[RU]

1. Способ лечения, облегчения симптомов, предотвращения прогрессирования или профилактики ожирения у млекопитающих, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 селективно вызывает в больных клетках млекопитающего переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении нормализованного митохондриального окислительного фосфорилирования.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, по существу, не вызывает в нормальных клетках млекопитающих переключения клеточного энергетического метаболизма в направлении митохондриального окислительного фосфорилирования.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающим является человек (или не являющееся человеком млекопитающее).

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ожирение поддается или чувствительно к воздействию коэнзима Q10, или его метаболитов, или аналогов.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что ожирение характеризуется дисрегуляцией функции митохондриального окислительного фосфорилирования, что приводит к изменению регуляции генов и/или взаимодействию белок-белок, что способствует или непосредственно приводит к ожирению.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 включает: (а) бензохинон или по меньшей мере одну молекулу, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, и (b) по меньшей мере одну молекулу, которая способствует синтезу и/или присоединению изопреноидных единиц к бензохиноновому кольцу.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что вышеупомянутая по меньшей мере одна молекула, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, включает в себя L-фенилаланин, DL-фенилаланин, D-фенилаланин, L-тирозин, DL-тирозин, D-тирозин, 4-гидроксифенилпируват, 3-метокси-4-гидроксиманделат (ванилилмандалата или VMA), ванилиновую кислоту, пиридоксин или пантенол.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что вышеупомянутая по меньшей мере одна молекула, которая способствует синтезу и/или присоединению изопреноидных единиц к бензохиноновому кольцу, включает в себя фенилацетат, 4-гидроксибензоат, мевалоновую кислоту, ацетилглицин, ацетил-СоА или фарнезил.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 включает: (a) один или несколько из L-фенилаланина, L-тирозина и 4-гидроксифенилпирувата; (b) один или несколько из 4-гидроксибензоата, фенилацетата и бензохинона.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10: (a) ингибирует экспрессию Bcl-2 и/или стимулирует экспрессию каспазы-3 и/или (b) ингибирует клеточную пролиферацию.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10 в тканях человека, подвергающегося лечению, отличается от концентрации в контрольном стандарте ткани человека, находящегося в здоровом или нормальном состоянии.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что форма коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10, вводимого человеку, отличается от преобладающей формы, находимой в системе кровотока у человека.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество фармацевтической композиции, достаточное для лечения ожирения у человека: a) повышающе регулирует или понижающе регулирует митохондриальное окислительное фосфорилирование или b) модулирует анаэробное использование глюкозы и/или биосинтез лактата.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что лечение происходит благодаря взаимодействию коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10 с HNF4-альфа или трансальдолазой.

16. Способ по п.1, где метаболическим нарушением является коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, действующий на окисление в митохондриях бета-клеток, уменьшающий размер адипоцитов и/или контролирующий уровни кортизола.

17. Способ избирательного усиления митохондриального окислительного фосфорилирования в больных клетках млекопитающих, нуждающихся в лечении ожирения, включающий введение вышеупомянутому млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, тем самым избирательно усиливая митохондриальное окислительное фосфорилирование в вышеупомянутых больных клетках млекопитающего.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что дополнительно включает: а) повышающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из молекул, перечисленных в табл. 2-4, 6-28 и 63-68, имеющих позитивное кратное изменение; и/или понижающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из молекул, перечисленных в табл. 2-4, 6-28 и 63-68, имеющих негативное кратное изменение; или b) модулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из HNF4-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11, XIAP, 20 BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, сМус, трансальдолазы 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазы, 4-гидробензоата, цитозольного фактора нейтрофилов 2, синтазы оксида азота 2А, супероксиддисмутазы 2, VDAC, Вах канала, ANT, Цитохрома с, комплекса I, комплекса II, комплекса III, комплекса IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam киназы II.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что вышеупомянутое лечение, облегчение симптомов, предотвращение прогрессирования или профилактика ожирения приводят к снижению объема талии, снижению содержания внутреннего жира, снижению уровня триглицеридов в плазме натощак или повышению уровня липопротеина высокой плотности натощак.

20. Способ по любому из пп.1, 17-19, отличающийся тем, что дополнительно включает введение дополнительного терапевтического агента.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что дополнительный терапевтически агент выбирается из группы, состоящей из агентов для лечения сахарного диабета, агентов для лечения осложнений диабета, антигиперлипемических агентов, гипотензивных или антигипертензивных агентов, агентов от ожирения, диуретиков, химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов и иммуносупрессоров.

22. Способ уменьшения уровней липидов у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10.

23. Способ лечения, облегчения симптомов, профилактики прогрессирования или предупреждения поддающегося воздействию коэнзима Q10 нарушения у млекопитающих, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, где коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 избирательно вызывает в больных клетках млекопитающего переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении уровней гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования, наблюдаемых в нормальных клетках млекопитающих при нормальных физиологических условиях, где нарушением, поддающимся воздействию коэнзима Q10, является ожирение.

24. Способ по п.1, 17, 22 или 23, в котором фармацевтическая композиция содержит от 1 до 25 мас.% коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10.

(57) Реферат / Формула:

1. Способ лечения, облегчения симптомов, предотвращения прогрессирования или профилактики ожирения у млекопитающих, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 селективно вызывает в больных клетках млекопитающего переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении нормализованного митохондриального окислительного фосфорилирования.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, по существу, не вызывает в нормальных клетках млекопитающих переключения клеточного энергетического метаболизма в направлении митохондриального окислительного фосфорилирования.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающим является человек (или не являющееся человеком млекопитающее).

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ожирение поддается или чувствительно к воздействию коэнзима Q10, или его метаболитов, или аналогов.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что ожирение характеризуется дисрегуляцией функции митохондриального окислительного фосфорилирования, что приводит к изменению регуляции генов и/или взаимодействию белок-белок, что способствует или непосредственно приводит к ожирению.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 включает: (а) бензохинон или по меньшей мере одну молекулу, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, и (b) по меньшей мере одну молекулу, которая способствует синтезу и/или присоединению изопреноидных единиц к бензохиноновому кольцу.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что вышеупомянутая по меньшей мере одна молекула, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, включает в себя L-фенилаланин, DL-фенилаланин, D-фенилаланин, L-тирозин, DL-тирозин, D-тирозин, 4-гидроксифенилпируват, 3-метокси-4-гидроксиманделат (ванилилмандалата или VMA), ванилиновую кислоту, пиридоксин или пантенол.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что вышеупомянутая по меньшей мере одна молекула, которая способствует синтезу и/или присоединению изопреноидных единиц к бензохиноновому кольцу, включает в себя фенилацетат, 4-гидроксибензоат, мевалоновую кислоту, ацетилглицин, ацетил-СоА или фарнезил.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 включает: (a) один или несколько из L-фенилаланина, L-тирозина и 4-гидроксифенилпирувата; (b) один или несколько из 4-гидроксибензоата, фенилацетата и бензохинона.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10: (a) ингибирует экспрессию Bcl-2 и/или стимулирует экспрессию каспазы-3 и/или (b) ингибирует клеточную пролиферацию.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10 в тканях человека, подвергающегося лечению, отличается от концентрации в контрольном стандарте ткани человека, находящегося в здоровом или нормальном состоянии.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что форма коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10, вводимого человеку, отличается от преобладающей формы, находимой в системе кровотока у человека.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество фармацевтической композиции, достаточное для лечения ожирения у человека: a) повышающе регулирует или понижающе регулирует митохондриальное окислительное фосфорилирование или b) модулирует анаэробное использование глюкозы и/или биосинтез лактата.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что лечение происходит благодаря взаимодействию коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10 с HNF4-альфа или трансальдолазой.

16. Способ по п.1, где метаболическим нарушением является коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, действующий на окисление в митохондриях бета-клеток, уменьшающий размер адипоцитов и/или контролирующий уровни кортизола.

17. Способ избирательного усиления митохондриального окислительного фосфорилирования в больных клетках млекопитающих, нуждающихся в лечении ожирения, включающий введение вышеупомянутому млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, тем самым избирательно усиливая митохондриальное окислительное фосфорилирование в вышеупомянутых больных клетках млекопитающего.

18. Способ по п.17, отличающийся тем, что дополнительно включает: а) повышающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из молекул, перечисленных в табл. 2-4, 6-28 и 63-68, имеющих позитивное кратное изменение; и/или понижающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из молекул, перечисленных в табл. 2-4, 6-28 и 63-68, имеющих негативное кратное изменение; или b) модулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из HNF4-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11, XIAP, 20 BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, сМус, трансальдолазы 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазы, 4-гидробензоата, цитозольного фактора нейтрофилов 2, синтазы оксида азота 2А, супероксиддисмутазы 2, VDAC, Вах канала, ANT, Цитохрома с, комплекса I, комплекса II, комплекса III, комплекса IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam киназы II.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что вышеупомянутое лечение, облегчение симптомов, предотвращение прогрессирования или профилактика ожирения приводят к снижению объема талии, снижению содержания внутреннего жира, снижению уровня триглицеридов в плазме натощак или повышению уровня липопротеина высокой плотности натощак.

20. Способ по любому из пп.1, 17-19, отличающийся тем, что дополнительно включает введение дополнительного терапевтического агента.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что дополнительный терапевтически агент выбирается из группы, состоящей из агентов для лечения сахарного диабета, агентов для лечения осложнений диабета, антигиперлипемических агентов, гипотензивных или антигипертензивных агентов, агентов от ожирения, диуретиков, химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов и иммуносупрессоров.

22. Способ уменьшения уровней липидов у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10.

23. Способ лечения, облегчения симптомов, профилактики прогрессирования или предупреждения поддающегося воздействию коэнзима Q10 нарушения у млекопитающих, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, где коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 избирательно вызывает в больных клетках млекопитающего переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении уровней гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования, наблюдаемых в нормальных клетках млекопитающих при нормальных физиологических условиях, где нарушением, поддающимся воздействию коэнзима Q10, является ожирение.

24. Способ по п.1, 17, 22 или 23, в котором фармацевтическая композиция содержит от 1 до 25 мас.% коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10.

---

Евразийское 023913 (13) B1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45) Дата публикации и выдачи патента 2016.07.29
(21) Номер заявки 201101523
(22) Дата подачи заявки
2010.05.11
(51) Int. Cl.
A61K31/122 (2006.01) A61K31/12 (2006.01) A61K31/194 (2006.01) A61K31/19 (2006.01) A61P3/00 (2006.01)
(54)
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ ЭПИМЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛИ, МНОГОАСПЕКТНЫЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ИЛИ ФАКТОРЫ ВЛИЯНИЯ
(31) 61/177,241; 61/177,243; 61/177,244; 61/177,246
(32) 2009.05.11
(33) US
(43) 2012.10.30
(86) PCT/US2010/034447
(87) WO 2010/132502 2010.11.18
(71) (73) Заявитель и патентовладелец:
БЕРГ ФАРМА ЭЛЭЛСИ (US)
(72) Изобретатель:
Нэрейн Найвен Раджин, Маккук Джон Патрик, Сарангараджан Рангапрасад (US)
(74) Представитель:
Соболев А.Ю. (RU)
(56) WO-A2-2008156654 US-A1-20030235812 US-A1-20040101874 US-A1-20020049176
(57) Описаны способы и композиции для лечения метаболических нарушений у людей с использованием эпиметаболических переключателей, многоаспектных внутриклеточных молекул или факторов влияния.
Родственные заявки
Настоящая заявка заявляет о приоритете предварительной заявки на патент США №61/177241, поданной 11 мая 2009, озаглавленной "Способы лечения онкологических нарушений, использующие эпиметаболический переключатель (Коэнзим Q10)" (Attorney Docket No.: 117732-00601), предварительной заявки на патент США № 61/177243, поданной 11 мая 2009, озаглавленной "Способы лечения онкологических нарушений, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспктные внутриклеточные молекулы или факторы влияния" (Attorney Docket No.: 117732-00701), предварительной заявки на патент США № 61/177244, поданной 11 мая 2009, озаглавленной "Способы диагностики онкологических нарушений, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния" (Attorney Docket No.: 117732-00801), предварительной заявки на патент США № 61/177245, поданной 11 мая 2009, озаглавленной "Способы лечения метаболических расстройств, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспектные внутриклеточные молекулы или факторы влияния" (Attorney Docket No.: 117732-00901), и предварительной заявки на патент США № 61/177246, поданной 11 мая 2009, озаглавленной "Способы диагностики метаболических расстройств, использующие эпиметаболические переключатели, многоаспктные внутриклеточные молекулы или факторы влияния" (Attorney Docket No.: 117732-01001). Полное содержание каждой из вышеупомянутых заявок включено в настоящую заявку путем ссылки.
Уровень техники
Исследование относится к лечению, предотвращению и уменьшению метаболических расстройств, таких как диабет и ожирение.
Когда уровень глюкозы в крови возрастает после еды, инсулин секретируется и стимулирует клетки периферийных тканей (скелетной мускулатуры и жировые) активно поглощать глюкозу из крови в качеств источника энергии. Потеря гомеостаза глюкозы в результате дисрегуляции секреции или действия инсулина обычно приводит к метаболическим расстройствам, таким как диабет, который может запускаться или осложняться ожирением. Поскольку такое состояние часто приводит к смерти, необходимо выработать стратегии для восстановления адекватного выведения глюкозы из кровотока.
Хотя диабет может возникать вторично при любом состоянии, которое приводит к сильному повреждению поджелудочной железы (например, панкреатит, опухоли, прием определенных лекарств, таких как кортикостероиды или пентамидин, передозировка железа (например, гемохроматоз), приобретенные или генетические эндокринные нарушения и хирургическое вмешательство), наиболее распространенные формы диабета обычно возникают из первичных нарушений инсулиновой сигнальной системы. Существуют два основных типа диабета, называемые диабет типа 1 (также известный как ин-сулинзависимый диабет (ИЗД)) и диабет типа 2 (также известный как инсулиннезависимый диабет (ИНЗД)). И тот, и другой тип диабета создают одинаковые долговременные проблемы, несмотря на различные механизмы патогенеза.
Диабет типа 1, который отвечает за примерно 10% всех случаев первичных диабетов, является ор-гано-специфичным аутоиммунным заболеванием, характеризующимся обширным разрушением инсу-лин-вырабатывающих бета-клеток панкреатической железы. Последующее уменьшение выработки инсулина неизбежно приводит к дерегуляции метаболизма глюкозы. Хотя введение инсулина приносит значительную пользу пациентам, страдающим от этого нарушения, короткий период полувыведения инсулина из сыворотки является главным препятствием для поддержания нормоглицемии. Альтернативным лечением является трансплантация островковых клеток, но эта стратегия имеет ограниченный успех.
Диабет типа 2, который встречается чаще всего, характеризуется дерегуляцией секреции инсулина и/или пониженной реакцией периферийных тканей на инсулин, т.е. резистентностью к инсулину. Хотя патогенез диабета типа 2 остается неясным, эпидемиологические исследования подтверждают, что эта форма диабета возникает из совокупности множества генетических дефектов или полиморфизмов, каждый из которых вносит свой вклад в риск развития нарушения и модифицируется факторами окружения, включая избыточный вес, питание, отсутствие активности, лекарства и избыточное потребление алкоголя. Хотя доступны различные терапевтические средства для лечения диабета типа 2, они связаны с различными вредными для здоровья побочными эффектами. Соответственно, пациентам, у которых диагностируется диабет типа 2 или риск его развития, часто советуют поменять образ жизни, включая потерю веса, изменения в питании, физические упражнения и умеренное потребление алкоголя. Однако таких изменений образа жизни недостаточно для восстановления того ущерба, который диабет причинил сосудам и внутренним органам.
Коэнзим Q10, также называемый здесь CoQ10, Q10, убихинон или убидекаренон, является популярной пищевой добавкой, и в капсульной форме может продаваться в продуктовых магазинах, магазинах здоровой пищи, аптеках и тому подобных магазинах, в качестве витаминоподобной добавки, помогающей защитить иммунную систему благодаря антиоксидантным свойствам убихинона, восстановленной формы CoQ10. CoQ10 известен специалистам и описан в международной публикации № WO 2005/069916, включенной в данное описание в полном объеме путем ссылки.
CoQ10 обнаруживается в большинстве тканей человеческого тела и тканях других млекопитаю
щих. Тканевое распределение и окислительно-восстановительный потенциал CoQ10 у людей рассмотрены! в обзорной статье Bhagavan and Chopra (2006, Free Radical Research 40(5), 445-453. Авторы сообщают, что "как общее правило, ткани с высокими энергетическими требованиями или метаболической активностью, такие как сердце, почки, легкие и мускулы, содержат сравнительно большие концентрации CoQ10." Авторы в дальнейшем сообщают, что "[а] основное количество CoQ10 в тканях находится в востановленной форме в виде гидрохинона или унихинона, исключение составляют мозг и легкие," что "видимо, отражает повышенный окислительный стресс в этих двух тканях." В частности, Bhagavan сообщает, что в сердце, почках, легких, мускулах, кишечнике и крови (плазма), около 61, 75, 95, 65, 95 и 96%, соответственно, CoQ10 находится в востановленной форме. Подобным образом, Ruiz-Jiminez, et al. (2007 J. Chroma A, 1175, 242-248) сообщает, что при оценке количества Q10 и восстановленной формы Q10 (Q10H2) в плазме человека большинство (90%) молекул было обнаружено в восстановленной форме.
CoQ10 очень липофилен и практически нерастворим в воде. Вследствие его нерастворимости в воде, ограниченной растворимости в жирах и сравнительно большого молекулярного веса эффективность перорального приема CoQ10 является низкой. Bhagavan и Chopra сообщают, что "в одном исследовании на крысах сообщалось, что было усвоено только около 2-3% орально введенного CoQ10." Bha-gavan и Chopra также сообщают, что "данные исследований на крысах показывают, что CoQ10 восстанавливается до убихинола или во время, или сразу же после абсорбции в кишечнике."
Поскольку имеющиеся в настоящее время стратегии лечения диабета не являются оптимальными, существует настоятельная потребность в лекарствах, которые являются более эффективными и не имеют таких вредных побочных эффектов.
Сущность изобретения
Настоящее исследование частично основано на том открытии, что митохондриальная дисфункция связана с широким спектром болезней, включая метаболические болезни (такие как диабет и ожирение), и что определенные эндогенные молекулы, такие как CoQ10, играют ключевую роль в успешной диагностике, лечении и предотвращении таких метаболических болезней. Изобретение также частично основано на том открытии, что эти ключевые эндогенные молекулы играют важную роль в поддержании нормальной митохондриальной функции путем прямого влияния на окислительное фосфорилиро-вание, и что восстановление или стимуляция более близкого к норме митохондриального окислительного фосфорилирования может эффективно лечить или предотвращать прогрессию метаболических болезней. Изобретение также основано на открытии, что определенный тип факторов влияния (например, CoQ10) может избирательно вызывать, в больных клетках при метаболических болезнях, переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении более близкого к норме (нормализованного) митохондриального окислительного фосфорилирования. Эти факторы влияния способны модулировать внутриклеточные мишени, которые служат ключевыми индикаторами метаболических болезней (таких как диабет) в зависимости от соответствующих терапевтических критериев.
Настоящее исследование также основано, по меньшей мере частично, на открытии, что применение эндогенного Коэнзима Q10 (также называемого здесь CoQ10 или Q10) к клеткам приводит к апоп-тозной реакции. Апоптозная реакция предпочтительно вызывается в раковых клетках. Наблюдался время- и дозозависимый эффект уровней митохондриального Q10, где через 48 ч уровень в митохондриях клеток возрос в шесть раз. Настоящее изобретение дополнительно основано на неожиданном открытии, что Q10 сохраняется в замещенной окисленной форме (про-оксидантной) и не превращается в востановленную (анти-оксидантную) форму Q10H2 в каком-либо значительном количестве. Изобретение основывается также на открытии, что уровни значительного числа белков и мРНК модулируются в клетках, подвергавшихся воздействию Q10. Было обнаружено, что эти модулированные белки группируются в несколько клеточных путей метаболизма, включая апоптозы, биологию рака и рост клеток, гликолиз и метаболизм, молекулярный транспорт и клеточный сигналинг.
Данные заявителей, описанные здесь, дают новый взгляд на механизм действия Q10. В особенности, не имея намерения ограничиваться теорией, открытия заявителей показывают, что Q10 вызывает метаболический сдвиг в микроокружении клеток. Про многие болезни известно, что они связаны с измененным метаболическим статусом. Например, известно, что у раковых клеток особый метаболизм (эффект Варбурга), вследствие чего большинство раковых клеток вырабатывают энергию преимущественно путем гликолиза с последующей ферментацией молочной кислоты в цитозоле, а не путем окислительного фосфорилирования (окисления пирувата) в митохондриях. В другом примере метаболические нарушения, такие как диабет и ожирение, связаны с измененным метаболизмом глюкозы.
Соответственно, в изобретении предложен, в первом аспекте, способ лечения, облегчения симптомов, подавления прогрессии или предотвращения поддающихся влиянию CoQ10 нарушений у млекопитающих, способ включает введение при необходимости млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один фактор влияния (фактор-в), где фактор влияния избирательно вызывает в больных клетках млекопитающих переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении уровней гликолиза и митохондри-ального окислительного фосфорилирования, наблюдаемые в нормальных клетках млекопитающих при
нормлальных физиологических условиях.
В одном воплощении изобретения поддающееся влиянию CoQ10 нарушение является метаболическим заболеванием.
Изобретение предоставляет в другом аспекте способ лечения, облегчения симптомов, подавления прогрессии или предотвращения метаболического нарушения у млекопитающих, способ включает введение при необходимости млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один фактор влияния (фактор-в), где фактор влияния избирательно вызывает в больных клетках млекопитающих переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении нормализованного окислительного фосфорилирования.
В одном воплощении изобретения фактор влияния, по большей части, не вызывает переключения клеточного энергетического метаболизма в направлении митохондриального окислительноя фосфори-лирования в нормальных клетках млекопитающих.
В одном воплощении изобретения млекопитающим является человек (или не являющееся человеком млекопитающее).
В одном воплощении изобретения метаболическое нарушение реагирует или чувствительно к лечению коэнзимом Q10 или его метаболитами или аналогами.
В одном воплощении изобретения метаболическое нарушение характеризуется дисрегуляцией функции митохондриального окислительного фосфорилироавния, которая приводит к изменению регуляции генов и/или взаимодействия белок-белок, что способствует или непосредственно приводит к метаболической болезни.
В одном воплощении изобретения фактор влияния включает в себя: (а) бензохинон или, по меньшей мере, одну молекулу, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, и (b) по меньшей мере, одну молекулу, которая способствует синтезу и/или присоединению изопреноидных частиц к бензохиноновому кольцу.
В одном воплощении изобретения, по меньшей мере, одна вышеупомянутая молекула, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, включает в себя: L-фенилаланин, DL-фенилаланин, D-фенилаланин, L-тирозин, DL-тирозин, D-тирозин, 4-гидрокси-фенилпируват, 3-метокси-4-гидроксиманделат (ванилилманделат или VMA), ванилиновую кислоту, пироксин или пантенол.
В одном воплощении изобретения, по меньшей мере, одна вышеупомянутая молекула, которая способствует синтезу и/или прикреплению изопреноидных единиц к бензохиноновому кольцу, включает в себя: фенилацетат, 4-гидроксибензоат, мевалоновую кислоту, ацетилглицин, ацетил-СоА или фар-незил.
В одном воплощении изобретения фактор влияния включает в себя: (а) один или несколько из L-фенилаланина, L-тирозина и 4-гидроксифенилпирувата; и, (b) один или несколько из 4-гидроксибен-зоата, фенилацетата и бензохинона.
В одном воплощении изобретения фактор влияния: (а) ингибирует экспрессию Bcl-2 и/или стимулирует экспрессию каспазы-3; и/или, (b) ингибирует клеточную пролиферацию.
В одном воплощении изобретения фактор влияния является многоаспектной внутриклеточной молекулой (МВМ). В одном воплощении изобретения МВМ выбирается из: альфа-кетоглутарата/ аль-фа-кетоглутаровой кислоты, малата/яблочной кислоты, сукцината/янтарной кислоты, глюкозамина, аденозина, аденозиндифосфата, глюкоуронида/глюкуроновой кислоты, никотиновой кислоты, динук-леотида никотиновой кислоты, аланина/фенилаланина, пиридоксина, тиамина или флавинаденинди-нуклеотида. В одном воплощении изобретения многоаспектная внутриклеточная молекула выбирается из группы, состоящей из ацетил Со-А, пальмитоил Со-А, L-карнитина и аминокислот (например, тирозина, фенилаланина и цистеина).
В одном воплощении изобретения фактор влияния является эпиметаболическим переключателем (эпи-переключателем). В одном воплощении изобретения эпиметаболический переключатель выбирается из трансалдолазы, транскетолазы, сукцинил СоА синтазы, пируваткарбоксилазы или рибофлавина. В одном воплощении изобретения эпиметаболический переключатель выбирается из группы, состоящей из коэнзима Q10, витамина D3 и компонентов внеклеточного матрикса. В одном воплощении изобретения, эпиметаболический переключатель является коэнзимом Q10. В одном воплощении изобретения компоненты внеклеточного матрикса выбираются из группы, состоящей из фибронектина, имму-номодуляторов (TNFa или интерлейкина), ангиогенных факторов; и факторов апоптоза.
В одном воплощении изобретения лечение получила выборка людей, и по меньшей мере 25% выборки имели системный уровень фактора влияния, который был терапевтическим для болезни, на которую было направлено лечение. В других воплощениях лечение получила выборка людей, и по меньшей мере мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или более из выборки имели системный уровень коэнзима Q10, который был терапевтическим для болезни, на которую было направлено лечение. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует считать частью этого изобретения, например, от 10 до 25%, от 15 до 35%, от 25 до 50%, от 35 до 60%, от 40 до 70%, от 50 до 75%, от 60 до 85% или от 70 до 90%.
В одном воплощении изобретения метаболическое нарушение, которое подвергают лечению, не
является заболеванием, которое обычно лечат путем местного воздействия, например, раком молочной железы или простаты, с ожиданием системной доставки активного агента на терапевтически эффективных уровнях.
В одном воплощении изобретения концентрация фактора влияния в тканях человека, подвергающегося лечению, отличается от концентрации в контрольном стандарте ткани человека, находящейся в здоровом или нормальном состоянии.
В одном воплощении изобретения форма фактора влияния, введенного человеку, отличается от преобладающей формы, находящейся в общей системе циркуляции у человека. В одном воплощении изобретения фактор влияния вводится человеку в окисленной форме.
В одном воплощении изобретения количество, достаточное для лечения метаболического нарушения у человека, повышающе регулирует или понижающе регулирует митохондриальное окислительное фосфорилирование.
В одном воплощении изобретения количество, достаточное для лечения метаболического нарушения у человека, модулирует анаэробное использование глюкозы и/или биосинтез лактата.
В другом аспекте изобретения предоставлен способ лечения или профилактики метаболического нарушения у людей, включающий в себя введение фактора влияния людям в количестве, достаточном для лечения или предотвращения метаболического нарушения, гдефактор влияния вводится таким образом, что в течение лечения сохраняет свою окисленную форму, тем самым леча или предотвращая метаболическое нарушение.
В одном воплощении изобретения, форма фактора влияния, вводимого человеку, отличается от преобладающей формы, находящейся в общей системе циркуляции у человека.
Изобретение предоставляет, в еще одном аспекте, способ лечения или профилактики метаболического нарушения у людей, включающий отбор пациентов, подверженных метаболическому заболеванию, и введение вышеупомянутым людям терапевтически эффективного количества фактора влияния, способного усиливать митохондриальное окислительное фосфорилирование и опционально блокировать анаэробное использование глюкозы, тем самым леча или предотвращая метаболическое нарушение.
Изобретение предоставляет, в другом аспекте, способ для избирательного усиления митохондри-ального окислительного фосфорилирования в больных клетках млекопитающих, нуждающихся в лечении метаболического нарушения, способ включает в себя: введение вышеупомянутому млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтического состава, содержащего, по меньшей мере, один фактор-в, тем самым избирательно усиливая митохондриальное окислительное фосфорили-рование в вышеупомянутых больных клетках млекопитающего.
В одном воплощении способов изобретения способ также включает в себя повышающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из молекул, перечисленных в таблицах 2-4, таблицах 6-28 и таблицах 63-68, имеющих позитивное кратное изменение; и/или понижающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из молекул, перечисленных в таблицах 2-4, таблицах 6-28 и таблицах 63-68, имеющих негативное кратное изменение, тем самым леча или предотвращая метаболическое нарушение. В одном воплощении изобретения способ также включает в себя модуляцию экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из HOT'4-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L, XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, сМус, трансалдолазы 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазы, 4-гидробензоата, нейтрофильного цитозольного фактора 2, оксида азота синтазы 2А, супероксида дисмутазы 2, VDAC, Вах канала, ANT, Цитохрома с, комплекса 1, комплекса II, комплекса III, комплекса IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam Киназы II.
В одном воплощении способов изобретения лечение происходит посредством взаимодействия фактора влияния с молекулой, выбранной из группы, состоящей из молекул, перечисленных в таблицах 2-4, таблицах 6-28 и таблицах 63-68. В одном воплощении изобретения лечение происходит посредством взаимодействия фактора влияния с белком, выбранным из группы, состоящей из HOT'4-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, сМус, трансаль-долазы 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазы, 4-гидробензоата, цитозольного фактора нейтрофи-лов 2, синтазы оксида азота 2А и супероксиддисмутазы 2, VDAC, Вах канала, ANT, цитохрома с, комплекса I, комплекса II, комплекса III, комплекса IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam Киназы II. В одном воплощении изобретения, лечение происходит посредством взаимодействия фактора-в с HNF4-альфа. В одном воплощении изобретения лечение происходит посредством взаимодействия фактора-в с трансальдолазой.
В одном воплощении способов изобретения метаболическое нарушение выбирается из группы, состоящей из диабета, ожирения, преддиабета, Метаболического Синдрома и любого ключевого элемента метаболического расстройства.
В одном воплощении изобретения метаболическое нарушение является диабетом, и фактор-в влияет на функцию бета-клеток, метаболизм инсулина и/или депонирование глюкагона.
В одном воплощении изобретения, метаболическое нарушение является ожирением, и фактор-в
действует на окисление в митохондриях бета-клеток, уменьшает размер адипоцитов и/или контролирует уровни кортизола.
В одном воплощении изобретения метаболическое нарушение является кардиоваскулярной болезнью, и действие фактора-в уменьшает пролиферацию клеток гладкой мускулатуры в средней оболочке стенки аорты, перикисное окисление липидов, синтез тромбоксана-ах2, TNFa, IL-1B, агрегацию тромбоцитов, снижение образования оксида азота (NO), депонирование тромбоцитов и/или нормализует гликемический контроль.
В одном воплощении изобретения, ключевые элементы метаболического нарушения включают нарушенную гликемию натощак, нарушенную толерантность к глюкозе, увеличенный объем талии, повышенное содержание внутреннего жира, повышенный уровень глюкозы в плазме натощак, повы-шенныуй уровень триглицеридов в плазме натощак, пониженный уровень липопротеина высокой плотности натощак, повышенное кровяное давление, резистентность к инсулину, гиперинсулинемию, нарушения сердечно-сосудистой системы, застойную сердечную недостаточность, повышенный уровень норэпинефрина в плазме, повышенный уровень связанных с сердечно-сосудистой системой факторов воспаления, повышенный уровень в плазме факторов, усиливающих дисфункцию сосудистого эндотелия, гиперлипопротеинемию, артериосклероз или атеросклероз, гиперфагию, гиперглицемию, гиперли-пидемию и гипертензию или повышенное кровяное давление, повышенные уровни в плазме постпран-диального триглицерида или свободных жирных кислот, повышенный клеточный окислительный стресс или его маркеры в плазме, повышенный гиперкоагуляционный статус в плазме, жировой гепа-тоз, болезнь почек, включая почечную недостаточность.
В одном воплощении способов изобретения способ также включает введение дополнительного терапевтического агента, например агентов для лечения сахарного диабета, агентов для лечения осложнений диабета, антигиперлипемических агентов, гипотензивных или антигипертензивных агентов, агентов от ожирения, диуретиков, химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов и иммуносупрессоров. В одном воплощении способов изобретения метаболическое нарушение выбирается из группы, состоящей из диабета, ожирения, преддиабета, Метаболического Синдрома и любого ключевого элемента метаболического расстройства. В одном воплощении изобретения, ключевые элементы метаболического нарушения выбираются из группы, состоящей из нарушенной гликемии натощак, нарушенной толерантности к глюкозе, увеличенного объема талии, повышенного содержания внутреннего жира, повышенного уровеня глюкозы в плазме натощак, повышенного уровня триглице-ридов в плазме натощак, пониженного уровня липопротеина высокой плотности натощак, повышенного кровяного давления, резистентности к инсулину, гиперинсулинемии, нарушения сердечнососудистой системы, застойной сердечной недостаточности, повышенного уровня норэпинефрина в плазме, повышенного уровня связанных с сердечно-сосудистой системой факторов воспаления, повышенного уровня в плазме факторов, усиливающих дисфункцию сосудистого эндотелия, гиперлипопро-теинемии, артериосклероза или атеросклероза, гиперфагии, гиперглицемии, гиперлипидемии и гипер-тензии или повышенного кровяного давления, повышенных уровней в плазме постпрандиального триг-лицерида или свободных жирных кислот, повышенного клеточного окислительного стресса или его маркеров в плазме, повышенного гиперкоагуляционного статуса в плазме, жирового гепатоза, болезни почек, включая почечную недостаточность.
В одном воплощении способов изобретения способ также включает введение дополнительного терапевтического агента, например, агента для лечения сахарного диабета, агента для лечения осложнений диабета, антигиперлипемического агента, гипотензивного или антигипертензивного агента, агента от ожирения, диуретиков, химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов и иммуносупрессоров.
В дальнейшем аспекте изобретения предоставлен способ идентификации агента, который эффективен в лечении метаболического нарушения, способ включает выбор фактора влияния, идентификацию фактора влияния, способного переключать метаболический статус клетки, и определение того, эффективен ли фактор влияния в лечении метаболического нарушения; таким образом идентифицируется агент, эффективный в лечении метаболического нарушения.
В одном воплощении изобретения фактор влияния идентифицируется как способный переключать метаболический статус клетки путем оценки изменений в хотя бы одном из следующих параметров: экспрессии мРНК, экспрессии белка, концентрации липидов или метаболитов, уровнях биоэнергетических молекул, клеточной энергетике, функции митохондрий и числу митохондрий.
В одном воплощении изобретения фактор влияния, эффективный в лечении метаболического нарушения, может уменьшать уровни глюкозы или уровни липидов у пациента.
В еще одном аспекте изобретения предоставлен способ идентификации многоаспектной внутриклеточной молекулы, включающий в себя контакт клетки с эндогенной молекулой; мониторинг действия эндогенной молекулы на профиль клеточного микроокружения; и идентификацию эндогенной молекулы, которая вызывает изменение профиля клеточной микросреды, таким образом идентифицируется многоаспектная внутриклеточная молекула.
В одном воплощении изобретения способ также включает в себя сравнение влияния эндогенной
молекулы на профиль клеточного микроокружения больной клетки и нормальной контрольной клетки; и идентификацию эндогенной молекулы, которая вызывает различные изменения в профиле клеточной микросреды больной клетки и нормальной контрольной клетки; таким образом идентифицируется
МВМ.
В одном воплощении изобретения действие на профиль клеточного микроокружения определяется путем оценки изменения уровня или активности клеточной молекулы, выбранной из группы, состоящей из мРНК, белков, липидов и метаболитов.
В еще одном аспекте изобретения предоставлен способ идентификации эпиметаболического переключателя, включающий в себя сравнение молекулярных профилей двух или более клеток или тканей, где две или более клеток или тканей находятся на различных стадиях нарушения; идентификацию молекулы из молекулярных профилей, для которых изменение уровня коррелирует со стадией нарушения; введение молекулы в клетку и оценку возможности молекулы переключить метаболический статус клетки; где молекула, способная переключить метаболический статус клетки, идентифицируется как эпиметаболический переключатель.
В одном воплощении изобретения молекулярный профиль выбирается из группы, состоящей из профиля метаболитов, профиля липидов, профиля белков или профиля РНК.
В одном воплощении изобретения молекула не оказывает негативного воздействия на здоровье или рост нормальных клеток.
В другом аспекте изобретения предоставлена композиция, включающая агента, идентифицированного в соответствии с любым из способов изобретения. Изобретение также предоставляет, в родственном аспекте, набор, включающий состав изобретения.
В другом аспекте изобретения предоставлен способ уменьшения уровней глюкозы у пациентов, включащий введение пациенту эффективного количества состава изобретения. Изобретение также предоставляет, в родственном аспекте, способ уменьшения уровней липидов у пациента, включащий введение пациенту эффективного количества состава изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - чувствительность SK-MEL-28 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 2 - чувствительность SKBR3 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 3 - чувствительность РаСа2 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 4 - чувствительность РС-3 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 5 - чувствительность HepG2 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 6 - чувствительность MCF-7 к 24 ч воздействия Q10, оцененная по количеству ранних и поздних апоптозных клеток.
Фиг. 7 - оценка апоптозных клеток после 24 ч воздействия Q10, оцененная по методу Apostrand
ELISA.
Фиг. 8 - пример гель-анализа на 2-D гель-электрофорезе. Отмечены точки, выбранные для идентификации.
Фиг. 9 - сеть взаимодействий между белками, идентифицированными в 2-D гель электрофорезе, модулированными Q10 в SK-MEL-28 клетках.
Фиг. 10 - пентозофосфатный путь, адаптированный по Verhoeven et al. (Am. J. Hum. Genet. 2001
68(5): 1086-1092).
Фиг. 11 - 2-D гель богатого митохондриями материала SK-MEL-28 клеток. Отмечены точки, исключенные и идентифицированные путем масс-спектроскопии.
Фиг. 12 - сравнительный график относительных количеств Q10, присутствующего в митохондриях SK-MEL-28 после экзогенного добавления 100 мкМ Q10 в культуральную среду.
Фиг. 13 - карта известных процессов апоптозного пути.
Фиг. 14 - анализ иммуноблоттингом Bcl-xl.
Фиг. 15 - анализ иммуноблоттингом образцов SK-MEL-28, обработанных антителами Виментин. Фиг. 16 - анализ иммуноблоттингом лизиса клеток из различных клеточных линий, оцененный с помощью пяти антител к комплексам окислительного фосфорилирования (MitoSciences #MS601). Фиг. 17 - сравнение с помощью иммуноблоттинга уровней F1-альфа. Фиг. 18 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на C-III-Core 2. Фиг. 19 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на С-П-30. Фиг. 20 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на C-IV-COX II. Фиг. 21 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на C-I-20 (ND6). Фиг. 22 - анализ иммуноблоттингом различных типов клеток на пять митохондриальных белков. Фиг. 23 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на комплекс V белка C-V-a.
Фиг. 24 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на C-III-Core 1.
Фиг. 25 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на Порин(VDAC1).
Фиг. 26 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на Циклофилин D.
Фиг. 27 - сравнение с помощью иммуноблоттинга реакции на Q10 и на Цитохром С.
Фиг. 28 - теоретическая модель Q10 (сферическая), входящего в липидсвязывающий канал HNF4альфа (1M7W.pdb) в открытую конформацию Helix 10.
Фиг. 29 - OCR в HDFa клетках в разном глюкозном состоянии в норме и при гипоксии.
Фиг. 30 - OCR в HASMC клетках в разном глюкозном состоянии в норме и при гипоксии.
Фиг. 31 - OCR значения в MCF-7 клетках рака молочной железы в отсутствие и в присутствии 31510 и стрессоров.
Фиг. 32 - OCR значения в РаСа-2 раковых клетках поджелудочной железы в отсутствие и в присутствии 31510 и стрессоров.
Подробное описание изобретения
1. Определения.
При использовании здесь каждый из следующих терминов имеет значение, соответствующее ему в этом разделе.
Термины в единственном числе, используемые в настоящем документе, относятся к одному или более (т.е., по меньшей мере, к одному) грамматическому объекту статьи. Например, "один элемент" обозначает один элемент или более одного элемента.
Термин "включая" используется здесь в значении и взаимозаменяемо с фразой "включая, но не ограничиваясь".
Термин "или" используется здесь в значении и взаимозаменяемо с термином "и/или," если только контекст прямо не указывает на другое.
Термин "такой как" используется здесь в значении и взаимозаменяемо с фразой "такой как, но не ограничиваясь".
"Пациент" или "субъект", подвергнутый лечению по способу изобретения, может означать или человека, или не являющееся человеком животное, предпочтительно млекопитающее.
"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое, будучи введено пациенту для лечения болезни, достаточно для оказания эффекта лечения болезни. Если соединение вводится для профилактики болезни, количество достаточно для избежания или отсрочки наступления болезни. "Терапевтически эффективное количество" будет варьировать в сильной зависимости от соединения, болезни и ее серьезности и возраста, веса и тому подобного у пациента, подвергаемого лечению.
"Профилактика" или "предотвращение" относится к уменьшению риска развития болезни или нарушения (т.е., причиной того, что по крайней мере один из клинических симптомов болезни не разовьется у пациента, который может быть подвержен или предрасположен к болезни, но еще не иметь ее или не показывать симптомов болезни).
Термин "профилактическое" или "терапевтическое" количество относится к введению субъекту одной или более композиций, о которых идет речь. Если введение предшествует клиническому проявлению нежелаемого состояния (например, болезни или другого нежелаемого состояния организма), тогда воздействие является профилактическим, т.е. оно предотвращает развитие в организме нежелательного состояния, а в случае если введение происходит после проявления нежелательного состояния, воздействие является терапевтическим (т.е., имеет своей целью уменьшить, улучшить или поддержать существующее нежелательное состояние или его побочные эффекты).
Термин "терапевтический эффект" относится к местному или системному эффекту у животных, особенно млекопитающих, и в первую очередь человека, причиной которого является фармакологически активное вещество. Термин таким образом относится к любому веществу, которое намереваются использовать для диагностики, курса лечения, облегчения, лечения или предотвращения болезни или в увеличении желаемого физического или ментального развития и условий у животных или людей. Фраза "терапевтически эффективное количество" означает, такое количество вещества, которое производит определенное желаемое местное или системное действие в приемлемом соотношении польза/риск, применимом к любому лечению. В некоторых вариантах воплощения терапевтически эффективное количество вещества будет зависеть от его терапевтического индекса, растворимости и тому подобного. Например, определенные композиции, раскрытые в способах настоящего изобретения, могут вводиться в достаточном количестве для получения обоснованного соотношения преимущество/риск, применимого к такому лечению.
"Пациент" означает любое животное (например, человек), включая лошадей, собак, кошек, свиней, коз, кроликов, хомяков, обезьян, морских свинок, крыс, мышей, ящериц, змей, коров, рыб и птиц.
"Метаболический путь" относится к последовательности энзим-опосредованных реакций, которые трансформируют одно соединение в другое и предоставляют промежуточные продукты и энергию для клеточных функций. Метаболический путь может быть линейным или цикличным.
"Метаболический статус" относится к молекулярному содержанию в определенной клеточной,
многоклеточной или тканевой среде в определенный момент времени, оцененному по различным химическим и биологическим показателям, которые имеют отношение к состоянию здоровья или болезни.
Термин "микрочип" относится к совокупности определенных полинуклеотидов, олигонуклеоти-дов, полипептидов (например, антител) или пептидов, синтезированных на субстрате, таком как бумага, нейлон или другой тип мембраны, фильтра, тонкой пластинки, стеклянной пластинки или любой другой твердой подложки.
Термины "нарушения" и "болезни" используются взаимозаменяемо и относятся к любому отклонению от нормальной структуры или функции любой части, органа или системы организма (или любой их комбинации). Определенная болезнь выражается по характерным симптомам и признакам, включая биологические, химические и физические изменения и часто связывается с множеством других факторов, включая, но не ограничиваясь, демографическим, окружащей среды, генетическим и медицинским историческим факторами. Определенные характерные признаки, симптомы и соответствующие факторы могут быть подсчитаны различными методами для получения важной диагностической информации.
Термин "экспрессия", используемый здесь, означает процесс, по которому полипептид образуется из ДНК. Процесс включает транскрипцию на гене мРНК и трансляцию на этой мРНК полипептида. В зависимости от контекста, в котором это выражение используется, "экспрессия" может относиться к образованию РНК, белка или и того, и другого.
Термин "уровень экспрессии гена" относится к уровню мРНК, а также пре-мРНК, образующихся трнасприптов РНК, промежуточных транскриптов, зрелой(ых) мРНК и продуктов распада, или к уровню белка, кодируемого этим геном в клетке.
Термин "модуляция" относится к повышающему регулированию (т.е. активации или стимуляции), понижающему регулированию (т.е. ингибированию или супрессии) в качестве реакции, или к тому и другому в комбинации или отдельно. "Модулятор" является композицией или молекулой, которая модулирует, и может быть, например, агонистом, антагонистом, активатором, стимулятором, супрессором или ингибитором.
Термин "промежуточный продукт биосинтеза коэнзима", используемый здесь, характеризует те соединения, которые образуются при химическом/биологическом превращении тирозина и Ацетил-СоА в убихинон. Промежуточные продукты биосинтеза коэнзима включают 3-гексапренил-4-гидроксибензоат, 3-гексапренил-4,5-дигидроксибензоат, 3-гексапренил-4-гидрокси-5-метоксибензоат, 2-гексапренил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-гексапренил-3-метил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-гекса-пренил-3-метил-5-гидрокси-6-метокси-1,4-бензохинон, 3-октапренил-4-гидроксибензоат, 2-октапре-нилфенол, 2-октапренил-6-метолксифенол, 2-октапренил-3-метил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-окта-пренил-3-метил-5-гидрокси-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-декапренил-3-метил-5-гидрокси-6-метокси-
1.4- бензохинон, 2-декапренил-3-метил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-декапренил-6-метокси-1,4-бензохинон, 2-декапренил-6-метоксифенол, 3-декапренил-4-гидрокси-5-метоксибензоат, 3-декапренил-
4.4- дигидроксибензоат, 3-декапренил-4-гидроксибензоат, 4-гидроксифенилпируват, 4-гидроксифенил-лактат, 4-гидроксибензоат, 4-гидрокициннамат и гексапренидифосфат.
Используемый здесь термин "анаэробное использование глюкозы" или "анаэробный гликолиз" относится к клеточному вырабатыванию энергии путем гликолиза, следующего после молочнокислой ферментации в цитозоле. Например, многие раковые клетки вырабатывают энергию путем анаэробного гликолиза.
Используемый здесь термин "аэробный гликолиз" или "митохондриальное окислительное фосфо-рилирование" относится к клеточному вырабатыванию энергии путем гликолиза, следующего после окисления пирувата в митохондриях.
Используемая здесь фраза "может блокировать анаэробное использование глюкозы и усиливать митохондриальное окислительное фосфорилирование" относится к способности фактора влияния (например., эпиметаболического переключателя) вызывать переключение или изменение в метаболическом статусе клетки от анаэробного гликолиза к аэробному гликолизу или митохондриальному окислительному фосфорилированию.
Теперь будет сделана детальная ссылка на предпочитаемые воплощения изобретения. Хотя изобретение будет описано в соответствии с предпочтительными воплощениями, следует понимать, что изобретение не следует ограничивать этими предпочтительными воплощениями. Напротив, изобретение включает альтернативы, модификации и эквиваленты, которые можно включить в объем и область изобретения, как определено в приложенной формуле.
II. Факторы влияния на внутреннюю среду
В настоящем изобретении представлены способы лечения метаболических нарушений путем введения фактора влияния на внутреннюю среду. "Факторы влияния на внутреннюю среду" (факторы влияния, В-факторы) являются молекулами, которые благотворным образом влияют или модулируют болезненную внутреннюю среду, давая возможность болезненной внутренней среде измениться, восстановив или поддержав нормальную или здоровую внутреннюю среду, что приводит к нормальному со
стоянию. Факторы влияния включают как многоаспектные внутриклеточные молекулы (МВМ), так и эпиметаболические переключатели (эпи-переключатели), определенные ниже. 1. Многоаспектная внутриклеточная молекула (МВМ).
Термин "многоаспектная внутриклеточная молекула (МВМ)", является выделенной версией или синтезированной версией эндогенной молекулы, которая в природе образуется в организме и/или присутствует, по меньшей мере, в одной клетке человека. МВМ характеризуется одной или более, двумя или более, тремя или более или всеми следующими функциями. МВМ способны проникать в клетку, и проникновение в клетку включает полное или частичное проникновение в клетку, пока биологически активная часть молекулы полностью не войдет в клетку. МВМ способны запускать механизмы сигнальной трансдукции и/или экспрессии генов в клетке. МВМ являются многоаспектными, поскольку молекулы одновременно обладают как терапевтическим действием, так и являются носителем, т.е. переносчиком лекарства. МВМ также являются многоаспектными, поскольку молекулы одним образом действуют на состояние болезни и другим образом на нормальное состояние. Например, в случае CoQ-10, введение CoQ-10 в клетки меланомы в присутствии VEGF приводит к снижению уровня Bcl2, который, в свою очередь, приводит к снижению онтогенетического потенциала клеток меланомы. Напротив, в нормальном фибробласте, при одновременном введении CoQ-10 и VEFG эффект на уровни Bcl2 не оказывается. Предпочительно, МВМ избирательно действует на клетки в состоянии болезни, и по большей части не оказывает эффекта на (соседние) клетки в нормальном состоянии. Предпочтительно, МВМ избирательно оказывает влияние на клетки в болезненном состоянии, близкие по фенотипу, метаболическому статусу, генотипу, уровням экспрессии мРНК/белков, и т.д., приближая клетки к нормальному состоянию.
В одном варианте воплощения, МВМ является также эпи-переключателем. В другом варианте воплощения МВМ не является эпи-переключателем. Специалист в данной области техники поймет, что подразумевается, что МВМ изобретения также включает в себя смесь двух или более эндогенных молекул, где смесь характеризуется одной или более вышеупомянутых функций. Эндогенные молекулы в смеси представлены в таком соотношении, что смесь действует как МВМ.
МВМ могут быть молекулами, имеющими липидную основу, или не имеющими липидной основы. Примеры МВМ включают, не ограничиваясь, CoQ10, ацетил Со-А, пальмитил Со-А, L-карнитин, аминокислоты, такие как, например, тирозин, фенилаланин и цистеин. В одном воплощении МВМ является маленькой молекулой. В одном воплощении изобретения МВМ не является CoQ10. МВМ может идентифицировать обычным образом любой специалист, используя любой из анализов, подробно описанных в настоящем документе.
В некоторых вариантах воплощения МВМ включает соединения семейства витаминов В, или нук-леотиды, мононуклеотиды или динуклеотиды, которые содержат соединения семейства витаминов В. Соединения семейства витаминов В включают, например, тиамин (витамин В1), ниацин (также известный как никотиновая кислота или витамин В3), или пиридоксин (витамин В6), а также провитамины, такие как пантенол (провитамин В5). В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из тиамина, ниацина и пиридоксина. Нуклеозиды, мононуклеотиды или динуклеотиды, в состав которых входят соединения семейства витаминов В, включают, например, нуклеозиды, мононуклеотиды или динуклео-тиды, в состав которых входит молекула аденина или ниацина (никотиновой кислоты). В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из аденозина, аденозиндифосфата (АДФ), флавин аденозин динуклеотида (ФАД, который содержит части витамина В2 и АДФ) и динуклеотид никотиновой кислоты.
В других вариантах воплощения МВМ включает аминокислоты. Примеры аминокислот включают, например, тирозин (напр, L-тирозин), цистеин, фенилаланин (например, L-фенилаланин) и аланин. В некоторых вариантах воплощения, аминокислотой является фенилаланин или аланин. В некоторых вариантах воплощения, МВМ включает производные аминокислот, такие как 4-гидроксифенилпируват или ацетилглицин.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является аналогом глюкозы, напр, молекулой глюкозы, где одна группа -ОН или -СН2ОН замещена группой -СООН, -СОО- или -NH2. Примеры аналогов глюкозы включают глюкозамин, глюциронид и глюкуронат.
В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из соединений формулы (I)
хо J\
где n является целым числом из 0 или 1; R1, R2, R3 и R4, при их наличии, каждый независимо выбирается из водорода и гидроксила, или R1 и R2 вместе с углеродом, к которому они присоединяются, образуют карбонильную (С=О) группу; W является -СООН или -N(CH3)3+; и
X является водородом, отрицательно заряженным или катионом щелочного металла, такого как
Na+.
Понятно, что когда n равно 0, CHR3 группа связана с заместителем W.
В некоторых вариантах воплощения W является -^СН3)3 . В некоторых вариантах воплощения МВМ является карнитином, таким как L-карнитин.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является дикарбоновой кислотой. В некоторых вариантах воплощения W является -СООН. В некоторых вариантах воплощения R3 является водородом. В некоторых вариантах воплощения n равно 0. В некоторых вариантах воплощения каждый из R1 и R2 независима являются водородом. В некоторых вариантах воплощения W является -СООН, R3 является водородом, n равно 0, и каждый из R1 и R2 независимо являются водородом. В некоторых вариантах воплощения n равно 1. В некоторых вариантах воплощения R1 и R2 берутся вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуя карбонильную (С=О) группу. В некоторых вариантах воплощения, R4 является водородом. В некоторых вариантах воплощения, R4 является гидроксилом. В некоторых вариантах воплощения, W является -СООН, R3 является водородом, n равно 1 и R1 и R2 берутся вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуя карбонильную (С=О) группу.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является промежуточным продуктом цикла Кребса, излишки которого сдвигают цикл Кребса в направлении окислительного фосфорилирования. Примеры промежуточных продуктов цикла Кребса, которые являются МВМ, включают янтарную кислоту или сукцинат, яблочную кислоту или малат, и а-кетоглутаровую кислоту или а-кетоглутарат.
В некоторых вариантах воплощения МВМ является строительным блоком CoQ10, который имеет следующую структуру
Таким образом, строительные блоки CoQ10 включают, не ограничиваясь, фенилаланин, тирозин, 4-гидроксифенилпируват, фенилацетат, 3-метокси-4-гидроксиманделат, ванилиновую кислоту, 4-гидрокибензоат, мевалоновую кислоту, фарнезил, 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинон, а также их соответствующие кислоты или ионы. В некоторых вариантах воплощения МВМ выбирается из фенин-лаланина, тирозина, 4-гироксифенилпирувата, фенилацетата и 4-гидроксибензоата.
(i) Способы идентификации МВМ.
В настоящем изобретении представлены способы идентификации МВМ. Способы идентификации МВМ включают, в целом, экзогенное добавление к клетке эндогенной молекулы и оценку действия на клетку, например, на профиль микроокружения клетки, которое производит эндогенная молекула. Действие на клетку оценивается по следующим параметрам (один или несколько): клеточное строение, мРНК, белки, липиды и/или метаболический уровень, для идентификаци изменений в профиле клеточной микросреды. В одном варианте воплощения клетки являются культивируемыми клетками, например, in vitro. В одном варианте воплощения клетки находятся в организме. Эндогенная молекула может быть добавлена в клетку в одной концентрации или может быть добавлена в клетку в различных концентрациях. В одном варианте воплощения эндогенная молекула добавляется к клеткам так, что уровень эндогенной молекулы в клетках поднимается (например, поднимается в 1,1 раза, 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 1,6 раза, 1,7 раза, 1,8 раза, 1,9 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раза, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 35 раз, 40 раз, 45 раз, 50 раз или больше) по сравнению с уровнем эндогенной молекулы в контрольной клетке, не подвергавшейся воздействию.
Молекулы, которые вызывают изменение в клетке, как определяется по изменениям, например, в следующих параметрах (одному или нескольким): морфологии, физиологии и/или составу (например, мРНК, белки, липиды, метаболиты), могут, кроме того, оцениваться для определения, различаются ли вызываемые изменения в профиле клеточной микросреды между болезненным клеточным состоянием и нормальным клеточным состоянием. Клетки (например, линии клеточных культур) различного тканевого происхождения, клеточного типа или состояния, могут быть оценены путем сравнительной оценки. Например, изменения, вызванные в профиле клеточной микросреды раковой клетки, могут быть сравнимы с изменениями, вызванными в нераковой или нормальной клетке. Эндогенная молекула, которая, как наблюдается, вызывает изменения в профиле микросреды клетки (например, вызывает изменения в морфологии, физиологии и/или составу, например, мРНК, белки, липиды или метаболиты в клетке и/или различным образом (например, предпочтительно) вызывает изменения в профиле клеточной микросреды в болезенной клетке по сравнению с нормальной клеткой, идентифицируется как
МВМ.
МВМ изобретения могут быть МВМ, имеющими липидную основу, или МВМ, не имеющими ли-пидной основы. Способы идентификации МВМ, имеющих липидную основу, включают вышеописанные базовые клеточные способы, в которых имеющая липидную основу эндогенная молекула экзоген-но добавляется к клетке. В предпочтительном варианте воплощения, имеющая липидную основу эндогенная молекула добавляется к клетке таким образом, что уровень имеющей липидную основу эндо
генной молекулы в клетке повышается. В одном варианте воплощения уровень имеющей липидную основу эндогенной молекулы повышается в 1,1 раза, 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 1,6 раза, 1,7 раза, 1,8 раза, 1,9 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раза, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 35 раз, 40 раз, 45 раз, 50 раз или больше по сравнению с уровнем в контрольных клетках, не подвергавшихся воздействию. Формула и доставка молекулы с липидной основой в клетку зависит от свойств каждой исследуемой молекулы, но многие способы известны специалистам. Примеры формулы и доставки молекул с липидной основой, включают, не ограничиваясь, солюбилизацию корастворителями, молекулы-переносчики, липосомы, дисперсии, суспензии, дисперсии наночастиц, эмульсии, например, эмульсии типа "масло в воде" или "вода в масле", мультифазные эмульсии, например, эмульсии типа "масло в воде в масле", полимерный захват и инкапсуляцию. Доставка МВМ с липидной основой в клетку может быть подтверждена экстракцией клеточных липидов и количественным определением МВМ с помощью обычных способов, известных специалистам, таких как масс-спектрометрия.
Способы идентификации не имеющих липидной основы МВМ включают вышеописанные базовые клеточные способы, в которых не имеющая липидной основы эндогенная молекула экзогенно добавляется к клетке. В предпочтительном варианте воплощения не имеющая липидной основы эндогенная молекула добавляется к клетке таким образом, что уровень имеющей липидную основу эндогенной молекулы в клетке повышается. В одном варианте воплощения, уровень не имеющей липидную основу эндогенной молекулы повышается в 1,1 раза, 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 1,6 раза, 1,7 раза, 1,8 раза, 1,9 раза, 2,0 раза, 3,0 раза, 4,0 раза, 5,0 раза, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 35 раз, 40 раз, 45 раз, 50 раз или больше по сравнению с уровнем в контрольных клетках, не подвергавшихся воздействию. Формула и доставка не имеющей липидной основы молекулы в клетку зависит от свойств каждой исследуемой молекулы, но многие способы известны специалистам. Примеры формулы и доставки не имеющих липидной основы молекул, включают, не ограничиваясь, солюбилизацию ко-растворителями, молекулы-переносчики, активный транспорт, полимерный захват или адсорбцию, полимерную прививку, липосомную инкапсуляцию, и композицию с направленными системами доставки. Доставка МВМ с липидной основой в клетку может быть подтверждена экстракцией клеточных липидов и количественным определением МВМ с помощью обычных способов, известных специалистам, таких как масс-спектрометрия.
2. Эпиметаболические переключатели (эпи-переключатели).
При использовании здесь, "эпиметаболический переключатель" (эпи-переключатель) является молекулой (эндогенной или экзогенной), которая модулирует метаболическое переключение от здорового (или нормального) состояния к болезненному состоянию и наоборот, тем самым поддерживая или восстанавливая здоровье клеток, тканей, систем и/или здоровье человека в целом. Эпи-переключатели способны к эффективной нормализации в тканевой микросреде. Например, эпи-переключатель включает любую молекулу, которая способна, при добавлении или извлечении из клетки, влиять на микросреду (например, на метаболический статус) клетки. Специалисты поймут, что под эпи-переключателем изобретения также может подразумеваться смесь из двух или более молекул, где смесь характеризуется одной или более из вышеупомянутых функций. Молекулы в смеси представлены в таком соотношении, что смесь действует как эпи-переключатель. Примеры эпи-переключателей включают, не ограничиваясь, coQ-10; витамин D3; ЕСМ компоненты, такие как фибронектин; иммуномодуляторы, такие как TNFa и любые интерлейкины, например, IL-5, IL-12, DL-23; факторы ангиогенеза и факторы апоптоза.
В некоторых вариантах воплощения, эпи-переключатель является энзимом, таким как энзим, который или прямо принимает участие в катализации одной или более реакций в цикле Кребса, или вырабатывает промежуточные продукты цикла Кребса, избыток которых запускает цикл Кребса. В некоторых вариантах воплощения энзим является энзимом неокислительной фазы пентозофосфатного пути, таким как трансальдолаза или транскетолаза. В других вариантах воплощения энзим является компонентом энзима или энзимного комплекса, который способствует циклу Кребса, таким как синтаза или лигаза. Примеры энзимов включают сукцинил СоА синтазу (энзим цикла Кребса) или пируват карбок-силазу (лигазу, которая катализирует обратимую карбоксилацию пирувата с образованием оксалоаце-тата (ОАА), промежуточного продукта цикла Кребса).
В некоторых вариантах воплощения эпи-переключатель является строительным блоком CoQ10. Строительные блоки CoQ10 включают, не ограничиваясь, фенилаланин, тирозин, 4-гидроксифенил-пируват, фенилацетат, 3-метокси-4-гидрокиманделат, ванилиновую кислоту, 4-гидрокибензоат, мева-лоновую кислоту, фарнезил, 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинон, а также их соответствующие кислоты или ионы. В некоторых вариантах воплощения эпи-переключатель выбирается из фенилаланина, тирозина, 4-гидроксифенилпирувата, фенилацетата и 4-гидроксибензоата.
В некоторых вариантах воплощения эпи-переключатель является соединением семейства витаминов В. В семейство витаминов В входят, например, рибофлавин (витамин В2) или его аналоги. Эпи-переключатели также включают любые аналоги или неактивные формы лекарства, которые могут превращаться в ходе метаболизма in vivo в любые эндогенные МВМ, такие как описанные здесь.
В одном варианте воплощения эпи-переключатель является также МВМ. В одном варианте воплощения эпи-переключатель не является CoQ10. Специалисты в данной области могут обычным обра
зом идентифицировать эпи-переключатели с помощью анализов, подробно описанных в настоящем документе.
(i) Способы идентификации эпи-переключателей.
Эпиметаболические переключатели (эпи-переключатели) являются молекулами, способными модулировать метаболический статус клетки, например, вызывать метаболическое переключение со здорового (или нормального) состояния на болезненное состояние и наоборот, и тем самым способными поддерживать или восстанавливать здоровье клеток, тканей, органов, систем и/или здоровье человека в целом. Эпи-переключатели изобретения, таким образом, полезны для диагностической оценки болезненного состояния. Кроме того, эпи-переключатели изобретения полезны для терапевтических применений, где применение или введение эпи-переключателя (или модуляция эпи-переключателя другими терапевтическими молекулами) приводит к нормализации клеточной микросреды и болезненного состояния.
Идентификация эпи-метаболического переключателя включает, в общем, установление молекулярного профиля, например, метаболитов, липидов, белков или РНК (их индивидуальные профили или в комбинации) для совокупности клеток или тканей, которые демонстрируют различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Молекула из профиля(ей), у которой изменение уровня (напр, возрастание или уменьшение уровня) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируется как потенцильный эпи-переключатель.
В одном варианте воплощения эпи-переключатель является также МВМ. Потенциальные эпи-переключатели можно оценить по их способности проникать в клетки путем экзогенного присоединения к клетке при использовании любого количества обычных способов, известных специалистам в данной области, и при использовании любого способа, описанного здесь. Например, проникновение потенциального эпи-переключателя в клетку можно подтвердить экстрацией клеточного содержимого и оценкой количества потенциального эпи-переключателя обычными способами, известными специалистам в данной области, такими как масс-спектрометрия. Потенциальный эпи-переключатель, способный проникать в клетку, тем самым идентифицируется как МВМ.
Для идентификации эпи-переключателя, потенциальный эпи-переключатель затем оценивается по способности переключать метаболический статус клетки. Способность потенциальных эпи-переключателей переключать метаболический статус клеточной микросреды оценивается по вхождению (например экзогенному присоединению) в клетку потенциального эпи-переключателя и мониторингу в клетке одного или более признаков: изменений экспрессии генов (например, изменения в мРНК или экспрессии белков), изменений концентрации липидов или уровней метаболитов, изменений уровней биоэнергетичных молекул, изменений клеточной энергетики и/или изменений функции или числа митохондрий. Способность потенциальных эпи-переключателей переключать метаболический статус клеточной микросреды обычно может быть идентифицирована специалистом в данной области при использовании любого из способов, подробно описанных в настоящем документе. Потенциальные эпи-переключатели в дальнейшем оцениваются по способности переключать метаболический статус больной клетки в направлении нормального здорового состояния (или напротив, по способности переключать метаболический статус нормальной клетки в направлении состояния болезни). Потенциальный эпи-переключатель, способный перекючать метаболический статус больной клетки в направлении нормального здорового состояния (или переключать метаболический статус нормальной клетки в направлении состояния болезни) таким образом идентифицируется как эпи-переключатель. В предпочтительных вариантах воплощения, эпи-переключатель не оказывает негативного влияния на здоровье и/или рост нормальных клеток.
Эпиметаболические переключатели изобретения включают, не ограничиваясь, низкомолекулярные метаболиты, молекулы с липидной основой и белки и РНК. Для идентификации метаболического переключателя в классе низкомолекулярных эндогенных метаболитов, устанавливаются метаболитные профили совокупности клеток или тканей, которые демонстрируют различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Метаболитный профиль для каждой клетки или ткани определяется путем экстракции метаболитов из клетки или ткани и последующих идентификации и количественной оценки метаболитов с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области, включающих, например, методы жидкостной хроматографии в совокупности с масс-спектрометрией или газовой хроматографии в совокупности с масс-спектрометрией. Метаболиты, у которых изменение уровня (например, возрастание или уменьшение уровня) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируются как потенциальные эпи-переключатели.
Для идентификации эпи-метаболических переключателей в классе эндогенных молекул, имеющих липидную основу, устанавливаются липидные профили для совокупности клеток или тканей, которые демонстрируют различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Липидный профиль для каждой клетки или ткани определяется путем экстракции метаболитов из клетки или ткани и последующих идентификации и количественной оценки метаболитов с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области, включающих, например, методы жидкостной хроматографии в совокупности с масс-спектрометрией или газовой хроматографии в совокупности с масс
спектрометрией. Липиды, у которых изменение уровня (например, возрастание или уменьшение уровня основной массы или следов) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируются как потенциальные эпи-переключатели.
Для идентификации эпиметаболических переключателей в классе белков и РНК, устанавливаются профили экспрессии генов для совокупности клеток или тканей, которые показывают различные болезненные состояния, прогрессию или агрессивность. Профиль экспрессии для каждой клетки или ткани определяется по уровню(ям) мРНК или белка с использованием стандартных протеомических методов, анализа мРНК или геномна, напр, подробно описанных в настоящем документе. Гены, у которых возрастание экспрессии (например, возрастание или уменьшение экспрессии мРНК или уровня белка) коррелирует с болезненным состоянием, прогрессией или агрессивностью, идентифицируются как потенциальные эпи-переключатели.
Когда молекулярные профили, описанные выше, установлены (например, для растворимых метаболитов, молекул с липидной основой, белков, РНК, или других биологических классов соединений), проводятся анализы клеточных и биохимических путей обмена, для выявления известных связей между идентифицированными потенциальными эпи-переключателями в клеточной микросреде. Эта информация, полученная благодаря таким анализам клеточных и/или биохимических путей обмена, может быть использована для группирования путей обмена и потенциальных эпи-переключателей.
Полезность эпи-переключателя для модулирования болезненного состояния может быть в дальнейшем оценена и подтверждена специалистами с использованием любого из способов, известных специалистам в данной области или подробно описанных в настоящем документе. Полезность эпи-переключателя для модулирования болезенного состояния может быть оценена путем прямой экзогенной доставки эпи-переключателя в клетку или в организм. Полезность эпи-переключателя для модулирования болезеннного состояния может быть альтернативно оценена путем разработки молекул, которые прямо модулируют эпи-переключатель (например, уровень или активность эпи-переключателя). Полезность эпи-переключателя для модулирования болезеннного состояния может также быть оценена путем разработки молекул, которые непрямо модулируют эпи-переключатель (например, уровень или активность эпи-переключателя) путем регулирования других молекул, таких как гены (например, регулируя РНК или уровень белка), включенных в тот же путь синтеза, что и эпи-переключатель.
Эпи-метаболитический подход, описанный здесь, способствует идентификации эндогенных молекул, которые существуют в клеточной микросреде и уровни которых чувствительны и контролируются генетически, мРНК, или основанными на белках механизмах. Обнаруженные в нормальных клетках регуляторные пути, которые запускаются эпи-переключателями настоящего изобретения, могут предоставлять терапевтическую ценность в разрегулированной или болезненной клеточной микросреде. Кроме того, эпи-метаболитический подход, описанный здесь, идентифицирует эпи-переключатели, которые могут предоставлять диагностический индикатор для использования в клиническом отборе пациентов, в наборах для диагностики болезней или как прогностический индикатор.
В определенных вариантах вополощения, МВМ и эпи-переключатели, раскрытые здесь, включают те, которые обычно используются в качестве пищевых добавок. В определенных вариантах вополоще-ния, эти МВМ и/или эпи-переключатели, раскрытые здесь, являются фармацевтической маркой. В определенных вариантах вополощения, МВМ и/или эпи-переключатели, имеющие фармацевтическую марку, имеют чистоту между около 95% и около 100% и включают все значения между 95 и 100%. В определенных вариантах вополощения, чистота МВМ и/или эпи-переключателей составляет 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 или 100%. В определенных вариантах воплощения МВМ и/или эпи-переключатели свободны от эндотоксинов. В других вариантах воплощения МВМ и/или эпи-переключатели свободны от чужеродных белковых веществ. В определенных вариантах воплощения МВМ и/или эпи-переключателем является CoQ10.
III. Анализы, используемые для идентификации МВМ/эпи-переключателей.
Приемы и способы настоящего изобретения, предназначенные для выделения и идентификации представляющих интерес молекул и соединений, включают, не ограничиваясь: жидкостную хроматографию (ЖХ), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), масс-спектрометрию (МС), газовую хроматографию (ГХ), жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию (ЖХ-МС), газовую хроматографию/масс-спектрометрию (ГХ-МС), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), магнитную резонансную томографию (МРТ), инфракрасную спектрометрию с преобразованием Фурье (ПФ-ИК), и масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС). Следует понимать, что техники масс-спектрометрии включают, не ограничиваясь, использование магнитных секторов и двухфокусных приборов, трансмиссионных квадрупольных приборов, квадрупольных приборов ионных ловушек, времяпролетных приборов (TOF), приборов ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FT-MS), и времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF MS).
Количественное определение уровней биоэнергетических молекул.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут быть идентифицированы по изменениям в уровнях клеточных биоэнергетических молекул (например, АТФ, пирувата, АДФ,
НАДН, НАД, НАДФН, НАДФ, ацетилСоА, FADH2) в клетках, к которым применили возможный эпи-переключатель. В типовых методах определения уровней биоэнергетичеких молекул используется ко-лорометрия, флюоресценция и/или биолюминесцентные способы. Примеры таких способов приведены ниже.
Уровни АТФ внутри клетки могут быть оценены при помощи различных способов и систем, известных специалистам в данной области. Например, в одной системе цитоплазматическая АТФ, вышедшая из лизированных клеток, реагирует с люциферином и энзимом люциферазой, выделяя свет. Эта биолюминесценция подсчитывается на биолюминометре, и таким образом можно подсчитать концентрацию внутриклеточной АТФ (набор для анализа АТФ EnzyLight(tm) (ЕАТР-100), BioAssay Systems, Hayward, Калифорния). В другой системе, например, и АТФ, и ее дефосфорилированная форма, АДФ, подсчитываются с помощью биолюминесценции; после того как уровни АТФ подсчитаны, АДФ трансформируется в АТФ и затем определяется и подсчитывается с использованием той же люцифе-разной системы (набор для анализа отношения АДФ/АТФ ApoSENSOR(tm), BioVision Inc., Mountain View, Калифорния).
Пируват является важным промежуточным продуктом в клеточных путях обмена. Пируват может превращаться в углевод путем глюконеогенеза, превращаться в жирную кислоту или усваиваться при посредстве ацетил СоА, или превращаться в аланин или этанол, в зависимости от метаболического статуса клетки. Таким образом, определение уровней пирувата дает подсчет метаболичекой активности и статус клеточного образца. Один способ для определения пирувата, например, использует как колориметрию, так и флюорометрию для определения концентраций пирувата в различных диапазонах (набор для анализа пирувата EnzyChrom(tm) (Cat# EPYR-100), BioAssay Systems, Hayward, Калифорния).
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут влиять на процесс окислительного фосфорилирования, проходящий в митохондриях клеток, которые задейстовованы в образовании и поддержании биоэнергетических молекул в клетках. Кроме способов определения изменений в клеточной энергетике непосредственно в клеточных культурах и образцах (описанных выше), существуют способы, определяющие и подсчитывающие действия компонентов дискретных энзимов и комплексов митохондрий в клетках. Например, анализ полной активности OXPHOS MT-OXC MitoTox(tm) (Mito-Sciences Inc., Eugene, Орегон) может определять и подсчитывать действия соединений, примененных непосредственно к комплексам I-V, выделенным из митохондрий. Способы определения и подсчета действий индивидуальных митохондриальных комплексов, таких как НАДН дегидрогеназа (Комплекс I), цитохром с оксидаза (Комплекс IV) и АТФ синтаза (Комплекс V) также доступны (MitoSciences Inc., Eugene, Орегон).
Оценка клеточной энергетики.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут также быть идентифицированы по изменениям в клеточной энергетике. Один пример оценки клеточной энергетики - оценка в реальном времени потребления молекулярного кислорода и/или изменений в рН среды клеточной культуры. Например, способность потенциального эпи-переключателя модулировать метаболический статус клетки может быть анализирована с использованием, например, XF24 Анализатора (Seahorse, Inc.). Эта технология позволяет в реальном времени определить изменение кислорода и рН в монослое клеток для того, чтобы оценить биоэнергетику клеточной микросреды. XF24 Анализатор подсчитывает и сравнивает показатель потребления кислорода (OCR), который является оценкой аэробного метаболизма и внеклеточного окисления (ECAR), который является оценкой гликолиза, и оба служат индикаторами клеточной энергетики.
Оценка окислительного фосфорилирования и митохондриальной функции.
Окислительное фосфорилирование - это процесс, путем которого АТФ образуется при окислении питательных соединений, осуществляющийся у эукариот благодаря белковым комплексам, встроенным в мембраны митохондрий. Поскольку окислительное фосфорилирование является основным источником АТФ в клетках большинства организмов, изменения активности окислительного фосфорилирова-ния могут сильно видоизменить метаболизм и энергетический баланс в клетке. В некоторых вариантах воплощения изобретения факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут определяться и/или идентифицироваться благодаря своему действию на окислительное фосфорилирование. В некоторых вариантах воплощения факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут определяться и/или идентифицироваться благодаря своему действию на специфические аспекты окислительного фосфорилирования, включая, не ограничиваясь, цепь транспорта электронов и синтез АТФ.
Встроенные в мембрану белковые комплексы митохондрий, которые осуществляют процессы, участвующие в окислительном фосфорилировании, выполняют специфические задачи и имеют номера I, II, Ш и IV. Эти комплексы, вместе с проходящей сквозь мембрану АТФ-синтазой (также известной как Комплекс V), являются ключевыми единицами, участвующими в процессах окислительного фос-форилирования. В дополнение к анализам, которые могут определить действия факторов влияния (например, МВМ или эпи-переключателей ) на функцию митохондрий в общем и процессы окислительного фосфорилирования в частности, существуют анализы, которые можно использовать для определения
действий эпи-перключателей на отдельный комплекс, выделенный из остальных комплексов.
Комплекс I, также известный как НАДН-коэнзим Q оксидоредуктаза или НАДХ дегидрогеназа, является первым белком в цепи транспорта электронов. В некоторых вариантах воплощения, можно провести определение и подсчет действия эпи-переключателя на образование НАД+ Комплексом I. Например, комплекс может быть извлечен методом иммунного захвата из образца в 96-луночный планшет; окисление НАДН в НАД+ происходит одновременно с восстановлением молекулы красителя, у которой коэффициэнт поглощения возрастает на 450 нМ (набор для микропланшетного анализа активности фермента комплекса I, MitoSciences Inc., Eugene, Орегон).
Комплекс IV, также известный как цитохором с оксидаза (ЦО), является последним белком в цепи транспорта электронов. В некоторых вариантах воплощения можно провести определение и подсчет действия эпи-переключателя на окисление цитохрома с и восстановление кислорода до воды Комплексом IV. Например, ЦО можно извлечь путем иммуносорбции в микролуночный планшет и оценить окисление ЦО с помощью колориметрического анализа (набор для микропланшетного анализа активности фермента комплекса IV, MitoSciences Inc., Eugene, Орегон).
Последним ферментом в процессе окислительного фосфорилирования является АТФ-синтаза (Комплекс V), которая использует протонный градиент, созданный другими комплексами, для синтеза АТФ из АДФ. В некоторых вариантах воплощения можно провести определение и подсчет действия эпи-переключателя на активность АТФ. Например, активность и количество АТФ-синтазы в образце также можно оценить по АТФ-синтазе, которую извлекают путем иммуносорбции в микролуночный планшет. Фермент при определенных условиях может функционировать также как АТФ-аза, таким образом в этом анализе активности АТФ-синтазы степень, в которой АТФ редуцируется до АДФ, оценивается по определению одновременного окисления НАДН до НАД+. Количество АТФ подсчитывается с использованием меченного антитела к АТФ-азе (набор для микропланшетного двойного анализа АТФ-синтазы (активность + количество), MitoSciences Inc., Eugene, Орегон). Дополнительные анализы окислительного фосфорилирования включают анализы, которые определяют действие на активность Комплексов II и II. Например, система полного OXPHOS МТ-ОХС MitoTox(tm) (MitoSciences Inc., Eugene, Орегон) может использоваться для оценки действия соединения на Комплексы II и III, а также Комплексы I, IV и V, для предоставления данных о действии соединения на всю систему окислительного фосфорилирования.
Как замечено выше, наблюдение в реальном времени образцов интактных клеток может быть проведено с использованием проб на изменение содержания кислорода и рН в клеточной культураль-ной среде. Эти анализы клеточной энергетики дают широкое представление о митохондриальной функции и действиях потенциальных факторов влияния (например, МВМ или эпи-переключателей) на активность митохондрий в клетках образца.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут также действовать на мито-хондриальную проницаемость (МРТ), явление, заключающееся в том, что проницаемость митохондри-альных мембран возрастает вследствие образования митохондриальных проницаемых транзитных пор (МРТР). Возрастание митохондриальной проницаемости может приводить к разбуханию митохондрий, неспособности осуществлять окислительное фосфорилирование с образованием АТФ и к гибели клетки. МРТ может участвовать в индукции апоптозов (см., например, Halestrap, A.P., Biochem. Soc. Trans. 34:232-237 (2006) и Lena, A. et al. JouPHKl of Translational Med. 7:13-26 (2009), полное описание которого включено в настоящую заявку путем ссылки).
В некоторых вариантах воплощения осуществляются детекция и количественный подсчет действия фактора влияния (например, МВМ или эпи-переключателя) на образование, прекращение и/или действие МРТ и МРТР. Например, аналитические исследования могут определить МРТ благодаря использованию специальных молекул красителя (кальцеина), локализующихся во внутренней мембране митохондрий и других клеточных структур. Использование другой молекулы, CoCl2, служит для подавления флюоресценции красителя кальцеина в цитозоле. CoCl2, однако, не может иметь доступ внутрь митохондрий, таким образом флюоресценция в митохондриях не подавляется, пока не появляется МРТ и CoCl2 не получает возможность попадать внутрь митохондрий благодаря МРТР. Потеря митохондриально-специфичного флюоресцентного сигнала говорит о наличии МРТ. Проточная цито-метрия может быть использована для оценки флюоресценции в клетках и органеллах (набор для анализа переходных пор MitoProbe(tm), Molecular Probes, Eugene, Орегон). В дополнительных анализах используется флюоресцентный микроскоп для оценки экспериментальных результатов (набор для анализа митохондриальных переходных пор Image-iT(tm) LIVE, Molecular Probes, Eugene, Орегон).
Измерение клеточной пролиферации и воспалительной реакции.
В некоторых вариантах воплощения изобретения, факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут быть идентифицированы и оценены по их действию на образование или активность молекул, связанных с клеточной пролиферацией и/или воспалительной реакции. Эти молекулы включают, не ограничиваясь, цитокины, факторы роста, гормоны, компоненты внеклеточного матрик-са, хемокины, нейропептиды, нейротрансмиттеры, нейротрофины и другие молекулы, участвующие в
клеточном сигналинге, а также внутриклеточные молекулы, такие как те, которые участвуют в сигнальной трансдукции.
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является фактором роста с потенциальными ангиогенез-ными, васкулогенными и митогенными свойствами. VEGF стимулирует проницаемость и разбухание эндотелия, и действие VEGF связано с многочисленными болезнями и расстройствами, включая ревматоидные артриты, метастазирующий рак, возрастную дегенерацию макулы и диабетическую ретинопатию.
В некоторых вариантах воплощения изобретения фактор влияния (например, МВМ или эпи-переключатель) может быть идентифицирован и охарактеризован по его действию на образование VEGF. Например, клетки, существующие в условиях гипоксии или имитации ацидоза будут показывать возрастание VEGF образования. VEGF, выделяемый в среду, может быть исследован с использованием ELISA или других основанных на антителах анализах, с использованием имеющихся в продаже анти-VEGF антител (R &D Systems, Minneapolis, Миннесота). В некоторых вариантах воплощения изобретения эпи-переключатель может быть идентифицирован и и/или описан на основе его действия(й) на реакцию клеток на VEGF и/или на основе его действия(й) на экспрессию или активность VEGF рецептора.
Фактор некроза опухолей (TNF), задействованный как в работе здоровой иммунной системы, так и при аутоиммунных болезнях, является ключевым медиатором при воспалении и активности иммунной системы. В некоторых вариантах воплощения изобретения эпи-переключатель может быть идентифицирован и характеризован по его влиянию на образование или активность TNF. Например, TNF, образующийся в культивируемых клетках и секретируемый в среду, может быть подсчитан с использованием иммуноферментного твердофазного анализа и других основанных на антителах способах, известных специалистам. Кроме того, в некоторых вариантах воплощения фактор влияния может быть идентифицирован и охарактеризован по его действию(ям) на экспрессию рецептора к (Human TNF RI Duoset, R &D Systems, Minneapolis, Миннесота).
Компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ) играют роль как в структуре клеток и тканей, так и в процессах сигналинга. Например, латентный трансформирующий фактор роста бета связывается с белками, являющимися компонентами ЕСМ, что создает резервуар трансформирующего фактора роста бета(TGFP) внутри ЕСМ. Матрикс-связывающий TGFp может высвобождаться во время процессов трансформации матрикса и может влиять на действие фактора роста на близлежащие клетки (Dallas, S.
Methods in Mol. Biol. 139:231-243 (2000)).
В некоторых вариантах воплощения фактор влияния (например, МВМ или эпи-переключатель) может быть идентифицирован и охарактеризован по его действию на образование ЕСМ в культивируемых клетках. У исследователей есть полноценные технологии, благодаря которым можно исследовать и количественно определить образование ЕСМ в клетках, а также состав ЕСМ. Например, синтез ЕСМ в клетках можно оценить, внедряя клетки в гидрогель перед инкубацией. Биохимические и другие анализы проводились на ЕСМ, образованном клетками после сбора клеток и расщепления в гидрогеле (Strehin, I. и Elisseeff, J. Methods in Mol. Bio. 522:349-362 (2009)).
В некоторых вариантах воплощения может быть идентифицировано или охарактеризовано действие фактора влияния (например, МВМ или эпи-переключателя) на образование, наличие или отсутствие ЕСМ или одного из его компонентов в организме. Разработаны техники для получения мышей с заданным нокаутом генов, которые позволяют нокаутировать определенные ЕСМ гены только в отдельных типах клеток или на определенных стадиях развития (Brancaccio, M. et al. Methods in Mol Bio. 522:15-50 (2009)). Таким образом можно оценить действие применения или введения эпи-переключателя или потенциального эпи-переключателя на активность или отсутствие определенных ЕСМ компонентов в определенных тканях на определенных стадиях развития.
Измерение целостности плазматической мембраны и гибели клеток.
Факторы влияния (например, МВМ или эпи-переключатели) могут быть идентифицированы по изменениям целостности плазматической мембраны в клеточном образце и/или по изменениям числа или проницаемости клеток, которые подвержены апоптозам, некрозам или клеточным изменениям, которые демонстрируют повышенную или пониженную вероятность гибели клеток.
Анализ лактатдегидрогеназы (LDH) может дать оценку клеточного статуса и уровней повреждения. LDH является стабильным и сравнительно обильным цитоплазматическим ферментом. Когда плазматическая мембрана теряет физическую целостность, LDH выходит в межклеточное пространство. Более высокие концентрации LDH коррелируют с более высокими уровнями повреждения плазматической мембраны и гибели клеток. Примеры анализов LDH включают анализы, которые используют колориметрическую систему для определения и количественного подсчета уровней LDH в образце, а восстановленная форма тетразоловой соли образуется при активности фермента LDH (набор лактат-дегидрогеназы QuantiChrom(tm) (DLDH-100), BioAssay Systems, Hayward, Калифорния; набор определения цитотоксичности LDH, Clontech, Mountain View, Калифорния).
Апоптоз - это процесс программируемой гибели клеток, который может начинаться с множества
различных событий. Изменения скорости и/или числа клеток, которые подверглись апоптозам, можно определять с помощью различных анализов. Одним типом анализа, который используется для детекции и количественного определения апоптозов, является каспазный анализ. Каспазы -это цистеинпротена-зы, специфичные для аспаргиновой кислоты, которые активируются при протеолитическом расщеплении во время апоптоза. Примеры анализов, которые определяют активированные каспазы, включают аналитические системы PhiPhiLux(r) (Oncolmmunin, Inc., Gaithersburg, Мэриленд) и Caspase-Glo(r) 3/7 (Promega Corp., Madison, Висконсин). Дополнительные анализы, которые могут определить апоптозы и изменения процента или числа клеток, подвергшихся апоптозу в сравниваемых образцах, включают TUNEL/ДНК фрагментационные анализы. Эти анализы определяют от 180 до 200 пар оснований ДНК фрагментов, образовавшихся в ядре во время фазы апоптоза.
Примеры TUNEL/ДНК фрагментационных анализов включают набор для определения гибели клеток in situ (Roche Applied Science, Indianapolis, Индиана) и TUNEL колориметрические и флюоро-метрические системы DeadEnd(tm) (Promega Corp., Madison, Висконсин).
Некоторые апоптозные анализы детектируют и делают количественную оценку белков, связанных с апоптозами и/или неапоптозным состоянием. Например, мультиплексный анализ цитотоксичности MultiTox-Fluor (Promega Corp., Madison, Висконсин) использует один субстрат, флюоресцентную систему для детекции и подсчета протеаз, специфичных для живых и мертвых клеток, тем самым оценивая отношение живых клеток и клеток, подвергшихся апоптозу, в образце клеток или тканей.
В продаже имеются дополнительные способы детекции и количественной оценки апоптозов, которые включают анализы, определяющие клеточную проницаемость (например, анализ апоптоза APO-Percentage(tm), Biocolor, Великобритания) и анализы для Annexin V (например, набор для определения апоптоза Annexin V-Biotin, BioVision Inc., Mountain View, Калифорния).
IV. Лечение метаболических нарушений.
В некоторых воплощениях соединения настоящего изобретения, например, МВМ или эпи-переключатели, описанные здесь, могут быть использованы для лечения поддающегося влиянию Коэн-зима Q10 состояния у субъектов, нуждающихся в таком лечении. Выражение "поддающееся влиянию коэнзима Q10 состояние," или "поддающееся влиянию CoQ10 состояние," включает болезни, расстройства, состояния, которые можно лечить, предотвращать или иным образом облегчать путем введения коэнзима Q10. Не имея стремления ограничиваться какой-либо определенной теорией, и как будет в дальнейшем описано здесь, полагается, что функции CoQ10, по меньшей мере частично, состоят в вызове метаболического переключения в микроокружении клетки, таком как переключение в направлении типа и/или уровня окислительного фосфорилирования в клетках с нормальным состоянием. Соответственно, в некоторых вариантах воплощения изобретения поддающиеся влиянию CoQ10 состояния являются состояниями, которые возникают вследствие измененного метаболизма в клеточном микроокружении. В одном воплощении изобретения поддающееся влиянию CoQ10 состояние является метаболическим заболеванием. Поддающиеся влиянию коэнзима Q10 состояния включают, например, метаболические расстройства, такие как ожирение, диабеты, преддиабетные состояния, метаболический синдром и эндокринные нарушения. Поддающиеся влиянию коэнзима Q10 состояния включают, кроме того, другие метаболические расстройства, описанные здесь.
В некоторых вариантах воплощения изобретения соединения настоящего изобретения, например, МВМ или эпи-переключатели, описанные здесь, действуют подобно коэнзиму Q10. При использовании в настоящем документе фраза "действовать подобно коэнзиму Q10" означает способность соединения демонстрировать, по меньшей мере, частично такое же или подобное действие, как коэнзим Q10. В некоторых вариантах воплощения изобретения соединения настоящего изобретения демонстрируют 25% или более от действия коэнзима Q10. В некоторых вариантах воплощения изобретения соединения настоящего изобретения демонстрируют до 130% от действия коэнзима Q10. В некоторых вариантах воплощения изобретения, соединения настоящего изобретения демонстрируют около 30-130% действия коэнзима Q10. Следует понимать, что каждое значение, перечисленное в этом параграфе, можно модифицировать термином "около". Кроме того, следует понимать, что значение в любом диапазоне, который находится между любыми двумя величинами, перечисленными в этом параграфе, тем самым входит в настоящее изобретение. Например, в некоторых вариантах воплощения соединения настоящего изобретения демонстрируют действие коэнзима Q10 между около 50 и около 100%. В некоторых вариантах воплощения действием, которое подобно у коэнзима Q10 и соединений настоящего изобретения, является способность вызывать переключение клеточного метаболизма. В некоторых вариантах воплощения изобретения действие, которое подобно у CoQ10 и у соединений настоящего изобретения, оценивается по НРК (норма расхода кислорода, OCR) и/или НВКО (норма внеклеточного окисления,
ECAR).
В настоящем изобретении представлены способы лечения, облегчения симптомов, предотвращения прогрессирования или профилактики поддающихся влиянию CoQ10 нарушений у млекопитающих, способ включает введение млекопитающему при соответствующей необходимости терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один фактор
влияния (фактор-в), где фактор влияния избирательно вызывает, в больных клетках млекопитающих, переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении уровней гликолиза и митохонд-риального окислительного фосфорилирования, наблюдаемых в нормальных клетках млекопитающих при нормальных физиологических условиях.
В настоящем изобретении представлены также способы лечения, облегчения симптомов, предотвращения прогрессирования или профилактики метаболических нарушений у млекопитающих, включающие введение млекопитающему при соответствующей необходимости терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один фактор влияния (фактор-в), где фактор влияния избирательно вызывает, в больных клетках млекопитающих, переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении нормализованного митохондриального окислительного фосфорилирования.
В настоящем изобретении предоставлены также способы для избирательного усиления митохонд-риального окислительного фосфорилирования в больных клетках млекопитающих, нуждающихся в лечении метаболического нарушения, метод включает введение вышеупомянутым млекопитающим терапевтически эффективного количества фармацевтического состава, содержащего по крайней мере один фактор влияния, тем самым избирательно усиливая митохондриальное окислительное фосфори-лирование в вышеупомянутых больных клетках млекопитающих.
В настоящем изобретении предоставлены также способы лечения или предотвращения метаболического нарушения у человека, включая введение фактора влияния человеку в количестве, достаточном для лечения или предотвращения метаболического нарушения, тем самым леча или предотвращая метаболическое нарушение.
В настоящем изобретении предоставлены также способы лечения или предотвращения метаболического нарушения у людей, включающие выявление людей, подверженных метаболическому заболеванию, и введение вышеупомянутым людям терапевтически эффективного количества фактора-в, способного блокировать анаэробное использование глюкозы и усилить митохондриальное окислительное фосфорилирование, тем самым леча или предотвращая метаболическое нарушение.
Настоящее изобретение предоставляет также способ для лечения или предотвращения метаболического нарушения у человека, включая введение фактора влияния (фактора-в) человеку в количестве, достаточном для лечения или предотвращения метаболического нарушения, где фактор влияния (фак-тор-в) вводится таким образом, что он сохраняется в окисленной форме в течение лечения, тем самым леча или предотвращая метаболическое нарушение.
"Метаболическое нарушение" означает любое паталогическое состояние, являющееся результатом изменения в метаболизме пациента. Такие нарушения включают нарушения, связанные с аберрантными общей глюкозой, жировым и/или белковым метаболизмом и их паталогическими последствиями. Метаболические нарушения включают нарушения, являющиеся результатом изменений в гомеостазисе глюкозы, приводящим, например, к гиперглицемии. В соответствии с этим изобретением, изменение в уровнях глюкозы обычно является возрастанием уровней глюкозы по крайней мере на 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или даже 100% по сравнению с такими уровнями у здоровых пациентов. Метаболические нарушения могут пагубно действовать на клеточные функции, такие как клеточная пролиферация, рост, дифференцировка или миграция, клеточная регуляция гомеостаза, меж- или внутриклеточная коммуникация; тканевая функция, такая как функция печени, мышечная функция, или функция адипо-цитов; системные реакции в организме, такие как гормональные реакции (например, инсулиновый ответ). Метаболические нарушения включают, не ограничиваясь, ожирение, диабет (также называемый здесь сахарным диабетом) (например, диабет типа I, диабет типа II, MODY, и гестационный диабет), преддиабет, метаболический синдром, нарушение механизмов насыщение и эндокринные нарушения, например, при старении. Дальнейшие примеры метаболических нарушений включают, не ограничиваясь, гиперфагию, гипофагию, болезнь депонирования триглицерида, синдом Барде-Бидля, синдром Ло-ренса-Муна, синдром Прадера-Лабхарта-Вилли, синдром Кирнса-Сейра, анорексия, отсутствие средней цепи ацил-СоА дегидрогеназы и кахексия. В некоторых воплощениях изобретения метаболическое нарушение является состоянием, поддающимся влиянию Coenzyme Q10.
"Лечение, уменьшение или предотвращение метаболического нарушения" означает улучшение такого состояния до или после его появления. По сравнению с эквивалентным контролем, не подвергавшимся лечению, такое уменьшение или степень предотвращения составляет по крайней мере 5, 10, 20, 40, 50, 60, 80, 90, 95 или 100% при подсчете по любому стандартному методу. Сахарный диабет является гетерогенной группой метаболических болезней, которая приводит к хроническому повышению глюкозы в крови (гиперглицемия). Диабет характеризуется разрушением панкреатических островков или дисфункцией, приводящей к потере регуляции глюкозы. Двумя основными типами сахарного диабета являются тип I, также известный как "инсулин-зависимый диабет" ("ИЗД") или "юношеский диабет", и тип II, также известный как "инсулин-независимый" ("ИНЗД") или "диабет зрелого возраста".
"Диабетом типа I" называется состояние, которое появляется в результате аутоиммунно-опосредованного разрушения панкреатических бета-клеток с последующим уменьшением образовании инсулина, что приводит к гиперглицемии. Диабет типа I требует инсулинзаместительной терапии для
обеспечения выживания. Хотя медикаменты, такие как инъецируемый инсулин и оральные гипоглике-мики, позволяют диабетикам жить дольше, диабет остается третьим главным убийцей, после болезней сердца и рака. Однако эти медикаменты не контролируют уровни сахара в крови достаточно, чтобы предотвратить кобебания между высоким и низким уровнями сахара в крови, что в результате повреждает почки, глаза и кровяные сосуды. Данные Исследования по контролю диабета и его осложнений (DCCT) показывают, что интенсивный контроль глюкозы в крови достоверно замедляет осложнения диабета, такие как ретинопатию, нефропатию и нейропатию, по сравнению с конвенциональной терапией, состоящей из одной или двух инъекций инсулина в день. Интенсивная терапия в DCCT включала многократные инъекции инсулина три или более раз в день или непрекращающееся подкожное введение инсулина (НПВИ) при помощи внешней помпы. Инсулиновые помпы являются одним из множества альтернативных вариантов для подкожных многократных ежедневных инъекций, для приближенной физиологической замены инсулина.
"Диабетом типа 2" называется состояние, при котором у пациента концентрация глюкозы в крови натощак или в сыворотке больше чем 125 мг/дл (6,94 ммоль/л). Диабет типа II характеризуется гиперг-лицемией в присутствие уровней инсулина в плазме выше нормы (гиперинсулинемия), представляет собой около 90% всех случаев диабета и встречается чаще всего у взрослых людей старше 40 лет с лишним весом. Развитие диабета типа II связано с повышенными концентрациями глюкозы в крови, в совокупности с соответствующим уменьшением уровня глюкозо-индуцированной секреции инсулина. Считается, что при диабете типа II тканевые процессы с контролируемым углеводным метаболизмом теряют чувствительность к инсулину и, следовательно, имеет место не недостаток образования инсулина, а пониженная чувствительность к возросшим уровням глюкозы в крови и неспособность реагировать на образование инсулина. Альтернативно, диабет может быть результатом различных дефектов в молекулярном механизме, который опосредует действие инсулина на клетки-мишени, таких как недостаток рецепторов к инсулину на поверхностях этих клеток. Следовательно, лечение деабета типа II зачастую не требует введения инсулина, но может быть основано на изменении диеты и образа жизни, в сочетании с терапией оральными гипоглицемическими агентами, такими как, например, сульфонилмо-чевина.
Преддиабетом называется состояние, когда пациент предрасположен к развитию диабета типа 2. Преддиабет распространяется на определение ухудшенной переносимости глюкозы, включая пациентов с глюкозой в крови натощак в пределах верхней границы нормы 100 мг/дл (Meigs et al., Diabetes 2003 52:1475-1484) и гиперинсулинемией натощак (повышенной концентрацией инсулина в плазме).
"Ожирением" называется состояние, когда у пациента ИМТ эквивалентно или выше чем 30 кг/м. "Ожирением внутренних органов" называется соотношение объема талии к объему бедер более 1,0 у пациентов мужского пола и более 0,8 у пациентов женского пола. В другом аспекте ожирение внутренних органов определяет риск резистентности к инсулину и развития преддиабета.
"Повышенный вес" относится к пациентам с ИМТ более 25 кг/м2 и менее 30 кг/м2. "Прибавление веса" относится к увеличению веса тела в связи с поведенческими привычками или зависимостями, например, перееданием или обжорством, прекращением курения или в связи с биологическими изменениями (в течение жизни), например, прибавление веса, связанное со старением у мужчин и менопаузой у женщин или набор веса после беременности.
"Метаболический синдром" (МС), также называемый Синдром X, относится к метаболическому расстройству, которое действует на другие пути метаболизма и системы в теле. Первоначально метаболический синдром определялся как группа метаболических нарушений (включая ожирение, резистентность к инсулину, гипертензию и дислипидемию, в первую очередь гипертриглицеридемию), которые совместно усиливают риск сердечнососудистых нарушений. Позднее (2001) национальная обучающая программа США по холестерину (NCEP) классифицировала "Метаболический синдром" как соответствующий следующим пяти критериям: :уровень глюкозы натощак не менее 110 мг/дл, уровень тригли-церида в плазме не менее 150 мг/дл (гипертриглицеридемия), ЛПВП-холестерин менее 40 мг/дл у мужчин или менее 50 мг/дл у женщин, кровяное давление не менее 130/85 мм Hg (гипертензия), и центральное ожирение, определяемое как обхват талии более чем 40 дюймов у мужчин и более чем 35 дюймов у женщин. В настоящее время существуют следующие три других международно признанных определения метаболического синдрома: 1) Всемирной организации здравоохранения 2) Американской кардиологической ассоциации /Национального института болезней сердца, легких и крови (AHA/NHLBI) и 3) Международной федерации диабета (IDF). Определения метаболического синдрома, данные ВОЗ, AHA/NHLBI и IDF, очень похожи на определение NECP, и во всех для определения синдрома используются одинаковые метаболические параметры, но ВОЗ также включает оценку инсулина по уровням инсулина натощак (Moebus S et al, Cardiovascular Diabetology, 6: 1-10, 2007; Athyros V G et al, Int. J. Cardiology, 117: 204-210, 2007). Но даже назначительные различия в пороговых значениях этих метаболических параметров между этими различными определениями, по которым классифицируется наличие метаболического синдрома, могут приводить к различной классификации определенного пациента как имеющего или не имеющего синдром в соответствии с этими различными определениями. Кроме того, распространенность сердечно-сосудистых нарушений (ССЗ) с МС различается в зависимо
сти от используемого определения (Moebus S et al, Cardiovascular Diabetology, 6: 1-10, 2007; Athyros V G et al, Int. J. Cardiology, 117: 204-210, 2007). По оценке Американской ассоциации диабета каждый пятый человек, имеющий лишний вес, страдает от метаболического синдрома.
В других аспектах метаболический синдром описывается по общепринятым симптомам, которые включают, не ограничиваясь, синдром X, синдром резистентности к инсулину, инсулин-резистентную гипертензию, метаболический гипертензивный синдром, дисметаболический синдром. Компоненты метаболического синдрома включают, не ограничиваясь, нарушение толерантности к глюкозе, нарушение концентрации глюкозы в сыворотке натощак, нарушение концентрации глюкозы в крови натощак, гиперинсулинемию, преддиабет, ожирение, ожирение внутренних органов, гипертриглицеридемию, повышенные концентрации в сыворотке свободных жирных кислот, повышенные концентрации в сыворотке С-реактивного белка, повышенные концентрации в сыворотке липопротеина, повышенные концентрации в сыворотке гомоцистеина, повышенные концентрации в сыворотке маленьких липопро-теинов низкой плотности (ЛПНП) в комплексе с холестерином, повышенные концентрации в сыворотке липопротеин-ассоциированной фосфолипазы (А2), пониженные концентрации в сыворотке липо-протеинов высокой плотности (ЛПВП) в комплексе с холестерином, пониженные концентрации в сыворотке ЛПВП ^^-холестерина, пониженные концентрации в сыворотке адипонектина, и альбуминурия (см: Pershadsingh НА. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma: therapeutic target for diseases beyond diabetes: quo vadis? Expert Opin Investig Drugs. (2004) 13:215-28, и ссылки, цитируемые здесь).
"Ключевые элементы" вышеупомянутых метаболических нарушений включают, не ограничиваясь, нарушенную гликемию натощак или нарушение толерантности к глюкозе, увеличенный объем талии, повышенное содержание внутреннего жира, повышенную глюкозу в плазме натощак, повышенные триглицериды в плазме натощак, пониженный уровень липопротеинов высокой плотности в плазме натощак, повышенное кровяное давление, резистентность к инсулину, гиперинсулинемию, сердечнососудистую болезнь (или ее компоненты, такие как артериослероз, болезнь коронарных артерий, болезнь периферийных сосудов, или цереброваскулярная болезнь), застойная сердечная недостаточность, повышенный норэпинефрин в плазме, повышенный уровень факторов воспаления, связанных с сердечно-сосудистой системой, повышенный уровень в плазме факторов, усиливающих дисфункцию сосудистого эндотелия, гиперлипопротеинемия, артериосклероз или атеросклероз, гиперфагия, гиперглице-мия, гиперлипидемия, и гипертензия или повышенное кровяное давление, повышенные уровени в плазме после еды триглицерида или свободных жирных кислот, повышенный клеточный окислительный стресс или его маркеры в плазме, повышенный гиперкоагулятивный статус кровеносной системы, жировой гепатоз, болезнь почек, включая почечную недостаточность.
"Резистентностью к инсулину" называется состояние, при котором для поддержания эугликеми-ческого статуса требуются уровни инсулина в системе кровообращения, превышающие нормальную реакцию на поступление глюкозы (Ford et al., JAMA. 2002, 287:356-9). Резистентность к инсулину и реакция на терапию пациента с резистентностью к инсулину могут быть измерены путем модели оценки гомеостаза, оценивающей степень резистентности к инсулину, (HOMA-IR), что является достоверным показателем резистентности к инсулину (Katsuki et al., Diabetes Care 2001, 24:362-5). Оценка резистентности к инсулину по модели оценки гомеостаза (HOMA)-IR может быть подсчитана по формуле, раскрытой у Galvin et al., Diabet Med 1992, 9:921-8, где НОМА-Ш=[инсулин в сыворотке натощак (мкЕД/мл)].время [глюкоза в плазме натощак (ммоль/л)/22.5].
"Гиперинсулинемия" определяется как состояние, при котором у пациента с резистентностью к инсулину, имеющего или не имеющего эуглицемию, концентрации инсулина в плазме или сывротоке натощак или после еды превышают концентрации у нормальны, не полных индивидуумов без резистентности к инсулину, имеющих соотношение талии к бедрам <1.0 (для мужчин) или <0.8 (для женщин).
Термин "нарушение толерантности к глюкозе" (IGT) используется для описания человека, у которого при проведении теста на толерантность к глюкозе уровень глюкозы в крови находится между нормой и гипергликемией. У такого человека выше риск развития диабета, хотя не считается, чтоу него есть диабет. Например, нарушенной толерантностью к глюкозе называется состояние, при котором у пациента концентрация глюкозы в крови натощак или концентрация глюкозы в сыворотке натощак выше, чем 110 мг/дл и меньше чем 126 мг/дл (7.00 ммоль/л), или концентрация глюкозы в крови через 2 ч после еды или глюкозы в сыворотке выше чем 140 мг/дл (7.78 ммоль/л) и меньше чем 200 мг/дл (11.11 ммоль/л).
Состояние "гипергликемии" (высокого сахара в крови) является состоянием, при котором уровень глюкозы в крови слишком высокий. Обычно гипергликемия появлятся, когда уровень глюкозы в крови превышает 180 мг/дл. Симптомы гипергликемии включают частое мочеиспускание, чрезмерную жажду и, через продолжительное время, потерю веса.
Состояние "гипогликемии" (низкого сахара в крови) является состоянием, при котором уровень глюкозы в крови слишком низкий. Обычно гипогликемия появляется, когда уровень глюкозы в крови падает ниже 70 мг/дл. Симптомы гипогликемии включают резкие смены настроения, онемение конечностей (особенно в кистях и предплечьях), помрачение сознания, дрожь или головокружение. Посколь
ку это состояние возникает, когда инсулин превышает количество доступной глюкозы, иногда его называют инсулиновой реакцией.
(i) Диагностика метаболических нарушений.
Методы и составы настоящего изобретения полезны для лечения пациентов, у которых диагностировано метаболическое нарушение, такое как диабет, или имеется риск его развития. Пациент, у которого предотвращается развитие метаболического нарушения (например, диабета или ожирения), может иметь такой диагноз или не иметь его. Специалист поймет, что пациенты изобретения могут быть субъектами стандартных анализов или могут быть идентифицированы, без исследования, как субъекты с повышенным риском вследствие наличия одного или более факторов риска.
Диагноз метаболического нарушения может быть поставлен с использованием любого стандартного метода, известного специалистом, такого как описанные здесь. Методы диагностики диабета, описанные, например, в патенте США № 6,537,806, включены сюда в качестве ссылки. Диабет может быть диагностирован и может наблюдаться с использованием, например, анализа мочи, в котором измеряются уровни глюкозы и кетона (продукта расщепления жиров); анализов, которые измеряют уровни глюкозы в крови; анализы толерантности к глюкозе; и анализы, которые определяют характерные для метаболического нарушения молекулярные маркеры в биологическом образце (напр, крови, сыворотке или моче), собранных у млекопитающих (напр, количественная оценка уровней гемоглобина Alc (HbAlc) в случае диабета).
Пациентом, у которого лечится метаболическое нарушение, является тот, у кого практикующий врач диагностировал наличие такого состояния. Диагноз может быть поставлен при помощи любых подходящих методов, таких как описанные здесь. Пациент, у которого предотвращается развитие диабета или ожирения, может получить или не получить такой диагноз. Специалист поймет, что пациенты изобретения могут быть подвергнуты стандартным анализам или же могут быть идентифицированы без обследования как имеющие высокий риск вследствие присутствия одного или более факторов риска, таких как семейный анамнез, ожирение, особая этническая принадлежность (например, афроамерикан-цы и испано-американцы), гестационный диабет или вынашивание ребенка, который весит более девяти фунтов, гипертензия, наличие паталогического состояния, предшествующего ожирению или диабету, высокие уровни в крови триглицеридов, высокие уровни в крови холестерина, наличие молекулярных марекров (напр, наличие аутоантител), и возраст (более 45 лет). Считается, что у пациентов есть ожирение, если их вес на 20% (25% у женщин) или более превышает максимальный вес, желательный для их роста.. Взрослые, у который лишний вес превышает 100 фунтов, считаются имеющими болезненное ожирение. Ожирение также определяется как индекс массы тела (ИМТ), превышающий 30 кг/м.
У пациентов может диагностироваться риск развития диабета или диабет, если случайный анализ глюкозы в плазме (проводимый в любое время дня) показывает значение 200 мг/дл или более, если анализ глюкозы в плазме натощак показывает значение 126 мг/дл или более (после 8 ч), или если оральный тест толерантности к глюкозе (OGTT) показывает значение глюкозы в плазме 200 мг/дл или более в образце крови, взятом чере два часа после того, как пациент примет напиток, содержащий 75 грамм глюкозы, растворенной в воде. OGTT измеряет глюкозу в плазме во временные интервалы после 3-часового периода. Желательно, чтобы уровень глюкозы в плазме у пациентов с диабетом, подвергаемых лечению в соответствиис изобретением, находился между 160 и 60 мг/дл, между 150 и 70 мг/дл, между 140 и 70 мг/дл, между 135 и 80 мг/дл и предпочтительно между 120 и 80 мг/дл.
Необязательно, можно применить тест на гемоглобин Alc (HbAlc), который оценивает средние уровни глюкозы в крови в течение периода двух и трех месяцев. У человека, не имеющего диабета, значение HbAlc обычно находится между 4 и 6%. Для каждого 1%, на который возрастает HbAlc, уровень глюкозы в крови возрастает примерно на 30 мг/дл и возрастает риск осложнений. Предпочтительно, значение HbAlc у пациента, подвергаемого лечению в соответствии с настоящим изобретением, уменьшается до значения менее чем 9%, менее чем 7%, менее чем 6%, и наиболее предпочтительно до около 5%. Таким образом уровни HbAlc пациента, подвергаемого лечению, предпочтительно уменьшаются на 10, 20, 30, 40, 50% или более по сравнению с уровнями до лечения.
Гестационный диабет обычно диагностируется на основе значений глюкозы в плазме, подсчитанных во время OGTT. Поскольку уровни глюкозы в во время беременности в норме ниже, пороговые значения для диагностики диабета во время беременности ниже, чем у того же человека перед беременностью. Если у женщины имеются два показателя глюкозы в плазме, которые соответствуют или превышают любое из следующих значений, у нее есть гестационный диабет: уровень глюкозы в плазме натощак 95 мг/дл, 1-часовой уровень 180 мг/дл, 2-часовой уровень 155 мг/дл или 3-часовой уровень 140 мг/дл.
Для диагностики диабета типа I может также быть проведен анализ на кетоны. Поскольку кетоны образуются в крови при нехватке инсулина, они в итоге накапливаются в моче. Высокие уровни кето-нов в крови могут приводить к серьезному состоянию, называемому кетоасцидозом.
В соответствии с рекомендациями Американской ассоциации диабета для диагностики диабета типа 2 у пациента должен быть уровень глюкозы в плазме натощак, превышающий или равный 126 мг/дл или в 2-часовом оральном тесте на толерантность к глюкозе (OGTT) значение глюкозы в плазме
превышающее или равное 200 мг/дл (Diabetes Care, 26:S5-S20, 2003).
Родственное состояние, называемое преддиабетом, определяется как наличие уровня глюкозы натощак выше чем 100 мг/дл, но менее чем 126 мг/дл или уровня 2-часовой OGTT глюкозы в плазме выше чем 140 мг/дл, но менее чем 200 мг/дл. Растущее количество данных подтверждает, что состояние преддиабета может быть фактором риска для развития сердечно-сосудистой болезни (Diabetes Care 26:2910-2914, 2003). Преддиабет, также называемый нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенной гликемией натощак является основным фактором риска для развития сахарного диабета типа 2, сердечнососудистой болезни и смертности. Основное внимание уделяется разработке терапевтических вмешательств, которые предотвращают развитие диабета типа 2. (Pharmacotherapy, 24:362-71, 2004).
Ожирение (обычно определяемое как Индекс Массы Тела приблизительно > 30 кг/м2) часто связывается с различными патологическими состояниями, такими как гиперинсулинемия, резистентность к инсулину, диабет, гипертензия и дислипидемия. Каждое из таких состояний вносит свой вклад в риск развития сердечно-сосудистой болезни.
Наряду с резистентностью к инсулину, гипертензией и дислипидемией ожирение рассматривается как часть Метаболического Синдрома (также известного как Синдром X), которые в совокупности увеличивают вероятность сердечно-сосудистой болезни. В последнее время национальная обучающая программа США по холестерину классифицирует Метаболический Синдром как соответствующий трем из следующих пяти критериев: уровень глюкозы натощак не менее 110 мг/дл, уровень триглицерида в плазме не менее 150 мг/дл (гипертриглицеридеми), ЛПВП-холестерин ниже 40 мг/дл у мужчин или ниже 50 мг/дл у женщин, давление крови не менее 130/85 мм рт ст (гипертензия), и центральное ожирение, где центральное ожирение определяется при окружности талии более чем 40 дюймов у мужчин и более чем 35 дюймов у женщин.
(ii) Оценка эффективности лечения метаболического нарушения.
Специалист поймет, что любой из вышеупомянутых анализов или любой другой анализ, известный специалистам, может быть использован для мониторинга эффективности терапевтического лечения изобретения. Поскольку измерение уровней гемоглобина Alc (HbAlc) является показателем средней глюкозы в крови в течение последующих двух-трех месяцев, этот анализ может быть использован для мониторинга реакции пациента на лечение диабета.
Терапевнические способы изобретения эффективны в снижении уровней глюкозы или уровней липидов у пациента. Под "снижением уровней глюкозы" подразумевается уменьшение уровня глюкозы по крайней мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 100% по сравнению с не подвергавшимся воздействию контролем. Желательными являются уровни глюкозы, сниженные до уровней нормогли-кемии, т.е. между 150 и 60 мг/дл, между 140 и 70 мг/дл, между 130 и 70 мг/дл, между 125 и 80 мг/дл, а также между 120 и 80 мг/дл. Такое снижение уровней глюкозы может быть получено при повышении любой биологической активности, связанной с клиренсом глюкозы из крови. Соответственно, агент, обладающий способностью уменьшать уровни глюкозы, может повышать образование, секрецию или действие инсулина. Действие инсулина может быть повышено, например, путем повышения поглощения глюкозы периферийными тканями и/или путем редукции образования глюкозы печенью. Альтернативно агент изобретения может уменьшать абсорбцию углеводов в кишечнике, изменяя активность транспортера глюкозы (например, путем увеличения экспрессии GLUT4, собственной активности или транслокации), увеличивать количество чувствительной к инсулину ткани (например, увеличивая диф-ференцировку мышечных клеток или адипоцитов), или изменяя транскрипцию генов в адипоцитах или мышечных клетках (например, изменяя секрецию факторов адипоцитами при экспрессии генов метаболического пути). Желательно, чтобы агент изобретения повышал более чем одну из активностей, связанных с клиренсом глюкозы. Под "уменьшением уровней липидов" подразумевается уменьшение уровней липидов по крайней мере на 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 100% по сравнению с необработанным контролем.
Под "изменением пути сигналинга инсулина, при котором уменьшаются уровни глюкозы" подразумевается изменение (путем повышения или уменьшения) любой из активностей, включенных в сиг-налинг инсулина, таким образом, что общим результатом будет повышение клиренса глюкозы из плазмы. Например, фактор-в изобретения изменяет путь сигналинга инсулина, приводя к возрастанию образования, секреции или действия инсулина, повышению потребления глюкозы периферийными тканями, уменьшению образования глюкозы печенью или к уменьшению абсорбции углеводов из кишечника.
Способность фактора влияния, например, эпи-переключателя, уменьшать уровни глюкозы и тем самым лечить метаболическое нарушение, может оцениваться с использованием стандартных анализов, известных специалистам. Например, может использоваться основанный на клетках скрининговый анализ, который идентифицирует агенты, увеличивающие потребление глюкозы. В частности, различные адипоциты в клеточной культуре могут использоваться для исследования способности эпи-переключателя увеличивать потребление глюкозы после инсулиновой стимуляции, что определяется при помощи глюкозы с радиоактивной меткой. В другом типовом анализе человеческие миобласты, полученные путем иммортализации клеток, извлеченных из субъектов, не имеющих диабета, могут
использоваться для исследования действия агентов на синтез гликогена, с использованием инсулина как позитивного контроля. Перед воздействием клетки помещаются в бессыворотную среду и затем инкубируются или с эпи-переключателем, или с контролем в течение двух часов в бессыворотной среде, содержащей глюкозу с радиоактивной меткой, после чего делается количественный подсчет синтеза гликогена. Примерные анализы в дальнейшем описываются в примерах.
V. Терапевтические мишени при метаболических заболеваниях.
В настоящем изобретении представлены способы идентификации терапевтических мишеней при метаболических заболеваниях. В изобретении также представлены терапевтические мишени, идентифицированные такими способами. Идентификация терапевтической цели включает, в общем, экзогенное применение фактора-В или возможного фактора-В на клетку или группу клеточных линий, и последующую оценку изменений, вызыванных в подвергшейся воздействию клетке по сравнению с контрольной клетокой, не подвергавшейся воздействию. Вызыванные клеточные изменения, которые прослеживаются, включают, не ограничиваясь, изменения морфологии, физиологии или состава, например, уровня РНК, белков, жиров или метаболитов, в клетке. Вызыванные клеточные изменения как результат воздействия возможного фактора-В можно проследить с использованием любого из анализов, описанных в настоящем документе. Например, изменения экспрессии генов по уровню мРНК можно оценить по методу ПЦР в режиме реального времени, в котором изменения в экспрессии генов, влияющие на уровень белка, можно проследить с использованием антительных микропанелей и 2-D гель-электрофореза. Гены, идентифицированные как модулированные возможным факторов-В (например, по мРНК и/или уровню белка) затем оценивались по перспективе системной биологии с использованием анализа метаболизма (программа Ingenuity IPA) и при изучении известной литературы. Гены, идентифицированные как потенциальные терапевтические мишени, затем проходили подтверждающий анализ, такой как иммуноблоттинг, нокаут миРНК или рекомбинантные методы, основанные на выработке и характеристике белка. Затем для идентификации модуляторов мишеней можно использовать скри-нинговые анализы. Модуляторы терапевтических мишеней полезны как новые терапевтические агенты для метаболических нарушений. Модуляторы терапевтических мишеней можно обычным образом идентифицировать с использованием скрининговых анализов, детально описанных в настоящем документе, или с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области техники.
Гены, идентифицированные здесь как модулированные (например, повышающе или понижающе модулированные, на уровне мРНК или белка) посредством МВМ/эпи-переключателя, CoQ10, являются мишенями для лекарства изобретения. Мишени для лекарства изобретения включают, не ограничиваясь, гены, перечисленные здесь ниже в таблицах 2-4 и 6-28 и 63-68. Основанные на результатах экспериментов, описанных здесь в приложениях, ключевые белки, модулированные Q10, связаны с или могут быть классифицированы по различным путям обмена или группам молекул, включая факторы транскрипции, апоптозный ответ, пентозофосфатный путь, путь биосинтеза, окислительный стресс (про-окиданты), мембранные перестройки и метаболизм окислительного фосфорилирования. На основании полученных здесь результатов ключевыми белками, модулируемыми CoQ10, являются следующие. Ключевой белок, модулируемый CoQ10 и являющийся трансприпционным фактором, HNF4альфа. Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с апоптозным ответом, включают Bcl-xl, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, и сМус. Ключевой белок, модулируемый CoQ10 и связанный с пентозофосфатным путем, является трансальдолазой 1. Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с путями биосинтеза, включают COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазу и 4-гидроксибензоат. Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с окислительным стрессом (про-оксиданты) включают цитозольный фактор нейтрофилов 2, синтазу оксида азота 2А и супероксиддисмутазу 2 (митохондриальную). Ключевые белки, модулируемые CoQ10 и связанные с метаболизмом окислительного фосфорилирования, включают Цитохром с, комплекс I, комплекс II, комплекс Ш и комплекс IV. Другие ключевые белки, которые прямо или опосредованно модулируются CoQ10, включают Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam Киназу II.
Соответственно, в одном варианте воплощения изобретения, мишени лекарственного средства могут включать ЮЛЧ-альфа Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, трансальдолазу 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазу, 4-гидробензоат, цитозольный фактор нейтрофилов 2, синтазу оксида азота 2А и супероксиддисмутазу 2, VDAC, Вах канал, ANT, Цитохром с, комплекс I, комплекс II, комплекс III, комплекс IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam Киназу II. В предпочитаемых вариантах воплощения, мишени лекарственного средства могут включать HNF4A, трансальдолазу, NM23 и BSCv. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является TNF4A. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является трансальдолаза. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является NM23. В одном варианте воплощения мишенью лекарственного средства является BSCv. Скрини-рующие анализы, полезные для идентификации модуляторов или идентификации мишеней лекарственных средств, описаны ниже.
VI. Скрининговые анализы.
В настоящем изобретении также представлены способы (также называемые здесь "скрининговые
анализы") идентификации модуляторов, т.е., кандидатов или тестируемых соединений или агентов (например, белков, пептидов, пептидомиметиков, пептоидов, маленьких молекул или других веществ), которые модулируют экпрессию и/или активность идентифицированной терапевтической мишени изобретения. Такие анализы обычно включают в себя реакцию между терапевтической мишенью изобретения и одним или более исследуемым соединением. Другие соединения сами могут быть или тестируемыми соединениями, или комбинацией тестируемых компонентов и веществ, естественно связывающихся с маркером изобретения. Соединения, идентифицированные посредством анализов, таких как описанные здесь, могут быть полезны, например, для лечения или профилактики метаболического нарушения.
Исследуемые соединения, используемые в скрининговых анализах настоящего изобретения, могут быть получены из любого доступного источника, включая систематические библиотеки природных и/или синтетических соединений. Исследуемые соединения также могут быть получены путем любого из многочисленных подходов в комбинированных библиотечных способах, известных специалистам, включая: биологические библиотеки; пептоидные библиотеки (библиотеки молекул, имеющих функциональность пептидов, но с новым, не пептидным каркасом, устойчивым к ферментному расщеплению, но тем не менее остающимся биоактивным; см, например, Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); территориально доступные параллельные библиотеки твердой фазы или растворимой фазы; синтетические библиотечные способы, требующие деконволюции; библиотечные способы; и синтетические библиотечные способы, использующие аффинную хроматографию. Подходы биологической библиотеки и пептоидной библиотеки ограничены пептидными библиотеками, в то время как другие четыре подхода пригодны для библиотек пептидов, непептидных олигомеров или низкомолекулярных соединений (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Примеры способов для синтеза молекулярных библиотек можно найти в специальной литературе: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Set U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; и in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233.
Библиотеки соединений могут быть представлены в растворах (например, Houghten, 1992, Bio-techniques 13:412-421), или в частицах (Lam, 1991, Nature 354:82-84), чипах (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), бактериях и/или спорах, (Ladner, USP 5,223,409), плазмидах (Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) или фагах (Scott и Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, supra.).
Скрининговые способы настоящего изобретения включают в себя контакт клеток с исследуемым соединением и определение способности исследуемого соединения модулировать экспрессию и/или активность терапевтической мишени изобретения в клетке. Экспрессия и/или активность терапевтической мишени изобретения может быть определена, как описано в настоящем документе. Экспрессия и/или активность терапевтической мишени изобретения может также быть определена с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области. В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности повышать экспрессию и/или активность терапевтической мишени изобретения. В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности повышать экспрессию и/или активность терапевтической мишени, выбранной из белков, перечисленных в таблицах 2-4 и 6-28 и 63-68, где терапевтическая мишень повышающе модулируется CoQ10 (например, показывает положительное кратное изменение). В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности понижать экспрессию и/или активность терапевтической мишени изобретения. В одном варианте воплощения соединение выбирается на основе его способности понижать экспрессию и/или активность терапевтической мишени, выбранной из белков, перечисленных в таблицах 2-4 и 6-28 и 63-68, где терапевтическая мишень понижающе модулируется CoQ10 (например, показывает отрицательное кратное изменение).
В другом варианте воплощения настоящего изобретения представлены способы скринирования возможных или тестируемых соединений, которые являются субстратами терапевтических мишеней изобретения или их биологически активных составляющих. В еще одном варианте воплощения изобретения представлены способы скринирования возможных или тестируемых соединений, которые связываются с терапевтическими мишенями изобретения или их биологически активными составляющими. Определение способности тестируемого вещества прямо связываться с терапевтической мишенью может быть проведено при соединении вещества с радиоизотопной или энзимной меткой таким образом, что такое связывание соединения с терапевтической мишенью можно определить, детектируя меченное маркером соединение в комплексе. Например, соединения (например, маркер к субстрату) можно по-
131 125 35 14 3
метить I, I, S, С, или Н, прямо или опосредованно, и радиоактивный изотоп будет детектирован или прямым подсчетом радиоэмиссии, или подсчетом сцинцилляции. Альтернативно, соединения способа могут быть энзимно помечены, например, пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой или люци
феразой, и энзимная метка детектируется путем определения превращения соответствующего субстрата в продукт.
Это изобретение также относится к новым агентам, идентифицированным по вышеописанным способам скринирования. Соответственно, в объеме этого изобретения для дальнейшего использования находится агент, идентифицированный как описано здесь в соответствующей модели на животных. Например, агент, способный модулировать экспрессию и/или активность маркера изобретения, идентифицированный как описано здесь, может быть использован в модели на животных для определения эффективности, токсичности или побочных эффектов воздействия такого агента. Альтернативно, агент, идентифицированный как описано здесь, может быть использован в модели на животных для определения механизма действия такого агента. Кроме того, это изобретение относится к использованию новых агентов, идентифицированным по вышеописанным способам скринирования, для лечения, как описано выше.
VII. Фармацевтические композиции и фармацевтическое введение.
Факторы влияния изобретения могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Типично, фармацевтическая композиция содержит фактор влияния изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании здесь "фармацевтически приемлемый носитель" включает все без исключения растворы, диспергентные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые агенты, изотонический и абсорбирующий агенты и подобные тому физиологически совместимые. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько из воды, солевого раствора, фосфатного буферного солевого раствора, декстрозы, глицерина, этанола и подобных соединений, а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительным включить в состав изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут также включать в минорных количествах вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие реагенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность фактора влияния.
Композиции настоящего изобретения могут быть в различных формах. Они включают, например, жидкости, полутвердые и твердые дозированные формы, такие как жидкие растворы (например, инъецируемые и вливаемые растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, кремы, лосьоны, мази или пасты, капли, подходящие для введения в глаза, уши или нос, липосомы и суппозитории. Предпочитаемая форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.
Факторы влияния настоящего изобретения могут вводиться различными способами, известными специалистам в данной области. Для многих терапевтических применений, предпочитаемым путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или вливание. Как поймут специалисты в данной области, путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах воплощения, активное соединение может быть приготовлено с носителем, который защитит соединение от быстрого высвобождения, таким как рецептура контролируемого высвобождения, включающая импланты, трансдермальные пластыри и микроинкап-сулированные системы доставки. Могут использоваться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы для приготовления таких рецептур запатентованы или в основном известны специалистам в данной области. См., например, Системы доставки лекарств с непрерывным и контролируемым высвобождением, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. В одном варианте воплощения способ введения является парэнтеральным (например, внутривенным, подкожным, внутрибрюшинным, внутримышечным). В одном варианте воплощения фактор влияния вводится путем внутривенного вливания или инъекции. В другом варианте воплощения фактор влияния вводится путем внутримышечной или подкожной инъекции. В предпочтительном варианте воплощения фактор влияния вводится местно.
Терапевтические композиции типично должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть по рецептуре раствором, микроэмульсией, дисперсией, липосомой или другой упорядоченной структурой, подходящей для высокой концентрации лекарства. Стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены путем включения активного компонента (например, фактора влияния) в требуемое количество подходящего раствора с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, как требуется, с последующим фильтрованием и стерилизацией. Как правило, дисперсии приготавливаются путем включения активного компонента в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных лиофилизованных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов предпочитаемыми способами приготовления являются вакуумная сушка и распылительная сушка, которые дают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желаемого ингредиента из их раствора, предварительно стерелизованного и профильтрованного. Необходимая текучесть раствора может быть достигнута, например, использованием покрытия, такого как лецитин, поддержанием нужного размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбсция инъецируемых композиций может быть
достигнута включением в композицию реагента, который задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.
Техники и рецептуры в основном можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remming-ton, Meade Publishing Co., Easton, Пенсильвания. Для системного введения предпочтительна инъекция, включая внутримышечную, внутривенную, внутрибрюшинную и подкожную. Композиции для инъекции могут быть сделаны по рецептуре в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка или раствор Рингера. Кроме того, соединения могут быть изготовлены в твердой форме и растворены или превращены в суспензию непосредственно перед использованием. Также включаются лиофилизированные формы.
Фармацевтические композиции для орального введения могут иметь форму, например, таблеток или капсул, приготовленных стандартными способами с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как связывающие реагенты (например, желатинированный кукурузный крахмал, поливи-нилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазочные вещества (например, стеарат магния, тальк или окись кремния); разрыхлители (например, картофельный крахмал или натрия гликолят крахмала); или увлажняющие реагенты (например, лауретсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты по способам, хорошо известным специалистам в данной области. Жидкие препараты для орального введения могут иметь форму, например, растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены в виде сухого продукта для соединения с водой или другим подходящим носителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут быть приготовлены обычными способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие реагенты (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или гуммиарабик); безводные носители (например, атионд масло, жирные эфиры, этиловый спирт или ректифицированные растительные масла); и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также при необходимости содержать буферные соли, ароматизаторы, подкрашивающие и подслащивающие вещества.
Препараты для орального введения могут быть разработаны так, чтобы обеспечить контролируемое высвобождение активного компонента. Для введения через рот композиции могут иметь форму таблеток или лепешек, изготовленных стандартным образом. Для введения путем ингаляции соединения для использования в соответствии с настоящим изобретением легко доставляются в форме аэрозольного спрея, подающегося из баллона под давлением или небулайзера, с использованием подходящей сжатой жидкости, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозольного баллона под давлением дозированная единица может быть точно определена, если обеспечить доставку клапаном постоянного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инжекторе могут быть разработаны с содержанием порошка смеси компонентов и подходящей порошковой базы, такой как лактоза или крахмал.
Соединения могут быть изготовлены для парэнтерального введения путем инъекции, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Рецептуры для инъекции могут быть представлены в лекарственной форме со стандартной дозировкой, например, в ампулах или мультидозных емкостях, с добавленным консервантом. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в жировых или водных носителях, и могут содержать рецептурные реагенты, такие как суспензирующие, стабилизирующие и/или дисперсирующие реагенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в форме порошка для соединения с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед использованием.
Соединения могут быть также изготовлены в ректальной композиции, такой как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие традиционную суппозиторную основу, такую как кокосовое масло или другие глицериды.
В дополнение к композициям, описанным выше, соединения могут также быть изготовлены как депо препарата. Такие долгодействующие композиции могут вводиться имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, в композиции могут входить подходящие полимерные или гидрофобные вещества (например, как эмульсия в соответствующем масле) или ионообменные смолы, или в виде слабо растворимых производных, например, как слабо растворимая соль.
Системное введение может также быть трансмукозальным или трансдермальным. Для трансмуко-зального или трансдермального введения в рецептуре используются пенетранты, пригодные для преодоления барьера. Такие пенетранты в большинстве своем известны специалистам и включают, например, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты, для облегчения проникновения могут быть использованы детергенты. Трансмукозальное введение может быть произведено с использованием назальных спреев или суппозиториев. Для местного введения, соединение(я) изобретения смешиваются в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, известных в большинстве своем специалистам. Местно может быть использован водный раствор для лечения повреждений или воспаления для ускорения
исцеления.
Композиции могут, при желании, быть представлены в виде упаковки или диспенсера, который может содержать одну или более дозовых единиц в форме, содержащей активный ингредиент. Упаковка, может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистер. К упаковке или диспенсеру могут прилагаться инструкции по применению.
Для терапии, включающей введение нуклеиновых кислот, соединение(я) изобретения могут быть изготовлены во множестве форм введения, включая системное и местное введение. Техники и рецептуры в большинстве своем можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remmington, Meade Publishing Co., Easton, Пенсильвания. Для системного введения предпочтительна инъекция, включая внутримышечную, внутривенную, внутрибрюшинную, внутриузловую и подкожную. Для инъекции соеди-нения(й) изобретения могут быть изготовлены в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка и раствор Рингера. Кроме того, соединение(я) могут быть изготовлены в твердой форме и растворены или превращены в суспензию непосредственно перед использованием. Также включаются лиофилизированные формы.
В одном варианте воплощения, композиции, содержащие фактор влияния, вводятся местно. Предпочтительно представлять активный ингредиент, т.е. фактор-В, как фармацевтическую композицию. Активного ингредиента может содержаться, для местного введения, от около 0,001% до около 20% от массы, по весу композиции в конечном продукте, хотя он может составлять до 30% от массы, предпочтительно от около 1% до около 20% от массы композиции. Местные композиции настоящего изобретения содержат активный ингредиент вместе с одним или более приемлемым ностелем(ями), а также опционально любой другой терапевтический ингредиент(ы). Носитель(и) должен быть "приемлемым" в отношении того, что должен сочетаться с другими ингредиентами композиции и не причинять вред реципиенту.
При лечении пациента, у которого выявлена соответствующая болезнь, вводится терапевтически эффективное количество агента или агентов. Терапевтически эффективная доза означает такое количество соединения, которое приводит к облегчению симптомов или удлинению срока жизни пациента.
Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений должна определяться стандартными фармацевтическими процедурами в клеточных культурах или экспериментальных животных, например, определением ЛД50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ЭДзд (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение между токсичным и терапевтическим эффектами называется терапевтическим индексом и может быть выражено как соотношение ЛД50/ЭД50. Предпочтительны соединения, которые показывают высокие терапевтические индексы. Данные, полученные из таких клеточных исследований и исследований на животных, могут быть использованы в разработке диапазона дозировки для использования у людей. Дозировка таких соединений находится предпочтительно внутри диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ЭД50 с маленькой или отсутствующей токсичностью. Дозировка может варьировать внутри этого диапазона в зависимости от применяемой формы дозы и используемого способа введения.
Для любого соединения, используемого в способе изобретения, терапевтически эффективная доза может быть установлена непосредственно из исследований клеточной культуры. Например, доза может быть разработана в моделях на животных для достижения циркулирующей концентрации в плазме в диапазоне, который включает IC50, как определено в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения полезной дозы для людей. Уровни в плазме могут быть подсчитаны, например, при помощи ВЭЖХ.
Точная композиция, путь введения и дозировка могут быть выбраны отдельным врачом с учетом состояния пациента, (см. например Fingl et al., Фармакологическая основа терапии, 1975, гл. 1 с. 1). Следует заметить, что внимательный медик будет знать, как и когда следует остановить, прервать или отрегулировать введение, приводящее к токсичности или к дисфункции органа. И наоборот, внимательный врач также будет знать, как отрегулировать лечение к более высоким уровням, если клинический ответ не адекватен (не допуская токсичность). Размер вводимой дозы при лечении соответствующего паталогического расстройства будет варьировать в соответствии с серьезностью состояния, подвергающегося лечению, и способа введения. Серьезность состояния может, например, быть оценена, частично, путем стандартных прогностических способов оценки. Более того, доза и, возможно, частота дозы, также будет варьировать в зависимости от возраста, веса тела и реакции отдельного пациента. Программа, сопоставимая с обсуждаемой выше, может быть использована в ветеринарной медицине.
В зависимости от определенных состояний, подвергаемых лечению, соответствующие агенты могут быть созданы и введены системно или местно. Техники для разработки формулы и введения можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remington, 18е изд.., Mack Publishing Co., Easton, Пенсильвания. (1990). Подходящие способы введения могут включать оральное, ректальное, трансдер-мальное, вагинальное, трансмукозальное или кишечное введение; парентеральную доставу, включая внутримышечные, подкожные, костномозговые инъекции, а также интратекальные, прямые внутриже-лудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции, перечислено лишь несколько способов.
Композиции, описанные выше, могут вводиться субъекту в любой подходящей рецептуре. В дополнение к лечению метаболического нарушения местными композициями фактора влияния, например CoQ10, в других аспектах изобретения фактор влияния, например CoQ10, может быть доставлен другими способами. Например, фактор влияния, например CoQ10 может быть разработан для парентеральной доставки, например, для подкожной, внутривенной, внутримышечной или внутриопухолевой инъекции. Могут использоваться другие способы доставки, например, липосомная доставка или диффузия из прибора, наполненного композицией. Композиции могут вводиться одним болюсом, множественными инъекциями или непрерывной инфузией (например, внутривенно или путем перитонеально-го диализа). Для парентерального введения, композиции предпочтительно разрабатываются в стерильной апирогенной форме. Композиции настоящего изобретения также могут вводиться in vitro в клетку (например, для вызова апоптозов в раковой клетке в культуре in vitro) непосредственным добавлением композиции к жидкости, в которой содержится клетка.
В зависимости от определенных состояний, подвергаемых лечению, соответствующие агенты могут быть созданы и введены системно или местно. Техники для разработки формулы и введения можно найти в публикации Фармацевтические науки, Remington, 18е изд., Mack Publishing Co., Easton, Пенсильвания. (1990). Подходящие способы введения могут включать оральное, ректальное, трансдер-мальное, вагинальное, трансмукозальное или кишечное введение; парентеральную доставу, включая внутримышечные, подкожные, костномозговые инъции, а также интратекальные, прямые внутрижелу-дочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции, перечислено лишь несколько способов.
Для инъекции агенты изобретения могут быть разработаны в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для такого трансмукозального введения в рецептуре используются пенетранты, пригодные для преодоления барьера. Такие пенетранты в большинстве своем известны специалистам в данной области.
Использование фармацевтически пригодных носителей в рецептуре соединений, раскрытых здесь для практики изобретения, в дозах, пригодных для системного введения, входит в объем изобретения. С правильным выбором носителя и подходящей технологией производства, композиции настоящего изобретения, в частности, разработанные как растворы, могут вводиться парентерально, например, путем внутривенной инъекции. Могут быть легко разработаны композиции с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных специалистам, в дозах, подходящих для орального введения. Такие носители дают возможность композициям изобретения быть изготовлеными в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий и тому подобного, для орального введения пациенту, подвергаемому лечению.
Агенты, предназначенные для внутриклеточного введения, могут вводиться с использованием техник, хорошо известных специалистам, имеющим стандартные знания в данной области. Например, такие агенты могут быть инкапсулированы в липосомы, затем введены, как описано выше. Липосомы являются сферическими липидными двухслойными структурами с водным содержимым. Все молекулы, представленные в водном растворе во время образования липосомы, включены в водную среду. Содержимое липосом защищено от внешней микросреды и, поскольку липосомы проникают сквозь клеточные мембраны, эффективно доставляется в цитоплазму клеток. Кроме того, вследствие своей гидрофобности маленькие органические молекулы могут вводиться прямо внутриклеточно.
Фармацевтические композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в эффективном количестве для достижения соответствующей цели. Определение эффективного количества вполне возможно для специалистов в данной области, особенно в свете детального раскрытия, предоставленного здесь. В дополнение к активным ингредиентам эти фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, содержащие вспомогательные вещества, которые способствуют созданию содержащих активные компоненты препаратов, которые можно использовать в фармацевтике. Препараты, формула которых подходит для орального введения, могут быть в форме таблеток, драже, капсул или растворов. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть произведены по способу, который сам по себе известен, например, посредством стардатного смешивания, растворения, грануляции, приготовления драже, процессов возгонки, эмульгирования, инкапсулирования, улавливания или лиофилизации.
Композиции, подходящие для местного введения, включают жидкости или полужидкие препараты, подходящие для проникновения сквозь кожу в месте, где требуется лечение, такие как жидкие мази, лосьоны, кремы, мази или пасты и капли, подходящие для введения в глаза, уши или нос. Капли в соответствии с настоящим изобретением могут быть в виде стерильных водных или жировых растворов и могут быть приготовлены путем разведения активного ингредиента в подходящем водном растворе бактерицидного и/или фунгицидного реагента и/или любого другого подходящего консерванта, и предпочтительно включать поверхностно-активный реагент. Получившийся в результате раствор затем может быть очищен и стерилизован путем фильтрации и помещен в контейнер по асептичной технологии.
Примерами бактерицидных и фунгицидных реагентов, подходящих для включения в капли, являются нитрат или ацетат фенилртути (0,002%), хлорид бензалкония (0,01%) и ацетат хлоргексидина (0,01%). Подходящие растворы для приготовления жирового раствора включают глицерин, разведенный спирт и пропиленгликоль.
Лосьоны в соответствии с настоящим изобретением включают те, которые подходят для применения для кожи или глаз. Глазной лосьон может содержать стерильный водный раствор, необязательно содержащий бактерицид, который может быть приготовлен по способам, похожим на способы, описанные для приготовления капель. Лосьоны или жидкие мази для применения для кожи могут также включать подсушивающий и охлаждающий кожу реагент, такой как спирт или ацетон, и/или увлажнитель, такой как глицерин или масло, такое как касторовое масло или арахисовое масло.
Кремы, мази или пасты в соответствии с настоящим изобретением являются полутвердыми формулами с активным ингредиентом для наружного применения. Они могут быть сделаны путем смеси активного ингредиента в мелкодисперсной или порошковой форме, отдельно или в растворе или суспензии в водной или неводной жидкости, с воздухом в подходящем механизме, с масляной или немасляной основой. Основа может содержать углеводороды, такие как твердый, мягкий или жидкий парафин, глицерин, пчелиный воск, металлсодержащее мыло; растительный клей; масло природного происхождения, такое как миндальное, кукурузное, арахисовое, касторовое или оливковое масло; шерстяной жир или его производные, или жирные кислоты, такие как стеариновая или олеиновая кислоты вместе со спиртом, таким как пропиленгликоль или макрогели. Композиция может включать любой подходящий поверхностно-активный агент, такие как анионный, катионный или неионизированный поверхностно-активный агент, такие как эфиры сорбита или их полиоксиэтиленовые производные. Также могут быть включены суспендирующие агенты, такие как природные смолы, производные целлюлозы или неорганические вещества, такие как кремний, и другие ингредиенты, такие как ланолин.
Фармацевтические композиции для парэнтерального введения включают водные растворы активных компонентов в растворимой в воде форме. Кроме того, суспензии активных компонентов могут быть приготовлены в виде подходящих для масляных инъекций суспензий. Подходящие липофильные растворы или несущие среды включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Суспензии для водных инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрия карбок-симетилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость компонентов, что позволяет проникать раствору в более высокой концентрации.
Фармацевтические препараты для орального использования могут представлять из себя комбинацию активных компонентов с твердыми вспомогательными веществами, необязательно размолотыми, в результате чего получается смесь, и произведенными в виде смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, при желании, для получения таблеток или драже. Подходящими вспомогательными веществами являются, в частности, наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гид-роксипропилметил-целлюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (ПВП). При желании можно добавить дезинтегрирующие агенты, такие как поперечно сшитый поливинилпир-ролидон, агар или альгиновая кислота или ее соли, такие как альгинат натрия.
Драже производятся в соответствующей оболочке. Для этой целей могут быть использованы концентрированные растворы сахара, которые необязательно могут содержать гуммиарабик, тальк, поли-винилпирролидон, карбопол гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К оболочке таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты для идентификации или характеристики различных комбинаций или доз активных компонентов.
Фармацевтические препараты, которые можно использовать орально, включают плотно наполненные капсулы, сделанные из желатина, а также мягкие, запечатанные капсулы, сделанные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Плотно наполненные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связующими веществами, такими как крахмал, и/или лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторы. В мягких капсулах активные компоненты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные кислоты, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы.
Композиция при желании может включать буферную систему. Буферные системы выбираются так, чтобы поддерживать или буферезировать рН композиций внутри желаемого диапазона. Термин "буферная система" или "буфер", используемые здесь, означают растворенный реагент или реагенты, которые, находясь в водном растворе, стабилизируют такой раствор, не давая произойти сильным изменениям рН (концентрации ионов водорода или активности) при добавлении к нему кислот или оснований. Растворенный реагент или реагенты, которые таким образом отвечают за устойчивость или из
менения рН от стартового значения рН в буфере в диапазоне, указанном выше, хорошо известны. Хотя подходящих буферов существует очень много, предпочитаемым буфером является моногидрат фосфата калия.
Конечное значение рН фармацевтической композиции может варьировать внутри физиологически совместимого диапазона. Обязательно, чтобы конечное значение рН не раздражало кожу человека и предпочтительно, чтобы оно способствовало трансдермальному транспорту активного компонента, т.е. CoQ10. Без нарушения этого условия рН может быть выбрано так, чтобы усилить стабильность соединения CoQ10 и чтобы при необходимости подогнать к нужному состоянию консистенцию. В одном варианте воплощения предпочтительное значение рН от около 3,0 до около 7,4, более предпочтительное от около 3,0 до около 6,5, наиболее предпочтительное от около 3,5 до около 6,0.
В композиции предпочтительных местных носителей основным компонетом является вода, обязательно очищенная, например, деоинизированная вода. Такие носители содержат воду в диапазоне от более чем около 50 до около 95 процентов, на основе общего веса композиции. Конкретное количество присутствующей воды не является критичным, однако оно подгоняется для получения желаемой вязкости (обычно от около 50 спз до около 10000 сПз) и/или концентрации других компонентов. Местные носители предпочтительно имеют вязкость не менее около 30 сПз.
Другие известные трансдермальные проникающие в кожу факторы также могут быть использованы для содействия доставки CoQ10. Иллюстрацией являются сульфоксиды, такие как диметилсульфок-сид (ДМСО) и подобные ему вещества; циклические амиды, такие как 1-додецилазациклогептан-2-он (Azone.TM., зарегистрированная торговая марка Nelson Research, Inc.) и подобные ему вещества; амиды, такие как ^^диметилацетамид (ДМА) ^^диэтилтолуамид, ^^диметилформамид, N,N-диметилоктамид, ^^диметилдекамид, и подобные вещества; производные пирролидона, такие как N-метил-2-пирролидон, 2-пирролидон, 2-пирролидон-5-карбоксильная кислота, N-(2-гидроксиэтил)-2-пирролидон или его эфиры жирных кислот, 1-лаурил-4-метоксикарбонил-2-пирролидон, N-талловалкилпирролидоны, и подобные вещества; полиолы, такие как пропиленгликоль, этиленгликоль, полиэтиленгликоль, дипропиленгликоль, глицерин, гексантриол и подобные вещества; линейные и разветвленные жирные кислоты, такие как олеиновая, линолевая, лауриновая, валериановая, гептановая, капроновая, миристиновая, изовалериановая, неопентановая, триметилгексановая, изостеариновая и подобные вещества; спирты, такие как этанол, пропанол, бутанол, октанол, олеиловый, стеариловый, ланолиновый спирты, и подобные вещества; анионные поверхностно-активные вещества, такие как лаурат натрия, натрий лаурилсульфат, и подобные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, такие как хлорид бензалколия, хлорид додецилтриметиламмония, бромид цетилтриметиламмония, и подобные вещества; неионные поверхностно-активные вещества, такие как эфиры пропоксилирован-ного полиоксиэтилена, напр, Полоксамер 231, Полоксамер 182, Полоксамер184, и подобные вещества, этоксилированные жирные кислоты, например, Tween 20, Myjr 45, и подобные вещества, производные сорбитана, например, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Span 60, и подобные вещества, этоксилирирован-ные спирты, например, полиоксиэтилена (4) лауиловый эфир (Brij 30), полиоксиэтилена (2) олеиловый эфир (Brij 93), и подобные вещества, лецитин и производные лецитина, и подобные вещества; терпены, такие как D-лимонен, а-пинен, р-карен, а-терпинеол, карвол, карвон, ментон, оксид лимонена, оксид а-пинена, эвкалиптовое масло и подобные вещества. Также подходят в качестве проникающих сквозь кожу факторов органические кислоты и эфиры, такие как салициловая кислота, метилсалицилат, лимонная кислота, янтарная кислота и подобные вещества.
В одном варианте воплощения настоящего изобретения представлены композиции, содержащие CoQ10, и способы их приготовления. Предпочтительно, композиции содержат, по меньшей мере, от около 1% до около 25% CoQ10 (весовые проценты). CoQ10 можно приобрести у Asahi Kasei N &P (Hokkaido, Japan) как УБИДЕКАРЕНОН (USP). CoQ10 также можно приобрести у Kaneka Q10 как Ka-neka Q10 (USP УБИДЕКАРЕНОН) в порошковой форме (Pasadena, Texas, USA). CoQ10, использованный в способах, приведенных здесь, имеет следующие характеристики: остаточные растворители соответствуют требованию USP 467; содержание воды менее чем 0,0%, менее чем 0,05% или менее чем 0,2%; остаток после прокаливания 0,0%, менее чем 0,05%, или менее чем 0,2%; содержание тяжелых металлов менее чем 0,002%, или менее чем 0,001%; чистота между 98-100% или 99,9%, или 99,5%. Способы приготовления композиций предоставлены в разделе примеров ниже.
В некоторых вариантах воплощения изобретения предоставляются способы для лечения или профилактики метаболического нарушения у людей местным введением коэнизма Q10 людям, таким образом чтобы оказать лечебное или профилактическое действие, где человеку вводится местная доза коэн-зима Q10 с местным наполнителем, где коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в диапазоне от около 0,01 до около 0,5 миллиграммов коэнзима Q10 на квадратный сантиметр кожи. В одном варианте воплощения, коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в диапазоне от около 0,09 до около 0,15 мг CoQ10 на квадратный сантиметр кожи. В различных вариантах воплощения, коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в диапазоне от около 0,001 до около 5,0, от около 0,005 до около 1,0, от около 0,005 до около 0,5, от около 0,01 до около 0,5, от около 0,025 до около 0,5, от около 0,05 до около 0,4, от около
0,05 до около 0,30, от около 0,10 до около 0,25, или от около 0,10 до 0,20 мг CoQ10 на квадратный сантиметр кожи. В других вариантах воплощения, коэним Q10 применяется к целевой ткани в дозе около 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, 0,25, 0,26, 0,27, 0,28, 0,29, 0,30, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38,
0,39, 0,40, 0,41, 0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49 или 0,5 мг CoQ10 на квадратный сантиметр
кожи. В одном варианте воплощения, коэнзим Q10 применяется к целевой ткани в дозе около 0,12 мг CoQ10 на квадратный сантиметр кожи. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует рассматривать как часть этого изобретения, например, от около 0,03 до около 0,12, от около 0,05 до около 0,15, от около 0,1 до около 0,20, или от около 0,32 до около 0,49 мг CoQ10 на квадратный сантиметр кожи.
В другом варианте воплощения изобретения, коэнзим Q10 вводится в форме крема CoQ10 в дозе между 0,5 и 10 миллиграммами крема CoQ10 на квадратный сантиметр кожи, где крем CoQ10 содержит между 1 и 5% коэнзима Q10. В одном варианте воплощения, крем CoQ10 содержит около 3% коэн-зима Q10. В других вариантах воплощения, крем CoQ10 содержит около 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5% коэнзима Q10. В различных вариантах воплощения, крем CoQ10 вводится в дозе около 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10 миллиграмм крема CoQ10 на квадратный сантиметр кожи. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует рассматривать как часть этого изобретения, например, между около 0,5 и около 5,0, около 1,5 и 2,5, или около 2,5 и 5,5 мг крема CoQ10 на квадратный сантиметр кожи.
В другом варианте воплощения коэнзим Q10 вводится в форме крема CoQ10 в дозе между 3 и 5 миллиграммами крема CoQ10 на квадратный сантиметр кожи, где крем CoQ10 содержит между 1 и 5% коэнзима Q10. В одном варианте воплощения крем CoQ10 содержит около 3% коэнзима Q10. В других вариантах воплощения крем CoQ10 содержит около 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5% коэнзима Q10. В различных вариантах воплощения, крем CoQ10 вводится в дозе около 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5,0 миллиграмм крема CoQ10 на квадратный сантиметр кожи. Следует понимать, что диапазоны значений, в которых границами является любая из этих величин, также следует рассматривать как часть этого изобретения, например, между около 3.0 и около 4,0, около 3,3 и 5,3, или около 4,5 и 4,9 мг крема CoQ10 на квадратный сантиметр кожи.
Некоторые аспекты изобретения предоставляют способы для лечения или профилактики метаболического нарушения у людей путем местного введения коэнзима Q10, так чтобы имели место лечение или профилактика, где коэнзим Q10 местно применяется один или несколько раз за 24 ч в течение шести недель или более.
Некоторые аспекты изобретения предоставляют способ для приготовления 3% крема коэнзима Q10, который включает этапы приготовления Фаз А, В, С, D и Е и комбинацию всех фаз, такую как формирование масло-в-воде эмульсии 3% CoQ10 крема.
В некоторых вариантах воплощения, ингредиенты фазы А включают алкил С12-15 бензоат NF 4,00 вес.%, цетиловый спирт 2,00 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,5 вес.% и стеариловый спирт NF 1,50 вес.%, тогда как ингредиенты фазы В включают диэтиленгликоль моноэфир NF 5,00 вес.%, глицерин USP 2,00 вес.%, пропиленгликоль USP 1,50 вес.%, феноксиэтанол NF 0,475 вес.%, очищенную воду USP 16,725 вес.% и дисперсию карбомера 2% 40,00 вес.%, и ингредиенты фазы С включают молочную кислоту USP 0,50 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,00 вес.%, троламин NF 1,30 вес.%, и очищенную воду USP 2,50 вес.%. Кроме того, в этих воплощениях ингредиенты фазы D включают диоксид титана USP 1,00 вес.%, а ингредиенты фазы Е включают CoQ10 21% концентрат 15 вес.%.
Термин "Троламин," используемый здесь, относится к Троламину NF, Триэтаноламину, TEAlan (r), TEAlan 99%, Триэтаноламину, 99%, Триэтаноламину, NF или Триэтаноламину, 99%, NF. Эти термины могут быть использованы здесь взаимозаменяемо.
В некоторых других вариантах воплощения, ингредиенты фазы А включают каприно-вый/каприлиновый триглицерид 4,00 вес.%, цетиловый спирт 2,00 вес.%, глицерина стеарат/ПЭГ-100 4,5 вес.% и стеариловый спирт NF 1,50 вес.%, тогда как ингредиенты фазы В включают диэтиленгли-коля моноэфир NF 5,0 вес.%, глицерин USP 2,00 вес.%, пропиленгликоль USP 1,50 вес.%, феноксиэтанол NF 0,475 вес.%, очищенную воду USP 16,725 вес.% и дисперсию карбомера 2% 40,00 вес.%, и ингредиенты фазы С включают молочную кислоту USP 0,50 вес.%, раствор лактата натрия USP 2,00 вес.%, троламин NF 1,30 вес.%, и очищенную воду USP 2,50 вес.%. Кроме того, в этих воплощениях ингредиенты фазы D включают диоксид титана USP 1,00 вес.%, а ингредиенты фазы Е включают CoQ10 21% концентрат 15 вес.%.
В некоторых вариантах воплощения изобретения предоставляются способы приготовления 3% крема коэнзима Q10, которые включают этапы (1) добавления ингредиентов фазы А в соответствующую емкость и нагрев до 70-80°С на водяной бане; (2) добавление ингредиентов фазы В, за исключением дисперсии карбомера, в соответствующую емкость и смешение для образования смешанной фазы В; (3) помещение ингредиентов фазы Е в соответствующую емкость и расплавление их при 50-60°С на
водяной бане для образования расплавленной фазы; (4) добавление дисперсии карбомера к емкости со сместью и нагрев до 70-80°С с одновременным перемешиванием; (5) добавление смешанной фазы В к емкости со смесью, с поддержанием температуры на уровне 70-80°С; (6) добавление ингредиентов фазы С к емкости со сместью, с поддержанием температуры на уровне 70-80°С; (7) добавление ингредиентов фазы D к емкости со смесью и последующее перемешивание и гомогенизирование содержимого емкости; затем (8) остановка гомогенизации и охлаждение содержимого емкости до 50-60°С; затем (9) прекращение перемешивания и добавление расплавленной фазы Е к емкости со сместью для образования дисперсии; (10) постоянное перемешивание до тех пор, пока дисперсия не станет ровной и однородной; затем (11) охлаждение содержимого емкости со смесью до 45-50°С.
В некоторых других вариантах воплощения изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 3% крем CoQ10. Крем включает фазу А, имеющую С12-15 алкилбензоат 4,00 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,00 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,5 вес.%, глицерилстеа-рат и ПЭГ-100 4,5 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,00 вес.%, пропиленгликоль 1,5 вес.%, этокси-дигликоль 5,0 вес.%, феноксиэтанол 0,475 вес.%, дисперсию карбомера 40,00 вес.%, очищенную воду 16,725 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,300 вес.%, молочную кислоту 0,500 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, воду 2,5 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,000 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 15,000 вес.%. В некоторых вариантах воплощения дисперсия кар-бомера включает воду, феноксиэтанол, пропиленгликоль и карбомер 940.
В некоторых других вариантах воплощения изобретения, предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 3% крем CoQ10. Крем включает фазу
А, имеющую каприновый/каприлиновый триглицерид 4,00 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,00 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,5 вес.%, глицерилстеарат и ПЭГ-100 4,5 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,00 вес.%, пропиленгликоль 1,5 вес.%, этоксидигликоль 5,0 вес.%, феноксиэтанол 0,475 вес.%, дисперсию карбомера 40,00 вес.%, очищенную воду 16,725 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,300 вес.%, молочную кислоту 0,500 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, воду 2,5 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,000 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 15,000 вес.%. В некоторых вариантах воплощения дисперсия карбомера включает воду, феноксиэтанол, пропиленгликоль и карбомер 940.
В некоторых других вариантах воплощения изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 1,5% крем CoQ10. Крем включает фазу А, имеющую С12-15 алкилбензоат 5,000 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,00 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,5 вес.%, глицерилстеарат и ПЭГ-100 4,500 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,000 вес.%, пропилен 1,750 вес.%, этоксидигликоль 5,000 вес.%, феноксиэтанол 0,463 вес.%, дисперсию карбомера 50,00 вес.%, очищенную воду 11,377 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,300 вес.%, молочную кислоту 0,400 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, и воду 4,210 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,00 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 1,500 вес.%.
В некоторых других вариантах воплощения изобретения предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая 1,5% крем CoQ10. Крем включает фазу А, имеющую каприновый/каприлиновый триглицерид 5,000 вес.% в композиции, цетиловый спирт 2,000 вес.% в композиции, стеариловый спирт 1,50 вес.%, глицерилстеарат и ПЭГ-100 4,500 вес.%; фазу В, имеющую глицерин 2,000 вес.%, пропилен 1,750 вес.%, этоксидигликоль 5,000 вес.%, феноксиэтанол 0,463 вес.%, дисперсию карбомера 50,00 вес.%, очищенную воду 11,377 вес.%; фазу С, имеющую триэтаноламид 1,3 вес.%, молочную кислоту 0,400 вес.%, раствор лактата натрия 2,000 вес.%, и воду 4,210 вес.%; фазу D, имеющую диоксид титана 1,000 вес.%; и фазу Е, имеющую CoQ10 21% концентрации 1,500 вес.%. В некоторых вариантах воплощения дисперсия карбомера включает воду, феноксиэтанол и пропиленгликоль.
1. Комбинированная терапия.
В некоторых вариантах воплощения, фактор влияния изобретения и/или содержащие его фармацевтические композиции могут использоваться в комбинированной терапии с по крайней мере одним другим терапевтическим агентом, который может быть другим фактором влияния и/или содержащей его фармацевтической композицией. Фактор влияния и/или содержащая его фармацевтическая композиция и другой терапевтический агент могут действовать аддитивно или, более предпочтительно, си-нергически. В одном варианте воплощения фактор влияния и/или содержащая его фармацевтическая композиция вводится одновременно с введением другого терапевтического агента. В другом варианте воплощения, смесь и/или содержащая ее фармацевтическая композиция вводится до или после введения другого терапевтического агента
Примеры других терапевтических агентов, которые могут использоваться с фактором влияния изобретения, включают, не ограничиваясь, лечащие сахарный диабет агенты, лечащие осложнения диабета агенты, антигиперлипемические агенты, гипотензивные или антигипертензивные агенты, агенты против ожирения, химиотерапевтические агенты, иммунотерапевтические агенты, иммуноподав-ляющие агенты и тому подобные.
Примеры агентов для лечения сахарного диабета включают инсулиновые формулы (например,
формулы с животным инсулином, выделенным из поджелудочной железы коров или свиней; формулы с человеческим инсулином, синтезированные при помощи технологий генной инженерии с использованием соответствующих микроорганизмов или техник), повышающие чувствительность к инсулину агенты, фармацевтически приемлемые соли, гидраты или их сольваты (например, пиоглитазон, трогли-тазон, розиглитазон, нетоглитазон, балаглитазон, ривоглитазон, тезаглитазар, фарглитазар, CLX-0921, R-483, NIP-221, NIP-223, DRF-2189, GW-7282TAK-559, Т-131, RG-12525, LY-510929, LY-519818, BMS-298585, DRF-2725, GW-1536, GI-262570, KRP-297, TZD18 (Merck), DRF-2655, и тому подобные), ингибиторы альфа-глюкозидазы (например, воглибоза, акарбоза, миглитол, эмиглитат и тому подобные), бигуаниды (например, фенформин, метформин, буформин и тому подобные) или сульфонилмочевина (например, толбутамид, глибенкламид, гликлазид, хлорпропамид, толазамид, ацетогексамид, гликло-пирамид, глимепирид и тому подобные), а также другие усиливающие секрецию инсулина агенты (например, репаглинид, сенаглинид, натеглинид, митиглинид, GLP-1 и тому подобные), агонисты амирина (например, прамлинтид и тому подобные), ингибитор фосфотирозинфосфатазы (например, ванадиевая кислота и тому подобные) и тому подобные.
Примеры агентов для лечения осложнений диабета включают, не ограничиваясь, ингибиторы аль-доредуктазы (например, толрестат, эпалрестат, зенарестат, зополрестат, миналрестат, фидареатат, SK-860, СТ-112 и тому подобные), нейротрофные факторы (например, NGF, NT-3, BDNF и тому подобные), ингибиторы PKC (например, LY-333531 и тому подобные), ингибиторы конечного продукта усиленного гликозилирования (AGE) (например, ALT946, пимагедин, пирадоксамин, фенацилтиазолиума бромид (ALT766) и тому подобные), агенты, гасящие активный кислород (например, липоевая кислота или ее производные, биофлаваноиды включая флавины, изофлавины, флавононы, процианидины, анто-цианидины, пикногенол, лютеин, ликопен, витамин Е, коэнзим Q, и тому подобные), цереброваскуляр-ные расширяющие агенты (например, тиаприд, мексилетен и тому подобные).
Антигиперлипемические агенты включают, например, основанные на статинах компоненты, которые являются ингибиторами синтеза холестерина (например, правастатин, симвастатин, ловастатин, аторвастатин, флувастатин, розувастатин и тому подобные), ингибиторы синтетазы сквалена или соединения фибрата, имеющие понижающий триглицерид эффект (например, фенофибрат, гемфиброзил, безафибрат, хлофибрат, синфибрат, клинофибрат и тому подобные).
Гипотензивные агенты включают, например, ингибиторы ангиотенсин-конвертирующего фермента (например, каптоприл, эналаприл, делаприл, беназеприл, цилазаприл, эналаприл, эналаприлат, фоси-ноприл, лизоноприл, моэксиприл, перинодоприл, квинаприл, рамиприл, трандолаприл и тому подобные) или антагонисты ангиотензина II (например, лозартан, кандесартан цилексетил, олмесартан ме-доксомил, эпросартан, валсартан, телмисартан, ирбесартан, тазосартан, помисартан, риписартан фора-сартан, и тому подобные).
Агенты против ожирения включают, например, агенты против центрального ожирения (например, дексфенфлурамин, фенфлурамин, фентермин, сибутрамин, амфепрамон, дексамфетамин, мазиндол, фенилпропаноламин, клобензорекс и тому подобные), гастроинтерстинальной липазы ингибиторы (например, орлистал и тому подобные), .бета-3 агонисты (например, CL-316243, SR-58611-А, UL-TG-307, SB-226552, AJ-9677, BMS-196085 и тому подобные), аппетит-подавляющие агенты на основе пептидов (например, лептин, CNTF и тому подобные), агонисты холецитстокинина (например, линтитрипт, FPL-15849 и тому подобные) и тому подобные.
Диуретики включают, например, производные ксантина (например, салицилат теобромина натрия, салицилат теобромина кальция и тому подобные), составы с тиазидом (например, этиазид, циклопен-тиазид, трихлорметиазид, гидрохлортиазид, гидрофлуметиазид, бентилгидрохлортиазид, пентфлутизид, политиазид, метиклотиазид и тому подобные), составы с антиалдостероном (например, спиронолактон, триамтерин и тому подобные), ингибиторы декарбоксилазы (например, ацетазоламид и тому подобные), составы с хлорбензенсульфонамидом (например, хлорталидон, мефрузид, индапамид и тому подобные), азоземид, изосорбид, этакриновая кислота, пиретанид, буметанид, фуросемид и тому подобные.
Химиотерапевтические агенты включают, например, алкилирующие агенты (например, цикло-фосфамид, ифосфамид и тому подобные), антагонисты метаболизма (например, метотрексат, 5-флуороурацил и тому подобные), антираковые антибиотики (например, митомицин, адриамицин и тому подобные), антираковые агенты растительного происхождения (например, винкристин, увиндезин, таксол и тому подобные), цисплатин, карбоплатин, этопозид и тому подобные. Из этих веществ предпочитаемыми являются производные 5-флуороурацил, такие как фуртулон и неофуртулон.
Иммунотерапевтические агенты включают, например, компоненты микроорганизмов или бактерий (например, производные мурамилдипептида, пицибанил и тому подобные), полисахариды, имеющие иммуноусиливающую активность (например, лентинан, сизофилан, крестин и тому подобные), цитокины, полученные при помощи технологии генной инженерии (например, интерферон, интерлей-кин (IL) и тому подобные), колониестимулирующие факторы (например, колониестимулирующий фактор гранулоцитов, эриторопоэтин и тому подобные) и тому подобные, среди этих веществ предпочтительными являются IL-1, IL-2, IL-12 и тому подобные.
Иммуноподавляющие агенты включают, например, ингибитор кальциневрина /модуляторы имму-нофилина, такие как циклоспорин (Сандиммун, Генграф, Неорал), такролимус (Програф, FK506), ASM 981, сиролимус (RAPA, рапамицин, Рапамун), или его производное SDZ-RAD, глюкокортикоиды (преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон), ингибиторы синтеза пуринов (микофено-лат мофетил, MMF, Селлсепт^), азатиоприн, циклофосфамид), антагонисты интерлейкина (базилик-симаб, даклизумаб, деоксиспергуалин), лимфоцит-зависимые агенты, такие как антитимоцита глобулин (Тимоглобулин, Лимфоглобулин), анти-CD3 антитело (ОКТ3), и тому подобные.
Кроме того, агенты, чье помогающее при кахексии действие установлено на животной модели или при клинических исследованиях, такие как ингибиторы циклооксигеназы (например, индометацин и тому подобные) [Cancer Research, Vol.49, page 5935-5939, 1989], производные прогестерона (например, ацетат мегестрола) [Journal of Clinical Oncology, Vol.12, page 213-225, 1994], глюкостероиды (например, дексаметазон и тому подобные), агенты на основе метоклопрамида, агенты на основе тетрагидроканна-бинола, агенты, улучшающие метаболизм липидов (например, эйкосапентаеновая кислота и тому подобные) [British Journal of Cancer, Vol.68, page 314-318, 1993], гормоны роста, IGF-1, антитела к TNF-альфа, LIF, IL-6 и онкостатин М также могут применяться вместе с соединениями настоящего изобретения.
Настоящее изобретение в дальнейшем иллюстрируется следующими примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылок и опубликованных патентов и заявок на патенты, цитируемых в заявке, включены в настоящую заявку путем ссылки.
Примеры изобретения
Настоящее изобретение, описанное на данный момент в целом, будет лучше понято благодаря ссылкам на следующие примеры, которые включены только с целями иллюстрации определенных аспектов и модификаций настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение, поскольку специалист распознает из данных здесь описаний и следующих примеров, другие способы, агенты, соединения, или способы анализа данных, все без ограничения, которые могут быть применены, не выходя за заявленный объем формулы изобретения.
Содержание всех патентов, заявок на патенты, публикаций патентов или научных статей, цитируемых в любом месте этой заявки, включены в настоящую заявку путе ссылки в полном объеме.
Практика настоящего изобретения использует в случае соответствия и если не указано иное, стандартные техники клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, вирусологии, рекомбинатной ДНК и иммунологии, известные специалистам. Такие техники описаны в литературе. См., например, Молекулярное клонирование: лабораторное пособие, 3е изд., под ред. Sambrook и Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001); учебник Способы в энзимологии (Academic Press, Inc., N.Y.); Применение антител, вторая редакция под ред. Harlow и Lane, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Действующие протоколы в клеточной биологии, под ред. Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, и Yamada, John Wiley и Sons, Inc., New York, 1999; и Протоколы ПЦР, под ред. Bartlett et al., Humana Press, 2003.
Пример 1. Идентификация CoQ10 как МВМ.
Для того чтобы оценить CoQ10 как потенциальную МВМ, CoQ10 в окисленной форме был экзо-генно добавлен к группе клеточных линий, включая как линии раковых клеток, так и линии нормальных контрольных клеток, и были оцененыизменения, вызыванные в профиле клеточного микроокружения для каждой клеточной линии из группы. Были оценены изменения в клеточной морфологии/физиологии и в составе клетки, включая уровни мРНК и белков, и проведено сравнение по этим параметрам больных и здоровых клеток. Результаты этих экспериметов идентифицировали CoQ10 и, в особенности, окисленную форму CoQ10, как МВМ.
В первой серии экспериментов изменения в клеточной морфологии/физиологии были оценены при исследовании чувствительности и апоптозного ответа клеток к CoQ10. Группа линий клеток кожи, включающая контрольные клеточные линии (в первую очередь культуру кератиноцитов и меланоци-тов) и несколько линий раковых клеток кожи (SK-MEL-28, неместастазирующая меланома кожи; SK-MEL-2, метастазирующая меланома кожи; или SCC, плоскоклеточная карцинома; РаСа2, клеточная линия рака поджелудочной железы; или HEP-G2, клеточная линия рака печени) были подвергнуты воздействию различных концентраций коэнзима Q10. Результаты этих экспериментов показывают, что линии раковых клеток демонстрируют дозозависимый ответ, отличный от ответа линий контрольных клеток, при этом индукция апоптоза и смерть клеток происходят только в раковых клетках. Примеры экспериментов описаны детально в примере 3 ниже.
Затем были проведены исследования для оценки изменений в составе клеток после обработки CoQ10. Изменения в экспрессии генов на уровне мРНК анализировались с использованием метода ПЦР в режиме реального времени. Примеры экспериментов описаны детально в примерах 6 и 9-13 ниже. В дополнительных экспериментах, изменения в экспрессии генов по уровню белка анализировались с использованием метода антител на микрочипах, 2-мерного гель электрофореза, за которым следовала идентификация белка с использованием масс-спектрометрии, и иммуноблоттинга. Примеры экспериментов описаны детально ниже в примерах 4, 7 и 8, соответственно. Результаты этих исследований де
монстрируют, что важные изменения в экспрессии генов как по уровню мРНК, так и по уровню белка, были вызываны в исследуемых клеточных линиях благодаря добавлению окисленной формы CoQ10. Было обнаружено, что гены, модулированные воздействием CoQ10, группировались по различным клеточным путям, включая апоптозы, биологию рака и роста клетки, гликолиз и метаболизм, молекулярный транспорт и клеточный сигналинг.
Были проведены эксперименты для подтверждения вхождения CoQ10 в клетку и определения концентрации и формы CoQ10, присутствующего в клетке. В частности, концентрация коэнзима Q10, а также форма CoQ10 (т.е., окисленная или восстановленная), присутствующего в митохондриях, была определена путем анализа богатых митохондриями препаратов, выделенных из клеток, обработанных CoQ10. Было подтверждено, что концентрация коэнзима Q10, присутствующего в митохондриях, возрастает время- и дозозависимым образом при добавлении экзогенного Q10. Непредсказуемым и неожиданным результатом явилось то, что было установлено присутствие CoQ10 в митохондриях преимущественно в окисленной форме. Кроме того, изменения в концентрациях белков из богатых митохондриями образцов были проанализированы с использованием 2-D гель электрофорезов и идентификации белка путем масс-спектрометрии. Результаты этих экспериментов показали, что концентрации окисленной формы CoQ10 в митохондриях, определяемые на различных временных точках, коррелируют с широким многообразием клеточных изменений, что доказывается путем модуляции мРНК и концентраций белка для специфических белков, связанных с путями метаболизма и апоптоза. Примеры экспериментов детально описаны в примере 5 ниже.
Результаты, описанные здесь заявителями, идентифицировали эндогенную молекулу CoQ10 и, в особенности, окисленную форму CoQ10, как МВМ. Например, результаты идентифицировали CoQ10 как МВМ, поскольку наблюдалось, что CoQ10 вызывал изменения в экспрессии генов как по уровню мРНК, так и по уровню белка. Результаты показали, что CoQ10 имеет многоаспектный характер, поскольку CoQ10 вызывал различные изменения в клеточной морфологии/физиологии и клеточном составе (например, различные изменения в экспрессии генов как по уровню мРНК, так и по уровню белка), в состоянии болезни (например, раке) по сравнению с нормальным (например, нераковым) состоянием. Больше того, результаты показали, что CoQ10 имеет многоаспектный характер, поскольку CoQ10 был способен входить в клетки и таким образом демонстрировал как терапевтическое действие, так и функции носителя.
Пример 2. Способы идентификации связанных с болезнью процессов и биомаркеры метаболических нарушений.
Из клеточных исследований, в которых клеточные линии обрабатывались изучаемыми молекулами, по количеству мРНК, количеству белковых антител и по 2D гель-электрофорезу были оценены различия между обработанными и необработанными клетками. Белки, идентифицированные по сравнительным анализам образцов как модулированные МВМ или эпи-переключателем, оценивались по перспективе системной биологии с использованием анализа метаболизма (программа Ingenuity IPA) и обзору известной литературы. Белки, идентифицированные как потенциальные терапевтические или биомаркерные мишени, подвергались подтверждающим анализам, таким как иммуноблоттинг, нокаут миРНК или создание рекомбинантных белков и характеризующие способы.
Материалы и способы для примеров 3-8
Коэнзим Q10 исходный раствор.
А 500 мкМ коэнзима Q10 (5% изопропанол в среде для роста клеток) был приготовлен следующим образом. 10 мл 500 мкМ исходного раствора коэнзима Q10 приготовлялся свежим каждый раз.
Молекулярный вес: 863,34 (0,0005 моль/л)(0,010 л)(863,34 г/моль) = 0,004317 г.
Чтобы приготовить 10 мл 500 мкМ исходного раствора, 4,32 мг коэнзима Q10 взвешивалось в 15 мл пробирке Falcon, и добавлялось 500 мкл изопропанола. Раствор нагревался на 50-60 °С водяной бане при перемешивании до полного растворения. К этому раствору добавлялось 9,5 мл среды (той же среды, в которой росли клетки).
Клеточная культура.
Клетки были получены из коллекции культур американского типа или Gibco. Клетки выращивались в среде DMEM/F-12 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 0,25 мкг/мл амфотери-цина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 U мл-1 пенициллина. Клетки содержались в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2 при 37°С.
Обработка коэнзимом Q10 и выделение общего белка.
Клетки росли до 85% заселенности до того, как их подвергали влиянию Q10. В среду добавили Q10 в таком количестве, чтобы получить 50 и 100 микромолярные концентрации. Колбы были разделены на контроль, 50 мкМ Q10 и 100 мкМ Q10. Белок был выделен из обработанных и контрольных колб через 4, 8, 12 и 24 ч. Для выделения белков клетки были промыты три раза 5 мл ледяного PBS с рН 7,4. Затем клетки были промыты в 3 мл PBS, осаждены центрифугированием и ресуспендированы в лизи-рующем буфере с рН 7,4 (80 мМ TRIS-HCl, 1% SDS, с ингибиторами протеазы и фосфатазы). Концентрации белка были подсчитаны с использованием метода ВСА.
Клеточные линии.
Клеточные линии, перечисленные ниже, были размножены и для каждой создан клеточный банк. Было получено большое число клеток для различных исследований и собран материл для анализов. Как правило, когда для поддержания клеточных линий не требовалась определенная клеточная среда, используемой для роста клеток средой была DMEMF-12 с 5% сывороткой. Клетки как правило росли до 75-80% заселенности (свободного пространства) перед сбором и использованием в клеточных исследований и последующими стандартными способами. Для экспериментов были взяты следующие клеточные линии:
SK-MEL-28 (неметастазирующая меланома кожи),
SK-MEL-2 (метастазирующая меланома кожи),
HEKa (кератиноциты, кожный контроль),
НЕМа (меланоциты, кожный контроль),
nFIB (неонатальные фибробласты),
HEP-G2 (рак печени) [SBH линия клеток],
SkBr-3 (рак молочной железы, Her2 сверхэкспрессия),
MCF-7 (рак молочной железы, р53 мутация),
РС-3 (рак простаты) [SBH линия клеток],
SkBr-3 (аденокарцинома молочной железы человека),
NCI-ES-0808,
SCC (плоскоклеточная карцинома),
РаСа-2 NIH-3T3.
Клеточная культура:
Клетки были получены из коллекции культур американского типа или Gibco. Клетки выращивались в среде DMEM/F-12 с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 0,25 мкг/мл амфотери-цина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 U мл-1 пенициллина. Клетки содержались в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2 при 37°С.
Клетки злокачественной меланомы кожи SK-MEL28 росли и содержались DMEM/F12 с Глюта-максом (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния) с добавкой 5% FBS, амфотерицина и пенициллина/стрептомицина. Клетки росли при 37°С с 5% СО2. Детали дополнительных клеточных линий и словий роста перечислены в таблице ниже.
Таблица 1. Клеточные линии, анализированные на чувствительность к Q10
Клеточная
Описание
Условия роста
линия
РаСа2
Карцинома
поджелудочной
железы
DMEM/F12 с Глютамакс + 10%FBS, 2.5% лошадиная сыворотка, амфотерицин, пенициллин/стрептомицин.
HepG2
Гепатоцеллюлярная карцинома
MEM с солями Earles с добавлением 10% FBS, амфотерицина, пенициллина/стрептомицина, пирувата натрия и заменимых аминокислот.
РСЗ
Аденокарцинома простаты
DMEM/F12 с Глютамакс с добавлением 5%FBS, амфотерицина и пенициллина/стрептомицина.
SKBtf
Рак молочной железы
DMEM/F12 с Глютамакс с добавлением 5% FBS и амфотерицина, пенициллина/стрептомицина.
MCF-7
Рак молочной железы
DMEM/F12 с Глютамакс с добавлением 5% FBS и амфотерицина, пенициллина/стрептомицина.
Обработка Q10 SKMEL28 клеток.
SK-MEL28 клетки были обработаны 100 мкМ Q10 или контрольным раствором. Q10 был приготовлен следующим образом. В 15 мл пробирку с крышкой было перенесено 4,32 мг Q10 (производство Cytotech) и затем растворено добавлением 500 мкл изопропанола. Получившийся раствор был нагрет на 65°С водяной бане и размешан на вортексе на большой скорости. Раствор Q10/изопропанола был доведен до объема 10 мл добавлением отстоявшейся среды для клеточной культуры. Исходный раствор затем был размешан на вортексе для достижения максимальной растворимости Q10. Исходный раствор был разведен (2 мл исходного раствора и 8 мл среды) для получения конечной концентрации 100 мкмМ Q10. Для контрольного раствора к 9,5 мл среды было добавлено 500 мкл изопропанола. Контрольный исходный раствор был затем разведен (2 мл исходного раствора) 8 мл среды. Клетки собирались через 6, 16, 24, 48 или 72 ч после начала обработки.
Обработка Q10 клеток SCC.
SCC клетки были обработаны 100 мкМ Q10 (подготовленным как описано выше) или 6 часов, или 24 часа. Контрольными клетками были необработанные клетки. Клетки были собраны и осаждены через различное время после обработки и осадок был заморожен свежим и хранился при -80 °С, пока РНК
не было выделено по XTAL как описано ниже. Выделение РНК:
Клетки после различного времени обработки были лизированы для выделения РНК с использованием RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc., Valencia CA) по инструкциям производителя. РНК было подсчитано путем определении оптической плотности при 260 нм.
Синтез первой нити.
Первая нить кДНК была синтезирована с 1 мкг общей РНК с использованием набора для синтеза первой нити RT2 (SABiosciences., Frederick Мэриленд) по рекомендациям производителя. ПЦР в режиме реального времени.
Продукты синтеза первой нити были растворены в воде, смешаны с SYBR зеленой мастер-микс (реакционная смесь, SABiosciences., Frederick, Мэриленд) и помещены в прибор для ПЦР анализа. ПЦР в режиме реального времени была осуществлена для нескольких аналитических наборов (апоптозные анализы, диабетические анализы, анализы акислительного стресса и оксидантной защиты, и анализы белков теплового шока) (SABiosciences, Frederick, Мэриленд) на Biorad CFX96.
Определение чувствительности клеточных линий к коэнзиму Q10 путем Nexin анализа для апоп-тозов.
Процент клеток в раннем и позднем апоптозах был подсчитан через 24 ч после обработки коэнзи-мом Q10. Ранний и поздний апоптозы использовались как маркеры для понимания различий в чувствительности различных линий раковых клеток к коэнзиму Q10. Различными тестируемыми клеточными линиями были РаСа2, HepG2, РС-3, SKBr3, MCF-7 и SK-MEL28. Клеткам дали адгезировать в течение ночи в 96-луночных планшетах. Эти клетки были обработаны контрольным раствором, 50 мкМ Q10 или 100 мкМ коэнзима Q10. Через 24 часа наличие апоптозных клеток было оценено на проточном ци-тометре РСА96 (Guava Technologies, Hayward, Калифорния). Кроме того, некоторые клетки были обработаны 4 мкМ Стауроспорином в течение 2 ч в качестве позитивного контроля на апоптозы. Клетки были промыты PBS и диссоциированы 50 мкл Accumax (Innovative Cell Technologies, San Diego, Калифорния) при комнатной температуре. Диссоциация была остановлена добавлением культуральной среды, содержащей 1% Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, St.Louis, Миссури). Затем 100 мкл Nexin реагента (Guava Technologies, Hayward, Калифорния) было добавлено в каждую лунку. Через 20 минут инкубации в темноте исследование проводилось в чашках со слабой адгезией для минимизации повторного присоединения клеток к субстрату. Nexin реагент содержит два красителя. Annexin-V-PE, который определяет уровень фосфотидил серина на внешней стороне клеток, характеризирует ранние апоптозные клетки. Второй краситель, 7-AAD проникает только в поздние апоптозные клетки, что отличает их от живых (здоровых) и ранних апоптозных клеток. Процент четырех популяций клеток: живых, ранних апоптозных, поздних апоптозных и остатков клеток определялся с использованием программы Cytosoft 2.5.7 (Guava Technologies, Hayward, Калифорния).
Иммуноблоттинг.
Примерно 50 мкг белка исследовалось на образец путем иммуноблоттинга. Все эксперименты были поставлены трижды плюс контроль. Белки были разделены в 12% TRIS-HCl геле, перенесены путем электрофореза на нитроцеллюлозные мембраны и блокированы с использованием 5% сыворотки и TBST раствором перед инкубацией с первичными антителами. Первичные антитела инкубировались в течение ночи при 4°С в 5% BSA и TBST растворе. Вторичные антитела инкубировались в течение одного часа при 4°C. Все антитела были получены по технологии клеточной сигнализации. Антитела были использованы в соотношении 1:1000, за исключением р-актина, соотношение которого составляло 1:5000. Блоты были получены и результаты были подсчитаны с использованием NIH Java денсиномет-ра и программы Image J. Все блоты были также исследованы и нормализованы по соответствующей экспрессии р-актина.
Двухмерные электрофорезы.
Перед изоэлектрическим фокусированием (IEF), образцы были растворены в 40 мМ Tris, 7 М мочевине, 2 М тиомочевине, и 1% С7 цвиттерионным детергентом, восстановлены трибутилфосфином и алкилированы 10 мМ акриламидом в течение 90 мин при комнатной температуре. После этого образцы были проведены через 10-кДа прибор Amicon Ultra, по меньшей мере, с 3 объемами ресуспендирующе-го буфера, содержащего 7 М мочевину, 2 М тиомочевину и 2% CHAPS для восстановления проводимости образца. Одна сотня микрограмм белка была подвергнута IEF при 11-см рН от 3 до 10, рН от 4 до 7 или рН от 6 до 11 на полосках с фиксированным градиентом рН (GE, Amersham, USA) to 100,000 вольт-час. После IEF, полоски с фиксированным градиентом рН были откалиброваны в 6 М мочевине, 2% SDS, 50 мМ Tris-ацетат буфере, рН 7,0, и 0,01% бромфеноле голубом и поставлен SDS-полиактриламид гель электрофорез на 8-16% Tris-HCl Precast Gel, 1 мм (Bio-Rad, USA). Электрофорезы в геле были поставлены дважды. Затем они останавливались в SYPRO Ruby, 80 мл/гель (Invitrogen, USA) и получали их изображение на Fuji FLA-5100 лазерном сканере или переносили на PVDF мембрану.
Дополнительная информация была получена для контрольных образцов для определения полезности белковой идентификации при использовании способов, которые используют dPC (Protein Forest Inc.) избирательное pI фракционирование, за которым следует трипсиновое расщепление dPC комплек
сом с масс-спектрометрии идентификацией и полу-подсчетом (Nanomate или LC/LTQ/MS). The dPC анализы, проведенные с контрольными образцами, показали свою полезность для идентификации большой субпопуляции белков. Материалы, полученные в ходе исследований, были направлены в архив, так чтобы их можно было использовать в качестве источника для необходимых в будущем исследований.
Анализ изображений 2D-геля.
Анализы всех изображений геля были осуществлены с использованием Progenesis Discovery и Pro (Nonlinear Dynamics Inc., Newcastle upon Tyne, Великобритания). После детекции точек, совмещения, фоновой субтракции, нормализации и фильтрации данные для SYPRO Ruby гель изображений были экспортированы. Парные сравнения между группами были проведены с использованием критерия Стьюдента для идентификации точек, экспрессия которых достоверно изменилась (р > 0,05).
Исследование с помощью антител.
Микрочип для антител (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) был использован для скрининго-вого исследования с помощью 700 белковых антител для оценки изменений в уровнях концентрации белков в обработанных Q10 клетках (SK-MEL-28, SCC). Экспрессия белка в клеточном экстракте устанавливалась, когда белок связывался с соответствующим антителом, помещенным на пластинку. Перед связыванием белки прямо метились флюоресцентным красителем, который потом использовался для флюоресцентной визуализации и количественного анализа. Исследование использовалось для сравнения белковых профилей экспрессии в двух образцах (исследуемый и референсный образцы), каждый метился различным Су красителем (Су3 или Су5) и два образца использовались совместно в равных белковых концентрациях в исследовании. Интенсивность флюоресцентного сигнала для каждого образца затем записывалась отдельно на длине волны, соответствующей красящей метке образца, и сравнивалась.
Высокие дозы коэнзима Q10 регулируют экспрессию генов, включенных в апоптозный, диабетический и окислительного стресса пути в культивируемых SKMEL-28 клетках. Детали эксперимента.
SKMEL-28 клетки (АТСС Каталог # НТВ-72) являются неместастазирующими клетками мелано-мы кожи, которые выращивались в среде DMEM/F-12, содержащей Глютамакс (Invitrogen Cat# 10565042), с добавлением 5% FBS, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина, были обработаны средой или 100 мкМ коэнзима Q10 в течение различного времени. Любые изменения в экспрессии генов, следовавшие за обработкой коэнзимом Q10, были подсчитаны с использованием методов ПЦР в режиме реального времени (Apoptosis Cat #PAHS-12, Diabetes Cat #PAHS-023 и Oxidative Stress Cat #PAHS-065). (SABiosciences, Frederick, Мэриленд).
Исходная концентрация 500 мкМ коэнзима Q10 была приготовлена путем растворения 4,32 мг в 500 мкл изопропанола, который затем разводился до 10 мл добавлением среды. Альтернативно выпол-налось перемешивание и нагрев до 65°С растворенного Q10. 2 мл исходного раствора разводилось до 10 мл средой для получения среды, содержащей 100 мкМ Q10, которая использовалась для обработки клеток. Параллельно приготовлялся контрольный раствор по тому же протоколу, за исключением того, что коэнзим Q10 не добавлялся.
SKMEL-28 клетки были помещены с плотностью 1х105 клеток на лунку в 6-луночный планшет. Через 24 ч, когда клетки прикрепились и заселенность составляла 50%, добавили контрольный раствор или 100 мкМ Q10. Клетки были собраны через 6, 16, 24, 48 или 72 ч после обработки Q10, а обработанные контрольным раствором клетки были собраны через 24 ч. Клетки лизировались для выделения РНК в течение различного времени обработки с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen, Inc., Valencia, Калифорния, Cat #74104) по инструкциям производителя с использованием микроцентрифуги и обработки ДНКазой. Количество РНК определялось при определении оптической плотности на 260 нм.
ПЦР в режиме реального времени проводилось путем синтеза с первой нити кДНК с использованием 0,4-1 мкг общей РНК в качестве матрицы с использованием набора синтеза первой нити RT2 (SABiosciences., Frederick, Мэриленд, Cat# C-03) с этапом элиминации геномной ДНК в соответствии с рекомендациями производителя. Продукты синтеза с первой нити были растворены в воде, смешаны с SYBR зеленой мастер-микс (реакционная смесь, SABiosciences., Frederick, Мэриленд, Cat#PA-010-12) и с ними были проведены ПЦР-анализы с праймерами для 84 различных генов, связанных с обычным метаболизмом, 5 конститутивных генов, использованных для нормализации, обратной транскрипции и ПЦР-контроля. ПЦР в режиме реального времени проходила в Biorad Cfx96. Амплификация была начата горячим стартом для активации фермента, продолжалась 40 циклов (95°С -15 секунд этап денатурации и 60°С- 1 минута этап отжига и удлинения), с последующей программой кривой плавления. Значения Ct, полученные от ПЦР термоциклера по всем обработанным группам, были занесены в таблицу Excel и загружены в программу сравнительного анализа, доступную по адресу www .sabiosciences.com/ pcr/arrayanalysis.php.
Очистка богатых митохондриями образцов.
Детали эксперимента: SKMEL-28, NCI-ES0808 и NIH-3T3 клетки, обработанные 100 мкМ Q10 24 или 48 ч вместе с клетками, которые были собраны при t=0, промыты и извлечены из колб Т160. Клет
ки центрифугировали, собрали осадок, заморозили и хранили при -80°С до выделения митохондрий. Клеточный осадок был разморожен, ресуспендирован и измельчен в гомогенизаторе Даунса. Гомогенат был центрифугирован и митохондрии выделены с использованием реагентов и протокола, рекомендованных набором выделения митохондрий для культурных клеток (MitoSciences, Eugene, Орегон, Cat # MS852). Фракция митохондрий была разделена на аликвоты и хранилась при -80°С. Способ подсчета Коэнзима Q10 и Убихинола-10.
Способ одновременного определения коэнзима Q10 (Q10) и восстановленной формы убихинола-10 (Q10H2) был выполнен на основе недавно опубликованного способа (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma-togr. A, 1175, 242-248) благодаря использованию LC-MS/MS с ионизацией электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов. Возможны высоко избирательная идентификация и чувствительный подсчет Q10 и Q10H2, вкупе с идентификацией других выбранных липидов. Аликвота богатых митохондриями образцов из SK-MEL-28, обработанных 100 мкМ Q10, была подвергнута стандартной пре-обработке, основанной на осаждении белка (100 мкл клеточного осадка, диспергированного ультразвуком в 300 мкл 1-пропанола), экстракции жидкость-жидкость (добавить 100 мкл воды к супер-натанту и экстрагировать Х3 200 мкл н-гексана), выпаривани комбиниованных гексановых экстрактов до высыхания и восстановлению в 50 мкл of 95:5 метанол/гексан (по объему). Анализ был проведен LC-MS/MS на Waters Quattro II тройном квадрупольном масс-спектрометре с Prism RP 1x100 мм, колонками с частицами размером 5 мкм (Keystone Scientific). Изократическое элюирование с 4 мМ фор-миата аммония в смеси 20% изопропилового спирта и 80% метанола со скоростью потока 50 мкл/мин. Было введено десять мкл каждого образца. MRM анализ был проведен с использованием m/z 882,7> 197,00 (Q10H2) и m/z 880,80> 197,00 (Q10) переходов с напряжением на конусе 40 и энергией столкновений 30.
Пример 3. Чувствительность клеточных линий к CoQ10.
Множество клеточных линий тестировались на чувствительность к Q10 после 24 ч обработки с использованием реагента (Nexin реагент), который содержит два типа красителей, 7AAD и Annexin-V-PE. Краситель 7-AAD проникает в клетки с проницаемой мембраной, в первую очередь в те клетки, которые находятся на поздней стадии апоптоза. Annexin-V-PE - это краситель, который связывается с фосфотидил серином, который появляется на внешней поверхности плазматической мембраны у ранних апоптозных клеток. Nexin реагент таким образом может быть использован для различения популяций апоптозных клеток в проточном цитометре.
РаСа2 клетки показали увеличение как ранних, так и поздних апоптозных клеток (5-10% отобранных клеток) с 50 мкМ Q10 и 100 мкМ Q10 после 24 ч обработки Q10. РС-3 клетки также показали уве-лечение как ранней, так и поздней апоптозной популяции с 50 мкМ и 100 мкМ Q10, хотя возрастание было меньше по сравнению с РаСа2 клетками. MCF-7 и SK-MEL28 клетки показали возрастание только ранней апоптозной популяции с 50 мкМ и 100 мкМ Q10. HepG2 клетки также были чувствительны к обработке 50 мкМ Q10, где наблюдалось возрастание поздних апоптозных и ранних апоптозных стадий на около 20% от отобранных клеток. SKBr3 была единственной исследованной клеточной линией, которая не показала никакого значимого увеличения ранних и поздних апоптозов при обработке как 50 мкМ, так и 100 мкМ Q10. Результаты представлены на фигурах 1-6.
Для того чтобы получить дополнительное подтверждение, что воздействие Q10 приводит к апоп-тозному ответу у HepG2 раковых клеток печени, второе апоптозное исследование было оценено с использованием основанного на ApoStrand(tm) ELISA метода, где подсчитывались однонитевые ДНК. The ApoStrand(tm) ELISA основывается на чувствительности ДНК в апоптозных клетках к денатурации фор-мамидом и на детекции денатурированных ДНК моноклональными антителами к однонитевым ДНК (онДНК). Обработка раковых клеток печени линии HepG2 50 и 100 мкМ Q10 привела к детектируемым апоптозам, с дозозависимым ответом в 17 и 32%, соответственно (фигура 7). Эти результаты совпадают с наблюдением индуцированных Q10 апоптозов в других линиях раковых клеток из других тканей (например, SCC, SKMEL-28, MCF-7, и РС-3).
Пример 4. Протеомический анализ клеток, обработанных Q10.
Клеточный осадок образцов, обработанных Q10, был анализирован с использованием протеоми-чеких методов. Клеточные осадки были лизированы и обработаны с использованием 2-D геля и имму-ноблоттинга. Три клеточных типа (SKMEL-28, SCC, и nFib) были обработаны Q10 и подвергнуты про-теомитической характеристике путем 2-D гель электрофореза. Протеометический анализ SKMEL-28 клеток, обработанных Q10.
В первой экспериментальной серии, проведенной и оцененной путем иммуноблоттинга и 2-D гель электрофореза, участвовала линия клеток рака кожи SKMEL-28. Эта экспериментальная серия включала SK-MEL-28 клетки, обработанные 3, 6, 12 и 24 ч 0, 50 или 100 мкМ Q10.
Обработанные Q10 образцы SK-MEL-28 были подвергнуты 2-D гель электрофорезу (фиг. 8) и анализировались на идентификацию изменений в концентрациях белка по сравнению с контрольными образцами. Был проведен сравнительный анализ 943 точек в двадцати четырех гелях, где сравнивались контрольный образец и все обработанные образцы. Анализы включали идентификацию изменений на
точках во времени, из-за возрастания, снижения или пост-трансляционной модификации.
Анализы обнаружили тридцать два статистически достоверно различимых точечных изменений. По ним двадцать статистически неопределимых точки были извлечены и подвергнуты белковой идентификации путем расщепления трипином и масс-спектрометрии. Охарактеризованные пептиды были найдены в белковой базе данных с помощью аналитической программы Mascot и MSRAT для идентификации белков (табл. 2).
Таблица 2. Белки, идентифицированные как показавшие различную реакцию на обработку Q10 в клетках SKMEL-28
Зремя
(ч)
Q10
Кони, (мкМ)
\2D
точка #
Экспрессия
Разница
Белок
Название
Гил
528
понизилась
1,234
Катепсин D
2TSD
пегггидаза
702
понизилась
1,575
Шаперокин содержащий ГСР1, субьедншща 3
ecu
другое
понизилась
1,383
Фактор инициации грансляции эукариот 3
EIF3G
регулятор грансляции
829
понизилась
1,074
Рибосомальный белок Р2
RPLP2
другое
363
понизилась
1,121
Грансальдолаза 1
TALDOl
фермент
152
возросла
-1,464
Фактор инициации грансляции зукарнот 6
EIF6
регулятор грансляции
175
возросла
¦1,32
Стоматин; HSPC322
STOM
другое
S27
возросла
•1,457
Гирозин З/Трнлтофан 5-монооксигеназы акттгвацни белок
iTVHAZ
фермент
139
возросла
¦1,628
Зиментин
VIM
другое
218
возросла
¦1,416
Зиментин
VIM
вдутое
218
возросла
¦1,212
Зиментин
VIM
другое
139
возросла
•1,036
Зиментин
VIM
другое
507
понизилась
1,379
ПаминБ1
LMNB1
другое
571
понизилась
1,832
Рецептор импорта в митохондрии Тот22
ГОММ22
транспортер
166
возросла
•1,171
ALG-2 интерактивный белок 1
PDCD6IP
другое
550
возросла
¦1,747
Пептидилпролил иэомераза А
PPIA
фермент
613
понизилась
1,802
Галецнн-1
LGALS1
другое
242
понизилась
1,373
Фосфоглицерат мутаэа; фосфоманномутаза 2
PGAM2
фосфатаза
326
понизилась
1,385
глицил-tPHK синтаза
3ARS
фермент
419
понизилась
1,451
Гомолог Mago-nashi
MAGOH
другое
100
528
понизилась
¦1,036
Катепснн D
CTSD
!пептидаза
100
702
понизилась
1,151
-Шперокин содержащий ГСР1, субъединица 3
CCT3
другое
100
понизилась
1,122
фактор инициации грансляции эукариот 3
EIF3G
регулятор грансляции
100
S29
понизилась
1,145
Рибосомальныи белок Р2
RPLP2
другое
100
368
понизилась
1,209
Грансальдолаза1
rALDOl
фермент
100
139
возросла
¦1,829
Зиментин
VIM
другое
100
218
возросла
¦1,761
Зиментин
VIM
другое
100
452
понизилась
1,134
фактор инициации грансляции эукариот 6
EIF6
регулятор трансляции
100
252
понизилась
1,4
Sec 13 белок, Кератин II
100
827
понизилась
1,12
Гирозин З/Трилтофан 5-монооксигеназы активации белок
VWHAZ
фермент
100
возросла
¦ 1,679
-алецин-1; кератин П
LGALS1
другое
Ключевой находкой этого эксперимента было уменьшение трансальдолазы 1, что поддерживает предположение, что Q10 действует, изменяя метаболический статус внутри раковой клетки. Трансаль-долаза 1 - фермент в пути пентозофосфата (также известного как гексомонофосфатный шунт). Тран-сальдолаза (ЕС:2.2.1.2) катализирует обратимый перенос трехуглеродной кетольной единицы с седо-гептулозы 7-фосфата на глицеральдегид 3-фосфат для формирования эритрозы 4-фосфата и фруктозы 6-фосфата. Этот фермент, вместе с транскетолазой, осуществляет связь между гликолитическим и пен-тозофосфатным путями. Это важно для синтеза нуклеотидов и синтеза НАДФН, для содействия образованию восстанавливающих эквивалентов для биосинтетических реакций и для поддержания восстановительной среды.
Недавняя публикация (Basta, P., et.al. August 2008, Cancer Detect Prevention, 32, 200-208) предоставила доказательство генетического полиморфизма трансальдолазы и была связана с плоскоклеточной карциномой головы и шеи. Другая недавняя публикация (Qian, Y., et.al. May 2008, Biochem J, 415, 123134) идентифицировала отсутствие трансальдолазы как модулятор митохондриального гомеостаза, по
тока Са2+ и апоптозов.
По этим первичным результатам другие белки, идентифицированные путем 2-D гель-электрофореза как модулированные Q10 в SK-MEL-28, были анализированы по известным связям (фиг. 9). Функциональная оценка этих белков показала, что существует группа, участвующая в 14-3-3-опосредованном сигналинге (PDCP6IP, YWHAZ и VIM), наряду с отдельными белками, связанными со множеством процессов [клеточный цикл; пентозофосфатный путь (TALDO1); церамид сигналинге (CTSD); аминоацил-тРНК биосинтезе (GARS) и импорте белков в митохондрии (ТОМ22)].
Протеомический анализ SCC клеток, обработанных Q10.
Другая линия клеток рака кожи, плоскоклеточная карцинома (SCC), также была подготовлена и проанализирована путем 2-D гель-электрофореза, как в предыдущем эксперименте по анализу SK-MEL-28. SCC клетки были обработаны 100 мкМ Q10 в течение 6 или 24 ч до сбора. Были взяты также контрольные необработанные клетки. Клеточный осадок был лизирован, и образцы были подвергнуты 2-D электрофорезу (дважды на точку). Были проведены анализы шести сотен белковых точек в сравнительном исследовании, где контрольный образец сравнивался с шестичасовым и двадцатичетырехчасовым воздействием.
Верхние двадцать пять статистически достоверно различимых изменений на точках были оценены путем сравнительного анализа в 2-D электрофорез-геле. По ним двадцать точек были извлечены и подвергнуты белковой идентификации путем расщепления трипсином и масс-спектрометрии (результаты представлены в табл. 3 ниже). Таблица 3. Белки, идентифицированные как показавшие различную реакцию на 100 мкМ обработку
Трансальдолаза 1. Как наблюдалось ранее у SKMEL-28 клеток, обработанных Q10, фермент трансальдолаза 1 был модулирован с уменьшением в концентрациях. Это дает независимое от 1тредыдущего наблюдения подтверждение связи между Q10 и перестройками в трансальдолазе (и таким образом в метаболическом статусе клетки).
Трансальдолаза - фермент неокислительной фазы пентозофосфатного пути, (фигура 10). Пентозо-фосфатный путь является ключевым моментом в метаболическом статусе клетки для образования ни-котинамидадениндинуклеотидфосфата (восстановленного НАДХ), для восстановительного биосинтеза
и для образования рибозы, которая является необходимым компонентом АТФ, ДНК и РНК. Трансаль-долаза также связывает пентозофосфатный путь с гликолизом. Гликолиз - метаболический путь, по которому раковые клетки получают энергию, необходимую для поддержания жизни клетки, если мито-хондриальный процесс окислительного фосфорилирования не задействован. Q10 является необходимым коэнзимным фактором, требующимся для окислительного фосфорилирования и образования АТФ в митохондриях.
BSCv. Точка 23 была новым белком человека из Хромосомы 20, называнным BSCv. BSCv белок также известен как связанный с плазматической мембранов адипоцитов белок (названия генов: АРМАР или C20orf3) и предполагается, что он является мембранным белком типа II с последовательностью, подобной белковому семейству синтаз стриктозидина. Обработка Q10 приводит к уменьшению концентраций этого белка. Этот белок не очень хорошо охарактеризован, и его гомология с стриктозидин синтазами не подвержена. Интересно, что этот белок связывается с ролью в дифференциации адипоцитов (Albrektsen et al., 2001). Недавние протеомические исследования человеческой сальниковой жировой ткани идентифицировали BSCv как один из девяти белков с различной экспрессией при поликис-тозном синдроме яичников (ПКСЯ) у страдающих ожирением женщин (Corton, 2008 Hum. Reprod. 23: 651-661). Поскольку он является белком клеточной оболочки, который реагирует на Q10, антитело к BSCv было бы полезно и как биомаркер. На основании настоящих результатов и доступной литературы, BSCv потенциально может играть роль при раке и диабете.
NM23A. Неметастатических клеток 1, белок (NM23A, также известный как NME1), считающийся метастатическим супрессором. Этот ген (NME1) был идентифицирован, поскольку уровни его мРНК транскриптов падают в высоко метастазирующих клетках. Белок обладает активностью как нуклеозид дифосфат киназа (НДК) и существует как гексамер, состоящий из 'А' (кодирумой этим геном) и 'В' (кодируемой NME2) изоформ. Мутации по этому гену идентифицированы в агрессивных нейробластомах. Активность NDK поддерживает равновесие между концентрациями различных нуклеозидтрифосфатов, как, например, при превращении GTP, образующегося в цикле лимонной кислоты (Кребса), в АТФ. Комплекс NDK связывается с р53 через взаимодействие с STRAP. Следует заметить, что STRAP связан с HNF4A. Таким образом, NM23A является потенциальным белком, участвующим в путях, важных для клеточного контроля и лечения болезни.
Rho GDP диссоциации ингибитор (GDI) альфа: GDI регулирует GDP/GTP обменную реакцию Rho белков путем ингибирования диссоциации GDP от них, и последующего связывания GTP с ними. Белок показывает повышающую регуляцию в раковых клетках.
Пример 5. Анализы митохондриального обогащения.
Доказательства по нескольким линиям подвердили, что оценка тесной связи роли митохондриаль-ных белков и биологии рака и реакции на Q10 является достоверной. Во-первых, Q10 в процессах ми-тохондриального окислительного фосфорилирования для образования энергии в нормальных клетках играет необходимую роль. Однако метаболическое переключение, которое происходит в раковых клетках, приводит к тому, что энергия образуется по альтернативному пути гликолиза, не требующем Q10. Во-вторых, апоптозный ответ клеток требует наличия митохондриальных белков. Установлено, что Q10 стимулирует апоптозы в раковых клетках (семейство белков Bcl-2, цитохром с). Наконец, новые митохондриальные белки идентифицированы как модулированные воздействием Q10, что показано изменением уровня белка в митохондриях при импорте рецепторного белка ТОМ22 (см. эксперименты, описанные здесь).
Получение богатых митохондриями образцов.
Клетки рака кожи SKMEL-28 были обработаны 100 мкМ Q10 или пустым раствором в течение 6, 19 или 48 ч. Клетки были собраны путем промывки и соскабливания клеток с Т-160 колб (4 на каждую временную точку). Клетки были собраны путем центрифугировании, и осадок был заморожен и хранился при -80°С. Клеточный осадок был ресуспендирован и разрушен с использованием 2 мл гомогенизатора Dounce. Реагенты и способы были получены из набора для выделения митохондрий для культивируемых клеток (MitoSciences, Cat# MS852). Получившиеся в результате образцы митохондрий были разделены на 75 мкл аликвоты (4-5 аликвот на образец) и хранились при -80°С.
Протеомический анализ богатых митохондриями образцов, выделенных из SK-MEL-28 клеток, обработанных Q10.
2-D гель-электрофорез был осуществлен на белках, растворенных из двух аликвот SK-MEL-28 богатых митохондриями образцов, обработанных 100 мкМ Q10 в течение 6, 19 и 48 часов (одновременно с соответствующими обработанными пустым раствором контролями). Образцы были подвергнуты 2-D электрофорезу (дважды на каждой точке). Были проведены анализы 525 белковых точек в сравнительном исследовании, где контрольный образец сравнивался с образцами других временных точек (фигура
11).
Девять статистически достоверно различимых изменений на точках были выбраны для сравнительного анализа в 2-D электрофорез-геле. По ним 9 точек были извлечены и подвергнуты белковой идентификации путем расщепления трипсином и масс-спектрометрии.
Таблица 4. Белки, идентифицированные как показавшие различную реакцию на обработку Q10 в
Ацил-СоА тиоэстераза 7: Ацил-СоА тиоэстераза 7 (АСОТ7) является членом энзимного семейства, которое катализирует гидролиз жирного ацил-СоА в свободную жирную кислоту и СоА. Этот фермент таким образом играет роль в регуляции липидного метаболизма и клеточного сигналинга. АСОТ7 связан с длинноцепочечными ацил-СоА субстратами с цепями жирных кислот, состоящими из 8-16 атомов углерода (С8-С16). Точная функция АСОТ7 в клетке понятна не до конца. Транскрипция этого гена активируются связывающим стерол регуляторный элемент белком 2, что подтверждает его функцию в метаболизме холестерина.
Результаты этого примера показывают, что АСОТ7 потенциально участвует в метаболизме Q10, прямо или косвенно. Таким образом, целевая АСОТ7 может содействовать модуляции внутриклеточных уровней Q10 и тем самым влиять на клеточные эффекты Q10.
Пируваткиназа: пируваткиназа - фермент, участвующий в последнем этапе гликолиза Он катализирует перенос фосфатной группы с фосфоенолпирувата (PEP) к АДФ, производя одну молекулу пирувата и одну молекулу АТФ.
шфУвртинаУа фосфоенолпируват (НЕРУ (РЮ s пируват{Рут> трансферам
Белком предположительно является PKM2, изоформа типа 2, которая была идентифицирована в богатом митохондриями образце SK-MEL-28. Хорошо известно, что эта изоформа участвует в образовании и регуляции опухолевых клеток.
Подсчет уровней Q10 в митохондриях.
Способ одновременного определения коэнзима Q10 (Q10) и восстановленной формы убихинола-10 (Q10H2) был выполнен на основе недавно опубликованного способа (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma
А, 1175, 242-248) благодаря использованию LC-MS/MS с ионизацией электрораспылением (ESI) в режиме определения положительных ионов Возможны высоко избирательная идентификация и чувствительный подсчет Q10 и Q10H2, вкупе с идентификацией других выбранных липидов Аликвоты богатых митохондриями образцов из SK-MEL-28, обработанных 100 мкМ Q10, были подвергнуты стандартной пре-обработке, основанной на осаждении белка, экстракции жидкость-жидкость, выпаривании до высыхания и восстановлению в 50 мкл смеси 95:5 метанол/гексан (по объему).
В этом анализе были подсчитаны Q10, Q10H2 и Q9 (табл. 5). Уровни соответствующей молекулы Q9 были низкими, и близко от уровня детекции. Уровни необработанных образцов были сравнительно постоянными, с 6 часами обработанным Q10 образцом, имеющим тот же уровень. Для контроля за вариабельностью материала образцов были подсчитаны также уровни холестерина для подтверждения того, что различия не происходят вследствие погрешностей в размере образцов. Когда уровни Q10 были верными по сравнению со значениями общего белка, наблюдаемого в белковой экстракции других аликвот из тех же митохондриальных проб, сравнительные соотношения были сопоставимыми. Таким образом, достоверное возрастание уровней Q10 наблюдалось на 19 часах (~в 3 раза), с даже большим возрастанием на временной точке 48 ч (~ в 6 раз) (фиг. 12).
Таблица 5. HPLC-MS Результаты количественного определения уровней Q10, присутствующего в бога-
Неожиданным результатом этого исследования было обнаружение того, что Q10 попадал в клетки в окисленной форме. Для 48-часовых образцов восстановленная форма Q10H2 также была подсчитана, и было обнаружено, что она присутствует в достоверно более низких количествах (0,28 нг/образец CoQ10H2 по сравнению с 46,63 нг/образец CoQ10). Было общее возрастание (в 3 раза) в уровнях Q10H2 в обработанном Q10 48-часовом образце, хотя уровни были близкими к предполагаемому порогу чувствительности способа. Интересно, что окисленная форма (Q10) может действовать как прооксидант в биологических системах. В соответствии с литературой, когда человеческая плазма была оценена по Q10 и Q10H2, было обнаружено, что большинство (90%) молекул присутствуют в восстановленной форме Q10H2 (Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma А, 1175,242-248), которая может действовать как антиок-сидант.
Таким образом, эти результаты подтверждают и дают количественную оценку того, что уровни Q10 возрастают в митохондриях после экзогенного добавления Q10 в среду. Неожиданным открытием было то, что Q10 оставался в той же окисленной форме (про-оксидант), в которой его добавили, и не превращался в восстановленную (анти-оксидант) форму Q10H2 в каком-либо значительном количестве.
Пример 6. Анализы ПЦР в режиме реального времени.
Эксперимент 1. Апоптозный анализ.
Как обсуждалось в примере 3, обработка раковых клеток Q10 вызывает гибель части этих клеток вследствие апоптозных процессов. Чтобы идентифицировать белки, задействованные в реакции на Q10, были применены методы полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени (RT-ПЦР) для идентификации изменений в уровнях мРНК для генов/белков, включенных в целевые пути, связанные с апоптозом.
При использовании ПЦР методов как скринингового механизма, оценивался спектр целевых молекул, которые потенциально предлагались как способные отвечать на биологическое действие Q10 внутри клеток. Изменения в уровнях мРНК были оценены с использованием количественных оценок ПЦР в режиме реального времени для определения уровней мРНК в отобранных заранее подсериях, содержащих 80 специфических целевых путей.
Для интерпретации мРНК результатов, идентифицировались и оценивались гены, у которых в два раза изменялась транскрипция их мРНК. Уровень генной транскрипции для образования мРНК дает только грубую оценку потенциальных изменений в уровне экспрессируемого белка. Специалисты в данной области поймут, что каждая мРНК может иметь различные степени, в какой она деградирует или в какой ее трансляция неэффективна, поэтому в результате будут получаться различные количества белка.
SkBr-3 клетки, обработанные 50 мкМ Q10 24 ч.
Способ анализа RT-ПЦР был использован для количественного определения изменений уровней мРНК для всех 84 белков, связанных с апоптозным путем. Эксперименты с апоптозным анализом ПЦР в режиме реального времени на SkBr3 с Q10 (24 ч) показали, что влияние было оказано на следующие мРНК: Bcl2, Bcl2Ll, Bcl2L11, Birc6, Bax, Xiap, Hprt1, Apaf1, Abl1, Braf. Эти результаты также предоставили доказательства того, что обработка Q10 вызывает апоптозный ответ в раковых клетках.
Таблица 6А
Uoigene Refseq
Описание
Обозначен не
Положите лышя-Отрицател ьная
регуляция 13.1957 6.3291
Название гена
BCL2L1 13.1957 Hs.516966 NM_138578 ВСЬ2-подобный 1 BCL-XL/S
BNIP2 6.3291 Hs.646490 NM_004330 ВСЬ2/аденоБнрус El В BNIP-2/NIP2
5.4717 4.7966
4.6012 4.3832 4.3832
3.896 2.6244
BCL2 BIRC6
BCL2L11
XIAP
BRAF
BAX APAF1
HPRT1
19кДа взаимодействующ ий белок 2
Hs. 150749 NM_OO0633 В-клетки CLL/лимфома Bcl-2 2
Hs. 150107 NMJ)162S2 Бакуловирусный I АР APOLLON/B повтор-содержащий 6 RUCE (аполлон)
Hs.469658 NM_006538 ВСЬ2-подобный 11 BAM/BIM
(содействие апоптозам) Hs.356076 NM_0OU67 Х-связанный ингибитор API3/BIRC4 апоптозов
Hs.550061 NM_O04333 гомолог Bl вирусного Braf
Hs.631546 NM 004324
онкогена мышиной 1/BRAF1 саркомы V-raf
ВСЬ2 <вязанныйХ Bax zeta
Hs.708112 NM_001160
белок
Фактор 1, CED4/DKFZp
-160.6748 Hs.412707 NM_000194
активирующий 781В1145 апоптозную пептидазу Гипоксантин HGPRT/HPRT Фосфорибозилграсфераз а 1 (синдром Леш-Нихана)
Согласованные результаты трех независимых экспериментов на SK-MEL-28 клетках представлены ниже в табл. 6В. В SCC клетках многие гены также регулируются обработкой 100 мкМ Q10. Гены в апоптозном анализе, которые по видимости регулируются в SCC клетках, описаны в табл. 7. Мы обнаружили, что многие гены регулируются на 6 ч, как в SK-MEL-28 клетках, так и в SCC клетках. На 24 ч регуляция уменьшается. Гены которые по видимости регулируются как в SK-MEL-28 клетках, так и в SCC клетках, описаны в табл. 8.
Таблица 6В. Гены в клетках SK-MEL-28, которые регулируются воздействием 100 мкМ Q10, при анализе апоптозным анализом
Обозначени
Описание
Регуляция
Локалнза цня
Возможные функции
ABL1
С-аЫ онкоген 1,
рецептор
тирозинкнназы
Отрицательно регулируется на 72 часах
-Ядро
Тирозинкиназа
BAG1
BCL2-
ассоциированны й атероген
Положительно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Анти-апоптоз, путь рецептора глюкокортикоида
BCL2
В-клетки CLL/лимфома 2
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Гибель клеток
BCL2A1
BCL2-связанный белок А1
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Регулятор каспаз, фосфор ил иро ванне ТР73
BCL2L1
BCL2 -подобный
Отрицательно регулируется на 72 часах
Цитоплаз ма
Ингибитор каспаз
BCL2L10
ВСХ2-подобный 10 (содействие апоптозам)
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Активатор каспаз
BCL2L11
BCL2-подобный 11 (содействие
Отрицательно регулируется на
Цитоплаз ма
Про-апотш, активатор каспазы
апоптозам)
48 часах
BIRC3
Бакуловирусный IAP повтор-содержащий 3
Отрицательно регулируется на 6 часах
Цитоплаз ма
Анти-апоптоз
BIRC8
Бакуловирусный IAP повтор-содержащий S
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Активатор каспаз
CARD8
Семейство поддерживающег о каспазы домена, член 8
Отрицательно регулируется на 48 часах
Ядро
Активатор каспаз
CASP14
Каспаза 14, связанная с апоптозом цисте инпептнд аза
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Связанная с
апоптозами
цистеинпептидаза
CASP5
Каспаза 5, связанная с апоптозом цистеинпептидаза
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Связанная с
апоптозами
цистеинпептидаза
CD40LG
CD40 лиганд (TNF
суперсемейство, член 5, гипер-lgM синдром)
Отрицательно регулируется на 48 часах
Внеклеточ ное
пространс тво
Связывание рецептора CD40
CIDEA
DFFA-подобный эффектор а, вызывающий клеточную гибель
Положительно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Про-апоптоз
FADD
Fas (TNFRSF6)-связанный через домен гибели
Отрицательно регулируется на 6 часах
Цитоплаз ма
Про-апоптоз
FAS
Суперсемейство рецепторов Fas (TNF, член 6)
Положительно регулируется на 48 часах
Плазмати
ческая
мембрана
Про-апоптоз
FASLG
Fas лиганд
Отрицательно
Внеклеточ
Про-апоптоз
(суперсемейство TNF, член 6)
регулируется на 48 часах
ное
пространс тво
GADD45A
Задержка роста и индуцирование повреждения ДНК, альфа
Положительно регулируется на 48 часах
Ядро
Задержка роста
HRK
Harakiri, BCL2 взаимодействую щий белок (содержит только ВНЗ домен)
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Про-апоптоз
PYCARD
PYD и CARD домен
содержащий
Отрицательно регулируется на 6 часах
Цитоплаз ма
Активатор апоптозной протеазы
TNF
Фактор некроза опухолей (суперсемейство TNF, член 2)
Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется
Внеклеточ ное
пространс тво
Связывание TNF рецептора
TNFRSF10A
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 10а
Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется
Плазмати
ческая
мембрана
Активатор каспаз
TNFRSF10B
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 10Ь
Отрицательно регулируется на 72 часах
Плазмати
ческая
мембрана
р53 сигналинг, активатор каспаз.
TNFRSF1A
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А
Отрицательно регулируется на 72 часах
Плазмати
ческая
мембрана
Про-апоптоз
тозным анализом
Обозначение
Описание
Регуляция
Отрицательно регулируется на 6 часах и затем
АКТ1
Гомолог 1 вирусного онкогена мышиной тимомы V-afct
положительно регулируется на 24 часах.
BAG4
ВСЬ2-ассоциированный атаноген
Положительно регулируется на 24 часах.
ВАХ
BCL2-ассоциированный X белок
Положительно регулируется на 24 часах.
BCL2
В-клеток СЫ-Лшмфома 2
Положительно регулируется на 24 часах.
Отрицательно регулируется на б часах и затем
BCL2L1
ВСЬ2-подобный 1
положительно регулируется на 24 часах.
BIRC3
Бакуловирусный IAP повтор-содержащий 3
Отрицательно регулируется на б часах.
BNTP3
В <Х2/аденовирус Е1В 19кДа взаимодействующий белок 3
Отрицательно регулируется на 24 часах.
CARD6
Семейство поддерживающего каспазы домена, член 6
Отрицательно регулируется на 6 часах.
Каспаза 6, связанная с апоптозом
Положительно
CASP6
цистеинпептидаза
регулируется на 24 часах.
Каспаза 7, связанная с апоптозом
Положительно
CASP7
цистеи нпептидаза
регулируется на 24 часах.
CD40
CD40 молекула, суперсемейство TNF рецепторов, член 5
Отрицательно регулируется на 6 часах.
FADD
Fas Положительно регулируется на 24 часах.
GADD45A
Задержка роста и индуцирование
Положительно
повреждения ДНК, альфа
регулируется на 24 часах.
HRK
Harakiri, BCL2 взаимодействующий белок (содержит только ВНЗ домен)
Положительно регулируется на 24 часах.
TNFRSF21
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 21
Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNFRSF25
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 25
Отрицательно регулируется на 6 часах и затем положительно регулируется на 24 часах.
CD27
CD27 молекула
Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNFRSF9
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 9
Отрицательно регулируется на 6 часах.
TNFSF10
Фактора некроза опухолей (лиганд) суперсемейство, член 10
Положительно регулируется на 24 часах.
CD70
CD70 молекула
Отрицательно регулируется на 6 часах.
TP53
Опухолевый белок р53
Положительно регулируется на 24 часах.
TP73
Опухолевый белок р73
Отрицательно регулируется на 6 часах и затем положительно регулируется на 24 часах.
TRAF2
TNF рецептор-ассоциированный фактор 2
Положительно регулируется на 24 часах.
Интересно, что измененные уровни мРНК показали значимую положительную регуляцию в сериях апоптозных белков, где Bcl-xl был выше всего. Это также наблюдалось в экспериментах анализа белка на SK-MEL-28 клетках.
Bcl-xl является трансмембранной молекулой в митохондриях (Bcl-xl является обозначением "ба-зальноклеточная сверхбольшая лимфома"). Она включена в сигнальный путь трансдукции FAS-L и является одним из нескольких антиапоптозных белков, которые являются членами белкового семейства Bcl-2. Она задействована в выживании раковых клеток. Однако известно, что альтернативный сплайсинг Bcl-х мРНК человека может приводить, по меньшей мере, к двум различным видам Bcl-х мРНК, Bcl-xL и Bcl-xS. Преобладающий белковый продукт (233 аминокислоты) - более крупная Bcl-х мРНК, Bcl-xL, которая подавляет клеточную гибель вследствие удаления фактора роста (Boise et al., 1993. Cell 74, 597-608). Bcl-xS, а с другой стороны, ингибирует возможность Bcl-2 ингибировать клеточную ги
бель и делает клетки более восприимчивыми к апоптозной гибели клеток. Используемые анализы не различают, какая изоформа является повышающе регулируемой. Bcl-х изоформа, которая повышающе регулируется CoQ10 в этих исследованиях, может быть определена обычными способами, известными специалистам, например, использованием RT-ПЦР способов для оценки соотношения двух изоформ мРНК сплайсинга (Bcl-xL vs Bcl-sL).
Из наблюдения связанных с апоптозом белков было замечено, что множественные про- и анти-апоптозные факторы в BCL-2 семействе или взаимодействие с этими факторами модулировали уровни экспрессии (BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). Эти белки управляют проникновением через мембраны митохондрий.
Ранний маркер апоптозного ответа наблюдался вместе с повышающей регуляцией Каспазы-9 (16 часов), что согласуется с предыдущими наблюдениями апоптозов с каспазой 3/7 белков. Индукция стресс-сигналинг путей приводит к высвобождению циторохрома с из митохондрий и активации apaf-1 (апоптосомы), которая в свою очередь расщепляет про-энзимы каспазы-9 в активную форму. После инициации каспаза-9 начинает расщеплять прокаспазу-3 и прокаспазу-7, запуская дополнительные апоптозные пути.
Семейство рецепторов к фактору некроза опухолей также постоянно имеет отношение к модулированным белкам.
Замечена также сильная понижающая регуляция опухолевого белка р73. Анализы множества опухолей, обычно находимых у человека, включая рак молочной железы и яичников, показали высокую экспрессию р73 по сравнению с нормальными тканями в соответствующих областях. Недавние открытия подтверждают, что дерегулируемая сверхэкспрессия транскрипционных факторов в организме, участвующих в регуляции клеточного цикла и синтезе ДНК в клетках млекопитающих (например, E2F-1), вызывает экспрессию р73. Это подтверждает, что р73 может быть онкобелком, но может быть задействован в различных механизмах, которые связаны с р53 белком. На фиг. 13 представлена схема апоптозного пути.
Клетки SKMEL-28.
Из наблюдения связанных с апоптозом белков было замечено, что множественные про- и анти-апоптозные факторы в BCL-2 семействе или взаимодействие с этими факторами модулировали уровни
экспрессии (BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). Эти белки управляют проникновением через мембраны митохондрий.
Ранний маркер апоптозного ответа наблюдался вместе с повышающей регуляцией каспазы-9 (16 часов), что согласуется с предыдущими наблюдениями апоптозов с каспазой 3/7 белков. Индукция стресс-сигналинг путей приводит к высвобождению циторохрома с из митохондрий и активации apaf-1 (апоптосомы), которая в свою очередь расщепляет про-энзимы каспазы-9 в активную форму. После инициации каспаза-9 начинает расщеплять прокаспазу-3 и прокаспазу-7, запуская дополнительные апоптозные пути.
Таблица 9. Изменения в уровнях мРНК в SKMEL-28 клетках, обработанных 100 мкМ Q10, оцененных по RT-ПЦР анализам, сосредоточенным на апоптозных путях
справ. Поел.
Описание
Обознач ение
бчОДО
16 ч Q10
24чОД0
72 ч 010
NM.006538
BCL2 -подобный 11 (содействие апоптозам)
BCL2L1
2,13
2,41
1,92
2,51
NM_000875
Инсулин-подобный рецептор фактора роста 1
IGF1R
1,77
1,09
1,33
1,25
NM_0O4O48
Бета-2-
микроглобулин
В2М
1,74
1,76
1,58
3,11
NM_003921
В-клеток CLL/лимфома 10
BCL10
1,55
1,87
1,48
-3,11
NM_004330
В(Х2/аденовиру с Е1В 19кДа взаимодействую щий белок 2
BNIP2
1,46
1,51
1,57
-1,61
NM_005157
С-аЫ онкоген I, рецептор тирозин киназы
ABL1
1,42
2,77
-1,22
-2,03
NM_004323
BCL2-
acc оциированны й атаноген
BAG1
1,41
1,44
-1,61
-2,45
NM_001229
Каспаза 9, связанная с апоптозом цнстеинпептидаз
CASP9
1,32
3,96
1,83
1,14
NM_003806
Harakiri, BCL2 взаимодействую щий белок (содержит только ВНЗ домен)
HRK
1,18
4,52
2,73
-1,14
NM_001924
Задержка роста и индуцирование повреждения ДНК, альфа
GADD45
1,07
3,34
1,13
-2,36
NM_001188
BCL2-
антагонист/килле р!
ВАК!
1,06
2,73
-1,00
-4,54
NM_004295
TNF рецептор-связанный фактор 4
TRAF4
-1,91
2,63
-1,58
-740,66
NM_003842
Суперсемейство рецепоров факторов некроза
опухолей, член 10Ь
TNFRSF
-2,07
1,53
-1,81
-710,49
NM_000633
В-клеток CLL/лимфома 2
BCL2
-2,98
-1,63
-2,82
-11,36
NM.001242
CD27 молекула
CD27
-3,40
-2,38
-1,35
-12,72
NM_014430
Клеточную гибель
вызывающий
CIDEB
-3,48
1,56
-3,69
-2,59
DFFA-подобный эффектор b
NM.001065
Суперсемейство рецепоров факторов некроза
опухолей, член 1А
TNFRSF 1А
-4,53
2,28
-3,30
1,22
NM_005427
Опухолевый белок р73
ТР73
-4,66
-9,80
-8,71
-26,96
NM_003844
Суперсемейство рецепоров факторов некроза
опухолей, член 10а
TNFRSF 10А
-4,84
-5,26
-4,33
-11,84
NM_138578
В^2-подобный
BCL2L1
-4,94
-1,80
-6,17
-7,04
NM_001165
Бакуловирусный LAP повтор-содержащий 3
BIRC3
-13,68
-1,98
-2,42
-3,42
Семейство рецепторов к фактору некроза опухолей также постоянно имеет отношение к модулированным белкам.
Замечена также сильная понижающая регуляция опухолевого белка р73. Анализы множества опухолей, обычно находимых у человека, включая рак молочной железы и яичников, показали высокую экспрессию р73 по сравнению с нормальными тканями в соответствующих областях. Недавние открытия подтверждают, что дерегулируемая сверхэкспрессия транскрипционных факторов в организме, участвующих в регуляции клеточного цикла и синтезе ДНК в клетках млекопитающих (например, E2F
1), вызывает экспрессию р73. Это подтверждает, что р73 может быть онкобелком, но может быть задействован в различных механизмах, которые связаны с р53 белком.
Эксперимент 2. ПЦР в режиме реального времени. Анализы, использующие наборы окислительного стресса и антиоксидантной защиты.
Для идентификации белков, которые были включены в Q10 ответ, был использован метод поли-меразно-цепной реакции в режиме реального времени (RT-ПЦР) для идентификации изменений в уровнях мРНК для генов/белков, включенных в целевые пути окислительного стресса и антиоксидантной защиты.
В табл. 10 ниже перечисляются гены, которые регулируются в SK-MEL28 клетки, обработанных 100 мкМ Q10. Результаты даются только для тех генов, которые являются регулируемыми в двух независимых экспериментах. Хотя существует достоверное количество генных регуляций, наблюдаемых на 6 часах, большинство достоверных изменений в уровнях РНК наблюдаются на 48 ч. Таблица 10. Гены в SK-MEL-28 клетках, которые регулируются при обработке 100 мкМ Q10, что видно по анализам окислительного стресса и антиоксидантной защиты Arrays"
Обознач ение
Описание
Регуляция
Локализация
Возможные функции.
ALB
Альбумин
Отрицательная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Белок-носитель, анти-апоптозная
АОХ1
Альдегид оксидаза
Положительная регуляция с 16 часов
Цитоплазма
Образование
свободных
радикалов,
метаболизм
ксенобиотиков
АРОЕ
Аполипопротеин Е
Отрицательная регуляция на 4$ часах
Внеклеточное пространство
Метаболизм липидов
АТОХ1
АТХ1
акгиоксидантного белка 1 гомолог (дрожжи)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Метаболизм меди
BNIP3
ВСЫ/аденовирус Е1В 19кДа взаимоде йству юти й белок 3
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Анти-апоптоз
CSDE1
Домен холодового шока, содержащий El, РНК-связывающийся
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Регуляция транскрипции
CYBA
Цитохром Ь-245, альфа полипептид
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Алоптозы
CYGB
Цитоглобин
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Пероксидаза, транспортер
DHCR24
24-
де гидрохо листерин редуктаза
Отрицательная регуляция на 6 часах
Цитоплазма
Перенос электронов, связывание с ТР53, участие в апоптозах
DUOX1
Двойная оксидаза 1
Положительная регуляция на 48 часах
Плазматическ ая мембрана
Связывание ионов кальция, перенос электронов
DUOX2
Двойная оксидаза 2
Отрицательная регуляция на 48 часах
Неизвестна
Связывание ионов кальция
ЕРНХ2
Эпоксида
гидролаза 2, цитоплазматическа
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Метаболизм
арахидоновой
кислоты
ЕРХ
Эозинофил пероксидаза
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Метаболизм
фенилаланина,
апоптозы
GPX2
Глутатиона пероксидаза 2 (желудочно-кишечная)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Перенос электронов, связывание с ТР53, участие в апоптозах
GPX3
Глутатиона пероксидаза 3 (плазма)
Положительная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Метаболизм арахидоновой
КИСЛОТЫ,
отрицательная регуляция в карциыомах
GPX5
Глутатиона пероксидаза 5 (эпидидемальнъш андроген-связанный белок)
Положительная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Метаболизм
арахидоновой
кислоты.
GPX6
Глутатиона пероксидаза б (обонятельная)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Метаболизм
арахидоновой
кислоты.
GSR
Глутатиона редуктаза
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Метаболизм глутамата и глутатиона, апоптозы
GTF2I
Общий фактор транскрипции II, i
Отрицательная регуляция на б часах
Ядро
Активатор транскрипции, транскрипция fos.
KRT1
Кератин 1 (эпидермолитическ ий гиперкератоз)
Положительная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Связывание сахара
LPO
Лактопероксидаза
Отрицательная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Метаболизм фенилаланина
MBL2
Манноза-
связывающий
лектин (белок С) 2,
растворимый
(недостаток
опсонина)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Дополнительный сигналинг, распознавание паттерна в рецепторах
MTST3
Микросомального глутатиона S-трансфераза 3
Положительная регуляция на 16 часах
Цитоплазма
Метаболизм ксенобиотиков.
MPO
Миело пероксидаза
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Анти-апоптоз,
метаболизм
фенилаланина
MPV17
MpV17
митохондриальный внутренний мембранный белок
Отрицательная регуляция на 6 часах
Цитоплазма
Поддержание
митохондриальной
ДНК.
MT3
Металлотио неин 3
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Связывание ионов меди.
NCF1
Цитозольный фактор
нейтрофилов 1, (хронический грану лематоз, аутосома 1)
Отрицательная регуляция с 6 часах
Цитоплазма
Образование свободных радикалов
NCF2
Цитозольный фактор
нейтрофилов 2 (65кДа, хронический грану лематоз, аутосома 2)
Положительная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Перенос электронов
NME5
Белок,
экспресс 1фующи йс я в неметастазирующи х клетках 5, (нуклеотид-дифосфат киназа)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Неизвестна
Метаболизм киназ. пуринов и пиримидинов
NOS2A
Оксида азота синтаза 2А (индуцируемая, гепатоциты)
Отрицательная регуляция па 48 часах
Цитоплазма
Сигналинг рецептора
глюкокортикоида,
апоптозы
OXR1
Устойчивость к окислению 1
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Реакция на
окислительный
стресс
PDLIM1
PDZ и LIM домен 1 (elfin)
Положительная регуляция на48 часах
Цитоплазма
Активатор транскрипции
РГРЗ-Е
Фосфоинозитид-связывающий белок PIP3-E
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Пероксидаза
PRDX2
Пероксиредоксин 2
Отрицательная регуляция на 6 часах
Цитоплазма
Роль в метаболизме фенилаланина. Роль в гибели клеток
PRDX4
Пероксиредоксин 4
Отрицательная регуляция с 24 часов
Цитоплазма
Тиоредоксин пероксидаза
PREXl
Фосфатиддлинозит ол 3,4,5-трисфосфат-зависимый RAC 1
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Формирует окисленные свободные радикалы
PRG3
Протеогликан 3
Отрицательная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Роль в гибели клеток.
PTGS1
Просгагландин-эндоперокспд синтаза 1 (простагландин G/H синтаза и циклооксигеназа)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Метаболизм арахидоновой кислоты, синтез простагландинов
PTGS2
Простагландин-эндоперокид синтаза 2 (простагландин G/H синтаза и циклоокигеназа)
Положительная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Метаболизм арахидоновой кислоты, синтез простагландинов
PXDN
Пероксидаз
гомолог
(Drosophila)
Положительная регуляция на 48 часах
Неизвестна
Связывание с TRAF4, связывание ионов кальция, связывание ионов железа.
PXDNL
Пероксидаз гомолога (Drosophila) -подобный
Отрицательная регуляция на 48 часах
Неизвестна
пероксидаза, связывание ионов кальция, связывание ионов железа.
RNF7
Ring finger белок 7
Положительная регуляция на 16 часах
Ядро
апоптозы, связывание ионов меди, путь обмена убихинона
SGK2
Сыворотка/глюкок ортикоид регулируемая киназа 2
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Киназа, регулятор каналов калия
SIRT2
Сиртуин
(молчащего МАТ-локуса
информационной регуляции 2 гомолог) 2 (S. cerevisiae)
Положительная регуляция на 16 часах
Ядро
Фактор транскрипции
SOD1
Супероксиддисмут аза 1, растворимая (амиотрофический боковой склероз 1 (у взрослых))
Положительная регуляция на 16 часах
Цитоплазма
Апоптозы, активатор каспазы
SOD2
Супероксиддисмут аза 2, митоходриальная
Положительная регуляция на 16 часах
Цитоплазма
Апоптозы, регулируется TNF.
SOD3
Супероксиддисмут аза 3, внеклеточная
Отрицательная регуляция на 48 часах
Внеклеточное пространство
Про-апоптозное
SRXN1
Сульфиредоксина 1 гомолог (S. cerevisiae)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Связывание ДНК, оксидоредуктаза
TPO
Тиреоид-пероксидаза
Отрицательная регуляция на 48 часах
Плазматическ ая мембрана
Йодирование тироглобулина, метаболизм тирозина, метаболизм фенилаланина
TTN
Титин
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Актина цитоскелета сигналинг, интегрина сигналинг
TXNDC
Тиоредоксин домен-содержащий 2 (сперматозоиды)
Отрицательная регуляция на 48 часах
Цитоплазма
Метаболизм пиримидинов
Цитозольный фактор нейтрофилов 2 (NCF2, 65кДа, хронический гранулематоз, аутосома 2) был одним из тех, чьи мРНК индуцировались вначале (наблюдалось на 6 часах). Впоследствии на временной точке 16 часов и дальше, после задержки на первичной фазе, индуцировались очень высокие уровни цитозольного фактора нейтрофилов 1 (NCF1) (хронический гранулематоз, аутосома 1).
Цитозольный фактор нейтрофилов 2 является цитозольной субъединицей мультибелкового комплекса, известного как НАДФН оксидаза, обычно находимая в нейтрофилах. Эта оксидаза вырабатыва
ет множество супероксидов, которые попадают в полость нейтрофильной фагосомы.
НАДФН оксидаза (никотинамид аденин динуклеотид фосфатоксидаза) является связанным с мембраной энзимным коплексом. Ее можно обнаружить в плазматической мембране, а также в мембране фагосомы. Она состоит из шести следующих субъединиц:
a Rho гуанозин трифосфотаза (GTPa3a), обычно Rac1 или Rac2 (Rac - обозначение для Rho-связан-ного С3 субстрата ботулинического токсина);
Пять "phox" единиц. (Phox - обозначение для фагоцитарной оксидазы);
Р91-РНОХ (содержит гем);
p22phox;
p40phox;
p47phox (NCF1);
p67phox (NCF2)ю
Замечено, что уровни других НАДФН оксизад не изменились. Ферментом является NOX5, который является новой НАДФН оксидазой, вырабатывающей супероксиды и действующей как Н+ канал (2+)-зависимым образом.
Кроме того, фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат-зависимый RAC обменный агент l(PREXl) также повышающе регулировался. Этот белок действует как фактор обмена нуклеотида гуанина для RHO семейства маленьких GTP-связывающих белков (RACs). Показано, что он связывает и активирует RAC1 превращая связанный GDP в свободный GTP. Кодируемый белок, который находится в основном в цитоплазме, активируется фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфатом и бета-гамма субъединицами гетеротримерных G белков.
Вторым основным рано индуцированным белком была синтаза оксида азота 2А (индуцируемая, гепатоциты) (NOS2A). Оксид азота - реактивный свободный радикал, который действует как биологический медиатор в нескольких процессах, включая нейротрансмиссию и антимикробную и антиопухолевую активность. Этот ген кодирует синтазу оксида азота, которая экспрессируется в печени и индуцируется комбинацией липополисахаридов и определенных цитокинов.
Супероксиддисмутаза 2, митохондриальная (SOD2) является членом семейства железо/марганец содержащих супероксиддисмутаз. Она кодирует митохондриальный белок, который формирует гомо-тетрамер и связывает один ион марганца на субъединицу. Этот белок связывает супероксидные побочные продукты окислительного фосфорилирования и превращает их в перекись водорода и двухатомный кислород. Мутации по этому гену связаны с идиопатической кардиомиопатией (ИКМП), преждевременным старением, спорадической болезнью двигательного нейрона и раком.
Примером понижающей белковой регуляции является Forkhead box M1 (FOXM1), про которого известно, что этот белок играет ключевую роль в последовательности событий клеточного цикла, где пики эндогенной экспрессии FOXM1 наблюдаются на фазах S и G2/M. Недавние исследования показали, что FOXM1 регулирует экспрессию множества G2/М-специфичных генов, таких как Plk1, циклин В2, Nek2 и CENPF и играет важную роль в поддержании сегрегации хромосом и стабильности генома. FOXM1 ген в настоящее время известен как протоонкоген человека. Аномальная повышающая регуляция FOXM1 участвует в онкогенезе базальноклеточной карциномы (БКК). Повышающую регуляцию FOXM1 позднее обнаружили в большинстве солидных раков человека, включая рак печени, молочной железы, легких, простаты, шейки матки, кишечника, поджелудочной железы и мозга. Дальнейшие исследования БКК и Q10 должны определить уровни FOXM1.
SKMEL-28 клетки.
Дальнейшие эксперименты проводились с использованием SKMEL-28 клеток. Уровни мРНК, присутствующей в SKMEL-28 клетках, обработанных 100 мкМ Q10, сравнивались с уровнями необработанных клеток на различных временных точках с использованием методов ПЦР в режиме реального времени (RT-ПЦР). ПЦР-анализ (SABiosciences) представляет из себя серию оптимизированных для ПЦР в режиме реального времени праймерных анализов в 96-луночных планшетов для задействованных в метаболизме или связанных с болезнью генов, а также соответствующие контроли количества РНК. ПЦР-анализ осуществляет анализ генной экспрессии с помощью чувствительной ПЦР в режиме реального времени и возможность определения мультигенного профиля на микрочипе.
Таблица 11. Список и классификация мРНК уровней, оцененных по ПЦР-анализам Окислительного Стресса и Антиоксидантной Защиты. Наиболее сильные изменения уровней мРНК после шести часов обработки 100 мкМ Q10 на SKMEL-28 клетках показаны путем визуального выделения названия белка (возрастание - полужирный шрифт; снижение - подчеркивание; нет изменений - серый).
Антиоксида нты:
Глютатиона пероксидазы (GPx): GPX1. GPX2, GPX3, GPX4, GPX5, GPX6, GPX7 , GSTZ1. Peroxiredoxins fTPxl: PftDXl, PRDX2, PROX3, PRDX4, PRDX5, PRDX6.
Другие пекнжидазыСАТ. CSDE1, CYGB. DUOXl, DUOX2 , EPX, GPRlSft LPO MPO, PIP3-E, PTGS1,
PTGS2, PXDN, PXDNL, TPO, TTN.
Другие антвОКСидантКВ, APOE, GSR, MT3, SEL5, SOD1, SOD3, SRXNl, TXNDC2, TXNRD1, TXNRD2 . Гены, вовлеченные в метаболизм активных частиц кислорода (ROS):
Супеооксид-дисмутазы tSQCt): 50D1, SQE2r SOD3.
Другие гены, вовлеченные в суперокстдный иетабмдвлг, CCS, CYBA, DUOXl, DUOX2, ?ЗЛ21, МТЗ, NCF1, HCFI, NOS2A' N0XS,ЈBBS1.PR63.
Другие гены, вовлеченные в метаболизм ROSOX1. BNIP3, ЕРНХ2, MPV17, 5FTPD.
Гены, ответственные за окнслительниамеИВД, APOE, АТОХ1, CAT, CCL5, CSDE1, CYGB, DGKK, DHCR24, DUOX1, DUOX2, DUSP1, EPX, FOXM1, GLRX2, GPR156 , GPX1, GPX2 , GPX3, GPX4, GPXS, GPX6, GPX7 , GSS, KRT1, LPO, MBL2, MPO, MSRA, MTL5. NME5, NUOT1, OXR1, OXSR1, PDUM1, PIP3-E, PNKP, PRDX2, PRDXS, PRDX6, PRNP, RNF7, SCARA3, 5ELS, SEPP1 gg^ дщТ2 god SOJ22, SRXN1, STK25, TPO, TTN, TXNRD2
альфа шлипептид
NM_O0O433
NCF2
Цитозольный фактор нейтрофилов 2 (65кДа, хронический гранулематоз, аутосома 2)
1,2266
3,0077
0,0954
5,476
NM_000963
PTGS2
Простагландин-эндопе роксид синтаза 2 (простагландин Q/H синтаза и цнклооксигеназа)
-0,6912
2,7046
2,6552
4,0553
-3,3022
NM_183079
PRNP
Прионный белок (р27-30) (болезнь Крейтцфельда-Якоба, синдром Герстмана-Штрауслера-Шейнкера, фатальная семейная бессонница)
-0,2144
3,5236
2,9086
5,0837
-3,9396
NMJ04052
BNIP3
ВГХ2/аденовирус Е1В 19кДа
взаимодействующий белок 3
-2,9376
3,3288
4,312
-18,206
-4,8424
NM_000242
MBL2
Манноза-связывающий лектин (белок С) 2, растворимый (недостаток опсоннна)
-0,3622
-1,907
-3,014
-1,1854
-6,4544
NM_021953
FOXM1
Forkhead box Ml
-0,8135
0,068
-0,921
3,3655
-10,095
Цитозольный фактор нейтрофилов 2 (NCF2, 65кДа, хронический гранулематоз, аутосома 2) был одним из тех, чьи мРНК индуцировались вначале (наблюдалось на 6 часах). Впоследствии на временной точке 16 часов и дальше, после задержки на первичной фазе, индуцировались очень высокие уровни цитозольного фактор нейтрофилов 1 (NCF1) (хронический гранулематоз, аутосома 1).
Цитозольный фактор нейтрофилов 2 является цитозольной субъединицей мультибелкового комплекса, известного как НАДФН оксидаза, обычно находимая в нейтрофилах. Эта оксидаза вырабатывает множество супероксидов, которые попадают в полость нейтрофильной фагосомы. НАДФН оксидаза (никотинамид аденин динуклеотид фосфатоксидаза) является связанным с мембраной энзимным коп-лексом. Ее можно обнаружить в плазматической мембране, а также в мембране фагосомы. Она состоит из шести следующих субъединиц:
a Rho гуанозин трифосфотаза (GTPaзa), обычно Rac1 или Rac2 (Rac -обозначение для Rho-связан-ного С3 субстрата ботулинического токсина);
Пять "phox" единиц. (Phox - обозначение для фагоцитарной оксидазы);
Р91-РНОХ (содержит гем);
p22phox;
p40phox;
p47phox (NCF1);
p67phox (NCF2).
Замечено, что уровни других НАДФН оксизад не изменились. Ферментом является NOX5, который является новой НАДФН оксидазой, вьгоабатывающей супероксиды и действующей как Н+ канал (2+)-зависимым образом.
Кроме того, фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфат-зависимый RAC обменный агент l(PREXl) также повышающе регулировался. Этот белок действует как фактор обмена нуклеотида гуанина для RHO семейства маленьких GTP-связывающих белков (RACs). Показано, что он связывает и активирует RAC1 превращая связанный GDP в свободный GTP. Кодируемый белок, который находится в основном в цитоплазме, активируется фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфатом и бета-гамма субъединицами гетеротримерных G белков.
Вторым основным рано индуцированным белком была синтаза оксида азота 2А (индуцируемая, гепатоциты) (NOS2A). Оксид азота - реактивный свободный радикал, который действует как биологический медиатор в нескольких процессах, включая нейротрансмиссию и антимикробную и антиопухолевую активность. Этот ген кодирует синтазу оксида азота, которая экспрессируется в печени и индуцируется комбинацией липополисахаридов и определенных цитокинов.
Примером понижающей белковой регуляции является Forkhead box M1 (FOXM1), про которого известно, что этот белок играет ключевую роль в последовательности событий клеточного цикла, где пики эндогенной экспрессии FOXM1 наблюдаются на фазах S и G2/M. Недавние исследования показали, что FOXM1 регулирует экспрессию множества G2/М-специфичных генов, таких как Plk1, циклин В2, Nek2 и CENPF и играет важную роль в поддержании сегрегации хромосом и стабильности генома. FOXM1 ген в настоящее время известен как протоонкоген человека. Аномальная повышающая регуляция FOXM1 участвует в онкогенезе базальноклеточной карциномы (БКК). Повышающую регуляцию FOXM1 позднее обнаружили в большинстве солидных раков человека, включая рак печени, молочной железы, легких, простаты, шейки матки, кишечника, поджелудочной железы и мозга. Дальнейшие исследования БКК и Q10 должны определить уровни FOXM1.
Эксперимент 3. Анализы ПЦР в режиме реального времени, использующие анализ теплового шока.
Эксперимент 4. Анализы ПЦР в режиме реального времени, использующие диабетический анализ.
Анализы теплового шока были проведены для SCC клеток, и данные регулируемых генов представлены ниже в табл. 13.
Эксперименты, описанные в этом примере, были проведены для проверки общей гипотезы, что Q10 оказывает влияние на множество генов и меняет метаболический статус клетки. мРНК из SKMEL-28 клеток, обработанных 100 мкМ Q10, была оценена на RT-ПЦР по набору целевых белков, участвующих в диабетическом и связанными с ним путями. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что для нескольких белков, участвующих в путях гликолиза и процессинге инсулина, изменились уровни экспрессии их мРНК (представлено в табл. 14).
Таблица 14. Основные изменения уровней мРНК в SKMEL-28 клетках, обработанных
Результаты этих первичных экспериментов показывают, что уровни мРНК для множества инсулин-связанных белков модулировались в обоих направлениях. Результаты показывают, что Q10 мог бы влиять на лечение и/или оценку диабетической болезни.
Дальнейшие эксперименты проводились для подтверждения результатов, полученных на SK-MEL-28 клетках, обработанных Q10. Многие гены в SK-MEL-28 клетках регулируются уже на 6 часах после обработки после обработки Q10. Однако первичная регуляция становится менее заметной на 16 и 24 часах. Около 48 часов мы обнаружили, что многие гены диабетического набора снова стали сильно
регулируемыми Совпадающие результаты двух или более независимых экспериментов представлены ниже в таблице 15. В SCC клетках также показана регуляция некоторых генов, на 6 и 24 часах после обработки Q10. Эти результаты, полученные на SCC клетках, представлены в таблице 16, а гены, которые регулируются и в SK-MEL-28 клетках, и в SCC клетках, представлены в табл. 17. Таблица 15. Связанные с диабетом гены в SK-MEL-28 клетках, регулируемые обработкой 100 мкМ Q10
Обозначен ие
Описание
Регуляция
Локалнза цня
Возможные функции
ADRB3
Адренергический, бета-3-, рецептор
Отрицательно регулируется на 48 часах
Плазмати
ческая
мембрана
сАМР сигналинг, G-белка сигналинг
СЕАСАМ1
Молекула клеточной адгезии 1, связанная с карциоэмбриональным антигеном (билиарный гликопротеин)
Отрицательно регулируется на 48 часах
Внеклето чное
пространс тво
Анти-апоптоз" позитивная регуляция ан г йоге не за
СЕВРА
ССААТ/энхансер связывающий белок (С/ЕВР), альфа
Положительно регулируется на 48 часах
Ядро
Глюкокортикоидн ого рецептора сигналинг, VDR/RXR активация.
CTLA4
Цнтото ксичнын Т-лимфоцит-
ассоциированный белок
Отрицательно регулируется на 48 часах
Плазмати
ческая
мембрана
Т клеток рецептора сигналинг,, активирует
CASP8.
DUSP4
Двойная специфичная фосфатаза4
Отрицательно регулируется на 48 часах
Ядро
Фосфатаза
ENPP1
Эктонуклеотидная пирофосфатаза/фосфоди эстераза 1
Отрицательно регулируется на 48 часах
Плазмати
ческая
мембрана
Негативная регуляция пути инсулинового рецептора
FOXC2
Forkhead box С2 (MFH-1, мезенхимный forkhead 1)
Отрицательно регулируется на 48 часах
Ядро
Анти-апоптоз, фактор
транскрипции
G6PD
Глюкоза-б-фосфатдегидрогеназа
Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется
Цитоплаз ма
Пентозофосфатны й путь, метаболизм глутатиона.
НМОХ1
Гем оксигеназа (д Ациклическая) 1
Отрицательно регулируется на 48 часах
Цитоплаз ма
Гем оксигеназа дециклическая
ICAM1
Молекула внутриклетрч ной адгезии 1 (CD54), рецептор риновируса человека
Отрицательно регулируется на 48 часах
Плазмати
ческая
мембрана
Регулируется аторвастатином, влияет на некоторые каспазы.
IL4R
Интерлейкина 4 рецептор
Отрицательно регулируется на 48 часах
Плазмати
ческая
мембрана
Положительная регуляция ТР73, связывает IRS1 и IRS2
IRS1
Рецептора инсулина субстрат 1
Положительно регулируется на 48 часах, затем отрицательно регулируется
Плазмати
ческая
мембрана
Связывает инсулин рецептор
IRS2
Рецептора инсулина субстрат 2
Отрицательно регулируется на 48 часах
Плазмати
ческая
мембрана
IGF-1 сигналинг
Обозначение
Описание.
G6PD
Гл ю коза- 6-фосфатдегидрогеназа
1С AMI
Молекула внутриклеточной адгезии 1 (CD54), рецептор риновируса человека
PTK3CD
Фосфоннозитид'З-киназа, катализатор, дельта полипептид
SREBF1
Стерол-регуляторный элемент связывающий транкрипционный фактор 1
TNF
Фактор некроза onyxonefi(TNF суперсемейство, член 2)
TNFRSF1A
Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухолей, член 1А
VEGFA
Фактор роста эндотелия сосудовА
Уровни мРНК для множества имеющих отношение к инсулину белков модулировались в обоих направлениях. Q10 оказывает воздействие на регуляцию клеточного метаболизма, и таким образом влияет на болезни, связанные с нарушением метаболизма, такие как диабет. Ниже обсуждаются два белка, которые показали значительную модуляцию.
Митоген-активируемая протеинкиназа 14 (MAPK14): Митоген-активируемая протеинкиназа 14 (MAPK14) является членом семейства МАР-киназ. МАР-киназы действуют как интеграционные точки во множестве биохимических сигналов и участвуют во множестве клеточных процессов, таких как пролиферация, дифференциация, регуляция транскрипции и развитие. Результаты этого эксперимента показывают, что MAPK14 обнаружила значительную понижающую регуляцию.
Гепатоцитов ядерный фактор 4, альфа (HNF4A): HNF4 (гепатоцитов ядерный фактор 4) является ядерным рецепторным белком, экспрессирующимся по большей части в печени, кишечнике, почках и
бета-клетках поджелудочной железы, который очень важен для развития печени. У человека существуют две изоформы NHF4, альфа и гамма, кодируемые двумя различными генами HNF4A и HNF4G, соответственно. (См., например^Мгиег FL, Bossu JP, Laudet V, Fruchart JC, Laine В (1994). "Клонирование и секвенирование с ДНК, с кодированием гепатоцитного ядерного фактора человека 4 демонстрирует наличие двух изоформ в печени человека". Gene 147 (2): 269-72.)
HNF4 первоначально считался "рецептором-сиротой". Однако позже обнаружили, что активность HNF4 поддерживается постоянным связыванием со множеством жирных кислот (см., например, Sladek F (2002). "В отчаянном поиске ...чего-то". Mol Cell 10 (2): 219-221 и Jump DB, Botolin D, Wang Y, Xu J, Christian B, Demeure О (2005). "Регуляция транскрипции гепатического гена при помощи жирных кислот". J Nutr 135 (11)). Связывающийся с лигандом домен HNF4, как и у других ядерных рецепторов, принимает каноническую форму односпирального сэндвича (см., например Wisely GB, Miller AB, Davis RG, Thornquest AD Jr, Johnson R, Spitzer T, Sefler A, Shearer B, Moore JT, Miller AB, Willson TM, Williams SP (2002). "Гепатоцитный ядерный фактор 4 является фактором транскрипции, который, в основном, связывает жирные кислоты". Structure 10 (9): 1225-34 и Dhe-Paganon S, Duda K, Iwamoto M, Chi YI, Shoelson SE (2002). "Кристаллическая структура связывающего домена альфа-лиганда HNF4 в комплексе с эндогенным лигандом жирной кислоты". J Biol Chem 277 (41): 37973-6) и взаимодействует с коактиваторными белками, (см., например Duda K, Chi YI, Shoelson SE (2004). "Структурная основа для HNF-4альфа активации при помощи связывания лигандом и соактиватором". J BiolChem 279 (22):
23311-6).
Мутации по гену HNF4-a связаны с развитием приступов диабета взрослых в молодом возрасте (MODY). (см., например Fajans SS, Bell GI, Polonsky KS (2001). "Молекулярные механизмы и клиническая патофизиология диабета взрослых в молодом возрасте". N Engl J Med 345 (13): 971-80.)
Гепатоцитов ядерный фактор 4 (HNF4) является тканеспецифичным транскрипционным фактором, про которого известно, что он регулирует большое число генов в гепатоцитах и клетках поджелудочной железы. Хотя HNF4 высоко экспрессируется в некоторых отделах почек, о его роли в этом органе и об HNF4-регулируемых генах в почечных клетках известно мало. Распространенность и активность HNF4 часто уменьшаются в клетках почечной карциномы (RCC), что указывает на то, что некоторые опухоли подавляют функцию HNF4 в почечных клетках. Интересно, что показано, что многие гены, регулируемые HNF4, дерегулируются в исследованиях RCC на микрочипах. Эти гены (ACY1, WT1, SELENBP1, COBL, EFHD1, AGXT2L1, ALDH5A1, ТНЕМ2, АВСВ1, FLJ14146, CSPG2, TRIM9 и HEY1) являются хорошими кандидатами на роль генов, активность которых изменяется при снижении
HNF4 в RCC.
В структуре лиганд-связывающего домена HNF4альфа (1M7W.pdb; Dhe-Paganon (2002) JBC, 277, 37973); наблюдался маленький липид, который был выделен из Е. coli. Кристалл содержит две конфор-мации белка, где удлиненная спираль 10 и короткая спираль 12 имеют альтернативные конформации. Интересно, что при изучении липид-связывающего участка нашли, что там существуют два участка. Один выходящий участок захватывает головную группу маленького липида, и было замечено, что несколько карман-образующих регионов колаколизованы с этим выходящим участком. Есть гипотеза, что Q10 специфически связывается с этим транскрипционным фактором. Когда моделируется, как Q10 встраивается в этот связанный с липидами канал, кольцо Q10 входит в карман (фигура 28). Мутация с неизвестными функциями (E276Q) могла бы иметь потенциал для упорядочения остатков, выпрямляющих этот карман, и тем самым оказывать негативное воздействие на предполагаемое связывание
Q10.
Кроме того, в согласии с такой моделью связывания Q10, гидрофобный хвост выходил бы за внутреннюю полость и взаимодействовал бы с удлиненным helix 10. Таким образом, это взаимодействие могло бы потенциально менять конформацию helix 10/12 группы. Это могло бы затем менять равновесие активация/инактивация активности транскрипционного фактора.
Пример 7. Анализы антителами на микрочипах.
Оценка концентрации белка, связанной с наличием Q10, была проведена с использованием метода антител на микрочипах. Микрочип содержал антитела примерно к 700 белкам, широкому диапазону типов белков и потенциальным маркерам обменных путей.
Первоначальный эксперимент для определения изменений уровней концентрации белков в клетках, обработанных Q10, был проведен на микрочипах с антителами (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) и SK-MEL-28 клетками, обработанными 6 или 24 ч. Клетки были собраны и экстрагированы для получения растворимого белкового супернатанта. Две порции белков (~1 мг в общем) из каждого образца (1 мг/мл) каждая были помечены флюоресцентной меткой (Су3 и Су5, соответственно). Избыточная метка была удалена из белка, и материал использовался для инкубации на микрочипах. Для сравнения образцов с двух временных точек были смешаны равные количества белка, при этом каждый образец относился к различному меченому типу (например, 3-часовой экстракт, меченый Су3, был смешан с 24-часовым экстрактом, меченым Су5). После инкубации с микрочипом (в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем), микрочипы были промыты и высушены. Микрочипы сканировались на флюоресцентном лазерном сканере для подсчета сравнительной флюресцентной ин
тенсивности Су3 и Су5 меток.
Таблица 18. Белки с повысившимися уровнями в SK-MEL-28 клетках после 24-часовой обработки 50
мкМ Q10
обработки 50 мкМ Q10
Название
Соотношение
BclxL
4,2
BID
3,7
Bmf
3,7
РиМАЬЬсЗ
3,0
Zip-Киназа
2,8
Bmf
2,8
DcR2
2,7
E2F1
2,7
FAK pTyr577
2,5
FKHRL1 FOX03a
2,5
MTBP
2,5
Коннексин 32
2,5
Аннексии VII
2,4
p63
2,4
SUMOl
2,4
IAfadin
2,3
MDMX
2,3
Pyk2
2,3
RIP Рецептор-
взаимодействующий
белок
2,3
RICK
2,3
IKKa
2,3
Bclx
2,3
Afadin
2,2
Название
Соотношение
Класпин
2,1
GRP75
2,1
Каспаза 6
ILP2
2,1
аАктинин
2,1
Витронектин
2,1
DRAK1
2,1
PTEN
2,1
Grb2
2,1
HDAC4
2,0
HDAC7
2,0
Синтаза оксида азота bNOS
2,0
HDAC2
2,0
р38 МАРК
2,0
Рилин
2,0
Протеинкиназа Cd
2,0
сегЬВЗ
2,0
hSNF5 WI1
2,0
Протеинкиназа Са
2,0
Глутаматный peuerrropNMDAR 2а
2,0
Лептин
2,0
Диметилированный гистон НЗ diMeLys4
2,0
2,0
Пролиферируюший клеточный белок Ki67
2,2
Гистон НЗ pSer28
2,2
CASK LDM2
2,2
Центрин
2,2
ТОМ22
2,1
Синтаза оксида азота эндотелиальная eNOS
2,1
Протеинкиназа Ва
2,1
Ламинин
2,1
Миозина й> ядерный
2,1
Каспаза 7
2,1
MAP Киназа 2 ERK2
2,1
KIF17
2,1
МеСР2
2,0
Рецептор фактора роста нервов р75
2,0
Киназа легких цепей миозина
2,0
cRaf pSer621
2,0
GRP78 BiP
2,0
сМус
2,0
Rafl
2,0
MTA2MTA1L
2,0
Sir2
2,0
ATF2pThr69 71
2,0
Протеинкиназа С
2,0
Протеинкиназа Cb-2
2,0
Для того чтобы подтвердить ранее наблюдавшиеся апоптозные белки, и чтобы расширить оценку по большому числу про-апоптозных и анти-апоптозных белков, были выбраны два метода исследования, по которым можно скринировать большое семейство потенциально задествованных белков.
Во-первых, микрочип с антителами (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) был использован для скрининга с использованием 700 белковых антител для определения изменений в уровнях концентраций белков в SK-MEL-28 клетках, обработанных 24 часа с 50 мкМ Q10.
Из экспериментов с антителами, на SKMEL-28 с Q10 (24 ч), были идентифицированы следующие белки с измененными уровнями: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Коннексин 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCbl. Главное заключение, выведенное из этого первичного исследования, состояло в том, что на ожидаемые пре-апоптозные белки было оказано влияние.
Исследования на микрочипах с антителами на SK-MEL-28
Микрочип с антителами (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma) был использован для скрининга с использованием 700 белковых антител для определения изменений в уровнях концентраций белков в SK-MEL-28 клетках, обработанных 24 ч с 50 мкМ Q10.
Таблица 20. Изменения уровней белка в SKMEL-28, обработанных 50 мкМ Q10
Название
Номер антител
SKMEL28
SKMEL28/
НЕКа
(Sigma)
Q10/
НЕКа
Q10/
SKMEL28
контроль
НЕКа
контроль
контроль
BclxL
В9429
2,46
1,04
1,83
PUMA ЬЬсЗ
Р4743
2,31
1,14
2,14
Bmf
В1559
2,23
1,12
2,11
Bmf
В1684
2,09
1,13
1,74
cJun рЗегбЗ
J2128
1,99
1,14
1,85
BLK
В8928
1,94
1,05
1,51
Из экспериментов с антителами, на SKMEL-28 с Q10 (24 ч), были идентифицированы следующие белки с измененными уровнями: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Коннексин 32, PUMA bbc3, BID, Par4, cCbl. Эти данные подтверждают, что уровни пре-апоптозных белков изменились после инкубации с повышенными уровнями экзогенно добавленного Q10.
Bcl-xl ("базальноклеточная лимфома сверхбольшая") является трансмембранной молекулой в митохондриях. Она включена в сигнальный путь трансдукции FAS-L и является одним из нескольких ан-тиапоптозных белков, которые являются членами белкового семейства Bcl-2. Она задействована в выживании раковых клеток. Однако известно, что альтернативный сплайсинг Bcl-х мРНК человка может приводить к по крайней мере двум различным видам Bcl-х мРНК, Bcl-xL и Bcl-xS. Преобладающий белковый продукт (233 аминокислоты) -более крупная Bcl-х мРНК, Bcl-xL, которая подавляет клеточную гибель вследствие удаления фактора роста (Boise et al., 1993. Cell 74, 597-608). Bcl-xS, а с другой стороны, ингибирует возможность Bcl-2 ингибировать клеточную гибель и делает клетки более восприимчивыми к апоптозной гибели клеток.
Таблица 21. Протеины с возросшими уровнями в SCC клетках после 24 ч обработки 100 мкМ Q10.
Название
Соотношение
PUMA ЬЬсЗ
3,81
HDAC7
3,21
BID
3,12
МТВР
3,00
р38 MAP Киназа
неактивированная
2,93
PKR
2,87
TRAIL
2,86
DR5
2,86
Cdk3
2,82
гЖадгерин
2,71
Рилин
2,68
р35 Cdk5 Регулятор
2,63
HDAC10
2,60
RAP1
2,59
PSF
2,56
сМус
2,55
Метилированного
гистона НЗ MeLys9
2,54
HDAC1
2,51
F1A
2,48
ROCK1
2,45
Bim
2,45
FXR2
2,44
DEDAF
2,44
DcRl
2,40
APRIL
2,40
PRMT1
2,36
Pyk2 pTyr580
2,34
Витронектин
2,33
Синаптоподин
2,32
Каспаза13
2,30
Синтаксин 8
2,29
DR6
2,29
BLK
2,28
ROCK2
2,28
Название
Соотношение
Sir2
2,25
DcR3
2,24
RbAp48 RbAp46
2,21
OGlcNAc Трансфераза
2,21
GRP78 BiP
2,20
Sin3A
2,20
P63
2,20
Пресенилин1
2,19
РМЛ
2,18
PAKlpThr212
2,17
HDAC8
2,16
HDAC6
2,15
Синтаза оксида азота
индуцируемая iNOS
2,15
Нейрофибромин
2,15
Синтаксин 6
2,13
Parkin
2,12
Radl7
2,11
Синтаза оксида азота
bNOS
2,10
TIS7
2,09
ОР18 Статмин
(статмин 1/онкобелок
18)
2,08
фосфо-Ь-Катенин
pSer45
2,07
НеурабинП
2,07
е Тубулин
2,07
РКВ pThi308
2,07
Орнитин
Декарбоксилаза
2,07
Р53 ВР1
2,06
Рук2
2,05
HDAC5
2,05
Коннексин 43
2,05
а1Синтрофин
2,04
MRP1
2,04
сегЬВ4
2,03
S Нитроцистеин
2,03
SGK
2,02
Rab5
2,01
Убиквитина С
терминальная
гадролаза L1
2,01
Миозина lb ядерный
2,00
Раг4 апоптозного
ответа простаты 4
2,00
Пример 8. Иммуноблоттинги.
Первый эксперимент, проведенный и оцененный с помощью иммуноблоттинга и 2-D гель-электрофорезов был осуществлен на линии клеток рака кожи SKMEL-28. В этой экспериментальной серии участвовали SK-MEL-28 клетки, обработанные в течение 3, 6, 12, и 24 ч 50 или 100 мкМ Q10.
Различные типы клеток были оценены путем иммуноблоттинга с антителами к Bcl-xL (фиг. 14), антителами к Виментину (фиг. 15), серией антител к функции митохондриального окислительного фосфорилирования (фиг. 16-21) и с серией антител, связанных с целостностью митохондриальной мембраны (фиг. 22-27). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что некоторые из исследуемых белков в результате обработки клеток Q10 показали повышающую или понижающую регуляцию.
Пример 9. Связанные с диабетом гены, идентифицированные как модулированные по уровням мРНК вследствие обработки клеток рака поджелудочной железы (РаСа2) 100 мкМ Q10.
Диабетные анализы были применены для образцов, обработанных 100мкМ Q10, в различное время после обработки. Эксперименты были проведены практически так же, как описано выше. Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в табл. 23 ниже. Результаты показывают, что обработка Q10 модулировала следующие гены: АВСС8, ACLY, ADRB3, CCL5, СЕАСАМ1, CEBRA, FOXG1, FOXP3, G6PD, GLP1R, GPD1, HNF4A, ICAM1, IGFBP5, INPPL1, IRS2, MAPK14, МЕ1, NFKB1, PARP1, PIK3C2B, PIK3CD, PPARGC1B, PRKAG2, PTPN1, PYGL, SLC2A4, SNAP25, HNF1B, TNRFSF1A, TRIB3, VAPA, VEGFA, IL4R и IL6.
Пример 10. Связанные с ангиогенезом гены, идентифицированные как модулированные по уровням мРНК вследствие обработки клеток рака поджелудочной железы (РаСа2) 100 мкМ Q10.
Ангиогенезные анализы были применены для образцов, обработанных 100мкМ Q10, в различное время после обработки. Эксперименты были проведены практически так же, как описано выше. Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в таблице 24 ниже. Результаты показывают, что обработка Q10 модулировала следующие гены: AKT1, ANGPTL4, ANGPEP, CCL2, CDH4, CXCL1, EDG1, EFNA3, EFNB2, EGF, FGF1, ID3, IL1B, IL8, KDR, NRP1, РЕСАМ1, PROK2, SERPINF1, SPHK1, STAB1, TGFB1, VEGFA и VEGFB.
Таблица 24. Список генов, связанных с ангиогенезом, экспрессия которых регулируется 100 мкМ Q10 и возможные функции которых в клетке повышающе регулируются (серый) и понижающе регулируются (белый)
Ген
Функция гена.
ANGPTL4
антиангиогенез, негативный регулятор апоптозов, метаболизм липидов.
CDH5
Развитие кровяных сосудов, клеточная адгезия, негативный регулятор клеточной пролиферации.
FGF1
клеточная адгезия, клеточная пролиферация.
АКТ1
Процесс метаболизма углеводов, процесс биосинтеза гликогена, процесс метаболизма глюкозы, путь сигналинга рецептора инсулина, активация про-апоптозных генных продуктов, апоптозные изменения митохондрий
ANPEP
протеолизиз, развитие многоклеточности, клеточная дифференциация
CCL2
хемотаксис, анти-апоптоз, JAK-STAT каскад, морфогенез органов, репликация вирусного генома
CXCL1
хемотаксис, воспалительная реакция, иммунный ответ, негативная регуляция клеточной пролиферации, организация и биогенез актинового цитоскелета
EDG1
позитивная регуляция клеточной пролиферации, трансмиссия нервного импульса, регуляция клеточной адгезии, дифференцировка нейронов, позитивная регуляция миграции клеток, позитивная регуляция Ras
EFNB2
клетка-клетка сигналинг, регулируется VEGFA.
EGF
Активация активности МАРКК, позитивная регуляция митозов, ДНК репликация
ILffi
Ответ на глюкокортикоидную стимуляцию, апоптозы, сигнальная трансдукция, клетка-клетка сигналинг, негативная регуляция клеточной пролиферации
IL8
Задержка клеточного цикла
KDR
VEGF путь, регулируется АКТ.
NRP1
клеточная адгезия, сигнальная трансдукция, клетка-клетка сигналинг, клеточная пролиферация, регулируется VEGFA
PECAM1
Клеточная адгезия, регулируемая TNF.
PR0K2
Активация МАРК, анти-апоптоз, клеточная пролиферация,
регулирует АКТ,
SPHK1
анти-апоптоз, клеточная пролиферация, регулирует митозы, миграцию клеток.
STAB1
Воспалительная реакция, клеточная адгезия, рецептор-опосредованный эндоцитоз, клетка-клетка сигналинг, негативная регуляция ангиогенеза, защитная реакция на бактерии
VEGFA
анти-апоптоз, регулирует TNF, регулируется HIF1.
Пример 11. Связанные с апоптозом гены, идентифицированные как модулированные по уровням мРНК вследствие обработки клеток рака поджелудочной железы (РаСа2) 100 мкМ Q10.
Апоптозные анализы были применены для образцов, обработанных 100мкМ Q10, в различное время после обработки. Эксперименты были проведены практически так же, как описано выше. Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в таблице 25 ниже. Результаты показывают, что обработка Q10 модулировала следующие гены: ABL1, АКТ1, Bcl2L1, BclAF1, CASP1, CASP2, CASP6, CIDEA, FADD, LTA, TNF, TNFSF10A и TNFSF10.
Пример 12. ПЦР диабетический анализ на клетках рака печени (HepG2).
HepG2 (рака печени) клетки были обработаны или раствором-носителем в течение 24 ч, или 100 мкМ Q10 в течение различного времени. Обработка была проведена на 1х105 клеток на лунку, после чего следовала процедура, использованная для РаСа2 клеток (выше, примеры 9-11). Однако общее количество РНК, выделенной из этих образцов, было ниже ожидаемого. Обратная транскриптаза нормально работает при использовании 1 мкг общей РНК (определено подсчетом на 260 нм). Максимальный объем, который мог быть использован для обратной транкриптазы, составляет 8 мкл. Поскольку концентрация РНК была низкой, в RT-ПЦР анализах использовались образцы, обработанные раствором-носителем и Q10 в течение 16 и 48 ч с использованием 0,44 мкг РНК. Был проведен первичный анализ тенденций и паттернов в регуляции генов HepG2 обработкой 100 мкМ Q10, как представлено в таблице 26 ниже. Результаты показали, что каждый из генов PPARGC1A, PRKAA1 и SNAP25 показал отрицательную регуляцию на 16 часах после обработки (примерно в 20 раз, 6 раз и 5 раз, соответственно). На 48 часах после обработки PPARGC1A и PRKAA1 показали нормальное состояние или слабую повышающую регуляцию, тогда как SNAP25 показал понижающую регуляцию примерно в 2 раза.
Таблица 26. Список генов, регулируемых в диабетическом анализе, где HepG2 клетки обработаны 100 мкМ Q10
Ген
Название гена
Функция гена.
PPARGC1A
Рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом гамма, коактиватор 1 альфа
Участвует в гибели клеток, пролиферации, клеточном дыхании и трансмембранном потенциале.
PRKAA1
протеинкиназа, АМР-активируемый, альфа 1 каталитическая субъединица
Регулирует ТР53 и участвует в апоптозах, регулирует гликолиз, регулирует активность метаболитических ферментов.
SNAP25
Синаптосомально-ассоциированный белок, 25кДа
Играет роль в транспорте, встраивании, экзоцитозе и высвобождении молекул.
Пример 13. ПЦР ангиогенезный анализ на клетках рака печени (HepG2).
HepG2 (рака печени) клетки были обработаны или раствором-носителем в течение 24 ч, или 100 мкМ Q10 в течение различного времени. Обработка была проведена на 1х105 клеток на лунку, после чего следовала процедура, использованная для РаСа2 клеток (выше, примеры 9-11). Однако общее количество РНК, выделенной из этих образцов, было ниже ожидаемого. Обратная транскриптаза нормально работает при использовании 1 мкг общей РНК (определено подсчетом на 260 нм). Максимальный объем, который мог быть использован для обратной транкриптазы, составляет 8 мкл. Поскольку концентрация РНК была низкой, в RT-ПЦР анализах использовались образцы, обработанные раствором-носителем и Q10 в течение 16 и 48 ч с использованием 0,44 мкг РНК. Был проведен первичный анализ тенденций и паттернов в регуляции генов HepG2 обработкой 100 мкМ Q10, как представлено в таблице 27 ниже. Результаты показали, что каждый из генов ANGPTL3, ANGPTL4, CXCL1, CXCL3, CXCL5, ENG, MMP2 и TIMP3 показал повышающую регуляцию на 16 часах после обработки (примерно в 5.5, 3, 3, 3.2, 3, 3, 1 и 6.5 раз, 6 раз и 5 раз соответственно). ID3 показал понижающую регуляцию на 16 часах после обработки Q10, примерно в 5 раз по сравнению с контролем. На 48 ч после обработки ANGPTL3, CXCL1, CXCL3, ENG и TIMP3 еще показывали повышающую регуляцию (примерно в 3.5, 1.5, 3.175, 2 и 3 раза, соответственно, по сравнению с контролем), тогда как ANGPTL4, CXCL5, ID3 и ММР2 показывали понижающую регуляцию примерно в 1, 1, 2 и 18 раз, соответственно, по сравнению с контролем.
Таблица 27. Список генов, регулируемых в ангиогенезном анализе, где HepG2 клетки
обработаны 100 мкМ Q10
Ген
Название гена
Функция гена
ANGFTL3
ангаопоэтин-подобный 3
Преимущественно экспрессируется в печени, роль в клеточной миграции и адгезии, регулирует метаболизм жирных кислот и глицерина.
ANGPTL4
ангиопозтин-подобный 4
Регулируется PPARG, ингибитор апоптозов в эндотелиоцитах сосудистой стенки, играет роль в метаболизме липидов и глюкозы и чувствительности к инсулину
CXCL1
хемокин (С-Х-С motif) лиганд 1 (меланомы роста стимуляция активности, альфа)
Роль в клеточной пролиферации и миграции
CXCL3
хемокин (С-Х-С motif) лиганд3
Активация хемокинов, активация звездчатых клеток печени, миграция, пролиферация.
CXCL5
хемокин (С-Х-С motif) лиганд 5
Продукция вместе с IL8 при стимуляции IL1 или TNFA. Играет роль в хемотаксисе, миграции, глюлиферации.
ENG
Эндоглин
Связывание с TGFBR и участие в миграции, пролиферации, прикреплении и инвазивности
ГОЗ
Ингибитор ДНК связывающегося 3,
Регулирует ММР2, регулируется TGFB1, витамином D3, ретиноевой кислотой,
доминантного негативного helix-loop-helix белка
VEGFA, участвует в апоптозах, пролиферации, дифференцировке, миграции.
ММР2
матрикса металлопептидаза 2 (желатиназа А, 72кДа желатиназа, 72кДа тип ГУ коллагеназа)
Активация звездчатых клеток печени, HIF" сигналинг, связывание с TIMP3, участие в образовании опухолей, апоптозах, пролиферации, инвазионное(tm), миграции и хемотаксисе.
TIMP3
TIMP металлопептидаз ингибитор 3
Регулирует ММР2, 1САМ1. Регулируется TGFB, EGF, TNF, FGF и ТР53. Участвует в апоптозах, клеточной адгезии и злокачественном перерождении.
Белки, известные своим участием в процессе ангиогенеза, были компонентами RT-ПЦР анализа. Ангиогенез является критически важным процессом, благодаря которому раковые клетки становятся злокачественными. Некоторые из этих белков также вовлечены в диабет.
ANGPTL3 и ANGPTL4. В литературе, имеющей отношение к ANGPTL3, этот белок связывается с регуляцией метаболизма липидов. В частности, из литературы (Li, С. Curr Opin Lipidol 2006 Apr;17(2):152-6) известно, что и ангиопоэтины, и ангиопоэтин подобные белки имеют сходные структуры доменов. ANGPTL3 и 4 единственные два члена этого суперсемейства, которые ингибируют активность липопротеинлипаз. Однако ANGPTL3 и 4 по-разному регулируются на многих уровнях, что подтверждается тем, что in vivo их функции не избыточны. ANGPTL3 и 4 протеолетически превращаются в две половины и по-разному регулируются ядерными рецепторами. Трансгенная сверхэкспрессия ANGPTL4, так же как нокаут ANGPTL3 или 4 демонстрируют, что эти два белка играют важную роль в метаболизме липопротеинов: образующийся в печени ANGPTL3 ингибирует липопротенилипазную активность преимущественно во время пищеварения, тогда как ANGPTL4 играет важную роль и во время пищеварения, и в промежутках между пищеварением. Кроме того, ANGPTL4 регулирует тканес-пецифичную доставку липопротеин-производных жирных кислот. ANGPTL4 таким образом является эндокринным или аутокринным/паракринным ингибитором липопротеинлипаз, в зависимости от места экспрессии.
Липопротеинлипаза является ферментом, который гидролизует липиды в липопротеинах, таких как хиломикроны и липопротеины с очень низкой плотностью (VLDL), в три жирные кислоты и одну молекулу глицерина. Липопротеинлипазная активность в данных тканях является лимитирующей скорость стадией для усваивания триглицерид-производной жирной кислоты. Дисбаланс в разделении жирных кислот имеет значительные метаболические последствия. Показано, что высокожировые диеты приводят к тканеспецифичной сверхэкспрессии LPL, которая задействована в тканеспецифичной резистентности к инсулину и последующем развитии сахарного диабета типа 2.
Результаты этого примера показывают, что Q10 модулирует белки, участвующие в метаболизме липидов, что подтверждает важность дальнейших исследований ANGPTL3/ANGPTL4 и связанных с ними обменных путей. Например, ANGPTL3/ANGPTL4 играют определенную роль в следующих путях: Akt, холестерин, жирные кислоты, HDL-холестерин, HNF1A, ITGA5, ITGA5, ITGAV, ITG83, L-трилодотинонин, LIPG, LPL, Mapk, Nrth, NR1H3, PPARD, PTK2, RXRA, триацилглерол и 9-цис-ретиноевая кислота.
Пример 14. ПЦР анализ на клетках рака печени (HEPG2).
Апоптозные анализы были применены для образцов, обработанных 100мкМ Q10 в течение 16 и 48 ч, как описано выше. Однако анализ для 48 ч был проведен с использованием в качестве фулорофора FAM, а не SYBR. И FAM, и SYBR флуоресцируют на одной длине волны.
Различные гены, которые, как было обнаружено, были модулированы обработкой Q10, приведены в таблице 28 ниже. Результаты показывают, что CASP9 показала повышающую регуляцию на 16 ч после обработки Q10, примерно в 61 раз по сравнению с контролем, тогда как BAG1 и TNFRSF1A показали понижающую регуляцию на 16 часах после обработки примерно в 6 и 4 раза, соответственно, по сравнению с контролем. На 48 ч после обработки CASP9, BAG1 и TNFRSF1A показали повышаюущую регуляцию примерно в 55, 1 1 раза, соответственно, по сравнению с контролем.
Таблица 28. Список генов, регулируемых в апоптозном анализе, где HepG2 клетки обработаны
Пример 15. Определение способности эпи-переключателя лечить метаболическое расстройство.
Для того чтобы определить, способен ли выбранный Эпи-переключатель, например, CoQ10, лечить метаболическое нарушение, например, диабет, были проведены анализы на основе клеток, в которых мониторилось возрастание инсулин-стимулированного потребления глюкозы. В частности, дифференцированные мышиные адипоциты использовались для идентификации агентов, которые обладают способностью увеличивать потребление глюкозы после стимуляции инсулином, как определялось путем подсчета сцинтилляции глюкозы с радиоактивной меткой (используя, например, Perkin Elmer 1450
Microbeta JET reader). Эти анализы проводились следующим образом. Материалы и методы. Среда "Prees".
Полная среда, также называемая средой "Prees", приготавливалась следующим образом. В модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (DMEM) добавлялся L-глутамин, пенициллин-G и стрептомицин (пен/стреп), и инактивированная высокой температурой эмбриональная бычья сыворотка (FBS) (температура инактивации составляла 65°С в течение 30 мин). Поскольку сыворотка может действовать на рост, адгезию и дифференцировку клеток, любая новая партия сыворотки вначале тестировалась перед использованием. Среда приводилась в равновесие в инкубаторе (5% СО2), пока не устанавливалось подходящего значения рН (около 7), что показывалось красным/оранжевым цветом индикаторного красителя. Если среда становилась розовой (что показывает высокий рН), мы отказывались от такой среды, поскольку эти условия могут повлиять на клетки и денатурировать инсулин, ипользуе-мый в дифференцировочной среде-1 (ДС1) и дифференцировочной среде-2 (ДС2).
Дифференцировочные среды.
Дифференцировочная среда-1 (ДС1) приготавливалась путем добавления к DMEM 10% FBS, L-глутамина, пен/стреп, IBMX (375 .мкЕД), инсулина (120 нМ), и дексаметазона (188 нМ). Дифференци-ровочная среда-2 (ДС2) приготавливалась путем добавления к DMEM 10% FBS, L-глутамина, пен/стреп и инсулина (120 нМ).
Приготовление желатинизированных планшетов.
Планшеты клеточной культуры желатинизировались следующим образом. Желатин (1% (мас./об.) в дистиллированной воде) был автоклавирован и хранился при комнатной температуре. Дно каждой лунки с культурой клеток было покрыто равномерно желатиновым раствором, так, чтобы не образовывались комки. Этот раствор был удален так, чтобы оставалась тонкая пленка желатина. Эти планшеты оставлялись сушиться в вытяжном шкафу. Планшеты затем промывались PBS, после чего 0,5% раствор глутарового альдегида (глутаральдегид в дистиллированной воде) добавлялся с лункам с клеточной культурой. Через десять минут лунки дважды промывались DMEM, содержащим пен-стреп. Каждый этап промывки должен был составлять не менее пять минут.
Клеточная культура.
3T3-L1 преадипоцитные клетки пересаживались каждые 2-3 дня или после достижения конфлу-энтности около 60%. Чрезмерная конфлуэнтность может повлиять на способность этих клеток дифференцироваться в адипоциты.
Другие реагенты.
D-^-nnoMm ("cold" глюкоза, без радиоактивной метки) добавлялась к смеси DPBS до конечной концентрации 10 мМ.
Лизирующий буфер, смесь основания (например, гидроксида натрия в конечной концентрации 0.5N) и детергента (напр, сульфат додецила натрия (SDS), разведенного до конечной концентрации 0,1% (масса/объем)) приготовлялся каждый раз свежий (за один или два часа до использования). Пере использованием лизирующий буфер нагревался до температуры, превышающей комнатную температуру на период примерно 30 мин, чтобы избежать осаждения буфера.
Определение потребления глюкозы.
Клетки преадипоциты 3T3-L1 были помещены в планшеты с плотностью примерно 5000 клеток на лунку (в черные NUNC 96 луночные планшеты). Эти клетки дифференцировались в адипоциты в два различных этапа. Вначале клетки культивировались в дифференцированной среде-1 (DM1) (день 1 дифференцировки адипоцитов) в течение периода двух-трех дней. DM1 предотвращает пролиферацию и вызывает экспрессию адипоцит-специфичных генов. Клетки затем культивировались в дифференцированной среде-2 (DM2) от 3 до 4 дней, после чего культуральная среда замещалась свежей DM2. Анализ потребления глюкозы проводился на 9-15 дней дифференцировки. За два дня до эксперимента (на 7-13 день дифференцировки), ДС2 удалялась и замещалась свежей средой "Prees". Исследуемые соединения добавлялись в это время, так чтобы инкубационный период составлял примерно 48 ч. В день эксперимента клетки (теперь на 9-15 день дифференцировки) выдерживались три часа в DPBS, сульфате магния (0,8 мМ) и Hepes (10 мМ) при рН около 7. После этого инкубационного периода к адипоци-там добавлялся свежий DPBS-одержащий инсулин (10 нМ). Свежий DPBS без инсулина добавлялся к клеткам, служившим негативным контролем. После инкубационного периода в течение 25 мин при 37°С, радиоактивная глюкоза (меченая 14С, в конечной концентрации 0,04 мМ, около 0,26 мкКи 14С-глюкозы на каждую лунку) добавлялась к среде на период 15 мин при комнатной температуре. Среда затем удалялась и клетки тщательно промывались и лизировались. После лизиса клетки формировали маленькую мутную массу, находимую на дне лунки, 10% ледяная уксусная кислота добавлялась к каждой лунке для нейтрализации реакции лизиса. Затем к лункам добавлялась сцинтиллирующая жидкость и включение глюкозы определялось путем подсчета радиоактивности в каждой лунке с использованием MicroBeta планшетного ридера.
С использованием вышеописанного экспериментального протокола эпи-переключатель иденти
фицировался как способный лечить метаболическое нарушение, например диабет, где эпи-переключатель увеличивает, повышает или усиливает инсулин-стимулируемое потребление глюкозы в клетках in vitro.
Пример 16. Идентификация МВМ, связанной с метаболическим расстройством.
Для того чтобы оценить перспективную молекулу (например, фактор влияния) как потенциальную МВМ, выбранная перспективная МВМ экзогенно добавлялась к нескольким клеточным линиям, включая как больные (раковые) линии клеток, так и линии нормальных контрольных клеток, и оценивались изменения, вызыванные в профиле клеточного микроокружения для каждой клеточной линии. Изменения в клеточной морфологии, физиологии и/или составе клеток, включая, например, мРНК и уровни белков, оценивались и сравнивались для больных клеток по сравнению с нормальными клетками.
Изменения в клеточной морфологии/физиологии оценивались по определению чувствительности и апоптозного ответа клеток к перспективной МВМ. Эти эксперименты проводились, как детально описано в примере 3. Вкратце, группа клеточных линий, содержавшая по крайней мере одну контрольную линию клеток и по крайней мере одну линию раковых клеток подвергалась воздействию различных концентраций перспективной МВМ. Чувствительность клеточных линий к потенциальной МВМ оценивалась по мониторингу клеточного выживания в разное время и в диапазоне применявшихся концентраций. Апоптозный ответ клеточных линий к потенциальной МВМ оценивался с использованием, например, Nexin реагента в комбинации с методом проточной цитометрии. Nexin реагент содержит комбинацию двух красителей, 7AAD и Annexin-V-PE, и позволяет оценить популяцию клеток на раннем и позднем апоптозах. Можно использовать дополнительный апоптозный анализ, который оценивает однонитевые ДНК, с использованием, например, Apostrand(tm) ELISA метода. Чувствительность и апоптозный ответ больных и контрольных клеточных линий оценивались и сравнивались. Молекула, которая демонстрирует различную цитотоксичность и/или по-разному вызывает апоптозный ответ в больных клетках по сравнению с нормальными клетками, идентифицировалась как МВМ.
Оценивались изменения в составе клеток после воздействия перспективной МВМ. Изменения в экспрессии генов на уровне мРНК анализировались с использованием метода ПЦР-анализа в режиме реального времени. Эти эксперименты проведены, как описано детально в примерах 6 и 9-13. Вкратце, перспективная МВМ экзогенно добавлялась к одной или более клеточным линиям, включая, например, линию больных клеток и линию нормальных контрольных клеток, и мРНК выделялась из клеток через различное время после воздействия. Уровень MPHKS ДЛЯ генов, участвующих в специфичных путях, оценивался с использованием целевых анализов, включая, например, анализы, специфичные для апоп-тозов, окислительного стресса и антиоксидантной защиты, ангиогенеза, теплового шока или диабета. Гены, у которых транскрипция их мРНК менялась в два раза или больше, идентифицировались и оценивались. Молекула, которая вызывает изменения в уровнях мРНК в клетках и/или вызывает различные изменения в уровне одной или более мРНК в больных клетках по сравнению с нормальными клетками, идентифицировалась как МВМ.
В дополнительных экспериментах, изменения в экспрессии генов по уровню белка анализировались с использованием метода антител на микрочипах, 2-мерного гель электрофореза, за которым следовала идентификация белка с использованием масс-спектрометрии, и иммуноблоттинга. Эти эксперименты проведены, как описано в примерах 7, 4 и 8, соответственно. Вкратце, перспективная МВМ экзо-генно добавлялась к одной или более клеточным линиям, включая, например, линию больных клеток и линию нормальных контрольных клеток, и растворенный белок экстрагировался из клеток в различное время, например, на 6 ч или 24 ч после обработки. Изменения, вызыванные в уровнях белков перспе-тивной МВМ, оценивались с использованием микрочипов с антителами, содержащих антитела к около 700 белкам, широкому диапазону типов белков и потенциальным маркерам обменных путей. Дальнейший дополнительный протеомический анализ мог быть проведен с использованием мерного (2-D) гель-электрофореза в совокупности с методом масс-спектрометрии. Перспективная МВМ экзогенно добавлялась к одной или более клеточным линиям, включая, например, линию больных клеток и линию нормальных контрольных клеток, и клеточный осадок лизировался и подвергался 2-D гель-электрофорезу. Гели анализировались для идентификации изменений в уровнях белков в обработанных образцах по сравнению с контрольными, необработанными образцами. Гели анализировались для идентификации изменений на временных точках, для того чтобы определить возросшие уровни, снизившиеся уровни или посттрансляционную модификацию. Точки, показавшие статистически достоверные изменения, извлекались и подвергались белковой идентификации расщеплением пепсином и ха-рактеризации масс-спектрометрией. Проводился поиск охарактеризованных пептидов в белковой базе данных, например, с программными анализами Mascot и MSRAT для идентификации белков. В дополнение к вышеупомянутым 2-D гель анализам и экспериментам с антителами на микрочипах, потенциальные изменения в уровнях специфических белков, вызыванные перспективной МВМ, могли быть оценены путем иммуноблоттинга. Во всех протеомических экспериментах белки с возросшими или снизившимися уровнями в различных клеточных линиях идентифицировались и оценивались. Молекула, которая вызывает изменения в уровнях белков в клетках и/или вызывает различные изменения в
уровне одного или более белков в больных клетках по сравнению с нормальными клетками, идентифицируется как МВМ.
Гены, относительно которых было обнаружено, что они модулируются воздействием перспективной МВМ из вышеупомянутых экспериментов, становились объектами клеточных и биохимических путей анализов и в соответствии с ними могли быть разделены на несколько клеточных путей метаболизма, включая апоптозы, биологию рака и рост клеток, гликолиз и метаболизм, молекулярный транспорт и клеточный сигналинг.
Проводились эксперименты для подтверждения вхождения перспективной МВМ в клетки, для определения того, локализовалась ли перспективная МВМ внутри клетки, и для определения уровня и формы перспективной МВМ, присутствующей в клетке. Эксперименты проводились, например, как описано детально в примере 5. Например, для определения уровня и формы перспективной МВМ, присутствующей в митохондриях, получались и анализировались богатые митохондриями препараты из клеток, обработанных перспективной МВМ. Тем самым можно подтвердить, что уровень перспективной МВМ, присутствующей в митохондриях, возрастает время- и дозозависимым образом при добавлении экзогенной перспективной МВМ. Кроме того, изменения уровней белков из богатых митохон-риями образцов анализировались с использованием 2-D гель-электрофореза, и белок идентифицировался с помощью масс-спектроскопии, как описывалось выше для белковых образцов из целых клеток. Перспективные МВМ, для которых обнаружено, что они проникают в клетку и присутствуют в повышенной концентрации, например, в митохондриях, идентифицировались как МВМ. Уровни перспективной МВМ в клетках, или, например, специфически в митохондриях, определявшиеся на разных временных точках, могут коррелировать с другими наблюдаемыми клеточными изменениями, что подтверждается, например, модуляцией мРНК и уровней белка для определенных белков.
Перспективные МВМ, для которых было установлено, что они вызывают изменения в составе клеток, например, вызывают изменения экспрессии генов на уровне мРНК или белков, идентифицируются как МВМ. Перспективные МВМ для которых было установлено, что они вызывают разные изменения в морфологии, физиологии или составе клеток (например, разные изменения экспрессии генов на уровне мРНК или белков), в болезненном состоянии (например, диабет или ожирение) по сравнению с нормальными клетками идентифицируются как МВМ и, в особенности, как имеющие многоаспектный характер. Перспективные МВМ, относительно которых было обнаружено, что они способны проникать в клетки, идентифицировались как МВМ и, в особенности, как имеющие многоаспектный характер, поскольку тем самым перспективные МВМ демонстрировали в добавление к терапевтическому действию также и действие молекулы-переносчика.
Пример 17. Идентификация CoQ10 как эпи-переключателя, связанного с метаболическим расстройством.
Группа линий клеток кожи, включающая контрольные клеточные линии (в первую очередь культуру кератиноцитов и меланоцитов) и несколько линий раковых клеток кожи (SK-MEL-28, неместаста-зирующая меланома кожи; SK-MEL-2, метастазирующая меланома кожи; или rSCC, плоскоклеточная карцинома; РаСа2, клеточная линия рака поджелудочной железы; или HEP-G2, клеточная линия рака печени) были подвергнуты воздействию различных концентраций коэнзима Q10. Линии раковых клеток показали дозозависимый ответ, отличавшийся по сравнению с контрольными линиями клеток, где индукция апоптозов и клеточная гибель имели место только в раковых клетках. Примеры экспериментов описаны детально, например, в примере 3.
Были проведены анализы для оценки изменений в мРНК и уровнях белка после воздействия CoQ10 в ранее идентифицированных клетках. Изменения экспрессии мРНК анализировались с использованием ПЦР в режиме реального времени на микрочипах, специфичных для: апоптозов, оксисли-тельного стресса и аксидантов, ангиогенеза и диабета. Изменения экспрессии белка анализировались с использованием анализа антител на микрочипах и иммуноблоттинга. Результаты этих анализов демонстрировали, в клеточных линиях в результате добавления коэнзима Q10 наблюдались значительные изменения экспрессии генов, на уровне как мРНК, так и белков. В результате обработки CoQ10 наблюдалась модуляция многочисленных генов, про которые было известно, что они связаны с процессами клеточного метаболизма или участвуют в них. Например, было обнаружено, что экспрессия белка ядерного рецептора HNF4A модулируется в клетках после обработки Q10. Экспрессия трансальдолазы 1 (TAL) также модулировалась в клетках, обработанных Q10. TAL балансирует уровни НАДФН и промежуточных продуктов реактивного кислорода, тем самым регулируя трансмембранный потенциал митохондрий, который критически важен для синтеза АТФ и выживания клеток. Имеющие особое значение для метаболических нарушений, многие гены, известные как связанные, например, с диабетом, были идентифицированы как регулируемые Q10. Примеры экспериментов описаны здесь детально, например, в примерах 4, 6,7, 8 и 9.
Q10 является необходимым кофактором для возбуждения процессов фосфорилирования в митохондриях для вырабатывания энергии. Уровень коэнзима Q10, а также формы CoQ10, присутствующей в митохондриях, был определен путем анализа богатых митохондриями препаратов из клеток, обработанных CoQ10. Подтвердилось, что уровень коэнзима Q10, присутствующего в митохондриях, возрас
тает время- и дозозависимым образом при добавлении экзогенного Q10. Время обработки коррелировало с множеством клеточных изменений, наблюдаемых в модуляции уровней мРНК и белков для определенных белков, связанных с путями метаболизма и апоптоза. Примеры экспериментов описаны здесь детально, например, в примере 5.
Результаты, описанные здесь, идентифицируют эндогенную молекулу CoQ10 как эпи-переключатель. В особенности результаты идентифицируют CoQ10 как вызывающую переключение в метаболическом статусе и частичное восстановление функций митохондрий в клетках. Эти заключения основываются на следующей интерпретации данных, описанных здесь, и существующих на настоящее время представлений в соответствующей области.
Известно, что Q10 синтезируется, активно транспортируется, накапливается и используется во внутренней мембране митохондрий. Известно также, что Q10 - необходимый кофактор в процессах окислительного фосфорилирования в митохондриях, вырабатывающих энергию. Однако в большинстве раковых клеток энергия вырабатывается преимущественно в процессе гликолиза, следующего за ферментацией молочной кислоты в цитоплазме, а не после окисления пирувата в митохондриях, как у большинства нормальных клеток. Окислительное фосфорилирование включает транспорт электронов комплексами и цитохромом с. Апоптозы включают разрушение митохондрий, когда про-апоптозные факторы вызывают повышенную проницаемость внутренней мембраны митохондрий. Используя различные метаболические пути энергетического синтеза, раковые клетки способны ослаблять нормальную апоптозную реакцию на дефекты в клетке. Не имея намерения ограничиваться теорией, Заявители делают предположение, что Q10 функционирует, повышающе регулируя белки пути окислительного фосфорилировани, таким образом возвращая митохондриальную функцию назад к состоянию, при котором распознаются онкогенетические дефекты и запускается апоптоз. Таким образом Q10 действует как эпи-переключатель, переключающий метаболический статус клетки.
Пример 18. Идентификация эпи-переключателя, связанного с метаболическим заболеванием.
Группа линий клеток кожи, включающая контрольные клеточные линии (в первую очередь культуру кератиноцитов и меланоцитов) и несколько линий раковых клеток кожи (SK-MEL-28, неместаста-зирующая меланома кожи; SK-MEL-2, метастазирующая меланома кожи; или rSCC, плоскоклеточная карцинома; РаСа2, клеточная линия рака поджелудочной железы; или HEP-G2, клеточная линия рака печени) были подвергнуты воздействию различных концентраций перспективного эпи-переключателя. Изменения в клеточной морфологии/физиологии были оценены при исследовании чувствительности и апоптозного ответа клеток к перспективному эпи-переключателю. Эти эксперименты были проведены, как детально описано в примере 3. Вкратце, чувствительность клеточных линий к перспективному эпи-переключателю оценивалась путем мониторинга выживания клеток на различных временных точках и в диапазоне применяемых концентраций. Апоптозный ответ клеточных линий к перспективному эпи-переключателю оценивался с использованием, например, Nexin реагента в комбинации с методом проточной цитометрии. Nexin реагент содержит комбинацию двух красителей, 7AAD и Annexin-V-PE, и позволяет количественно определить популяцию клеток на ранних и поздних апоптозах. Дополнительное апоптозное исследование, в котором оцениваются однонитевые ДНК, может использовать, например, метод ApostrandTM ELISA. Чувствительность и апоптозный ответ больных и контрольных клеточных линий оценивались и сравнивались. Перспективные эпи-переключатели оценивались на основе их способности предпочтительно или выборочно ингибировать клеточный рост в раковых клетках по сравнению с нормальными или контрольными клетками. Перспективные эпи-переключатели в дальнейшем оценивались на основе их способности предпочтительно или выборочно вызывать апоптозы в раковых клетках по сравнению с нормальными или контрольными клетками.
Были проведены анализы для оценки изменений в уровнях мРНК и белков ранее идентифицированных клеток после обработки перспективным эпи-переключателем. Изменения уровней мРНК анализировались с использованием ПЦР в режиме реального времени на микрочипах. Эти эксперименты были проведены, как описано детально в примерах 6 и 9-13. Вкратце, мРНК выделялась из клеток через различное время после воздействия. Уровни мРНК для генов, участвующих в специфичных путях, оценивались с использованием целевых анализов, включая, например, анализы, специфичные для апопто-зов, окислительного стресса и антиоксидантной защиты, ангиогенеза, теплового шока или диабета. Гены, у которых транскрипция их мРНК менялась в два раза или больше, идентифицировались и оценивались.
Изменения в экспрессии белков анализируются с использованием анализов антител на микрочипах, 2-D гель-электрофорез анализов в совокупности с масс-спектроскопией, и анализов иммуноблот-тингом. Эти эксперименты проводились, как детально описано в примерах 7, 4 и 8, соответственно. Вкратце, растворимый белок выделялся из клеток на различных временных точках, например, 6 ч или 24 ч, после чего обрабатывался перспективным эпи-переключателем. Изменения, вызыванные в уровнях белков перспективным эпи-переключателем, оценивались с использованием микрочипа на антителах, содержащего антитела к примерно 700 белкам, широкому диапазону типов белков и потенциальным маркерам обменных путей. Дальнейшие дополнительные протеомичские анализы можно провести с использованием 2-мерного (2-D) гель-электрофореза в совокупности с методом масс-спектроскопии.
Перспективный эпи-переключатель экзогенно добавлялся с клеточным линиям и клеточный осадок лизировался и подвергался 2-D гель-электрофорезу. Гели анализировались для идентификации изменений в уровнях белков в обработанных образцах по сравнению с контрольными, необработанными образцами. Гели анализировались для идентификации изменений на разных временных точках обработки, для определения возросших уровней, снизившихся уровней или посттрансляционной модификации. Точки, показавшие статистически достоверные изменения, извлекались и подвергались белковой идентификации путем трипсинового расщепления и масс-спектроскопии. Охарактеризованные пептиды искались в белковой базе данных, например, с программами Mascot и MSRAT для идентификации белков. В добавление к предшествовавшим 2-D гель-анализам и экспериментам с антителами на микрочипах, потенциальные изменения уровней специфических белков, вызыванные возможной МВМ, могли быть оценены иммуноблоттингом. Во всех протеомических экспериментах белки с возросшими или снизившимися уровнями в различных клеточных линиях идентифицировались и оценивались.
Возможные эпи-переключатели оценивались на основе изменений, вызванных в экспрессии генов, в уровнях мРНК и/или белков, в клеточных линиях вследствие добавления возможного эпи-переклю-чателя. В частности, возможные эпи-переключатели оценивались на основе их способности модулировать гены, известные своей связью или включенностью в клеточные метаболические процессы. По особенной связи с метаболическими заболеваниями, возможные эпи-переключатели оценивались по их способности модулировать гены, известные своей связь, например, с диабетом или ожирением.
Уровень возможного эпи-переключателя, также как форма возможного эпи-переключателя, присутствующая в клетке или в определенной клеточной локации опеделялась с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области. Например, уровень возможного эпи-переключателя в митохондриях в зависимости от времени и дозы определялся путем анализа богатых митохондриями препаратов из клеток, обработанных возможным эпи-переключателем. Уровни возможного эпи-переключателя в митохондриях на разных временных точках можно было сравнить и определить их корреляцию с другими наблюдаемыми клеточными изменениями, такими как модуляция уровней мРНК и белков для специфичных белков, связанных с метаболизмом и путями апоптоза.
Перспективные эпи-переключатели, которые, как наблюдалось, вызывали переключение метаболического статуса в клетке на основании результатов, наблюдаемых в предыдущих экспериментах, идентифицируются как эпи-переключатели. Например, перспективный эпи-переключатель, который увеличивает, повышает или усиливает инсулин-стимулируемое потребление глюкозы в клетках, идентифицировался как эпи-переключатель.
Пример 19. Идентификация витамина D3 как эпи-переключателя.
Витамин D3, или 1а, 25-дигидроксивитамин D3 (также известный как кальцитриол) является метаболитом витамина D, который синтезируется из витамина в двухэтапном энзимном процессе. Витамин D3 взаимодействует со своим повсеместным ядерным рецептором витамина D (VDR), регулируя транскрипцию широкого спектра генов, участвующих в кальциевом и фосфатном гомеостазе, а также в делении и дифференцировке клеток. Сообщалось, что витамин D3 обладает антираковым действием во многочисленных модельных системах, включая плоскоклеточную карциному, аденокарциному простаты, рак яичников, молочной железы и легких (обзор Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700).
Сообщалось, что антираковые эффекты витамина D3 участвуют во многих механимах, включая остановку роста на G1 фазе клеточного цикла, апоптозы, дифференцировку опухолевых клеток, разрушение посредников фактора роста -сигналов выживания клеток, и ингибирование ангиогенезов и клеточной адгезии (обзор Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700). Например, сообщалось, уделяя особенное внимание апоптозам, что витамин D3 вызывает апоптозы, регулируя ключевые медиаторы апоптозов, такие как подавление экспрессии антиапоптозов, белки предвыживания BCL2 и BCL-XL, или вызывая экспрессию про-апоптозных белков (например, ВАХ, BAK и BAD) (Deeb et al. 2007). В другом примере сообщалось, уделяя особенное внимание ангиогенезу, что витамин D3 ингибирует пролиферацию некоторых эндотелиальных клеток, имеющих опухолевое происхождение, и ингбириру-ет экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), который вызывает ангиогенез в опухолях (обзор Masuda и Jones, 2006 Mol. Cancer Ther. 5(4): 797-8070). В другом примере сообщалось, уделяя особенное внимание остановке клеточного цикла, что витамин D3 вызывает транскрипцию гена циклин-зависимой киназы ингибитора p21WAFI/CIPI и вызывает синтез и/или стабилизацию циклин-зависимой киназы ингибитора р27KIPI белка, которые чрезвычайно важны для индукции остановки G1. (Deeb et al. 2007).
На основе предыдущих наблюдений витамин D3 идентифицировался как эпи-переключатель, т.е., обладающий способностью переключать метаболический статус клетки. Витамин D3 является эпи-переключателем благодаря своей способности вызывать апоптозы в клетках и, в особенности, на основании его способности по-разному подавлять клеточный рост и вызывать апоптозную реакцию в больных (раковых) клетках по сравнению с нормальными клетками (например, по-разному модулировать экспрессию белков, таких как BCL-2, BCL-XL, и ВАХ, включенных в апоптозы, в раковых клетках по сравнению с нормальными).
Пример 20. Анализ иммуноблоттингом клеток, обработанных коэнзимом Q10.
За последние пять десятилетий был накоплен громадный объем информации касательно эндогенных/экзогенных факторов, влияющих на специфические процессы, лежащие в основе злокачественной трансформации. Клиническая и базовая литература дает доказательства того, что изменения в структуре и функциях ДНК играют важную роль в инициации и развитии рака, определяя рак как генетическую болезнь. (Wooster, 2010; Haiman, 2010). В начале 1920-х Otto Warburg и другие исследователи, занимавшиеся характеристикой фундаментальных изменений в этиологии онкогенеза, описали два главных наблюдения (а) способность клеток транспортировать и утилизировать глюкозу при образовании АТФ в для образоваия энергии в присутствии кислорода - также известного как эффект Варбурга и (b) изменения в структуре и функции митохондрий - включая изменения в транспорте электронов, приводящие к уменьшению образования митохондриальной АТФ. Последние несколько лет в исследованиях возвращается представление о центральной роли клеточной биоэнергетики в этиологии рака, т.е. на взгляде на рак как на метаболическое нарушение.
Хотя исторически мутации в генах считаются отвечающими за изменения в генной экспрессии, накопились литературные данные в поддержку того, что эпигенетические процессы играют ключевую роль во влиянии на экспрессию генов в поддержании канцерогенеза. Это доказывается наблюдениями, что скорость мутаций большинства генов низкая и не может быть причиной множества мутаций, находимых в раковых клетках. Эпигенетические изменения регулируются метилированием и модификацией гистоновых хвостов, и те и дргуие по сути связаны с энергетическим (нутриентным) статусом клеток, так как им требуется доступность ко-факторов, например ацетил СоА требуется для гистонового аце-тилирования (ref). Биосинтез ацетил СоА зависит от гликолиза и цикла Кребса, прямо связанных со внутриклеточным энергетическим статусом для регуляции экспрессии и активности генов.
В нормальных клетках митохондриальное окислительное фосфорилирование производит значительное количество АТФ, соответствующее энергетическим нуждам для поддержания физиологической активности и поддержания жизни клетки. Следствием митохондриального вырабатывания энергии является образование химически активных кислородных радикалов (ROS), аберрантные продукты которых приводят к повреждению митохондрий (refs). Хорошо установлено, что постоянное образование ROS митохондриями приводит к кумулятивной аккумуляции генетических мутаций, феномену, который участвует в этиологии канцерогенеза. Подтверждено, что в раковых клетках снижается мито-хондриальное дыхание для минимизации образования ROS, и происходит переключение на гликолиз для поддержания образования энергии. Таким образом, постепенное переключение образования энергии с окислительного фосфорилирования на гликолиз было бы необходимым для клеток для поддержания образования энгергии, поддержания физиологических функций и могло быть связано с движением фенотипа нормальной клетки в сторону раковой клетки. Постепенное переключение клеточного энергетического (биоэнергетического) профиля в совокупности с накопившимися изменениями (мутациями) в митохондриальном геноме приводит к изменениям в клеточном метаболизме. Изменения в метаболическом профиле всей клетки вследствие перехода от митохондриального фосфорилирования к гликолизу соответствуют анормальной биоэнергетике, вызыванной метаболическоим профилем и более глубокими причинами, поддерживающими канрцерогенез. Целевое вмешательство с использованием эндогенных молекул для вызова клеточного метаболического переключения к условиям неканцерогенного нормального митохондриального окислительного фосфорилирования, связанного с клеточным биоэнергетическим статусом, представляет собой терапевтический критерий эффективности в лечении рака.
Коэнзим Q10 как МВМ, вызывающая эпи-метаболическое переключение.
Данные, представленные здесь, демонстрируют, что лечение нормальных и раковых клеток коэн-зимом Q10 связано с изменениями в экспрессии белков, которые регулируют ключевые биохимические точки в континууме гликолиз -митохондриальный окислительный стресс. Комбинация данных, описывающих оценку экспрессии белков иммуноблоттингом и степенями кислородного потребления демонстрирует, что в нормальных клетках нет значимых изменений в нормальных степенях гликолиза и ми-тохондриального дыхания вследствие воздействия коэнзима Q10. Таким образом, значения экспрессии белков и степени митохондриального дыхания в нормальных клеточных линиях, например HDFa (нормальные фибробласты взрослого человека), HASMC (нормальные гладкие мускульные клетки аорты человека), nFib (нормальные фибробласты) и HeKa (нормальные кератиоциты человека) можно рассматривать как отображающие базовый физиологический статус. Любые отклонения в экспрессии белков и степени митохондриального дыхания в линиях раковых клеток, например HepG2 (рак печени), РаСа-2 (рак поджелудочной железы), MCF7 (рак молочной железы), SK-MEL (меланома) и SCC-25 (плоскоклеточная карцинома), представляет изменение вследствие возникновения/прогрессирования болезни, в данном случае рака. Экспериментальные доказательства поддерживают гипотезу, что воздействие коэнзима Q10 на раковые клетки связано с клеточной патофизиологической реорганизацией, которая вспоминает о нормальных клетках. Именно, приведенные здесь данные демонстрируют, что воздействие коэнзима Q10 на раковые клетки связанос переключением в гликолитических путях и ми-тохондриалном окислительном фосфорилировании, отвечающем за индукцию глобальной реорганизации клеточной архитектуры к наблюдаемой в нормальных клетках.
В нормальных клетках, конец гликолитического производства связан с митохондриальным окислительным фосфорилированием (OXPHOS), т.е. генерацией пирувата из глюкозы через глюкозный путь для вхождения в цикл Кребса (также известный как цикл трикарбоксильной кислоты, ТСА, или цикл лимонной кислоты) для образования восстановленных эквивалентов для поддержания митохонд-риального OXPHOS для образования АТФ. Таким образом, в нормальных клетках экспрессия и функциональная ориентация генного продукта, участвующего в гликолизе, служит затравкой адекватной генерации пирувата и его вхождению в цикл Кребса. Дисрегулируемая экспрессия и функция Клюевых белков, участвующих в путях гликолиза и цикла Кребса в раковых клетках приводит к повышению гликолиза со значительным снижением митохондриальной функции. Воздействие на раковые клетки коэнзима Q10, эндогенной молекулы, которая селективно влияет на митохондриальную дыхательную цепь, влияет (нормализует) экспрессию белков путей гликолиза и цикла Кребса, содействуя биоэнергетическому переключению, так что образование энергии (т.е. генерация АТФ) восстанавливается в митохондриях.
Экспериментальная процедура Иммуноблоттинг. Эксперимент 1.
Клетками, использовавшимися для эксперимента, были HDFa и MCF-7 клетки, которые обрабатывались или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях, 50 мкМ и 100 мкМ, и собирались через 24 часа после обработки. Весь клеточный осадок сразу же ресуспендировался в 1 мл С7 буфера и переносился в меченые 15 мл тубы. Образцы затем подвергались обработке ультразвуком в холодной комнате на льду с использованием 6 ультразвуковых импульсов с шагом #14. Образцы центрифугировались короткое время на 2500 г после обработки ультразвуком и переносились в 2 мл пробирки. У каждого образца проверялось рН (рН должно быть 9,0) с использованием пены, остававшейся в 50 мл пробирке.
Алкилирование и восстановление проб осуществлялась для каждой пробы добавлением 10 мкл 1М акриламида, 25 мкл трибутилфосфена и инкубацией в течение 90 мин со прерывистым смешиванием. После инкубации 10 мкл 1М DTT добавлялось и пробирки центрифугировались при 20000 г и 20°С в течение 10 мин, и супернатант переносился в помеченные Amicon Ultra фильтры для центрифугирования с 10 k сечениями (Millipore catalog # UFC 801024). Образцы 2 раза центрифугировались по 15 минут на 2500 г. Проводимость оценивалась только для чапсов. Если проводимость проб была высокой, тогда 1 мл чапсов добавлялось и снова центрифугировалось на 2500 г, пока объем не снижался до 250 мкл. Если проводимость была 200 или менее, образцы центрифугировались на 5 мин интервалах при 2500 г пока объем супернатанта не становился между 150-100 мкл. Пробы супернатанта переносились в эппендорфы и делался анализ Брадфорда с использованием BSA как стандарта.
Пробы были обработаны по стандартному протоколу, как описано выше, и количество белка на каждую пробу определялось по анализу Брадфорда. Объемы проб, эквивалентные 10 мкг белка, были приготовлены, как показано ниже, с красителем Lamelli Loading (LDS) и MilliQ водой, и разгонялись в 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE геле (Invitrogen, cat # NP0323Box).
Гели разгонялись в течение 50 мин с использованием 1X MOPS буфера, с использованием NOVEX Xcell Surelock системы при 200 В. Гели затем переносились в течение 1 ч с использованием NOVEX Xcell Surelock протокола влажного переноса при 30 В. Блоты красились с Simply Blue Safestain от Invitrogen (LC6065).
IDH1 и АТФ Цитратлиазы уровни в HDFa и MCF-7 образцах.
После переноса каждый блот был помещен между 2 бумажными фильтрами Whatman и высушен в течение 15-20 мин. После сушки на блотах НВ карандашом были помечены дата, тип образца и номер блота (1 или 2). Молекулярный вес маркеров был очерчен карандашом с одной линией для голубого и двойной для цветного маркера. Блоты активировались метанолом 5 секунд, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый). Блот 1 был зондирован первичным антителом для IDH1 (Cell Signaling # 3997) в TBST с 5% BSA (разведение 1:1000) и блот 2 с кроличьим поликлональным антителом для АТФ цитрата лиазы в 5% BSA (Cell Signaling #4332) при разведении 1:1000 и инкубировался на ночь при 4 градусах С с перемешиванием. После ночной инкубации с первичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондированы вторичными антителами (антикроличьи; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубированы с ECF реагентом в течение 5 мин. и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Уровни актина в HDFa и MCF-7 образцах.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота были скани
рованы на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 секунд, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-Т при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондированы антителом к Актину в 5% BSA (Sigma Catalog # A5316, клон АС-74) при разведении 1:5000 в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами, блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондированы вторичными антителами (антимышиные; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 минут и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при
500 В.
Иммуноблоттинг. Эксперимент 2.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были SKMEL28, SCC-25, nFib и Heka, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях, 50 мкМ или 100 мкМ, и собраны после 3, 6 и/или 24 часов обработки. Пробы были обработаны и разогнаны в 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE геле, как описано выше. Гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Уровни IDH1 для 4 клеточных линий.
После переноса блот был высушен в течение 15-20 мин, активирован метанолом 5 с, промыт водой 5 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) Затем блот зондировался первичным антителом для IDH1 (Cell Signaling # 3997) в TBST с 5% BSA (разведение 1:1000) на ночь при 4 градусах С на шейкере. После ночной инкбации с первичными антителами блот промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и был зондирован вторичными антителами (антикроличьи; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами, блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
АТФ цитрат лиазы уровни в 4 различных клеточных линиях.
Изоцитрат дегидрогеназы блот был зачищен путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блот сканировался на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блот активировался метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый). Затем блот зондировался кроличьим поликлональным антителом к АТФ цитрат лиазе в 5% BSA (Cell Signaling #4332) при разведении 1:1000 на ночь при 4°С на шейкере. После ночой инкубации с первичными антителами к АТФ цитрат лиазе блот промывался 3 раза TBS-T ( Х-15'; 2Х 5' каждый) и был зондирован вторичными антителами (антикроличьи; 1:10,000 разведение) в течение 1 часа на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В. Уровни актина в 4 различных клеточных линиях.
АТФ цитрат лиазы блот был зачищен путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 минут инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блот сканировался на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блот активировался метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T ( Х-15'; 2Х 5' каждый) и зондировался антителом к Актину в 5% BSA (Sigma catalog # А5316, клон АС-74) 1:5000 разведение на 1 час при комнатной температуре на шейкере. После 1 часа инкубации с первичными антителами к Актину мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и были зондированы вторичными антителами (антимышиные; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Имммуноблоттинг. Эксперимент 3.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были HepG2, HASMC, и РАСА2 клетки, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 мкМ и 100 мкМ) и собраны через 48 ч после обработки. В этом эксперименте (иммуноблоттинг эксперимент 3) и во всех экспериментах, описанных ниже в этом примере (т.е. иммуноблоттинг эксперименты с 4 по 9), клетки
были дополнительно обработаны или 5 мМ глюкозой ("5G") или 22 мМ глюкозой ("22G"). Образцы, взятые из клеток, были обработаны и разогнаны в 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE геле, как описано выше. Гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
IDH1, АТФ цитрат лиазы и актина уровни в HASMC vs. PACA2 и HepG2.
Уровни IDH1, АТФ цитрат лиазы и актина были определены путем зондирования блотов первичными антителами к IDH1, АТФ цитрат лиазе и актину, в основном как описано выше. Иммуноблоттинг. Эксперимент 4.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были HepG2 клетки которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 мкМ и 100 мкМ) и собраны через 24 или 48 ч после обработки. Образцы были обработаны и разогнаны в 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE геле, как описано выше. Гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Уровни лактат дегидрогеназы в HepG2 клетках.
После переноса каждый блот был высушен в течение 15-20 мин, активирован метанолом 5 с, промыт водой 5 мин и TBST 15 мин. Блот блокировался в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый), и зондирован первичным антителом к лактатдегидрогеназе (abeam ab2101; поликлональные) в 5% BSA (1:1000 разведение) на ночь при 4°С на шейкере. После ночой инкубации с первичными антителами к лактатдегид-рогеназе блот промывался 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и был зондирован вторичными антителами (кроличьи антикоза; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Пируват киназы мышечной формы (PKM2) уровни в HepG2 клетках.
Лактата дегидрогеназы блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 секунд, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались кроличьим поликлональным антителом к Пируват киназе М2 в 5% BSA (Novus Biologicals catalog # H00005315-D01P) 1:500 разведение на ночь при 4°С на шейкере. После но-чой инкубации с первичными антителами к Пируват киназе М2 мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антикроличьи; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Уровни пируват дегидрогеназы бета в HepG2 клетках.
Пируват киназы блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. После того как убедились, что зачистка антитела и ECF реагент работает, блоты активировались метанолом 5 секунд, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к Пируват дегидрогиназе в 5% BSA (ABNOVA catalog # H00005162-M03) 1:500 разведение на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами к Пируват дегидрогеназе мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антимышиные; 1:10,000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блот был промыт 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировался с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Уровни актина в HepG2 клетках.
Пируват дегидрогеназы блоты были зачищены и затем вновь зондированы антителами к актину, как описано выше.
Иммуноблоттинг. Эксперимент 5.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были MIAPACA2 (РАСА2) клетки, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 мкМ и 100 мкМ) и собраны через 24 или 48 ч после обработки. РАСА2 образцы были обработаны и гели разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Лактат дегидрогеназы (LDH) и Пируват дегидрогеназы (PDH) уровни в РаСа2 клетках
Уровни LDH и PDH определялись путем зондирования блотов подряд первичными антителами к LDH и PDH, по существу, как описано выше. Каспазы 3 уровня в РаСа2 клетках.
Блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 секунд, промывались водой 5 минут и TBST 15 минут. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к Каспазе 3 в 5% BSA (Santacruz Biotechnology # sc7272) 1:200 разведение на ночь при 4°С на шейкере. После ночной инкубации с первичными антителами к Каспазе 3 мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антимышиные; 1:10000 разведение) в течение 1 часа на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Иммуноблоттинг. Эксперимент 6.
Клетками, использованными в этом эксперименте с иммуноблоттингом, были РС-3, HepG2, MCF-7, HDFa и РАСА2, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 IV формулой и собраны через 24 ч после обработки. Образцы были обработаны и гели были разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Каспаза 3 и уровни Актина в различных клеточных типах.
Уровни Каспазы 3 и актина определялись зондированием блотов первичными антителами к Кас-пазе 3 и актину, как описано выше.
Иммуноблоттинг. Эксперимент 7.
Клетками, использованными в этом эксперименте, были клетки гладкой мускулатуры аорты человека (HASMC), которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях (50 мкМ и 100 мкМ) и собраны через 24 или 48 ч после обработки. HASMC образцы были обработаны и гели разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Экспериментальный протокол для Актина.
Уровни актина определялись зондированием блотов первичными антителами к актину, как описано выше.
Экспериментальный протокол для Hif 1alpha, Каспазы 3 и PDHB.
Актиновые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 минут инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блоты сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 часа 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к Hif 1 alpha, Каспазе 3 или PDHB в 5% BSA (1:200 при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к Hif 1 alpha (Abcam ab2185; антикроличье) были разведены 1:500 в 5% BSA. Первичные антитела к Каспазе 3 (Santacruz sc7272; антикроличье) были разведены 1:200 в 5% BSA. Первичные антитела к пируват дегидрогеназе бета (PDHB) (Novus Biologi-cals H00005162-M03; антимышиное) были разведены 1:500 в 5% BSA. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (PDHB антимышиное; Hif la и Каспаза 3 антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1Х-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при
400 В и при 500 В.
Экспериментальный протокол для PKM2, SDHB и SDHC.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 минут инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блоты сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к PKM2, SDHB или SDHC в 5% BSA в TBS-T (1:200 при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к SDHC (ABNOVA H00006391-M02; антимышиное) были разведены 1:500. Первичные антитела к SDHB были из Abcam ab4714-200; антимышиное; были разведены 1:1000. Первичные антитела к пируваткиназе М2 (PKM2) были из Novus
Biologicals H00005315-D0IP; антикроличье; были разведены 1:500. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (SDHB & С антимышино; и PKM2 антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Экспериментальный протокол для LDH и Bik:
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блоты сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к LDH или Bik в 5% BSA в TBS-T при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к LDH были из Abcam ab2101; антикозье; были разведены 1:1000. Первичные антитела к Bik были из Cell Signaling #9942; антикроличье; были разведены 1:1000. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (LDH антикозье; Jackson Laboratories) и Bik антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 часа на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 минут и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Иммуноблоттинг. Эксперимент 9.
Использованными клетками были HepG2, которые были обработаны или нет коэнзимом Q10 в двух различных концентрациях, 50 мкМ и 100 мкМ, и собраны через 24 или 48 ч после обработки. HepG2 образцы были обработаны и гели разогнаны, перенесены и окрашены, как описано выше.
Экспериментальный протокол для Актина.
Уровни актина определялись зондированием блотов первичными антителами к актину, как описано выше.
Экспериментальный протокол для Каспазы 3 и ММР-6.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блоты сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к Каспазе 3 или ММР-6 в 5% BSA при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к Каспазе 3 (Abcam ab44976-100; антикроличье) были разведены 1:500 в 5% BSA. Первичные антитела к ММР-6 (Santacruz scMM0029-ZB5; антимышиное) были разведены 1:100 в 5% BSA. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (ММР-6 антимышиное; каспаза 3 антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Экспериментальный протокол для LDH.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. 2 блота сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к LDH в 5% BSA или 5% сыворотке при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к LDH 080309b1 (Abcam ab2101; антикозье) были разведены 1:1000 в 5% BSA. Первичные антитела к LDH 080309b2 (Abcam ab2101; антикозье) были разведены 1:100 в 5% BSA. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (Jackson Immuno Research антикозье; 1:10000 разведение; 305-055-045) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ
разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Экспериментальный протокол для трансальдолазы и Hif1a.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блоты сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 часа 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителом к Трансальдолазе или Hif1a в 5% BSA при инкубации на ночь при 4 градусах С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к Трансальдолазе (Abcam ab67467; антимышиное) были разведены 1:500. Первичные антитела к Hif1a (Abcam ab2185; антикроличье) были разведены 1:500. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антимышиное или антикроличье; 1:10000 разведение) в течение 1 часа при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Экспериментальный протокол для IGFBP3 и ТР53.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блоты сканировались на лазерном сканере для определения полноты зачистки. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителами к IGFBP3 или ТР53 в 5% BSA при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к IGFBP3 (Abcam ab76001; антикроличье) были разведены 1:100. Первичные антитела к ТР53 (Sigma Aldrich AV02055; антикроличье) были разведены 1:100. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антикроличье; 1:10,000 разведение) в течение 1 часа на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Экспериментальный протокол для Трансальдолазы и PDHB.
Вышеупомянутые блоты были зачищены путем инкубации 30 мин в метаноле, с последующими двумя 10-минутными промывками с TBS-T, затем 30 мин инкубации с Stripping буфером при 50°С, и с последующими двумя промывками 100 мл или более TBS-T в течение 30' каждая. Блоты активировались метанолом 5 с, промывались водой 5 мин и TBST 15 мин. Блоты блокировались в течение 1 ч 5% блокирующим реагентом в TBS-T при комнатной температуре и затем промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и зондировались антителами к Трансальдолазе или PDHB в 5% BSA при инкубации на ночь при 4°С на малой скорости шейкера. Первичные антитела к Трансальдолазе (Santacruz sc51440; антикозье) были разведены 1:200. Первичные антитела к PDHB (Novus Biologicals H00005162-M03; антимышиное) были разведены 1:500. После инкубации с первичными антителами мембраны промывались 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждая) и были зондированы вторичными антителами (антикозье или антимышиное; 1:10000 разведение) в течение 1 ч на орбитальном наклонном шейкере при комнатной температуре. После 1 ч инкубации с вторичными антителами блоты были промыты 3 раза TBS-T (1X-15'; 2Х 5' каждый) и затем инкубировались с ECF реагентом 5 мин и затем каждый блот сканировался с 5100 Fuji Laser сканером на 25 мкМ разрешении, 16 бит, зеленый лазер, при 400 В и при 500 В.
Результаты
Изоцитрат дегидрогеназа - 1 (IDH-1).
Изоцитрат дегидрогеназа - один из ферментов, который является частью ТСА цикла, который обычно присутствует внутри митохондриального матрикса. Однако IDH1 является цитозольной формой энзима, которая катализирует окислительное декарбоксилирование изоцитрата в а-кетоглутарат и вырабатывает диоксид углерода в двухэтапном процессе. IDH1 является НАДФ+ зависимой формой, которая присутствует в цитоплазме и пероксисоме. IDH1 инактивируется Ser113 фосфорилированием и экспрессируется во многих видах, включая те, у которых нет цикла лимонной кислоты. Судя по всему, в норме IDH1 функционирует как супрессор опухолей, который при инактивации способствует онкоге-незу, частично за счет активации HIF-1 пути (Bayley 2010; Reitman, 2010). Недавние исследования вовлекли инактивирующие мутации в EDH1 в этиологию глиобластомы (Bleeker, 2009; Bleeker, 2010).
Обработка коэнзимом Q10 повышала экспрессию IDH1 в линиях раковых клеток, включая MCF-7, SKMEL28, HepG2 и РаСа-2 клетки. Было среднее возрастание экспрессии в SCC25 клеточных линиях.
Напротив, культуры первичных фибробластов человека HDFa, nFIB и клеток гладкой мускулатуры аорты человека HASMC не показали значительных изменений в экспрессионном паттерне IDH1 в ответ на коэнзим Q10. а-кетоглутарат (а-КГ) является ключевым промежуточным продуктом в цикле ТСА, биохимически синтезируемым из изоцитрата и в конечном итоге превращающемся в сукцинил соА и являющимся лекарственно-ориентированным МВМ и эпи-переключателем. Образование а-КГ служит критическим местом связи в ТСА цикле, поскольку может использоваться клеткой для пополнения промежуточных веществ в цикле, приводя к образованию восстановленных эквивалентов и возрастанию окислительного фосфорилировния.
АТФ Цитрат Лиаза (ACL).
Таким образом, кооэнзим Q10, опосредуя возрастание экспрессии IDH1, приводит к формированию промежуточных продуктов, которые могут быть использованы в митохондриальном ТСА цикле для увеличения окислительного фосфорилирования в раковых клетках. Результаты суммированы в таблицах ниже.
АТФ цитрат лиаза (ACL) является гомотетрамерным (~126 кд) ферментом, который катализирует образование ацетил-СоА и оксалоацетата в цитозоле. Эта реакция является очень важным первым этапом в биосинтезах жирных кислот, холестерина и ацетилхолина, а также для глюкогенеза (Towle et al., 1997). Питательные вещества и гормоны регулируют уровень экспрессии и фосфориляционный статус этого ключевого фермента. Сообщалось о Ser454 фосфорилировании ACL благодаря Akt и PKA (Berwick., DC MW et al., 2002; Pierce MW et al., 1982).
Данные описывают действие коэнзима Q10 на АТФ цитат лиазу в нормальных и раковых клетках. Постоянно наблюдается, что в раковых клетах существует дозозависимое снижение экспрессии ACL ферментов. И, напротив, судя по всему существует тенденция возрастания экспрессии ACL в нормальных клетках. Цитозольный ACL демонстрирует необходимость для ацетилирования гистонов в клетке во время стимуляции фактора роста и во время дифференцировки. Тот факт, что ACL утилизирует ци-тозольной глюкозы дериват цитрат для образования Ацетил СоА, необходимого для ацетилирования гистонов, процесса, важного в процессе новообразований, демонстрирует роль коэнзима Q10, вызывающего экспрессию ACL, влияющего на функцию раковых клеток. Ацетил СоА, вырабатывающийся из цитрата благодаря цитозольному ACL, служит источником для биосинтезов новых липидов и холестерина во время деления клеток. Таким образом, коэнзим Q10, вызывающий изменения в экспрессии ACL, влияет на способность Ацетил СоА синтезировать липиды и хотестерин в нормальных клетках по сравнению с раковыми клетками. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 32. ATPCL в HDFa и MCF-7
Количество - Композиция
Нормализованная интенсивность
PACA5g48-cpefla
1,00
PACA5g48-50-Ko3H3HM QIO
0,68
PACA5g48-100-Ko3H3HM QIO
0,42
PACA22G48-cpena
1,00
РАСА22О48-50-Коэнзим QIO
1,12
PACA22G48- 100-Коэнзим QIO
1,74
Hep5g48-cpefla
1,00
Hep5g48-50-Ko3H3HM QIO
0,85
Hep5g48-100-Коэнзим QIO
0,79
Hep22G48-cpefla
1,00
Нер22С48-50-Коэнзим QIO
1,29
Hep22G48-100-Ko3H3HM QIO
2,09
Пируват Киназа М2 (PKM2).
Пируват киназа является ферментом, участвующем в гликолитическом пути. Она отвечает за перенос фосфата с фосфоенолпирувата (PEP) на аденозиндифосфат (АДФ) с образованием АТФ и пиру-вата. PKM2 является изоэнзимом гликолитической пируваткиназы, экспрессия которого характеризуется по метаболитической функции ткани, т.е. М2 изоэнзим экспрессируется в нормальных быстро про-лиферирующих клетках с высокими энергетическими потребностями, такими как эмбриональные клетки, и также экспрессируется в нескольких нормальных дифферинцированных тканях, таких как легкие и инсулоциты поджелудочной железы, где требуется высокая степень синтеза нуклеиновых кислот. PKM2 в высокой степени экспрессируется в опухолевых клетках вследствие своей зависимости от гли-колитического пути, отвечающего энергетическим потребностям клетки. PKM2 изоформа, в норме считающаяся ограниченной эмбриональным периодом, ре-экспрессируется в раковых клетках. Клетки, экспрессирующие PKM2, поддерживают сильный аэробный гликолитический фенотип (показывающий переключение в метаболитическом фенотипе) с возрастанием образования лактата и снижением окислительного фосфорилирования. Таким образом, снижение экспрессии PKM2 в раковых клетках переключает или понижающе регулирует образование энергии благодаря гликолитическому пути, стратегии, которая полезна в лечении рака. Данные демонстрируют различный паттерн экспрессии PKM2 в нормальных и раковых клетках, где раковые клетки демонстрируют более высокий уровень экспрессии по сравнению с нормальными. Обработка клеток коэнзимом Q10 изменяет экспрессионный паттерн PKM2 выше и ниже исходных уровней в нормальных и раковых клетках (фиг. 81-85). В исследуемых раковых клетках существует дозозависимое снижение экспрессии PKM2, и в основном не наблюдается изменений в нормальных клетках. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Лактат дегидрогеназа (LDH).
LDH является ферментом, который катализирует взаимное превращение пирувата и лактата с одновременным взаимным превращением НАДН и НАД+. Он обладает способностью превращать пируват в лактат (молочную кислоту) при низком давлении кислорода в клетке для образования восстановленных эквивалентов и образования АТФ за счет митохондриального окислительного фосфорилирования. Раковые клетки обычно демонстрируют повышенную экспрессию LDH для поддержания гликолитиче-ского потока для образования АТФ и восстановленных эквивалентов и уменьшения митохондриально-го OXPHOS. Таким образом, уменьшение экспрессии LDH в раковых клетках переключает метаболизм с образования лактата на содействие входу пирувата в ТСА цикл. Обработка коэнзимом Q10 уменьшала экспрессию лактатдегидрогеназы (LDH) при раке с минимальным действием на нормальные клетки, поддерживая роль коэнзима Q10 в вызове переключения в биоэнергетике раковых клеток для образования АТФ с гликолитического на митохондриальные OXPHOS источники путем минимизации превращения цитоплазматического пирувата в молочную кислоту. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Пируват Дегидрогеназа - В (PDH-E1).
Пируват дегидрогеназа бета (PDH-E1) является первым ферментным компонентом, который является частью пируватдегидрогеназного комплекса (PDC), который превращает пируват в ацетилСоА. PDH-E1 требует тиамина как кофактора для своей активности, осуществляет первые две биохимические реакции в PDC комплексе, необходимые для превращения пирувата в ацетилСоА для вхождения в ТСА цикл в митохондриях. Таким образом, сопутствующее снижение экспрессии PKM2 и LDH в ходе возрастания экспрессии PDH-E1 в раковых клетках увеличивает степень вхождения пирувата для усиления митохондриального OXPHOS для образования АТФ. Данные показывают, что экспрессия PDH-E1 в нормальных и раковых клеточных линиях, исходная линия экспрессии этого фермента уменьшается при раке по сравнению с нормальными клетками. Воздействие коэнзимом Q10 связано с прогрессивным повышением экспрессии PDH-E1 белков в раковых клетках при минимальных изменениях в нормальных клетках. Результаты суммаризованы в таблицах ниже.
Каспаза-3.
Контроль начала апоптозов часто влияет на уровень инициатора каспаз, каспазы-2, -9 и -8/10. Во внешнем пути апоптозов, каспаза-8 активируется, прямо расщепляется и активирует каспазы-убийцы (такие как каспаза-3). Активная каспаза-3 расщепляет и активирует другие каспазы (6, 7, и 9), а также и соответствующие цели в клетках (например, PARP и DFF). В этих исследованиях уровни эффекторов белка каспазы-3 оценивались в раковых клеточных линиях и в нормальных клеточных линиях в ответ на коэнзим Q10. Следует заметить, что хотя считается, что контроль за апоптозами идет через инициатора каспаз, множество сигнальных путей прерывается взамен передачи апоптозного сигнала через прямую ингибицию эффекторов каспаз. Для, например, Р38 MAPK фосфорилирует каспазу-3 и поддерживает ее активность (Alvarado-Kristensson et al., 2004). Интересно, что активация белка фосфотазы (РР2А) в том же исследовании или протеинкиназы С дельта (PKC дельта) (Voss et al., 2005) может препятствовать действию р38 MAPK усиливать активацию каспазы-3 и содействовать передаче апоптозно-го сигнала. Следовательно, события на уровне активации каспазы-3 или после активации каспазы-3 могут определять конечную судьбу клетки в некоторых случаях.
Каспаза-3 является цистеин-аспаргиновой кислоты протеиназой, которая играет центральную роль в фазе осуществления клеточного апоптоза. Уровни каспазы 3 в раковых клетках возрастали при обработке коэнзимом Q10. Напротив, экспрессия каспазы-3 в нормальных клетках умеренно понизилась. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 45. Каспаза 3 в РАСА2
Количество Композиция
Нормализованный объем (24 ч)
Нормализованный объем (24 ч)
5г-Среда
324
300
5г-50-Коэнзим Q10
325
701
5г-100-Коэнзим QIO
374
291
22G-Cpefla
344
135
22G-50-KO3H3HM Q10
675
497
22G-100-KO3H3HM Q10
842
559
Сукцинат дегидрогеназа (SDH).
Сукцинат дегидрогеназа, также известная как сукцинат-коэнзим Q редуктаза, является комплексом внутренней митохондриальной мембраны, которая задействована и в ТСА, и в электронной транспортной цепи. В ТСА этот комплекс катализирует окисление сукцината до фумарата с сопутствующим восстановлением убихинона до убихинола. (Baysal et al., Science 2000; и Tomlinson et al., Nature Genetics 2002). Обнаружено, что генеративные мутации в SDH В, С и D субъединицах инициируют события семейной параганглиомы или лейомиомы (Baysal et al., Science 2000).
Иммуноблоттинг использовался для характеристики экспрессии SDH субъединицы В в митохонд-риальных препаратах раковых клеток, обработанных коэнзимом Q10. Результаты подтверждают, что обработка коэнзимом Q10 связана с возрастанием уровней SDH белка в митохондриях клеток. Эти результаты подтверждают, что одним из механизмов действия коэнзима Q10 является переключение метаболизма клеток на ТСА цикл и на митохондрии благодаря возрастанию уровней митохондриальных ферментов, таких как SDHB. Результаты суммированы в таблице ниже.
Таблица 48. Сукцинат дегидрогеназа В в NCIE0808 митопрепаратах
Композиция - Время
Средний
нормализованный объем
Среда
531
50 мкМ Коэнзим Q10, Зч
634
100 мкМ Коэнзим Q10, Зч
964
50 мкМ Коэнзим Q10,6ч
1077
100 мкМ Коэнзим Q10, 6ч
934
Индуцирующий гипоксию фактор-1.
Индуцирующий гипоксию фактор (Hif) является транскрипционным фактором, состоящим из альфа и бета субъединиц. При нормоксии уровни белка Hifl альфа очень низкие вследствие его постоянной деградации в последовательности посттрансляционных событий. Обычно считается, что переключение между гликолизом и окислительным фосфорилированием контролируется совместной активностью двух ферментов PDH и LDH, которые определяют катаболическую судьбу пирувата. Hif контролирует эту критическую точку бифуркации, индуцируя уровни LDH и ингибируя активность PDH путем стимуляции PDK. Благодаря своей способности отводить метаболизм пирувата от митохондрий в цитозоль, Hif считается ключевым медиатором биоэнергетического переключения в раковой клетке.
Воздействие коэнзима Q10 снижает уровни белка Hif1 альфа в митохондриальных препаратах раковых клеток. В лизатах нормальных клеток также наблюдается более слабая полоса Hif1, показывающая снижение. Результаты суммированы в таблицах ниже.
Таблица 49. Hifl альфа слабая полоса в HASMC клетках после обработки
Пример 21. Анализ степени потребления кислорода (OCR) и внеклеточной кислотности (ECAR) в нормальных и раковых клетках, обработанных CoQ10.
Этот пример демонстрирует, что воздействие на клетки репрезентативной МВМ /эпи-переключателем изобретения - CoQ10 - в отсутствие и/или присутствие стрессора (например, гиперг-лицемии, гипоксии, молочной кислоты), связано с переключением между гликолизом /биосинтезом лактата и митохондриальным окислительным фосфорилированием (как оценено по значениям ECAR и OCR), в сторону значений, наблюдаемых в нормальных клетках при нормальных физиологических условиях.
Заявители демонстрировали в гфедыщущих разделах, что воздействие CoQ10 на раковые клетки связано с изменениями экспрессии определенных белков, которые усиливают митохондриальное окис
лительное фосфорилирование, с сопутствующим снижением гликолиза и биосинтеза лактата. Этот пример показывает, что непосредственную оценку митохондриального окислительного фосфорилиро-вания можно наблюдать путем подсчета степени потребления кислорода (OCR) в клеточных линиях с использованием SeaHorse XF анализатора, инструмента, который оценивает растворенный кислород и внеклеточные уровни в in vitro экспериментальной модели (SeaHorse Biosciences Inc, North Billerica,
MA).
pH внеклеточного микроокружения сравнительно кислый в опухолях по сравнению с внутриклеточным (цитоплазматическим) рН и окружающими нормальными тканями. Этот характерный признак опухолей служит множеству целей, включая способность нарушать внеклеточный матрикс (ЕСМ), отличительную черту опухолевых метастаз, которая впоследствии инициирует сигнальный каскад, который затем модулирует:
ангиогенез в опухоли;
повышенную активацию механизма остановки, контролирующего включение-выключение клеточного цикла;
иммуномодулирующие механизмы, которые содействуют системе клеточной системы уклонения от иммунного надзора;
элементы метаболического контроля, которые повышают зависимость от гликолитического потока и потребления лактата;
дисрегуляцию ключевых семейств апоптозных генов, таких как Bcl-2, IAP, EndoG, AIF, которые служат возрастанию онкогенности.
Не имея стремления ограничиваться какой-либо определенной теорией, кислая рН внешнего микроокружения в опухоли является последствием возрастания концентрации ионов водорода, вышедших из опухолевых клеток из-за возросшего образования лактата из-за изменившегося гликолитического фенотипа.
В этом эксперименте OCR и степень внеклеточной кислотности (ECAR) в нормальных клеточных линиях наблюдались в присутствие и отсутствие CoQ10 для определения базовых величин. Наблюдалось, что в своем естественном окружении базовые степени OCR в нормальных клеточных линиях различны, и обычно зависят от физиологической роли клеток в теле.
Например, одна серия экспериментов была проведена с использованием неканцерогенной клеточной линии HDFa, которая является клеточной линией дермальных фибробластов у взрослых людей. Фибробласты - клетки, которые в основном синтезируют и секретируют компоненты внеклеточного матрикса (ЕСМ) и коллаген, который формирует структурный каркас (строму) тканей. Кроме того, известно, что фибробласты служат в ткани посредниками множества функций, таких как заживление мелких ран и местная иммуномодуляция. При нормальных физиологических условиях энергетические потребности нормальных фибробластов удовлетворяются использованием комбинации гликолиза и окислительного фосфорилировния - гликолиз предоставляет необходимые вещества для синтеза ЕСМ.
В отличие от HDF, HASMC (клетки гладкой мускулатуры аорты человека) находятся в артериях, венах, лимфатических сосудах, пищеварительном тракте, дыхательных путях, мочевом пузыре и в других тканях со способностью подвергаться регулируемому возбуждению и сокращению. Способность гладких мускулов, таких как клетки HASMC, сокращаться, требует энергии, запасенной в АТФ. Эти ткани переходят от низкоэнергетической модели, когда АТФ может поставляться из митохондрий, к высокоэнергетической модели (во время физической активности/стресса), когда энергия предоставляется путем переключения на гликолиз для быстрого образования АТФ. Таким образом, нормальные клетки гладкой мускулатуры могут использовать комбинацию митохондриального OXPHOS и гликолиза для удовлетворения своих энергетических потребностей в нормальном физиологическом состоянии.
Разница в их сравнительных физиологических ролях (т.е., HDFa и HASMC) наблюдалась в остаточных OCR значениях, подсчитанных в этих клеточных линиях с использованием SeaHorse XF анализатора. Фиг. 29 и 30 описывают OCR в HDFa и HASMC клетках, растущих в условиях физиологически нормального количества глюкозы (около 4,6 мМ) и при повышенной глюкозе (гипергликемия).
Базовое значение OCR для HDFa в отсутствие каких-либо воздействий при нормальной доступности кислорода примерно 40 рмоль/мин (фигура 29) в присутствии 5,5 мМ глюкозы. Это значение слегка повысилось, когда клетки содержали в 22 мМ глюкозе. Напротив, в клетках HASMC значения OCR при 5,5 мМ глюкозы примерно 90 пмоль/мин., и значение OCR уменьшилось до примерно 40 пмоль/мин. в присутствии 22 мМ глюкозы. Таким образом, в условиях гипергликемии существует различная реакция у HDFa и HASMC, что демонстрирует врожденные различия в их соответствующем физиологическом складе и функциях.
Обработка CoQ10 в клетках связана с изменениями в OCR, которая проявляется в условиях, наблюдаемых при нормальных глюкозных условиях (5 мМ). Сложность физиологического ответа соответствует присутствию малой плотности кислорода. Таким образом, влияние CoQ10 связано с изменениями в степенях OCR в нормальных клетках в сторону физиологического статуса, который присущ определенным типам клеток.
Табл. 51 ниже описывает значения ECAR (мрН/мин) в HDFa клетках в присутствии или отсутствии CoQ10 в условиях нормоксии и гипоксии при 5,5 мМ и 22 мМ глюкозы. Можно видеть, что у нормальных клеток обработка CoQ10 имела минимальное влияние на значения ECAR, даже когда было оказано влияние на OCR в этих клетках. В условиях гипоксии при больших значениях глюкозы обработка CoQ10 была связана с понижением повышенного ECAR до значения, которое наблюдалось в условиях нормоксии и отсутствии обработки.
В таблице 52 оцененные базовые значения ECAR (мрН/мин) в HASMC были выше по сравнению с HDFa. To, что условия гипоксии стали причиной повышения ECAR, скорее всего связано с тем, что внутриклеточная гипоксия вызывает ацидозы во вторую очередь после возрастания гликолиза
Наблюдалось, что обработка CoQ10 связана со спускающимся трендом степеней ECAR в гипег-ликемичных клетках HASMC в условиях гипоксии по сравнению со значением, которое наблюдается в условиях нормоксии при нормальной глюкозе. Эти данные показывают наличие физиологической изменчивости, которое свойственно физиологической роли определенного типа клеток, изменения наблюдаются при анормальных условиях (напр, гипергликемии), и происходит переключение в направлении нормы при воздействии CoQ10.
Напротив, раковые клетки (например, MCF-7, РаСа-2) по сути своей склонны к культуре с более высокими уровнями глюкозы по сравнению с нормальными клетками из-за своего гликолитического фенотипа, поддерживающегося в культуре. Воздействие CoQ10 приводит к последовательному уменьшению значений OCR (фиг. 31 и 32).
Действие CoQ10 на значения OCR в MCF-7 и РаСа-2 клетках было подобно действию на нормальные HDFa и HASMC клетки, тогда как вариабельный ответ подтверждал терапевтическую реакцию, основанную на индивидуальном метаболитическом профиле линии раковых клеток.
Табл. 53 описывает значения ECAR в РаСа-2 клетках. В отличие от нормальных клеток, раковые клетки фенотипически склонны использовать высокие уровни глюкозы для образования АТФ (усиленный гликолиз), что приводит к повышенному ECAR (табл. 53, ECAR для необработанной нормоксии 17 мМ) при 21 мрН/мин. Обработка CoQ10 дает значительное уменьшение степени ECAR при этих условиях, скорее всего связанное с уменьшением вырабатываемой при гликолизе молочной кислоты. Соответствующее уменьшение OCR в этих клетках скорее всего связано с повышенной эффективностью митохондриального OXPHOS.
Подобное сравнение OCR и ECAR значений (данные не показаны), определенных для множество других нормальных и раковых клеток, включает: НАЕС (нормальные эндотелиальные клетки аорты человека), MCF-7 (рак молочной железы), HepG2 (рак печени) и сильно метастазирующие РС-3 (рак простаты) клеточные линии. Во всех этих исследуемых линиях воздействие CoQ10 в отсутствие и/или присутствие стрессоров (например, гипергликемии, гипоксии, молочной кислоты) было связано с переключением в значениях OCR и ECAR к значениям, наблюдаемым в нормальных клетках при нормальных физиологических условиях. Таким образом, общее действие CoQ10 на лечение рака, включая клеточную гибель, является эффектом потока из-за его совместного влияния на протеомические, геномные, метаболические результаты одновременно с переключением клеточной биоэнергетики с гликолиза на митохондриальное OXPHOS.
Пример 22. Структурные молекулярные элементы для биосинтеза CoQ10.
Этот пример демонстрирует, что определенные предшественники биосинтеза CoQ10, такие как те, которые участвуют в биосинтезе бензохинонового кольца и те, которые участвуют в биосинтезе изо-проновых повторов и их присоединении к бензохиноновому кольцу, ("компоненты структурных элементов"), могут вводиться отдельно или вводиться в комбинации с целевыми клетками, и оказывать эффект отрицательной регуляции на ингибитор апоптозов Bcl-2, и/или положительной регуляции на промотор апоптозов Каспазу-3. Определенные предшественники или их комбинации могут также ин-гибировать клеточную пролиферацию. Данные подтверждают, что такие предшественники CoQ10 могут быть использованы вместо CoQ10 для достижения по большей части таких же результатов, как и при введении CoQ10.
Определенные приведенные в качестве примера экспериментальные условия, использованные в экспериментах, перечинены ниже.
Skmel-28 клетки меланомы культивировались в DMEM/F12 с добавлением 5% эмбриональной бычей сыворотки (FBS) и 1X конечной концентрации антибиотиков. Клетки росли до 85% заселенности и были обработаны компонентами структурных элементов в течение 3, 6, 12 и 24 ч. Клетки затем были собраны и проведен иммуноблоттинг.
Исследуемые компоненты строительных элементов включали L-фенилаланин, DL-фенилаланин, D-фенилаланин, L-тирозин, DL-тирозин, D-тирозин, 4-гидрокси-фенилпируват, фенилацетат, 3-меток-си-4-гидроксиманделат (манделат ванилина или VMA), ванилиновую кислоту, 4-гидроксибензоат, пи-роксин, пантенол, мевалоновую кислоту, Ацетилглицин, Ацетил-СоА, Фарнезил и 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинон.
Для иммуноблоттинга клетки были собраны в холодный PBS, лизированы и уровни белка были количественно определены с использованием ВСА белкового анализа. Общий лизат клеток был помещен в 12% Tris-HCl гель. Белки затем были перенесены на нитроцеллюлозную бумагу, а затем блокированы 5% сывороткой Tris-буферного раствора в течение 1 часа. Белки затем подвергались действию первичных антител (Bcl-2 и каспаза-3) в течение ночи. Нитроцеллюлозная бумага затем экспозирова-лась в Pico Chemilluminescent на 5 мин и регистрировалась экспрессия белка. После экспозиции актин подсчитывался по такому же способу. С использованием ImageJ были подсчитаны уровни белковой экспрессии. t-Тест использовался для анализа статистической достоверности
Иллюстративные результаты экспериментов представлены ниже.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-фенилаланина. Перед тем, как вступить в путь синтеза структуры кольца хинона, L-фенилаланин превращается в тирозин. Иммуноблоттинг был проведен для определения любых изменений вэкспрессии апоптозных белков в клетках меланомы Тестировались следующие концентрации: 5 мкМ, 25 мкМ и 100 мкМ. В первоначальных исследованих L-фенилаланин добавлялся к DMEM/F12 среде, которая содержала его в концентрации 0,4 М. Для 5 мкМ, 25 мкМ и 100 мкМ, конечная концентрация L-фенилаланина в среде была 0,405 М, 0,425 М и 0,500 М, соответственно. Эти конечные концентрации исследовались на Skmel-28 клетках в течение периодов инкубации 3, 6, 12 и 24 ч. Клетки росли до 80% заселенности до добавления воздействующей среды и собирались с использованием процедуры иммуноблоттинга, как описано выше Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось при 100 мкМ L-фенилаланина после 3 и 12 ч инкубации. При 5 мкМ L-фенилаланина статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось после 6 ч инкубации. При 25 мкМ L-фенилаланина статистически достоверное снижение Bcl-2 и статистически достоверное возрастание каспазы-3 наблюдались после 12 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 показывает изменение апоптозного потенциала, статистически достоверное возрастание каспазы-3 подтверждает, что клетки подверглись апоптозу. Имелась постоянная тенденция снижения Bcl-2 по срав
нению с контролем, хотя из-за размера образцов и стандартного отклонения в этом эксперименте эти временные точки не были статистически достоверными.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов D-фенилаланина: D-фенилаланин, химически синтезированная форма биоактивного L-фенилаланина, исследовался в сравнении с L-фенилал-анином. Для всех трех концентраций (5 мкМ, 25 мкМ и 100 мкМ) D-фенилаланина наблюдалось достоверное уменьшение экспрессии Bcl-2 после 6 ч инкубации. Кроме того для 5 мкМ и 25 мкМ наблюдалось достоверное уменьшение после 3 ч инкубации. Для 5мкМ и 100 мкМ концентраций наблюдалось достоверное возрастание экспрессии каспазы-3 после 6 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов DL-фенилаланина: DL-фенилаланин также исследовался в сравнении с L-фенилаланином. Опять концентрации 5 мкМ, 25 мкМ, и 100 мкМ исследовались на Skmel-28 клетках. Периоды инкубации составляли 3, 6, 12 и 24 ч. Статистически достоверное возрастание каспазы-3 наблюдалось после 3 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось после 24 ч инкубации. Хотя тенденция снижения Bcl-2 и возрастания каспазы-3 наблюдалась при всех концентрациях и на всех временных точках, это не было статистически достоверным в этом эксперименте.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-тирозина: L-тирозин является компонентом структурных элементов в синтезе структуры кольца хинона CoQ10. Первичное исследование L-тирозина не дало концентраций белка, достаточно высоких для иммуноблоттинга. В этом исследовании концентрации 25 мкМ исследовались иммуноблоттингом. В DMEM/F12 среде использовалась содержащая L-тирозин динатриевая соль в концентрации 0.398467 М. Первоначальная концентрация была увеличена до 500 нМ, 5 мкМ, и 15 мкМ. Статистически достоверное возрастание каспазы-3 наблюдалось для 500 нМ концентраций после 12 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось для 5 мкМ концентрации после 24 ч инкубации. Статистически достоверное снижение Bcl-2 наблюдалось для 500 мкМ и 5 мкМ концентраций после 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов D-тирозина: D-тирозин, синтетическая форма L-тирозина, исследовался в сравнении с апоптозным действием L-тирозина на клетки меланомы. Основываясь на первоначальных исследованиях L-тирозина, для иммуноблоттинга были выбраны концентрации ниже 25 мкМ. Тестируемыми концентрациями были 1 мкМ, 5 мкМ, и 15 мкМ. D-тирозин показал уменьшение экспрессии Bcl-2 при 5 мкМ и 15 мкМ концентрациях на 12 и 24-часовых временных периодах. Каспаза-3 значительно возрастала при концентрациях 5 мкМ на 3, 12 и 24 временных периодах. Также наблюдалось возрастание экспрессии каспазы-3 при 1 мкМ на 12 и 24 временных периодах. Кроме того, существует возрастание экспрессии каспазы-3 при 5 мкМ на 12-часовом временном периоде.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов DL-тирозина: DL-тирозин, синтерическая форма L-тирозина, также исследовался в сравнении с апоптозным действием L-тирозина на клетки. Существует статистически достоверное уменьшение экспрессии Bcl-2, наблюдаемое при 1 мкМ и 15 мкМ концентрациях после 12 ч инкубации и при 5 мкМ после 24 ч инкубации. Возрастание экспрессии каспазы-3 также наблюдалось при 5 мкМ и 15 мкМ после 12 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 4-гидрокси-фенилпирувата: 4-гидрокси-фенилпируват получается из аминокислот тирозина и фенилаланина и может играть роль в синтезе структуры кольца. Концентрации 1 мкМ, 5 мкМ и 15 мкМ исследовались на экспрессию Bcl-2 и каспа-зы-3. Для 5 мкМ и 15 мкМ концентраций наблюдается значительное уменьшение экспрессии Bcl-2 после 24 часов инкубации и значительное возрастание экспрессии каспазы-3 после 12 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов фенилацетата: фенилацетат потенциально может превратиться в 4-гидроксибензоат, который играет роль в присоединении боковой цепи к структуре кольца. Тестировались следующие концентрации: 1 мкМ, 5 мкМ, и 15 мкМ. Для фенилацетата наблюдается уменьшение экспрессии Bcl-2 для концентраций 5 мкМ и 15 мкМ после 12 и 24 ч инкубации. Возрастание экспрессии каспазы-3 наблюдалось для концентраций 5 мкМ и 15 мкМ после 12 ч и 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 3-метокси-4-гидроксиманделат (манделат ванилина или VMA): VMA является дополнительным компонентом для синтеза структуры кольца хи-нона CoQ10. Тестировались следующие концентрации: 100 нМ, 250 нМ, 500 нМ, 1 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ. Хотя статистически достоверное апоптозное действие в этом эксперименте не наблюдалось, данные показывают тенденцию снижения экспрессии Bcl-2.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов ванилиновой кислоты: Ванилиновая кислота является предшественником синтеза кольца хинона и исследовалась в концентрациях 500 нМ, 5 мкМ, и 15 мкМ. Экспрессию Bcl-2 и каспазы-3 оценили путем иммуноблоттинга. Ванилиновая кислота показала достоверное уменьшение экспрессии Bcl-2 при концентрациях 500 нМ и 5 мкМ на временной точке 24 ч инкубации. Для концентрации 15 мкМ наблюдается уменьшение экспрессии Bcl-2 после 3 ч инкубации. Для клеток, инкубированных с 15 мкМ в течение 24 ч наблюдается значительное повышение экспрессии каспазы-3.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 4-гидроксибензоата: 4-гидроксибензойная
кислота играет роль в присоединении изопреноидной боковой цепи к структуре кольца. Тестировались следующие концентрации: 500 нМ, 1 мкМ, и 50 мкМ. Наблюдалось достоверное уменьшение экспрессии Bcl-2 для концентраций 15 мкМ после 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов 4-пиродоксина: Пиродоксин - другой предшествующий структурный элемент для синтеза структуры кольца хинона CoQ10. Для этого компонента тестировались следующие концентрации: 5мкМ, 25мкМ и 100 мкМ. Клетки оценивались по уровням Bcl-2 и каспазы-3. Пиридоксин показал значительное снижение экспрессии Bcl-2 в клетках меланомы после 24 ч инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов пантенола: Пантенол играет роль в синтезе структуры кольца хинона CoQ10. Концентрации, тестируемые на клетках меланомы, были следующими: 5 мкМ, 25 мкМ и 100 мкМ.
Этот компонент показал значительное снижение экспрессии Bcl-2 при 25 мкМ концентрации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов мевалона: мевалоновая кислота является одним из основных компонентов в синтезе CoQ10. Для этого компонента тестировались следующие концентрации: 500 нМ, 1 мкМ, 25 мкМ, и 50 мкМ. В этом эксперименте не было показано достоверного уменьшения экспрессии Bcl-2 или возрастания экспрессии каспазы-3.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов ацетилглицина: другим путем для синтеза CoQ10 является изопреноидный синтез (боковой цепи). Добавление ацетилглицина превращает Коэн-зим А в Ацетил-СоА, который входит в путь мевалона для изопреноидного синтеза. Тестировались следующие концентрации 5 мкМ, 25 мкМ, и 100 мкМ. Исследование ацетилглицина показало значительное уменьшение экспрессии Bcl-2 после 12 часов инкубации при концентрациях 5 мкМ и 25 мкМ. Значительное уменьшение Bcl-2 было отмечено при 100 мкМ концентрации при 24 часовой временной точке инкубации.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов Ацетил-СоА: Ацетил-СоА является предшественником в мевалоновом пути в синтезе CoQ10. Тестировались следующие концентрации 500 нМ, 1 мкМ, 25 мкМ, и 50 мкМ. Не наблюдалось значительного снижения экспрессии Bcl-2 или возрастания каспазы-3 при тестируемых концентрациях и временных точках.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-Тирозина в комбинации с фарнезилом: L-тирозин является одним из предшественников в синтезе структуры кольца хинона CoQ10. Предыдущие эксперименты исследовали воздействие L-тирозина в среде с L-фенилаланином и L-тирозином. В этом исследовании L-тирозин изучался в среде без добавления L-фенилаланина и L-тирозина. В этом исследовании конечными тестируемыми концентрациями L-тирозина были 500 нМ, 5 мкМ, и 15 мкМ. Фар-незил тестировался в концентрации 50 мкМ. Не наблюдалось достоверного влияния на 3 и 6-часовых временных точках.
Иммуноблоттинг компонента структурных элементов L-фенилаланина в комбинации с фарнезилом: L-фенилаланин, предшественник синтеза структуры кольца хинона, исследовался в комбинации с фарнезилом в среде, свободной от L-тирозина и L-фенилаланина. Иммуноблоттинг был проведен для оценки экспрессии Bcl-2 и каспазы-3. Конечными концентрациями L-фенилаланина были: 5 мкМ, 25 мкМ, и 100 мкМ. Фарнезил бьш добавлен в концентрации 50 мкМ. Это исследование показало уменьшение экспрессии Bcl-2 для большинства тестируемых концентраций и комбинаций, как показано в таблице ниже.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации 4-гидроксибензоата с бензохиноном: Эта серия экспериментов использовала анализ клеточной пролиферации для определения действия комбинированных различных строительных блоков молекул на клеточную пролиферацию.
Первое исследование определяло действие комбинации 4-гидроксибензоата с бензохиноном. Клетки инкубировались 48 ч, после чего определялось число клеток для живых клеток. Каждая тестовая группа сравнивалась с контролем, и каждая комбинационная группа сравнивалась с контролем по бензохинону. Композиции статистически анализировались при добавлении бензохинона. Следующая таблица суммирует результаты подсчета клеток, где X означает статистическое уменьшение числа клеток.
Существует значительное уменьшение числа клеток, инкубированных с 4-гидроксибензоатом и бензохиноном и в комбинации. Для комбинации 50 мкМ 4-гидроксибензоата в комбинации с 70 мкМ бензохинона существует значительное уменьшение числа клеток, по сравнению с контролем по бензо-хинону. Это подтверждает синергетичечское действие этого молярного соотношения.
Дополнительные исследования были проведены для исследования дополнительных молярных соотношений. Для первого теста 4-гидроксибензоат был тестирован в концентрации 500 нМ, 1 мкМ, и 50 мкМ. Эти концентрации тестировались в комбинации с 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохиноном (Benzo). Тестируемая концентрация Benzo составляла 25 мкМ, 50 мкМ, и 100 мкМ. Клетки меланомы росли до заселенности 80% и сажались в 6-луночные планшеты в концентрации 40K клеток на лунку. Клетки были обработаны CoQ10, 4-гидроксибензоатом, Benzo, и комбинацией 4-гидроксибензоат/ бензо.
Т-тест был проведен с р <0,05 как статистически достоверной. X означает статистически достоверное уменьшение числа клеток.
Таблица 56. 4-Гидроксибензоат и/или 2,3-диметокси-5-метил-р-бензохинон (Benzo)
Контроль vs Benzo 25 мкМ
Контроль vs Benzo (В) 50 мкМ
Контроль vs Benzo (В) 100 мкМ
Контроль vs 4-Гидроксибензоат (НВ) Контроль нМ
Контроль vs НВ 1 мкМ
Контроль vs НВ 50 мкМ
500 нМ НВ vs 500 нМ НВ w/ 25 В
500 нМ НВ vs 500 нМ НВ w/ 50 В
500 нМ НВ vs 500 нМ НВ w/ 100 В
1 мкМ НВ vs 1 мкМ НВ w/ 25 В
1 мкМ НВ vs 1 мкМ НВ w/ 50 В
1 мкМ НВ vs 1 мкМ НВ w/100 В
50 мкМ НВ vs 50 мкМ НВ w/ 25 В
50 мкМ НВ vs 50 мкМ НВ w/ 50 В
50 мкМ НВ vs 50 мкМ НВ w/100 В
500HMHBW/25BVS25B
500 нМ НВ w/50 В vs 50 В
SOOHMHBW/IOOBVS 100 В
1 мкМ НВ w/ 25 В vs 25 В
1MKMHBW/50BVS5OB
1 MKMHBW/ 100В vs 100В
50 мкМ НВ w/ 25 В vs 25 В
50 мкМ НВ w/ 50 В vs 50 В
50MKMHBW/100BVS 100В
Существует значительное уменьшение пролиферации клеток в среде, содержащей НВ. Больше того, комбинация НВ с бензохиноном показала значительное уменьшение числа клеток, сравнимое с клетками, инкубированными с соответствующими концентрациями бензохинона.
Анализ клеточной пролиферации также был сделан на клетках неонатальных фибробластов. Концентрации тестирумого НВ были 500 нМ, 5 мкМ, и 25 мкМ. НВ также тестировался в комбинации с бензохиноном в концентрациях 25 мкМ, 50 мкМ и 100 мкМ. Клетки меланомы были посажены по 40k клеток на лунку и были обработаны в течение 24 ч. Клетки были обработаны трипсином и подсчитаны с использованием счетчика.
Статистический анализ не показал значительного уменьшения клеток фибробластов. Это показывает минимальную токсичность или ее отсутствие в нормальных клетках.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации фенилацетата и бензохинона: фенилацетат является предшественником синтеза 4-гидроксибензойной кислоты (облегчает присоединение структуры кольца). Анализ клеточной пролиферации был осуществлен для определения эффекта инкубации с фе-нилацетатом в комбинации с CoQ10 и бензохиноном.
Таблица 57. Фенилацетат и/или бензохинон
Контроль и 25/25 мкМ Ben
Контроль и 25/50 мкМ Ben
Контроль и 25/100 мкМВеп
Контроль и 25/25 мкМ Q-10
Контроль и 25/25 мкМ Q-10
Контроль и 25/50 мкМ Q-10
Контроль и 25/100 мкМ Q-10
Контроль и Ben 25
Контроль и Ben 50
Контроль и Ben 100
Контроль и Q-10 25
Контроль и Q-10 50
Контроль и Q-10 100
Ben 25 мкМ и 500 нМ/25 мкМ Ben
Ben 25 мкМ и 5 нМ/25 мкМ Ben
Ben 25 мкМ н 25 нМ/25 мкМ Ben
Ben 50 мкМ и 500 нМ/50 мкМ Ben
Ben 50 мкМ и 5 нМ/50 мкМ Ben
Ben 50 мкМ и 25 нМ/50 мкМ Ben
Ben 100 мкМ и 500 нМ/100 мкМ Ben
Ben 100 мкМ и 5 нМ/100 мкМ Ben
Ben 100 мкМ и 25 нМ/100 мкМ Ben
Q-10 25 мкМ и 500 нМ/25 мкМ Q-10
Q-10 25 мкМ и 5 нМ/25 мкМ Q-10
Q-10 25 мкМ и 25 нМ/25 мкМ Q-10
Q-10 50 мкМ и 500 нМ/50 мкМ Q-10
Q-10 50 мкМ и 5 нМ/50 мкМ Q-10
Q-10 50 мкМ и 25 нМ/50 мкМ Q-10
Q-10 100 мкМ и 500 нМ/100 мкМ Q-10
Q-10 100 мкМ и 5 нМ/100 мкМ Q-10
Q-10 100 мкМ и 25 нМ/100 мкМ Q-10
Данные показывают, что добавление фенилацетата в комбинации с бензохиноном значительно уменьшает клеточную пролиферацию. Комбинация с CoQ10 и фенилацетатом значительно уменьшает число клеток по сравнению с инкубацией с CoQ10 одним бензохиноном.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации 4-гидроксибензоата с фарнезилом: 4-гидроксибензоат был инкубирован в комбинации с Фарнезилом. Суммарные результаты перечислены ниже. Группы 4-гидроксибензоата сравнивались с контрольными и фарнезил-контрольными группами. X означает статистически достоверное уменьшение числа клеток.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-фенилаланина с бензозиноном: анализ клеточной пролиферации был проведен для тестировния комбинации L-фенилаланина в комбинации с безнохиноном. Ниже суммированы результаты по L-фенилаланину в сравнении с контролем и бензо-хиноновым контролем. X показывает статистически достоверное уменьшение.
Таблица 59. L-Фенилаланин и/или бензохинон
L-фенилаланин
По сравнению с контролем
По сравнению с L-фенилаланином в совкупности с w/o бензохиноном
По сравнению с
бензохиноновым
контролем
5 мкМ
5 мкМ w/ Benzo (50мкМ)
5 мкМ w/ Benzo (100 мкМ)
25мкМ
25 мкМ w/ Benzo (50мкМ)
25 мкМ w/ Benzo (100 мкМ)
100 мкМ
100 MKMW/ Benzo (50 мкМ)
100 MKMW/ Benzo (100 мкМ)
Подобная синергетическая роль наблюдается для L-фенилаланина в комбинации с бензохиноном.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-фенилаланина с фарнезилом: Предварительные результаты комбинации исследований клеточной пролиферации L-фенилаланина, инкубированных в комбинации с фарнезилом. L-фенилаланин сравнивался с контрольными и фарнезил-контрольными группами. X обозначает статистически достоверное уменьшение числа клеток.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-тирозина сбензозиноном.
L-тирозин использовался для инкубации в комбинации с бензохиноном после чего было подсчитано число клеток. Группы сравнивались с контрольными группами и бензохиноновыми контрольными группами.
Добавление бензохинона не амплифицирует эффект L-тирозина на число клеток.
Анализ клеточной пролиферации при комбинации L-тирозина с бензохиноном. Это исследование исследует комбинацию L-тирозина с Фарнезилом. Группы сравнивались с контролем и Фарнезил контрольными группами.
Таблица 62. L-тирозин и/или фарнезил
L-тирозин
По сравнению с контролем
По сравнению с L-тирозином в совокупности с w/o Фарнезил
По сравнению с
Фарнезил
контролем
500 нМ
500 нМ w/ Фарнезил (50 мкМ)
500 нМ vrl Фарнезил (50 мкМ)
5 мкМ
5 мкМ w/ Фарнезил (50 мкМ)
5 мкМ w/ Фарнезил (100 мкМ)
15 мкМ
15 мкМ w/ Фарнезил (50 мкМ)
15 мкМ w/ Фарнезил (100 мкМ)
Комбинация L-тирозина и фарнезила не приводит к синергическому эффекту на уменьшение числа клеток в этом эксперименте.
Синтез CoQ10 разделяется на две основные части, которые состоят из синтеза структуры кольца и синтеза структуры боковой цепи. Здесь к онкогенным клеткам были добавлены вещества, которые являются предшественниками для компонентов синтеза боковой цепи и структуры кольца. Эти результаты сосредоточены на исследовании 3 основных компонентов, включенных в синтез структуры кольца, и двух компонентов, которые играют роль в присоединении структуры кольца к структуре боковой цепи. Тремя компонентами, показавшими значительное уменьшение Bcl-2 и возрастание каспазы-3 экспрессии, были: 1) L-фенилаланин, 2) L-тирозин и 3) 4-гидроксифенилпируват. Двумя компонентами,
включенными в присоединение боковой цепи к структуре кольца, были: 1) 4-гидроксибензоат и 2) фе-нилацетат.
Эти результаты также показали, что экзогенная доставка этих компонентов в комбинации с 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохиноном (бензохинон) значительно ингибирует пролиферацию клеток. Это показывает, что добавка структуры кольца с компонентами для присоединения боковой цепи к бензо-хиноновму кольцу может дополнительно усилить механизм синтеза CoQ10. Это может также содействовать стабилизации молекулы в поддержании функциональных свойств, необходимых для клеточных процессов. Фенилацетат, являющийся предшественником синтеза 4-гидроксибензоата, который экзо-генно доставляется в комбинации с бензохиноном имеет подобное влияние на онкогенные клетки.
Пример 23. Модуляция генной экспрессии коэнзимом Q10 в клеточной модели диабета.
Коэнзим Q10 является эндогенной молекулой с устоявшейся ролью в поддержании нормальной митохондриальной фукнции, прямо влияя на окислительное фосфорилирование. Существует экспериментальное доказательство, которое демонстрирует способность коэнзима Q10 модулировать внутриклеточные цели, которые служат ключевыми показателями метаболических расстройств, таких как диабеты, таким образом достигая терапевтического эффекта.
Для того чтобы понять, как коэнзим Q10 регулирует экспрессию генов, связанных с причиной или лечением диабета, в качестве экспериментальной модели были использованы иммортальная первичная линия клеток проксимальных канальцев почек, произошедшая из почки человека (HK-2) и первичные культуры гладких мускульных клеток аорты человека (HASMC). The HK-2 и HASMC клетки нормально поддерживаются в культуре с 5,5 мМ глюкозы, которая является концентрацией, связанной с диапазоном, считающимся нормальным для крови человека. Однако для того чтобы симулировать диабетическое окружение, обе клеточные линии впоследствии содержались при 22 мМ глюкозы, что соответствует значениям, наблюдаемым в крови человека, связанным с хронической гипергликемией. Клетки впоследствии дали размножаться через 3 перехода, так что во внутриклеточных регуляционных процессах МВМ функционально адаптировались к диабетическому состоянию. Выбор клеточной линии основывался на физиологическом влиянии диабета на почечную дисфункцию и прогрессию абсолютной почечной недостаточности (ESRD) в добавление к прогрессивной патофизиологии подорванной кардиоваскулярной функции.
Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HK-2 клетках с использованием диабетического ПЦР анализа.
Диабетический ПЦР анализ (SABiosciences) применяется для скринирования 84 генов одновременно. В этом исследовании тестировались следующее 4 обработки: HK-2;
HK-2 Н содержавшаяся при 22 мМ глюкозы; ШС2(Н) +50 мкМ коэнзима Q10; и ШС2(Н) + 100 мкМ коэнзима Q10.
Точный анализ данных ПЦР в режиме реального времени HK-2 образцов по диабетическому анализу (Cat # PAHS-023E, SABiosciences Frederick, Мэриленд) был сделан для того чтобы исключить все результаты, где регуляция генов менее чем в два раза по сравнению с нормальными необработанными HK-2 клетками с значением р менее чем 0,05. Гены, для которых наблюдалось, что они регулируются или хронической гипергликемией, или коэнзимом Q10, перечислены в табл. 63 и их функции и внутриклеточная локация (взятые из Ingenuity Pathway Analysis) перечислены в табл. 64.
Таблица 63
Гены
НК-2(Н)
Кратность
регуляции
знамени ер
НК-2(Н)-50 мкМ Коэнзим Q10 кратность регуляции
знамени ер
НК-2(Н)-100 мкМ Коэнзим Q10
Кратность регуляции
значен" ер
СЕАСАМ1
1,26
0,409
3,47
0,067
5,36
0,032
PIK3C2B
1,48
0,131
2,32
0,115
3,31
0,003
INSR
-1,09
0,568
2,51
0,103
2,88
0,024
TNF
2,00
0,005
2,57
0,042
2,81
0,020
ENPP1
-1,50
0,002
1,42
0,238
2,67
0,038
PRKCB
-1,75
0,005
1,82
0,280
2,49
0,042
DUSP4
1,27
0,318
1,24
0,455
2,26
0,060
SELL
-1,58
0,219
1,77
0,042
2,06
0,021
SNAP25
-1,00
0,934
1,46
0,377
1,97
0,059
Среди детектируемых РНК транскриптов с модулированными уровнями, ракового эмбрионального антигена молекула клеточной адгезии 1 (СЕАСАМ1) была идентифицирована как высоко повышающе регулируемая в HK2(H) клетках, особенно обработкой 100 мкМ коэнзима Q10. СЕАСАМ-1, также известный как CD66a и BGP-I, является 115-200 KD типом I трансмембранного гликопротеина, который принадлежит к субсемейству мембран-связанных СЕА из суперсемейства СЕА. На поверхности клеток он формирует нековалентные гомо- и гетеродимеры. Внеклеточный регион содержит три С2-типа Ig-подобных доменов и один N-терминальный V-тип Ig-подобного домена. Существуют множественные сплайс-вариации, включающие регионы С-терминальные для второго С2-типа домена (аа 320 и далее). Предполагается, что отсутствие интактной экспрессии CEACAM1 у мышей усиливает метаболический синдром, связанный с диабетами, тогда как возрастание экспрессии СЕАСАМ1 связывается с возрастающей инсулиновой интернализацией, которая подтверждает возрастание инсулиновой чувствительности и утилизации глюкозы (например, движения глюкозы из крови в клетки), таким образом смягчая резистентность к инсулину, отличительный признак сахарного диабета 2 типа.
Как показано в табл. 63, экспрессия инсулирового рецептора (INSR) также меняется в диабетических HK-2 клетках, обработанных коэнзимом Q10. Не имея стремления ограничиваться теорией, возрастание экспрессии INSR при обработке коэнзимом Q10 должно усилить чувствительность к инсулину (или одного, или в совокупности с экспрессией СЕАСАМ1) с возможностью развернуть основные физиологические/метаболические трудности, связанные с диабетом.
Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HK-2 клетках с использованием митохондриально-го анализа
Дифференциальная экспрессия митохондриальных генов при диабете оценивалась с использованием митохондриальных анализов (Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick, Мэриленд). Гены, которые регулируются хронической гипергликемией и /или воздействием коэнзима Q10, перечислены в таблице 65, а их функции и локализация перечислены в таблице 66.
Таблица 65
Гены
НК2 (Н)
необработа
ннын
значение
НК-2(Н) 50 мкМ
Коэнзима Q10
р значение
НК-2(Н) 100 мкМ Коэнзима Q10
значение
GRPEL1
-1,5837
0,151255
-2,6512
0,04704
-1,933
0,139161
SLC25A3
-8,6338
0,071951
-8,2059
0,0425
-1,6984
0,995194
ТОММ40
-2,3134
0,140033
-1,1567
0,115407
-1,9509
0,038762
TSPO
-3,6385
0,111056
-6,7583
0,073769
-2,1104
0,167084
На сегодняшни день, роль четырех митохондриальных генов, идентифицированных (табл. 65) в диабетических HK-2 клетках, обработанных коэнзимом Q10, не охарактеризована в диабете.
Исследование 2. Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HASMC клетках с использованием диабетического ПЦР анализа.
Диабетический ПЦР анализ (SABiosciences) позволяет скринировать одновременно 84 гена. 4 обработками, тестированными в этом исследовании, были:
HASMC;
HASMC Н, содержавшиеся в 22 мМ глюкозы; HASMC (Н) + 50 мкМ коэнзима Q10; и HASMC (Н) + 100 мкМ коэнзима Q10.
Точный анализ данных ПЦР в режиме реального времени HASMC образцов по диабетическому анализу (Cat # PAHS-023E, SABiosciences Frederick, Мэриленд) был сделан для того, чтобы исключить все результаты, где регуляция генов менее чем в два раза по сравнению с нормальными необработанными HASMC клетками с значением р менее чем 0,05. Гены, для которых наблюдалось, что они регулируются или хронической гипергликемией, и/или коэнзимом Q10, перечислены в табл. 67.
Таблица 67
Гены
HASMC-(Н)
Г""
HASMC-
03)-50
мкМ
коэнзима
QI0
Г4'""
HASMC-
(Щ-100
мкМ
коэнзима Q10
значение р
AGT
1,3051
0,547507
-1,0169
0,781622
2,3027
0,030195
CCL5
-17,4179
0,013798
-5,3796
0,022489
-4,6913
0,022696
СЕАСАМ1
-5,5629
0,012985
-5,3424
0,014436
-5,8025
0,012948
IL6
2,7085
0,049263
3,8172
0,012685
6,0349
0,000775
INSR
1,4649
0,207788
1,9622
0,081204
2,0801
0,016316
NFKB1
1,482
0,072924
1,3779
0,191191
2,0898
0,027694
PIK3C2B
2,0479
0,218276
1,4331
0,254894
2,6329
0,069422
SELL
¦1,9308
0,087513
1,2476
0,393904
4,0371
0,000177
TNF
-1,814
0,108322
-3,2434
0,043526
-1,8489
0,133757
В клетках HASMC, обработка гипергликемичных клеток коэнзимом Q10 привела к изменению экспрессии в генах, включенных в регуляцию васкулярной фукнции (AGT), чувствительности к инсулину (СЕАСАМ1, INSR, SELL) и воспалительной/иммунной функции (IL-6, TNF, CCL5). Не имея стремления ограничиваться теорией, возрастание экспрессии INSR может быть связано с возрастанием инсулиновой чувствительности в HASMC клетках, которая является физиологическим свойством, которое благоприятно для лечения диабета, тогда как IL-6, в дополнение к своим иммунорегулирующим свойствам, как преполагается, действует на гомеостаз и метаболизм глюкозы, как прямо, так и опосредованно, путем действия на скелетные мышечные клетки, адипоциты, гепаоциты, панкреатические р-клетки и нейроэндокринные клетки. Перед активацией нормальная Т-клетка экспрессирует и секрети-рует RANTES и хемокиновый (C-Cmotif) лиганд (CCL5). CCL5 экспрессируется адипоцитами, и уровни RANTES в сыворотке возрастают при ожирении и диабете 2 типа. Однако, как показано в табл. 67, обработка HASMC клеток коэнзимом Q10 приводит к значительному уменьшению экспрессии CCL5. Основываясь на вышеизложенных данных, мы надеемся, что введение коэнзима Q10 будет давать терапевтическую пользу в лечении диабета.
Действие коэнзима Q10 на экспрессию генов в HASMC клетках с использованием митохондри-ального анализа
Различная экспрессия митохондриальных генов была исследована с использованием митохондри
ального анализа (Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick, Мэриленд). Гены, которые регулируются или хронической гипергликемией, и/или коэнзимом Q10, показаны в табл. 68.
Таблица 68
Гены
HASMC-(Н)
значение
HASMC-(Н) 50 мкМ коэнзима Q10
значение
HASMC-
(Н)-100
мкМ
коэнзима
Q10
значение р
BCL2L1
-1,6558
0,244494
-2,7863
0,008744
-2,3001
0,014537
MFN1
-1,4992
0,317009
-1,2585
0,021185
-2,2632
0,005961
PMAIP1
-4,7816
0,206848
-6,8132
0,000158
-4,352
0,000286
SLC25A1
-2,2051
0,020868
-1,834
0,00581
-3,0001
0,03285
SLC25A13
-2,0527
0,035987
-1,5
0,029019
-1,5245
0,043712
SLC25A39
-1,0699
0,417217
-1,4257
0,104814
-2,1214
0,007737
SLC25A22
-2,1747
0,007344
-1,9839
0,0013
-10,3747
0,003437
TIMM44
-1,3605
0,414909
-2,3214
0,004118
-1,9931
0,010206
ТОММ40
-1,1982
0,428061
-2,0922
0,002195
-2,2684
0,003272
TSPO
-1,402
0,304875
-2,0586
0,061365
-2,3647
0,044656
Обработка гипергликемичных HASMC клеток коэнзимом Q10 привела к изменению экспрессии в генах, которые регулируют программируемую клеточную гибель или апоптоз (BCL2L1, PMIAP1 также известный как NOXA), белки транспортеры (SLC25A1 [транспортер цитрата], SLC25A13 [антипортер аспартата-глутамата], SLC25A19 [транспортер тиамин пирофосфата] и SLC25A22 [глутамат-гидроген котранспортер]) и белки транспорта в митохондриальном матриксе (MFN1, TIMM44 и ТОММ40). Активность этих транспортеров играет важную роль в регуляции предшественников, необходимых для цикла Кребса и поддержания митохондриального окислительного фосфорилирования. Эти результаты показывают, что воздействие на диабетические клетки HASMC коэнзимом Q10 связано с изменениями в экспрессии цитоплазматических и митохондриальных генов, что в свою очередь согласуется с тем, что коэнзим Q10 предоставляет терапевтическую пользу в лечении диабета.
Сравнение с данными, наблюдаемыми при воздействии на HASMC клетки и HK-2 клетки коэнзи-мом Q10 или в гипергликемическом окружении, показывает, что 4 гена обычно регулируются коэнзи-мом Q10 в обеих клеточных линиях (например, PIK3C2B и SELL в анализе генной экспрессии и ТОММ40 и TSPO в митохондриальном анализе). Эти результаты демонстрируют, что воздействие на клетки в диабетическом состоянии коэнзимом Q10 связано с изменением экспрессии генов, про которых известно, что они связаны с причиной или лечением диабета.
Эквиваленты.
Специалисты в данной области распознают, или будут способны распознать, используя лишь обычные эксперименты, многие эквиваленты определенным воплощениям и способам, описанным в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты полностью включены в объем следующей формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Дзе Реджентс ов дзе Юниверсити ов Калифорния Хорвитц, Рейчел Э. Даудна, Дженнифер А. Внденхефт, Блейк Инек, Мартин
<120> КОМПОЗИЦИИ ЭНДОРИБОНУКЛЕАЗ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> BERK-U8WO
<150> US 61/413,287 <151> 2010-U-12
<150> US 61/365,627 <151> 2010-07-19
<150> US 61/333,163 <151> 2010-05-10
<160> 103
<] 70> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> I
guucacugcc guauaggcag cuaagaaa 28
<210> 2 <21]> 204 <212> PRT
<213> Moritella sp. PE36 <400> 2
Met Leu Asn Arg Phe Tyr Phe Tyr He Lys Phe He Pro Gin His Thr
15 10 15
Asp Asn Ala Phe Leu He Gly Arg Cys He Lys Val Ser His Ala Phe
20 25 30
Phe Ala Lys His Ser He Thr Gly Val Gly Val Ser Phe Pro Cys Trp
35 40 45
Ser Glu Gin Asp He Gly Asn Ala Leu Ala Phe Val Ser Thr Asp Met
50 55 60
Glu Ala Leu Glu Gin Leu Lys Ala Gin Pro Leu Phe Ser Val Met Ala
65 70 75 80
Asp Glu Leu He Phe Glu He Ser Asp Val Leu Ser He Pro Asp Lys
85 90 95
Leu Glu Glu Glu Arg Phe Thr Leu Asn Tyr Ala He Arg Lys Ser Phe
100 105 110
Ala Gly Asp Lys Lys Arg Arg Leu Lys Arg Ala Lys Lys Arg Ala Glu
115 120 125
Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Lys Pro Val Leu His lie Asrt Thr Glu Lys
130 135 140
Arg Val Phe Asn His Tyr His Thr He Pro Met Asn Ser Lys Gtu Lys
145 150 155 160
Pro Asp Gly Phe Thr Leu His Val Gin Lys Asn Pro Cys Val Glu Gin
165 170 175
Tyr Ala Ala Asp Phe Leu Asp Tyr Gly Phe Ala Thr Asn Glu Gin His
180 185 190
Arg Gly Thr Val Pro Lys Leu Ser Ser Leu Met Lys 195 200
<210> 3 <211> 192 <212> PRT
<213> Moritella sp. PE36 <400> 3
Met Asp Val Phe Leu Leu Ser Gly Arg Cys Ala Lys Ala Leu His Asn
15 10 15
Phe Glu Phe Lys Lys Arg Lys His Asn He Gly He Ala Leu Pro Cys
20 25 30
Trp Ser Glu Asn Ser Val Gly Asp Met He Ala Phe Val Ser Glu Asp
35 40 45
Lys Asn Gin Leu Leu Lys Phe His Gin Asp Ser Tyr Phe Gin Met Met
50 55 60
Ala Ser Asp Glu He Phe He He Ser Asp He Thr Ala Val Asn Ser
65 70 75 80
Glu Leu Pro Glu Val Gin Phe Cys Arg Asn Asn Thr He Ser Lys Met
85 90 95
Phe He Lys Asp Thr Gin Lys Arg Leu Arg Arg Thr Gin Lys Arg Ala
100 105 110
Glu Ala Arg Gly Asp Ala Phe Lys Pro Ala Leu His Glu Asn Ser Lys
115 120 125
Lys Arg Val Phe Glu Asn Phe His Ser Leu Pro lie Asp Ser Tyr Gly
130 135 140
Thr Glu Glu Asp Phe Met Leu His He Gin Lys His Asn Asp Val Ala
145 150 155 160
Leu Ser Asp Cys Tyr Thr Ser Tyr Gly Phe Ala Thr Asn Asn Asp Asn
165 170 175
Arg Gly Thr Val Pro Asp Met Ser He Leu Phe Asn Gin Met Thr Lys
180 185 190
<210> 4 <211> 224 <212> PRT
<213> Shewanella sp. W3-18-1 <400> 4
Met Lys Tyr Tyr Leu Asp He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Ala Asn
15 10 15
Leu Gly Phe Leu Trp His Lys Val Tyr Gin Gin He His Leu Met Leu
20 25 30
Val Glu His Lys Val Ser Val Glu Asn Ser Ala He Gly Leu Ser Phe
35 40 45
Pro Lys Tyr Asp Ala Lys Ser Phe Ser Asp Asn Thr Lys Phe Pro Leu
50 55 60
Gly Asp Lys Leu Arg Leu Phe Ala Gly Thr Glu Gin Gin Leu Ala Asp
65 70 75 80
Leu Lys Val Ala Gin Trp Leu Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Val His lie
85 90 95
Lys Ala He Lys Ala Val Pro Asp Asn Val Ser Glu Tyr Ala Tyr Phe
100 105 110
Lys Arg Arg His Phe Lys Ser Pro Asp Lys Leu Arg Arg Asn He Asp
115 120 125
Ala Arg Ala He Val He Ala Gin Lys Asn Gly Phe Ala He Asn Glu
130 135 140
Val Lys Thr Arg Leu Leu Ala Ser He Asp Asn Leu Asp Thr Lys Ser
145 150 155 160
Lys Leu Pro Phe He Asn Leu Arg Ser Leu Ser Thr Glu Lys Asp Val
165 170 175
Ser Pro Ala Asp Arg Arg Lys Phe Leu Leu Phe He Glu Cys Glu Lys
180 185 190
Val Thr Lys Pro Ser Gin Asn Asn Gly Leu Phe Asn Cys Tyr Gly Leu
195 200 205
Ser Arg Arg Ala Gin Thr Glu Gin Ala Ala Val Pro Trp Phe Glu Gly
210 215 220
<210> 5
<211> 167
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 5
Met Ser Val Leu Phe Gly Lys Leu His Gin Ala Leu Val Ala Gin Gly
15 10 15
Gly Asp Arg He Gly Val Ser Phe Pro Asp Leu Asp Glu Ser Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Gly Glu Arg Leu Arg He His Ala Ser Ala Asp Asp Leu Arg
35 40 45
Ala Leu Leu Ala Arg Pro Trp Leu Glu Gly Leu Arg Asp His Leu Gin
50 55 60
Phe Gly Glu Pro Ala Val Val Pro His Pro Thr Pro Tyr Arg Gin Val
65 70 75 80
Ser Arg Val Gin Ala Lys Ser Asn Pro Glu Arg Leu Arg Arg Arg Leu
85 90 95
Met Arg Arg His Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg Lys Arg He Pro
100 105 110
Asp Thr Val Ala Arg Ala Leu Asp Leu Pro Phe Val Thr Leu Arg Ser
115 120 125
Gin Ser Thr Gly Gin His Phe Arg Leu Phe lie Arg His Gly Pro Leu
130 135 140
Gin Val Thr Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Tyr Gly Leu Ser Lys
145 150 155 160
Gly Gly Phe Val Pro Trp Phe
165
<210> 6 <2U> 187 <212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 6
Met Asp His Tyr Leu Asp lie Arg Leu Arg Pro Asp Pro Glu Phe Pro
15 10 15
Pro Ala Gin Leu Met Ser Val Leu Phe Gly Lys Leu His Gin Ala Leu
20 25 30
Val Ala Gin Gly Gly Asp Arg He Gly Val Ser Phe Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Glu Ser Arg Ser Arg Leu Gly Glu Arg Leu Arg He His Ala Ser Ala
50 55 60
Asp Asp Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Pro Trp Leu Glu Gly Leu Arg
65 70 75 80
Asp His Leu Gin Phe Gly Glu Pro Ala Val Val Pro His Pro Thr Pro
85 90 95
Tyr Arg Gin Val Ser Arg Val Gin Val Lys Ser Asn Pro Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Arg Arg Leu Met Arg Arg His Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg
115 120 125
Lys Arg He Pro Asp Thr Val Ala Arg Ala Leu Asp Leu Pro Phe Val
130 135 140
Thr Leu Arg Ser Gin Ser Thr Gly Gin His Phe Arg Leu Phe He Arg
145 150 155 160
His Gly Pro Leu Gin Val Thr Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Tyr
165 170 175
Gly Leu Ser Lys Gly Gly Phe Val Pro Trp Phe 180 185
<210> 7
<2I1> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 7
guucacugcc guguaggcag cuaagaaa 28
<210> 8 <2U> 187 <212> PRT
<213 > Pseudomonas aeru g in osa <400> 8
Met Asp His Tyr Leu Asp He Arg Leu Arg Pro Asp Pro Glu Phe Pro
15 10 15
Pro Ala Gin Leu Met Ser Val Leu Phe Gly Lys Leu His Gin Ala Leu
20 25 30
Val Ala Gin Gly Gly Asp Arg He Gly Val Ser Phe Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Glu Ser Arg Ser Arg Leu Gly Glu Arg Leu Arg He His Ala Ser Ala
50 55 60
Asp Asp Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Pro Trp Leu Glu Gly Leu Arg
65 70 75 80
Asp His Leu Gin Phe Gly Glu Pro Ala Val Val Pro His Pro Thr Pro
85 90 95
Tyr Arg Gin Val Ser Arg Val Gin Ala Lys Ser Asn Pro Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Arg Arg Leu Met Arg Arg His Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg
115 120 125
Lys Arg He Pro Asp Thr Val Ala Arg Thr Leu Asp Leu Pro Phe Val
130 135 140
Thr Leu Arg Ser Gin Ser Thr Gly Gin His Phe Arg Leu Phe He Arg
145 150 155 160
His Gly Pro Leu Gin Ala Thr Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Tyr
165 170 175
Gly Leu Ser Lys Gly Gly Phe Val Pro Trp Phe 180 185
<210> 9 <211> 187 <212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 9
Met Asp His Tyr Leu Asp He Arg Leu Arg Pro Asp Pro Glu Phe Pro
15 10 15
Pro Ala Gin Leu Met Ser Val Leu Phe Gly Lys Leu His Gin Ala Leu
20 25 30
Val Ala Gin Gly Gly Asp Arg He Gly Val Ser Phe Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Glu Ser Arg Ser Arg Leu Gly Glu Arg Leu Arg He His Ala Ser Ala
50 55 60
Asp Asp Leu His Ala Leu Leu Ala Arg Pro Trp Leu Glu Gly Leu Arg
65 70 75 80
Asp His Leu Gin Phe Gly Glu Ala Ala Val Val Pro His Pro Thr Pro
85 90 95
Tyr Arg Gin Val Ser Arg Val Gin Ala Lys Ser Asn Pro Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Arg Arg Leu Met Arg Arg His Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg
115 120 125
Lys Arg He Pro Asp Thr Val Ala Arg Thr Leu Asp Leu Pro Phe Val
130 135 140
Thr Leu Arg Ser Gin Ser Thr Gly Gin His Phe Arg Leu Phe He Arg
145 150 155 160
His Gly Pro Leu Gin Ala Thr Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Tyr
165 170 175
Gly Leu Ser Lys Gly Gly Phe Val Pro Trp Phe 180 185
<210> 10 <211> 184 <212> PRT
<213> Dickey a dadantii <400> 10
Met Asp His Tyr He Glu He Arg Val Leu Pro Asp Leu Glu Phe Ser
15 10 15
Ala Val Gin Leu Leu Ser Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Gin Arg Ala Thr Gly Ala He Gly Val Ser Phe Pro Asp Val Asp
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Glu Arg Leu Arg Leu His Gly Ser Val Gin Glu Leu
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Gin Thr Gly Trp Leu Lys Gly Leu Arg Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Ala He Thr Glu Pro Leu Pro Val Pro Ala Gly Ala Lys His Arg Thr
85 90 95
Val Arg Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ala Val Ser Lys Gly Arg Met Thr Glu Asp Glu Ala Ala Thr Arg He
115 120 125
Pro Tyr Ala Val Glu Lys Arg Ser Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Leu Arg
130 135 140
Ser Leu Ser Ser Gly Gin Thr Phe Leu Leu Phe Val Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Leu Gin Asp Lys Pro Val Ala Gly Ala Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Thr Thr He Pro Trp Phe 180
<2I0> 11 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 11
guucacugcc gcguaggcag cuuagaaa 28
<210> 12 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 12
guucacugcc gaguaggcag cuuagaaa 28
<210> 13 <211> 184 <212> PRT
<213> Pectobacteriumwasabiae <400> 13
Met Asp His Tyr He Asp He Arg Val Gin Pro Asp Pro Glu Phe Thr
15 10 15
Ala Pro Gin Leu Leu Asn Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Gin Leu Ala Asp Gly Lys lie Gly He Ser Phe Pro Glu Val Gly
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu His Gly Thr Ala Asp Ala Leu
50 55 60
Ser Thr Leu Glu Lys Thr Ser Trp Leu Lys Gly Leu Arg Asp Тут Thr
65 70 75 SO
Gin Val Ser Glu Cys Lys Ala Val Pro Asn Asn Val Lys Phe Arg Tru-
ss 90 95
Val Arg Arg Val Gin Leu Lys Thr Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ser Val Asn Lys Gly Trp Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Ala Arg He
115 120 125
Pro Asp Ala Val Glu Lys Arg Ser Thr Leu Pro Phe Val Gin He Lys
130 135 140
Ser Leu Ser Asn Gly Gin Met Phe Phe Val Phe Val Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Leu Gin Asn Ala Pro Ala Thr Gly Arg Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Ala Thr Val Pro Trp Phe 180
<210> 14
<2U> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 14
guucacugcc guauaggcag cuuagaaa 28
<210> 15 <211> 184 <212> PRT
<213> Photorhabdus asymbiotica <400> 15
Met Asp Tyr Tyr Phe Glu He Leu Val Leu Pro Asp Pro Glu Phe Ser
15 10 15
Lys Gin Ser Leu Met Glu Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Gin Val Gly Asn Gly Arg He Gly Val Ser Phe Pro Cys Ala Arg
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Asp Lys Leu Arg He His Gly Ala Ser Glu Ala Leu
50 55 60
Asn Asp Leu Gin Ala Leu Pro Trp Leu Lys Gly Leu Arg Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Glu He Met Asp He Gin Pro Val Pro Gin Asp Thr Gin Tyr Arg Arg
85 90 95
Val Ser Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ser lie Lys Lys Gly Trp Leu Thr Glu Glu Gin Ala Arg Gin Arg He
115 120 125
Pro He Ser Lys Glu Gin Arg Thr His Leu Pro Phe Leu Leu Val Lys
130 135 140
Ser Leu Ser Ser Arg Gin Thr Phe Pro Leu Phe He Glu Gin Gly Pro
145 150 155 160
He Glu Asp Lys Pro Thr Pro Gly Val Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Ser Ala Thr He Pro Trp Phe 180
<210> 16 <211> 29 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 16
guucacuguc guacaggcag cuuagaaaa 29
<210> 17 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 17
gugcacugcc guacaggcag cuuagaaa 28
<210> 18 <211> 24 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 18
acugccguac aggcaguuua gaaa 24
<210> 19
<21l> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 19
guucacugcc gcacaggcag cuuagaaa 28
<2Ю> 20
<2ll> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 20
guguacugcc guacaggcag cuuagaaa 28
<210> 21
<2U> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 21
guucacugcc guacaggcag cuuagaaa 28
<210> 22 <211> 184 <212> PRT
<213> Dickey a dadantii <400> 22
Met Asp His Тут He Glu He Arg Val Leu Pro Asp Pro Glu Phe Ser
15 10 15
Gly Val Gin Leu Leu Ser Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Gin Arg Ala Thr Gly Ala He Gly Val Ser Phe Pro Asp Ala Gly
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Glu Arg Leu Arg Leu His Gly Ser Val Gin Glu Leu
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Gin Thr Gly Trp Leu Arg Gly Leu Arg Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Ala He Thr Glu Pro Leu Pro Val Pro Ala Gly Val Lys His Arg Thr
85 90 95
Val Arg Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ala Val Asn Lys Gly Arg Met Thr Val Asp Glu Ala Asp Ala Arg He
115 120 125
Pro Tyr Thr Val Glu Lys Arg Thr Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Leu Arg
130 135 140
Ser Leu Ser Asn Gly Gin Thr Phe Leu Leu Phe Val Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Leu Gin Asp Lys Pro Val Ala Gly Ala Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Val Ala Thr He Pro Trp Phe 180
<210> 23 <2ll> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 23
guucacugcc guguaggcag cuuagaaa 28
<210> 24 <211> 188 <212> PRT
<213> Xanthomonas albilineans <400> 24
Met Gin His Tyr Leu Asp Leu His Leu Arg Pro Asp Pro Glu Leu Ala
15 10 15
Pro Tyr Gin Leu Leu Gly Ala Leu Tyr Ala Arg Leu His Arg Ser Leu
20 25 30
Val Thr Leu Asn Thr Thr Arg lie Gly Val Ser Phe Pro Gly His Asp
35 40 45
Asn Arg Val Pro Thr Leu Gly Thr His Leu Arg Leu His Gly Asp Asp
50 55 60
Ser Thr Leu His His Leu Met Ala Thr Thr Trp Leu His Gly Val Arg
65 70 75 80
Asp His Val Thr He Thr Ser He Gly Ala Val Pro Ser Glu Ala Val
85 90 95
Hts Arg Gin Val Thr Arg Val Gin Ala Lys Ser Ser Pro Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Arg Arg Ala Met Arg Arg His Gly He Ser Glu Asp Leu Ala Val
115 120 125
Gin Arg He Pro Asp Ser Ala Ala Glu Gin Leu Arg Leu Pro Phe Val
130 135 140
Val Leu Gly Ser Arg Ser Thr Gly Gin Thr Ala Phe Pro Val Phe Val
145 150 155 160
Arg His Gly Pro Val Gin Gin Glu Pro Val Pro Gly Asp Phe Ser Ser
165 170 175
Tyr Gly Leu Ser Arg Gly Ala Thr Val Pro Trp Phe 180 185
<210> 25 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 25
guucacugcc guguaggcag cucagaaa 28
<210> 26 <211> 27 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 26
uucacugccg uguaggcagc ucagaaa 27
<210> 27 <211> 28 <212> RNA
<213 > Ис кусственная последовател ь ность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 27
guucacugcc guauaggcag cucagaaa 28
<210> 28 <2И> 184 <212> PRT
<213> Pectobacterium atrosepticum <400> 28
Met Asp His Tyr He Asp He Arg Val Gin Pro Asp Pro Glu Phe Thr
15 10 15
Ala Ser Gin Leu Leu Asn Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Val Leu
20 25 30
Gly Gin Leu Ala Asn Gly Lys He Gly He Ser Phe Pro Glu Val Gly
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu His Gly Thr Glu Asp Ala Leu
50 55 60
Ser Thr Leu Glu Lys Thr Ser Trp Leu Lys Gly Leu Arg Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Gin Val Ser Glu Cys Lys Val Val Pro Asn Gly Val Lys Phe Arg Thr
85 90 95
Val Arg Arg Val Gin Leu Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ser Val Ser Lys Gly Trp Leu Thr Ala Ala Glu Ala Ala Ala Arg lie
115 120 125
Pro Asp Ala Val Glu Lys Arg Ser Ala Leu Pro Phe Val Gin He Lys
130 135 140
Ser Leu Ser Asn Gly Gin Met Phe Phe Val Phe Val Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Leu Gin Asn Ala Pro Thr Ala Gly Arg Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Thr Glu Ala Thr Val Pro Trp Phe 180
<210> 29 <211> 184 <212> PRT
<213> Photorhabdus luminescens <400> 29
Met Asp Tyr Tyr Leu Glu He Arg Val Leu Pro Asp Leu Glu Phe Ser
15 10 15
Gin Gin Ser Leu Phe Glu Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Gin Leu Ser Asn Gly Gin Val Gly Val Ser Phe Pro Cys Ala Arg
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Asp Thr Leu Arg He His Gly Ser Ser Glu Ala Leu
50 55 60
Asn Asp Leu Gin Ala Leu Pro Trp Leu Lys Gly Leu Arg Asp Tyr Thr
65 70 75 80
Glu Val He Asp He Gin Pro He Pro Gin Glu Thr Lys Tyr Arg Cys
85 90 95
Val Ser Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ala He Lys Lys Gly Trp Leu Thr Gly Glu Gin Ala Arg Gin Arg He
115 120 125
Pro He Ser Lys Glu Gin Arg Thr His Leu Pro Phe Leu Phe Leu Lys
130 135 140
Ser Leu Ser Ser Gly Gin Ser Phe Leu Leu Phe Val Lys Gin Gly Pro
145 150 155 160
He Gin Asp Lys Pro Thr Ser Gly He Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ser Ser Ala Thr He Pro Trp Phe 180
<2I0> 30 <211> 188 <212> PRT
<213> Desulfurivibrio alkaliphilus
<400> 30
Met Val Met Ala Met Asp Cys Tyr Val Glu He Ser Leu Leu Pro Asp
15 10 15
Pro Glu Phe Pro Asp Ser He Leu Met Asn Ala Leu Phe Ala Lys Leu
20 25 30
His Arg Ala Leu Ala Glu Asn Gly Lys Gin Glu He Gly Val Ser Phe
35 40 45
Pro Glu Phe Gly Lys Lys Leu Asn Ser Lys Leu Arg He His Gly Ser
50 55 60
Glu Glu Ser Leu Lys Arg Leu Met Asp Leu Asn Trp lie Gin Gly Met
65 70 75 80
Lys Asp Tyr Thr Arg Val Ser Gly lie Ala Lys Val Pro Asp Ser Cys
85 90 95
Gin Tyr Arg Thr Val Lys Arg Val Gin Ala Lys Ser Ser Val Asp Arg
100 105 110
Leu Tyr Arg Arg Ser Val Lys Lys Gly Trp Leu Ser Glu Glu Asn Ala
115 120 125
Glu Gin Gin Lys Glu Arg Ala Arg Glu Gly Arg Leu Lys Leu Pro Phe
130 135 140
Val Gin Leu Lys Ser Gin Thr Thr Gly Gin Gin Phe Arg Leu Phe He
145 150 155 160
Gin His Gly Ser Leu Gin Glu Lys Pro Val Thr Gly Arg Phe Ser Ser
165 170 175
Tyr Gly Leu Ser Asn Glu Ala Thr Val Pro Trp Phe 180 185
<210> 31 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 31
guucacugcc gcacaggcag cucagaaa 28
<210> 32 <211> 184 <212> PRT <213> Dickeyazeae
<400> 32
Met Asp His Туг Не Glu lie Arg Val Leu Pro Asp Leu Glu Phe Ser
15 10 15
Ala Val Gin Leu Leu Ser Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Gin Gin Ala Thr Gly Ala He Gly Val Ser Phe Pro Asp Val Gly
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Glu Arg Leu Arg Leu His Gly Ser Glu Gin Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Leu Glu Gin Thr Gly Trp Arg Thr Gly Leu Arg Asp Tyr Ser
65 70 75 80
Thr He Thr Asp Val Leu Thr Val Pro Thr Gly Ala Gin Tyr Arg Thr
85 90 95
Val Arg Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ala Val Ser Lys Gly Trp Leu Thr Ala Asp Glu Ala Ala Ala Arg He
115 120 125
Pro Tyr Ala Val Glu Lys Arg Thr Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Leu Arg
130 135 140
Ser Leu Ser Ser Gly Gin Pro Phe Leu Leu Phe Val Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Leu Gin Asp Lys Pro Val Ala Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Ala Thr lie Pro Tip Phe 180
<210> 33
<211> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 33
gugcacugcc guauaggcag cuuagaaa 28
<210> 34
<2ll> 184
<212> PRT
<213> Yersiniapestis
<400> 34
Met Asp His Tyr Leu Asp He Arg Val Leu Pro Asp Pro Glu Phe Ser
15 10 15
Ala Gin Thr Leu Leu Glu Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Val Ala Thr He Pro Gly Arg Val Gly Val Ser Phe Pro Thr Ala Gly
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Ser Gin Leu Arg Leu His Gly Ser Arg Gly Asp Leu
50 55 60
Leu Glu Leu Gin Ser Ala Gly Trp Leu Lys Gly Leu Gin Asp Tyr Cys
65 70 75 80
Glu Cys Ser Glu He Leu Pro Val Pro Ala Asp Val Lys His Arg Thr
85 90 95
He Arg Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Gin Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ser Val Ser Lys Gly Trp Leu Thr Glu Glu Gin Ala Arg Leu Arg He
115 120 125
Pro Asp Ser His Asp Lys Arg Cys Asp Leu Pro Phe Leu Arg Leu Lys
130 135 140
Ser Arg Ser Ser Glu Gin Tyr Phe Leu Leu Phe He Glu Gin Gly Thr
145 150 155 160
Leu Gin Ala Ser Ala Thr Thr Gly Glu Phe Ser Ala Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Val Asn Ala Thr lie Pro Trp Phe 180
<210> 35 <211> 30 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 35
uguucacugc cgcacaggca gcuuagaaaa 30
<210> 36 <211> 184 <212> PRT
<213> Dickeya dadantii
<400> 36
Met Asp His Tyr He Glu He Arg Val Leu Pro Asp Pro Glu Phe Ser
15 10 15
Ala Val Gin Leu Leu Ser Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Gin Arg Ala Thr Gly Asp He Gly Val Ser Phe Pro Asp Ala Gly
35 40 45
Lys Thr Leu Gly Glu Arg Leu Arg Leu His Gly Ser Val Gin Ala Leu
50 55 60
Ala Ala Leu Glu Gin Thr Gly Trp Leu Lys Gly Leu Arg Asp Tyr Ser
65 70 75 80
Thr He Thr Asp Val Leu Thr Val Pro Thr Gly Ala Gin Tyr Arg Thr
85 90 95
Val Arg Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ala Val Ser Lys Gly Arg Met Thr Ala Asp Glu Ala Ala Ala Arg He
115 120 125
Pro Tyr Ala Ala Glu Lys Arg Thr Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Leu Arg
130 135 140
Ser Leu Ser Ser Gly Gin Thr Phe Leu Leu Phe Val Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Leu Gin Glu Lys Pro Val Ala Gly Val Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala He Ala Thr He Pro Trp Phe 180
<210> 37 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 37
gugaacugcc gcauaggcag cuuagaaa 28
<210> 38
<211> 198
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 38
Met Ala Val Ser Leu Val Arg Asn Arg Asn Lys Glu Leu Pro Met Asp
15 10 15
His Tyr Leu Glu He Arg Val Leu Pro Asp Pro Glu Phe Ser Ser Glu
20 25 30
Met Leu Met Ala Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Val Leu Gly Ala
35 40 45
Arg Gly Gin Gly Asp He Gly Val Ser Phe Pro Asp Val Asn Val Met
50 55 60
Pro Gly Ala Arg Leu Arg Leu His Gly Ser Ala Gin Ala Leu Gin Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ala Ser Thr Trp Arg Lys Gly Leu Thr Asp Tyr Cys Gin Cys
85 90 95
Ser Pro Val Thr Pro Val Pro Glu He Lys Gly Trp Arg Val Val Ser
100 105 110
Arg Val Gin Val Lys Ser Asn Pro Gin Arg Leu Leu Arg Arg Ser Val
115 120 125
Lys Lys Gly Trp Leu Thr Glu Glu Gin Ala He Glu Arg Leu Ala Thr
130 135 140
Gin Ala Glu Gin Arg Thr Asp Leu Pro Phe Leu Asn Met Lys Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ser Gin Gin Leu Phe Lys Leu Phe He Arg His Gly Asp Leu Leu
165 170 175
Lys Glu Pro Val Lys Gly Glu Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser Ala Thr
180 185 190
Ala Thr He Pro Trp Phe 195
<210> 39
<211> 184
<212> PRT
<113> Escherichia coli
<400> 39
Met Asp His Tyr Leu Glu He Arg Val Leu Pro Asp Pro Glu Phe Ser
15 10 15
Ser Glu Met Leu Met Ala Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Val Leu
20 25 30
Gly Ala Arg Gly Gin Gly Asp He Gly Val Ser Phe Pro Asp Val Asn
35 40 45
Val Met Pro Gly Ala Arg Leu Arg Leu His Gly Ser Ala Gin Ala Leu
50 55 60
Gin Ala Leu Glu Ala Ser Thr Trp Arg Lys Gly Leu Thr Asp Tyr Cys
65 70 75 80
Gin Cys Ser Pro Val Thr Pro Val Pro Glu lie Lys Gly Trp Arg Val
85 90 95
Val Ser Arg Val Gin Val Lys Ser Asn Pro Gin Arg Leu Leu Arg Arg
100 105 110
Ser Val Lys Lys Gly Trp Leu Thr Glu Glu Gin Ala He Glu Arg Leu
115 120 125
Ala Thr Gin Ala Glu Gin Arg Thr Asp Leu Pro Phe Leu Asn Met Lys
130 135 140
Ser Leu Ser Ser Gin Gin Leu Phe Lys Leu Phe He Arg His Gly Asp
145 150 155 160
Leu Leu Lys Glu Pro Val Lys Gly Glu Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Ala Thr He Pro Trp Phe ISO
<210> 40 <211> 184 <212> PRT
<213> Tolumonas auensis <400> 40
Met Asp His Tyr Leu Asp He Arg Leu Leu Pro Glu Glu Pro Glu Val
15 10 15
Ser Glu Ser Phe Leu Leu Asn Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Val Arg
20 25 30
Leu Gly Gin Gin Ala Gin Gly Arg Val Gly Val Ser Phe Pro Asp His
35 40 45
His Lys Arg Leu Gly Asp Leu Leu Arg Leu His Gly Gin Arg Thr Asp
50 55 60
Leu Gin Ala Leu Met Ala Asp Asp Trp Leu Gin Gly Leu Lys Gly Tyr
65 70 75 80
Thr Gin Cys Ser Glu Val Leu Pro He Pro Ala Thr Val Ser Tyr Arg
85 90 95
Ala Val Lys Arg Val Gin Ala Lys Ser Ala His Asn Lys Arg Gin Arg
100 105 110
Ser He Ala Lys Gly Trp Leu Thr Glu Ser Glu Ala Gin He Arg He
115 120 125
Pro Asp Thr Gin Gin Lys Glu Leu His Leu Pro Phe Val Gin Leu Lys
130 135 140
Ser Arg Ser Asn Gly Gin Met Met Arg Val Tyr Val Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Val Leu Ala Val Pro Val Ser Gly Tyr Phe Asn Ala Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ser He Ala Thr He Pro Trp Phe 180
<210> 41
<2U> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 41
cuucacugcc gcacaggcag cuuagaaa 28
<210> 42 <211> 184 <212> PRT
<213> Erwinia pyrifoliae <400> 42
Met Asp His Tyr Gin Asp lie Arg Val Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly
15 10 15
Glu Ala Val Leu Leu Ala Gin Val Phe Met His Leu His Gin Val Leu
20 25 30
Met Arg Ala Ala Asn Gly Arg He Gly He Ser Phe Pro Asn Val Lys
35 40 45
Arg Thr Leu Gly Asp Arg He Arg Leu His Gly Thr Leu Asp Asp Leu
50 55 60
Ser Ala Leu Gin Gin Ser Gly Trp Asn Lys Cys Leu Arg Asp Tyr He
65 70 75 80
Ala Cys Ser Asp He Ala Pro Val Pro Lys Gly Ala Ala Trp Arg Thr
85 90 95
Val Arg Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ser Val Asn Lys Gly Trp Leu Ser Glu Gin Glu Ala Ala Glu Arg lie
115 120 125
Ser Vat Leu Asn Glu Gin Arg Ser Asn Leu Pro Phe Leu Gin lie Lys
130 135 140
Ser Gly Ser Asn Gly Gin Ala Trp Arg Leu Phe He Glu His Gly Ser
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Pro Ser Asp Gly Ser Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Ala Ala Thr He Pro Trp Phe 180
<210> 43 <211> 28 <212> RNA
<213 > Искусствен ная последовател ь ность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 43
uucacugccg uacaggcagc uuagaaaa 28
<210> 44
<211> 198
<212> PRT
<213> Escherichia со И
<400> 44
Met Ala Val Ser Leu Val Arg Asn Arg Asn Lys Glu Leu Pro Met Asp
15 10 15
His Tyr Leu Glu He Arg Val Leu Pro Asp Pro Glu Phe Ser Ser Glu
20 25 30
Met Leu Met Ala Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Val Leu Gly Ala
35 40 45
Arg Gly Gin Gly Asp He Gly Val Ser Phe Pro Asp Val Asn Val Met
50 55 60
Pro Gly Thr His Leu Arg Leu His Gly Ser Ala Gin Ala Leu Gin Glu
65 70 75 80
Leu Glu Ala Ser Thr Trp Arg Lys Gly Leu Thr Asp Tyr Cys Gin Cys
85 90 95
Ser Pro Val Thr Pro Val Pro Glu He Lys Gly Trp Arg Val Val Ser
100 105 110
Arg Val Gin Val Lys Ser Asn Pro Gin Arg Leu Leu Arg Arg Ser Val
115 120 125
Lys Lys Gly Trp Leu Thr Glu Glu Gin Ala lie Glu Arg Leu Ala Thr
130 135 140
Gin Ala Glu Gin Arg Thr Asp Leu Pro Phe Leu Asn Met Lys Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ser Gin Gin Gin Phe Lys Leu Phe He Arg His Gly Asp Leu Leu
165 170 175
Lys Glu Pro Val Lys Gly Glu Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser Ala Thr
180 185 190
Ala Thr He Pro Trp Phe 195
<210> 45 <211> 190 <2I2> PRT
<213> Verminephrobacter eiseniae <400> 45
Met Ser Thr His Tyr lie Asp He Thr Leu Arg Pro Asp Pro Glu Phe
15 10 15
Ser Pro Ala His Leu Leu Asn Ala Leu His Ala Gin Leu His Leu Ala
20 25 30
Leu Val Gin Leu Gly Thr Gly Asp Val Gly Val Ser Phe Pro Gly Phe
35 40 45
lie Leu Arg Gly Glu His Ser His Leu Gly Thr Thr Leu Arg Leu His
50 55 60
Gly Ala Thr Ser Ala Leu Gin Arg Leu Gin Ala Leu Ser Trp Leu Arg
65 70 75 80
Gly Met Arg Asp His Val Lys Thr Ser Glu Val Ala Pro Val Pro Thr
85 90 95
His Thr Gin His Arg Val Val Arg Arg Val Gin Ala Lys Ser Ser Pro
100 105 110
Glu Arg Ser Arg Arg Arg Leu Met Arg Arg Leu Glu He Asp Glu Ala
115 120 125
Gin Ala Leu Gin Arg lie Pro Asp Gin Glu Gly Arg Arg Leu Ala Leu
130 135 140
Pro Tyr Leu Arg Leu Gin Ser Ala Ser Lys Gly Gin Val Phe Arg Leu
145 150 155 160
Phe He Glu His Gly Pro Leu Leu Asp Thr Pro Ser Pro Gly Ser Phe
165 170 175
Gly Thr Tyr Gly Leu Ser Thr Gin Ala Thr He Pro Trp Phe
180 185 190
<210> 46 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетическийолигонуклеотид <400> 46
guucacugcc ggauaggcag cucagaaa 28
<210> 47 <211> 195 <212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum <400> 47
Met Asp His Tyr Leu Asp He Arg Leu Leu Pro Asp Ala Asp Phe Gly
15 10 15
Pro Pro Val Leu Met Asn Ala Leu Tyr Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Ala Ala Gin Gin Arg Gin Asp lie Gly Val Ser Phe Pro Gly Tyr Asp
35 40 45
Pro Ala Pro Ser Ser His Asp Gly Lys Pro Leu Pro Pro Thr Leu Gly
50 55 60
Leu Thr Leu Arg Leu His Gly Ser Ala Ala Ala Leu Asp Gly Leu Met
65 70 75 80
Ala Arg Arg Trp Leu Ser Gly Phe Ala Asp His Ala He Val Gly Asp
85 90 95
He Arg Pro Val Pro Ala Gly Ala Ser Ala Val Ser Val Arg Arg Arg
100 105 110
Gin Ala Lys Ser Ser Pro Ala Arg Ala Arg Asp Arg Leu Met Arg Arg
115 120 125
Gin Gly He Ser Ala Glu Glu Ala Arg Arg Arg He Pro Asp Glu Thr
130 135 140
Ala Gin Arg Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Thr Val Asp Ser Ala Ser Thr
145 150 155 160
Gly Gin Cys Phe Arg Leu Phe Val Glu Gin Gin Ala Ala Pro Ser He
165 170 175
Ala Ala Gly Ser Phe Asn Ala Tyr Gly Leu Ser Ala Ala Ala Ala Leu
180 185 190
Pro Ala Trp 195
<210> 48 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 48
guucacugcc ggauaggcag cuuagaaa 28
<210> 49 <211> 184 <212> PRT
<213> Erwiniatasmaniensis <400> 49
Met Asp Arg Тут Gin Asp lie Arg Val Arg Val Asp Ala Glu Met Thr
15 10 15
Ala Pro Val Leu Leu Ala Gin Val Phe Met Arg Leu His Gin Val Leu
20 25 30
Met Arg Ala Ala Asn Gly Arg He Gly He Ser Phe Pro Asp Val Lys
35 40 45
Leu Thr Leu Gly Asp Arg He Arg Leu His Gly Thr Leu Asp Asp Leu
50 55 60
Ser Ser Leu Gin Gin Ser Gly Trp Asp Lys Gly Leu Thr Asp Tyr He
65 70 75 80
Ala Cys Ser Ala He Asp Pro Val Pro Pro Gly Ala Ala Trp Arg Tru-
ss 90 95
Val Arg Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Ala Glu Arg Leu Arg Arg Arg
100 105 110
Ser Val Asn Lys Gly Trp Leu Asn Glu Ala Glu Ala Ala Glu Arg He
115 120 125
Asn Val Leu Ser Glu Gin Arg Ser Asp Leu Pro Тут Leu Gin lie Lys
130 135 140
Ser Gly Ser Asn Gly His Ala Trp Arg Leu Phe lie Glu His Gly Pro
145 150 155 160
Leu Val Ser Val Pro Val Asn Gly Gly Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Ala Thr Val Pro Trp Phe 180
<210> 50
<2I1> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 50
guucacugcc guacaggcag cuuagaag 28
<210> 51 <211> 190 <212> PRT
<213> Delftia acidovorans <400> 51
Met Ala Met Thr Ser His Tyr He Asp Thr Thr Leu Leu Pro Asp Pro
15 10 15
Glu Phe Ser His Ala His Leu Leu Gly Ala Leu Val Ala Lys Leu His
20 25 30
Arg Ala Leu Val Gin Leu Gly Ser Thr Asp He Gly lie Ser Phe Pro
35 40 45
Gly Tyr Ser Leu Arg Pro Arg Thr Leu Gly Thr He Leu Arg Leu His
50 55 60
Gly Ser Glu Ala Ala Leu Arg Gly Leu Met Glu Gin Pro Trp Leu Gin
65 70 75 80
Gly Met Arg Asp His Val His Cys Thr Pro Pro Ala Leu Val Pro Glu
85 90 95
Gly Ala Val Pro Cys Leu Val Gin Arg Arg Gin Phe Lys Thr Ser Pro
100 105 110
Asp Arg Leu Arg Arg Arg Arg Met Arg Arg Lys Gly Glu Thr Ala Glu
115 120 125
Gin Ala Ala Ala Ala He Pro Asp Ser Val Glu Arg Thr Pro Asp Leu
130 135 140
Pro Tyr Val Gin Leu Arg Ser Ala Ser Thr Gly Gin Pro Phe Cys Leu
145 150 155 160
Phe Val Glu Gin Lys Ala Val Gin Gly Thr Ala Gly Gin Glu Gly Phe
165 170 175
Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Leu Gly Thr Ala Val Pro Trp Phe
180 185 190
<210> 52 <2I1> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 52
guucgcugcc gcguaggcag cucagaaa 28
<210> 53 <211> 184 <212> PRT
<213> Enterobacter sp. 63 8
<400> 53
Met Asp His Тут Leu Glu He Arg Val Leu Ser Asp Pro Glu Phe Ser
15 10 15
Glu Glu Thr Leu Met Ala Ala Leu Phe Ala Lys Leu His Arg Ala Leu
20 25 30
Gly Ala Arg Gly Gin Gly Asp He Gly Val Ser Phe Pro Arg Tyr Ser
35 40 45
Leu Lys Pro Gly Asp Thr Leu Arg Leu His Gly Ser Ala Gin Ser Leu
50 55 60
Asp Glu Leu Glu Lys Met Ala Trp Arg Lys Gly Leu Ser Asp Tyr Cys
65 70 75 80
Leu Cys Lys Gly Val Leu Pro Ala Pro Asp Val Asn Ala Trp Arg Cys
85 90 95
Val Ser Arg Val Gin Val Lys Ser Ser Pro Gin Arg Leu Met Arg Arg
100 105 110
Ser Val Lys Lys Gly Trp Leu Thr Glu Glu Glu Ala Gin Gin Arg Leu
115 120 125
Leu Asn Leu Gin Glu Ala Arg Thr Asp Leu Pro Trp Leu Asn Leu Gin
130 135 140
Ser Leu Ser Thr Gly Gin Ser Phe Arg Leu Phe He Arg His Gly Asp
145 150 155 160
He Val Asp Met Pro Met Cys Gly Glu Phe Ser Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Ala Thr He Pro Trp Phe 180
<210> 54 <2U> 186 <212> PRT
<213> Thioalkalivibrio sp. K90mix
<400> 54
Met Asp His Tyr Leu Asp Leu Arg Val Met Pro Asp Pro Glu Phe Lys
15 10 15
Glu Thr Thr Leu Leu Gly Ala Leu Val Ser Lys Leu His Arg Arg Leu
20 25 30
Val Ser Met Ser Ala Asp Asp He Gly He Ser Leu Pro Asp His Glu
35 40 45
Gin Glu Pro Pro Leu Gly Arg Arg Leu Arg Val His Gly Thr Gin Gly
50 55 60
Arg Leu Asn Leu Leu Met Gin Asp Glu Trp Leu Gly Gly Met Gin Ser
65 70 75 80
Leu Val Asp Ala Thr Pro Val Gin Pro Val Pro Asp Gin Val Thr Tyr
85 90 95
Arg Pro Val Arg Arg Arg Gin Tyr Lys Thr Asn Ala Glu Arg Leu Arg
100 105 110
Arg Arg Arg Met Arg Arg His Gly Glu Ser Тут Glu Glu Ala Arg Gin
115 120 125
His He Pro Asp Thr Val Glu Arg Arg Val Asn Thr Pro Phe Leu Ser
130 135 140
Val Gin Ser Ala Ser Thr Gly Gin Arg Phe Ser Leu Phe lie Glu His
145 150 155 160
Gly Pro Pro Gin Gin His Ala Ser Pro Gly Arg Phe Asn Thr Tyr Gly
165 170 175
Leu Ser Gin Asp Ala Thr Val Pro Trp Phe 180 185
<210> 55
<211> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 55
guuagcugcc gcacaggcag cucagaaa 28
<210> 56 <211> 193 <212> PRT
<213> Zymomonas mobilis <400> 56
Met Leu Ala Asn Pro Val Asp Ser Tyr Gin Asp lie Tyr He Leu Pro
15 10 15
Asn Gin Glu He Ala Pro His He He Met Glu Lys Leu Phe Ser Leu
20 25 30
Leu His Leu Glu Leu Val Arg Leu Gly Ser Gin His He Gly He Ser
35 40 45
Phe Pro Glu His Asp Asn Asn Lys Pro Cys Leu Gly Ser Arg Leu Arg
50 55 60
Leu His Gly Thr Gly Ala Asp Leu His Glu Leu Ala Leu Ser Gly Trp
65 70 75 80
He Thr Arg Leu Asp Asp Tyr Leu Tyr Cys Glu Asp He Lys Ser Val
85 90 95
Pro Glu He Arg Gin Tyr Cys Val Val Ser Arg Val Gin Ala Lys Ser
100 105 110
Ser Pro Ala Arg Leu Arg Arg Arg Ala He Arg Arg His Gly Phe His
115 120 125
Asp Glu Glu Ala Lys Lys Val He Pro Asp Thr Ala Phe Glu Arg Leu
130 135 140
Glu Leu Pro Phe lie Met Thr Gly Ser Cys Ser Thr Lys Gin Pro Arg
145 150 155 160
Phe Pro Val Phe lie Ser His Lys lie He Gin Asn Lys Leu Met Asn
165 170 175
Gly Asn Phe Asn Ser Tyr Gly Leu Ser Leu Gly Ala Ser Val Pro Trp
180 185 190
Phe
<210> 57 <211> 193 <212> PRT
<213> Zymomonas mobilis <400> 57
Met Leu Ala Asn Pro Val Asp Ser Tyr Gin Asp lie Tyr He Leu Pro
15 10 15
Asn Gin Glu He Ala Pro His He He Met Glu Lys Leu Phe Ser Leu
20 25 30
Leu His Leu Glu Leu Val Arg Leu Gly Ser Gin His He Gly He Ser
35 40 45
Phe Pro Glu His Asp Asn Asn Lys Pro Cys Leu Gly Ser Arg Leu Arg
50 55 60
Leu His Gly Ala Gly Ala Asp Leu His Glu Leu Ala Leu Ser Gly Trp
65 70 75 80
He Thr Arg Leu Asp Asp Tyr Leu Тут Cys Glu Asp He Lys Ser Val
85 90 95
Pro Glu lie Arg Gin Tyr Cys Val Val Ser Arg Val Gin Ala Lys Ser
100 105 110
Ser Pro Ala Arg Leu Arg Arg Arg Ala He Arg Arg His Gly Phe His
115 120 125
Asp Glu Glu Ala Lys Lys Val He Pro Asp Thr Ala Phe Glu Arg Leu
130 135 140
Glu Leu Pro Phe He Met Thr Gly Ser Cys Ser Thr Lys Gin Pro Arg
145 150 155 160
Phe Pro Val Phe He Ser His Lys lie He Gin Asp Lys Leu Met Asn
165 170 175
Gly Asn Phe Asn Ser Tyr Gly Leu Ser Leu Gly Ala Ser Val Pro Trp
180 185 190
Phe
<210> 58 <211> 191 <212> PRT
<213> Acidovorax sp. JS42 <400> 58
Met Thr Thr His Тут He Asn He Thr Leu Leu Pro Asp Pro Glu Phe
15 10 15
Ser His Ala His Leu Leu Gly Ala Leu Val Ala Lys Leu His Arg Ala
20 25 30
Leu Val Gin Gly His Thr Thr Asp He Gly Val Ser Tyr Pro Gin His
35 40 45
Val Ser Gin Pro Leu Thr Lys Arg Thr Leu Gly Ala Val Leu Arg Leu
50 55 60
His Gly Thr Pro Glu Ala Leu Gin Arg Leu Met Glu Glu Asp Trp Leu
65 70 75 80
Lys Gly Met Arg Asp His Thr Gin Val Gly Glu Leu Leu Pro Val Pro
85 90 95
Ser Arg Asp Gin Leu Asn Gin Pro Phe Phe Arg Leu Leu Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Ala Gin Lys Phe Pro Leu Phe He Glu Gin Arg Asn Ala Glu Lys
145 150 155 160
Ala Gly Lys Gin Ser Val Tyr Ser Ala Tyr Gly Leu Ser Val Gly Gly
165 170 175
Ser Thr Val Pro Trp Phe ISO
<210> 61 <211> 184 <212> PRT
<213> Photobacterium profundum <400> 61
Met Met Asp Ser Tyr Val Asp He Gin Leu Lys Pro Asp Ala Glu Met
15 10 15
Arg Glu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Val Phe Thr Lys Phe His Lys Ala
20 25 30
Leu Ala Thr Leu Asn Thr Asn Lys He Gly lie Ser Phe Pro Gin Met
35 40 45
Asn Leu Lys Leu Gly Arg Leu Phe Arg He His Gly Asn Ala Ser Leu
50 55 60
Leu Lys Asp Leu Gin Gly lie Lys Trp Leu Gly Ala Leu Ala Gly Tyr
65 70 75 80
Cys Gin Val Gly Glu He Thr Val Val Pro Asp Gin Val Gin Tyr Arg
85 90 95
Val He Ser Val Lys Arg Ser Asn Leu Ser Lys Ala Lys Leu Lys Arg
100 105 110
Leu lie Ala Arg Gly Ser He Asp Lys Asp Gly Glu Lys Arg Tyr Lys
115 120 125
Val Lys Met Leu Ser Gin Gly Phe Asp Asn Pro Тут Leu Asp Leu Phe
130 135 140
Ser Ser Ser Thr Gly Gin Val Tyr Arg Lys Phe Phe Glu Phe Gly Asp
145 150 155 160
He Gin Ala Thr Ser Val Ser Asp Glu Phe Asp Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Asn Thr Ala Thr lie Pro Trp Phe 180
<210> 62 <211> 184 <212> PRT
<213> Legionella pneumophila
<400> 62
Met Asp His Tyr Leu Asp He Ser He Leu Pro Asp Ser Glu Phe Thr
15 10 15
Thr Pro Val Leu Met Asn Ala He Tyr Thr Asn Leu His Lys Ala Leu
20 25 30
His Thr Leu Ala Ser Thr Asn He Gly Val Ser Phe Pro Lys Tyr Ser
35 40 45
Ser Thr Leu Gly Asn Leu Leu Arg He His Gly Lys Lys Glu Ala Leu
50 55 60
Gin Glu Leu Gin Asn Leu Asn Trp He Gly Gly Met He Gly Tyr Cys
65 70 75 80
Glu Ala Ser Leu lie Lys Thr Val Pro Ala Asp Thr Lys Phe Arg Thr
85 90 95
Val Ser Arg Lys Gin Pro Thr Met Ser Gin Ser Lys Leu Arg Arg Leu
100 105 110
lie Lys Arg Asn Ser Leu Thr Glu Asp Glu He Arg Gin Tyr Lys Ala
115 120 125
Lys Met Phe Ser Lys Gly Leu Asp Asn Pro Туг He Glu Leu Val Ser
130 135 140
Val Ser Asn Gly Gin Arg His Arg Arg Tyr He Glu Phe Gly Glu Leu
145 150 155 160
Phe Asn Glu Pro He Pro Gly Leu Phe Asp Gin Phe Gly Leu Ser Asn
165 170 175
Ser Ala Thr Val Pro Trp Phe Asp 180
<210> 63 <211> 184 <212> PRT
<213> Legionella pneumophila <400> 63
Met Asp His Tyr Leu Glu lie Ser He Leu Pro Asp Ser Glu Phe Thr
15 10 15
Thr Pro Val Leu Met Asn Ala He Tyr Thr Asn Leu His Lys Ala Leu
20 25 30
His Thr Leu Ala Ser Thr Ser He Gly Val Ser Phe Pro Lys Tyr Ser
35 40 45
Ser Thr Leu Gly Asn He Leu Arg He His Gly Lys Lys Glu Val Leu
50 55 60
Gin Asp Leu Gin Asn Leu Asn Trp He Gly Gly Met He Gly Tyr Cys
65 70 75 80
Glu Ala Ser Leu He Lys Thr Val Pro Ala Asp Thr Lys Phe Arg Thr
85 90 95
Val Ser Arg Lys Gin Pro Thr Met Ser Gin Ser Lys Leu Arg Arg Leu
100 105 110
He Lys Arg Asn Thr Leu Thr Glu Asp Glu lie Arg Gin Tyr Lys Ala
115 120 125
Lys Met Phe Ser Lys Gly Leu Asp Asn Pro Tyr He Glu Leu Val Ser
130 135 140
Val Ser Asn Gly Gin Arg His Arg Arg Tyr He Glu Phe Gly Glu Leu
145 150 155 160
Phe Asn Glu Pro Ser Pro Gly Leu Phe Asp Gin Phe Gly Leu Ser Asn
165 170 175
Ser Ala Thr Val Pro Trp Phe Asp 180
<210> 64 <211> 183 <212> PRT
<213> Shewanella putrefaciens
<400> 64
Met Asn Ser Tyr He Asp lie Arg Leu Lys Pro Asp Ala Glu Met Arg
15 10 15
Glu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Val Phe Thr Lys Phe His Lys Ala Leu
20 25 30
Val Thr Leu Asn Ser His Lys He Gly He Ser Phe Pro Gin Met Lys
35 40 45
Leu Ser Leu Gly Gin Leu Phe Arg He His Gly Asp Ala Ser Leu Leu
50 55 60
His Asp Leu Gin Gly Leu Asp Trp Leu Gly Pro Leu Ala Gly Tyr Cys
65 70 75 80
Gin Val Thr Ala Val Ser Ala Val Pro Asp His Val Gin Tyr Arg He
85 90 95
Val Ser Val Lys Arg Ser Asn Leu Ser Lys Ala Lys Leu Lys Arg Leu
100 105 110
He Ala Arg Gly Ser He Asp Lys Asp Gly Glu Lys Arg Tyr Lys Val
115 120 125
Lys Met Leu Gly Gin Gly Phe Asp Asn Pro Tyr Leu Asp Leu Phe Ser
130 135 140
Ser Ser Thr Gly Gin Val Tyr Arg Lys Phe Phe Glu Phe Ser Asp He
145 150 155 160
Gin Ala His Pro Leu Asp Gly Glu Phe Asp Ser Tyr Gly Leu Ser Lys
165 170 175
Thr Ala Thr Val Pro Trp Phe ISO
<2I0> 65 <2H> 28 <2I2> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 65
guucaccgcc gcacaggcgg cuuagaaa 28
<210> 66 <211> 184 <212> PRT
<213> Legionella pneumophila <400> 66
Met Asp Tyr Tyr Val Asp He Leu He Lys Pro Asp Ser Glu Lys Ser
15 10 15
Leu Asn Phe Leu Leu Ser Thr Leu Tyr Thr Lys Leu His Lys Val Leu
20 25 30
His Asp Met Ala Ser Thr Asn He Gly Val Ser Phe Pro Lys Tyr Asn
35 40 45
He Thr Leu Gly Asn lie Leu Arg He His Ser Lys Lys Val Val Leu
50 55 60
Asp Glu Leu Leu Gly Met Asn Phe Leu Ser Gly He Asn Asn Туг Тут
65 70 75 80
Glu Val Ser Pro He Lys Ser Val Pro Ala Asp Ser Lys Phe Arg He
85 90 95
He Ser Arg Lys Gin Thr Thr Met Ser Gin Ser Lys Met Arg Arg Leu
100 105 110
Phe Lys Arg Gly Ser Met Thr Val Gly Asp He Arg Gin Tyr Lys Ala
115 120 125
Lys Met Phe Ala Lys Ser He Asp Asn Pro Tyr Leu Glu Leu Val Ser
130 135 140
Gly Ser Asn Gly Tyr Arg Tyr Arg Arg Tyr lie Glu Phe Gly Glu Leu
145 150 155 160
Leu Asp Gin Pro Val Tyr Gly Glu Phe Asp Arg Phe Gly Leu Ser Lys
165 170 175
Thr Ala Thr Val Pro Trp Phe Asp 180
<210> 67 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 67
guuaacugcc gcacaggcag cuuagaag 28
<210> 68 <211> 183 <212> PRT
<213> Vibrio metschnikovii
<400> 68
Met Asp Ser Tyr lie Glu lie Arg Leu Gin Pro Asp Ala Glu Met Pro
15 10 15
Glu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Val Phe Thr Lys Phe His Lys Ala Leu
20 25 30
Val He Leu His Ser Asn Gin He Gly lie Ser Phe Pro Glu Val Asn
35 40 45
Val Lys Leu Gly Arg Leu Phe Arg Leu His Gly Glu Ala Ser Phe Leu
50 55 60
His Asp Leu Gin Gly Leu Asn Trp Leu Gly Pro Leu Ser Gly Tyr Cys
65 70 75 80
Gin Val Ser Glu He Leu Ala He Pro Glu Gin Val Gin Tyr Arg Val
85 90 95
He Ser Val Lys Arg Ser Asn Leu Ser Gin Ala Lys Leu Arg Arg Leu
100 105 110
He Ala Arg Gly Ser He Asp Lys Glu Gly Glu Lys Arg Tyr Lys Val
115 120 125
Lys Met Leu Ser Gin Gly Phe Asp Asn Pro Tyr Leu Asp Leu Phe Ser
130 135 140
Ser Ser Thr Lys Gin Val His Arg Lys Phe Phe Glu Phe Gly Glu He
145 150 155 160
Gin Pro Leu Pro Val Ser Gly Lys Phe Asp Ser Тут Gly Leu Ser His
165 170 175
Thr Thr Thr Val Pro Trp Phe 180
<210> 69 <2U> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 69
Lys Met Leu Ser Gin Gly Phe Asp Asn Pro Tyr Leu Asp Leu Ser Ser
130 135 140
Ser Ser Thr Gly Gin Val Tyr Arg Lys Phe Phe Glu Phe Ser Asp He
145 150 155 160
Gin Ala Asp Pro Val Asp Gly Glu Phe Asp Ser Tyr Gly Leu Ser Lys
165 170 175
Thr Ala Thr Val Pro Trp Phe 180
<210> 72
<21I> 28
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 72
aguguucugc cgaauaggca gcuaagaa 28
<210> 73
<211> 184
<212> PRT
<213> Vibrio cholerae
<400> 73
Met Met Asp Ala Тут lie Asp He Arg Leu Met Pro Asp Ala Glu Met
15 10 15
Arg Glu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Val Phe He Lys Phe His Lys Ala
20 25 30
Leu Val Lys Leu Gin Ser Asn Lys lie Gly lie Ser Phe Pro Glu Ala
35 40 45
Asn He Lys Leu Gly Arg Leu Phe Arg Leu His Gly Glu Val Ser Ala
50 55 60
Leu His Asp Leu Gin Gly Leu Asn Trp Leu Gly Pro Leu Ala Gly Tyr
65 70 75 80
Cys Lys He Thr Thr Val Thr His Val Pro Asp Gin Val Glu Tyr Arg
85 90 95
lie He Ser Val Lys Arg Ser Asn Leu Ser Lys Ala Lys Leu Ala Arg
100 105 110
Leu He Ala Arg Gly Ser He Asp Lys Asp Gly Glu Lys Arg Tyr Lys
115 120 125
Val Lys Met Leu Arg Gin Gly Phe Asp Asn Pro Tyr Leu Asp Leu Ser
130 135 140
Ser Ser Ser Thr Gly Gin Val Tyr Arg Lys Phe Phe Glu Phe Ser Asp
145 150 155 160
Ik Gin Ala Glu Pro Val Asp Gly Glu Phe Asp Ser Tyr Gly Leu Ser
165 170 175
Lys Thr Ala Thr Val Pro Trp Phe 180
<210> 74
<211> 29
<212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 74
guucacugcc gcacaggcag cuuagaaau 29
<210> 75 <211> 197 <212> PRT
<213> Oxalobacter formigenes <400> 75
Met Lys His Tyr He Glu He Thr Leu Thr Gly Ser Pro Asp Phe Pro
15 10 15
Leu Tyr His Leu Trp Ser Lys Leu Tyr Thr Gin Leu His Leu Ala Leu
20 25 30
Val Glu Asn Arg Asp Ala Ser Asp Gin Val Asn He Gly Val Ser Phe
35 40 45
Pro Glu Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Lys Gly Met Gly Phe Leu Gly Thr
50 55 60
Lys Leu Arg Leu Phe Ala Glu Asp Glu Thr Ser Leu Gin Lys He Asp
65 70 75 80
He Gin Lys Trp Phe Val Arg Leu Asn Asp Cys He His lie Thr Pro
85 90 95
Val Cys Arg Val Pro Leu Asn Glu He Thr Gly Tyr Ala Thr Phe Ser
100 105 110
Arg Lys His He Lys Ser Asn Ala Glu Arg Leu Ala Arg Arg Gin Met
115 120 125
Lys Arg His Lys Asp Leu Ser Phe His Glu Thr Val Gin Arg Tyr Gin
130 135 140
Lys Asn Leu Ala Lys Ser Pro Leu Pro Phe He Gin Leu Glu Ser Leu
145 150 155 160
Thr Asn Ser His Pro Phe Lys Leu Phe lie Glu Lys Lys Pro Ala He
165 170 175
Asn Ala Ser Leu Lys Val Phe Thr Thr Tyr Gly Leu Ser Ala Glu Ser
180 185 190
Thr He Pro Glu Phe 195
<210> 76 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическийолигонуклеотид <400> 76
guucacugcc guauaggcag cuuagaag 28
<210> 77 <211> 193 <212> PRT
<2I3> Psychromonas ingrahamii <400> 77
Met Lys Tyr Tyr Leu Asp He Thr Leu Leu Pro Asp He Glu He Pro
15 10 15
Leu Gly Phe He Trp Gin Lys Val Phe Gin Gin Val His He Ala Leu
20 25 30
Ala Asp Asn Lys Val Gly Glu Asn Glu Ser Asp He Ala Leu Ser Leu
35 40 45
Pro Asn Tyr Gly Asp Lys Ala Phe Pro Leu Gly Asn Lys Leu Arg Leu
50 55 60
Phe Ser Val Ser Glu Gin Ala Leu Glu Arg Leu Ala lie Thr Lys Trp
65 70 75 80
Leu Lys Arg Phe Thr Asp His Thr His He Thr Ser Val Lys Ala Val
85 90 95
Pro Glu Ser Ala Asn Glu Tyr Ala Cys Phe Thr Arg Lys Gin Phe Asn
100 105 110
Thr Asn He Ser Arg Leu Ala Arg Arg Arg Ala Lys Arg His Met Glu
115 120 125
Thr Phe Glu Lys Ala Leu Gin Tyr Tyr Asp Asn Phe Ala Glu Glu Gin
130 135 140
Thr Lys Leu Pro Phe Met Asn lie Lys Ser Leu Thr Asn Asn Ala Gin
145 150 155 160
Phe Arg He Phe lie Glu Arg Ser He Thr Lys He Pro Lys Gin Gly
165 170 175
Thr Phe Asn Cys Tyr Gly Leu Ser Gin Ala He Ala Thr Val Pro Trp
180 185 190
Phe
<210> 78 <211> 29 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 78
guguuccccg ugcccacggg gaugaaccg 29
<210> 79 <211> 202 <212> PRT
<213> Dichelobacter nodosus <400> 79
Met Asn Phe Tyr Gin Glu He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Val Ser
15 10 15
Leu Tyr Phe Leu Trp Ser Lys Val Tyr Gly Gin Leu His He Ala Leu
20 25 30
Ala Asp Val Arg Asn Arg Tyr Gly He Asp Thr He Gly Val Asn Phe
35 40 45
Pro His Tyr Val Tyr Glu Glu Gin Asn His Lys Val Val Ala Ala Arg
50 55 60
Leu Gly Asp Gin Leu Arg He Phe Ala Leu Ala Glu Asn Asp Leu Glu
65 70 75 80
Lys Leu Gin He Asn Gin Trp Leu Glu Arg Leu Ser Asp Tyr Val His
85 90 95
He Lys Arg He Ser Lys He Glu Pro Asn Lys Val Thr Gly Tyr Val
100 105 110
Val Val Lys Arg Tyr Arg Tyr Pro Ser Leu Asp Lys Val Ala Leu Arg
115 120 125
Phe Ala Gin Phe Arg Lys He Asn Phe Glu Glu Ala Arg Lys His Cys
130 135 140
Thr Lys Tyr Lys His Gin Ala Lys Asn Tyr Pro Phe He Met Leu Lys
145 150 155 160
Ser Gin Ser Asn Gin Glu Tyr Tyr Lys Leu Ser lie Arg Gin Glu Asn
165 170 175
Ala Gin Glu Ser Val Ser Gly Arg Phe Asn Val Tyr Gly He Asn Ser
180 185 190
Ala Thr Gly He Val Thr Val Pro Asn Trp 195 200
<210> 80 <211> 194 <212> PRT
<213> Shewanella baltica <400> 80
Met Asn His Tyr Leu Asp He Thr Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Gly
15 10 15
His Tyr Phe Leu Trp Glu Lys Leu Tyr His Gin Val His Leu Ala Leu
20 25 30
Val Glu His Lys Asn Arg Val Gly Gin Phe Glu He Ala Ala Ala Phe
35 40 45
Pro Gin Phe Asn Glu Met Asp Asn Ser Leu Gly Ser Lys Leu Arg Leu
50 55 60
Leu Ala Thr Gin Pro Gin His Leu G)u Asp Leu Lys Val Ser Asn Trp
65 70 75 80
Leu Arg His Phe Thr Asp Tyr Leu His He Ser Ser lie Arg Pro Val
85 90 95
Pro Glu Lys He Glu Val Tyr Val Ala Tyr Ser Arg Pro Ala He Arg
100 105 110
Ala Asn Lys Ala Arg Glu He Ala Arg Arg Met Lys Arg His Asn Glu
115 120 125
Thr Leu Glu Gin Ala Thr Ala His Phe Glu Gly Phe Lys Pro Lys Lys
130 135 140
Thr Lys Ala Pro Phe Val Tyr Met Gin Ser Тут Thr Lys Asp Ser Arg
145 150 155 160
Phe Pro Leu Phe lie Gin Gin Thr His Ser Ala Val Val Lys Glu Gly
165 170 175
Ser Val Ser Phe Asp Ser Tyr Gly Leu Ser Ser Arg Gly Tyr Leu Pro
180 185 190
Lys Phe
<210> 81 <211> 194 <212> PRT
<213> Shewanella baltica <400> 81
Met Asn His Tyr Leu Asp He Thr Leu Leu Pro Asn Glu Glu Val Gly
15 10 15
His Tyr Phe Leu Trp Glu Lys Leu Tyr His Gin Met His Leu Ala Leu
20 25 30
Val Glu His Lys Asn Arg Val Gly Gin Phe Glu lie Ala Ala Ala Phe
35 40 45
Pro Gin Phe Asn Glu Met Asp Asn Asn Leu Gly Ser Lys Leu Arg Leu
50 55 60
Leu Ala Thr Gin Pro Gin His Leu Glu Asp Leu Lys Val Ser Asn Trp
65 70 75 80
Leu Arg His Phe Thr Asp Tyr Leu His He Ser Ser He Arg Pro Val
85 90 95
Pro Asp Lys He Glu Val Tyr Val Ala Tyr Ser Arg Pro Ala He Arg
100 105 110
Ala Asn Lys Ala Arg Glu He Ala Arg Arg Met Lys Arg His Asn Glu
115 120 125
Thr Leu Val Gin Ala Thr Ala His Phe Glu Gly Phe Lys Pro Lys Lys
130 135 140
Thr Lys Ala Pro Phe Val Tyr Met Gin Ser Tyr Thr Lys Asp Ser Arg
145 150 155 160
Phe Pro Leu Phe He Gin Gin Thr His Ser Ala Va! Val Lys Glu Gly
165 170 175
Asn Val Ser Phe Asp Ser Tyr Gly Leu Ser Ser Arg Gly Tyr Leu Pro
180 185 190
Lys Phe
<210> 82 <211> 204 <212> PRT
<213> Acinetobacter baumannii <400> 82
Met Met Asn Trp Тут Gin Glu He Thr Leu He Asp Gin Asp Glu lie
15 10 15
Ser Leu Tyr Phe He Trp Ser Lys Val Tyr Thr Gin Leu His He Ala
20 25 30
Phe Ala Glu His Ser Asn Glu Gin Gly Arg lie Ser Phe Gly Val Ser
35 40 45
Phe Pro Gin Tyr Arg He Asn Glu Gin Lys Lys He Gly Phe Leu Gly
50 55 60
Thr Lys lie Arg Val Phe Ala Ser Ser Glu Asn Asp Leu Gin Gin Leu
65 70 75 80
Asn Leu Gly Lys Trp Leu Glu Arg Phe He Asp Tyr Va! His He Thr
85 90 95
Gin Pro Arg Glu Val Pro Arg Ala Lys He Thr Gly Tyr Ala His Tyr
100 105 110
Tyr Arg Val Asn His Arg Met Ser Val Glu Glu Arg He Val His Gin
115 120 125
Ala Gin Arg Arg Asn He Ser Leu Asp Gin Ala Arg Gin His Phe Lys
130 135 140
Gin Тут Val Glu Gin Pro Val Val Glu Pro Tyr Val Ser Leu Lys Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Lys Arg Glu Glu Asn Val Asp Arg Pro Tyr Arg Leu Tyr
165 170 175
He Gly Lys Ser Leu Val Asp Glu Ala Arg Asp Gly Met Phe Gly Thr
180 185 190
Tyr Gly Leu Ser Arg Met Thr Thr Val Pro Glu Phe 195 200
<210> 83
<2ll> 28
<2I2> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 83
guucauggcg gcauacgcca uuuagaaa 28
<210> 84 <21l> 203 <212> PRT
<213> Acinetobacter baumannii <400> 84
Met Asn Trp Tyr Gin Glu He Thr Leu lie Asp Gin Asp Glu He Ser
15 10 15
Leu Tyr Phe He Trp Ser Lys Val Tyr Thr Gin Leu His He Ala Phe
20 25 30
Ala Glu His Ser Asn Glu Gin Gly Arg He Ser Phe Gly Val Ser Phe
35 40 45
Pro Gin Tyr Arg He Asn Glu Gin Lys Lys He Gly Phe Leu Gly Thr
50 55 60
Lys He Arg Val Phe Ala Ser Ser Glu Asn Asp Leu Gin Gin Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gly Lys Trp Leu Glu Arg Phe He Asp Tyr Val His lie Thr Gin
85 90 95
Pro Arg Glu Val Pro Arg Ala Lys He Thr Gly Tyr Ala His Tyr Tyr
100 105 110
Arg Val Asn His Arg Met Ser Val Glu Glu Arg He Val His Gin Ala
115 120 125
Gin Arg Arg Asn lie Ser Leu Asp Gin Ala Arg Gin His Phe Lys Gin
130 135 140
Tyr Val Glu Gin Pro Val Val Glu Pro Тут Val Ser Leu Lys Ser Leu
145 150 155 160
Ser Ala Lys Arg Glu Glu Asn Val Asp Arg Pro Tyr Arg Leu Tyr lie
165 170 175
Gly Lys Ser Leu Val Asp Glu Ala Arg Asp Gly Met Phe Gly Thr Tyr
180 185 190
Gly Leu Ser Arg Met Thr Thr Val Pro Glu Phe 195 200
<210> 85 <211> 186 <212> PRT
<213> Pasteurella multocida <400> 85
Met Thr Thr His Tyr He Glu Leu Lys Ala He Pro Gin Met Asp Met
15 10 15
Leu Gin Ser Glu Val He Gly His Cys Met Gin He Leu His Gin Phe
20 25 30
Leu Pro His Phe Glu Gly Arg Val Gly Val Ala Phe Pro Ala Tyr Gly
35 40 45
Leu Gly Arg Thr Leu Gly Gly He Val Arg Leu Phe Ala Asn Gin Glu
50 55 60
Asp Cys Asn Gin Leu His Gin Gin Leu Leu Arg Ser Gly Leu Ser Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Leu He Ser Glu Val Ser Lys Thr Pro Leu Pro Thr Glu His
85 90 95
Arg Ser Tyr Ser Arg Val His Arg Lys Gly Gin Ser Ala He Arg Arg
100 105 110
Thr Glu Lys Arg Leu Lys Ser Gin Gly Arg Trp Asp Glu Ser He Arg
115 120 125
Ala Asp Met Gin Gin Arg Gin Gin Asn Val Ala Phe Phe Pro His Cys
130 135 140
His Leu Lys Ser Ala Ser Thr Gly Gin Arg Phe He Leu Ala Val Lys
145 150 155 160
Glu Asn Arg Met Pro Gin Ser Cys Val Gly Val Phe Asn Ala Tyr Gly
165 170 175
Leu Ser Asn Ser Ala Thr Val Pro His Phe 180 185
<210> 86 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 86
guucaccauc guguagaugg cuuagaaa 28
<210> 87 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 87
guuaacugcc guauaggcag cuuagaaa 28
<210> 88 <211> 187 <212> PRT
<213> Aggregatibacter actinomycetemcomitans
<400> 88
Met Thr Val Gin Thr His Tyr He Glu He Lys Ala He Pro Gin Val
15 10 15
Asp Met Leu Gin Thr Glu Val He Gly Phe Cys Leu Gin Lys Leu His
20 25 30
Gin He Leu Pro His Phe Glu Gly Arg He Gly Leu Ala Phe Pro Ala
35 40 45
Tyr Gly Asn Asp Lys Thr Leu Gly Gly lie He Arg Leu Phe Gly Thr
50 55 60
Glu Asn Asp Cys Gly Phe He His Phe Lys Leu Gin Ser Leu Arg Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Leu He Ser Glu Val Met Pro He Pro Glu Lys Val Arg Ser
85 90 95
Tyr Arg He Tyr Gin Arg lie Gin Pro Lys Gly Gin Ser Ser lie Arg
100 105 110
Arg Ala Glu Lys Arg Leu Thr Ala Gin Gly Lys Trp Asn Glu Glu Val
115 120 125
Leu Gin Asn Met Leu Gin Lys Gin Ala Thr Gin Arg lie Tyr Pro His
130 135 140
Ala His Leu Lys Ser Ser Ser Thr Lys Gin Gin Phe He Leu Ala He
145 150 155 160
Lys Ser Val His Gin Thr Lys Ala Val Glu Gly Val Phe Ser Ala Tyr
165 170 175
Gly Leu Ser Gin Thr Thr Thr Val Pro His Phe 180 185
<210> 89 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 89
cuucacugcc gaauaggcag cuuagaaa 28
<210> 90 <211> 199 <212> PRT
<213> Marinomonas sp. MWYL1 <400> 90
Met Lys His Tyr He Asp He Thr Leu Leu Pro Ser Asp Asp He Gly
15 10 15
Val His Phe Leu Trp Ser Lys Leu Met Met Gin Val His Leu Ala Leu
20 25 30
Val Glu He Gin Asn Glu Gin Lys Gin Val Pro Val Ala Val Ser Phe
35 40 45
Pro Lys Tyr Gin Pro Arg Glu Asn Glu Lys Leu Gly Phe Val Gly Asn
50 55 60
Lys Leu Arg Leu Phe Ala Asn Asp Lys Thr Asp Leu Glu Arg Leu Asn
65 70 75 80
Phe Gly Lys Trp Leu His Arg Leu Glu Asp Tyr Val His He Lys Ser
85 90 95
He Ala Asp Val Pro Asn Asp Val He Ser Tyr Glu Ser Phe Asn Arg
100 105 110
Arg Ser Lys Ser Gly Ser Pro Asp Lys His He Lys Arg Arg Met Gin
115 120 125
Arg His Asn Glu Thr Trp Glu Gin Ala Ala Ala Phe Phe Lys Gly Tyr
130 135 140
Ser Met Glu Lys Ala Asp Lys Asp Leu Pro Phe He Arg Met Lys Ser
145 150 155 160
Leu His Ser Asp Asn Glu Phe Cys Met Ser He He Arg Lys Glu Ala
165 170 175
Ala Pro Ser Asn Lys His He Met Phe Asn Thr Tyr Gly Leu Ser Ala
180 185 190
Glu Gly Val Leu Pro Lys Phe 195
<210> 91 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 91
guucgccgcc gagcacgcgg cuuagaaa 28
<210> 92
<211> 190
<212> PRT
<213> Dialister invisus
<400> 92
Met Glu Tyr Tyr Gin Glu He Thr Leu Leu Pro Cys Ala Glu Val Ser
15 10 15
Leu Ala Phe Leu Trp Thr Lys Val Phe Thr Gin Leu His He Ala Phe
20 25 30
Ala Asp Glu Lys Asn Lys Ser Gly His Asn Leu Tyr Ala Val Ser Phe
35 40 45
Pro Glu Tyr Arg Glu Thr Gly Leu Gly Glu Lys He Arg Val Phe Ala
50 55 60
Glu Ala Gin Glu Leu Glu Arg Leu Asn Leu Ser Lys Val Leu Gly Arg
65 70 75 80
Leu Leu Asp Tyr Val His Cys Thr Ser He Arg Lys Val Pro Glu Arg
85 90 95
Lys Leu Arg Gly Tyr Ala Val Tyr Ser Arg Tyr Gin Pro Glu Gly Ser
100 105 110
He Trp Val Lys Ala Arg Arg Tyr Ala Lys Arg His Pro Gly Val Thr
115 120 125
He Glu Glu Ala Ala Arg Leu Leu Gin Gly Lys Arg Lys Ser Val Arg
130 135 140
Leu Pro Tyr He Gin Met Lys Ser Leu Ser Arg Gly Gly Thr Phe Ser
145 150 155 160
Leu Phe He Lys Lys Arg Val Glu Lys Glu Ser Ala Leu Thr Glu Cys
165 170 175
Gly Thr Tyr Gly Leu Ser Asn Asn Arg Thr Val Pro Glu Phe
180 185 190
<210> 93 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 93
guuaacugcc gcauagguag uuuagaaa 28
<210> 94 <211> 28 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 94
guuaucugcc guauaggcag cuuagaaa 28
<210> 95 <211> 189 <212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 95
Met Ser Glu Leu Thr His Tyr He Glu Leu Lys Ala He Pro Gin Val
15 10 15
Asp He Leu Gin Thr Asp Val He Ala His Gly Leu Gin He Leu His
20 25 30
Lys Phe Leu Pro Leu Tyr Gin Gly Glu He Gly Leu Ser Phe Pro Ala
35 40 45
Tyr Gly Leu Gly Arg Thr Leu Gly Gly He lie Arg Val Phe Gly Asn
50 55 60
Glu Gin His Cys Thr Gin He Lys Thr Gin Leu lie Gly Glu Gly Leu
65 70 75 80
Gin Asp Tyr Val Leu He Thr Ser Val Thr Pro Val Pro Glu Glu He
85 90 95
Val Glu Тут His Arg Tyr Gin Arg Val His Arg Lys Gly Gin Ser Ala
100 105 110
He Arg Arg Thr Glu Gin Phe Leu Val Gin Gin Gly Lys Trp Thr Glu
115 120 125
Glu He Arg Gin Glu Met Leu He His Gin Gin Asn Gin Lys Val Phe
130 135 140
Pro Tyr Val Lys Leu Lys Ser Gly Ser Thr Lys Gin His Phe Val Leu
145 150 155 160
Ala He Arg Gin Leu Arg Leu Ala Glu Pro Ala Ser Gly Leu Phe Asn
165 170 175
Ala Tyr Gly Leu Ser Gin Ala Ala Thr Val Pro His Phe 180 185
96 28
RNA
Искусственная последовательность
Синтетический олигонуклеотид 96
cuucacugcc guauaggcag cuuagaaa 28
<210> 97 <211> 189 <212> PRT
<213> Ac tinobac ill us p 1 europneum oni ae <400> 97
Met Ser Glu Leu Thr His Tyr He Glu Leu Lys Ala He Pro Gin Val
15 10 15
Asp He Leu Gin Thr Asp Val He Ala His Gly Leu Gin He Leu His
20 25 30
Lys Phe Leu Pro Leu Tyr Gin Gly Glu He Gly Leu Ser Phe Pro Ala
35 40 45
Tyr Gly Leu Gly Arg Thr Leu Gly Gly He He Arg Val Phe Gly Asn
50 55 60
Glu Gin His Cys Thr Gin He Lys Thr Gin Leu lie Gly Glu Gly Leu
65 70 75 80
Gin Asp Tyr Val Leu lie Thr Ser Val Thr Pro Val Pro Glu Glu He
85 90 95
Val Glu Tyr His Arg Tyr Gin Arg Val His Arg Lys Gly Gin Ser Ala
100 105 110
lie Arg Arg Thr Glu Gin Phe Leu Val Gin Gin Gly Lys Trp Thr Glu
115 120 125
Glu lie Arg Gin Glu Met Leu He His Gin Gin Asn Gin Lys Val Phe
130 135 140
Pro Tyr Val Lys Leu Lys Ser Gly Ser Thr Lys Gin His Phe Val Leu
145 150 155 160
Ala lie Arg Gin Leu Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Gly Leu Phe Asn
165 170 175
Ala Tyr Gly Leu Ser Lys He Ala Thr Val Pro His Phe 180 185
<210> 98 <211> 189 <212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumoniae <400> 98
Met Ser Glu Leu Thr His Tyr lie Glu Leu Lys Ala lie Pro Gin Val
15 10 15
Asp He Leu Gin Thr Asp Val He Ala His Gly Leu Gin He Leu His
20 25 30
Lys Phe Leu Pro Leu Tyr Gin Gly Glu He Gly Leu Ser Phe Pro Ala
35 40 45
Тут Gly Leu Gly Arg Thr Leu Gly Gly He He Arg Val Phe Gly Asn
50 55 60
Glu Gin His Cys Thr Gin He Lys Thr Gin Leu He Gly G)u Gly Leu
65 70 75 80
Gin Asp Tyr Val Leu He Thr Ser Val Thr Pro Val Pro Glu Glu He
85 90 95
Val Glu Tyr His Arg Tyr Gin Arg Val His Arg Lys Gly Gin Ser Ala
100 105 110
He Arg Arg Thr Glu Gin Phe Leu Val Gin Gin Gly Lys Trp Thr Glu
115 120 125
Glu He Arg Gin Glu Met Leu He His Gin Gin Asn Gin Lys Val Phe
130 135 140
Pro His Val Lys Leu Lys Ser Gly Ser Thr Lys Gin His Phe Val Leu
145 150 155 160
Ala He Arg Gin Leu Arg Leu Ala Glu Pro Ser Phe Gly Leu Phe Asn
165 170 175
Thr Tyr Gly Leu Ser Lys He Ala Thr Val Pro His Phe 180 185
<210> 99 <211> 189 <212> PRT
<213> Actinobacillus pleuropneumontae
<400> 99
Met Ser Glu Leu Thr His Tyr He Glu Leu Lys Ala He Pro Gin Val
15 10 15
Asp He Leu Gin Thr Asp Val He Ala His Gly Leu Gin He Leu His
20 25 30
Lys Phe Leu Pro Leu Tyr Gin Gly Glu He Gly Leu Ser Phe Pro Ala
35 40 45
Tyr Gly Leu Gly Arg Thr Leu Gly Gly He lie Arg Val Leu Gly Asn
50 55 60
Glu Gin His Cys Thr Gin He Lys Thr Gin Leu He Gly Glu Gly Leu
65 70 75 80
Gin Asp Tyr Val Leu He Thr Ser Val Thr Pro Val Pro Glu Glu He
85 90 95
Val Glu Tyr His Arg Tyr Gin Arg Val His Arg Lys Gly Gin Ser Ala
100 105 110
He Arg Arg Thr Glu Gin Phe Leu Val Gin Gin Gly Lys Trp Thr Glu
115 120 125
Glu He Arg Gin Glu Met Leu lie His Gin Gin Asn Gin Lys Val Phe
130 135 140
Pro His Val Lys Leu Lys Ser Gly Ser Thr Lys Gin His Phe Val Leu
145 150 155 160
Ala He Arg Gin Leu Arg Leu Ala Glu Pro Ser Phe Gly Leu Phe Asn
165 170 175
Thr Tyr Gly Leu Ser Lys He Ala Thr Val Pro His Phe 180 185
<210> 100 <211> 201 <212> PRT
<213> Streptococcus thermophi I us <400> 100
Met Ser Lys Thr Met He He Gly Leu Thr Gly Gly He Ala Ser Gly
15 10 15
Lys Ser Thr Val Val Glu He He Lys Asp Ala Gly Tyr Lys Val He
20 25 30
Asp Ala Asp Gin Leu Val His Asp Met Gin Val Lys Gly Gly Arg Leu
35 40 45
Tyr Gin Ala Leu Leu Asp Trp Leu Gly Asp Gly He Leu Leu Pro Asn
50 55 60
Gly Glu Leu Asn Arg Pro Lys Leu Gly Gin Leu He Phe Ser Ser Glu
65 70 75 80
Glu Met Arg Тут Gin Ser Ala Glu lie Gin Gly Lys He He Arg Glu
85 90 95
Glu Leu Ala Ala Lys Arg Asp Cys Leu Ala Lys Glu Glu Asp Val Phe
100 105 110
Phe Met Asp lie Pro Leu Leu Phe Glu Asn Asp Tyr Gin Asp Trp Phe
115 120 125
Asp Gin He Trp Leu Val Ala Val Ser Pro Gin Val Gin Gly Gin Arg
130 135 140
Leu Met Lys Arg Asn His Leu Ser Ala Glu Glu Ala Gly Met Arg He
145 150 155 160
Ala Ser Gin Met Pro Leu Ala Glu Lys Leu Pro Tyr Ala Ser Leu Val
165 170 175
He Asp Asn Asn Gly Asn He Asp Asp Leu Lys Lys Lys Val Lys Gly
180 185 190
Ala He Lys Asp Leu Ala Asn Leu Val 195 200
<210> 101
<211> 187
<212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<400> 101
Met Asp His Tyr Leu Asp He Arg Leu Arg Pro Asp Pro Glu Phe Pro
15 10 15
Pro Ala Gin Leu Mel Ser Val Leu Phe Gly Lys Leu Ala Gin Ala Leu
20 25 30
Val Ala Gin Gly Gly Asp Arg He Gly Val Ser Phe Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Glu Ser Arg Ser Arg Leu Gly Glu Arg Leu Arg lie His Ala Ser Ala
50 55 60
Asp Asp Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Pro Trp Leu Glu Gly Leu Arg
65 70 75 80
Asp His Leu Gin Phe Gly Glu Pro Ala Val Val Pro His Pro Thr Pro
85 90 95
Tyr Arg Gin Val Ser Arg Val Gin Val Lys Ser Asn Pro Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Arg Arg Leu Met Arg Arg His Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg
115 120 125
Lys Arg He Pro Asp Thr Val Ala Arg Ala Leu Asp Leu Pro Phe Val
130 135 140
Thr Leu Arg Ser Gin Ser Thr Gly Gin His Phe Arg Leu Phe He Arg
145 150 155 160
His Gly Pro Leu Gin Ala Thr Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Tyr
165 170 175
Gly Leu Ser Lys Gly Gly Phe Val Pro Trp Phe 180 185
<210> 102 <211> 187 <212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa <400> 102
Met Asp His Tyr Leu Asp lie Arg Leu Arg Pro Asp Pro Glu Phe Pro
15 10 15
Pro Ala Gin Leu Met Ser Val Leu Phe Gly Lys Leu Ala Gin Ala Leu
20 25 30
Val Ala Gin Gly Gty Asp Arg lie Gly Val Ser Phe Pro Asp Leu Asp
35 40 45
Glu Cys Arg Ser Arg Leu Gly Glu Arg Leu Arg He His Ala Ser Ala
50 55 60
Asp Asp Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Pro Trp Leu Glu Gly Leu Arg
65 70 75 80
Asp His Leu Gin Phe Gly Glu Pro Ala Val Val Pro His Pro Thr Pro
85 90 95
Tyr Arg Gin Val Ser Arg Val Gin Val Lys Ser Asn Pro Glu Arg Leu
!00 105 110
Arg Arg Arg Leu Met Arg Arg His Asp Leu Ser Glu Glu Glu Ala Arg
115 120 125
Lys Arg He Pro Asp Thr Val Ala Arg Ala Leu Asp Leu Pro Phe Val
130 135 140
Thr Leu Arg Ser Gin Ser Thr Gly Gin His Phe Arg Leu Phe He Arg
145 150 155 160
His Gly Pro Leu Gin Ala Thr Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Tyr
165 170 175
Gly Leu Ser Lys Gly Gly Phe Vat Pro Trp Phe 180 185
<210> 103 <2I1> 20 <212> RNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 103
guucacugcc guauaggcag 20
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения, облегчения симптомов, предотвращения прогрессирования или профилактики ожирения у млекопитающих, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 селективно вызывает в больных клетках млекопитающего переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении нормализованного митохондриального окислительного фосфорилирования.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, по существу, не вызывает в нормальных клетках млекопитающих переключения клеточного энергетического метаболизма в направлении митохондриального окислительного фосфори-лирования.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что млекопитающим является человек (или не являющееся человеком млекопитающее).
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ожирение поддается или чувствительно к воздействию коэнзима Q10, или его метаболитов, или аналогов.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что ожирение характеризуется дисрегуляцией функции ми-тохондриального окислительного фосфорилирования, что приводит к изменению регуляции генов и/или взаимодействию белок-белок, что способствует или непосредственно приводит к ожирению.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 включает:
(a) бензохинон или по меньшей мере одну молекулу, которая способствует биосинтезу бензохи-нонового кольца, и
(b) по меньшей мере одну молекулу, которая способствует синтезу и/или присоединению изопре-ноидных единиц к бензохиноновому кольцу.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что вышеупомянутая по меньшей мере одна молекула, которая способствует биосинтезу бензохинонового кольца, включает в себя L-фенилаланин, DL-фенил-аланин, D-фенилаланин, L-тирозин, DL-тирозин, D-тирозин, 4-гидроксифенилпируват, 3-метокси-4-гидроксиманделат (ванилилмандалата или VMA), ванилиновую кислоту, пиридоксин или пантенол.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что вышеупомянутая по меньшей мере одна молекула, которая способствует синтезу и/или присоединению изопреноидных единиц к бензохиноновому кольцу, включает в себя фенилацетат, 4-гидроксибензоат, мевалоновую кислоту, ацетилглицин, ацетил-СоА или фарнезил.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 включает:
(a) один или несколько из L-фенилаланина, L-тирозина и 4-гидроксифенилпирувата;
(b) один или несколько из 4-гидроксибензоата, фенилацетата и бензохинона.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10:
(a) ингибирует экспрессию Bcl-2 и/или стимулирует экспрессию каспазы-3 и/или
(b) ингибирует клеточную пролиферацию.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10 в тканях человека, подвергающегося лечению, отличается от концентрации в контрольном стандарте ткани человека, находящегося в здоровом или нормальном состоянии.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что форма коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10, вводимого человеку, отличается от преобладающей формы, находимой в системе кровотока у человека.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что количество фармацевтической композиции, достаточное для лечения ожирения у человека:
a) повышающе регулирует или понижающе регулирует митохондриальное окислительное фосфо-рилирование или
b) модулирует анаэробное использование глюкозы и/или биосинтез лактата.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что лечение происходит благодаря взаимодействию коэн-зима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10 с НОТ^-альфа или тран-сальдолазой.
16. Способ по п.1, где метаболическим нарушением является коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, действующий на окисление в митохондриях бета-клеток, уменьшающий размер адипоцитов и/или контролирующий уровни кортизола.
15.
17. Способ избирательного усиления митохондриального окислительного фосфорилирования в больных клетках млекопитающих, нуждающихся в лечении ожирения, включающий введение вышеупомянутому млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, тем самым избирательно усиливая митохондриальное окислительное фосфорилирование в вышеупомянутых больных клетках млекопитающего.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что дополнительно включает:
a) повышающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из молекул, перечисленных в табл. 2-4, 6-28 и 63-68, имеющих позитивное кратное изменение; и/или понижающее регулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из молекул, перечисленных в табл. 2-4, 6-28 и 63-68, имеющих негативное кратное изменение; или
b) модулирование экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из HNF4-альфа, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11, XIAP, 20 BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, сМус, трансальдолазы 1, COQ1, COQ3, COQ6, пренилтрансферазы, 4-гидробензоата, цитозольного фактора нейтрофилов 2, синтазы оксида азота 2А, супероксиддисмутазы 2, VDAC, Вах канала, ANT, Цитохрома с, комплекса I, комплекса II, комплекса III, комплекса IV, Foxo 3а, DJ-1, IDH-1, Cpt1C и Cam киназы II.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что вышеупомянутое лечение, облегчение симптомов, предотвращение прогрессирования или профилактика ожирения приводят к снижению объема талии, снижению содержания внутреннего жира, снижению уровня триглицеридов в плазме натощак или повышению уровня липопротеина высокой плотности натощак.
20. Способ по любому из пп.1, 17-19, отличающийся тем, что дополнительно включает введение дополнительного терапевтического агента.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что дополнительный терапевтически агент выбирается из группы, состоящей из агентов для лечения сахарного диабета, агентов для лечения осложнений диабета, антигиперлипемических агентов, гипотензивных или антигипертензивных агентов, агентов от ожирения, диуретиков, химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов и иммуносупрес-соров.
22. Способ уменьшения уровней липидов у пациента, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10.
23. Способ лечения, облегчения симптомов, профилактики прогрессирования или предупреждения поддающегося воздействию коэнзима Q10 нарушения у млекопитающих, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10, где коэнзим Q10 или по меньшей мере один структурный элемент коэнзима Q10 избирательно вызывает в больных клетках млекопитающего переключение клеточного энергетического метаболизма в направлении уровней гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования, наблюдаемых в нормальных клетках млекопитающих при нормальных физиологических условиях, где нарушением, поддающимся воздействию коэнзима Q10, является ожирение.
24. Способ по п.1, 17, 22 или 23, в котором фармацевтическая композиция содержит от 1 до 25 мас.% коэнзима Q10 или по меньшей мере одного структурного элемента коэнзима Q10.
19.
ЖИВЫЕ : ПОЗДНИЙ 1 РАННИЙ 1 КЛЕТКИ АПОПТОЗ АПОПТОЗ КАТЕГОРИЯ КЛЕТОК
Фиг. 4
КАТЕГОРИЯ КЛЕТОК
Фиг. 5
Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
023913
023913
- 1 -
- 1 -
(19)
023913
023913
- 1 -
- 1 -
(19)
023913
023913
- 1 -
- 1 -
(19)
023913
023913
- 4 -
- 3 -
(19)
023913
023913
- 46 -
- 46 -
023913
023913
- 48 -
- 48 -
023913
023913
- 52 -
- 52 -
023913
023913
- 53 -
- 53 -
023913
023913
- 55 -
- 55 -
023913
023913
- 56 -
- 56 -
023913
023913
- 63 -
- 63 -
023913
023913
- 64 -
- 64 -
023913
023913
- 64 -
- 64 -
023913
023913
- 65 -
- 65 -
023913
023913
- 66 -
- 66 -
023913
023913
- 67 -
- 67 -
023913
023913
- 106 -
- 106 -
023913
023913
- 107 -
- 107 -
023913
023913
- 134 -
- 134 -
023913
023913
- 135 -
- 135 -
023913
023913
- 140 -
- 140 -
023913
023913
- 141 -
- 141 -
023913
023913
- 155 -
- 156 -
023913
023913
- 155 -
- 156 -
023913
023913
- 157 -
- 156 -
023913
023913
- 158 -
- 158 -
023913
023913
- 159 -
- 159 -
023913
023913
- 160 -
- 160 -