для исследования связывания и активации ССК-В R получили стабильные линии клеток, экспрес-сирующие один из рецепторов CCK человека или мыши тем же образом, каким были получены клеточные линии hGLP-1 R (см. выше). Вкратце, авторы использовали клетки HEK293 для трансфекции кДНК CCK-А R или CCK-В R [hCCK-A R (идентификатор гена: L19315), hCCK-B R (NM_1 76875), mCCK-A R (NM 009827) и mCCK-B R (NM 007627)] человека или мыши, все клонированные в плазмиду трансфек-ции pIRES-neo2dNGFR. Клетки культивировали по стандартному протоколу в питательной среде и трансфицировали плазмидой с использованием Lipofectamin (Invitrogen). Клетки, стабильно экспресси-рующие рецепторы CCK, отбирали с добавлением G418 в питательную среду (только клетки, поглотившие и встроившие плазмиду с экспрессией кДНК, выживали) и культивировали их. Стоковые суспензии клеток замораживали для последующего использования.
In vitro действия пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению оценивали с помощью измерения p-ERK (с использованием анализа AlphaScreen(tm) SureFire p-ERK) в клетках HEK293, стабильно экспрессировавших CCK-В R (рецептор гастрина с высоким сродством) человека и мыши соответственно. Анализы эффективности рецепторов гастрина (анализы AlphaScreen(tm) SureFire p-ERK) проводили согласно следующему описанию.
День 1. Посев клеток
Описываемые клетки, экспрессировавшие CCK-В R, высеивали в концентрации 20,000 клеток/лунка в 100 мкл питательной среды [DMEM, 10% FCS, пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл)] в 96-луночные планшеты, покрытые поли^-лизином. Клетки инкубировали в инкубаторе (37°С, 5% CO2) в течение двух дней.
День 3. Смена среды на бессывороточную
Питательную среду меняли на 80 мкл бессывороточной среды [DMEM, пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл)] на лунку и продолжали инкубировать клетки в течение 19 ч в инкубаторе (37°С, 5% CO2).
День 4. Стимуляция пептидным конъюгатом и анализ AlphaScreen(tm) SureFire p-ERK
1. Через 19 ч добавляли 20 мкл бессывороточной среды, содержавшей одну из 5 раз личных концентраций пептидного конъюгата (в трех повторениях для каждой концентрации), и клетки инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Среду для стимуляции удаляли, быстро переворачивая планшет вверх тормашками, и в каждую лунку добавляли 60 мкл x лизирующего буфера (из набора для анализа SureFire).
3. Планшет перемешивали на шейкере для планшетов в течение 5 мин и помещали на лед.
4. Анализ SureFire P-ERK: 4 мкл каждого супернатанта переносили в 384-луночный про-
ксипланшет (Perkin Elmer).
5. 4 мкл каждого из двух лизатов контролей (нестимулированный и стимулированный) добавляли в проксипланшет в двух повторениях.
6. Смешивали 60 частей реакционного буфера, 10 частей буфера для активации, 1 часть акцепторных бусин и 1 часть донорских бусин (реакционный буфер + буфер для активации + бусины). 7 мкл полученного реакционного буфера + активационного буфера + бусин добавляли в лунки проксипланшета, перед добавлением в лунки смесь тщательно ресуспендировали.
7. Планшет инкубировали в течение 2 ч в темном боксе при 22°С в инкубаторе.
8. Планшет анализировали на свето-эмиссионном ридере планшетов Envision(tm) (Perkin-Elmer) с использованием соответствующей программы считывания (Perkin-Elmer). Пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению исследовали в описанных выше анализах (т.е. эффективность активации GLP-1 R человека, эффективность активации CCK-В R человека и эффективность активации CCK-В R мыши).
GLP-1 (7-36) человека и эксендин-4(1-39) использовали в качестве положительного контроля в анализе эффективности активации рецептора GLP-1 человека (hGLP-1 R), и h[Gln1,Leu15]Гастрин 17 и CCK-8 (состоящий из С-терминальных 8 активных аминокислотных остатков CCK) использовали в качестве положительных контролей при анализе эффективности рецептора CCK-В человека (hCCK-B R) и анализе рецептора CCK-В мыши (mCCK-B R).
В данном исследовании активации рецептора CCK h[Gln1,Leu15]Гастрин 17 (имеющий последова
тельность H-QGPWLEEEEEAYGWLDF-NH2) использовали в качестве контрольного соединения. Остаток глутамина (Gln) мог быть изменен в некоторой степени до PyroGlu, но без потери связывающей активности рецептора.
Результаты (значения ЕС50 в моль/л) представлены ниже в табл. 1, 1а и 2.
Таблица 1. In vitro эффективность (ЕС50, моль/л) соединений (пептидных конъюгатов) согласно настоящему изобретению в активации hGLP-1 R, hCCK-B R и mCCK-B R
соеди нения
Пептидный конъюгат
ЕС50 hGLP-1 R
EC5"
EC50
mCCK-B R
Эксендин-4(1 -39)-Peg3-Peg3-|61п1,1еи151Гастрин-17
5.8 XlO"10
1.90 xlO"8
5.4 x10 s
Эксендин-4(1 -28)-Peg3-Peg3-[1.еи4]Гастрин 6
7.74 xlO"10
3.8 xlO"8
7.15 x10 s
GLP-1 (7-36)-[Glnl, Leul5] Гастрин-17
1.45X10"10
2.59x10 s
7.31x10 s
GLP-1 (7-36)-K-[Glnl,Leul5j Гастрин-17
8.42x10'"
7.73x10*
1.14x10"'
GLP-1 {7-36)-AAA-[Glnl, Leul5]racTpnH-17
1.14x10м
1.88x10 s
5.41x10 s
GLP-1 (7-36)-5KK-[Glnl, LeulS) Гастрин-17
1.16x10"(tm)
1.56x10 s
s.sexio"8
GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Glnl,Leul5] Гастрин 17
9.26x10"
8.76xl0"9
5.11x10 s
GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Glnl,Leul 5] Гастрин-17
7.78x10""
8.20X109
5.83x10^
GLP-1 (7-36j-SAoc-SKK-[Glnl,LeulS] Гастрин-17
1.56X10"10
5.19x10 s
8.25x10 s
GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-(Glnl,Leul 5] Гастрин-17
1.37X10"10
2.57xl0'8
8.69x10 s
GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Glnl,Leu 15] Гастрин-17
1.22xl0'10
1.28X10'8
7.14X10'8
Контроль
GLP-1 (7-36)
1.66x10'"
Контроль
Эксендин-4(1-39)
1.63xl0'10
Контроль
п[61п1Деи15]Гастрин-17
4.69x10 s
1.82x10 s
Контроль
CCK-8
6.1xl09
1.63x10"'
a. In vitro эффективность (ЕС50, моль/л) соединений (пептидных кон ю настоящему изобретению в активации hGLP-1 R, hCCK-B R и mC(
соеди нения
Пептидный конъюгат
EC50
hCCK-B R
EC50
Эксендин-4(1 -39)-Peg3-Peg3-[Glnl,LeulS]raCTpHH-17
2.7 xlO-"
8.0 xlO 9
5.4 x10 s
Эксендин-4(1 -28)-Peg3-Peg3-[Leu4]racTpnH-6
2.8x10""
1.1x10 s
7.1 xlO"7
[Leu4]facrpHH-6
[Tyrl3]3KceHAHH-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Ееи4]Гастрин-6
4.6X10"
1.2 xlO"3
[Orn20]3KceHAMH-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]radpHH-6
3.8X10"
1.5 XlO"8
3KceHAHH-4(l-28)-Peg3-[Leu4]racrpHH-6
5.0X10""
1.0 XlO"
Эксендин-4(1 -28)-[1еи4]Гастрин-б
6.1 XlO'11
1.4 xlOa
Эксендин-4(1-27)-[1еи4]Гэ <трин-11
1.0 xlO'"
4.3 XlO"9
3KceHflHH-4(l-27)-Peg3-[Leu4]racTpHH-6
1.4X10"
5.3 XlO"9
Эксендин-4(1-27)-РевЗ-[1еиЗ]Гаарин-5
2.9X10'"
4.1x10"'
3KCeHflMH-4(l-26)-Peg3-[Leu3]raapMH-5
1.4x10 s
3.2 XlO"5
3KceHAMH-4(l-27)-Peg3-[Leu2]raapMH-4
4.1X10"
8.1x10 s
[Tyrl3,Leul4]3KceHflMH-4(l-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]racrpHH-6
5.0X10"
8.4 xlO"9
[Tvrl3,Phe25]3KceHflMH-4(l-27)-Peg3-Peg3-75 [1_еи4]Гастрин-6
3.5 XlO""
8.4 xlO"9
[Leul4,Phe25]3KceHflHH-4(l-27)-Peg3-Peg3-76 [Leu4jraopHH-6
2.6x10"
7.9 XlO9
[Tyrl3,Leul4,Phe25]3KceHAHH-4(l-27)-Peg3-Peg3- 77 [Leu4]racrpMH-6
4.4x10"
9.1 XlO"9
Боковая цепь-цикло(^уз12,61и16]Эксендин-4(1-2S)-Peg3- 78 Peg3-[Leu4]racrpMH-6
2.5 XlO11
5.9 XlO"9
Боковая цепь-цикло([61и16Лу520]Эксендин-4(1 -28)-Peg3- 79 Peg3-[Leu4]racrpHH-6
2.6 XlO""
5.3 XlO"9
Боковая цепь-цикло(^у520,61и24]Экеендин-4(1 -28)-Peg3-80 Peg3-[Leu4]racrpHH-6
3,2x10"
4.0 XlO"9
[Lysl6]3KceHAHH-4(l -28)-Peg3-Peg3-[Leu4]racTpnH-6
3.2 XlO'11
1.5 xlO"8
3KceHflHH-4(l-28)-Peg3-K-Peg3-[Leu4]racTpMH-
2.8 XlO"11
2.14 XlO "
Эксендин-4(1 -28)-[Тпг4]Гастрин-6
4.4 XlO""
45.8 XlO"8
Эксендин-4(1 -28)-[Рпе4]Гастрин-б
4.4 XlO'11
1.4 XlO
[1еи141Эксендин-4(1-28)-[lNal3,Leu4]racrpHH-6
4.0 XlO'11
2.7x10
[1еи14]Эксендин-4(1 -28)-(М1е41Гастрин-6
5.2 XlO'11
2.4 xlOs
![.еи14]Эксендин-4(1-28Н1еи4,[3-(3-Пиридил)- А1а]6]Гастрин-б
2.8 xlO'"
2.0 xlO"8
Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl313KceHflHH-4(l-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]racTpHH-6
4.6 xlO"
2.0 XlO"8
[Leul4,Phe25,Tyrl3]3KceHflMH-4(l-27)-Peg3-Peg3-ILeu4,Phe3iracrpxH-6
2.3 xlO"
1.2 XlO"6
[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KCeHflMH-4(l-27)-Peg3-Peg3- [1еи4,РпеЗ]Гастрин-6
3.2x10""
1.3 XlO"6
IArg27,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KCeHflMH-4(l -27)-Peg3- [1.еи4]Гастрин-6
6.8 XlO11
1.8 XlO"8
[Argl2,27,Leul4,Lysl6,Phe25,Tyrl313KceHflHH-4(1 -27)- Peg3-[Leu4]racrpiiH-6
1.7 xlO10
2.6 XlO"3
[Argl2,27,Leul4,Lys20,Phe25,Tyrl313K"Heiln-4(1-27)- Peg3-[Leu4)raopHn-6
5.8 XlO11
2.6 XlO"8
[Argl2,27,Leul4,Lys24,Phe25,Tyrl3]3KceHeMM-4(1-27)- Peg3-[Leu4]racrpnH-6
1.3 xlO10
3,6 XlO"8
IArgl2,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KCeHflHH-4(l -27)-Peg3- [Leu4]racTpnK-6
7.9 xlO "
1.4 XlO"8
[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KCeHflMH-4(l-27)-[1еи2]Гастрин-4
1.2xlO'5
2.11x10"'
IGIu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KCeHflHH-4(l-27)-Peg3- [Leu2]racTpnK-4
6.0x10"
1.3X10"8
[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KCeHflMH-4(l-27)-Orn-Peg3- (1еи2]Гастрин-4
4.6x10""
LOxlO"8
[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3)3KceHAHH-4(l-27)-Peg3-Orn- 11еи2]Гастрин-4
4.1x10""
S.lxlO"8
10О
|Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KCGHflHH-4(l-27)-Orn-Om- [Leu2]racrpnn-4
l.lxlO10
8.6 XlO"7
101
[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KceHflMH-4(l-27)-[1еи4)Гастрин-6
1.1X10"10
3.0 xHT8
102
[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KceHAMH-4(l-27)-Peg3- [Leu4]raopnH-6
9.1x10"
5.4 XlO"8
103
(Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl313KceHAMH-4(l-27)-Orn-Peg3- [1.еи4]Гастрин-6
1.2 XlO"10
1.0 XlO'
104
[Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KceHflMH-4(l-27)-Peg3-Orn- [1еи4]Гастрин-6
8.7x10""
8.8 XlO"3
105
|Glu9,Leul4,Phe25,Tyrl3]3KceHAMH-4(l-27)-Orn-Orn- [1.еи4]Гастрин-б
1.1X10"'°
1.6 XlO"8
GLP-1 (7-36)-8Аос-8Аос- 45 [Glnl,Leul5]racTpHH-17
4.2 xlO""
1.3 XlO"8
7.1x10""
Контр
ОЛЬ
GLP-1 (7-36)
1.7 XlO"11
NT.
NT.
Контр
ОЛЬ
Эксендин-4(1-39)
2.4 XlO"11
NT.
NT.
Контр
ОЛЬ
h[Glnl,Leul5]racTpHH-17
4.7 XlO9
1.8x10*
Контр ОЛЬ
ССК-8
6.3 xlO"9
1.6x10"'
Контр
ОЛЬ
h]Leul5]raCTpnH-17
2.4 x10 s
106
[Lys(reKcaAeKaHOHn-H3oGlu)34]GLP-l(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]racrpHH-6
4.9x10"
1.8 XlO"8
107
[ Arg34, Lys( Гексаде ка но и л-
H30Glu)26]GLP-l(7-37)-Peg3-Peg3-
[Leu4]racTpnH-6
1.4X10'10
2.9x10-"
108
[ Arg26,34, Lys( Гек садекан о ил-
H3oGlu)36]GLP-l(7-37)-Peg3-Peg3-
[Leu4]racTpHH-6
1.1x10 й
7.8x10 s
109
[Lys(reKcaAeKaHOHn-H3oGlu)26]GLP-l(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]racTpnH-6
9,9x10"
2.6X10"8
110
[Arg26,34,Gly8,Lys(reKcaAeKaHO№i-H30Glu)36]GLP-l(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]raopHH-6
1.2xl0"10
2.9xl0"8
111
[А|Ь8,А^34Лу5(Гексадеканоил-
H3oGlu)26]GLP-l(7-37)-Peg3-Peg3-
[Ееи4]Гастрин-6
8.8x10"
5.9X10"8
112
[Aib8,Arg34]GLP-l (7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]racrpHH-6
4.3x10"
4.2x10""
113
[Arg34]GLP-l (7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]racrpHH-6
2.7x10"
2.4x10*
NT: не проверяли
Результаты
Результаты, представленные в табл. 1, 1а, 2 и 3 выше, показывают, что обычно все пептидные конъюгаты согласно настоящему изобретению являются мощными агонистами всех трех рассматривае
мых рецепторов и что они проявляют очень похожие уровни эффективности.
Пример 3. Отсеивающий анализ Соединения 73 на 92 отобранных пептидных GPCR
Соединение 73 было выбрано для исследования большой выборки пептидных рецепторов типа GPCR для того, чтобы на раннем этапе выявить любую неспецифичность рецептора. Эти рецепторы принадлежат к семействам GPCR классов А и В, и анализ проводили с помощью Millipore с использованием платформы для скрининга их GPCR. Каждый GPCR активировали своим контрольным пептидным ли-гандом (известным активатором соответствующих рецепторов) или соединением 73 в концентрации 100 нМ. Агонизм рецептора выражен в % по сравнению с контрольным пептидом (который дает 100% активации по определению). Только ожидаемый рецептор GLP-1 и рецептор CCKB (CCK2) активировались существенно (100 и 95% соответственно) Соединением 73, что показывает, что пептид специфичен в отношении этих двух рецепторов.
Пример 4. Фармакокинетика (PK) соединения 1 и 33 на мышах
Методика
Трем мышам C57BI давали 100 нмоль соединения 1 или 33 на кг в виде внутривенной или подкожной болюсной инъекции и получали образцы плазмы через 240 мин после введения дозы. Образцы получали от трех мышей в каждую точку времени. Образцы плазмы анализировали на наличие соединения 33
с использованием LC/MC/MC (10-1000 нМ).
Результаты
Таблица 4. Параметры после внутривенного и подкожного введения 100 нмоль/кг мышам
Соединение 33
Соединение 1
Параметр
Единица
подкожно
Внутривенно
подкожно
внутривенно
час
3,4
2,8
0,45
0,28
100%
97%
Оба соединения проявляли превосходную биодоступность (F) после подкожного введения, при этом соединение 33 показывало повышенный профиль PK, вероятно из-за более длительного периода полураспада (фиг. 1А, 1В и табл. 4).
Пример 5. PK соединения 33 и 74-80
Метод
Двум мышам C57BI вводили однократную подкожную дозу 100 нмоль/кг каждого пептида. Образцы крови получали через 5 и 30 мин и через 1, 2, 4, 6, 16 и 24 ч. В каждый момент времени забирали образцы от двух мышей. Образцы плазмы анализировали после твердофазного выделения (SPE) методом жидкостной хроматографии масс-спектрометрии (LC-MC/MC).
Таблица 5. Т1/2 после подкожного введения 100 нмоль/кг мыши
Соединение
ТХ(ч)
2,0
3.6
2.3
3.1
2.5
2.0
1.5
1.9
Пептиды показывают многообещающие профили T1/2, при этом соединения 74 и 77 превосходили по периоду полураспада и действию остальные соединения (табл. 5 и фиг. 2).
Пример 6. In vivo активность пептидных конъюгатов согласно настоящему изобретению на мышах
db/db
Материалы и методы
Мышиную модель db/db ранее использовали для оценки действия возможных терапевтических кандидатов на сохранение р-клеток [Rolin В. et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283: E745-E752 (2002)]. В нескольких исследования была показана корреляция между содержанием панкреатического инсулина и массы р-клеток [Rolin В. et al. (loc.cit.); Suarez-Pinzon W.L et al., Diabetes 54: 2596-2601 (2005); Suarez-Pinzon W.L. et al., Diabetes 57: 3281 -3288 (2008)].
В настоящем исследовании 6-недельных самок мышей db/db (BKS.Cg-m +/+ Leprdb/J) (Taconic Europe A/S, Lille Skensved, Denmark) акклиматизировали к новым условиям обитания и обеспечивали неограниченный доступ к нормальному корму и воде. Мышей размещали по парам в комнате с контролируемым освещением, температурой и влажностью. За развитием диабета наблюдали на протяжении 2 недель посредством измерения уровня глюкозы в крови, и перед лечением диабетических мышей случайным образом распределяли по группам лечения в зависимости от уровней глюкозы у них в крови (n = 10/группа). Затем животным делали мнимые инъекции подкожно 100 мкл носителя (раз в сутки) в тече
ние трех дней для того, чтобы животные привыкли к обращению и инъекциям. После рандомизации и мнимой инъекции животных обрабатывали (sc, дважды в день) в течение 16 дней комбинациями h[Leu15]Гастрин-17 (1, 10 и 50 нмоль/кг) и Эксендин-4(1-39) (1, 10 и 50 нмоль/кг) или Соединением 1 (пептидный конъюгат согласно настоящему изобретению) [т.е. эксендин-4(1-39)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17] (1, 10 и 50 нмоль/кг) или носителем (буфер PBS; объем инъекции 5 мо/кг). Ежедневные инъекции проводили между 8:00 и 9:00 часами и между 15:00 и 16:00 часами, при этом свежие растворы готовили непосредственно перед введением.
Образцы крови (200 мкл) получали из орбитального сплетения и помещали в пробирки с ЭДТА перед введением дозы (день 1) и на 8 и 16 сутки лечения. Каждый образец крови центрифугировали и плазму (100 мкл) хранили при -80°С для дальнейшего анализа. Образцы крови для определения уровня глюкозы в крови получали из хвостовой вены. После заключительного дня введения дозы животных забивали (16 день) под действием анестезии СО2 с последующей цервикальной дислокацией. Поджелудочную железу каждого животного незамедлительно изымали, взвешивали и хранили для дальнейшего анализа содержания инсулина.
Измерения
Концентрации глюкозы в цельной крови (мМ) определяли оксидазным методом иммоби-лизированной глюкозы (Elite Autoanalyser, Bayer, Denmark). Уровень С-пептида в плазме определяли с использованием набора для радиоиммуноанализа С-пептида (Linco/Millipore, kit RCP-21 K). Содержание панкреатического инсулина определяли с использованием набора для радиоиммуноанализа инсулина крысы (Linco/Millipore, набор R1-13).
Результаты
Как ясно следует из фиг. 3, наблюдали значительно повышенное содержание панкреатического инсулина у животных, обработанных пептидным конъюгатом согласно настоящему изобретению (Соединение 1), по сравнению с животными, обработанными простой комбинацией Эксендин-4(1-39) и h[Leu15]Гастрин-17, или обработанных носителем. Таким образом, по-видимому, действие на уровни панкреатического инсулина, возникающее в результате ковалентной конденсации или связывания (конъюгации) группы Эксендин-4 и группы Гастрина в составе пептидного конъюгата, согласно настоящему изобретению может быть неожиданно большим, чем при использовании соответствующей аддитивной комбинации двух отдельных пептидных компонентов.
Пример 7. Шестинедельное исследование
Протокол
125 самки мышей db/db (BKS.Cg-m +/+ Leprdb/J) (на момент поступления 6-недельные) были получены от Taconic Europe A/S. На 4 сутки получали кровь животных, которых со держали на полуголодной диете, для определения базового уровня С-пептида в плазме, инсулина в плазме, глюкозы в крови и уровней HbA1c. Затем животных распределяли по 5 группам лечения n = 20 в зависимости от базового уровня С-пептида и HbAlc в плазме. Животным делали подкожные инъекции 100 мкл носителя дважды в стуки в течение по меньшей мере 3 дней для акклиматизации животных к условиям содержания и экспериментальным процедурам.
Затем животным делали подкожные инъекции дважды в день пептидов или носитель на протяжении 42 дней согласно табл. 6. Дневные инъекции делали в период 08:00-09:00 и 15:00-16:00 свежеприготовленными растворами. Последний день введения дозы было утро 42 дня.
Исследование прекращали на 42-й день. Животных содержали на полуголодной диете, и они получали последнюю дозу утром. Забирали пробы крови для определения С-пептида плазмы, инсулина в плазме крови, глюкозы в крови и HBA1c. После забора крови животные были подвергнуты эвтаназии с использованием СО2 с последующей дислокацией шейных позвонков. Получали поджелудочную железу, ее взвешивали, делили на 3 части и переносили в пробирки, содержащие 2 мл холодного кислого спирта, и проводили анализ содержания инсулина.
Соединение 33 снижало уровень глюкозы в крови (фиг. 4) и повышало концентрацию инсулина в плазме по сравнению с носителем у мышей db/db (фиг. 5). Кроме того, обработка соединением 33 вызывала статистически существенное снижение уровней HBA1c по сравнению с животными, которым вводили носитель и Гастрин17 + Эксендин-4 (фиг. 6). Эти результаты показывают, что соединение 33 улучшало гликемический контроль в крови мышей с диабетом.
Кроме того, соединение 33 вызывало статистически значимое увеличение содержание панкреатического инсулина по сравнению с носителем (фиг. 7). Кроме того, как соединение 33, так и эксендин-4 приводили к значительному увеличению дельты уровня С-пептида в плазме, что указывает на улучшение
функции поджелудочной железы во всех группах (фиг. 8).
Совместное введение эксендин-4 и гастрина не превосходило эксендин-4 по улучшению гликеми-ческого контроля у мышей db/db. Таким образом, дозы, использованные в данном исследовании, не оказывали синергетического действия эксендин-4 и гастрина на гликемию.
Наши данные показывают, что пептидный конъюгат соединение 33 значительно повышает содержание панкреатического инсулина и улучшает контроль гликемии у мышей db/db, что следует из снижения HBAlc.
Пример 8. Исследование лекарственного средства в режиме "каникулы" Протокол
Получали 150 самцов мышей db/db в возрасте 5-6 недель. Животных содержали (5 мышей/клетка) в контролируемых условиях (20-22°С, 55-85% влажности) с соблюдением цикла 12:12 ч свет/темнота, свет включали в 05.00 утра. Животных кормили вволю, содержали на стандартной диете Altromin № 1324, и они имели свободный доступ к подкисленной водопроводной воде. На момент начала исследования животные имели возраст 8-9 недель. Все животные были акклиматизированы и обрабатывались ежедневно минимум за одну неделю до начала эксперимента.
Образцы крови
Перед началом лечения и в день 93 (перед прекращением) у голодных мышей (17 ч) были получены пробы крови (150 мкл) из орбитальных сплетений с помощью покрытой ЭДТА микропипетки. Образцы крови помещали в пробирки, покрытые EDTA, и хранили на льду. Образцы крови центрифугировали и полученную плазму (по крайней мере 50 мкл) хранили (при-80°С) для последующего анализа уровня С-пептида и инсулина. Также в день -10/12 (до начала лечения) и день 93 (до окончания) проводили анализ образцов крови (50 мкл), полученных из орбитальных сплетений, на глюкозу крови (палочки) и HBA1c.
Деление
За 6-4 дня до введения первой дозы препарата животным, которым устраивали голодание (17 ч), проводили пероральный тест на переносимость глюкозы (оГТТ, см. ниже). Площадь под кривой концентрации глюкозы в крови, полученной за 240-минутный период (AUC единица измерения: мМ*мин), использовали для разделения животных на 5 групп (А-Е) по 26 животных в каждой, чтобы получить похожую переносимость глюкозы в обеих группах. Через первые 50 дней приема препарата (период 1) проводили второй теста на переносимость глюкозы. На основании этого второго оГТТ каждую группу мышей делили по AUC (как указано выше) на две подгруппы, отображающие похожую переносимость глюкозы.
Введение доз
Животным вводили один раз в день подкожно дозу носителя (2*n = 26), эксендин-4 (n = 26) или соединение 33 (n = 26) и вводили эти дозы в соответствии с табл. 6 в течение 50 дней. Дозы вводили между 02.00 и 3.00 вечера каждый день в виде инъекции объемом 5 мл/кг. Через 50 дней введения дозы животных распределяли на 7 групп, как показано в табл. 1. Этот режим дозирования продолжали в течение 40 дней, животных забивали на 93 день.
Пероральный тест на переносимость глюкозы (оГТТ)
оГТТ проводили в дни -6/4, 50, 65, 78 и 91 периода лечения на животных, которым устраивали голодание в течение ночи (17 ч) после последней инъекции носителя или соединения. Образцы крови брали из кончика хвоста и измеряли уровень глюкозы в крови. Для предотвращения смешанного приема пищи животным устраивали голодание на протяжении всего оГТТ. Сразу же после начальной пробы крови (t=0, уровня глюкозы в крови натощак) давали пероральную дозу (1 г/кг) глюкозы (глюкозамоно-гидрат, SAD 500 г/л), растворенную в воде MQ (5 мл/кг, 0,2 г/мл), и животных возвращали в их домашние клетки (t = 0). Затем определяли уровни глюкозы в крови в момент времени t=15, 30, 60, 120 и 240 минут.
Глюкоза натощак
Для дальнейшего наблюдения за статусом диабета у животных измеряли уровень глюкозы натощак в крови после 8 ч голодания в день 0, 37, 44, 58, 72 и 85. Чтобы свести к минимуму стресс, животные голодали в течение дня (с 06.00 утра, когда привычное потребление пищи был низко), и уровень глюкозы в крови натощак определяли в 02.00 дня.
Носитель: PBS: Фосфатно-солевой буфер Gibco (#70011, рН 7.4).
Соединение 33 - двойной агонист GLP-1-Гастрина - уменьшал площадь под кривой глюкозы (AUC) после перорального теста на глюкозу, а также снижал уровень глюкозы в крови натощак по сравнению с контролем, получавшим носитель, независимо от того, была ли парадигма лечения профилактической, лечением или "каникулами" (фиг. 9-10). Кроме того, инсулина и С-пептида в плазме и уровни HbAl в крови были значительно ниже у мышей, получавших соединение 33, по сравнению с теми, которые получали носитель (фиг. 11). Эти данные показывают, что соединение 33 улучшает контроль гликемии у мышей с сахарным диабетом db/db и в большей степени, чем эксендин-4 и лираглутид. Примечательно, что эффект соединений на гликемический контроль сохранялся в течение нескольких дней после прекращения лечения, при этом он был наиболее выражен у мышей, получавших соединение 33.
Перечень последовательностей
<210> 102
<21I> 34
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность синтетического пептида
<220>
<221> РАЗНЫЕ_ОСОБЕННОСТИ <222> (28)..(28) <223> Хаа = Peg3
<400> 102
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
15 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu Phe Leu Lys Xaa Tyr Gly Trp Leu
20 25 30
Asp Phe
<210> 103
<211> 35
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность синтетического пептида
<220>
<221> РАЗНЫЕ_ОСОБЕННОСТИ <222> (28)..(2S) <223> Xaa = Om
<220>
<221> РАЗНЫЕ_ОСОБЕННОСТИ <222> (29)..(29) <223> Xaa = Peg3
<400> 103
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
15 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu Phe Leu Lys Хаа Xaa Tyr Gly Trp
20 25 30
Leu Asp Phe 35
<210> 104
<211> 35
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность синтетического пептида
<220>
<221> РАЗНЫЕ_ОСОБЕННОСТИ
<222> (28)..(28)
<223> Xaa = Peg3
<220>
<221> РАЗНЫЕ_ОСОБЕННОСТИ <222> (29)..(29) <223> Xaa = Orn
<400> 104
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
15 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe He Glu Phe Leu Lys Xaa Xaa Tyr Gly Trp
20 25 30
Leu Asp Phe
<210> 105
<211> 35
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность синтетического пептида
<220>
<221> РАЗНЫЕ_ОСОБЕННОСТИ
<222> (28)..(29) <223> Xaa = Orn
<400> 105
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Glu
15 10 15
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептидный конъюгат, имеющий формулу I
R1-Z-L-Y-R2 (I),
в которой
R1 представляет собой Н, 0^4 алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; R2 представляет собой ОН или NH2;
Z содержит последовательность Эксендина-4(1-39), имеющую последовательность His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser,
или его аналога Za;
L представляет собой необязательную линкерную группу; и
Y содержит последовательность Гастрина-17, имеющую последовательность Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe, в которой Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr или его аналога Ya.
2. Пептидный конъюгат по п.1, отличающийся тем, что:
(i) Za имеет до 10 замен в положениях и/или содержит укорочение на 0-конце на 1-12 аминокислот по сравнению с последовательностью Эксендина-4; и/или
(ii) Ya имеет до 5 замен в положениях по сравнению с последовательностью Гастрина-17 и/или содержит укорочение на N-конце на 1-13 аминокислот по сравнению с последовательностью Гастрина-17.
3. Пептидный конъюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIa His-Z2-Z3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Z10-Z11-Z12-Z13-Z14-Glu-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20-Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33-Z34-Z35-Z36-Z37-Z38-Z39 (IIa), в которой
Z2 выбран из Gly, Ala, Ser, Aib, Thr, Leu и Ile;
Z3 выбран из Glu и Asp;
Z9 выбран из Asp и Glu;
Z10 выбран из Leu, Val, Ile и Ala;
Z11 выбран из Ser и Aib;
Z12 выбран из Ser, Gln, Arg, Cys, Lys, Glu и Orn; Z13 выбран из Arg, Ser, Gin, Tyr и Glu;
Z14 выбран из Gly, Cys, Phe, Tyr, Trp, Lys, Met, Leu, Nle и Ile;
Z16 выбран из Asp, Gly, Aib, Glu, Lys и Cys;
Z17 выбран из Glu, Cys, Lys, Ser и Gln;
Z18 выбран из Ala и Aib;
Z19 выбран из Val, Leu, Ile и Ala;
Z20 выбран из Arg, Lys, Cys, Orn и Glu;
Z21 выбран из Leu и Glu;
Z22 выбран из Phe и Ala;
Z23 выбран из Ile и Leu;
Z24 выбран из Glu, Cys, Lys, Ala и Arg;
Z25 выбран из Trp, Cys, Lys и Phe;
Z26 выбран из Leu и Ile;
Z27 выбран из Ile, Val, Gln, Lys, Cys, Arg и Orn;
Z28 выбран из Asn, Ser, Asp, Aib, Gln, Lys, Cys, Arg, Tyr, bAla, Glu, Orn и Leu или он отсутствует;
Z29 выбран из Gly, Aib и bAla или он отсутствует;
Z30 выбран из Gly, Cys, Lys и Arg или он отсутствует;
Z31 выбран из Pro, Ser и Asp или он отсутствует;
Z32 выбран из Ser и Lys или он отсутствует;
Z33 представляет собой Ser или он отсутствует;
Z34 выбран из Gly и Lys или он отсутствует;
Z35 представляет собой Ala или он отсутствует;
Z36 представляет собой Pro или он отсутствует;
Z37 представляет собой Pro или он отсутствует;
Z38 представляет собой Pro или он отсутствует;
Z39 представляет собой Ser или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIb
L1-L2-L3-L4 (IIb),
в которой
L1 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIc
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIc),
в которой
Y1 представляет собой Gln или он отсутствует; Y2 представляет собой Gly или он отсутствует; Y3 представляет собой Pro или он отсутствует; Y4 представляет собой Trp или он отсутствует; Y5 представляет собой Leu или он отсутствует; Y6 представляет собой Glu или он отсутствует;
Y7 представляет собой Glu или он отсутствует; Y8 представляет собой Glu или он отсутствует; Y9 представляет собой Glu или он отсутствует; Y10 представляет собой Glu или он отсутствует; Y11 представляет собой Ala или он отсутствует; Y12 выбран из Ala и Tyr или он отсутствует; Y13 выбран из Gly и Ala, или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, Phe, 1Nal и Met; Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr и Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.
4. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIa His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Z 13 -Z 14-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Z20-Leu-Phe-Ile-
Z24-Z25-Leu-Z27-Z28 (IIIa),
в которой
Z9 выбран из Asp и Glu;
Z12 выбран из Lys, Arg и Orn;
Z13 выбран из Gln и Tyr;
Z14 выбран из Met и Leu;
Z16 выбран из Glu, Cys и Lys;
Z20 выбран из Arg, Lys и Orn;
Z24 выбран из Lys и Glu;
Z25 выбран из Trp, Lys, Cys и Phe;
Z27 выбран из Lys, Arg и Orn;
Z28 выбран из Asn и Asp или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIb
L1-L2-L3-L4 (IIIb),
в которой
L1 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L2 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L3 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L4 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IIIc
Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (IIIc),
в которой
Y12 выбран из Tyr и Ala или он отсутствует;
Y13 выбран из Gly и Ala или он отсутствует;
Y14 выбран из Trp, 1Nal и Phe;
Y15 выбран из Leu, Nle, Thr и Phe и
Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.
5. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVa His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Gln-Met-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-
Trp-Leu-Z27-Z28 (IVa),
в которой
Z9 выбран из Glu и Asp;
Z12 выбран из Lys и Orn;
Z16 выбран из Glu и Lys;
Z27 выбран из Lys и Orn;
Z28 выбран из Asn и Asp или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVb
L1-L2-L3-L4 (IVb),
в которой
L1 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L2 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L3 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L4 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IVc
Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IVc),
в которой
Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует и Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.
6. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что
Za представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Va His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Z9-Leu-Ser-Z12-Tyr-Leu-Glu-Z16-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-
Phe-Leu-Z27-Z28 (Va),
в которой
Z9 выбран из Glu и Asp;
Z12 выбран из Lys и Orn;
Z16 выбран из Glu и Lys;
Z27 выбран из Lys и Orn;
Z28 выбран из Asn и Asp, или он отсутствует;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Vb
L1-L2-L3-L4 (Vb),
в которой
L1 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L2 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L3 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; L4 выбран из Peg3, Gln, Cys, Lys и Orn или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу Vc
Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (Vc),
в которой
Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует; Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.
7. Пептидный конъюгат по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что пептидная последовательность формулы I содержит один или несколько внутримолекулярных мостиков.
8. Пептидный конъюгат по п.7, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик образуется между боковыми цепями двух аминокислотных остатков, которые разделены тремя аминокислотами в линейной последовательности согласно формуле I.
9. Пептидный конъюгат по п.8, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик образуется между боковыми цепями пар остатков х и х+3, х+4 или х+5.
10. Пептидный конъюгат по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик представляет собой лактамное кольцо.
11. Пептидный конъюгат по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что указанный внутримолекулярный мостик включает пару остатков, в которых:
Z12 представляет собой Lys и Z16 представляет собой Glu; Z12 представляет собой Glu и Z16 представляет собой Lys;
Z16 представляет собой Glu и Z20 представляет собой Lys; Z16 представляет собой Lys и Z20 представляет собой Glu;
Z20 представляет собой Glu и Z24 представляет собой Lys; Z20 представляет собой Lys и Z24 представляет собой Glu.
12. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что Za имеет по меньшей мере 75% идентичности с природным эксендином-4, например по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%.
13. Пептидный конъюгат по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что Ya имеет по меньшей мере 70% идентичности с природным гастрином, например по меньшей мере 75, 80, 85, 90 или 95%.
14. Пептидный конъюгат по любому из гфедыдущих пунктов, отличающийся тем, что пептид формулы I имеет последовательность
Эксендин-4(1-39)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(l-3 9)-[Gln1 ,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1 -3 9)-K-[Gln1 ^^^астрин-П, Эксендин-4(1 -3 9)-ААА-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1 -3 9)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(l-39)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(l-39)-8Аос-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, Эксендин-4(1-39)-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1 -3 9)-K-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1 -3 9)-ААА-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(l-39)-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(1 -3 9)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(l-39)-8Аос-SKK-[Leu4]Гастрин-6, Эксендин-4(l-39)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-39)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин- 6,
Эксендин-4(l-28)-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(l-28)-K-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(l-28)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(1-28)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(1-28)-Peg3-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Gln1,Leu15]гастрин-17,
Эксендин-4(l-28)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(l-28)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(l-28)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
Эксендин-4(1-28)-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4 (1-28)-K- [Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-28)-ААА-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(l-28)-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(l-28)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(l-28)-8Аос-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(l-28)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-28)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин-6,
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
15. Пептидный конъюгат по пп.1-11, отличающийся тем, что пептид форму лы I имеет последовательность:
Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu3]Гастрин-5,
Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3-[Ala1,Leu4]гастрин-6,
Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Ala2,Leu4]гастрин-6,
Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu2]гастрин-4,
[Leu14]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Om12]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]гастрин-6,
[Orn27]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]гастрин-6,
[phe25]]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Asp28]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
^13^^x0^-4(1 -28)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Om20]Эксендин-4(l-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-28)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-28)-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1 -27)-[Leu4]Гастрин-11,
Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu3]Гастрин-5,
Эксендин-4(1-26)-Peg3-[Leu3]Гастрин-5,
Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu2]Гастрин-4,
[Tyr13 ,Leu14] Эксендин-4(1 -27)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Tyr13 ^х^Рксендин^! -27)-Peg3 -Peg3-[Leu4]]гастрин-6,
[Leu14,Phe25]Эксендин-4( 1 -27)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[тyr13,Leu14,Phe25]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Боковая цепь-цикло([Lys12,Glu16]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Боковая цепь-цикло([Glu16,Lys20]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Боковая цепь-цикло([Lys20,Glu24]Эксендин-4(1-28)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Lys16] Эксендин-4(1 -28)-Peg3 -Peg3 -[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-28)-Peg3-K-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
Эксендин-4(l-28)-[Thr4]Гастрин-6,
Эксендин-4(1-28)-[Phe4]Гастрин-6,
[Leu14] Эксендин-4(1 -28)-[1Nal3 ,Leu4]Гастрин-6,
[Leu14] Эксендин-4(1 -28)-[Nle4]Гастрин-6,
[Leu14] Эксендин-4(1 -28)-[Leu4, [3 -(3 -пиридил)-Ala]6]Гастрин-6,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4,Pheз]гастрин-6,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-Peg3-[Leu4,Pheз]]Гастрин-6,
[Arg27,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Arg12,27,Leu14,Lys16,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Arg12,27,Leu14,Lys20,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu4]гастрин-6,
[Arg12,27,Leu14,Lys24,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu4]гастрин-6,
[Arg12,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr13]Эксендин-4(1-27)-[Leu2]Гастрин-4,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu2]Гастрин-4,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Peg3-[Leu2]Гастрин-4,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-Om-[Leu2]гастрин-4,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Om-[Leu2]Гастрин-4,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-[Leu4]Гастрин-6,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Peg3-Om-[Leu4]гастрин-6,
[Glu9,Leu14,Phe25,Tyr1з]Эксендин-4(l-27)-Om-Om-[Leu4]Гастрин-6,
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
16. Пептидный конъюгат, имеющий формулу VI
R1-X-L-Y-R2 (VI),
в которой
R1 представляет собой Н, С1-С4 алкил, ацетил, формил, бензоил или трифторацетил; R2 представляет собой ОН или NH2;
X содержит последовательность GLP-1 (7-36), имеющую последовательность His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg, или ее аналога Ха,
L представляет собой линкер, содержащий до 4 природных или неприродных аминокислот или их комбинацию, или он отсутствует;
Y содержит последовательность Гастрина-17, имеющую последовательность Gln-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Y15-Asp-Phe, при этом Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr или его аналога Ya.
17. Пептидный конъюгат по п.16, отличающийся тем, что:
(i) Xa имеет до 5 замен в положениях и/или у него отсутствуют 1-2 аминокислоты на С-конце по сравнению с последовательностью GLP-1; и/или
(ii) Ya имеет до 5 замен в положениях по сравнению с последовательностью Гастрина-17 и/или у него отсутствуют 1-13 аминокислот на N-конце по сравнению с последовательностью Гастрина-17.
18. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-17, отличающийся тем, что:
Xa представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIa His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-
Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (VIIa),
в которой
X8 выбран из Ala, Aib и Gly; X26 выбран из Arg и Lys; X34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIb
L1-L2-L3-L4 (VIIb),
в которой
L1 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L3 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; L4 выбран из Ser, Ala, Lys, Orn, bAla, 8Aoc, DBF, Peg3, Cys, Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIc
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Y17 (VIIc), в которой
Y1 представляет собой Gln или он отсутствует; Y2 представляет собой Gly или он отсутствует; Y3 представляет собой Pro или он отсутствует; Y4 представляет собой Trp или он отсутствует; Y5 представляет собой Leu или он отсутствует; Y6 представляет собой Glu или он отсутствует; Y7 представляет собой Glu или он отсутствует; Y8 представляет собой Glu или он отсутствует; Y9 представляет собой Glu или он отсутствует; Y10 представляет собой Glu или он отсутствует; Y11 представляет собой Ala или он отсутствует;
Y12 выбран из Ala, Tyr или он отсутствует; Y13 выбран из Gly, Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp, Phe, lNal и Met; Y15 выбран из Leu, Nle, Phe и Thr и Y17 выбран из Phe и 3-(3-пиридил)аланина.
19. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-18, отличающийся тем, что
Xa представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIa His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-
Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (VIIIa),
в которой
X8 выбран из Ala, Aib и Gly; X26 выбран из Arg и Lys; X34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIb
L1-L2-L3-L4 (VIIIb),
в которой
L1 выбран из Peg3, Orn, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Ser, Ala, Orn, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Lys, Ala, Cys, Orn и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Lys, Orn, Ala, Peg3, Cys и Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу VIIIc
Y12-Y13-Y14-Y15-Asp-Phe (VIIIc),
в которой
Y12 выбран из Tyr, Ala или он отсутствует; Y13 выбран из Gly, Ala или он отсутствует; Y14 выбран из Trp и Phe; Y15 выбран из Leu, Trp и Phe.
20. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-19, отличающийся тем, что:
Xa представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXa His-X8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X26-Glu-Phe-Ile-Ala-
Trp-Leu-Val-X34-Gly-X36 (IXa),
в которой
X8 выбран из Ala, Aib и Gly; Х26 выбран из Arg и Lys; Х34 выбран из Arg и Lys; Х36 выбран из Arg и Lys;
L представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXb
L1-L2-L3-L4 (IXb),
в которой
L1 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L2 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L3 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; L4 выбран из Orn, Peg3, Cys, Lys и Gln или он отсутствует; Ya представляет собой пептидную последовательность, имеющую формулу IXc
Y12-Y13-Trp-Leu-Asp-Phe (IXc),
в которой
Y12 представляет собой Tyr или он отсутствует; Y13 представляет собой Gly или он отсутствует.
21. Пептидный конъюгат по любому из пп. 16-20, отличающийся тем, что Ха имеет по меньшей мере 85% идентичности с природным эксендином-4, например по меньшей мере 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5%.
22. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-21, отличающийся тем, что по меньшей мере один из Lys или Cys дополнительно конъюгирован с липофильным заместителем.
23. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-21, отличающийся тем, что пептид формулы VI имеет последовательность
GLP-1 (7-36)-[Gln1 ^^^астрин-П, GLP-1 (7-36)-K-[Gln1 ,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-AAA-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-Peg3 -Peg3-[Gln1 ,Leu15]Гастрин-17, GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
GLP-1 (7-36)-8Aoc-8Aoc-[Gln1,Leu15]Гастрин-17,
GLP-1 (7-36)-[Leu4]Гастрин-6,
GLP-1 (7-36)-K-[Leu4]Гастрин-6,
GLP-1 (7-36)-ААА-[Leu4]Гастрин-6,
GLP-1 (7-36)-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
GLP-1 (7-36)-Peg3-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
GLP-1 (7-36)-Peg3-Peg3-[Leu4]гастрин-6,
GLP-1 (7-36)-8Aoc-SKK-[Leu4]Гастрин-6,
GLP-1 (7-36)-DBF-SKK-[Leu4]Гастрин-6
GLP-1 (7-36)-8Аос-8Аос-[Leu4]Гастрин-6,
[Aib8,Arg34] GLP-1 (7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Arg34]GLP-1 (7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
24. Пептидный конъюгат по любому из пп.16-22, отличающийся тем, что пептид формулы VI имеет последовательность
[Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)34] GLP-1 (7-37)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Arg34,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)26]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Arg26,34,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)36]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)26] GLP-1 (7-37)-Peg3 -Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Arg26,34,Gly8,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)36]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
[Aib8,Arg34,Lys(Гексадеканоил-изо-Glu)26]GLP-1(7-37)-Peg3-Peg3-[Leu4]Гастрин-6,
или его фармацевтически приемлемая соль или сольват.
25. Применение пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-24 в качестве лекарственного средства для индукции у нуждающегося в этом субъекта неогенеза панкреатических островков.
26. Применение пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-24 в качестве лекарственного средства для предотвращения у нуждающегося в этом субъекта апоптоза р-клеток в панкреатических островках.
27. Применение пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.25-26, отличающееся тем, что указанный субъект представляет собой человека.
28. Способ лечения нуждающегося в этом субъекта от заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из
сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа, предиабета, синдрома инсулинорезистентно-сти, нарушения толерантности к глюкозе (IGT), болезненных состояний, связанных с повышенным уровнем глюкозы в крови, гипергликемии, гипертензии, атерогенной дислипидемии, артериосклероза (например, атеросклероз), ишемической болезни сердца, заболевания периферических артерий, инсульта, микроангиопатии, желудочного заболевания, метаболического синдрома, рака (например, рака толстой кишки), воспалительной болезни кишечника (ВБК) и синдрома раздраженного кишечника (СРК),
указанный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по пп.1-24.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой человека.
30. Фармацевтическая композиция, содержащая пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по пп.1-24 совместно с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или основой.
31. Способ лечения состояния, вызванного или характеризующегося избыточной массой тела, например, для лечения и/или предотвращения ожирения, патологического ожирения, воспаления, вызванного ожирением, заболевания желчного пузыря, вызванного ожирением, апноэ сна, вызванного ожирением, метаболического синдрома, предиабета, указанный способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества пептидного конъюгата или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата по любому из пп.1-24.
32. Применение соединения по любому из пп.1-24 для предотвращения набора веса или обеспечения потери веса у субъекта, который в этом нуждается.
33. Применение соединения по любому из пп.1-24 в способе улучшения уровней глюкозы в периферической крови, переносимости глюкозы и/или уровня холестерина в периферической крови, снижения уровней ЛПНП в периферической крови и/или повышения соотношения ЛПВП/ЛПНП у нуждающегося в этом субъекта.
34. Применение по любому из пп.25-27, 32, 33, отличающееся тем, что соединение вводят как часть комбинированной терапии совместно с агентом для лечения диабета, ожирения, дислипидемии или гипе-тензии.
35. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения диабета представляет собой метформин, сульфонилмочевину, глинид, ингибитор DPP-IV, глитазон, инсулин или аналог инсулина.
29.
36. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения ожирения представляет собой агонист рецептора глюкагонподобного пептида 1, пептид YY или его аналог, антагонист рецептора кан-набиноидов 1, ингибитор липазы, агонист рецептора меланокортина 4 или антагонист рецептора мела-нинконцентрирующего гормона 1.
37. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения гипертензии представляет собой ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, блокатор рецептора ангиотензина II, диуретик, бета-блокатор или блокатор кальциевых каналов.
38. Применение по п.34, отличающееся тем, что агент для лечения дислипидемии представляет собой статин, фибрат, ниацин и/или ингибитор всасывания холестерина.
39. Способ по любому из пп.28, 29, 31, отличающийся тем, что соединение вводят как часть комбинированной терапии совместно с агентом для лечения диабета, ожирения, дислипидемии или гипертен-зии.
40. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения диабета представляет собой метформин, сульфонилмочевину, глинид, ингибитор DPP-IV, глитазон, инсулин или аналог инсулина.
41. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения ожирения представляет собой аго-нист рецептора глюкагонподобного пептида 1, пептид YY или его аналог, антагонист рецептора канна-биноидов 1, ингибитор липазы, агонист рецептора меланокортина 4 или антагонист рецептора меланин-концентрирующего гормона 1.
42. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения гипертензии представляет собой ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, блокатор рецептора ангиотензина II, диуретик, бета-блокатор или блокатор ионов кальция.
43. Способ по п.39, отличающийся тем, что агент для лечения дислипидемии представляет собой статин, фибрат, ниацин и/или ингибитор всасывания холестерина.
44. Способ получения соединения по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что указанный способ включает
Фиг. 1B
синтез указанного соединения методикой твердофазного или жидкофазного пептидного синтеза и выделение конечного продукта пептидного конъюгата с получением соединения по любому из пп.1-24.
45. Применение соединения по любому из пп.1-24 в способе улучшения уровней глюкозы в периферической крови, переносимости глюкозы и/или уровня холестерина в периферической крови, снижения уровней ЛПНП в периферической крови и/или повышения соотношения ЛПВП/ЛПНП у нуждающегося в этом субъекта, при этом используется режим дозирования "лекарственные каникулы".
46. Устройство, содержащее по меньшей мере один пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по пп.1-24, для введения пептидного конъюгата субъекту.
47. Набор, содержащий по меньшей мере один пептидный конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль или сольват по пп. 1-24 и также содержащий упаковку и инструкцию по применению.
45.
45.
45.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023925
023925
- 1 -
- 1 -
023925
023925
- 1 -
- 1 -
023925
023925
- 1 -
- 1 -
023925
023925
- 1 -
- 1 -
023925
023925
- 4 -
- 3 -
023925
023925
- 25 -
023925
023925
- 28 -
- 28 -
023925
023925
- 29 -
- 29 -
023925
023925
- 31 -
- 31 -
023925
023925
- 36 -
- 36 -
023925
023925
- 61 -
- 61 -
023925
023925
- 65 -
- 65 -
023925
023925
- 66 -
- 66 -
023925
- 69 -
- 70 -
023925
- 69 -
- 70 -
023925
023925
- 72 -
- 72 -